Tak, fordi du besøger Nature.com. Du bruger en browserversion med begrænset CSS-understøttelse. For at få den bedste oplevelse anbefaler vi, at du bruger en opdateret browser (eller deaktiverer kompatibilitetstilstand i Internet Explorer). For at sikre løbende support viser vi desuden webstedet uden typografier og JavaScript.
Viser en karrusel med tre slides på én gang. Brug knapperne Forrige og Næste til at navigere gennem tre slides ad gangen, eller brug skyderknapperne i slutningen til at navigere gennem tre slides ad gangen.
Selvsamlende neurale organeller repræsenterer en lovende in vitro-platform til modellering af menneskelig udvikling og sygdom. Organoider mangler dog den konnektivitet, der findes in vivo, hvilket begrænser modning og forhindrer integration med andre kredsløb, der styrer adfærd. Her viser vi, at kortikale organoider afledt af humane stamceller, transplanteret ind i den somatosensoriske cortex hos neonatale nøgne rotter, udvikler modne celletyper, der integreres i sensoriske og motivationsrelaterede kredsløb. MR afslørede organoidvækst efter transplantation i flere stamcellelinjer og dyr, mens single-core-analyse afslørede progression af kortikogenese og fremkomsten af ​​et aktivitetsafhængigt transkriptionsprogram. Faktisk udviser transplanterede kortikale neuroner mere komplekse morfologiske, synaptiske og interne membranegenskaber end deres in vitro-modstykker, hvilket muliggør detektion af neuronale defekter hos patienter med Timothys syndrom. Anatomisk og funktionel sporing har vist, at transplanterede organeller modtager thalamokortikale og kortikokortikale input, og in vivo-optagelser af neural aktivitet tyder på, at disse input kan generere sensoriske reaktioner i humane celler. Endelig udvider kortikale organoider axoner gennem rottehjernen, og deres optogenetiske aktivering fører til belønningssøgende adfærd. Således modnes transplanterede humane cortexneuroner og deltager i værtens kredsløb, der styrer adfærd. Vi forventer, at denne tilgang vil lette detektionen af ​​fænotyper på strengniveau i patientafledte celler, som ikke kan detekteres på anden vis.
Den udviklende menneskelige hjerne er en bemærkelsesværdig selvorganiserende proces, hvor celler prolifererer, differentierer, migrerer og forbinder sig for at danne funktionelle neuronale kredsløb, der yderligere forfines gennem sensorisk oplevelse. Et centralt problem i forståelsen af ​​den menneskelige hjerneudvikling, især i forbindelse med sygdom, er manglen på adgang til hjernevæv. Selvorganiserende organeller, herunder humane cortexorganoider (hCO; også kendt som den menneskelige cortex-sfære), kan generere 2,3,4,5,6. Imidlertid begrænser flere begrænsninger deres bredere anvendelse til at forstå udviklingen og funktionen af ​​neurale kredsløb. Især er det uklart, om hCO-modning er begrænset af fraværet af visse mikro-miljømæssige og sensoriske input, der er til stede in vivo. Derudover er deres anvendelighed i modellering af genetisk komplekse og adfærdsmæssige neuropsykiatriske lidelser i øjeblikket begrænset.
Transplantation af hCO₂ til en intakt levende hjerne kan overvinde disse begrænsninger. Tidligere undersøgelser har vist, at humane neuroner transplanteret ind i gnavercortex er i stand til at overleve, projicere og kommunikere med gnaverceller7,8,9,10,11,12. Disse eksperimenter udføres dog normalt på voksne dyr, hvilket kan begrænse synaptisk og axonal integration. Her beskriver vi et transplantationsparadigme, hvor vi transplanterede 3D hCO₂ afledt af hiPS-celler ind i den primære somatosensoriske cortex (S1) hos immundefekte rotter på et tidligt stadie af plastisk udvikling. Transplanterede hCO₂ (t-hCO₂) neuroner undergår betydelig modning, modtager thalamokortikale og kortikal-kortikale input, der fremkalder sensoriske reaktioner, og udvider axonale projektioner ind i rottehjernen for at drive belønningssøgende adfærd. Forlænget modning af t-hCO₂ har afsløret neuronale defekter hos patienter med Timothys syndrom (TS), en alvorlig genetisk lidelse forårsaget af mutationer i den spændingsfølsomme L-type CaV1.2 calciumkanal (kodet af CACNA1C).
For at studere humane kortikale neuroner i kredsløb in vivo, transplanterede vi stereotaktisk intakt 3D hCO ind i S1 fra tidlige postnatale atymiske rotter (dag 3-7 postnatalt) (fig. 1a og udvidede data fra fig. 1a-c). På dette tidspunkt har de thalamokortikale og kortikokortikale axonale projektioner endnu ikke fuldført deres S1-innervation (ref. 13). Denne tilgang er således designet til at maksimere t-hCO integrationen, samtidig med at påvirkningen af ​​endogene kredsløb minimeres. For at visualisere placeringen af ​​t-hCO i levende dyr udførte vi T2-vægtede MRI-hjernerekonstruktioner af rotter 2-3 måneder efter transplantation (fig. 1b og udvidede data, fig. 1d). t-hCO3 blev let observeret, og volumenmålinger af t-hCO3 svarede til dem, der blev beregnet ud fra fikserede snit (Udvidede data fig. 1d,e; P > 0,05). t-hCO3 blev let observeret, og volumenmålinger af t-hCO3 svarede til dem, der blev beregnet ud fra fikserede snit (Udvidede data fig. 1d,e; P > 0,05). t-hCO легко наблюдались, а объемные измерения t-hCO были аналогичны рассчитанным для фиксированных расрезиз, ( рис 1d, e; P> 0,05). t-hCO3 var let observerbare, og volumetriske t-hCO3-målinger lignede dem, der blev beregnet for faste sektioner (udvidede data, fig. 1d, e; P > 0,05).很容易观察到t-hCO，并且t-hCO的体积测量值与从固定切片计算的测量值相似（扩展数据图1d、e；P >。5）。5）很容易观察到t-hCO，并且t-hCO t-hCO легко наблюдался, а объемные измерения t-hCO были аналогичны рассчитанным для фиксированных срезиов ( рис 1d, e; P> 0,05). t-hCO3 var let observerbar, og volumetriske t-hCO3-målinger lignede dem, der blev beregnet for faste sektioner (udvidede data, fig. 1d, e; P > 0,05).Vi bestemte t-hCO₂ i 81 % af de transplanterede dyr cirka 2 måneder efter transplantation (n = 72 dyr; hCO₂ fra 10 hiPS-cellelinjer; hiPS-cellelinjer i supplerende tabel 1). Af disse var 87 % placeret i hjernebarken (fig. 1c). Ved at udføre serielle MR-scanninger på flere tidspunkter i den samme transplanterede rotte fandt vi en ni gange stigning i t-hCO₂-volumen inden for 3 måneder (fig. 1d og udvidede data, fig. 1f). Transplanterede dyr havde en høj overlevelsesrate (74 %) 12 måneder efter transplantation (udvidede data, fig. 1g og supplerende tabel 2), og der blev ikke fundet nogen åbenlyse motoriske eller hukommelsesforstyrrelser, gliose eller elektroencefalogram (EEG). Data fig. 1g og supplerende tabel 2). 1t-m og 3e).
a, Skematisk oversigt over eksperimentelt design. hCO₂ afledt af hiPS-celler blev transplanteret ind i S1 hos nyfødte nøgne rotter på dag 30-60 af differentieringen. b, T2-vægtede koronale og horisontale MR-billeder, der viser t-hCO₂ i S1 2 måneder efter transplantation. Skalalinje, 2 mm. c, Kvantificering af succesrater for engraftment vist for hver hiPS-cellelinje (n = 108, tal inden for søjler angiver mængden af ​​t-hCO₂ pr. hIPS-cellelinje) og kortikal eller subkortikal placering (n = 88). d, MR-billede af en koronararterie (venstre; skalalinje, 3 mm) og tilsvarende 3D volumetrisk rekonstruktion (skalalinje, 3 mm), der viser en stigning i t-hCO₂ over 3 måneder. e, Gennemgang af t-hCO₂-mønstre i rottehjernebark. Skalalinje, 1 mm. f, Repræsentative immuncytokemiske billeder af t-hCO vist fra øverst til venstre mod højre (under differentiering): PPP1R17 (4 måneder gammel), NeuN (8 måneder gammel), SOX9 og GFAP (8 måneder gammel), PDGFRα; (8 måneder), MAP2 (8 måneder) og IBA1 (8 måneder). Skalalinje, 20 µm. Samtidig ekspression af HNA indikerer celler af human oprindelse. g, snRNA-seq: Unified manifold and projection (UMAP) dimensionalitetsreduktionsbilleddannelse af alle t-hCO-kerner af høj kvalitet efter Seurat-integration (n=3 t-hCO-prøver, n=2 hiPS-cellelinjer). Astrocytter, celler fra astrocytlinjen; cyc prog, cirkulerende progenitorer; GluN DL, dybe glutamaterge neuroner; GluN DL/SP, dybe og sublamellære glutamaterge neuroner; GluN UL, øvre lags glutamaterge neuroner; oligodendrocytter, oligodendrocytter; OPC, oligodendrocyt-progenitorceller; RELN, reelin-neuroner. h, Gene Ontology (GO) termberigelsesanalyse af gener signifikant opreguleret (justeret P < 0,05, fold change > 2, udtrykt i mindst 10% af kernerne) i t-hCO glutamaterge neuroner sammenlignet med hCO glutamaterge neuroner. h, Gene Ontology (GO) termberigelsesanalyse af gener signifikant opreguleret (justeret P < 0,05, fold change > 2, udtrykt i mindst 10% af kernerne) i t-hCO glutamaterge neuroner sammenlignet med hCO glutamaterge neuroner. h, Анализ обогащения терминов Gene Ontology (GO) til генов со значительной активацией (скорректированный P <0,05, кратность изкратность изктивацией по крайней мере в 10% ядер) в глутаматергических нейронах t-hCO på сравнению с глутаматергическими нейронах. h, Gene Ontology (GO) termberigelsesanalyse for gener med signifikant aktivering (justeret P <0,05, fold change >2, ekspression i mindst 10% kerner) i t-hCO glutamaterge neuroner sammenlignet med hCO glutamaterge neuroner. h，与hCO 谷氨酸能神经元相比，t-hCO 谷氨酸能神经元中基因显着上调（谎整后0,05，倍数变化> 2，在至少10% 的细胞核中表达）的基因本体论(GO) 术鐆〭密 h ， 与 hco 谷氨酸 能 元 相比 ， t-hco 谷氨酸 能 神经 元 基因 显着 上谼 ， 弈同 p.变化 变化> 2 ， 至少 10% 的 核中 表达） 基因 基因 基因 的 的 的 的 焚 的 的 焇 的的 的 的 的本体论(GO) 术语富集分析. h, гены значительно активизировались (скорректированный P <0,05, кратность изменения> 2, экспрессируется по 1% краенев краенев глутаматергических нейронах t-hCO по сравнению с глутаматергическими нейронами hCO Онтологическийский (GO) анализ. h, gener var signifikant opreguleret (justeret P < 0,05, fold change > 2, udtrykt i mindst 10% af kernerne) i t-hCO glutamaterge neuroner sammenlignet med hCO glutamaterge neuroner Ontologisk (GO) analyse af berigelsestermen.Den stiplede linje angiver en aq-værdi på 0,05. i, UMAP-billeddannelse af GluN-celletyper i t-hCO ved hjælp af label-overførsel fra et reference 22 snRNA-seq voksen motor cortex-datasæt. CT — kortikothalamiske celler, ET — ekstracerebrale celler, IT — interne telencefale celler, NP — nærprojektion.
Vi vurderede derefter cytoarkitekturen og den samlede cellulære sammensætning af t-hCO. Antistoffarvning af rotteendotelceller afslørede vaskularisering med t-hCO, mens IBA1-farvning afslørede tilstedeværelsen af ​​rottemikroglia i hele transplantatet (fig. 1f og udvidede data, fig. 3c, d). Immunfarvning afslørede humane nukleære antigen (HNA)-positive celler, der co-udtrykte PPP1R17 (kortikale progenitorer), NeuN (neuroner), SOX9 og GFAP (glia-afledte celler) eller PDGFRα (oligodendrocyt-progenitorer) (figur 1f). For at studere den cellulære sammensætning af t-hCO ved enkeltcelleopløsning udførte vi single-core RNA-sekventering (snRNA-seq) efter cirka 8 måneders differentiering. Bulkfiltrering og fjernelse af rottekerner gav 21.500 humane mononukleære kort af høj kvalitet (fig. 1g og udvidede data, fig. 4a, b). Ekspressionsmønstre for typiske celletypemarkører identificerede klynger af større kortikale celleklasser, herunder dybe og overfladiske glutamaterge neuroner, cirkulerende progenitorceller, oligodendrocytter og astrocyt-afstamning (fig. 1g, udvidede data, fig. 4c og supplerende tabel 3). Immunfarvning for SATB2 og CTIP2 viste, at på trods af tilstedeværelsen af ​​kortikale subtyper udviste t-hCO ikke en klar anatomisk stratificering (udvidede data, fig. 3a). Stadie-matchet snRNA-seq hCO producerede stort set lignende celleklasser, med få undtagelser, herunder fraværet af oligodendrocytter og tilstedeværelsen af ​​GABAerge neuroner, hvilket kan afspejle de tidligere rapporterede gunstige in vitro-betingelser for laterale progenitorceller15 (udvidede data, fig. 4f-i og supplerende tabel 4). Differentiel genekspressionsanalyse afslørede signifikante forskelle i glutamaterge neuroner mellem t-hCO og hCO (Supplerende Tabel 5), herunder aktivering af sæt af gener forbundet med neuronal modning, såsom synaptisk signalering, dendritisk lokalisering og spændingsstyret kanalaktivitet (Figur 1h og Supplerende Tabel 5). Tabel 6). Følgelig udviste kortikale glutamaterge t-hCO neuroner accelereret transkriptionel modning.
