Kiitos, että kävit Nature.com-sivustolla. Käytät selainversiota, jossa on rajoitettu CSS-tuki. Parhaan käyttökokemuksen saavuttamiseksi suosittelemme käyttämään päivitettyä selainta (tai poistamaan yhteensopivuustilan käytöstä Internet Explorerissa). Lisäksi jatkuvan tuen varmistamiseksi näytämme sivuston ilman tyylejä ja JavaScriptiä.
Näyttää kolmen dian karusellin kerralla. Siirry kolmen dian läpi kerrallaan Edellinen- ja Seuraava-painikkeilla tai siirry kolmen dian läpi kerrallaan lopussa olevilla liukusäätimen painikkeilla.
Itsejärjestyvät hermosolut edustavat lupaavaa in vitro -alustaa ihmisen kehityksen ja sairauksien mallintamiseen. Organoidit kuitenkin puuttuvat in vivo -olosuhteissa vallitsevasta kytkeytyvyydestä, mikä rajoittaa kypsymistä ja estää integraation muihin käyttäytymistä sääteleviin hermosoluihin. Tässä tutkimuksessa osoitamme, että ihmisen kantasoluista peräisin olevista aivokuoren organoidit, jotka siirretään vastasyntyneiden alastomien rottien somatosensoriseen aivokuoreen, kehittävät kypsiä solutyyppejä, jotka integroituvat aisti- ja motivaatioon liittyviin hermosoluihin. Magneettikuvaus paljasti elinsiirron jälkeistä organoidikasvua useissa kantasolulinjoissa ja eläimissä, kun taas yhden ytimen analyysi paljasti kortikogeneesin etenemisen ja aktiivisuudesta riippuvan transkriptio-ohjelman syntymisen. Siirretyillä aivokuoren neuroneilla on todellakin monimutkaisempia morfologisia, synaptisia ja sisäisiä kalvoominaisuuksia kuin niiden in vitro -vastineilla, mikä mahdollistaa hermosoluvaurioiden havaitsemisen Timothyn oireyhtymää sairastavilla potilailla. Anatominen ja toiminnallinen jäljitys on osoittanut, että siirretyt organellit vastaanottavat talamokortikaalisia ja kortikokortikaalisia syötteitä, ja hermoston aktiivisuuden in vivo -tallenteet viittaavat siihen, että nämä syötteet voivat tuottaa aistivasteita ihmissoluissa. Lopuksi, aivokuoren organoidit ulottavat aksoneja koko rotan aivoihin, ja niiden optogeneettinen aktivaatio johtaa palkitsevaa käyttäytymistä. Näin ollen siirretyt ihmisen aivokuoren neuronit kypsyvät ja osallistuvat isännän käyttäytymistä sääteleviin hermoverkkoihin. Odotamme tämän lähestymistavan helpottavan sellaisten juostetason fenotyyppien havaitsemista potilasperäisissä soluissa, joita ei voida havaita muilla keinoin.
Kehittyvä ihmisaivot on merkittävä itseorganisoituva prosessi, jossa solut lisääntyvät, erilaistuvat, siirtyvät ja yhdistyvät muodostaen toiminnallisia hermoverkkoja, joita jalostetaan edelleen aistikokemuksen kautta. Keskeinen ongelma ihmisaivojen kehityksen ymmärtämisessä, erityisesti sairauksien yhteydessä, on aivokudoksen saatavuuden puute. Itseorganisoituvat organellit, mukaan lukien ihmisen aivokuoren organoidit (hCO; joka tunnetaan myös nimellä ihmisen aivokuoren pallo), voivat tuottaa 2,3,4,5,6. Useat rajoitukset kuitenkin rajoittavat niiden laajempaa soveltamista hermoverkkojen kehityksen ja toiminnan ymmärtämiseen. Erityisesti on epäselvää, rajoittaako hCO:n kypsymistä tiettyjen mikroympäristön ja aistisyötteiden puuttuminen in vivo. Lisäksi, koska hCO:ita ei ole integroitu verkkoihin, jotka voivat tuottaa käyttäytymisvaikutuksia, niiden hyödyllisyys geneettisesti monimutkaisten ja käyttäytymiseen liittyvien neuropsykiatristen häiriöiden mallintamisessa on tällä hetkellä rajallista.
HCO:n siirto ehjään elävään aivoon voi voittaa nämä rajoitukset. Aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että jyrsijän aivokuoreen siirretyt ihmisen neuronit pystyvät selviytymään, projisoimaan ja kommunikoimaan jyrsijäsolujen kanssa7,8,9,10,11,12. Nämä kokeet tehdään kuitenkin yleensä aikuisilla eläimillä, mikä voi rajoittaa synaptista ja aksonaalista integraatiota. Tässä kuvaamme siirtoparadigman, jossa siirsimme hiPS-soluista peräisin olevaa 3D-hCO:ta immuunipuutteisten rottien primaariseen somatosensoriseen aivokuoreen (S1) plastisen kehityksen varhaisessa vaiheessa. Siirretyt hCO (t-hCO) -neuronit kypsyvät merkittävästi, vastaanottavat talamokortikaalisia ja kortikaalisesti-kortikaalisia syötteitä, jotka herättävät aistivasteita, ja laajentavat aksonaalisia projektioita rotan aivoihin ohjatakseen palkitsevaa käyttäytymistä. T-hCO:n pitkittynyt kypsyminen on paljastanut hermosoluvaurioita potilailla, joilla on Timothyn oireyhtymä (TS), vakava geneettinen sairaus, jonka aiheuttavat mutaatiot jänniteherkässä L-tyypin CaV1.2-kalsiumkanavassa (jota koodaa CACNA1C).
Tutkiaksemme ihmisen aivokuoren hermoverkkoja in vivo siirsimme stereotaktisesti ehjää 3D-hCO3:ta varhaisen postnataalin atymiikkojen rottien S1-soluihin (päivät 3–7 postnataalista) (kuva 1a ja kuvan 1a-c laajennetut tiedot). Tässä vaiheessa talamokortikaaliset ja kortikokortikaaliset aksoniprojektiot eivät ole vielä saaneet S1-hernotusta valmiiksi (viite 13). Täten tämä lähestymistapa on suunniteltu maksimoimaan t-hCO3:n integraatio ja minimoimaan vaikutus endogeenisiin hermoverkkoihin. Visualisoidaksemme t-hCO3:n sijainnin elävissä eläimissä, teimme T2-painotettuja MRI-aivorekonstruktioita rotille 2–3 kuukautta siirron jälkeen (kuva 1b ja laajennetut tiedot, kuva 1d). t-hCO2 havaittiin helposti ja t-hCO2:n tilavuusmittaukset olivat samanlaisia ​​kuin kiinteistä viipaleista lasketut (laajennettu data, kuva 1d, e; P > 0,05). t-hCO2 havaittiin helposti ja t-hCO2:n tilavuusmittaukset olivat samanlaisia ​​kuin kiinteistä viipaleista lasketut (laajennettu data, kuva 1d, e; P > 0,05). t-hCO легко наблюдались, а объемные измерения t-hCO были аналогичны рассчитанным для фиксировансрезох данные, рис 1d, P> 0,05). t-hCO2 havaittiin helposti, ja volumetriset t-hCO2-mittaukset olivat samanlaisia ​​kuin kiinteille osille lasketut (laajennettu data, kuva 1d, e; P > 0,05).很容易观察到t-hCO，并且t-hCO的体积测量值与从固定切片计算的测量值相似（扩展数据图、e；P > 0,05＀很容易观察到t-hCO，并且t-hCO t-hCO легко наблюдался, а объемные измерения t-hCO были аналогичны рассчитанным для фиксированшыревых данные, рис 1d, P> 0,05). t-hCO2 havaittiin helposti, ja volumetriset t-hCO2-mittaukset olivat samanlaisia ​​kuin kiinteille osille lasketut (laajennettu data, kuva 1d, e; P > 0,05).Määritimme t-hCO2:n 81 %:lla siirretyistä eläimistä noin 2 kuukautta siirron jälkeen (n = 72 eläintä; hCO2 10 hiPS-solulinjasta; hiPS-solulinjat lisätaulukossa 1). Näistä 87 % sijaitsi aivokuoressa (kuva 1c). Suorittamalla sarja-MRI-kuvauksia useissa ajankohtina samalle siirretylle rotalle havaitsimme t-hCO2-tilavuuden yhdeksänkertaisen kasvun 3 kuukauden kuluessa (kuva 1d ja laajennetut tiedot, kuva 1f). Siirretyillä eläimillä oli korkea eloonjäämisaste (74 %) 12 kuukautta siirron jälkeen (laajennetut tiedot, kuva 1g ja lisätaulukko 2), eikä selviä motorisia tai muistihäiriöitä, glioosia tai aivosähkökäyrää (EEG). Tiedot kuva 1g ja lisätaulukko 2. 1h–m ja 3e).
a, Kaaviokuva kokeellisesta suunnittelusta. hiPS-soluista peräisin olevaa hCO2:ta siirrettiin vastasyntyneiden alastomien rottien S1-soluihin erilaistumisen päivinä 30–60. b, T2-painotetut koronaaliset ja horisontaaliset MRI-kuvat, jotka osoittavat t-hCO2:n S1-soluissa 2 kuukautta siirron jälkeen. Skaalapalkki, 2 mm. c, Siirteen kiinnittymisen onnistumisasteiden kvantifiointi kullekin hiPS-solulinjalle (n = 108, palkkien sisällä olevat numerot osoittavat t-hCO2:n määrän hIPS-solulinjaa kohden) ja kortikaaliselle tai subkortikaaliselle sijainnille (n = 88). d, MRI-kuva sepelvaltimosta (vasen; skaalapalkki, 3 mm) ja vastaava 3D-volumetrinen rekonstruktio (skaalapalkki, 3 mm), joka osoittaa t-hCO2:n lisääntymisen 3 kuukauden aikana. e, Katsaus t-hCO2-kuvioihin rotan aivokuoressa. Skaalapalkki, 1 mm. f, Edustavat immunosytokemialliset kuvat t-hCO:sta ylhäältä vasemmalta oikealle (erilaistumisen aikana): PPP1R17 (4 kuukautta vanha), NeuN (8 kuukautta vanha), SOX9 ja GFAP (8 kuukautta vanha), PDGFRα; (8 kuukautta), MAP2 (8 kuukautta) ja IBA1 (8 kuukautta). Skaalapalkki, 20 µm. HNA:n samanaikainen ilmentyminen osoittaa ihmisperäisiä soluja. g, snRNA-sekvenssi: Yhtenäinen moninaisuus ja projektio (UMAP) -dimensionaalisuuden vähentämiskuvaus kaikista korkealaatuisista t-hCO-ytimistä Seurat-integraation jälkeen (n = 3 t-hCO-näytettä, n = 2 hiPS-solulinjaa). Astrosyytit, astrosyyttilinjan solut; cyc prog, verenkierrossa olevat progenitorit; GluN DL, syvät glutamaattiergiset neuronit; GluN DL/SP, syvät ja sublamellaariset glutamaattiergiset neuronit; GluN UL, ylemmän kerroksen glutamaattiergiset neuronit; oligodendrosyytit, oligodendrosyytit; OPC, oligodendrosyyttien progenitorisolut; RELN, reeliinineuronit. h, geeniontologian (GO) termien rikastusanalyysi geeneistä, joiden ilmentymä on merkittävästi noussut (säädetty P 2, ilmaistuna vähintään 10 %:ssa ytimistä) t-hCO3-glutamaattiergisissä neuroneissa verrattuna hCO3-glutamaattiergisiin neuroneihin. h, geeniontologian (GO) termien rikastusanalyysi geeneistä, joiden ilmentymä on merkittävästi noussut (säädetty P 2, ilmaistuna vähintään 10 %:ssa ytimistä) t-hCO3-glutamaattiergisissä neuroneissa verrattuna hCO3-glutamaattiergisiin neuroneihin. h, Анализ обогащения терминов Geeniontologia (GO) для генов со значительной активацией (скорректированный P <0,05, криязмен2, экспрессия по крайней мере в 10% ядер) в глутаматергических нейронах t-hCO по сравнению с глутамачерских neurologia hCO. h, Gene Ontology (GO) -termien rikastusanalyysi geeneille, joilla on merkittävä aktivaatio (säädetty P 2, ilmentyminen vähintään 10%:n ytimissä) t-hCO3-glutamaattiergisissä neuroneissa verrattuna hCO3-glutamaattiergisiin neuroneihin. h，与hCO 谷氨酸能神经元相比，t-hCO 谷氨酸能神经元中基因显着上调（调整P 0.05，倍数变化> 2，在至少10% 的细胞核中表达）的基因本体论(GO) 术语富雠 h ， 与 hco 谷氨酸 能 元 相比 ， t-hco 谷氨酸 能 神经 元 基因 显着 上谎 弐 5 p， 弎 弎 弎变化 变化> 2 ， 至少 10% 的 核中 表达） 基因 基因 基因 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的的 的 的 的本体论(GO) 术语富集分析. h, гены значительно активизировались (скорректированный P <0,05, кратность изменения> 2, экспрессируется по крайне по крайне) глутаматергических нейронах t-hCO по сравнению с глутаматергическими нейронами hCO Онтологический () термина обогащения. h, geenien ilmentyminen lisääntyi merkittävästi (säädetty P <0,05, kertainen muutos > 2, ilmentyi vähintään 10 %:ssa ytimistä) t-hCO3-glutamaattiergisissä neuroneissa verrattuna hCO3-glutamaattiergisiin neuroneihin. Rikastustermin ontologinen (GO) analyysi.Katkoviiva osoittaa aq-arvon 0,05. i, GluN-solutyyppien UMAP-kuvantaminen t-hCO3:ssa käyttäen leimasiirtoa aikuisen motorisen aivokuoren 22 snRNA-seq-referenssiaineistosta. CT — kortikotalamussolut, ET — aivojen ulkopuoliset solut, IT — sisäiset telenkefaalisolut, NP — lähiprojektio.
Seuraavaksi arvioimme t-hCO:n sytoarkkitehtuuria ja kokonaisvaltaista solukoostumusta. Rotan endoteelisolujen vasta-ainevärjäys paljasti t-hCO:n verisuonituksen, kun taas IBA1-värjäys paljasti rotan mikrogliasolujen läsnäolon koko siirteessä (kuva 1f ja laajennetut tiedot, kuva 3c, d). Immunovärjäys paljasti ihmisen tuma-antigeenin (HNA) positiivisia soluja, jotka ilmensivät yhdessä PPP1R17:ää (aivokuoren progenitorit), NeuN:ää (neuronit), SOX9:ää ja GFAP:tä (gliasoluista peräisin olevat solut) tai PDGFRα:aa (oligodendrosyyttien progenitorit) (kuva 1f). Tutkiaksemme t-hCO:n solukoostumusta yksittäisten solujen resoluutiolla, suoritimme yhden ytimen RNA-sekvensoinnin (snRNA-seq) noin 8 kuukauden erilaistumisen jälkeen. Rotan tumien massasuodatus ja poisto tuottivat 21 500 korkealaatuista ihmisen mononukleaarista karttaa (kuva 1g ja laajennetut tiedot, kuva 4a, b). Tyypillisten solutyyppimarkkereiden ilmentymismallit tunnistivat tärkeimpien aivokuoren soluluokkien klustereita, mukaan lukien syvät ja pinnalliset glutamatergiset neuronit, verenkierrossa olevat progenitorit, oligodendrosyytit ja astrosyyttilinjat (kuva 1g, laajennettu data, kuva 4c ja lisätaulukko 3). SATB2:n ja CTIP2:n immunovärjäys osoitti, että aivokuoren alatyyppien läsnäolosta huolimatta t-hCO:lla ei ollut selkeää anatomista kerrostumista (laajennettu data, kuva 3a). Vaihekohtaisesti sovitettu snRNA-sekvensointi hCO:lla tuotti pääpiirteittäin samanlaisia ​​soluluokkia muutamaa poikkeusta lukuun ottamatta, mukaan lukien oligodendrosyyttien puuttuminen ja GABAergisten neuronien läsnäolo, mikä saattaa heijastaa aiemmin raportoituja suotuisia in vitro -olosuhteita lateraalisille progenitorisoluille15 (laajennettu data, kuva 4f–i ja lisätaulukko 4). Geeniekspression differentiaalinen analyysi paljasti merkittäviä eroja glutamatergisten neuronien välillä t-hCO:n ja hCO3:n välillä (lisätaulukko 5), mukaan lukien neuronien kypsymiseen liittyvien geenijoukkojen aktivaatio, kuten synaptisen signaloinnin, dendriittisen lokalisaation ja jänniteherkän kanava-aktiivisuuden (kuva 1h ja lisätaulukko 5). taulukko 6). Näin ollen kortikaalisilla glutamatergisilla t-hCO-neuroneilla havaittiin kiihtynyt transkriptionaalinen kypsyminen.
