Grazie per aver visitato Nature.com. Stai utilizzando una versione del browser con supporto CSS limitato. Per un'esperienza ottimale, ti consigliamo di utilizzare un browser aggiornato (o di disattivare la modalità di compatibilità in Internet Explorer). Inoltre, per garantire un supporto continuo, mostriamo il sito senza stili e JavaScript.
Visualizza un carosello di tre diapositive contemporaneamente. Utilizza i pulsanti Precedente e Successivo per scorrere tre diapositive alla volta, oppure utilizza i pulsanti di scorrimento alla fine per scorrere tre diapositive alla volta.
Gli organelli neurali autoassemblanti rappresentano una promettente piattaforma in vitro per la modellazione dello sviluppo e delle patologie umane. Tuttavia, gli organoidi sono privi della connettività presente in vivo, il che ne limita la maturazione e impedisce l'integrazione con altri circuiti che controllano il comportamento. Qui dimostriamo che organoidi corticali derivati ​​da cellule staminali umane, trapiantati nella corteccia somatosensoriale di ratti nudi neonati, sviluppano tipi cellulari maturi che si integrano nei circuiti sensoriali e motivazionali. La risonanza magnetica (MRI) ha rivelato la crescita degli organoidi post-trapianto in diverse linee di cellule staminali e in diversi animali, mentre l'analisi a singolo nucleo ha rivelato la progressione della corticogenesi e l'emergere di un programma di trascrizione dipendente dall'attività. Infatti, i neuroni corticali trapiantati presentano proprietà morfologiche, sinaptiche e di membrana interna più complesse rispetto alle loro controparti in vitro, consentendo l'individuazione di difetti neuronali nei pazienti con sindrome di Timothy. Tracciati anatomici e funzionali hanno dimostrato che gli organelli trapiantati ricevono input talamocorticali e corticocorticali, e le registrazioni in vivo dell'attività neurale suggeriscono che questi input possano generare risposte sensoriali nelle cellule umane. Infine, gli organoidi corticali estendono gli assoni in tutto il cervello di ratto e la loro attivazione optogenetica induce comportamenti di ricerca di ricompensa. Pertanto, i neuroni corticali umani trapiantati maturano e partecipano ai circuiti dell'ospite che controllano il comportamento. Ci aspettiamo che questo approccio faciliti l'individuazione di fenotipi a livello di filamento nelle cellule derivate dal paziente che non possono essere rilevati con altri mezzi.
Lo sviluppo del cervello umano è un notevole processo di auto-organizzazione in cui le cellule proliferano, si differenziano, migrano e si connettono per formare circuiti neuronali funzionali che vengono ulteriormente perfezionati attraverso l'esperienza sensoriale. Un problema chiave nella comprensione dello sviluppo del cervello umano, soprattutto nel contesto delle patologie, è la mancanza di accesso al tessuto cerebrale. Gli organelli auto-organizzanti, inclusi gli organoidi della corteccia umana (hCO; noti anche come sfere della corteccia umana), possono generare 2, 3, 4, 5, 6. Tuttavia, diverse limitazioni ne limitano l'applicazione più ampia alla comprensione dello sviluppo e del funzionamento dei circuiti neurali. In particolare, non è chiaro se la maturazione dell'hCO sia limitata dall'assenza di determinati input microambientali e sensoriali presenti in vivo. Inoltre, poiché gli hCO non sono integrati in circuiti in grado di generare esiti comportamentali, la loro utilità nella modellazione di disturbi neuropsichiatrici geneticamente complessi e comportamentali è attualmente limitata.
Il trapianto di hCO in un cervello vivente intatto può superare queste limitazioni. Studi precedenti hanno dimostrato che i neuroni umani trapiantati nella corteccia di roditori sono in grado di sopravvivere, proiettare e comunicare con le cellule di roditori7,8,9,10,11,12. Tuttavia, questi esperimenti vengono solitamente eseguiti su animali adulti, il che può limitare l'integrazione sinaptica e assonale. Qui descriviamo un paradigma di trapianto in cui abbiamo trapiantato hCO 3D derivato da cellule hiPS nella corteccia somatosensoriale primaria (S1) di ratti immunodeficienti in una fase precoce dello sviluppo plastico. I neuroni hCO trapiantati (t-hCO) subiscono una maturazione sostanziale, ricevono input talamocorticali e cortico-corticali che suscitano risposte sensoriali ed estendono proiezioni assonali nel cervello di ratto per indurre comportamenti di ricerca di ricompensa. La maturazione prolungata di t-hCO ha rivelato difetti neuronali nei pazienti affetti dalla sindrome di Timothy (TS), una grave malattia genetica causata da mutazioni nel canale del calcio CaV1.2 di tipo L, sensibile al voltaggio (codificato da CACNA1C).
Per studiare i neuroni corticali umani nei circuiti in vivo, abbiamo trapiantato stereotassicamente hCO3 3D intatto in S1 di ratti atimici postnatali precoci (3-7 giorni dopo la nascita) (Fig. 1a e dati estesi delle Fig. 1a-c). A questo punto, le proiezioni assonali talamocorticali e corticocorticali non hanno ancora completato la loro innervazione S1 (rif. 13). Pertanto, questo approccio è progettato per massimizzare l'integrazione di t-hCO3 minimizzando l'impatto sui circuiti endogeni. Per visualizzare la posizione di t-hCO3 in animali vivi, abbiamo eseguito ricostruzioni cerebrali tramite risonanza magnetica pesata in T2 di ratti 2-3 mesi dopo il trapianto (Fig. 1b e dati estesi, Fig. 1d). La t-hCO è stata osservata facilmente e le misurazioni del volume della t-hCO erano simili a quelle calcolate da fette fisse (dati estesi Fig. 1d,e; P > 0,05). La t-hCO è stata osservata facilmente e le misurazioni del volume della t-hCO erano simili a quelle calcolate da fette fisse (dati estesi Fig. 1d,e; P > 0,05). t-hCO è stato semplicemente realizzato, un'analisi completa di t-hCO è stata realizzata in modo analogico per i test fisici (расширенные данные, рис. 1d, e; P> 0,05). La t-hCO è stata osservata facilmente e le misurazioni volumetriche della t-hCO erano simili a quelle calcolate per le sezioni fisse (dati espansi, Fig. 1d, e; P > 0,05).很容易观察到t-hCO,并且t-hCO的体积测量值与从固定切片计算的测量值相似（扩展数据图1d、e；P > 0.05）.很容易观察到t-hCO,并且t-hCO t-hCO è stato semplicemente creato, un'analisi approfondita di t-hCO è stata realizzata in modo analogico per i test fisici (расширенные данные, рис. 1d, e; P> 0,05). La t-hCO è stata osservata facilmente e le misurazioni volumetriche della t-hCO erano simili a quelle calcolate per le sezioni fisse (dati espansi, Fig. 1d, e; P > 0,05).Abbiamo determinato la t-hCO nell'81% degli animali trapiantati circa 2 mesi dopo il trapianto (n = 72 animali; hCO da 10 linee cellulari hiPS; linee cellulari hiPS nella Tabella Supplementare 1). Di questi, l'87% era localizzato nella corteccia cerebrale (Fig. 1c). Eseguendo scansioni MRI seriali a più punti temporali nello stesso ratto trapiantato, abbiamo riscontrato un aumento di nove volte del volume di t-hCO entro 3 mesi (Fig. 1d e dati espansi, Fig. 1f). Gli animali trapiantati hanno mostrato un alto tasso di sopravvivenza (74%) a 12 mesi dal trapianto (dati espansi, Fig. 1g e Tabella Supplementare 2), e non sono stati riscontrati evidenti deficit motori o di memoria, gliosi o elettroencefalogramma (EEG). Dati Fig. 1g e Tabella Supplementare 2). 1h–m e 3e).
a, Schema del disegno sperimentale. L'hCO3 derivato dalle cellule hiPS è stato trapiantato in S1 di ratti neonati nudi nei giorni 30-60 di differenziazione. b, Immagini MRI coronali e orizzontali pesate in T2 che mostrano t-hCO3 in S1 2 mesi dopo il trapianto. Barra di scala, 2 mm. c, Quantificazione dei tassi di successo dell'attecchimento mostrati per ciascuna linea cellulare hiPS (n = 108, i numeri all'interno delle barre indicano la quantità di t-hCO3 per linea cellulare hIPS) e posizione corticale o sottocorticale (n = 88). d, Immagine MRI di un'arteria coronaria (sinistra; barra di scala, 3 mm) e corrispondente ricostruzione volumetrica 3D (barra di scala, 3 mm) che mostra un aumento di t-hCO3 nell'arco di 3 mesi. e, Revisione dei pattern di t-hCO3 nella corteccia cerebrale del ratto. Barra di scala, 1 mm. f, Immagini immunocitochimiche rappresentative di t-hCO mostrate dall'alto a sinistra a destra (durante la differenziazione): PPP1R17 (4 mesi), NeuN (8 mesi), SOX9 e GFAP (8 mesi), PDGFRα (8 mesi), MAP2 (8 mesi) e IBA1 (8 mesi). Barra di scala, 20 µm. La co-espressione di HNA indica cellule di origine umana. g, snRNA-seq: Imaging di riduzione dimensionale a collettore unificato e proiezione (UMAP) di tutti i nuclei t-hCO di alta qualità dopo integrazione di Seurat (n=3 campioni di t-hCO, n=2 linee cellulari hiPS). Astrociti, cellule della linea astrocitaria; cyc prog, progenitori circolanti; GluN DL, neuroni glutamatergici profondi; GluN DL/SP, neuroni glutamatergici profondi e sottolamellari; GluN UL, neuroni glutamatergici dello strato superiore; oligodendrociti, oligodendrociti; OPC, cellule progenitrici degli oligodendrociti; RELN, neuroni reelin. h, analisi di arricchimento dei termini Gene Ontology (GO) dei geni significativamente sovraregolati (P ​​aggiustato < 0,05, variazione > 2, espressi in almeno il 10% dei nuclei) nei neuroni glutamatergici t-hCO rispetto ai neuroni glutamatergici hCO. h, analisi di arricchimento dei termini Gene Ontology (GO) dei geni significativamente sovraregolati (P ​​aggiustato < 0,05, variazione > 2, espressi in almeno il 10% dei nuclei) nei neuroni glutamatergici t-hCO rispetto ai neuroni glutamatergici hCO. h, Analisi dei termini dell'analisi Gene Ontology (GO) per i geni con attivazione intelligente (scorrezione P <0,05, qualità modifica > 2, espressione successiva крайней мере в 10% ядер) nei glutammati neuronali t-hCO in abbinamento ai glutammati neuronali hCO. h, analisi di arricchimento dei termini Gene Ontology (GO) per geni con attivazione significativa (P aggiustato < 0,05, variazione > 2, espressione in almeno il 10% dei nuclei) nei neuroni glutamatergici t-hCO rispetto ai neuroni glutamatergici hCO. h, 与hCO 谷氨酸能神经元相比, t-hCO 谷氨酸能神经元中基因显着上调（调整后P < 0,05, 倍数变化> 2,在至少10% 的细胞核中表达）的基因本体论(GO) 术语富集分析. h, 与 hco 谷氨酸 能 元 相比, t-hco 谷氨酸 能 神经 元 基因 显着 上调 （后 后 p <0.05 ， 变化 变化> 2, aumento del 10% 的 核中 表达） 基因 基因 基因 的本体论(GO) 术语富集分析. h, i geni sono attivati ​​(P ​​<0,05, variazione di qualità> 2, l'pressione è aumentata più del 10% in più) in glutamatergico neuronale t-hCO in fase di integrazione con glutamatergico neuronale hCO Analisi ontologica (GO) termine dell'operazione. h, i geni sono stati significativamente sovraregolati (P ​​aggiustato < 0,05, variazione > 2, espressi in almeno il 10% dei nuclei) nei neuroni glutamatergici t-hCO rispetto ai neuroni glutamatergici hCO Analisi ontologica (GO) del termine di arricchimento.La linea tratteggiata indica un valore aq di 0,05. i, Imaging UMAP dei tipi di cellule GluN in t-hCO utilizzando il trasferimento di etichetta da un set di dati di riferimento di 22 snRNA-seq della corteccia motoria adulta. CT: cellule corticotalamiche, ET: cellule extracerebrali, IT: cellule telencefaliche interne, NP: proiezione prossimale.
Abbiamo quindi valutato la citoarchitettura e la composizione cellulare complessiva di t-hCO. La colorazione anticorpale delle cellule endoteliali di ratto ha rivelato vascolarizzazione con t-hCO, mentre la colorazione con IBA1 ha rivelato la presenza di microglia di ratto in tutto l'innesto (Fig. 1f e dati espansi, Fig. 3c, d). L'immunocolorazione ha rivelato cellule positive all'antigene nucleare umano (HNA) che co-esprimono PPP1R17 (progenitori corticali), NeuN (neuroni), SOX9 e GFAP (cellule derivate dalla glia) o PDGFRα (progenitori degli oligodendrociti) (Figura 1f). Per studiare la composizione cellulare di t-hCO a risoluzione di singola cellula, abbiamo eseguito il sequenziamento di RNA a singolo nucleo (snRNA-seq) dopo circa 8 mesi di differenziamento. La filtrazione in massa e la rimozione dei nuclei di ratto hanno prodotto 21.500 mappe mononucleari umane di alta qualità (Fig. 1g e dati espansi, Fig. 4a, b). I pattern di espressione di marcatori tipici di tipo cellulare hanno identificato cluster delle principali classi di cellule corticali, tra cui neuroni glutamatergici profondi e superficiali, progenitori circolanti, oligodendrociti e linea cellulare astrocitaria (Fig. 1g, dati espansi, Fig. 4c e Tabella integrativa 3). L'immunocolorazione per SATB2 e CTIP2 ha mostrato che, nonostante la presenza di sottotipi corticali, t-hCO non mostrava una chiara stratificazione anatomica (dati espansi, Fig. 3a). L'snRNA-seq hCO corrispondente allo stadio ha prodotto classi cellulari sostanzialmente simili, con alcune eccezioni, tra cui l'assenza di oligodendrociti e la presenza di neuroni GABAergici, che potrebbero riflettere le condizioni favorevoli in vitro precedentemente riportate per le cellule progenitrici laterali15 (dati espansi, Fig. 4f – i e Tabella supplementare 4). L'analisi dell'espressione genica differenziale ha rivelato differenze significative nei neuroni glutammatergici tra t-hCO e hCO (Tabella supplementare 5), inclusa l'attivazione di gruppi di geni associati alla maturazione neuronale come la segnalazione sinaptica, la localizzazione dendritica e l'attività dei canali voltaggio-dipendenti (Figura 1h e Tabella supplementare 5, tabella 6). Di conseguenza, i neuroni glutammatergici corticali t-hCO hanno mostrato una maturazione trascrizionale accelerata.