For at belyse, om disse transkriptionelle ændringer i t-hCO var relateret til morfologiske forskelle mellem hCO in vitro og t-hCO in vivo, rekonstruerede vi stadie-matchede biocytin-fyldte hCO og hCO i akutte sektioner efter 7-8 måneders differentiering. hCO neuroner (fig. 2a). t-hCO neuroner var signifikant større, havde 1,5 gange soma-diameteren, dobbelt så mange dendritter og en samlet seksdobbelt stigning i den samlede dendritiske længde sammenlignet med in vitro hCO (fig. 2b). Derudover observerede vi en signifikant højere tæthed af dendritiske pigge i t-hCO neuroner end i hCO neuroner (fig. 2c). Dette tyder på, at t-hCO neuroner undergår omfattende dendritisk forlængelse og forgrening, hvilket i kombination med fortsat celleproliferation kan bidrage til den intensive vækst af t-hCO efter transplantation (fig. 1d og udvidede data fig. 1f). Dette fik os til at undersøge de elektrofysiologiske egenskaber. Membrankapacitansen var otte gange højere (udvidede data, fig. 8d), membranpotentialet i hviletilstand var mere hyperpolariseret (ca. 20 mV), og strøminjektion inducerede en højere maksimal excitationshastighed i t-hCO neuroner end i hCO neuroner. in vitro (fig. 2d), e), hvilket er i overensstemmelse med de større og mere komplekse morfologiske træk ved t-hCO. Derudover var hyppigheden af ​​spontane excitatoriske postsynaptiske strømbegivenheder (EPSC) signifikant højere i t-hCO neuroner (fig. 2f), hvilket tyder på, at den øgede tæthed af dendritiske pigge observeret i t-hCO neuroner var forbundet med funktionel excitabilitet. seksuel synapse. Vi bekræftede den umodne karakter af hCO neuroner in vitro ved at registrere mærkede glutamaterge neuroner (udvidede data, fig. 6a-c).
a, 3D-rekonstruktion af biocytinfyldte hCO- og t-hCO-neuroner efter 8 måneders differentiering. b, Kvantificering af morfologiske træk (n = 8 hCO neuroner, n = 6 t-hCO neuroner; **P = 0,0084, *P = 0,0179 og ***P < 0,0001). b, Kvantificering af morfologiske træk (n = 8 hCO neuroner, n = 6 t-hCO neuroner; **P = 0,0084, *P = 0,0179 og ***P < 0,0001). б, количественная оценка морфологических признаков (n = 8 нейронов hCO, n = 6 нейронов t-hCO; ** P = 0,0084, * P = 9 0,01***). b, kvantificering af morfologiske træk (n=8 hCO neuroner, n=6 t-hCO neuroner; **P=0,0084, *P=0,0179 og ***P<0,0001). b，形态学特征的量化（n = 8 个hCO 神经元，n = 6 个t-hCO 神经元；**P = 0,0084，1***P9 0,0084，1***P9 0 0,0001). b，形态学特征的量化（n = 8 个hCO 神经元，n = 6 个t-hCO 神经元；**P = 0,0084，1***P9 0,0084，1***P9 0 0,0001). б, количественная оценка морфологических признаков (n = 8 нейронов hCO, n = 6 нейронов t-hCO; ** P = 0,0084, * P = 9 0,01***). b, kvantificering af morfologiske træk (n=8 hCO neuroner, n=6 t-hCO neuroner; **P=0,0084, *P=0,0179 og ***P<0,0001).c, 3D-rekonstruktion af hCO- og t-hCO-dendritiske grene efter 8 måneders differentiering. Røde stjerner angiver formodede dendritiske rygsøjler. Kvantificering af dendritisk rygsøjles tæthed (n = 8 hCO-neuroner, n = 6 t-hCO-neuroner; **P = 0,0092). d, Kvantificering af hvilemembranpotentialet (n = 25 hCO neuroner, n = 16 t-hCO neuroner; ***P < 0,0001). d, Kvantificering af hvilemembranpotentialet (n = 25 hCO neuroner, n = 16 t-hCO neuroner; ***P < 0,0001). d, количественная оценка мембранного потенциала покоя (n = 25 нейронов hCO, n = 16 нейронов t-hCO; *** P <0,0001). d, kvantificering af hvilemembranpotentialet (n = 25 hCO neuroner, n = 16 t-hCO neuroner; ***P < 0,0001). d，静息膜电位的量化（n = 25 hCO 神经元，n = 16 t-hCO 神经元；***P < 0,0001）. d，静息膜电位的量化（n = 25 hCO 神经元，n = 16 t-hCO 神经元；***P < 0,0001）. d, количественная оценка мембранного потенциала покоя (n = 25 нейронов hCO, n = 16 нейронов t-hCO; *** P <0,0001). d, kvantificering af hvilemembranpotentialet (n = 25 hCO neuroner, n = 16 t-hCO neuroner; ***P < 0,0001). e, Gentagen aktionspotentialaffyring i hCO og t-hCO induceret ved stigende strøminjektioner og kvantificering af den maksimale affyringshastighed (n = 25 hCO neuroner, n = 16 t-hCO neuroner; ***P < 0,0001). e, Gentagen aktionspotentialaffyring i hCO og t-hCO induceret ved stigende strøminjektioner og kvantificering af den maksimale affyringshastighed (n = 25 hCO neuroner, n = 16 t-hCO neuroner; ***P < 0,0001). e, повторное возбуждение потенциала действия в hCO og t-hCO, вызванное увеличением тока, og количествия скорости возбуждения (n = 25 нейронов hCO, n = 16 нейронов t-hCO; *** P <0,0001). e, genoplivning af aktionspotentialet i hCO og t-hCO induceret af strømforøgelse og kvantificering af maksimal affyringshastighed (n = 25 hCO neuroner, n = 16 t-hCO neuroner; *** P < 0,0001). e，通过增加电流注入诱导的hCO 和t-hCO 重复动作电位放电，以及最大攌善＇n =2个hCO 神经元，n = 16 个t-hCO 神经元；***P < 0,0001）. E ， 通过 增加 电流 注入 的 的 hco 和 t-hco 重复 电位 放电 ， 以及锟 最 备 刼 n 2个 hco 神经 ， n = 16 个 t-hco 神经 ； *** p <0,0001） 。 e, повторяющееся возбуждение потенциала действия hCO og t-hCO, вызванное увеличением подачи токенкаич и коце максимальной скорости возбуждения (n = 25 нейронов hCO, n = 16 нейронов t-hCO; *** P <0,0001). e, gentagen affyring af hCO3- og t-hCO3-aktionspotentialer induceret af øget strømforsyning og kvantificering af maksimal affyringshastighed (n = 25 hCO3-neuroner, n = 16 t-hCO3-neuroner; *** P < 0,0001). f, Spontane EPSC'er (sEPSC'er) i hCO- og t-hCO-neuroner efter 8 måneders differentiering og kvantificering af hyppigheden af ​​synaptiske hændelser (n = 25 hCO-neuroner, n = 17 t-hCO-neuroner; ***P < 0,0001). f, Spontane EPSC'er (sEPSC'er) i hCO- og t-hCO-neuroner efter 8 måneders differentiering og kvantificering af hyppigheden af ​​synaptiske begivenheder (n = 25 hCO-neuroner, n = 17 t-hCO-neuroner; ***P < 0,0001). f, спонтанные EPSC (sEPSC) в нейронах hCO og t-hCO через 8 месяцев дифференцировки и количественная оценка часистоты событий (n = 25 нейронов hCO, n = 17 нейронов t-hCO; *** P <0,0001) . f, Spontane EPSC'er (sEPSC'er) i hCO- og t-hCO-neuroner efter 8 måneders differentiering og kvantificering af synaptiske hændelsesrater (n = 25 hCO-neuroner, n = 17 t-hCO-neuroner; ***P <0,0001). f，分化8 个月时hCO 和t-hCO 神经元中的自发性EPSCs (sEPSCs)，以及突触事件频率的神经元，n = 17 t-hCO 神经元；***P < 0,0001）. f，分化8 个月时hCO 和t-hCO 神经元中的自发性EPSCs (sEPSCs)，以及突触事件频率的5 CO神率的量匼（n = 25 hCO 神率的量匼（n = 25hCO P < 0,0001）. f, спонтанные EPSC (sEPSC) в нейронах hCO og t-hCO через 8 месяцев дифференцировки и количественная оценка часистоты событий (n = 25 нейронов hCO, n = 17 нейронов t-hCO; *** P <0,0001). f, Spontane EPSC'er (sEPSC'er) i hCO- og t-hCO-neuroner efter 8 måneders differentiering og kvantificering af synaptiske hændelsesrater (n = 25 hCO-neuroner, n = 17 t-hCO-neuroner; *** P < 0,0001).For bf blev hCO3 og t-hCO3 i linje 1208-2 taget fra den samme differentieringsbatch, der blev vedligeholdt parallelt. g, Gensætberigelsesanalyse (ensidig Fishers eksakte test) af gener signifikant opreguleret (justeret P < 0,05, foldændring > 2, udtrykt i mindst 10% af kernerne) i t-hCO glutamaterge neuroner sammenlignet med hCO glutamaterge neuroner med gensæt af både tidlig-respons (ERG) og sen-respons (LRG) aktivitetsafhængige gener identificeret fra et in vivo musestudie16 og menneskespecifikke LRG'er fra in vitro neuroner17. g, Gensætberigelsesanalyse (ensidig Fishers eksakte test) af gener signifikant opreguleret (justeret P < 0,05, foldændring > 2, udtrykt i mindst 10% af kernerne) i t-hCO glutamaterge neuroner sammenlignet med hCO glutamaterge neuroner med gensæt af både tidlig-respons (ERG) og sen-respons (LRG) aktivitetsafhængige gener identificeret fra et in vivo musestudie16 og menneskespecifikke LRG'er fra in vitro neuroner17. g, анализ обогащения набора генов (односторонний точный критерий Фишера) генов со значительной активацений (скор0некий, 5,0 кратность изменения > 2, экспрессия по меньшей мере в 10% ядер) в глутаматергических нейровнах t-hCO по сратность глутаматергическими нейронами hCO наборы генов как раннего (ERG), так и позднего (LRG) генов, зависящих от aktivitationer, indikatorer og installationer på computeren in vivo16, og specifikationer for LRG i in vitro17nov. g, analyse af gensætberigelse (ensidig Fishers eksakte test) af gener med signifikant aktivering (justeret P < 0,05, foldændring > 2, ekspression i mindst 10 % af kernerne) i t-hCO glutamaterge neuroner sammenlignet med hCO glutamaterge neuronsæt af både tidlige (ERG) og sene (LRG) aktivitetsafhængige gener identificeret i in vivo-mus16 og menneskespecifikke LRG'er fra neuroner in vitro17. g，t-hCO谷氨酸能神经元与hCO谷氨酸能神经元相比，t -hCO谷氨酸能神经元显着上调（调整后P<0,05，倍数变化>2，在至少10%的细胞核中表达）的基因集富集分析（单侧F isher精确检验）从体内小鼠研究中鉴定的早期反应(ERG)和晚期反应(LRG) 活性依赖性基因的基因组16 和体外神经元17 中的人类特异 g ， t-hco 谷氨酸 神经 元 与 hco 谷氨酸 神经 元 相比 ， t-hco 谷氨酸 襞经 兰 神绸 兰<0,05 ， 倍数> 2 ， 至少 至少 10%的 细胞 核中 表达） 的 集富集 分析 羧单）体内 小鼠 研究 中 的 早期 反应 反应 反应 和 晚期 反应 反应 (lrg) 活性 基因 嚄 基因咻 16神经元 17 中 中 17 中 17的人类特异性LRG. g, глутаматергические нейроны t-hCO были значительно активизированы по сравнению с глутаматергическическими нейкор P<0,05, кратность изменения> 2, не менее 10% Анализ обогащения набора генов (односторонний точный тест Фирашний) позднего гены, зависящие от активности ответа (LRG), идентифицированные в исследованиях на мышах in vivo16 og нейронах in vitro17. LRG, специфичные для человека. g, t-hCO glutamaterge neuroner var signifikant opreguleret sammenlignet med hCO glutamaterge neuroner (justeret P < 0,05, fold ændring > 2, mindst 10 %. Analyse af genberigelse for tidlig respons (ERG) og sen respons (ensidig Fisher's eksakte test) responsaktivitetsafhængige gener (LRG'er) identificeret i in vivo mus16 og in vitro neuroner.17 Humane specifikke LRG'er.Den stiplede linje indikerer en Bonferroni-korrigeret P-værdi på 0,05. h, GluN-genekspression (pseudo-pakke og skalering af hvert gen) var signifikant opreguleret i snRNA-seq-replikaer af LRG-gener i t-hCO glutamaterge neuroner. i, immunfarvning, der viser SCG2-ekspression i t-hCO (øvre) og hCO (nedre) neuroner. Hvide pile peger på SCG2+ celler. Skalalinje, 25 µm. Data er udtrykt som middelværdi ± standardafvigelse.
