Diolch am ymweld â Nature.com. Rydych chi'n defnyddio fersiwn porwr gyda chefnogaeth CSS gyfyngedig. I gael y profiad gorau, rydym yn argymell eich bod chi'n defnyddio porwr wedi'i ddiweddaru (neu'n analluogi Modd Cydnawsedd yn Internet Explorer). Yn ogystal, er mwyn sicrhau cefnogaeth barhaus, rydym yn dangos y wefan heb arddulliau a JavaScript.
Yn dangos carwsél o dair sleid ar unwaith. Defnyddiwch y botymau Blaenorol a Nesaf i symud trwy dair sleid ar y tro, neu defnyddiwch y botymau llithrydd ar y diwedd i symud trwy dair sleid ar y tro.
Mae organynnau niwral hunan-ymgynnull yn cynrychioli platfform in vitro addawol ar gyfer modelu datblygiad a chlefyd dynol. Fodd bynnag, nid oes gan organoidau'r cysylltedd sy'n bodoli in vivo, sy'n cyfyngu ar aeddfedu ac yn atal integreiddio â chylchedau eraill sy'n rheoli ymddygiad. Yma rydym yn dangos bod organoidau cortigol sy'n deillio o gelloedd bonyn dynol a drawsblannwyd i gortecs somatosynhwyraidd llygod noeth newyddenedigol yn datblygu mathau o gelloedd aeddfed sy'n integreiddio i gylchedau synhwyraidd a chymhelliant. Datgelodd MRI dwf organoid ôl-drawsblannu mewn sawl llinell gelloedd bonyn ac anifeiliaid, tra bod dadansoddiad craidd sengl wedi datgelu dilyniant corticogenesis a dyfodiad rhaglen drawsgrifio sy'n ddibynnol ar weithgaredd. Yn wir, mae niwronau cortigol wedi'u trawsblannu yn arddangos priodweddau morffolegol, synaptig a philen fewnol mwy cymhleth na'u cymheiriaid in vitro, gan ganiatáu canfod diffygion niwronaidd mewn cleifion â syndrom Timothy. Mae olrhain anatomegol a swyddogaethol wedi dangos bod organynnau wedi'u trawsblannu yn derbyn mewnbynnau thalamocortical a corticocortigol, ac mae recordiadau in vivo o weithgaredd niwral yn awgrymu y gall y mewnbynnau hyn gynhyrchu ymatebion synhwyraidd mewn celloedd dynol. Yn olaf, mae organoidau cortigol yn ymestyn acsonau ledled ymennydd y llygoden fawr, ac mae eu gweithrediad optogenetig yn arwain at ymddygiad sy'n ceisio gwobr. Felly, mae niwronau cortecs dynol wedi'u trawsblannu yn aeddfedu ac yn cymryd rhan yng nghylchedau'r gwesteiwr sy'n rheoli ymddygiad. Rydym yn disgwyl i'r dull hwn hwyluso canfod ffenoteipiau lefel llinyn mewn celloedd sy'n deillio o gleifion na ellir eu canfod trwy ddulliau eraill.
Mae ymennydd dynol sy'n datblygu yn broses hunan-drefnu nodedig lle mae celloedd yn lluosogi, yn gwahaniaethu, yn mudo, ac yn cysylltu i ffurfio cylchedau niwronau swyddogaethol sy'n cael eu mireinio ymhellach trwy brofiad synhwyraidd. Problem allweddol wrth ddeall datblygiad ymennydd dynol, yn enwedig yng nghyd-destun clefyd, yw'r diffyg mynediad at feinwe'r ymennydd. Gall organynnau hunan-drefnu, gan gynnwys organoidau cortecs dynol (hCO; a elwir hefyd yn sffêr y cortecs dynol), gynhyrchu 2,3,4,5,6. Fodd bynnag, mae sawl cyfyngiad yn cyfyngu ar eu cymhwysiad ehangach i ddeall datblygiad a swyddogaeth cylchedau niwral. Yn benodol, nid yw'n glir a yw aeddfedu hCO wedi'i gyfyngu gan absenoldeb rhai mewnbynnau microamgylcheddol a synhwyraidd sy'n bresennol in vivo. Yn ogystal, oherwydd nad yw hCOs wedi'u hintegreiddio i gylchedau a all gynhyrchu canlyniadau ymddygiadol, mae eu defnyddioldeb wrth fodelu anhwylderau niwroseiciatrig cymhleth yn enetig ac ymddygiadol yn gyfyngedig ar hyn o bryd.
Gall trawsblannu hCO i ymennydd byw cyfan oresgyn y cyfyngiadau hyn. Mae astudiaethau blaenorol wedi dangos bod niwronau dynol sydd wedi'u trawsblannu i'r cortecs cnofilod yn gallu goroesi, taflunio a chyfathrebu â chelloedd cnofilod7,8,9,10,11,12. Fodd bynnag, mae'r arbrofion hyn fel arfer yn cael eu cynnal ar anifeiliaid sy'n oedolion, a all gyfyngu ar integreiddio synaptig ac axonaidd. Yma, rydym yn disgrifio paradigm trawsblannu lle gwnaethom drawsblannu hCO 3D sy'n deillio o gelloedd hiPS i'r cortecs somatosynhwyraidd cynradd (S1) o lygod mawr diffygiol mewn imiwnedd yng nghyfnod cynnar datblygiad plastig. Mae niwronau hCO (t-hCO) wedi'u trawsblannu yn aeddfedu'n sylweddol, yn derbyn mewnbynnau thalamocortical a cortigol-cortigol sy'n ennyn ymatebion synhwyraidd, ac yn ymestyn tafluniadau axonaidd i ymennydd y llygoden fawr i yrru ymddygiad sy'n ceisio gwobr. Mae aeddfedu estynedig t-hCO wedi datgelu diffygion niwronaidd mewn cleifion â syndrom Timothy (TS), anhwylder genetig difrifol a achosir gan dreigladau yn y sianel calsiwm CaV1.2 math-L sy'n sensitif i foltedd (wedi'i hamgodio gan CACNA1C).
I astudio niwronau cortigol dynol mewn cylchedau in vivo, fe wnaethom drawsblannu hCO 3D cyfan yn stereotactig i S1 llygod mawr athymig ôl-enedigol cynnar (dyddiau 3-7 ar ôl enedigaeth) (Ffig. 1a a data estynedig Ffig. 1a-c). Ar y pwynt hwn, nid yw'r tafluniadau axonaidd thalamocortical a corticocortigol wedi cwblhau eu nerfiad S1 eto (cyf. 13). Felly, mae'r dull hwn wedi'i gynllunio i wneud y mwyaf o integreiddio t-hCO wrth leihau'r effaith ar gylchedau mewndarddol. I ddelweddu lleoliad t-hCO mewn anifeiliaid byw, fe wnaethom ail-greu ymennydd MRI pwysol T2 o lygod mawr 2-3 mis ar ôl trawsblannu (Ffig. 1b a data estynedig, Ffig. 1d). Arsylwyd t-hCO yn rhwydd ac roedd mesuriadau cyfaint t-hCO yn debyg i'r rhai a gyfrifwyd o sleisys sefydlog (Data Estynedig Ffig. 1d,e; P > 0.05). Arsylwyd t-hCO yn rhwydd ac roedd mesuriadau cyfaint t-hCO yn debyg i'r rhai a gyfrifwyd o sleisys sefydlog (Data Estynedig Ffig. 1d,e; P > 0.05). t-hCO легко наблюдались, а объемные измерения t-hCO были аналогичны рассчитанным для фиксировансреѷ данные, рис 1d, e; Roedd t-hCO2 yn hawdd ei arsylwi, ac roedd mesuriadau t-hCO2 cyfeintiol yn debyg i'r rhai a gyfrifwyd ar gyfer adrannau sefydlog (data estynedig, Ffig. 1d, e; P > 0.05).很容易观察到t-hCO，并且t-hCO cliciwch i weld mwy o luniau o'r enw P > 、 、 0.05 ）很容易观察到t-hCO，并且t-hCO t-hCO легко наблюдался, а объемные измерения t-hCO были аналогичны рассчитанным для фиксированнреѷе данные, рис 1d, e; Roedd t-hCO2 yn hawdd ei arsylwi, ac roedd mesuriadau t-hCO2 cyfeintiol yn debyg i'r rhai a gyfrifwyd ar gyfer adrannau sefydlog (data estynedig, Ffig. 1d, e; P > 0.05).Fe wnaethom bennu t-hCO3 mewn 81% o anifeiliaid a drawsblannwyd tua 2 fis ar ôl trawsblannu (n = 72 o anifeiliaid; hCO3 o 10 llinell gell hiPS; llinellau celloedd hiPS yn Nhabl Atodol 1). O'r rhain, roedd 87% wedi'u lleoli yn y cortecs cerebral (Ffig. 1c). Drwy gynnal sganiau MRI cyfresol ar sawl pwynt amser yn yr un llygoden fawr a drawsblannwyd, gwelsom gynnydd naw gwaith yng nghyfaint t-hCO3 o fewn 3 mis (Ffig. 1d a data estynedig, Ffig. 1f). Roedd gan anifeiliaid a drawsblannwyd gyfradd oroesi uchel (74%) 12 mis ar ôl trawsblannu (data estynedig, Ffig. 1g a Thabl Atodol 2), ac ni chanfuwyd unrhyw namau echddygol neu gof amlwg, gliosis, na electroenceffalogram (EEG). Data Ffig. 1g a thabl atodol 2). 1h–m a 3e).
a, Cynllun sgematig o ddyluniad arbrofol. Cafodd hCO3 a ddeilliodd o gelloedd hiPS ei drawsblannu i S1 llygod noeth newydd-anedig ar ddiwrnodau 30-60 o wahaniaethu. b, Delweddau MRI coronaidd a llorweddol wedi'u pwysoli gan T2 yn dangos t-hCO3 yn S1 2 fis ar ôl trawsblannu. Bar graddfa, 2 mm. c, Mesur cyfraddau llwyddiant impio a ddangosir ar gyfer pob llinell gell hiPS (n = 108, mae'r niferoedd o fewn y bariau'n dangos faint o t-hCO3 fesul llinell gell hIPS) a lleoliad cortigol neu isgortigol (n = 88). d, Delwedd MRI o rydweli goronaidd (chwith; bar graddfa, 3 mm) ac ail-greu cyfeintiol 3D cyfatebol (bar graddfa, 3 mm) yn dangos cynnydd yn t-hCO3 dros 3 mis. e, Adolygiad o batrymau t-hCO3 yng nghortecs yr ymennydd llygod mawr. Bar graddfa, 1 mm. f, Delweddau imiwnocytochemegol cynrychioliadol o t-hCO a ddangosir o'r chwith uchaf i'r dde (yn ystod gwahaniaethu): PPP1R17 (4 mis oed), NeuN (8 mis oed), SOX9 a GFAP (8 mis oed), PDGFRα; (8 mis), MAP2 (8 mis) ac IBA1 (8 mis). Bar graddfa, 20 µm. Mae cyd-fynegiant HNA yn dynodi celloedd o darddiad dynol. g, snRNA-seq: Delweddu lleihau dimensiwn maniffold a thafluniad unedig (UMAP) o bob niwclews t-hCO o ansawdd uchel ar ôl integreiddio Seurat (n=3 sampl t-hCO, n=2 linell gell hiPS). Astrocytes, celloedd y llinell astrocyte; cyc prog, rhagflaenwyr cylchredeg; GluN DL, niwronau glutamatergig dwfn; GluN DL/SP, niwronau glutamatergig dwfn ac islamellar; GluN UL, niwronau glutamatergig haen uchaf; oligodendrocytes, oligodendrocytes; OPC, celloedd rhagflaenydd oligodendrocyte; RELN, niwronau reelin. h, Dadansoddiad cyfoethogi termau Ontoleg Genynnau (GO) o enynnau wedi'u huchreoleiddio'n sylweddol (P wedi'i addasu < 0.05, newid plyg > 2, wedi'i fynegi mewn o leiaf 10% o niwclysau) mewn niwronau glutamatergig t-hCO o'i gymharu â niwronau glutamatergig hCO. h, Dadansoddiad cyfoethogi termau Ontoleg Genynnau (GO) o enynnau wedi'u huchreoleiddio'n sylweddol (P wedi'i addasu < 0.05, newid plyg > 2, wedi'i fynegi mewn o leiaf 10% o niwclysau) mewn niwronau glutamatergig t-hCO o'i gymharu â niwronau glutamatergig hCO. h, Анализ обогащения терминов Gene Ontology (GO) для генов со значительной активацией (скорректированный P <0,05> 2, экспрессия по крайней мере в 10% ядер) в глутаматергических нейронах t-hCO по сравнению сравнению с глутаматергических нейронах t-hCO по сравнению с глутмичих hCO. h, Dadansoddiad cyfoethogi termau Ontoleg Genynnau (GO) ar gyfer genynnau ag actifadu sylweddol (P wedi'i addasu <0.05, newid plyg >2, mynegiant mewn o leiaf 10% o'r niwclei) mewn niwronau glutamatergig t-hCO o'i gymharu â niwronau glutamatergig hCO. h，与hCO 谷氨酸能神经元相比, t-hCO 谷氨酸能神经元中基因显着世调（调整.嘌嘍台 咃整. 2, 在至少 10% 的细胞核中表达）的基因本体论(GO) 术语富集分析。 h，与 hco谷氨酸能元相比，t-hco 谷氨酸能 神经元 基因显着 上调（后 嘌 嘌 嘌 后 嘎 嘎 嘎 嘏 变化> 2 ， 至少 10% 的 核中 表达） 基因 基因 基因 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的的 的本体论(GO) 术语富集分析。 h, гены значительно активизировались (скорректированный P <0,05, кратность изменения> 2, экспрессипо мере в 10% ядер) в глутаматергических нейронах t-hCO по сравнению с глутаматергическими нейронами hCO Оионих анализ термина обогащения. h, roedd genynnau wedi'u cynyddu'n sylweddol (P wedi'i addasu < 0.05, newid plyg > 2, wedi'i fynegi mewn o leiaf 10% o'r niwclysau) mewn niwronau glutamatergig t-hCO o'i gymharu â niwronau glutamatergig hCO Dadansoddiad ontolegol (GO) o'r term cyfoethogi.Mae'r llinell ddotiog yn dangos gwerth aq o 0.05. i, delweddu UMAP o fathau o gelloedd GluN mewn t-hCO gan ddefnyddio trosglwyddo label o set ddata cortecs modur oedolion 22 snRNA-seq cyfeirio. CT — celloedd corticothalamig, ET — celloedd allymennydd, IT — celloedd telenceffalig mewnol, NP — tafluniad agos.