Selvittääksemme, liittyivätkö nämä transkriptionaaliset muutokset t-hCO:ssa morfologisiin eroihin hCO:n in vitro ja t-hCO:n in vivo välillä, rekonstruoimme vaihe-sovitettuja biokytiinillä täytettyjä hCO:ta ja hCO:ta akuuteista leikkeistä 7–8 kuukauden erilaistumisen jälkeen. hCO-neuronit (kuva 2a). t-hCO-neuronit olivat merkittävästi suurempia, niillä oli 1,5 kertaa soman halkaisija, kaksinkertainen määrä dendriittejä ja kokonaisdendriittien kokonaispituus kuusinkertaistui verrattuna in vitro hCO:hon (kuva 2b). Lisäksi havaitsimme merkittävästi suuremman dendriittisten piikkien tiheyden t-hCO-neuroneissa kuin hCO-neuroneissa (kuva 2c). Tämä viittaa siihen, että t-hCO-neuronit läpikäyvät laajan dendriittisen pidentymisen ja haarautumisen, mikä yhdessä jatkuvan solujen lisääntymisen kanssa voi edistää t-hCO:n voimakasta kasvua elinsiirron jälkeen (kuva 1d ja laajennetut tiedot kuva 1f). Tämä sai meidät tutkimaan elektrofysiologisia ominaisuuksia. Kalvokapasitanssi oli kahdeksan kertaa suurempi (laajennettu data, kuva 8d), lepotilan kalvopotentiaali oli hyperpolarisoituneempi (noin 20 mV), ja virran injektio indusoi korkeamman maksimaalisen viritysnopeuden t-hCO-neuroneissa kuin hCO-neuroneissa. in vitro (kuva 2d, e), mikä on yhdenmukaista t-hCO:n suurempien ja monimutkaisempien morfologisten ominaisuuksien kanssa. Lisäksi spontaanien eksitatoristen postsynaptisten virtatapahtumien (EPSC) esiintymistiheys oli merkittävästi korkeampi t-hCO-neuroneissa (kuva 2f), mikä viittaa siihen, että t-hCO-neuroneissa havaittu dendriittisten piikkien tiheyden lisääntyminen liittyi toiminnalliseen herkkyyteen. Vahvistimme hCO-neuronien kehittymättömän luonteen in vitro tallentamalla leimattuja glutamatergisia neuroneja (laajennettu data, kuva 6a-c).
a, biokytiinillä täytettyjen hCO3- ja t-hCO3-neuronien 3D-rekonstruktio 8 kuukauden erilaistumisen jälkeen. b, Morfologisten piirteiden kvantifiointi (n = 8 hCO3-neuronia, n = 6 t-hCO3-neuronia; **P = 0,0084, *P = 0,0179 ja ***P < 0,0001). b, Morfologisten piirteiden kvantifiointi (n = 8 hCO3-neuronia, n = 6 t-hCO3-neuronia; **P = 0,0084, *P = 0,0179 ja ***P < 0,0001). б, количественная оценка морфологических признаков (n = 8 нейронов hCO, n = 6 нейронов t-hCO; ** P = 0,0084,0,0 P = 9,0 0,0 *** 1 =9). b, morfologisten piirteiden kvantifiointi ( n = 8 hCO3-neuronia, n = 6 t-hCO3-neuronia; ** P = 0,0084, * P = 0,0179 ja *** P < 0,0001). b，形态学特征的量化（n = 8 个hCO 神经元，n = 6 个t-hCO 神经元；**P = 0,0084，*P = 90.017P = 90 0,0001). b，形态学特征的量化（n = 8 个hCO 神经元，n = 6 个t-hCO 神经元；**P = 0,0084，*P = 90.017P = 90 0,0001). б, количественная оценка морфологических признаков (n = 8 нейронов hCO, n = 6 нейронов t-hCO; ** P = 0,0084,0,0 P = 9,0 0,0 *** 1 =9). b, morfologisten piirteiden kvantifiointi ( n = 8 hCO3-neuronia, n = 6 t-hCO3-neuronia; ** P = 0,0084, * P = 0,0179 ja *** P < 0,0001).c, hCO3- ja t-hCO3-dendriittisten haarojen 3D-rekonstruktio 8 kuukauden erilaistumisen jälkeen. Punaiset tähdet osoittavat oletettuja dendriittisiä piikkejä. Dendriittisten piikien tiheyden kvantifiointi (n = 8 hCO3-neuronia, n = 6 t-hCO3-neuronia; **P = 0,0092). d, Lepokalvopotentiaalin kvantifiointi (n = 25 hCO3-neuronia, n = 16 t-hCO3-neuronia; ***P < 0,0001). d, Lepokalvopotentiaalin kvantifiointi (n = 25 hCO3-neuronia, n = 16 t-hCO3-neuronia; ***P < 0,0001). d, количественная оценка мембранного потенциала покоя (n = 25 нейронов hCO, n = 16 нейронов t-hCO; *** P <0,0001). d, lepokalvopotentiaalin kvantifiointi (n = 25 hCO3-neuronia, n = 16 t-hCO3-neuronia; ***P < 0, 0001). d，静息膜电位的量化（n = 25 hCO 神经元，n = 16 t-hCO 神经元；***P < 0,0001）. d，静息膜电位的量化（n = 25 hCO 神经元，n = 16 t-hCO 神经元；***P < 0,0001）. d, количественная оценка мембранного потенциала покоя (n = 25 нейронов hCO, n = 16 нейронов t-hCO; *** P <0,0001). d, lepokalvopotentiaalin kvantifiointi (n = 25 hCO3-neuronia, n = 16 t-hCO3-neuronia; ***P < 0, 0001). e, Toistuva aktiopotentiaalin laukaisu hCO3:ssa ja t-hCO3:ssa, indusoituna kasvavilla virran injektioilla, ja maksimaalisen laukaisunopeuden kvantifiointi (n = 25 hCO3-neuronia, n = 16 t-hCO3-neuronia; ***P < 0,0001). e, Toistuva aktiopotentiaalin laukaisu hCO3:ssa ja t-hCO3:ssa, indusoituna kasvavilla virran injektioilla, ja maksimaalisen laukaisunopeuden kvantifiointi (n = 25 hCO3-neuronia, n = 16 t-hCO3-neuronia; ***P < 0,0001). e, повторное возбуждение потенциала действия в hCO и t-hCO, вызванное увеличением тока, и количественная скорости возбуждения (n = 25 нейронов hCO, n = 16 нейронов t-hCO; *** P <0,0001). e, virran kasvun ja maksimaalisen laukaisunopeuden kvantifioinnin aiheuttama aktiopotentiaalin uudelleenlaukaisu hCO3:ssa ja t-hCO3:ssa (n = 25 hCO3-neuronia, n = 16 t-hCO3-neuronia; *** P < 0,0001). e，通过增加电流注入诱导的hCO 和t-hCO 重复动作电位放电，以及最大放电 最大放电个hCO 神经元，n = 16 个t-hCO 神经元；***P < 0,0001）. E ， 通过 增加 电流 注入 的 的 hco 和 t-hco 重复 电位 放电 ， 以及 最 大 的 最 大 的 2个 hco 神经 ， n = 16 个 t-hco 神经 ； *** p <0,0001） 。 e, повторяющееся возбуждение потенциала действия hCO и t-hCO, вызванное увеличением подачи тока, и ковциенчи тока максимальной скорости возбуждения (n = 25 нейронов hCO, n = 16 нейронов t-hCO; *** P <0,0001). e, lisääntyneen virransyötön aiheuttama hCO3- ja t-hCO3-aktiopotentiaalien toistuva laukaisu ja maksimaalisen laukaisunopeuden kvantifiointi (n = 25 hCO3-neuronia, n = 16 t-hCO3-neuronia; *** P < 0,0001). f, Spontaanit EPSC:t (sEPSC:t) hCO- ja t-hCO-neuroneissa 8 kuukauden erilaistumisen jälkeen ja synaptisten tapahtumien taajuuden kvantifiointi (n = 25 hCO-neuronia, n = 17 t-hCO-neuronia; ***P < 0,0001). f, Spontaanit EPSC:t (sEPSC:t) hCO- ja t-hCO-neuroneissa 8 kuukauden erilaistumisen jälkeen ja synaptisten tapahtumien esiintymistiheyden kvantifiointi (n = 25 hCO-neuronia, n = 17 t-hCO-neuronia; ***P < 0,0001). f, спонтанные EPSC (sEPSC) в нейронах hCO и t-hCO через 8 месяцев дифференцировки и количественная оценка синаптических событий (n = 25 нейронов hCO, n = 17 нейронов t-hCO; *** P <0,0001) . f, Spontaanit EPSC:t (sEPSC:t) hCO- ja t-hCO-neuroneissa 8 kuukauden erilaistumisen ja synaptisten tapahtumien määrän kvantifioinnin jälkeen ( n = 25 hCO-neuronia, n = 17 t-hCO-neuronia; *** P <0, 0001). f，分化8 个月时hCO 和t-hCO 神经元中的自发性EPSCs (sEPSCs)，以及突触事件频率的2麋件频率的神经元，n = 17 t-hCO 神经元；***P < 0,0001） . f，分化8 个月时hCO 和t-hCO 神经元中的自发性EPSCs (sEPSCs)，以及突触事件频率的2Ｆ事件频率的神率的量匼（n = 25 hCO 神率的量匼（n = 25hCO P < 0,0001） . f, спонтанные EPSC (sEPSC) в нейронах hCO и t-hCO через 8 месяцев дифференцировки и количественная оценка синаптических событий (n = 25 нейронов hCO, n = 17 нейронов t-hCO; *** P <0,0001). f, Spontaanit EPSC:t (sEPSC:t) hCO- ja t-hCO-neuroneissa 8 kuukauden erilaistumisen ja synaptisten tapahtumien määrän kvantifioinnin jälkeen (n = 25 hCO-neuronia, n = 17 t-hCO-neuronia; *** P < 0,0001).Bf:n osalta linjan 1208-2 hCO3 ja t-hCO3 otettiin samasta rinnakkain ylläpidetystä erilaistumiserästä. g, Geenisettien rikastusanalyysi (yksipuolinen Fisherin tarkka testi) geeneistä, joiden ilmentyminen lisääntyi merkittävästi (korjattu P < 0,05, kerrannainen muutos > 2, ilmentyen vähintään 10 %:ssa ytimistä) t-hCO-glutamaattiergisissä neuroneissa verrattuna hCO-glutamaattiergisiin neuroneihin, joissa on sekä varhaisen vasteen (ERG) että myöhäisen vasteen (LRG) aktiivisuudesta riippuvia geenejä sisältäviä geenisettejä tunnistettu in vivo -hiiritutkimuksesta16 ja ihmisspesifisiä LRG:itä in vitro -neuroneista17. g, Geenisettien rikastusanalyysi (yksipuolinen Fisherin tarkka testi) geeneistä, joiden ilmentyminen lisääntyi merkittävästi (korjattu P < 0,05, kerrannainen muutos > 2, ilmentyen vähintään 10 %:ssa ytimistä) t-hCO-glutamaattiergisissä neuroneissa verrattuna hCO-glutamaattiergisiin neuroneihin, joissa on sekä varhaisen vasteen (ERG) että myöhäisen vasteen (LRG) aktiivisuudesta riippuvia geenejä sisältäviä geenisettejä tunnistettu in vivo -hiiritutkimuksesta16 ja ihmisspesifisiä LRG:itä in vitro -neuroneista17. g, анализ обогащения набора генов (односторонний точный критерий Фишера) генов со значительной активацией (скорва,05 активацией) кратность изменения > 2, экспрессия по меньшей мере в 10% ядер) в глутаматергических нейронах t-hCO по сравнению с глутаматергическими нейронами hCO наборы генов как раннего (ERG), так и позднего (LRG) генов, нотергическими генов, зав идентифицированных в исследовании на мышах in vivo16, и специфических для человека LRG из нейронов in vitro17. g, geenisettien rikastumisen analyysi (yksisuuntainen Fisherin tarkka testi) geeneissä, joilla oli merkittävä aktivaatio (korjattu P < 0,05, kerrannainen muutos > 2, ilmentyminen vähintään 10 %:ssa ytimistä) t-hCO-glutamaattiergisissä neuroneissa verrattuna sekä varhaisiin (ERG) että myöhäisiin (LRG) aktiivisuudesta riippuviin hCO-glutamaattiergisten neuronien sarjoihin, jotka on tunnistettu in vivo -hiirissä16 ja ihmisspesifisissä LRG:issä neuroneista in vitro17. g，t-hCO谷氨酸能神经元与hCO谷氨酸能神经元相比，t -hCO谷氨酸能神经元显着上调（调整后P<0,05，倍数变化>2，在至少10%的细胞核中表达）的基因集富集分析（单侧F isher精确检验）从体内小鼠研究中鉴定的早期反应(ERG)和晚期反应(LRG) 活性依赖性基因的基因组16 和体外神经元17 中的人类特LRG异 g ， t-hco 谷氨酸 神经 元 与 hco 谷氨酸 神经 元 相比 ， t-hco 谷氨酸 神经 尃 调 神经 元<0.05 ， 倍数> 2 ， 至少 至少 10%的 细胞 核中 表达） 的 集富集 分析 䧈单 （单体内 小鼠 研究 中 的 早期 反应 反应 反应 和 晚期 反应 反应 (lrg) 活性 基因 的 基 基因 的 基 因 的 基 因神经元 17 中 中 17 中 17的人类特异性LRG. g, глутаматергические нейроны t-hCO были значительно активизированы по сравнению с глутаматергическими глутаматергическим (скорректированный P<0,05, кратность изменения> 2, не менее 10% Анализ обогащения набора генов (одностороней) тчстеный раннего ответа (ERG) ja позднего гены, зависящие от активности ответа (LRG), идентифицированные in иссясле vivo16 ja нейронах in vitro17. LRG, специфичные для человека. g, t-hCO3-glutamaattiergisten neuronien ilmentyminen lisääntyi merkittävästi verrattuna hCO3-glutamaattiergisiin neuroneihin (korjattu P < 0,05, kerrannainen muutos > 2, vähintään 10 %. Varhaisen vasteen (ERG) ja myöhäisen vasteen geenien rikastusanalyysi (yksisuuntainen Fisherin tarkka testi) osoitti, että vasteaktiivisuudesta riippuvat geenit (LRG) tunnistettiin in vivo -hiirissä16 ja in vitro -neuroneissa17. Ihmiselle spesifiset LRG:t.Katkoviiva osoittaa Bonferronilla korjatun P-arvon 0,05. h, GluN-geenin ilmentyminen (pseudopaketti ja kunkin geenin skaalaus) lisääntyi merkittävästi LRG-geenien snRNA-seq-replikoissa t-hCO3-glutamaattiergisissä neuroneissa. i, immunovärjäys, joka osoittaa SCG2:n ilmentymisen t-hCO3- (ylempi) ja hCO3- (alempi) neuroneissa. Valkoiset nuolet osoittavat SCG2+-soluihin. Skaalapalkki, 25 µm. Tiedot ilmaistaan ​​keskiarvona ± keskihajonta.