Baseret på den øgede aktivitet af t-hCO observeret i ex vivo-snit, afslørede snRNA-seq en aktivitetsafhængig opregulering af gentranskripter i t-hCO sammenlignet med hCO in vitro. Glutamaterge t-hCO-neuroner udtrykte højere niveauer af gener, der regulerer sen responsaktivitet (fig. 2g,h), hvilket blev fundet i tidligere undersøgelser af muse- og humane neuroner16,17. For eksempel viste BDNF18, SCG2 og OSTN, et primatspecifikt aktivitetsregulerende gen, øget ekspression i t-hCO-neuroner sammenlignet med hCO-neuroner (fig. 2g-i). Således udviste t-hCO-neuroner forbedrede modningsegenskaber sammenlignet med hCO-neuroner ved transkriptionelle, morfologiske og funktionelle analyser.
For yderligere at evaluere sammenhængen mellem t-hCO-modning og den menneskelige hjernes udvikling, udførte vi transkriptomiske sammenligninger af føtale og voksne kortikale celletyper19,20 og voksne21,22 samt omfattende data om kortikal genekspression23 under udvikling (udvidede data, figur 5). Med tidligere arbejde24 er den globale hCO- og t-hCO-transkriptommodningsstatus ved 7-8 måneders differentiering stort set i overensstemmelse med in vivo-udviklingstid og svarer mest til sent føtalt liv (udvidede data, figur 5a). Bemærkelsesværdigt observerede vi øget transkriptommodning i t-hCO sammenlignet med aldersmatchet hCO, samt transkriptomaktivering forbundet med synaptogenese, astrogenese og myelinisering (udvidede data, figur 5b-d). På celleniveau fandt vi tegn på en tyndere cortex-subtype i t-hCO, med klynger af glutamaterge neuroner, der overlapper med voksne L2/3-, L5- og L6-neuronsubtyper (figur 1i). I modsætning hertil var klyngeoverlapningen mellem glutamaterge t-hCO-neuroner og føtale kortikale neuroner mere begrænset midt i graviditeten (udvidede data, figur 5e-j). For at bestemme, om t-hCO-neuroner funktionelt set ligner humane postnatale neokortikale neuroner, udførte vi elektrofysiologiske optagelser og anatomiske rekonstruktioner af humane L2/3-pyramideformede neuroner i skarpe snit af den humane postnatale cortex (udvidede data, figur 7a). De elektrofysiologiske egenskaber af L2/3-pyramideformede neuroner lignede dem af t-hCO-pyramideformede neuroner (udvidede data, figur 7e). Morfologisk lignede L2/3-neuroner fra postnatale humane prøver mere t-hCO end hCO, selvom L2/3-celler var længere, indeholdt flere grene samlet set og havde en højere rygsøjletæthed (figur 3g og udvidede data, figur 7b-). G).
a, transplantation af hCO produceret af kontrol- og TS hiPS-cellelinjer til neonatale rotter. b, 3D-rekonstruktion af biocytinfyldte t-hCO-neuroner efter 8 måneders differentiering. c, kvantificering af gennemsnitlig dendritisk længde (n = 19 kontrolneuroner, n = 21 TS-neuroner; **P = 0,0041). d, 3D-rekonstruerede dendritiske grene fra kontrol og TS t-hCO ved 8 måneders differentiering og kvantificering af dendritisk rygsøjletæthed (n = 16 kontrolneuroner, n = 21 TS-neuroner, ***P < 0,0001). d, 3D-rekonstruerede dendritiske grene fra kontrol og TS t-hCO ved 8 måneders differentiering og kvantificering af dendritisk rygsøjletæthed (n = 16 kontrolneuroner, n = 21 TS-neuroner, ***P < 0,0001). d, 3D-rækkonstruktion ветвей из контроля og TS t-hCO через 8 mесяцев диференцировки и количе дендритных шипов (n = 16 контрольных нейронов, n = 21 TS нейронов, *** P <0,0001). d, 3D-rekonstruktion af dendritiske grene fra kontrol og t-hCO TS efter 8 måneders differentiering og kvantificering af dendritisk rygsøjletæthed (n = 16 kontrolneuroner, n = 21 TS-neuroner, ***P < 0,0001). d，分化8 个月时对照和TS t-hCO 的3D 重建树突分支，以及树突棘密度的量n=1,6个对照神经元，n = 21 个TS 神经元，***P < 0,0001）. d ， 分化 8 个 时 对照 和 ts t-hco 的 3d 重建 分支 分支 以及 树突棘 导度 1n 度 1n神经 元 ， n = 21 个 ts 神经 ， *** p <0,0001 ）。 d, 3D-rekonstruerede systemer og TS t-hCO har 8 måneders dækning og koordinering дендритных шипов (n = 16 контрольных нейронов, n = 21 TS нейронов, *** P <0,0001). d, 3D-rekonstruktion af kontrol-dendritiske grene og TS t-hCO efter 8 måneders differentiering og kvantificering af dendritisk rygsøjletæthed (n = 16 kontrolneuroner, n = 21 TS-neuroner, ***P < 0,0001).Røde stjerner angiver formodede dendritiske rygsøjler. e, spontane EPSC'er i kontrol- og TS t-hCO neuroner efter 8 måneders differentiering. f, kumulativ frekvensplot og kvantificering af frekvens og amplitude af synaptiske begivenheder (n = 32 kontrolneuroner, n = 26 TS neuroner; **P = 0,0076 og P = 0,8102). g, Scholl-analyse af TS- og kontrolneuroner i hCO og t-hCO. Stiplede linjer viser humane L2/3 postnatale pyramideformede neuroner til sammenligning (n = 24 kontrol t-hCO neuroner, n = 21 TS t-hCO neuroner, n = 8 kontrol hCO neuroner og n = 7 TS hCO neuroner). Data udtrykkes som middelværdi ± standardafvigelse.
t-hCO's evne til at replikere de morfologiske og funktionelle træk ved humane cortexneuroner på et højt niveau fik os til at undersøge, om t-hCO kunne bruges til at detektere sygdomsfænotyper. Vi fokuserede på TS, en alvorlig neurologisk udviklingsforstyrrelse forårsaget af gain-of-function-mutationer i genet, der koder for CaV1.2, som initierer aktivitetsafhængig gentranskription i neuroner. Vi opnåede hCO fra tre TS-patienter, der bar den mest almindelige substitution (p.G406R), og tre kontroller (fig. 3a). Efter transplantation fandt vi, at dendritisk morfologi var ændret i TS-neuroner sammenlignet med kontroller (fig. 3b og udvidede data, fig. 8a,b), med en dobbelt stigning i antallet af primære dendritter og en samlet stigning i gennemsnitlig og samlet fald i dendritisk længde (fig. 3c og udvidede data, fig. 8c). Dette var forbundet med en øget tæthed af pigge og en øget hyppighed af spontane EPSC'er i TS sammenlignet med kontrolneuroner (fig. 3d-f og udvidede data, fig. 8g). Yderligere analyse afslørede mønstre af unormal dendritisk forgrening i t-hCO TS sammenlignet med kontrolgruppen, men ikke i in vitro TS hCO på et lignende differentieringsstadium (fig. 3g). Dette er i overensstemmelse med vores tidligere rapporter om aktivitetsafhængig dendritisk krympning i TS og fremhæver denne transplantationsplatforms evne til at detektere sygdomsfænotyper in vivo.
Vi spurgte derefter, i hvilken grad t-hCO-celler er funktionelt integreret i rotte S1. S1 hos gnavere modtager stærke synaptiske input fra de ipsilaterale ventrale basale og posteriore thalamuskerner, såvel som de ipsilaterale motoriske og sekundære somatosensoriske cortex og kontralaterale S1 (fig. 4a). For at genoprette innervationsmønsteret inficerede vi hCO med rabiesvirus-dG-GFP/AAV-G og transplanterede hCO ind i S1-rotten 3 dage senere. Vi observerede tæt GFP-ekspression i neuroner i den ipsilaterale S1 og ventrale basalganglier 7-14 dage efter transplantation (fig. 4b, c). Derudover afslørede antistoffarvning af den thalamiske markør netrin G1 tilstedeværelsen af ​​thalamiske ender i t-hCO (fig. 4d, e). For at evaluere, om disse afferente projektioner kunne fremkalde synaptiske responser i t-hCO-celler, udførte vi helcelleoptagelser fra humane celler i skarpe snit af det thalamokortikale lag. Elektrisk stimulering af rotte S1, intern kapsel, hvid substans, fibre nær t-hCO eller optogenetisk aktivering af opsin-udtrykkende thalamiske ender i t-hCO inducerede EPSC'er med kort latens i t-hCO neuroner eksponeret for AMPA-receptorantagonisten NBQX. (Fig. 4f, g og udvidede data, Fig. 9a-g). Disse data viser, at t-hCO er anatomisk integreret i rottehjernen og kan aktiveres af rotteværtsvæv.
a, Skematisk diagram af et rabiessporingseksperiment. b, GFP og menneskespecifik STEM121-ekspression mellem t-hCO og rottehjernebark (øverste panel). GFP-ekspression i rottens ipsilaterale ventrale basale kerne (VB) (nederst til venstre) og ipsilaterale S1 (nederst til højre) er også vist. Målestok, 50 µm. De røde firkanter repræsenterer de områder af hjernen, hvor billederne blev taget. c, kvantificering af celler, der udtrykker GFP (n = 4 rotter). d, e - Netrin G1+ thalamiske terminaler i t-hCO. d viser et koronalt snit indeholdende t-hCO- og VB-kerner. Målestok, 2 mm. e viser Netrin G1- og STEM121-ekspression i t-hCO- (venstre) og VB- (højre) neuroner. Målestok, 50 µm. Den orange stiplede linje angiver t-hCO-grænsen. f, g, Aktuelle spor af t-hCO neuroner efter elektrisk stimulering i S1 rotte (f) eller intern kapsel (g), med (lilla) eller uden (sort) NBQX (venstre). EPSC-amplituder med og uden NBQX (n = 6 S1 neuroner, *P = 0,0119; og n = 6 interne kapselneuroner, **P = 0,0022) (midten). Procentdel af t-hCO neuroner, der viser EPSC som reaktion på elektrisk stimulering af rotte S1 (f) eller intern kapsel (g) (højre). aCSF, kunstig cerebrospinalvæske. h, skematisk diagram af 2P-billeddannelseseksperimentet (venstre). Ekspression af GCaMP6'er i t-hCO (midten). Skalalinje, 100 µm. Fluorescens-tidsforløb af GCaMP6'er (højre). i, Z-score for spontan aktivitetsfluorescens. j, skematisk illustration af overskægsstimulering. k, z-scorede 2P-fluorescensbaner i ét forsøg, justeret med whisker-afvigelse ved tidspunkt nul (stiplet linje) i eksempelceller. l, populationsgennemsnitlige z-score-responser for alle celler justeret med whisker-afvigelse ved tidspunkt nul (stiplet linje) (rød) eller tilfældigt genererede tidsstempler (grå). m. Skematisk diagram af eksperimentet med optisk markering. n, Rå spændingskurver fra et eksempel på t-hCO-celle under blå laserstimulering eller whisker-afbøjning. Røde pile angiver de første pigge forårsaget af lys (øverst) eller forårsaget af whisker-afbøjning (nederst). Grå skygge angiver perioder med whisker-afbøjning. o, Peak-lysbølgeformer og whisker-afbøjningsresponser. p, pigge fra et enkelt forsøg, justeret med afvigelsen af ​​whiskerene i cellerne i eksemplet. 0 angiver whisker-afvigelse (stiplet linje). q, populationsgennemsnitlig z-score-fyringshastighed for alle lysfølsomme celler, justeret med whisker-afvigelse ved tidspunkt nul (stiplet linje) (rød) eller tilfældigt genererede tidsstempler (grå). r, Andel af lysfølsomme enheder signifikant moduleret af whisker-afvigelse (n = 3 rotter) (venstre). Peak z-score latens (n ​​= 3 rotter; n = 5 (lysegrøn), n = 4 (mørkegrøn) og n = 4 (cyan) whisker-afbøjningsmodulationsenheder pr. rotte) (højre). Data udtrykkes som middelværdi ± standardafvigelse
Vi spurgte derefter, om t-hCO kunne aktiveres af sensoriske stimuli in vivo. Vi transplanterede hCO, der udtrykker de genetisk kodede calciumindikatorer GCaMP6, ind i S1-rotter. Efter 150 dage udførte vi fiberfotometri eller to-foton calciumbilleddannelse (fig. 4h og udvidede data, fig. 10a). Vi fandt, at t-hCO-celler udviste synkroniseret rytmisk aktivitet (figur 4i, udvidede data, figur 10b og supplerende video 1). For at karakterisere peak t-hCO-aktivitet udførte vi ekstracellulære elektrofysiologiske optagelser i bedøvede transplantationsrotter (udvidede data, fig. 10c-f). Vi har genereret stereotaksiske koordinater fra MR-billeder; disse registrerede enheder repræsenterer således formodede humane neuroner, selvom elektrofysiologi alene ikke tillader bestemmelse af en oprindelsesart. Vi observerede synkroniserede aktivitetsudbrud (udvidede data, fig. 10d). Udbruddene varede omkring 460 ms og blev adskilt af stilhedsperioder på omkring 2 sekunder (udvidede data, fig. 10d, e). Individuelle enheder affyrede i gennemsnit omkring tre skud pr. udbrud, hvilket er cirka 73 % af de registrerede enheder pr. udbrud. Aktiviteterne for de individuelle enheder var stærkt korrelerede, og disse korrelationer var højere end for enheder identificeret i uvaccinerede dyr registreret under de samme forhold (udvidede data, fig. 10f). For yderligere at karakterisere spike-responserne hos identificerede humant afledte neuroner udførte vi lysmærkningseksperimenter på bedøvede rotter transplanteret med hCO3, der udtrykker den lysfølsomme kationkanal rhodopsin 2 (hChR2), hvorigennem t-hCO3-neuroner genkender med kort latenstid (mindre end 10 ms) som reaktion på blå lysstimuli (fig. 4m-o). t-hCO-neuroner udviste udbrud af spontan aktivitet ved frekvenser svarende til dem, der observeres i calciumbilleddannelse, såvel som elektrofysiologiske optagelser udført i t-hCO i fravær af lysmarkering (udvidede data, fig. 10c-g). Der blev ikke observeret nogen spontan aktivitet i de tilsvarende stadier af hCO registreret in vitro. For at vurdere, om t-hCO kunne aktiveres af sensoriske stimuli, afbøjede vi kortvarigt rottehårene væk fra t-hCO (fig. 4j,m og udvidede data, fig. 10h,k). Ifølge tidligere undersøgelser8,10 viste en delmængde af t-hCO-celler øget aktivitet som reaktion på hårhårsafbøjning, hvilket ikke blev observeret, når dataene blev sammenlignet med tilfældige tidsstempler (fig. 4k-q og udvidede data, fig. 10h-q). Faktisk viste omkring 54% af de opto-mærkede enkeltenheder en signifikant øget ophidselsesrate efter hårhårsstimulering, der toppede ved omkring 650 ms (fig. 4r). Samlet set tyder disse data på, at t-hCO modtager passende funktionelle input og kan aktiveres af miljømæssige stimuli.