Per chiarire se questi cambiamenti trascrizionali in t-hCO fossero correlati a differenze morfologiche tra hCO in vitro e t-hCO in vivo, abbiamo ricostruito hCO e hCO riempiti di biocitina di stadio corrispondente in sezioni acute dopo 7-8 mesi di differenziamento. Neuroni hCO (Fig. 2a). I neuroni t-hCO erano significativamente più grandi, avevano un diametro del soma 1,5 volte superiore, il doppio dei dendriti e un aumento complessivo di sei volte della lunghezza dendritica totale rispetto a hCO in vitro (Fig. 2b). Inoltre, abbiamo osservato una densità significativamente maggiore di spine dendritiche nei neuroni t-hCO rispetto ai neuroni hCO (Fig. 2c). Ciò suggerisce che i neuroni t-hCO subiscono un esteso allungamento e ramificazione dendritica, che, in combinazione con la continua proliferazione cellulare, può contribuire alla crescita intensiva di t-hCO dopo il trapianto (Fig. 1d e Dati estesi Fig. 1f). Ciò ci ha spinto a indagare le proprietà elettrofisiologiche. La capacità di membrana era otto volte superiore (dati espansi, Fig. 8d), il potenziale di membrana a riposo era più iperpolarizzato (circa 20 mV) e l'iniezione di corrente induceva una maggiore frequenza di eccitazione massima nei neuroni t-hCO rispetto ai neuroni hCO. in vitro (Fig. 2d), e), il che è coerente con le caratteristiche morfologiche più ampie e complesse di t-hCO. Inoltre, la frequenza di eventi di corrente postsinaptica eccitatoria spontanea (EPSC) era significativamente più elevata nei neuroni t-hCO (Fig. 2f), suggerendo che l'aumentata densità di spine dendritiche osservata nei neuroni t-hCO fosse associata all'eccitabilità funzionale della sinapsi sessuale. Abbiamo confermato il carattere immaturo dei neuroni hCO in vitro registrando neuroni glutamatergici marcati (dati espansi, Fig. 6a-c).
a, Ricostruzione 3D dei neuroni hCO e t-hCO riempiti di biocitina dopo 8 mesi di differenziazione. b, Quantificazione delle caratteristiche morfologiche (n = 8 neuroni hCO, n = 6 neuroni t-hCO; **P = 0,0084, *P = 0,0179 e ***P < 0,0001). b, Quantificazione delle caratteristiche morfologiche (n = 8 neuroni hCO, n = 6 neuroni t-hCO; **P = 0,0084, *P = 0,0179 e ***P < 0,0001). б, количественная оценка морфологических признаков (n = 8 neuroni hCO, n = 6 neuroni t-hCO; ** P = 0,0084, * P = 0,0179 e *** P <0,0001). b, quantificazione delle caratteristiche morfologiche (n=8 neuroni hCO, n=6 neuroni t-hCO; **P=0,0084, *P=0,0179 e ***P<0,0001). b, n = 8 个hCO 神经元, n = 6 个t-hCO 神经元；**P = 0,0084,*P = 0,0179 和***P < 0,0001）. b, n = 8 个hCO 神经元, n = 6 个t-hCO 神经元；**P = 0,0084,*P = 0,0179 和***P < 0,0001）. б, количественная оценка морфологических признаков (n = 8 neuroni hCO, n = 6 neuroni t-hCO; ** P = 0,0084, * P = 0,0179 e *** P <0,0001). b, quantificazione delle caratteristiche morfologiche (n=8 neuroni hCO, n=6 neuroni t-hCO; **P=0,0084, *P=0,0179 e ***P<0,0001).c, ricostruzione 3D dei rami dendritici di hCO e t-hCO dopo 8 mesi di differenziazione. Gli asterischi rossi indicano le presunte spine dendritiche. Quantificazione della densità delle spine dendritiche (n = 8 neuroni hCO, n = 6 neuroni t-hCO; **P = 0,0092). d, Quantificazione del potenziale di membrana a riposo (n = 25 neuroni hCO, n = 16 neuroni t-hCO; ***P < 0,0001). d, Quantificazione del potenziale di membrana a riposo (n = 25 neuroni hCO, n = 16 neuroni t-hCO; ***P < 0,0001). d, количественная оценка мембранного потенциала покоя (n = 25 neuroni hCO, n = 16 neuroni t-hCO; *** P <0,0001). d, quantificazione del potenziale di membrana a riposo (n = 25 neuroni hCO, n = 16 neuroni t-hCO; ***P < 0,0001). d, 静息膜电位的量化（n = 25 hCO 神经元, n = 16 t-hCO 神经元；***P < 0,0001）. d, 静息膜电位的量化（n = 25 hCO 神经元, n = 16 t-hCO 神经元；***P < 0,0001）. d, количественная оценка мембранного потенциала покоя (n = 25 neuroni hCO, n = 16 neuroni t-hCO; *** P <0,0001). d, quantificazione del potenziale di membrana a riposo (n = 25 neuroni hCO, n = 16 neuroni t-hCO; ***P < 0,0001). e, Potenziale d'azione ripetitivo in hCO e t-hCO indotto da iniezioni di corrente crescenti e quantificazione della frequenza di scarica massima (n = 25 neuroni hCO, n = 16 neuroni t-hCO; ***P < 0,0001). e, Potenziale d'azione ripetitivo in hCO e t-hCO indotto da iniezioni di corrente crescenti e quantificazione della frequenza di scarica massima (n = 25 neuroni hCO, n = 16 neuroni t-hCO; ***P < 0,0001). e, il potenziale di aumento della potenza dell'hCO e del t-hCO è aumentato, e la concentrazione è aumentata scorie massime возбуждения (n = 25 нейронов hCO, n = 16 нейронов t-hCO; *** P <0,0001). e, riattivazione del potenziale d'azione in hCO e t-hCO indotta dall'aumento di corrente e quantificazione della frequenza massima di scarica (n = 25 neuroni hCO, n = 16 neuroni t-hCO; *** P < 0,0001). e, 通过增加电流注入诱导的hCO e t-hCO 重复动作电位放电,以及最大放电率的量化（n = 25 个hCO神经元, n = 16 个t-hCO 神经元；***P < 0,0001）. E, 通过 增加 电流 注入 的 的 hco 和 t-hco 重复 电位 放电 ， 以及 最 大 的 量化 （（n = 25 个 hco神经 ， n = 16 个 t-hco 神经 ； *** p <0,0001）. e, il potenziale di aumento della potenza dell'hCO e del t-hCO è aumentato, e la concentrazione è aumentata оценка максимальной скорости возбуждения (n = 25 neuroni hCO, n = 16 neuroni t-hCO; *** P <0,0001). e, attivazione ripetitiva dei potenziali d'azione hCO e t-hCO indotti dall'aumento dell'apporto di corrente e quantificazione della frequenza massima di attivazione (n = 25 neuroni hCO, n = 16 neuroni t-hCO; *** P < 0,0001). f, EPSC spontanee (sEPSC) nei neuroni hCO e t-hCO a 8 mesi di differenziazione e quantificazione della frequenza degli eventi sinaptici (n = 25 neuroni hCO, n = 17 neuroni t-hCO; ***P < 0,0001). f, EPSC spontanee (sEPSC) nei neuroni hCO e t-hCO a 8 mesi di differenziazione e quantificazione della frequenza degli eventi sinaptici (n = 25 neuroni hCO, n = 17 neuroni t-hCO; ***P < 0,0001). f, EPSC spontaneo (sEPSC) nei neuroni hCO e t-hCO in 8 mesi di differenza e concentrazione di campioni синаптических событий (n = 25 нейронов hCO, n = 17 нейронов t-hCO; ***P <0,0001) . f, EPSC spontanee (sEPSC) nei neuroni hCO e t-hCO a 8 mesi di differenziazione e quantificazione dei tassi di eventi sinaptici (n=25 neuroni hCO, n=17 neuroni t-hCO; ***P<0,0001). f, 分化8 个月时hCO 和t-hCO 神经元中的自发性EPSCs (sEPSCs)，以及突触事件频率的量化（n = 25 hCO神经元, n = 17 t-hCO 神经元；***P < 0,0001） . f, 分化8 个月时hCO 和t-hCO 神经元中的自发性EPSCs (sEPSCs)，以及突触事件频率的量匼（n = 25 hCO神率的量匼（n = 25 hCO 神率的量匼（n = 25hCO P < 0,0001） . f, EPSC spontaneo (sEPSC) nei neuroni hCO e t-hCO in 8 mesi di differenza e concentrazione di campioni синаптических событий (n = 25 нейронов hCO, n = 17 нейронов t-hCO; *** P<0,0001). f, EPSC spontanee (sEPSC) nei neuroni hCO e t-hCO a 8 mesi di differenziazione e quantificazione dei tassi di eventi sinaptici (n = 25 neuroni hCO, n = 17 neuroni t-hCO; *** P<0,0001).Per bf, hCO e t-hCO nella riga 1208-2 sono stati presi dallo stesso lotto di differenziazione mantenuto in parallelo. g, Analisi di arricchimento del set di geni (test esatto di Fisher unilaterale) di geni significativamente sovraregolati (P ​​aggiustato < 0,05, variazione > 2, espressi in almeno il 10% dei nuclei) nei neuroni glutamatergici t-hCO rispetto ai neuroni glutamatergici hCO con set di geni di geni dipendenti dall'attività sia a risposta precoce (ERG) che a risposta tardiva (LRG) identificati da uno studio in vivo sui topi16 e LRG specifici per l'uomo da neuroni in vitro17. g, Analisi di arricchimento del set di geni (test esatto di Fisher unilaterale) di geni significativamente sovraregolati (P ​​aggiustato < 0,05, variazione > 2, espressi in almeno il 10% dei nuclei) nei neuroni glutamatergici t-hCO rispetto ai neuroni glutamatergici hCO con set di geni di geni dipendenti dall'attività sia a risposta precoce (ERG) che a risposta tardiva (LRG) identificati da uno studio in vivo sui topi16 e LRG specifici per l'uomo da neuroni in vitro17. g, analisi dell'attività di Genova (criteri complessivi di pesca) Genova con attivazione intelligente (P <0,05, variazione di qualità > 2, espressione per meno di 10% in più) nei glutammati neuronali t-hCO in fase di valutazione con glutamatergicheskimi нейронами hCO наборы генов как раннего (ERG), так и позднего (LRG) генов, зависящих от активности, identificazione delle apparecchiature in vivo16, e specifici per il ceppo LRG di neuroni in vitro17. g, analisi dell'arricchimento del set di geni (test esatto di Fisher unilaterale) di geni con attivazione significativa (P aggiustato < 0,05, variazione > 2, espressione in almeno il 10% dei nuclei) nei neuroni glutamatergici t-hCO rispetto ai set di neuroni glutamatergici hCO di geni dipendenti dall'attività precoce (ERG) e tardiva (LRG) identificati nei topi in vivo16 e LRG specifici per l'uomo dai neuroni in vitro17. g, t-hCO谷氨酸能神经元与hCO谷氨酸能神经元相比, t -hCO谷氨酸能神经元显着上调（调整后P<0.05, 倍数变化>2,在至少10%的细胞核中表达）的基因集富集分析（单侧F isher精确检验）从体内小鼠研究中鉴定的早期反应(ERG)和晚期反应(LRG) 活性依赖性基因的基因组16 e 体外神经元17 中的人类特异性LRG. g ， t-hco 谷氨酸 神经 元 与 hco 谷氨酸 神经 元 相比 ， t-hco 谷氨酸 神经 元 上调 （调整 后 p <0.05 ， livello> 2, tasso di interesse 10% in meno rispetto a Fisher研究 中 的 早期 反应 反应 反应 和 晚期 反应 反应 (lrg) 活性 基因 的 基因组 16 和 神经元神经元 17 中 中 17 中 17的人类特异性LRG. g, neuroni glutammici t-hCO sono attivi attivi per la protezione dei glutammati нейронами hCO (скорректированный P<0,05, variazione di qualità> 2, non meno del 10% Analisi dell'analisi del livello di gravità (test tonico di pesca) percorso di uscita (ERG) e successivo geni, determinazione dell'attività attiva (LRG), identificazione delle cellule in vivo16 e neuroni in vitro17. LRG, specifico per gli uomini. g, i neuroni glutamatergici t-hCO sono stati significativamente sovraregolati rispetto ai neuroni glutamatergici hCO (P aggiustato < 0,05, variazione > 2, almeno il 10% Analisi di arricchimento genico della risposta precoce (ERG) e della risposta tardiva (test esatto di Fisher unilaterale) geni dipendenti dall'attività di risposta (LRG) identificati nei topi in vivo16 e nei neuroni in vitro.17 LRG specifici per l'uomo.La linea tratteggiata indica un valore di P corretto con Bonferroni di 0,05. h, l'espressione genica di GluN (pseudo-package e scala di ciascun gene) è risultata significativamente sovraregolata nelle repliche snRNA-seq dei geni LRG nei neuroni glutamatergici t-hCO. i, immunocolorazione che mostra l'espressione di SCG2 nei neuroni t-hCO (superiore) e hCO (inferiore). Le frecce bianche indicano le cellule SCG2+. Barra di scala, 25 µm. I dati sono espressi come media ± deviazione standard.
