Grazas por visitar Nature.com. Estás a usar unha versión do navegador con compatibilidade limitada con CSS. Para obter a mellor experiencia, recomendámosche que uses un navegador actualizado (ou que desactives o modo de compatibilidade en Internet Explorer). Ademais, para garantir a compatibilidade continua, mostramos o sitio sen estilos nin JavaScript.
Mostra un carrusel de tres diapositivas á vez. Usa os botóns Anterior e Seguinte para moverte por tres diapositivas á vez ou usa os botóns deslizantes do final para moverte por tres diapositivas á vez.
Os orgánulos neurais autoensamblados representan unha plataforma in vitro prometedora para modelar o desenvolvemento e as enfermidades humanas. Non obstante, os organoides carecen da conectividade que existe in vivo, o que limita a maduración e impide a integración con outros circuítos que controlan o comportamento. Aquí mostramos que os organoides corticais derivados de células nai humanas transplantados no córtex somatosensorial de ratas espidas neonatais desenvolven tipos de células maduras que se integran en circuítos sensoriais e relacionados coa motivación. A resonancia magnética revelou o crecemento de organoides postransplante en varias liñas de células nai e animais, mentres que a análise dun só núcleo revelou a progresión da corticoxénese e a aparición dun programa de transcrición dependente da actividade. De feito, as neuronas corticais transplantadas presentan propiedades morfolóxicas, sinápticas e de membrana interna máis complexas que as súas contrapartes in vitro, o que permite a detección de defectos neuronais en pacientes con síndrome de Timothy. O rastrexo anatómico e funcional demostrou que os orgánulos transplantados reciben entradas talamocorticais e corticocorticais, e os rexistros in vivo da actividade neuronal suxiren que estas entradas poden xerar respostas sensoriais en células humanas. Finalmente, os organoides corticais estenden os axóns por todo o cerebro da rata, e a súa activación optoxenética leva a un comportamento de busca de recompensas. Así, as neuronas do córtex humano transplantadas maduran e participan nos circuítos do hóspede que controlan o comportamento. Agardamos que esta estratexia facilite a detección de fenotipos a nivel de cadea en células derivadas de pacientes que non se poden detectar por outros medios.
O cerebro humano en desenvolvemento é un notable proceso de autoorganización no que as células proliferan, diferencian, migran e se conectan para formar circuítos neuronais funcionais que se refinan aínda máis a través da experiencia sensorial. Un problema clave para comprender o desenvolvemento do cerebro humano, especialmente no contexto das enfermidades, é a falta de acceso ao tecido cerebral. Os orgánulos autoorganizados, incluídos os organoides do córtex humano (hCO; tamén coñecido como esfera do córtex humano), poden xerar 2,3,4,5,6. Non obstante, varias limitacións limitan a súa aplicación máis ampla para comprender o desenvolvemento e o funcionamento dos circuítos neuronais. En particular, non está claro se a maduración da hCO está limitada pola ausencia de certas entradas microambientais e sensoriais presentes in vivo. Ademais, debido a que as hCO non están integradas en circuítos que poden xerar resultados conductuais, a súa utilidade na modelaxe de trastornos neuropsiquiátricos xeneticamente complexos e conductuais é actualmente limitada.
O transplante de hCO a un cerebro vivo intacto pode superar estas limitacións. Estudos previos demostraron que as neuronas humanas transplantadas no córtex de roedores son capaces de sobrevivir, proxectarse e comunicarse con células de roedores7,8,9,10,11,12. Non obstante, estes experimentos adoitan realizarse en animais adultos, o que pode limitar a integración sináptica e axonal. Aquí, describimos un paradigma de transplante no que transplantamos hCO 3D derivado de células hiPS no córtex somatosensorial primario (S1) de ratas inmunodeficientes nunha fase temperá do desenvolvemento plástico. As neuronas hCO (t-hCO) transplantadas sofren unha maduración substancial, reciben entradas talamocorticais e corticocorticais que provocan respostas sensoriais e estenden as proxeccións axonais ao cerebro da rata para impulsar o comportamento de busca de recompensas. A maduración prolongada de t-hCO revelou defectos neuronais en pacientes con síndrome de Timothy (TS), un trastorno xenético grave causado por mutacións no canal de calcio CaV1.2 de tipo L sensible á voltaxe (codificado por CACNA1C).
Para estudar as neuronas corticais humanas en circuítos in vivo, transplantamos estereotacticamente hCO 3D intacto en S1 de ratas atímicas posnatais temperás (días 3-7 posnatal) (Fig. 1a e datos ampliados da Fig. 1a-c). Neste punto, as proxeccións axonais talamocorticais e corticocorticais aínda non completaron a súa inervación S1 (ref. 13). Polo tanto, esta abordaxe está deseñada para maximizar a integración de t-hCO e minimizar o impacto nos circuítos endóxenos. Para visualizar a localización de t-hCO en animais vivos, realizamos reconstrucións cerebrais por resonancia magnética ponderadas en T2 de ratas 2-3 meses despois do transplante (Fig. 1b e datos ampliados, Fig. 1d). O t-hCO observáronse facilmente e as medicións de volume de t-hCO foron similares ás calculadas a partir de cortes fixos (Datos ampliados Fig. 1d, e; P > 0,05). O t-hCO observáronse facilmente e as medicións de volume de t-hCO foron similares ás calculadas a partir de cortes fixos (Datos ampliados Fig. 1d, e; P > 0,05). t-hCO легко наблюдались, а объемные измерения t-hCO были аналогичны рассчитанным длеро фиксины фикси (расширенные данные, рис. 1d, e; P> 0,05). Os t-hCO observáronse facilmente e as medicións volumétricas de t-hCO foron similares ás calculadas para seccións fixas (datos ampliados, Fig. 1d, e; P > 0,05).很容易观察到t-hCO，并且t-hCO的体积测量值与从固定切片计算的测量值相似（扩展数据图1d、e；P > 0,05）很容易观察到t-hCO，并且t-hCO t-hCO легко наблюдался, а объемные измерения t-hCO были аналогичны рассчитанным для фиксрнызнирово (расширенные данные, рис. 1d, e; P> 0,05). O t-hCO observouse facilmente e as medicións volumétricas de t-hCO foron similares ás calculadas para seccións fixas (datos ampliados, Fig. 1d, e; P > 0,05).Determinamos a t-hCO no 81 % dos animais transplantados aproximadamente 2 meses despois do transplante (n = 72 animais; hCO procedente de 10 liñas celulares hiPS; liñas celulares hiPS na Táboa suplementaria 1). Destes, o 87 % localizáronse no córtex cerebral (Fig. 1c). Ao realizar resonancias magnéticas en serie en varios momentos na mesma rata transplantada, atopamos un aumento de nove veces no volume de t-hCO nos 3 meses (Fig. 1d e datos ampliados, Fig. 1f). Os animais transplantados tiveron unha alta taxa de supervivencia (74 %) aos 12 meses posteriores ao transplante (datos ampliados, Fig. 1g e Táboa suplementaria 2) e non se atoparon deficiencias motoras ou da memoria evidentes, gliose nin electroencefalograma (EEG). Datos da Fig. 1g e táboa suplementaria 2). 1h-m e 3e).
a, Esquema do deseño experimental. O hCO derivado de células hiPS foi transplantado en S1 de ratas nuas recén nacidas nos días 30-60 de diferenciación. b, Imaxes de resonancia magnética coronal e horizontal ponderadas en T2 que mostran t-hCO en S1 2 meses despois do transplante. Barra de escala, 2 mm. c, Cuantificación das taxas de éxito do enxerto mostradas para cada liña celular hiPS (n = 108, os números dentro das barras indican a cantidade de t-hCO por liña celular hIPS) e a localización cortical ou subcortical (n = 88). d, Imaxe de resonancia magnética dunha arteria coronaria (esquerda; barra de escala, 3 mm) e reconstrución volumétrica 3D correspondente (barra de escala, 3 mm) que mostra un aumento no t-hCO durante 3 meses. e, Revisión dos patróns de t-hCO no córtex cerebral de rata. Barra de escala, 1 mm. f, Imaxes inmunocitoquímicas representativas de t-hCO móstranse de arriba a esquerda a dereita (durante a diferenciación): PPP1R17 (4 meses de idade), NeuN (8 meses de idade), SOX9 e GFAP (8 meses de idade), PDGFRα; (8 meses), MAP2 (8 meses) e IBA1 (8 meses). Barra de escala, 20 µm. A coexpresión de HNA indica células de orixe humana. g, secuenciación de snRNA: imaxe de redución da dimensionalidade de proxección e manifold unificado (UMAP) de todos os núcleos de t-hCO de alta calidade despois da integración de Seurat (n = 3 mostras de t-hCO, n = 2 liñas celulares hiPS). Astrocitos, células da liña de astrocitos; cyc prog, proxenitores circulantes; GluN DL, neuronas glutamatérxicas profundas; GluN DL/SP, neuronas glutamatérxicas profundas e sublamelares; GluN UL, neuronas glutamatérxicas da capa superior; oligodendrocitos, oligodendrocitos; OPC, células proxenitoras de oligodendrocitos; RELN, neuronas de reelina. h, análise de enriquecemento de termos de ontoloxía xénica (GO) de xenes significativamente regulados positivamente (P axustado < 0,05, cambio de pregamento > 2, expresados ​​en polo menos o 10 % dos núcleos) en neuronas glutamatérxicas t-hCO en comparación coas neuronas glutamatérxicas hCO. h, análise de enriquecemento de termos de ontoloxía xénica (GO) de xenes significativamente regulados positivamente (P axustado < 0,05, cambio de pregamento > 2, expresados ​​en polo menos o 10 % dos núcleos) en neuronas glutamatérxicas t-hCO en comparación coas neuronas glutamatérxicas hCO. h, Анализ обогащения терминов Gene Ontology (GO) для генов со значительной активацией (скоррективацией (скоррективацией) изменения > 2, экспрессия по крайней мере в 10% ядер) в глутаматергических нейронах t-hCO по сних глутаматергическими нейронами hCO. h, análise de enriquecemento de termos de ontoloxía xénica (GO) para xenes con activación significativa (P axustado <0,05, cambio de pregamento >2, expresión en polo menos o 10 % dos núcleos) en neuronas glutamatérxicas t-hCO en comparación coas neuronas glutamatérxicas hCO. h，与hCO 谷氨酸能神经元相比，t-hCO 谷氨酸能神经元中基因显着上调（谎P整0.05，倍数变化> 2，在至少10% 的细胞核中表达）的基因本体论(GO) 术语富核中表达）的基因本体论(GO) 术语富核中表达 h ， 与 hco 谷氨酸 能 元 相比 ， t-hco 谷氨酸 能 神经 元 基因 显着 上调 ０ 同 （ 05 .变化 变化> 2 ， 至少 10% 的 核中 表达） 基因 基因 基因 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的的 的 的 的本体论(GO) 术语富集分析。 h, гены значительно активизировались (скорректированный P <0,05, кратность изменения> 2, эсрусспия крайней мере в 10% ядер) в глутаматергических нейронах t-hCO по сравнению с глутаматергиоми мескических нейронах t-hCO Онтологический (GO) анализ термина обогащения. h, os xenes estaban significativamente regulados á alza (P axustado < 0,05, cambio de pregamento > 2, expresados ​​en polo menos o 10 % dos núcleos) nas neuronas glutamatérxicas de t-hCO en comparación coas neuronas glutamatérxicas de hCO. Análise ontolóxica (GO) do termo de enriquecemento.A liña punteada indica un valor aq de 0,05. i, imaxe UMAP de tipos de células GluN en t-hCO usando transferencia de etiquetas dun conxunto de datos de referencia de 22 snRNA-seq de córtex motor adulto. CT: células corticotalámicas, ET: células extracerebrais, IT: células telencefálicas internas, NP: proxección próxima.
Despois avaliamos a citoarquitectura e a composición celular xeral do t-hCO. A tinción de anticorpos das células endoteliais de rata revelou vascularización con t-hCO, mentres que a tinción de IBA1 revelou a presenza de microglía de rata en todo o enxerto (Fig. 1f e datos ampliados, Fig. 3c,d). A inmunotinción revelou células positivas para o antíxeno nuclear humano (HNA) que coexpresan PPP1R17 (proxenitores corticais), NeuN (neuronas), SOX9 e GFAP (células derivadas da glía) ou PDGFRα (proxenitores de oligodendrocitos) (Figura 1f). Para estudar a composición celular do t-hCO a resolución de célula única, realizamos a secuenciación de ARN dun só núcleo (snRNA-seq) despois de aproximadamente 8 meses de diferenciación. A filtración a granel e a eliminación de núcleos de rata produciron 21.500 mapas mononucleares humanos de alta calidade (Fig. 1g e datos ampliados, Fig. 4a,b). Os patróns de expresión de marcadores típicos de tipo celular identificaron grupos das principais clases de células corticais, incluíndo neuronas glutamatérxicas profundas e superficiais, proxenitores circulantes, oligodendrocitos e liñaxes de astrocitos (Fig. 1g, datos ampliados, Fig. 4c e Táboa suplementaria 3). A inmunotinción para SATB2 e CTIP2 mostrou que, a pesar da presenza de subtipos corticais, a t-hCO non mostraba unha estratificación anatómica clara (datos ampliados, Fig. 3a). A hCO de secuenciación de snRNA coincidente por estadio produciu clases celulares amplamente similares, con algunhas excepcións, incluíndo a ausencia de oligodendrocitos e a presenza de neuronas GABAérxicas, o que pode reflectir as condicións in vitro favorables para as células proxenitoras laterais descritas anteriormente15 (datos ampliados, Fig. 4f-i e Táboa suplementaria 4). A análise da expresión xénica diferencial revelou diferenzas significativas nas neuronas glutamatérxicas entre t-hCO e hCO (Táboa suplementaria 5), ​​incluída a activación de conxuntos de xenes asociados coa maduración neuronal, como a sinalización sináptica, a localización dendrítica e a actividade dos canais regulados por voltaxe (Figura 1h e Táboa suplementaria 5). En consecuencia, as neuronas glutamatérxicas t-hCO corticais mostraron unha maduración transcricional acelerada.