Vi undersøgte derefter, om t-hCO kunne aktivere kredsløb i rotter for at kontrollere adfærd. Vi undersøgte først, om axonerne fra t-hCO-neuroner projicerer ind i rottens omgivende væv. Vi inficerede hCO med en lentivirus, der koder for hChR2 fusioneret til EYFP (hChR2-EYFP). Efter 110 dage observerede vi EYFP-ekspression i ipsilaterale kortikale regioner, herunder den auditive, motoriske og somatosensoriske cortex, samt i subkortikale regioner, herunder striatum, hippocampus og thalamus (fig. 5a). For at vurdere, om disse efferente projektioner kunne fremkalde synaptiske responser i rotteceller, aktiverede vi optisk t-hCO-celler, der udtrykker hChR2-EYFP, ved at optage rotte-hjernebarkceller i skarpe hjernesnit. Aktivering af t-hCO-axoner med blåt lys inducerede EPSC'er med kort latenstid i rotte-pyramideformede cortexneuroner, som blev blokeret af NBQX (fig. 5b-g). Derudover kunne disse reaktioner blokeres af tetrodotoxin (TTX) og genoprettes af 4-aminopyridin (4-AP), hvilket tyder på, at de var forårsaget af monosynaptiske forbindelser (fig. 5e).
a, Skematisk diagram af axonsporing (venstre). t-hCO EYFP-ekspression (højre). Skalalinje, 100 µm. A1, auditiv cortex, ACC, anterior cingulate cortex, d. striatum, dorsal striatum, HPC, hippocampus; Diafragma, lateral septum, mPFC, medial præfrontal cortex, piri, piriform cortex, v. striatum, ventral striatum, VPM, ventropostomedial nucleus i thalamus, VTA, ventral tegmental region. De røde firkanter repræsenterer de områder af hjernen, hvor billederne blev taget. b, Skematisk diagram af stimuleringseksperimentet. c, d, Eksempler på responsen af ​​blåt lys-induceret fotostrøm (øverst) og spænding (nederst) i humane (c) EYFP+ t-hCO eller rotte (d) EYFP- celler. e, f, Aktuelle spor af rotteneuroner efter blå lysstimulering af t-hCO-axoner med TTX og 4-AR (grøn), TTX (grå) eller aCSF (sort) (e), med (violet) eller uden (sort)) NBQX (e). g, latenstid for responser induceret af blåt lys i rotteceller (n = 16 celler); vandrette søjler angiver gennemsnitlig latenstid (7,13 ms) (venstre). Amplitude af lysfremkaldte EPSC'er registreret med eller uden NBQX (n = 7 celler; ***P < 0,0001) (midten). Amplitude af lysfremkaldte EPSC'er registreret med eller uden NBQX (n = 7 celler; ***P < 0,0001) (midten). Амплитуда вызванных светом EPSC, зарегистрированных с или без NBQX (n = 7 клеток; ***P <0,0001) (ved sentr). Amplitude af lysinducerede EPSC'er registreret med eller uden NBQX (n = 7 celler; ***P < 0,0001) (midten).使用或不使用NBQX 记录的光诱发EPSC 的振幅（n = 7 个细胞；***P < 0,0001）（中）。使用或不使用NBQX 记录的光诱发EPSC 的振幅（n = 7 个细胞；***P < 0,0001）（中）。 Амплитуда вызванных светом EPSC, зарегистрированных с или без NBQX (n = 7 клеток; ***P <0,0001) (ved sentr). Amplitude af lysinducerede EPSC'er registreret med eller uden NBQX (n = 7 celler; ***P < 0,0001) (midten).Procentdel af rotteceller, der viser EPSC'er, der reagerer på blåt lys (højre). h, Skematisk diagram over en adfærdsopgave. d0, dag 0. i. Præstation af eksemplariske dyr på dag 1 (venstre) eller dag 15 (højre) af træningen. Det gennemsnitlige antal slik udført på dag 1 (venstre) eller dag 15 (højre i midten) (n = 150 forsøg med blåt lys, n = 150 forsøg med rødt lys; ***P < 0,0001). Det gennemsnitlige antal slik udført på dag 1 (venstre) eller dag 15 (højre i midten) (n = 150 forsøg med blåt lys, n = 150 forsøg med rødt lys; ***P < 0,0001). Среднее количество облизываний, выполненных в день 1 (слева) eller день 15 (ved центре справа) (n = 150 ende, слева) n = 150 испытаний с красным светом ***P <0,0001). Gennemsnitligt antal slik udført på dag 1 (venstre) eller dag 15 (midt til højre) (n = 150 forsøg med blåt lys, n = 150 forsøg med rødt lys; ***P < 0,0001).第1 天（左）或第15 天（右中）执行的平均舔次数（n = 150 次蓝光试验,150n = 150次红光试验；***P < 0,0001）.第1 天（左）或第15 天（右中）执行的平均舔次数（n = 150 次蓝光试验,150n = 150次红光试验；***P < 0,001 Среднее количество облизываний, выполненных в день 1 (слева) eller день 15 (ved центре справа) (n = 150 ende, слева) n = 150 испытаний с красным светом ***P <0,0001). Gennemsnitligt antal slik udført på dag 1 (venstre) eller dag 15 (midt til højre) (n = 150 forsøg med blåt lys, n = 150 forsøg med rødt lys; ***P < 0,0001).Kumulative slikninger for forsøg med rødt og blåt lys på dag 1 (midt til venstre) eller dag 15 (højre). NS, ikke signifikant. j,k, Adfærdskarakteristika hos alle dyr transplanteret med t-hCO, der udtrykker hChR2-EYFP (j) eller kontrolfluorofor (k) på dag 1 eller 15 (hChR2-EYFP: n = 9 rotter, **P = 0,0049; kontrol: n = 9, P = 0,1497). l, Udvikling af præferencescore (n = 9 hChR2, n = 9 kontrol; **P < 0,001, ***P < 0,0001). l, Udvikling af præferencescore (n = 9 hChR2, n = 9 kontrol; **P < 0,001, ***P < 0,0001). l, Эволюция показателя предпочтения (n = 9 hChR2, n = 9 контрольных; **P <0,001, ***P <0,0001). l, Udvikling af præferencescore (n = 9 hChR2, n = 9 kontroller; **P < 0,001, ***P < 0,0001). l，偏好评分的演变（n = 9 hChR2，n = 9 对照；**P < 0,001，***P < 0,0001）. l，偏好评分的演变（n = 9 hChR2，n = 9 对照；**P < 0,001，***P < 0,0001）. l, Эволюция показателей предпочтения (n = 9 hChR2, n = 9 контролей; **P <0,001, ***P <0,0001). l, Udvikling af præferencescorer (n = 9 hChR2, n = 9 kontroller; **P < 0,001, ***P < 0,0001).m, FOS-ekspression som reaktion på optogenetisk aktivering af t-hCO i S1. Billeder af FOS-ekspression (venstre) og kvantificering (n = 3 pr. gruppe; *P < 0,05, **P < 0,01 og ***P < 0,001) (højre) er vist. Billeder af FOS-ekspression (venstre) og kvantificering (n = 3 pr. gruppe; *P < 0,05, **P < 0,01 og ***P < 0,001) (højre) er vist. Показаны изображения экспрессии FOS (слева) и количественного определения (n = 3 på spil; * P <0,05, <01 ** P <0***) (справа). Billeder af FOS-ekspression (venstre) og kvantificering (n = 3 pr. gruppe; *P < 0,05, **P < 0,01 og ***P < 0,001) er vist (højre).显示了FOS 表达（左）和量化（每组n = 3；*P < 0.05、**P < 0.01 和***P < 0.001）（像〳）（像〳）显示了FOS 表达（左）和量化（每组n = 3；*P < 0.05、**P < 0.01 和***P < 0.001）（像〳）（像〳） Показаны изображения экспрессии FOS (слева) и количественного определения (n = 3 på spil; * P <0,05, <01 ** P <0***) (справа). Billeder af FOS-ekspression (venstre) og kvantificering (n = 3 pr. gruppe; *P < 0,05, **P < 0,01 og ***P < 0,001) er vist (højre).Skalalinje, 100 µm. Data er udtrykt som middelværdi ± standardfejl for BLA, basolateral tonsil, MDT, dorsomediale thalamuskerne, PAG, periaqueductal grå.
Endelig spurgte vi, om t-hCO kunne modulere rotteadfærd. For at teste dette transplanterede vi hChR2-EYFP-udtrykkende hCO i S1, og 90 dage senere implanterede vi optiske fibre i t-hCO til lysafgivelse. Vi trænede derefter rotterne med et modificeret operant betingningsparadigme (fig. 5h). Vi placerede dyrene i et adfærdstestkammer og anvendte tilfældigt 5 sekunders blå (473 nm) og rød (635 nm) laserstimuli. Dyrene modtog en vandbelønning, hvis de slikkede under blå lysstimulering, men ikke slikkede under rød lysstimulering. På den første træningsdag viste dyrene ingen forskel i slikning, når de blev stimuleret med blåt eller rødt lys. På dag 15 viste dyr transplanteret med hCO, der udtrykker hChR2-EYFP, dog mere aktiv slikning, når de blev stimuleret med blåt lys sammenlignet med rød lysstimulering. Disse ændringer i slikkeadfærd blev ikke observeret hos kontroldyr transplanteret med hCO, der udtrykte kontrolfluoroforen (indlæringssuccesrate: hChR2 89%, EYFP 0%, figur 5i-1 og supplerende video 2). Disse data tyder på, at t-hCO-celler kan aktivere rottenuroner for at stimulere belønningssøgende adfærd. For at finde ud af, hvilke rotte t-hCO neurale kredsløb der kan være involveret i disse adfærdsændringer, aktiverede vi optogenetisk t-hCO i trænede dyr og høstede væv 90 minutter senere. Immunhistokemi afslørede ekspression af det aktivitetsafhængige FOS-protein i flere hjerneområder involveret i motiveret adfærd, herunder den mediale præfrontale cortex, mediale thalamus og periaqueductal grå substans, som blev udtrykt enten i ustimulerede kontroldyr eller i dyr. ris. 5m). Samlet set tyder disse data på, at t-hCO kan modulere rottenuronal aktivitet for at drive adfærd.
