Faleminderit që vizituat Nature.com. Po përdorni një version të shfletuesit me mbështetje të kufizuar CSS. Për përvojën më të mirë, ju rekomandojmë të përdorni një shfletues të përditësuar (ose të çaktivizoni Modalitetin e Përputhshmërisë në Internet Explorer). Përveç kësaj, për të siguruar mbështetje të vazhdueshme, ne e shfaqim faqen pa stile dhe JavaScript.
Shfaq një karusel me tre diapozitiva njëherësh. Përdorni butonat "Më parë" dhe "Më pas" për të lëvizur midis tre diapozitivave njëherësh, ose përdorni butonat e rrëshqitësit në fund për të lëvizur midis tre diapozitivave njëherësh.
Organelet nervore vetë-mbledhëse përfaqësojnë një platformë premtuese in vitro për modelimin e zhvillimit dhe sëmundjeve njerëzore. Megjithatë, organoideve u mungon lidhja që ekziston in vivo, gjë që kufizon maturimin dhe parandalon integrimin me qarqe të tjera që kontrollojnë sjelljen. Këtu ne tregojmë se organoidet kortikale të nxjerra nga qelizat staminale njerëzore të transplantuara në korteksin somatosensor të minjve nudo të porsalindur zhvillojnë lloje qelizash të pjekura që integrohen në qarqe shqisore dhe të lidhura me motivimin. MRI zbuloi rritje të organoideve pas transplantimit në disa linja qelizash staminale dhe kafshë, ndërsa analiza me një bërthamë të vetme zbuloi përparimin e kortikogjenezës dhe shfaqjen e një programi transkriptimi të varur nga aktiviteti. Në të vërtetë, neuronet kortikale të transplantuara shfaqin veti më komplekse morfologjike, sinaptike dhe të membranës së brendshme sesa homologët e tyre in vitro, duke lejuar zbulimin e defekteve neuronale tek pacientët me sindromën e Timothyt. Gjurmimi anatomik dhe funksional ka treguar se organelet e transplantuara marrin inpute talamokortikale dhe kortikokortikale, dhe regjistrimet in vivo të aktivitetit nervor sugjerojnë se këto inpute mund të gjenerojnë përgjigje shqisore në qelizat njerëzore. Së fundmi, organoidet kortikale zgjasin aksone në të gjithë trurin e miut, dhe aktivizimi i tyre optogjenetik çon në sjellje që kërkon shpërblim. Kështu, neuronet e transplantuara të korteksit njerëzor piqen dhe marrin pjesë në qarqet e strehuesit që kontrollojnë sjelljen. Ne presim që kjo qasje të lehtësojë zbulimin e fenotipeve në nivel fijesh në qelizat e nxjerra nga pacienti që nuk mund të zbulohen me mjete të tjera.
Truri i njeriut në zhvillim është një proces i jashtëzakonshëm vetëorganizues në të cilin qelizat shumohen, diferencohen, migrojnë dhe lidhen për të formuar qarqe funksionale neuronale që përpunohen më tej përmes përvojës shqisore. Një problem kyç në të kuptuarit e zhvillimit të trurit të njeriut, veçanërisht në kontekstin e sëmundjes, është mungesa e aksesit në indet e trurit. Organelet vetëorganizuese, duke përfshirë organoidet e korteksit të njeriut (hCO; të njohura edhe si sfera e korteksit të njeriut), mund të gjenerojnë 2,3,4,5,6. Megjithatë, disa kufizime kufizojnë zbatimin e tyre më të gjerë në kuptimin e zhvillimit dhe funksionimit të qarqeve nervore. Në veçanti, është e paqartë nëse maturimi i hCO është i kufizuar nga mungesa e disa inputeve mikromjedisore dhe shqisore të pranishme in vivo. Përveç kësaj, për shkak se hCO-të nuk janë të integruara në qarqe që mund të gjenerojnë rezultate të sjelljes, dobia e tyre në modelimin e çrregullimeve neuropsikiatrike gjenetikisht komplekse dhe të sjelljes është aktualisht e kufizuar.
Transplantimi i hCO në një tru të gjallë të paprekur mund t'i kapërcejë këto kufizime. Studimet e mëparshme kanë treguar se neuronet njerëzore të transplantuara në korteksin e brejtësve janë në gjendje të mbijetojnë, të projektojnë dhe të komunikojnë me qelizat e brejtësve7,8,9,10,11,12. Megjithatë, këto eksperimente zakonisht kryhen në kafshë të rritura, të cilat mund të kufizojnë integrimin sinaptik dhe aksonal. Këtu, ne përshkruajmë një paradigmë transplantimi në të cilën ne transplantuam hCO 3D të nxjerrë nga qelizat hiPS në korteksin primar somatosensor (S1) të minjve me mungesë imuniteti në një fazë të hershme të zhvillimit plastik. Neuronet e transplantuara të hCO (t-hCO) i nënshtrohen pjekurisë së konsiderueshme, marrin inpute talamokortikale dhe kortikale-kortikale që shkaktojnë përgjigje shqisore dhe zgjerojnë projeksionet aksonale në trurin e miut për të nxitur sjelljen e kërkimit të shpërblimit. Pjekuria e zgjatur e t-hCO ka zbuluar defekte neuronale tek pacientët me sindromën e Timothy-t (TS), një çrregullim i rëndë gjenetik i shkaktuar nga mutacionet në kanalin e kalciumit CaV1.2 të tipit L të ndjeshëm ndaj tensionit (i koduar nga CACNA1C).
Për të studiuar neuronet kortikale njerëzore në qarqe in vivo, ne transplantuam stereotaktikisht hCO3 3D të paprekur në S1 të minjve atimikë të hershëm pas lindjes (ditët 3-7 pas lindjes) (Fig. 1a dhe të dhëna të zgjeruara të Fig. 1a-c). Në këtë pikë, projeksionet aksonale talamokortikale dhe kortikokortikale nuk e kanë përfunduar ende inervimin e tyre S1 (ref. 13). Kështu, kjo qasje është projektuar për të maksimizuar integrimin e t-hCO duke minimizuar ndikimin në qarqet endogjene. Për të vizualizuar vendndodhjen e t-hCO3 në kafshët e gjalla, ne kryem rindërtime të trurit me MRI të ponderuara T2 të minjve 2-3 muaj pas transplantimit (Fig. 1b dhe të dhëna të zgjeruara, Fig. 1d). t-hCO3 u vunë re lehtësisht dhe matjet e vëllimit të t-hCO3 ishin të ngjashme me ato të llogaritura nga feta fikse (Të dhëna të zgjeruara Fig. 1d, e; P > 0.05). t-hCO3 u vunë re lehtësisht dhe matjet e vëllimit të t-hCO3 ishin të ngjashme me ato të llogaritura nga feta fikse (Të dhëna të zgjeruara Fig. 1d, e; P > 0.05). t-hCO легко наблюдались, а объемные измерения t-hCO были аналогичны рассчитанным за фиксированных срезов (расширенные данные, рис. 1d, e; P> 0,05). t-hCO3 u vëzhguan lehtësisht, dhe matjet volumetrike të t-hCO3 ishin të ngjashme me ato të llogaritura për seksionet fikse (të dhëna të zgjeruara, Fig. 1d, e; P > 0.05).很容易观察到t-hCO，并且t-hCO的体积测量值与从固定切片计算的测量值相似（扩展数据图1d、e；P > 0.05＼很容易观察到t-hCO，并且t-hCO t-hCO легко наблюдался, а объемные измерения t-hCO были аналогичны рассчитанным за фиксированных срезов (расширенные данные, рис. 1d, e; P> 0,05). t-hCO3 u vëzhgua lehtësisht, dhe matjet volumetrike të t-hCO3 ishin të ngjashme me ato të llogaritura për seksionet fikse (të dhëna të zgjeruara, Fig. 1d, e; P > 0.05).Ne përcaktuam t-hCO në 81% të kafshëve të transplantuara afërsisht 2 muaj pas transplantimit (n = 72 kafshë; hCO nga 10 linja qelizore hiPS; linja qelizore hiPS në Tabelën Plotësuese 1). Nga këto, 87% ishin të vendosura në korteksin cerebral (Fig. 1c). Duke kryer skanime serike MRI në pika të shumëfishta kohore në të njëjtin mi të transplantuar, gjetëm një rritje nëntëfish të vëllimit të t-hCO brenda 3 muajve (Fig. 1d dhe të dhëna të zgjeruara, Fig. 1f). Kafshët e transplantuara kishin një shkallë të lartë mbijetese (74%) në 12 muaj pas transplantimit (të dhëna të zgjeruara, Fig. 1g dhe Tabela Plotësuese 2), dhe nuk u gjetën dëmtime të dukshme motorike ose të kujtesës, gliozë ose elektroencefalogramë (EEG). Të dhënat Fig. 1g dhe tabela plotësuese 2). 1h–m dhe 3e).
a, Skema e dizajnit eksperimental. hCO2 i nxjerrë nga qelizat hiPS u transplantua në S1 të minjve të porsalindur nudo në ditët 30-60 të diferencimit. b, Imazhe MRI koronale dhe horizontale të ponderuara T2 që tregojnë t-hCO në S1 2 muaj pas transplantimit. Shiriti i shkallës, 2 mm. c, Kuantifikimi i shkallëve të suksesit të transplantimit të treguara për secilën linjë qelizore hiPS (n = 108, numrat brenda shiritave tregojnë sasinë e t-hCO2 për linjë qelizore hIPS) dhe vendndodhjen kortikale ose subkortikale (n = 88). d, Imazh MRI i një arterie koronare (majtas; shiriti i shkallës, 3 mm) dhe rindërtimi volumetrik 3D përkatës (shiriti i shkallës, 3 mm) që tregon një rritje të t-hCO2 gjatë 3 muajve. e, Rishikimi i modeleve të t-hCO2 në korteksin cerebral të miut. Shiriti i shkallës, 1 mm. f, Imazhe përfaqësuese imunocitokimike të t-hCO të paraqitura nga lart majtas në të djathtë (gjatë diferencimit): PPP1R17 (4 muajsh), NeuN (8 muajsh), SOX9 dhe GFAP (8 muajsh), PDGFRα; (8 muajsh), MAP2 (8 muajsh) dhe IBA1 (8 muajsh). Shiriti i shkallës, 20 µm. Bashkë-shprehja e HNA tregon qelizat me origjinë njerëzore. g, snRNA-seq: Imazhe të reduktimit të dimensionalitetit të shumëfishtë dhe projeksionit të unifikuar (UMAP) të të gjitha bërthamave t-hCO me cilësi të lartë pas integrimit Seurat (n = 3 mostra t-hCO, n = 2 linja qelizore hiPS). Astrocitet, qelizat e linjës së astrociteve; cyc prog, paraardhësit qarkullues; GluN DL, neuronet glutamatergjike të thella; GluN DL/SP, neuronet glutamatergjike të thella dhe sublamellare; GluN UL, neuronet glutamatergjike të shtresës së sipërme; oligodendrocite, oligodendrocite; OPC, qelizat paraardhëse të oligodendrociteve; RELN, neuronet reelin. h, Analiza e pasurimit termik të Ontologjisë së Gjeneve (GO) e gjeneve të rritura ndjeshëm (P e rregulluar < 0.05, ndryshimi i fishimit > 2, i shprehur në të paktën 10% të bërthamave) në neuronet glutamatergjike t-hCO krahasuar me neuronet glutamatergjike hCO. h, Analiza e pasurimit termik të Ontologjisë së Gjeneve (GO) e gjeneve të rritura ndjeshëm (P e rregulluar < 0.05, ndryshimi i fishimit > 2, i shprehur në të paktën 10% të bërthamave) në neuronet glutamatergjike t-hCO krahasuar me neuronet glutamatergjike hCO. h, Analiz обогащения терминов Gene Ontology (SHKO) për gjene me domethënëstelnoy aktivizim (skorrektirovannыy P <0,05, кратность изменения > 2, эkspresija po krajney mere në 10% jastë jo egzistuese) со глутаматергическими нейронами hCO. h, Analiza e pasurimit të termit të Ontologjisë së Gjeneve (GO) për gjenet me aktivizim të rëndësishëm (P <0.05 i rregulluar, ndryshimi i fishimit >2, shprehja në të paktën 10% të bërthamave) në neuronet glutamatergjike t-hCO krahasuar me neuronet glutamatergjike hCO. h，与hCO 谷氨酸能神经元相比，t-hCO 谷氨酸能神经元中基因显着上调（调P 0,05，倍数变化> 2，在至少10% 的细胞核中表达）的基因本体论(SHKO) 术语富集术语富集 h ， 与 hco 谷氨酸 能 元 相比 ， t-hco 谷氨酸 能 神经 元 基因 显 上调 p.变化 变化> 2 ， 至少 10% 的 核中 表达） 基因 基因 基因 的 的 的 的 的 的 的 的 的的 的 的 的本体论(SHKO) 术语富集分析。 h, gjenы shumë aktivisht (skorrektirovannыy P <0,05, krasitje e ndryshimeve> 2, ekspresiruetsya me 10% jader) në glutamatergicheskih të pakënaqur t-hCO për sravneniyu Онтологический (SHKO) analiz термина обогащения. h, gjenet u rritën ndjeshëm (P e rregulluar < 0.05, ndryshimi i fishimit > 2, i shprehur në të paktën 10% të bërthamave) në neuronet glutamatergjike t-hCO krahasuar me neuronet glutamatergjike hCO. Analiza ontologjike (GO) e termit të pasurimit.Vija me pika tregon vlerën aq prej 0.05. i, imazheria UMAP e llojeve të qelizave GluN në t-hCO duke përdorur transferimin e etiketës nga një set i të dhënave referuese të korteksit motorik të të rriturve 22 snRNA-seq. CT — qeliza kortikotalamike, ET — qeliza ekstracerebrale, IT — qeliza telencefalike të brendshme, NP — projeksion i afërt.