Sulla base dell'aumentata attività di t-hCO osservata nelle fette ex vivo, l'analisi snRNA-seq ha rivelato una sovraregolazione attività-dipendente dei trascritti genici in t-hCO rispetto a hCO in vitro. I neuroni glutamatergici t-hCO esprimevano livelli più elevati di geni che regolano l'attività di risposta tardiva (Fig. 2g,h), riscontrati in studi precedenti su neuroni murini e umani16,17. Ad esempio, BDNF18, SCG2 e OSTN, un gene di regolazione dell'attività specifico dei primati, hanno mostrato un'espressione aumentata nei neuroni t-hCO rispetto ai neuroni hCO (Fig. 2g-i). Pertanto, i neuroni t-hCO hanno mostrato caratteristiche di maturazione migliorate rispetto ai neuroni hCO mediante analisi trascrizionali, morfologiche e funzionali.
Per valutare ulteriormente l'associazione della maturazione di t-hCO con lo sviluppo del cervello umano, abbiamo eseguito confronti trascrittomici di tipi di cellule corticali fetali e adulte19,20 e adulte21,22 così come dati estesi sull'espressione genica corticale23 durante lo sviluppo (dati estesi, Fig. 5). ). con lavori precedenti24 , lo stato di maturazione del trascrittoma globale di hCO e t-hCO a 7-8 mesi di differenziazione è ampiamente coerente con il tempo di sviluppo in vivo ed è più equivalente alla tarda vita fetale (dati estesi Fig. 5a). In particolare, abbiamo osservato una maggiore maturità del trascrittoma in t-hCO rispetto a hCO di pari età, così come l'attivazione del trascrittoma associata a sinaptogenesi, astrogenesi e mielinizzazione (dati estesi, Fig. 5b-d). A livello cellulare, abbiamo trovato prove di un sottotipo di corteccia più sottile in t-hCO, con cluster di neuroni glutammatergici sovrapposti ai sottotipi di neuroni adulti L2/3, L5 e L6 (Figura 1i). Al contrario, la sovrapposizione di cluster tra neuroni glutammatergici t-hCO e neuroni corticali fetali era più limitata a metà gravidanza (dati espansi, Figure 5e-j). Per determinare se i neuroni t-hCO siano funzionalmente simili ai neuroni neocorticali postnatali umani, abbiamo eseguito registrazioni elettrofisiologiche e ricostruzioni anatomiche di neuroni piramidali L2/3 umani in sezioni nitide della corteccia postnatale umana (dati espansi, Fig. 7a). Le proprietà elettrofisiologiche dei neuroni piramidali L2/3 erano simili a quelle dei neuroni piramidali t-hCO (dati espansi, Fig. 7e). Dal punto di vista morfologico, i neuroni L2/3 provenienti da campioni umani postnatali erano più simili a t-hCO che a hCO, sebbene le cellule L2/3 fossero più lunghe, contenessero complessivamente più ramificazioni e avessero una densità di spine più elevata (Fig. 3g e dati espansi, Fig. 7b-). G).
a, trapianto di hCO prodotto da linee cellulari hiPS di controllo e TS in ratti neonati. b, ricostruzione 3D dei neuroni t-hCO riempiti di biocitina dopo 8 mesi di differenziazione. c, quantificazione della lunghezza dendritica media (n = 19 neuroni di controllo, n = 21 neuroni TS; **P = 0,0041). d, rami dendritici ricostruiti in 3D da controllo e t-hCO TS a 8 mesi di differenziazione e quantificazione della densità delle spine dendritiche (n = 16 neuroni di controllo, n = 21 neuroni TS, ***P < 0,0001). d, rami dendritici ricostruiti in 3D da controllo e t-hCO TS a 8 mesi di differenziazione e quantificazione della densità delle spine dendritiche (n = 16 neuroni di controllo, n = 21 neuroni TS, ***P < 0,0001). d, ricostruzione 3D dei peli del viso con controllo e TS t-hCO a partire da 8 mesi di differenza e concentrazione un'ottima strategia per i capelli шипов (n = 16 контрольных нейронов, n = 21 TS нейронов, *** P <0,0001). d, ricostruzione 3D dei rami dendritici dal controllo e dal t-hCO TS a 8 mesi di differenziazione e quantificazione della densità delle spine dendritiche (n=16 neuroni di controllo, n=21 neuroni TS, ***P<0,0001). d, 8 个月时对照 e TS t-hCO 的3D 重建树突分支, 以及树突棘密度的量化（n = 16个对照神经元, n = 21 个TS 神经元, ***P < 0,0001）. d, 分化 8 个 时 对照 和 ts t-hco 的 3d 重建 分支 分支 以及 树突棘 密度 量化 （n = 16 个 神经元, n = 21 个 ts 神经, *** p <0,0001 ）. d, ricostruzione 3D del controllo dentale e TS t-hCO circa 8 mesi di differenza e concentrazione плотности дендритных шипов (n = 16 контрольных нейронов, n = 21 TS нейронов, *** P <0,0001). d, ricostruzione 3D dei rami dendritici di controllo e t-hCO TS a 8 mesi di differenziazione e quantificazione della densità delle spine dendritiche (n=16 neuroni di controllo, n=21 neuroni TS, ***P<0,0001).Gli asterischi rossi indicano presunte spine dendritiche. e, EPSC spontanee nei neuroni t-hCO di controllo e TS dopo 8 mesi di differenziamento. f, grafico della frequenza cumulativa e quantificazione di frequenza e ampiezza degli eventi sinaptici (n=32 neuroni di controllo, n=26 neuroni TS; **P=0,0076 e P=0,8102). g, analisi Scholl dei neuroni TS e di controllo in hCO e t-hCO. Le linee tratteggiate mostrano neuroni piramidali postnatali umani L2/3 per confronto (n=24 neuroni t-hCO di controllo, n=21 neuroni TS t-hCO, n=8 neuroni hCO di controllo e n=7 neuroni TS hCO). I dati sono espressi come media ± deviazione standard.
La capacità di t-hCO di replicare ad alto livello le caratteristiche morfologiche e funzionali dei neuroni corticali umani ci ha spinto a valutare se t-hCO potesse essere utilizzato per rilevare fenotipi di malattia. Ci siamo concentrati sulla sindrome di Tourette (TS), un grave disturbo dello sviluppo neurologico causato da mutazioni con guadagno di funzione nel gene che codifica CaV1.2, che avvia la trascrizione genica attività-dipendente nei neuroni. Abbiamo ottenuto hCO da tre pazienti con TS portatori della sostituzione più comune (p.G406R) e da tre controlli (Fig. 3a). Dopo il trapianto, abbiamo riscontrato un'alterazione della morfologia dendritica nei neuroni TS rispetto ai controlli (Fig. 3b e dati estesi, Fig. 8a, b), con un aumento di due volte del numero di dendriti primari e un aumento complessivo della lunghezza media e complessiva dei dendriti (Fig. 3c e dati estesi, Fig. 8c). Ciò è stato associato a una maggiore densità di spine e a una maggiore frequenza di EPSC spontanee nella TS rispetto ai neuroni di controllo (Fig. 3d–f e dati espansi, Fig. 8g). Ulteriori analisi hanno rivelato modelli di ramificazione dendritica anomala nella TS con t-hCO rispetto ai controlli, ma non nella TS con hCO in vitro a uno stadio simile di differenziazione (Fig. 3g). Ciò è coerente con i nostri precedenti studi sulla riduzione dendritica attività-dipendente nella TS e sottolinea la capacità di questa piattaforma di trapianto di rilevare fenotipi di malattia in vivo.
Abbiamo poi indagato in quale misura le cellule t-hCO siano funzionalmente integrate nel nucleo S1 del ratto. Nei roditori, il nucleo S1 riceve forti input sinaptici dai nuclei basali ventrali e posteriori del talamo ipsilaterale, nonché dalle cortecce motoria e somatosensoriale secondaria ipsilaterale e dal nucleo S1 controlaterale (Fig. 4a). Per ripristinare il pattern di innervazione, abbiamo infettato l'hCO con il virus della rabbia-dG-GFP/AAV-G e trapiantato l'hCO nel ratto S1 3 giorni dopo. Abbiamo osservato un'espressione densa di GFP nei neuroni del nucleo S1 ipsilaterale e dei gangli basali ventrali 7-14 giorni dopo il trapianto (Fig. 4b, c). Inoltre, la colorazione anticorpale del marcatore talamico netrina G1 ha rivelato la presenza di terminazioni talamiche nell'hCO-t (Fig. 4d, e). Per valutare se queste proiezioni afferenti potessero suscitare risposte sinaptiche nelle cellule t-hCO, abbiamo eseguito registrazioni cellulari intere da cellule umane in sezioni nitide dello strato talamocorticale. La stimolazione elettrica di S1 ​​di ratto, della capsula interna, della sostanza bianca, delle fibre in prossimità di t-hCO o l'attivazione optogenetica delle terminazioni talamiche esprimenti opsina in t-hCO hanno indotto EPSC a breve latenza nei neuroni t-hCO esposti all'antagonista del recettore AMPA NBQX. (Fig. 4f, g e dati estesi, Fig. 9a–g). Questi dati dimostrano che t-hCO è anatomicamente integrato nel cervello di ratto ed è in grado di essere attivato dal tessuto ospite di ratto.
a, Diagramma schematico di un esperimento di tracciamento della rabbia. b, Espressione di GFP e STEM121 specifica per l'uomo tra t-hCO e corteccia cerebrale di ratto (pannello superiore). È inoltre mostrata l'espressione di GFP nel nucleo basale ventrale (VB) ipsilaterale del ratto (in basso a sinistra) e in S1 ipsilaterale (in basso a destra). Barra di scala, 50 µm. I quadrati rossi rappresentano le aree del cervello in cui sono state acquisite le immagini. c, Quantificazione delle cellule che esprimono GFP (n = 4 ratti). d, e — Terminali talamici netrina G1+ in t-hCO. d mostra una sezione coronale contenente i nuclei t-hCO e VB. Barra di scala, 2 mm. e mostra l'espressione di netrina G1 e STEM121 nei neuroni t-hCO (a sinistra) e VB (a destra). Barra di scala, 50 µm. La linea tratteggiata arancione indica il confine t-hCO. f, g, Tracce attuali dei neuroni t-hCO dopo stimolazione elettrica nel ratto S1 (f) o nella capsula interna (g), con (viola) o senza (nero) NBQX (sinistra). Ampiezze EPSC con e senza NBQX (n = 6 neuroni S1, *P = 0,0119; e n = 6 neuroni della capsula interna, **P = 0,0022) (centro). Percentuale di neuroni t-hCO che mostrano EPSC in risposta alla stimolazione elettrica del ratto S1 (f) o della capsula interna (g) (destra). aCSF, liquido cerebrospinale artificiale. h, diagramma schematico dell'esperimento di imaging 2P (sinistra). Espressione di GCaMP6 in t-hCO (centro). Barra di scala, 100 µm. Timelapse della fluorescenza di GCaMP6 (destra). i, Z-score della fluorescenza dell'attività spontanea. j, illustrazione schematica della stimolazione dei baffi. k, traiettorie di fluorescenza 2P con punteggio z in una prova, allineate con la deviazione dei baffi al tempo zero (linea tratteggiata) nelle cellule di esempio. l, risposte del punteggio z mediate sulla popolazione di tutte le cellule allineate con la deviazione dei baffi al tempo zero (linea tratteggiata) (rosso) o timestamp generati casualmente (grigio). m. Diagramma schematico dell'esperimento sulla marcatura ottica. n, curve di tensione grezze da una cellula t-hCO di esempio durante la stimolazione con laser blu o la deflessione dei baffi. Le frecce rosse indicano i primi picchi causati dalla luce (in alto) o causati dalla deflessione dei baffi (in basso). L'ombreggiatura grigia indica i periodi di deflessione dei baffi. o, forme d'onda luminose di picco e risposte alla deflessione dei baffi. p, picchi di un singolo tentativo, allineati con la deviazione dei baffi nelle cellule dell'esempio. 0 indica la deviazione dei baffi (linea tratteggiata). q, frequenza di attivazione dello z-score mediata dalla popolazione per tutte le cellule fotosensibili, allineata con la deviazione dei baffi al tempo zero (linea tratteggiata) (rosso) o con timestamp generati casualmente (grigio). r, proporzione di unità fotosensibili significativamente modulate dalla deviazione dei baffi (n = 3 ratti) (sinistra). Latenza massima dello z-score (n = 3 ratti; n = 5 (verde chiaro), n = 4 (verde scuro) e n = 4 (ciano) unità di modulazione della deflessione dei baffi per ratto) (destra). I dati sono espressi come media ± deviazione standard.
