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自己組織化神経細胞小器官は、ヒトの発達と疾患をモデル化する有望なin vitroプラットフォームです。しかし、オルガノイドはin vivoに存在する接続性を欠いており、これが成熟を制限し、行動を制御する他の回路との統合を妨げます。本研究では、新生仔ヌードラットの体性感覚皮質に移植されたヒト幹細胞由来皮質オルガノイドが、感覚および動機づけ関連回路に統合される成熟細胞型を発達させることを示します。MRIにより、いくつかの幹細胞株および動物において移植後のオルガノイドの成長が明らかになり、シングルコア解析により皮質形成の進行と活動依存的転写プログラムの出現が明らかになりました。実際、移植された皮質ニューロンはin vitroのニューロンよりも複雑な形態学的、シナプス的、および内部膜的特性を示し、ティモシー症候群患者のニューロン欠陥の検出を可能にします。解剖学的および機能的トレーシングにより、移植された細胞小器官は視床皮質および皮質間皮質からの入力を受け取ることが示されており、生体内での神経活動記録は、これらの入力がヒト細胞において感覚反応を引き起こす可能性があることを示唆しています。さらに、皮質オルガノイドはラットの脳全体に軸索を伸ばし、その光遺伝学的活性化は報酬探索行動を引き起こします。このように、移植されたヒト皮質ニューロンは成熟し、宿主の行動を制御する回路に関与します。このアプローチにより、他の方法では検出できない患者由来細胞におけるストランドレベルの表現型の検出が容易になると期待されます。
発達中のヒト脳は注目すべき自己組織化プロセスであり、細胞が増殖、分化、移動し、接続して機能的な神経回路を形成し、感覚経験を通じてさらに洗練されます。特に疾患との関連でヒト脳の発達を理解する上で重要な問題は、脳組織にアクセスできないことです。ヒト皮質オルガノイド (hCO、ヒト皮質球とも呼ばれる) などの自己組織化細胞小器官は、2,3,4,5,6 を生成できます。ただし、いくつかの制限により、神経回路の発達と機能の理解への広範な応用が制限されています。特に、hCO の成熟が、生体内に存在する特定の微小環境と感覚入力の欠如によって制限されるかどうかは不明です。さらに、hCO は行動結果を生成できる回路に統合されていないため、遺伝的に複雑で行動的な神経精神疾患のモデル化における有用性は現在のところ限られています。
hCOを健常な生体脳に移植することで、これらの限界を克服できます。これまでの研究で、げっ歯類の大脳皮質に移植されたヒトニューロンは生存し、投射し、げっ歯類細胞と情報伝達できることが示されています7,8,9,10,11,12。しかし、これらの実験は通常、成体動物で行われるため、シナプスおよび軸索の統合が制限される可能性があります。本研究では、可塑性発達の初期段階にある免疫不全ラットの一次体性感覚野（S1）に、hiPS細胞由来の3D hCOを移植する移植パラダイムについて説明します。移植されたhCO（t-hCO）ニューロンは大幅に成熟し、感覚反応を引き起こす視床皮質および皮質間入力を受け取り、ラットの脳に軸索投射を伸ばして報酬探索行動を促進します。 t-hCO の長期成熟により、電圧感受性 L 型 CaV1.2 カルシウム チャネル (CACNA1C によってコード化) の変異によって引き起こされる重篤な遺伝性疾患であるティモシー症候群 (TS) の患者における神経欠陥が明らかになりました。
生体内の回路におけるヒト皮質ニューロンを研究するため、生後早期無胸腺ラット（生後3～7日）のS1に、完全な3D hCOを定位移植した（図1aおよび図1a～cの拡大データ）。この時点では、視床皮質および皮質間軸索投射はS1への神経支配をまだ完了していない（文献13）。したがって、このアプローチは、内因性回路への影響を最小限に抑えながら、t-hCOの統合を最大化するように設計されている。生体動物におけるt-hCOの位置を可視化するため、移植後2～3ヶ月のラットのT2強調MRI脳再構成を実施した（図1bおよび拡大データ、図1d）。 t-hCO は容易に観察され、t-hCO の体積測定値は固定スライスから計算された値と同様であった (拡張データ図 1d、e; P > 0.05)。 t-hCO は容易に観察され、t-hCO の体積測定値は固定スライスから計算された値と同様であった (拡張データ図 1d、e; P > 0.05)。 t-hCO легко наблюдались, а объемные измерения t-hCO были аналогичны рассчитанным для фиксированных срезов (расзиренные данные, рис. 1d, e; P> 0,05)。 t-hCO は容易に観察され、体積測定による t-hCO 測定値は固定切片で計算されたものと同様であった (拡大データ、図 1d、e; P > 0.05)。ｔ−ｈＣＯは非常に容易に観察され、ｔ−ｈＣＯの測定値は固定切片から計算された測定値と類似している（展開データ図１ｄ、ｅ；Ｐ＞０．０５）。t-hCO と t-hCO は容易に観察できます t-hCO легко наблюдался, а объемные измерения t-hCO были аналогичны рассчитанным для фиксированных срезов (расзиренные данные, рис. 1d, e; P> 0,05)。 t-hCO は容易に観察され、体積測定による t-hCO 測定値は固定切片で計算されたものと同様であった (拡大データ、図 1d、e; P > 0.05)。移植後約2か月で、移植動物の81％でt-hCOを測定した（n = 72匹、hCOは10種類のhiPS細胞株由来、hiPS細胞株は補足表1）。これらのうち、87％は大脳皮質に位置していた（図1c）。同じ移植ラットで複数の時点で連続MRIスキャンを実施したところ、3か月以内にt-hCO容積が9倍に増加していることを確認した（図1dおよび拡大データ、図1f）。移植動物は移植後12か月で高い生存率（74％）を示し（拡大データ、図1gおよび補足表2）、明らかな運動障害や記憶障害、神経膠症、脳波（EEG）は認められなかった。データは図1gおよび補足表2）。
