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स्व-संयोजन तंत्रिका अंग मानव विकास और रोग के मॉडलिंग के लिए एक आशाजनक इन विट्रो प्लेटफ़ॉर्म का प्रतिनिधित्व करते हैं। हालाँकि, ऑर्गेनोइड्स में वह कनेक्टिविटी नहीं होती है जो विवो में मौजूद होती है, जो परिपक्वता को सीमित करती है और व्यवहार को नियंत्रित करने वाले अन्य सर्किटों के साथ एकीकरण को रोकती है। यहाँ हम दिखाते हैं कि नवजात नग्न चूहों के सोमैटोसेंसरी कॉर्टेक्स में प्रत्यारोपित मानव स्टेम सेल-व्युत्पन्न कॉर्टिकल ऑर्गेनोइड्स परिपक्व कोशिका प्रकार विकसित करते हैं जो संवेदी और प्रेरणा-संबंधित सर्किट में एकीकृत होते हैं। एमआरआई ने कई स्टेम सेल लाइनों और जानवरों में प्रत्यारोपण के बाद ऑर्गेनोइड वृद्धि का खुलासा किया, जबकि सिंगल-कोर विश्लेषण ने कॉर्टिकोजेनेसिस की प्रगति और एक गतिविधि-निर्भर प्रतिलेखन कार्यक्रम के उद्भव का खुलासा किया। वास्तव में, प्रत्यारोपित कॉर्टिकल न्यूरॉन्स अपने इन विट्रो समकक्षों की तुलना में अधिक जटिल रूपात्मक, सिनैप्टिक और आंतरिक झिल्ली गुणों का प्रदर्शन करते हैं, जिससे टिमोथी सिंड्रोम वाले रोगियों में न्यूरोनल दोषों का पता लगाना संभव हो जाता है। शारीरिक और कार्यात्मक अनुरेखण ने दिखाया है कि प्रत्यारोपित अंग थैलेमोकोर्टिकल और कॉर्टिकोकॉर्टिकल इनपुट प्राप्त करते हैं, और तंत्रिका गतिविधि की इन विवो रिकॉर्डिंग से पता चलता है कि ये इनपुट मानव कोशिकाओं में संवेदी प्रतिक्रियाएँ उत्पन्न कर सकते हैं। अंत में, कॉर्टिकल ऑर्गेनोइड्स चूहे के मस्तिष्क में अक्षतंतु का विस्तार करते हैं, और उनके ऑप्टोजेनेटिक सक्रियण से पुरस्कार चाहने वाले व्यवहार की ओर अग्रसर होता है। इस प्रकार, प्रत्यारोपित मानव कॉर्टेक्स न्यूरॉन्स परिपक्व होते हैं और मेजबान के सर्किट में भाग लेते हैं जो व्यवहार को नियंत्रित करते हैं। हम उम्मीद करते हैं कि यह दृष्टिकोण रोगी-व्युत्पन्न कोशिकाओं में स्ट्रैंड-स्तरीय फेनोटाइप का पता लगाने में मदद करेगा जिन्हें अन्य तरीकों से नहीं पहचाना जा सकता है।
विकासशील मानव मस्तिष्क एक उल्लेखनीय स्व-संगठित प्रक्रिया है जिसमें कोशिकाएँ बढ़ती हैं, विभेदित होती हैं, पलायन करती हैं, और कार्यात्मक न्यूरोनल सर्किट बनाने के लिए जुड़ती हैं जिन्हें संवेदी अनुभव के माध्यम से और अधिक परिष्कृत किया जाता है। मानव मस्तिष्क के विकास को समझने में एक महत्वपूर्ण समस्या, विशेष रूप से बीमारी के संदर्भ में, मस्तिष्क के ऊतकों तक पहुँच की कमी है। मानव कॉर्टेक्स ऑर्गेनोइड्स (hCO; जिसे मानव कॉर्टेक्स क्षेत्र के रूप में भी जाना जाता है) सहित स्व-संगठित अंग, 2,3,4,5,6 उत्पन्न कर सकते हैं। हालाँकि, कई सीमाएँ तंत्रिका सर्किट के विकास और कार्यप्रणाली को समझने के लिए उनके व्यापक अनुप्रयोग को सीमित करती हैं। विशेष रूप से, यह स्पष्ट नहीं है कि hCO परिपक्वता विवो में मौजूद कुछ माइक्रोएन्वायरमेंटल और संवेदी इनपुट की अनुपस्थिति से सीमित है या नहीं। इसके अलावा, क्योंकि hCO को सर्किट में एकीकृत नहीं किया जाता है जो व्यवहारिक परिणाम उत्पन्न कर सकते हैं, आनुवंशिक रूप से जटिल और व्यवहारिक न्यूरोसाइकिएट्रिक विकारों के मॉडलिंग में उनकी उपयोगिता वर्तमान में सीमित है।
एक अक्षुण्ण जीवित मस्तिष्क में hCO का प्रत्यारोपण इन सीमाओं को दूर कर सकता है। पिछले अध्ययनों से पता चला है कि कृंतक प्रांतस्था में प्रत्यारोपित मानव न्यूरॉन्स कृंतक कोशिकाओं7,8,9,10,11,12 के साथ जीवित रहने, प्रोजेक्ट करने और संवाद करने में सक्षम हैं। हालाँकि, ये प्रयोग आमतौर पर वयस्क जानवरों पर किए जाते हैं, जो सिनैप्टिक और एक्सोनल एकीकरण को सीमित कर सकते हैं। यहाँ, हम एक प्रत्यारोपण प्रतिमान का वर्णन करते हैं जिसमें हमने प्लास्टिक विकास के प्रारंभिक चरण में इम्यूनोडेफ़िशिएंट चूहों के प्राथमिक सोमैटोसेंसरी कॉर्टेक्स (S1) में hiPS कोशिकाओं से प्राप्त 3D hCO को प्रत्यारोपित किया। प्रत्यारोपित hCO (t-hCO) न्यूरॉन्स पर्याप्त परिपक्वता से गुजरते हैं, थैलेमोकॉर्टिकल और कॉर्टिकल-कॉर्टिकल इनपुट प्राप्त करते हैं जो संवेदी प्रतिक्रियाएँ प्राप्त करते हैं, और इनाम-चाहने वाले व्यवहार को चलाने के लिए चूहे के मस्तिष्क में एक्सोनल प्रोजेक्शन का विस्तार करते हैं। टी-एचसीओ की विस्तारित परिपक्वता ने टिमोथी सिंड्रोम (टीएस) के रोगियों में न्यूरोनल दोषों को उजागर किया है, जो वोल्टेज-संवेदनशील एल-टाइप सीएवी 1.2 कैल्शियम चैनल (सीएसीएनए 1 सी द्वारा एनकोडेड) में उत्परिवर्तन के कारण होने वाला एक गंभीर आनुवंशिक विकार है।
इन विवो सर्किट में मानव कॉर्टिकल न्यूरॉन्स का अध्ययन करने के लिए, हमने प्रारंभिक प्रसवोत्तर एथीमिक चूहों (जन्म के 3-7 दिन बाद) के S1 में बरकरार 3D hCO को स्टीरियोटैक्टिक रूप से प्रत्यारोपित किया (चित्र 1a और चित्र 1a-c का विस्तारित डेटा)। इस बिंदु पर, थैलेमोकॉर्टिकल और कॉर्टिकोकॉर्टिकल एक्सोनल प्रोजेक्शन ने अभी तक अपना S1 इंनेर्वेशन पूरा नहीं किया है (संदर्भ 13)। इस प्रकार, यह दृष्टिकोण अंतर्जात सर्किट पर प्रभाव को कम करते हुए t-hCO एकीकरण को अधिकतम करने के लिए डिज़ाइन किया गया है। जीवित जानवरों में t-hCO के स्थान को देखने के लिए, हमने प्रत्यारोपण के 2-3 महीने बाद चूहों के T2-भारित MRI मस्तिष्क पुनर्निर्माण किए (चित्र 1b और विस्तारित डेटा, चित्र 1d)। t-hCO को आसानी से देखा गया और t-hCO का आयतन मापन स्थिर स्लाइस से गणना किए गए मापन के समान था (विस्तारित डेटा चित्र 1d,e; P > 0.05)। t-hCO को आसानी से देखा गया और t-hCO का आयतन मापन स्थिर स्लाइस से गणना किए गए मापन के समान था (विस्तारित डेटा चित्र 1d,e; P > 0.05)। t-hCO наблюдались, а объемные измерения t-hCO были аналогичны рассчитанным для фиксированных срезов (расширенные данные, рис. 1d, e; P> 0,05). t-hCO को आसानी से देखा जा सकता था, और आयतनात्मक t-hCO माप स्थिर खंडों के लिए गणना किए गए मापों के समान थे (विस्तारित डेटा, चित्र 1d, e; P > 0.05)।t-hCO, t-hCO के बारे में जानें 1 डी, ई, पी > 0.05।t-hCO, t-hCO के बारे में जानें t-hCO наблюдался, а объемные измерения t-hCO были аналогичны рассчитанным для фиксированных срезов (расширенные данные, рис. 1d, e; P> 0,05). t-hCO को आसानी से देखा जा सकता था, और आयतनात्मक t-hCO माप स्थिर खंडों के लिए गणना किए गए माप के समान थे (विस्तारित डेटा, चित्र 1d, e; P > 0.05)।हमने प्रत्यारोपण के लगभग 2 महीने बाद 81% प्रत्यारोपित जानवरों में t-hCO निर्धारित किया (n = 72 जानवर; 10 hiPS सेल लाइनों से hCO; पूरक तालिका 1 में hiPS सेल लाइनें)। इनमें से, 87% सेरेब्रल कॉर्टेक्स (चित्र 1c) में स्थित थे। एक ही प्रत्यारोपित चूहे में कई समय बिंदुओं पर सीरियल एमआरआई स्कैन करके, हमने 3 महीने के भीतर t-hCO की मात्रा में नौ गुना वृद्धि पाई (चित्र 1d और विस्तारित डेटा, चित्र 1f)। प्रत्यारोपित जानवरों में प्रत्यारोपण के 12 महीने बाद उच्च जीवित रहने की दर (74%) थी (विस्तारित डेटा, चित्र 1g और पूरक तालिका 2), और कोई स्पष्ट मोटर या स्मृति हानि, ग्लियोसिस, या इलेक्ट्रोएन्सेफेलोग्राम (ईईजी) नहीं पाया गया।
a, प्रायोगिक डिजाइन का योजनाबद्ध। hiPS कोशिकाओं से प्राप्त hCO को विभेदन के 30-60 दिन पर नवजात नग्न चूहों के S1 में प्रत्यारोपित किया गया। b, T2-भारित कोरोनल और क्षैतिज MRI चित्र, प्रत्यारोपण के 2 महीने बाद S1 में t-hCO दिखा रहे हैं। स्केल बार, 2 मिमी। c, प्रत्येक hiPS सेल लाइन (n = 108, बार के भीतर की संख्याएं प्रति hIPS सेल लाइन t-hCO की मात्रा दर्शाती हैं) और कॉर्टिकल या सबकोर्टिकल स्थान (n = 88) के लिए दिखाए गए ग्राफ्टमेंट सफलता दरों का परिमाणीकरण। d, एक कोरोनरी धमनी की MRI छवि (बाएं; स्केल बार, 3 मिमी) और संबंधित 3D वॉल्यूमेट्रिक पुनर्निर्माण (स्केल बार, 3 मिमी) 3 महीने में t-hCO में वृद्धि दिखा रहा है। f, t-hCO के प्रतिनिधि इम्यूनोसाइटोकेमिकल चित्र ऊपर बाएं से दाएं (भेदभाव के दौरान) दिखाए गए हैं: PPP1R17 (4 महीने पुराना), NeuN (8 महीने पुराना), SOX9 और GFAP (8 महीने पुराना), PDGFRα; (8 महीने), MAP2 (8 महीने) और IBA1 (8 महीने)। स्केल बार, 20 µm। HNA की सह-अभिव्यक्ति मानव उत्पत्ति की कोशिकाओं को इंगित करती है। g, snRNA-seq: सीरेट एकीकरण के बाद सभी उच्च-गुणवत्ता वाले t-hCO नाभिकों की एकीकृत मैनिफोल्ड और प्रोजेक्शन (UMAP) आयामीता में कमी इमेजिंग (n=3 t-hCO नमूने, n=2 hiPS सेल लाइनें)। एस्ट्रोसाइट्स, एस्ट्रोसाइट लाइन की कोशिकाएं; cyc prog ऑलिगोडेंड्रोसाइट्स, ऑलिगोडेंड्रोसाइट्स; ओपीसी, ऑलिगोडेंड्रोसाइट प्रोजेनिटर कोशिकाएं; आरईएलएन, रीलिन न्यूरॉन्स। एच, जीन ऑन्टोलॉजी (जीओ) शब्द संवर्धन विश्लेषण में एचसीओ ग्लूटामेटेरिक न्यूरॉन्स की तुलना में टी-एचसीओ ग्लूटामेटेरिक न्यूरॉन्स में महत्वपूर्ण रूप से अपग्रेड किए गए जीन (समायोजित पी < 0.05, गुना परिवर्तन> 2, कम से कम 10% नाभिक में व्यक्त) का विश्लेषण किया गया। एच, जीन ऑन्टोलॉजी (जीओ) शब्द संवर्धन विश्लेषण में एचसीओ ग्लूटामेटेरिक न्यूरॉन्स की तुलना में टी-एचसीओ ग्लूटामेटेरिक न्यूरॉन्स में महत्वपूर्ण रूप से अपग्रेड किए गए जीन (समायोजित पी < 0.05, गुना परिवर्तन> 2, कम से कम 10% नाभिक में व्यक्त) का विश्लेषण किया गया। h, Анализ обогащения терминов Gene Ontology (GO) для генов со значительной активацией (скорректированный P <0,05, кратность изменения > 2, экспрессия по 10% प्रति दिन के हिसाब से कम कीमत पर t-hCO по сравнению с глутаматергическими нейронами hCO. एच, एचसीओ ग्लूटामेटेरिक न्यूरॉन्स की तुलना में टी-एचसीओ ग्लूटामेटेरिक न्यूरॉन्स में महत्वपूर्ण सक्रियण (समायोजित पी <0.05, गुना परिवर्तन> 2, कम से कम 10% नाभिक में अभिव्यक्ति) वाले जीनों के लिए जीन ऑन्टोलॉजी (जीओ) शब्द संवर्धन विश्लेषण। h, 与hCO 谷氨酸能神经元相比,t-hCO 谷氨酸能神经元中基因显着上调（调整后P < 0.05，倍数变化> 2，在至少10% 的细胞核中表达）的基因本体论(GO) 术语富集分析。 h , 与 hco 谷氨酸 能 元 相比 , t-hco 谷氨酸 能 神经 元 基因 显着 上调 （后 后 p <0.05 ， 2, 10% और 10% की छूट的 的 的 的本体论(GO) 术语富集分析. एच, гены значительно активизировались (скорректированный P <0,05, кратность изменения> 2, экспрессируется по крайней мере в 10% ядер) в глутаматергических нейронах t-hCO по сравнению с глутаматергическими нейронами hCO Онтологический (GO) анализ термина обогащения. h, जीन hCO ग्लूटामेटेरिक न्यूरॉन्स की तुलना में t-hCO ग्लूटामेटेरिक न्यूरॉन्स में महत्वपूर्ण रूप से अपग्रेड किए गए थे (समायोजित P < 0.05, गुना परिवर्तन > 2, कम से कम 10% नाभिक में व्यक्त)। संवर्धन अवधि का ऑन्कोलॉजिकल (GO) विश्लेषण।बिंदीदार रेखा 0.05 के aq मान को दर्शाती है। i, संदर्भ 22 snRNA-seq वयस्क मोटर कॉर्टेक्स डेटासेट से लेबल स्थानांतरण का उपयोग करके t-hCO में GluN सेल प्रकारों की UMAP इमेजिंग। CT - कॉर्टिकोथैलेमिक कोशिकाएँ, ET - एक्स्ट्रासेरेब्रल कोशिकाएँ, IT ​​- आंतरिक टेलेंसफैलिक कोशिकाएँ, NP - निकट प्रक्षेपण।
फिर हमने t-hCO की साइटोआर्किटेक्चर और समग्र सेलुलर संरचना का मूल्यांकन किया। चूहे की एंडोथेलियल कोशिकाओं के एंटीबॉडी धुंधलापन ने t-hCO के साथ संवहनीकरण का खुलासा किया, जबकि IBA1 धुंधलापन ने पूरे ग्राफ्ट में चूहे के माइक्रोग्लिया की उपस्थिति का खुलासा किया (चित्र 1f और विस्तारित डेटा, चित्र 3c,d)। इम्यूनोस्टेनिंग ने मानव परमाणु एंटीजन (HNA) पॉजिटिव कोशिकाओं को PPP1R17 (कॉर्टिकल प्रोजेनीटर), न्यूएन (न्यूरॉन्स), SOX9 और GFAP (ग्लिअल-व्युत्पन्न कोशिकाएं) या PDGFRα (ऑलिगोडेंड्रोसाइट प्रोजेनीटर) (चित्र 1f) को सह-व्यक्त करते हुए प्रकट किया। एकल कोशिका रिज़ॉल्यूशन पर t-hCO की सेलुलर संरचना का अध्ययन करने के लिए, हमने लगभग 8 महीने के विभेदन के बाद सिंगल-कोर RNA अनुक्रमण (snRNA-seq) किया। चूहे के नाभिकों के बल्क निस्पंदन और निष्कासन से 21,500 उच्च-गुणवत्ता वाले मानव मोनोन्यूक्लियर मानचित्र प्राप्त हुए (चित्र 1जी और विस्तारित डेटा, चित्र 4ए,बी)। विशिष्ट सेल-प्रकार मार्करों के अभिव्यक्ति पैटर्न ने प्रमुख कॉर्टिकल सेल वर्गों के समूहों की पहचान की, जिसमें गहरे और सतही ग्लूटामेटेरिक न्यूरॉन्स, परिसंचारी पूर्वज, ऑलिगोडेंड्रोसाइट्स और एस्ट्रोसाइट वंश शामिल हैं (चित्र 1जी, विस्तारित डेटा, चित्र 4सी, और पूरक तालिका 3)। SATB2 और CTIP2 के लिए इम्यूनोस्टेनिंग ने दिखाया कि कॉर्टिकल उपप्रकारों की उपस्थिति के बावजूद, t-hCO ने स्पष्ट शारीरिक स्तरीकरण नहीं दिखाया (विस्तारित डेटा, चित्र 3ए)। चरण-मिलान वाले snRNA-seq hCO ने मोटे तौर पर समान कोशिका वर्ग का उत्पादन किया, कुछ अपवादों के साथ, जिसमें ऑलिगोडेंड्रोसाइट्स की अनुपस्थिति और GABAergic न्यूरॉन्स की उपस्थिति शामिल है, जो पार्श्व पूर्वज कोशिकाओं के लिए पहले से रिपोर्ट की गई अनुकूल इन विट्रो स्थितियों को दर्शा सकता है15 (विस्तारित डेटा, चित्र 4f - i और पूरक तालिका 4)। विभेदक जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण ने t-hCO और hCO (पूरक तालिका 5) के बीच ग्लूटामेटेरिक न्यूरॉन्स में महत्वपूर्ण अंतरों का खुलासा किया, जिसमें सिनैप्टिक सिग्नलिंग, डेंड्राइटिक स्थानीयकरण और वोल्टेज-गेटेड चैनल गतिविधि जैसे न्यूरोनल परिपक्वता से जुड़े जीन के सेट की सक्रियता शामिल है (चित्र 1h और पूरक तालिका 5)। तालिका 6)। तदनुसार, कॉर्टिकल ग्लूटामेटेरिक t-hCO न्यूरॉन्स ने त्वरित ट्रांसक्रिप्शनल परिपक्वता का प्रदर्शन किया।