Neurale organoider repræsenterer et lovende system til at studere menneskelig udvikling og sygdom in vitro, men de er begrænset af manglen på forbindelser mellem kredsløb, der eksisterer in vivo. Vi har udviklet en ny platform, hvor vi transplanterede hCO ind i S1 fra immunkompromitterede tidlige postnatale rotter for at studere menneskelig celleudvikling og -funktion in vivo. Vi har vist, at t-hCO udvikler modne celletyper, der ikke observeres in vitro28, og at t-hCO er anatomisk og funktionelt integreret i gnavernes hjerne. Integrationen af ​​t-hCO i gnavernes neurale kredsløb gjorde det muligt for os at etablere en forbindelse mellem menneskelig cellulær aktivitet og studeret dyreadfærd, hvilket viser, at t-hCO neuroner kan modulere rotteneuronal aktivitet for at drive adfærdsmæssige reaktioner.
Den platform, vi beskriver, har adskillige fordele i forhold til tidligere forskning i transplantation af humane celler ind i gnaverhjerner. For det første transplanterede vi hCO ind i den udviklende cortex hos tidligt postnatale rotter, hvilket kan fremme anatomisk og funktionel integration. For det andet tillod t-hCO MR-overvågning os at studere transplantatposition og vækst hos levende dyr, hvilket giver os mulighed for at udføre langsigtede studier med flere dyr og fastslå pålideligheden af ​​flere hiPS-cellelinjer. Endelig transplanterede vi intakte organoider i stedet for isolerede enkeltcellesuspensioner, som er mindre destruktive for humane celler og kan fremme integrationen og genereringen af ​​humane cortexneuroner i rottehjerner.
Vi anerkender, at på trods af fremskridt inden for denne platform forhindrer tidsmæssige, rumlige og artsoverskridende begrænsninger dannelsen af ​​humane neurale kredsløb med høj nøjagtighed, selv efter transplantation på et tidligt udviklingsstadium. For eksempel er det ikke klart, om den spontane aktivitet observeret i t-hCO repræsenterer en udviklingsmæssig fænotype, der ligner den rytmiske aktivitet observeret under kortikal udvikling, eller om det skyldes fraværet af undertrykkende celletyper til stede i t-hCO. Tilsvarende er det ikke klart, i hvilken grad fraværet af laminering i t-hCO påvirker kædekonnektiviteten30. Fremtidigt arbejde vil fokusere på at integrere andre celletyper såsom humane mikroglia, humane endotelceller og varierende andele af GABAerge interneuroner som vist ved hjælp af assembly 6 in vitro, samt at forstå, hvordan neural integration og processering kan forekomme i ændrede t-hCO transkriptionelle, synaptiske og adfærdsmæssige niveauer i celler opnået fra patienter.
Samlet set repræsenterer denne in vivo-platform en stærk ressource, der kan supplere in vitro-hjerneudvikling og sygdomsforskning. Vi forventer, at denne platform vil give os mulighed for at opdage nye fænotyper på strengniveau i ellers uhåndgribelige patientafledte celler og teste nye terapeutiske strategier.
Vi genererede hCO2.5 fra HiPS-celler som tidligere beskrevet. For at initiere hCO2-produktion fra hiPS-celler dyrket på feeder-lag, blev intakte kolonier af hiPS-celler fjernet fra kulturskåle ved hjælp af dispase (0,35 mg/ml) og overført til plastkulturer med ultralav hæftning indeholdende skåle med hiPS-cellekulturmedium (Corning) suppleret med to SMAD-hæmmere dorsomorphin (5 μM; P5499, Sigma-Aldrich) og SB-431542 (10 μM; 1614, Tocris) og ROCK-hæmmer Y-27632 (10 μM; S1049, Selleckchem). I løbet af de første 5 dage blev hiPS-cellemediet skiftet dagligt, og dorsomorphin og SB-431542 blev tilsat. På den sjette dag i suspension blev neurale sfæroider overført til neuralt medium indeholdende neurobasal-A (10888, Life Technologies), B-27-tilskud uden A-vitamin (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies), penicillin og streptomycin (1:100, Life Technologies) og suppleret med epidermal vækstfaktor (EGF; 20 ng ml−1; R&D Systems) og fibroblastvækstfaktor 2 (FGF2; 20 ng ml−1; R&D Systems) indtil dag 24. Fra dag 25 til dag 42 blev mediet suppleret med hjerneafledt neurotrofisk faktor (BDNF; 20 ng ml−1, Peprotech) og neurotrophin 3 (NT3; 20 ng ml−1; Peprotech) med medieskift hver anden dag. På den sjette dag i suspension blev neurale sfæroider overført til neuralt medium indeholdende neurobasal-A (10888, Life Technologies), B-27-tilskud uden A-vitamin (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies), penicillin og streptomycin (1:100, Life Technologies) og suppleret med epidermal vækstfaktor (EGF; 20 ng ml−1; R&D Systems) og fibroblastvækstfaktor 2 (FGF2; 20 ng ml−1; R&D Systems) indtil dag 24. Fra dag 25 til dag 42 blev mediet suppleret med hjerneafledt neurotrofisk faktor (BDNF; 20 ng ml−1, Peprotech) og neurotrophin 3 (NT3; 20 ng ml−1; Peprotech) med medieskift hver anden dag.På den sjette dag i suspensionen blev de neurale sfæroider overført til et neuralt medium indeholdende Neurobasal-A (10888, Life Technologies), B-27-tilskud uden vitamin A (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies) og penicillin.и стрептомицин (1:100, Life Technologies) og дополнены эпидермальным фактором роста (EGF; 20 нг/ml; R&D Systems) og фактором роста20F; нг/мл; R&D Systems) til 24-го дня. og streptomycin (1:100, Life Technologies) og suppleret med epidermal vækstfaktor (EGF; 20 ng/ml; R&D Systems) og fibroblastvækstfaktor 2 (FGF2; 20 ng/ml; R&D Systems) indtil dag 24.Fra dag 25 til 42 blev hjerneafledt neurotrofisk faktor (BDNF; 20 ng ml-1, Peprotech) og neurotrophin 3 (NT3; 20 ng ml-1, Peprotech) tilsat mediet, idet mediet blev skiftet hver anden dag.在悬浮的第6 天，将神经球体转移到含有neurobasal-A（10888，Life Technologies）、不含维生焠B-27生焠补充剂（12587，Life Technologies）、GlutaMax（1:100，Life Technologies）、青霉素的神经培养基丠和铼霉1:链霉Teknologier）并辅以表皮生长因子（EGF；20 ng ml-1；R&D Systems）和成纤维细胞生长因子2（FGF2；20 ng ml-1；R&D Systems）直至第24 天.在 悬浮 的 第 第 6 天 将 神经 球体 转移 含有 含有 neurobasal-a （10888 ， Life Technologies０ 焫 焫 縍b-27 补充剂 （12587 ， Life Technologies） Glutamax （1: 100 ， Life TechNOGIS青霉素 的 祴经 培养 基 中 链鈠 1（链霉Teknologier） 表皮 生长 因子 （（（20 ng ml-1 ； r & d Systems） 成 纤维 细胞 生长 2 （fgf2 ； 20 ng ml- 1；R&D SystemsＳ瀩瀬24） На 6-й день суспензии нейросферы были переведены на добавку, содержащую нейробазал-А (10888, Life Technologies), Нава-27, добавку А (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies), пенициллин- нейтрализованный стрептомицин (1:100, Life Technologies) с добавлением фальпицин (EGF; 20 нг мл-1; R&D Systems) og фактора роста фибробластов 2 (FGF2; 20 нг ml-1) 1; På dag 6 blev neurosfæresuspensionerne skiftet til et tilskud indeholdende neurobasal-A (10888, Life Technologies), B-27-tilskud uden A-vitamin (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies), penicillin-neutraliseret streptomycin (1:100, Life Technologies) suppleret med epidermal vækstfaktor (EGF; 20 ng ml-1; R&D Systems) og fibroblastvækstfaktor 2 (FGF2; 20 ng ml-1)1; R&D Systems) til 24-dage. R&D-systemer) indtil dag 24.Fra dag 25 til 42 blev hjerneafledt neurotrofisk faktor (BDNF; 20 ng ml-1, Peprotech) og neurotrofisk faktor 3 (NT3; 20 ng ml-1, Peprotech) tilsat dyrkningsmediet hver anden dag. Mediumskift én gang.Fra dag 43 blev hCO3 opretholdt i ikke-suppleret neurobasal-A-medium (NM; 1088022, Thermo Fisher) med mediumskift hver 4.-6. dag. For at opnå hCO3 fra hiPS-celler dyrket under fødefrie forhold blev hiPS-celler inkuberet med Accutase (AT-104, Innovate Cell Technologies) ved 37°C i 7 minutter, dissocieret i enkeltceller og udpladet på AggreWell 800-plader (34815, STEMCELL Technologies) med en tæthed på 3 × 106 enkeltceller pr. brønd i Essential 8-medium suppleret med ROCK-inhibitoren Y-27632 (10 μM; S1049, Selleckchem). Efter 24 timer blev medierne i brøndene pipetteret op og ned i medier indeholdende Essential 6-medier (A1516401, Life Technologies) suppleret med dorsomorphin (2,5 μM; P5499, Sigma-Aldrich) og SB-431542 (10 μM; 1614, Tocrida). Fra dag 2 til 6 blev Essential 6-medium dagligt erstattet med dorsomorphin og supplementet SB-431542. Fra den sjette dag blev neurosfæresuspensionerne overført til det neurobasale medium og vedligeholdt som beskrevet ovenfor.
Alle dyreforsøg blev udført i overensstemmelse med retningslinjerne for dyrepleje, der er godkendt af Stanford University Laboratory Animal Care Administrative Committee (APLAC). Drægtige, euthymiske RNU (rnu/+) rotter blev indkøbt (Charles River Laboratories) eller anbragt. Dyrene blev holdt i en 12-timers lys-mørke-cyklus med foder og vand ad libitum. Nøgne (FOXN1–/–) rotteunger i alderen tre til syv dage blev identificeret ved vækst af umodne knurhår før aflivning. Hvalpene (hanner og hunner) blev bedøvet med 2-3% isofluran og placeret på en stereotaktisk ramme. En trepanation af kraniet med en diameter på ca. 2-3 mm over S1 blev udført, mens dura mater's integritet blev opretholdt. Brug derefter en 30-G nål (ca. 0,3 mm) lige uden for kraniotomien til at gennembore dura. Påfør derefter HCO3 på en tynd 3×3 cm parafilm, og fjern overskydende medium. Brug en Hamilton-sprøjte fastgjort til en 23 G, 45° nål, og træk forsigtigt hCO3 ind i nålens mest distale ende. Installer derefter sprøjten på sprøjtepumpen, der er tilsluttet den stereotaktiske enhed. Placer derefter nålespidsen over et tidligere lavet 0,3 mm bredt punkteringshul i dura (z = 0 mm), og indsnævre sprøjten 1-2 mm (z = ca. -1,5 mm), indtil nålen er mellem dura mater A. Der dannes en tæt forsegling. Løft derefter sprøjten til midten af ​​den kortikale overflade ved z = -0,5 mm, og injicer hCO3 med en hastighed på 1-2 µl pr. minut. Efter afslutningen af ​​hCO3-injektionen trækkes nålen tilbage med en hastighed på 0,2-0,5 mm pr. minut, huden sys, og hvalpen placeres straks på en varm varmepude, indtil den er fuldstændig rask. Nogle dyr blev transplanteret bilateralt.
Alle dyreforsøg blev udført i overensstemmelse med Stanford Universitys APLAC-godkendte retningslinjer for dyrepleje. Rotter (mere end 60 dage efter transplantation) blev induceret med 5% isoflurananæstesi og bedøvet med 1-3% isofluran under billeddannelse. Til visualisering blev en 7 Tesla aktivt afskærmet horisontal borehulsscanner fra Bruker (Bruker Corp.) med et International Electric Company (IECO) gradientdrev, en afskærmet gradientindsats med en indvendig diameter på 120 mm (600 mT/m, 1000 T/m/s) anvendt ved hjælp af AVANCE. III, otte-kanals multi-spole RF og multi-core-funktioner og den ledsagende Paravision 6.0.1 platform. Optagelsen blev udført ved hjælp af en aktivt afkoblet volumetrisk RF-spole med en indvendig diameter på 86 mm og en fire-kanals kryokølet RF-spole kun til modtagelse. Axial 2D Turbo-RARE (gentagelsestid = 2500 ms, ekkotid = 33 ms, 2 gennemsnit) med 16 snitoptagelser, snittykkelse 0,6-0,8 mm, indeholdende 256 × 256 prøver. Signalerne blev modtaget ved hjælp af en kvadraturtransceiver volumetrisk RF-spole med en indre diameter på 2 cm (Rapid MR International, LLC). Endelig blev de indbyggede Imaris (BitPlane) overfladeestimeringsfunktioner brugt til 3D-gengivelse og volumenanalyse. En vellykket transplantation blev defineret som en, hvor områder med kontinuerligt T2-vægtet MRI-signal blev dannet i den transplanterede hemisfære. Transplantatafstødning blev defineret som et transplantat, der ikke producerede områder med kontinuerligt T2-vægtet MRI-signal i den transplanterede hemisfære. Subkortikal t-hCO blev ekskluderet fra efterfølgende analyse.