a、実験設計の概略図。hiPS細胞由来のhCOを、分化後30～60日目の新生ヌードラットのS1に移植した。b、移植後2か月のS1におけるt-hCOを示すT2強調MRI冠状断および水平断像。スケールバー、2 mm。c、各hiPS細胞株（n = 108、バー内の数字はhIPS細胞株あたりのt-hCO量を示す）および皮質または皮質下の部位（n = 88）ごとの移植成功率の定量化。d、冠動脈のMRI画像（左、スケールバー、3 mm）と対応する3D体積再構成画像（スケールバー、3 mm）は、3か月にわたるt-hCOの増加を示している。e、ラット大脳皮質におけるt-hCOパターンのレビュー。スケールバー、1 mm。 f、左上から右へ（分化過程）のt-hCOの代表的な免疫細胞化学画像：PPP1R17（4ヶ月齢）、NeuN（8ヶ月齢）、SOX9およびGFAP（8ヶ月齢）、PDGFRα（8ヶ月齢）、MAP2（8ヶ月齢）、IBA1（8ヶ月齢）。スケールバー、20µm。HNAとの共発現はヒト由来の細胞を示している。g、snRNA-seq：Seurat統合後の高品質t-hCO核すべての統合マニホールドおよび投影（UMAP）次元削減イメージング（t-hCOサンプルn=3、hiPS細胞株n=2）。アストロサイト：アストロサイト株の細胞；cyc prog：循環前駆細胞；GluN DL：深層グルタミン酸作動性ニューロン；GluN DL/SP：深層およびサブラメラグルタミン酸作動性ニューロン；GluN UL：上層グルタミン酸作動性ニューロン。オリゴデンドロサイト、オリゴデンドロサイト；OPC、オリゴデンドロサイト前駆細胞；RELN、リーリンニューロン。 h、hCOグルタミン酸ニューロンと比較したt-hCOグルタミン酸ニューロンで有意にアップレギュレーションされた遺伝子（調整済みP < 0.05、倍数変化> 2、少なくとも10%の核で発現）の遺伝子オントロジー（GO）用語エンリッチメント解析。 h、hCOグルタミン酸ニューロンと比較したt-hCOグルタミン酸ニューロンで有意にアップレギュレーションされた遺伝子（調整済みP < 0.05、倍数変化> 2、少なくとも10%の核で発現）の遺伝子オントロジー（GO）用語エンリッチメント解析。 h, 遺伝子オントロジー (GO) для генов со значительной активацией (скорректированный P <0,05, кратность) изменения > 2, экспрессия по крайней мере в 10% ядер) в глутаматергических нейронах t-hCO по сравнению с और देखेंナイロビアンhCO。 h、hCOグルタミン酸ニューロンと比較したt-hCOグルタミン酸ニューロンでの有意な活性化（調整済みP<0.05、倍数変化>2、少なくとも10％の核で発現）を示す遺伝子の遺伝子オントロジー（GO）用語エンリッチメント解析。 ｈ、ｈＣＯ谷酸能細胞と比較して、ｔ−ｈＣＯ谷酸能細胞中の遺伝子が上方調節されている（調節後Ｐ＜０．０５、倍数変化＞２、少なくとも１０％の細胞核で発現）遺伝子量（ＧＯ）の遺伝子量濃縮分析。 h 、 hco 谷酸能元比 、 t-hco 谷酸能神经元遺伝子は上方に位置する (後 後 p <0.05 、変動 変動> 2 、少なくとも 10% の核内発現) 遺伝子 遺伝子 遺伝子の の ののメインロジック (GO) の濃縮分析。 h, гены значительно активизировались (скорректированный P <0,05, кратность изменения> 2, экспрессируется по крайней мере в 10% ядер) в глутаматергических нейронах t-hCO по сравнению с глутаматергическими нейронами hCO Онтологический (GO) анализ термина обогащения。 h、遺伝子は、hCO グルタミン酸ニューロンと比較して、t-hCO グルタミン酸ニューロンで有意にアップレギュレーションされていました（調整済み P < 0.05、倍数変化 > 2、少なくとも 10% の核で発現）。エンリッチメント用語のオントロジー (GO) 分析。点線はaq値0.05を示しています。i、参照22 snRNA-seq成人運動皮質データセットからのラベル転写を用いたt-hCOにおけるGluN細胞型のUMAPイメージング。CT — 皮質視床細胞、ET — 脳外細胞、IT — 内終脳細胞、NP — 近距離投影。
次に、t-hCOの細胞構造と全体的な細胞構成を評価しました。ラット内皮細胞の抗体染色ではt-hCOによる血管新生が明らかになり、IBA1染色では移植片全体にラットミクログリアが存在することが明らかになりました（図1fおよび拡大データ、図3c、d）。免疫染色では、ヒト核抗原（HNA）陽性細胞がPPP1R17（皮質前駆細胞）、NeuN（ニューロン）、SOX9およびGFAP（グリア由来細胞）、またはPDGFRα（オリゴデンドロサイト前駆細胞）を共発現していることが明らかになりました（図1f）。t-hCOの細胞構成を単一細胞解像度で研究するため、分化誘導後約8ヶ月後にシングルコアRNAシーケンシング（snRNA-seq）を実施しました。ラット細胞をバルク濾過し、核を除去することで、21,500個の高品質なヒト単核細胞マップが得られた（図1gおよび拡大データ、図4a、b）。典型的な細胞型マーカーの発現パターンから、深層および表層グルタミン酸作動性ニューロン、循環前駆細胞、オリゴデンドロサイト、アストロサイト系譜など、主要な皮質細胞群のクラスターが同定された（図1g、拡大データ、図4c、および補足表3）。SATB2およびCTIP2の免疫染色では、皮質サブタイプが存在するにもかかわらず、t-hCOは明確な解剖学的層別化を示さなかった（拡大データ、図3a）。段階を合わせた snRNA-seq hCO は、オリゴデンドロサイトが存在せず、GABA 作動性ニューロンが存在するなど、いくつかの例外を除いて、ほぼ同様の細胞クラスを生成しました。これは、以前に報告された側方前駆細胞に好ましい in vitro 条件 15 を反映している可能性があります (拡大データ、図 4f – i および補足表 4)。差次的遺伝子発現解析により、t-hCO と hCO のグルタミン酸作動性ニューロンには有意な違いがあることが明らかになりました (補足表 5)。これには、シナプスシグナル伝達、樹状突起の局在、電位依存性チャネルの活性など、ニューロン成熟に関連する遺伝子セットの活性化が含まれます (図 1h および補足表 5)。表 6)。したがって、皮質グルタミン酸作動性 t-hCO ニューロンは、転写成熟が加速していました。