यह स्पष्ट करने के लिए कि क्या टी-एचसीओ में ये ट्रांसक्रिप्शनल परिवर्तन इन विट्रो में एचसीओ और इन विवो में टी-एचसीओ के बीच रूपात्मक अंतर से संबंधित थे, हमने 7-8 महीने के भेदभाव के बाद तीव्र खंडों में चरण-मिलान वाले बायोसाइटिन से भरे एचसीओ और एचसीओ का पुनर्निर्माण किया। एचसीओ न्यूरॉन्स (चित्र 2 ए)। टी-एचसीओ न्यूरॉन्स उल्लेखनीय रूप से बड़े थे, सोमा व्यास 1.5 गुना था, कई डेंड्राइट दोगुने थे, और इन विट्रो एचसीओ की तुलना में कुल डेंड्राइटिक लंबाई में छह गुना वृद्धि हुई थी (चित्र 2 बी)। इसके अलावा, हमने एचसीओ न्यूरॉन्स की तुलना में टी-एचसीओ न्यूरॉन्स में डेंड्राइटिक स्पाइन का उल्लेखनीय रूप से उच्च घनत्व देखा (चित्र 2 सी)। इससे पता चलता है कि टी-एचसीओ इसने हमें इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल गुणों की जांच करने के लिए प्रेरित किया। झिल्ली धारिता आठ गुना अधिक थी (विस्तारित डेटा, चित्र 8d), विश्राम-अवस्था झिल्ली क्षमता अधिक हाइपरपोलराइज्ड (लगभग 20 mV) थी, और वर्तमान इंजेक्शन ने hCO न्यूरॉन्स की तुलना में t-hCO न्यूरॉन्स में एक उच्च अधिकतम उत्तेजना दर प्रेरित की। इन विट्रो (चित्र 2d), e), जो t-hCO की बड़ी और अधिक जटिल रूपात्मक विशेषताओं के अनुरूप है। इसके अलावा, स्वतःस्फूर्त उत्तेजक पोस्टसिनेप्टिक वर्तमान घटनाओं (EPSC) की आवृत्ति t-hCO न्यूरॉन्स (चित्र 2f) में काफी अधिक थी, जो यह दर्शाता है कि t-hCO न्यूरॉन्स में देखी गई डेंड्राइटिक स्पाइन की बढ़ी हुई घनत्व कार्यात्मक उत्तेजना से जुड़ी थी। यौन सिनैप्स। हमने लेबल किए गए ग्लूटामेटेरिक न्यूरॉन्स (विस्तारित डेटा, चित्र 6a-c) को रिकॉर्ड करके इन विट्रो में hCO न्यूरॉन्स के अपरिपक्व चरित्र की पुष्टि की।
a, 8 महीने के विभेदन के बाद बायोसाइटिन से भरे hCO और t-hCO न्यूरॉन्स का 3D पुनर्निर्माण। बी, रूपात्मक विशेषताओं का परिमाणीकरण (एन = 8 एचसीओ न्यूरॉन्स, एन = 6 टी-एचसीओ न्यूरॉन्स; **पी = 0.0084, *पी = 0.0179 और ***पी < 0.0001)। बी, रूपात्मक विशेषताओं का परिमाणीकरण (एन = 8 एचसीओ न्यूरॉन्स, एन = 6 टी-एचसीओ न्यूरॉन्स; **पी = 0.0084, *पी = 0.0179 और ***पी < 0.0001)। б, количественная оценка морфологических признаков (n = 8 нейронов hCO, n = 6 нейронов t-hCO; ** पी = 0,0084, * पी = 0,0179 और *** पी <0,0001)। बी, रूपात्मक विशेषताओं का परिमाणीकरण (n=8 hCO न्यूरॉन्स, n=6 t-hCO न्यूरॉन्स; **P=0.0084, *P=0.0179, और ***P<0.0001)। b, 个 个 hCO 神 经 元, n = 6 t-hCO 神 经 元；**P = 0.0084,*P = 0.0179 和***P < 0.0001）。 b, 个 个 hCO 神 经 元, n = 6 t-hCO 神 经 元；**P = 0.0084,*P = 0.0179 和***P < 0.0001）。 б, количественная оценка морфологических признаков (n = 8 нейронов hCO, n = 6 нейронов t-hCO; ** पी = 0,0084, * पी = 0,0179 और *** पी <0,0001)। बी, रूपात्मक विशेषताओं का परिमाणीकरण (n=8 hCO न्यूरॉन्स, n=6 t-hCO न्यूरॉन्स; **P=0.0084, *P=0.0179, और ***P<0.0001)।सी, 8 महीने के विभेदन के बाद hCO और t-hCO डेंड्राइटिक शाखाओं का 3D पुनर्निर्माण। लाल तारांकन संभावित डेंड्राइटिक स्पाइन को इंगित करते हैं। डेंड्राइटिक स्पाइन घनत्व परिमाणीकरण (n = 8 hCO न्यूरॉन्स, n = 6 t-hCO न्यूरॉन्स; **P = 0.0092)। d, विश्राम झिल्ली क्षमता का परिमाणीकरण (n = 25 hCO न्यूरॉन्स, n = 16 t-hCO न्यूरॉन्स; ***P < 0.0001)। d, विश्राम झिल्ली क्षमता का परिमाणीकरण (n = 25 hCO न्यूरॉन्स, n = 16 t-hCO न्यूरॉन्स; ***P < 0.0001)। d, количественная оценка мембранного потенциала покоя (n = 25 нейронов hCO, n = 16 нейронов t-hCO; *** पी <0,0001)। d, विश्राम झिल्ली क्षमता परिमाणीकरण (n = 25 hCO न्यूरॉन्स, n = 16 t-hCO न्यूरॉन्स; ***P < 0.0001)। d，静息膜电位的量化（n = 25 hCO 神经元,n = 16 t-hCO 神经元；***P < 0.0001）。 d，静息膜电位的量化（n = 25 hCO 神经元,n = 16 t-hCO 神经元；***P < 0.0001）。 d, количественная оценка мембранного потенциала покоя (n = 25 нейронов hCO, n = 16 нейронов t-hCO; *** पी <0,0001)। d, विश्राम झिल्ली क्षमता परिमाणीकरण (n = 25 hCO न्यूरॉन्स, n = 16 t-hCO न्यूरॉन्स; ***P < 0.0001)। ई, वर्तमान इंजेक्शन में वृद्धि से प्रेरित hCO और t-hCO में दोहरावदार एक्शन पोटेंशिअल फायरिंग, और अधिकतम फायरिंग दर का परिमाणीकरण (n = 25 hCO न्यूरॉन्स, n = 16 t-hCO न्यूरॉन्स; ***P < 0.0001)। ई, वर्तमान इंजेक्शन में वृद्धि से प्रेरित hCO और t-hCO में दोहरावदार एक्शन पोटेंशिअल फायरिंग, और अधिकतम फायरिंग दर का परिमाणीकरण (n = 25 hCO न्यूरॉन्स, n = 16 t-hCO न्यूरॉन्स; ***P < 0.0001)। ई, повторное возбуждение потенциала действия в hCO और t-hCO, вызванное येलोकोका, और कोलोमालिना मोनाकोका, возбуждения (n = 25 нейронов hCO, n = 16 нейронов t-hCO; *** P <0,0001)। ई, वर्तमान वृद्धि और अधिकतम फायरिंग दर की मात्रा का निर्धारण (एन = 25 एचसीओ न्यूरॉन्स, एन = 16 टी-एचसीओ न्यूरॉन्स; *** पी < 0.0001) द्वारा प्रेरित एचसीओ और टी-एचसीओ में एक्शन पोटेंशिअल री-फायरिंग। e,通过增加电流注入诱导的hCO 和t-hCO 重复动作电位放电,以及最大放电率的量化（n = 25个hCO 神经元, n = 16 个t-hCO 神经元；***P < 0.0001）。 E , 通过 增加 电流 注入 的 的 एचसीओ 和 t-hco 重复 电位 放电 , 以及 最 大 的 量化 (n = 25)个 hco 神经, n = 16 个 t-hco 神经 ； *** p <0.0001） 。 ई, повторяющееся возбуждение потенциала действия hCO और t-hCO, вызванное युलवियोनिक पोडकोका, और कोलोइकोनिका मोनाकासामी скорости возбуждения (n = 25 нейронов hCO, n = 16 нейронов t-hCO; *** P <0,0001)। ई, बढ़ी हुई वर्तमान आपूर्ति और अधिकतम फायरिंग दर की मात्रा का निर्धारण द्वारा प्रेरित एचसीओ और टी-एचसीओ एक्शन पोटेंशिअल की दोहरावपूर्ण फायरिंग (एन = 25 एचसीओ न्यूरॉन्स, एन = 16 टी-एचसीओ न्यूरॉन्स; *** पी < 0.0001)। एफ, 8 महीने के विभेदन पर एचसीओ और टी-एचसीओ न्यूरॉन्स में सहज ईपीएससी (एसईपीएससी), और सिनैप्टिक घटनाओं की आवृत्ति का परिमाणीकरण (एन = 25 एचसीओ न्यूरॉन्स, एन = 17 टी-एचसीओ न्यूरॉन्स; ***पी < 0.0001)। एफ, 8 महीने के विभेदन पर एचसीओ और टी-एचसीओ न्यूरॉन्स में सहज ईपीएससी (एसईपीएससी), और सिनैप्टिक घटनाओं की आवृत्ति का परिमाणीकरण (एन = 25 एचसीओ न्यूरॉन्स, एन = 17 टी-एचसीओ न्यूरॉन्स; ***पी < 0.0001)। एफ, спонтанные EPSC (sEPSC) в нейронах и t-hCO через 8 месяцев дифференцировки и количественная оценка частоты синаптических событий (n = 25 нейронов hCO, n = 17 нейронов t-hCO; *** पी <0,0001)। एफ, एचसीओ और टी-एचसीओ न्यूरॉन्स में स्वतःस्फूर्त ईपीएससी (एसईपीएससी) 8 महीने के विभेदन और सिनैप्टिक घटना दरों के परिमाणीकरण पर (एन = 25 एचसीओ न्यूरॉन्स, एन = 17 टी-एचसीओ न्यूरॉन्स; ***पी <0.0001)। f, 8 个月时hCO और t-hCO 神经元中的自发性EPSCs (sEPSCs), 以及突触事件频率的量化（n = 25 एचसीओ神经元,n = 17 t-hCO 神经元；***P < 0.0001） . एफ, 8 से अधिक एचसीओ और टी-एचसीओ से ईपीएससी (एसईपीएससी) की आवश्यकता होती है, एन = 25 एचसीओ神率的量匼(n = 25 hCO 神率的量匼(n = 25hCO P < 0.0001) . एफ, спонтанные EPSC (sEPSC) в нейронах и t-hCO через 8 месяцев дифференцировки и количественная оценка частоты синаптических событий (n = 25 нейронов hCO, n = 17 нейронов t-hCO; *** पी <0,0001)। एफ, एचसीओ और टी-एचसीओ न्यूरॉन्स में स्वतःस्फूर्त ईपीएससी (एसईपीएससी) 8 महीने के विभेदन और सिनैप्टिक घटना दरों के परिमाणीकरण पर (एन = 25 एचसीओ न्यूरॉन्स, एन = 17 टी-एचसीओ न्यूरॉन्स; *** पी<0.0001)।bf के लिए, पंक्ति 1208-2 में hCO और t-hCO को समानांतर में बनाए गए समान विभेदन बैच से लिया गया था। जी, टी-एचसीओ ग्लूटामेटेरिक न्यूरॉन्स में महत्वपूर्ण रूप से उन्नत जीनों (समायोजित पी < 0.05, गुना परिवर्तन > 2, कम से कम 10% नाभिकों में व्यक्त) का जीन सेट संवर्धन विश्लेषण (एकतरफा फिशर का सटीक परीक्षण) इन विट्रो न्यूरॉन्स17 से पहचाने गए प्रारंभिक-प्रतिक्रिया (ईआरजी) और विलंबित-प्रतिक्रिया (एलआरजी) गतिविधि-निर्भर जीनों के जीन सेटों के साथ एचसीओ ग्लूटामेटेरिक न्यूरॉन्स की तुलना में। जी, टी-एचसीओ ग्लूटामेटेरिक न्यूरॉन्स में महत्वपूर्ण रूप से उन्नत जीनों (समायोजित पी < 0.05, गुना परिवर्तन > 2, कम से कम 10% नाभिकों में व्यक्त) का जीन सेट संवर्धन विश्लेषण (एकतरफा फिशर का सटीक परीक्षण) इन विट्रो न्यूरॉन्स17 से पहचाने गए प्रारंभिक-प्रतिक्रिया (ईआरजी) और विलंबित-प्रतिक्रिया (एलआरजी) गतिविधि-निर्भर जीनों के जीन सेटों के साथ एचसीओ ग्लूटामेटेरिक न्यूरॉन्स की तुलना में। जी, анализ обогащения набора генов (односторонний точный критерий Фишера) генов со значительной активацией (скорректированный P <0,05, кратность изменения > 2, экспрессия по меньшей мере в 10% ядер) в глутаматергических нейронах t-hCO по сравнению с глутаматергическими अन्य एचसीओ наборы генов как раннего (ERG), так и позднего (LRG) генов, зависящих от активности, идентифицированных в исследовании на мышах vivo16, और специфических для человека LRG из нейронов इन विट्रो17। जी, टी-एचसीओ ग्लूटामेटेरिक न्यूरॉन्स में महत्वपूर्ण सक्रियण (समायोजित पी<0.05, गुना परिवर्तन >2, कम से कम 10% नाभिक में अभिव्यक्ति) वाले जीनों के जीन सेट संवर्धन (वन-टेल्ड फिशर का सटीक परीक्षण) का विश्लेषण, इन विवो चूहों16 में पहचाने गए प्रारंभिक (ईआरजी) और देर (एलआरजी) दोनों गतिविधि-निर्भर जीनों के एचसीओ ग्लूटामेटेरिक न्यूरॉन्स सेट और इन विट्रो17 न्यूरॉन्स से मानव-विशिष्ट एलआरजी की तुलना में। g, t-hCO के बारे में जानकारी प्राप्त करने के लिए hCO के बारे में जानकारी प्राप्त करने के लिए कोई समस्या नहीं है,t -hCO की जांच करने के लिए कोई समस्या नहीं है (अधिक जानकारी P <0.05, कोई समस्या नहीं है) >2% प्रति वर्ष 10% प्रति वर्ष की दर से भुगतान किया जाता है） ईशर को एक नया उत्पाद मिला है (ईआरजी)和晚期反应(LRG) 活性依赖性基因的基因组16 和体外神经元17 中的人类特异性LRG. जी , टी-एचसीओ 谷氨酸 神经 元 与 एचसीओ 谷氨酸 神经 元 相比 , टी-एचसीओ 谷氨酸 神经 元 上调 （调整 后 p <0.05 ， लाभ> 2 ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， （ （ （ （फिशर ）））体内 और पढ़ें 17 वर्ष की आयु में 17 वर्ष की आयु में 17 वर्ष की आयु में LRG। जी, глутаматергические нейроны t-hCO были значительно активизированы по сравнению с глутаматергическими нейронами hCO (скорректированный पी<0,05, кратность изменения> 2, не менее 10% Анализ обогащения набора генов (односторонний тозднего гены, зависящие от активности ответа (LRG), идентифицированные в विवो16 में म्यूज़ियम और इन विट्रो17 में नियोनॉएज़ पर प्रकाश डाला गया। एलआरजी, специфичные для человека. जी, टी-एचसीओ ग्लूटामेटेरिक न्यूरॉन्स एचसीओ ग्लूटामेटेरिक न्यूरॉन्स की तुलना में महत्वपूर्ण रूप से अपग्रेड किए गए थे (समायोजित पी <0.05, गुना परिवर्तन> 2, कम से कम 10% प्रारंभिक प्रतिक्रिया (ईआरजी) और देर से प्रतिक्रिया जीन संवर्धन विश्लेषण (एक-पुच्छीय फिशर का सटीक परीक्षण) प्रतिक्रिया गतिविधि पर निर्भर जीन (एलआरजी) इन विवो चूहों16 और इन विट्रो न्यूरॉन्स17 मानव विशिष्ट एलआरजी में पहचाने गए।बिंदीदार रेखा 0.05 के बोनफेरोनी-संशोधित P मान को दर्शाती है। h, t-hCO ग्लूटामेटेरिक न्यूरॉन्स में LRG जीन के snRNA-seq प्रतिकृतियों में GluN जीन अभिव्यक्ति (प्रत्येक जीन का छद्म पैकेज और स्केलिंग) काफी हद तक अपग्रेड की गई थी। i, t-hCO (ऊपरी) और hCO (निचले) न्यूरॉन्स में SCG2 अभिव्यक्ति को दर्शाने वाला इम्यूनोस्टेनिंग। सफ़ेद तीर SCG2+ कोशिकाओं की ओर इशारा करते हैं। स्केल बार, 25 µm। डेटा को माध्य ± मानक विचलन के रूप में व्यक्त किया जाता है।