Pastaj vlerësuam citoarkitekturën dhe përbërjen e përgjithshme qelizore të t-hCO. Ngjyrosja me antitrupa e qelizave endoteliale të miut zbuloi vaskularizim me t-hCO, ndërsa ngjyrosja IBA1 zbuloi praninë e mikroglisë së miut në të gjithë shartimin (Fig. 1f dhe të dhëna të zgjeruara, Fig. 3c, d). Imunongjyrosja zbuloi qeliza pozitive për antigjenin bërthamor të njeriut (HNA) që bashkë-shprehnin PPP1R17 (paraardhës kortikal), NeuN (neuronet), SOX9 dhe GFAP (qeliza të derivuara nga glia) ose PDGFRα (paraardhës të oligodendrociteve) (Figura 1f). Për të studiuar përbërjen qelizore të t-hCO në rezolucion të një qelize të vetme, ne kryem sekuencimin e ARN-së me një bërthamë të vetme (snRNA-seq) pas afërsisht 8 muajsh diferencimi. Filtrimi në masë dhe heqja e bërthamave të miut dhanë 21,500 harta mononukleare njerëzore me cilësi të lartë (Fig. 1g dhe të dhëna të zgjeruara, Fig. 4a, b). Modelet e shprehjes së shënuesve tipikë të tipit qelizor identifikuan grupe të klasave kryesore të qelizave kortikale, duke përfshirë neuronet glutamatergjike të thella dhe sipërfaqësore, paraardhësit qarkullues, oligodendrocitet dhe linjën e astrociteve (Fig. 1g, të dhëna të zgjeruara, Fig. 4c dhe Tabela Plotësuese 3). Imunongjyrosja për SATB2 dhe CTIP2 tregoi se pavarësisht pranisë së nëntipeve kortikale, t-hCO nuk tregoi stratifikim të qartë anatomik (të dhëna të zgjeruara, Fig. 3a). hCO snRNA-seq i përputhur me fazën prodhoi klasa qelizash gjerësisht të ngjashme, me disa përjashtime, duke përfshirë mungesën e oligodendrociteve dhe praninë e neuroneve GABAergjike, të cilat mund të pasqyrojnë kushtet e favorshme in vitro të raportuara më parë për qelizat paraardhëse anësore15 (të dhëna të zgjeruara, Fig. 4f - i dhe Tabela Plotësuese 4). Analiza diferenciale e shprehjes së gjeneve zbuloi ndryshime të rëndësishme në neuronet glutamatergjike midis t-hCO dhe hCO (Tabela Plotësuese 5), duke përfshirë aktivizimin e grupeve të gjeneve të shoqëruara me maturimin neuronal siç është sinjalizimi sinaptik, lokalizimi dendritik dhe aktiviteti i kanalit të kontrolluar nga voltazhi (Figura 1h dhe Tabela Plotësuese 5). tabela 6). Prandaj, neuronet kortikale glutamatergjike t-hCO shfaqën maturim transkriptues të përshpejtuar.
Për të sqaruar nëse këto ndryshime transkriptuese në t-hCO lidheshin me ndryshimet morfologjike midis hCO in vitro dhe t-hCO in vivo, ne rindërtuam hCO dhe hCO të mbushura me biocitinë të përputhura në fazë në seksionet akute pas 7-8 muajsh diferencimi. neuronet hCO (Fig. 2a). Neuronet t-hCO ishin dukshëm më të mëdhenj, kishin 1.5 herë diametrin e somës, dy herë më shumë dendrite dhe një rritje të përgjithshme gjashtëfish në gjatësinë totale të dendritit krahasuar me hCO in vitro (Fig. 2b). Përveç kësaj, ne vumë re një dendësi dukshëm më të lartë të gjembave dendritike në neuronet t-hCO sesa në neuronet hCO (Fig. 2c). Kjo sugjeron që neuronet t-hCO i nënshtrohen zgjatjes dhe degëzimit të gjerë dendritik, i cili, në kombinim me përhapjen e vazhdueshme të qelizave, mund të kontribuojë në rritjen intensive të t-hCO pas transplantimit (Fig. 1d dhe të Dhëna të Zgjeruara Fig. 1f). Kjo na shtyu të hetojmë vetitë elektrofiziologjike. Kapaciteti i membranës ishte tetë herë më i lartë (të dhëna të zgjeruara, Fig. 8d), potenciali i membranës në gjendje qetësie ishte më i hiperpolarizuar (afërsisht 20 mV), dhe injektimi i rrymës shkaktoi një shkallë maksimale ngacmimi më të lartë në neuronet t-hCO3 sesa në neuronet hCO3. in vitro (Fig. 2d), e), gjë që është në përputhje me tiparet morfologjike më të mëdha dhe më komplekse të t-hCO3. Përveç kësaj, frekuenca e ngjarjeve të rrymës postsinaptike ngacmuese spontane (EPSC) ishte dukshëm më e lartë në neuronet t-hCO3 (Fig. 2f), duke sugjeruar që dendësia e rritur e shtyllave dendritike të vëzhguara në neuronet t-hCO3 ishte e lidhur me ngacmueshmërinë funksionale. sinapsi seksual. Ne konfirmuam karakterin e papjekur të neuroneve hCO3 in vitro duke regjistruar neuronet glutamatergjike të etiketuara (të dhëna të zgjeruara, Fig. 6a-c).
a, rindërtimi 3D i neuroneve hCO dhe t-hCO të mbushura me biocitinë pas 8 muajsh diferencimi. b, Kuantifikimi i karakteristikave morfologjike (n = 8 neurone hCO3, n = 6 neurone t-hCO3; **P = 0.0084, *P = 0.0179 dhe ***P < 0.0001). b, Kuantifikimi i karakteristikave morfologjike (n = 8 neurone hCO3, n = 6 neurone t-hCO3; **P = 0.0084, *P = 0.0179 dhe ***P < 0.0001). б, количественная оценка морфологических признаков (n = 8 nejronov hCO, n = 6 nejronov t-hCO; ** P = 0,0084, * P = 0,0179 и *** P <0,0001). b, përcaktimi sasior i karakteristikave morfologjike (n=8 neurone hCO3, n=6 neurone t-hCO3; **P=0.0084, *P=0.0179 dhe ***P<0.0001). b，形态学特征的量化（n = 8 个hCO 神经元，n = 6 个t-hCO 神经元；**P = 0.0084，1*P = 0.0084，1*9 0.0001). b，形态学特征的量化（n = 8 个hCO 神经元，n = 6 个t-hCO 神经元；**P = 0.0084，1*P = 0.0084，1*9 0.0001). б, количественная оценка морфологических признаков (n = 8 nejronov hCO, n = 6 nejronov t-hCO; ** P = 0,0084, * P = 0,0179 и *** P <0,0001). b, përcaktimi sasior i karakteristikave morfologjike (n=8 neurone hCO3, n=6 neurone t-hCO3; **P=0.0084, *P=0.0179 dhe ***P<0.0001).c, rindërtimi 3D i degëve dendritike të hCO dhe t-hCO pas 8 muajsh diferencimi. Yjet e kuq tregojnë gjembat dendritike të supozuara. Kuantifikimi i dendësisë së gjembave dendritike (n = 8 neurone hCO, n = 6 neurone t-hCO; **P = 0.0092). d, Kuantifikimi i potencialit të membranës në qetësi (n = 25 neurone hCO3, n = 16 neurone t-hCO3; ***P < 0.0001). d, Kuantifikimi i potencialit të membranës në qetësi (n = 25 neurone hCO3, n = 16 neurone t-hCO3; ***P < 0.0001). d, koliчественная оценка мембранного потенциала покоя (n = 25 hCO, n = 16 t-hCO; *** P <0,0001). d, kuantifikimi i potencialit të membranës në qetësi (n = 25 neurone hCO3, n = 16 neurone t-hCO3; ***P < 0.0001). d，静息膜电位的量化（n = 25 hCO 神经元，n = 16 t-hCO 神经元；***P <0,0001）。 d，静息膜电位的量化（n = 25 hCO 神经元，n = 16 t-hCO 神经元；***P <0,0001）。 d, koliчественная оценка мембранного потенциала покоя (n = 25 hCO, n = 16 t-hCO; *** P <0,0001). d, kuantifikimi i potencialit të membranës në qetësi (n = 25 neurone hCO3, n = 16 neurone t-hCO3; ***P < 0.0001). e, Shpërthimi i potencialit të veprimit përsëritës në hCO3 dhe t-hCO3 i induktuar nga rritja e injeksioneve të rrymës, dhe përcaktimi sasior i shkallës maksimale të shpërthimit (n = 25 neurone hCO3, n = 16 neurone t-hCO3; ***P < 0.0001). e, Shpërthimi i potencialit të veprimit përsëritës në hCO3 dhe t-hCO3 i induktuar nga rritja e injeksioneve të rrymës, dhe përcaktimi sasior i shkallës maksimale të shpërthimit (n = 25 neurone hCO3, n = 16 neurone t-hCO3; ***P < 0.0001). e, përsëritjen e shpejtë në hCO dhe t-hCO, vыzvannoe uveliciem toka, dhe koliчественная оценка maksimale скорости возбуждения (n = 25 nejronov hCO, n = 16 nejronov hCO, n = 16 nejronov t-hCO, n = 16 P***; 0 0,00 <0,CO). e, rindezja e potencialit të veprimit në hCO3 dhe t-hCO3 e shkaktuar nga rritja e rrymës dhe përcaktimi sasior i shkallës maksimale të ndezjes (n = 25 neurone hCO3, n = 16 neurone t-hCO3; *** P < 0.0001). e，通过增加电流注入诱导的hCO 和t-hCO 重复动作电位放电，以及最大攚电率个hCO 神经元，n = 16 个t-hCO 神经元；***P <0.0001）. E ， 通过 增加 电流 注入 的 的 hco 和 t-hco 重复 电位 放电 ， 以及 最 大 大 大个 hco 神经 , n = 16 个 t-hco 神经 ； *** p <0,0001） . e, повторяющееся возбуждение потенциала действия hCO dhe t-hCO, вызванное увеличением подачи тока, и количественная оценка maksimalьной скорости возбуждения (n = 25 neyronov hCO; n n hCO, n = 1 <0,0001). e, ndezja përsëritëse e potencialeve të veprimit të hCO3 dhe t-hCO3 e shkaktuar nga rritja e furnizimit me rrymë dhe përcaktimi sasior i shkallës maksimale të ndezjes (n = 25 neurone hCO3, n = 16 neurone t-hCO3; *** P < 0.0001). f, EPSC-të spontane (sEPSC) në neuronet hCO dhe t-hCO në 8 muaj diferencimi, dhe përcaktimi sasior i frekuencës së ngjarjeve sinaptike (n = 25 neurone hCO, n = 17 neurone t-hCO; ***P < 0.0001). f, EPSC-të spontane (sEPSC) në neuronet hCO dhe t-hCO në 8 muaj diferencimi, dhe përcaktimi sasior i frekuencës së ngjarjeve sinaptike (n = 25 neurone hCO, n = 17 neurone t-hCO; ***P < 0.0001). f, spontannыe EPSC (sEPSC) në hCO dhe t-hCO të pandryshuara me 8 ndryshime diferenciale dhe pika të përbashkëta të përbashkëta (n = 25 të reja hCO, n = 17 PCO, 0,0 t reja). f, EPSC-të spontane (sEPSC) në neuronet hCO dhe t-hCO në 8 muaj diferencimi dhe përcaktimi sasior i shkallëve të ngjarjeve sinaptike (n = 25 neurone hCO, n = 17 neurone t-hCO; ***P <0.0001). f，分化8 个月时hCO 和t-hCO 神经元中的自发性EPSCs (sEPSCs)，以及突触事件频率猖性EPSCs神经元，n = 17 t-hCO 神经元；***P <0.0001）. f，分化8 个月时hCO 和t-hCO 神经元中的自发性EPSCs (sEPSCs)，以及突触事件频率缄鏑性CO神率的量匼（n = 25 hCO 神率的量匼（n = 25hCO P <0,0001）. f, spontannыe EPSC (sEPSC) në hCO dhe t-hCO të pandryshuara me 8 ndryshime diferenciale dhe pika të përbashkëta të përbashkëta (n = 25 joekonomike hCO, n = 17 PCO, 0 t reja). f, EPSC-të spontane (sEPSC) në neuronet hCO dhe t-hCO në 8 muaj diferencimi dhe përcaktimi sasior i shkallëve të ngjarjeve sinaptike (n = 25 neurone hCO, n = 17 neurone t-hCO; *** P<0.0001).Për bf, hCO dhe t-hCO në rreshtin 1208-2 u morën nga e njëjta grup diferencimi i mbajtur paralelisht. g, Analiza e pasurimit të gjeneve (testi i saktë i njëanshëm i Fisherit) i gjeneve të rritura ndjeshëm (P i rregulluar < 0.05, ndryshimi i deles > 2, i shprehur në të paktën 10% të bërthamave) në neuronet glutamatergjike t-hCO krahasuar me neuronet glutamatergjike hCO me grupe gjenesh të gjeneve të varura nga aktiviteti si të përgjigjes së hershme (ERG) ashtu edhe të përgjigjes së vonë (LRG) të identifikuara nga një studim in vivo me minj16 dhe LRG specifike për njerëzit nga neuronet in vitro17. g, Analiza e pasurimit të gjeneve (testi i saktë i njëanshëm i Fisherit) i gjeneve të rritura ndjeshëm (P i rregulluar < 0.05, ndryshimi i deles > 2, i shprehur në të paktën 10% të bërthamave) në neuronet glutamatergjike t-hCO krahasuar me neuronet glutamatergjike hCO me grupe gjenesh të gjeneve të varura nga aktiviteti si të përgjigjes së hershme (ERG) ashtu edhe të përgjigjes së vonë (LRG) të identifikuara nga një studim in vivo me minj16 dhe LRG specifike për njerëzit nga neuronet in vitro17. g, analiza e analizës së gjeneve (odnostoronniй точный критерий Фишера) gjeneve me domethënës aktivacieй (skorrektirovannый P <0,05, pakësimi i ndryshimeve > 2, ekspresija e zvogëlimit të zvogëlimit të 110% më pak) neyronah t-hCO po sravneniyu me glutamatergicheskimi neyronami hCO naborы genov si rannego (ERG), так и позднего (LRG) gjen, përvisjaщих от aktiviteteve, identificirovannыh в исследовании на мышах in vivo16, и specifiческих для человека LRG из нейронов in vitro17. g, analiza e pasurimit të setit të gjeneve (testi i saktë i Fisher-it me një bisht) i gjeneve me aktivizim të konsiderueshëm (P <0.05 i rregulluar, ndryshimi i deles >2, shprehja në të paktën 10% të bërthamave) në neuronet glutamatergjike t-hCO krahasuar me setet e neuroneve glutamatergjike hCO të gjeneve të varura nga aktiviteti të hershëm (ERG) dhe të vonë (LRG) të identifikuara në minj in vivo16 dhe LRG specifike për njeriun nga neuronet in vitro17. g，t-hCO谷氨酸能神经元与hCO谷氨酸能神经元相比，t -hCO谷氨酸能神经元显着上调（调整后P<0.05，倍数变化>2，在至少10%的细胞核中表达）的基因集富集分析（单侧F isher精确检验）从体内小鼠研究中鉴定的早期反应(ERG)和晚期反应(LRG) 活性依赖性基因的基因组16 和体外神经元17 中的人类特R g ， t-hco 谷氨酸 神经 元 与 hco 谷氨酸 神经 元 相比 ， t-hco 谷氨酸 神经 刞萃 与<0.05 ， 倍数> 2 ， 至少 至少 10% 的 细胞 核中 表达） 的 集富集 分析 细胞 核中 表达） 的 集富集 分析 （弡体内 小鼠 研究 中 的 早期 反应 反应 反应 和 晚期 反应 反应 (lrg) 活性 基因 的 基因璄 16神经元 17 中 中 17 中 17 的人类特异性LRG. g, glutamatergjicheskie neyronы t-hCO dmth shumë i rëndësishëm aktivizirovanы me sravneniyu me glutamatergjicheskie neyronami hCO (skorrektirovannыy P<0,05, krasitje emeneniya> 2, jo vetëm 10% analitike точный тест Фишера) раннего ответа (ERG) и позднего гены, зависящие от активности ответа (LRG), идентифицированные в исследованиях на мышах in vivo16 dhe нейронах in vitro17, специфичные для человека. g, neuronet glutamatergjike t-hCO3 u rritën ndjeshëm krahasuar me neuronet glutamatergjike hCO3 (P <0.05 i rregulluar, ndryshimi i fishimit >2, të paktën 10% Analiza e pasurimit të gjenit të përgjigjes së hershme (ERG) dhe përgjigjes së vonë (testi i saktë i Fisher-it me një bisht) gjenet e varura nga aktiviteti i përgjigjes (LRG) të identifikuara në minj in vivo16 dhe neurone in vitro.17 LRG specifike për njerëzit.Vija me pika tregon një vlerë P të korrigjuar nga Bonferroni prej 0.05. h, shprehja e gjenit GluN (pseudo-paketimi dhe shkallëzimi i secilit gjen) u rrit ndjeshëm në replikat snRNA-seq të gjeneve LRG në neuronet glutamatergjike t-hCO. i, imunongjyrosja që tregon shprehjen e SCG2 në neuronet t-hCO (sipërme) dhe hCO (poshtë). Shigjetat e bardha tregojnë qelizat SCG2+. Shiriti i shkallës, 25 µm. Të dhënat shprehen si mesatare ± devijim standard.