Ex vivo -viipaleissa havaitun t-hCO:n lisääntyneen aktiivisuuden perusteella snRNA-sekvensointi paljasti aktiivisuudesta riippuvan geenitranskriptien lisääntyneen ilmentymisen t-hCO:ssa verrattuna hCO:hon in vitro. Glutamatergiset t-hCO-neuronit ilmensivät korkeampia määriä myöhäistä vasteaktiivisuutta sääteleviä geenejä (kuva 2g,h), joita on havaittu aiemmissa tutkimuksissa hiiren ja ihmisen neuroneilla16,17. Esimerkiksi BDNF18, SCG2 ja kädellisille spesifinen aktiivisuutta säätelevä geeni OSTN osoittivat lisääntynyttä ilmentymistä t-hCO-neuroneissa verrattuna hCO-neuroneihin (kuva 2g-i). Siten t-hCO-neuroneilla oli transkriptionaalisten, morfologisten ja toiminnallisten analyysien perusteella paremmat kypsymisominaisuudet verrattuna hCO-neuroneihin.
Jotta voisimme arvioida tarkemmin t-hCO:n kypsymisen yhteyttä ihmisen aivojen kehitykseen, teimme transkriptoomisia vertailuja sikiön ja aikuisen aivokuoren solutyypeistä19,20 ja aikuisen21,22 sekä keräsimme laajoja tietoja aivokuoren geenien ilmentymisestä23 kehityksen aikana (laajennettu data, kuva 5). Aiempien tutkimusten24 mukaisesti hCO:n ja t-hCO:n transkriptomien yleinen kypsymistila 7–8 kuukauden erilaistumisen kohdalla on pääpiirteittäin yhdenmukainen in vivo -kehitysajan kanssa ja vastaa parhaiten myöhäistä sikiöikää (laajennettu data, kuva 5a). Havaitsimme erityisesti lisääntynyttä transkriptomin kypsyyttä t-hCO:ssa verrattuna ikäryhmittäin sovitettuun hCO:hon, sekä transkriptomin aktivaatiota, joka liittyi synaptogeneesiin, astrogeneesiin ja myelinaatioon (laajennettu data, kuva 5b-d). Solutasolla löysimme todisteita ohuemmasta aivokuoren alatyypistä t-hCO:ssa, jossa glutamatergisten neuronien klusterit ovat päällekkäisiä aikuisen L2/3-, L5- ja L6-neuronien alatyyppien kanssa (kuva 1i). Sitä vastoin glutamatergisten t-hCO-neuronien ja sikiön aivokuoren neuronien klusterien päällekkäisyys oli rajoitetumpaa raskauden keskivaiheilla (laajennettu data, kuva 5e-j). Selvittääksemme, ovatko t-hCO-neuronit toiminnallisesti samankaltaisia ​​kuin ihmisen postnataaliset neokortikaaliset neuronit, teimme elektrofysiologisia tallenteita ja anatomisia rekonstruktioita ihmisen L2/3-pyramidineuroneista ihmisen postnataalisen aivokuoren terävissä leikkeissä (laajennettu data, kuva 7a). L2/3-pyramidineuronien elektrofysiologiset ominaisuudet olivat samankaltaiset kuin t-hCO-pyramidineuronien (laajennettu data, kuva 7e). Morfologisesti postnataalisista ihmisnäytteistä peräisin olevat L2/3-neuronit olivat samankaltaisempia t-hCO:n kuin hCO:n kanssa, vaikka L2/3-solut olivat pidempiä, niissä oli enemmän haaroja ja niiden selkärangan tiheys oli suurempi (kuva 3g ja laajennettu data, kuva 7b-). G).
a, Kontrollin ja TS-hiPS-solulinjojen tuottaman hCO3:n siirto vastasyntyneisiin rottiin. b, Biokytiinillä täytettyjen t-hCO3-neuronien 3D-rekonstruktio 8 kuukauden erilaistumisen jälkeen. c, dendriittisolujen keskimääräisen pituuden kvantifiointi (n = 19 kontrollineuronia, n = 21 TS-neuronia; **P = 0,0041). d, 3D-rekonstruoidut dendriittiset haarat kontrollista ja TS t-hCO3:sta 8 kuukauden erilaistumisen jälkeen ja dendriittisten selkärankojen tiheyden kvantifiointi (n = 16 kontrollineuronia, n = 21 TS-neuronia, ***P < 0,0001). d, 3D-rekonstruoidut dendriittiset haarat kontrollista ja TS t-hCO3:sta 8 kuukauden erilaistumisen jälkeen ja dendriittisten selkärankojen tiheyden kvantifiointi (n = 16 kontrollineuronia, n = 21 TS-neuronia, ***P < 0,0001). d, 3D-реконструкция дендритных ветвей из контроля и TS t-hCO через 8 месяцев дифференцировки и колинцостных плотности дендритных шипов (n = 16 контрольных нейронов, n = 21 TS нейронов, *** P <0,0001). d, kontrolli- ja t-hCO3 TS -solujen dendriittisten haarojen 3D-rekonstruktio 8 kuukauden erilaistumisen ja dendriittisen selkärangan tiheyden kvantifioinnin jälkeen ( n = 16 kontrollineuronia, n = 21 TS-neuronia, *** P <0, 0001). d，分化8 个月时对照和TS t-hCO 的3D 重建树突分支，以及树突棘密度的量n化16个对照神经元，n = 21 个TS 神经元，***P < 0,0001）. d ， 分化 8 个 时 对照 和 ts t-hco 的 3d 重建 分支 分支 以及 树突棘 密度 = 骁棘 密度神经 元 ， n = 21 个 ts 神经 ， *** p < 0,0001 ）. d, 3D-реконструкция дендритных ветвей контроля и TS t-hCO через 8 месяцев дифференцировки и колинцирополотна дендритных шипов (n = 16 контрольных нейронов, n = 21 TS нейронов, *** P <0,0001). d, kontrollidendriittisten haarojen ja TS t-hCO2:n 3D-rekonstruktio 8 kuukauden erilaistumisen ja dendriittisen selkärangan tiheyden kvantifioinnin jälkeen ( n = 16 kontrollineuronia, n = 21 TS-neuronia, *** P < 0,0001).Punaiset tähdet osoittavat oletettuja dendriittisiä piikkejä. e, spontaanit EPSC:t kontrolli- ja TS-t-hCO-neuroneissa 8 kuukauden erilaistumisen jälkeen. f, kumulatiivinen frekvenssikuvaaja ja synaptisten tapahtumien frekvenssin ja amplitudin kvantifiointi (n = 32 kontrollineuronia, n = 26 TS-neuronia; **P = 0,0076 ja P = 0,8102). g, Schollin analyysi TS- ja kontrollineuroneista hCO:ssa ja t-hCO:ssa. Katkoviivat esittävät vertailun vuoksi ihmisen L2/3-postnataalisia pyramidineuroneja (n = 24 kontrolli-t-hCO-neuronia, n = 21 TS-t-hCO-neuronia, n = 8 kontrolli-hCO-neuronia ja n = 7 TS-hCO-neuronia). Tiedot ilmaistaan ​​keskiarvona ± keskihajonta
t-hCO:n kyky replikoida ihmisen aivokuoren hermosolujen morfologisia ja toiminnallisia piirteitä korkealla tasolla sai meidät tutkimaan, voisiko t-hCO:ta käyttää tautifenotyyppien havaitsemiseen. Keskityimme TS:ään, vakavaan neurologiseen kehityshäiriöön, jonka aiheuttavat CaV1.2:ta koodaavan geenin toiminnanlisääntymismutaatiot, jotka käynnistävät aktiivisuusriippuvaisen geenitranskription hermosoluissa. Saimme hCO:ta kolmelta TS-potilaalta, joilla oli yleisin substituutio (p.G406R), ja kolmelta verrokilta (kuva 3a). Transplantaation jälkeen havaitsimme, että dendriittinen morfologia oli muuttunut TS-neuroneissa verrattuna verrokkeihin (kuva 3b ja laajennettu data, kuva 8a,b), primaaristen dendriittien lukumäärän kaksinkertaistuessa ja dendriittien keskimääräisen ja kokonaispituuden kokonaiskasvun sekä lyhentyessä (kuva 3c ja laajennettu data, kuva 8c). Tähän liittyi lisääntynyt piikkien tiheys ja spontaanien EPSC:iden esiintymistiheyden lisääntyminen TS:ssä verrattuna kontrollineuroneihin (kuva 3d–f ja laajennettu data, kuva 8g). Lisäanalyysi paljasti epänormaalia dendriittisten haarautumisten malleja t-hCO TS:ssä verrattuna kontrolleihin, mutta ei in vitro TS hCO:ssa samassa erilaistumisvaiheessa (kuva 3g). Tämä on yhdenmukaista aiempien raporttiemme kanssa aktiivisuusriippuvaisesta dendriittisten kutistumisesta TS:ssä ja korostaa tämän elinsiirtoalustan kykyä havaita tautifenotyyppejä in vivo.
Seuraavaksi kysyimme, missä määrin t-hCO-solut ovat toiminnallisesti integroituneet rotan S1-soluihin. Jyrsijöiden S1 saa voimakkaita synaptisia syötteitä ipsilateraalisista ventraalisista tyvi- ja takimmaisista talamuksen tumakkeista, sekä ipsilateraalisista motorisista ja sekundaarisista somatosensorisista aivokuoren osista ja kontralateraalisesta S1-solusta (kuva 4a). Hermoituskuvion palauttamiseksi infektoimme hCO:n rabiesvirus-dG-GFP/AAV-G:llä ja siirsimme hCO:n S1-rottiin 3 päivää myöhemmin. Havaitsimme tiheää GFP:n ilmentymistä ipsilateraalisen S1:n ja ventraalisten tyviganglioiden hermosoluissa 7–14 päivää siirron jälkeen (kuva 4b, c). Lisäksi talamuksen markkerin netrin G1 vasta-ainevärjäys paljasti talamuksen pätteiden läsnäolon t-hCO:ssa (kuva 4d, e). Jotta voisimme arvioida, voisivatko nämä afferenttiset projektiot herättää synaptisia vasteita t-hCO-soluissa, teimme kokonaisia ​​solumittauksia ihmissoluista talamokortikaalisen kerroksen terävistä osista. Rotan S1:n, sisäisen kapselin, valkean aineen ja t-hCO:n lähellä olevien kuitujen sähköinen stimulaatio tai opsiinia ilmentävien talamuksen päiden optogeneettinen aktivaatio t-hCO:ssa indusoi lyhytlatenssisia EPSC:itä t-hCO-neuroneissa, jotka altistettiin AMPA-reseptorin antagonistille NBQX. (kuva 4f, g ja laajennetut tiedot, kuva 9a–g). Nämä tiedot osoittavat, että t-hCO on anatomisesti integroitunut rotan aivoihin ja että rotan isäntäkudos voi aktivoida sen.