For stabilt at udtrykke GCaMP6'er i hCO til to-foton calciumbilleddannelse blev hiPS-celler inficeret med pLV[Exp]-EF1a::GcaMP6s-WPRE-Puro efterfulgt af selektion af antibiotika. Kort fortalt blev cellerne dissocieret med EDTA og suspenderet i 1 ml Essential 8-medium ved en tæthed på ca. 300.000 celler i nærvær af polybren (5 μg/ml) og 15 μl virus. Cellerne blev derefter inkuberet i suspension i 60 minutter og podet ved en tæthed på 50.000 celler pr. brønd. Efter konfluens blev cellerne behandlet med 5-10 μg ml-1 puromycin i 5-10 dage eller indtil stabile kolonier fremkom. Akut hCO-infektion blev udført som tidligere beskrevet5 med nogle modifikationer. Kort fortalt blev dag 30-45 hCO overført til 1,5 ml Eppendorf-mikrocentrifugerør indeholdende 100 μl nervemedium. Derefter fjernes cirka 90 µl af mediet, 3-6 µl lentivirus med høj titer (fra 0,5 x 108 til 1,2 x 109) tilsættes til røret, og hCO3 overføres til inkubatoren i 30 minutter. Tilsæt derefter 90-100 µl medium til hvert rør, og rørene returneres til inkubatoren natten over. Næste dag overføres hCO3 til frisk nervemedium i plader med lav hæftning. Efter 7 dage blev hCO3 overført til 24-brønds plader med glasbund til visualisering og evaluering af infektionskvaliteten. pLV[Exp]-SYN1::EYFP-WPRE og pLV[Exp]-SYN1::hChR2-EYFP-WPRE blev genereret af VectorBuilder. Lentivirus anvendes i de fleste eksperimenter, fordi det er integreret i værtsgenomet, hvilket muliggør reportergenekspression i inficerede cellelinjer. Til opfølgning på rabies blev hCO på dag 30-45 co-inficeret med rabies-ΔG-eGFP og AAV-DJ-EF1a-CVS-G-WPRE-pGHpA (plasmid #67528, Addgene), vasket grundigt i 3 dage og transplanteret til rotter i S1 og vedligeholdt in vivo i 7-14 dage.
Til immuncytokemi blev dyrene bedøvet og transkardielt perfunderet med PBS efterfulgt af 4% paraformaldehyd (PFA i PBS; Electron Microscopy Sciences). Hjerner blev fikseret i 4% PFA i 2 timer eller natten over ved 4°C, kryopræserveret i 30% sukrose i PBS i 48-72 timer og indlejret i 1:1, 30% sukrose:OCT (Tissue-Tek OCT Compound 4583, Sakura Finetek), og koronale snit blev lavet ved 30 µm ved hjælp af en kryostat (Leica). Til immunhistokemi af tykke snit blev dyrene perfunderet med PBS, og hjernen blev dissekeret og sektioneret koronalt ved 300-400 µm ved hjælp af en vibratom (Leica), og snittene blev fikseret med 4% PFA i 30 minutter. Derefter blev kryosnit eller tykke snit vasket med PBS, blokeret i 1 time ved stuetemperatur (10% normalt æselserum (NDS) og 0,3% Triton X-100 fortyndet i PBS) og blokeret med blokeringsopløsning ved 4°C. – Inkubation Kryosnit blev inkuberet natten over, og tykke snit blev inkuberet i 5 dage. De primære antistoffer, der blev anvendt, var: anti-NeuN (mus, 1:500; ab104224, abcam), anti-CTIP2 (rotte, 1:300; ab18465, abcam), anti-GFAP (kanin, 1:1.000; Z0334, Dako), anti-GFP (kylling, 1:1.000; GTX13970, GeneTex), anti-HNA (mus, 1:200; ab191181, abcam), anti-NeuN (kanin, 1:500; ABN78, Millipore), anti-PDGFRA (kanin, 1:200; sc-338, Santa Cruz), anti-PPP1R17 (kanin, 1:200; HPA047819, Atlas Antibodies), anti-RECA-1 (mus, 1:50; ab9774, abcam), anti-SCG2 (kanin, 1:100; 20357-1-AP, Proteintech), anti-SOX9 (ged, 1:500; AF3075, R&D Systems), Netrin G1a (ged, 1:100; AF1166, R&D Systems), anti-STEM121 (mus, 1:200; Y40410, Takara Bio), anti-SATB2 (mus, 1:50; ab51502, abcam), anti-GAD65/67 (kanin, 1:400; ABN904, Millipore) og anti-IBA1 (ged, 1:100; ab5076, abcam). De primære antistoffer, der blev anvendt, var: anti-NeuN (mus, 1:500; ab104224, abcam), anti-CTIP2 (rotte, 1:300; ab18465, abcam), anti-GFAP (kanin, 1:1.000; Z0334, Dako), anti-GFP (kylling, 1:1.000; GTX13970, GeneTex), anti-HNA (mus, 1:200; ab191181, abcam), anti-NeuN (kanin, 1:500; ABN78, Millipore), anti-PDGFRA (kanin, 1:200; sc-338, Santa Cruz), anti-PPP1R17 (kanin, 1:200; HPA047819, Atlas Antibodies), anti-RECA-1 (mus, 1:50; ab9774, abcam), anti-SCG2 (kanin, 1:100; 20357-1-AP, Proteintech), anti-SOX9 (ged, 1:500; AF3075, R&D Systems), Netrin G1a (ged, 1:100; AF1166, R&D Systems), anti-STEM121 (mus, 1:200; Y40410, Takara Bio), anti-SATB2 (mus, 1:50; ab51502, abcam), anti-GAD65/67 (kanin, 1:400; ABN904, Millipore) og anti-IBA1 (ged, 1:100; ab5076, abcam). Использовались следующие первичные антитела: анти-NeuN (мышиные, 1:500; ab104224, abcam), анти-CTIP2 (крысины7, abcam), abcam 1:840, abcam анти-GFAP (кроличьи, 1:1000; Z0334, Dako), анти- -GFP (курица, 1:1000; GTX13970, GeneTex), анти-HNA (мышь, 1:200; ab19118) 1:500; ABN78, Millipore), анти-PDGFRA (кролик, 1:200; sc-338, Санта-Круз), анти-PPP1R17 (кролик, 1:200; HPA047819, Atlas Antibodies), анти-RECA-1 (мышь, 1:50; ab9774, abcam), анти-SCG2 (scg2, анти-SCG2; 20357-1-AP, Proteintech), анти-SOX9 (козий, 1:500; AF3075, R&D Systems), нетрин G1a (козий, 1:100; AF1166, R&D Systems), анти-STEM121 (мыный: 20ши; Y40410, Takara Bio), анти-SATB2 (мышь, 1:50; ab51502, abcam), анти-GAD65/67 (кролик, 1:400; ABN904, Millipore) og анти-IBA1 (коза, 1:100; аб5076, абкам). De primære antistoffer, der blev anvendt, var: anti-NeuN (mus, 1:500; ab104224, abcam), anti-CTIP2 (rotte, 1:300; ab18465, abcam), anti-GFAP (kanin, 1:1000; Z0334, Dako), anti-GFP (kylling, 1:1000; GTX13970, GeneTex), anti-HNA (mus, 1:200; ab191181, abcam), anti-NeuN (kanin, 1:500; ABN78, Millipore), anti-PDGFRA (kanin, 1:200; sc-338, Santa Cruz), anti-PPP1R17 (kanin, 1:200; HPA047819, Atlas Antibodies), anti-RECA-1 (mus, 1:50; ab9774, abcam), anti-SCG2 (kanin, 1:100; 20357-1-AP, Proteintech), anti-SOX9 (ged, 1:500; AF3075, R&D Systems), netrin G1a (ged, 1:100; AF1166, R&D Systems), anti-STEM121 (mus, 1:200; Y40410, Takara Bio), anti-SATB2 (mus, 1:50; ab51502, abcam), anti-GAD65/67 (kanin, 1:400; ABN904, Millipore) og anti-IBA1 (ged, 1:100; ab5076, abkam).使用的一抗是：抗NeuN（小鼠，1:500；ab104224，abcam）抗CTIP2（大鼠，1:3 00；ab18465，abcam），抗GFAP（兔，1:1.000；Z0334，Dako），抗-GF P（鸡，1:1.000；GTX13970，GeneTex），抗HNA（小鼠，1:200；ab1911 81，abcam），抗NeuN（兔，1:500；ABN78，Millipore），抗PDGFRA（兔， 1:200；sc-338，Santa Cruz），抗PPP1R17（兔，1:200；HPA047819，Atlas抗体），抗RECA-1（小鼠，1:50；ab9774，abcam），抗SCG2（兔） , 1:100；20357-1-AP，Proteintech），抗SOX9（山羊，1:500；AF3075，R&D Systems），Netrin G1a（山羊，（山羊，，，1:10AF，1:10 Systems），抗STEM121（小鼠, 1:200;使用的一抗是：抗NeuN（小鼠，1:500；ab104224，abcam）抗CTIP2（大鼠，1 :300；ab18465，abcam），抗GFAP（兔，1:1.000；Z0334，Dako），抗-GFP（鸡，1:1.000；GTX13970，GeneTex），抗HNA（小鼠，1:200；ab 191181，abcam），抗NeuN（兔，1:500；ABN78，Millipore％弔，抗1: 200；sc-338，Santa Cruz），抗PPP1R17（兔，1:200；HPA047819，Atlas抗体），抗RECA-1（小鼠，1:50；ab9774，abcam），抗SCG2 100；20357-1-AP，Proteintech），抗SOX9（山羊，1:500；AF3075，R&D Systems），Netrin G1a（山羊，1:106，DQ100 Systemer）頏1:20, ;Y40410, Takara Bio), anti-SATB2 (mus, 1:50; ab51502, abcam), anti-GAD65/67 (kanin, 1:400; ABN904, Millipore) og anti-IBA1 (ged, 1:100; ab5076, abcam).De primære anvendte antistoffer var: anti-NeuN (mus, 1:500; ab104224, abcam), anti-CTIP2 (rotte, 1:300; ab18465, abcam), anti-GFAP (kanin, 1:1000; Z0334, Dako). , anti-GFP (kylling, 1:1000; GTX13970, GeneTex), anti-HNA (mus, 1:200; ab191181, abcam), anti-NeuN (kanin, 1:500; ABN78, Millipore), anti-PDGFRA (kanin, 1:200; sc-338, Santa Cruz), anti-PPP1R17 (kanin, 1:200; HPA047819, Atlas-antistof), anti-RECA-1 (mus, 1:50; ab9774, abcam), anti-SCG2 (kanin), 1:100;20357-1-AP, Proteintech), анти-SOX9 (коза, 1:500; AF3075, R&D Systems), Нетрин G1a (коза, 1:100; AF1166, R&D Systems), анти -STEM121, мы1ш4000, мы4ш100; Bio), анти-SATB2 (мышь, 1:50; ab51502, abcam), анти-GAD65/67 (кролик, 1:400; ABN904, Millipore) og анти-IBA1 (коза, 1:107; аба5076; аба50ка). 20357-1-AP, Proteintech), anti-SOX9 (ged, 1:500; AF3075, R&D Systems), Netrin G1a (ged, 1:100; AF1166, R&D Systems), anti-STEM121 (mus, 1:200; Y40410, Takara Bio), anti-SATB2 (mus, 1:50; ab51502, abcam), anti-GAD65/67 (kanin, 1:400; ABN904, Millipore) og anti-IBA1 (ged, 1:100; ab5076, abkam).Snittene blev derefter vasket med PBS og inkuberet med sekundært antistof i 1 time ved stuetemperatur (frosne snit) eller natten over ved 4°C (tykke snit). Alexa Fluor sekundært antistof (Life Technologies) fortyndet 1:1000 i blokeringsopløsning blev anvendt. Efter vask med PBS blev kernerne visualiseret med en Hoechst 33258 (Life Technologies). Til sidst blev præparaterne placeret på et mikroskop med dækglas (Fisher Scientific) ved hjælp af en Aquamount (Polysciences) og analyseret på et Keyence fluorescensmikroskop (BZ-X analysator) eller et Leica TCS SP8 konfokalmikroskop (Las-X) på billedet. Billederne blev behandlet ved hjælp af ImageJ-programmet (Fiji). For at kvantificere andelen af ​​humane neuroner i t-hCO og rottecortex blev der taget 387,5 μm brede rektangulære billeder i midten af ​​t-hCO, ved eller nær kanten af ​​rottecortex. Transplantatmarginer blev bestemt ved at vurdere ændringer i vævstransparens, HNA+ kerner og/eller tilstedeværelsen af ​​vævsautofluorescens. I hvert billede blev det samlede antal NeuN+ og HNA+ celler divideret med det samlede antal NeuN+ celler i samme område. For at sikre, at kun celler med kerner i billedplanet tælles, inkluderes kun celler, der også er Hoechst+, i beregningen. To billeder adskilt med mindst 1 mm blev gennemsnittet for at reducere den statistiske fejl.