Bazuar në aktivitetin e rritur të t-hCO të vëzhguar në feta ex vivo, snRNA-seq zbuloi një rritje të varur nga aktiviteti të transkripteve të gjeneve në t-hCO krahasuar me hCO in vitro. Neuronet glutamatergjike t-hCO shprehën nivele më të larta të gjeneve që rregullojnë aktivitetin e përgjigjes së vonë (Fig. 2g,h), të cilat u gjetën në studime të mëparshme në neuronet e miut dhe njeriut16,17. Për shembull, BDNF18, SCG2 dhe OSTN, një gjen specifik i rregullimit të aktivitetit të primatëve, tregoi shprehje të rritur në neuronet t-hCO krahasuar me neuronet hCO (Fig. 2g-i). Kështu, neuronet t-hCO shfaqën karakteristika të përmirësuara të maturimit krahasuar me neuronet hCO me anë të analizave transkriptuese, morfologjike dhe funksionale.
Për të vlerësuar më tej lidhjen e maturimit të t-hCO me zhvillimin e trurit të njeriut, ne kryem krahasime transkriptomike të llojeve të qelizave kortikale fetale dhe të rritura19,20 dhe të rritur21,22, si dhe të dhëna të gjera mbi shprehjen e gjeneve kortikale23 gjatë zhvillimit (të dhëna të zgjeruara, Fig. 5). Me punën e mëparshme24, statusi global i maturimit të transkriptomës hCO dhe t-hCO në 7-8 muaj diferencimi është përgjithësisht në përputhje me kohën e zhvillimit in vivo dhe është më ekuivalenti me jetën e vonë fetale (Të dhëna të zgjeruara Fig. 5a). Veçanërisht, ne vumë re pjekuri të rritur të transkriptomës në t-hCO krahasuar me hCO të përputhur me moshën, si dhe aktivizimin e transkriptomës të shoqëruar me sinaptogjenezën, astrogjenezën dhe mielinizimin (të dhëna të zgjeruara, Fig. 5b-d). Në nivel qelizor, ne gjetëm prova të një nëntipi më të hollë të korteksit në t-hCO, me grumbuj të neuroneve glutamatergjike që mbivendosen me nëntipet e neuroneve L2/3, L5 dhe L6 të rritur (Figura 1i). Në të kundërt, mbivendosja e grupeve midis neuroneve t-hCO glutamatergjike dhe neuroneve kortikale fetale ishte më e kufizuar në mesin e shtatzënisë (të dhëna të zgjeruara, Figura 5e-j). Për të përcaktuar nëse neuronet t-hCO janë funksionalisht të ngjashme me neuronet neokortikale postnatale njerëzore, ne kryem regjistrime elektrofiziologjike dhe rindërtime anatomike të neuroneve piramidale L2/3 njerëzore në seksione të mprehta të korteksit postnatal njerëzor (të dhëna të zgjeruara, Fig. 7a). Vetitë elektrofiziologjike të neuroneve piramidale L2/3 ishin të ngjashme me ato të neuroneve piramidale t-hCO (të dhëna të zgjeruara, Fig. 7e). Morfologjikisht, neuronet L2/3 nga mostrat njerëzore postnatale ishin më të ngjashme me t-hCO sesa me hCO, megjithëse qelizat L2/3 ishin më të gjata, përmbanin më shumë degë në përgjithësi dhe kishin një dendësi më të lartë të shtyllës kurrizore (Fig. 3g dhe të dhëna të zgjeruara, Fig. 7b-). G).
a, transplantimi i hCO3 të prodhuar nga linjat qelizore të kontrollit dhe TS hiPS në minjtë neonatalë. b, rindërtimi 3D i neuroneve t-hCO3 të mbushura me biocitinë pas 8 muajsh diferencimi. c, përcaktimi sasior i gjatësisë mesatare të dendritit (n = 19 neurone kontrolli, n = 21 neurone TS; **P = 0.0041). d, degë dendritike të rindërtuara në 3D nga kontrolli dhe TS t-hCO në 8 muaj diferencim, dhe përcaktimi sasior i dendësisë së shtyllës kurrizore dendritike (n = 16 neurone kontrolli, n = 21 neurone TS, ***P < 0.0001). d, degë dendritike të rindërtuara në 3D nga kontrolli dhe TS t-hCO në 8 muaj diferencim, dhe përcaktimi sasior i dendësisë së shtyllës kurrizore dendritike (n = 16 neurone kontrolli, n = 21 neurone TS, ***P < 0.0001). d, 3D-rekonstruksioni i дендритных ветвей из контроля и TS t-hCO через 8 месяцев дифференцировки и количественная оценка плотности дендритных шипов (n = 16 kontrollьnыh neyronov, n = 10, n = 20, n = 20, n = 20, n = 20, 20). d, rindërtimi 3D i degëve dendritike nga kontrolli dhe t-hCO TS në 8 muaj diferencimi dhe kuantifikimi i dendësisë së shtyllës kurrizore dendritike (n = 16 neurone kontrolli, n = 21 neurone TS, ***P <0.0001). d，分化8 个月时对照和TS t-hCO 的3D 重建树突分支，以及树突棘密度的量化 =1！个对照神经元，n = 21 个TS 神经元，***P <0.0001）. d ， 分化 8 个 时 对照 和 ts t-hco 的 3d 重建 分支 分支 以及 树突挘 密度 1度 量度神经 元 ， n = 21 ts 神经 ， *** p <0,0001 ）. d, 3D-rekonstruksioni i ditëdritnыh ветвей контроля и TS t-hCO через 8 месяцев дифференцировки и количественная оценка плотности дендритных шипов (n = 16 kontrollьnыh neyronov, n = 20,0TS). d, rindërtimi 3D i degëve dendritike të kontrollit dhe TS t-hCO në 8 muaj diferencimi dhe kuantifikimi i dendësisë së shtyllës kurrizore dendritike (n = 16 neurone kontrolli, n = 21 neurone TS, ***P <0.0001).Yjet e kuq tregojnë gjemba dendritike të supozuara. e, EPSC spontane në neuronet e kontrollit dhe TS t-hCO pas 8 muajsh diferencimi. f, grafiku i frekuencës kumulative dhe përcaktimi sasior i frekuencës dhe amplitudës së ngjarjeve sinaptike (n = 32 neurone kontrolli, n = 26 neurone TS; **P = 0.0076 dhe P = 0.8102). g, Analiza Scholl e neuroneve TS dhe kontrollit në hCO dhe t-hCO. Vijat e ndërprera tregojnë neuronet piramidale postnatale njerëzore L2/3 për krahasim (n = 24 neurone kontrolli t-hCO, n = 21 neurone TS t-hCO, n = 8 neurone kontrolli hCO dhe n = 7 neurone TS hCO). Të dhënat shprehen si mesatare ± devijim standard.
Aftësia e t-hCO për të replikuar tiparet morfologjike dhe funksionale të neuroneve të korteksit njerëzor në një nivel të lartë na shtyu të shqyrtonim nëse t-hCO mund të përdoret për të zbuluar fenotipet e sëmundjeve. Ne u përqendruam në TS, një çrregullim i rëndë neurozhvillimor i shkaktuar nga mutacionet e fitimit të funksionit në gjenin që kodon CaV1.2, i cili fillon transkriptimin e gjenit të varur nga aktiviteti në neurone. Ne morëm hCO nga tre pacientë me TS që mbanin zëvendësimin më të zakonshëm (p.G406R) dhe tre kontrolle (Fig. 3a). Pas transplantimit, zbuluam se morfologjia dendritike ishte ndryshuar në neuronet TS krahasuar me kontrollet (Fig. 3b dhe të dhëna të zgjeruara, Fig. 8a,b), me një rritje dyfish të numrit të dendriteve primare dhe një rritje të përgjithshme të uljes mesatare dhe të përgjithshme të gjatësisë dendritike (Fig. 3c dhe të dhëna të zgjeruara, Fig. 8c). Kjo u shoqërua me një dendësi të shtuar të shtyllave kurrizore dhe një frekuencë të shtuar të EPSC-ve spontane në TS krahasuar me neuronet e kontrollit (Fig. 3d–f dhe të dhëna të zgjeruara, Fig. 8g). Analiza e mëtejshme zbuloi modele të degëzimit dendritik anormal në t-hCO3 TS krahasuar me kontrollet, por jo në hCO3 TS in vitro në një fazë të ngjashme të diferencimit (Fig. 3g). Kjo është në përputhje me raportet tona të mëparshme të tkurrjes dendritike të varur nga aktiviteti në TS dhe thekson aftësinë e kësaj platforme transplantimi për të zbuluar fenotipet e sëmundjes in vivo.
Pastaj pyetëm se deri në çfarë mase qelizat t-hCO janë të integruara funksionalisht në S1 të miut. S1 te brejtësit merr sinjale të forta sinaptike nga bërthamat bazale dhe posteriore talamike ventrale ipsilaterale, si dhe nga kortekset motorike dhe somatosensore sekondare ipsilaterale, dhe S1 kontralaterale (Fig. 4a). Për të rivendosur modelin e inervimit, ne infektuam hCO me virusin e tërbimit-dG-GFP/AAV-G dhe transplantuam hCO te miu S1 3 ditë më vonë. Ne vumë re shprehje të dendur të GFP në neuronet e S1 ipsilaterale dhe ganglioneve bazale ventrale 7-14 ditë pas transplantimit (Fig. 4b, c). Përveç kësaj, ngjyrosja me antitrupa e shënuesit talamik netrin G1 zbuloi praninë e mbaresave talamike në t-hCO (Fig. 4d, e). Për të vlerësuar nëse këto projeksione aferente mund të nxirrnin përgjigje sinaptike në qelizat t-hCO, ne kryem regjistrime të të gjitha qelizave nga qelizat njerëzore në seksione të mprehta të shtresës talamokortikale. Stimulimi elektrik i S1 të miut, kapsulës së brendshme, lëndës së bardhë, fibrave pranë t-hCO ose aktivizimi optogjenetik i mbaresave talamike që shprehin opsinë në EPSC me latencë të shkurtër të induktuara nga t-hCO në neuronet t-hCO të ekspozuara ndaj antagonistit të receptorit AMPA NBQX. (Fig. 4f, g dhe të dhëna të zgjeruara, Fig. 9a–g). Këto të dhëna tregojnë se t-hCO është integruar anatomikisht në trurin e miut dhe është në gjendje të aktivizohet nga indi pritës i miut.
a, Diagrama skematike e një eksperimenti për ndjekjen e tërbimit. b, GFP dhe shprehja specifike e STEM121 për njeriun midis t-hCO dhe korteksit cerebral të miut (paneli i sipërm). Gjithashtu tregohet shprehja e GFP në bërthamën bazale ipsilaterale ventrale të miut (VB) (poshtë majtas) dhe S1 ipsilaterale (poshtë djathtas). Shiriti i shkallës, 50 µm. Katrorët e kuq përfaqësojnë zonat e trurit ku u morën imazhet. c, përcaktimi sasior i qelizave që shprehin GFP (n = 4 minj). d, e — terminalet talamike të Netrin G1+ në t-hCO. d tregon një seksion koronal që përmban bërthama t-hCO dhe VB. Shiriti i shkallës, 2 mm. e tregon shprehjen e Netrin G1 dhe STEM121 në neuronet t-hCO (majtas) dhe VB (djathtas). Shiriti i shkallës, 50 µm. Vija me pika portokalli tregon kufirin e t-hCO. f, g, Gjurmët aktuale të neuroneve t-hCO pas stimulimit elektrik në miun S1 (f) ose kapsulën e brendshme (g), me (vjollcë) ose pa (e zezë) NBQX (majtas). Amplitudat EPSC me dhe pa NBQX (n = 6 neurone S1, *P = 0.0119; dhe n = 6 neurone të kapsulës së brendshme, **P = 0.0022) (qendër). Përqindja e neuroneve t-hCO që tregojnë EPSC në përgjigje të stimulimit elektrik të miut S1 (f) ose kapsulës së brendshme (g) (djathtas). aCSF, lëng cerebrospinal artificial. h, diagrama skematike e eksperimentit të imazherisë 2P (majtas). Shprehja e GCaMP6s në t-hCO (mes). Shiriti i shkallës, 100 µm. Kalimi i kohës së fluoreshencës së GCaMP6s (djathtas). i, Z-rezultati i fluoreshencës së aktivitetit spontan. j, ilustrim skematik i stimulimit të mustaqeve. k, trajektore fluoreshence 2P të vlerësuara me z në një provë, të përafruara me devijimin e mustaqeve në kohën zero (vijë e ndërprerë) në qelizat shembull. l, përgjigjet e mesatares së popullsisë me rezultatin z të të gjitha qelizave të përafruara me devijimin e mustaqeve në kohën zero (vijë e ndërprerë) (e kuqe) ose pulla kohore të gjeneruara rastësisht (gri). m. Diagrama skematike e eksperimentit në shënimin optik. n, Kurbat e tensionit të papërpunuar nga një qelizë shembull t-hCO gjatë stimulimit me lazer blu ose devijimit të mustaqeve. Shigjetat e kuqe tregojnë majat e para të shkaktuara nga drita (sipër) ose të shkaktuara nga devijimi i mustaqeve (poshtë). Hija gri tregon periudhat e devijimit të mustaqeve. o, Format maksimale të valëve të dritës dhe përgjigjet e devijimit të mustaqeve. p, majat e një përpjekjeje të vetme, të përafruara me devijimin e mustaqeve në qelizat e shembullit. 0 tregon devijimin e mustaqeve (vijë e ndërprerë). q, shkalla e shkrepjes së rezultatit z të mesatarizuar të popullsisë për të gjitha qelizat fotosensitive, të përafruara me devijimin e mustaqeve në kohën zero (vijë e ndërprerë) (e kuqe) ose pulla kohore të gjeneruara rastësisht (gri). r, Përqindja e njësive fotosensitive të moduluara në mënyrë të konsiderueshme nga devijimi i mustaqeve (n = 3 minj) (majtas). Latencia maksimale e rezultatit z (n = 3 minj; n = 5 (jeshile e çelët), n = 4 (jeshile e errët) dhe n = 4 (cian) njësi modulimi të devijimit të mustaqeve për mi) (djathtas). Të dhënat shprehen si mesatare ± devijim standard.