a, Kaaviokuva rabies-seurantakokeesta. b, GFP:n ja ihmisspesifisen STEM121:n ilmentyminen t-hCO:n ja rotan aivokuoren välillä (ylempi paneeli). Näytetään myös GFP:n ilmentyminen rotan ipsilateraalisessa vatsanpuoleisessa tyvitumakkeessa (VB) (vasen alakulma) ja ipsilateraalisessa S1:ssä (oikea alakulma). Skaalapalkki, 50 µm. Punaiset neliöt edustavat aivoalueita, joilla kuvat otettiin. c, GFP:tä ilmentävien solujen kvantifiointi (n = 4 rottaa). d, e — Netrin G1+ talamuksen päätteet t-hCO:ssa. d esittää koronaalista leikkausta, joka sisältää t-hCO- ja VB-tumakkeet. Skaalapalkki, 2 mm. e esittää Netrin G1:n ja STEM121:n ilmentymistä t-hCO- (vasen) ja VB- (oikea) neuroneissa. Skaalapalkki, 50 µm. Oranssi katkoviiva osoittaa t-hCO-rajan. f, g, t-hCO-neuronien virtakäyrät sähköisen stimulaation jälkeen S1-rotassa (f) tai sisäisessä kapselissa (g), NBQX:n kanssa (violetti) tai ilman (musta) (vasen). EPSC-amplitudit NBQX:n kanssa ja ilman (n = 6 S1-neuronia, *P = 0,0119; ja n = 6 sisäisen kapselin neuronia, **P = 0,0022) (keskellä). EPSC:tä osoittavien t-hCO-neuronien prosenttiosuus vasteena rotan S1:n (f) tai sisäisen kapselin (g) sähköiseen stimulaatioon (oikea). aCSF, keinotekoinen aivo-selkäydinneste. h, 2P-kuvantamiskokeen kaaviokuva (vasen). GCaMP6-molekyylien ilmentyminen t-hCO:ssa (keskellä). Skaalapalkki, 100 µm. GCaMP6-molekyylien fluoresenssiaikaviive (oikea). i, Spontaanin aktiivisuuden fluoresenssin Z-pistemäärä. j, viiksien stimulaation kaaviokuva. k, z-pisteytetyt 2P-fluoresenssin trajektorit yhdessä kokeessa, linjassa viiksikarvojen poikkeaman kanssa ajanhetkellä nolla (katkoviiva) esimerkkisoluissa. l, kaikkien solujen populaatiokeskiarvoiset z-pistevasteet linjassa viiksikarvojen poikkeaman kanssa ajanhetkellä nolla (katkoviiva) (punainen) tai satunnaisesti luotujen aikaleimojen (harmaa) kanssa. m. Kaaviokuva optisen merkinnän kokeesta. n, Raakajännitekäyrät esimerkki-t-hCO3-kennosta sinisen laserstimulaation tai viiksikarvojen poikkeaman aikana. Punaiset nuolet osoittavat valon aiheuttamat ensimmäiset piikit (ylhäällä) tai viiksikarvojen poikkeaman aiheuttamat ensimmäiset piikit (alhaalla). Harmaa varjostus osoittaa viiksikarvojen poikkeaman jaksoja. o, Huippuvalon aaltomuodot ja viiksikarvojen poikkeamavasteet. p, yksittäisen yrityksen piikit, linjassa esimerkin solujen viiksikarvojen poikkeaman kanssa. 0 osoittaa viiksikarvojen poikkeaman (katkoviiva). q, kaikkien valoherkkien solujen populaatiokeskiarvoinen z-pisteen laukaisunopeus, linjassa viiksikarvojen poikkeaman kanssa ajanhetkellä nolla (katkoviiva) (punainen) tai satunnaisesti luotujen aikaleimojen (harmaa) kanssa. r, Viiksen poikkeaman merkitsevästi moduloimien valoherkkien yksiköiden osuus (n = 3 rottaa) (vasen). Huippu-z-pistemäärän latenssi (n = 3 rottaa; n = 5 (vaaleanvihreä), n = 4 (tummanvihreä) ja n = 4 (syaani) viiksen poikkeaman modulaatioyksikköä rottaa kohden) (oikea). Tiedot on ilmaistu keskiarvona ± keskihajonta
Sitten kysyimme, voisiko t-hCO aktivoitua aistiärsykkeillä in vivo. Siirsimme S1-rottiin hCO:ta, joka ilmensi geneettisesti koodattuja kalsiumindikaattoreita GCaMP6. 150 päivän kuluttua suoritimme kuitufotometrian tai kaksifotonisen kalsiumkuvantamisen (kuva 4h ja laajennettu data, kuva 10a). Havaitsimme, että t-hCO-solut osoittivat synkronoitua rytmistä aktiivisuutta (kuva 4i, laajennettu data, kuva 10b ja lisävideo 1). t-hCO-huipun aktiivisuuden karakterisoimiseksi teimme solunulkoisia elektrofysiologisia tallenteita nukutetuilla siirrännäisrotilla (laajennettu data, kuva 10c-f). Olemme luoneet stereotaksisia koordinaatteja MRI-kuvista; näin ollen nämä tallennetut yksiköt edustavat oletettuja ihmisen hermosoluja, vaikka pelkkä elektrofysiologia ei mahdollista alkuperälajin määrittämistä. Havaitsimme synkronoituja aktiivisuuspurskeita (laajennettu data, kuva 10d). Purskeet kestivät noin 460 ms ja niiden välillä oli noin 2 sekunnin hiljaisuusjaksot (laajennettu data, kuva 10d, e). Yksittäiset yksiköt ampuivat keskimäärin noin kolme laukausta pursketta kohden, mikä on noin 73 % rekisteröidyistä yksiköistä pursketta kohden. Yksittäisten yksiköiden aktiivisuudet korreloivat voimakkaasti, ja nämä korrelaatiot olivat korkeampia kuin rokottamattomilla eläimillä samoissa olosuhteissa tallennettujen yksiköiden (laajennettu data, kuva 10f). Jotta voisimme karakterisoida tarkemmin tunnistettujen ihmisperäisten neuronien piikkivasteita, suoritimme valomerkintäkokeita nukutetuilla rotilla, joille oli siirretty valoherkkää kationikanavaa rodopsiini 2:ta (hChR2) ilmentävää hCO3:ta, jonka kautta t-hCO-neuronit tunnistivat lyhyen latenssin (alle 10 ms) vasteena sinisen valon ärsykkeille (kuva 4m–o). t-hCO-neuronit osoittivat spontaanin aktiivisuuden purskeita taajuuksilla, jotka olivat samanlaisia ​​kuin kalsiumkuvantamisessa sekä t-hCO3:lla ilman valomerkintää tehdyissä elektrofysiologisissa tallenteissa havaitut (laajennettu data, kuva 10c-g). Spontaania aktiivisuutta ei havaittu vastaavissa hCO3:n vaiheissa in vitro -rekisteröidyissä näytteissä. Jotta voisimme arvioida, voiko aistiärsykkeet aktivoida t-hCO:n, ohjasimme rotan viikset lyhyesti poispäin t-hCO:sta (kuva 4j, m ja laajennettu data, kuva 10h, k). Aiempien tutkimusten8,10 mukaan osa t-hCO-soluista osoitti lisääntynyttä aktiivisuutta vastauksena viiksikarvojen taipumiseen, mitä ei havaittu, kun tietoja verrattiin satunnaisiin aikaleimoihin (kuva 4k–q ja laajennettu data, kuva 10h–q). Itse asiassa noin 54 %:lla optomerkityistä yksittäisistä yksiköistä havaittiin merkittävästi lisääntynyt virittymisnopeus viiksikarvojen stimulaation jälkeen, ja se saavutti huippunsa noin 650 ms:ssa (kuva 4r). Yhdessä nämä tiedot viittaavat siihen, että t-hCO vastaanottaa asianmukaisia ​​toiminnallisia syötteitä ja se voidaan aktivoida ympäristöärsykkeiden vaikutuksesta.
Seuraavaksi tutkimme, voiko t-hCO aktivoida rotilla hermoverkkoja käyttäytymisen kontrolloimiseksi. Ensin tutkimme, ulottuvatko t-hCO-neuronien aksonit rotan ympäröiviin kudoksiin. Infektoimme hCO:n lentiviruksella, joka koodaa hChR2:ta ja on fuusioitu EYFP:hen (hChR2-EYFP). 110 päivän kuluttua havaitsimme EYFP:n ilmentymistä ipsilateraalisilla aivokuoren alueilla, mukaan lukien kuulo-, motorinen ja somatosensorinen aivokuori, sekä subkortikaalisilla alueilla, mukaan lukien striatum, hippokampus ja talamus (kuva 5a). Jotta voisimme arvioida, voisivatko nämä efferentit projektiot aiheuttaa synaptisia vasteita rotan soluissa, aktivoimme optisesti hChR2-EYFP:tä ilmentäviä t-hCO-soluja tallentamalla rotan aivokuoren soluja terävistä aivoleikkeistä. T-hCO-aksonien aktivointi sinisellä valolla indusoi lyhyen latenssin EPSC:itä rotan pyramidaalisen aivokuoren neuroneissa, jotka NBQX esti (kuvat 5b–g). Lisäksi tetrodotoksiini (TTX) voi estää nämä vasteet ja 4-aminopyridiini (4-AP) voi palauttaa ne, mikä viittaa siihen, että ne johtuivat monosynaptisista yhteyksistä (kuva 5e).
a, Kaaviokuva aksonin seurannasta (vasen). t-hCO EYFP:n ilmentyminen (oikea). Skaalapalkki, 100 µm. A1, kuuloaivokuori, ACC, anteriorinen cingulaarinen aivokuori, d. striatum, dorsaalinen striatum, HPC, hippokampus; Pallea, lateraalinen väliseinä, mPFC, mediaalinen prefrontaalinen aivokuori, piriforminen aivokuori, v. striatum, ventral striatum, VPM, talamuksen ventropostomediaalinen tumake, VTA, ventral tegmental alue. Punaiset neliöt edustavat aivoalueita, joilla kuvat otettiin. b, Kaaviokuva stimulaatiokokeesta. c, d, Esimerkkejä sinisen valon indusoiman valovirran (ylhäällä) ja jännitteen (alhaalla) vasteesta ihmisen (c) EYFP+ t-hCO tai rotan (d) EYFP- soluissa. e, f, Rotan hermosolujen virtakäyrät t-hCO-aksonien sinisen valon stimulaation jälkeen TTX:llä ja 4-AR:lla (vihreä), TTX:llä (harmaa) tai aCSF:llä (musta) (e), NBQX:n kanssa (violetti) tai ilman (musta) (e). g, sinisen valon aiheuttamien vasteiden latenssi rotan soluissa (n = 16 solua); vaakasuorat palkit osoittavat keskimääräisen latenssin (7,13 ms) (vasemmalla). Valon aiheuttamien EPSC-solujen amplitudi, joka on tallennettu NBQX:llä tai ilman sitä (n = 7 solua; ***P < 0,0001) (keskellä). Valon aiheuttamien EPSC-solujen amplitudi, joka on tallennettu NBQX:llä tai ilman sitä (n = 7 solua; ***P < 0,0001) (keskellä). Амплитуда вызванных светом EPSC, зарегистрированных с или без NBQX (n = 7 клеток; ***P <0,0001) (в центре). Valon indusoimien EPSC-solujen amplitudi, joka on tallennettu NBQX:n kanssa tai ilman (n = 7 solua; ***P < 0,0001) (keskellä).使用或不使用NBQX 记录的光诱发EPSC 的振幅（n = 7 个细胞；***P < 0,0001）（中）使用或不使用NBQX 记录的光诱发EPSC 的振幅（n = 7 个细胞；***P < 0,0001）（中） Амплитуда вызванных светом EPSC, зарегистрированных с или без NBQX (n = 7 клеток; ***P <0,0001) (в центре). Valon indusoimien EPSC-solujen amplitudi, joka on tallennettu NBQX:n kanssa tai ilman (n = 7 solua; ***P < 0,0001) (keskellä).Siniseen valoon reagoivien EPSC-solujen prosenttiosuus rotan soluista (oikealla). h, Käyttäytymistehtävän kaaviokuva. d0, päivä 0. i. Esimerkkieläinten suoritus koulutuspäivänä 1 (vasen) tai 15. päivänä (oikea). Keskimääräinen nuolemisten lukumäärä päivänä 1 (vasen) tai päivänä 15 (oikea keskellä) (n = 150 sinisen valon yritystä, n = 150 punaisen valon yritystä; ***P < 0,0001). Keskimääräinen nuolemisten lukumäärä päivänä 1 (vasen) tai päivänä 15 (oikea keskellä) (n = 150 sinisen valon yritystä, n = 150 punaisen valon yritystä; ***P < 0,0001). Среднее количество облизываний, выполненных в день 1 (слева) или день 15 (в центре справа, в центре справа) = n = 150 испыта 150 испытаний с красным светом ***P <0,0001). Keskimääräinen nuolemisten lukumäärä päivänä 1 (vasen) tai päivänä 15 (keskellä oikealla) (n = 150 sinisen valon yritystä, n = 150 punaisen valon yritystä; ***P < 0,0001).第1 天（左）或第15 天（右中）执行的平均舔次数（n = 150 次蓝光试验150，n次红光试验；***P < 0,0001）.第1 天（左）或第15 天（右中）执行的平均舔次数（n = 150 次蓝光试验150，n次红光试验；***P < 0,001 Среднее количество облизываний, выполненных в день 1 (слева) или день 15 (в центре справа, в центре справа) = n = 150 испыта 150 испытаний с красным светом ***P <0,0001). Keskimääräinen nuolemisten lukumäärä päivänä 1 (vasen) tai päivänä 15 (keskellä oikealla) (n = 150 sinisen valon yritystä, n = 150 punaisen valon yritystä; ***P < 0,0001).Kumulatiiviset nuolemisannokset punaisen ja sinisen valon kokeissa päivänä 1 (keskellä vasemmalla) tai päivänä 15 (oikealla). NS, ei merkitsevä. j, k, Kaikkien hChR2-EYFP:tä (j) ilmentävällä t-hCO3:lla tai kontrollifluoroforilla (k) transplantoitujen eläinten käyttäytymisominaisuudet päivänä 1 tai 15 (hChR2-EYFP: n = 9 rottaa, ** P = 0,0049; kontrolli: n = 9, P = 0,1497). l, Mieltymyspisteiden kehitys (n = 9 hChR2, n = 9 kontrolli; **P < 0,001, ***P < 0,0001). l, Mieltymyspisteiden kehitys (n = 9 hChR2, n = 9 kontrolli; **P < 0,001, ***P < 0,0001). l, Эволюция показателя предпочтения (n = 9 hChR2, n = 9 контрольных; **P <0,001, ***P <0,0001). l, Mieltymyspisteiden kehitys (n = 9 hChR2, n = 9 kontrollia; **P < 0,001, ***P < 0,0001). l，偏好评分的演变（n = 9 hChR2，n = 9 对照；**P < 0,001，***P < 0,0001）. l，偏好评分的演变（n = 9 hChR2，n = 9 对照；**P < 0,001，***P < 0,0001）. l, Эволюция показателей предпочтения (n = 9 hChR2, n = 9 контролей; **P <0,001, ***P <0,0001). l, Mieltymyspisteiden kehitys (n = 9 hChR2, n = 9 kontrollia; **P < 0,001, ***P < 0,0001).m, FOS-ilmentymä vasteena t-hCO3:n optogeneettiselle aktivaatiolle S1:ssä. Kuvat FOS-ilmentymisestä (vasemmalla) ja kvantifioinnista (n = 3 ryhmää kohden; *P < 0,05, **P < 0,01 ja ***P < 0,001) (oikealla) on esitetty. Kuvat FOS-ilmentymisestä (vasemmalla) ja kvantifioinnista (n = 3 ryhmää kohden; *P < 0,05, **P < 0,01 ja ***P < 0,001) (oikealla) on esitetty. O FOS-ilmentymisen kuvat (vasen) ja kvantifiointi (n = 3 ryhmää kohden; *P<0,05, **P<0,01 ja ***P<0,001) on esitetty (oikea).显示了FOS 表达（左）和量化（每组n = 3；*P < 0,05、**P < 0,01 和***P。 0,001）叚叀）显示了FOS 表达（左）和量化（每组n = 3；*P < 0,05、**P < 0,01 和***P。 0,001）叚叀） O FOS-ilmentymisen kuvat (vasen) ja kvantifiointi (n = 3 ryhmää kohden; *P<0,05, **P<0,01 ja ***P<0,001) on esitetty (oikea).Skaalapalkki, 100 µm. Tiedot on ilmaistu BLA:n, basolateraalisen nielurisan, MDT:n, dorsomediaalisen talamuksen tumakkeen, PAG:n ja periakeduktaalisen harmaan keskiarvona ± keskivirhe.
Lopuksi kysyimme, voisiko t-hCO moduloida rotan käyttäytymistä. Tämän testaamiseksi siirsimme hChR2-EYFP:tä ilmentävää hCO:ta S1:een, ja 90 päivää myöhemmin istutimme optisia kuituja t-hCO:hon valon toimitusta varten. Sitten koulutimme rottia muunnetulla operantin ehdollistamisparadigmalla (kuva 5h). Asetimme eläimet käyttäytymistestikammioon ja käytimme satunnaisesti 5 sekunnin sinistä (473 nm) ja punaista (635 nm) laserärsykettä. Eläimet saivat vesipalkinnon, jos ne nuolivat sinisen valon stimulaation aikana, mutta eivät nuolleet punaisen valon stimulaation aikana. Koulutuksen ensimmäisenä päivänä eläimet eivät osoittaneet eroa nuolemisessa sinisen tai punaisen valon stimulaation aikana. Kuitenkin päivänä 15 eläimet, joille oli siirretty hChR2-EYFP:tä ilmentävää hCO:ta, nuolivat aktiivisemmin sinisen valon stimulaation aikana verrattuna punaisen valon stimulaatioon. Näitä nuolemiskäyttäytymisen muutoksia ei havaittu kontrollieläimillä, joille oli siirretty kontrollifluoroforia ilmentävää hCO:ta (oppimisen onnistumisprosentti: hChR2 89 %, EYFP 0 %, kuva 5i-1 ja lisävideo 2). Nämä tiedot viittaavat siihen, että t-hCO-solut voivat aktivoida rotan hermosoluja stimuloidakseen palkitsevaa käyttäytymistä. Selvittääksemme, mitkä rotan t-hCO-hermosolupiirit saattavat olla osallisina näissä käyttäytymisen muutoksissa, aktivoimme optogeneettisesti t-hCO:ta koulutetuilla eläimillä ja keräsimme kudoksia 90 minuuttia myöhemmin. Immunohistokemia paljasti aktiivisuudesta riippuvan FOS-proteiinin ilmentymisen useilla motivoituneeseen käyttäytymiseen osallistuvilla aivoalueilla, mukaan lukien mediaalinen prefrontaalinen aivokuori, mediaalinen talamuksen alue ja periaqueductal harmaa aine, jota ilmentyi joko stimuloimattomilla kontrollieläimillä tai eläimillä. (riisi. 5m). Yhteenvetona nämä tiedot viittaavat siihen, että t-hCO voi moduloida rotan hermosolujen aktiivisuutta stimuloidakseen käyttäytymistä.