एक्स विवो स्लाइस में देखी गई t-hCO की बढ़ी हुई गतिविधि के आधार पर, snRNA-seq ने इन विट्रो में hCO की तुलना में t-hCO में जीन ट्रांसक्रिप्ट के एक गतिविधि-निर्भर अपरेगुलेशन का खुलासा किया। ग्लूटामेटेरिक t-hCO न्यूरॉन्स ने देर से प्रतिक्रिया गतिविधि को विनियमित करने वाले जीन के उच्च स्तर को व्यक्त किया (चित्र 2g,h), जो माउस और मानव न्यूरॉन्स16,17 में पिछले अध्ययनों में पाया गया था। उदाहरण के लिए, BDNF18, SCG2, और OSTN, एक प्राइमेट-विशिष्ट गतिविधि-विनियमन जीन, ने hCO न्यूरॉन्स की तुलना में t-hCO न्यूरॉन्स में अभिव्यक्ति में वृद्धि दिखाई (चित्र 2g-i)। इस प्रकार, t-hCO न्यूरॉन्स ने ट्रांसक्रिप्शनल, मॉर्फोलॉजिकल और फंक्शनल विश्लेषणों द्वारा hCO न्यूरॉन्स की तुलना में बढ़ी हुई परिपक्वता विशेषताओं का प्रदर्शन किया।
मानव मस्तिष्क के विकास के साथ टी-एचसीओ परिपक्वता के संबंध का आगे मूल्यांकन करने के लिए, हमने भ्रूण और वयस्क कॉर्टिकल सेल प्रकारों19,20 और वयस्क21,22 की ट्रांसक्रिप्टोमिक तुलना की, साथ ही विकास के दौरान कॉर्टिकल जीन अभिव्यक्ति23 पर व्यापक डेटा (विस्तारित डेटा, चित्र 5)।)। पिछले कार्य 24 के साथ, 7-8 महीने के भेदभाव में वैश्विक एचसीओ और टी-एचसीओ ट्रांसक्रिप्टोम परिपक्वता की स्थिति मोटे तौर पर इन विवो विकास समय के अनुरूप है और यह भ्रूण के अंतिम जीवन के सबसे अधिक समतुल्य है (विस्तारित डेटा चित्र 5ए)। उल्लेखनीय रूप से, हमने आयु-मिलान वाले एचसीओ की तुलना में टी-एचसीओ में ट्रांसक्रिप्टोम परिपक्वता में वृद्धि देखी, सेलुलर स्तर पर, हमें t-hCO में पतले कॉर्टेक्स उपप्रकार का प्रमाण मिला, जिसमें ग्लूटामेटेरिक न्यूरॉन्स के समूह वयस्क L2/3, L5, और L6 न्यूरॉन उपप्रकारों के साथ ओवरलैपिंग करते हैं (चित्र 1i)। इसके विपरीत, ग्लूटामेटेरिक t-hCO न्यूरॉन्स और भ्रूण कॉर्टिकल न्यूरॉन्स के बीच क्लस्टर ओवरलैप गर्भावस्था के मध्य में अधिक सीमित था (विस्तारित डेटा, चित्र 5e-j)। यह निर्धारित करने के लिए कि क्या t-hCO न्यूरॉन्स कार्यात्मक रूप से मानव प्रसवोत्तर नियोकॉर्टिकल न्यूरॉन्स के समान हैं, हमने मानव प्रसवोत्तर कॉर्टेक्स के तीखे खंडों में मानव L2/3 पिरामिड न्यूरॉन्स की इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल रिकॉर्डिंग और शारीरिक पुनर्निर्माण किया (विस्तारित डेटा, चित्र 7a)। L2/3 पिरामिड न्यूरॉन्स के इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल गुण t-hCO पिरामिड न्यूरॉन्स के समान थे (विस्तारित डेटा, चित्र 7e)। आकृति विज्ञान की दृष्टि से, जन्म के बाद के मानव नमूनों से L2/3 न्यूरॉन्स hCO की तुलना में t-hCO से अधिक मिलते-जुलते थे, हालांकि L2/3 कोशिकाएं अधिक लंबी थीं, उनमें कुल मिलाकर अधिक शाखाएं थीं, और उनमें उच्च स्पाइन घनत्व था (चित्र 3जी और विस्तारित डेटा, चित्र 7बी-)। जी)।
क, नवजात चूहों में नियंत्रण और टीएस हाईपीएस सेल लाइनों द्वारा उत्पादित एचसीओ का प्रत्यारोपण। ख, 8 महीने के विभेदन के बाद बायोसाइटिन से भरे टी-एचसीओ न्यूरॉन्स का 3 डी पुनर्निर्माण। ग, औसत डेंड्राइटिक लंबाई का परिमाणीकरण (एन = 19 नियंत्रण न्यूरॉन्स, एन = 21 टीएस न्यूरॉन्स; ** पी = 0.0041)। d, 8 महीने के विभेदन पर नियंत्रण और टीएस टी-एचसीओ से 3डी-पुनर्निर्मित डेंड्राइटिक शाखाएं, और डेंड्राइटिक स्पाइन घनत्व का परिमाणीकरण (n = 16 नियंत्रण न्यूरॉन्स, n = 21 टीएस न्यूरॉन्स, ***P < 0.0001)। d, 8 महीने के विभेदन पर नियंत्रण और टीएस टी-एचसीओ से 3डी-पुनर्निर्मित डेंड्राइटिक शाखाएं, और डेंड्राइटिक स्पाइन घनत्व का परिमाणीकरण (n = 16 नियंत्रण न्यूरॉन्स, n = 21 टीएस न्यूरॉन्स, ***P < 0.0001)। d, 3D-реконструкция дендритных ветвей из контроля и TS t-hCO через 8 म्युसेव डेरिवेटिव और कोलोलिनिन ऑप्शंस प्लैनेट дендритных шипов (n = 16 контрольных нейронов, n = 21 TS нейронов, *** P <0,0001)। डी, 8 महीने के विभेदन और डेंड्राइटिक स्पाइन घनत्व परिमाणीकरण पर नियंत्रण और टी-एचसीओ टीएस से डेंड्राइटिक शाखाओं का 3 डी पुनर्निर्माण (एन = 16 नियंत्रण न्यूरॉन्स, एन = 21 टीएस न्यूरॉन्स, *** पी <0.0001)। d, 分化8 个月时对照和TS t-hCO 的3D 重建树突分支, 以及树突棘密度的量化（n = 16个对照神经元,n = 21 个TS 神经元,***P < 0.0001）。 d , 8 个 时 对照 和 ts t-hco 的 3d 重建 分支 分支 以 及 树突棘 密度 量化 （n = 16 个神经 元 , n = 21 个 ts 神经 , *** p <0.0001 ）。 d, 3D-реконструкция дендритных ветвей контроля и TS t-hCO через 8 म्युसेव डेरिवेटिव और कोलोलिनिन ऑप्शंस प्लैनेट дендритных шипов (n = 16 контрольных нейронов, n = 21 TS нейронов, *** P <0,0001)। डी, 8 महीने के विभेदन और डेंड्राइटिक स्पाइन घनत्व परिमाणीकरण पर नियंत्रण डेंड्राइटिक शाखाओं और टीएस टी-एचसीओ का 3 डी पुनर्निर्माण (एन = 16 नियंत्रण न्यूरॉन्स, एन = 21 टीएस न्यूरॉन्स, *** पी <0.0001)।लाल तारांकन संभावित डेंड्राइटिक स्पाइन को इंगित करते हैं। ई, 8 महीने के विभेदन के बाद नियंत्रण और टीएस टी-एचसीओ न्यूरॉन्स में स्वतःस्फूर्त ईपीएससी। एफ, संचयी आवृत्ति प्लॉट और सिनैप्टिक घटनाओं की आवृत्ति और आयाम का परिमाणीकरण (एन = 32 नियंत्रण न्यूरॉन्स, एन = 26 टीएस न्यूरॉन्स; **पी = 0.0076 और पी = 0.8102)। जी, एचसीओ और टी-एचसीओ में टीएस और नियंत्रण न्यूरॉन्स का शोल विश्लेषण। धराशायी रेखाएँ तुलना के लिए मानव L2/3 प्रसवोत्तर पिरामिड न्यूरॉन्स दिखाती हैं (एन = 24 नियंत्रण टी-एचसीओ न्यूरॉन्स, एन = 21 टीएस टी-एचसीओ न्यूरॉन्स, एन = 8 नियंत्रण एचसीओ न्यूरॉन्स, और एन = 7 टीएस एचसीओ न्यूरॉन्स)। डेटा को औसत ± मानक विचलन के रूप में व्यक्त किया जाता है
मानव कॉर्टेक्स न्यूरॉन्स की रूपात्मक और कार्यात्मक विशेषताओं को उच्च स्तर पर दोहराने की t-hCO की क्षमता ने हमें यह पता लगाने के लिए प्रेरित किया कि क्या t-hCO का उपयोग रोग फेनोटाइप का पता लगाने के लिए किया जा सकता है। हमने TS पर ध्यान केंद्रित किया, जो CaV1.2 को एन्कोड करने वाले जीन में लाभ-कार्य उत्परिवर्तन के कारण होने वाला एक गंभीर न्यूरोडेवलपमेंटल विकार है, जो न्यूरॉन्स में गतिविधि-निर्भर जीन प्रतिलेखन शुरू करता है। हमने सबसे आम प्रतिस्थापन (p.G406R) वाले तीन TS रोगियों और तीन नियंत्रण (चित्र 3a) से hCO प्राप्त किया। प्रत्यारोपण के बाद, हमने पाया कि नियंत्रण की तुलना में TS न्यूरॉन्स में डेंड्राइटिक आकारिकी बदल गई थी (चित्र 3b और विस्तारित डेटा, चित्र 8a,b), प्राथमिक डेंड्राइट्स की संख्या में दो गुना वृद्धि और औसत में समग्र वृद्धि और डेंड्राइटिक लंबाई में समग्र कमी (चित्र 3c और विस्तारित डेटा, चित्र 8c)। यह नियंत्रण न्यूरॉन्स की तुलना में टीएस में स्पाइन के बढ़े हुए घनत्व और स्वतःस्फूर्त ईपीएससी की बढ़ी हुई आवृत्ति से जुड़ा था (चित्र 3डी-एफ और विस्तारित डेटा, चित्र 8जी)। आगे के विश्लेषण से नियंत्रण की तुलना में टी-एचसीओ टीएस में असामान्य डेंड्राइटिक शाखाओं के पैटर्न का पता चला, लेकिन भेदभाव के समान चरण में इन विट्रो टीएस एचसीओ में नहीं (चित्र 3जी)। यह टीएस में गतिविधि-निर्भर डेंड्राइटिक सिकुड़न की हमारी पिछली रिपोर्टों के अनुरूप है और इस प्रत्यारोपण प्लेटफ़ॉर्म की विवो में रोग फेनोटाइप का पता लगाने की क्षमता को उजागर करता है।
फिर हमने पूछा कि t-hCO कोशिकाएँ किस हद तक चूहे S1 में कार्यात्मक रूप से एकीकृत हैं। कृंतकों में S1 को ipsilateral वेंट्रल बेसल और पोस्टीरियर थैलेमिक नाभिक, साथ ही ipsilateral मोटर और सेकेंडरी सोमैटोसेंसरी कॉर्टिस और कंट्रालेटरल S1 (चित्र 4a) से मजबूत सिनैप्टिक इनपुट प्राप्त होते हैं। इंनेर्वेशन पैटर्न को बहाल करने के लिए, हमने hCO को रेबीज वायरस-dG-GFP/AAV-G से संक्रमित किया और 3 दिन बाद hCO को S1 चूहे में प्रत्यारोपित किया। हमने प्रत्यारोपण के 7-14 दिन बाद ipsilateral S1 और वेंट्रल बेसल गैन्ग्लिया के न्यूरॉन्स में सघन GFP अभिव्यक्ति देखी (चित्र 4b, c)। इसके अलावा, थैलेमिक मार्कर नेट्रिन G1 के एंटीबॉडी स्टेनिंग ने t-hCO में थैलेमिक अंत की उपस्थिति का पता लगाया (चित्र 4d, e)। यह मूल्यांकन करने के लिए कि क्या ये अभिवाही प्रक्षेपण t-hCO कोशिकाओं में सिनैप्टिक प्रतिक्रियाएँ उत्पन्न कर सकते हैं, हमने थैलेमोकॉर्टिकल परत के तीखे खंडों में मानव कोशिकाओं से संपूर्ण कोशिका रिकॉर्डिंग की। चूहे S1, आंतरिक कैप्सूल, सफ़ेद पदार्थ, t-hCO के पास तंतुओं की विद्युत उत्तेजना या t-hCO में ऑप्सिन-व्यक्त करने वाले थैलेमिक अंत के ऑप्टोजेनेटिक सक्रियण ने AMPA रिसेप्टर प्रतिपक्षी NBQX के संपर्क में आने वाले t-hCO न्यूरॉन्स में लघु-विलंबता EPSCs को प्रेरित किया। (चित्र 4f, g और विस्तारित डेटा, चित्र 9a-g)। ये डेटा प्रदर्शित करते हैं कि t-hCO शारीरिक रूप से चूहे के मस्तिष्क में एकीकृत है और चूहे के मेजबान ऊतक द्वारा सक्रिय होने में सक्षम है।
a, रेबीज ट्रैकिंग प्रयोग का योजनाबद्ध आरेख। b, t-hCO और चूहे के सेरेब्रल कॉर्टेक्स (ऊपरी पैनल) के बीच GFP और मानव-विशिष्ट STEM121 अभिव्यक्ति। चूहे के इप्सिलैटरल वेंट्रल बेसल न्यूक्लियस (VB) (नीचे बाएं) और इप्सिलैटरल S1 (नीचे दाएं) में GFP अभिव्यक्ति भी दिखाई गई है। स्केल बार, 50 µm। लाल वर्ग मस्तिष्क के उन क्षेत्रों का प्रतिनिधित्व करते हैं जहां से छवियां ली गई थीं। c, GFP व्यक्त करने वाली कोशिकाओं का परिमाणीकरण (n = 4 चूहे)। d, e - t-hCO में Netrin G1+ थैलेमिक टर्मिनल। d t-hCO और VB नाभिक युक्त कोरोनल सेक्शन दिखाता है। स्केल बार, 2 मिमी। e t-hCO (बाएं) और VB एफ, जी, एस1 चूहे (एफ) या आंतरिक कैप्सूल (जी) में विद्युत उत्तेजना के बाद टी-एचसीओ न्यूरॉन्स के वर्तमान निशान, (बैंगनी) या बिना (काला) एनबीक्यूएक्स (बाएं) के साथ। एनबीक्यूएक्स के साथ और बिना ईपीएससी आयाम (एन = 6 एस1 न्यूरॉन्स, *पी = 0.0119; और एन = 6 आंतरिक कैप्सूल न्यूरॉन्स, **पी = 0.0022) (केंद्र)। चूहे एस1 (एफ) या आंतरिक कैप्सूल (जी) (दाएं) की विद्युत उत्तेजना के जवाब में ईपीएससी दिखाने वाले टी-एचसीओ न्यूरॉन्स का प्रतिशत। एसीएसएफ, कृत्रिम मस्तिष्कमेरु द्रव। एच, 2पी इमेजिंग प्रयोग का योजनाबद्ध आरेख (बाएं)। जीसीएएमपी6एस की टी-एचसीओ में अभिव्यक्ति (मध्य)। स्केल बार, 100 k, एक परीक्षण में z-स्कोर वाले 2P प्रतिदीप्ति प्रक्षेप पथ, उदाहरण कोशिकाओं में समय शून्य (डैश लाइन) पर व्हिस्कर विचलन के साथ संरेखित। l, सभी कोशिकाओं की जनसंख्या-औसत z-स्कोर प्रतिक्रियाएं समय शून्य (डैश लाइन) (लाल) या यादृच्छिक रूप से उत्पन्न टाइमस्टैम्प (ग्रे) पर व्हिस्कर विचलन के साथ संरेखित। m. ऑप्टिकल मार्किंग पर प्रयोग का योजनाबद्ध आरेख। n, नीले लेजर उत्तेजना या व्हिस्कर विक्षेपण के दौरान एक उदाहरण t-hCO सेल से कच्चा वोल्टेज वक्र। लाल तीर प्रकाश (शीर्ष) या व्हिस्कर विक्षेपण (नीचे) के कारण होने वाले पहले स्पाइक्स को इंगित करते हैं। ग्रे शेडिंग व्हिस्कर विक्षेपण की अवधि को इंगित करता है। o, शीर्ष प्रकाश तरंग q, सभी फोटोसेंसिटिव कोशिकाओं के लिए जनसंख्या-औसत z-स्कोर फायरिंग दर, समय शून्य (डैश लाइन) (लाल) या यादृच्छिक रूप से उत्पन्न टाइमस्टैम्प (ग्रे) पर व्हिस्कर विचलन के साथ संरेखित। r, व्हिस्कर विचलन (n = 3 चूहे) द्वारा महत्वपूर्ण रूप से संशोधित फोटोसेंसिटिव इकाइयों का अनुपात (बाएं)। पीक z-स्कोर विलंबता (n = 3 चूहे; n = 5 (हल्का हरा), n = 4 (गहरा हरा), और n = 4 (सियान) व्हिस्कर विक्षेपण मॉड्यूलेशन इकाइयाँ प्रति चूहा) (दाएं)। डेटा को माध्य ± मानक विचलन के रूप में व्यक्त किया जाता है