Ci siamo quindi chiesti se la t-hCO potesse essere attivata da stimoli sensoriali in vivo. Abbiamo trapiantato hCO esprimente gli indicatori di calcio geneticamente codificati GCaMP6 in ratti S1. Dopo 150 giorni, abbiamo eseguito la fotometria a fibre ottiche o l'imaging del calcio a due fotoni (Fig. 4h e dati espansi, Fig. 10a). Abbiamo scoperto che le cellule t-hCO mostravano un'attività ritmica sincronizzata (Figura 4i, Dati espansi, Figura 10b e Video supplementare 1). Per caratterizzare il picco di attività della t-hCO, abbiamo eseguito registrazioni elettrofisiologiche extracellulari in ratti trapiantati anestetizzati (dati espansi, Fig. 10c-f). Abbiamo generato coordinate stereotassiche da immagini MRI; pertanto, queste unità registrate rappresentano potenziali neuroni umani, sebbene l'elettrofisiologia da sola non consenta di determinarne l'origine. Abbiamo osservato picchi sincronizzati di attività (dati espansi, Fig. 10d). Le raffiche duravano circa 460 ms ed erano separate da periodi di silenzio di circa 2 s (dati espansi, Fig. 10d, e). Le singole unità sparavano in media circa tre cicli per raffica, che rappresenta approssimativamente il 73% delle unità registrate per raffica. Le attività delle singole unità erano altamente correlate e queste correlazioni erano superiori a quelle delle unità identificate in animali non vaccinati registrati nelle stesse condizioni (dati espansi, Fig. 10f). Per caratterizzare ulteriormente le risposte di picco dei neuroni derivati ​​dall'uomo identificati, abbiamo eseguito esperimenti di light-tagging su ratti anestetizzati trapiantati con hCO esprimenti il ​​canale cationico fotosensibile rodopsina 2 (hChR2), attraverso il quale i neuroni t-hCO riconoscevano a breve latenza (inferiore a 10 ms) in risposta a stimoli di luce blu (Fig. 4m–o). I neuroni t-hCO hanno mostrato raffiche di attività spontanea a frequenze simili a quelle osservate nell'imaging del calcio, così come nelle registrazioni elettrofisiologiche eseguite in t-hCO in assenza di marcatura luminosa (dati espansi, Fig. 10c-g). Non è stata osservata alcuna attività spontanea nelle corrispondenti fasi di hCO registrate in vitro. Per valutare se t-hCO potesse essere attivato da stimoli sensoriali, abbiamo deviato brevemente i baffi di ratto lontano da t-hCO (Fig. 4j,m e dati estesi, Fig. 10h,k). Secondo studi precedenti8,10, un sottoinsieme di cellule t-hCO ha mostrato un'attività aumentata in risposta alla deflessione dei baffi, che non è stata osservata quando i dati sono stati confrontati con timestamp casuali (Fig. 4k–q e dati espansi, Fig. 10h–q). Infatti, circa il 54% delle singole unità opto-marcate ha mostrato un tasso di eccitazione significativamente aumentato dopo la stimolazione dei baffi, con un picco a circa 650 ms (Fig. 4r). Nel complesso, questi dati suggeriscono che la t-hCO riceve input funzionali appropriati e può essere attivata da stimoli ambientali.
Abbiamo quindi studiato se t-hCO potesse attivare circuiti nei ratti per controllare il comportamento. Abbiamo inizialmente studiato se gli assoni dei neuroni t-hCO proiettassero nei tessuti circostanti del ratto. Abbiamo infettato hCO con un lentivirus che codifica per hChR2 fuso con EYFP (hChR2-EYFP). Dopo 110 giorni, abbiamo osservato l'espressione di EYFP nelle regioni corticali ipsilaterali, tra cui la corteccia uditiva, motoria e somatosensoriale, nonché nelle regioni sottocorticali, tra cui lo striato, l'ippocampo e il talamo (Fig. 5a). Per valutare se queste proiezioni efferenti potessero suscitare risposte sinaptiche nelle cellule di ratto, abbiamo attivato otticamente cellule t-hCO che esprimevano hChR2-EYFP registrando cellule della corteccia cerebrale di ratto in sezioni cerebrali acuminate. L'attivazione degli assoni t-hCO con luce blu ha indotto EPSC a breve latenza nei neuroni della corteccia piramidale di ratto, che sono stati bloccati da NBQX (Fig. 5b–g). Inoltre, queste risposte potrebbero essere bloccate dalla tetrodotossina (TTX) e ripristinate dalla 4-amminopiridina (4-AP), suggerendo che fossero causate da connessioni monosinaptiche (Fig. 5e).
a, Diagramma schematico del tracciamento assonale (sinistra). Espressione di t-hCO EYFP (destra). Barra di scala, 100 µm. A1, corteccia uditiva, ACC, corteccia cingolata anteriore, striato d., striato dorsale, HPC, ippocampo; diaframma, setto laterale, mPFC, corteccia prefrontale mediale, piri, corteccia piriforme, striato v., striato ventrale, VPM, nucleo ventropostomediale del talamo, VTA, regione tegmentale ventrale. I quadrati rossi rappresentano le aree del cervello in cui sono state acquisite le immagini. b, Diagramma schematico dell'esperimento di stimolazione. c, d, Esempi della risposta della fotocorrente indotta dalla luce blu (in alto) e del voltaggio (in basso) in cellule umane (c) EYFP+ t-hCO o di ratto (d) EYFP-. e, f, Tracce attuali dei neuroni del ratto dopo stimolazione con luce blu degli assoni t-hCO con TTX e 4-AR (verde), TTX (grigio) o aCSF (nero) (e), con (viola) o senza (nero) ) ) NBQX (e). g, latenza delle risposte indotte dalla luce blu nelle cellule del ratto (n = 16 cellule); le barre orizzontali indicano la latenza media (7,13 ms) (sinistra). Ampiezza degli EPSC evocati dalla luce registrati con o senza NBQX (n = 7 cellule; ***P < 0,0001) (al centro). Ampiezza degli EPSC evocati dalla luce registrati con o senza NBQX (n = 7 cellule; ***P < 0,0001) (al centro). L'ampiezza del campo visivo EPSC, misurata con o senza NBQX (n = 7 cellule; ***P <0,0001) (al centro). Ampiezza degli EPSC indotti dalla luce registrati con o senza NBQX (n = 7 cellule; ***P < 0,0001) (centro).使用或不使用NBQX 记录的光诱发EPSC 的振幅（n = 7 个细胞；***P < 0.0001）（中）.使用或不使用NBQX 记录的光诱发EPSC 的振幅（n = 7 个细胞；***P < 0.0001）（中）. L'ampiezza del campo visivo EPSC, misurata con o senza NBQX (n = 7 cellule; ***P <0,0001) (al centro). Ampiezza degli EPSC indotti dalla luce registrati con o senza NBQX (n = 7 cellule; ***P < 0,0001) (centro).Percentuale di cellule di ratto che mostrano EPSC che rispondono alla luce blu (a destra). h, Diagramma schematico di un compito comportamentale. d0, giorno 0. i. Prestazioni di animali esemplari al giorno 1 (a sinistra) o al giorno 15 (a destra) di addestramento. Numero medio di leccate eseguite il giorno 1 (sinistra) o il giorno 15 (centro destra) (n = 150 prove con luce blu, n = 150 prove con luce rossa; ***P < 0,0001). Numero medio di leccate eseguite il giorno 1 (sinistra) o il giorno 15 (centro destra) (n = 150 prove con luce blu, n = 150 prove con luce rossa; ***P < 0,0001). Raccolta completa di prodotti disponibili nel giorno 1 (secondo) o nel giorno 15 (nel centro di lavoro) (n = 150 iscrizioni con синим светом, n = 150 испытаний с красным светом; ***P<0,0001). Numero medio di leccate eseguite il giorno 1 (sinistra) o il giorno 15 (centro destra) (n = 150 prove con luce blu, n = 150 prove con luce rossa; ***P < 0,0001).第1 天（左）或第15 天（右中）执行的平均舔次数（n = 150 次蓝光试验, n = 150次红光试验；***P < 0,0001）.第1 天（左）或第15 天（右中）执行的平均舔次数（n = 150 次蓝光试验, n = 150次红光试验；***P < 0,001 Raccolta completa di prodotti disponibili nel giorno 1 (secondo) o nel giorno 15 (nel centro di lavoro) (n = 150 iscrizioni con синим светом, n = 150 испытаний с красным светом; ***P<0,0001). Numero medio di leccate eseguite il giorno 1 (sinistra) o il giorno 15 (centro destra) (n = 150 prove con luce blu, n = 150 prove con luce rossa; ***P < 0,0001).Leccate cumulative per le prove con luce rossa e blu al giorno 1 (al centro a sinistra) o al giorno 15 (a destra). NS, non significativo. j,k, Caratteristiche comportamentali di tutti gli animali trapiantati con t-hCO esprimente hChR2-EYFP (j) o fluoroforo di controllo (k) al giorno 1 o 15 (hChR2-EYFP: n = 9 ratti, ** P = 0,0049; controllo: n = 9, P = 0,1497). l, Evoluzione del punteggio di preferenza (n = 9 hChR2, n = 9 controllo; **P < 0,001, ***P < 0,0001). l, Evoluzione del punteggio di preferenza (n = 9 hChR2, n = 9 controllo; **P < 0,001, ***P < 0,0001). l, Эволюция показателя предпочтения (n = 9 hChR2, n = 9 controll; **P <0,001, ***P <0,0001). l, Evoluzione del punteggio di preferenza (n = 9 hChR2, n = 9 controlli; **P < 0,001, ***P < 0,0001). l,偏好评分的演变（n = 9 hChR2, n = 9 对照；**P < 0,001,***P < 0,0001）. l,偏好评分的演变（n = 9 hChR2, n = 9 对照；**P < 0,001,***P < 0,0001）. l, Эволюция показателей предпочтения (n = 9 hChR2, n = 9 controllo; **P <0,001, ***P <0,0001). l, Evoluzione dei punteggi di preferenza (n = 9 hChR2, n = 9 controlli; **P < 0,001, ***P < 0,0001).m, espressione di FOS in risposta all'attivazione optogenetica di t-hCO in S1. Sono mostrate le immagini dell'espressione di FOS (sinistra) e della quantificazione (n = 3 per gruppo; *P < 0,05, **P < 0,01 e ***P < 0,001) (destra). Sono mostrate le immagini dell'espressione di FOS (sinistra) e della quantificazione (n = 3 per gruppo; *P < 0,05, **P < 0,01 e ***P < 0,001) (destra). L'espressione dell'espressione FOS (sleva) e la combinazione di opzioni (n = 3 nel gruppo; * P <0,05, ** P <0,01 e *** P <0,001) (справа). Sono mostrate (a destra) le immagini dell'espressione di FOS (a sinistra) e della quantificazione (n = 3 per gruppo; *P<0,05, **P<0,01 e ***P<0,001).Il valore FOS è pari a n = 3;*P < 0,05、**P < 0,01 e***P < 0,001）（右）的图像.Il valore FOS è pari a n = 3;*P < 0,05、**P < 0,01 e***P < 0,001）（右）的图像. L'espressione dell'espressione FOS (sleva) e la combinazione di opzioni (n = 3 nel gruppo; * P <0,05, ** P <0,01 e *** P <0,001) (справа). Sono mostrate (a destra) le immagini dell'espressione di FOS (a sinistra) e della quantificazione (n = 3 per gruppo; *P<0,05, **P<0,01 e ***P<0,001).Barra di scala, 100 µm. I dati sono espressi come media ± errore standard di BLA, tonsilla basolaterale, MDT, nucleo talamico dorsomediale, PAG, sostanza grigia periacqueduttale.
Infine, ci siamo chiesti se il t-hCO3 potesse modulare il comportamento dei ratti. Per testarlo, abbiamo trapiantato hCO3 esprimente hChR2-EYFP in S1 e, 90 giorni dopo, abbiamo impiantato fibre ottiche nel t-hCO3 per la trasmissione della luce. Abbiamo quindi addestrato i ratti con un paradigma di condizionamento operante modificato (Fig. 5h). Abbiamo posizionato gli animali in una camera per test comportamentali e applicato casualmente stimoli laser blu (473 nm) e rosso (635 nm) della durata di 5 secondi. Gli animali ricevevano una ricompensa a base di acqua se leccavano durante la stimolazione con luce blu, ma non leccavano durante la stimolazione con luce rossa. Il primo giorno di addestramento, gli animali non hanno mostrato differenze nel leccamento quando stimolati con luce blu o rossa. Tuttavia, il quindicesimo giorno, gli animali trapiantati con hChR2-EYFP esprimente hCO3 mostravano un leccamento più attivo quando stimolati con luce blu rispetto alla stimolazione con luce rossa. Questi cambiamenti nel comportamento di leccamento non sono stati osservati negli animali di controllo trapiantati con hCO esprimenti il ​​fluoroforo di controllo (tasso di successo dell'apprendimento: hChR2 89%, EYFP 0%, Figura 5i-1 e Video Supplementare 2). Questi dati suggeriscono che le cellule t-hCO possano attivare i neuroni del ratto per stimolare il comportamento di ricerca di ricompensa. Per scoprire quali circuiti neurali t-hCO del ratto potrebbero essere coinvolti in questi cambiamenti comportamentali, abbiamo attivato optogeneticamente t-hCO in animali addestrati e prelevato tessuti 90 minuti dopo. L'immunoistochimica ha rivelato l'espressione della proteina FOS attività-dipendente in diverse regioni cerebrali coinvolte nel comportamento motivato, tra cui la corteccia prefrontale mediale, il talamo mediale e la materia grigia periacqueduttale, che è stata espressa sia negli animali di controllo non stimolati che negli animali. riso. 5m). Nel complesso, questi dati suggeriscono che t-hCO può modulare l'attività neuronale del ratto per guidare il comportamento.
Gli organoidi neurali rappresentano un sistema promettente per lo studio dello sviluppo e delle patologie umane in vitro, ma sono limitati dalla mancanza di connessioni tra i circuiti presenti in vivo. Abbiamo sviluppato una nuova piattaforma in cui abbiamo trapiantato hCO3 in S1 di ratti immunocompromessi in fase precoce postnatale per studiare lo sviluppo e la funzione delle cellule umane in vivo. Abbiamo dimostrato che t-hCO3 sviluppa tipi cellulari maturi non osservati in vitro28 e che t-hCO3 è integrato anatomicamente e funzionalmente nel cervello dei roditori. L'integrazione di t-hCO3 nei circuiti neurali dei roditori ci ha permesso di stabilire un collegamento tra l'attività cellulare umana e il comportamento animale studiato, dimostrando che i neuroni t-hCO3 possono modulare l'attività neuronale del ratto per guidare le risposte comportamentali.