Hermosoluorganoidit edustavat lupaavaa järjestelmää ihmisen kehityksen ja sairauksien tutkimiseen in vitro, mutta niitä rajoittaa in vivo -yhteyksien puute hermoverkostojen välillä. Olemme kehittäneet uuden alustan, jossa siirsimme hCO:ta immuunipuutteisten varhaisen postnataalin rottien S1-soluihin tutkiaksemme ihmissolujen kehitystä ja toimintaa in vivo. Olemme osoittaneet, että t-hCO kehittää kypsiä solutyyppejä, joita ei havaita in vitro28, ja että t-hCO on anatomisesti ja toiminnallisesti integroitunut jyrsijän aivoihin. t-hCO:n integrointi jyrsijän hermoverkkoihin mahdollisti yhteyden luomisen ihmisen soluaktiivisuuden ja tutkittujen eläinten käyttäytymisen välille, mikä osoitti, että t-hCO-neuronit voivat moduloida rotan hermosolujen aktiivisuutta ja ohjata käyttäytymisvasteita.
Kuvailemallamme alustalla on useita etuja aiempaan tutkimukseen verrattuna, jossa on siirretty ihmissoluja jyrsijöiden aivoihin. Ensinnäkin siirsimme hCO3:ta varhaisen postnataalisen rotan kehittyvään aivokuoreen, mikä voi helpottaa anatomista ja toiminnallista integraatiota. Toiseksi t-hCO3-magneettikuvaus mahdollisti siirteen sijainnin ja kasvun tutkimisen elävillä eläimillä, mikä mahdollisti pitkäaikaisten monieläinkokeiden suorittamisen ja useiden hiPS-solulinjojen luotettavuuden osoittamisen. Lopuksi siirsimme ehjiä organoideja eristettyjen yksittäisten solususpensioiden sijaan, jotka ovat vähemmän tuhoisia ihmissoluille ja voivat edistää ihmisen aivokuoren hermosolujen integraatiota ja muodostumista rotan aivoissa.
Tiedostamme, että tämän alustan edistysaskeleista huolimatta ajalliset, spatiaaliset ja lajien väliset rajoitukset estävät ihmisen hermoverkkojen muodostumisen tarkasti, jopa elinsiirron jälkeen kehityksen varhaisessa vaiheessa. Ei esimerkiksi ole selvää, edustaako t-hCO:ssa havaittu spontaani aktiivisuus kehitysfenotyyppiä, joka on samanlainen kuin aivokuoren kehityksen aikana havaittu rytminen aktiivisuus, vai johtuuko se t-hCO:ssa esiintyvien suppressoivien solutyyppien puuttumisesta. Samoin ei ole selvää, missä määrin laminaation puuttuminen t-hCO:sta vaikuttaa ketjujen kytkeytyvyyteen30. Tuleva työ keskittyy muiden solutyyppien, kuten ihmisen mikroglian, ihmisen endoteelisolujen ja GABAergisten interneuronien vaihtelevien osuuksien integrointiin, kuten assembly 6:lla in vitro on osoitettu, sekä sen ymmärtämiseen, miten hermojen integraatio ja prosessointi voi tapahtua muuttuneissa t-hCO:n transkriptionaalisissa, synaptisissa ja käyttäytymistasoilla potilailta saaduissa soluissa.
Kaiken kaikkiaan tämä in vivo -alusta edustaa tehokasta resurssia, joka voi täydentää ihmisen aivojen kehitystä ja sairauksien tutkimusta in vitro. Odotamme, että tämän alustan avulla voimme löytää uusia juostetason fenotyyppejä muuten vaikeasti löydettävistä potilasperäisistä soluista ja testata uusia terapeuttisia strategioita.
Tuotimme hCO2.5:tä HiPS-soluista aiemmin kuvatulla tavalla. HCO2-tuotannon aloittamiseksi ravintokerroksilla viljellyistä hiPS-soluista ehjät hiPS-solupesäkkeet poistettiin viljelymaljoista dispaasia (0,35 mg/ml) käyttäen ja siirrettiin erittäin vähän kiinnittyviä muoviviljelmiä sisältäviin maljoihin, joissa oli hiPS-soluviljelyalustaa (Corning), johon oli lisätty kahta SMAD-inhibiittoria: dorsomorfiinia (5 μM; P5499, Sigma-Aldrich) ja SB-431542:ta (10 μM; 1614, Tocris) sekä ROCK-inhibiittoria Y-27632:ta (10 μM; S1049, Selleckchem). Ensimmäisten viiden päivän aikana hiPS-soluviljelyalusta vaihdettiin päivittäin ja dorsomorfiinia ja SB-431542:ta lisättiin. Kuudentena suspensiopäivänä hermopallot siirrettiin hermoväliaineeseen, joka sisälsi neurobasaali-A:ta (10888, Life Technologies), A-vitamiinitonta B-27-lisää (12587, Life Technologies), GlutaMaxia (1:100, Life Technologies), penisilliiniä ja streptomysiiniä (1:100, Life Technologies) ja jota täydennettiin epidermaalisella kasvutekijällä (EGF; 20 ng ml−1; R&D Systems) ja fibroblastikasvutekijä 2:lla (FGF2; 20 ng ml−1; R&D Systems) päivään 24 asti. Päivästä 25 päivään 42 väliainetta täydennettiin aivoperäisellä neurotrofisella tekijällä (BDNF; 20 ng ml−1, Peprotech) ja neurotrofiini 3:lla (NT3; 20 ng ml−1; Peprotech) vaihtamalla väliaine joka toinen päivä. Kuudentena suspensiopäivänä hermopallot siirrettiin hermoväliaineeseen, joka sisälsi neurobasaali-A:ta (10888, Life Technologies), A-vitamiinitonta B-27-lisää (12587, Life Technologies), GlutaMaxia (1:100, Life Technologies), penisilliiniä ja streptomysiiniä (1:100, Life Technologies) ja jota täydennettiin epidermaalisella kasvutekijällä (EGF; 20 ng ml−1; R&D Systems) ja fibroblastikasvutekijä 2:lla (FGF2; 20 ng ml−1; R&D Systems) päivään 24 asti. Päivästä 25 päivään 42 väliainetta täydennettiin aivoperäisellä neurotrofisella tekijällä (BDNF; 20 ng ml−1, Peprotech) ja neurotrofiini 3:lla (NT3; 20 ng ml−1; Peprotech) vaihtamalla väliaine joka toinen päivä.Kuudentena suspensiopäivänä hermopallot siirrettiin hermoväliaineeseen, joka sisälsi Neurobasal-A:ta (10888, Life Technologies), B-27-lisäravinnetta ilman A-vitamiinia (12587, Life Technologies), GlutaMaxia (1:100, Life Technologies) ja penisilliiniä.и стрептомицин (1:100, Life Technologies) и дополнены эпидермальным фактором роста (EGF; 20 нг/мл; R&D Systems) и фактомифром роста фактомиф; 20 нг/мл; T&K Systems) до 24-го дня. ja streptomysiiniä (1:100, Life Technologies) ja täydennettynä epidermaalisella kasvutekijällä (EGF; 20 ng/ml; R&D Systems) ja fibroblastikasvutekijällä 2 (FGF2; 20 ng/ml; R&D Systems) päivään 24 asti.Päivinä 25–42 aivoista peräisin olevaa neurotrofista tekijää (BDNF; 20 ng ml-1, Peprotech) ja neurotrofiini 3:a (NT3; 20 ng ml-1, Peprotech) lisättiin elatusaineeseen vaihtaen elatusainetta joka toinen päivä.在悬浮的第6 天，将神经球体转移到含有neurobasal-A（10888，Life Technologies）、不含焴A2生皴B不含焴A2生补充剂（12587，Life Technologies）、GlutaMax（1:100，Life Technologies）、青霉素的神经培养基中和培养基中和頌， Technologies）并辅以表皮生长因子（EGF；20 ng ml-1；R&D Systems）和成纤维细胞生长因子2（2（FGF2ng ml；D Järjestelmät）直至第24 天.在 悬浮 的 第 第 6 将 神 经 球体 转移 含有 含有 neurobasal-a （10888 绻破 ， Life Technologies０ 丟b-27 补充剂 （12587 ， Life Technologies） Glutamax （1: 100 ， Life TechNOGIS青霉素 的 神经 培养 基 中 韹养 基 中 韹养 基 中 1（ 0 ， Life Technologies） 表皮 生长 因子 （（（20 ng ml-1 ； tutkimus- ja kehitysjärjestelmät） 成 纤维 细胞 生长 2 （fgf2 ； 20 ng ml-1；R&D Järjestelmät）直至第24天. На 6-й день суспензии нейросферы были переведены на добавку, содержащую нейробазал-А (10888, Life Technобававаку72 без витамина А (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies), пенициллин- нейтрализованный стрептомицин (1:100, Life Technologies) эпидермального фактора роста (EGF; 20 нг мл-1; R&D Systems) ja фактора роста фибробластов 2 (FGF2; 20 нг мл-1) 1; Päivänä 6 neurosfäärisuspensiot vaihdettiin ravintolisään, joka sisälsi neurobasal-A:ta (10888, Life Technologies), A-vitamiinitonta B-27-lisää (12587, Life Technologies), GlutaMaxia (1:100, Life Technologies), penisilliinineutralisoitua streptomysiiniä (1:100, Life Technologies), johon oli lisätty epidermaalista kasvutekijää (EGF; 20 ng ml-1; R&D Systems) ja fibroblastikasvutekijä 2:ta (FGF2; 20 ng ml-1)1. T&K-järjestelmät) 24-го дня. T&K-järjestelmät) päivään 24 asti.Päivistä 25 vuoteen 42 aivoperäistä neurotrofista tekijää (BDNF; 20 ng ml-1, Peprotech) ja neurotrofista tekijää 3 (NT3; 20 ng ml-1, Peprotech) lisättiin viljelyalustaan ​​joka toinen päivä. Alusta vaihdettiin kerran.Päivästä 43 alkaen hCO2:ta ylläpidettiin täydentämättömässä neurobasal-A-elatusaineessa (NM; 1088022, Thermo Fisher) ja elatusaine vaihdettiin 4–6 päivän välein. HCO2:n saamiseksi syöttöaineettomissa olosuhteissa viljellyistä hiPS-soluista hiPS-soluja inkuboitiin Accutase-liuoksella (AT-104, Innovate Cell Technologies) 37 °C:ssa 7 minuutin ajan, erotettiin yksittäisiksi soluiksi ja levitettiin AggreWell 800 -levyille (34815, STEMCELL Technologies) tiheydellä 3 × 106 yksittäistä solua kuoppaa kohden Essential 8 -elatusaineessa, johon oli lisätty ROCK-inhibiittoria Y-27632 (10 μM; S1049, Selleckchem). 24 tunnin kuluttua kuoppien kasvatusalustat pipetoitiin ylös ja alas kasvatusalustaan, joka sisälsi Essential 6 -kasvatusalustaa (A1516401, Life Technologies), johon oli lisätty dorsomorfiinia (2,5 μM; P5499, Sigma-Aldrich) ja SB-431542:ta (10 μM; 1614). , Tocrida). Päivinä 2–6 Essential 6 -kasvatusalusta korvattiin päivittäin dorsomorfiinilla ja SB-431542-lisäravinteella. Kuudennesta päivästä lähtien neurosfäärisuspensiot siirrettiin neurobasaaliseen kasvatusalustaan ​​ja niitä ylläpidettiin edellä kuvatulla tavalla.
Kaikki eläintoimenpiteet suoritettiin Stanfordin yliopiston laboratorioeläinten hoitokomitean (APLAC) hyväksymien eläintenhoito-ohjeiden mukaisesti. Tiineinä olevat eutymiset RNU (rnu/+) -rotat ostettiin (Charles River Laboratories) tai niitä pidettiin tiloissa. Eläimiä pidettiin 12 tunnin valo-pimeäsyklissä, ja ruokaa ja vettä annettiin vapaasti. Kolmesta seitsemään päivän ikäiset karvattomat (FOXN1–/–) rotanpennut tunnistettiin kehittymättömien viiksikarvojen kasvun perusteella ennen lopetusta. Pennut (uros ja naaras) nukutettiin 2–3 % isofluraanilla ja asetettiin stereotaksiselle kehykselle. Kallosta tehtiin trepanaatio, jonka halkaisija oli noin 2–3 mm S1:n yläpuolella, samalla kun säilytettiin kovakalvon eheys. Sitten käytettiin 30 G:n neulaa (noin 0,3 mm) aivan kraniotomian ulkopuolella kovakalvon lävistämiseksi. Levitä sitten HCO3:ta ohuelle 3 × 3 cm:n parafilmille ja poista ylimääräinen elatusaine. Vedä Hamilton-ruiskulla, joka on kiinnitetty 23 G:n, 45°:n neulaan, varovasti hCO3:ta neulan distaaliseen päähän. Aseta sitten ruisku stereotaksiin laitteeseen kytkettyyn ruiskupumppuun. Aseta sitten neulan kärki aiemmin tehtyyn 0,3 mm leveään pistoreikään kovakalvoon (z = 0 mm) ja kavenna ruiskua 1–2 mm (z = noin –1,5 mm), kunnes neula on kovakalvon A välissä. Muodostuu tiivis tiiviste. Nosta sitten ruisku kortikaalisen pinnan keskelle kohtaan z = -0,5 mm ja injektoi hCO3:ta nopeudella 1–2 µl minuutissa. HCO3-injektion jälkeen neula vedetään takaisin nopeudella 0,2–0,5 mm minuutissa, iho ommellaan ja pentu asetetaan välittömästi lämpimälle lämpötyynylle, kunnes se toipuu kokonaan. Joillekin eläimille tehtiin molemminpuolinen siirto.
Kaikki eläintoimenpiteet suoritettiin Stanfordin yliopiston APLAC:n hyväksymien eläintenhoito-ohjeiden mukaisesti. Rotat (yli 60 päivää elinsiirron jälkeen) nukutettiin 5 %:n isofluraanilla ja nukutettiin 1–3 %:lla isofluraanilla kuvantamisen aikana. Visualisointia varten käytettiin 7 Teslan aktiivisesti suojattua vaakasuoraa porareikäskanneria Brukerilta (Bruker Corp.), jossa oli International Electric Companyn (IECO) gradienttimoottori, suojattu gradientti-insertti, jonka sisähalkaisija oli 120 mm (600 mT/m, 1000 T/m/s), AVANCE. III -ohjelmistoa, jossa oli kahdeksankanavainen monikelainen radiotaajuus- ja moniydinominaisuudet, sekä siihen liittyvä Paravision 6.0.1 -alusta. Tallennus suoritettiin käyttämällä aktiivisesti irrotettua volumetrista radiotaajuuskelaa, jonka sisähalkaisija oli 86 mm, ja nelikanavaista kryojäähdytettyä radiotaajuuskelaa pelkästään vastaanottoa varten. Axial 2D Turbo-RARE (toistoaika = 2500 ms, kaiutusaika = 33 ms, 2 keskiarvoa), 16 viipaleen sieppausta, viipaleen paksuus 0,6–0,8 mm, sisältäen 256 × 256 näytettä. Signaalit vastaanotettiin käyttämällä kvadratuurilähetin-vastaanottimen volumetrista RF-kelaa, jonka sisähalkaisija oli 2 cm (Rapid MR International, LLC). Lopuksi käytettiin sisäänrakennettuja Imaris (BitPlane) -pinnanestimointifunktioita 3D-renderöintiin ja tilavuusanalyysiin. Onnistuneeksi elinsiirroksi määriteltiin sellainen, jossa siirretylle aivopuoliskolle muodostui jatkuvan T2-painotetun MRI-signaalin alueita. Siirteen hyljintä määriteltiin siirteenä, joka ei tuottanut jatkuvan T2-painotetun MRI-signaalin alueita siirretylle aivopuoliskolle. Subkortikaalinen t-hCO2 jätettiin pois myöhemmästä analyysistä.