t-hCO のこれらの転写変化が in vitro の hCO と in vivo の t-hCO の形態学的差異に関係するかどうかを解明するために、分化後 7～8 か月後の急性切片で、段階を合わせたビオシチン充填 hCO および hCO を再構築しました。hCO ニューロン (図 2a)。t-hCO ニューロンは有意に大きく、in vitro hCO と比較して細胞体の直径が 1.5 倍、樹状突起の数が 2 倍、樹状突起の総長が全体で 6 倍増加していました (図 2b)。さらに、t-hCO ニューロンの樹状突起棘の密度は hCO ニューロンよりも有意に高いことが観察されました (図 2c)。これは、t-hCO ニューロンが広範な樹状突起の伸長と分岐を起こし、それが継続的な細胞増殖と相まって、移植後の t-hCO の集中的な成長に寄与している可能性があることを示唆しています (図 1d および拡張データの図 1f)。これをきっかけに、電気生理学的特性を調査することになりました。膜容量は 8 倍高く (拡大データ、図 8d)、静止状態の膜電位はより過分極しており (約 20 mV)、電流注入によって t-hCO ニューロンで誘発される最大興奮率は hCO ニューロンよりも高くなりました (図 2d)、e)。これは、t-hCO のより大きく複雑な形態学的特徴と一致しています。さらに、自発興奮性シナプス後電流イベント (EPSC) の頻度は t-hCO ニューロンで有意に高く (図 2f)、t-hCO ニューロンで観察される樹状突起スパイン密度の増加は機能的興奮性と関連していることを示唆しています。性的シナプス。標識されたグルタミン酸作動性ニューロンを記録することにより、in vitro で hCO ニューロンの未熟な特徴を確認しました (拡大データ、図 6a-c)。
a、8 か月の分化後のビオシチン充填 hCO ニューロンと t-hCO ニューロンの 3D 再構築。 b、形態学的特徴の定量化（n = 8 hCOニューロン、n = 6 t-hCOニューロン、**P = 0.0084、*P = 0.0179、***P < 0.0001）。 b、形態学的特徴の定量化（n = 8 hCOニューロン、n = 6 t-hCOニューロン、**P = 0.0084、*P = 0.0179、***P < 0.0001）。 б, количественная оценка морфологических признаков (n = 8 нейронов hCO, n = 6 нейронов t-hCO; ** P = 0,0084, * P = 0,0179 и *** P <0,0001)。 b、形態学的特徴の定量化（n=8 hCOニューロン、n=6 t-hCOニューロン、**P=0.0084、*P=0.0179、***P<0.0001）。 b、形態的特徴の量化（n = 8 個の hCO 神単位、n = 6 個の t-hCO 神単位；**P = 0.0084、*P = 0.0179 および ***P < 0.0001）。 b、形態的特徴の量化（n = 8 個の hCO 神単位、n = 6 個の t-hCO 神単位；**P = 0.0084、*P = 0.0179 および ***P < 0.0001）。 б, количественная оценка морфологических признаков (n = 8 нейронов hCO, n = 6 нейронов t-hCO; ** P = 0,0084, * P = 0,0179 и *** P <0,0001)。 b、形態学的特徴の定量化（n=8 hCOニューロン、n=6 t-hCOニューロン、**P=0.0084、*P=0.0179、***P<0.0001）。c、分化後8ヶ月におけるhCOおよびt-hCO樹状枝の3D再構成。赤いアスタリスクは推定樹状突起棘を示す。樹状突起棘密度の定量化（n = hCOニューロン8個、n = t-hCOニューロン6個、**P = 0.0092）。 d、静止膜電位の定量化（n = 25 hCOニューロン、n = 16 t-hCOニューロン、***P < 0.0001）。 d、静止膜電位の定量化（n = 25 hCOニューロン、n = 16 t-hCOニューロン、***P < 0.0001）。 d, количественная оценка мембранного потенциала покоя (n = 25 нейронов hCO, n = 16 нейронов t-hCO; *** P <0,0001)。 d、静止膜電位の定量化（n = 25 hCOニューロン、n = 16 t-hCOニューロン; ***P < 0.0001）。 d、静圧膜電位の量化（n = 25 hCO 神単位、n = 16 t-hCO 神単位；***P < 0.0001）。 d、静圧膜電位の量化（n = 25 hCO 神単位、n = 16 t-hCO 神単位；***P < 0.0001）。 d, количественная оценка мембранного потенциала покоя (n = 25 нейронов hCO, n = 16 нейронов t-hCO; *** P <0,0001)。 d、静止膜電位の定量化（n = 25 hCOニューロン、n = 16 t-hCOニューロン; ***P < 0.0001）。 e、増加する電流注入によって誘発される hCO および t-hCO での反復活動電位発火、および最大発火率の定量化 (n = 25 hCO ニューロン、n = 16 t-hCO ニューロン、***P < 0.0001)。 