La piattaforma che descriviamo presenta diversi vantaggi rispetto alle ricerche precedenti sul trapianto di cellule umane nel cervello dei roditori. In primo luogo, abbiamo trapiantato hCO3 nella corteccia in via di sviluppo di ratti in fase precoce di vita, il che potrebbe facilitarne l'integrazione anatomica e funzionale. In secondo luogo, il monitoraggio MRI di t-hCO3 ci ha permesso di studiare la posizione e la crescita dell'innesto in animali vivi, consentendoci di condurre studi multi-animale a lungo termine e di stabilire l'affidabilità di diverse linee cellulari hiPS. Infine, abbiamo trapiantato organoidi intatti, anziché sospensioni isolate di singole cellule, che sono meno distruttive per le cellule umane e possono promuovere l'integrazione e la generazione di neuroni della corteccia umana nel cervello dei ratti.
Riconosciamo che, nonostante i progressi di questa piattaforma, vincoli temporali, spaziali e interspecie impediscono la formazione di circuiti neurali umani ad alta fedeltà, anche dopo il trapianto in una fase precoce dello sviluppo. Ad esempio, non è chiaro se l'attività spontanea osservata in t-hCO rappresenti un fenotipo evolutivo simile all'attività ritmica osservata durante lo sviluppo corticale, o se sia dovuta all'assenza di tipi cellulari soppressivi presenti in t-hCO. Analogamente, non è chiaro in che misura l'assenza di laminazione in t-hCO influenzi la connettività della catena30. I lavori futuri si concentreranno sull'integrazione di altri tipi cellulari come la microglia umana, le cellule endoteliali umane e diverse proporzioni di interneuroni GABAergici, come mostrato utilizzando l'assemblaggio 6 in vitro, nonché sulla comprensione di come l'integrazione e l'elaborazione neurale possano verificarsi in t-hCO alterati a livello trascrizionale, sinaptico e comportamentale nelle cellule ottenute da pazienti.
Nel complesso, questa piattaforma in vivo rappresenta una potente risorsa che può integrare lo sviluppo del cervello umano in vitro e la ricerca sulle malattie. Prevediamo che questa piattaforma ci permetterà di scoprire nuovi fenotipi a livello di filamento in cellule derivate da pazienti altrimenti difficili da individuare e di testare nuove strategie terapeutiche.
Abbiamo generato hCO2.5 dalle cellule HiPS come descritto in precedenza. Per avviare la produzione di hCO3 dalle cellule hiPS coltivate su strati feeder, colonie intatte di cellule hiPS sono state rimosse dalle piastre di coltura utilizzando dispasi (0,35 mg/mL) e trasferite in colture di plastica a bassissima aderenza contenenti piastre con terreno di coltura per cellule hiPS (Corning) supplementato con due inibitori SMAD, dorsomorfina (5 μM; P5499, Sigma-Aldrich) e SB-431542 (10 μM; 1614, Tocris) e l'inibitore ROCK Y-27632 (10 μM; S1049, Selleckchem). Durante i primi 5 giorni, il terreno di coltura per cellule hiPS è stato cambiato quotidianamente e sono stati aggiunti dorsomorfina e SB-431542. Al sesto giorno di sospensione, gli sferoidi neurali sono stati trasferiti in un terreno di coltura neurale contenente neurobasal-A (10888, Life Technologies), integratore di vitamina B-27 senza vitamina A (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies), penicillina e streptomicina (1:100, Life Technologies) e integrato con il fattore di crescita epidermico (EGF; 20 ng ml−1; R&D Systems) e il fattore di crescita dei fibroblasti 2 (FGF2; 20 ng ml−1; R&D Systems) fino al giorno 24. Dal giorno 25 al giorno 42, il terreno di coltura è stato integrato con fattore neurotrofico derivato dal cervello (BDNF; 20 ng ml−1, Peprotech) e neurotrofina 3 (NT3; 20 ng ml−1; Peprotech) con cambi del terreno a giorni alterni. Al sesto giorno di sospensione, gli sferoidi neurali sono stati trasferiti in un terreno di coltura neurale contenente neurobasal-A (10888, Life Technologies), integratore di vitamina B-27 senza vitamina A (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies), penicillina e streptomicina (1:100, Life Technologies) e integrato con il fattore di crescita epidermico (EGF; 20 ng ml−1; R&D Systems) e il fattore di crescita dei fibroblasti 2 (FGF2; 20 ng ml−1; R&D Systems) fino al giorno 24. Dal giorno 25 al giorno 42, il terreno di coltura è stato integrato con fattore neurotrofico derivato dal cervello (BDNF; 20 ng ml−1, Peprotech) e neurotrofina 3 (NT3; 20 ng ml−1; Peprotech) con cambi del terreno a giorni alterni.Al sesto giorno di sospensione, gli sferoidi neurali sono stati trasferiti in un mezzo neurale contenente Neurobasal-A (10888, Life Technologies), integratore di vitamina B-27 senza vitamina A (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies), penicillina.e streptomice (1:100, Life Technologies) e altre sostanze epidermiche (EGF; 20 ng/ml; R&D Systems) e fattori di resistenza fibre 2 (FGF2; 20 ng/ml; R&D Systems) per 24 giorni. e streptomicina (1:100, Life Technologies) e integrato con fattore di crescita epidermico (EGF; 20 ng/ml; R&D Systems) e fattore di crescita dei fibroblasti 2 (FGF2; 20 ng/ml; R&D Systems) fino al giorno 24.Dal giorno 25 al giorno 42, sono stati aggiunti al terreno di coltura il fattore neurotrofico derivato dal cervello (BDNF; 20 ng ml-1, Peprotech) e la neurotrofina 3 (NT3; 20 ng ml-1, Peprotech), cambiando il terreno di coltura a giorni alterni.在悬浮的第6 天,将神经球体转移到含有neurobasal-A（10888,Life Technologies）、不含维生素A 的B-27补充剂（12587,Life Technologies）、GlutaMax（1:100,Life Technologies）、青霉素的神经培养基中和链霉素（1:100,Life Tecnologie）并辅以表皮生长因子（EGF；20 ng ml-1；R&D Systems） e 成纤维细胞生长因子2（FGF2；20 ng ml-1；R&D Systems)直至第24 天.6补充剂 （12587, Life Technologies） Glutamax （1: 100, Life TechNOGIS青霉素 的 神经 培养 基 中 链霉素 （（1: 100, Life Technologies） 表皮生长 因子 （（（20 ng ml-1 ； r&d Systems） 成 纤维 细胞 生长 2 （fgf2 ； 20 ng ml- 1；R&D Systems）直至第24天. In 6 giorni la sospensione dei neuroscienziati è stata effettuata in anticipo sul lavoro, con la collaborazione del medico di famiglia (10888, Life Technologies), lavoro В-27 senza vitamina A (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies), penicillina-streptomicina neurale (1:100, Life Technologies) con un fattore epidermico aggiuntivo (EGF; 20 ng ml-1; Sistemi di ricerca e sviluppo) и фактора роста fibre 2 (FGF2; 20 нг мл-1) 1; Il giorno 6, le sospensioni di neurosfere sono state sostituite con un integratore contenente neurobasal-A (10888, Life Technologies), integratore di B-27 senza vitamina A (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies), streptomicina neutralizzata con penicillina (1:100, Life Technologies) integrato con fattore di crescita epidermico (EGF; 20 ng ml-1; R&D Systems) e fattore di crescita dei fibroblasti 2 (FGF2; 20 ng ml-1) 1; Sistemi di ricerca e sviluppo) per 24 giorni. Sistemi di R&S) fino al giorno 24.Dal giorno 25 al giorno 42, il fattore neurotrofico derivato dal cervello (BDNF; 20 ng ml-1, Peprotech) e il fattore neurotrofico 3 (NT3; 20 ng ml-1, Peprotech) sono stati aggiunti al terreno di coltura a giorni alterni. Cambiare il terreno una volta.A partire dal giorno 43, l'hCO2 è stato mantenuto in terreno di coltura neurobasal-A non supplementato (NM; 1088022, Thermo Fisher) con cambio del terreno ogni 4-6 giorni. Per ottenere hCO2 da cellule hiPS coltivate in condizioni di feederless, le cellule hiPS sono state incubate con Accutase (AT-104, Innovate Cell Technologies) a 37 °C per 7 minuti, dissociate in singole cellule e piastrate su piastre AggreWell 800 (34815, STEMCELL Technologies) a una densità di 3 × 106 singole cellule per pozzetto in terreno Essential 8 supplementato con l'inibitore ROCK Y-27632 (10 μM; S1049, Selleckchem). Dopo 24 ore, il terreno di coltura nei pozzetti è stato pipettato su e giù in un terreno di coltura contenente terreno Essential 6 (A1516401, Life Technologies) addizionato con dorsomorfina (2,5 μM; P5499, Sigma-Aldrich) e SB-431542 (10 μM; 1614). , Tocrida. Dal giorno 2 al giorno 6, il terreno Essential 6 è stato sostituito quotidianamente con dorsomorfina e addizionato con SB-431542. Dal sesto giorno, le sospensioni di neurosfere sono state trasferite al terreno neurobasale e mantenute come descritto sopra.
Tutte le procedure sugli animali sono state eseguite in conformità con le linee guida per la cura degli animali approvate dal Comitato Amministrativo per la Cura degli Animali da Laboratorio dell'Università di Stanford (APLAC). Ratti RNU (rnu/+) gravidi ed eutimici sono stati acquistati (Charles River Laboratories) o alloggiati. Gli animali sono stati tenuti a un ciclo luce-buio di 12 ore con cibo e acqua a volontà. I ​​cuccioli di ratto nudi (FOXN1–/–) di età compresa tra tre e sette giorni sono stati identificati dalla crescita dei baffi immaturi prima dell'abbattimento. I cuccioli (maschi e femmine) sono stati anestetizzati con isoflurano al 2-3% e posizionati su un telaio stereotassico. È stata eseguita una trapanazione del cranio con un diametro di circa 2-3 mm sopra S1, mantenendo l'integrità della dura madre. Quindi, utilizzare un ago da 30 G (circa 0,3 mm) appena al di fuori della craniotomia per perforare la dura madre. Quindi, applicare HCO3 su un sottile strato di parafilm di 3x3 cm e rimuovere il terreno in eccesso. Utilizzando una siringa Hamilton collegata a un ago da 23 G a 45°, aspirare delicatamente hCO3 nell'estremità più distale dell'ago. Quindi installare la siringa sulla pompa a siringa collegata al dispositivo stereotassico. Quindi posizionare la punta dell'ago su un foro di puntura di 0,3 mm precedentemente praticato nella dura madre (z = 0 mm) e restringere la siringa di 1-2 mm (z = circa -1,5 mm) fino a quando l'ago non si trova tra la dura madre A e si forma una sigillatura densa. Quindi sollevare la siringa al centro della superficie corticale a z = -0,5 mm e iniettare hCO3 a una velocità di 1-2 µl al minuto. Dopo aver completato l'iniezione di hCO3, l'ago viene retratto a una velocità di 0,2-0,5 mm al minuto, la pelle viene suturata e il cucciolo viene immediatamente posizionato su un termoforo caldo fino alla completa guarigione. Alcuni animali sono stati sottoposti a trapianto bilaterale.
Tutte le procedure sugli animali sono state eseguite in conformità con le linee guida per la cura degli animali approvate dall'APLAC della Stanford University. I ratti (con più di 60 giorni di trapianto) sono stati indotti con anestesia con isoflurano al 5% e anestetizzati con isoflurano all'1-3% durante l'imaging. Per la visualizzazione, è stato utilizzato uno scanner da foro orizzontale Bruker (Bruker Corp.) a 7 Tesla schermato attivamente con un motore di gradiente International Electric Company (IECO), un inserto di gradiente schermato con un diametro interno di 120 mm (600 mT/m, 1000 T/m/s) utilizzando AVANCE. III, RF multi-bobina a otto canali e funzionalità multi-core, e la piattaforma Paravision 6.0.1 associata. La registrazione è stata eseguita utilizzando una bobina RF volumetrica disaccoppiata attivamente con un diametro interno di 86 mm e una bobina RF crio-raffreddata a quattro canali per la sola ricezione. Turbo-RARE assiale 2D (tempo di ripetizione = 2500 ms, tempo di eco = 33 ms, 2 medie) con 16 acquisizioni di strato, spessore dello strato 0,6-0,8 mm, contenente 256 × 256 campioni. I segnali sono stati ricevuti utilizzando una bobina RF volumetrica con trasmettitore in quadratura con diametro interno di 2 cm (Rapid MR International, LLC). Infine, utilizzare le funzioni integrate di stima della superficie Imaris (BitPlane) per il rendering 3D e l'analisi del volume. Un trapianto riuscito è stato definito come un trapianto in cui si sono formate aree di segnale RM continuo pesato in T2 nell'emisfero trapiantato. Il rigetto del trapianto è stato definito come un trapianto che non ha prodotto aree di segnale RM continuo pesato in T2 nell'emisfero trapiantato. La t-hCO3 sottocorticale è stata esclusa dall'analisi successiva.