Yna fe wnaethom asesu'r cytobensaernïaeth a chyfansoddiad cellog cyffredinol t-hCO. Datgelodd staenio gwrthgyrff celloedd endothelaidd llygod mawr fasgwlareiddio gyda t-hCO, tra bod staenio IBA1 wedi datgelu presenoldeb microglia llygod mawr drwy gydol y grafft (Ffig. 1f a data estynedig, Ffig. 3c,d). Datgelodd imiwnostainio gelloedd positif antigen niwclear dynol (HNA) yn cyd-fynegi PPP1R17 (rhagflaenwyr cortigol), NeuN (niwronau), SOX9 a GFAP (celloedd sy'n deillio o glial) neu PDGFRα (rhagflaenwyr oligodendrocyte) (Ffigur 1f). I astudio cyfansoddiad cellog t-hCO ar benderfyniad celloedd sengl, fe wnaethom gynnal dilyniannu RNA craidd sengl (snRNA-seq) ar ôl tua 8 mis o wahaniaethu. Cynhyrchodd hidlo swmp a chael gwared ar niwclysau llygod mawr 21,500 o fapiau mononiwclear dynol o ansawdd uchel (Ffig. 1g a data estynedig, Ffig. 4a,b). Nododd patrymau mynegiant marcwyr math celloedd nodweddiadol glystyrau o brif ddosbarthiadau celloedd cortigol, gan gynnwys niwronau glutamatergig dwfn ac arwynebol, rhagflaenwyr cylchredol, oligodendrocytau, a llinach astrocytau (Ffig. 1g, data estynedig, Ffig. 4c, a Thabl Atodol 3). Dangosodd imiwnostainio ar gyfer SATB2 a CTIP2, er gwaethaf presenoldeb isdeipiau cortigol, nad oedd t-hCO yn dangos haeniad anatomegol clir (data estynedig, Ffig. 3a). Cynhyrchodd hCO seq snRNA cyfatebol o ran cam ddosbarthiadau celloedd tebyg iawn, gydag ychydig o eithriadau, gan gynnwys absenoldeb oligodendrocytau a phresenoldeb niwronau GABAergig, a all adlewyrchu'r amodau in vitro ffafriol a adroddwyd yn flaenorol ar gyfer celloedd rhagflaenwyr ochrol15 (data estynedig, Ffig. 4f – i a Thabl Atodol 4). Datgelodd dadansoddiad gwahaniaethol o fynegiant genynnau wahaniaethau sylweddol mewn niwronau glutamatergig rhwng t-hCO a hCO (Tabl Atodol 5), gan gynnwys actifadu setiau o enynnau sy'n gysylltiedig ag aeddfedu niwronau megis signalau synaptig, lleoleiddio dendritig, a gweithgaredd sianel foltedd-gatiedig (Ffigur 1h a Thabl Atodol 5). tabl 6). Yn unol â hynny, dangosodd niwronau t-hCO glutamatergig cortigol aeddfedu trawsgrifio cyflymach.
Er mwyn egluro a oedd y newidiadau trawsgrifio hyn yn t-hCO yn gysylltiedig â gwahaniaethau morffolegol rhwng hCO in vitro a t-hCO in vivo, fe wnaethom ail-greu hCO a hCO wedi'u llenwi â biocytin sy'n cyfateb i gamau mewn adrannau acíwt ar ôl 7-8 mis o wahaniaethu. niwronau hCO (Ffig. 2a). Roedd niwronau t-hCO yn sylweddol fwy, roedd ganddynt 1.5 gwaith diamedr y soma, dwywaith cymaint o dendritau, a chynnydd cyffredinol o chwe gwaith yng nghyfanswm hyd y dendritig o'i gymharu â hCO in vitro (Ffig. 2b). Yn ogystal, gwelsom ddwysedd sylweddol uwch o bigau dendritig mewn niwronau t-hCO nag mewn niwronau hCO (Ffig. 2c). Mae hyn yn awgrymu bod niwronau t-hCO yn cael ymestyn a changhennu dendritig helaeth, a all, ar y cyd â lluosogiad celloedd parhaus, gyfrannu at dwf dwys t-hCO ar ôl trawsblannu (Ffig. 1d a Data Estynedig Ffig. 1f). Fe wnaeth hyn ein hannog i ymchwilio i'r priodweddau electroffisiolegol. Roedd cynhwysedd y bilen wyth gwaith yn uwch (data estynedig, Ffig. 8d), roedd potensial y bilen cyflwr gorffwys wedi'i hyperbolareiddio'n fwy (tua 20 mV), ac fe wnaeth chwistrelliad cerrynt achosi cyfradd gyffroi uchaf uwch mewn niwronau t-hCO3 nag mewn niwronau hCO3. in vitro (Ffig. 2d), e), sy'n gyson â nodweddion morffolegol mwy a mwy cymhleth t-hCO3. Yn ogystal, roedd amlder digwyddiadau cerrynt ôl-synaptig cyffroi digymell (EPSC) yn sylweddol uwch mewn niwronau t-hCO3 (Ffig. 2f), gan awgrymu bod y dwysedd cynyddol o bigau dendritig a welwyd mewn niwronau t-hCO3 yn gysylltiedig â chyffroi swyddogaethol. synaps rhywiol. Cadarnhawyd cymeriad anaeddfed niwronau hCO3 in vitro trwy gofnodi niwronau glutamatergig wedi'u labelu (data estynedig, Ffig. 6a-c).
a, ail-greu 3D o niwronau hCO a t-hCO wedi'u llenwi â biocytin ar ôl 8 mis o wahaniaethu. b, Mesur nodweddion morffolegol (n = 8 niwron hCO, n = 6 niwron t-hCO; **P = 0.0084, *P = 0.0179 a ***P < 0.0001). b, Mesur nodweddion morffolegol (n = 8 niwron hCO, n = 6 niwron t-hCO; **P = 0.0084, *P = 0.0179 a ***P < 0.0001). б, количественная оценка мор pethолческих признаков (n = 8 нейронов hco, n = 6 н 6,0001). b, meintioli nodweddion morffolegol (n=8 niwron hCO, n=6 niwron t-hCO; **P=0.0084, *P=0.0179, a ***P<0.0001). b，形态学特征的量化（n = 8 个hCO 神经元， n = 6个t-hCO 神经元；**P = 0.0084，*P = 0.01.**0 ／ b，形态学特征的量化（n = 8 个hCO 神经元， n = 6个t-hCO 神经元；**P = 0.0084，*P = 0.01.**0 ／ б, количественная оценка мор pethолческих признаков (n = 8 нейронов hco, n = 6 н 6,0001). b, meintioli nodweddion morffolegol (n=8 niwron hCO, n=6 niwron t-hCO; **P=0.0084, *P=0.0179, a ***P<0.0001).c, Ail-greu 3D o ganghennau dendritig hCO3 a t-hCO3 ar ôl 8 mis o wahaniaethu. Mae seren goch yn dynodi asgwrn cefn dendritig tybiedig. Mesur dwysedd asgwrn cefn dendritig (n = 8 niwron hCO3, n = 6 niwron t-hCO3; **P = 0.0092). d, Mesur potensial y bilen gorffwys (n = 25 niwron hCO, n = 16 niwron t-hCO; ***P < 0.0001). d, Mesur potensial y bilen gorffwys (n = 25 niwron hCO, n = 16 niwron t-hCO; ***P < 0.0001). d, количественная оценка мембранного потенциала покоя (n = 25 нейронов hCO, n = 16 нейронов t-hCO; *** P <0,0001). d, meintioli potensial pilen gorffwys (n = 25 niwron hCO, n = 16 niwron t-hCO; ***P < 0.0001). d，静息膜电位的量化（n = 25 hCO 神经元， n = 16 t-hCO 神经元； ***P < 0.0001）。 d，静息膜电位的量化（n = 25 hCO 神经元， n = 16 t-hCO 神经元； ***P < 0.0001）。 d, количественная оценка мембранного потенциала покоя (n = 25 нейронов hCO, n = 16 нейронов t-hCO; *** P <0,0001). d, meintioli potensial pilen gorffwys (n = 25 niwron hCO, n = 16 niwron t-hCO; ***P < 0.0001). e, Tanio potensial gweithredu ailadroddus mewn hCO a t-hCO wedi'i achosi gan gynyddu chwistrelliadau cerrynt, a meintioli'r gyfradd danio uchaf (n = 25 niwron hCO, n = 16 niwron t-hCO; ***P < 0.0001). e, Tanio potensial gweithredu ailadroddus mewn hCO a t-hCO wedi'i achosi gan gynyddu chwistrelliadau cerrynt, a meintioli'r gyfradd danio uchaf (n = 25 niwron hCO, n = 16 niwron t-hCO; ***P < 0.0001). e, повторное возбуждение потенциала действия в hCO и t-hCO , вызванное увеличением тока , и количественкем оца оличественка и количественкем оца скорости возбуждения (n = 25 нейронов hCO, n = 16 нейронов t-hCO; *** P <0,0001). e, ail-danio potensial gweithredu yn hCO a t-hCO wedi'i achosi gan gynnydd cerrynt a meintioli'r gyfradd danio uchaf (n = 25 niwron hCO, n = 16 niwron t-hCO; *** P < 0.0001). e，通过增加电流注入诱导的hCO 和t-hCO 重复动作电位放电,以及最大放电率的5 =CO神经元，n = 16个t-hCO 神经元； *** P < 0.0001）。 E，通过增加电流注入的的 hco和 t-hco 重复电位放电，以及最大的里 和 和神经 ， n = 16个 t-hco 神经 ； *** p <0.0001）。 e, повторяющееся возбуждение потенциала действия hCO и t-hCO , вызванное увеличением подачи тока, и компании максимальной скорости возбуждения (n = 25 нейронов hCO, n = 16 нейронов t-hCO; *** P <0,0001). e, tanio ailadroddus o botensialau gweithredu hCO a t-hCO a achosir gan gyflenwad cerrynt cynyddol a meintioli'r gyfradd danio uchaf (n = 25 niwron hCO, n = 16 niwron t-hCO; *** P < 0.0001). f, EPSCs digymell (sEPSCs) mewn niwronau hCO a t-hCO ar ôl 8 mis o wahaniaethu, a meintioli amlder digwyddiadau synaptig (n = 25 niwron hCO, n = 17 niwron t-hCO; ***P < 0.0001). f, EPSCs digymell (sEPSCs) mewn niwronau hCO a t-hCO ar ôl 8 mis o wahaniaethu, a meintioli amlder digwyddiadau synaptig (n = 25 niwron hCO, n = 17 niwron t-hCO; ***P < 0.0001). f, спонтанные EPSC (sEPSC) в нейронах hCO и t-hCO через 8 месяцев дифференцировки и количественная оценкапаты чаты чаты чественная оценкаты событий (n = 25 нейронов hCO, n = 17 нейронов t-hCO; *** P <0,0001). f, EPSCs digymell (sEPSCs) mewn niwronau hCO a t-hCO ar ôl 8 mis o wahaniaethu a meintioli cyfraddau digwyddiadau synaptig (n=25 niwron hCO, n=17 niwron t-hCO; ***P<0.0001). f，分化8 个月时hCO 和t-hCO 神经元中的自发性EPSCs (sEPSCs), 以及突触事件频率的里匌 = 2神经元， n = 17 t-hCO 神经元； *** P < 0.0001） . f, 分化8 个月时hCO 和t-hCO 神经元中的自发性EPSCs (sEPSCs), 以及突触事件频率的釼匼匼匼匼匼及神率的量匼（n = 25 hCO 神率的量匼（n = 25hCO P < 0.0001） . f, спонтанные EPSC (sEPSC) в нейронах hCO и t-hCO через 8 месяцев дифференцировки и количественная оценкапаты чаты чаты чественная оценкаты событий (n = 25 нейронов hCO, n = 17 нейронов t-hCO; *** P <0,0001). f, EPSCs digymell (sEPSCs) mewn niwronau hCO a t-hCO ar ôl 8 mis o wahaniaethu a meintioli cyfraddau digwyddiadau synaptig (n = 25 niwron hCO, n = 17 niwron t-hCO; *** P<0.0001).Ar gyfer bf, cymerwyd hCO3 a t-hCO3 yn llinell 1208-2 o'r un swp gwahaniaethu a gynhaliwyd yn gyfochrog. g, Dadansoddiad cyfoethogi setiau genynnau (prawf union Fisher unochrog) o enynnau wedi'u huchreoleiddio'n sylweddol (P wedi'i addasu < 0.05, newid plyg > 2, wedi'i fynegi mewn o leiaf 10% o niwclysau) mewn niwronau glutamatergig t-hCO o'i gymharu â niwronau glutamatergig hCO gyda setiau genynnau o enynnau sy'n ddibynnol ar weithgaredd ymateb cynnar (ERG) ac ymateb hwyr (LRG) a nodwyd o astudiaeth llygoden in vivo16 ac LRGs penodol i bobl o niwronau in vitro17. g, Dadansoddiad cyfoethogi setiau genynnau (prawf union Fisher unochrog) o enynnau wedi'u huchreoleiddio'n sylweddol (P wedi'i addasu < 0.05, newid plyg > 2, wedi'i fynegi mewn o leiaf 10% o niwclysau) mewn niwronau glutamatergig t-hCO o'i gymharu â niwronau glutamatergig hCO gyda setiau genynnau o enynnau sy'n ddibynnol ar weithgaredd ymateb cynnar (ERG) ac ymateb hwyr (LRG) a nodwyd o astudiaeth llygoden in vivo16 ac LRGs penodol i bobl o niwronau in vitro17. g, анализ обогащения набора генов (односторонний точный критерий Фишера) генов со значительной акительной акительной акительной акительной акительной (скорректированный P <0,05, кратность изменения > 2, экспрессия по меньшей мере в 10% ядер) в глутамаронкина t-hCO по сравнению с глутаматергическими нейронами hCO наборы генов как раннего (ERG), так и позднего (LRG, годимато, LRG) активности, идентифицированных в исследовании на мышах in vivo16, и специфических для человека нроов 16 in vivo. g, dadansoddiad o gyfoethogi setiau genynnau (prawf union Fisher un-gynffon) o enynnau ag actifadu sylweddol (P wedi'i addasu <0.05, newid plyg >2, mynegiant mewn o leiaf 10% o niwclysau) mewn niwronau glutamatergig t-hCO o'i gymharu â setiau niwronau glutamatergig hCO o enynnau sy'n ddibynnol ar weithgaredd cynnar (ERG) a hwyr (LRG) a nodwyd mewn llygod in vivo16 ac LRGs penodol i bobl o niwronau in vitro17. g，t-hCO谷氨酸能神经元与hCO谷氨酸能神经元相比，t -hCO谷氨酸能神经元显着上调（调整后P<0.05,倍数变化>2，在至少10%的细胞核中表达）的基因集富集分析（单侧F isher精确检验）从体内小鼠研究中鉴定的早期反应(ERG)和晚期反应(LRG) 活性依赖性基因的基因组16 和体外神经元17 中的人类特倂 g，t-hco 谷氨酸神经元与 hco 谷氨酸神经元相比，t-hco谷氨酸神经元上<0. ， 倍数>2 ， 至少至少 10%的细胞核中表达）的集富集分析伈单侧 pysgotwr 精＆小鼠研究 中的早期反应反应反应和晚期反应 反应 (chd) 活性 基因的基因组的基因组 16神经元 17中中 17中 17的人类特异性LRG. g, глутаматергические нейроны t-hCO были значительно активизированы по сравнению с глутаматергемичи (скорректированный P<0,05, кратность изменения> 2, не менее 10% Анализ обогащения набора генов (одностора генов (одностора генов) Фишера) раннего ответа (ERG) и позднего гены, зависящие от активности ответа (LRG), идентифицирования идентифицирования мышах in vivo16 a нейронах in vitro17. LRG, специфичные для человека. g, roedd niwronau glutamatergig t-hCO wedi'u cynyddu'n sylweddol o'i gymharu â niwronau glutamatergig hCO (P wedi'i addasu <0.05, newid plyg >2, o leiaf 10% Dadansoddiad cyfoethogi genynnau ymateb cynnar (ERG) ac ymateb hwyr (prawf union Fisher un gynffon) genynnau sy'n ddibynnol ar weithgaredd ymateb (LRGs) a nodwyd mewn llygod in vivo16 a niwronau in vitro.17 LRGs penodol i bobl.Mae'r llinell ddotiog yn dangos gwerth P wedi'i gywiro gan Bonferroni o 0.05. h, roedd mynegiant genyn GluN (pecyn ffug a graddio pob genyn) wedi'i uwchreoleiddio'n sylweddol mewn atgynhyrchiadau snRNA-seq o enynnau LRG mewn niwronau glutamatergig t-hCO. i, imiwnostainio yn dangos mynegiant SCG2 mewn niwronau t-hCO (uchaf) a hCO (isaf). Mae saethau gwyn yn pwyntio at gelloedd SCG2+. Bar graddfa, 25 µm. Mynegir data fel cymedr ± gwyriad safonol.