e、増加する電流注入によって誘発される hCO および t-hCO での反復活動電位発火、および最大発火率の定量化 (n = 25 hCO ニューロン、n = 16 t-hCO ニューロン、***P < 0.0001)。 e、повторное возбуждение потенциала действия в hCO и t-hCO, вызванное увеличением тока, и количественная оценка максимальной скорости возбуждения (n = 25 нейронов hCO, n = 16 нейронов t-hCO; *** P <0,0001)。 e、電流増加によって誘発されるhCOおよびt-hCOの活動電位の再発火と最大発火率の定量化（n = 25 hCOニューロン、n = 16 t-hCOニューロン、*** P < 0.0001）。 e、追加電流注入により、hCO および t-hCO の反復動作により電位放出が行われ、最大放出電力の量が増加します（n = 25 hCO 神単位、n = 16 t-hCO 神単位；***P < 0.0001）。 E 、電流注入の hco および t-hco の繰り返し電位放出、および最大量化 ((n = 25 hco 神経過、n = 16 t-hco 神経過 ; *** p <0.0001)。 e, повторяющееся возбуждение потенциала действия hCO и t-hCO, вызванное увеличением подачи тока, и количественная оценка максимальной скорости возбуждения (n = 25 нейронов hCO, n = 16 нейронов t-hCO; *** P <0,0001)。 e、電流供給の増加によって誘発されるhCOおよびt-hCO活動電位の反復発火と最大発火率の定量化（n = 25 hCOニューロン、n = 16 t-hCOニューロン、*** P < 0.0001）。 f、分化8か月後のhCOニューロンとt-hCOニューロンにおける自発的EPSC（sEPSC）とシナプスイベント頻度の定量化（n = 25 hCOニューロン、n = 17 t-hCOニューロン、***P < 0.0001）。 f、分化8ヶ月後のhCOニューロンとt-hCOニューロンにおける自発的EPSC（sEPSC）とシナプスイベント頻度の定量化（n = 25 hCOニューロン、n = 17 t-hCOニューロン、***P < 0.0001）。 f, спонтанные EPSC (sEPSC) в нейронах hCO и t-hCO через 8 месяцев дифференциров​​ки и количественная оценка частоты синаптических событий (n = 25 нейронов hCO, n = 17 нейронов t-hCO; *** P <0,0001) 。 f、分化8か月後のhCOおよびt-hCOニューロンにおける自発的EPSC（sEPSC）とシナプスイベント率の定量化（n=25 hCOニューロン、n=17 t-hCOニューロン、***P<0.0001）。 f、分化8 毎月の hCO および t-hCO 神ユニット内の自発性 EPSC (sEPSC)、および突発イベント頻度の量化 (n = 25 hCO 神ユニット、n = 17 t-hCO 神ユニット；***P < 0.0001)。 f、分別8 月ごとの hCO および t-hCO 神ユニット内の自発性 EPSC (sEPSC)、および突発イベント頻度の量匼（n = 25 hCO 神率の量匼（n = 25hCO P < 0.0001））。 f, спонтанные EPSC (sEPSC) в нейронах hCO и t-hCO через 8 месяцев дифференциров​​ки и количественная оценка частоты синаптических событий (n = 25 нейронов hCO, n = 17 нейронов t-hCO; *** P <0,0001)。 f、分化8か月後のhCOニューロンとt-hCOニューロンにおける自発的EPSC（sEPSC）とシナプスイベント率の定量化（n = 25 hCOニューロン、n = 17 t-hCOニューロン、*** P<0.0001）。bf の場合、ライン 1208-2 の hCO と t-hCO は、並行して維持されている同じ分化バッチから取得されました。 g、マウス生体内研究16および試験管内ニューロンからのヒト特異的LRG17から特定された早期応答（ERG）および後期応答（LRG）活動依存性遺伝子の遺伝子セットを持つhCOグルタミン酸ニューロンと比較した、t-hCOグルタミン酸ニューロンで有意にアップレギュレーションされた遺伝子（調整済みP < 0.05、倍数変化> 2、少なくとも10%の核で発現）の遺伝子セットエンリッチメント解析（片側Fisherの正確検定）。 g、マウス生体内研究16および試験管内ニューロンからのヒト特異的LRG17から特定された早期応答（ERG）および後期応答（LRG）活動依存性遺伝子の遺伝子セットを持つhCOグルタミン酸ニューロンと比較した、t-hCOグルタミン酸ニューロンで有意にアップレギュレーションされた遺伝子（調整済みP < 0.05、倍数変化> 2、少なくとも10%の核で発現）の遺伝子セットエンリッチメント解析（片側Fisherの正確検定）。 g、анализ обогащения набора генов (односторонний точный критерий Физера) генов со значительной активацией (скорректированный P <0,05, кратность изменения > 2, экспрессия по меньзей мере в 10% ядер) в глутаматергических нейронах t-hCO по сравнению с глутаматергическими нейронами hCO наборы генов как раннего (ERG), так и позднего (LRG) генов, зависящих от vivo16 の中で、LRG のような存在である必要があります。