Para dilucidar se estes cambios transcricionais no t-hCO estaban relacionados con diferenzas morfolóxicas entre o hCO in vitro e o t-hCO in vivo, reconstruímos hCO e hCO cheos de biocitina con estadios coincidentes en seccións agudas despois de 7-8 meses de diferenciación. Neuronas hCO (Fig. 2a). As neuronas t-hCO eran significativamente máis grandes, tiñan 1,5 veces o diámetro do soma, o dobre de dendritas e un aumento global de seis veces na lonxitude dendrítica total en comparación co hCO in vitro (Fig. 2b). Ademais, observamos unha densidade significativamente maior de espiñas dendríticas nas neuronas t-hCO que nas neuronas hCO (Fig. 2c). Isto suxire que as neuronas t-hCO sofren un alongamento e ramificación dendrítica extensivos, o que, en combinación coa proliferación celular continua, pode contribuír ao crecemento intensivo do t-hCO despois do transplante (Fig. 1d e Datos ampliados Fig. 1f). Isto levounos a investigar as propiedades electrofisiolóxicas. A capacitancia da membrana foi oito veces maior (datos ampliados, Fig. 8d), o potencial de membrana en estado de repouso estaba máis hiperpolarizado (aproximadamente 20 mV) e a inxección de corrente induciu unha taxa de excitación máxima máis alta nas neuronas t-hCO que nas neuronas hCO in vitro (Fig. 2d), e), o que é consistente coas características morfolóxicas máis grandes e complexas da t-hCO. Ademais, a frecuencia de eventos de corrente postsináptica excitatoria espontánea (EPSC) foi significativamente maior nas neuronas t-hCO (Fig. 2f), o que suxire que o aumento da densidade de espiñas dendríticas observado nas neuronas t-hCO estaba asociado coa excitabilidade funcional da sinapse sexual. Confirmamos o carácter inmaduro das neuronas hCO in vitro rexistrando neuronas glutamatérxicas marcadas (datos ampliados, Fig. 6a-c).
a. Reconstrución 3D de neuronas hCO e t-hCO cheas de biocitina despois de 8 meses de diferenciación. b, Cuantificación das características morfolóxicas (n = 8 neuronas hCO, n = 6 neuronas t-hCO; **P = 0,0084, *P = 0,0179 e ***P < 0,0001). b, Cuantificación das características morfolóxicas (n = 8 neuronas hCO, n = 6 neuronas t-hCO; **P = 0,0084, *P = 0,0179 e ***P < 0,0001). б, количественная оценка морфологических признаков (n = 8 нейронов hCO, n = 6 нейронка морфологических признаков) *** P <0,0001). b, cuantificación das características morfolóxicas (n=8 neuronas hCO, n=6 neuronas t-hCO; **P=0,0084, *P=0,0179 e ***P<0,0001). b，形态学特征的量化（n = 8 个hCO 神经元，n = 6 个t-hCO 神经元；**P = 0,0084，*P = 90 个t-hCO 神经元；**P = 0,0084，*P = P = 90 0,0001). b，形态学特征的量化（n = 8 个hCO 神经元，n = 6 个t-hCO 神经元；**P = 0,0084，*P = 90 个t-hCO 神经元；**P = 0,0084，*P = P = 90 0,0001). б, количественная оценка морфологических признаков (n = 8 нейронов hCO, n = 6 нейронка морфологических признаков) *** P <0,0001). b, cuantificación das características morfolóxicas (n=8 neuronas hCO, n=6 neuronas t-hCO; **P=0,0084, *P=0,0179 e ***P<0,0001).c, reconstrución 3D das ramas dendríticas de hCO3 e t-hCO3 despois de 8 meses de diferenciación. Os asteriscos vermellos indican as posibles espiñas dendríticas. Cuantificación da densidade das espiñas dendríticas (n = 8 neuronas hCO3, n = 6 neuronas t-hCO3; **P = 0,0092). d, Cuantificación do potencial de membrana en repouso (n = 25 neuronas hCO3, n = 16 neuronas t-hCO3; ***P < 0,0001). d, Cuantificación do potencial de membrana en repouso (n = 25 neuronas hCO3, n = 16 neuronas t-hCO3; ***P < 0,0001). d, количественная оценка мембранного потенциала покоя (n = 25 нейронов hCO, n = 16 нейронов t-hCO; *** P-hCO). d, cuantificación do potencial de membrana en repouso (n = 25 neuronas hCO3, n = 16 neuronas t-hCO3; ***P < 0,0001). d，静息膜电位的量化（n = 25 hCO 神经元，n = 16 t-hCO 神经元；***P < 0,0001）。 d，静息膜电位的量化（n = 25 hCO 神经元，n = 16 t-hCO 神经元；***P < 0,0001）。 d, количественная оценка мембранного потенциала покоя (n = 25 нейронов hCO, n = 16 нейронов t-hCO; *** P-hCO). d, cuantificación do potencial de membrana en repouso (n = 25 neuronas hCO3, n = 16 neuronas t-hCO3; ***P < 0,0001). e, Disparo de potencial de acción repetitivo en hCO3 e t-hCO3 inducido por inxeccións de corrente crecentes e cuantificación da taxa de disparo máxima (n = 25 neuronas hCO3, n = 16 neuronas t-hCO3; ***P < 0,0001). e, Disparo de potencial de acción repetitivo en hCO3 e t-hCO3 inducido por inxeccións de corrente crecentes e cuantificación da taxa de disparo máxima (n = 25 neuronas hCO3, n = 16 neuronas t-hCO3; ***P < 0,0001). e, повторное возбуждение потенциала действия в hCO e t-hCO, вызванное увеличением тока, e количением тока, и количнествия максимальной скорости возбуждения (n = 25 нейронов hCO, n = 16 нейронов t-hCO; *** P <0,0001). e, reactivación do potencial de acción en hCO3 e t-hCO3 inducida polo aumento da corrente e a cuantificación da taxa de disparo máxima (n = 25 neuronas hCO3, n = 16 neuronas t-hCO3; *** P < 0,0001). e，通过增加电流注入诱导的hCO 和t-hCO 重复动作电位放电，以及最大放甄大放电率率率电，n 5个hCO 神经元，n = 16 个t-hCO 神经元；***P <0,0001）。 E ， 通过 增加 电流 注入 的 的 hco 和 t-hco 重复 电位 放电 ， 以及 最 大 及 最 大 大 及 （ （ （ 2个 hco 神经 ， n = 16 个 t-hco 神经 ； *** p <0,0001） 。 e, повторяющееся возбуждение потенциала действия hCO e t-hCO, вызванное увеличением подакач, и и количественная оценка максимальной скорости возбуждения (n = 25 нейронов hCO, n = 16 нейронов t-hCO, n = 16 нейронов t-10,000*** P-10,00в t). e, disparo repetitivo de potenciais de acción de hCO3 e t-hCO3 inducidos por un aumento do subministro de corrente e a cuantificación da taxa de disparo máxima (n = 25 neuronas hCO3, n = 16 neuronas t-hCO3; *** P < 0,0001). f, EPSCs espontáneos (sEPSCs) en neuronas hCO e t-hCO aos 8 meses de diferenciación e cuantificación da frecuencia de eventos sinápticos (n = 25 neuronas hCO, n = 17 neuronas t-hCO; ***P < 0,0001). f, EPSCs espontáneos (sEPSCs) en neuronas hCO e t-hCO aos 8 meses de diferenciación e cuantificación da frecuencia de eventos sinápticos (n = 25 neuronas hCO, n = 17 neuronas t-hCO; ***P < 0,0001). f, спонтанные EPSC (sEPSC) в нейронах hCO и t-hCO через 8 месяцев дифференцировки и количествечная количественая количества синаптических событий (n = 25 нейронов hCO, n = 17 нейронов t-hCO; *** P <0,0001) . f, EPSCs espontáneos (sEPSCs) en neuronas hCO e t-hCO aos 8 meses de diferenciación e cuantificación das taxas de eventos sinápticos (n = 25 neuronas hCO, n = 17 neuronas t-hCO; ***P < 0,0001). f，分化8 个月时hCO 和t-hCO 神经元中的自发性EPSCs (sEPSCs)，以及突触事件频率延频率元中的自发性EPSCs (sEPSCs)神经元，n = 17 t-hCO 神经元；***P <0,0001） . f，分化8 个月时hCO 和t-hCO 神经元中的自发性EPSCs (sEPSCs)，以及突触事件频率延频率元中的自发性EPSCs (sEPSCs)神率的量匼（n = 25 hCO 神率的量匼（n = 25hCO P <0,0001） . f, спонтанные EPSC (sEPSC) в нейронах hCO и t-hCO через 8 месяцев дифференцировки и количествечная количественая количества синаптических событий (n = 25 нейронов hCO, n = 17 нейронов t-hCO; *** P <0,0001). f, EPSCs espontáneos (sEPSCs) en neuronas hCO e t-hCO aos 8 meses de diferenciación e cuantificación das taxas de eventos sinápticos (n = 25 neuronas hCO, n = 17 neuronas t-hCO; *** P<0,0001).Para bf, o hCO3 e o t-hCO3 na liña 1208-2 tomáronse do mesmo lote de diferenciación mantido en paralelo. g, Análise de enriquecemento do conxunto de xenes (proba exacta de Fisher unilateral) de xenes significativamente regulados positivamente (P axustado < 0,05, cambio de pregamento > 2, expresados ​​en polo menos o 10 % dos núcleos) en neuronas glutamatérxicas de t-hCO en comparación con neuronas glutamatérxicas de hCO con conxuntos de xenes dependentes da actividade tanto de resposta temperá (ERG) como de resposta tardía (LRG) identificados a partir dun estudo in vivo con ratos16 e LRG específicos de humanos de neuronas in vitro17. g, Análise de enriquecemento do conxunto de xenes (proba exacta de Fisher unilateral) de xenes significativamente regulados positivamente (P axustado < 0,05, cambio de pregamento > 2, expresados ​​en polo menos o 10 % dos núcleos) en neuronas glutamatérxicas de t-hCO en comparación con neuronas glutamatérxicas de hCO con conxuntos de xenes dependentes da actividade tanto de resposta temperá (ERG) como de resposta tardía (LRG) identificados a partir dun estudo in vivo con ratos16 e LRG específicos de humanos de neuronas in vitro17. g, анализ обогащения набора генов (односторонний точный критерий Фишера) генов со знаторонний точный критерий Фишера) (скорректированный P <0,05, кратность изменения > 2, экспрессия по меньшей мере в 10% ядетерь в гадетерь в гадетерь нейронах t-hCO по сравнению с глутаматергическими нейронами hCO наборы генов как раннего (ERG), так и позднего (LRG) генов, зависящих от активности, идентифицированнысних в ованнысних в ванныснего мышах in vivo16, и специфических для человека LRG из нейронов in vitro17. g, análise do enriquecemento do conxunto de xenes (proba exacta de Fisher unilateral) de xenes con activación significativa (P < 0,05 axustado, cambio de pregamento > 2, expresión en polo menos o 10 % dos núcleos) en neuronas glutamatérxicas de t-hCO en comparación con conxuntos de neuronas glutamatérxicas de hCO de xenes dependentes da actividade tanto temperás (ERG) como tardías (LRG) identificados en ratos in vivo16 e LRG específicos de humanos de neuronas in vitro17. g，t-hCO谷氨酸能神经元与hCO谷氨酸能神经元相比，t -hCO谷氨酸能神经元显着上调（调整后P<0,05，倍数变化>2，在至少10%的细胞核中表达）的基因集富集分析（单侧F isher精确检验）从体内小鼠研究中鉴定的早期反应(ERG)和晚期反应(LRG) 活性依赖性基因的基因组16 和体外神经元17 中的人类牧异怂性LRG。 g ， t-hco 谷氨酸 神经 元 与 hco 谷氨酸 神经 元 相比 ， t-hco 谷氨酸 神经 元 神经 元 上 ， p <0,05 ， 倍数> 2 ， 至少 至少 10%的 细胞 核中 表达） 的 集富集 分析 （分析 （分析 （分析 （单（单） 核中 表达）体内 小鼠 研究 中 的 早期 反应 反应 反应 和 晚期 反应 反应 (lrg) 活性 基因 的 基因组 16 因组 反应 反应 (lrg)中 中 17 中 17的人类特异性LRG. g, глутаматергические нейроны t-hCO были значительно активизированы по сравнению с глутамчтесрованы нейронами hCO (скорректированный P<0,05, кратность изменения> 2, не менее 10% (односторонний точный тест Фишера) раннего ответа (ERG) e позднего гены, зависящие от активности ответа (LRG), идентифицированные в исследованиях на мышах in vivo16 e нейронах in vitro17. LRG, специфичные для человека. As neuronas glutamatérxicas de g, t-hCO víronse significativamente sobreexpresadas en comparación coas neuronas glutamatérxicas de hCO (P <0,05 axustado, cambio de pregamento >2, polo menos un 10 % de xenes dependentes da actividade de resposta (LRG) de resposta temperá (ERG) e resposta tardía (proba exacta de Fisher unilateral) identificados en ratos in vivo16 e neuronas in vitro.17 LRG específicos de humanos.A liña punteada indica un valor P corrixido por Bonferroni de 0,05. h, a expresión do xene GluN (pseudoempaquetamento e escalado de cada xene) regulouse positivamente de forma significativa nas réplicas de secuenciación de snRNA dos xenes LRG en neuronas glutamatérxicas t-hCO. i, inmunotinción que mostra a expresión de SCG2 en neuronas t-hCO (superior) e hCO (inferior). As frechas brancas apuntan ás células SCG2+. Barra de escala, 25 µm. Os datos exprésanse como media ± desviación estándar.