Pastaj pyetëm nëse t-hCO3 mund të aktivizohej nga stimujt ndijor in vivo. Ne transplantuam hCO3 që shprehin treguesit e kalciumit të koduar gjenetikisht GCaMP6 te minjtë S1. Pas 150 ditësh, kryem fotometri me fibra ose imazhe kalciumi me dy fotone (Fig. 4h dhe të dhëna të zgjeruara, Fig. 10a). Zbuluam se qelizat t-hCO3 shfaqën aktivitet ritmik të sinkronizuar (Figura 4i, Të dhëna të zgjeruara, Figura 10b dhe Videoja plotësuese 1). Për të karakterizuar aktivitetin maksimal të t-hCO3, kryem regjistrime elektrofiziologjike jashtëqelizore te minjtë e transplantuar të anestezuar (të dhëna të zgjeruara, Fig. 10c-f). Ne kemi gjeneruar koordinata stereotaksike nga imazhet MRI; kështu, këto njësi të regjistruara përfaqësojnë neurone njerëzore të supozuara, megjithëse vetëm elektrofiziologjia nuk lejon që të përcaktohet një specie origjine. Ne vëzhguam shpërthime të sinkronizuara të aktivitetit (të dhëna të zgjeruara, Fig. 10d). Shpërthimet zgjatën rreth 460 ms dhe u ndanë nga periudha heshtjeje prej rreth 2 s (të dhëna të zgjeruara, Fig. 10d, e). Njësitë individuale qëlluan mesatarisht rreth tre fishekë për shpërthim, që është afërsisht 73% e njësive të regjistruara për shpërthim. Aktivitetet e njësive individuale ishin shumë të korreluara, dhe këto korrelacione ishin më të larta se ato të njësive të identifikuara në kafshë të pavaksinuara të regjistruara në të njëjtat kushte (të dhëna të zgjeruara, Fig. 10f). Për të karakterizuar më tej përgjigjet e shpejta të neuroneve të identifikuara me origjinë njerëzore, ne kryem eksperimente me etiketimin e dritës në minj të anestezuar të transplantuar me hCO që shprehin kanalin e kationit të ndjeshëm ndaj dritës, rodopsinën 2 (hChR2), përmes të cilit neuronet t-hCO njohin me latencë të shkurtër (më pak se 10 ms) në përgjigje të stimujve të dritës blu (Fig. 4m–o). Neuronet t-hCO shfaqën shpërthime të aktivitetit spontan në frekuenca të ngjashme me ato të vëzhguara në imazherinë e kalciumit, si dhe regjistrimet elektrofiziologjike të kryera në t-hCO në mungesë të shënjimit të dritës (të dhëna të zgjeruara, Fig. 10c-g). Nuk u vu re asnjë aktivitet spontan në fazat përkatëse të hCO të regjistruara in vitro. Për të vlerësuar nëse t-hCO mund të aktivizohej nga stimujt ndijor, ne i devijuam shkurtimisht mustaqet e miut larg t-hCO (Fig. 4j,m dhe të dhëna të zgjeruara, Fig. 10h,k). Sipas studimeve të mëparshme8,10, një nëngrup i qelizave t-hCO tregoi aktivitet të rritur në përgjigje të devijimit të mustaqeve, i cili nuk u vu re kur të dhënat u krahasuan me pulla kohore të rastësishme (Fig. 4k–q dhe të dhëna të zgjeruara, Fig. 10h–q). Në të vërtetë, rreth 54% e njësive të vetme të etiketuara me opto treguan një shkallë zgjimi dukshëm më të lartë pas stimulimit të mustaqeve, duke arritur kulmin në rreth 650 ms (Fig. 4r). Të marra së bashku, këto të dhëna sugjerojnë që t-hCO merr inpute funksionale të përshtatshme dhe mund të aktivizohet nga stimujt mjedisorë.
Pastaj ne hetuam nëse t-hCO mund të aktivizonte qarqet te minjtë për të kontrolluar sjelljen. Së pari ne hetuam nëse aksonet e neuroneve t-hCO projektohen në indet përreth miut. Ne infektuam hCO me një lentivirus që kodon hChR2 të shkrirë me EYFP (hChR2-EYFP). Pas 110 ditësh, ne vumë re shprehjen e EYFP në rajonet kortikale ipsilaterale, duke përfshirë korteksin dëgjimor, motorik dhe somatosensor, si dhe në rajonet subkortikale, duke përfshirë striatumin, hipokampusin dhe talamusin (Fig. 5a). Për të vlerësuar nëse këto projeksione eferente mund të nxirrnin përgjigje sinaptike në qelizat e miut, ne aktivizuam optikisht qelizat t-hCO që shprehin hChR2-EYFP duke regjistruar qelizat e korteksit cerebral të miut në seksione të mprehta të trurit. Aktivizimi i aksoneve t-hCO me dritë blu shkaktoi EPSC me latencë të shkurtër në neuronet e korteksit piramidal të miut, të cilat u bllokuan nga NBQX (Fig. 5b–g). Përveç kësaj, këto përgjigje mund të bllokohen nga tetrodotoksina (TTX) dhe të rivendosen nga 4-aminopiridina (4-AP), duke sugjeruar që ato të jenë shkaktuar nga lidhjet monosinaptike (Fig. 5e).
a, Diagrama skematike e gjurmimit të aksonit (majtas). Shprehja e t-hCO EYFP (djathtas). Shiriti i shkallës, 100 µm. A1, korteksi dëgjimor, ACC, korteksi cingulate anterior, d. striatum, striatum dorsal, HPC, hipokampus; Diafragma, septumi lateral, mPFC, korteksi prefrontal medial, piri, korteksi piriform, v. striatum, striatumi ventral, VPM, bërthama ventropostomediale e talamusit, VTA, rajoni tegmental ventral. Katrorët e kuq përfaqësojnë zonat e trurit ku u morën imazhet. b, Diagrama skematike e eksperimentit të stimulimit. c, d, Shembuj të përgjigjes së fotorrymës së induktuar nga drita blu (sipër) dhe tensionit (poshtë) në qelizat njerëzore (c) EYFP+ t-hCO ose miu (d). e, f, Gjurmët aktuale të neuroneve të miut pas stimulimit me dritë blu të aksoneve t-hCO me TTX dhe 4-AR (jeshile), TTX (gri) ose aCSF (e zezë) (e), me (vjollcë) ose pa (e zezë) ) ) NBQX (e). g, latenca e përgjigjeve të shkaktuara nga drita blu në qelizat e miut (n = 16 qeliza); shiritat horizontalë tregojnë latencën mesatare (7.13 ms) (majtas). Amplituda e EPSC-ve të evokuara nga drita të regjistruara me ose pa NBQX (n = 7 qeliza; ***P < 0.0001) (mes). Amplituda e EPSC-ve të evokuara nga drita të regjistruara me ose pa NBQX (n = 7 qeliza; ***P < 0.0001) (mes). Amplituda in the world EPSC, e regjistruar me ose pa NBQX (n = 7 kletok; ***P <0,0001) (në qendër). Amplituda e EPSC-ve të induktuara nga drita të regjistruara me ose pa NBQX (n = 7 qeliza; ***P < 0.0001) (qendër).使用或不使用NBQX 记录的光诱发EPSC 的振幅（n = 7 个细胞；***P <0.0001）（中）使用或不使用NBQX 记录的光诱发EPSC 的振幅（n = 7 个细胞；***P <0.0001）（中） Amplituda in the world EPSC, e regjistruar me ose pa NBQX (n = 7 kletok; ***P <0,0001) (në qendër). Amplituda e EPSC-ve të induktuara nga drita të regjistruara me ose pa NBQX (n = 7 qeliza; ***P < 0.0001) (qendër).Përqindja e qelizave të miut që tregojnë EPSC që i përgjigjen dritës blu (djathtas). h, Diagrama skematike e një detyre sjelljeje. d0, dita 0. i. Performanca e kafshëve shembullore në ditën 1 (majtas) ose ditën 15 (djathtas) të trajnimit. Numri mesatar i lëpirjeve të kryera në ditën 1 (majtas) ose ditën 15 (djathtas në qendër) (n = 150 prova me dritë blu, n = 150 prova me dritë të kuqe; ***P < 0.0001). Numri mesatar i lëpirjeve të kryera në ditën 1 (majtas) ose ditën 15 (djathtas në qendër) (n = 150 prova me dritë blu, n = 150 prova me dritë të kuqe; ***P < 0.0001). Среднее количество облизываний, выполненных во ditë 1 (слева) ose ditë 15 (në центре справа) (n = 150 përdorim me симним светом, n = 150 испытаний со красным светом; ***P <0,000). Numri mesatar i lëpirjeve të kryera në ditën 1 (majtas) ose ditën 15 (qendër djathtas) (n = 150 prova me dritë blu, n = 150 prova me dritë të kuqe; ***P < 0.0001).第1 天（左）或第15 天（右中）执行的平均舔次数（n = 150 次蓝光试验，n =次红光试验；***P <0.0001）.第1 天（左）或第15 天（右中）执行的平均舔次数（n = 150 次蓝光试验，n =次红光试验；***P <0,001 Среднее количество облизываний, выполненных во ditë 1 (слева) ose ditë 15 (në центре справа) (n = 150 përdorim me симним светом, n = 150 испытаний со красным светом; ***P <0,000). Numri mesatar i lëpirjeve të kryera në ditën 1 (majtas) ose ditën 15 (qendër djathtas) (n = 150 prova me dritë blu, n = 150 prova me dritë të kuqe; ***P < 0.0001).Lëpirjet kumulative për provat me dritë të kuqe dhe blu në ditën 1 (qendër majtas) ose ditën 15 (djathtas). NS, jo domethënëse. j,k, Karakteristikat e sjelljes së të gjitha kafshëve të transplantuara me t-hCO që shprehin hChR2-EYFP (j) ose fluorofor kontrolli (k) në ditën 1 ose 15 (hChR2-EYFP: n = 9 minj, ** P = 0.0049; kontrolli: n = 9, P = 0.1497). l, Evolucioni i pikëzimit të preferencës (n = 9 hChR2, n = 9 kontroll; **P < 0.001, ***P < 0.0001). l, Evolucioni i pikëzimit të preferencës (n = 9 hChR2, n = 9 kontroll; **P < 0.001, ***P < 0.0001). l, Эволюция показателя предпочтения (n = 9 hChR2, n = 9 kontrollьnых; **P <0,001, ***P <0,0001). l, Evolucioni i pikëzimit të preferencës (n = 9 hChR2, n = 9 kontrolle; **P < 0.001, ***P < 0.0001). l，偏好评分的演变（n = 9 hChR2，n = 9 对照；**P <0.001;***P <0.0001）。 l，偏好评分的演变（n = 9 hChR2，n = 9 对照；**P <0.001;***P <0.0001）。 l, Эволюция показателей предпочтения (n = 9 hChR2, n = 9 kontrollues; **P <0,001, ***P <0,0001). l, Evolucioni i pikëve të preferencës (n = 9 hChR2, n = 9 kontrolle; **P < 0.001, ***P < 0.0001).m, shprehja e FOS në përgjigje të aktivizimit optogjenetik të t-hCO në S1. Tregohen imazhe të shprehjes së FOS (majtas) dhe përcaktimi sasior (n = 3 për grup; *P < 0.05, **P < 0.01 dhe ***P < 0.001) (djathtas). Tregohen imazhe të shprehjes së FOS (majtas) dhe përcaktimi sasior (n = 3 për grup; *P < 0.05, **P < 0.01 dhe ***P < 0.001) (djathtas). Pokazanы izobrazeniya эkspressii FOS (sleva) dhe përcaktimi koliчестe (n = 3 në grup; * P <0,05, ** P <0,01 dhe *** P <0,001) (sdrejta). Imazhet e shprehjes së FOS (majtas) dhe përcaktimi sasior (n = 3 për grup; *P<0.05, **P<0.01 dhe ***P<0.001) janë paraqitur (djathtas).显示了FOS 表达（左）和量化（每组n = 3；*P <0,05、**P <0,01 和***P <0,001）（右显示了FOS 表达（左）和量化（每组n = 3；*P <0,05、**P <0,01 和***P <0,001）（右 Pokazanы izobrazeniya эkspressii FOS (sleva) dhe përcaktimi koliчестe (n = 3 në grup; * P <0,05, ** P <0,01 dhe *** P <0,001) (sdrejta). Imazhet e shprehjes së FOS (majtas) dhe përcaktimi sasior (n = 3 për grup; *P<0.05, **P<0.01 dhe ***P<0.001) janë paraqitur (djathtas).Shiriti i shkallës, 100 µm. Të dhënat shprehen si gabim mesatar ± standard i BLA-së, bajames bazolaterale, MDT-së, bërthamës talamike dorsomediale, PAG-së, grisë periakueduktale.
Së fundmi, pyetëm nëse t-hCO3 mund të modulonte sjelljen e minjve. Për ta testuar këtë, ne transplantuam hCO3 që shpreh hChR2-EYFP në S1, dhe 90 ditë më vonë, ne implantuam fibra optike në t-hCO3 për dhënien e dritës. Pastaj i stërvitëm minjtë me një paradigmë të modifikuar të kushtëzimit operant (Fig. 5h). Ne i vendosëm kafshët në një dhomë testimi sjelljeje dhe aplikuam rastësisht stimuj lazeri blu (473 nm) dhe të kuq (635 nm) 5 sekondash. Kafshët morën një shpërblim uji nëse lëpinin gjatë stimulimit me dritë blu, por nuk lëpinin gjatë stimulimit me dritë të kuqe. Në ditën e parë të stërvitjes, kafshët nuk treguan ndryshim në lëpirje kur stimuloheshin me dritë blu ose të kuqe. Megjithatë, në ditën e 15-të, kafshët e transplantuara me hCO3 që shprehin hChR2-EYFP treguan lëpirje më aktive kur stimuloheshin me dritë blu krahasuar me stimulimin me dritë të kuqe. Këto ndryshime në sjelljen e lëpirjes nuk u vunë re te kafshët kontrolluese të transplantuara me hCO që shprehnin fluoroforin e kontrollit (shkalla e suksesit në të nxënë: hChR2 89%, EYFP 0%, Figura 5i-1 dhe Videoja Plotësuese 2). Këto të dhëna sugjerojnë që qelizat t-hCO mund të aktivizojnë neuronet e miut për të stimuluar sjelljen e kërkimit të shpërblimit. Për të zbuluar se cilat qarqe nervore t-hCO të miut mund të jenë të përfshira në këto ndryshime të sjelljes, ne aktivizuam optogjenetikisht t-hCO te kafshët e trajnuara dhe indet e mbledhura 90 minuta më vonë. Imunohistokimia zbuloi shprehjen e proteinës FOS të varur nga aktiviteti në disa rajone të trurit të përfshira në sjelljen e motivuar, duke përfshirë korteksin prefrontal medial, talamusin medial dhe lëndën gri periakueduktale, e cila u shpreh ose te kafshët e kontrollit të pastimuluara ose te kafshët. oriz. 5m). Të marra së bashku, këto të dhëna sugjerojnë që t-hCO mund të modulojë aktivitetin neuronal të miut për të nxitur sjelljen.