ビトロ17。 g、t-hCOグルタミン酸ニューロンで有意に活性化した遺伝子（調整済みP<0.05、倍数変化>2、少なくとも10%の核で発現）の遺伝子セットエンリッチメント（片側Fisherの正確検定）の解析。in vivoマウス16およびin vitroニューロンからのヒト特異的LRG17で同定された初期（ERG）および後期（LRG）活動依存性遺伝子のhCOグルタミン酸ニューロンセットと比較。 g，t-hCO谷酸能神经元とhCO谷酸能神经元比，t-hCO谷酸能神经元显着上调（调整後P<0.05，倍数变化） >2、少なくとも 10% の細胞核で発現）の遺伝子濃縮分析（片側フィッシャー精巣検査）体内マウス研究で決定された初期反応（ERG）期反応（ＬＲＧ）活性依存性遺伝子の遺伝子群１６および体外神経細胞１７中のヒト特異的ＬＲＧ。 g 、 t-hco 谷氨酸 神经 元と hco 谷氨酸 神经 元 相対比 、 t-hco 谷氨酸 神经 元 上调 （整後 p <0.05 、倍数> 2 、少なくとも少なくとも 10% の細胞核中発現） の集合分析（片側フィッシャー精緻）） 体内マウス研究における初期反応反応および後期反応（lrg）活性遺伝子の遺伝子群16および神細胞細胞17の中17のヒト型特異性LRG。 g、глутаматергические нейроны t-hCO были значительно активизированы по сравнению с глутаматергическими нейронами hCO (скорректированный P<0,05, кратность изменения> 2, не менее 10% Анализ обогащения набора генов (односторонний точныйてかФизера) раннего ответа (ERG) и позднего гены, зависящие от активности ответа (LRG), идентифициров​​анные в生体内での 16 と生体外での нейронах 17。 LRG、最高の日。 g、t-hCO グルタミン酸作動性ニューロンは、hCO グルタミン酸作動性ニューロンと比較して有意にアップレギュレーションされていました (調整済み P<0.05、倍数変化 >2、少なくとも 10%)。初期応答 (ERG) および後期応答遺伝子エンリッチメント解析 (片側フィッシャーの正確検定) 応答活動依存遺伝子 (LRG) は、in vivo マウス 16 および in vitro ニューロン 17 で特定されています。ヒト特有の LRG。点線はBonferroni補正P値0.05を示す。h：t-hCOグルタミン酸ニューロンにおけるLRG遺伝子のsnRNA-seqレプリカにおいて、GluN遺伝子発現（各遺伝子の擬似パッケージおよびスケーリング）が有意に上昇した。i：t-hCO（上）およびhCO（下）ニューロンにおけるSCG2発現を示す免疫染色。白矢印はSCG2+細胞を指す。スケールバーは25µm。データは平均±標準偏差として表される。
ex vivo切片において観察されたt-hCOの活性増加に基づき、snRNA-seq解析により、in vitroにおいてhCOと比較してt-hCOの遺伝子転写産物が活動依存的に増加していることが明らかになった。グルタミン酸作動性t-hCOニューロンは、マウスおよびヒトニューロンにおける過去の研究16,17で確認されている遅延反応活性を制御する遺伝子（図2g、h）の発現レベルが高かった。例えば、BDNF18、SCG2、そして霊長類特異的な活性制御遺伝子であるOSTNは、hCOニューロンと比較してt-hCOニューロンで発現レベルが上昇していた（図2g-i）。このように、転写、形態、機能解析の結果から、t-hCOニューロンはhCOニューロンと比較して成熟特性が強化されていることが示された。
t-hCO 成熟とヒトの脳の発達との関連性をさらに評価するために、胎児および成人の皮質細胞タイプ19,20 と成人21,22 のトランスクリプトームの比較、ならびに発達中の皮質遺伝子発現23 に関する広範なデータを行いました (拡大データ、図 5)。 )。以前の研究 24 と比較すると、分化後 7～8 ヶ月における hCO および t-hCO トランスクリプトームの全体的な成熟状態は、生体内の発達時間とほぼ一致しており、胎児期後期に最も相当します (拡大データ、図 5a)。特に、年齢を合わせた hCO と比較して t-hCO のトランスクリプトーム成熟が進んでいること、およびシナプス形成、アストロジェネシス、およびミエリン形成に関連するトランスクリプトーム活性化が観察されました (拡大データ、図 5b-d)。細胞レベルでは、t-hCO の皮質サブタイプがより薄く、グルタミン酸作動性ニューロンのクラスターが成体の L2/3、L5、L6 ニューロンサブタイプと重なり合っている証拠が見つかりました (図 1i)。対照的に、グルタミン酸作動性 t-hCO ニューロンと胎児皮質ニューロンのクラスターの重なりは、妊娠中期にはより限定的でした (拡大データ、図 5e-j)。t-hCO ニューロンがヒト出生後大脳新皮質ニューロンと機能的に類似しているかどうかを判断するために、ヒト出生後大脳皮質の鮮明な切片を用いて、ヒト L2/3 錐体ニューロンの電気生理学的記録と解剖学的再構築を行いました (拡大データ、図 7a)。L2/3 錐体ニューロンの電気生理学的特性は、t-hCO 錐体ニューロンの特性と類似していました (拡大データ、図 7e)。形態学的には、出生後ヒトサンプルの L2/3 ニューロンは hCO よりも t-hCO に類似していましたが、L2/3 細胞はより長く、全体的により多くの枝を含み、より高いスパイン密度を示しました (図 3g および拡大データ、図 7b-)。G)。