Per esprimere stabilmente GCaMP6s in hCO3 per l'imaging del calcio a due fotoni, le cellule hiPS sono state infettate con pLV[Exp]-EF1a::GcaMP6s-WPRE-Puro e successivamente trattate con antibiotici selezionati. In breve, le cellule sono state dissociate con EDTA e sospese in 1 ml di terreno di coltura Essential 8 a una densità di circa 300.000 cellule in presenza di polibrene (5 μg/ml) e 15 μl di virus. Le cellule sono state quindi incubate in sospensione per 60 minuti e seminate a una densità di 50.000 cellule per pozzetto. Dopo la confluenza, le cellule sono state trattate con 5-10 μg ml-1 di puromicina per 5-10 giorni o fino alla comparsa di colonie stabili. L'infezione acuta con hCO3 è stata eseguita come precedentemente descritto5 con alcune modifiche. In breve, trasferire il terreno di coltura hCO3 al giorno 30-45 in provette da microcentrifuga Eppendorf da 1,5 ml contenenti 100 μl di terreno di coltura per nervi. Si prelevano quindi circa 90 µl di terreno di coltura, si aggiungono 3-6 µl di lentivirus ad alto titolo (da 0,5 x 10¹ a 1,2 x 10¹) alla provetta e si trasferisce l'hCO3 nell'incubatrice per 30 minuti. Quindi si aggiungono 90-100 µl di terreno di coltura a ciascuna provetta e si rimettono le provette nell'incubatrice per una notte. Il giorno successivo, si trasferisce l'hCO3 nel terreno di coltura per nervi freschi in piastre a basso legame. Dopo 7 giorni, l'hCO3 è stato trasferito in piastre a fondo di vetro a 24 pozzetti per la visualizzazione e la valutazione della qualità dell'infezione. pLV[Exp]-SYN1::EYFP-WPRE e pLV[Exp]-SYN1::hChR2-EYFP-WPRE sono stati generati da VectorBuilder. Il lentivirus viene utilizzato nella maggior parte degli esperimenti perché è integrato nel genoma dell'ospite, consentendo l'espressione del gene reporter nelle linee cellulari infette. Per il follow-up della rabbia, il giorno 30-45 hCO è stato coinfettato con rabies-ΔG-eGFP e AAV-DJ-EF1a-CVS-G-WPRE-pGHpA (plasmide n. 67528, Addgene), lavato accuratamente per 3 giorni e trapiantato nei ratti in S1 e mantenuto in vivo per 7-14 giorni.
Per l'immunocitochimica, gli animali sono stati anestetizzati e perfusi transcardiacamente con PBS seguito da paraformaldeide al 4% (PFA in PBS; Electron Microscopy Sciences). I cervelli sono stati fissati in PFA al 4% per 2 ore o per tutta la notte a 4 °C, crioconservati in saccarosio al 30% in PBS per 48-72 ore e inclusi in OCT 1:1 al 30% di saccarosio (Tissue-Tek OCT Compound 4583, Sakura Finetek) e sono state realizzate sezioni coronali a 30 µm utilizzando un criostato (Leica). Per l'immunoistochimica di sezioni spesse, gli animali sono stati perfusi con PBS e il cervello è stato dissezionato e sezionato coronalmente a 300-400 µm utilizzando un vibratomo (Leica) e le sezioni sono state fissate con PFA al 4% per 30 minuti. Quindi le criosezioni o sezioni spesse sono state lavate con PBS, bloccate per 1 ora a temperatura ambiente (10% di siero di asino normale (NDS) e 0,3% di Triton X-100 diluito in PBS) e bloccate con soluzione bloccante a 4°C. – Incubazione Le criosezioni sono state incubate durante la notte e le sezioni spesse sono state incubate per 5 giorni. Gli anticorpi primari utilizzati sono stati: anti-NeuN (topo, 1:500; ab104224, abcam) anti-CTIP2 (ratto, 1:300; ab18465, abcam), anti-GFAP (coniglio, 1:1.000; Z0334, Dako), anti-GFP (pollo, 1:1.000; GTX13970, GeneTex), anti-HNA (topo, 1:200; ab191181, abcam), anti-NeuN (coniglio, 1:500; ABN78, Millipore), anti-PDGFRA (coniglio, 1:200; sc-338, Santa Cruz), anti-PPP1R17 (coniglio, 1:200; HPA047819, Atlas Anticorpi), anti-RECA-1 (topo, 1:50; ab9774, abcam), anti-SCG2 (coniglio, 1:100; 20357-1-AP, Proteintech), anti-SOX9 (capra, 1:500; AF3075, R&D Systems), Netrin G1a (capra, 1:100; AF1166, R&D Systems), anti-STEM121 (topo, 1:200; Y40410, Takara Bio), anti-SATB2 (topo, 1:50; ab51502, abcam), anti-GAD65/67 (coniglio, 1:400; ABN904, Millipore) e anti-IBA1 (capra, 1:100; ab5076, abcam). Gli anticorpi primari utilizzati sono stati: anti-NeuN (topo, 1:500; ab104224, abcam) anti-CTIP2 (ratto, 1:300; ab18465, abcam), anti-GFAP (coniglio, 1:1.000; Z0334, Dako), anti-GFP (pollo, 1:1.000; GTX13970, GeneTex), anti-HNA (topo, 1:200; ab191181, abcam), anti-NeuN (coniglio, 1:500; ABN78, Millipore), anti-PDGFRA (coniglio, 1:200; sc-338, Santa Cruz), anti-PPP1R17 (coniglio, 1:200; HPA047819, Atlas Anticorpi), anti-RECA-1 (topo, 1:50; ab9774, abcam), anti-SCG2 (coniglio, 1:100; 20357-1-AP, Proteintech), anti-SOX9 (capra, 1:500; AF3075, R&D Systems), Netrin G1a (capra, 1:100; AF1166, R&D Systems), anti-STEM121 (topo, 1:200; Y40410, Takara Bio), anti-SATB2 (topo, 1:50; ab51502, abcam), anti-GAD65/67 (coniglio, 1:400; ABN904, Millipore) e anti-IBA1 (capra, 1:100; ab5076, abcam). Sono stati utilizzati i seguenti titoli di coda: anti-NeuN (macchine, 1:500; ab104224, abcam), anti-CTIP2 (crisi, 1:300; ab18465, abcam), anti-GFAP (кроличьи, 1:1000; Z0334, Dako), anti- -GFP (versione, 1:1000; GTX13970, GeneTex), anti-HNA (versione, 1:200; ab191181, abcam), anti-NeuN (versione, 1:500; ABN78, Millipore), anti-PDGFRA (versione, 1:200; sc-338, Santa Croce), anti-PPP1R17 (colla, 1:200; HPA047819, Atlas Antibodies), anti-RECA-1 (versione, 1:50; ab9774, abcam), anti-SCG2 (versione, 1:100; 20357-1-AP, Proteintech), anti-SOX9 (versione, 1:500; AF3075, R&D Systems), rete G1a (versione, 1:100; AF1166, Sistemi di ricerca e sviluppo), anti-STEM121 (modello, 1:200; Y40410, Takara Bio), anti-SATB2 (modello, 1:50; ab51502, abcam), anti-GAD65/67 (lunghezza, 1:400; ABN904, Millipore) e anti-IBA1 (lunga, 1:100; ab5076, inferiore). Gli anticorpi primari utilizzati sono stati: anti-NeuN (topo, 1:500; ab104224, abcam), anti-CTIP2 (ratto, 1:300; ab18465, abcam), anti-GFAP (coniglio, 1:1000; Z0334, Dako), anti-GFP (pollo, 1:1000; GTX13970, GeneTex), anti-HNA (topo, 1:200; ab191181, abcam), anti-NeuN (coniglio, 1:500; ABN78, Millipore), anti-PDGFRA (coniglio, 1:200; sc-338, Santa Cruz), anti-PPP1R17 (coniglio, 1:200; HPA047819, Atlas Anticorpi), anti-RECA-1 (topo, 1:50; ab9774, abcam), anti-SCG2 (coniglio, 1:100; 20357-1-AP, Proteintech), anti-SOX9 (capra, 1:500; AF3075, R&D Systems), netrina G1a (capra, 1:100; AF1166, R&D Systems), anti-STEM121 (topo, 1:200; Y40410, Takara Bio), anti-SATB2 (topo, 1:50; ab51502, abcam), anti-GAD65/67 (coniglio, 1:400; ABN904, Millipore) e anti-IBA1 (capra, 1:100; ab5076, abkam).使用的一抗是：抗NeuN（小鼠,1:500；ab104224,abcam）抗CTIP2（大鼠,1:3 00；ab18465,abcam）,抗GFAP（兔,1:1.000；Z0334,Dako）,抗-GF P（鸡,1:1.000；GTX13970,GeneTex）,抗HNA（小鼠,1:200；ab191181,abcam）,抗NeuN（兔,1:500；ABN78,Millipore）,抗PDGFRA（兔, 1:200；sc-338,Santa Cruz）,抗PPP1R17（兔,1:200；HPA047819,Atlante抗体）, 抗RECA-1（小鼠, 1:50；ab9774, abcam）, 抗SCG2（兔） , 1:100；20357-1-AP, Proteintech）, 抗SOX9 (山羊), 1:500；AF3075, Sistemi di ricerca e sviluppo）, Netrin G1a (山羊), 1:100；AF1166, R&S Sistemi）, 抗STEM121（小鼠, 1:200;使用的一抗是：抗NeuN（小鼠,1:500；ab104224,abcam）抗CTIP2（大鼠,1 :300；ab18465,abcam）,抗GFAP（兔,1:1.000；Z0334,Dako）,抗-GFP（鸡,1:1.000；GTX13970,GeneTex）,抗HNA（小鼠,1:200；ab191181,abcam）,抗NeuN（兔,1:500；ABN78,Millipore％弔,抗1: 200；sc-338,Santa Cruz）,抗PPP1R17（兔,1:200；HPA047819,Atlas 抗体）,抗RECA-1（小鼠,1:50；ab9774,abcam）,抗SCG2 100;Y40410, Takara Bio), anti-SATB2 (topo, 1:50; ab51502, abcam), anti-GAD65/67 (coniglio, 1:400; ABN904, Millipore) e anti-IBA1 (capra, 1:100; ab5076, abcam).Gli anticorpi primari utilizzati sono stati: anti-NeuN (topo, 1:500; ab104224, abcam), anti-CTIP2 (ratto, 1:300; ab18465, abcam), anti-GFAP (coniglio, 1:1000; Z0334, Dako). , anti-GFP (pollo, 1:1000; GTX13970, GeneTex), anti-HNA (topo, 1:200; ab191181, abcam), anti-NeuN (coniglio, 1:500; ABN78, Millipore), anti-PDGFRA (coniglio, 1:200; sc-338, Santa Cruz), anti-PPP1R17 (coniglio, 1:200; HPA047819, anticorpo Atlas), anti-RECA-1 (topo, 1:50; ab9774, abcam), anti-SCG2 (coniglio), 1:100;20357-1-AP, Proteintech), anti-SOX9 (dimensione, 1:500; AF3075, R&D Systems), Rete G1a (versione, 1:100; AF1166, R&D Systems), anti-STEM121 (versione, 1:200; Y40410, Takara Bio), anti-SATB2 (versione, 1:50; ab51502, abcam), anti-GAD65/67 (versione, 1:400; ABN904, Millipore) e anti-IBA1 (коза, 1:100; аб5076, абкам). 20357-1-AP, Proteintech), anti-SOX9 (capra, 1:500; AF3075, R&D Systems), Netrin G1a (capra, 1:100; AF1166, R&D Systems), anti-STEM121 (topo, 1:200; Y40410, Takara Bio), anti-SATB2 (topo, 1:50; ab51502, abcam), anti-GAD65/67 (coniglio, 1:400; ABN904, Millipore) e anti-IBA1 (capra, 1:100; ab5076, abkam).Le sezioni sono state quindi lavate con PBS e incubate con anticorpo secondario per 1 ora a temperatura ambiente (sezioni congelate) o per una notte a 4 °C (sezioni spesse). È stato utilizzato l'anticorpo secondario Alexa Fluor (Life Technologies) diluito 1:1000 in soluzione bloccante. Dopo il lavaggio con PBS, i nuclei sono stati visualizzati con un Hoechst 33258 (Life Technologies). Infine, i vetrini sono stati posizionati su un microscopio con coprioggetto (Fisher Scientific) utilizzando un Aquamount (Polysciences) e analizzati su un microscopio a fluorescenza Keyence (analizzatore BZ-X) o un microscopio confocale Leica TCS SP8 (Las-X) sull'immagine. Le immagini sono state elaborate utilizzando il programma ImageJ (Fiji). Per quantificare la proporzione di neuroni umani nel t-hCO e nella corteccia di ratto, sono state acquisite immagini rettangolari di 387,5 μm di larghezza al centro del t-hCO, sul bordo o in prossimità del bordo della corteccia di ratto. I margini dell'innesto sono stati determinati valutando le variazioni di trasparenza del tessuto, la presenza di nuclei HNA+ e/o la presenza di autofluorescenza tissutale. In ciascuna immagine, il numero totale di cellule NeuN+ e HNA+ è stato diviso per il numero totale di cellule NeuN+ nella stessa area. Per garantire che vengano conteggiate solo le cellule con nuclei nel piano dell'immagine, sono state incluse nel calcolo solo le cellule Hoechst+. È stata calcolata la media di due immagini separate da almeno 1 mm per ridurre l'errore statistico.