En uge før prøveindsamling placeres hCO3-transplantationsdyr (ca. 8 måneders differentiering) i et mørkt rum med trimmede skæg for at minimere sensorisk stimulering. Isolering af kerner blev udført som tidligere beskrevet, med nogle ændringer. Kort fortalt blev t-hCO3 og hCO3 destrueret ved hjælp af detergent-mekanisk cellelyse og en 2 ml glasvævskværn (D8938, Sigma-Aldrich/KIMBLE). De rå kerner blev derefter filtreret fra ved hjælp af et 40 µm filter og centrifugeret ved 320 g i 10 minutter ved 4 °C, før en sucrosedensitetsgradient blev udført. Efter centrifugeringstrinnet (320 g i 20 minutter ved 4 °C) blev prøverne resuspenderet i 0,04% BSA/PBS med tilsætning af 0,2 enheder µl-1 RNase-hæmmer (40 u µl-1, AM2682, Ambion) og ført gennem et 40 µm flowfilter. De dissocierede kerner blev derefter resuspenderet i PBS indeholdende 0,02% BSA og påført en Chromium Single Cell 3'-chip (estimeret genvinding på 8.000 celler pr. bane). snRNA-seq-biblioteker blev fremstillet med Chromium Single cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics). snRNA-seq-biblioteker blev fremstillet med Chromium Single cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics). Библиотеки snRNA-seq были приготовлены с помощью Chromium Single cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics). snRNA-seq-bibliotekerne blev fremstillet ved hjælp af Chromium Single cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics). snRNA-seq 文库是使用Chromium Single cell 3′ GEM、Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics) 制备的。 snRNA-seq 文库是使用Chromium Single cell 3′ GEM、Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics) 制备的。 Библиотеку snRNA-seq готовили использованием Chromium Single Cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics). snRNA-seq-biblioteket blev fremstillet ved hjælp af Chromium Single Cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics).Biblioteker fra forskellige prøver blev samlet og sekventeret af Admera Health på NovaSeq S4 (Illumina).
Genekspressionsniveauer for hver formodet nuklear stregkode blev kvantificeret ved hjælp af 10x Genomics CellRanger analysesoftwarepakken (version 6.1.2). Specifikt blev aflæsningerne matchet med en kombination af humane (GRCh38, Ensemble, version 98) og rotte (Rnor_6.0, Ensemble, version 100) referencegenomer oprettet med mkref-kommandoen og ved hjælp af count med –include-introns=TRUE-kommandoen for at kvantificere inkludering af aflæsninger kortlagt til intronregioner. For t-hCO-prøver blev humane kerner identificeret baseret på det konservative krav om, at mindst 95 % af alle kortlagte aflæsninger matcher det humane genom. Alle efterfølgende analyser blev udført på et filtreret stregkodearray output fra CellRanger ved hjælp af R-pakken (version 4.1.2) Seurat (version 4.1.1)32.
For at sikre, at kun kerner af høj kvalitet inkluderes i den efterfølgende analyse, blev en iterativ filtreringsproces implementeret for hver prøve. Først identificeres og fjernes kerner af lav kvalitet med færre end 1000 unikke gener fundet og mere end 20% af det samlede antal mitokondrier. Efterfølgende blev den rå gennummermatrix normaliseret ved regulariseret negativ binomial regression ved hjælp af sctransform(vst.flavor=”v2″)-funktionen, som også identificerede de 3000 mest variable gener ved hjælp af standardparametre. Dimensionsreduktion blev udført på de øvre variable gener ved hjælp af Principal Component Analysis (PCA) med standardparametre ved hjælp af en datasætdimension på 30 (dims = 30 blev valgt baseret på visuel inspektion af knæsteder og brugt til alle prøver og ensembleanalyser). Vi udførte derefter flere runder af iterativ klyngedannelse (opløsning = 1) for at klassificere gener baseret på unormalt lavt genantal (median under 10. percentil), unormalt højt mitokondrie-genantal (median over 95. percentil) for at identificere og fjerne formodede celler af lav kvalitet. Klynger og/eller en høj andel af mistænkte tvillinger identificeret ved hjælp af DoubletFinder33-pakken (gennemsnitlig DoubletFinder-score over 95. percentil). t-hCO-prøver (n=3) og hCO-prøver (n=3) blev integreret separat ved hjælp af IntegrateData-funktionen med ovenstående parametre. Derefter endnu en runde med kvalitativ filtrering af det integrerede datasæt blev udført som beskrevet ovenfor.
Efter fjernelse af kerner af lav kvalitet blev det integrerede datasæt grupperet (opløsning = 0,5) og indlejret til UMAP34-visualiseringsformål. Markørgener for hver klynge blev bestemt ved hjælp af FindMarkers-funktionen med standardparametre beregnet ud fra normaliserede genekspressionsdata. Vi identificerer og klassificerer større celleklasser ved at kombinere føtale og voksne kortikale referencedatasæt med markørgenekspression [19, 20, 21, 35] og annotation. Især blev cirkulerende precursorer identificeret ved ekspressionen af ​​MKI67 og TOP2A. Progenitorklynger blev defineret ved fraværet af mitotiske transkripter, høj overlapning med multipotente gliale progenitorklynger beskrevet i sen metafase føtal cortex og EGFR- og OLIG1-ekspression. Vi bruger udtrykket astrocyt til at omfatte flere tilstande af astrocytdifferentiering, fra sen radial glia til modning af astrocytter. Astrocytklynger udtrykker høje niveauer af SLC1A3 og AQP4 og har vist sig at kortlægges med undertyper af føtal radial glia og/eller voksne astrocytter. OPC'er udtrykker PDGFRA og SOX10, mens oligodendrocytter udtrykker myeliniseringsmarkører (MOG og MYRF). Glutamaterge neuroner blev identificeret ved tilstedeværelsen af ​​neuronale transkripter (SYT1 og SNAP25), fraværet af GABAerge markører (GAD2) og ekspressionen af ​​NEUROD6, SLC17A7, BCL11B eller SATB2. GluN-neuroner blev yderligere opdelt i øvre (SATB2-ekspression og tab af BCL11B) og dybe (BCL11B-ekspression) underklasser. Putative subpladeneuroner (SP) udtrykker kendte SP18-markører såsom ST18 og SORCS1 ud over dybe GluN-markører. Choroid plexus-lignende celler blev identificeret ved TTR-ekspression, og meningeal-lignende celler udtrykte fibroblastassocierede gener og kortlagde pial/vaskulære celler fra referencedatasættet.
Differentiel analyse af genekspression mellem t-hCO og hCO underklasser blev udført ved hjælp af en nyudviklet pseudo-batch-metode reproduceret i prøver implementeret ved hjælp af Libra R-pakken (version 1.0.0). Specifikt blev edgeR log-likelihood-tests (version 3.36.0, pakke R) udført for grupper ved at summere antallet af gener i celler for en given celleklasse for hver prøvereplikering. Til heatmap-visualisering beregnes normaliserede værdier pr. million (CPM) ved hjælp af edgeR (cpm() funktion) og skaleres (for at opnå middelværdi = 0, standardafvigelse = 1). Gene Ontology (GO) berigelsesanalyse af signifikant opregulerede t-hCO GluN gener blev udført (Benjamini-Hochberg korrigeret P-værdi på mindre end 0,05 udtrykt i mindst 10% af t-hCO GluN celler og en fold-stigning i ændring på mindst 2 gange) udført ved hjælp af ToppGene Suite (https://toppgene.cchmc.org/)37. Vi bruger ToppFun-appen med standardparametre og rapporterer Benjamini-Hochberg-korrigerede P-værdier beregnet ud fra GO-annoterede hypergeometriske tests.
For at matche vores snRNA-seq-klynger med annoterede celleklynger fra referencestudier af primær enkeltcellet RNA-seq eller voksen snRNA-seq19,20,21,22, anvendte vi en parret datasætintegrationsmetode. Vi brugte SCTransform (v2) normaliseringsworkflowet i Seurat til at integrere og sammenligne klyngeoverlapninger mellem datasæt (ved hjælp af de samme parametre som ovenfor). Individuelle datasæt blev tilfældigt delmængder op til 500 celler eller kerner pr. oprindelig klynge for at opnå beregningseffektivitet. Ved hjælp af en lignende tilgang som tidligere beskrevet blev klyngeoverlap defineret som andelen af ​​celler eller kerner i hver samlet klynge, der overlappede med referenceklyngens etiket. For yderligere at klassificere GluN'er brugte vi Seurats TransferData-workflow til GluN-delmængdedata til at tildele referencedatasætetiketter til vores GluN-celler.
For at vurdere modningsstatussen for det globale transkriptom af t-hCO og hCO prøver, sammenlignede vi vores pseudo-bulk prøver med BrainSpan/psychENCODE23, som består af en stor RNA-sekvens, der spænder over den menneskelige hjerneudvikling. Vi udførte PCA på en kombineret mønster-normaliseret genekspressionsmatrix fra kortikale prøver 10 uger efter undfangelse og senere i 5567 gener (sammen med vores data), der tidligere var blevet identificeret som aktive i BrainSpan kortikale prøver (defineret som større end 50% i udviklingsvarians forklaret af alder ved hjælp af en kubisk model)38. Derudover udledte vi gener forbundet med vigtige transkriptomsignaturer af neurologisk udvikling ved hjælp af ikke-negativ matrixfaktorisering som tidligere beskrevet. Prøvevægtene beregnet ved hjælp af den ikke-negative matrixfaktoriseringsprocedure er plottet i figur 5b med udvidede data for hver af de fem signaturer beskrevet af Zhu et al.38. Igen blev aktivitetsafhængige transkriptionsmarkører udledt fra tidligere publicerede studier. Især var ERG og LRG signifikant opreguleret i glutamaterge neuroner identificeret ved hjælp af snRNA-seq-samlingen fra musens visuelle cortex efter visuel stimulering fra Supplerende Tabel 3 Hrvatin et al.16. Humant berigede LRG'er blev opnået fra KCl-aktiverede humane føtale hjernekulturer og høstet 6 timer efter stimulering, og de filtrerede gener var signifikant opreguleret hos mennesker, men ikke hos gnavere (Supplerende Tabel 4). Analyse af gensætberigelse ved hjælp af disse gensæt blev udført ved hjælp af en envejs Fishers eksakte test.
Bedøv rotterne med isofluran, fjern hjernerne og anbring dem i en kold (ca. 4 °C) iltet (95 % O2 og 5 % CO2) sukroseopløsning for snit indeholdende: 234 mM sukrose, 11 mM glukose, 26 mM NaHCO3, 2,5 mM KCl, 1,25 mM NaH2PO4, 10 mM MgSO4 og 0,5 mM CaCl2 (ca. 310 mOsm). Koronale snit af rottehjernen (300-400 µm) indeholdende t-hCO3 blev lavet ved hjælp af et Leica VT1200 vibratom som tidligere beskrevet39. Snittene blev derefter overført til et sektioneringskammer med kontinuerlig oxygenering ved stuetemperatur indeholdende aCSF fremstillet af: 10 mM glukose, 26 mM NaHCO3, 2,5 mM KCl, 1,25 mM NaHPO4, 1 mM MgSO4, 2 mM CaCl2 og 126 mM NaCl (298 mOsm) mindst 45 minutter før optagelse. Snittene blev optaget i et nedsænket kammer, hvor de kontinuerligt blev perfunderet med aCSF (95% O2 og 5% CO2 hætteglas). Alle data blev optaget ved stuetemperatur. t-hCO neuroner blev termineret med en borsilikatglaspipette fyldt med en opløsning indeholdende 127 mM kaliumgluconat, 8 mM NaCl, 4 mM magnesium ATP, 0,3 mM natrium GTP, 10 mM HEPES og 0,6 mM EGTA, pH 7,2, intern opløsning justeret med KOH (290 mOsm). For at genvinde blev biocytin (0,2%) tilsat optagelsesopløsningen.
Data blev indsamlet ved hjælp af en MultiClamp 700B forstærker (Molecular Devices) og en Digidata 1550B digitaliseringsenhed (Molecular Devices), lavpasfiltreret ved 2 kHz, digitaliseret ved 20 kHz og analyseret ved hjælp af Clampfit (Molecular Devices), Origin (OriginPro, 2021b, OriginLab) og brugerdefinerede MATLAB-funktioner (Mathworks). Krydsningspotentialet blev beregnet ved hjælp af JPCalc, og indtastningerne blev justeret til den beregnede værdi på -14 mV. Operation IV består af en række strømtrin i trin på 10-25 pA, fra -250 til 750 pA.