फिर हमने पूछा कि क्या t-hCO को इन विवो में संवेदी उत्तेजनाओं द्वारा सक्रिय किया जा सकता है। हमने आनुवंशिक रूप से एनकोडेड कैल्शियम संकेतक GCaMP6 को व्यक्त करने वाले hCO को S1 चूहों में प्रत्यारोपित किया। 150 दिनों के बाद, हमने फाइबर फोटोमेट्री या दो-फोटोन कैल्शियम इमेजिंग (चित्र 4h और विस्तारित डेटा, चित्र 10a) का प्रदर्शन किया। हमने पाया कि t-hCO कोशिकाओं ने समकालिक लयबद्ध गतिविधि (चित्र 4i, विस्तारित डेटा, चित्र 10b और पूरक वीडियो 1) का प्रदर्शन किया। चरम t-hCO गतिविधि को चिह्नित करने के लिए, हमने एनेस्थेटाइज्ड ट्रांसप्लांट चूहों (विस्तारित डेटा, चित्र 10c-f) में बाह्यकोशिकीय इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल रिकॉर्डिंग की। हमने MRI छवियों से स्टीरियोटैक्सिक निर्देशांक उत्पन्न किए हैं; इस प्रकार, ये रिकॉर्ड की गई इकाइयाँ संभावित मानव न्यूरॉन्स का प्रतिनिधित्व करती हैं, हालाँकि अकेले इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी मूल की प्रजाति को निर्धारित करने की अनुमति नहीं देती है। हमने गतिविधि के समकालिक विस्फोटों (विस्तारित डेटा, चित्र 10d) को देखा। विस्फोट लगभग 460 एमएस तक चले और लगभग 2 सेकंड की मौन अवधि से अलग हुए (विस्तारित डेटा, चित्र 10डी, ई)। व्यक्तिगत इकाइयों ने प्रति विस्फोट औसतन लगभग तीन राउंड फायर किए, जो प्रति विस्फोट पंजीकृत इकाइयों का लगभग 73% है। व्यक्तिगत इकाइयों की गतिविधियाँ अत्यधिक सहसंबंधित थीं, और ये सहसंबंध समान परिस्थितियों में दर्ज किए गए बिना टीकाकरण वाले जानवरों में पहचानी गई इकाइयों की तुलना में अधिक थे (विस्तारित डेटा, चित्र 10एफ)। पहचाने गए मानव-व्युत्पन्न न्यूरॉन्स की स्पाइक प्रतिक्रियाओं को और अधिक स्पष्ट करने के लिए, हमने प्रकाश-संवेदनशील कैशन चैनल रोडोप्सिन 2 (एचसीआर2) को व्यक्त करने वाले एचसीओ के साथ प्रत्यारोपित एनेस्थेटाइज्ड चूहों पर प्रकाश-टैगिंग प्रयोग किए, जिसके माध्यम से टी-एचसीओ न्यूरॉन्स नीली रोशनी उत्तेजनाओं (चित्र 4एम-ओ) के जवाब में कम विलंबता पहचान (10 एमएस से कम) करते हैं। t-hCO न्यूरॉन्स ने कैल्शियम इमेजिंग में देखी गई आवृत्तियों के समान स्वतःस्फूर्त गतिविधि के विस्फोटों का प्रदर्शन किया, साथ ही प्रकाश अंकन की अनुपस्थिति में t-hCO में किए गए इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल रिकॉर्डिंग (विस्तारित डेटा, चित्र 10c-g)। इन विट्रो में दर्ज hCO के संगत चरणों में कोई स्वतःस्फूर्त गतिविधि नहीं देखी गई। यह आकलन करने के लिए कि क्या t-hCO को संवेदी उत्तेजनाओं द्वारा सक्रिय किया जा सकता है, हमने चूहे की मूंछों को t-hCO से कुछ समय के लिए दूर कर दिया (चित्र 4j,m और विस्तारित डेटा, चित्र 10h,k)। पिछले अध्ययनों 8,10 के अनुसार, t-hCO कोशिकाओं के एक उपसमूह ने मूंछ विक्षेपण की प्रतिक्रिया में बढ़ी हुई गतिविधि दिखाई, जो डेटा की तुलना यादृच्छिक समय टिकटों (चित्र 4k-q और विस्तारित डेटा, चित्र 10h-q) के साथ करने पर नहीं देखी गई। वास्तव में, ऑप्टो-लेबल वाली एकल इकाइयों में से लगभग 54% ने मूंछ उत्तेजना के बाद काफी बढ़ी हुई उत्तेजना दर दिखाई, जो लगभग 650 ms (चित्र 4r) पर चरम पर थी। कुल मिलाकर, ये आंकड़े बताते हैं कि t-hCO को उचित कार्यात्मक इनपुट प्राप्त होते हैं और पर्यावरणीय उत्तेजनाओं द्वारा इसे सक्रिय किया जा सकता है।
फिर हमने जांच की कि क्या t-hCO चूहों में व्यवहार को नियंत्रित करने के लिए सर्किट को सक्रिय कर सकता है। हमने सबसे पहले जांच की कि क्या t-hCO न्यूरॉन्स के अक्षतंतु चूहे के आस-पास के ऊतकों में प्रक्षेपित होते हैं। हमने hCO को hChR2 को EYFP (hChR2-EYFP) से जुड़े लेन्टिवायरस एन्कोडिंग से संक्रमित किया। 110 दिनों के बाद, हमने श्रवण, मोटर और सोमैटोसेंसरी कॉर्टिस सहित इप्सिलैटरल कॉर्टिकल क्षेत्रों में EYFP अभिव्यक्ति देखी, साथ ही स्ट्रिएटम, हिप्पोकैम्पस और थैलेमस (चित्र 5a) सहित सबकोर्टिकल क्षेत्रों में भी। यह आकलन करने के लिए कि क्या ये अपवाही प्रक्षेपण चूहे की कोशिकाओं में सिनैप्टिक प्रतिक्रियाएँ उत्पन्न कर सकते हैं, हमने चूहे के मस्तिष्क के तीखे हिस्सों में सेरेब्रल कॉर्टेक्स कोशिकाओं को रिकॉर्ड करके hChR2-EYFP व्यक्त करने वाली t-hCO कोशिकाओं को ऑप्टिकली सक्रिय किया। नीली रोशनी के साथ टी-एचसीओ अक्षतंतुओं की सक्रियता ने चूहे के पिरामिडल कॉर्टेक्स न्यूरॉन्स में लघु-विलंबता ईपीएससी को प्रेरित किया, जिसे एनबीक्यूएक्स (चित्र 5बी-जी) द्वारा अवरुद्ध किया गया था। इसके अलावा, इन प्रतिक्रियाओं को टेट्रोडोटॉक्सिन (टीटीएक्स) द्वारा अवरुद्ध किया जा सकता है और 4-एमिनोपाइरीडीन (4-एपी) द्वारा बहाल किया जा सकता है, जो यह सुझाव देता है कि वे मोनोसिनेप्टिक कनेक्शन (चित्र 5ई) के कारण थे।
ए, एक्सॉन ट्रैकिंग का योजनाबद्ध आरेख (बाएं)। टी-एचसीओ ईवाईएफपी अभिव्यक्ति (दाएं)। स्केल बार, 100 µm। A1, श्रवण प्रांतस्था, ACC, पूर्ववर्ती सिंगुलेट प्रांतस्था, d. स्ट्रिएटम, पृष्ठीय स्ट्रिएटम, HPC, हिप्पोकैम्पस; डायाफ्राम, पार्श्व पट, mPFC, औसत दर्जे का प्रीफ्रंटल प्रांतस्था, पिरी, पिरिफॉर्म प्रांतस्था, v. स्ट्रिएटम, वेंट्रल स्ट्रिएटम, VPM, थैलेमस का वेंट्रोपोस्टोमेडियल न्यूक्लियस, VTA, वेंट्रल टेगमेंटल क्षेत्र। लाल वर्ग मस्तिष्क के उन क्षेत्रों का प्रतिनिधित्व करते हैं जहाँ से चित्र लिए गए थे। बी, उत्तेजना प्रयोग का योजनाबद्ध आरेख। सी, डी, मानव (सी) ईवाईएफपी+ टी-एचसीओ या चूहे (डी) ईवाईएफपी- कोशिकाओं में नीली रोशनी से प्रेरित फोटोकरंट (ऊपर) और वोल्टेज (नीचे) की प्रतिक्रिया के उदाहरण। ई, एफ, टीटीएक्स और 4-एआर (हरा), टीटीएक्स (ग्रे) या एसीएसएफ (काला) (ई) के साथ टी-एचसीओ अक्षतंतुओं की नीली रोशनी उत्तेजना के बाद चूहे न्यूरॉन्स के वर्तमान निशान, (बैंगनी) या बिना (काला) ) एनबीक्यूएक्स (ई)। जी, चूहे की कोशिकाओं में नीली रोशनी से प्रेरित प्रतिक्रियाओं की विलंबता (एन = 16 कोशिकाएं); क्षैतिज पट्टियाँ औसत विलंबता (7.13 एमएस) (बाएं) दर्शाती हैं। एनबीक्यूएक्स के साथ या उसके बिना रिकॉर्ड किए गए प्रकाश-उत्पन्न ईपीएससी का आयाम (एन = 7 कोशिकाएं; ***पी < 0.0001) (मध्य)। एनबीक्यूएक्स के साथ या उसके बिना रिकॉर्ड किए गए प्रकाश-उत्पन्न ईपीएससी का आयाम (एन = 7 कोशिकाएं; ***पी < 0.0001) (मध्य)। ईपीएससी को जोड़ने के लिए, आपको NBQX (n = 7) की आवश्यकता होती है клеток; ***P <0,0001) (в центре). एनबीक्यूएक्स के साथ या उसके बिना रिकॉर्ड किए गए प्रकाश-प्रेरित ईपीएससी का आयाम (एन = 7 कोशिकाएं; ***पी < 0.0001) (केंद्र)।एनबीक्यूएक्स के लिए ईपीएससी की जांच करें (एन = 7 प्रतिशत; *** पी < 0.0001）（中）)।एनबीक्यूएक्स के लिए ईपीएससी की जांच करें (एन = 7 प्रतिशत; *** पी < 0.0001）（中）)। ईपीएससी को जोड़ने के लिए, आपको NBQX (n = 7) की आवश्यकता होती है клеток; ***P <0,0001) (в центре). एनबीक्यूएक्स के साथ या उसके बिना रिकॉर्ड किए गए प्रकाश-प्रेरित ईपीएससी का आयाम (एन = 7 कोशिकाएं; ***पी < 0.0001) (केंद्र)।नीली रोशनी के प्रति प्रतिक्रिया करने वाली EPSCs को दर्शाने वाली चूहे कोशिकाओं का प्रतिशत (दाहिनी ओर)। h, एक व्यवहारिक कार्य का योजनाबद्ध आरेख। d0, दिन 0. i. प्रशिक्षण के दिन 1 (बाएं) या दिन 15 (दाएं) पर अनुकरणीय जानवरों का प्रदर्शन। दिन 1 (बाएं) या दिन 15 (दाएं केंद्र) पर किए गए चाटों की औसत संख्या (n = 150 नीली प्रकाश परीक्षण, n = 150 लाल प्रकाश परीक्षण; ***P < 0.0001)। दिन 1 (बाएं) या दिन 15 (दाएं केंद्र) पर किए गए चाटों की औसत संख्या (n = 150 नीली प्रकाश परीक्षण, n = 150 लाल प्रकाश परीक्षण; ***P < 0.0001)। Среднее количество облизываний, выполненных в день (слева) или दिन 15 (в центре справа) (n = 150 दिन प्रति दिन, n = 150 दिन सी красным светом; ***पी <0,0001). दिन 1 (बाएं) या दिन 15 (केंद्र दाएं) पर किए गए चाटों की औसत संख्या (n = 150 नीली प्रकाश परीक्षण, n = 150 लाल प्रकाश परीक्षण; ***P < 0.0001)।1 वर्ष (लगभग) 15 वर्ष (15 वर्ष) के बाद शेष राशि (n = 150 वर्ष, n = 150 अधिकतम सीमा ；***P < 0.0001）。1 वर्ष (लगभग) 15 वर्ष (15 वर्ष) के बाद शेष राशि (n = 150 वर्ष, n = 150 अधिकतम सीमा ；***P < 0.001 Среднее количество облизываний, выполненных в день (слева) или दिन 15 (в центре справа) (n = 150 दिन प्रति दिन, n = 150 दिन सी красным светом; ***पी <0,0001). दिन 1 (बाएं) या दिन 15 (केंद्र दाएं) पर किए गए चाटों की औसत संख्या (n = 150 नीली प्रकाश परीक्षण, n = 150 लाल प्रकाश परीक्षण; ***P < 0.0001)।दिन 1 (मध्य बाएँ) या दिन 15 (दाएँ) पर लाल और नीली रोशनी के परीक्षणों के लिए संचयी चाट। एन.एस., महत्वपूर्ण नहीं। j,k, दिन 1 या 15 पर hChR2-EYFP (j) या नियंत्रण फ्लोरोफोर (k) व्यक्त करने वाले t-hCO के साथ प्रत्यारोपित सभी जानवरों की व्यवहारगत विशेषताएँ (hChR2-EYFP: n = 9 चूहे, ** P = 0.0049; नियंत्रण: n = 9, P = 0.1497)। एल, वरीयता स्कोर का विकास (एन = 9 एचसीएचआर2, एन = 9 नियंत्रण; **पी < 0.001, ***पी < 0.0001)। एल, वरीयता स्कोर का विकास (एन = 9 एचसीएचआर2, एन = 9 नियंत्रण; **पी < 0.001, ***पी < 0.0001)। एल, Эволюция показателя предпочтения (n = 9 hChR2, n = 9 контрольных; **P <0,001, ***P <0,0001). एल, वरीयता स्कोर का विकास (एन = 9 एचसीएचआर2, एन = 9 नियंत्रण; **पी < 0.001, ***पी < 0.0001)। l, अधिकतम लाभ (n = 9 hChR2, n = 9 प्रतिशत);**P < 0.001,***P < 0.0001）。 l, अधिकतम लाभ (n = 9 hChR2, n = 9 प्रतिशत);**P < 0.001,***P < 0.0001）。 एल, Эволюция показателей предпочтения (n = 9 hChR2, n = 9 контролей; **P <0,001, ***P <0,0001). एल, वरीयता स्कोर का विकास (एन = 9 एचसीएचआर2, एन = 9 नियंत्रण; **पी < 0.001, ***पी < 0.0001)।m, S1 में t-hCO के ऑप्टोजेनेटिक सक्रियण की प्रतिक्रिया में FOS अभिव्यक्ति। एफओएस अभिव्यक्ति (बाएं) और परिमाणीकरण (n = 3 प्रति समूह; *P < 0.05, **P < 0.01 और ***P < 0.001) (दाएं) की छवियां दिखाई गई हैं। एफओएस अभिव्यक्ति (बाएं) और परिमाणीकरण (n = 3 प्रति समूह; *P < 0.05, **P < 0.01 और ***P < 0.001) (दाएं) की छवियां दिखाई गई हैं। Показаны изображения экспрессии FOS (слева) и количественного определения (n = 3 на группу; * P <0,05, ** P <0,01 и *** P <0,001) (справа). एफओएस अभिव्यक्ति (बाएं) और परिमाणीकरण (n = 3 प्रति समूह; *P<0.05, **P<0.01, और ***P<0.001) की छवियां दिखाई गई हैं (दाएं)।FOS की गणना करें (अधिकतम) और पूर्णांक n = 3；*P < 0.05、**P < 0.01 और***P < 0.001）（右）的图像。FOS की गणना करें (अधिकतम) और पूर्णांक n = 3；*P < 0.05、**P < 0.01 और***P < 0.001）（右）的图像。 Показаны изображения экспрессии FOS (слева) и количественного определения (n = 3 на группу; * P <0,05, ** P <0,01 и *** P <0,001) (справа). एफओएस अभिव्यक्ति (बाएं) और परिमाणीकरण (n = 3 प्रति समूह; *P<0.05, **P<0.01, और ***P<0.001) की छवियां दिखाई गई हैं (दाएं)।स्केल बार, 100 µm. डेटा को BLA, बेसोलैटरल टॉन्सिल, MDT, डोर्सोमेडियल थैलेमिक न्यूक्लियस, PAG, पेरियाक्वेडक्टल ग्रे के औसत ± मानक त्रुटि के रूप में व्यक्त किया जाता है।
अंत में, हमने पूछा कि क्या t-hCO चूहे के व्यवहार को संशोधित कर सकता है। इसका परीक्षण करने के लिए, हमने hChR2-EYFP-व्यक्त करने वाले hCO को S1 में प्रत्यारोपित किया, और 90 दिन बाद, हमने प्रकाश वितरण के लिए t-hCO में ऑप्टिकल फाइबर प्रत्यारोपित किए। फिर हमने चूहों को एक संशोधित ऑपरेटिव कंडीशनिंग प्रतिमान (चित्र 5h) के साथ प्रशिक्षित किया। हमने जानवरों को एक व्यवहार परीक्षण कक्ष में रखा और बेतरतीब ढंग से 5 सेकंड के लिए नीले (473 एनएम) और लाल (635 एनएम) लेजर उत्तेजनाएं लागू कीं। जानवरों को पानी का इनाम मिला अगर उन्होंने नीली रोशनी की उत्तेजना के दौरान चाटा लेकिन लाल रोशनी की उत्तेजना के दौरान नहीं चाटा। प्रशिक्षण के पहले दिन, जानवरों ने नीली या लाल रोशनी से उत्तेजित होने पर चाटने में कोई अंतर नहीं दिखाया। हालांकि, 15वें दिन, hChR2-EYFP व्यक्त करने वाले hCO के साथ प्रत्यारोपित जानवरों ने लाल रोशनी की उत्तेजना की तुलना में नीली रोशनी से उत्तेजित होने पर अधिक सक्रिय चाटना दिखाया। चाटने के व्यवहार में ये बदलाव hCO प्रत्यारोपित नियंत्रण जानवरों में नहीं देखे गए थे जो नियंत्रण फ्लोरोफोर को व्यक्त करते थे (सीखने की सफलता दर: hChR2 89%, EYFP 0%, चित्र 5i-1 और अनुपूरक वीडियो 2)। ये डेटा बताते हैं कि t-hCO कोशिकाएं पुरस्कार चाहने वाले व्यवहार को उत्तेजित करने के लिए चूहे के न्यूरॉन्स को सक्रिय कर सकती हैं। यह पता लगाने के लिए कि चूहे के कौन से t-hCO तंत्रिका सर्किट इन व्यवहार परिवर्तनों में शामिल हो सकते हैं, हमने प्रशिक्षित जानवरों में t-hCO को ऑप्टोजेनेटिक रूप से सक्रिय किया और 90 मिनट बाद ऊतकों को काटा। इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री ने प्रेरित व्यवहार में शामिल कई मस्तिष्क क्षेत्रों में गतिविधि-निर्भर FOS प्रोटीन की अभिव्यक्ति का खुलासा किया, जिसमें औसत दर्जे का प्रीफ्रंटल कॉर्टेक्स, औसत दर्जे का थैलेमस और पेरियाक्वेडक्टल ग्रे मैटर शामिल हैं
तंत्रिका अंग मानव विकास और बीमारी का इन विट्रो में अध्ययन करने के लिए एक आशाजनक प्रणाली का प्रतिनिधित्व करते हैं, लेकिन वे इन विवो में मौजूद सर्किटों के बीच कनेक्शन की कमी के कारण सीमित हैं। हमने एक नया प्लेटफ़ॉर्म विकसित किया है जिसमें हमने मानव कोशिका विकास और इन विवो में कार्य का अध्ययन करने के लिए प्रतिरक्षाविहीन प्रारंभिक प्रसवोत्तर चूहों के S1 में hCO प्रत्यारोपित किया। हमने दिखाया है कि t-hCO परिपक्व कोशिका प्रकार विकसित करता है जो इन विट्रो28 में नहीं देखे गए हैं और t-hCO शारीरिक और कार्यात्मक रूप से कृंतक मस्तिष्क में एकीकृत है। कृंतक तंत्रिका सर्किट में t-hCO के एकीकरण ने हमें मानव सेलुलर गतिविधि और अध्ययन किए गए पशु व्यवहार के बीच एक लिंक स्थापित करने की अनुमति दी, यह दिखाते हुए कि t-hCO न्यूरॉन्स व्यवहारिक प्रतिक्रियाओं को चलाने के लिए चूहे की न्यूरोनल गतिविधि को संशोधित कर सकते हैं।