Baseándose no aumento da actividade de t-hCO observado en cortes ex vivo, a secuenciación de snRNA revelou unha regulación á alza dependente da actividade dos transcritos xénicos en t-hCO en comparación con hCO in vitro. As neuronas t-hCO glutamatérxicas expresaron niveis máis altos de xenes que regulan a actividade de resposta tardía (Fig. 2g, h), que se atoparon en estudos previos en neuronas de rato e humana16,17. Por exemplo, BDNF18, SCG2 e OSTN, un xene regulador da actividade específico de primates, mostraron unha maior expresión nas neuronas t-hCO en comparación coas neuronas hCO (Fig. 2g-i). Polo tanto, as neuronas t-hCO exhibiron características de maduración melloradas en comparación coas neuronas hCO mediante análises transcricionais, morfolóxicas e funcionais.
Para avaliar máis a asociación da maduración do t-hCO co desenvolvemento do cerebro humano, realizamos comparacións transcriptómicas de tipos de células corticais fetais e adultas19,20 e adultas21,22, así como datos exhaustivos sobre a expresión xénica cortical23 durante o desenvolvemento (datos ampliados, Fig. 5). ). con traballos previos24, o estado global de maduración do transcriptoma de hCO e t-hCO aos 7-8 meses de diferenciación é amplamente consistente co tempo de desenvolvemento in vivo e é máis equivalente á vida fetal tardía (Datos ampliados, Fig. 5a). Cabe destacar que observamos unha maior madurez do transcriptoma no t-hCO en comparación co hCO da mesma idade, así como a activación do transcriptoma asociada á sinaptoxénese, a astroxénese e a mielinización (datos ampliados, Fig. 5b-d). A nivel celular, atopamos evidencias dun subtipo de córtex máis delgado no t-hCO, con grupos de neuronas glutamatérxicas que se superpoñen aos subtipos de neuronas L2/3, L5 e L6 adultas (Figura 1i). En contraste, a superposición de clústeres entre as neuronas t-hCO glutamatérxicas e as neuronas corticais fetais foi máis limitada a mediados do embarazo (datos ampliados, Figura 5e-j). Para determinar se as neuronas t-hCO son funcionalmente similares ás neuronas neocorticais posnatais humanas, realizamos rexistros electrofisiolóxicos e reconstrucións anatómicas de neuronas piramidais L2/3 humanas en seccións nítidas do córtex posnatal humano (datos ampliados, Fig. 7a). As propiedades electrofisiolóxicas das neuronas piramidais L2/3 foron similares ás das neuronas piramidais t-hCO (datos ampliados, Fig. 7e). Morfoloxicamente, as neuronas L2/3 de mostras humanas posnatais foron máis similares á t-hCO que á hCO, aínda que as células L2/3 eran máis longas, contiñan máis ramas en xeral e tiñan unha maior densidade de espiñas (Fig. 3g e datos ampliados, Fig. 7b-). G).
a, transplante de hCO producido por liñas celulares de control e TS hiPS en ratas neonatais. b, reconstrución 3D de neuronas t-hCO cheas de biocitina despois de 8 meses de diferenciación. c, cuantificación da lonxitude dendrítica media (n = 19 neuronas de control, n = 21 neuronas TS; **P = 0,0041). d, ramas dendríticas reconstruídas en 3D a partir de control e TS t-hCO3 aos 8 meses de diferenciación e cuantificación da densidade da espiña dendrítica (n = 16 neuronas de control, n = 21 neuronas TS, ***P < 0,0001). d, ramas dendríticas reconstruídas en 3D a partir de control e TS t-hCO3 aos 8 meses de diferenciación e cuantificación da densidade da espiña dendrítica (n = 16 neuronas de control, n = 21 neuronas TS, ***P < 0,0001). d, 3D-реконструкция дендритных ветвей из контроля e TS t-hCO через 8 месяцев дифференцев дифференцен контроля через оценка плотности дендритных шипов (n = 16 контрольных нейронов, n = 21 TS нейронов, *** P <0,0001). d, reconstrución 3D das ramas dendríticas a partir do grupo de control e do grupo de t-hCO3 TS aos 8 meses de diferenciación e cuantificación da densidade da espiña dendrítica (n=16 neuronas de control, n=21 neuronas TS, ***P<0,0001). d，分化8 个月时对照和TS t-hCO 的3D 重建树突分支，以及树突棘密度的量化 = 16（n个对照神经元，n = 21 个TS 神经元，***P < 0,0001）. d ， 分化 8 个 时 对照 和 ts t-hco 的 3d 重建 分支 分支 以及 树突棘 密度 棘 密度 重建   16神经 元 ， n = 21 个 ts 神经 ， *** p <0,0001 ）。 d, 3D-реконструкция дендритных ветвей контроля e TS t-hCO через 8 месяцев дифференцировестроля через оценка плотности дендритных шипов (n = 16 контрольных нейронов, n = 21 TS нейронов, *** P <0,0001). d, reconstrución 3D das ramas dendríticas de control e TS t-hCO3 aos 8 meses de diferenciación e cuantificación da densidade da espiña dendrítica (n = 16 neuronas de control, n = 21 neuronas TS, ***P < 0,0001).Os asteriscos vermellos indican supostas espiñas dendríticas. e, EPSCs espontáneas en neuronas t-hCO de control e TS despois de 8 meses de diferenciación. f, gráfica de frecuencia acumulada e cuantificación da frecuencia e amplitude dos eventos sinápticos (n = 32 neuronas de control, n = 26 neuronas TS; **P = 0,0076 e P = 0,8102). g, análise de Scholl das neuronas TS e de control en hCO e t-hCO. As liñas descontinuas mostran as neuronas piramidais posnatais humanas L2/3 para comparación (n = 24 neuronas t-hCO de control, n = 21 neuronas t-hCO TS, n = 8 neuronas hCO de control e n = 7 neuronas hCO TS). Os datos exprésanse como media ± desviación estándar.
A capacidade da t-hCO para replicar as características morfolóxicas e funcionais das neuronas do córtex humano a un alto nivel levounos a explorar se a t-hCO podería empregarse para detectar fenotipos de enfermidades. Centrámonos na TS, un trastorno grave do neurodesenvolvemento causado por mutacións de ganancia de función no xene que codifica CaV1.2, que inicia a transcrición xénica dependente da actividade nas neuronas. Obtivemos hCO de tres pacientes con TS que portaban a substitución máis común (p.G406R) e tres controis (Fig. 3a). Despois do transplante, descubrimos que a morfoloxía dendrítica estaba alterada nas neuronas TS en comparación cos controis (Fig. 3b e datos ampliados, Fig. 8a, b), cun aumento do dobre no número de dendritas primarias e un aumento xeral na diminución media e xeral da lonxitude dendrítica (Fig. 3c e datos ampliados, Fig. 8c). Isto asociouse cun aumento da densidade de espiñas e un aumento da frecuencia de EPSCs espontáneos na TS en comparación coas neuronas de control (Fig. 3d-f e datos ampliados, Fig. 8g). Unha análise posterior revelou patróns de ramificación dendrítica anormal en t-hCO TS en comparación cos controis, pero non en TS hCO in vitro nun estadio de diferenciación similar (Fig. 3g). Isto é consistente cos nosos informes previos de contracción dendrítica dependente da actividade en TS e destaca a capacidade desta plataforma de transplante para detectar fenotipos de enfermidades in vivo.
Despois preguntamos ata que punto as células t-hCO están integradas funcionalmente na S1 de rata. A S1 en roedores recibe fortes entradas sinápticas dos núcleos basais ventrais ipsilaterais e talámicos posteriores, así como das cortezas motora ipsilaterais e somatosensorial secundaria, e da S1 contralateral (Fig. 4a). Para restaurar o patrón de inervación, infectamos a hCO co virus da rabia-dG-GFP/AAV-G e transplantamos hCO a unha rata S1 3 días despois. Observamos unha densa expresión de GFP nas neuronas da S1 ipsilaterais e dos ganglios basais ventrais de 7 a 14 días despois do transplante (Fig. 4b, c). Ademais, a tinción de anticorpos do marcador talámico netrina G1 revelou a presenza de terminacións talámicas na t-hCO (Fig. 4d, e). Para avaliar se estas proxeccións aferentes poderían provocar respostas sinápticas nas células t-hCO, realizamos rexistros de células enteiras de células humanas en seccións nítidas da capa talamocortical. A estimulación eléctrica da S1 de rata, a cápsula interna, a substancia branca, as fibras preto da t-hCO ou a activación optoxenética das terminacións talámicas que expresan opsina en t-hCO induciu EPSCs de curta latencia en neuronas t-hCO expostas ao antagonista do receptor AMPA NBQX. (Fig. 4f, g e datos ampliados, Fig. 9a–g). Estes datos demostran que a t-hCO está integrada anatomicamente no cerebro da rata e pode ser activada polo tecido hóspede da rata.
a, Diagrama esquemático dun experimento de rastrexo da rabia. b, GFP e expresión de STEM121 específica de humanos entre t-hCO e o córtex cerebral de rata (panel superior). Tamén se mostra a expresión de GFP no núcleo basal ventral ipsilateral (VB) da rata (inferior á esquerda) e S1 ipsilateral (inferior á dereita). Barra de escala, 50 µm. Os cadrados vermellos representan as áreas do cerebro onde se tomaron as imaxes. c, cuantificación de células que expresan GFP (n = 4 ratas). d, e — Terminais talámicos de netrina G1+ en t-hCO. d mostra unha sección coronal que contén os núcleos de t-hCO e VB. Barra de escala, 2 mm. e mostra a expresión de netrina G1 e STEM121 nas neuronas t-hCO (esquerda) e VB (dereita). Barra de escala, 50 µm. A liña punteada laranxa indica o bordo do t-hCO. f, g, Trazas actuais de neuronas t-hCO despois da estimulación eléctrica en rata S1 (f) ou cápsula interna (g), con (púrpura) ou sen (negro) NBQX (esquerda). Amplitudes de EPSC con e sen NBQX (n = 6 neuronas S1, *P = 0,0119; e n = 6 neuronas da cápsula interna, **P = 0,0022) (centro). Porcentaxe de neuronas t-hCO que mostran EPSC en resposta á estimulación eléctrica de rata S1 (f) ou cápsula interna (g) (dereita). aCSF, líquido cefalorraquídeo artificial. h, diagrama esquemático do experimento de imaxe 2P (esquerda). Expresión de GCaMP6s en t-hCO (medio). Barra de escala, 100 µm. Lapso de tempo de fluorescencia de GCaMP6s (dereita). i, puntuación Z da fluorescencia de actividade espontánea. j, ilustración esquemática da estimulación do bigote. k, traxectorias de fluorescencia 2P con puntuación z nun ensaio, aliñadas coa desviación dos bigotes no tempo cero (liña descontinua) en células de exemplo. l, respostas de puntuación z promediadas na poboación de todas as células aliñadas coa desviación dos bigotes no tempo cero (liña descontinua) (vermello) ou marcas de tempo xeradas aleatoriamente (gris). m. Diagrama esquemático do experimento sobre marcado óptico. n, curvas de tensión brutas dunha célula de exemplo de t-hCO3 durante a estimulación con láser azul ou a desviación dos bigotes. As frechas vermellas indican os primeiros picos causados ​​pola luz (arriba) ou causados ​​pola desviación dos bigotes (abaixo). O sombreado gris indica períodos de desviación dos bigotes. o, formas de onda de luz máximas e respostas de desviación dos bigotes. p, picos dun só intento, aliñados coa desviación dos bigotes nas células do exemplo. 0 indica a desviación dos bigotes (liña descontinua). q, taxa de disparo de puntuación z promediada na poboación para todas as células fotosensibles, aliñada coa desviación dos bigotes no tempo cero (liña descontinua) (vermello) ou marcas de tempo xeradas aleatoriamente (gris). r, Proporción de unidades fotosensibles moduladas significativamente pola desviación do bigote (n = 3 ratas) (esquerda). Latencia máxima da puntuación z (n = 3 ratas; n = 5 (verde claro), n = 4 (verde escuro) e n = 4 (cian) unidades de modulación da deflexión do bigote por rata) (dereita). Os datos exprésanse como media ± desviación estándar.