Thalamus, hvid substans og S1-afferenter blev elektrisk stimuleret i thalamokortikale skiver under patch-clamp-optagelse af hCO-neuroner, som tidligere beskrevet. Kort fortalt blev hjernen placeret på et 3D-printbord vippet i en vinkel på 10°, og hjernens forside blev skåret i en vinkel på 35°. Hjernen blev derefter limet til den skårne overflade og opdelt i sektioner, hvorved de thalamokortikale, fremspringende axoner blev bevaret. Bipolære wolframelektroder (0,5 MΩ) blev monteret på en anden mikromanipulator og strategisk placeret for at stimulere fire regioner pr. celle (indre kapsel, hvid substans, S1 og hCO). Optag synaptiske responser efter 300 µA fasisk stimulering ved 0,03-0,1 Hz.
hChR2-ekspresserende hCO-neuroner blev aktiveret ved 480 nm, og lyspulser genereret af en LED (Prizmatix) blev påført gennem et ×40-objektiv (0,9 NA; Olympus) for at registrere hChR2-ekspression nær cellerne. Den belyste feltdiameter er cirka 0,5 mm, og den samlede effekt er 10-20 mW. Pulsbredden blev indstillet til 10 ms, hvilket svarer til den puls, der blev givet under adfærdslæringseksperimentet. Forskellige stimuleringsfrekvenser blev anvendt, fra 1 til 20 Hz, men kun den første puls i serien blev brugt til kvantificering. Intervallerne mellem togene er normalt længere end 30 sekunder for at minimere effekten på synaptiske hæmmende eller faciliterende veje. For at teste, om hChR2-responsen var monosynaptisk, påførte vi TTX (1 μM) på badet, indtil EPSC-reaktionen forsvandt, og påførte derefter 4-aminopyridin (4-AP; 100 μM). Typisk returneres et respons inden for få minutter, med en lidt længere forsinkelse mellem LED-tænding og EPSC-generering. NBQX (10 μM) blev brugt til at teste, om responsen er drevet af AMPA-receptorer.
Skarpe hCO₂-sektioner blev fremstillet som tidligere beskrevet. Kort fortalt blev hCO₂-sektioner indlejret i 4% agarose og overført til celler indeholdende 126 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM NaH₂PO₄, 1 mM MgSO₄, 2 mM CaCl₂, 26 mM NaHCO₃ og 10 mM d-(+)-glukose i sektioner. Sektionerne blev skåret ved 200-300 µm ved stuetemperatur ved hjælp af en Leica VT1200 vibrator og opbevaret i ASF ved stuetemperatur. Derefter blev patch-camp-optagelse af hele celler udført på hCO₂-sektioner under et direkte SliceScope-mikroskop (Scientifica). Sektionerne blev perfunderet med aCSF (95% O₂ og 5% CO₂), og cellesignalerne blev optaget ved stuetemperatur. hCO-neuroner blev påført ved hjælp af en borsilikatglaspipette fyldt med en opløsning indeholdende 127 mM kaliumgluconat, 8 mM NaCl, 4 mM magnesium ATP, 0,3 mM natrium GTP, 10 mM HEPES og 0,6 mM EGTA, intern pH 7, 2, justeret med KOH (osmolaritet 290). Til genvinding tilsættes 0,2% Biocytin til den interne opløsning.
Data blev indsamlet af Clampex (Clampex 11.1, Molecular Devices) ved hjælp af en MultiClamp 700B forstærker (Molecular Devices) og en Digidata 1550B digitaliseringsenhed (Molecular Devices), lavpasfiltreret ved 2 kHz, digitaliseret ved 20 kHz og analyseret ved hjælp af Clampfit (version 10.6) til analyse (molekylære enheder) og brugerdefinerede MATLAB-funktioner (MATLAB 2019b, Mathworks). Forbindelsespotentialet blev beregnet ved hjælp af JPCalc, og indtastningerne blev justeret til det beregnede forbindelsespotentiale på -14 mV. Operation IV består af en række strømtrin i trin på 5-10 pA fra -50 til 250 pA.
Til morfologisk rekonstruktion af klemte neuroner blev 0,2% biocytin (Sigma-Aldrich) tilsat den interne opløsning. Cellerne primes i mindst 15 minutter efter hacking. Pipetten trækkes derefter langsomt ind i 1-2 minutter, indtil den registrerede membran er fuldstændig forseglet. Efter snitfysiologisk procedure blev snittene fikseret natten over ved 4° C i 4% PFA, vasket med PBS X3 og fortyndet 1:1000 med streptavidin-konjugeret DyLight 549 eller DyLight 405 (Vector Labs). Celler fyldt med biocytin (2%; Sigma-Aldrich) blev mærket under patch clamp-optagelse ved stuetemperatur i 2 timer. Snittene blev derefter monteret på mikroskopiglas ved hjælp af en Aquamount (Thermo Scientific) og visualiseret den næste dag på et Leica TCS SP8 konfokalmikroskop ved hjælp af et olieimmersionsobjektiv med en numerisk apertur ×40 1,3, forstørrelse ×0,9-1,0, xy. Samplinghastigheden er cirka 7 pixels pr. mikron. Z-stabler med intervaller på 1 µm blev taget serielt, og z-stack-mosaikker og Leica-baseret auto-stitching blev udført for at dække hele det dendritiske træ for hver neuron. Neuroner blev derefter sporet semimanuelt ved hjælp af neuTube 40-grænsefladen, og SWC-filer blev genereret. Filerne blev derefter uploadet til SimpleNeuriteTracer41 Fiji-plugin'et (ImageJ, version 2.1.0; NIH).
Humant kortikalt væv blev indhentet med informeret samtykke i henhold til en protokol godkendt af Institutional Review Board ved Stanford University. To prøver af humant postpartumvæv (3 og 18 år gamle) blev indhentet ved resektion af frontal cortex (midterste frontale gyrus) som en del af en operation for refraktær epilepsi. Efter resektion blev vævet udtaget i iskold NMDG-aCSF indeholdende: 92 mM NMDG, 2,5 mM KCl, 1,25 mM NaH2PO4, 30 mM NaHCO3, 20 mM HEPES, 25 mM glukose, 2 mM thiourea, 5 mM natriumascorbat, 3 mM natriumpyruvat, 0,5 mM CaCl24H2O og 10 mM MgSO47H2O. Titrer til pH 7,3-7,4 med koncentreret saltsyre. Væv blev leveret til laboratoriet inden for 30 minutter, og koronale snit blev taget i henhold til den ovenfor beskrevne procedure.
Alle dyreforsøg blev udført i overensstemmelse med Stanford Universitys APLAC-godkendte retningslinjer for dyrepleje. Rotter (mere end 140 dage efter transplantation) blev induceret med 5% isoflurananæstesi og bedøvet med 1-3% isofluran intraoperativt. Dyrene blev placeret i en stereotaktisk ramme (Kopf), og buprenorphin (SR) med forlænget frigivelse blev injiceret subkutant. Kraniet eksponeres, rengøres, og 3-5 knogleskruer indsættes. For at målrette t-hCO3 genererede vi stereotaksiske koordinater fra MR-billeder. Et borehul blev boret på det interessante sted, og fibre (400 µm i diameter, NA 0,48, dorisk) blev sænket 100 µm under hCO3-overfladen og fastgjort til kraniet med UV-hærdende tandcement (Relyx).
Fiberfotometriske optagelser blev udført som tidligere beskrevet42. For at registrere spontan aktivitet blev rotterne placeret i et rent bur, og et fiberoptisk patchkabel (Doric) med en diameter på 400 µm, der var forbundet til et fiberoptisk fotometrisk dataopsamlingssystem, blev forbundet til det implanterede fiberoptiske kabel. Under den 10 minutter lange optagelse af motorisk aktivitet kunne dyrene frit udforske buret. For at registrere den fremkaldte aktivitet blev rotterne (mere end 140 dage efter transplantation) bedøvet med 5% isofluran til induktion og 1-3% isofluran til vedligeholdelse. Dyret blev placeret i en stereotaktisk ramme (Kopf), og knurhårene på den modsatte side af t-hCO3 trimmes til ca. 2 cm og føres gennem et net forbundet til en piezoelektrisk aktuator (PI). Et 400 µm fiberoptisk patchkabel (Doric) blev forbundet til den implanterede fiber og forbundet til dataopsamlingssystemet. Whiskers på den modsatte side af t-hCO blev derefter afbøjet 50 gange (2 mm ved 20 Hz, 2 s pr. præsentation) på tilfældige tidspunkter af et piezoelektrisk drev over en 20 minutters optagelsesperiode. Brug Arduino MATLAB Support Package til at styre afbøjningstiden med brugerdefineret MATLAB-kode. Hændelser synkroniseres med dataopsamlingssoftwaren ved hjælp af transistor-transistor logik (TTL) pulser.
Rotter (mere end 140 dage efter transplantation) blev induceret med 5% isoflurananæstesi og bedøvet med 1-3% isofluran intraoperativt. Dyrene blev placeret i en stereotaktisk ramme (Kopf), og buprenorphin SR og dexamethason blev injiceret subkutant. Kraniet eksponeres, rengøres, og 3-5 knogleskruer indsættes. For at målrette t-hCO genererede vi stereotaksiske koordinater fra MR-billeder. En cirkulær kraniotomi (ca. 1 cm i diameter) blev udført med et højhastighedsbor direkte over den transplanterede hCO. Når knoglen er så tynd som muligt, men før der bores gennem hele knoglen, bruges en pincet til at fjerne den resterende intakte bækkenskive for at afsløre den underliggende t-hCO. Kraniotomien blev fyldt med sterilt saltvand, og et dækglas og en speciel hovedstift blev fastgjort til kraniet med UV-hærdet tandcement (Relyx).
To-foton-billeddannelse blev udført ved hjælp af et Bruker multifotonmikroskop med et Nikon LWD (×16, 0,8 NA) objektiv. GCaMP6-billeddannelse blev udført ved 920 nm med 1,4x enkelt z-plan forstørrelse og 8x gennemsnit på 7,5 fps. Rotter blev induceret med 5% isoflurananæstesi og vedligeholdt med 1-3% isofluran. Rotterne blev placeret i en specialfremstillet hovedfixtur og placeret under linsen. En 3-minutters baggrundsoptagelse af motorisk aktivitet blev opnået. I løbet af 20 minutters optagelse blev 50 pust (hver præsentation 100 ms lang) tilfældigt leveret til whisker-puden modsat t-hCO ved hjælp af en picospricer. Brug Arduino MATLAB Support Package til at kontrollere burst-tiden med brugerdefineret MATLAB-kode. Synkroniser begivenheder med dataopsamlingssoftware (PrairieView 5.5) ved hjælp af TTL-pulser. Til analyse blev billederne korrigeret for xy-bevægelse ved hjælp af affin korrektion i MoCo-programmet, der blev lanceret i Fiji. Ekstraktion af fluorescerende spor fra individuelle celler ved hjælp af CNMF-E43. Fluorescens blev ekstraheret for hvert interesseområde, konverteret til dF/F-kurver og derefter konverteret til z-scores.
Rotter (mere end 140 dage efter transplantation) blev induceret med 5% isoflurananæstesi og bedøvet med 1-3% isofluran intraoperativt. Dyrene blev placeret i en stereotaktisk ramme (Kopf), og buprenorphin SR og dexamethason blev injiceret subkutant. Kæberne på den modsatte side af t-hCO blev klippet til ca. 2 cm og ført gennem et net forbundet til en piezoelektrisk aktuator. Kraniet eksponeres og rengøres. En jordskrue i rustfrit stål er fastgjort til kraniet. For at målrette t-hCO genererede vi stereotaksiske koordinater fra MR-billeder. Udfør en cirkulær kraniotomi (ca. 1 cm i diameter) med et højhastighedsbor lige over t-hCO. Når knoglen er så tynd som muligt, men før der bores gennem hele knoglen, bruges en pincet til at fjerne den resterende intakte bækkenskive for at afsløre den underliggende t-hCO. Individuelle celler blev optaget ved hjælp af 32-kanals eller 64-kanals højdensitets siliciumprober (Cambridge Neurotech) jordet til jordskruer og forforstærket med RHD-forstærkere (Intan). Brug manipulatoren til at sænke elektroderne ned til målstedet gennem kraniotomien, som er fyldt med sterilt saltvand. Dataindsamling blev udført ved en frekvens på 30 kHz ved hjælp af Open Ephys dataopsamlingssystem. Optagelsen fortsatte kun, når vi detekterede stærkt korreleret rytmisk spontan aktivitet i mere end 10 kanaler, hvilket tyder på, at elektroderne var placeret i transplantatet (baseret på to-foton calciumbilleddannelsesdata). En 10-minutters baggrundsoptagelse af motorisk aktivitet blev opnået. Whiskers på den modsatte side af t-hCO blev derefter afbøjet 50 gange (2 mm ved 20 Hz, 2 s pr. præsentation) på tilfældige tidspunkter af et piezoelektrisk drev over en 20-minutters optagelsesperiode. Ved hjælp af MATLAB Support Package til Arduino (MATLAB 2019b) kan afbøjningstiden kontrolleres med brugerdefineret MATLAB-kode. Brug TTL-pulser til at synkronisere begivenheder med dataopsamlingssoftware.
Til optiske markeringseksperimenter blev et 200 µm optisk patchkabel (Dorisk) forbundet til en 473 nm laser (Omicron) og forbundet til en 200 µm optisk fiber placeret over kraniotomien. Umiddelbart før dette justeres jumpereffekten til 20 mW. Brug manipulatoren til at sænke elektroderne ned til målstedet gennem kraniotomien, som er fyldt med sterilt saltvand. Ved begyndelsen af ​​optagelsen blev der udsendt ti lyspulser 473 nm (frekvens 2 Hz, pulsvarighed 10 ms). Lysfølsomme celler blev defineret som celler, der udviste en spike-respons inden for 10 ms lys i 70 % eller mere af forsøgene.