Yn seiliedig ar y gweithgaredd cynyddol o t-hCO a welwyd mewn sleisys ex vivo, datgelodd snRNA-seq gynnydd mewn trawsgrifiadau genynnau yn t-hCO sy'n ddibynnol ar weithgaredd o'i gymharu â hCO in vitro. Mynegodd niwronau t-hCO glutamatergig lefelau uwch o enynnau sy'n rheoleiddio gweithgaredd ymateb hwyr (Ffig. 2g,h), a ganfuwyd mewn astudiaethau blaenorol mewn niwronau llygoden a dynol16,17. Er enghraifft, dangosodd BDNF18, SCG2, ac OSTN, genyn rheoleiddio gweithgaredd penodol i brimatiaid, fynegiant cynyddol mewn niwronau t-hCO o'i gymharu â niwronau hCO (Ffig. 2g-i). Felly, dangosodd niwronau t-hCO nodweddion aeddfedu gwell o'i gymharu â niwronau hCO trwy ddadansoddiadau trawsgrifio, morffolegol, a swyddogaethol.
Er mwyn gwerthuso ymhellach y cysylltiad rhwng aeddfedu t-hCO a datblygiad ymennydd dynol, gwnaethom gymhariaethau trawsgrifiomig o fathau o gelloedd cortigol ffetws ac oedolyn19,20 ac oedolion21,22 yn ogystal â data helaeth ar fynegiant genynnau cortigol23 yn ystod datblygiad (data estynedig, Ffig. 5). gyda gwaith blaenorol24, mae statws aeddfedu trawsgrifio hCO a t-hCO byd-eang ar 7-8 mis o wahaniaethu yn fras gyson ag amser datblygu in vivo ac mae'n fwyaf cyfatebol i fywyd ffetws hwyr (Data Estynedig Ffig. 5a). Yn nodedig, gwelsom aeddfedrwydd trawsgrifio cynyddol yn t-hCO o'i gymharu â hCO cyfatebol o ran oedran, yn ogystal ag actifadu trawsgrifio sy'n gysylltiedig â synaptogenesis, astrogenesis, a myeliniad (data estynedig, Ffig. 5b-d). Ar y lefel gellog, gwelsom dystiolaeth o isdeip cortecs teneuach yn t-hCO, gyda chlystyrau o niwronau glutamatergig yn gorgyffwrdd ag isdeipiau niwron L2/3, L5, ac L6 oedolion (Ffigur 1i). Mewn cyferbyniad, roedd gorgyffwrdd clwstwr rhwng niwronau t-hCO glutamatergig a niwronau cortigol ffetws yn fwy cyfyngedig yng nghanol beichiogrwydd (data estynedig, Ffigur 5e-j). Er mwyn pennu a yw niwronau t-hCO yn debyg yn swyddogaethol i niwronau neocortigol ôl-enedigol dynol, fe wnaethom gynnal recordiadau electroffisiolegol ac adluniadau anatomegol o niwronau pyramid L2/3 dynol mewn adrannau miniog o'r cortecs ôl-enedigol dynol (data estynedig, Ffig. 7a). Roedd priodweddau electroffisiolegol niwronau pyramid L2/3 yn debyg i rai niwronau pyramid t-hCO (data estynedig, Ffig. 7e). Yn forffolegol, roedd niwronau L2/3 o samplau dynol ôl-enedigol yn debycach i t-hCO nag i hCO, er bod celloedd L2/3 yn hirach, yn cynnwys mwy o ganghennau ar y cyfan, ac roedd ganddynt ddwysedd asgwrn cefn uwch (Ffig. 3g a data estynedig, Ffig. 7b-). G).
a, trawsblannu hCO a gynhyrchwyd gan linellau celloedd rheoli a TS hiPS i lygod mawr newyddenedigol. b, ail-greu 3D o niwronau t-hCO wedi'u llenwi â biocytin ar ôl 8 mis o wahaniaethu. c, meintioli hyd dendritig cymedrig (n = 19 niwron rheoli, n = 21 niwron TS; **P = 0.0041). d, canghennau dendritig wedi'u hail-greu mewn 3D o'r rheolydd a'r TS t-hCO ar ôl 8 mis o wahaniaethu, a meintioli dwysedd asgwrn cefn dendritig (n = 16 niwron rheoli, n = 21 niwron TS, ***P < 0.0001). d, canghennau dendritig wedi'u hail-greu mewn 3D o'r rheolydd a'r TS t-hCO ar ôl 8 mis o wahaniaethu, a meintioli dwysedd asgwrn cefn dendritig (n = 16 niwron rheoli, n = 21 niwron TS, ***P < 0.0001). d, 3D-реконструкция дендритных ветвей из контроля и TS t-hCO через 8 месяцев дифференцировки изолия плотности дендритных шипов (n = 16 контрольных нейронов, n = 21 TS нейронов, *** P <0,0001). d, Ail-greu 3D o ganghennau dendritig o'r grŵp rheoli a'r TS t-hCO ar ôl 8 mis o wahaniaethu a meintioli dwysedd asgwrn cefn dendritig (n=16 niwron rheoli, n=21 niwron TS, ***P<0.0001). d，分化8个月时对照和TS t-hCO 的3D 重建树突分支，以及树突棘密度的量化（n = 16个对照神经元， n = 21 个TS 神经元, *** P < 0.0001）。 d，分化 8个时对照和 ts t-hco 的 3d 重建 分支 分支 以及树突棘密度釈和缏 的 1元 ， n = 21 个 ts 神经 ， *** p <0.0001）。 ch, 3D-реконструкция дендритных ветвей контроля и TS t-hCO через 8 месяцев диффференцировки и коленкиче стольски дендритных шипов (n = 16 контрольных нейронов, n = 21 TS нейронов, *** P <0,0001). d, ail-greu 3D o ganghennau dendritig rheoli a TS t-hCO ar ôl 8 mis o wahaniaethu a meintioli dwysedd asgwrn cefn dendritig (n=16 niwron rheoli, n=21 niwron TS, ***P<0.0001).Mae seren goch yn dynodi asgwrn cefn dendritig tybiedig. e, EPSCs digymell mewn niwronau rheoli a TS t-hCO ar ôl 8 mis o wahaniaethu. f, plot amlder cronnus a meintioli amlder ac osgled digwyddiadau synaptig (n=32 niwron rheoli, n=26 niwron TS; **P=0.0076 a P=0.8102). g, Dadansoddiad Scholl o niwronau TS a rheoli yn hCO a t-hCO. Mae llinellau toredig yn dangos niwronau pyramid ôl-enedigol L2/3 dynol i'w cymharu (n = 24 niwron t-hCO rheoli, n = 21 niwron TS t-hCO, n = 8 niwron hCO rheoli, ac n = 7 niwron TS hCO). Mynegir data fel y cymedr ± gwyriad safonol.
Fe wnaeth gallu t-hCO i efelychu nodweddion morffolegol a swyddogaethol niwronau cortecs dynol ar lefel uchel ein hannog i archwilio a ellid defnyddio t-hCO i ganfod ffenoteipiau clefydau. Canolbwyntiom ar TS, anhwylder niwroddatblygiadol difrifol a achosir gan dreigladau ennill-swyddogaeth yn y genyn sy'n amgodio CaV1.2, sy'n cychwyn trawsgrifiad genyn sy'n ddibynnol ar weithgaredd mewn niwronau. Cawsom hCO gan dri chlaf TS sy'n cario'r amnewidiad mwyaf cyffredin (p.G406R) a thri rheolydd (Ffig. 3a). Ar ôl trawsblannu, gwelsom fod morffoleg dendritig wedi'i newid mewn niwronau TS o'i gymharu â rheolyddion (Ffig. 3b a data estynedig, Ffig. 8a,b), gyda chynnydd deublyg yn nifer y dendritau cynradd a chynnydd cyffredinol yn y gostyngiad cymedrig a chyffredinol yn hyd dendritig (Ffig. 3c a data estynedig, Ffig. 8c). Roedd hyn yn gysylltiedig â dwysedd cynyddol o bigau ac amlder cynyddol o EPSCs digymell mewn TS o'i gymharu â niwronau rheoli (Ffig. 3d–f a data estynedig, Ffig. 8g). Datgelodd dadansoddiad pellach batrymau o ganghennu dendritig annormal mewn TS t-hCO o'i gymharu â rheolyddion, ond nid mewn TS hCO in vitro ar gam gwahaniaethu tebyg (Ffig. 3g). Mae hyn yn gyson â'n hadroddiadau blaenorol ar grebachu dendritig sy'n ddibynnol ar weithgaredd mewn TS ac yn tynnu sylw at allu'r platfform trawsblannu hwn i ganfod ffenoteipiau clefydau in vivo.
Yna gofynnwyd i ba raddau y mae celloedd t-hCO wedi'u hintegreiddio'n swyddogaethol i mewn i S1 y llygoden fawr. Mae S1 mewn cnofilod yn derbyn mewnbynnau synaptig cryf o'r niwclei thalamig basal fentrol ipsilateral a posterior, yn ogystal â'r cortecsau somatosynhwyraidd modur ac eilaidd ipsilateral, ac S1 contralateral (Ffig. 4a). I adfer y patrwm nerfu, fe wnaethom heintio hCO â firws y gynddaredd-dG-GFP/AAV-G a thrawsblannu hCO i mewn i lygoden fawr S1 3 diwrnod yn ddiweddarach. Gwelsom fynegiant trwchus GFP mewn niwronau'r S1 ipsilateral a'r ganglia basal fentrol 7–14 diwrnod ar ôl trawsblannu (Ffig. 4b, c). Yn ogystal, datgelodd staenio gwrthgyrff y marcwr thalamig netrin G1 bresenoldeb terfyniadau thalamig yn t-hCO (Ffig. 4d, e). I werthuso a allai'r tafluniadau afferol hyn ysgogi ymatebion synaptig mewn celloedd t-hCO, fe wnaethom gynnal recordiadau celloedd cyfan o gelloedd dynol mewn adrannau miniog o'r haen thalamocortical. Ysgogiad trydanol S1 llygoden fawr, capsiwl mewnol, mater gwyn, ffibrau ger t-hCO neu actifadu optogenetig terfyniadau thalamig sy'n mynegi opsin mewn EPSCs hwyrni byr a achosir gan t-hCO mewn niwronau t-hCO sydd wedi'u hamlygu i'r gwrthwynebydd derbynnydd AMPA NBQX. (Ffig. 4f, g a data estynedig, Ffig. 9a–g). Mae'r data hyn yn dangos bod t-hCO wedi'i integreiddio'n anatomegol i ymennydd llygoden fawr a'i fod yn gallu cael ei actifadu gan feinwe gwesteiwr llygoden fawr.
a, Diagram sgematig o arbrawf olrhain y gynddaredd. b, GFP a mynegiant STEM121 penodol i fodau dynol rhwng t-hCO a chortecs yr ymennydd llygoden fawr (panel uchaf). Hefyd dangosir mynegiant GFP yng nghnewyllyn gwaelodol fentrol ipsilateral (VB) y llygoden fawr (chwith isaf) ac ipsilateral S1 (dde isaf). Bar graddfa, 50 µm. Mae'r sgwariau coch yn cynrychioli'r ardaloedd o'r ymennydd lle cymerwyd y delweddau. c, meintioli celloedd sy'n mynegi GFP (n = 4 llygoden fawr). d, e — Terfynellau thalamig Netrin G1+ yn t-hCO. Mae d yn dangos adran goronal sy'n cynnwys niwclysau t-hCO a VB. Bar graddfa, 2 mm. Mae e yn dangos mynegiant Netrin G1 a STEM121 mewn niwronau t-hCO (chwith) a VB (dde). Bar graddfa, 50 µm. Mae'r llinell ddotiog oren yn nodi'r ffin t-hCO. f, g, Olion cyfredol niwronau t-hCO ar ôl ysgogiad trydanol mewn llygoden fawr S1 (f) neu gapsiwl mewnol (g), gyda (porffor) neu heb (du) NBQX (chwith). Osgledau EPSC gyda a heb NBQX (n = 6 niwron S1, *P = 0.0119; ac n = 6 niwron capsiwl mewnol, **P = 0.0022) (canol). Canran y niwronau t-hCO sy'n dangos EPSC mewn ymateb i ysgogiad trydanol llygoden fawr S1 (f) neu gapsiwl mewnol (g) (dde). aCSF, hylif serebro-sbinol artiffisial. h, diagram sgematig o'r arbrawf delweddu 2P (chwith). Mynegiant GCaMP6s mewn t-hCO (canol). Bar graddfa, 100 µm. Cyfnod amser fflwroleuedd GCaMP6s (dde). i, Sgôr-Z fflwroleuedd gweithgaredd digymell. j, darlun sgematig o ysgogiad mwstas. k, llwybrau fflwroleuedd 2P wedi'u sgorio gan z mewn un treial, wedi'u halinio â gwyriad blew ar amser sero (llinell doredig) mewn celloedd enghreifftiol. l, ymatebion sgôr-z cyfartalog y boblogaeth o'r holl gelloedd wedi'u halinio â gwyriad blew ar amser sero (llinell doredig) (coch) neu stampiau amser a gynhyrchwyd ar hap (llwyd). m. Diagram sgematig o'r arbrawf ar farcio optegol. n, Cromliniau foltedd crai o gell t-hCO enghreifftiol yn ystod ysgogiad laser glas neu wyriad blew. Mae saethau coch yn nodi'r pigau cyntaf a achosir gan olau (top) neu a achosir gan wyriad blew (gwaelod). Mae cysgodi llwyd yn nodi cyfnodau o wyriad blew. o, Tonffurfiau golau brig ac ymatebion gwyriad blew. p, pigau un ymgais, wedi'u halinio â gwyriad y blew yng nghelloedd yr enghraifft. Mae 0 yn nodi gwyriad blew (llinell doredig). q, cyfradd tanio sgôr-z gyfartalog y boblogaeth ar gyfer pob cell sy'n sensitif i olau, wedi'i halinio â gwyriad blew ar amser sero (llinell doredig) (coch) neu stampiau amser a gynhyrchwyd ar hap (llwyd). r, Cyfran yr unedau ffotosensitif a fodiwleiddir yn sylweddol gan wyriad blewog (n = 3 llygoden fawr) (chwith). Uchafswm oedi sgôr-z (n = 3 llygoden fawr; n = 5 (gwyrdd golau), n = 4 (gwyrdd tywyll), ac n = 4 (cyan) unedau modiwleiddio gwyriad blewog fesul llygoden fawr) (dde). Mynegir data fel cymedr ± gwyriad safonol
Yna gofynnwyd a allai t-hCO gael ei actifadu gan ysgogiadau synhwyraidd in vivo. Fe wnaethom drawsblannu hCO yn mynegi'r dangosyddion calsiwm wedi'u hamgodio'n enetig GCaMP6 i mewn i lygod mawr S1. Ar ôl 150 diwrnod, fe wnaethom gynnal ffotometreg ffibr neu ddelweddu calsiwm dau-ffoton (Ffig. 4h a data estynedig, Ffig. 10a). Fe wnaethom ganfod bod celloedd t-hCO yn arddangos gweithgaredd rhythmig cydamserol (Ffigur 4i, Data Estynedig, Ffigur 10b a Fideo Atodol 1). I nodweddu gweithgaredd brig t-hCO, fe wnaethom gynnal recordiadau electroffisiolegol allgellog mewn llygod mawr trawsblannu wedi'u hanestheteiddio (data estynedig, Ffig. 10c-f). Rydym wedi cynhyrchu cyfesurynnau stereotacsig o ddelweddau MRI; felly, mae'r unedau cofnodedig hyn yn cynrychioli niwronau dynol tybiedig, er nad yw electroffisioleg yn unig yn caniatáu pennu rhywogaeth o darddiad. Fe wnaethom arsylwi byrstiau cydamserol o weithgaredd (data estynedig, Ffig. 10d). Parhaodd y ffrwydradau tua 460 ms ac roeddent wedi'u gwahanu gan gyfnodau tawelwch o tua 2 eiliad (data estynedig, Ffig. 10d, e). Taniodd unedau unigol gyfartaledd o tua thair rownd fesul ffrwydrad, sef tua 73% o'r unedau cofrestredig fesul ffrwydrad. Roedd gweithgareddau unedau unigol yn gysylltiedig iawn, ac roedd y cydberthnasau hyn yn uwch na rhai unedau a nodwyd mewn anifeiliaid heb eu brechu a gofnodwyd o dan yr un amodau (data estynedig, Ffig. 10f). I nodweddu ymatebion pigog niwronau sy'n deillio o fodau dynol a nodwyd ymhellach, gwnaethom arbrofion tagio golau ar lygod mawr wedi'u hanestheteiddio a drawsblannwyd â hCO3 yn mynegi'r sianel cation sy'n sensitif i olau rhodopsin 2 (hChR2), lle mae niwronau t-hCO3 yn gallu adnabod hwyrni byr (llai na 10 ms) mewn ymateb i ysgogiadau golau glas (Ffig. 4m–o). Dangosodd niwronau t-hCO ffrwydradau o weithgarwch digymell ar amleddau tebyg i'r rhai a welwyd mewn delweddu calsiwm, yn ogystal â recordiadau electroffisiolegol a gyflawnwyd yn t-hCO heb farcio golau (data estynedig, Ffig. 10c-g). Ni welwyd unrhyw weithgarwch digymell yn y camau cyfatebol o hCO a gofnodwyd in vitro. Er mwyn asesu a allai t-hCO gael ei actifadu gan ysgogiadau synhwyraidd, fe wnaethom wyro blew'r llygoden fawr i ffwrdd o t-hCO am gyfnod byr (Ffig. 4j,m a data estynedig, Ffig. 10h,k). Yn ôl astudiaethau blaenorol8,10, dangosodd is-set o gelloedd t-hCO weithgarwch cynyddol mewn ymateb i wyro blew'r llygoden, na welwyd pan gymharwyd y data â stampiau amser ar hap (Ffig. 4k–q a data estynedig, Ffig. 10h–q). Yn wir, dangosodd tua 54% o'r unedau sengl a labelwyd ag opto gyfradd cyffroi sylweddol uwch ar ôl ysgogiad blew'r llygoden, gan gyrraedd uchafbwynt o tua 650 ms (Ffig. 4r). Gyda'i gilydd, mae'r data hyn yn awgrymu bod t-hCO yn derbyn mewnbynnau swyddogaethol priodol a gellir ei actifadu gan ysgogiadau amgylcheddol.