GCaMP6-molekyylien stabiiliksi ilmentämiseksi hCO:ssa kaksifotonikalsiumkuvausta varten hiPS-solut infektoitiin pLV[Exp]-EF1a::GcaMP6s-WPRE-Puro-plasmidilla, minkä jälkeen valittiin antibiootit. Lyhyesti sanottuna solut dissosioitiin EDTA:lla ja suspendoitiin 1 ml:aan Essential 8 -elatusainetta noin 300 000 solun tiheydellä polybreenin (5 μg/ml) ja 15 μl:n virusmäärän läsnä ollessa. Soluja inkuboitiin sitten suspensiossa 60 minuuttia ja kylvettiin tiheydellä 50 000 solua per kuoppa. Konfluenssin jälkeen soluja käsiteltiin 5–10 μg ml-1 puromysiinillä 5–10 päivän ajan tai kunnes stabiileja pesäkkeitä ilmestyi. Akuutti hCO-infektio suoritettiin aiemmin kuvatulla tavalla5 muutamin muutoksin. Lyhyesti sanottuna, siirrettiin päivän 30–45 hCO 1,5 ml:n Eppendorf-mikrosentrifugiputkiin, jotka sisälsivät 100 µl hermoväliainetta. Sitten noin 90 µl väliainetta poistetaan, putkeen lisätään 3–6 µl korkeatiitteristä lentivirusta (0,5 x 108 - 1,2 x 109) ja hCO3 siirretään inkubaattoriin 30 minuutiksi. Lisää sitten 90–100 µl väliainetta jokaiseen putkeen ja palauta putket inkubaattoriin yön yli. Seuraavana päivänä hCO3 siirretään tuoreeseen hermoväliaineeseen matalan kiinnittymisen levyille. Seitsemän päivän kuluttua hCO3 siirrettiin 24-kuoppaisille lasipohjaisille levyille infektion laadun visualisointia ja arviointia varten. pLV[Exp]-SYN1::EYFP-WPRE ja pLV[Exp]-SYN1::hChR2-EYFP-WPRE luotiin VectorBuilderilla. Lentivirusta käytetään useimmissa kokeissa, koska se on integroitunut isäntägenomiin, mikä mahdollistaa reportterigeenin ilmentymisen infektoituneissa solulinjoissa. Rabieksen seurantaa varten päivinä 30–45 hCO:lle tehtiin yhteisinfektio rabies-ΔG-eGFP:llä ja AAV-DJ-EF1a-CVS-G-WPRE-pGHpA:lla (plasmidi #67528, Addgene), sitä pestiin huolellisesti 3 päivän ajan ja siirrettiin rottiin S1-vaiheeseen, jossa sitä pidettiin in vivo 7–14 päivän ajan.
Immunosytokemiaa varten eläimet nukutettiin ja perfusoitiin transkardiaalisesti PBS:llä ja sen jälkeen 4 % paraformaldehydillä (PFA PBS:ssä; Electron Microscopy Sciences). Aivot fiksoitiin 4 % PFA:ssa 2 tuntia tai yön yli 4 °C:ssa, kryosäilöttiin 30 % sakkaroosiin PBS:ssä 48–72 tuntia ja upotettiin 30 % sakkaroosiin ja OCT:hen (Tissue-Tek OCT Compound 4583, Sakura Finetek) suhteessa 1:1. Koronaaliset leikkeet tehtiin 30 µm:n paksuisina kryostaattia (Leica) käyttäen. Paksujen leikkeiden immunohistokemiaa varten eläimet perfusoitiin PBS:llä, ja aivot dissektioitiin ja leikattiin koronaalisesti 300–400 µm:n paksuisina leikkeinä käyttäen vibratomia (Leica). Leikkeitä fiksoitiin 4 % PFA:lla 30 minuuttia. Sitten kryosektiot tai paksut leikkeet pestiin PBS-liuoksella, blokattiin 1 tunnin ajan huoneenlämmössä (10 % normaalia aasin seerumia (NDS) ja 0,3 % Triton X-100 laimennettuna PBS-liuokseen) ja blokattiin blokkausliuoksella 4 °C:ssa. – Inkubointi Kryosektioita inkuboitiin yön yli ja paksuja leikkeitä 5 päivää. Käytetyt ensisijaiset vasta-aineet olivat: anti-NeuN (hiiri, 1:500; ab104224, abcam), anti-CTIP2 (rotta, 1:300; ab18465, abcam), anti-GFAP (kani, 1:1 000; Z0334, Dako), anti-GFP (kana, 1:1 000; GTX13970, GeneTex), anti-HNA (hiiri, 1:200; ab191181, abcam), anti-NeuN (kani, 1:500; ABN78, Millipore), anti-PDGFRA (kani, 1:200; sc-338, Santa Cruz), anti-PPP1R17 (kani, 1:200; HPA047819, Atlas-vasta-aineet), anti-RECA-1 (hiiri, 1:50; ab9774, abcam), anti-SCG2 (kani, 1:100; 20357-1-AP, Proteintech), anti-SOX9 (vuohi, 1:500; AF3075, R&D Systems), Netrin G1a (vuohi, 1:100; AF1166, R&D Systems), anti-STEM121 (hiiri, 1:200; Y40410, Takara Bio), anti-SATB2 (hiiri, 1:50; ab51502, abcam), anti-GAD65/67 (kani, 1:400; ABN904, Millipore) ja anti-IBA1 (vuohi, 1:100; ab5076, abcam). Käytetyt ensisijaiset vasta-aineet olivat: anti-NeuN (hiiri, 1:500; ab104224, abcam), anti-CTIP2 (rotta, 1:300; ab18465, abcam), anti-GFAP (kani, 1:1 000; Z0334, Dako), anti-D-GFP (kana, 1:1 000; GTX13970, GeneTex), anti-HNA (hiiri, 1:200; ab191181, abcam), anti-NeuN (kani, 1:500; ABN78, Millipore), anti-PDGFRA (kani, 1:200; sc-338, Santa Cruz), anti-PPP1R17 (kani, 1:200; HPA047819, Atlas-vasta-aineet), anti-RECA-1 (hiiri, 1:50; ab9774, abcam), anti-SCG2 (kani, 1:100; 20357-1-AP, Proteintech), anti-SOX9 (vuohi, 1:500; AF3075, R&D Systems), Netrin G1a (vuohi, 1:100; AF1166, R&D Systems), anti-STEM121 (hiiri, 1:200; Y40410, Takara Bio), anti-SATB2 (hiiri, 1:50; ab51502, abcam), anti-GAD65/67 (kani, 1:400; ABN904, Millipore) ja anti-IBA1 (vuohi, 1:100; ab5076, abcam). Использовались следующие первичные антитела: анти-NeuN (мышиные, 1:500; ab104224, abcam), анти-CTIP2 (30;ке, CTIP2: ны0; ab18465, abcam), анти-GFAP (кроличьи, 1:1000; Z0334, Dako), анти-GFP (курица, 1:1000; GTX13970, GeneTex), анти-HNA (мы1,2910,8; abcam), анти-NeuN (кролик, 1:500; ABN78, Millipore), анти-PDGFRA (кролик, 1:200; sc-338, Санта-Круз), анти-PPP1R17 (кролик, 1:200; HPA047819, Atlas-vasta-aineet), 1:5, 1, ма-1 ab9774, abcam), анти-SCG2 (кролик , 1:100; 20357-1-AP, Proteintech), анти-SOX9 (козий, 1:500; AF3075, R&D Systems), нетрин G1a,;,1:1&101a Systems), анти-STEM121 (мышиный , 1:200; Y40410, Takara Bio), анти-SATB2 (мышь, 1:50; ab51502, abcam), анти-GAD65/67 (кролик, 1:400; ABN904)-IBAiант904, (коза, 1:100; аб5076, абкам). Käytetyt ensisijaiset vasta-aineet olivat: anti-NeuN (hiiri, 1:500; ab104224, abcam), anti-CTIP2 (rotta, 1:300; ab18465, abcam), anti-GFAP (kani, 1:1000; Z0334, Dako), anti-GFP (kana, 1:1000; GTX13970, GeneTex), anti-HNA (hiiri, 1:200; ab191181, abcam), anti-NeuN (kani, 1:500; ABN78, Millipore), anti-PDGFRA (kani, 1:200; sc-338, Santa Cruz), anti-PPP1R17 (kani, 1:200; HPA047819, Atlas-vasta-aineet), anti-RECA-1 (hiiri, 1:50; ab9774, abcam), anti-SCG2 (kani, 1:100; 20357-1-AP, Proteintech), anti-SOX9 (vuohi, 1:500; AF3075, R&D Systems), netrin G1a (vuohi, 1:100; AF1166, R&D Systems), anti-STEM121 (hiiri, 1:200; Y40410, Takara Bio), anti-SATB2 (hiiri, 1:50; ab51502, abcam), anti-GAD65/67 (kani, 1:400; ABN904, Millipore) ja anti-IBA1 (vuohi, 1:100; ab5076, abkam).使用的一抗是：抗NeuN（小鼠，1:500；ab104224，abcam）抗CTIP2（大鼠，1:3 00；ab18465，abcam），抗GFAP（兔，1:1,000；Z0334，Dako），抗-GF P（鸡，1:1 000；GTX13970，GeneTex），抗HNA（小鼠，1:200；ab1911 81，abcam），抗NeuN（兔，1:500；ABN78，Millipore），抗PDGFRA（兔， 1:200；sc-338，Santa Cruz），抗PPP1R17（兔，1:200；HPA047819，Atlas抗体），抗RECA-1（小鼠，1:50；ab9774，abcam），抗SCG2（兔） , 1:100；20357-1-AP，Proteintech），抗SOX9（山羊，1:500；AF3075，T&K-järjestelmät），Netrin G1a（山羊，1:100；AF1166，R&D Systems），抗STEM121（小鼠, 1:200;使用的一抗是：抗NeuN（小鼠，1:500；ab104224，abcam）抗CTIP2（大鼠，1 :300；ab18465，abcam），抗GFAP（兔，1:1,000；Z0334，Dako），抗-GFP（鸡，1:1 000；GTX13970，GeneTex），抗HNA（小鼠，1:200；ab 191181，abcam），抗NeuN（兔，1:500；ABN78，Millipore％弔，抗1: 200；sc-338，Santa Cruz），抗PPP1R17（兔，1:200；HPA047819，Atlas抗体），抗RECA-1（小鼠，1:50；ab9774，abcam），抗SCG2 100；20357-1-AP，Proteintech），抗SOX9（山羊，1:500；AF3075，R&D Systems），Netrin G1a（山羊，1:100， Järjestelmät）頏1:20, ;Y40410, Takara Bio), anti-SATB2 (hiiri, 1:50; ab51502, abcam), anti-GAD65/67 (kani, 1:400; ABN904, Millipore) ja anti-IBA1 (vuohi, 1:100; ab5076, abcam).Käytetyt ensisijaiset vasta-aineet olivat: anti-NeuN (hiiri, 1:500; ab104224, abcam), anti-CTIP2 (rotta, 1:300; ab18465, abcam), anti-GFAP (kani, 1:1000; Z0334, Dako). , anti-GFP (kana, 1:1000; GTX13970, GeneTex), anti-HNA (hiiri, 1:200; ab191181, abcam), anti-NeuN (kani, 1:500; ABN78, Millipore), anti-PDGFRA (kani, 1:200; sc-338, Santa Cruz), anti-PPP1R17 (kani, 1:200; HPA047819, Atlas-vasta-aine), anti-RECA-1 (hiiri, 1:50; ab9774, abcam), anti-SCG2 (kani), 1:100;20357-1-AP, Proteintech), анти-SOX9 (коза, 1:500; AF3075, R&D Systems), Нетрин G1a (коза, 1:100; AF1166, R&D Systems), анти -STEM120,,1:401, (Yмыш20;, 1:40; Takara Bio), анти-SATB2 (мышь, 1:50; ab51502, abcam), анти-GAD65/67 (кролик, 1:400; ABN904, Millipore) ja анти-IBA1 (коза, 6,1500; 6,1500; 1,15). 20357-1-AP, Proteintech), anti-SOX9 (vuohi, 1:500; AF3075, R&D Systems), Netrin G1a (vuohi, 1:100; AF1166, R&D Systems), anti-STEM121 (hiiri, 1:200; Y40410, Takara Bio), anti-SATB2 (hiiri, 1:50; ab51502, abcam), anti-GAD65/67 (kani, 1:400; ABN904, Millipore) ja anti-IBA1 (vuohi, 1:100; ab5076, abkam).Leikkeet pestiin sitten PBS:llä ja inkuboitiin sekundaarisen vasta-aineen kanssa 1 tunnin ajan huoneenlämmössä (paksut leikkeet) tai yön yli 4 °C:ssa (paksut leikkeet). Käytettiin Alexa Fluor -sekundaarista vasta-ainetta (Life Technologies) laimennettuna 1:1000 estoliuoksessa. PBS-pesun jälkeen tumat visualisoitiin Hoechst 33258 -laitteella (Life Technologies). Lopuksi lasilevyt asetettiin peitinlaseilla varustetulle mikroskoopille (Fisher Scientific) käyttäen Aquamount-laitetta (Polysciences) ja analysoitiin Keyence-fluoresenssimikroskoopilla (BZ-X-analysaattori) tai Leica TCS SP8 -konfokaalimikroskoopilla (Las-X) kuvan perusteella. Kuvat käsiteltiin ImageJ-ohjelmalla (Fiji). Ihmisen hermosolujen osuuden kvantifioimiseksi t-hCO:ssa ja rotan aivokuoressa otettiin 387,5 μm leveitä suorakaiteen muotoisia kuvia t-hCO:n keskeltä, rotan aivokuoren reunalta tai läheltä sitä. Siirteen reunat määritettiin arvioimalla muutoksia kudoksen läpinäkyvyydessä, HNA+-ytimissä ja/tai kudoksen autofluoresenssin esiintymisessä. Jokaisessa kuvassa NeuN+- ja HNA+-solujen kokonaismäärä jaettiin samalla alueella olevien NeuN+-solujen kokonaismäärällä. Jotta varmistettaisiin, että vain kuvatasossa olevat tumat sisältävät solut lasketaan mukaan, laskelmaan sisällytetään vain solut, jotka ovat myös Hoechst-positiivisia. Kahden vähintään 1 mm:n etäisyydellä toisistaan ​​olevan kuvan keskiarvo laskettiin tilastollisen virheen pienentämiseksi.