हम जिस प्लैटफ़ॉर्म का वर्णन कर रहे हैं, उसमें कृंतक मस्तिष्क में मानव कोशिकाओं के प्रत्यारोपण पर पिछले शोध की तुलना में कई फ़ायदे हैं। सबसे पहले, हमने hCO को जन्म के बाद के शुरुआती चूहों के विकासशील प्रांतस्था में प्रत्यारोपित किया, जो शारीरिक और कार्यात्मक एकीकरण को सुविधाजनक बना सकता है। दूसरा, t-hCO MRI निगरानी ने हमें जीवित जानवरों में ग्राफ्ट की स्थिति और वृद्धि का अध्ययन करने की अनुमति दी, जिससे हमें दीर्घकालिक बहु-पशु अध्ययन करने और कई hiPS सेल लाइनों की विश्वसनीयता स्थापित करने में मदद मिली। अंत में, हमने अलग-अलग एकल कोशिका निलंबन के बजाय बरकरार ऑर्गेनोइड्स को प्रत्यारोपित किया, जो मानव कोशिकाओं के लिए कम विनाशकारी हैं और चूहे के मस्तिष्क में मानव कॉर्टेक्स न्यूरॉन्स के एकीकरण और पीढ़ी को बढ़ावा दे सकते हैं।
हम स्वीकार करते हैं कि इस प्लेटफ़ॉर्म में प्रगति के बावजूद, अस्थायी, स्थानिक और क्रॉस-प्रजाति की बाधाएं विकास के शुरुआती चरण में प्रत्यारोपण के बाद भी उच्च निष्ठा के साथ मानव तंत्रिका सर्किट के गठन को रोकती हैं। उदाहरण के लिए, यह स्पष्ट नहीं है कि टी-एचसीओ में देखी गई सहज गतिविधि कॉर्टिकल विकास के दौरान देखी गई लयबद्ध गतिविधि के समान विकासात्मक फेनोटाइप का प्रतिनिधित्व करती है या यह टी-एचसीओ में मौजूद दमनकारी कोशिका प्रकारों की अनुपस्थिति के कारण है। इसी तरह, यह स्पष्ट नहीं है कि टी-एचसीओ में लेमिनेशन की अनुपस्थिति किस हद तक चेन कनेक्टिविटी को प्रभावित करती है30। भविष्य का काम अन्य कोशिका प्रकारों जैसे मानव माइक्रोग्लिया, मानव एंडोथेलियल कोशिकाओं और GABAergic इंटरन्यूरॉन्स के अलग-अलग अनुपातों को एकीकृत करने पर ध्यान केंद्रित करेगा जैसा कि इन विट्रो में असेंबली 6 का उपयोग करके दिखाया गया है
कुल मिलाकर, यह इन विवो प्लेटफ़ॉर्म एक शक्तिशाली संसाधन का प्रतिनिधित्व करता है जो इन विट्रो मानव मस्तिष्क विकास और रोग अनुसंधान को पूरक कर सकता है। हम अनुमान लगाते हैं कि यह प्लेटफ़ॉर्म हमें अन्यथा मायावी रोगी-व्युत्पन्न कोशिकाओं में नए स्ट्रैंड-स्तरीय फेनोटाइप की खोज करने और नई चिकित्सीय रणनीतियों का परीक्षण करने की अनुमति देगा।
हमने पहले बताए अनुसार HiPS कोशिकाओं से hCO2.5 उत्पन्न किया। फीडर परतों पर संवर्धित hiPS कोशिकाओं से hCO उत्पादन आरंभ करने के लिए, डिस्पैस (0.35 mg/mL) का उपयोग करके कल्चर डिश से hiPS कोशिकाओं की अक्षुण्ण कॉलोनियों को निकाला गया और hiPS सेल कल्चर माध्यम वाली डिश युक्त अल्ट्रा-लो अटैचमेंट प्लास्टिक कल्चर में स्थानांतरित किया गया। (कॉर्निंग) दो SMAD अवरोधक डोरसोमोर्फिन (5 μM; P5499, सिग्मा-एल्ड्रिच) और SB-431542 (10 μM; 1614, टोक्रिस) और ROCK अवरोधक Y-27632 (10 μM; S1049, सेलेककेम) के साथ पूरक। पहले 5 दिनों के दौरान, hiPS सेल माध्यम को प्रतिदिन बदला गया और डोरसोमोर्फिन और SB-431542 को मिलाया गया। निलंबन के छठे दिन, तंत्रिका गोलाकार को न्यूरोबेसल-ए (10888, लाइफ टेक्नोलॉजीज), विटामिन ए के बिना बी-27 अनुपूरक (12587, लाइफ टेक्नोलॉजीज), ग्लूटामैक्स (1:100, लाइफ टेक्नोलॉजीज), पेनिसिलिन और स्ट्रेप्टोमाइसिन (1:100, लाइफ टेक्नोलॉजीज) युक्त तंत्रिका माध्यम में स्थानांतरित किया गया और 24 दिन तक एपिडर्मल ग्रोथ फैक्टर (ईजीएफ; 20 एनजी एमएल−1; आर एंड डी सिस्टम्स) और फाइब्रोब्लास्ट ग्रोथ फैक्टर 2 (एफजीएफ2; 20 एनजी एमएल−1; आर एंड डी सिस्टम्स) के साथ पूरक किया गया। 25वें दिन से 42वें दिन तक, माध्यम को मस्तिष्क-व्युत्पन्न न्यूरोट्रॉफिक कारक (बीडीएनएफ; 20 एनजी एमएल−1, पेप्रोटेक) और न्यूरोट्रॉफिन 3 (एनटी निलंबन के छठे दिन, तंत्रिका गोलाकार को न्यूरोबेसल-ए (10888, लाइफ टेक्नोलॉजीज), विटामिन ए के बिना बी-27 अनुपूरक (12587, लाइफ टेक्नोलॉजीज), ग्लूटामैक्स (1:100, लाइफ टेक्नोलॉजीज), पेनिसिलिन और स्ट्रेप्टोमाइसिन (1:100, लाइफ टेक्नोलॉजीज) युक्त तंत्रिका माध्यम में स्थानांतरित किया गया और 24 दिन तक एपिडर्मल ग्रोथ फैक्टर (ईजीएफ; 20 एनजी एमएल−1; आर एंड डी सिस्टम्स) और फाइब्रोब्लास्ट ग्रोथ फैक्टर 2 (एफजीएफ2; 20 एनजी एमएल−1; आर एंड डी सिस्टम्स) के साथ पूरक किया गया। 25वें दिन से 42वें दिन तक, माध्यम को मस्तिष्क-व्युत्पन्न न्यूरोट्रॉफिक कारक (बीडीएनएफ; 20 एनजी एमएल−1, पेप्रोटेक) और न्यूरोट्रॉफिन 3 (एनटीनिलंबन के छठे दिन, तंत्रिका गोलाकारों को न्यूरोबेसल-ए (10888, लाइफ टेक्नोलॉजीज), विटामिन ए रहित बी-27 अनुपूरक (12587, लाइफ टेक्नोलॉजीज), ग्लूटामैक्स (1:100, लाइफ टेक्नोलॉजीज), पेनिसिलिन युक्त तंत्रिका माध्यम में स्थानांतरित किया गया।और стрептомицин (1:100, लाइफ टेक्नोलॉजीज) और дополнены эпидермальным фактором роста (ईजीएफ; 20) нг/мл; R&D Systems) और фактором фибробластов 2 (FGF2; 20 нг/мл; R&D Systems) до 24-дня. और स्ट्रेप्टोमाइसिन (1:100, लाइफ टेक्नोलॉजीज) और एपिडर्मल ग्रोथ फैक्टर (ईजीएफ; 20 एनजी/एमएल; आर एंड डी सिस्टम) और फाइब्रोब्लास्ट ग्रोथ फैक्टर 2 (एफजीएफ2; 20 एनजी/एमएल; आर एंड डी सिस्टम) के साथ 24 दिन तक पूरक किया गया।25 से 42 दिनों तक, मस्तिष्क-व्युत्पन्न न्यूरोट्रॉफिक कारक (BDNF; 20 ng ml-1, पेप्रोटेक) और न्यूरोट्रॉफिन 3 (NT3; 20 ng ml-1, पेप्रोटेक) को माध्यम में मिलाया गया, हर दूसरे दिन माध्यम बदला गया।न्यूरोबासल-ए (10888, लाइफ टेक्नोलॉजीज) और ए बी-27 अधिक जानकारी (12587, लाइफ टेक्नोलॉजीज), ग्लूटामैक्स (1:100, लाइफ टेक्नोलॉजीज) और लाइफ टेक्नोलॉजीज प्रौद्योगिकियां: ईजीएफ; 20 एनजी एमएल-1; आर एंड डी सिस्टम्स; और प्रौद्योगिकी प्रौद्योगिकी; एफजीएफ2; 20 एनजी एमएल-1; आर एंड डी सिस्टम्स）直至第24 वर्ष।न्यूरोबेसल-ए (10888, लाइफ टेक्नोलॉजीज) और 6 वर्ष से अधिक समय तक न्यूरोबेसल-ए (10888, लाइफ टेक्नोलॉजीज) से संपर्क करें। बी-27 उत्पाद (12587, लाइफ टेक्नोलॉजीज) ग्लूटामैक्स (1: 100, लाइफ टेक्नॉजिस, लाइफ टेक्नोलॉजी, लाइफ टेक्नोलॉजी टेक्नोलॉजीज) अधिक पढ़ें सिस्टम्स 24 दिनों में उपलब्ध हैं। На 6-й день суспензии нейросферы были переведены на добавку, अन्य उत्पाद-ए (10888, लाइफ टेक्नोलॉजीज), अन्य उत्पाद वी-27 अन्य उत्पाद ए (12587, लाइफ टेक्नोलॉजीज), ग्लूटामैक्स (1:100, लाइफ टेक्नोलॉजीज), пенициллин- нейтрализованный стрептомицин (1:100, लाइफ टेक्नोलॉजीज) с добавлением हार्डवेयर प्रोसेसर (ईजीएफ; 20 मिलियन मिलियन-1; आर एंड डी सिस्टम) और लैपटॉप प्रोसेसर фибробластов 2 (FGF2; 20 нг мл-1) 1; 6वें दिन, न्यूरोस्फीयर सस्पेंशन को न्यूरोबैसल-ए (10888, लाइफ टेक्नोलॉजीज), विटामिन ए रहित बी-27 सप्लीमेंट (12587, लाइफ टेक्नोलॉजीज), ग्लूटामैक्स (1:100, लाइफ टेक्नोलॉजीज), पेनिसिलिन-न्यूट्रलाइज्ड स्ट्रेप्टोमाइसिन (1:100, लाइफ टेक्नोलॉजीज) युक्त सप्लीमेंट में बदल दिया गया, जिसे एपिडर्मल ग्रोथ फैक्टर (ईजीएफ; 20 एनजी एमएल-1; आर एंड डी सिस्टम्स) और फाइब्रोब्लास्ट ग्रोथ फैक्टर 2 (एफजीएफ2; 20 एनजी एमएल-1) 1 के साथ पूरक किया गया; आर एंड डी सिस्टम्स) 24 दिन से। आर एंड डी सिस्टम) 24 दिन तक।25 से 42 दिनों तक, मस्तिष्क-व्युत्पन्न न्यूरोट्रॉफिक फैक्टर (BDNF; 20 ng ml-1, पेप्रोटेक) और न्यूरोट्रॉफिक फैक्टर 3 (NT3; 20 ng ml-1, पेप्रोटेक) को हर दूसरे दिन कल्चर मीडियम में मिलाया गया। एक बार मीडियम बदलें।43वें दिन से शुरू करके, hCO को हर 4-6 दिन में माध्यम परिवर्तन के साथ बिना पूरक न्यूरोबेसल-ए माध्यम (NM; 1088022, थर्मो फिशर) में बनाए रखा गया। फीडरलेस स्थितियों के तहत संवर्धित hiPS कोशिकाओं से hCO प्राप्त करने के लिए, hiPS कोशिकाओं को Accutase (AT-104, Innovate Cell Technologies) के साथ 37°C पर 7 मिनट के लिए इनक्यूबेट किया गया, एकल कोशिकाओं में विघटित किया गया, और ROCK अवरोधक Y-27632 (10 μM; S1049, Selleckchem) के साथ पूरक Essential 8 माध्यम में 3 × 106 एकल कोशिकाओं प्रति वेल के घनत्व पर AggreWell 800 प्लेटों (34815, STEMCELL Technologies) पर प्लेट किया गया। 24 घंटे के बाद, कुओं में मीडिया को ऊपर और नीचे आवश्यक 6 मीडिया (A1516401, लाइफ टेक्नोलॉजीज) युक्त मीडिया में पिपेट किया गया, जिसमें डोरसोमोर्फिन (2.5 μM; P5499, सिग्मा-एल्ड्रिच) और SB-431542 (10 μM; 1614, टोक्रिडा) के साथ पूरक किया गया। 2 से 6 दिनों तक, आवश्यक 6 माध्यम को प्रतिदिन डोरसोमोर्फिन और पूरक SB-431542 से बदल दिया गया। छठे दिन से, न्यूरोस्फीयर सस्पेंशन को न्यूरोबेसल माध्यम में स्थानांतरित कर दिया गया और ऊपर वर्णित अनुसार बनाए रखा गया।
सभी पशु प्रक्रियाएं स्टैनफोर्ड विश्वविद्यालय प्रयोगशाला पशु देखभाल प्रशासनिक समिति (APLAC) द्वारा अनुमोदित पशु देखभाल दिशानिर्देशों के अनुसार की गईं। गर्भवती यूथिमिक RNU (rnu/+) चूहों को खरीदा गया (चार्ल्स रिवर लेबोरेटरीज) या घर में रखा गया। जानवरों को भोजन और पानी के साथ 12 घंटे के प्रकाश-अंधेरे चक्र पर रखा गया था। तीन से सात दिन की उम्र के नग्न (FOXN1–/–) चूहे के पिल्ले को मारने से पहले अपरिपक्व मूंछों की वृद्धि से पहचाना गया। पिल्लों (नर और मादा) को 2-3% आइसोफ्लुरेन से बेहोश किया गया और स्टीरियोटैक्सिक फ्रेम पर रखा गया। ड्यूरा मेटर की अखंडता को बनाए रखते हुए S1 के ऊपर लगभग 2-3 मिमी व्यास के साथ खोपड़ी का एक ट्रेपनेशन किया गया। फिर ड्यूरा को छेदने के लिए क्रैनियोटॉमी के ठीक बाहर 30-जी सुई (लगभग 0.3 मिमी) का उपयोग करें। फिर एक पतली 3×3 सेमी पैराफिल्म पर HCO लगाएं और अतिरिक्त माध्यम को हटा दें। 23 G, 45° सुई से जुड़ी हैमिल्टन सिरिंज का उपयोग करते हुए, सुई के सबसे दूरस्थ छोर में धीरे से hCO खींचें। फिर स्टीरियोटैक्सिक डिवाइस से जुड़े सिरिंज पंप पर सिरिंज स्थापित करें। फिर सुई की नोक को ड्यूरा (z = 0 मिमी) में पहले से बने 0.3 मिमी चौड़े पंचर छेद पर रखें और सिरिंज को 1-2 मिमी (z = लगभग -1.5 मिमी) तक संकीर्ण करें जब तक कि सुई ड्यूरा मेटर ए के बीच न हो जाए। एक घनी सील बन जाती है। फिर सिरिंज को z = -0.5 मिमी पर कॉर्टिकल सतह के केंद्र तक उठाएं और 1-2 µl प्रति मिनट की दर से hCO इंजेक्ट करें। hCO इंजेक्शन के पूरा होने के बाद, सुई को 0.2-0.5 मिमी प्रति मिनट की दर से वापस खींच लिया जाता है
सभी पशु प्रक्रियाएं स्टैनफोर्ड विश्वविद्यालय APLAC-अनुमोदित पशु देखभाल दिशानिर्देशों के अनुसार की गईं। चूहों (प्रत्यारोपण के 60 दिन से अधिक समय बाद) को 5% आइसोफ्लुरेन एनेस्थीसिया दिया गया और इमेजिंग के दौरान 1-3% आइसोफ्लुरेन के साथ एनेस्थेटाइज किया गया। विज़ुअलाइज़ेशन के लिए, एक 7 टेस्ला सक्रिय रूप से परिरक्षित क्षैतिज बोरहोल स्कैनर ब्रूकर (ब्रूकर कॉर्प) एक इंटरनेशनल इलेक्ट्रिक कंपनी (IECO) ग्रेडिएंट ड्राइव के साथ, 120 मिमी (600 mT/m, 1000 T/m/s) के आंतरिक व्यास के साथ एक परिरक्षित ग्रेडिएंट इंसर्ट का उपयोग AVANCE. III, आठ-चैनल मल्टी-कॉइल RF और मल्टी-कोर क्षमताओं और साथ में पैराविज़न 6.0.1 प्लेटफ़ॉर्म का उपयोग करके किया गया था। रिकॉर्डिंग 86 मिमी के आंतरिक व्यास के साथ एक सक्रिय रूप से अलग किए गए वॉल्यूमेट्रिक RF कॉइल और केवल प्राप्त करने के लिए चार-चैनल क्रायो-कूल्ड RF कॉइल का उपयोग करके की गई थी। अक्षीय 2D टर्बो-रेयर (पुनरावृत्ति समय = 2500 एमएस, प्रतिध्वनि समय = 33 एमएस, 2 औसत) 16 स्लाइस कैप्चर के साथ, स्लाइस मोटाई 0.6–0.8 मिमी, जिसमें 256 × 256 नमूने हैं। संकेतों को 2 सेमी (रैपिड एमआर इंटरनेशनल, एलएलसी) के आंतरिक व्यास के साथ एक चतुर्भुज ट्रांसीवर वॉल्यूमेट्रिक आरएफ कॉइल का उपयोग करके प्राप्त किया गया था। अंत में, 3D रेंडरिंग और वॉल्यूम विश्लेषण के लिए अंतर्निहित इमारिस (बिटप्लेन) सतह अनुमान कार्यों का उपयोग करें। एक सफल प्रत्यारोपण को एक ऐसे प्रत्यारोपण के रूप में परिभाषित किया गया था जिसमें प्रत्यारोपित गोलार्ध में निरंतर T2-भारित एमआरआई संकेत के क्षेत्र बनते थे। ग्राफ्ट अस्वीकृति को एक ऐसे ग्राफ्ट के रूप में परिभाषित किया गया था जो प्रत्यारोपित गोलार्ध में निरंतर T2-भारित एमआरआई संकेत के क्षेत्रों का उत्पादन नहीं करता था। उप-कॉर्टिकल t-hCO को बाद के विश्लेषण से बाहर रखा गया था।