Despois preguntamos se o t-hCO podería activarse mediante estímulos sensoriais in vivo. Transplantamos hCO que expresaba os indicadores de calcio codificados xeneticamente GCaMP6 a ratas S1. Despois de 150 días, realizamos fotometría de fibra ou imaxes de calcio de dous fotóns (Fig. 4h e datos ampliados, Fig. 10a). Descubrimos que as células t-hCO presentaban actividade rítmica sincronizada (Figura 4i, Datos ampliados, Figura 10b e Vídeo suplementario 1). Para caracterizar a actividade máxima do t-hCO, realizamos rexistros electrofisiolóxicos extracelulares en ratas de transplante anestesiadas (datos ampliados, Fig. 10c-f). Xeramos coordenadas estereotáxicas a partir de imaxes de resonancia magnética; polo tanto, estas unidades rexistradas representan putativas neuronas humanas, aínda que a electrofisioloxía por si soa non permite determinar unha especie de orixe. Observamos explosións de actividade sincronizadas (datos ampliados, Fig. 10d). As ráfagas duraron uns 460 ms e estiveron separadas por períodos de silencio duns 2 s (datos ampliados, Fig. 10d, e). As unidades individuais dispararon unha media duns tres disparos por ráfaga, o que supón aproximadamente o 73 % das unidades rexistradas por ráfaga. As actividades das unidades individuais estaban altamente correlacionadas e estas correlacións eran maiores que as das unidades identificadas en animais non vacinados rexistradas nas mesmas condicións (datos ampliados, Fig. 10f). Para caracterizar mellor as respostas aos picos das neuronas derivadas de humanos identificadas, realizamos experimentos de etiquetado con luz en ratas anestesiadas transplantadas con hCO que expresa o canal catiónico fotosensible rodopsina 2 (hChR2), a través do cal as neuronas t-hCO realizan un recoñecemento de curta latencia (menos de 10 ms) en resposta a estímulos de luz azul (Fig. 4m–o). As neuronas t-hCO mostraron explosións de actividade espontánea a frecuencias similares ás observadas nas imaxes de calcio, así como nos rexistros electrofisiolóxicos realizados en t-hCO en ausencia de marcas de luz (datos ampliados, Fig. 10c-g). Non se observou actividade espontánea nas etapas correspondentes de hCO rexistradas in vitro. Para avaliar se o t-hCO podía ser activado por estímulos sensoriais, desviamos brevemente os bigotes de rata lonxe do t-hCO (Fig. 4j, m e datos ampliados, Fig. 10h, k). Segundo estudos previos8,10, un subconxunto de células t-hCO mostrou un aumento da actividade en resposta á desviación dos bigotes, o que non se observou cando se compararon os datos con marcas de tempo aleatorias (Fig. 4k-q e datos ampliados, Fig. 10h-q). De feito, aproximadamente o 54 % das unidades individuais optomarcadas mostraron unha taxa de excitación significativamente maior despois da estimulación dos bigotes, alcanzando un máximo duns 650 ms (Fig. 4r). En conxunto, estes datos suxiren que o t-hCO recibe entradas funcionais axeitadas e pode ser activado por estímulos ambientais.
Despois investigamos se o t-hCO podía activar circuítos en ratas para controlar o comportamento. Primeiro investigamos se os axóns das neuronas t-hCO se proxectan nos tecidos circundantes da rata. Infectamos o hCO cun lentivirus que codifica o hChR2 fusionado con EYFP (hChR2-EYFP). Despois de 110 días, observamos a expresión de EYFP nas rexións corticais ipsilaterais, incluíndo os córtices auditivo, motor e somatosensorial, así como nas rexións subcorticais, incluíndo o estriado, o hipocampo e o tálamo (Fig. 5a). Para avaliar se estas proxeccións eferentes podían provocar respostas sinápticas nas células de rata, activamos opticamente as células t-hCO que expresaban hChR2-EYFP rexistrando células do córtex cerebral de rata en seccións cerebrais nítidas. A activación dos axóns de t-hCO con luz azul induciu EPSC de curta latencia en neuronas do córtex piramidal de rata, que foron bloqueadas por NBQX (Figs. 5b-g). Ademais, estas respostas poderían ser bloqueadas pola tetrodotoxina (TTX) e restauradas pola 4-aminopiridina (4-AP), o que suxire que foron causadas por conexións monosinápticas (Fig. 5e).
a, Diagrama esquemático do seguimento dos axóns (esquerda). Expresión de t-hCO EYFP (dereita). Barra de escala, 100 µm. A1, córtex auditivo, ACC, córtex cingulado anterior, d. estriado, estriado dorsal, HPC, hipocampo; diafragma, septo lateral, mPFC, córtex prefrontal medial, piri, córtex piriforme, v. estriado, estriado ventral, VPM, núcleo ventropostomedial do tálamo, VTA, rexión tegmental ventral. Os cadrados vermellos representan as áreas do cerebro onde se tomaron as imaxes. b, Diagrama esquemático do experimento de estimulación. c, d, Exemplos da resposta da fotocorrente inducida por luz azul (arriba) e a voltaxe (abaixo) en células humanas (c) EYFP+ t-hCO ou de rata (d) EYFP-. e, f, Trazas actuais de neuronas de rata despois da estimulación con luz azul dos axóns de t-hCO con TTX e 4-AR (verde), TTX (gris) ou aCSF (negro) (e), con (violeta) ou sen (negro)) ) NBQX (e). g, latencia das respostas inducidas por luz azul en células de rata (n = 16 células); as barras horizontais indican a latencia media (7,13 ms) (esquerda). Amplitude dos EPSCs evocados por luz rexistrados con ou sen NBQX (n = 7 células; ***P < 0,0001) (medio). Amplitude dos EPSCs evocados por luz rexistrados con ou sen NBQX (n = 7 células; ***P < 0,0001) (medio). Амплитуда вызванных светом EPSC, зарегистрированных с или без NBQX (n = 7 клеток; ***P <0,0001) (втрецен). Amplitude dos EPSCs inducidos por luz rexistrados con ou sen NBQX (n = 7 células; ***P < 0,0001) (centro).使用或不使用NBQX 记录的光诱发EPSC 的振幅（n = 7 个细胞；***P < 0,0001）（中）。使用或不使用NBQX 记录的光诱发EPSC 的振幅（n = 7 个细胞；***P < 0,0001）（中）。 Амплитуда вызванных светом EPSC, зарегистрированных с или без NBQX (n = 7 клеток; ***P <0,0001) (втрецен). Amplitude dos EPSCs inducidos por luz rexistrados con ou sen NBQX (n = 7 células; ***P < 0,0001) (centro).Porcentaxe de células de rata que mostran EPSCs que responden á luz azul (dereita). h, Diagrama esquemático dunha tarefa conductual. d0, día 0. i. Rendemento de animais exemplares o día 1 (esquerda) ou o día 15 (dereita) do adestramento. O número medio de lambetadas realizadas o día 1 (esquerda) ou o día 15 (centro dereita) (n = 150 probas con luz azul, n = 150 probas con luz vermella; ***P < 0,0001). O número medio de lambetadas realizadas o día 1 (esquerda) ou o día 15 (centro dereita) (n = 150 probas con luz azul, n = 150 probas con luz vermella; ***P < 0,0001). Среднее количество облизываний, выполненных в день 1 (слева) или день 15 (в центре справа 150 (выполненных в день) синим светом, n = 150 испытаний с красным светом ***P <0,0001). Número medio de lambetadas realizadas o día 1 (esquerda) ou o día 15 (centro dereita) (n = 150 probas con luz azul, n = 150 probas con luz vermella; ***P < 0,0001).第1 天（左）或第15 天（右中）执行的平均舔次数（n = 150 次蓝光试验（n = 150次红光试验；***P <0,0001）。第1 天（左）或第15 天（右中）执行的平均舔次数（n = 150 次蓝光试验（n = 150次红光试验；***P < 0,001 Среднее количество облизываний, выполненных в день 1 (слева) или день 15 (в центре справа 150 (выполненных в день) синим светом, n = 150 испытаний с красным светом ***P <0,0001). Número medio de lambetadas realizadas o día 1 (esquerda) ou o día 15 (centro dereita) (n = 150 probas con luz azul, n = 150 probas con luz vermella; ***P < 0,0001).Lambeduras acumulativas para as probas de luz vermella e azul no día 1 (centro esquerda) ou no día 15 (dereita). NS, non significativo. j,k, Características do comportamento de todos os animais transplantados con t-hCO que expresa hChR2-EYFP (j) ou fluoróforo de control (k) no día 1 ou 15 (hChR2-EYFP: n = 9 ratas, ** P = 0,0049; control: n = 9, P = 0,1497). l, Evolución da puntuación de preferencia (n = 9 hChR2, n = 9 control; **P < 0,001, ***P < 0,0001). l, Evolución da puntuación de preferencia (n = 9 hChR2, n = 9 control; **P < 0,001, ***P < 0,0001). l, Эволюция показателя предпочтения (n = 9 hChR2, n = 9 контрольных; **P <0,001, ***P <0,0001). l, Evolución da puntuación de preferencia (n = 9 hChR2, n = 9 controis; **P < 0,001, ***P < 0,0001). l，偏好评分的演变（n = 9 hChR2，n = 9 对照；**P < 0,001，***P < 0,0001）. l，偏好评分的演变（n = 9 hChR2，n = 9 对照；**P < 0,001，***P < 0,0001）. l, Эволюция показателей предпочтения (n = 9 hChR2, n = 9 контролей; **P <0,001, ***P <0,0001). l, Evolución das puntuacións de preferencia (n = 9 hChR2, n = 9 controis; **P < 0,001, ***P < 0,0001).m, expresión de FOS en resposta á activación optoxenética de t-hCO en S1. Móstranse imaxes da expresión de FOS (esquerda) e da cuantificación (n = 3 por grupo; *P < 0,05, **P < 0,01 e ***P < 0,001) (dereita). Móstranse imaxes da expresión de FOS (esquerda) e da cuantificación (n = 3 por grupo; *P < 0,05, **P < 0,01 e ***P < 0,001) (dereita). Показаны изображения экспрессии FOS (слева) и количественного определения (n = 3 на групресии, * P<0,0 группу;, * P** P<0,0 5, ** P** <0,001) (sprava). Móstranse imaxes da expresión de FOS (esquerda) e da cuantificación (n = 3 por grupo; *P<0,05, **P<0,01 e ***P<0,001) (dereita).显示了FOS 表达（左）和量化（每组n = 3；*P < 0,05、**P < 0,01 和***P < 0,001）（叄右）显示了FOS 表达（左）和量化（每组n = 3；*P < 0,05、**P < 0,01 和***P < 0,001）（叄右） Показаны изображения экспрессии FOS (слева) и количественного определения (n = 3 на групресии, * P<0,0 группу;, * P** P<0,0 5, ** P** <0,001) (sprava). Móstranse imaxes da expresión de FOS (esquerda) e da cuantificación (n = 3 por grupo; *P<0,05, **P<0,01 e ***P<0,001) (dereita).Barra de escala, 100 µm. Os datos exprésanse como media ± erro estándar de BLA, amígdala basolateral, MDT, núcleo talámico dorsomedial, PAG, gris periacueductal.
Finalmente, preguntámonos se o t-hCO podería modular o comportamento das ratas. Para comprobalo, transplantamos hCO que expresaba hChR2-EYFP en S1 e, 90 días despois, implantamos fibras ópticas no t-hCO para a administración de luz. Despois adestramos as ratas cun paradigma de condicionamento operante modificado (Fig. 5h). Colocamos os animais nunha cámara de probas de comportamento e aplicamos aleatoriamente estímulos láser azul (473 nm) e vermello (635 nm) durante 5 segundos. Os animais recibían unha recompensa de auga se lambían durante a estimulación con luz azul, pero non lambían durante a estimulación con luz vermella. O primeiro día de adestramento, os animais non mostraron diferenza no lambedo cando foron estimulados con luz azul ou vermella. Non obstante, no día 15, os animais transplantados con hCO que expresaba hChR2-EYFP mostraron un lambedo máis activo cando foron estimulados con luz azul en comparación coa estimulación con luz vermella. Estas modificacións no comportamento de lamber non se observaron en animais de control transplantados con hCO que expresaban o fluoróforo de control (taxa de éxito da aprendizaxe: hChR2 89 %, EYFP 0 %, Figura 5i-1 e Vídeo Suplementario 2). Estes datos suxiren que as células t-hCO poden activar as neuronas de rata para estimular o comportamento de busca de recompensas. Para descubrir que circuítos neuronais de t-hCO de rata poderían estar implicados nestes cambios de comportamento, activamos optoxeneticamente a t-hCO en animais adestrados e recollemos tecidos 90 minutos despois. A inmunohistoquímica revelou a expresión da proteína FOS dependente da actividade en varias rexións do cerebro implicadas no comportamento motivado, incluíndo o córtex prefrontal medial, o tálamo medial e a materia gris periacueductal, que se expresaba en animais de control non estimulados ou en animais. arroz. 5m). En conxunto, estes datos suxiren que a t-hCO pode modular a actividade neuronal da rata para impulsar o comportamento.