Organoidet nervore përfaqësojnë një sistem premtues për studimin e zhvillimit dhe sëmundjeve njerëzore in vitro, por ato janë të kufizuara nga mungesa e lidhjeve midis qarqeve që ekzistojnë in vivo. Ne kemi zhvilluar një platformë të re në të cilën kemi transplantuar hCO në S1 të minjve të hershëm pas lindjes me imunitet të kompromentuar për të studiuar zhvillimin dhe funksionin e qelizave njerëzore in vivo. Ne kemi treguar se t-hCO zhvillon lloje qelizash të pjekura që nuk janë vërejtur in vitro28 dhe se t-hCO është i integruar anatomikisht dhe funksionalisht në trurin e brejtësve. Integrimi i t-hCO në qarqet nervore të brejtësve na lejoi të krijojmë një lidhje midis aktivitetit qelizor njerëzor dhe sjelljes së studiuar të kafshëve, duke treguar se neuronet t-hCO mund të modulojnë aktivitetin neuronal të miut për të nxitur përgjigjet sjelljesore.
Platforma që përshkruajmë ka disa përparësi krahasuar me hulumtimet e mëparshme mbi transplantimin e qelizave njerëzore në trurin e brejtësve. Së pari, ne transplantuam hCO3 në korteksin në zhvillim të minjve të hershëm pas lindjes, gjë që mund të lehtësojë integrimin anatomik dhe funksional. Së dyti, monitorimi i t-hCO3 MRI na lejoi të studiojmë pozicionin dhe rritjen e shartimit në kafshët e gjalla, duke na lejuar të kryejmë studime afatgjata shumëkafshësh dhe të përcaktojmë besueshmërinë e disa linjave qelizore hiPS. Së fundmi, ne transplantuam organoide të paprekura, në vend të pezullimeve të izoluara të qelizave të vetme, të cilat janë më pak shkatërruese për qelizat njerëzore dhe mund të nxisin integrimin dhe gjenerimin e neuroneve të korteksit njerëzor në trurin e minjve.
Ne pranojmë se pavarësisht përparimeve në këtë platformë, kufizimet kohore, hapësinore dhe ndër-specie parandalojnë formimin e qarqeve nervore njerëzore me besueshmëri të lartë, edhe pas transplantimit në një fazë të hershme të zhvillimit. Për shembull, nuk është e qartë nëse aktiviteti spontan i vërejtur në t-hCO përfaqëson një fenotip zhvillimor të ngjashëm me aktivitetin ritmik të vërejtur gjatë zhvillimit kortikal, apo nëse është për shkak të mungesës së llojeve të qelizave shtypëse të pranishme në t-hCO. Në mënyrë të ngjashme, nuk është e qartë se deri në çfarë mase mungesa e laminimit në t-hCO ndikon në lidhjen e zinxhirit30. Puna e ardhshme do të përqendrohet në integrimin e llojeve të tjera të qelizave si mikroglia njerëzore, qelizat endoteliale njerëzore dhe përmasat e ndryshme të interneuroneve GABAergjike siç tregohet duke përdorur montimin 6 in vitro, si dhe në kuptimin se si integrimi dhe përpunimi nervor mund të ndodhë në nivele të ndryshuara transkriptimi, sinaptike dhe sjelljeje të t-hCO në qelizat e marra nga pacientët.
Në përgjithësi, kjo platformë in vivo përfaqëson një burim të fuqishëm që mund të plotësojë zhvillimin e trurit të njeriut dhe kërkimin e sëmundjeve in vitro. Ne parashikojmë që kjo platformë do të na lejojë të zbulojmë fenotipe të reja në nivel fijesh në qeliza të nxjerra nga pacientët, të cilat përndryshe do të ishin të pakapshme, dhe të testojmë strategji të reja terapeutike.
Ne gjeneruam hCO2.5 nga qelizat HiPS siç është përshkruar më parë. Për të filluar prodhimin e hCO nga qelizat hiPS të kultivuara në shtresa ushqyese, kolonitë e paprekura të qelizave hiPS u hoqën nga enët e kulturës duke përdorur dispase (0.35 mg/mL) dhe u transferuan në kultura plastike me ngjitje ultra të ulët që përmbanin enë me medium kulture qelizore hiPS. (Corning) të plotësuara me dy frenues SMAD dorsomorfinë (5 μM; P5499, Sigma-Aldrich) dhe SB-431542 (10 μM; 1614, Tocris) dhe frenues ROCK Y-27632 (10 μM; S1049, Selleckchem). Gjatë 5 ditëve të para, mediumi qelizor hiPS ndryshohej çdo ditë dhe u shtuan dorsomorfinë dhe SB-431542. Në ditën e gjashtë në pezullim, sferoidet nervore u transferuan në një medium nervor që përmbante neurobasal-A (10888, Life Technologies), suplement B-27 pa vitaminë A (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies), penicilinë dhe streptomicinë (1:100, Life Technologies) dhe u plotësuan me faktorin e rritjes epidermale (EGF; 20 ng ml−1; R&D Systems) dhe faktorin e rritjes së fibroblasteve 2 (FGF2; 20 ng ml−1; R&D Systems) deri në ditën e 24-të. Nga dita e 25-të deri në ditën e 42-të, mediumi u plotësua me faktor neurotrofik të derivuar nga truri (BDNF; 20 ng ml−1, Peprotech) dhe neurotrofinë 3 (NT3; 20 ng ml−1; Peprotech) me ndryshime të mediumit çdo ditë tjetër. Në ditën e gjashtë në pezullim, sferoidet nervore u transferuan në një medium nervor që përmbante neurobasal-A (10888, Life Technologies), suplement B-27 pa vitaminë A (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies), penicilinë dhe streptomicinë (1:100, Life Technologies) dhe u plotësuan me faktorin e rritjes epidermale (EGF; 20 ng ml−1; R&D Systems) dhe faktorin e rritjes së fibroblasteve 2 (FGF2; 20 ng ml−1; R&D Systems) deri në ditën e 24-të. Nga dita e 25-të deri në ditën e 42-të, mediumi u plotësua me faktor neurotrofik të derivuar nga truri (BDNF; 20 ng ml−1, Peprotech) dhe neurotrofinë 3 (NT3; 20 ng ml−1; Peprotech) me ndryshime të mediumit çdo ditë tjetër.Në ditën e gjashtë në pezullim, sferoidet nervore u transferuan në një medium nervor që përmbante Neurobasal-A (10888, Life Technologies), suplement B-27 pa vitaminë A (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies), penicilinë.и streptomicin (1:100, Life Technologies) dhe plotësues эпидермальным фактором роста (EGF; 20 ng/ml; R&D Systems) и фактор роста фибробластов 2 (FGF2; 20 ng/ml; R&D Systems) deri në 24-. dhe streptomicinë (1:100, Life Technologies) dhe të plotësuar me faktor rritjeje epidermale (EGF; 20 ng/ml; R&D Systems) dhe faktor rritjeje të fibroblasteve 2 (FGF2; 20 ng/ml; R&D Systems) deri në ditën e 24-të.Nga dita 25 deri në ditën 42, faktori neurotrofik i derivuar nga truri (BDNF; 20 ng ml-1, Peprotech) dhe neurotrofina 3 (NT3; 20 ng ml-1, Peprotech) u shtuan në medium, duke e ndryshuar atë çdo ditë tjetër.在悬浮的第6 天，将神经球体转移到含有neurobasal-A（10888，Life Technologies）、不含维A7补充剂 (12587，Life Technologies）、GlutaMax（1:100，Life Technologies）、青霉素的神经培养基中和10Life Teknologjitë）并辅以表皮生长因子（EGF；20 ng ml-1；R&D Systems）和成纤维细胞生长因子2（FGF2；20ng ml-1；R&D Systems）直至第24天。在 悬浮 的 第 第 6 天 将 神经 球体 转移 含有 含有 neurobasal-a （10888 ， 画 画 Technologies） b-27 补充剂 （12587 ， Life Technologies） Glutamax （1: 100 ， Life TechNOGIS青霉素 的 神经 培养 基 培养 基 中 10 ， Teknologjitë e Jetës） 表皮 生长 因子 (((20 ng ml-1) Sistemet e kërkimit dhe zhvillimit) Në 6-й день суспензии на нейросферы были переведены во добавку, содержащую нейробазал-А (10888, Life Technologies), Добавку В-27 без витамин А (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies), пеници стрептомицин (1:100, Life Technologies) со добавлением эпидермального фактора роста (EGF; 20 ng ml-1; R&D Systems) и фактора роста фибробластов 2 (FGF2; 20 ng ml-1) 1; Në ditën e 6-të, pezullimet e neurosferave u zëvendësuan me një suplement që përmbante neurobasal-A (10888, Life Technologies), suplement B-27 pa vitaminë A (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies), streptomicinë të neutralizuar me penicilinë (1:100, Life Technologies) të plotësuar me faktor rritjeje epidermale (EGF; 20 ng ml-1; R&D Systems) dhe faktor rritjeje të fibroblasteve 2 (FGF2; 20 ng ml-1) 1; Sistemet e R&D) deri në 24 ditë. Sistemet e Kërkimit dhe Zhvillimit) deri në ditën e 24-të.Nga dita 25 deri në ditën 42, faktori neurotrofik i derivuar nga truri (BDNF; 20 ng ml-1, Peprotech) dhe faktori neurotrofik 3 (NT3; 20 ng ml-1, Peprotech) u shtuan në mjedisin e kulturës çdo dy ditë. Ndërrimi i mjedisit bëhet një herë.Duke filluar nga dita e 43-të, hCO2 u mbajt në një mjedis neurobasal-A pa shtesa (NM; 1088022, Thermo Fisher) me ndërrim të mjedisit çdo 4-6 ditë. Për të marrë hCO2 nga qelizat hiPS të kultivuara në kushte pa ushqyes, qelizat hiPS u inkubuan me Accutase (AT-104, Innovate Cell Technologies) në 37°C për 7 minuta, u disociuan në qeliza të vetme dhe u vendosën në pllaka AggreWell 800 (34815, STEMCELL Technologies) me një dendësi prej 3 × 106 qeliza të vetme për pus në mjedisin Essential 8 të plotësuar me frenuesin ROCK Y-27632 (10 μM; S1049, Selleckchem). Pas 24 orësh, media në puse u pipetua lart e poshtë në media që përmbante media Essential 6 (A1516401, Life Technologies) të plotësuar me dorsomorfinë (2.5 μM; P5499, Sigma-Aldrich) dhe SB-431542 (10 μM; 1614). , Tocrida). Nga dita 2 deri në 6, media Essential 6 zëvendësohej çdo ditë me dorsomorfinë dhe suplementin SB-431542. Nga dita e gjashtë, pezullimet e neurosferave u transferuan në median neurobazale dhe u mirëmbajtën siç përshkruhet më sipër.
Të gjitha procedurat e kafshëve u kryen në përputhje me udhëzimet e kujdesit për kafshët, të miratuara nga Komiteti Administrativ i Kujdesit për Kafshët i Laboratorit të Universitetit Stanford (APLAC). Minjtë shtatzënë eutimikë RNU (rnu/+) u blenë (Laboratorët Charles River) ose u strehuan. Kafshët u mbajtën në një cikël 12-orësh dritë-errësirë ​​me ushqim dhe ujë ad libitum. Këlyshët e minjve të zhveshur (FOXN1–/–) të moshës tre deri në shtatë ditë u identifikuan nga rritja e mustaqeve të papjekura para skartimit. Këlyshët (meshkuj dhe femra) u anestezuan me 2-3% izofluran dhe u vendosën në një kornizë stereotaksike. Një trepanim i kafkës me një diametër prej afërsisht 2-3 mm mbi S1 u krye duke ruajtur integritetin e dura mater. Pastaj përdorni një gjilpërë 30-G (afërsisht 0.3 mm) pak jashtë kraniotomisë për të shpuar dura-n. Pastaj aplikoni HCO3 në një parafilm të hollë 3×3 cm dhe hiqni mjedisin e tepërt. Duke përdorur një shiringë Hamilton të bashkangjitur në një gjilpërë 23 G, 45°, tërhiqni butësisht hCO3 në skajin më distal të gjilpërës. Pastaj instaloni shiringën në pompën e shiringës të lidhur me pajisjen stereotaksike. Pastaj vendosni majën e gjilpërës mbi një vrimë shpimi me gjerësi 0.3 mm të bërë më parë në dura (z = 0 mm) dhe ngushtoni shiringën 1-2 mm (z = afërsisht –1.5 mm) derisa gjilpëra të jetë midis dura mater A. Formohet një vulë e dendur. Pastaj ngrini shiringën në qendër të sipërfaqes kortikale në z = -0.5 mm dhe injektoni hCO3 me një shpejtësi prej 1-2 µl në minutë. Pas përfundimit të injektimit të hCO3, gjilpëra tërhiqet me një shpejtësi prej 0.2-0.5 mm në minutë, lëkura qepet dhe këlyshi vendoset menjëherë në një jastëk të ngrohtë ngrohës deri në shërim të plotë. Disa kafshë u transplantuan në mënyrë bilaterale.
Të gjitha procedurat e kujdesit ndaj kafshëve u kryen në përputhje me udhëzimet e kujdesit ndaj kafshëve të miratuara nga APLAC i Universitetit Stanford. Minjtë (më shumë se 60 ditë pas transplantimit) u induktuan me anestezi 5% izoflurani dhe u anestezuan me 1-3% izofluran gjatë imazherisë. Për vizualizim, u përdor një skaner horizontal 7 Tesla me mbrojtje aktive për vrimat e shpimit Bruker (Bruker Corp.) me një sistem gradient të International Electric Company (IECO), një insert gradient të mbrojtur me një diametër të brendshëm prej 120 mm (600 mT/m, 1000 T/m/s) duke përdorur AVANCE.III, aftësi RF me shumë spirale tetë-kanalëshe dhe shumë-bërthamëshe, dhe platformën shoqëruese Paravision 6.0.1. Regjistrimi u krye duke përdorur një spirale RF volumetrike të çkypur në mënyrë aktive me një diametër të brendshëm prej 86 mm dhe një spirale RF me katër kanale të krioftohur vetëm për marrje. Turbo-RARE 2D Aksial (koha e përsëritjes = 2500 ms, koha e jehonës = 33 ms, 2 mesatare) me 16 kapje prerjesh, trashësi prerjeje 0.6–0.8 mm, që përmban 256 × 256 mostra. Sinjalet u morën duke përdorur një spirale RF volumetrike të një marrësi-transmetuesi kuadraturë me një diametër të brendshëm prej 2 cm (Rapid MR International, LLC). Së fundmi, përdorni funksionet e integruara të vlerësimit të sipërfaqes Imaris (BitPlane) për renderimin 3D dhe analizën e vëllimit. Një transplant i suksesshëm u përcaktua si ai në të cilin zona të sinjalit të vazhdueshëm MRI të ponderuar T2 u formuan në hemisferën e transplantuar. Refuzimi i transplantit u përcaktua si një transplant që nuk prodhoi zona të sinjalit të vazhdueshëm MRI të ponderuar T2 në hemisferën e transplantuar. t-hCO3 subkortikal u përjashtua nga analiza pasuese.