Una settimana prima della raccolta dei campioni, posizionare gli animali da trapianto di hCO (circa 8 mesi di differenziazione) in una stanza buia con i baffi tagliati per ridurre al minimo la stimolazione sensoriale. L'isolamento dei nuclei è stato eseguito come descritto in precedenza, con alcune modifiche. In breve, t-hCO e hCO sono stati distrutti mediante lisi cellulare meccanica con detergente e un frantoio per tessuti in vetro da 2 ml (D8938, Sigma-Aldrich/KIMBLE). I nuclei grezzi sono stati quindi filtrati utilizzando un filtro da 40 µm e centrifugati a 320 g per 10 minuti a 4 °C prima di eseguire un gradiente di densità di saccarosio. Dopo la fase di centrifugazione (320 g per 20 min a 4°C), i campioni sono stati risospesi in soluzione di BSA/PBS allo 0,04% con l'aggiunta di 0,2 unità di µl-1 di inibitore della RNasi (40 µl-1, AM2682, Ambion) e filtrati attraverso un filtro di flusso da 40 µm. I nuclei dissociati sono stati quindi risospesi in PBS contenente BSA allo 0,02% e caricati su un chip Chromium Single Cell 3' (recupero stimato di 8.000 cellule per corsia). Le librerie snRNA-seq sono state preparate con il kit Chromium Single cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics). Le librerie snRNA-seq sono state preparate con il kit Chromium Single cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics). Le librerie snRNA-seq sono state sviluppate con la promozione di Chromium Single cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics). Le librerie snRNA-seq sono state preparate utilizzando Chromium Single cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics). snRNA-seq 文库是使用Chromium Single cell 3′ GEM、Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics) 制备的. snRNA-seq 文库是使用Chromium Single cell 3′ GEM、Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics) 制备的. Bibliografia snRNA-seq con utilizzo di Chromium Single Cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics). La libreria snRNA-seq è stata preparata utilizzando Chromium Single Cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics).Le librerie provenienti da campioni diversi sono state raggruppate e sequenziate da Admera Health su NovaSeq S4 (Illumina).
I livelli di espressione genica per ciascun presunto codice a barre nucleare sono stati quantificati utilizzando il software di analisi 10x Genomics CellRanger (versione 6.1.2). Nello specifico, le letture sono state confrontate con una combinazione di genomi di riferimento umani (GRCh38, Ensemble, versione 98) e di ratto (Rnor_6.0, Ensemble, versione 100) creati con il comando mkref e utilizzando il comando count con il comando –include-introns=TRUE per quantificare le letture include mappate sulle regioni introniche. Per i campioni di t-hCO, i nuclei umani sono stati identificati in base al requisito conservativo che almeno il 95% di tutte le letture mappate corrispondesse al genoma umano. Tutte le analisi successive sono state eseguite su un array di codici a barre filtrato in uscita da CellRanger utilizzando il pacchetto R (versione 4.1.2) Seurat (versione 4.1.1)32.
Per garantire che solo i nuclei di alta qualità siano inclusi nell'analisi successiva, è stato implementato un processo di filtraggio iterativo per ciascun campione. In primo luogo, vengono identificati e rimossi i nuclei di bassa qualità con meno di 1000 geni univoci e più del 20% dei mitocondri totali. Successivamente, la matrice grezza del numero di geni è stata normalizzata mediante regressione binomiale negativa regolarizzata utilizzando la funzione sctransform(vst.flavor="v2"), che ha anche identificato i 3000 geni più variabili utilizzando parametri predefiniti. La riduzione dimensionale è stata eseguita sui geni con la variabile più alta utilizzando l'analisi delle componenti principali (PCA) con parametri predefiniti utilizzando una dimensione del set di dati pari a 30 (dims = 30 è stato scelto in base all'ispezione visiva dei siti del ginocchio ed è stato utilizzato per tutti i campioni e le analisi d'insieme). Abbiamo quindi eseguito diversi cicli di clustering iterativo (risoluzione = 1) per classificare i geni in base a un conteggio genico anormalmente basso (mediana inferiore al 10° percentile) e a un conteggio genico mitocondriale anormalmente alto (mediana superiore al 95° percentile) per identificare e rimuovere cellule putative di bassa qualità. cluster e/o un'alta percentuale di gemelli sospetti identificati utilizzando il pacchetto DoubletFinder33 (punteggio medio DoubletFinder superiore al 95° percentile). Campioni di t-hCO3 (n=3) e campioni di hCO3. (n=3) sono stati integrati separatamente utilizzando la funzione IntegrateData con i parametri sopra indicati. Successivamente, è stato eseguito un ulteriore ciclo di filtraggio qualitativo del set di dati integrato, come descritto sopra.
Dopo aver rimosso i kernel di bassa qualità, il set di dati integrato è stato raggruppato (risoluzione = 0,5) e incorporato per la visualizzazione in UMAP34. I geni marcatori per ciascun cluster sono stati determinati utilizzando la funzione FindMarkers con parametri predefiniti calcolati a partire da dati di espressione genica normalizzati. Identifichiamo e classifichiamo le principali classi cellulari combinando set di dati di riferimento corticali fetali e adulte con l'espressione genica marcatrice 19, 20, 21, 35 e l'annotazione. In particolare, i precursori circolanti sono stati identificati dall'espressione di MKI67 e TOP2A. I cluster di progenitori sono stati definiti dall'assenza di trascritti mitotici, dall'elevata sovrapposizione con i cluster di progenitori gliali multipotenti descritti nella corteccia fetale in metafase tardiva e dall'espressione di EGFR e OLIG1. Utilizziamo il termine astrociti per comprendere diversi stadi di differenziazione degli astrociti, dalla glia radiale tardiva alla maturazione degli astrociti. I cluster di astrociti esprimono alti livelli di SLC1A3 e AQP4 e hanno dimostrato di mappare con sottotipi di glia radiale fetale e/o astrociti adulti. Gli OPC esprimono PDGFRA e SOX10, mentre gli oligodendrociti esprimono marcatori di mielinizzazione (MOG e MYRF). I neuroni glutammatergici sono stati identificati dalla presenza di trascritti neuronali (SYT1 e SNAP25), dall'assenza di marcatori GABAergici (GAD2) e dall'espressione di NEUROD6, SLC17A7, BCL11B o SATB2. I neuroni GluN sono stati ulteriormente suddivisi in sottoclassi superiori (espressione di SATB2 e perdita di BCL11B) e profonde (espressione di BCL11B). I neuroni sottoplacca (SP) presunti esprimono marcatori SP18 noti come ST18 e SORCS1, oltre ai marcatori GluN profondi. Le cellule simili al plesso coroideo sono state identificate tramite l'espressione di TTR, mentre le cellule simili a meninge hanno espresso geni associati ai fibroblasti e hanno mappato le cellule piali/vascolari del set di dati di riferimento.
L'analisi differenziale dell'espressione genica tra le sottoclassi di t-hCO e hCO è stata eseguita utilizzando un metodo pseudo-batch di nuova concezione, riprodotto in campioni implementati con il pacchetto Libra R (versione 1.0.0). Nello specifico, sono stati eseguiti test di log-verosimiglianza di edgeR (versione 3.36.0, pacchetto R) per gruppi, sommando il numero di geni nelle cellule per una data classe cellulare per ogni replicazione del campione. Per la visualizzazione della mappa di calore, i valori normalizzati per milione (CPM) vengono calcolati utilizzando edgeR (funzione cpm()) e scalati (per ottenere media = 0, deviazione standard = 1). È stata eseguita un'analisi di arricchimento Gene Ontology (GO) dei geni GluN di t-hCO significativamente sovraregolati (valore di p corretto di Benjamin-Hochberg inferiore a 0,05 espresso in almeno il 10% delle cellule GluN di t-hCO e un aumento della variazione di almeno 2 volte). Eseguito utilizzando la suite ToppGene (https://toppgene.cchmc.org/)37. Utilizziamo l'app ToppFun con parametri predefiniti e riportiamo i valori P corretti con Benjamini-Hochberg calcolati da test ipergeometrici annotati con GO.
Per abbinare i nostri cluster snRNA-seq con cluster cellulari annotati provenienti da studi di riferimento su RNA-seq primario a singola cellula o snRNA-seq adulto19,20,21,22, abbiamo applicato un approccio di integrazione di dataset appaiati. Abbiamo utilizzato il flusso di lavoro di normalizzazione SCTransform (v2) in Seurat per integrare e confrontare le sovrapposizioni di cluster tra i dataset (utilizzando gli stessi parametri di cui sopra). I singoli dataset sono stati suddivisi casualmente in sottoinsiemi fino a 500 cellule o nuclei per cluster originale per garantire l'efficienza computazionale. Utilizzando un approccio simile a quello descritto in precedenza, la sovrapposizione dei cluster è stata definita come la proporzione di cellule o nuclei in ciascun cluster raggruppato che si sovrapponeva all'etichetta del cluster di riferimento. Per classificare ulteriormente i GluN, abbiamo utilizzato il flusso di lavoro TransferData di Seurat per i dati dei sottoinsiemi GluN per assegnare etichette del dataset di riferimento alle nostre cellule GluN.
Per valutare lo stato di maturazione del trascrittoma globale dei campioni di t-hCO e hCO, abbiamo confrontato i nostri campioni pseudo-bulk con BrainSpan/psychENCODE23, che consiste in un'ampia sequenza di RNA che abbraccia lo sviluppo del cervello umano. Abbiamo eseguito un'analisi PCA su una matrice di espressione genica normalizzata per pattern combinata da campioni corticali 10 settimane dopo il concepimento e successivamente, in 5567 geni (insieme ai nostri dati) che erano stati precedentemente identificati come attivi nei campioni corticali BrainSpan (definiti come una varianza evolutiva superiore al 50% spiegata dall'età utilizzando un modello cubico)38. Inoltre, abbiamo derivato geni associati alle principali firme del trascrittoma del neurosviluppo utilizzando la fattorizzazione della matrice non negativa come precedentemente descritto. I pesi del campione calcolati utilizzando la procedura di fattorizzazione della matrice non negativa sono riportati nelle Figure 5b con dati espansi per ciascuna delle cinque firme descritte da Zhu et al.38. Anche in questo caso, i marcatori trascrizionali dipendenti dall'attività sono stati derivati ​​da studi pubblicati in precedenza. In particolare, ERG e LRG sono risultati significativamente sovraregolati nei neuroni glutamatergici identificati tramite la raccolta di snRNA-seq della corteccia visiva del topo dopo stimolazione visiva, come riportato nella Tabella Supplementare 3 (Hrvatin et al.16). Gli LRG arricchiti nell'uomo sono stati ottenuti da colture di cervello fetale umano attivato con KCl e raccolti 6 ore dopo la stimolazione, e i geni filtrati sono risultati significativamente sovraregolati nell'uomo, ma non nei roditori (Tabella Supplementare 4). L'analisi dell'arricchimento del set di geni utilizzando questi set di geni è stata eseguita utilizzando un test esatto di Fisher a una via.
Anestetizzare i ratti con isoflurano, prelevare i cervelli e immergerli in una soluzione fredda (circa 4 °C) di saccarosio ossigenato (95% O2 e 5% CO2) per sezioni contenenti: 234 mM di saccarosio, 11 mM di glucosio, 26 mM di NaHCO3, 2,5 mM di KCl, 1,25 mM di NaH2PO4, 10 mM di MgSO4 e 0,5 mM di CaCl2 (circa 310 mOsm). Sezioni coronali di cervello di ratto (300-400 µm) contenenti t-hCO sono state realizzate utilizzando un vibratomo Leica VT1200 come descritto in precedenza39. Le sezioni sono state quindi trasferite in una camera di sezionamento con ossigenazione continua a temperatura ambiente contenente aCSF preparato con: 10 mM di glucosio, 26 mM di NaHCO3, 2,5 mM di KCl, 1,25 mM di NaHPO4, 1 mM di MgSO4, 2 mM di CaCl2 e 126 mM di NaCl (298 mOsm), almeno 45 minuti prima della registrazione. Le sezioni sono state registrate in una camera immersa dove sono state perfuse in continuo con aCSF (fiala al 95% di O2 e al 5% di CO2). Tutti i dati sono stati registrati a temperatura ambiente. I neuroni t-hCO sono stati terminati con una pipetta di vetro borosilicato riempita con una soluzione contenente 127 mM di gluconato di potassio, 8 mM di NaCl, 4 mM di magnesio ATP, 0,3 mM di sodio GTP, 10 mM di HEPES e 0,6 mM di EGTA, pH 7,2, soluzione interna aggiustata con KOH (290 mOsm). Per recuperare, è stata aggiunta biocitina (0,2%) alla soluzione di registrazione.
I dati sono stati acquisiti utilizzando un amplificatore MultiClamp 700B (Molecular Devices) e un digitalizzatore Digidata 1550B (Molecular Devices), filtrati passa-basso a 2 kHz, digitalizzati a 20 kHz e analizzati utilizzando Clampfit (Molecular Devices), Origin (OriginPro, OriginLab, 2021b) e funzioni MATLAB personalizzate (Mathworks). Il potenziale di giunzione è stato calcolato utilizzando JPCalc e i valori sono stati corretti al valore calcolato di -14 mV. L'operazione IV consiste in una serie di incrementi di corrente di 10-25 pA, da -250 a 750 pA.
Il talamo, la sostanza bianca e le afferenze S1 sono stati stimolati elettricamente in sezioni talamocorticali durante la registrazione patch-clamp dei neuroni hCO, come descritto in precedenza. In breve, il cervello è stato posizionato su un tavolo per stampa 3D inclinato di 10° e la parte anteriore del cervello è stata sezionata con un angolo di 35°. Il cervello è stato quindi incollato alla superficie di taglio e sezionato, preservando gli assoni talamocorticali sporgenti. Elettrodi bipolari in tungsteno (0,5 MΩ) sono stati montati su un secondo micromanipolatore e posizionati strategicamente per stimolare quattro regioni per cellula (capsula interna, sostanza bianca, S1 e hCO). Registrare le risposte sinaptiche dopo una stimolazione fasica di 300 µA a 0,03-0,1 Hz.