Os organoides neuronais representan un sistema prometedor para estudar o desenvolvemento humano e as enfermidades in vitro, pero están limitados pola falta de conexións entre os circuítos que existen in vivo. Desenvolvemos unha nova plataforma na que transplantamos hCO a S1 de ratas inmunodeprimidas en fase posnatais temperás para estudar o desenvolvemento e a función das células humanas in vivo. Demostramos que a t-hCO desenvolve tipos de células maduras que non se observan in vitro28 e que a t-hCO está integrada anatómica e funcionalmente no cerebro dos roedores. A integración da t-hCO nos circuítos neuronais dos roedores permitiunos establecer unha conexión entre a actividade celular humana e o comportamento animal estudado, demostrando que as neuronas t-hCO poden modular a actividade neuronal das ratas para impulsar respostas conductuais.
A plataforma que describimos ten varias vantaxes sobre as investigacións previas sobre o transplante de células humanas en cerebros de roedores. En primeiro lugar, transplantamos hCO3 no córtex en desenvolvemento de ratas en fase posnatais temperás, o que pode facilitar a integración anatómica e funcional. En segundo lugar, a monitorización por resonancia magnética de t-hCO3 permitiunos estudar a posición e o crecemento do enxerto en animais vivos, o que nos permitiu realizar estudos a longo prazo con varios animais e establecer a fiabilidade de varias liñas celulares hiPS. Finalmente, transplantamos organoides intactos, en lugar de suspensións de células individuais illadas, que son menos destrutivas para as células humanas e poden promover a integración e a xeración de neuronas do córtex humano en cerebros de ratas.
Recoñecemos que, a pesar dos avances nesta plataforma, as restricións temporais, espaciais e interespecíficas impiden a formación de circuítos neuronais humanos con alta fidelidade, mesmo despois do transplante nunha fase temperá do desenvolvemento. Por exemplo, non está claro se a actividade espontánea observada no t-hCO representa un fenotipo de desenvolvemento similar á actividade rítmica observada durante o desenvolvemento cortical ou se se debe á ausencia de tipos de células supresoras presentes no t-hCO. Do mesmo xeito, non está claro ata que punto a ausencia de laminación no t-hCO afecta á conectividade da cadea30. O traballo futuro centrarase na integración doutros tipos de células como a microglía humana, as células endoteliais humanas e proporcións variables de interneuronas GABAérxicas, como se mostra mediante a ensamblaxe 6 in vitro, así como na comprensión de como a integración e o procesamento neuronais poden producirse en niveis transcricionais, sinápticos e de comportamento alterados do t-hCO en células obtidas de pacientes.
En xeral, esta plataforma in vivo representa un recurso poderoso que pode complementar o desenvolvemento do cerebro humano in vitro e a investigación de enfermidades. Agardamos que esta plataforma nos permita descubrir novos fenotipos a nivel de cadea en células derivadas de pacientes que doutro xeito serían difíciles de alcanzar e probar novas estratexias terapéuticas.
Xeramos hCO2.5 a partir de células HiPS como se describiu anteriormente. Para iniciar a produción de hCO a partir de células hiPS cultivadas en capas alimentadoras, retiráronse colonias intactas de células hiPS das placas de cultivo usando dispase (0,35 mg/mL) e transferíronse a cultivos de plástico de adhesión ultrabaxa que contiñan placas con medio de cultivo celular hiPS (Corning) suplementado con dous inhibidores de SMAD, dorsomorfina (5 μM; P5499, Sigma-Aldrich) e SB-431542 (10 μM; 1614, Tocris) e o inhibidor de ROCK Y-27632 (10 μM; S1049, Selleckchem). Durante os primeiros 5 días, o medio celular hiPS cambiouse diariamente e engadíronse dorsomorfina e SB-431542. O sexto día en suspensión, os esferoides neurais transferíronse a un medio neural que contiña neurobasal-A (10888, Life Technologies), suplemento de B-27 sen vitamina A (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies), penicilina e estreptomicina (1:100, Life Technologies) e suplementado co factor de crecemento epidérmico (EGF; 20 ng ml−1; R&D Systems) e o factor de crecemento de fibroblastos 2 (FGF2; 20 ng ml−1; R&D Systems) ata o día 24. Do día 25 ao día 42, o medio suplementouse con factor neurotrófico derivado do cerebro (BDNF; 20 ng ml−1, Peprotech) e neurotrofina 3 (NT3; 20 ng ml−1; Peprotech) con cambios de medio cada dous días. O sexto día en suspensión, os esferoides neurais transferíronse a un medio neural que contiña neurobasal-A (10888, Life Technologies), suplemento de B-27 sen vitamina A (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies), penicilina e estreptomicina (1:100, Life Technologies) e suplementado co factor de crecemento epidérmico (EGF; 20 ng ml−1; R&D Systems) e o factor de crecemento de fibroblastos 2 (FGF2; 20 ng ml−1; R&D Systems) ata o día 24. Do día 25 ao día 42, o medio suplementouse con factor neurotrófico derivado do cerebro (BDNF; 20 ng ml−1, Peprotech) e neurotrofina 3 (NT3; 20 ng ml−1; Peprotech) con cambios de medio cada dous días.Ao sexto día en suspensión, os esferoides neurais foron transferidos a un medio neural que contiña Neurobasal-A (10888, Life Technologies), suplemento B-27 sen vitamina A (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies) e penicilina.e стрептомицин (1:100, Life Technologies) e дополнены эпидермальным фактором роста (EGF; 20 нг/мл; R&D Systems) и фактором роста фибробластов 2 (FGF2; 20 нг/мл; R&D Systems) ata 24-го дня. e estreptomicina (1:100, Life Technologies) e suplementado con factor de crecemento epidérmico (EGF; 20 ng/ml; R&D Systems) e factor de crecemento de fibroblastos 2 (FGF2; 20 ng/ml; R&D Systems) ata o día 24.Dos días 25 ao 42, engadíronse ao medio factor neurotrófico derivado do cerebro (BDNF; 20 ng ml-1, Peprotech) e neurotrofina 3 (NT3; 20 ng ml-1, Peprotech), cambiándoo cada dous días.在悬浮的第6 天，将神经球体转移到含有neurobasal-A（10888，Life Technologies）、不含维生素-A27补充剂（12587，Tecnoloxías da vida）、GlutaMax（1:100，Tecnoloxías da vida）、青霉素的神经培养基中和链霉（Life:1000 Tecnoloxías）并辅以表皮生长因子（EGF；20 ng ml-1；I+D Systems）和成纤维细胞生长因子2（FGF2；20 ng ml-1；R&D Systems）直至第24 天。在 悬浮 的 第 第 6 天 将 神经 球体 转移 含有 含有 neurobasal-a （10888 ， Life Technologies） 縠 吃体 縠 a b-27 补充剂 （12587 ， Life Technologies） Glutamax （1: 100 ， Life TechNOGIS青霉素 的 神经 培养 基 中 链  （ 10 （ Life TechNOGIS青霉素Tecnoloxías） 表皮 生长 因子 （（（20 ng ml-1 ； Sistemas de I+D） 成 纤维 细胞 生长 2 （fgf2 ； 20 ng ml- 1；Sistemas de I+D）直至穬㬀24 На 6-й день суспензии нейросферы были переведены на добавку, содержащую нейробаферы были переведены на добавку, содержащую нейробаферы (Life Technologies) В-27 без витамина А (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies), пенициллин- нейтрализованный стрептомицин, (1:1000 Life Technologies), добавлением эпидермального фактора роста (EGF; 20 нг мл-1; I+D Systems) e фактора роста фибробластов 2 (FGF2; 20 нг мл-1) 1; O día 6, as suspensións de neuroesferas cambiáronse a un suplemento que contiña neurobasal-A (10888, Life Technologies), suplemento B-27 sen vitamina A (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies), estreptomicina neutralizada con penicilina (1:100, Life Technologies) suplementado con factor de crecemento epidérmico (EGF; 20 ng ml-1; R&D Systems) e factor de crecemento de fibroblastos 2 (FGF2; 20 ng ml-1)1; Sistemas de I+D) ata 24 anos. Sistemas de I+D) ata o día 24.Dos días 25 ao 42, engadíronse ao medio de cultivo factor neurotrófico derivado do cerebro (BDNF; 20 ng ml-1, Peprotech) e factor neurotrófico 3 (NT3; 20 ng ml-1, Peprotech) cada dous días. O medio cámbiase unha vez.A partir do día 43, o hCO mantívose en medio neurobasal-A sen suplementos (NM; 1088022, Thermo Fisher) cun cambio de medio cada 4-6 días. Para obter hCO a partir de células hiPS cultivadas en condicións sen alimentador, as células hiPS incubáronse con Accutase (AT-104, Innovate Cell Technologies) a 37 °C durante 7 minutos, disociáronse en células individuais e plantáronse en placas AggreWell 800 (34815, STEMCELL Technologies) a unha densidade de 3 × 106 células individuais por pozo en medio Essential 8 suplementado co inhibidor ROCK Y-27632 (10 μM; S1049, Selleckchem). Despois de 24 horas, os medios dos pozos foron pipeteados arriba e abaixo a medios que contiñan medio Essential 6 (A1516401, Life Technologies) suplementado con dorsomorfina (2,5 μM; P5499, Sigma-Aldrich) e SB-431542 (10 μM; 1614). , Tocrida). Dos días 2 a 6, o medio Essential 6 foi substituído diariamente por dorsomorfina e suplemento SB-431542. A partir do sexto día, as suspensións de neuroesferas foron transferidas ao medio neurobasal e mantidas como se describiu anteriormente.
Todos os procedementos con animais realizáronse de acordo coas directrices de coidado de animais aprobadas polo Comité Administrativo de Coidado de Animais de Laboratorio da Universidade de Stanford (APLAC). Adquiríronse ou aloxáronse ratas RNU eutímicas preñadas (rnu/+) (Charles River Laboratories). Os animais mantivéronse nun ciclo de luz-escuridade de 12 horas con alimento e auga ad libitum. As crías de rata espidas (FOXN1–/–) de tres a sete días identificáronse polo crecemento de bigotes inmaduros antes do sacrificio. As crías (machos e femias) foron anestesiadas con isoflurano ao 2-3 % e colocadas nun marco estereotáxico. Realizouse unha trepanación do cranio cun diámetro de aproximadamente 2-3 mm por riba de S1, mantendo a integridade da duramadre. A continuación, utilizouse unha agulla de 30 G (aproximadamente 0,3 mm) xusto fóra da craniotomía para perforar a duramadre. Despois, aplique HCO3 a un parafilm fino de 3×3 cm e retire o exceso de medio. Usando unha xiringa Hamilton conectada a unha agulla de 23 G e 45°, inxecte suavemente hCO3 polo extremo máis distal da agulla. A continuación, instale a xiringa na bomba de xiringa conectada ao dispositivo estereotáxico. Coloque a punta da agulla sobre un orificio de punción de 0,3 mm de ancho realizado previamente na duramadre (z = 0 mm) e estreite a xiringa de 1 a 2 mm (z = aproximadamente –1,5 mm) ata que a agulla quede entre a duramadre A, fórmese un selo denso. Despois, levante a xiringa ata o centro da superficie cortical en z = -0,5 mm e inxecte hCO3 a unha velocidade de 1-2 µl por minuto. Despois de completar a inxección de hCO3, retréase a agulla a unha velocidade de 0,2-0,5 mm por minuto, sútase a pel e o cachorro colócase inmediatamente sobre unha almofada térmica ata a súa completa recuperación. Algúns animais foron transplantados bilateralmente.
Todos os procedementos con animais realizáronse de acordo coas directrices de coidado de animais aprobadas pola Universidade de Stanford (APLAC). As ratas (máis de 60 días despois do transplante) foron inducidas con anestesia con isoflurano ao 5 % e anestesiadas con isoflurano ao 1-3 % durante a obtención de imaxes. Para a visualización, utilizouse un escáner de pozos horizontal con protección activa de 7 Tesla Bruker (Bruker Corp.) cun accionamento de gradiente de International Electric Company (IECO), un inserto de gradiente blindado cun diámetro interno de 120 mm (600 mT/m, 1000 T/m/s) con AVANCE. III, capacidades de RF multibobina de oito canles e multinúcleo, e a plataforma Paravision 6.0.1 que o acompaña. A gravación realizouse usando unha bobina de RF volumétrica desacoplada activamente cun diámetro interno de 86 mm e unha bobina de RF crioarrefriada de catro canles só para recepción. Turbo-RARE axial 2D (tempo de repetición = 2500 ms, tempo de eco = 33 ms, 2 medias) con 16 capturas de corte, grosor de corte de 0,6 a 0,8 mm, que contén 256 × 256 mostras. Os sinais recibíronse usando unha bobina de RF volumétrica de transceptor en cuadratura cun diámetro interno de 2 cm (Rapid MR International, LLC). Finalmente, use as funcións de estimación de superficie integradas de Imaris (BitPlane) para a renderización 3D e a análise de volume. Un transplante exitoso definiuse como aquel no que se formaron áreas de sinal de resonancia magnética ponderado en T2 continuo no hemisferio transplantado. O rexeitamento do enxerto definiuse como un enxerto que non produciu áreas de sinal de resonancia magnética ponderado en T2 continuo no hemisferio transplantado. A t-hCO subcortical excluíuse da análise posterior.