Për të shprehur në mënyrë të qëndrueshme GCaMP6s në hCO3 për imazhe me dy fotone të kalciumit, qelizat hiPS u infektuan me pLV[Exp]-EF1a::GcaMP6s-WPRE-Puro, e ndjekur nga përzgjedhja e antibiotikëve. Shkurtimisht, qelizat u disociuan me EDTA dhe u pezulluan në 1 ml medium Essential 8 me një dendësi prej afërsisht 300,000 qelizash në prani të polibrenit (5 μg/ml) dhe 15 μl virus. Qelizat më pas u inkubuan në pezullim për 60 minuta dhe u mbjellën në një dendësi prej 50,000 qelizash për pus. Pas bashkimit, qelizat u trajtuan me 5-10 μg ml-1 puromicinë për 5-10 ditë ose derisa të shfaqeshin koloni të qëndrueshme. Infeksioni akut me hCO u krye siç është përshkruar më parë5 me disa modifikime. Shkurtimisht, transferoni ditën 30-45 të hCO3 në tuba mikrocentrifugësh Eppendorf 1.5 ml që përmbajnë 100 µl medium nervor. Pastaj hiqen afërsisht 90 µl të mjedisit, në tub shtohen 3-6 µl lentivirus me titër të lartë (nga 0.5 x 108 në 1.2 x 109) dhe hCO3 transferohet në inkubator për 30 minuta. Pastaj shtoni 90-100 µl të mjedisit në secilin tub dhe kthejini tubat në inkubator gjatë natës. Të nesërmen, transferoni hCO3 në mjedis nervor të freskët në pllaka me ngjitje të ulët. Pas 7 ditësh, hCO3 u transferua në pllaka me fund qelqi me 24 puseta për vizualizim dhe vlerësim të cilësisë së infeksionit. pLV[Exp]-SYN1::EYFP-WPRE dhe pLV[Exp]-SYN1::hChR2-EYFP-WPRE u gjeneruan nga VectorBuilder. Lentivirusi përdoret në shumicën e eksperimenteve sepse është i integruar në gjenomën pritëse, duke lejuar shprehjen e gjenit raportues në linjat qelizore të infektuara. Për ndjekjen e tërbimit, dita 30-45 hCO u bashkë-infektua me rabies-ΔG-eGFP dhe AAV-DJ-EF1a-CVS-G-WPRE-pGHpA (plazmidi #67528, Addgene), u larë plotësisht për 3 ditë dhe u transplantua te minjtë në S1 dhe u mbajt in vivo për 7-14 ditë.
Për imunocitokimi, kafshët u anestezuan dhe u perfuzuan në mënyrë transkardiale me PBS të ndjekur nga 4% paraformaldehidë (PFA në PBS; Electron Microscopy Sciences). Truri u fiksua në 4% PFA për 2 orë ose gjatë natës në 4°C, u kriokonservuan në 30% sukrozë në PBS për 48-72 orë dhe u futën në 1:1, 30% sukrozë: OCT (Tissue-Tek OCT Compound 4583, Sakura Finetek) dhe prerjet koronale u bënë në 30 µm duke përdorur një kriostat (Leica). Për imunohistokiminë e prerjeve të trasha, kafshët u perfuzuan me PBS dhe truri u disektua dhe u sekcionua në mënyrë koronare në 300-400 µm duke përdorur një vibratom (Leica) dhe prerjet u fiksuan me 4% PFA për 30 minuta. Pastaj, krioseksionet ose prerjet e trasha u lanë me PBS, u bllokuan për 1 orë në temperaturë ambienti (10% serum normal gomari (NDS) dhe 0.3% Triton X-100 i holluar në PBS) dhe u bllokuan me tretësirë ​​bllokuese në 4°C. – Inkubacioni Krioseksionet u inkubuan gjatë natës dhe prerjet e trasha u inkubuan për 5 ditë. Antitrupat parësorë të përdorur ishin: anti-NeuN (miu, 1:500; ab104224, abcam) anti-CTIP2 (miu, 1:300; ab18465, abcam), anti-GFAP (lepuri, 1:1,000; Z0334, Dako), anti-GFP (pula, 1:1,000; GTX13970, GeneTex), anti-HNA (miu, 1:200; ab191181, abcam), anti-NeuN (lepuri, 1:500; ABN78, Millipore), anti-PDGFRA (lepuri, 1:200; sc-338, Santa Cruz), anti-PPP1R17 (lepuri, 1:200; HPA047819, Antitrupat Atlas), anti-RECA-1 (miu, 1:50; ab9774, abcam), anti-SCG2 (lepuri, 1:100; 20357-1-AP, Proteintech), anti-SOX9 (dhi, 1:500; AF3075, R&D Systems), Netrin G1a (dhi, 1:100; AF1166, R&D Systems), anti-STEM121 (miu, 1:200; Y40410, Takara Bio), anti-SATB2 (miu, 1:50; ab51502, abcam), anti-GAD65/67 (lepuri, 1:400; ABN904, Millipore) dhe anti-IBA1 (dhi, 1:100; ab5076, abcam). Antitrupat parësorë të përdorur ishin: anti-NeuN (miu, 1:500; ab104224, abcam) anti-CTIP2 (miu, 1:300; ab18465, abcam), anti-GFAP (lepuri, 1:1,000; Z0334, Dako), anti -GFP (pula, 1:1,000; GTX13970, GeneTex), anti-HNA (miu, 1:200; ab191181, abcam), anti-NeuN (lepuri, 1:500; ABN78, Millipore), anti-PDGFRA (lepuri, 1:200; sc-338, Santa Cruz), anti-PPP1R17 (lepuri, 1:200; HPA047819, Antitrupat Atlas), anti-RECA-1 (miu, 1:50; ab9774, abcam), anti-SCG2 (lepuri 1:100; 20357-1-AP, Proteintech), anti-SOX9 (dhi, 1:500; AF3075, R&D Systems), Netrin G1a (dhi, 1:100; AF1166, R&D Systems), anti-STEM121 (miu 1:200; Y40410, Takara Bio), anti-SATB2 (miu 1:50; ab51502, abcam), anti-GAD65/67 (lepuri 1:400; ABN904, Millipore) dhe anti-IBA1 (dhi, 1:100; ab5076, abcam). Anti-NeuN (mыshinыe, 1:500; ab104224, abcam), anti-CTIP2 (крысиные, 1:300; ab18465, abcam), anti-GFAP (1:010), anti-GFAP (1:030), -GFP (kurica, 1:1000; GTX13970, GeneTex), anti-HNA (mышь, 1:200; ab191181, abcam), anti-NeuN (krolik, 1:500; ABN78, Millipore), anti-PDGFRA (кролик20, 3:1: Санта-Круз), anti-PPP1R17 (crolik, 1:200; HPA047819, Atlas Antitrupa), anti-RECA-1 (mыshь, 1:50; ab9774, abcam anti-SCG2 (crolik , 1:100; 20357-1-tech, SO-AP, 1:500; AF3075, R&D Systems), нетрин G1a (козий, 1:100; AF1166, R&D Systems), anti-STEM121 (мышиный , 1:200; Y40410, Takara Bio), анти-SATB2,1:5; anti-GAD65/67 (krolik, 1:400; ABN904, Millipore) dhe anti-IBA1 (koza, 1:100; ab5076, abkam). Antitrupat kryesorë të përdorur ishin: anti-NeuN (miu, 1:500; ab104224, abcam), anti-CTIP2 (miu, 1:300; ab18465, abcam), anti-GFAP (lepuri, 1:1000; Z0334, Dako), anti-GFP (pula, 1:1000; GTX13970, GeneTex), anti-HNA (miu, 1:200; ab191181, abcam), anti-NeuN (lepuri, 1:500; ABN78, Millipore), anti-PDGFRA (lepuri, 1:200; sc-338, Santa Cruz), anti-PPP1R17 (lepuri, 1:200; HPA047819, Antitrupat Atlas), anti-RECA-1 (miu, 1:50; ab9774, abcam), anti-SCG2 (lepuri, 1:100; 20357-1-AP, Proteintech), anti-SOX9 (dhi, 1:500; AF3075, R&D Systems), netrina G1a (dhi, 1:100; AF1166, R&D Systems), anti-STEM121 (miu, 1:200; Y40410, Takara Bio), anti-SATB2 (miu, 1:50; ab51502, abcam), anti-GAD65/67 (lepuri, 1:400; ABN904, Millipore) dhe anti-IBA1 (dhi, 1:100; ab5076, abkam).使用的一抗是：抗NeuN（小鼠，1:500；ab104224，abcam）抗CTIP2（大鼠，1:3 00；ab18465，abcam），抗GFAP（兔，1:1000；Z0334，Dako），抗-GF P（鸡，1:1000；GTX13970，GeneTex），抗HNA（小鼠，1:200；ab1911 81,abcam)，抗NeuN（兔，1:500；ABN78，Milipore），抗PDGFRA（兔， 1:200；sc-338，Santa Cruz），抗PPP1R17（兔，1:200；HPA047819，Atlas抗体），抗RECA-1（小鼠，1:50；ab9774,abcam），抗SCG2（兔）, 1:100;20357-1-AP，Proteintech），抗SOX9（山羊，1:500；AF3075，R&D Systems），Netrin G1a（山羊（山羊，，山羊，1:10， Sistemet，抗STEM121（小鼠, 1:200;使用的一抗是：抗NeuN（小鼠，1:500；ab104224，abcam）抗CTIP2（大鼠，1 :300；ab18465,abcam），抗GFAP（兔，1:1000；Z0334，Dako），抗-GFP（鸡，1:1000；GTX13970，GeneTex），抗HNA（小鼠，1:200；ab 191181,abcam,,抗NeuN（兔,1:500,ABN78,Millipore,弔,抗1: 200；sc-338，Santa Cruz），抗PPP1R17（兔，1:200；HPA047819，Atlas抗体），抗RECA-1（小鼠，1:50；ab9774，abcam），抗SCG2 100；20357-1-AP，Proteintech），抗SOX9（山羊，1:500；AF3075，R&D Systems），Netrin G1a（山羊，1:110（山羊，1:110（ Sistemet) 1:20, ;Y40410, Takara Bio), anti-SATB2 (miu, 1:50; ab51502, abcam), anti-GAD65/67 (lepuri, 1:400; ABN904, Millipore) dhe anti-IBA1 (dhia, 1:100; ab5076, abcam).Antitrupat kryesorë të përdorur ishin: anti-NeuN (miu, 1:500; ab104224, abcam), anti-CTIP2 (miu, 1:300; ab18465, abcam), anti-GFAP (lepuri, 1:1000; Z0334, Dako). , anti-GFP (pulë, 1:1000; GTX13970, GeneTex), anti-HNA (mi, 1:200; ab191181, abcam), anti-NeuN (lepur, 1:500; ABN78, Millipore), anti-PDGFRA (lepur, 1:200; sc-338, Santa Cruz), anti-PPP1R17 (lepur, 1:200; HPA047819, antitrup Atlas), anti-RECA-1 (mi, 1:50; ab9774, abcam), anti-SCG2 (lepur), 1:100;20357-1-AP, Proteintech), anti-SOX9 (koza, 1:500; AF3075, R&D Systems), Netrin G1a (koza, 1:100; AF1166, R&D Systems), anti -STEM121 (mышь, 1:2020,Tarak, 1:2020, YARA; (mыshь, 1:50; ab51502, abcam), anti-GAD65/67 (krolik, 1:400; ABN904, Millipore) dhe anti-IBA1 (koza, 1:100; ab5076, abkam). 20357-1-AP, Proteintech), anti-SOX9 (dhi, 1:500; AF3075, R&D Systems), Netrin G1a (dhi, 1:100; AF1166, R&D Systems), anti-STEM121 (mi, 1:200; Y40410, Takara Bio), anti-SATB2 (mi, 1:50; ab51502, abcam), anti-GAD65/67 (lepur, 1:400; ABN904, Millipore), dhe anti-IBA1 (dhi, 1:100; ab5076, abkam).Seksionet u lanë më pas me PBS dhe u inkubuan me antitrupa sekondarë për 1 orë në temperaturë ambienti (seksione të ngrira) ose gjatë natës në 4°C (seksione të trasha). U përdor antitrupi sekondar Alexa Fluor (Life Technologies) i holluar 1:1000 në tretësirë ​​bllokuese. Pas larjes me PBS, bërthamat u vizualizuan me një Hoechst 33258 (Life Technologies). Së fundmi, laminat u vendosën në një mikroskop me mbulesa (Fisher Scientific) duke përdorur një Aquamount (Polysciences) dhe u analizuan në një mikroskop fluoreshent Keyence (analizues BZ-X) ose një mikroskop konfokal Leica TCS SP8 (Las-X) mbi imazhin. Imazhet u përpunuan duke përdorur programin ImageJ (Fiji). Për të përcaktuar proporcionin e neuroneve njerëzore në t-hCO dhe korteksin e miut, imazhe drejtkëndëshe me gjerësi 387.5 μm u morën në qendër të t-hCO, në ose afër skajit të korteksit të miut. Kufijtë e shartimit u përcaktuan duke vlerësuar ndryshimet në transparencën e indeve, bërthamat HNA+ dhe/ose praninë e autofluoreshencës së indeve. Në secilën imazh, numri total i qelizave NeuN+ dhe HNA+ u pjesëtua me numrin total të qelizave NeuN+ në të njëjtën zonë. Për t'u siguruar që të numërohen vetëm qelizat me bërthama në planin e imazhit, në llogaritje përfshihen vetëm qelizat që janë gjithashtu Hoechst+. Dy imazhe të ndara me të paktën 1 mm u mesatarizuan për të zvogëluar gabimin statistikor.