Yna, fe wnaethom ymchwilio i weld a allai t-hCO actifadu cylchedau mewn llygod mawr i reoli ymddygiad. Yn gyntaf, fe wnaethom ymchwilio i weld a oedd acsonau niwronau t-hCO yn taflunio i feinweoedd cyfagos y llygoden fawr. Fe wnaethom heintio hCO â lentifirws yn amgodio hChR2 wedi'i asio ag EYFP (hChR2-EYFP). Ar ôl 110 diwrnod, fe wnaethom arsylwi mynegiant EYFP mewn rhanbarthau cortigol ipsilateral, gan gynnwys y cortecsau clywedol, modur, a somatosynhwyraidd, yn ogystal ag mewn rhanbarthau isgortigol, gan gynnwys y striatwm, yr hippocampus, a'r thalamws (Ffig. 5a). Er mwyn asesu a allai'r taflunio efferent hyn ysgogi ymatebion synaptig mewn celloedd llygod mawr, fe wnaethom actifadu celloedd t-hCO yn optegol sy'n mynegi hChR2-EYFP trwy gofnodi celloedd cortecs yr ymennydd llygod mawr mewn adrannau ymennydd miniog. Actifadu acsonau t-hCO gydag EPSCs hwyrni byr a achosir gan olau glas mewn niwronau cortecs pyramidaidd llygod mawr, a gafodd eu rhwystro gan NBQX (Ffigau 5b–g). Yn ogystal, gallai'r ymatebion hyn gael eu rhwystro gan tetrodotoxin (TTX) a'u hadfer gan 4-aminopyridine (4-AP), sy'n awgrymu eu bod wedi'u hachosi gan gysylltiadau monosynaptig (Ffig. 5e).
a, Diagram sgematig o olrhain axon (chwith). Mynegiant t-hCO EYFP (dde). Bar graddfa, 100 µm. A1, cortecs clywedol, ACC, cortecs cingwlaidd anterior, d. striatwm, striatwm dorsal, HPC, hippocampus; Diaffragm, septwm ochrol, mPFC, cortecs rhagblaenol medial, piri, cortecs piriform, v. striatwm, striatwm fentrol, VPM, niwclews ventropostomedial y thalamws, VTA, rhanbarth tegmental fentrol. Mae'r sgwariau coch yn cynrychioli'r ardaloedd o'r ymennydd lle cymerwyd y delweddau. b, Diagram sgematig o'r arbrawf ysgogiad. c, d, Enghreifftiau o ymateb ffotogerrynt a achosir gan olau glas (top) a foltedd (gwaelod) mewn celloedd EYFP+ t-hCO dynol (c) neu EYFP- llygod mawr (d). e, f, Olion cyfredol niwronau llygod mawr ar ôl ysgogiad golau glas o axonau t-hCO gyda TTX a 4-AR (gwyrdd), TTX (llwyd) neu aCSF (du) (e), gyda (fioled) neu heb (du)) NBQX (e). g, oedi ymatebion a achosir gan olau glas mewn celloedd llygod mawr (n = 16 cell); mae bariau llorweddol yn dynodi oedi cyfartalog (7.13 ms) (chwith). Osgled EPSCs a ysgogwyd gan olau a gofnodwyd gyda neu heb NBQX (n = 7 cell; ***P < 0.0001) (canol). Osgled EPSCs a ysgogwyd gan olau a gofnodwyd gyda neu heb NBQX (n = 7 cell; ***P < 0.0001) (canol). Амплитуда вызванных светом EPSC, зарегистрированных с или без NBQX (n = 7 клеток; ***P <0,0001)(ев цент). Osgled EPSCs a achosir gan olau a gofnodwyd gyda neu heb NBQX (n = 7 cell; ***P < 0.0001) (canol).使用或不使用NBQX 记录的光诱发EPSC 的振幅（n = 7个细胞； ***P <0.0001）（中）使用或不使用NBQX 记录的光诱发EPSC 的振幅（n = 7个细胞； ***P <0.0001）（中） Амплитуда вызванных светом EPSC, зарегистрированных с или без NBQX (n = 7 клеток; ***P <0,0001)(ев цент). Osgled EPSCs a achosir gan olau a gofnodwyd gyda neu heb NBQX (n = 7 cell; ***P < 0.0001) (canol).Canran y celloedd llygod mawr sy'n dangos EPSCs sy'n ymateb i olau glas (dde). h, Diagram sgematig o dasg ymddygiadol. d0, diwrnod 0. i. Perfformiad anifeiliaid enghreifftiol ar ddiwrnod 1 (chwith) neu ddiwrnod 15 (dde) o hyfforddiant. Y nifer cymedrig o lyfiadau a gyflawnwyd ar ddiwrnod 1 (chwith) neu ddiwrnod 15 (canol dde) (n = 150 o dreialon golau glas, n = 150 o dreialon golau coch; ***P < 0.0001). Y nifer cymedrig o lyfiadau a gyflawnwyd ar ddiwrnod 1 (chwith) neu ddiwrnod 15 (canol dde) (n = 150 o dreialon golau glas, n = 150 o dreialon golau coch; ***P < 0.0001). Среднее количество облизываний, выполненных в день 1 (слева) или день 15 (в центре справа) (n = 15 панис светом, n = 150 испытаний с красным светом ***P <0,0001). Nifer cymedrig y llyfiadau a gyflawnwyd ar ddiwrnod 1 (chwith) neu ddiwrnod 15 (canol dde) (n = 150 o dreialon golau glas, n = 150 o dreialon golau coch; ***P < 0.0001).第1 天（左）或第15 天（右中）执行的平均舔次数（n = 150 次蓝光试验，n = 150次红光试验；**P <0.0001）。第1 天（左）或第15 天（右中）执行的平均舔次数（n = 150 次蓝光试验，n = 150次红光试验；**P < 0.001 Среднее количество облизываний, выполненных в день 1 (слева) или день 15 (в центре справа) (n = 15 панис светом, n = 150 испытаний с красным светом ***P <0,0001). Nifer cymedrig y llyfiadau a gyflawnwyd ar ddiwrnod 1 (chwith) neu ddiwrnod 15 (canol dde) (n = 150 o dreialon golau glas, n = 150 o dreialon golau coch; ***P < 0.0001).Lyfiadau cronnus ar gyfer treialon golau coch a glas ar ddiwrnod 1 (canol chwith) neu ddiwrnod 15 (dde). NS, ddim yn arwyddocaol. j,k, Nodweddion ymddygiad yr holl anifeiliaid a drawsblannwyd â t-hCO yn mynegi hChR2-EYFP (j) neu fflworoffor rheoli (k) ar ddiwrnod 1 neu 15 (hChR2-EYFP: n = 9 llygoden fawr, ** P = 0.0049; rheolaeth: n = 9, P = 0.1497). l, Esblygiad y sgôr dewis (n = 9 hChR2, n = 9 rheolydd; **P < 0.001, ***P < 0.0001). l, Esblygiad y sgôr dewis (n = 9 hChR2, n = 9 rheolydd; **P < 0.001, ***P < 0.0001). l, Эволюция показателя предпочтения (n = 9 hChR2, n = 9 контрольных; **P <0,001, ***P <0,0001). l, Esblygiad y sgôr dewis (n = 9 hChR2, n = 9 rheolydd; **P < 0.001, ***P < 0.0001). l，偏好评分的演变（n = 9 hChR2， n = 9 对照；**P < 0.001, ***P < 0.0001）。 l，偏好评分的演变（n = 9 hChR2， n = 9 对照；**P < 0.001, ***P < 0.0001）。 l, Эволюция показателей предпочтения (n = 9 hChR2, n = 9 контролей; **P <0,001, ***P <0,0001). l, Esblygiad sgoriau dewis (n = 9 hChR2, n = 9 rheolydd; **P < 0.001, ***P < 0.0001).m, mynegiant FOS mewn ymateb i actifadu optogenetig t-hCO yn S1. Dangosir delweddau o fynegiant FOS (chwith), a meintioli (n = 3 fesul grŵp; *P < 0.05, **P < 0.01 a ***P < 0.001) (dde). Dangosir delweddau o fynegiant FOS (chwith), a meintioli (n = 3 fesul grŵp; *P < 0.05, **P < 0.01 a ***P < 0.001) (dde). Показаны изображения экспрессии fos (слева) и количественного определеления (n = 3 на гру * 0,0 0. (справа). Dangosir delweddau o fynegiant FOS (chwith) a meintioli (n = 3 fesul grŵp; *P<0.05, **P<0.01, a ***P<0.001) (dde).显示了FOS表达（左）和量化（每组n = 3；*P <0.05、**P <0.01 和**P < 0.001）（右倁显示了FOS表达（左）和量化（每组n = 3；*P <0.05、**P <0.01 和**P < 0.001）（右倁 Показаны изображения экспрессии fos (слева) и количественного определеления (n = 3 на гру * 0,0 0. (справа). Dangosir delweddau o fynegiant FOS (chwith) a meintioli (n = 3 fesul grŵp; *P<0.05, **P<0.01, a ***P<0.001) (dde).Bar graddfa, 100 µm. Mynegir data fel cymedr ± gwall safonol BLA, tonsil basolateral, MDT, niwclews thalamig dorsomedial, PAG, llwyd periaqueductal.
Yn olaf, gofynnwyd a allai t-hCO fodiwleiddio ymddygiad llygod mawr. I brofi hyn, fe wnaethom drawsblannu hCO sy'n mynegi hChR2-EYFP i mewn i S1, a 90 diwrnod yn ddiweddarach, fe wnaethom fewnblannu ffibrau optegol i mewn i t-hCO ar gyfer cyflwyno golau. Yna fe wnaethom hyfforddi'r llygod mawr gyda pharadigm cyflyru gweithredol wedi'i addasu (Ffig. 5h). Fe wnaethom osod yr anifeiliaid mewn siambr brawf ymddygiad a chymhwyso ysgogiadau laser glas (473 nm) a choch (635 nm) 5 eiliad ar hap. Derbyniodd anifeiliaid wobr ddŵr os oeddent yn llyfu yn ystod ysgogiad golau glas ond ni wnaethant llyfu yn ystod ysgogiad golau coch. Ar ddiwrnod cyntaf yr hyfforddiant, ni ddangosodd yr anifeiliaid unrhyw wahaniaeth mewn llyfu pan gawsant eu hysgogi â golau glas neu goch. Fodd bynnag, ar ddiwrnod 15, dangosodd anifeiliaid a drawsblannwyd â hCO sy'n mynegi hChR2-EYFP lyfu mwy egnïol pan gawsant eu hysgogi â golau glas o'i gymharu ag ysgogiad golau coch. Ni welwyd y newidiadau hyn mewn ymddygiad llyfu mewn anifeiliaid rheoli a drawsblannwyd â hCO yn mynegi'r fflworoffor rheoli (cyfradd llwyddiant dysgu: hChR2 89%, EYFP 0%, Ffigur 5i-1 a Fideo Atodol 2). Mae'r data hyn yn awgrymu y gall celloedd t-hCO actifadu niwronau llygod mawr i ysgogi ymddygiad sy'n ceisio gwobr. I ddarganfod pa gylchedau niwral t-hCO llygod mawr a allai fod yn rhan o'r newidiadau ymddygiadol hyn, fe wnaethom actifadu t-hCO yn optogenetig mewn anifeiliaid hyfforddedig a chasglu meinweoedd 90 munud yn ddiweddarach. Datgelodd imiwnohistochemeg fynegiant y protein FOS sy'n ddibynnol ar weithgaredd mewn sawl rhanbarth o'r ymennydd sy'n ymwneud ag ymddygiad ysgogol, gan gynnwys y cortecs rhagblaenol medial, y thalamws medial, a'r mater llwyd periaqueductal, a fynegwyd naill ai mewn anifeiliaid rheoli heb eu hysgogi neu mewn anifeiliaid. reis. 5m). Gyda'i gilydd, mae'r data hyn yn awgrymu y gall t-hCO fodiwleiddio gweithgaredd niwronau llygod mawr i yrru ymddygiad.
Mae organoidau niwral yn cynrychioli system addawol ar gyfer astudio datblygiad a chlefydau dynol in vitro, ond maent wedi'u cyfyngu gan y diffyg cysylltiadau rhwng cylchedau sy'n bodoli in vivo. Rydym wedi datblygu platfform newydd lle rydym wedi trawsblannu hCO i S1 llygod mawr ôl-enedigol cynnar sydd ag imiwnedd dan bwysau i astudio datblygiad a swyddogaeth celloedd dynol in vivo. Rydym wedi dangos bod t-hCO yn datblygu mathau o gelloedd aeddfed na welwyd in vitro28 a bod t-hCO wedi'i integreiddio'n anatomegol ac yn swyddogaethol i ymennydd y cnofilod. Caniataodd integreiddio t-hCO i gylchedau niwral cnofilod inni sefydlu cysylltiad rhwng gweithgaredd cellog dynol ac ymddygiad anifeiliaid a astudiwyd, gan ddangos y gall niwronau t-hCO fodiwleiddio gweithgaredd niwronau llygod mawr i yrru ymatebion ymddygiadol.
Mae gan y platfform rydyn ni'n ei ddisgrifio sawl mantais dros ymchwil flaenorol ar drawsblannu celloedd dynol i ymennydd cnofilod. Yn gyntaf, fe wnaethon ni drawsblannu hCO i gortecs datblygol llygod mawr ôl-enedigol cynnar, a all hwyluso integreiddio anatomegol a swyddogaethol. Yn ail, fe wnaeth monitro MRI t-hCO ganiatáu inni astudio safle a thwf y trawsblaniad mewn anifeiliaid byw, gan ganiatáu inni gynnal astudiaethau aml-anifeiliaid hirdymor a sefydlu dibynadwyedd sawl llinell gell hiPS. Yn olaf, fe wnaethon ni drawsblannu organoidau cyfan, yn hytrach nag ataliadau celloedd sengl ynysig, sy'n llai dinistriol i gelloedd dynol a gallant hyrwyddo integreiddio a chynhyrchu niwronau cortecs dynol mewn ymennydd llygod mawr.