Para expresar de forma estable as GCaMP6 en hCO para a obtención de imaxes de calcio de dous fotóns, infectáronse células hiPS con pLV[Exp]-EF1a::GcaMP6s-WPRE-Puro, seguido da selección de antibióticos. En resumo, as células disociáronse con EDTA e suspendéronse en 1 ml de medio Essential 8 a unha densidade de aproximadamente 300.000 células en presenza de polibreno (5 μg/ml) e 15 μl de virus. Despois, as células incubáronse en suspensión durante 60 minutos e sementáronse a unha densidade de 50.000 células por pozo. Despois da confluencia, as células tratáronse con 5-10 μg/ml-1 de puromicina durante 5-10 días ou ata que apareceron colonias estables. A infección aguda por hCO realizouse como se describiu previamente5 con algunhas modificacións. En resumo, transferir o hCO dos días 30-45 a tubos de microcentrífuga Eppendorf de 1,5 ml que conteñan 100 µl de medio nervioso. Despois, retíranse aproximadamente 90 µl do medio, engádense ao tubo de 3 a 6 µl de lentivirus de alto título (de 0,5 x 108 a 1,2 x 109) e o hCO transfírese á incubadora durante 30 minutos. A continuación, engádense de 90 a 100 µl de medio a cada tubo e devólvense os tubos á incubadora durante a noite. Ao día seguinte, transfírese o hCO ao medio nervioso fresco en placas de baixa fixación. Despois de 7 días, o hCO transferiuse a placas con fondo de vidro de 24 pozos para a súa visualización e avaliación da calidade da infección. Os pLV[Exp]-SYN1::EYFP-WPRE e os pLV[Exp]-SYN1::hChR2-EYFP-WPRE xeráronse mediante VectorBuilder. Os lentivirus utilízanse na maioría dos experimentos porque están integrados no xenoma do hóspede, o que permite a expresión do xene informador en liñas celulares infectadas. Para o seguimento da rabia, o día 30-45 coinfectouse hCO con rabies-ΔG-eGFP e AAV-DJ-EF1a-CVS-G-WPRE-pGHpA (plásmido n.º 67528, Addgene), lavouse completamente durante 3 días e transplantouse a ratas en S1 e mantívose in vivo durante 7-14 días.
Para a inmunocitoquímica, os animais foron anestesiados e perfundidos transcardiacamente con PBS seguido de paraformaldehído ao 4 % (PFA en PBS; Electron Microscopy Sciences). Os cerebros fixáronse en PFA ao 4 % durante 2 horas ou durante a noite a 4 °C, crioconserváronse en sacarosa ao 30 % en PBS durante 48-72 horas e incluíronse en sacarosa ao 30 %: OCT (Tissue-Tek OCT Compound 4583, Sakura Finetek) 1:1 e realizáronse seccións coronais a 30 µm usando un criostato (Leica). Para a inmunohistoquímica de seccións grosas, os animais foron perfundidos con PBS e o cerebro foi diseccionado e seccionado coronalmente a 300–400 µm usando un vibrátomo (Leica) e as seccións fixáronse con PFA ao 4 % durante 30 minutos. A continuación, as crioseccións ou as seccións grosas laváronse con PBS, bloqueáronse durante 1 hora a temperatura ambiente (10 % de soro de burro normal (NDS) e 0,3 % de Triton X-100 diluído en PBS) e bloqueáronse cunha solución de bloqueo a 4 °C. – Incubación As crioseccións incubáronse durante a noite e as seccións grosas durante 5 días. Os anticorpos primarios empregados foron: anti-NeuN (rato, 1:500; ab104224, abcam), anti-CTIP2 (rata, 1:300; ab18465, abcam), anti-GFAP (coello, 1:1.000; Z0334, Dako), anti-GFP (polo, 1:1.000; GTX13970, GeneTex), anti-HNA (rato, 1:200; ab191181, abcam), anti-NeuN (coello, 1:500; ABN78, Millipore), anti-PDGFRA (coello, 1:200; sc-338, Santa Cruz), anti-PPP1R17 (coello, 1:200; HPA047819, Atlas Antibodies), anti-RECA-1 (rato, 1:50;). ab9774, abcam), anti-SCG2 (coello, 1:100; 20357-1-AP, Proteintech), anti-SOX9 (cabra, 1:500; AF3075, R&D Systems), Netrina G1a (cabra, 1:100; AF1166, R&D Systems), anti-STEM121 (rato, 1:200; Y40410, Takara Bio), anti-SATB2 (rato, 1:50; ab51502, abcam), anti-GAD65/67 (coello, 1:400; ABN904, Millipore) e anti-IBA1 (cabra, 1:100; ab5076, abcam). Os anticorpos primarios empregados foron: anti-NeuN (rato, 1:500; ab104224, abcam), anti-CTIP2 (rata, 1:300; ab18465, abcam), anti-GFAP (coello, 1:1.000; Z0334, Dako), anti-GFP (polo, 1:1.000; GTX13970, GeneTex), anti-HNA (rato, 1:200; ab191181, abcam), anti-NeuN (coello, 1:500; ABN78, Millipore), anti-PDGFRA (coello, 1:200; sc-338, Santa Cruz), anti-PPP1R17 (coello, 1:200; HPA047819, Atlas Antibodies), anti-RECA-1 (rato, 1:50;). ab9774, abcam), anti-SCG2 (coello, 1:100; 20357-1-AP, Proteintech), anti-SOX9 (cabra, 1:500; AF3075, R&D Systems), Netrina G1a (cabra, 1:100; AF1166, R&D Systems), anti-STEM121 (rato, 1:200; Y40410, Takara Bio), anti-SATB2 (rato, 1:50; ab51502, abcam), anti-GAD65/67 (coello, 1:400; ABN904, Millipore) e anti-IBA1 (cabra, 1:100; ab5076, abcam). Использовались следующие первичные антитела: анти-NeuN (мышиные, 1:500; ab104224, abcam), анти-CTIP:с12ные (Использовались) ab18465, abcam), анти-GFAP (кроличьи, 1:1000; Z0334, Dako), анти- -GFP (курица, 1:1000; GTX13970, GeneTex), анти-HNA (,1,1:1:1000) abcam), анти-NeuN (кролик, 1:500; ABN78, Millipore), анти-PDGFRA (кролик, 1:200; sc-338, Санта-Круз), анти-PPP1R17 (кролик, 1:200; HPA047819, Atlas Antibodies), анти-RECA-1 (мыш40, ab97:5ь, ab97:5ь, ab97:5ь; анти-SCG2 (кролик , 1:100; 20357-1-AP, Proteintech), анти-SOX9 (козий, 1:500; AF3075, R&D Systems), нетрин G1a (коз110й, 6, AF: 1160 Systems), анти-STEM121 (мышиный, 1:200; Y40410, Takara Bio), анти-SATB2 (мышь, 1:50; ab51502, abcam), анти-GAD65/67 (кролик, 1:400; ABN904, Millipore) e анти-IBA1 (коза, 1 :100; абббка, абб5076, мабка). Os anticorpos primarios empregados foron: anti-NeuN (rato, 1:500; ab104224, abcam), anti-CTIP2 (rata, 1:300; ab18465, abcam), anti-GFAP (coello, 1:1000; Z0334, Dako), anti-GFP (polo, 1:1000; GTX13970, GeneTex), anti-HNA (rato, 1:200; ab191181, abcam), anti-NeuN (coello, 1:500; ABN78, Millipore), anti-PDGFRA (coello, 1:200; sc-338, Santa Cruz), anti-PPP1R17 (coello, 1:200; HPA047819, Atlas Antibodies), anti-RECA-1 (rato, 1:50;). ab9774, abcam), anti-SCG2 (coello, 1:100; 20357-1-AP, Proteintech), anti-SOX9 (cabra, 1:500; AF3075, R&D Systems), netrina G1a (cabra, 1:100; AF1166, R&D Systems), anti-STEM121 (rato, 1:200; Y40410, Takara Bio), anti-SATB2 (rato, 1:50; ab51502, abcam), anti-GAD65/67 (coello, 1:400; ABN904, Millipore) e anti-IBA1 (cabra, 1:100; ab5076, abkam).使用的一抗是：抗NeuN（小鼠，1:500；ab104224，abcam）抗CTIP2（大鼠，1:3 00；ab18465，abcam），抗GFAP（兔，1:1,000；Z0334，Dako），抗-GF P（鸡，1:1,000；GTX13970，GeneTex），抗HNA（小鼠，1:200；ab1911 81，abcam），抗NeuN（兔，1:500；ABN78，Millipore），抗PDGFRA（兔， 1:200；sc-338，Santa Cruz），抗PPP1R17（兔，1:200；HPA047819，Atlas抗体），抗RECA-1（小鼠，1:50；ab9774，abcam），抗SCG2（兔）, 1:100；20357-1-AP，Proteintech），抗SOX9（山羊，1:500；AF3075，R&D Systems），Netrin G1a（山羊（山羊，1:101D；；AF3075，R&D Systems） Systems），抗STEM121（小鼠, 1:200;使用的一抗是：抗NeuN（小鼠，1:500；ab104224，abcam）抗CTIP2（大鼠＠1 :300；ab18465，abcam），抗GFAP（兔，1:1,000；Z0334，Dako），抗-GFP（鸡，1:1,000；GTX13970，GeneTex），抗HNA（小鼠，1:200；ab 191181，abcam），抗NeuN（兔，1:500；ABN78，Millipore％弔，抗1: 200；sc-338，Santa Cruz），抗PPP1R17（兔，1:200；HPA047819，Atlas抗体），抗RECA-1（小鼠，1:50；ab9774，abcam），抗SCG2 100；20357-1-AP，Proteintech），抗SOX9（山羊，1:500；AF3075，R&D Systems），Netrin G1a（山羊（山羊；1:1006；AF306；R&D Systems） Sistemas）頏1:20, ;Y40410, Takara Bio), anti-SATB2 (rato, 1:50; ab51502, abcam), anti-GAD65/67 (coello, 1:400; ABN904, Millipore) e anti-IBA1 (cabra, 1:100; ab5076, abcam).Os anticorpos primarios empregados foron: anti-NeuN (rato, 1:500; ab104224, abcam), anti-CTIP2 (rata, 1:300; ab18465, abcam), anti-GFAP (coello, 1:1000; Z0334, Dako). , anti-GFP (polo, 1:1000; GTX13970, GeneTex), anti-HNA (rato, 1:200; ab191181, abcam), anti-NeuN (coello, 1:500; ABN78, Millipore), anti-PDGFRA (coello, 1:200; sc-338, Santa Cruz), anti-PPP1R17 (coello, 1:200; HPA047819, anticorpo Atlas), anti-RECA-1 (rato, 1:50; ab9774, abcam), anti-SCG2 (coello), 1:100;20357-1-AP, Proteintech), анти-SOX9 (коза, 1:500; AF3075, R&D Systems), Нетрин G1a (коза, 1:100; AF1166, R&D Systems), анти (коза, 1:500; AF3075, R&D Systems), анти (0:012ь, мы12ь) Y40410, Takara Bio), анти-SATB2 (мышь, 1:50; ab51502, abcam), анти-GAD65/67 (кролик, 1:400; ABN904, Millipore) и анти-IBA1, ка7:10, кролик, 1:400 абкам). 20357-1-AP, Proteintech), anti-SOX9 (cabra, 1:500; AF3075, R&D Systems), Netrina G1a (cabra, 1:100; AF1166, R&D Systems), anti-STEM121 (rato, 1:200; Y40410, Takara Bio), anti-SATB2 (rato, 1:50; ab51502, abcam), anti-GAD65/67 (coello, 1:400; ABN904, Millipore) e anti-IBA1 (cabra, 1:100; ab5076, abkam).As seccións laváronse con PBS e incubáronse cun anticorpo secundario durante 1 hora a temperatura ambiente (seccións conxeladas) ou durante a noite a 4 °C (seccións grosas). Empregouse o anticorpo secundario Alexa Fluor (Life Technologies) diluído 1:1000 en solución de bloqueo. Despois de lavar con PBS, os núcleos visualizáronse cun Hoechst 33258 (Life Technologies). Finalmente, os portaobxectos colocáronse nun microscopio con cubreobxectos (Fisher Scientific) usando un Aquamount (Polysciences) e analizáronse nun microscopio fluorescente Keyence (analizador BZ-X) ou nun microscopio confocal Leica TCS SP8 (Las-X) na imaxe. As imaxes procesáronse usando o programa ImageJ (Fiji). Para cuantificar a proporción de neuronas humanas no t-hCO e no córtex da rata, tomáronse imaxes rectangulares de 387,5 μm de ancho no centro do t-hCO, no bordo do córtex da rata ou preto del. As marxes do enxerto determináronse avaliando os cambios na transparencia dos tecidos, os núcleos HNA+ e/ou a presenza de autofluorescencia dos tecidos. En cada imaxe, o número total de células NeuN+ e HNA+ dividiuse polo número total de células NeuN+ na mesma área. Para garantir que só se conten as células con núcleos no plano da imaxe, só se inclúen no cálculo as células que tamén son Hoechst+. Calculouse a media de dúas imaxes separadas por polo menos 1 mm para reducir o erro estatístico.