दो-फ़ोटॉन कैल्शियम इमेजिंग के लिए hCO में GCaMP6s को स्थिर रूप से व्यक्त करने के लिए, hiPS कोशिकाओं को pLV[Exp]-EF1a::GcaMP6s-WPRE-Puro से संक्रमित किया गया और उसके बाद एंटीबायोटिक्स का चयन किया गया। संक्षेप में, कोशिकाओं को EDTA से अलग किया गया और पॉलीब्रीन (5 μg/ml) और 15 μl वायरस की उपस्थिति में लगभग 300,000 कोशिकाओं के घनत्व पर Essential 8 माध्यम के 1 ml में निलंबित कर दिया गया। फिर कोशिकाओं को 60 मिनट के लिए निलंबन में रखा गया और प्रति कुँए 50,000 कोशिकाओं के घनत्व पर बोया गया। संगम के बाद, कोशिकाओं को 5-10 μg ml-1 प्यूरोमाइसिन के साथ 5-10 दिनों के लिए या स्थिर कॉलोनियों के प्रकट होने तक उपचारित किया गया। कुछ संशोधनों के साथ पहले वर्णित5 के अनुसार तीव्र hCO संक्रमण किया गया। संक्षेप में, 30-45 दिन hCO को 1.5 मिली इप्पेनडॉर्फ माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें जिसमें 100 µl तंत्रिका माध्यम हो। फिर माध्यम के लगभग 90 µl को हटा दिया जाता है, 3-6 µl उच्च टिटर लेंटिवायरस (0.5 x 108 से 1.2 x 109 तक) को ट्यूब में जोड़ा जाता है, और hCO को 30 मिनट के लिए इनक्यूबेटर में स्थानांतरित किया जाता है। फिर प्रत्येक ट्यूब में 90-100 µl माध्यम डालें और ट्यूबों को रात भर इनक्यूबेटर में वापस रखें। अगले दिन, कम अटैचमेंट प्लेटों में hCO को ताजा तंत्रिका माध्यम में स्थानांतरित करें। 7 दिनों के बाद, संक्रमण की गुणवत्ता के दृश्य और मूल्यांकन के लिए hCO को 24-वेल ग्लास बॉटम प्लेटों में स्थानांतरित किया गया। pLV[Exp]-SYN1::EYFP-WPRE और pLV[Exp]-SYN1::hChR2-EYFP-WPRE वेक्टरबिल्डर द्वारा उत्पन्न किए गए थे। अधिकांश प्रयोगों में लेंटिवायरस का उपयोग किया जाता है क्योंकि यह मेजबान जीनोम में एकीकृत होता है, जिससे संक्रमित कोशिका रेखाओं में रिपोर्टर जीन अभिव्यक्ति की अनुमति मिलती है। रेबीज फॉलो-अप के लिए, दिन 30-45 hCO को रेबीज-ΔG-eGFP और AAV-DJ-EF1a-CVS-G-WPRE-pGHpA (प्लास्मिड #67528, एडजीन) के साथ सह-संक्रमित किया गया, 3 दिनों तक अच्छी तरह से धोया गया, और S1 में चूहों में प्रत्यारोपित किया गया और 7-14 दिनों तक इन विवो में बनाए रखा गया।
इम्यूनोसाइटोकेमिस्ट्री के लिए, जानवरों को एनेस्थेटाइज किया गया और ट्रांसकार्डियल रूप से पीबीएस के साथ छिड़का गया, उसके बाद 4% पैराफॉर्मलडिहाइड (पीबीएस में पीएफए; इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी साइंसेज) डाला गया। मस्तिष्क को 4% पीएफए ​​में 2 घंटे या रात भर 4°C पर स्थिर किया गया, 48-72 घंटों के लिए पीबीएस में 30% सुक्रोज में क्रायोप्रिजर्व किया गया, और 1:1, 30% सुक्रोज में एम्बेड किया गया: OCT (टिशू-टेक OCT कम्पाउंड 4583, सकुरा फिनटेक) और क्रायोस्टेट (लीका) का उपयोग करके 30 µm पर कोरोनल सेक्शन बनाए गए। मोटे सेक्शन की इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री के लिए, जानवरों को पीबीएस के साथ छिड़का गया, और मस्तिष्क को वाइब्रेटोम (लीका) का उपयोग करके 300-400 µm पर कोरोनल रूप से विच्छेदित और सेक्शन किया गया और सेक्शन को 30 मिनट के लिए 4% पीएफए ​​के साथ स्थिर किया गया। फिर क्रायोसेक्शन या मोटे खंडों को पीबीएस से धोया गया, कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए ब्लॉक किया गया (10% सामान्य गधा सीरम (एनडीएस) और 0.3% ट्राइटन एक्स -100 पीबीएस में पतला) और 4 डिग्री सेल्सियस पर अवरोधक समाधान के साथ ब्लॉक किया गया। - ऊष्मायन क्रायोसेक्शन को रात भर ऊष्मायन किया गया और मोटे खंडों को 5 दिनों के लिए ऊष्मायन किया गया। उपयोग की जाने वाली प्राथमिक एंटीबॉडी थीं: एंटी-न्यूएन (चूहा, 1:500; ab104224, abcam) एंटी-CTIP2 (चूहा, 1:300; ab18465, abcam), एंटी-GFAP (खरगोश, 1:1,000; Z0334, डाको), एंटी-GFP (मुर्गी, 1:1,000; GTX13970, GeneTex), एंटी-HNA (चूहा, 1:200; ab191181, abcam), एंटी-न्यूएन (खरगोश, 1:500; ABN78, मिलिपोर), एंटी-PDGFRA (खरगोश, 1:200; sc-338, सांता क्रूज़), एंटी-PPP1R17 (खरगोश, 1:200; HPA047819, एटलस एंटीबॉडीज़), एंटी-RECA-1 (चूहा, 1:50; ab9774, abcam), एंटी-SCG2 (खरगोश, 1:100; 20357-1-AP, प्रोटीनटेक), एंटी-SOX9 (बकरी, 1:500; AF3075, R&D सिस्टम), नेट्रिन G1a (बकरी, 1:100; AF1166, R&D सिस्टम), एंटी-STEM121 (चूहा, 1:200; Y40410, ताकारा बायो), एंटी-SATB2 (चूहा, 1:50; ab51502, abcam), एंटी-GAD65/67 (खरगोश, 1:400; ABN904, मिलिपोर) और एंटी-IBA1 (बकरी, 1:100; ab5076, abcam)। उपयोग की जाने वाली प्राथमिक एंटीबॉडी थीं: एंटी-न्यूएन (चूहा, 1:500; ab104224, abcam) एंटी-सीटीआईपी2 (चूहा, 1:300; ab18465, abcam), एंटी-जीएफएपी (खरगोश, 1:1,000; जेड0334, डको), एंटी-जीएफपी (मुर्गी, 1:1,000; जीटीएक्स13970, जीनेटेक्स), एंटी-एचएनए (चूहा, 1:200; ab191181, abcam), एंटी-न्यूएन (खरगोश, 1:500; एबीएन78, मिलिपोर), एंटी-पीडीजीएफआरए (खरगोश, 1:200; एससी-338, सांता क्रूज़), एंटी-पीपीपी1आर17 (खरगोश, 1:200; एचपीए047819, एटलस एंटीबॉडीज़), एंटी-आरईसीए-1 (चूहा, 1:50; ab9774, abcam), एंटी-SCG2 (खरगोश, 1:100; 20357-1-AP, प्रोटीनटेक), एंटी-SOX9 (बकरी, 1:500; AF3075, R&D सिस्टम), नेट्रिन G1a (बकरी, 1:100; AF1166, R&D सिस्टम), एंटी-STEM121 (चूहा, 1:200; Y40410, ताकारा बायो), एंटी-SATB2 (चूहा, 1:50; ab51502, abcam), एंटी-GAD65/67 (खरगोश, 1:400; ABN904, मिलिपोर) और एंटी-IBA1 (बकरी, 1:100; ab5076, abcam). Использовались следующие первичные антитела: анти-NeuN (мышиные, 1:500; ab104224, abcam), анти-CTIP2 (крысиные, 1:300; ab18465, abcam), анти-GFAP (кроличьи, 1:1000; Z0334, Dako), анти- -GFP (курица, 1:1000; GTX13970, GeneTex), анти-HNA (мышь, 1:200; ab191181, abcam), анти-NeuN (кролик, 1:500; ABN78, मिलिपोर), анти-PDGFRA (кролик, 1:200; sc-338, Санта-Круз), анти-PPP1R17 (кролик, 1:200; HPA047819, एटलस एंटीबॉडीज), एन्टिन-रेका-1 (мышь, 1:50; ab9774, abcam), एन्टिन-SCG2 (кролик, 1:100; 20357-1-एपी, प्रोटीनटेक), एन्टिन-SOX9 (козий, 1:500; AF3075, R&D सिस्टम्स), нетрин G1a (козий, 1:100; AF1166, R&D सिस्टम्स), анти-STEM121 (мышиный, 1:200; Y40410, टकारा बायो), एनेट-SATB2 (мышь, 1:50; ab51502, abcam), анти-GAD65/67 (кролик, 1:400; ABN904, millipore) और анти-IBA1 (коза, 1 :100; аб5076, абкам). इस्तेमाल की जाने वाली प्राथमिक एंटीबॉडी थीं: एंटी-न्यूएन (चूहा, 1:500; ab104224, abcam), एंटी-CTIP2 (चूहा, 1:300; ab18465, abcam), एंटी-GFAP (खरगोश, 1:1000; Z0334, डाको), एंटी-GFP (मुर्गी, 1:1000; GTX13970, GeneTex), एंटी-HNA (चूहा, 1:200; ab191181, abcam), एंटी-न्यूएन (खरगोश, 1:500; ABN78, मिलिपोर), एंटी-PDGFRA (खरगोश, 1:200; sc-338, सांता क्रूज़), एंटी-PPP1R17 (खरगोश, 1:200; HPA047819, एटलस एंटीबॉडीज़), एंटी-RECA-1 (चूहा, 1:50; ab9774, abcam), एंटी-SCG2 (खरगोश, 1:100; 20357-1-AP, प्रोटीनटेक), एंटी-SOX9 (बकरी, 1:500; AF3075, R&D सिस्टम), नेट्रिन G1a (बकरी, 1:100; AF1166, R&D सिस्टम), एंटी-STEM121 (चूहा, 1:200; Y40410, ताकारा बायो), एंटी-SATB2 (चूहा, 1:50; ab51502, abcam), एंटी-GAD65/67 (खरगोश, 1:400; ABN904, मिलिपोर) और एंटी-IBA1 (बकरी, 1:100; ab5076, abkam)।समाधान देखें: न्यूएन (न्यून), 1:500, एबी104224, एबकैम, सीटीआईपी2, 1:3 00；ab18465，abcam），抗GFAP（兔，1:1,000；Z0334，Dako），抗-GF P（鸡，1:1,000；GTX13970，GeneTex），抗HNA（小鼠，1:200；ab1911 81，abcam），抗NeuN（兔，1:500；ABN78，मिलिपोर），抗PDGFRA（兔， 1:200；sc-338，सांता क्रूज़），抗PPP1R17（兔，1:200；HPA047819，एटलस ठीक है），RECA-1（小鼠，1:50；ab9774，abcam），抗SCG2（兔） , 1:100；20357-1-एपी，प्रोटीनटेक），抗SOX9（山羊，1:500；AF3075，R&D Systems），नेट्रिन G1a（山羊，1:100；AF1166，R&D Systems），抗STEM121（小鼠, 1:200;अगला चरण: NeuN（小鼠,1:500；ab104224,abcam）抗CTIP2（大鼠,1 :300；ab18465，abcam），抗GFAP（兔，1:1,000；Z0334，Dako），抗-GFP（鸡，1:1,000；GTX13970，GeneTex），抗HNA（小鼠，1:200；ab 191181，abcam），抗NeuN（兔，1:500；ABN78，मिलिपोर％弔，抗1: 200；sc-338，सांता क्रूज़），抗PPP1R17（兔，1:200；HPA047819，एटलस समाधान），रेका-1（小鼠，1:50；ab9774，abcam），抗SCG2 100；20357-1-एपी，प्रोटीनटेक），抗SOX9（山羊，1:500；AF3075，R&D Systems），नेट्रिन G1a（山羊，1:100；AF1166，R&D सिस्टम）頏1:20, ;Y40410, ताकारा बायो), एंटी-एसएटीबी2 (चूहा, 1:50; एबी51502, एबकैम), एंटी-जीएडी65/67 (खरगोश, 1:400; एबीएन904, मिलिपोर) और एंटी-आईबीए1 (बकरी, 1:100; एबी5076, एबकैम)।उपयोग किए गए प्राथमिक एंटीबॉडी थे: एंटी-न्यूएन (चूहा, 1:500; ab104224, abcam), एंटी-CTIP2 (चूहा, 1:300; ab18465, abcam), एंटी-GFAP (खरगोश, 1:1000; Z0334, डको)। , एंटी-जीएफपी (चिकन, 1:1000; जीटीएक्स13970, जीनेटेक्स), एंटी-एचएनए (चूहा, 1:200; एबी191181, एबकैम), एंटी-न्यूएन (खरगोश, 1:500; एबीएन78, मिलिपोर), एंटी-पीडीजीएफआरए (खरगोश, 1:200; एससी-338, सांता क्रूज़), एंटी-पीपीपी1आर17 (खरगोश, 1:200; एचपीए047819, एटलस एंटीबॉडी), एंटी-आरईसीए-1 (चूहा, 1:50; एबी9774, एबकैम), एंटी-एससीजी2 (खरगोश), 1:100;20357-1-एपी, प्रोटीनटेक), анти-SOX9 (коза, 1:500; AF3075, R&D सिस्टम्स), Нетрин G1a (коза, 1:100; AF1166, R&D सिस्टम्स), анти -STEM121 (мышь, 1:200; Y40410, टकारा बायो), анти-SATB2 (мышь; ab51502, abcam), анти-GAD65/67 (кролик, 1:400; ABN904, मिलिपोर) और анти-IBA1 (коза, 1:100; аб5076, абкам). 20357-1-एपी, प्रोटीनटेक), एंटी-एसओएक्स9 (बकरी, 1:500; एएफ3075, आर एंड डी सिस्टम), नेट्रिन जी1ए (बकरी, 1:100; एएफ1166, आर एंड डी सिस्टम), एंटी-एसटीईएम121 (चूहा, 1:200; वाई40410, ताकारा बायो), एंटी-एसएटीबी2 (चूहा, 1:50; एबी51502, एबकैम), एंटी-जीएडी65/67 (खरगोश, 1:400; एबीएन904, मिलिपोर), और एंटी-आईबीए1 (बकरी, 1:100; एबी5076, एबकैम)।इसके बाद खंडों को पीबीएस से धोया गया और द्वितीयक एंटीबॉडी के साथ कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए (जमे हुए खंड) या रात भर 4 डिग्री सेल्सियस (मोटे खंड) पर रखा गया। ब्लॉकिंग समाधान में 1:1000 पतला एलेक्सा फ्लोराइड द्वितीयक एंटीबॉडी (लाइफ टेक्नोलॉजीज) का इस्तेमाल किया गया। पीबीएस से धोने के बाद, नाभिक को होचस्ट 33258 (लाइफ टेक्नोलॉजीज) के साथ देखा गया। अंत में, स्लाइड्स को एक एक्वामाउंट (पॉलीसाइंसेज) का उपयोग करके कवरस्लिप्स (फिशर साइंटिफिक) के साथ एक माइक्रोस्कोप पर रखा गया और छवि पर कीन्स फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप (बीजेड-एक्स विश्लेषक) या लेईका टीसीएस एसपी8 कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप (लास-एक्स) पर विश्लेषण किया गया। छवियों को इमेजजे प्रोग्राम (फिजी) का उपयोग करके संसाधित किया गया। ऊतक पारदर्शिता, HNA+ नाभिक और/या ऊतक ऑटोफ्लोरोसेंस की उपस्थिति में परिवर्तन का आकलन करके ग्राफ्ट मार्जिन निर्धारित किए गए थे। प्रत्येक छवि में, न्यूएन+ और एचएनए+ कोशिकाओं की कुल संख्या को उसी क्षेत्र में न्यूएन+ कोशिकाओं की कुल संख्या से विभाजित किया गया था। यह सुनिश्चित करने के लिए कि केवल छवि तल में नाभिक वाली कोशिकाओं की गणना की जाती है, केवल वे कोशिकाएँ जो होचस्ट+ भी हैं, गणना में शामिल की जाती हैं। सांख्यिकीय त्रुटि को कम करने के लिए कम से कम 1 मिमी से अलग की गई दो छवियों का औसत निकाला गया।
नमूना संग्रह से एक सप्ताह पहले, hCO प्रत्यारोपित जानवरों (लगभग 8 महीने के विभेदन) को एक अंधेरे कमरे में रखें, जिसमें संवेदी उत्तेजना को कम करने के लिए मूंछें काटी गई हों। नाभिक का अलगाव पहले बताए गए तरीके से किया गया था, कुछ संशोधनों के साथ। संक्षेप में, t-hCO और hCO को डिटर्जेंट-मैकेनिकल सेल लिसिस और 2 मिली ग्लास टिशू ग्राइंडर (D8938, सिग्मा-एल्ड्रिच/किम्बल) का उपयोग करके नष्ट कर दिया गया। फिर कच्चे नाभिक को 40 µm फ़िल्टर का उपयोग करके फ़िल्टर किया गया और सुक्रोज घनत्व ढाल करने से पहले 4 °C पर 10 मिनट के लिए 320 ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज किया गया। सेंट्रीफ्यूजेशन चरण (4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए 320 ग्राम) के बाद, नमूनों को 0.04% बीएसए/पीबीएस में 0.2 यूनिट µl-1 आरएनेज अवरोधक (40 यू µl-1, एएम2682, एम्बियन) के साथ फिर से निलंबित कर दिया गया और 40 µm प्रवाह फिल्टर से गुजारा गया। अलग हुए नाभिक को फिर 0.02% बीएसए युक्त पीबीएस में फिर से निलंबित कर दिया गया और क्रोमियम सिंगल सेल 3′ चिप पर लोड किया गया (प्रति लेन 8,000 कोशिकाओं की अनुमानित वसूली)। snRNA-seq लाइब्रेरीज़ को क्रोमियम सिंगल सेल 3′ GEM, लाइब्रेरी और जेल बीड किट v3 (10x जीनोमिक्स) के साथ तैयार किया गया था। snRNA-seq लाइब्रेरीज़ को क्रोमियम सिंगल सेल 3′ GEM, लाइब्रेरी और जेल बीड किट v3 (10x जीनोमिक्स) के साथ तैयार किया गया था। अधिक पढ़ें एसएनआरएनए-सीक लाइब्रेरी क्रोमियम सिंगल सेल 3′ जीईएम, लाइब्रेरी और जेल बीड किट v3 (10x जीनोमिक्स) का उपयोग करके तैयार की गई थी। एसएनआरएनए-एसईक्यू क्रोमियम सिंगल सेल 3' जीईएम, लाइब्रेरी और जेल बीड किट वी3 (10x जीनोमिक्स) का उपयोग करता है। एसएनआरएनए-एसईक्यू क्रोमियम सिंगल सेल 3' जीईएम, लाइब्रेरी और जेल बीड किट वी3 (10x जीनोमिक्स) का उपयोग करता है। Библиотеку snRNA-seq готовили с использованием क्रोमियम सिंगल सेल 3' जीईएम, लाइब्रेरी और जेल बीड किट v3 (10x जीनोमिक्स)। एसएनआरएनए-सीक लाइब्रेरी को क्रोमियम सिंगल सेल 3′ जीईएम, लाइब्रेरी और जेल बीड किट v3 (10x जीनोमिक्स) का उपयोग करके तैयार किया गया था।एडमेरा हेल्थ द्वारा नोवासेक एस4 (इलुमिना) पर विभिन्न नमूनों से प्राप्त लाइब्रेरी को एकत्रित किया गया और अनुक्रमित किया गया।