Rydym yn cydnabod, er gwaethaf datblygiadau yn y platfform hwn, fod cyfyngiadau amserol, gofodol, a thrawsrywogaethol yn atal ffurfio cylchedau niwral dynol gyda chywirdeb uchel, hyd yn oed ar ôl trawsblannu yng nghyfnod cynnar y datblygiad. Er enghraifft, nid yw'n glir a yw'r gweithgaredd digymell a welwyd yn t-hCO yn cynrychioli ffenoteip datblygiadol tebyg i'r gweithgaredd rhythmig a welwyd yn ystod datblygiad cortigol, neu a yw oherwydd absenoldeb mathau o gelloedd ataliol sy'n bresennol yn t-hCO. Yn yr un modd, nid yw'n glir i ba raddau y mae absenoldeb lamineiddio yn t-hCO yn effeithio ar gysylltedd cadwyn30. Bydd gwaith yn y dyfodol yn canolbwyntio ar integreiddio mathau eraill o gelloedd megis microglia dynol, celloedd endothelaidd dynol, a chyfrannau amrywiol o interneuronau GABAergig fel y dangosir gan ddefnyddio cydosodiad 6 in vitro, yn ogystal â deall sut y gall integreiddio a phrosesu niwral ddigwydd mewn lefelau trawsgrifio, synaptig ac ymddygiadol t-hCO wedi'u newid mewn celloedd a gafwyd gan gleifion.
At ei gilydd, mae'r platfform in vivo hwn yn cynrychioli adnodd pwerus a all ategu datblygiad ymennydd dynol ac ymchwil i glefydau in vitro. Rydym yn rhagweld y bydd y platfform hwn yn ein galluogi i ddarganfod ffenoteipiau lefel llinyn newydd mewn celloedd sy'n deillio o gleifion a fyddai fel arall yn anodd eu canfod a phrofi strategaethau therapiwtig newydd.
Fe wnaethon ni gynhyrchu hCO2.5 o gelloedd HiPS fel y disgrifiwyd yn flaenorol. I gychwyn cynhyrchu hCO o gelloedd hiPS a gafodd eu meithrin ar haenau porthi, tynnwyd cytrefi cyfan o gelloedd hiPS o seigiau diwylliant gan ddefnyddio dispase (0.35 mg/mL) a'u trosglwyddo i ddiwylliannau plastig ag ymlyniad isel iawn yn cynnwys seigiau gyda chyfrwng diwylliant celloedd hiPS. (Corning) wedi'i ategu â dau atalydd SMAD dorsomorffin (5 μM; P5499, Sigma-Aldrich) ac SB-431542 (10 μM; 1614, Tocris) ac atalydd ROCK Y-27632 (10 μM; S1049, Selleckchem). Yn ystod y 5 diwrnod cyntaf, newidiwyd y cyfrwng celloedd hiPS yn ddyddiol ac ychwanegwyd dorsomorffin ac SB-431542. Ar y chweched diwrnod mewn ataliad, trosglwyddwyd sfferoidau niwral i gyfrwng niwral yn cynnwys niwrobasal-A (10888, Life Technologies), atchwanegiad B-27 heb fitamin A (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies), penisilin a streptomycin (1:100, Life Technologies) ac ategwyd y ffactor twf epidermaidd (EGF; 20 ng ml−1; R&D Systems) a ffactor twf ffibroblast 2 (FGF2; 20 ng ml−1; R&D Systems) tan ddiwrnod 24. O ddiwrnod 25 i ddiwrnod 42, ategwyd y cyfrwng â ffactor niwrotroffig sy'n deillio o'r ymennydd (BDNF; 20 ng ml−1, Peprotech) a niwrotroffin 3 (NT3; 20 ng ml−1; Peprotech) gyda newidiadau cyfrwng bob yn ail ddiwrnod. Ar y chweched diwrnod mewn ataliad, trosglwyddwyd sfferoidau niwral i gyfrwng niwral yn cynnwys niwrobasal-A (10888, Life Technologies), atchwanegiad B-27 heb fitamin A (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies), penisilin a streptomycin (1:100, Life Technologies) ac ategwyd y ffactor twf epidermaidd (EGF; 20 ng ml−1; R&D Systems) a ffactor twf ffibroblast 2 (FGF2; 20 ng ml−1; R&D Systems) tan ddiwrnod 24. O ddiwrnod 25 i ddiwrnod 42, ategwyd y cyfrwng â ffactor niwrotroffig sy'n deillio o'r ymennydd (BDNF; 20 ng ml−1, Peprotech) a niwrotroffin 3 (NT3; 20 ng ml−1; Peprotech) gyda newidiadau cyfrwng bob yn ail ddiwrnod.Ar y chweched diwrnod mewn ataliad, trosglwyddwyd y sfferoidau niwral i gyfrwng niwral yn cynnwys Neurobasal-A (10888, Life Technologies), atchwanegiad B-27 heb fitamin A (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies), penisilin.и стрептомицин (1:100, Life Technologies) и дополнены эпидермальным фактором роста (EGF; 20 нг/мл; R&D Systems) и факторомифроF2 (EGF; 20 нг/мл; R&D Systems) и факторомифроFро2 20 нг/мл; Systemau Ymchwil a Datblygu) до 24-го дня. a streptomycin (1:100, Life Technologies) ac wedi'i ategu â ffactor twf epidermaidd (EGF; 20 ng/ml; R&D Systems) a ffactor twf ffibroblast 2 (FGF2; 20 ng/ml; R&D Systems) tan ddiwrnod 24.O ddiwrnodau 25 i 42, ychwanegwyd ffactor niwrotroffig sy'n deillio o'r ymennydd (BDNF; 20 ng ml-1, Peprotech) a niwrotroffin 3 (NT3; 20 ng ml-1, Peprotech) at y cyfrwng, gan newid y cyfrwng bob yn ail ddiwrnod.Neurobasal-A (10888), Technolegau Bywyd) (12587), Technolegau Bywyd) GlutaMax (1:100), Technolegau Bywyd, 、青霉素的神经培养基中和链霉素, 1 Life: Technolegau）并辅以表皮生长因子（EGF；20 ng ml-1; Ymchwil a Datblygu Systemau）和成纤维细胞生长因子2（FGF2；20 ng ml-1；R&D Systems）直至第24天。在悬浮的第第 6天将神经球体转移含有含有 niwro-basal-a （10888，Technolegau Bywyd）不矔移含有含有-a （10888，Technolegau Bywyd） 不矔 吟矔补充剂 (12587，Technolegau Bywyd) Glutamax （1:100， Life TechNOGIS青霉素的神经培养基中 链霉素 1:100 ， Life TechNOGIS 青霉素的神经培养基中 链霉素 ， Technolegau （Ｈ（）生长 因子（（（（20 ng ml-1 ； r&d Systems）成纤维细胞生长 2 （fgf2 ； 20 ng ml- 1；R&D Systems）盬嬀、 Am 6-й день суспензии нейросферы были переведены на добавку, содержащую нейробазал-А (10888, Life-Technolegau), без витамина А (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies), пенициллин- нейтрализованный стрептомицин (1:100, Life Technologies) слендома эпидермального фактора роста (EGF; 20 нг мл-1; R&D Systems) и фактора роста фибробластов 2 (FGF2; 20 нг ml-1) 1; Ar ddiwrnod 6, newidiwyd ataliadau niwrosffer i atchwanegiad yn cynnwys niwrobasal-A (10888, Life Technologies), atchwanegiad B-27 heb fitamin A (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies), streptomycin wedi'i niwtraleiddio â phenisilin (1:100, Life Technologies) wedi'i ategu â ffactor twf epidermaidd (EGF; 20 ng ml-1; Systemau Ymchwil a Datblygu) a ffactor twf ffibroblast 2 (FGF2; 20 ng ml-1) 1; Systemau Ymchwil a Datblygu) до 24-го дня. Systemau Ymchwil a Datblygu) tan ddiwrnod 24.O ddiwrnodau 25 i 42, ychwanegwyd ffactor niwrotroffig sy'n deillio o'r ymennydd (BDNF; 20 ng ml-1, Peprotech) a ffactor niwrotroffig 3 (NT3; 20 ng ml-1, Peprotech) at y cyfrwng diwylliant bob yn ail ddiwrnod. Newidiwyd y cyfrwng unwaith.Gan ddechrau o ddiwrnod 43, cynhaliwyd hCO3 mewn cyfrwng niwrobasal-A heb ei atchwanegu (NM; 1088022, Thermo Fisher) gyda newid cyfrwng bob 4–6 diwrnod. I gael hCO3 o gelloedd hiPS a gafodd eu tyfu o dan amodau di-fwydydd, cafodd celloedd hiPS eu magu gydag Accutase (AT-104, Innovate Cell Technologies) ar 37°C am 7 munud, eu daduno'n gelloedd sengl, a'u platio ar blatiau AggreWell 800 (34815, STEMCELL Technologies) ar ddwysedd o 3 × 106 o gelloedd sengl fesul ffynnon mewn cyfrwng Essential 8 wedi'i ategu â'r atalydd ROCK Y-27632 (10 μM; S1049, Selleckchem). Ar ôl 24 awr, cafodd y cyfryngau yn y pyllau eu pipedu i fyny ac i lawr i gyfryngau yn cynnwys cyfryngau Hanfodol 6 (A1516401, Life Technologies) wedi'u hategu â dorsomorffin (2.5 μM; P5499, Sigma-Aldrich) a SB-431542 (10 μM; 1614). , Tocrida). O ddiwrnodau 2 i 6, disodlwyd cyfrwng Hanfodol 6 bob dydd â dorsomorffin ac atchwanegiad SB-431542. O'r chweched diwrnod, trosglwyddwyd yr ataliadau niwrosffer i'r cyfrwng niwrobasal a'u cynnal fel y disgrifiwyd uchod.
Perfformiwyd yr holl weithdrefnau anifeiliaid yn unol â'r canllawiau gofal anifeiliaid a gymeradwywyd gan Bwyllgor Gweinyddol Gofal Anifeiliaid Labordy Prifysgol Stanford (APLAC). Prynwyd llygod mawr ewthymig beichiog RNU (rnu/+) (Charles River Laboratories) neu eu rhoi mewn cartref. Cadwyd yr anifeiliaid ar gylchred golau-tywyllwch 12 awr gyda bwyd a dŵr ad libitum. Nodwyd cŵn bach noeth (FOXN1–/–) rhwng tair a saith diwrnod oed gan dwf mwstas anaeddfed cyn eu difa. Anesthetwyd y cŵn bach (gwryw a benyw) gyda 2-3% isoflurane a'u gosod ar ffrâm stereotacsig. Perfformiwyd trepanation o'r benglog gyda diamedr o tua 2-3 mm uwchben S1 gan gynnal cyfanrwydd y dura mater. Yna defnyddiwch nodwydd 30-G (tua 0.3 mm) ychydig y tu allan i'r craniotomi i dyllu'r dura. Yna rhowch HCO i barafilm tenau 3 × 3 cm a thynnwch y cyfrwng gormodol. Gan ddefnyddio chwistrell Hamilton sydd ynghlwm wrth nodwydd 23 G, 45°, tynnwch hCO yn ysgafn i ben mwyaf distal y nodwydd. Yna gosodwch y chwistrell ar y pwmp chwistrell sydd wedi'i gysylltu â'r ddyfais stereotacsig. Yna rhowch flaen y nodwydd dros dwll tyllu 0.3 mm o led a wnaed yn flaenorol yn y dura (z = 0 mm) a chulhewch y chwistrell 1–2 mm (z = tua –1.5 mm) nes bod y nodwydd rhwng y dura mater A. mae sêl drwchus wedi'i ffurfio. Yna codwch y chwistrell i ganol yr wyneb cortigol ar z = -0.5 mm a chwistrellwch hCO ar gyfradd o 1-2 µl y funud. Ar ôl cwblhau'r pigiad o hCO, tynnir y nodwydd yn ôl ar gyfradd o 0.2-0.5 mm y funud, pwytho'r croen, a rhoddir y ci bach ar unwaith ar bad gwresogi cynnes nes ei fod wedi gwella'n llwyr. Trawsblannwyd rhai anifeiliaid yn ddwy ochrog.
Perfformiwyd yr holl weithdrefnau anifeiliaid yn unol â chanllawiau gofal anifeiliaid a gymeradwywyd gan APLAC Prifysgol Stanford. Cafodd llygod mawr (mwy na 60 diwrnod ar ôl trawsblannu) eu hysgogi ag anesthesia isofluran 5% a'u hanestheteiddio ag 1-3% isofluran yn ystod delweddu. Ar gyfer delweddu, defnyddiwyd sganiwr twll turio llorweddol 7 Tesla wedi'i amddiffyn yn weithredol Bruker (Bruker Corp.) gyda gyriant graddiant Cwmni Trydan Rhyngwladol (IECO), mewnosodiad graddiant wedi'i amddiffyn â diamedr mewnol o 120 mm (600 mT/m, 1000 T/m/s) gan ddefnyddio AVANCE. III, galluoedd RF aml-goil wyth sianel a galluoedd aml-graidd, a'r platfform Paravision 6.0.1 cysylltiedig. Perfformiwyd recordio gan ddefnyddio coil RF folwmetrig wedi'i ddatgysylltu'n weithredol â diamedr mewnol o 86 mm a choil RF pedair sianel wedi'i oeri â chryo ar gyfer derbyn yn unig. Turbo-RARE 2D Echelinol (amser ailadrodd = 2500 ms, amser adlais = 33 ms, 2 gyfartaledd) gyda 16 o gipiadau sleisen, trwch sleisen 0.6–0.8 mm, yn cynnwys 256 × 256 o samplau. Derbyniwyd y signalau gan ddefnyddio coil RF cyfeintiol trawsderbynydd cwadratur gyda diamedr mewnol o 2 cm (Rapid MR International, LLC). Yn olaf, defnyddiwch y swyddogaethau amcangyfrif arwyneb Imaris (BitPlane) adeiledig ar gyfer rendro 3D a dadansoddi cyfaint. Diffinwyd trawsblaniad llwyddiannus fel un lle ffurfiwyd ardaloedd o signal MRI parhaus wedi'i bwysoli gan T2 yn hemisffer yr drawsblannwyd. Diffinwyd gwrthod impiad fel impiad nad oedd yn cynhyrchu ardaloedd o signal MRI parhaus wedi'i bwysoli gan T2 yn hemisffer yr drawsblannwyd. Cafodd t-hCO isgortigol ei eithrio o'r dadansoddiad dilynol.