Viikkoa ennen näytteenottoa hCO3-siirtoeläimet (noin 8 kuukautta erilaistumista) asetetaan pimeään huoneeseen, viikset leikattuina aistinvaraisen stimulaation minimoimiseksi. Tumien eristäminen suoritettiin aiemmin kuvatulla tavalla, joitakin muutoksia tehden. Lyhyesti sanottuna t-hCO3 ja hCO3 tuhottiin käyttämällä pesuaine-mekaanista solulyysiä ja 2 ml:n lasikudosjauhinta (D8938, Sigma-Aldrich/KIMBLE). Raa'at tumat suodatettiin sitten pois 40 µm:n suodattimella ja sentrifugoitiin 320 g:llä 10 minuuttia 4 °C:ssa ennen sakkaroositiheysgradientin suorittamista. Sentrifugointivaiheen (320 g 20 minuuttia 4 °C:ssa) jälkeen näytteet suspendoitiin uudelleen 0,04 % BSA/PBS:ään lisäämällä 0,2 yksikköä µl-1 RNase-inhibiittoria (40 u µl-1, AM2682, Ambion) ja johdettiin 40 µm:n virtaussuodattimen läpi. Dissosioituneet tumat suspendoitiin sitten uudelleen PBS:ään, joka sisälsi 0,02 % BSA:ta, ja ladattiin Chromium Single Cell 3' -sirulle (arvioitu talteenotto 8 000 solua kaistaa kohden). snRNA-seq-kirjastot valmistettiin Chromium Single cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3:lla (10x Genomics). snRNA-seq-kirjastot valmistettiin Chromium Single cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3:lla (10x Genomics). Библиотеки snRNA-seq были приготовлены с помощью Chromium Single cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics). snRNA-seq-kirjastot valmistettiin käyttämällä Chromium Single cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics). snRNA-seq 文库是使用Chromium Single cell 3′ GEM、Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics) 制备的。 snRNA-seq 文库是使用Chromium Single cell 3′ GEM、Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics) 制备的。 Библиотеку snRNA-seq готовили с использованием Chromium Single Cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics). snRNA-seq-kirjasto valmistettiin käyttämällä Chromium Single Cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics).Eri näytteistä peräisin olevat kirjastot yhdistettiin ja sekvensoitiin Admera Healthin toimesta NovaSeq S4:llä (Illumina).
Kunkin oletetun tumaviivakoodin geeniekspressiotasot kvantifioitiin käyttämällä 10x Genomics CellRanger -analyysiohjelmistopakettia (versio 6.1.2). Tarkemmin sanottuna lukemia verrattiin ihmisen (GRCh38, Ensemble, versio 98) ja rotan (Rnor_6.0, Ensemble, versio 100) referenssigenomien yhdistelmään, jotka oli luotu mkref-komennolla ja käyttäen count-funktiota yhdessä –include-introns=TRUE-komennon kanssa intronialueille kartoitettujen lukemien kvantifiointiin. t-hCO2-näytteiden osalta ihmisen tumat tunnistettiin konservatiivisen vaatimuksen perusteella, että vähintään 95 % kaikista kartoitetuista lukemista vastaa ihmisen genomia. Kaikki myöhemmät analyysit tehtiin CellRangerin tuottamalla suodatetulla viivakoodimatriisilla käyttäen R-pakettia (versio 4.1.2) ja Seurat-ohjelmaa (versio 4.1.1)32.
Jotta myöhempään analyysiin sisällytettäisiin vain korkealaatuisia tumia, kullekin näytteelle tehtiin iteratiivinen suodatusprosessi. Ensin tunnistetaan ja poistetaan heikkolaatuiset tumat, joissa on alle 1000 ainutlaatuista geeniä ja yli 20 % mitokondrioiden kokonaismäärästä. Tämän jälkeen raaka geenimäärämatriisi normalisoitiin regularisoidulla negatiivisella binomiregressiolla käyttäen sctransform(vst.flavor=”v2”)-funktiota, joka myös tunnisti 3000 eniten vaihtelevaa geeniä oletusparametreilla. Ylimmän muuttujan geeneille suoritettiin dimension pienennys käyttämällä pääkomponenttianalyysiä (PCA) oletusparametreilla käyttäen 30:n dimensiota (dims = 30 valittiin polven kohtien visuaalisen tarkastuksen perusteella ja sitä käytettiin kaikissa näytteissä ja ensemble-analyyseissä). Sitten suoritimme useita iteratiivisen klusteroinnin kierroksia (resoluutio = 1) luokitellaksemme geenejä epänormaalin alhaisen geenimäärän (mediaani alle 10. persentiilin), epänormaalin korkean mitokondriaalisen geenimäärän (mediaani yli 95. persentiilin) ​​perusteella tunnistaaksemme ja poistaaksemme oletetut heikkolaatuiset solut, klusterit ja/tai suuri osuus epäillyistä kaksosista, jotka tunnistettiin DoubletFinder33-paketilla (keskimääräinen DoubletFinder-pistemäärä yli 95. persentiilin). t-hCO2-näytteet (n=3) ja hCO2-näytteet (n=3) integroitiin erikseen käyttämällä IntegrateData-funktiota yllä olevilla parametreilla. Sitten Integroidun tietojoukon kvalitatiivisen suodatuksen toinen kierros suoritettiin edellä kuvatulla tavalla.
Heikkolaatuisten ytimien poistamisen jälkeen integroitu datajoukko ryhmiteltiin (resoluutio = 0,5) ja upotettiin UMAP34-visualisointia varten. Kunkin klusterin markkerigeenit määritettiin FindMarkers-funktiolla käyttäen normalisoiduista geenien ilmentymisdatasta laskettuja oletusparametreja. Tunnistamme ja luokittelemme tärkeimmät soluluokat yhdistämällä sikiön ja aikuisen aivokuoren vertailudatajoukot markkerigeenien ilmentymiseen 19, 20, 21, 35 ja annotaatioihin. Erityisesti verenkierrossa olevat prekursorit tunnistettiin MKI67:n ja TOP2A:n ilmentymisen perusteella. Progenitoriklusterit määriteltiin mitoottisten transkriptien puuttumisen, suuren päällekkäisyyden sikiön aivokuoren myöhäisessä metafaasissa kuvattujen multipotenttien gliasolujen progenitoriklusterien kanssa sekä EGFR:n ja OLIG1:n ilmentymisen perusteella. Käytämme termiä astrosyytti kattamaan useita astrosyyttien erilaistumisen tiloja myöhäisestä radiaaligliasta astrosyyttien kypsymiseen. Astrosyyttiklusterit ilmentävät korkeita SLC1A3- ja AQP4-tasoja, ja niiden on osoitettu kartoittuvan sikiön radiaaliglian ja/tai aikuisten astrosyyttien alatyyppeihin. OPC-solut ilmentävät PDGFRA:ta ja SOX10:tä, kun taas oligodendrosyytit ilmentävät myelinaatiomarkkereita (MOG ja MYRF). Glutamatergiset neuronit tunnistettiin neuronaalisten transkriptien (SYT1 ja SNAP25) läsnäolon, GABAergisten markkerien puuttumisen (GAD2) sekä NEUROD6:n, SLC17A7:n, BCL11B:n tai SATB2:n ilmentymisen perusteella. GluN-neuronit jaettiin edelleen ylempiin (SATB2:n ilmentyminen ja BCL11B:n puutos) ja syviin (BCL11B:n ilmentyminen) alaluokkiin. Oletetut alalevyn (SP) neuronit ilmentävät tunnettuja SP18-markkereita, kuten ST18:aa ja SORCS1:tä, syvien GluN-markkereiden lisäksi. Suonikalvon hermopunoksen kaltaiset solut tunnistettiin TTR:n ilmentymisen perusteella, ja aivokalvon kaltaiset solut ilmensivät fibroblasteihin liittyviä geenejä ja kartoittivat vertailuaineiston piaali-/verisuonisoluja.
Geeniekspression differentiaalinen analyysi t-hCO3- ja hCO3-alaluokkien välillä suoritettiin käyttämällä uutta pseudo-batch-menetelmää, joka toistettiin Libra R -paketilla (versio 1.0.0) toteutetuissa näytteissä. Tarkemmin sanottuna ryhmille suoritettiin edgeR-log-likelihood-testit (versio 3.36.0, paketti R) laskemalla yhteen tietyn soluluokan solujen geenien lukumäärä kullekin näytereplikoinnille. Lämpökarttojen visualisointia varten normalisoidut miljoonasosa-arvot (CPM) laskettiin käyttämällä edgeR:ää (cpm()-funktio) ja skaalattiin (keskiarvon = 0, keskihajonnan = 1 saavuttamiseksi). Merkittävästi ylösilmentyneiden t-hCO3 GluN -geenien geeniontologiaan (GO) perustuva rikastusanalyysi (Benjamini-Hochberg-korjattu P-arvo alle 0,05, ilmentyen vähintään 10 %:ssa t-hCO3 GluN -soluista, ja muutoksen kertainen kasvu vähintään kaksinkertainen) tehtiin ToppGene Suite -ohjelmistolla (https://toppgene.cchmc.org/)37. Käytämme ToppFun-sovellusta oletusparametreilla ja raportoimme Benjamini-Hochberg-korjatut P-arvot, jotka on laskettu GO-annotoiduista hypergeometrisista testeistä.
Yhdistääksemme snRNA-sekvensointiklusterimme primaaristen yksisoluisten RNA-sekvensointien tai aikuisten snRNA-sekvensointien vertailututkimusten annotoituihin soluklustereihin19,20,21,22, käytimme paritetun datasetin integrointimenetelmää. Käytimme Seuratin SCTransform (v2) -normalisointityönkulkua integroidaksemme ja vertaillaksemme klusterien päällekkäisyyksiä datasettien välillä (käyttäen samoja parametreja kuin yllä). Yksittäiset datasetit jaettiin satunnaisesti osajoukkoihin enintään 500 solua tai ydintä alkuperäistä klusteria kohden laskennallisen tehokkuuden parantamiseksi. Käyttämällä aiemmin kuvattua samankaltaista lähestymistapaa klusterien päällekkäisyys määriteltiin niiden solujen tai tumien osuudeksi kussakin yhdistetyssä klusterissa, jotka olivat päällekkäisiä vertailuklusterin merkinnän kanssa. GluN-solujen tarkempaa luokittelua varten käytimme Seuratin TransferData-työnkulkua GluN-osajoukkodatalle määrittääksemme vertailutietosetin merkinnät GluN-soluillemme.
Arvioidaksemme t-hCO- ja hCO-näytteiden globaalin transkriptomin kypsymistilaa vertasimme pseudobulk-näytteitämme BrainSpan/psychENCODE23-tietokantaan, joka koostuu laajasta RNA-sekvenssistä, joka kattaa ihmisen aivojen kehityksen. Suoritimme PCA:n yhdistetylle kuvio-normalisoidulle geenien ilmentymismatriisille aivokuoren näytteistä 10 viikkoa hedelmöityksen jälkeen ja myöhemmin 5567 geenille (yhdessä tietojemme kanssa), jotka oli aiemmin tunnistettu aktiivisiksi BrainSpanin aivokuoren näytteissä (määritelty yli 50 %:n kehitysvarianssina, joka selittyy iän avulla kuutiomallia käyttäen)38. Lisäksi johdimme geenejä, jotka liittyvät neurologisen kehityksen tärkeimpiin transkriptomin ominaisuuksiin, käyttämällä ei-negatiivista matriisifaktorisointia aiemmin kuvatulla tavalla. Ei-negatiivisella matriisifaktorisointimenetelmällä lasketut otospainot on esitetty kuvissa 5b, joissa on laajennetut tiedot kullekin viidelle Zhu et al.38 kuvaamalle ominaisuudelle. Jälleen kerran aktiivisuudesta riippuvat transkriptiomerkit johdettiin aiemmin julkaistuista tutkimuksista. Erityisesti ERG:n ja LRG:n ilmentymät lisääntyivät merkittävästi glutamatergisissa neuroneissa, jotka tunnistettiin hiiren näköaivokuoren snRNA-sekvensointikokoelmalla visuaalisen stimulaation jälkeen lisätaulukosta 3 Hrvatin et al.16. Ihmisellä rikastetut LRG:t saatiin KCl:lla aktivoiduista ihmisen sikiön aivoviljelmistä ja kerättiin 6 tuntia stimulaation jälkeen, ja suodatettujen geenien ilmentymät lisääntyivät merkittävästi ihmisillä, mutta eivät jyrsijöillä (lisätaulukko 4). Geenisettien rikastumisen analyysi näitä geenisettejä käyttäen suoritettiin käyttämällä yksisuuntaista Fisherin tarkkaa testiä.
Nukuta rotat isofluraanilla, poista aivot ja aseta ne kylmään (noin 4 °C) hapetettuun (95 % O2 ja 5 % CO2) sakkaroosiliuokseen, joka sisältää: 234 mM sakkaroosia, 11 mM glukoosia, 26 mM NaHCO3:a, 2,5 mM KCl:a, 1,25 mM NaH2PO4:a, 10 mM MgSO4:a ja 0,5 mM CaCl2:a (noin 310 mOsm). Rotan aivojen koronaalileikkeet (300–400 µm), jotka sisälsivät t-hCO3:a, tehtiin Leica VT1200 -vibratomilla aiemmin kuvatulla tavalla39. Leikkeet siirrettiin sitten leikekammioon, jossa oli jatkuva huoneenlämmössä tapahtuva hapetus ja joka sisälsi aCSF:ää, joka oli valmistettu: 10 mM glukoosista, 26 mM NaHCO3:sta, 2,5 mM KCl:sta, 1,25 mM NaHPO4:sta, 1 mM MgSO4:sta, 2 mM CaCl2:sta ja 126 mM NaCl:sta (298 mOsm). vähintään 45 minuuttia ennen rekisteröintiä. Leikkeet rekisteröitiin upotettuun kammioon, jossa niitä perfusoitiin jatkuvasti aCSF:llä (95 % O2 ja 5 % CO2 -injektiopullo). Kaikki tiedot rekisteröitiin huoneenlämmössä. t-hCO-neuronit päätettiin borosilikaattilasipipetillä, joka oli täytetty liuoksella, joka sisälsi 127 mM kaliumglukonaattia, 8 mM NaCl:a, 4 mM magnesium-ATP:tä, 0,3 mM natrium-GTP:tä, 10 mM HEPES:iä ja 0,6 mM EGTA:ta, pH 7,2, sisäinen liuos, joka oli säädetty KOH:lla (290 mOsm). Talteen ottamiseksi rekisteröintiliuokseen lisättiin biosytiiniä (0,2 %).
Tiedot kerättiin MultiClamp 700B -vahvistimella (Molecular Devices) ja Digidata 1550B -digitointilaitteella (Molecular Devices), alipäästösuodatettiin 2 kHz:n taajuudella, digitoitiin 20 kHz:n taajuudella ja analysoitiin Clampfit- (Molecular Devices) ja Originiin (OriginPro, 2021b, OriginLab) sekä mukautetuilla MATLAB-funktioilla (Mathworks). Liitospotentiaali laskettiin JPCalc-ohjelmalla ja arvot säädettiin laskettuun arvoon -14 mV. Operaatio IV koostuu sarjasta virta-askeleita 10–25 pA:n askelin välillä -250–750 pA.