प्रत्येक संभावित परमाणु बारकोड के लिए जीन अभिव्यक्ति स्तरों को 10x जीनोमिक्स सेलरेंजर विश्लेषण सॉफ्टवेयर पैकेज (संस्करण 6.1.2) का उपयोग करके परिमाणित किया गया था। विशेष रूप से, रीड्स को मानव (GRCh38, एनसेंबल, संस्करण 98) और चूहे (Rnor_6.0, एनसेंबल, संस्करण 100) संदर्भ जीनोम के संयोजन के साथ मिलान किया गया था, जिसे mkref कमांड के साथ बनाया गया था और –include-introns=TRUE कमांड के साथ गिनती का उपयोग करके इंट्रॉन क्षेत्रों में मैप किए गए रीडिंग को परिमाणित किया गया था। टी-एचसीओ नमूनों के लिए, मानव नाभिक की पहचान रूढ़िवादी आवश्यकता के आधार पर की गई थी कि सभी मैप किए गए रीड्स में से कम से कम 95% मानव जीनोम से मेल खाते हों। सभी बाद के विश्लेषण सेलरेंजर से फ़िल्टर किए गए बारकोड सरणी आउटपुट पर आर पैकेज (संस्करण 4.1.2) सेरात (संस्करण 4.1.1)32 का उपयोग करके किए गए थे।
यह सुनिश्चित करने के लिए कि बाद के विश्लेषण में केवल उच्च गुणवत्ता वाले नाभिक ही शामिल किए जाएं, प्रत्येक नमूने के लिए एक पुनरावृत्त फ़िल्टरिंग प्रक्रिया लागू की गई। सबसे पहले, 1000 से कम अद्वितीय जीन वाले कम गुणवत्ता वाले नाभिक और कुल माइटोकॉन्ड्रिया के 20% से अधिक की पहचान की गई और उन्हें हटा दिया गया। इसके बाद, sctransform(vst.flavor=”v2″) फ़ंक्शन का उपयोग करके नियमित नकारात्मक द्विपद प्रतिगमन द्वारा कच्चे जीन संख्या मैट्रिक्स को सामान्यीकृत किया गया, जिसने डिफ़ॉल्ट मापदंडों का उपयोग करके 3000 सबसे अधिक परिवर्तनशील जीन की भी पहचान की। 30 के डेटा सेट आयाम का उपयोग करके डिफ़ॉल्ट मापदंडों के साथ प्रिंसिपल कंपोनेंट एनालिसिस (PCA) का उपयोग करके ऊपरी परिवर्तनशील जीन पर आयाम में कमी की गई (घुटने के स्थानों के दृश्य निरीक्षण के आधार पर आयाम = 30 चुना गया था और सभी नमूनों और समूह विश्लेषणों के लिए उपयोग किया गया था)। फिर हमने असामान्य रूप से कम जीन गणना (10वें प्रतिशत से नीचे का माध्य), असामान्य रूप से उच्च माइटोकॉन्ड्रियल जीन गणना (95वें प्रतिशत से ऊपर का माध्य) के आधार पर जीन को वर्गीकृत करने के लिए पुनरावृत्त क्लस्टरिंग (रिज़ॉल्यूशन = 1) के कई दौर किए ताकि निम्न गुणवत्ता वाले संभावित कोशिकाओं की पहचान की जा सके और उन्हें हटाया जा सके। डबल्टफाइंडर33 पैकेज (95वें प्रतिशत से ऊपर का माध्य डबल्टफाइंडर स्कोर) का उपयोग करके पहचाने गए संदिग्ध जुड़वां बच्चों का उच्च अनुपात। t-hCO नमूने (n=3) और hCO नमूने (n=3) उपरोक्त मापदंडों के साथ इंटीग्रेटडेटा फ़ंक्शन का उपयोग करके अलग-अलग एकीकृत किया गया। फिर एकीकृत डेटा सेट के गुणात्मक फ़िल्टरिंग का एक और दौर ऊपर वर्णित अनुसार किया गया था।
निम्न गुणवत्ता वाले कर्नेल को हटाने के बाद, एकीकृत डेटासेट को समूहीकृत किया गया (रिज़ॉल्यूशन = 0.5) और UMAP34 विज़ुअलाइज़ेशन उद्देश्यों के लिए एम्बेड किया गया। प्रत्येक क्लस्टर के लिए मार्कर जीन को सामान्यीकृत जीन अभिव्यक्ति डेटा से गणना किए गए डिफ़ॉल्ट मापदंडों के साथ FindMarkers फ़ंक्शन का उपयोग करके निर्धारित किया गया था। हम भ्रूण और वयस्क कॉर्टिकल संदर्भ डेटासेट को मार्कर जीन अभिव्यक्ति 19,20,21,35 और एनोटेशन के साथ जोड़कर प्रमुख सेल वर्गों की पहचान और वर्गीकरण करते हैं। विशेष रूप से, परिसंचारी अग्रदूतों की पहचान MKI67 और TOP2A की अभिव्यक्ति द्वारा की गई थी। प्रोजेनिटर क्लस्टर को माइटोटिक ट्रांसक्रिप्ट की अनुपस्थिति, लेट मेटाफ़ेज़ भ्रूण कॉर्टेक्स में वर्णित मल्टीपोटेंट ग्लियल प्रोजेनिटर क्लस्टर के साथ उच्च ओवरलैप और EGFR और OLIG1 अभिव्यक्ति द्वारा परिभाषित किया गया था। हम एस्ट्रोसाइट शब्द का उपयोग एस्ट्रोसाइट भेदभाव की कई अवस्थाओं को शामिल करने के लिए करते हैं, लेट रेडियल ग्लिया से लेकर एस्ट्रोसाइट्स की परिपक्वता तक। एस्ट्रोसाइट क्लस्टर SLC1A3 और AQP4 के उच्च स्तर को व्यक्त करते हैं और उन्हें भ्रूण के रेडियल ग्लिया और/या वयस्क एस्ट्रोसाइट्स के उपप्रकारों के साथ मैप करते हुए दिखाया गया है। OPCs PDGFRA और SOX10 को व्यक्त करते हैं जबकि ऑलिगोडेंड्रोसाइट्स माइलिनेशन मार्कर (MOG और MYRF) को व्यक्त करते हैं। ग्लूटामेटेरिक न्यूरॉन्स की पहचान न्यूरोनल ट्रांसक्रिप्ट (SYT1 और SNAP25) की उपस्थिति, GABAergic मार्कर (GAD2) की अनुपस्थिति और NEUROD6, SLC17A7, BCL11B या SATB2 की अभिव्यक्ति द्वारा की गई। ग्लूएन न्यूरॉन्स को आगे ऊपरी (SATB2 अभिव्यक्ति और BCL11B की हानि) और गहरे (BCL11B अभिव्यक्ति) उपवर्गों में विभाजित किया गया। पुटेटिव सबप्लेट (SP) न्यूरॉन्स गहरे ग्लूएन मार्करों के अलावा ST18 और SORCS1 जैसे ज्ञात SP18 मार्करों को व्यक्त करते हैं। कोरॉइड प्लेक्सस जैसी कोशिकाओं की पहचान टीटीआर अभिव्यक्ति द्वारा की गई, और मेनिंगियल जैसी कोशिकाओं ने फाइब्रोब्लास्ट-संबंधित जीनों को व्यक्त किया और संदर्भ डेटा सेट की पियाल/संवहनी कोशिकाओं को मैप किया।
t-hCO और hCO उपवर्गों के बीच जीन अभिव्यक्ति का विभेदक विश्लेषण लिब्रा आर पैकेज (संस्करण 1.0.0) का उपयोग करके कार्यान्वित नमूनों में पुनरुत्पादित एक नव विकसित छद्म-बैच विधि का उपयोग करके किया गया था। विशेष रूप से, प्रत्येक नमूना प्रतिकृति के लिए एक दिए गए सेल वर्ग के लिए कोशिकाओं में जीन की संख्या को जोड़कर समूहों के लिए edgeR लॉग-संभावना परीक्षण (संस्करण 3.36.0, पैकेज आर) किए गए थे। हीटमैप विज़ुअलाइज़ेशन के लिए, सामान्यीकृत प्रति मिलियन (CPM) मानों की गणना edgeR (cpm() फ़ंक्शन) का उपयोग करके की जाती है और स्केल किया जाता है (माध्य = 0, मानक विचलन = 1 प्राप्त करने के लिए)। महत्वपूर्ण रूप से अपग्रेड किए गए t-hCO GluN जीन का जीन ऑन्टोलॉजी (GO) संवर्धन विश्लेषण किया गया (बेंजामिनी-होचबर्ग ने 0.05 से कम के P मान को कम से कम 10% t-hCO GluN कोशिकाओं में व्यक्त किया और कम से कम 2 गुना परिवर्तन में वृद्धि)। टॉपजीन सूट (https://toppgene.cchmc.org/) का उपयोग करके प्रदर्शन किया गया37. हम डिफ़ॉल्ट मापदंडों के साथ टॉपफन ऐप का उपयोग करते हैं और GO-एनोटेटेड हाइपरजियोमेट्रिक परीक्षणों से गणना की गई बेंजामिनी-होचबर्ग-सही पी-मानों की रिपोर्ट करते हैं।
प्राथमिक एकल-कोशिका RNA-seq या वयस्क snRNA-seq19,20,21,22 के संदर्भ अध्ययनों से एनोटेट सेल क्लस्टर के साथ हमारे snRNA-seq क्लस्टर का मिलान करने के लिए, हमने एक युग्मित डेटासेट एकीकरण दृष्टिकोण लागू किया। हमने डेटासेट के बीच क्लस्टर ओवरलैप को एकीकृत करने और तुलना करने के लिए Seurat में SCTransform (v2) सामान्यीकरण वर्कफ़्लो का उपयोग किया (ऊपर दिए गए समान मापदंडों का उपयोग करके)। कम्प्यूटेशनल दक्षता के लिए व्यक्तिगत डेटासेट को यादृच्छिक रूप से प्रति मूल क्लस्टर 500 कोशिकाओं या कोर तक उप-समूहित किया गया था। पहले वर्णित समान दृष्टिकोण का उपयोग करते हुए, क्लस्टर ओवरलैप को प्रत्येक पूल किए गए क्लस्टर में कोशिकाओं या नाभिक के अनुपात के रूप में परिभाषित किया गया था जो संदर्भ क्लस्टर के लेबल के साथ ओवरलैप होते थे। GluNs को और अधिक वर्गीकृत करने के लिए, हमने अपने GluN कोशिकाओं को संदर्भ डेटासेट लेबल असाइन करने के लिए GluN सबसेट डेटा के लिए Seurat के TransferData वर्कफ़्लो का उपयोग किया।
टी-एचसीओ और एचसीओ नमूनों के वैश्विक ट्रांसक्रिप्टोम की परिपक्वता स्थिति का आकलन करने के लिए, हमने अपने छद्म-बल्क नमूनों की तुलना ब्रेनस्पैन/साइकएनकोड23 से की, जिसमें मानव मस्तिष्क के विकास में फैले एक बड़े आरएनए अनुक्रम शामिल हैं। हमने गर्भाधान के 10 सप्ताह बाद कॉर्टिकल नमूनों से एक संयुक्त पैटर्न-सामान्यीकृत जीन अभिव्यक्ति मैट्रिक्स पर पीसीए किया और बाद में, 5567 जीनों (हमारे डेटा के साथ) में जिन्हें पहले ब्रेनस्पैन कॉर्टिकल नमूनों में सक्रिय के रूप में पहचाना गया था (एक क्यूबिक मॉडल का उपयोग करके उम्र द्वारा समझाया गया विकासात्मक भिन्नता में 50% से अधिक के रूप में परिभाषित)38। इसके अलावा, हमने पहले वर्णित अनुसार गैर-नकारात्मक मैट्रिक्स फैक्टराइजेशन का उपयोग करके न्यूरोडेवलपमेंट के प्रमुख ट्रांसक्रिप्टोम हस्ताक्षरों से जुड़े जीन प्राप्त किए। गैर-नकारात्मक मैट्रिक्स फैक्टराइजेशन प्रक्रिया का उपयोग करके गणना किए गए नमूना भार को झू एट अल द्वारा वर्णित पांच हस्ताक्षरों में से प्रत्येक के लिए विस्तारित डेटा के साथ चित्र 5 बी में प्लॉट किया गया है। फिर से, गतिविधि पर निर्भर ट्रांसक्रिप्शनल मार्कर पहले से प्रकाशित अध्ययनों से प्राप्त किए गए थे। विशेष रूप से, पूरक तालिका 3 हर्वाटिन एट अल.16 से दृश्य उत्तेजना के बाद माउस विज़ुअल कॉर्टेक्स snRNA-seq संग्रह द्वारा पहचाने गए ग्लूटामेटेरिक न्यूरॉन्स में ERG और LRG काफ़ी हद तक अपग्रेड हुए थे। मानव-समृद्ध LRG को KCl-सक्रिय मानव भ्रूण मस्तिष्क संस्कृतियों से प्राप्त किया गया और उत्तेजना के 6 घंटे बाद काटा गया, और फ़िल्टर किए गए जीन मनुष्यों में काफ़ी हद तक अपग्रेड हुए लेकिन कृन्तकों में नहीं (पूरक तालिका 4)। इन जीन सेटों का उपयोग करके जीन सेट संवर्धन का विश्लेषण एकतरफा फिशर के सटीक परीक्षण का उपयोग करके किया गया था।
आइसोफ्लुरेन से चूहों को बेहोश करें, मस्तिष्क निकालें और ठंडे (लगभग 4°C) ऑक्सीजन युक्त (95% O2 और 5% CO2) सुक्रोज घोल में रखें, जिसके भाग में निम्नलिखित हों: 234 mM सुक्रोज, 11 mM ग्लूकोज, 26 mM NaHCO3, 2.5 mM KCl, 1.25 mM. NaH2PO4, 10 mM MgSO4 और 0.5 mM CaCl2 (लगभग 310 mOsm)। t-hCO युक्त चूहे के मस्तिष्क के कोरोनल भाग (300-400 µm) को पहले बताए गए अनुसार Leica VT1200 वाइब्रेटोम का उपयोग करके बनाया गया था39। फिर खंडों को निरंतर कमरे के तापमान पर ऑक्सीजन युक्त एक सेक्शनिंग चैंबर में स्थानांतरित किया गया, जिसमें 10 mM ग्लूकोज, 26 mM NaHCO3, 2.5 mM KCl, 1.25 mM NaHPO4, 1 mM MgSO4, 2 mM CaCl2 और 126 mM NaCl (298 mOsm) से तैयार aCSF शामिल था। रिकॉर्डिंग से कम से कम 45 मिनट पहले। खंडों को एक डूबे हुए कक्ष में रिकॉर्ड किया गया था जहाँ उन्हें लगातार aCSF (95% O2 और 5% CO2 शीशी) से भरा गया था। सभी डेटा कमरे के तापमान पर रिकॉर्ड किए गए थे। टी-एचसीओ न्यूरॉन्स को 127 मिमी पोटेशियम ग्लूकोनेट, 8 मिमी NaCl, 4 मिमी मैग्नीशियम एटीपी, 0.3 मिमी सोडियम जीटीपी, 10 मिमी HEPES, और 0.6 मिमी EGTA, pH 7.2, KOH (290 mOsm) के साथ समायोजित आंतरिक घोल युक्त घोल से भरे बोरोसिलिकेट ग्लास पिपेट से समाप्त किया गया। ठीक होने के लिए, रिकॉर्डिंग घोल में बायोसाइटिन (0.2%) मिलाया गया।
मल्टीक्लैम्प 700B एम्पलीफायर (मॉलिक्यूलर डिवाइस) और डिजिडेटा 1550B डिजिटाइज़र (मॉलिक्यूलर डिवाइस) का उपयोग करके डेटा प्राप्त किया गया, 2 kHz पर लो-पास फ़िल्टर किया गया, 20 kHz पर डिजिटाइज़ किया गया और क्लैम्पफ़िट (मॉलिक्यूलर डिवाइस), ओरिजिन (ओरिजिनप्रो) का उपयोग करके विश्लेषण किया गया। 2021b, ओरिजिनलैब)। और कस्टम MATLAB फ़ंक्शन (मैथवर्क्स)। जंक्शन क्षमता की गणना JPCalc का उपयोग करके की गई थी और प्रविष्टियों को -14 mV के परिकलित मान पर समायोजित किया गया था। ऑपरेशन IV में -250 से 750 pA तक 10-25 pA चरणों में वर्तमान चरणों की एक श्रृंखला शामिल है।
जैसा कि पहले बताया गया है, थैलेमस, श्वेत पदार्थ और S1 अभिवाही को hCO न्यूरॉन्स की पैच-क्लैंप रिकॉर्डिंग के दौरान थैलेमोकॉर्टिकल स्लाइस में विद्युत रूप से उत्तेजित किया गया था। संक्षेप में, मस्तिष्क को 10° कोण पर झुकाए गए 3D प्रिंटिंग टेबल पर रखा गया था, और मस्तिष्क के सामने के हिस्से को 35° कोण पर काटा गया था। फिर मस्तिष्क को कटी हुई सतह पर चिपका दिया गया और थैलेमोकॉर्टिकल उभरे हुए अक्षतंतुओं को संरक्षित करते हुए उसे काट दिया गया। द्विध्रुवीय टंगस्टन इलेक्ट्रोड (0.5 MΩ) को दूसरे माइक्रोमैनिपुलेटर पर लगाया गया और प्रति कोशिका चार क्षेत्रों (आंतरिक कैप्सूल, श्वेत पदार्थ, S1 और hCO) को उत्तेजित करने के लिए रणनीतिक रूप से तैनात किया गया। 0.03–0.1 हर्ट्ज पर 300 µA चरणीय उत्तेजना के बाद सिनैप्टिक प्रतिक्रियाओं को रिकॉर्ड करें।
hChR2-एक्सप्रेसिंग hCO न्यूरॉन्स को 480 एनएम पर सक्रिय किया गया और कोशिकाओं के पास hChR2 अभिव्यक्ति को रिकॉर्ड करने के लिए एक ×40 ऑब्जेक्टिव (0.9 NA; ओलंपस) के माध्यम से एक LED (प्रिज्मैटिक्स) द्वारा उत्पन्न प्रकाश पल्स को लागू किया गया। प्रबुद्ध क्षेत्र का व्यास लगभग 0.5 मिमी है और कुल शक्ति 10-20 mW है। पल्स की चौड़ाई 10 ms पर सेट की गई थी, जो व्यवहारिक सीखने के प्रयोग के दौरान दिए गए पल्स से मेल खाती है। 1 से 20 हर्ट्ज तक विभिन्न उत्तेजना आवृत्तियों का उपयोग किया गया था, लेकिन श्रृंखला के केवल पहले पल्स का उपयोग मात्रा निर्धारण के लिए किया गया था। सिनैप्टिक निरोधात्मक या सुगम मार्गों पर प्रभाव को कम करने के लिए ट्रेनों के बीच अंतराल आमतौर पर 30 सेकंड से अधिक लंबा होता है। यह जांचने के लिए कि क्या hChR2 प्रतिक्रिया मोनोसिनैप्टिक थी, हमने EPSC प्रतिक्रिया के गायब होने तक बाथ पर TTX (1 μM) लगाया और फिर 4-एमिनोपाइरीडीन (4-AP; 100 μM) लगाया। आमतौर पर, कुछ ही मिनटों में प्रतिक्रिया वापस आ जाती है, जिसमें LED फायरिंग और EPSC जेनरेशन के बीच थोड़ी अधिक देरी होती है। NBQX (10 μM) का उपयोग यह जांचने के लिए किया गया था कि क्या प्रतिक्रिया AMPA रिसेप्टर्स द्वारा संचालित होती है।