I fynegi GCaMP6s yn sefydlog mewn hCO3 ar gyfer delweddu calsiwm dau-ffoton, heintiwyd celloedd hiPS â pLV[Exp]-EF1a::GcaMP6s-WPRE-Puro ac yna dewiswyd gwrthfiotigau. Yn gryno, dadunwyd celloedd ag EDTA a'u hatal mewn 1 ml o gyfrwng Essential 8 ar ddwysedd o tua 300,000 o gelloedd ym mhresenoldeb polybrene (5 μg/ml) a 15 μl o firws. Yna deorwyd y celloedd mewn ataliad am 60 munud a'u hau ar ddwysedd o 50,000 o gelloedd fesul ffynnon. Ar ôl cydlifiad, triniwyd celloedd â 5-10 μg ml-1 o puromycin am 5-10 diwrnod neu nes bod cytrefi sefydlog yn ymddangos. Perfformiwyd haint hCO3 acíwt fel y disgrifiwyd yn flaenorol5 gyda rhai addasiadau. Yn gryno, trosglwyddwyd diwrnod 30-45 o hCO3 i diwbiau microcentrifuge Eppendorf 1.5 ml sy'n cynnwys 100 µl o gyfrwng nerf. Yna tynnir tua 90 µl o'r cyfrwng, ychwanegir 3-6 µl o lentifirws titer uchel (o 0.5 x 108 i 1.2 x 109) at y tiwb, a throsglwyddir yr hCO3 i'r deorydd am 30 munud. Yna ychwanegwch 90–100 µl o gyfrwng at bob tiwb a dychwelwch y tiwbiau i'r deorydd dros nos. Y diwrnod canlynol, trosglwyddwch hCO3 i gyfrwng nerf ffres mewn platiau atodiad isel. Ar ôl 7 diwrnod, trosglwyddwyd hCO3 i blatiau gwaelod gwydr 24-ffynnon i ddelweddu a gwerthuso ansawdd yr haint. Cynhyrchwyd pLV[Exp]-SYN1::EYFP-WPRE a pLV[Exp]-SYN1::hChR2-EYFP-WPRE gan VectorBuilder. Defnyddir lentifirws yn y rhan fwyaf o arbrofion oherwydd ei fod wedi'i integreiddio i genom y gwesteiwr, gan ganiatáu mynegiant genyn gohebydd mewn llinellau celloedd heintiedig. Ar gyfer dilyniant y gynddaredd, cafodd hCO ei heintio ar y cyd â rabies-ΔG-eGFP ac AAV-DJ-EF1a-CVS-G-WPRE-pGHpA (plasmid #67528, Addgene) ar ddiwrnod 30-45, ei olchi'n drylwyr am 3 diwrnod, a'i drawsblannu i lygod mawr yn S1 a'i gynnal in vivo am 7-14 diwrnod.
Ar gyfer imiwnocytocemeg, cafodd yr anifeiliaid eu hanestheteiddio a'u trwytholi'n draws-gardiaidd â PBS ac yna 4% paraformaldehyd (PFA mewn PBS; Electron Microscopy Sciences). Cafodd yr ymennydd eu sefydlogi mewn 4% PFA am 2 awr neu dros nos ar 4°C, eu rhewi-gadw mewn 30% swcros mewn PBS am 48-72 awr, a'u mewnosod mewn 1:1, 30% swcros: OCT (Tissue-Tek OCT Compound 4583, Sakura Finetek) a gwnaed adrannau coronal ar 30 µm gan ddefnyddio cryostat (Leica). Ar gyfer imiwnocytocemeg adrannau trwchus, cafodd yr anifeiliaid eu trwytholi â PBS, a chafodd yr ymennydd ei ddyrannu a'i dorri'n goronal ar 300–400 µm gan ddefnyddio dirgrynwr (Leica) a chafodd yr adrannau eu sefydlogi gyda 4% PFA am 30 munud. Yna golchwyd cryo-doriadau neu adrannau trwchus â PBS, eu blocio am 1 awr ar dymheredd ystafell (10% serwm asyn arferol (NDS) a 0.3% Triton X-100 wedi'i wanhau mewn PBS) a'u blocio â thoddiant blocio ar 4°C. – Deori Deoriwyd cryo-doriadau dros nos a deoriwyd adrannau trwchus am 5 diwrnod. Y prif wrthgyrff a ddefnyddiwyd oedd: gwrth-NeuN (llygoden, 1:500; ab104224, abcam) gwrth-CTIP2 (llygoden fawr, 1:300; ab18465, abcam), gwrth-GFAP (cwningen, 1:1,000; Z0334, Dako), gwrth-GFP (cyw iâr, 1:1,000; GTX13970, GeneTex), gwrth-HNA (llygoden, 1:200; ab191181, abcam), gwrth-NeuN (cwningen, 1:500; ABN78, Millipore), gwrth-PDGFRA (cwningen, 1:200; sc-338, Santa Cruz), gwrth-PPP1R17 (cwningen, 1:200; HPA047819, Gwrthgyrff Atlas), gwrth-RECA-1 (llygoden, 1:50; ab9774, abcam), gwrth-SCG2 (cwningen, 1:100; 20357-1-AP, Proteintech), gwrth-SOX9 (gafr, 1:500; AF3075, Systemau Ymchwil a Datblygu), Netrin G1a (gafr, 1:100; AF1166, Systemau Ymchwil a Datblygu), gwrth-STEM121 (llygoden, 1:200; Y40410, Takara Bio), gwrth-SATB2 (llygoden, 1:50; ab51502, abcam), gwrth-GAD65/67 (cwningen, 1:400; ABN904, Millipore) a gwrth-IBA1 (gafr, 1:100; ab5076, abcam). Y prif wrthgyrff a ddefnyddiwyd oedd: gwrth-NeuN (llygoden, 1:500; ab104224, abcam) gwrth-CTIP2 (llygoden fawr, 1:300; ab18465, abcam), gwrth-GFAP (cwningen, 1:1,000; Z0334, Dako), gwrth-GFP (cyw iâr, 1:1,000; GTX13970, GeneTex), gwrth-HNA (llygoden, 1:200; ab191181, abcam), gwrth-NeuN (cwningen, 1:500; ABN78, Millipore), gwrth-PDGFRA (cwningen, 1:200; sc-338, Santa Cruz), gwrth-PPP1R17 (cwningen, 1:200; HPA047819, Gwrthgyrff Atlas), gwrth-RECA-1 (llygoden, 1:50; ab9774, abcam), gwrth-SCG2 (cwningen, 1:100; 20357-1-AP, Proteintech), gwrth-SOX9 (gafr, 1:500; AF3075, Systemau Ymchwil a Datblygu), Netrin G1a (gafr, 1:100; AF1166, Systemau Ymchwil a Datblygu), gwrth-STEM121 (llygoden, 1:200; Y40410, Takara Bio), gwrth-SATB2 (llygoden, 1:50; ab51502, abcam), gwrth-GAD65/67 (cwningen, 1:400; ABN904, Millipore) a gwrth-IBA1 (gafr, 1:100; ab5076, abcam). Использовались следующие первичные антитела: анти-NeuN (мышиные, 1:500; ab104224, abcam), анти-CTIP2 (мышиные, 1:500; ab104224, abcam), анти-CTIP2; ab18465, abcam), анти-GFAP (кроличьи, 1:1000; Z0334, Dako), анти- -GFP (курица, 1:1000; GTX13970, GeneTex), анти-HNA (мы1: 2: анти-HNA (мы1: 1: 1: 1: abcam), анти-NeuN (кролик, 1:500; ABN78, Millipore), анти-PDGFRA (кролик, 1:200; sc-338, Санта-Круз), анти-PPP1R17 (кролик, 1:200; HPA047819, Atlas Antibodies), анти-RECA-1 (мышь, 1:50; ab9774, abcam), кролик, анти-RECA-1 (мышь, 1:50; ab9774, abcam), кролик, анти-RECA-1 (мышь, 1:50; ab9774, abcam), CG0:к1: анти-RECA-1 (мышь, 1:50; ab9774, abcam), анти-RECA-1 (мышь, 1:50; ab9774, abcam), кролик, анти-REC 20357-1-AP, Proteintech), анти-SOX9 (козий, 1:500; AF3075, R&D Systems), нетрин G1a (козий, 1:100; AF1166, R&D Systems), ант1и-STEM 1:200; Y40410, Takara Bio), анти-SATB2 (мышь, 1:50; ab51502, abcam), анти-GAD65/67 (кролик, 1:400; ABN904, Millipore) ac анти-IBA1 (коза, 1 :100; аб5076, абкам). Y prif wrthgyrff a ddefnyddiwyd oedd: gwrth-NeuN (llygoden, 1:500; ab104224, abcam), gwrth-CTIP2 (llygoden fawr, 1:300; ab18465, abcam), gwrth-GFAP (cwningen, 1:1000; Z0334, Dako), gwrth-GFP (cyw iâr, 1:1000; GTX13970, GeneTex), gwrth-HNA (llygoden, 1:200; ab191181, abcam), gwrth-NeuN (cwningen, 1:500; ABN78, Millipore), gwrth-PDGFRA (cwningen, 1:200; sc-338, Santa Cruz), gwrth-PPP1R17 (cwningen, 1:200; HPA047819, Gwrthgyrff Atlas), gwrth-RECA-1 (llygoden, 1:50; ab9774, abcam), gwrth- SCG2 (cwningen, 1:100; 20357-1-AP, Proteintech), gwrth-SOX9 (gafr, 1:500; AF3075, Systemau Ymchwil a Datblygu), netrin G1a (gafr, 1:100; AF1166, Systemau Ymchwil a Datblygu), gwrth- STEM121 (llygoden, 1:200; Y40410, Takara Bio), gwrth-SATB2 (llygoden, 1:50; ab51502, abcam), gwrth-GAD65/67 (cwningen, 1:400; ABN904, Millipore) a gwrth-IBA1 (gafr, 1:100; ab5076, abkam).使用的一抗是:抗NeuN（小鼠, 1:500；ab104224, abcam）抗CTIP2（大鼠, 1:3 00；ab18465,abcam）,抗GFAP（兔, 1:1,000；Z0334, Dako）,抗-GF P（鸡，1:1,000；GTX13970, GeneTex）, HNA（小鼠, 1:200 ab191181, abcam）, 抗NeuN (兔, 1:500 ；ABN78, Mipore) 1:200 ；sc-338, Santa Cruz）, 抗PPP1R17（兔, 1:200；HPA047819, Atlas抗体）, RECA-1 (小鼠, 1:50 ； ab9774), abcam）, 抗SCG2（兔）, 1:100 ； 20357-1-AP, Proteintech）, 抗SOX9（山羊, 1:500 ；AF3075, Systemau Ymchwil a Datblygu）, Netrin G1a (山羊, 1:100 ；AF1166，R&D Systemau）, STEM121（小鼠, 1:200;使用的一抗是:抗NeuN（小鼠, 1:500；ab104224, abcam）抗CTIP2（大鼠, 1 : 300 ；ab18465, abcam）, 抗 GFAP（兔, 1:1,000；Z0334, Dako）,抗-GFP (鸡， 1:1,000) GTX13970, GeneTex), HNA (小鼠, 1:200) ab191181, abcam）, 抗NeuN（兔, 1:500, Mill ABN7, 1:500, 1:500, 200 ；sc-338, Santa Cruz）, PPP1R17（兔, 1:200; 100 ； 20357-1-AP, Proteintech）, 抗SOX9（山 羊, 1:500 ； AF3075, Systemau Ymchwil a Datblygu）, Netrin G1a (山 羊, 1:100 ； AF1166, Systemau Ymchwil a Datblygu);Y40410, Takara Bio), gwrth-SATB2 (llygoden, 1:50; ab51502, abcam), gwrth-GAD65/67 (cwningen, 1:400; ABN904, Millipore) a gwrth-IBA1 (gafr, 1:100; ab5076, abcam).Y prif wrthgyrff a ddefnyddiwyd oedd: gwrth-NeuN (llygoden, 1:500; ab104224, abcam), gwrth-CTIP2 (llygoden fawr, 1:300; ab18465, abcam), gwrth-GFAP (cwningen, 1:1000; Z0334, Dako). , gwrth-GFP (cyw iâr, 1:1000; GTX13970, GeneTex), gwrth-HNA (llygoden, 1:200; ab191181, abcam), gwrth-NeuN (cwningen, 1:500; ABN78, Millipore), gwrth-PDGFRA (cwningen, 1:200; sc-338, Santa Cruz), gwrth-PPP1R17 (cwningen, 1:200; HPA047819, gwrthgorff Atlas), gwrth-RECA-1 (llygoden, 1:50; ab9774, abcam), gwrth-SCG2 (cwningen), 1:100;20357-1-AP, Proteintech), анти-SOX9 (коза, 1:500; AF3075, R&D Systems), Нетрин G1a (коза, 1:100; AF1166, R&D Systems), анти -мSTEM1:ы2; Y40410, Takara Bio), анти-SATB2 (мышь, 1:50; ab51502, abcam), анти-GAD65/67 (кролик, 1:400; ABN904, Millipore) и анти-IBA1 (к1оза0, 1:50; абкам). 20357-1-AP, Proteintech), gwrth-SOX9 (gafr, 1:500; AF3075, Systemau Ymchwil a Datblygu), Netrin G1a (gafr, 1:100; AF1166, Systemau Ymchwil a Datblygu), gwrth-STEM121 (llygoden, 1:200; Y40410, Takara Bio), gwrth-SATB2 (llygoden, 1:50; ab51502, abcam), gwrth-GAD65/67 (cwningen, 1:400; ABN904, Millipore), a gwrth-IBA1 (gafr, 1:100; ab5076, abkam).Yna golchwyd yr adrannau gyda PBS a'u magu gydag gwrthgorff eilaidd am 1 awr ar dymheredd ystafell (adrannau wedi'u rhewi) neu dros nos ar 4°C (adrannau trwchus). Defnyddiwyd gwrthgorff eilaidd Alexa Fluor (Life Technologies) wedi'i wanhau 1:1000 mewn hydoddiant blocio. Ar ôl golchi gyda PBS, gwelwyd y niwclysau gyda Hoechst 33258 (Life Technologies). Yn olaf, gosodwyd y sleidiau ar ficrosgop gyda gorchudd-slipiau (Fisher Scientific) gan ddefnyddio Aquamount (Polysciences) a'u dadansoddi ar ficrosgop fflwroleuol Keyence (dadansoddwr BZ-X) neu ficrosgop confocal Leica TCS SP8 (Las-X) ar y ddelwedd. Proseswyd y delweddau gan ddefnyddio'r rhaglen ImageJ (Fiji). I fesur cyfran y niwronau dynol yn t-hCO a'r cortecs llygoden fawr, cymerwyd delweddau petryalog 387.5 μm o led yng nghanol y t-hCO, ar neu ger ymyl cortecs y llygoden fawr. Penderfynwyd ar ymylon impiad trwy asesu newidiadau mewn tryloywder meinwe, niwclysau HNA+, a/neu bresenoldeb hunan-fflwroleuedd meinwe. Ym mhob delwedd, rhannwyd cyfanswm nifer y celloedd NeuN+ a HNA+ â chyfanswm nifer y celloedd NeuN+ yn yr un ardal. Er mwyn sicrhau mai dim ond celloedd â chnewyllynnau yn y plân delwedd sy'n cael eu cyfrif, dim ond celloedd sydd hefyd yn Hoechst+ sy'n cael eu cynnwys yn y cyfrifiad. Cyfartaleddwyd dwy ddelwedd wedi'u gwahanu gan o leiaf 1 mm i leihau'r gwall ystadegol.
Wythnos cyn casglu'r sampl, rhowch yr anifeiliaid trawsblannu hCO3 (tua 8 mis o wahaniaethu) mewn ystafell dywyll gyda mwstas wedi'i docio i leihau ysgogiad synhwyraidd. Perfformiwyd ynysu'r niwclysau fel y disgrifiwyd yn flaenorol, gyda rhai addasiadau. Yn gryno, dinistriwyd t-hCO3 a hCO3 gan ddefnyddio lysis celloedd glanedydd-fecanyddol a grinder meinwe gwydr 2 ml (D8938, Sigma-Aldrich/KIMBLE). Yna hidlwyd y niwclysau crai gan ddefnyddio hidlydd 40 µm a'u centrifugio ar 320 g am 10 munud ar 4 °C cyn perfformio graddiant dwysedd swcros. Ar ôl y cam centrifugio (320 g am 20 munud ar 4 °C), ail-ataliwyd y samplau mewn 0.04% BSA/PBS gydag ychwanegu 0.2 uned o atalydd RNase µl-1 (40 u µl-1, AM2682, Ambion) a'u pasio trwy hidlydd llif 40 µm. Yna cafodd y niwclysau dadunedig eu hail-atal mewn PBS yn cynnwys 0.02% o BSA a'u llwytho ar sglodion Chromium Single Cell 3′ (adferiad amcangyfrifedig o 8,000 o gelloedd fesul lôn). Paratowyd llyfrgelloedd snRNA-seq gyda'r Chromium Single cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics). Paratowyd llyfrgelloedd snRNA-seq gyda'r Chromium Single cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics). Библиотеки snRNA-seq были приготовлены с помощью Cromiwm Cell sengl 3′ GEM, Pecyn Glain Llyfrgell a Gel v3 (Genomeg 10x). Paratowyd y llyfrgelloedd snRNA-seq gan ddefnyddio Chromium Single cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics). snRNA-seq 文库是使用Chromium Cell sengl 3′ GEM, Llyfrgell a Glain Glain Kit v3 (Genomeg 10x) 制备的。 snRNA-seq 文库是使用Chromium Cell sengl 3′ GEM, Llyfrgell a Glain Glain Kit v3 (Genomeg 10x) 制备的。 Библиотеку snRNA-seq готовили с использованием Cromiwm Cell Sengl 3′ GEM, Llyfrgell a Glain Bead Kit v3 (10x Genomeg). Paratowyd y llyfrgell snRNA-seq gan ddefnyddio Chromium Single Cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics).Cafodd llyfrgelloedd o wahanol samplau eu cronni a'u dilyniannu gan Admera Health ar NovaSeq S4 (Illumina).