Neuroni hCO esprimenti hChR2 sono stati attivati ​​a 480 nm e impulsi luminosi generati da un LED (Prizmatix) sono stati applicati attraverso un obiettivo ×40 (0,9 NA; Olympus) per registrare l'espressione di hChR2 in prossimità delle cellule. Il diametro del campo illuminato è di circa 0,5 mm e la potenza totale è di 10-20 mW. La durata dell'impulso è stata impostata a 10 ms, che corrisponde all'impulso somministrato durante l'esperimento di apprendimento comportamentale. Sono state utilizzate diverse frequenze di stimolazione, da 1 a 20 Hz, ma solo il primo impulso della serie è stato utilizzato per la quantificazione. Gli intervalli tra i treni di impulsi sono solitamente superiori a 30 s per minimizzare l'effetto sulle vie inibitorie o facilitanti sinaptiche. Per verificare se la risposta di hChR2 fosse monosinaptica, abbiamo applicato TTX (1 μM) al bagno fino alla scomparsa della reazione EPSC, quindi abbiamo applicato 4-amminopiridina (4-AP; 100 μM). In genere, la risposta si ottiene entro pochi minuti, con un ritardo leggermente maggiore tra l'accensione del LED e la generazione dell'EPSC. NBQX (10 μM) è stato utilizzato per verificare se la risposta fosse indotta dai recettori AMPA.
Le sezioni Sharp hCO sono state create come descritto in precedenza. In breve, le sezioni hCO sono state incluse in agarosio al 4% e trasferite in cellule contenenti 126 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM NaH₂PO₂, 1 mM MgSO₂, 2 mM CaCl₂, 26 mM NaH₂CO₂ e 10 mM d-(+)-glucosio. Le sezioni sono state tagliate a 200-300 µm a temperatura ambiente utilizzando un vibratore Leica VT1200 e conservate in ASF a temperatura ambiente. Successivamente, è stata eseguita la registrazione patch-camp delle cellule intere sulle sezioni hCO al microscopio diretto SliceScope (Scientifica). Le sezioni sono state perfuse con aCSF (95% O₂ e 5% CO₂) e i segnali cellulari sono stati registrati a temperatura ambiente. I neuroni hCO sono stati applicati utilizzando una pipetta di vetro borosilicato riempita con una soluzione contenente 127 mM di gluconato di potassio, 8 mM di NaCl, 4 mM di magnesio ATP, 0,3 mM di sodio GTP, 10 mM di HEPES e 0,6 mM di EGTA, pH interno 7, 2, corretto con KOH (osmolarità 290). Per il recupero, aggiungere lo 0,2% di biocitina alla soluzione interna.
I dati sono stati acquisiti da Clampex (Clampex 11.1, Molecular Devices) utilizzando un amplificatore MultiClamp 700B (Molecular Devices) e un digitalizzatore Digidata 1550B (Molecular Devices), filtrati passa-basso a 2 kHz, digitalizzati a 20 kHz e analizzati con Clampfit (versione 10.6) per analisi, dispositivi molecolari) e funzioni MATLAB personalizzate (MATLAB 2019b, Mathworks). Il potenziale di giunzione è stato calcolato utilizzando JPCalc e i valori sono stati adattati al potenziale di giunzione calcolato di -14 mV. L'operazione IV consiste in una serie di incrementi di corrente di 5-10 pA, da -50 a 250 pA.
Per la ricostruzione morfologica dei neuroni pizzicati, è stato aggiunto biocitina allo 0,2% (Sigma-Aldrich) alla soluzione interna. Le cellule vengono preparate per almeno 15 minuti dopo l'hacking. La pipetta viene quindi aspirata lentamente per 1-2 minuti fino alla completa sigillatura della membrana registrata. Seguendo la procedura di fisiologia delle sezioni, le sezioni sono state fissate per una notte a 4 °C in PFA al 4%, lavate con PBS X3 e diluite 1:1000 con DyLight 549 o DyLight 405 coniugato con streptavidina (Vector Labs). Le cellule riempite con biocitina (2%; Sigma-Aldrich) sono state marcate durante la registrazione con patch clamp a temperatura ambiente per 2 ore. Le sezioni sono state quindi montate su vetrini per microscopia utilizzando un Aquamount (Thermo Scientific) e visualizzate il giorno successivo su un microscopio confocale Leica TCS SP8 con obiettivo a immersione in olio e apertura numerica ×40 1,3, ingrandimento ×0,9–1,0, xy. La frequenza di campionamento è di circa 7 pixel per micron. Sono stati ottenuti in serie Z-stack a intervalli di 1 µm, e sono stati eseguiti mosaici di Z-stack e auto-stitching basati su Leica per coprire l'intero albero dendritico di ciascun neurone. I neuroni sono stati quindi tracciati semi-manualmente utilizzando l'interfaccia neuTube 40 e sono stati generati file SWC. I file sono stati quindi caricati sul plugin SimpleNeuriteTracer41 Fiji (ImageJ, versione 2.1.0; NIH).
Tessuto corticale umano è stato ottenuto con consenso informato secondo un protocollo approvato dall'Institutional Review Board dell'Università di Stanford. Due campioni di tessuto postpartum umano (di età compresa tra 3 e 18 anni) sono stati ottenuti mediante resezione della corteccia frontale (giro frontale medio) nell'ambito di un intervento chirurgico per epilessia refrattaria. Dopo la resezione, il tessuto è stato prelevato in NMDG-aCSF ghiacciato contenente: 92 mM di NMDG, 2,5 mM di KCl, 1,25 mM di NaH₂PO₂, 30 mM di NaHCO₂, 20 mM di HEPES, 25 mM di glucosio, 2 mM di tiourea, 5 mM di ascorbato di sodio, 3 mM di piruvato di sodio, 0,5 mM di CaCl₂·4H₂O e 10 mM di MgSO₂·7H₂O. Titolare a pH 7,3-7,4 con acido cloridrico concentrato. I tessuti sono stati consegnati al laboratorio entro 30 minuti e sono state prelevate sezioni coronali secondo la procedura descritta sopra.
Tutte le procedure sugli animali sono state eseguite in conformità con le linee guida per la cura degli animali approvate dall'APLAC della Stanford University. I ratti (oltre 140 giorni dopo il trapianto) sono stati indotti con anestesia con isoflurano al 5% e anestetizzati con isoflurano all'1-3% intraoperatoriamente. Gli animali sono stati posizionati su un telaio stereotassico (Kopf) e buprenorfina a rilascio prolungato (SR) è stata iniettata per via sottocutanea. Il cranio è stato esposto, pulito e sono state inserite 3-5 viti ossee. Per indirizzare la t-hCO2, abbiamo generato coordinate stereotassiche da immagini di risonanza magnetica. È stato praticato un foro con una fresa nel sito di interesse e le fibre (diametro 400 µm, NA 0,48, Doric) sono state abbassate 100 µm al di sotto della superficie dell'hCO2 e fissate al cranio con cemento dentale fotopolimerizzabile (Relyx).
Le registrazioni fotometriche in fibra sono state eseguite come precedentemente descritto42. Per registrare l'attività spontanea, i ratti sono stati posti in una gabbia pulita e un cavo patch in fibra ottica da 400 µm di diametro (Doric) collegato a un sistema di acquisizione dati fotometrici in fibra ottica è stato collegato al cavo in fibra ottica impiantato. Durante i 10 minuti di registrazione dell'attività motoria, gli animali erano liberi di esplorare la gabbia. Per registrare l'attività evocata, i ratti (oltre 140 giorni dopo il trapianto) sono stati anestetizzati con isoflurano al 5% per l'induzione e isoflurano all'1-3% per il mantenimento. Posizionare l'animale in un telaio stereotassico (Kopf) e i baffi sul lato opposto del t-hCO vengono accorciati a circa 2 cm e fatti passare attraverso una rete collegata a un attuatore piezoelettrico (PI). Un cavo patch in fibra ottica da 400 µm (Doric) è stato collegato alla fibra impiantata e al sistema di acquisizione dati. I baffi sul lato opposto di t-hCO sono stati quindi deviati 50 volte (2 mm a 20 Hz, 2 s per presentazione) a intervalli casuali tramite un azionamento piezoelettrico, per un periodo di registrazione di 20 minuti. Utilizzare il pacchetto di supporto MATLAB per Arduino per controllare il tempo di deflessione con codice MATLAB personalizzato. Gli eventi sono sincronizzati con il software di acquisizione dati tramite impulsi logici transistor-transistor (TTL).
Ratti (oltre 140 giorni dopo il trapianto) sono stati indotti con anestesia con isoflurano al 5% e anestetizzati con isoflurano all'1-3% intraoperatoriamente. Gli animali sono stati posizionati su un telaio stereotassico (Kopf) e buprenorfina SR e desametasone sono stati iniettati per via sottocutanea. Il cranio è stato esposto, pulito e sono state inserite 3-5 viti ossee. Per indirizzare la t-hCO2, abbiamo generato coordinate stereotassiche da immagini MRI. È stata eseguita una craniotomia circolare (circa 1 cm di diametro) con un trapano ad alta velocità direttamente sopra l'hCO2 trapiantato. Una volta che l'osso è stato il più sottile possibile, ma prima di perforarlo completamente, utilizzare una pinza per rimuovere il disco pelvico intatto rimanente per rivelare la t-hCO2 sottostante. La craniotomia è stata riempita con soluzione fisiologica sterile e un coprioggetto e uno speciale perno per la testa sono stati fissati al cranio con cemento dentale fotopolimerizzabile (Relyx).
L'imaging a due fotoni è stato eseguito utilizzando un microscopio multifotone Bruker con obiettivo Nikon LWD (×16, 0,8 NA). L'imaging GCaMP6 è stato eseguito a 920 nm con ingrandimento singolo sul piano z di 1,4x e una media di 8x di 7,5 fps. I ratti sono stati indotti con anestesia con isoflurano al 5% e mantenuti con isoflurano all'1-3%. I ratti sono stati posizionati in un dispositivo di fissaggio per la testa personalizzato e posizionati sotto la lente. È stata ottenuta una registrazione di sottofondo di 3 minuti dell'attività motoria. Nel corso di 20 minuti di registrazione, 50 puff (ogni presentazione della durata di 100 ms) sono stati erogati casualmente al cuscinetto vibrisse opposto a t-hCO3 utilizzando un picospricer. Utilizzare il pacchetto di supporto MATLAB Arduino per controllare il tempo di burst con codice MATLAB personalizzato. Sincronizzare gli eventi con il software di acquisizione dati (PrairieView 5.5) utilizzando impulsi TTL. Per l'analisi, le immagini sono state corrette per il movimento xy utilizzando la correzione affine nel programma MoCo lanciato nelle Fiji. L'estrazione delle tracce fluorescenti dalle singole cellule è stata effettuata utilizzando CNMF-E43. La fluorescenza è stata estratta per ciascuna regione di interesse, convertita in curve dF/F e quindi convertita in z-score.
Ratti (oltre 140 giorni dopo il trapianto) sono stati indotti con anestesia con isoflurano al 5% e anestetizzati con isoflurano all'1-3% intraoperatoriamente. Gli animali sono stati posizionati su un telaio stereotassico (Kopf) e buprenorfina SR e desametasone sono stati iniettati per via sottocutanea. I baffi sul lato opposto del t-hCO sono stati tagliati a circa 2 cm e infilati attraverso una rete collegata a un attuatore piezoelettrico. Il cranio è stato esposto e pulito. Una vite di messa a terra in acciaio inossidabile è stata fissata al cranio. Per indirizzare il t-hCO, abbiamo generato coordinate stereotassiche da immagini di risonanza magnetica. Eseguire una craniotomia circolare (circa 1 cm di diametro) con un trapano ad alta velocità appena sopra il t-hCO. Una volta che l'osso è il più sottile possibile, ma prima di perforare l'intero osso, utilizzare una pinza per rimuovere il disco pelvico intatto rimanente per rivelare il t-hCO sottostante. Le singole cellule sono state registrate utilizzando sonde in silicio ad alta densità a 32 o 64 canali (Cambridge Neurotech) collegate a terra tramite viti di messa a terra e preamplificate con amplificatori RHD (Intan). Utilizzare il manipolatore per abbassare gli elettrodi sul sito bersaglio attraverso la craniotomia, che viene riempita con soluzione salina sterile. La raccolta dati è stata eseguita a una frequenza di 30 kHz utilizzando il sistema di acquisizione dati Open Ephys. La registrazione è continuata solo quando abbiamo rilevato un'attività spontanea ritmica altamente correlata in più di 10 canali, suggerendo che gli elettrodi fossero posizionati nell'innesto (sulla base dei dati di imaging del calcio a due fotoni). È stata ottenuta una registrazione di fondo dell'attività motoria di 10 minuti. I baffi sul lato opposto di t-hCO sono stati quindi deflessi 50 volte (2 mm a 20 Hz, 2 s per presentazione) a intervalli casuali tramite un azionamento piezoelettrico per un periodo di registrazione di 20 minuti. Utilizzando il pacchetto di supporto MATLAB per Arduino (MATLAB 2019b), è stato possibile controllare il tempo di deflessione con codice MATLAB personalizzato. Utilizzare impulsi TTL per sincronizzare gli eventi con il software di acquisizione dati.
Per gli esperimenti di marcatura ottica, un cavo ottico di collegamento da 200 µm (Doric) collegato a un laser a 473 nm (Omicron) è stato collegato a una fibra ottica da 200 µm posizionata sopra la craniotomia. Immediatamente prima, regolare la potenza del jumper a 20 mW. Utilizzare il manipolatore per abbassare gli elettrodi sul sito bersaglio attraverso la craniotomia, che è riempita con soluzione salina sterile. All'inizio della registrazione, sono stati emessi dieci impulsi di luce a 473 nm (frequenza 2 Hz, durata 10 ms). Le cellule fotosensibili sono state definite come cellule che hanno mostrato una risposta a picco entro 10 ms di luce nel 70% o più delle prove.