Talamusta, valkeaa ainetta ja S1-afferentteja stimuloitiin sähköisesti talamokortikaalisissa viipaleissa hCO-neuronien patch-clamp-rekisteröinnin aikana, kuten aiemmin on kuvattu. Lyhyesti sanottuna aivot asetettiin 10 asteen kulmaan kallistetulle 3D-tulostuspöydälle ja aivojen etuosa leikattiin 35 asteen kulmassa. Aivot liimattiin sitten leikkauspintaan ja leikattiin säilyttäen talamokortikaaliset ulkonevat aksonit. Bipolaariset volframielektrodit (0,5 MΩ) kiinnitettiin toiseen mikromanipulaattoriin ja sijoitettiin strategisesti stimuloimaan neljää aluetta solua kohden (sisäkapseli, valkea aine, S1 ja hCO). Rekisteröi synaptiset vasteet 300 µA:n vaiheellisen stimulaation jälkeen 0,03–0,1 Hz:n taajuudella.
hChR2:ta ilmentävät hCO-neuronit aktivoitiin 480 nm:ssä ja LEDin (Prizmatix) tuottamat valopulssit johdettiin ×40-objektiivin (0.9 NA; Olympus) läpi hChR2:n ilmentymisen tallentamiseksi solujen lähellä. Valaistun kentän halkaisija oli noin 0,5 mm ja kokonaisteho 10–20 mW. Pulssinleveys asetettiin 10 millisekuntiin, mikä vastaa käyttäytymisen oppimiskokeessa annettua pulssia. Käytettiin erilaisia ​​stimulaatiotaajuuksia, 1–20 Hz, mutta kvantifiointiin käytettiin vain sarjan ensimmäistä pulssia. Sarjojen väliset aikavälit ovat yleensä yli 30 sekuntia, jotta vaikutus synaptisiin inhiboiviin tai fasilitoivaan reittiin olisi mahdollisimman pieni. Testataksemme, oliko hChR2-vaste monosynaptinen, lisäsimme kylpyyn TTX:tä (1 μM), kunnes EPSC-reaktio katosi, ja sitten lisäsimme 4-aminopyridiiniä (4-AP; 100 μM). Tyypillisesti vaste palautuu muutamassa minuutissa, ja LEDin laukaisun ja EPSC:n syntymisen välillä on hieman pidempi viive. NBQX:ää (10 μM) käytettiin testaamaan, ohjaako vaste AMPA-reseptorit.
Terävät hCO3-leikkeet luotiin aiemmin kuvatulla tavalla. Lyhyesti sanottuna hCO3-leikkeet upotettiin 4 % agaroosiin ja siirrettiin soluihin, jotka sisälsivät 126 mM NaCl:a, 2,5 mM KCl:a, 1,25 mM NaH2PO4:a, 1 mM MgSO4:a, 2 mM CaCl2:a, 26 mM NaHCO3:a ja 10 mM d-(+)-glukoosia. Leikkeet leikattiin 200–300 µm:n paksuisina huoneenlämmössä Leica VT1200 -värähtelijällä ja säilytettiin ASF-liuoksessa huoneenlämmössä. Sitten kokonaisten solujen patch-camp-rekisteröinti suoritettiin hCO3-leikkeille suoralla SliceScope-mikroskoopilla (Scientifica). Leikkeet perfusoitiin aCSF:llä (95 % O2 ja 5 % CO2) ja solusignaalit rekisteröitiin huoneenlämmössä. hCO₂-neuroneja levitettiin borosilikaattilasipipetillä, joka oli täytetty liuoksella, joka sisälsi 127 mM kaliumglukonaattia, 8 mM NaCl:a, 4 mM magnesium-ATP:tä, 0,3 mM natrium-GTP:tä, 10 mM HEPES:iä ja 0,6 mM EGTA:ta, sisäinen pH 7, 2, säädetty KOH:lla (osmolaarisuus 290). Talteenottoa varten sisäiseen liuokseen lisättiin 0,2 % biosytiiniä.
Tiedot hankittiin Clampexilla (Clampex 11.1, Molecular Devices) käyttäen MultiClamp 700B -vahvistinta (Molecular Devices) ja Digidata 1550B -digitointilaitetta (Molecular Devices). Tiedot suodatettiin alipäästösuodatuksella 2 kHz:n taajuudella, digitalisoitiin 20 kHz:n taajuudella ja analysoitiin Clampfit-ohjelmistolla (versio 10.6) analyysiä varten (molecular devices) ja mukautetuilla MATLAB-funktioilla (MATLAB 2019b, Mathworks). Liitospotentiaali laskettiin JPCalc-ohjelmistolla ja syötteet säädettiin laskettuun -14 mV:n liitospotentiaaliin. Operaatio IV koostuu sarjasta virta-askeleita 5–10 pA:n askelin välillä -50–250 pA.
Puristettujen hermosolujen morfologista rekonstruktiota varten sisäiseen liuokseen lisättiin 0,2 % biosytiiniä (Sigma-Aldrich). Soluja pohjustetaan vähintään 15 minuuttia rikkomisen jälkeen. Pipettiä vedetään sitten hitaasti sisään 1–2 minuutin ajan, kunnes rekisteröity kalvo on täysin suljettu. Leikefysiologisen toimenpiteen jälkeen leikkeet kiinnitettiin yön yli 4 °C:ssa 4 % PFA:ssa, pestiin PBS X3:lla ja laimennettiin suhteessa 1:1000 streptavidiinikonjugoidulla DyLight 549:llä tai DyLight 405:llä (Vector Labs). Biosytiinillä (2 %; Sigma-Aldrich) täytetyt solut merkittiin patch clamp -rekisteröinnin aikana huoneenlämmössä 2 tunnin ajan. Sitten leikkeet kiinnitettiin mikroskooppilaseille käyttäen Aquamount-laitetta (Thermo Scientific) ja visualisoitiin seuraavana päivänä Leica TCS SP8 -konfokaalimikroskoopilla käyttäen öljyimmersio-objektiivia, jonka numeerinen aukko oli ×40 1,3, suurennus ×0,9–1,0, xy. Näytteenottotaajuus on noin 7 pikseliä mikronia kohden. Z-pinot otettiin sarjana 1 µm:n välein, ja z-pino-mosaiikit ja Leica-pohjainen automaattinen ompelu suoritettiin kunkin neuronin koko dendriittisen puun peittämiseksi. Neuronien seuranta tehtiin sitten puolimanuaalisesti neuTube 40 -käyttöliittymän avulla ja SWC-tiedostot luotiin. Tiedostot ladattiin sitten SimpleNeuriteTracer41 Fiji -laajennukseen (ImageJ, versio 2.1.0; NIH).
Ihmisen aivokuoren kudosnäytteet kerättiin tietoon perustuvalla suostumuksella Stanfordin yliopiston tutkimuslautakunnan hyväksymän protokollan mukaisesti. Kaksi ihmisen synnytyksen jälkeistä kudosnäytettä (3 ja 18-vuotiailta) saatiin poistamalla otsalohkon alue (keskimmäinen otsalohko) osana hoitoresistentin epilepsian leikkausta. Resektion jälkeen kudos kerättiin jääkylmään NMDG-aCSF-liuokseen, joka sisälsi: 92 mM NMDG:tä, 2,5 mM KCl:a, 1,25 mM NaH2PO4:a, 30 mM NaHCO3:a, 20 mM HEPES:iä, 25 mM glukoosia, 2 mM tioureaa, 5 mM natriumaskorbaattia, 3 mM natriumpyruvaattia, 0,5 mM CaCl2·4H2O:ta ja 10 mM MgSO4·7H2O:ta. Titrattiin pH-arvoon 7,3–7,4 väkevällä suolahapolla. Kudokset toimitettiin laboratorioon 30 minuutin kuluessa ja koronaaleikkeet otettiin edellä kuvatun menettelyn mukaisesti.
Kaikki eläintoimenpiteet suoritettiin Stanfordin yliopiston APLAC:n hyväksymien eläintenhoito-ohjeiden mukaisesti. Rotat (yli 140 päivää elinsiirron jälkeen) indusoitiin 5 % isofluraanilla anestesiassa ja nukutettiin 1–3 % isofluraanilla leikkauksen aikana. Eläimet asetettiin stereotaksiseen kehykseen (Kopf) ja pitkävaikutteista buprenorfiinia (SR) injektoitiin ihon alle. Kallo paljastettiin, puhdistettiin ja siihen asetettiin 3–5 luuruuvia. T-hCO2:n kohdentamiseksi generoimme stereotaksiset koordinaatit MRI-kuvista. Kiinnostavaan kohtaan porattiin porareikä ja kuidut (halkaisija 400 µm, NA 0,48, Doric) laskettiin 100 µm hCO2-pinnan alapuolelle ja kiinnitettiin kalloon UV-kovettuvalla hammassementillä (Relyx).
Kuitufotometriset mittaukset tehtiin aiemmin kuvatulla tavalla42. Spontaanin aktiivisuuden tallentamiseksi rotat sijoitettiin puhtaaseen häkkiin ja implantoituun kuituoptiseen kaapeliin liitettiin 400 µm:n halkaisijaltaan oleva kuituoptinen kytkentäkaapeli (Doric), joka oli kytketty kuituoptiseen fotometriseen tiedonkeruujärjestelmään. 10 minuutin motorisen aktiivisuuden tallentamisen aikana eläimet saivat tutkia häkkiä vapaasti. Herätetyn aktiivisuuden tallentamiseksi rotat (yli 140 päivää siirron jälkeen) nukutettiin 5 %:lla isofluraanilla induktiota varten ja 1–3 %:lla isofluraanilla ylläpitoa varten. Eläin asetettiin stereotaktiseen kehykseen (Kopf) ja t-hCO2:n vastakkaisella puolella olevat viikset lyhennettiin noin 2 cm:n pituisiksi ja pujotettiin pietsosähköiseen toimilaitteeseen (PI) liitetyn verkon läpi. 400 µm:n kuituoptinen kytkentäkaapeli (Doric) liitettiin implantoituun kuituun ja tiedonkeruujärjestelmään. t-hCO2:n vastakkaisella puolella olevia viiksikarvoja poikkeutettiin sitten 50 kertaa (2 mm 20 Hz:n taajuudella, 2 sekuntia esityskertaa kohden) satunnaisina aikoina pietsosähköisellä käyttölaitteella 20 minuutin tallennusjakson aikana. Poikkeutusaikaa voi ohjata Arduino MATLAB -tukipaketilla mukautetulla MATLAB-koodilla. Tapahtumat synkronoidaan tiedonkeruuohjelmistoon transistori-transistorilogiikkapulsseja (TTL) käyttäen.
Rotille (yli 140 päivää elinsiirron jälkeen) indusoitiin 5 % isofluraanianestesia ja nukutettiin 1–3 % isofluraanilla leikkauksen aikana. Eläimet asetettiin stereotaksiseen kehykseen (Kopf) ja buprenorfiini SR ja deksametasoni injektoitiin ihon alle. Kallo paljastettiin, puhdistettiin ja siihen asetettiin 3–5 luuruuvia. T-hCO:n kohdentamiseksi generoimme stereotaksiset koordinaatit MRI-kuvista. Siirretyn hCO:n päälle tehtiin pyöreä kraniotomia (noin 1 cm halkaisijaltaan) suurnopeusporalla. Kun luu on mahdollisimman ohut, mutta ennen koko luun läpi poraamista, jäljelle jäänyt ehjä lantion välilevy poistettiin pihteillä alla olevan t-hCO:n paljastamiseksi. Kraniotomia täytettiin steriilillä suolaliuoksella, ja peitinlasi ja erityinen päätappi kiinnitettiin kalloon UV-kovetetulla hammassementillä (Relyx).
Kaksifotonikuvaus tehtiin Bruker-monifotonimikroskoopilla ja Nikon LWD (×16, 0,8 NA) -objektiivilla. GCaMP6-kuvaus tehtiin 920 nm:ssä 1,4-kertaisella yksittäisellä z-tason suurennuksella ja 8-kertaisella keskimäärin 7,5 fps:n nopeudella. Rotat indusoitiin 5 %:n isofluraanianestesialla ja niitä ylläpidettiin 1–3 %:n isofluraanilla. Rotat asetettiin mittatilaustyönä tehtyyn pään kiinnikkeeseen linssin alle. Motorisesta toiminnasta saatiin 3 minuutin taustatallenne. 20 minuutin tallennuksen aikana annettiin satunnaisesti 50 imaisua (jokainen anto 100 ms pitkä) t-hCO2:n vastakkaiselle viiksialueelle picospricerin avulla. Purskeiden kestoa voi hallita mukautetulla MATLAB-koodilla Arduino MATLAB -tukipaketilla. Tapahtumat voidaan synkronoida tiedonkeruuohjelmiston (PrairieView 5.5) kanssa TTL-pulsseja käyttäen. Analyysiä varten kuvien xy-liike korjattiin affiinikorjauksella MoCo-ohjelmassa, joka lanseerattiin Fidžillä. Fluoresenssijälkien eristäminen yksittäisistä soluista käyttäen CNMF-E43:a. Fluoresenssi eristettiin kullekin kiinnostuksen kohteena olevalle alueelle, muunnettiin dF/F-käyriksi ja sitten muunnettiin z-pisteiksi.
Rotille (yli 140 päivää elinsiirron jälkeen) indusoitiin 5 % isofluraanianestesia ja ne nukutettiin 1–3 % isofluraanilla leikkauksen aikana. Eläimet asetettiin stereotaksiseen kehykseen (Kopf) ja buprenorfiini SR ja deksametasoni injektoitiin ihon alle. T-hCO:n vastakkaisella puolella olevat viikset leikattiin noin 2 cm:n pituisiksi ja pujotettiin pietsosähköiseen toimilaitteeseen yhdistetyn verkon läpi. Kallo paljastettiin ja puhdistettiin. Ruostumattomasta teräksestä valmistettu maadoitusruuvi kiinnitettiin kalloon. T-hCO:n kohdistamiseksi generoimme stereotaksiset koordinaatit magneettikuvauksista. Suoritimme pyöreän kraniotomia (halkaisijaltaan noin 1 cm) suurnopeusporalla juuri t-hCO:n yläpuolelle. Kun luu on mahdollisimman ohut, mutta ennen koko luun läpi poraamista, käytä pihtejä jäljellä olevan ehjän lantiolevyn poistamiseksi alla olevan t-hCO:n paljastamiseksi. Yksittäiset solut tallennettiin käyttämällä 32-kanavaisia ​​tai 64-kanavaisia ​​​​suurtiheyksisiä piisontimia (Cambridge Neurotech), jotka oli maadoitettu maadoitusruuveihin ja esivahvistettu RHD-vahvistimilla (Intan). Elektrodit laskettiin manipulaattorilla kohdealueelle kraniotomian kautta, joka oli täytetty steriilillä suolaliuoksella. Tiedonkeruu suoritettiin 30 kHz:n taajuudella käyttäen Open Ephys -tiedonkeruujärjestelmää. Tallennus jatkui vasta, kun havaitsimme erittäin korreloivaa rytmistä spontaania aktiivisuutta yli 10 kanavalla, mikä viittaa siihen, että elektrodit sijaitsivat siirteessä (kaksifotonisen kalsiumkuvantamisen perusteella). Motorisesta aktiivisuudesta saatiin 10 minuutin taustatallenne. t-hCO2:n vastakkaisella puolella olevia viiksikarvoja poikkeutettiin sitten 50 kertaa (2 mm 20 Hz:n taajuudella, 2 s esityskertaa kohden) satunnaisina aikoina pietsosähköisellä käyttölaitteella 20 minuutin tallennusjakson aikana. Käytä MATLAB Support Package for Arduino (MATLAB 2019b) ja ohjaa poikkeutusaikaa mukautetulla MATLAB-koodilla. Käytä TTL-pulsseja tapahtumien synkronointiin tiedonkeruuohjelmiston kanssa.
Optisia merkintäkokeita varten 200 µm:n optinen kytkentäkaapeli (Doric), joka oli kytketty 473 nm:n laseriin (Omicron), kytkettiin kraniotomian päälle asetettuun 200 µm:n optiseen kuituun. Välittömästi ennen tätä säädettiin jumpperiteho 20 mW:iin. Laske elektrodit manipulaattorin avulla kohdealueelle kraniotomian kautta, joka on täytetty steriilillä suolaliuoksella. Tallennuksen alussa lähetettiin kymmenen 473 nm:n valopulssia (taajuus 2 Hz, pulssin kesto 10 ms). Valoherkät solut määriteltiin soluiksi, jotka osoittivat piikkivasteen 10 ms:n sisällä valosta 70 %:ssa tai useammassa kokeista.