जैसा कि पहले बताया गया है, तीखे hCO सेक्शन बनाए गए। संक्षेप में, hCO सेक्शन को 4% एगरोज़ में एम्बेड किया गया और 126 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM NaH2PO4, 1 mM MgSO4, 2 mM CaCl2, 26 mM NaHCO3 और 10 mM d-(+) -ग्लूकोज युक्त कोशिकाओं में स्थानांतरित किया गया। सेक्शन को कमरे के तापमान पर 200-300 µm पर Leica VT1200 वाइब्रेटर का उपयोग करके काटा गया और कमरे के तापमान पर ASF में संग्रहीत किया गया। फिर, एक डायरेक्ट स्लाइसस्कोप माइक्रोस्कोप (साइंटिफिका) के तहत hCO सेक्शन पर पूरी कोशिकाओं की पैच-कैंप रिकॉर्डिंग की गई। सेक्शन को aCSF (95% O2 और 5% CO2) से भरा गया और कमरे के तापमान पर सेल सिग्नल रिकॉर्ड किए गए। hCO न्यूरॉन्स को 127 mM पोटेशियम ग्लूकोनेट, 8 mM NaCl, 4 mM मैग्नीशियम ATP, 0.3 mM सोडियम GTP, 10 mM HEPES, और 0.6 mM EGTA युक्त घोल से भरे बोरोसिलिकेट ग्लास पिपेट का उपयोग करके लगाया गया, आंतरिक pH 7, 2, KOH (ऑस्मोलैरिटी 290) के साथ समायोजित किया गया। रिकवरी उद्देश्यों के लिए, आंतरिक घोल में 0.2% बायोसाइटिन मिलाएं।
क्लैम्पेक्स (क्लैम्पेक्स 11.1, मॉलिक्यूलर डिवाइसेस) द्वारा मल्टीक्लैम्प 700बी एम्प्लीफायर (मॉलिक्यूलर डिवाइसेस) और डिजिडेटा 1550बी डिजिटाइज़र (मॉलिक्यूलर डिवाइसेस) का उपयोग करके डेटा प्राप्त किया गया, 2 kHz पर लो-पास फ़िल्टर किया गया, 20 kHz पर डिजिटाइज़ किया गया और विश्लेषण के लिए क्लैम्पफ़िट (संस्करण 10.6) का उपयोग करके विश्लेषण किया गया, मॉलिक्यूलर डिवाइसेस) और कस्टम MATLAB फ़ंक्शन (MATLAB 2019b, मैथवर्क्स)। जंक्शन क्षमता की गणना JPCalc का उपयोग करके की गई और प्रविष्टियों को -14 mV की गणना की गई जंक्शन क्षमता में समायोजित किया गया। ऑपरेशन IV में -50 से 250 pA तक 5-10 pA चरणों में वर्तमान चरणों की एक श्रृंखला शामिल है।
पिंच किए गए न्यूरॉन्स के रूपात्मक पुनर्निर्माण के लिए, आंतरिक घोल में 0.2% बायोसाइटिन (सिग्मा-एल्ड्रिच) मिलाया गया। हैकिंग के बाद कम से कम 15 मिनट के लिए कोशिकाओं को प्राइम किया जाता है। फिर पिपेट को धीरे-धीरे 1-2 मिनट के लिए अंदर खींचा जाता है जब तक कि पंजीकृत झिल्ली पूरी तरह से सील न हो जाए। सेक्शन फिजियोलॉजी प्रक्रिया के बाद, सेक्शन को 4% PFA में 4° C पर रात भर स्थिर किया गया, PBS X3 से धोया गया, और स्ट्रेप्टाविडिन-संयुग्मित डाइलाइट 549 या डाइलाइट 405 (वेक्टर लैब्स) के साथ 1:1000 पतला किया गया। बायोसाइटिन (2%; सिग्मा-एल्ड्रिच) से भरी कोशिकाओं को 2 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर पैच क्लैंप रिकॉर्डिंग के दौरान लेबल किया गया। फिर एक्वामाउंट (थर्मो साइंटिफिक) का उपयोग करके माइक्रोस्कोपी स्लाइड पर सेक्शन लगाए गए और अगले दिन एक तेल विसर्जन उद्देश्य का उपयोग करके एक लेईका टीसीएस एसपी8 कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप पर एक संख्यात्मक एपर्चर ×40 1.3, आवर्धन ×0.9–1.0, xy के साथ विज़ुअलाइज़ किया गया। नमूना दर लगभग 7 पिक्सेल प्रति माइक्रोन है। 1 µm अंतराल पर Z-स्टैक क्रमिक रूप से प्राप्त किए गए थे, और प्रत्येक न्यूरॉन के पूरे डेंड्रिटिक पेड़ को कवर करने के लिए z-स्टैक मोज़ाइक और लेईका-आधारित ऑटो-सिलाई का प्रदर्शन किया गया था। फिर न्यूट्यूब 40 इंटरफ़ेस का उपयोग करके न्यूरॉन्स को अर्ध-मैन्युअल रूप से ट्रैक किया गया और SWC फ़ाइलें बनाई गईं। फिर फ़ाइलों को SimpleNeuriteTracer41 फिजी प्लगइन (ImageJ, संस्करण 2.1.0; NIH) पर अपलोड किया गया।
स्टैनफोर्ड विश्वविद्यालय के संस्थागत समीक्षा बोर्ड द्वारा अनुमोदित प्रोटोकॉल के अनुसार सूचित सहमति से मानव कॉर्टिकल ऊतक प्राप्त किया गया था। मानव प्रसवोत्तर ऊतक (3 और 18 वर्ष पुराने) के दो नमूने दुर्दम्य मिर्गी के लिए सर्जरी के भाग के रूप में ललाट प्रांतस्था (मध्य ललाट गाइरस) के उच्छेदन द्वारा प्राप्त किए गए थे। उच्छेदन के बाद, बर्फ़-ठंडे NMDG-aCSF में ऊतक को काटें जिसमें निम्न शामिल हैं: 92 mM NMDG, 2.5 mM KCl, 1.25 mM NaH2PO4, 30 mM NaHCO3, 20 mM HEPES, 25 mM ग्लूकोज, 2 mM थायोयूरिया, 5 mM सोडियम एस्कॉर्बेट, 3 mM सोडियम पाइरूवेट, 0.5 mM CaCl2 4H2O और 10 mM MgSO4 7H2O। सांद्र हाइड्रोक्लोरिक एसिड के साथ pH 7.3-7.4 तक टाइट्रेट करें। ऊतकों को 30 मिनट के भीतर प्रयोगशाला में पहुंचा दिया गया और ऊपर वर्णित प्रक्रिया के अनुसार कोरोनल सेक्शन लिए गए।
सभी पशु प्रक्रियाएं स्टैनफोर्ड विश्वविद्यालय APLAC-अनुमोदित पशु देखभाल दिशानिर्देशों के अनुसार की गईं। चूहों (प्रत्यारोपण के 140 दिन से अधिक समय बाद) को 5% आइसोफ्लुरेन एनेस्थीसिया दिया गया और ऑपरेशन के दौरान 1-3% आइसोफ्लुरेन से एनेस्थेटाइज किया गया। जानवरों को एक स्टीरियोटैक्सिक फ्रेम (कोपफ) में रखा गया और निरंतर रिलीज ब्यूप्रेनॉर्फिन (एसआर) को चमड़े के नीचे इंजेक्ट किया गया। खोपड़ी को उजागर किया जाता है, साफ किया जाता है और 3-5 हड्डी के पेंच डाले जाते हैं। टी-एचसीओ को लक्षित करने के लिए, हमने एमआरआई छवियों से स्टीरियोटैक्सिक निर्देशांक उत्पन्न किए। रुचि के स्थान पर एक गड़गड़ाहट छेद ड्रिल किया गया और फाइबर (400 µm व्यास, NA 0.48, डोरिक) को hCO सतह से 100 µm नीचे उतारा गया और UV-इलाज योग्य डेंटल सीमेंट (रेलेक्स) के साथ खोपड़ी में सुरक्षित किया गया।
फाइबर फोटोमेट्रिक रिकॉर्डिंग पहले बताए गए तरीके से की गई42। स्वतःस्फूर्त गतिविधि को रिकॉर्ड करने के लिए, चूहों को एक साफ पिंजरे में रखा गया और एक 400 µm व्यास के फाइबर ऑप्टिक पैच केबल (डोरिक) को फाइबर ऑप्टिक फोटोमेट्रिक डेटा अधिग्रहण प्रणाली से जोड़ा गया और प्रत्यारोपित फाइबर ऑप्टिक केबल से जोड़ा गया। मोटर गतिविधि की 10 मिनट की रिकॉर्डिंग के दौरान, जानवर पिंजरे का पता लगाने के लिए स्वतंत्र थे। प्रेरित गतिविधि को रिकॉर्ड करने के लिए, चूहों (प्रत्यारोपण के 140 दिनों से अधिक) को प्रेरण के लिए 5% आइसोफ्लुरेन और रखरखाव के लिए 1-3% आइसोफ्लुरेन के साथ एनेस्थेटाइज किया गया था। जानवर को एक स्टीरियोटैक्टिक फ्रेम (कोपफ) में रखें और टी-एचसीओ के विपरीत तरफ मूंछों को लगभग 2 सेमी तक ट्रिम किया जाता है और एक पीजोइलेक्ट्रिक एक्ट्यूएटर (पीआई) से जुड़ी जाली से गुजारा जाता है। एक 400 µm फाइबर ऑप्टिक पैच केबल (डोरिक) को प्रत्यारोपित फाइबर से जोड़ा गया और डेटा अधिग्रहण प्रणाली से जोड़ा गया। फिर t-hCO के विपरीत दिशा में मूंछों को 20 मिनट की रिकॉर्डिंग अवधि में पीजोइलेक्ट्रिक ड्राइव द्वारा यादृच्छिक समय पर 50 बार (20 हर्ट्ज पर 2 मिमी, 2 सेकंड प्रति प्रस्तुति) विक्षेपित किया गया। कस्टम MATLAB कोड के साथ विक्षेपण समय को नियंत्रित करने के लिए Arduino MATLAB सहायता पैकेज का उपयोग करें। ट्रांजिस्टर-ट्रांजिस्टर लॉजिक (TTL) पल्स का उपयोग करके डेटा अधिग्रहण सॉफ़्टवेयर के साथ घटनाओं को सिंक्रनाइज़ किया जाता है।
चूहों (प्रत्यारोपण के 140 दिन से अधिक समय बाद) को 5% आइसोफ्लुरेन एनेस्थीसिया दिया गया और ऑपरेशन के दौरान 1-3% आइसोफ्लुरेन से एनेस्थेटाइज किया गया। जानवरों को एक स्टीरियोटैक्सिक फ्रेम (कोपफ) में रखा गया और ब्यूप्रेनॉर्फिन एसआर और डेक्सामेथासोन को चमड़े के नीचे इंजेक्ट किया गया। खोपड़ी को उजागर किया जाता है, साफ किया जाता है और 3-5 हड्डी के पेंच डाले जाते हैं। टी-एचसीओ को लक्षित करने के लिए, हमने एमआरआई छवियों से स्टीरियोटैक्सिक निर्देशांक उत्पन्न किए। प्रत्यारोपित एचसीओ के ठीक ऊपर एक उच्च गति ड्रिल के साथ एक गोलाकार क्रैनियोटॉमी (लगभग 1 सेमी व्यास) किया गया था। एक बार जब हड्डी यथासंभव पतली हो जाती है, लेकिन पूरी हड्डी के माध्यम से ड्रिलिंग करने से पहले, अंतर्निहित टी-एचसीओ को प्रकट करने के लिए शेष बरकरार पेल्विक डिस्क को हटाने के लिए संदंश का उपयोग करें। क्रैनियोटॉमी को स्टेराइल सलाइन से भर दिया गया था, और एक कवरस्लिप और एक विशेष हेड पिन को यूवी-क्योर डेंटल सीमेंट (रिलीक्स) के साथ खोपड़ी से जोड़ा गया था।
निकॉन LWD (×16, 0.8 NA) ऑब्जेक्टिव के साथ ब्रूकर मल्टीफ़ोटॉन माइक्रोस्कोप का उपयोग करके दो-फ़ोटॉन इमेजिंग की गई। GCaMP6 इमेजिंग 920 nm पर 1.4x सिंगल z-प्लेन आवर्धन और 8x औसत 7.5 fps के साथ की गई। चूहों को 5% आइसोफ्लुरेन एनेस्थीसिया के साथ प्रेरित किया गया और 1-3% आइसोफ्लुरेन के साथ बनाए रखा गया। चूहों को एक कस्टम मेड हेड फ़िक्स्चर में रखा गया और लेंस के नीचे रखा गया। मोटर गतिविधि की 3 मिनट की पृष्ठभूमि रिकॉर्डिंग प्राप्त की गई। 20 मिनट की रिकॉर्डिंग के दौरान, 50 पफ (प्रत्येक प्रस्तुति 100 ms लंबी) को पिकोसप्राइसर का उपयोग करके t-hCO के विपरीत व्हिस्कर पैड पर बेतरतीब ढंग से वितरित किया गया। कस्टम MATLAB कोड के साथ बर्स्ट समय को नियंत्रित करने के लिए Arduino MATLAB सहायता पैकेज का उपयोग करें। TTL पल्स का उपयोग करके डेटा अधिग्रहण सॉफ़्टवेयर (PrairieView 5.5) के साथ ईवेंट को सिंक्रनाइज़ करें। विश्लेषण के लिए, फिजी में शुरू किए गए MoCo कार्यक्रम में एफ़िन सुधार का उपयोग करके छवियों को xy गति के लिए सही किया गया था। CNMF-E43 का उपयोग करके व्यक्तिगत कोशिकाओं से फ्लोरोसेंट ट्रेस का निष्कर्षण। रुचि के प्रत्येक क्षेत्र के लिए प्रतिदीप्ति को निकाला गया, dF/F वक्रों में परिवर्तित किया गया, और फिर z-स्कोर में परिवर्तित किया गया।
चूहों (प्रत्यारोपण के 140 दिनों से अधिक बाद) को 5% आइसोफ्लुरेन एनेस्थीसिया दिया गया और ऑपरेशन के दौरान 1-3% आइसोफ्लुरेन से एनेस्थेटाइज किया गया। जानवरों को एक स्टीरियोटैक्सिक फ्रेम (कोपफ) में रखा गया और ब्यूप्रेनॉर्फिन एसआर और डेक्सामेथासोन को चमड़े के नीचे इंजेक्ट किया गया। टी-एचसीओ के विपरीत तरफ की मूंछों को लगभग 2 सेमी तक काटा गया और एक पीजोइलेक्ट्रिक एक्ट्यूएटर से जुड़ी जाली के माध्यम से पिरोया गया। खोपड़ी को उजागर किया गया और साफ किया गया। खोपड़ी से एक स्टेनलेस स्टील का ग्राउंड स्क्रू जुड़ा हुआ है। टी-एचसीओ को लक्षित करने के लिए, हमने एमआरआई छवियों से स्टीरियोटैक्सिक निर्देशांक उत्पन्न किए। टी-एचसीओ के ठीक ऊपर एक उच्च गति ड्रिल के साथ एक गोलाकार क्रैनियोटॉमी (लगभग 1 सेमी व्यास) करें। व्यक्तिगत कोशिकाओं को 32-चैनल या 64-चैनल उच्च घनत्व वाले सिलिकॉन जांच (कैम्ब्रिज न्यूरोटेक) का उपयोग करके रिकॉर्ड किया गया था, जो ग्राउंड स्क्रू से जुड़े थे और आरएचडी एम्पलीफायरों (इंटान) के साथ पूर्व-प्रवर्धित थे। क्रैनियोटॉमी के माध्यम से लक्ष्य साइट पर इलेक्ट्रोड को कम करने के लिए मैनिपुलेटर का उपयोग करें, जो बाँझ खारा से भरा हुआ है। ओपन एफिस डेटा अधिग्रहण प्रणाली का उपयोग करके 30 kHz की आवृत्ति पर डेटा संग्रह किया गया था। रिकॉर्डिंग केवल तब जारी रही जब हमने 10 से अधिक चैनलों में अत्यधिक सहसंबद्ध लयबद्ध सहज गतिविधि का पता लगाया, यह सुझाव देते हुए कि इलेक्ट्रोड ग्राफ्ट में स्थित थे (दो-फोटोन कैल्शियम इमेजिंग डेटा के आधार पर)। मोटर गतिविधि की 10 मिनट की पृष्ठभूमि रिकॉर्डिंग प्राप्त की गई थी। टी-एचसीओ के विपरीत तरफ मूंछों को 20 मिनट की रिकॉर्डिंग अवधि में एक पीजोइलेक्ट्रिक ड्राइव द्वारा यादृच्छिक समय पर 50 बार (20 हर्ट्ज पर 2 मिमी, प्रति प्रस्तुति 2 एस) विक्षेपित किया गया था। Arduino के लिए MATLAB सपोर्ट पैकेज (MATLAB 2019b) का उपयोग करके, कस्टम MATLAB कोड के साथ विक्षेपण समय को नियंत्रित करें। डेटा अधिग्रहण सॉफ़्टवेयर के साथ ईवेंट को सिंक्रनाइज़ करने के लिए TTL पल्स का उपयोग करें।
ऑप्टिकल मार्किंग प्रयोगों के लिए, 473 एनएम लेजर (ओमिक्रॉन) से जुड़ा 200 µm ऑप्टिकल पैच कॉर्ड (डोरिक) क्रैनियोटॉमी पर रखे 200 µm ऑप्टिकल फाइबर से जुड़ा था। इसके तुरंत पहले, जम्पर पावर को 20 mW पर समायोजित करें। क्रैनियोटॉमी के माध्यम से इलेक्ट्रोड को लक्ष्य स्थल तक नीचे लाने के लिए मैनिपुलेटर का उपयोग करें, जो बाँझ खारा से भरा हुआ है। रिकॉर्डिंग की शुरुआत में, प्रकाश के दस पल्स 473 एनएम (आवृत्ति 2 हर्ट्ज, पल्स अवधि 10 एमएस) उत्सर्जित किए गए थे। प्रकाश संवेदनशील कोशिकाओं को उन कोशिकाओं के रूप में परिभाषित किया गया था जो 70% या उससे अधिक परीक्षणों में प्रकाश के 10 एमएस के भीतर स्पाइक प्रतिक्रिया प्रदर्शित करती थीं।