a、コントロールおよびTS hiPS細胞株によって生成されたhCOの新生ラットへの移植。b、8か月の分化後のビオシチン充填t-hCOニューロンの3D再構築。c、平均樹状突起長の定量化（n = 19コントロールニューロン、n = 21 TSニューロン、**P = 0.0041）。 d、分化8か月後の対照およびTS t-hCOからの3D再構築樹状枝、および樹状突起棘密度の定量化（n = 16対照ニューロン、n = 21 TSニューロン、***P < 0.0001）。 d、分化8か月後の対照およびTS t-hCOからの3D再構築樹状枝、および樹状突起棘密度の定量化（n = 16対照ニューロン、n = 21 TSニューロン、***P < 0.0001）。 d、3D-реконструкция дендритных ветвей из контроля и TS t-hCO через 8 месяцев дифференциров​​ки и количественная оценка плотности дендритных зипов (n = 16 контрольных нейронов, n = 21 TS нейронов, *** P <0,0001)。 d、分化8か月後の対照およびt-hCO TSからの樹状枝の3D再構築と樹状突起棘密度の定量化（n=16対照ニューロン、n=21 TSニューロン、***P<0.0001）。 d、8 ヶ月間の対照および TS t-hCO の 3D 再構築突起枝、および突起棘密度の量を分別した（n = 16 の対照神単位、n = 21 の TS 神単位、***P < 0.0001）。 d、8 時間の対照および ts t-hco の 3d 再構成分枝および突刺棘密度の定量化 (n = 16 個の神経、n = 21 個の ts 神経、*** p <0.0001)。 d、3D-реконструкция дендритных ветвей контроля и TS t-hCO через 8 месяцев дифференциров​​ки и количественная оценка плотности дендритных зипов (n = 16 контрольных нейронов, n = 21 TS нейронов, *** P <0,0001)。 d、分化8か月目における対照樹状枝とTS t-hCOの3D再構築および樹状突起棘密度定量化（n=16対照ニューロン、n=21 TSニューロン、***P<0.0001）。赤いアスタリスクは推定樹状突起スパインを示す。e, 分化後8ヶ月のコントロールおよびTS t-hCOニューロンにおける自発的EPSC。f, 累積頻度プロットおよびシナプスイベントの頻度と振幅の定量化（コントロールニューロンn=32、TSニューロンn=26; **P=0.0076およびP=0.8102）。g, hCOおよびt-hCOにおけるTSおよびコントロールニューロンのScholl解析。破線は比較のためにヒトL2/3出生後錐体ニューロンを示す（コントロールt-hCOニューロンn=24、TS t-hCOニューロンn=21、コントロールhCOニューロンn=8、TS hCOニューロンn=7）。データは平均±標準偏差として表される。
t-hCO がヒト皮質ニューロンの形態的および機能的特徴を高いレベルで再現できることから、t-hCO を使用して疾患表現型を検出できるかどうかの調査が始まりました。私たちは、ニューロンで活動依存性遺伝子転写を開始する CaV1.2 をコードする遺伝子の機能獲得型変異によって引き起こされる重度の神経発達障害である TS に着目しました。最も一般的な置換 (p.G406R) を持つ 3 人の TS 患者と 3 人のコントロールから hCO を採取しました (図 3a)。移植後、TS ニューロンではコントロールと比較して樹状突起の形態が変化しており (図 3b および拡大データ、図 8a、b)、一次樹状突起の数が 2 倍に増加し、樹状突起の長さの平均が全体的に増加し、全体的に減少していることがわかりました (図 3c および拡大データ、図 8c)。これは、対照ニューロンと比較して、TSにおけるスパイン密度の増加と自発性EPSCの頻度の増加と関連していました（図3d–fおよび拡大データ、図8g）。さらなる解析により、対照と比較してt-hCO TSでは異常な樹状突起の分岐パターンが明らかになりましたが、同様の分化段階にあるin vitro TS hCOでは異常な分岐パターンは見られませんでした（図3g）。これは、TSにおける活動依存的な樹状突起の収縮に関するこれまでの報告と一致しており、この移植プラットフォームがin vivoで疾患表現型を検出できることを示唆しています。
次に、t-hCO細胞がラットS1にどの程度機能的に統合されているかを検討しました。げっ歯類のS1は、同側腹側基底核および後視床核、同側運動野および二次体性感覚野、そして対側S1から強いシナプス入力を受けています（図4a）。神経支配パターンを回復させるため、hCOに狂犬病ウイルスdG-GFP/AAV-Gを感染させ、3日後にhCOをS1ラットに移植しました。移植後7～14日目に、同側S1および腹側基底核のニューロンにおいて高密度のGFP発現が観察されました（図4b、c）。さらに、視床マーカーであるネトリンG1の抗体染色により、t-hCOに視床終末が存在することが明らかになりました（図4d、e）。これらの求心性投射がt-hCO細胞でシナプス応答を誘発するかどうかを評価するため、視床皮質層の鋭角切片からヒト細胞を採取し、全細胞記録を行った。ラットのS1、内包、白質、t-hCO近傍の線維への電気刺激、またはt-hCOにおけるオプシン発現視床終末の光遺伝学的活性化は、AMPA受容体拮抗薬NBQXに曝露されたt-hCOニューロンにおいて短潜時のEPSCを誘発した（図4f、gおよび拡張データ、図9a～g）。これらのデータは、t-hCOがラット脳に解剖学的に組み込まれており、ラットの宿主組織によって活性化され得ることを示している。