Unha semana antes da recollida da mostra, coloque os animais transplantados con hCO3 (aproximadamente 8 meses de diferenciación) nunha habitación escura cos bigotes recortados para minimizar a estimulación sensorial. O illamento dos núcleos realizouse como se describiu anteriormente, con algunhas modificacións. En resumo, o t-hCO3 e o hCO3 foron destruídos mediante lise celular mecánica con deterxente e un moedor de tecido de vidro de 2 ml (D8938, Sigma-Aldrich/KIMBLE). Os núcleos brutos foron filtrados cun filtro de 40 µm e centrifugados a 320 g durante 10 minutos a 4 °C antes de realizar un gradiente de densidade de sacarosa. Despois do paso de centrifugación (320 g durante 20 min a 4 °C), as mostras foron resuspendidas en BSA/PBS ao 0,04 % coa adición de 0,2 unidades de inhibidor de RNase por µl-1 (40 u µl-1, AM2682, Ambion) e pasadas a través dun filtro de fluxo de 40 µm. Os núcleos disociados foron resuspendidos en PBS que contiña 0,02 % de BSA e cargados nun chip Chromium Single Cell 3′ (recuperación estimada de 8.000 células por carril). As bibliotecas de secuenciación de snRNA preparáronse co kit de esferas de xel e biblioteca de 3′ GEM de células individuais de Chromium v3 (10x Genomics). As bibliotecas de secuenciación de snRNA preparáronse co kit de esferas de xel e biblioteca de 3′ GEM de células individuais de Chromium v3 (10x Genomics). Библиотеки snRNA-seq были приготовлены с помощью Chromium Single cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics). As bibliotecas de secuenciación de snRNA preparáronse empregando o kit de microscopía GEM de 3′ de Chromium Single cell 3′, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics). snRNA-seq 文库是使用Chromium Single Cell 3′ GEM、Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics) 制备的。 snRNA-seq 文库是使用Chromium Single Cell 3′ GEM、Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics) 制备的。 Библиотеку snRNA-seq готовили с использованием Chromium Single Cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics). A biblioteca de secuenciación de snRNA preparouse empregando o kit de microscopía e perlas de xel Chromium Single Cell 3′ GEM, Library & Gel Bead v3 (10x Genomics).Admera Health agrupou e secuenciau bibliotecas de diferentes mostras en NovaSeq S4 (Illumina).
Os niveis de expresión xénica para cada suposto código de barras nuclear cuantificáronse empregando o paquete de software de análise 10x Genomics CellRanger (versión 6.1.2). Especificamente, as lecturas comparáronse cunha combinación de xenomas de referencia humanos (GRCh38, Ensemble, versión 98) e de rata (Rnor_6.0, Ensemble, versión 100) creados co comando mkref e empregando count co comando –include-introns=TRUE para a cuantificación, incluíndo lecturas mapeadas a rexións de intróns. Para as mostras de t-hCO, os núcleos humanos identificáronse baseándose no requisito conservador de que polo menos o 95 % de todas as lecturas mapeadas coincidan co xenoma humano. Todas as análises posteriores realizáronse nunha matriz de códigos de barras filtrada saída de CellRanger empregando o paquete R (versión 4.1.2) Seurat (versión 4.1.1)32.
Para garantir que só se inclúan na análise posterior os núcleos de alta calidade, implementouse un proceso de filtrado iterativo para cada mostra. En primeiro lugar, identifícanse e elimínanse os núcleos de baixa calidade con menos de 1000 xenes únicos atopados e máis do 20 % do total de mitocondrias. Posteriormente, a matriz numérica de xenes brutos normalizouse mediante regresión binomial negativa regularizada usando a función sctransform(vst.flavor="v2", que tamén identificou os 3000 xenes máis variables usando parámetros predeterminados. A redución de dimensións realizouse nos xenes variables superiores usando a Análise de Compoñentes Principais (PCA) con parámetros predeterminados usando unha dimensión de conxunto de datos de 30 (dims = 30 elixiuse en función da inspección visual dos sitios do xeonllo e utilizouse para todas as mostras e análises de conxunto). Despois realizamos varias roldas de agrupamento iterativo (resolución = 1) para clasificar os xenes en función do reconto de xenes anormalmente baixo (mediana por debaixo do percentil 10), o reconto de xenes mitocondriais anormalmente alto (mediana por riba do percentil 95) para identificar e eliminar células putativas de baixa calidade. Clústeres e/ou unha alta proporción de xemelgos sospeitosos identificados usando o paquete DoubletFinder33 (puntuación media de DoubletFinder por riba do percentil 95). As mostras de t-hCO (n=3) e as mostras de hCO (n=3) integráronse por separado usando a función IntegrateData cos parámetros anteriores. Despois realizouse outra rolda de filtrado cualitativo do conxunto de datos integrado como se describiu anteriormente.
Despois de eliminar os núcleos de baixa calidade, o conxunto de datos integrado agrupouse (resolución = 0,5) e incorporouse para fins de visualización de UMAP34. Os xenes marcadores para cada clúster determináronse usando a función FindMarkers con parámetros predeterminados calculados a partir de datos de expresión xénica normalizados. Identificamos e clasificamos as principais clases celulares combinando conxuntos de datos de referencia corticais fetais e adultos coa expresión de xenes marcadores 19,20,21,35 e anotación. En particular, os precursores circulantes identificáronse pola expresión de MKI67 e TOP2A. Os clústeres proxenitores definíronse pola ausencia de transcritos mitóticos, alta superposición con clústeres proxenitores gliais multipotentes descritos no córtex fetal en metafase tardía e expresión de EGFR e OLIG1. Usamos o termo astrocito para abarcar varios estados de diferenciación de astrocitos, desde a glía radial tardía ata a maduración dos astrocitos. Os clústeres de astrocitos expresan altos niveis de SLC1A3 e AQP4 e demostrouse que se mapean con subtipos de glía radial fetal e/ou astrocitos adultos. As OPC expresan PDGFRA e SOX10, mentres que os oligodendrocitos expresan marcadores de mielinización (MOG e MYRF). As neuronas glutamatérxicas identificáronse pola presenza de transcritos neuronais (SYT1 e SNAP25), a ausencia de marcadores GABAérxicos (GAD2) e a expresión de NEUROD6, SLC17A7, BCL11B ou SATB2. As neuronas GluN dividíronse aínda máis en subclases superiores (expresión de SATB2 e perda de BCL11B) e profundas (expresión de BCL11B). As neuronas putativas da subplaca (SP) expresan marcadores SP18 coñecidos como ST18 e SORCS1, ademais de marcadores GluN profundos. As células de tipo plexo coroide identificáronse pola expresión de TTR, e as células de tipo menínxea expresaron xenes asociados a fibroblastos e mapearon células piais/vasculares do conxunto de datos de referencia.
A análise diferencial da expresión xénica entre as subclases de t-hCO e hCO realizouse empregando un método pseudo-batch recentemente desenvolvido, reproducido en mostras implementadas co paquete Libra R (versión 1.0.0). Especificamente, realizáronse probas de verosimilitude logarítmica de edgeR (versión 3.36.0, paquete R) para grupos sumando o número de xenes nas células para unha clase celular determinada para cada replicación da mostra. Para a visualización do mapa de calor, os valores normalizados por millón (CPM) calcúlanse empregando edgeR (función cpm()) e escalámolos (para conseguir unha media = 0, desviación estándar = 1). Realizouse unha análise de enriquecemento de ontoloxía xénica (GO) de xenes GluN de t-hCO significativamente regulados ao alza (valor P corrixido de Benjamini-Hochberg inferior a 0,05 expresado en polo menos o 10 % das células GluN de t-hCO e un aumento de cambio de polo menos 2 veces). Realizado empregando ToppGene Suite (https://toppgene.cchmc.org/)37. Usamos a aplicación ToppFun con parámetros predeterminados e informamos de valores P corrixidos por Benjamini-Hochberg calculados a partir de probas hipergeométricas anotadas por GO.
Para combinar os nosos clústeres de secuenciación de ARN pequeno (snRNA-seq) con clústeres celulares anotados de estudos de referencia de secuenciación de ARN unicelular primaria ou secuenciación de ARN pequeno (snRNA-seq) adulta19,20,21,22, aplicamos unha abordaxe de integración de conxuntos de datos emparellados. Empregamos o fluxo de traballo de normalización SCTransform (v2) en Seurat para integrar e comparar as superposicións de clústeres entre conxuntos de datos (usando os mesmos parámetros que os anteriores). Os conxuntos de datos individuais agrupáronse aleatoriamente en subconxuntos de ata 500 células ou núcleos por clúster orixinal para obter eficiencia computacional. Usando unha abordaxe similar á descrita anteriormente, a superposición de clústeres definiuse como a proporción de células ou núcleos en cada clúster agrupado que se superpoñían coa etiqueta do clúster de referencia. Para clasificar aínda máis as GluN, empregamos o fluxo de traballo TransferData de Seurat para datos de subconxuntos de GluN para asignar etiquetas de conxuntos de datos de referencia ás nosas células GluN.
Para avaliar o estado de maduración do transcriptoma global das mostras de t-hCO e hCO, comparamos as nosas mostras pseudo-bulk con BrainSpan/psychENCODE23, que consiste nunha gran secuencia de ARN que abrangue o desenvolvemento do cerebro humano. Realizamos PCA nunha matriz de expresión xénica normalizada por patrón combinada de mostras corticais 10 semanas despois da concepción e posteriormente, en 5567 xenes (xunto cos nosos datos) que foran identificados previamente como activos en mostras corticais de BrainSpan (definidas como superiores ao 50 % na varianza do desenvolvemento explicada pola idade mediante un modelo cúbico)38. Ademais, derivamos xenes asociados coas principais sinaturas do transcriptoma do neurodesenvolvemento mediante a factorización de matrices non negativas, como se describiu anteriormente. Os pesos da mostra calculados mediante o procedemento de factorización de matrices non negativas represéntanse nas figuras 5b con datos ampliados para cada unha das cinco sinaturas descritas por Zhu et al.38. De novo, os marcadores transcricionais dependentes da actividade deriváronse de estudos publicados previamente. En particular, ERG e LRG víronse significativamente regulados á alza nas neuronas glutamatérxicas identificadas pola recollida de snRNA-seq do córtex visual do rato despois da estimulación visual da Táboa suplementaria 3 Hrvatin et al.16. Os LRG enriquecidos en humanos obtivéronse a partir de cultivos de cerebro fetal humano activados con KCl e recolléronse 6 horas despois da estimulación, e os xenes filtrados víronse significativamente regulados á alza en humanos pero non en roedores (Táboa suplementaria 4). A análise do enriquecemento do conxunto de xenes utilizando estes conxuntos de xenes realizouse mediante unha proba exacta de Fisher unidireccional.
Anestesiar as ratas con isoflurano, retirar os cerebros e colocar nunha solución fría (aproximadamente a 4 °C) osixenada (95 % de O2 e 5 % de CO2) para as seccións que conteñan: 234 mM de sacarosa, 11 mM de glicosa, 26 mM de NaHCO3, 2,5 mM de KCl, 1,25 mM de NaH2PO4, 10 mM de MgSO4 e 0,5 mM de CaCl2 (aproximadamente 310 mOsm). As seccións coronais de cerebro de rata (300–400 µm) que conteñan t-hCO realizáronse cun vibratomo Leica VT1200 como se describiu anteriormente39. As seccións foron transferidas a unha cámara de seccionamento con oxixenación continua a temperatura ambiente que contiña aCSF preparado a partir de: 10 mM de glicosa, 26 mM de NaHCO3, 2,5 mM de KCl, 1,25 mM de NaHPO4, 1 mM de MgSO4, 2 mM de CaCl2 e 126 mM de NaCl (298 mOsm) polo menos 45 minutos antes do rexistro. As seccións rexistráronse nunha cámara mergullada onde se perfundiron continuamente con aCSF (vial de 95 % de O2 e 5 % de CO2). Todos os datos rexistráronse a temperatura ambiente. As neuronas t-hCO3 foron terminadas cunha pipeta de vidro de borosilicato chea cunha solución que contiña 127 mM de gluconato de potasio, 8 mM de NaCl, 4 mM de ATP de magnesio, 0,3 mM de GTP de sodio, 10 mM de HEPES e 0,6 mM de EGTA, pH 7,2, solución interna axustada con KOH (290 mOsm). Para a recuperación, engadiuse biocitina (0,2%) á solución de rexistro.
Os datos adquiríronse cun amplificador MultiClamp 700B (Molecular Devices) e un dixitalizador Digidata 1550B (Molecular Devices), filtráronse con paso baixo a 2 kHz, dixitalizáronse a 20 kHz e analizáronse con Clampfit (Molecular Devices), Origin (OriginPro). 2021b, OriginLab) e funcións personalizadas de MATLAB (Mathworks). O potencial de unión calculouse con JPCalc e as entradas axustáronse ao valor calculado de -14 mV. A operación IV consiste nunha serie de pasos de corrente en pasos de 10-25 pA, de -250 a 750 pA.
O tálamo, a substancia branca e os aferentes S1 foron estimulados electricamente en cortes talamocorticais durante o rexistro mediante patch-clamp das neuronas hCO3, como se describiu anteriormente. En resumo, o cerebro colocouse nunha mesa de impresión 3D inclinada nun ángulo de 10° e a parte frontal do cerebro cortouse nun ángulo de 35°. Despois, o cerebro pegouse á superficie cortada e seccionouse, preservando os axóns sobresaíntes talamocorticais. Montáronse eléctrodos bipolares de tungsteno (0,5 MΩ) nun segundo micromanipulador e colocáronse estratexicamente para estimular catro rexións por célula (cápsula interna, substancia branca, S1 e hCO3). Rexistra as respostas sinápticas despois dunha estimulación fásica de 300 µA a 0,03–0,1 Hz.