Një javë para mbledhjes së mostrës, vendosni kafshët e transplantuara me hCO3 (përafërsisht 8 muaj diferencim) në një dhomë të errët me mustaqe të prera për të minimizuar stimulimin ndijor. Izolimi i bërthamave u krye siç është përshkruar më parë, me disa modifikime. Shkurtimisht, t-hCO3 dhe hCO3 u shkatërruan duke përdorur lizën qelizore mekanike me detergjent dhe një mulli indesh qelqi 2 ml (D8938, Sigma-Aldrich/KIMBLE). Bërthamat e papërpunuara u filtruan më pas duke përdorur një filtër 40 µm dhe u centrifuguan në 320 g për 10 minuta në 4 °C para se të kryenin një gradient dendësie të saharozës. Pas hapit të centrifugimit (320 g për 20 minuta në 4 °C), mostrat u risuspenduan në 0.04% BSA/PBS me shtimin e 0.2 njësive të frenuesit µl-1 RNase (40 u µl-1, AM2682, Ambion) dhe kaluan nëpër një filtër rrjedhjeje 40 µm. Bërthamat e disociuara u resuspenduan më pas në PBS që përmbante 0.02% BSA dhe u ngarkuan në një çip Chromium Single Cell 3′ (rikuperimi i vlerësuar prej 8,000 qelizash për korsi). Bibliotekat e snRNA-seq u përgatitën me Chromium Single cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics). Bibliotekat e snRNA-seq u përgatitën me Chromium Single cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics). Biblioteki snRNA-seq mund të përdoret me ndihmën e Chromium Single cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics). Bibliotekat e snRNA-seq u përgatitën duke përdorur Chromium Single cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics). snRNA-seq 文库是使用Chromium Single cell 3′ GEM、Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics) 制备的。 snRNA-seq 文库是使用Chromium Single cell 3′ GEM、Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics) 制备的。 Biblioteku snRNA-seq përgatitet me përdorimin e Chromium Single Cell 3' GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics). Biblioteka snRNA-seq u përgatit duke përdorur Chromium Single Cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics).Bibliotekat nga mostra të ndryshme u bashkuan dhe u sekuencuan nga Admera Health në NovaSeq S4 (Illumina).
Nivelet e shprehjes së gjenit për secilin barkod bërthamor të supozuar u përcaktuan sasiore duke përdorur paketën softuerike të analizës 10x Genomics CellRanger (versioni 6.1.2). Në mënyrë specifike, leximet u përputhën me një kombinim të gjenomeve referuese njerëzore (GRCh38, Ensemble, versioni 98) dhe miut (Rnor_6.0, Ensemble, versioni 100) të krijuara me komandën mkref dhe duke përdorur komandën –include-introns=TRUE për të përfshirë leximet e hartuara në rajonet e introneve. Për mostrat t-hCO3, bërthamat njerëzore u identifikuan bazuar në kërkesën konservative që të paktën 95% e të gjitha leximeve të hartuara përputhen me gjenomin njerëzor. Të gjitha analizat pasuese u kryen në një matricë barkodesh të filtruar të dalë nga CellRanger duke përdorur paketën R (versioni 4.1.2) Seurat (versioni 4.1.1)32.
Për të siguruar që vetëm bërthamat me cilësi të lartë të përfshihen në analizën pasuese, për secilën mostër u zbatua një proces filtrimi përsëritës. Së pari, identifikohen dhe hiqen bërthamat me cilësi të ulët me më pak se 1000 gjene unike të gjetura dhe më shumë se 20% të totalit të mitokondrive. Më pas, matrica e numrit të gjeneve të papërpunuara u normalizua me anë të regresionit binomial negativ të rregulluar duke përdorur funksionin sctransform(vst.flavor=”v2″), i cili gjithashtu identifikoi 3000 gjenet më të ndryshueshme duke përdorur parametrat e paracaktuar. Reduktimi i dimensionit u krye në gjenet e variablave të sipërme duke përdorur Analizën Kryesore të Komponentëve (PCA) me parametra të paracaktuar duke përdorur një dimension të të dhënave prej 30 (dims = 30 u zgjodh bazuar në inspektimin vizual të vendeve të gjurit dhe u përdor për të gjitha mostrat dhe analizat e ansamblit). Pastaj kryem disa raunde të grupimit iterativ (rezolucioni = 1) për të klasifikuar gjenet bazuar në numërimin anormalisht të ulët të gjeneve (mesatarja nën percentilin e 10-të), numërimin anormalisht të lartë të gjeneve mitokondriale (mesatarja mbi percentilin e 95-të) për të identifikuar dhe hequr qelizat e supozuara me cilësi të ulët. Grumbuj dhe/ose një përqindje të lartë të binjakëve të dyshuar të identifikuar duke përdorur paketën DoubletFinder33 (rezultati mesatar i DoubletFinder mbi percentilin e 95-të). Mostrat t-hCO3 (n=3) dhe mostrat hCO3 (n=3) u integruan veçmas duke përdorur funksionin IntegrateData me sa më sipër. parametrat. Pastaj u krye një raund tjetër i filtrimit cilësor të grupit të të dhënave të integruara siç përshkruhet më sipër.
Pas heqjes së bërthamave me cilësi të ulët, grupi i të dhënave të integruara u grupua (rezolucioni = 0.5) dhe u nguli për qëllime vizualizimi UMAP34. Gjenet shënuese për secilin grumbull u përcaktuan duke përdorur funksionin FindMarkers me parametra parazgjedhur të llogaritur nga të dhënat e normalizuara të shprehjes së gjeneve. Ne identifikojmë dhe klasifikojmë klasat kryesore të qelizave duke kombinuar grupet e të dhënave referuese kortikale fetale dhe të të rriturve me shprehjen e gjeneve shënuese 19,20,21,35 dhe shënimet. Në veçanti, pararendësit qarkullues u identifikuan nga shprehja e MKI67 dhe TOP2A. Grumbujt progjenitorë u përcaktuan nga mungesa e transkripteve mitotike, mbivendosja e lartë me grumbujt progjenitorë glialë multipotente të përshkruar në korteksin fetal të metafazës së vonë, dhe shprehja e EGFR dhe OLIG1. Ne përdorim termin astrocit për të përfshirë disa gjendje të diferencimit të astrociteve, nga glia radiale e vonë deri në maturimin e astrociteve. Grumbujt e astrociteve shprehin nivele të larta të SLC1A3 dhe AQP4 dhe kanë treguar se përputhen me nëntipet e glias radiale fetale dhe/ose astrociteve të të rriturve. OPC-të shprehin PDGFRA dhe SOX10, ndërsa oligodendrocitet shprehin shënjues të mielinizimit (MOG dhe MYRF). Neuronet glutamatergjike u identifikuan nga prania e transkripteve neuronale (SYT1 dhe SNAP25), mungesa e shënjuesve GABAergjikë (GAD2) dhe shprehja e NEUROD6, SLC17A7, BCL11B ose SATB2. Neuronet GluN u ndanë më tej në nënklasa të sipërme (shprehja e SATB2 dhe humbja e BCL11B) dhe të thella (shprehja e BCL11B). Neuronet e supozuara të nënpllakës (SP) shprehin shënjues të njohur SP18 si ST18 dhe SORCS1 përveç shënjuesve të thellë GluN. Qelizat e ngjashme me pleksusin koroid u identifikuan nga shprehja TTR, dhe qelizat e ngjashme me meningeale shprehën gjene të shoqëruara me fibroblastet dhe hartuan qelizat piale/vaskulare të grupit të të dhënave referuese.
Analiza diferenciale e shprehjes së gjeneve midis t-hCO dhe nënklasave hCO u krye duke përdorur një metodë pseudo-batch të zhvilluar rishtazi të riprodhuar në mostra të implementuara duke përdorur paketën Libra R (versioni 1.0.0). Në mënyrë specifike, testet e gjasës logaritmike të edgeR (versioni 3.36.0, paketa R) u kryen për grupet duke mbledhur numrin e gjeneve në qeliza për një klasë të caktuar qelizash për secilën replikim të mostrës. Për vizualizimin e hartës së nxehtësisë, vlerat e normalizuara për milion (CPM) llogariten duke përdorur edgeR (funksioni cpm()) dhe shkallëzohen (për të arritur mesataren = 0, devijimi standard = 1). U krye analiza e pasurimit të Ontologjisë së Gjeneve (GO) të gjeneve t-hCO GluN të rritura ndjeshëm (vlera P e korrigjuar Benjamini-Hochberg më pak se 0.05 e shprehur në të paktën 10% të qelizave t-hCO GluN dhe një rritje fish në ndryshim prej të paktën 2 herë). U krye duke përdorur ToppGene Suite (https://toppgene.cchmc.org/)37. Ne përdorim aplikacionin ToppFun me parametra të paracaktuar dhe raportojmë vlerat P të korrigjuara nga Benjamini-Hochberg të llogaritura nga testet hipergeometrike të shënuara nga GO.
Për të përputhur grupet tona të snRNA-seq me grupet e qelizave të shënuara nga studimet referuese të RNA-seq primare të një qelize të vetme ose snRNA-seq të rritur19,20,21,22, ne aplikuam një qasje të integrimit të të dhënave të çiftëzuara. Ne përdorëm rrjedhën e punës së normalizimit SCTransform (v2) në Seurat për të integruar dhe krahasuar mbivendosjet e grupeve midis grupeve të të dhënave (duke përdorur të njëjtat parametra si më sipër). Grupet individuale të të dhënave u ndanë rastësisht në nëngrupe deri në 500 qeliza ose bërthama për grupim origjinal për efikasitet llogaritës. Duke përdorur një qasje të ngjashme siç është përshkruar më parë, mbivendosja e grupimit u përcaktua si përqindja e qelizave ose bërthamave në secilin grupim të bashkuar që mbivendoseshin me etiketën e grupimit të referencës. Për të klasifikuar më tej GluN-të, ne përdorëm rrjedhën e punës TransferData të Seurat për të dhënat e nëngrupit GluN për të caktuar etiketat e të dhënave referuese në qelizat tona GluN.
Për të vlerësuar statusin e maturimit të transkriptomit global të mostrave t-hCO dhe hCO, ne krahasuam mostrat tona pseudo-bulk me BrainSpan/psychENCODE23, e cila përbëhet nga një sekuencë e madhe ARN-je që përfshin zhvillimin e trurit të njeriut. Ne kryem PCA në një matricë të kombinuar të shprehjes së gjenit të normalizuar sipas modelit nga mostrat kortikale 10 javë pas konceptimit dhe më vonë, në 5567 gjene (së bashku me të dhënat tona) që ishin identifikuar më parë si aktivë në mostrat kortikale BrainSpan (të përcaktuara si më të mëdha se 50% në variancën zhvillimore të shpjeguar nga mosha duke përdorur një model kub)38. Përveç kësaj, ne nxorëm gjenet e shoqëruara me nënshkrimet kryesore të transkriptomit të neurozhvillimit duke përdorur faktorizimin e matricës jo-negative siç është përshkruar më parë. Peshat e mostrës të llogaritura duke përdorur procedurën e faktorizimit të matricës jo-negative janë paraqitur në Fig. 5b me të dhëna të zgjeruara për secilën nga pesë nënshkrimet e përshkruara nga Zhu et al.38. Përsëri, shënuesit transkriptues të varur nga aktiviteti u nxorën nga studime të publikuara më parë. Në veçanti, ERG dhe LRG u rritën ndjeshëm në neuronet glutamatergjike të identifikuara nga mbledhja e snRNA-seq të korteksit vizual të miut pas stimulimit vizual nga Tabela Plotësuese 3 Hrvatin et al.16. LRG-të e pasuruara nga njerëzit u morën nga kulturat e trurit të fetusit njerëzor të aktivizuara me KCl dhe u mblodhën 6 orë pas stimulimit, dhe gjenet e filtruara u rritën ndjeshëm tek njerëzit, por jo tek brejtësit (Tabela Plotësuese 4). Analiza e pasurimit të setit të gjeneve duke përdorur këto sete gjenesh u krye duke përdorur një test të saktë Fisher me një drejtim.
Anestezoni minjtë me izofluran, hiqni trurin dhe vendoseni në tretësirë ​​të ftohtë (afërsisht 4°C) të oksigjenuar (95% O2 dhe 5% CO2) të saharozës për prerjet që përmbajnë: 234 mM saharozë, 11 mM glukozë, 26 mM NaHCO3, 2.5 mM KCl, 1.25 mM NaH2PO4, 10 mM MgSO4 dhe 0.5 mM CaCl2 (rreth 310 mOsm). Prerjet koronale të trurit të miut (300–400 µm) që përmbajnë t-hCO3 u bënë duke përdorur një vibratom Leica VT1200 siç është përshkruar më parë39. Seksionet u transferuan më pas në një dhomë prerjeje me oksigjenim të vazhdueshëm në temperaturë ambienti që përmbante aCSF të përgatitur nga: 10 mM glukozë, 26 mM NaHCO3, 2.5 mM KCl, 1.25 mM NaHPO4, 1 mM MgSO4, 2 mM CaCl2 dhe 126 mM NaCl (298 mOsm). të paktën 45 minuta para regjistrimit. Seksionet u regjistruan në një dhomë të zhytur ku ato u perfuzuan vazhdimisht me aCSF (flakë 95% O2 dhe 5% CO2). Të gjitha të dhënat u regjistruan në temperaturë ambienti. Neuronet t-hCO3 u ndërprenë me një pipetë qelqi borosilikat të mbushur me një tretësirë ​​që përmbante 127 mM glukonat kaliumi, 8 mM NaCl, 4 mM ATP magnezi, 0.3 mM GTP natriumi, 10 mM HEPES dhe 0.6 mM EGTA, pH 7.2, tretësirë ​​e brendshme e rregulluar me KOH (290 mOsm). Për të rikuperuar, biocitina (0.2%) u shtua në tretësirën e regjistrimit.
Të dhënat u morën duke përdorur një amplifikator MultiClamp 700B (Molecular Devices) dhe një dixhitalizues Digidata 1550B (Molecular Devices), u filtruan me frekuenca të ulëta në 2 kHz, u dixhitalizuan në 20 kHz dhe u analizuan duke përdorur Clampfit (Molecular Devices), Origin (OriginPro). 2021b, OriginLab). dhe funksione të personalizuara MATLAB (Mathworks). Potenciali i kryqëzimit u llogarit duke përdorur JPCalc dhe hyrjet u rregulluan në vlerën e llogaritur prej -14 mV. Operacioni IV përbëhet nga një seri hapash të rrymës në hapa 10-25 pA, nga -250 në 750 pA.
Talamusi, lënda e bardhë dhe aferentët S1 u stimuluan elektrikisht në prerjet talamokortikale gjatë regjistrimit me anë të kapëseve të neuroneve hCO3, siç është përshkruar më parë. Shkurtimisht, truri u vendos në një tavolinë printimi 3D të anuar në një kënd 10°, dhe pjesa e përparme e trurit u pre në një kënd 35°. Truri më pas u ngjit në sipërfaqen e prerë dhe u pre, duke ruajtur aksonet e spikatura talamokortikale. Elektroda bipolare të tungstenit (0.5 MΩ) u montuan në një mikromanipulator të dytë dhe u pozicionuan strategjikisht për të stimuluar katër rajone për qelizë (kapsula e brendshme, lënda e bardhë, S1 dhe hCO3). Regjistroni përgjigjet sinaptike pas stimulimit fazik 300 µA në 0.03–0.1 Hz.