a、狂犬病追跡実験の模式図。b、t-hCOとラット大脳皮質間のGFPおよびヒト特異的STEM121の発現（上段）。ラットの同側腹側基底核（VB）（左下）および同側S1（右下）におけるGFPの発現も示す。スケールバー、50µm。赤い四角は、画像が撮影された脳の領域を表す。c、GFPを発現している細胞の定量化（n = 4匹のラット）。d、e — t-hCOにおけるネトリンG1+視床終末。dは、t-hCOおよびVB核を含む冠状断面を示す。スケールバー、2mm。eは、t-hCO（左）およびVB（右）ニューロンにおけるネトリンG1およびSTEM121の発現を示す。スケールバー、50µm。オレンジ色の点線は t-hCO の境界を示しています。f、g、S1 ラット (f) または内包 (g) における電気刺激後の t-hCO ニューロンの電流トレース、NBQX あり (紫) またはなし (黒) (左)。NBQX ありとなしの EPSC 振幅 (n = 6 S1 ニューロン、*P = 0.0119、n = 6 内包ニューロン、**P = 0.0022) (中央)。ラット S1 (f) または内包 (g) の電気刺激に反応して EPSC を示す t-hCO ニューロンの割合 (右)。aCSF、人工脳脊髄液。h、2P イメージング実験の模式図 (左)。t-hCO における GCaMP6s の発現 (中央)。スケールバー、100 µm。GCaMP6s の蛍光タイムラプス (右)。i、自発活動蛍光の Z スコア。 j、口ひげ刺激の模式図。k、1回の試行におけるZスコア化された2P蛍光軌跡。例の細胞における時間ゼロ（破線）でのヒゲの偏差に合わせて整列。l、時間ゼロ（破線）でのヒゲの偏差に合わせて整列した全細胞の集団平均Zスコア応答（赤）またはランダムに生成されたタイムスタンプ（灰色）。m。光マーキング実験の模式図。n、青色レーザー刺激中またはヒゲの偏向中における例のt-hCO細胞の生の電圧曲線。赤い矢印は、光によって引き起こされた最初のスパイク（上）またはヒゲの偏向によって引き起こされた最初のスパイク（下）を示しています。灰色の網掛けはヒゲの偏向期間を示しています。o、ピーク光波形とヒゲの偏向応答。p、例の細胞におけるヒゲの偏差に合わせて整列した1回の試行のスパイク。0はヒゲの偏差（破線）を示しています。 q, 全ての光感受性細胞の集団平均Zスコア発火率。ヒゲ偏向ゼロ時（破線）（赤）またはランダムに生成されたタイムスタンプ（灰色）に整列。r, ヒゲ偏向によって有意に変調された光感受性単位の割合（n = 3匹のラット）（左）。ピークZスコア潜時（n = 3匹のラット；ラット1匹あたりn = 5（薄緑）、n = 4（濃緑）、n = 4（シアン）のヒゲ偏向変調単位）（右）。データは平均±標準偏差として表される。
次に、t-hCOが生体内で感覚刺激によって活性化されるかどうかを調べました。遺伝子コード化カルシウム指示薬GCaMP6を発現するhCOをS1ラットに移植しました。150日後、ファイバー測光法または2光子カルシウムイメージングを実施しました（図4hおよび拡大データ、図10a）。t-hCO細胞は同期した律動活動を示していることがわかりました（図4i、拡大データ、図10bおよび補足ビデオ1）。t-hCOのピーク活動の特徴を明らかにするため、麻酔をかけた移植ラットで細胞外電気生理学的記録を実施しました（拡大データ、図10c-f）。MRI画像から定位座標を生成したため、記録されたこれらの単位は推定上のヒトニューロンを表していますが、電気生理学だけでは起源の種を特定することはできません。同期した活動のバーストを観察しました（拡大データ、図10d）。バーストは約 460 ミリ秒続き、約 2 秒の沈黙期間で区切られていました (拡大データ、図 10d、e)。個々のユニットはバーストあたり平均約 3 ラウンド発火しており、これはバーストあたりの登録ユニットの約 73% に相当します。個々のユニットの活動は高度に相関しており、これらの相関は、同じ条件下で記録されたワクチン未接種の動物で特定されたユニットの相関よりも高かったです (拡大データ、図 10f)。特定されたヒト由来ニューロンのスパイク応答をさらに特徴付けるために、光感受性カチオンチャネルロドプシン 2 (hChR2) を発現している hCO を移植した麻酔ラットで光タグ付け実験を行い、これを介して t-hCO ニューロンは青色光刺激に応答して短い潜時認識 (10 ミリ秒未満) を示しました (図 4m～o)。 t-hCO ニューロンは、カルシウムイメージングや光マーキングのない t-hCO で行われた電気生理学的記録で観察されるものと同様の周波数で、自発的な活動のバーストを示した (拡大データ、図 10c-g)。in vitro で記録された hCO の対応する段階では、自発活動は観察されなかった。t-hCO が感覚刺激によって活性化されるかどうかを評価するために、ラットのヒゲを t-hCO から短時間そらした (図 4j、m および拡大データ、図 10h、k)。以前の研究8,10 によれば、t-hCO 細胞のサブセットはヒゲのそらしに応じて活動の増加を示したが、データをランダムなタイムスタンプと比較した場合にはこの増加は観察されなかった (図 4k-q および拡大データ、図 10h-q)。実際、光標識された単一ユニットの約54%は、ヒゲ刺激後に覚醒率が有意に上昇し、約650msでピークに達した（図4r）。これらのデータを総合すると、t-hCOは適切な機能的入力を受け、環境刺激によって活性化され得ることが示唆される。
次に、t-hCOがラットの行動制御回路を活性化できるかどうかを調べました。まず、t-hCOニューロンの軸索がラットの周囲組織に投射するかどうかを調べました。hChR2とEYFPを融合させたレンチウイルス（hChR2-EYFP）をhCOに感染させました。110日後、聴覚野、運動野、体性感覚野を含む同側皮質領域、および線条体、海馬、視床を含む皮質下領域においてEYFPの発現を観察しました（図5a）。これらの遠心性投射がラット細胞でシナプス応答を引き起こすかどうかを評価するため、ラット脳の鮮明切片を用いて大脳皮質細胞を記録し、hChR2-EYFPを発現するt-hCO細胞を光活性化しました。青色光によるt-hCO軸索の活性化は、ラット錐体皮質ニューロンにおいて短潜時のEPSCを誘発したが、NBQXによって阻害された（図5b～g）。さらに、これらの反応はテトロドトキシン（TTX）によって阻害され、4-アミノピリジン（4-AP）によって回復した。これは、これらの反応が単シナプス結合によって引き起こされたことを示唆している（図5e）。