Mesurwyd lefelau mynegiant genynnau ar gyfer pob cod bar niwclear tybiedig gan ddefnyddio'r pecyn meddalwedd dadansoddi 10x Genomics CellRanger (fersiwn 6.1.2). Yn benodol, parwyd y darlleniadau yn erbyn cyfuniad o genom cyfeirio dynol (GRCh38, Ensemble, fersiwn 98) a llygod mawr (Rnor_6.0, Ensemble, fersiwn 100) a grëwyd gyda'r gorchymyn mkref a defnyddio cyfrif gyda'r gorchymyn –include-introns=TRUE i fesur cynnwys darlleniadau wedi'u mapio i ranbarthau intron. Ar gyfer samplau t-hCO3, nodwyd niwclysau dynol yn seiliedig ar y gofyniad ceidwadol bod o leiaf 95% o'r holl ddarlleniadau wedi'u mapio yn cyfateb i'r genom dynol. Perfformiwyd yr holl ddadansoddiadau dilynol ar arae cod bar wedi'i hidlo a allbwnwyd o'r CellRanger gan ddefnyddio'r pecyn R (fersiwn 4.1.2) Seurat (fersiwn 4.1.1)32.
Er mwyn sicrhau mai dim ond niwclysau o ansawdd uchel sy'n cael eu cynnwys yn y dadansoddiad dilynol, gweithredwyd proses hidlo ailadroddus ar gyfer pob sampl. Yn gyntaf, caiff niwclysau o ansawdd isel gyda llai na 1000 o enynnau unigryw wedi'u canfod a mwy na 20% o gyfanswm y mitochondria eu nodi a'u tynnu. Wedi hynny, normaleiddiwyd y matrics nifer genynnau crai gan atchweliad binomial negatif wedi'i reoleiddio gan ddefnyddio'r ffwythiant sctransform(vst.flavor=”v2″), a nododd hefyd y 3000 o enynnau mwyaf amrywiol gan ddefnyddio paramedrau diofyn. Perfformiwyd lleihau dimensiwn ar y genynnau amrywiol uchaf gan ddefnyddio Dadansoddiad Cydrannau Prif (PCA) gyda pharamedrau diofyn gan ddefnyddio dimensiwn set ddata o 30 (dewiswyd dims = 30 yn seiliedig ar archwiliad gweledol o safleoedd y pen-glin a'i ddefnyddio ar gyfer pob sampl a dadansoddiadau ensemble). Yna gwnaethom gynnal sawl rownd o glystyru ailadroddus (datrysiad = 1) i ddosbarthu genynnau yn seiliedig ar gyfrif genynnau annormal o isel (canolrif islaw'r 10fed ganradd), cyfrif genynnau mitocondriaidd annormal o uchel (canolrif uwchlaw'r 95fed ganradd) i nodi a chael gwared ar gelloedd tybiedig o ansawdd isel. clystyrau a/neu gyfran uchel o efeilliaid a amheuir a nodwyd gan ddefnyddio'r pecyn DoubletFinder33 (sgôr DoubletFinder cymedrig uwchlaw'r 95fed ganradd). Integreiddiwyd samplau t-hCO (n=3) a samplau hCO (n=3) ar wahân gan ddefnyddio'r ffwythiant IntegrateData gyda'r paramedrau uchod. Yna Perfformiwyd rownd arall o hidlo ansoddol o'r set ddata integredig fel y disgrifiwyd uchod.
Ar ôl tynnu'r cnewyllyn o ansawdd isel, cafodd y set ddata integredig ei grwpio (datrysiad = 0.5) a'i hymgorffori at ddibenion delweddu UMAP34. Penderfynwyd ar enynnau marciwr ar gyfer pob clwstwr gan ddefnyddio'r swyddogaeth FindMarkers gyda pharamedrau diofyn wedi'u cyfrifo o ddata mynegiant genynnau wedi'i normaleiddio. Rydym yn nodi ac yn dosbarthu prif ddosbarthiadau celloedd trwy gyfuno setiau data cyfeirio cortigol ffetws ac oedolion gyda mynegiant genynnau marciwr 19,20,21,35 ac anodiad. Yn benodol, nodwyd rhagflaenwyr cylchredeg gan fynegiant MKI67 a TOP2A. Diffinwyd clystyrau rhagflaenwyr gan absenoldeb trawsgrifiadau mitotig, gorgyffwrdd uchel â chlystyrau rhagflaenwyr glial amlbwrpas a ddisgrifir yng nghortex ffetws metaffas hwyr, a mynegiant EGFR ac OLIG1. Rydym yn defnyddio'r term astrocyte i gwmpasu sawl cyflwr o wahaniaethu astrocyte, o glia rheiddiol hwyr i aeddfedu astrocytes. Mae clystyrau astrocyte yn mynegi lefelau uchel o SLC1A3 ac AQP4 ac wedi'u dangos i fapio ag isdeipiau o glia rheiddiol ffetws a/neu astrocytes oedolion. Mae celloedd OPC yn mynegi PDGFRA a SOX10 tra bod oligodendrocytau yn mynegi marcwyr myeliniad (MOG a MYRF). Nodwyd niwronau glutamatergig gan bresenoldeb trawsgrifiadau niwronol (SYT1 a SNAP25), absenoldeb marcwyr GABAergig (GAD2), a mynegiant NEUROD6, SLC17A7, BCL11B, neu SATB2. Rhannwyd niwronau GluN ymhellach yn is-ddosbarthiadau uchaf (mynegiant SATB2 a cholli BCL11B) a dwfn (mynegiant BCL11B). Mae niwronau is-blât tybiedig (SP) yn mynegi marcwyr SP18 hysbys fel ST18 a SORCS1 yn ogystal â marcwyr GluN dwfn. Nodwyd celloedd tebyg i'r plecsws coroid gan fynegiant TTR, a mynegodd celloedd tebyg i'r meningeal enynnau sy'n gysylltiedig â ffibroblast a mapio celloedd pial/fasgwlaidd y set ddata gyfeirio.
Perfformiwyd dadansoddiad gwahaniaethol o fynegiant genynnau rhwng is-ddosbarthiadau t-hCO a hCO gan ddefnyddio dull ffug-swp newydd ei ddatblygu a atgynhyrchwyd mewn samplau a weithredwyd gan ddefnyddio'r pecyn Libra R (fersiwn 1.0.0). Yn benodol, perfformiwyd profion tebygolrwydd log edgeR (fersiwn 3.36.0, pecyn R) ar gyfer grwpiau trwy gyfuno nifer y genynnau mewn celloedd ar gyfer dosbarth celloedd penodol ar gyfer pob atgynhyrchiad sampl. Ar gyfer delweddu map gwres, cyfrifir gwerthoedd wedi'u normaleiddio fesul miliwn (CPM) gan ddefnyddio edgeR (swyddogaeth cpm()) a'u graddio (i gyflawni cymedr = 0, gwyriad safonol = 1). Perfformiwyd dadansoddiad cyfoethogi Ontoleg Genynnau (GO) o enynnau GluN t-hCO wedi'u huwchreoleiddio'n sylweddol (gwerth P wedi'i gywiro gan Benjamini-Hochberg o lai na 0.05 wedi'i fynegi mewn o leiaf 10% o gelloedd GluN t-hCO a chynnydd plyg mewn newid o leiaf 2 waith). Perfformiwyd gan ddefnyddio ToppGene Suite (https://toppgene.cchmc.org/)37. Rydym yn defnyddio'r ap ToppFun gyda pharamedrau diofyn ac yn adrodd gwerthoedd P wedi'u cywiro gan Benjamini-Hochberg a gyfrifwyd o brofion hypergeometrig wedi'u hanodio gan GO.
I baru ein clystyrau snRNA-seq â chlystyrau celloedd wedi'u hanodio o astudiaethau cyfeirio o RNA-seq celloedd sengl cynradd neu snRNA-seq oedolion19,20,21,22, fe wnaethom gymhwyso dull integreiddio set ddata wedi'i baru. Fe wnaethom ddefnyddio'r llif gwaith normaleiddio SCTransform (v2) yn Seurat i integreiddio a chymharu gorgyffwrdd clwstwr rhwng setiau data (gan ddefnyddio'r un paramedrau ag uchod). Cafodd setiau data unigol eu is-osod ar hap hyd at 500 o gelloedd neu greiddiau fesul clwstwr gwreiddiol er mwyn effeithlonrwydd cyfrifiadurol. Gan ddefnyddio dull tebyg i'r hyn a ddisgrifiwyd yn flaenorol, diffinwyd gorgyffwrdd clwstwr fel cyfran y celloedd neu'r niwclysau ym mhob clwstwr cronedig a oedd yn gorgyffwrdd â label y clwstwr cyfeirio. I ddosbarthu GluNs ymhellach, fe wnaethom ddefnyddio llif gwaith TransferData Seurat ar gyfer data is-set GluN i aseinio labeli set ddata gyfeirio i'n celloedd GluN.
Er mwyn asesu statws aeddfedu'r trawsgrifiad byd-eang o samplau t-hCO a hCO, cymharom ein samplau ffug-swmp â BrainSpan/psychENCODE23, sy'n cynnwys dilyniant RNA mawr sy'n cwmpasu datblygiad ymennydd dynol. Gwnaethom PCA ar fatrics mynegiant genynnau wedi'i normaleiddio'n batrwm cyfun o samplau cortigol 10 wythnos ar ôl cenhedlu ac yn ddiweddarach, mewn 5567 o enynnau (ynghyd â'n data) a nodwyd yn flaenorol fel rhai gweithredol mewn samplau cortigol BrainSpan (a ddiffinnir fel rhai sy'n fwy na 50% mewn amrywiant datblygiadol a eglurir gan oedran gan ddefnyddio model ciwbig)38. Yn ogystal, deilliom enynnau sy'n gysylltiedig â llofnodion trawsgrifiad mawr o niwroddatblygiad gan ddefnyddio ffactorio matrics annegatif fel y disgrifiwyd yn flaenorol. Mae'r pwysau sampl a gyfrifwyd gan ddefnyddio'r weithdrefn ffactorio matrics annegatif wedi'u plotio yn Ffig. 5b gyda data estynedig ar gyfer pob un o'r pum llofnod a ddisgrifiwyd gan Zhu et al.38. Unwaith eto, deilliodd marcwyr trawsgrifio sy'n ddibynnol ar weithgaredd o astudiaethau a gyhoeddwyd yn flaenorol. Yn benodol, roedd ERG ac LRG wedi'u huchreoleiddio'n sylweddol mewn niwronau glutamatergig a nodwyd gan gasgliad snRNA-seq cortecs gweledol y llygoden ar ôl ysgogiad gweledol o Dabl Atodol 3 Hrvatin et al.16. Cafwyd LRGs wedi'u cyfoethogi â bodau dynol o ddiwylliannau ymennydd ffetws dynol wedi'u actifadu gan KCl a'u cynaeafu 6 awr ar ôl ysgogiad, ac roedd y genynnau wedi'u hidlo wedi'u huchreoleiddio'n sylweddol mewn bodau dynol ond nid mewn cnofilod (Tabl Atodol 4). Perfformiwyd dadansoddiad o gyfoethogi setiau genynnau gan ddefnyddio'r setiau genynnau hyn gan ddefnyddio prawf union unffordd Fisher.
Anesthetiwch lygod mawr gydag isofluran, tynnwch yr ymennydd a'u rhoi mewn toddiant swcros oer (tua 4°C) ocsigenedig (95% O2 a 5% CO2) ar gyfer adrannau sy'n cynnwys: 234 mM swcros, 11 mM glwcos, 26 mM NaHCO3, 2.5 mM KCl, 1.25 mM NaH2PO4, 10 mM MgSO4 a 0.5 mM CaCl2 (tua 310 mOsm). Gwnaed adrannau coronal ymennydd llygod mawr (300–400 µm) yn cynnwys t-hCO gan ddefnyddio dirgrynwr Leica VT1200 fel y disgrifiwyd yn flaenorol39. Yna trosglwyddwyd yr adrannau i siambr dorri gydag ocsigeniad tymheredd ystafell parhaus yn cynnwys aCSF wedi'i baratoi o: 10 mM glwcos, 26 mM NaHCO3, 2.5 mM KCl, 1.25 mM NaHPO4, 1 mM MgSO4, 2 mM CaCl2 a 126 mM NaCl (298 mOsm). o leiaf 45 munud cyn cofnodi. Cofnodwyd yr adrannau mewn siambr drochi lle cawsant eu trwytho'n barhaus ag aCSF (ffiol 95% O2 a 5% CO2). Cofnodwyd yr holl ddata ar dymheredd ystafell. Terfynwyd niwronau t-hCO gyda phibed gwydr borosilicate wedi'i lenwi â thoddiant yn cynnwys 127 mM glwconad potasiwm, 8 mM NaCl, 4 mM magnesiwm ATP, 0.3 mM sodiwm GTP, 10 mM HEPES, a 0.6 mM EGTA, pH 7.2, toddiant mewnol wedi'i addasu gyda KOH (290 mOsm). Er mwyn adfer, ychwanegwyd biocytin (0.2%) at y toddiant recordio.
Cafwyd data gan ddefnyddio mwyhadur MultiClamp 700B (Molecular Devices) a digidydd Digidata 1550B (Molecular Devices), wedi'i hidlo pas isel ar 2 kHz, ei ddigideiddio ar 20 kHz, a'i ddadansoddi gan ddefnyddio Clampfit (Molecular Devices), Origin (OriginPro). 2021b, OriginLab). a swyddogaethau MATLAB personol (Mathworks). Cyfrifwyd y potensial cyffordd gan ddefnyddio JPCalc ac addaswyd y cofnodion i'r gwerth cyfrifedig o -14 mV. Mae Gweithrediad IV yn cynnwys cyfres o gamau cerrynt mewn camau 10-25 pA, o -250 i 750 pA.
Cafodd y thalamws, y mater gwyn, ac afferentau S1 eu hysgogi'n drydanol mewn sleisys thalamocortical yn ystod recordio clamp-clwt o niwronau hCO, fel y disgrifiwyd yn flaenorol. Yn gryno, gosodwyd yr ymennydd ar fwrdd argraffu 3D wedi'i ogwyddo ar ongl 10°, a thorrwyd blaen yr ymennydd ar ongl 35°. Yna gludwyd yr ymennydd i'r wyneb wedi'i dorri a'i dorri'n adrannol, gan gadw'r axonau thalamocortical sy'n ymwthio allan. Gosodwyd electrodau twngsten deubegwn (0.5 MΩ) ar ail ficromanipulator a'u lleoli'n strategol i ysgogi pedwar rhanbarth fesul cell (capsiwl mewnol, mater gwyn, S1 a hCO). Cofnodwch ymatebion synaptig ar ôl ysgogiad cyfnodol 300 µA ar 0.03–0.1 Hz.