Neuronet hCO3 që shprehin hChR2 u aktivizuan në 480 nm dhe pulset e dritës së gjeneruar nga një LED (Prizmatix) u aplikuan përmes një objektivi ×40 (0.9 NA; Olympus) për të regjistruar shprehjen e hChR2 pranë qelizave. Diametri i fushës së ndriçuar është afërsisht 0.5 mm dhe fuqia totale është 10-20 mW. Gjerësia e pulsit u vendos në 10 ms, që korrespondon me pulsin e dhënë gjatë eksperimentit të të mësuarit të sjelljes. U përdorën frekuenca të ndryshme stimulimi, nga 1 deri në 20 Hz, por vetëm pulsi i parë i serisë u përdor për përcaktim sasior. Intervalet midis vargjeve janë zakonisht më të gjata se 30 s për të minimizuar efektin në rrugët frenuese ose lehtësuese sinaptike. Për të testuar nëse përgjigja e hChR2 ishte monosinaptike, ne aplikuam TTX (1 μM) në banjë derisa reaksioni EPSC të zhdukej, dhe më pas aplikuam 4-aminopiridinë (4-AP; 100 μM). Zakonisht, një përgjigje kthehet brenda pak minutash, me një vonesë pak më të gjatë midis ndezjes së LED dhe gjenerimit të EPSC. NBQX (10 μM) u përdor për të testuar nëse përgjigja drejtohet nga receptorët AMPA.
Seksionet e mprehta të hCO2 u krijuan siç është përshkruar më parë. Shkurtimisht, seksionet e hCO2 u ngulitën në 4% agarozë dhe u transferuan në qeliza që përmbanin 126 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM NaH2PO4, 1 mM MgSO4, 2 mM CaCl2, 26 mM NaHCO3 dhe 10 mM d-(+)-glukozë në 200-300 µm në temperaturë ambienti duke përdorur një vibrator Leica VT1200 dhe u ruajtën në ASF në temperaturë ambienti. Pastaj, regjistrimi patch-camp i qelizave të tëra u krye në seksionet e hCO2 nën një mikroskop direkt SliceScope (Scientifica). Seksionet u perfuzuan me aCSF (95% O2 dhe 5% CO2) dhe sinjalet qelizore u regjistruan në temperaturë ambienti. Neuronet hCO2 u aplikuan duke përdorur një pipetë qelqi borosilikat të mbushur me një tretësirë ​​që përmbante 127 mM glukonat kaliumi, 8 mM NaCl, 4 mM ATP magnezi, 0.3 mM GTP natriumi, 10 mM HEPES dhe 0.6 mM EGTA, pH i brendshëm 7, 2, i rregulluar me KOH (osmolariteti 290). Për qëllime rikuperimi, shtoni 0.2% Biocitinë në tretësirën e brendshme.
Të dhënat u morën nga Clampex (Clampex 11.1, Molecular Devices) duke përdorur një amplifikator MultiClamp 700B (Molecular Devices) dhe një dixhitalizues Digidata 1550B (Molecular Devices), u filtruan me frekuenca të ulëta në 2 kHz, u dixhitalizuan në 20 kHz dhe u analizuan duke përdorur Clampfit (versioni 10.6) për analizë, pajisje molekulare) dhe funksione të personalizuara MATLAB (MATLAB 2019b, Mathworks). Potenciali i kryqëzimit u llogarit duke përdorur JPCalc dhe hyrjet u rregulluan në potencialin e llogaritur të kryqëzimit prej -14 mV. Operacioni IV përbëhet nga një seri hapash të rrymës në hapa 5-10 pA nga -50 në 250 pA.
Për rindërtimin morfologjik të neuroneve të shtrënguara, në tretësirën e brendshme u shtua 0.2% biocitinë (Sigma-Aldrich). Qelizat përgatiten për të paktën 15 minuta pas copëtimit. Pipeta më pas tërhiqet ngadalë për 1-2 minuta derisa membrana e regjistruar të vuloset plotësisht. Duke ndjekur procedurën e fiziologjisë së prerjes, prerjet u fiksuan gjatë natës në 4°C në 4% PFA, u lanë me PBS X3 dhe u holluan 1:1000 me DyLight 549 ose DyLight 405 të konjuguar me streptavidinë (Vector Labs). Qelizat e mbushura me biocitinë (2%; Sigma-Aldrich) u etiketuan gjatë regjistrimit me kapëse patch në temperaturë ambienti për 2 orë. Prerjet më pas u montuan në lame mikroskopi duke përdorur një Aquamount (Thermo Scientific) dhe u vizualizuan të nesërmen në një mikroskop konfokal Leica TCS SP8 duke përdorur një objektiv zhytjeje në vaj me një aperturë numerike ×40 1.3, zmadhim ×0.9-1.0, xy. Shkalla e marrjes së mostrave është afërsisht 7 piksel për mikron. Skedat Z në intervale 1 µm u morën në seri, dhe mozaikët e skedave Z dhe qepja automatike e bazuar në Leica u kryen për të mbuluar të gjithë pemën dendritike të secilit neuron. Neuronet më pas u gjurmuan gjysmë manualisht duke përdorur ndërfaqen neuTube 40 dhe u gjeneruan skedarë SWC. Skedarët më pas u ngarkuan në shtojcën SimpleNeuriteTracer41 Fiji (ImageJ, versioni 2.1.0; NIH).
Indet kortikale njerëzore u morën me pëlqimin e informuar sipas një protokolli të miratuar nga Bordi i Rishikimit Institucional të Universitetit të Stanfordit. Dy mostra të indeve njerëzore pas lindjes (3 dhe 18 vjeç) u morën me anë të rezeksionit të korteksit frontal (gyrus frontal i mesëm) si pjesë e kirurgjisë për epilepsi refraktare. Pas rezeksionit, indet u mblodhën në NMDG-aCSF të ftohtë me akull që përmbante: 92 mM NMDG, 2.5 mM KCl, 1.25 mM NaH2PO4, 30 mM NaHCO3, 20 mM HEPES, 25 mM glukozë, 2 mM tioure, 5 mM askorbat natriumi, 3 mM piruvat natriumi, 0.5 mM CaCl2 4H2O dhe 10 mM MgSO4 7H2O. Titrohen në pH 7.3-7.4 me acid klorhidrik të përqendruar. Indet u dorëzuan në laborator brenda 30 minutash dhe prerjet koronale u morën sipas procedurës së përshkruar më sipër.
Të gjitha procedurat e kujdesit ndaj kafshëve u kryen në përputhje me udhëzimet e kujdesit ndaj kafshëve të miratuara nga APLAC i Universitetit të Stanfordit. Minjtë (më shumë se 140 ditë pas transplantimit) u induktuan me anestezi 5% izoflurani dhe u anestezuan me 1-3% izofluran gjatë operacionit. Kafshët u vendosën në një kornizë stereotaksike (Kopf) dhe buprenorfinë (SR) me çlirim të zgjatur u injektuan në mënyrë nënlëkurore. Kafka ekspozohet, pastrohet dhe futen 3-5 vida kockore. Për të synuar t-hCO3, ne gjeneruam koordinata stereotaksike nga imazhet MRI. Një vrimë gërvishtëse u shpua në vendin e interesit dhe fibrat (diametër 400 µm, NA 0.48, Dorik) u ulën 100 µm nën sipërfaqen e hCO3 dhe u fiksuan në kafkë me çimento dentare të shërueshme nga UV (Relyx).
Regjistrimet fotometrike me fibra u kryen siç është përshkruar më parë42. Për të regjistruar aktivitetin spontan, minjtë u vendosën në një kafaz të pastër dhe një kabllo patch me fibra optike me diametër 400 µm (Doric) i lidhur me një sistem fotografik të të dhënave me fibra optike u lidh me kabllon e fibrave optike të implantuar. Gjatë regjistrimit 10-minutësh të aktivitetit motorik, kafshët ishin të lira të eksploronin kafazin. Për të regjistruar aktivitetin e evokuar, minjtë (më shumë se 140 ditë pas transplantimit) u anestezuan me 5% izofluran për induksion dhe 1-3% izofluran për mirëmbajtje. Vendoseni kafshën në një kornizë stereotaktike (Kopf) dhe mustaqet në anën e kundërt të t-hCO3 shkurtohen në rreth 2 cm dhe kalohen përmes një rrjete të lidhur me një aktivizues piezoelektrik (PI). Një kabllo patch me fibra optike 400 µm (Doric) u lidh me fibrën e implantuar dhe u lidh me sistemin e mbledhjes së të dhënave. Mustaqet në anën e kundërt të t-hCO3 u devijuan më pas 50 herë (2 mm në 20 Hz, 2 s për prezantim) në kohë të rastësishme nga një makinë piezoelektrik gjatë një periudhe regjistrimi prej 20 minutash. Përdorni Paketën e Mbështetjes Arduino MATLAB për të kontrolluar kohën e devijimit me kodin MATLAB të personalizuar. Ngjarjet sinkronizohen me softuerin e mbledhjes së të dhënave duke përdorur pulset logjike tranzistor-tranzistor (TTL).
Minjtë (më shumë se 140 ditë pas transplantimit) u induktuan me anestezi 5% izoflurani dhe u anestezuan me 1-3% izofluran gjatë operacionit. Kafshët u vendosën në një kornizë stereotaksike (Kopf) dhe buprenorfinë SR dhe deksametazon u injektuan nënlëkurësisht. Kafka ekspozohet, pastrohet dhe futen 3-5 vida kockore. Për të synuar t-hCO3, ne gjeneruam koordinata stereotaksike nga imazhet MRI. Një kraniotomi rrethore (me diametër afërsisht 1 cm) u krye me një shpues me shpejtësi të lartë direkt mbi hCO3 të transplantuar. Pasi kocka të jetë sa më e hollë të jetë e mundur, por para se të shpohet e gjithë kocka, përdorni pincë për të hequr diskun e mbetur të legenit të paprekur për të zbuluar t-hCO3 poshtë. Kraniotomia u mbush me tretësirë ​​fiziologjike sterile, dhe një mbulesë dhe një kunj special me kokë u ngjitën në kafkë me çimento dentare të kuruar me UV (Relyx).
Imazheria me dy fotone u krye duke përdorur një mikroskop shumëfotonësh Bruker me një objektiv Nikon LWD (×16, 0.8 NA). Imazheria GCaMP6 u krye në 920 nm me zmadhim të vetëm në planin z dhe një mesatare 8x prej 7.5 fps. Minjtë u induktuan me anestezi 5% izofluran dhe u mbajtën me 1-3% izofluran. Minjtë u vendosën në një pajisje koke të bërë me porosi dhe u pozicionuan nën lente. U mor një regjistrim 3-minutësh në sfond i aktivitetit motorik. Gjatë 20 minutave të regjistrimit, 50 puff-e (çdo prezantim 100 ms i gjatë) u dorëzuan rastësisht në jastëkun e mustaqeve përballë t-hCO3 duke përdorur një picospricer. Përdorni Paketën e Mbështetjes Arduino MATLAB për të kontrolluar kohën e shpërthimit me kodin e personalizuar MATLAB. Sinkronizoni ngjarjet me softuerin e mbledhjes së të dhënave (PrairieView 5.5) duke përdorur pulset TTL. Për analizë, imazhet u korrigjuan për lëvizjen xy duke përdorur korrigjimin afin në programin MoCo të lançuar në Fixhi. Nxjerrja e gjurmëve fluoreshente nga qelizat individuale duke përdorur CNMF-E43. Fluoreshenca u nxor për secilën rajon me interes, u konvertua në kurba dF/F dhe më pas u konvertua në z-score.
Minjtë (më shumë se 140 ditë pas transplantimit) u induktuan me anestezi 5% izoflurani dhe u anestezuan me 1-3% izofluran gjatë operacionit. Kafshët u vendosën në një kornizë stereotaksike (Kopf) dhe buprenorfinë SR dhe deksametazon u injektuan në mënyrë nënlëkurore. Mustaqet në anën e kundërt të t-hCO u prenë në rreth 2 cm dhe u futën përmes një rrjete të lidhur me një aktivizues piezoelektrik. Kafka ekspozohet dhe pastrohet. Një vidë çeliku inox është e lidhur me kafkën. Për të synuar t-hCO, ne gjeneruam koordinata stereotaksike nga imazhet MRI. Kryeni një kraniotomi rrethore (afërsisht 1 cm në diametër) me një shpues me shpejtësi të lartë pak mbi t-hCO. Pasi kocka të jetë sa më e hollë të jetë e mundur, por para se të shponi të gjithë kockën, përdorni pincë për të hequr diskun e mbetur të paprekur të legenit për të zbuluar t-hCO që ndodhet poshtë saj. Qelizat individuale u regjistruan duke përdorur sonda silikoni me dendësi të lartë me 32 ose 64 kanale (Cambridge Neurotech) të tokëzuara në vida tokëzimi dhe të para-amplifikuara me amplifikatorë RHD (Intan). Përdorni manipulatorin për të ulur elektrodat në vendin e synuar përmes kraniotomisë, e cila është e mbushur me tretësirë ​​fiziologjike sterile. Mbledhja e të dhënave u krye në një frekuencë prej 30 kHz duke përdorur sistemin e mbledhjes së të dhënave Open Ephys. Regjistrimi vazhdoi vetëm kur zbuluam aktivitet spontan ritmik shumë të korreluar në më shumë se 10 kanale, duke sugjeruar që elektrodat ishin të vendosura në shart (bazuar në të dhënat e imazhit të kalciumit me dy fotone). U mor një regjistrim në sfond 10-minutësh i aktivitetit motorik. Mustaqet në anën e kundërt të t-hCO3 u devijuan më pas 50 herë (2 mm në 20 Hz, 2 s për prezantim) në kohë të rastësishme nga një makinë piezoelektrik gjatë një periudhe regjistrimi 20-minutëshe. Duke përdorur Paketën e Mbështetjes MATLAB për Arduino (MATLAB 2019b), kontrolloni kohën e devijimit me kodin MATLAB të personalizuar. Përdorni impulset TTL për të sinkronizuar ngjarjet me softuerin e mbledhjes së të dhënave.
Për eksperimentet e shënjimit optik, një kabllo patch optik 200 µm (Doric) i lidhur me një lazer 473 nm (Omicron) u lidh me një fibër optike 200 µm të vendosur mbi kraniotomi. Menjëherë para kësaj, rregulloni fuqinë e xhumperit në 20 mW. Përdorni manipulatorin për të ulur elektrodat në vendin e synuar përmes kraniotomisë, e cila është e mbushur me tretësirë ​​fiziologjike sterile. Në fillim të regjistrimit, u emetuan dhjetë pulse drite 473 nm (frekuenca 2 Hz, kohëzgjatja e pulsit 10 ms). Qelizat fotosensitive u përcaktuan si qeliza që shfaqën një përgjigje të shpejtë brenda 10 ms të dritës në 70% ose më shumë të provave.