As neuronas hCO que expresan hChR2 activáronse a 480 nm e aplicáronse pulsos de luz xerados por un LED (Prizmatix) a través dun obxectivo ×40 (0,9 NA; Olympus) para rexistrar a expresión de hChR2 preto das células. O diámetro do campo iluminado é de aproximadamente 0,5 mm e a potencia total é de 10-20 mW. O ancho do pulso axustouse a 10 ms, o que corresponde ao pulso administrado durante o experimento de aprendizaxe conductual. Utilizáronse varias frecuencias de estimulación, de 1 a 20 Hz, pero só o primeiro pulso da serie se utilizou para a cuantificación. Os intervalos entre trens adoitan ser superiores a 30 s para minimizar o efecto sobre as vías inhibitorias ou facilitadoras sinápticas. Para comprobar se a resposta de hChR2 era monosináptica, aplicamos TTX (1 μM) ao baño ata que a reacción de EPSC desapareceu e, a continuación, aplicamos 4-aminopiridina (4-AP; 100 μM). Normalmente, devólvese unha resposta nuns poucos minutos, cun atraso lixeiramente maior entre o acendido do LED e a xeración de EPSC. Empregouse NBQX (10 μM) para comprobar se a resposta está impulsada polos receptores AMPA.
Creáronse seccións nítidas de hCO3 como se describiu anteriormente. En resumo, as seccións de hCO3 incluíronse en ágarosa ao 4 % e transferíronse a células que contiñan 126 mM de NaCl, 2,5 mM de KCl, 1,25 mM de NaH2PO4, 1 mM de MgSO4, 2 mM de CaCl2, 26 mM de NaHCO3 e 10 mM de d-(+)-glicosa. As seccións cortáronse a 200–300 µm a temperatura ambiente cun vibrador Leica VT1200 e almacenáronse en ASF a temperatura ambiente. Despois, realizouse un rexistro patch-camp de células enteiras en seccións de hCO3 baixo un microscopio SliceScope directo (Scientifica). As seccións perfundíronse con aCSF (95 % de O2 e 5 % de CO2) e os sinais celulares rexistráronse a temperatura ambiente. As neuronas de hCO3 aplicáronse usando unha pipeta de vidro de borosilicato chea cunha solución que contiña 127 mM de gluconato de potasio, 8 mM de NaCl, 4 mM de ATP de magnesio, 0,3 mM de GTP de sodio, 10 mM de HEPES e 0,6 mM de EGTA, pH interno 7,2, axustado con KOH (osmolaridade 290). Para fins de recuperación, engádese 0,2 % de biocitina á solución interna.
Os datos foron adquiridos por Clampex (Clampex 11.1, Molecular Devices) empregando un amplificador MultiClamp 700B (Molecular Devices) e un dixitalizador Digidata 1550B (Molecular Devices), filtrados de paso baixo a 2 kHz, dixitalizados a 20 kHz e analizados mediante Clampfit (versión 10.6) para a análise, dispositivos moleculares) e funcións personalizadas de MATLAB (MATLAB 2019b, Mathworks). O potencial de unión calculouse mediante JPCalc e as entradas axustáronse ao potencial de unión calculado de -14 mV. A operación IV consiste nunha serie de pasos de corrente en pasos de 5-10 pA de -50 a 250 pA.
Para a reconstrución morfolóxica das neuronas pinchadas, engadiuse biocitina (Sigma-Aldrich) ao 0,2 % á solución interna. As células cebáronse durante polo menos 15 minutos despois do pirateo. A continuación, a pipeta introdúcese lentamente durante 1–2 minutos ata que a membrana rexistrada estea completamente selada. Seguindo o procedemento de fisioloxía da sección, as seccións fixáronse durante a noite a 4 °C en PFA ao 4 %, laváronse con PBS X3 e diluíronse 1:1000 con DyLight 549 ou DyLight 405 (Vector Labs) conxugados con estreptavidina. As células cheas de biocitina (2 %; Sigma-Aldrich) marcáronse durante o rexistro con patch clamp a temperatura ambiente durante 2 horas. Despois, as seccións montáronse en portaobxectos de microscopía usando un Aquamount (Thermo Scientific) e visualizáronse ao día seguinte nun microscopio confocal Leica TCS SP8 usando un obxectivo de inmersión en aceite cunha apertura numérica ×40 1,3, aumento ×0,9–1,0, xy. A taxa de mostraxe é de aproximadamente 7 píxeles por micra. Obtivéronse en serie apilamentos Z a intervalos de 1 µm e realizáronse mosaicos de apilamentos Z e unión automática baseada en Leica para cubrir toda a árbore dendrítica de cada neurona. Despois, rastrexáronse as neuronas semimanualmente usando a interface neuTube 40 e xeráronse ficheiros SWC. Os ficheiros cargáronse despois no complemento SimpleNeuriteTracer41 Fiji (ImageJ, versión 2.1.0; NIH).
O tecido cortical humano obtívose co consentimento informado segundo un protocolo aprobado polo Consello de Revisión Institucional da Universidade de Stanford. Obtivéronse dúas mostras de tecido humano posparto (de 3 e 18 anos de idade) mediante resección do córtex frontal (xiro frontal medio) como parte dunha cirurxía para a epilepsia refractaria. Despois da resección, recóllese tecido en NMDG-aCSF xeado que contén: 92 mM de NMDG, 2,5 mM de KCl, 1,25 mM de NaH2PO4, 30 mM de NaHCO3, 20 mM de HEPES, 25 mM de glicosa, 2 mM de tiourea, 5 mM de ascorbato de sodio, 3 mM de piruvato de sodio, 0,5 mM de CaCl24H2O e 10 mM de MgSO47H2O. Titularse a pH 7,3-7,4 con ácido clorhídrico concentrado. Os tecidos leváronse ao laboratorio en 30 minutos e tomáronse seccións coronais segundo o procedemento descrito anteriormente.
Todos os procedementos nos animais realizáronse de acordo coas directrices de coidado animal aprobadas pola Universidade de Stanford (APLAC). As ratas (máis de 140 días despois do transplante) foron inducidas con anestesia con isoflurano ao 5 % e anestesiadas con isoflurano ao 1-3 % intraoperatoriamente. Os animais colocáronse nun marco estereotáxico (Kopf) e inxectóuselles buprenorfina de liberación sostida (SR) por vía subcutánea. O cranio expúxose, límpase e insértense de 3 a 5 parafusos óseos. Para dirixir o t-hCO3, xeramos coordenadas estereotáxicas a partir de imaxes de resonancia magnética. Perforouse un orificio no lugar de interese e as fibras (400 µm de diámetro, NA 0,48, dóricas) baixaronse 100 µm por debaixo da superficie do hCO3 e fixáronse ao cranio con cemento dental curable por UV (Relyx).
Os rexistros fotométricos de fibra realizáronse como se describiu previamente42. Para rexistrar a actividade espontánea, as ratas colocáronse nunha gaiola limpa e un cable de conexión de fibra óptica de 400 µm de diámetro (Doric) conectado a un sistema de adquisición de datos fotométricos de fibra óptica conectouse ao cable de fibra óptica implantado. Durante o rexistro de 10 minutos da actividade motora, os animais tiñan liberdade para explorar a gaiola. Para rexistrar a actividade evocada, as ratas (máis de 140 días despois do transplante) anestesiáronse con isoflurano ao 5 % para a indución e isoflurano ao 1-3 % para o mantemento. Coloque o animal nun marco estereotáctico (Kopf) e os bigotes do lado oposto do t-hCO3 recórtanse a uns 2 cm e pásanse a través dunha malla conectada a un actuador piezoeléctrico (PI). Un cable de conexión de fibra óptica de 400 µm (Doric) conectouse á fibra implantada e ao sistema de adquisición de datos. Os bigotes do lado oposto do t-hCO3 foron desviados 50 veces (2 mm a 20 Hz, 2 s por presentación) en momentos aleatorios mediante un accionamento piezoeléctrico durante un período de gravación de 20 minutos. Use o paquete de soporte Arduino MATLAB para controlar o tempo de desviación con código MATLAB personalizado. Os eventos sincronízanse co software de adquisición de datos mediante pulsos de lóxica transistor-transistor (TTL).
As ratas (máis de 140 días despois do transplante) foron inducidas con anestesia con isoflurano ao 5 % e anestesiadas con isoflurano ao 1-3 % intraoperatoriamente. Os animais foron colocados nun marco estereotáxico (Kopf) e inxectáronselles buprenorfina SR e dexametasona por vía subcutánea. O cranio é exposto, límprase e insírense de 3 a 5 parafusos óseos. Para dirixir o t-hCO, xeramos coordenadas estereotáxicas a partir de imaxes de resonancia magnética. Realizouse unha craniotomía circular (aproximadamente 1 cm de diámetro) cunha broca de alta velocidade directamente sobre o hCO transplantado. Unha vez que o óso é o máis delgado posible, pero antes de perforar todo o óso, use pinzas para retirar o disco pélvico intacto restante para revelar o t-hCO subxacente. A craniotomía encheuse con solución salina estéril e un cubreobxectivos e un alfinete de cabeza especial foron fixados ao cranio con cemento dental curado por UV (Relyx).
As imaxes de dous fotóns realizáronse cun microscopio multifotónico Bruker cun obxectivo Nikon LWD (×16, 0,8 NA). As imaxes de GCaMP6 realizáronse a 920 nm cun aumento no plano z único de 1,4x e unha media de 8x de 7,5 fps. As ratas foron inducidas con anestesia con isoflurano ao 5 % e mantidas con isoflurano ao 1-3 %. As ratas colocáronse nunha fixación de cabeza feita a medida e colocáronse debaixo da lente. Obtivose unha gravación de fondo da actividade motora de 3 minutos. Ao longo de 20 minutos de gravación, administráronse aleatoriamente 50 inhalacións (cada presentación de 100 ms de duración) á almofada de bigotes oposta ao t-hCO3 usando un picospreador. Usa o paquete de soporte de Arduino MATLAB para controlar o tempo de ráfaga con código MATLAB personalizado. Sincroniza eventos co software de adquisición de datos (PrairieView 5.5) usando pulsos TTL. Para a análise, as imaxes corrixíronse para o movemento xy usando corrección afín no programa MoCo lanzado en Fidxi. Extracción de trazas fluorescentes de células individuais usando CNMF-E43. Extraeuse a fluorescencia para cada rexión de interese, converteuse a curvas dF/F e despois converteuse a puntuacións z.
As ratas (máis de 140 días despois do transplante) foron inducidas con anestesia con isoflurano ao 5 % e anestesiadas con isoflurano ao 1-3 % intraoperatoriamente. Os animais foron colocados nun marco estereotáxico (Kopf) e inxectáronselles buprenorfina SR e dexametasona por vía subcutánea. Os bigotes do lado oposto do t-hCO cortáronse a uns 2 cm e pasáronse a través dunha malla conectada a un actuador piezoeléctrico. O cranio expúxose e límpase. Fixouse un parafuso de aceiro inoxidable ao cranio. Para dirixir o t-hCO, xeramos coordenadas estereotáxicas a partir de imaxes de resonancia magnética. Realizar unha craniotomía circular (aproximadamente 1 cm de diámetro) cunha broca de alta velocidade xusto por riba do t-hCO. Unha vez que o óso sexa o máis delgado posible, pero antes de perforar todo o óso, usar pinzas para retirar o disco pélvico intacto restante para revelar o t-hCO subxacente. Rexistráronse células individuais empregando sondas de silicio de alta densidade de 32 ou 64 canles (Cambridge Neurotech) conectadas a terra a parafusos e preamplificadas con amplificadores RHD (Intan). Empregouse o manipulador para baixar os eléctrodos ata o sitio obxectivo a través da craniotomía, que está chea de solución salina estéril. A recollida de datos realizouse a unha frecuencia de 30 kHz empregando o sistema de adquisición de datos Open Ephys. O rexistro continuou só cando detectamos unha actividade espontánea rítmica altamente correlacionada en máis de 10 canles, o que suxire que os eléctrodos estaban situados no enxerto (baseado en datos de imaxes de calcio de dous fotóns). Obtivose un rexistro de fondo da actividade motora de 10 minutos. Os bigotes do lado oposto do t-hCO3 foron entón desviados 50 veces (2 mm a 20 Hz, 2 s por presentación) en momentos aleatorios mediante un accionamento piezoeléctrico durante un período de rexistro de 20 minutos. Usando o paquete de soporte de MATLAB para Arduino (MATLAB 2019b), controlase o tempo de desviación con código MATLAB personalizado. Usar pulsos TTL para sincronizar eventos con software de adquisición de datos.
Para os experimentos de marcado óptico, un cable de conexión óptico de 200 µm (Doric) conectado a un láser de 473 nm (Omicron) conectouse a unha fibra óptica de 200 µm colocada sobre a craniotomía. Inmediatamente antes disto, axuste a potencia do jumper a 20 mW. Use o manipulador para baixar os eléctrodos ata o sitio obxectivo a través da craniotomía, que está chea de solución salina estéril. Ao comezo da gravación, emitíronse dez pulsos de luz de 473 nm (frecuencia 2 Hz, duración do pulso 10 ms). As células fotosensibles definíronse como células que mostraron unha resposta de pico dentro dos 10 ms de luz no 70 % ou máis dos ensaios.