Cafodd niwronau hCO sy'n mynegi hChR2 eu actifadu ar 480 nm a chymhwyswyd pylsau golau a gynhyrchwyd gan LED (Prizmatix) trwy amcan ×40 (0.9 NA; Olympus) i gofnodi mynegiant hChR2 ger y celloedd. Mae diamedr y maes goleuedig tua 0.5 mm a'r cyfanswm pŵer yw 10-20 mW. Gosodwyd lled y pwls i 10 ms, sy'n cyfateb i'r pwls a roddwyd yn ystod yr arbrawf dysgu ymddygiadol. Defnyddiwyd amleddau ysgogi amrywiol, o 1 i 20 Hz, ond dim ond pwls cyntaf y gyfres a ddefnyddiwyd ar gyfer meintioli. Mae'r cyfnodau rhwng trenau fel arfer yn hirach na 30 eiliad i leihau'r effaith ar lwybrau ataliol neu hwyluso synaptig. I brofi a oedd yr ymateb hChR2 yn monosynaptig, fe wnaethom gymhwyso TTX (1 μM) i'r baddon nes i'r adwaith EPSC ddiflannu, ac yna cymhwyso 4-aminopyridine (4-AP; 100 μM). Yn nodweddiadol, dychwelir ymateb o fewn ychydig funudau, gydag oedi ychydig yn hirach rhwng tanio LED a chynhyrchu EPSC. Defnyddiwyd NBQX (10 μM) i brofi a yw'r ymateb yn cael ei yrru gan dderbynyddion AMPA.
Crëwyd adrannau miniog o hCO3 fel y disgrifiwyd yn flaenorol. Yn gryno, mewnosodwyd adrannau hCO3 mewn 4% agaros a'u trosglwyddo i gelloedd yn cynnwys 126 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM NaH2PO4, 1 mM MgSO4, 2 mM CaCl2, 26 mM NaHCO3 a 10 mM d-(+) -glwcos yn. Torrwyd adrannau ar 200–300 µm ar dymheredd ystafell gan ddefnyddio dirgrynwr Leica VT1200 a'u storio mewn ASF ar dymheredd ystafell. Yna, perfformiwyd recordio patch-camp o gelloedd cyfan ar adrannau hCO3 o dan ficrosgop SliceScope uniongyrchol (Scientifica). Trwythwyd adrannau ag aCSF (95% O2 a 5% CO2) a chofnodwyd signalau celloedd ar dymheredd ystafell. Cymhwyswyd niwronau hCO gan ddefnyddio piped gwydr borosilicate wedi'i llenwi â thoddiant yn cynnwys 127 mM o glwconad potasiwm, 8 mM NaCl, 4 mM o magnesiwm ATP, 0.3 mM o sodiwm GTP, 10 mM HEPES, a 0.6 mM EGTA, pH mewnol 7, 2, wedi'i addasu gyda KOH (osmolarity 290). At ddibenion adfer, ychwanegwch 0.2% o Biocytin at y toddiant mewnol.
Cafwyd data gan Clampex (Clampex 11.1, Molecular Devices) gan ddefnyddio mwyhadur MultiClamp 700B (Molecular Devices) a digidydd Digidata 1550B (Molecular Devices), hidlwyd pas isel ar 2 kHz, digideiddiwyd ar 20 kHz, a dadansoddwyd gan ddefnyddio Clampfit (fersiwn 10.6) ar gyfer dadansoddi, dyfeisiau moleciwlaidd) a swyddogaethau MATLAB personol (MATLAB 2019b, Mathworks). Cyfrifwyd y potensial cyffordd gan ddefnyddio JPCalc ac addaswyd y cofnodion i'r potensial cyffordd cyfrifedig o -14 mV. Mae Gweithrediad IV yn cynnwys cyfres o gamau cerrynt mewn camau 5-10 pA o -50 i 250 pA.
Ar gyfer ail-greu morffolegol niwronau wedi'u pinsio, ychwanegwyd 0.2% o biocytin (Sigma-Aldrich) at y toddiant mewnol. Caiff y celloedd eu paratoi am o leiaf 15 munud ar ôl eu hacio. Yna caiff y piped ei dynnu i mewn yn araf am 1-2 funud nes bod y bilen gofrestredig wedi'i selio'n llwyr. Gan ddilyn y weithdrefn ffisioleg adrannol, cafodd adrannau eu gosod dros nos ar 4°C mewn 4% PFA, eu golchi â PBS X3, a'u gwanhau 1:1000 gyda DyLight 549 neu DyLight 405 (Vector Labs) wedi'i gyfuno â streptavidin. Cafodd celloedd wedi'u llenwi â biocytin (2%; Sigma-Aldrich) eu labelu yn ystod recordio clampio clwt ar dymheredd ystafell am 2 awr. Yna gosodwyd yr adrannau ar sleidiau microsgopeg gan ddefnyddio Aquamount (Thermo Scientific) a'u delweddu'r diwrnod canlynol ar ficrosgop confocal Leica TCS SP8 gan ddefnyddio amcan trochi olew gydag agorfa rifiadol ×40 1.3, chwyddiad ×0.9–1.0, xy. Mae'r gyfradd samplu tua 7 picsel fesul micron. Cafwyd pentyrrau-Z ar gyfnodau o 1 µm yn olynol, a pherfformiwyd mosaigau pentwr-z a phwytho awtomatig yn seiliedig ar Leica i orchuddio coeden dendritig gyfan pob niwron. Yna olrheiniwyd niwronau yn lled-law gan ddefnyddio'r rhyngwyneb neuTube 40 a chynhyrchwyd ffeiliau SWC. Yna uwchlwythwyd y ffeiliau i'r ategyn SimpleNeuriteTracer41 Fiji (ImageJ, fersiwn 2.1.0; NIH).
Cafwyd meinwe cortigol ddynol gyda chydsyniad gwybodus yn unol â phrotocol a gymeradwywyd gan Fwrdd Adolygu Sefydliadol Prifysgol Stanford. Cafwyd dau sampl o feinwe ôl-enedigol ddynol (3 a 18 oed) trwy dynnu'r cortecs blaen (gyrus blaen canol) fel rhan o lawdriniaeth ar gyfer epilepsi anhydrin. Ar ôl tynnu'r meinwe, casglwch y meinwe mewn NMDG-aCSF oer iâ yn cynnwys: 92 mM NMDG, 2.5 mM KCl, 1.25 mM NaH2PO4, 30 mM NaHCO3, 20 mM HEPES, 25 mM glwcos, 2 mM thiourea, 5 mM sodiwm ascorbat, 3 mM sodiwm pyruvat, 0.5 mM CaCl2 4H2O a 10 mM MgSO4 7H2O. Titradu i pH 7.3-7.4 gydag asid hydroclorig crynodedig. Dosbarthwyd y meinweoedd i'r labordy o fewn 30 munud a chymerwyd adrannau coronal yn unol â'r weithdrefn a ddisgrifiwyd uchod.
Perfformiwyd yr holl weithdrefnau anifeiliaid yn unol â chanllawiau gofal anifeiliaid a gymeradwywyd gan APLAC Prifysgol Stanford. Ysgogwyd llygod mawr (mwy na 140 diwrnod ar ôl trawsblannu) ag anesthesia isofluran 5% a'u hanestheteiddio ag 1-3% isofluran yn ystod y llawdriniaeth. Gosodwyd anifeiliaid mewn ffrâm stereotacsig (Kopf) a chwistrellwyd buprenorffin rhyddhau parhaus (SR) yn isgroenol. Caiff y benglog ei datgelu, ei glanhau a mewnosodir 3-5 sgriw esgyrn. I dargedu t-hCO3, cynhyrchwyd cyfesurynnau stereotacsig o ddelweddau MRI. Driliwyd twll burr yn y safle o ddiddordeb a gostyngwyd ffibrau (400 µm mewn diamedr, NA 0.48, Doric) 100 µm o dan wyneb yr hCO3 a'u sicrhau i'r benglog gyda sment deintyddol y gellir ei wella ag UV (Relyx).
Perfformiwyd recordiadau ffotometrig ffibr fel y disgrifiwyd yn flaenorol42. I gofnodi gweithgaredd digymell, gosodwyd llygod mawr mewn cawell glân a chysylltwyd cebl clytiau ffibr optig 400 µm mewn diamedr (Doric) wedi'i gysylltu â system gaffael data ffotometrig ffibr optig â'r cebl ffibr optig a fewnblannwyd. Yn ystod y recordiad 10 munud o weithgaredd modur, roedd yr anifeiliaid yn rhydd i archwilio'r cawell. I gofnodi'r gweithgaredd a ysgogwyd, anesthetwyd llygod mawr (mwy na 140 diwrnod ar ôl trawsblannu) gyda 5% isoflurane ar gyfer ysgogi ac 1-3% isoflurane ar gyfer cynnal a chadw. Rhowch yr anifail mewn ffrâm stereotactig (Kopf) a chaiff y mwstas ar ochr arall y t-hCO eu tocio i tua 2 cm a'u pasio trwy rwyll sydd wedi'i chysylltu ag actuator piezoelectrig (PI). Cysylltwyd cebl clytiau ffibr optig 400 µm (Doric) â'r ffibr a fewnblannwyd a'i gysylltu â'r system gaffael data. Yna cafodd y mwstas ar ochr arall t-hCO eu gwyro 50 gwaith (2 mm ar 20 Hz, 2 eiliad fesul cyflwyniad) ar adegau ar hap gan yriant piezoelectrig dros gyfnod recordio o 20 munud. Defnyddiwch y Pecyn Cymorth Arduino MATLAB i reoli amser gwyro gyda chod MATLAB personol. Mae digwyddiadau'n cael eu cydamseru â'r feddalwedd caffael data gan ddefnyddio pylsau rhesymeg transistor-transistor (TTL).
Cafodd llygod mawr (mwy na 140 diwrnod ar ôl trawsblannu) eu hysgogi ag anesthesia isofluran 5% a'u hanestheteiddio ag 1-3% isofluran yn ystod y llawdriniaeth. Gosodwyd yr anifeiliaid mewn ffrâm stereotacsig (Kopf) a chwistrellwyd buprenorffin SR a dexamethasone yn isgroenol. Caiff y benglog ei datgelu, ei glanhau a mewnosodir 3-5 sgriw esgyrn. I dargedu t-hCO3, cynhyrchwyd cyfesurynnau stereotacsig o ddelweddau MRI. Perfformiwyd craniotomi crwn (tua 1 cm mewn diamedr) gyda dril cyflymder uchel yn uniongyrchol dros yr hCO3 a drawsblannwyd. Unwaith y bydd yr asgwrn mor denau â phosibl, ond cyn drilio trwy'r asgwrn cyfan, defnyddiwch forseps i gael gwared ar y ddisg pelfig gyfan sy'n weddill i ddatgelu'r t-hCO3 oddi tano. Llenwyd y craniotomi â halwynog di-haint, ac atodwyd gorchudd a phin pen arbennig i'r benglog gyda sment deintyddol wedi'i halltu ag UV (Relyx).
Perfformiwyd delweddu dau-ffoton gan ddefnyddio microsgop aml-ffoton Bruker gydag amcan Nikon LWD (×16, 0.8 NA). Perfformiwyd delweddu GCaMP6 ar 920 nm gyda chwyddiad plân-z sengl 1.4x a chyfartaledd 8x o 7.5 fps. Ysgogwyd llygod mawr gyda 5% anesthesia isoflurane a'u cynnal gyda 1-3% isoflurane. Gosodwyd y llygod mawr mewn gosodiad pen wedi'i wneud yn arbennig a'u gosod o dan y lens. Cafwyd recordiad cefndir 3 munud o weithgaredd modur. Dros gyfnod o 20 munud o recordio, cyflwynwyd 50 pwff (pob cyflwyniad 100 ms o hyd) ar hap i'r pad mwstas gyferbyn â t-hCO gan ddefnyddio picospricer. Defnyddiwch y Pecyn Cymorth Arduino MATLAB i reoli amser byrstio gyda chod MATLAB personol. Cydamserwch ddigwyddiadau â meddalwedd caffael data (PrairieView 5.5) gan ddefnyddio curiadau TTL. Ar gyfer dadansoddi, cywirwyd y delweddau ar gyfer symudiad xy gan ddefnyddio cywiriad affin yn y rhaglen MoCo a lansiwyd yn Ffiji. Echdynnu olion fflwroleuol o gelloedd unigol gan ddefnyddio CNMF-E43. Echdynnwyd fflwroleuedd ar gyfer pob rhanbarth o ddiddordeb, ei drawsnewid yn gromliniau dF/F, ac yna ei drawsnewid yn sgoriau-z.
Cafodd llygod mawr (mwy na 140 diwrnod ar ôl trawsblannu) eu hysgogi ag anesthesia isofluran 5% a'u hanestheteiddio ag 1-3% isofluran yn ystod y llawdriniaeth. Gosodwyd anifeiliaid mewn ffrâm stereotacsig (Kopf) a chwistrellwyd buprenorffin SR a dexamethasone yn isgroenol. Torrwyd y mwstas ar ochr arall y t-hCO i tua 2 cm a'u rhoi trwy rwyll wedi'i chysylltu ag actuator piezoelectrig. Mae'r benglog yn cael ei datgelu a'i glanhau. Mae sgriw daear dur di-staen ynghlwm wrth y benglog. I dargedu t-hCO, cynhyrchwyd cyfesurynnau stereotacsig o ddelweddau MRI. Perfformiwch graniotomi crwn (tua 1 cm mewn diamedr) gyda dril cyflymder uchel ychydig uwchben y t-hCO. Unwaith y bydd yr asgwrn mor denau â phosibl, ond cyn drilio trwy'r asgwrn cyfan, defnyddiwch forseps i dynnu'r ddisg pelfig gyfan sy'n weddill i ddatgelu'r t-hCO oddi tano. Cofnodwyd celloedd unigol gan ddefnyddio chwiliedyddion silicon dwysedd uchel 32-sianel neu 64-sianel (Cambridge Neurotech) wedi'u seilio i sgriwiau daear ac wedi'u rhag-helaethu gyda mwyhaduron RHD (Intan). Defnyddiwch y manipulator i ostwng yr electrodau i'r safle targed trwy'r craniotomi, sydd wedi'i lenwi â halwynog di-haint. Casglwyd data ar amledd o 30 kHz gan ddefnyddio'r system gaffael data Open Ephys. Dim ond pan ganfuom weithgaredd digymell rhythmig cydberthynol iawn mewn mwy na 10 sianel y parhaodd y recordiad, gan awgrymu bod yr electrodau wedi'u lleoli yn y grafft (yn seiliedig ar ddata delweddu calsiwm dau-ffoton). Cafwyd recordiad cefndir 10 munud o weithgaredd modur. Yna gwyrwyd y mwstas ar ochr arall t-hCO 50 gwaith (2 mm ar 20 Hz, 2 eiliad fesul cyflwyniad) ar adegau ar hap gan yriant piezoelectrig dros gyfnod recordio o 20 munud. Gan ddefnyddio'r Pecyn Cymorth MATLAB ar gyfer Arduino (MATLAB 2019b), rheolwch amser gwyro gyda chod MATLAB personol. Defnyddiwch bylsiau TTL i gydamseru digwyddiadau â meddalwedd caffael data.
Ar gyfer arbrofion marcio optegol, cysylltwyd llinyn clytwaith optegol 200 µm (Doric) wedi'i gysylltu â laser 473 nm (Omicron) â ffibr optegol 200 µm wedi'i osod dros y craniotomi. Yn syth cyn hyn, addaswch bŵer y siwmper i 20 mW. Defnyddiwch y manipulator i ostwng yr electrodau i'r safle targed trwy'r craniotomi, sydd wedi'i lenwi â halwynog di-haint. Ar ddechrau'r recordiad, allyrrwyd deg pwls o olau 473 nm (amledd 2 Hz, hyd pwls 10 ms). Diffinwyd celloedd ffotosensitif fel celloedd a arddangosodd ymateb pigyn o fewn 10 ms o olau mewn 70% neu fwy o'r treialon.