a、軸索追跡の模式図（左）。t-hCO EYFP発現（右）。スケールバー、100 µm。A1、聴覚皮質、ACC、前帯状皮質、d。線条体、背側線条体、HPC、海馬。横隔膜、外側中隔、mPFC、内側前頭前皮質、梨状皮質、v。線条体、腹側線条体、VPM、視床腹側内側核、VTA、腹側被蓋野。赤い四角は、画像が撮影された脳領域を示しています。b、刺激実験の模式図。c、d、ヒト（c）EYFP+ t-hCOまたはラット（d）EYFP-細胞における青色光誘起光電流（上）および電圧（下）の応答例。 e、f、TTXおよび4-AR（緑）、TTX（灰色）またはaCSF（黒）によるt-hCO軸索の青色光刺激後のラットニューロンの電流トレース（e）、NBQXあり（紫）またはなし（黒）） ）NBQX（e）。g、ラット細胞（n = 16個の細胞）での青色光誘導反応の潜時。水平バーは平均潜時（7.13 ms）を示す（左）。 NBQX の有無で記録された光誘発 EPSC の振幅 (n = 7 細胞; ***P < 0.0001) (中央)。 NBQX の有無で記録された光誘発 EPSC の振幅 (n = 7 細胞; ***P < 0.0001) (中央)。 EPSC は、NBQX (n = 7 клеток; ***P <0,0001) (в центре) を表します。 NBQX の有無で記録された光誘導 EPSC の振幅 (n = 7 細胞; ***P < 0.0001) (中央)。NBQX で認められた光照射の使用または不使用により、EPSC の振幅が変化しました（n = 7 細胞；***P < 0.0001）（中）。NBQX で認められた光照射の使用または不使用により、EPSC の振幅が変化しました（n = 7 細胞；***P < 0.0001）（中）。 EPSC は、NBQX (n = 7 клеток; ***P <0,0001) (в центре) を表します。 NBQX の有無で記録された光誘導 EPSC の振幅 (n = 7 細胞; ***P < 0.0001) (中央)。青色光に反応する EPSC を示すラット細胞の割合（右）。h、行動課題の模式図。d0、0 日目。i。トレーニング 1 日目（左）または 15 日目（右）の例示的な動物のパフォーマンス。 1 日目 (左) または 15 日目 (右中央) に行われた舐めの平均回数 (n = 150 青色光試験、n = 150 赤色光試験、***P < 0.0001)。 1 日目 (左) または 15 日目 (右中央) に行われた舐めの平均回数 (n = 150 青色光試験、n = 150 赤色光試験、***P < 0.0001)。 Среднее количество облизываний, выполненных в день 1 (слева) или день 15 (в центре справа) (n = 150 испытаний с) синим светом, n = 150 испытаний с красным светом; ***P <0,0001)。 1 日目 (左) または 15 日目 (中央右) に実行された舐め動作の平均回数 (n = 150 青色光試験、n = 150 赤色光試験、***P < 0.0001)。1 回目の天（左）または 15 回目の天（右中）に実行された平均光回数（n = 150 次光テスト、n = 150 次光テスト；***P < 0.0001）。1 回目の天（左）または 15 回目の天（右中）の実行の平均回数（n = 150 次光試験、n = 150 次光試験；***P < 0.001） Среднее количество облизываний, выполненных в день 1 (слева) или день 15 (в центре справа) (n = 150 испытаний с) синим светом, n = 150 испытаний с красным светом; ***P <0,0001)。 1 日目 (左) または 15 日目 (中央右) に実行された舐め動作の平均回数 (n = 150 青色光試験、n = 150 赤色光試験、***P < 0.0001)。1日目（中央左）または15日目（右）の赤色光および青色光試験における累積舐め回数。NS、有意差なし。j、k、1日目または15日目にhChR2-EYFP（j）またはコントロール蛍光体（k）を発現するt-hCOを移植されたすべての動物の行動特性（hChR2-EYFP：n = 9匹、** P = 0.0049、コントロール：n = 9、P = 0.1497）。 l、選好スコアの推移（hChR2群n = 9、対照群n = 9、**P < 0.001、***P < 0.0001）。 l、選好スコアの推移（hChR2群n = 9、対照群n = 9、**P < 0.001、***P < 0.0001）。 l, Эволюция показателя предпочтения (n = 9 hChR2, n = 9 контрольных; **P <0,001, ***P <0,0001)。 l、選好スコアの推移（hChR2群n = 9、対照群n = 9、**P < 0.001、***P < 0.0001）。 l、好ましい評価の変化（n = 9 hChR2、n = 9 対照；**P < 0.001、***P < 0.0001）。 l、好ましい評価の変化（n = 9 hChR2、n = 9 対照；**P < 0.001、***P < 0.0001）。 l、Эволюция показателей предпочтения (n = 9 hChR2、n = 9 контролей; **P <0,001、***P <0,0001)。 l、選好スコアの推移（hChR2群n = 9、対照群n = 9、**P < 0.001、***P < 0.0001）。m、S1におけるt-hCOの光遺伝学的活性化に応じたFOS発現。 FOS 発現の画像 (左) と定量化 (グループあたり n = 3、*P < 0.05、**P < 0.01、***P < 0.001) (右) を示します。 FOS 発現の画像 (左) と定量化 (グループあたり n = 3、*P < 0.05、**P < 0.01、***P < 0.001) (右) を示します。 Показаны изображения экспрессии FOS (слева) и количественного определения (n = 3 на группу; * P <0,05, ** P <0,01 и *** P <0,001) (справа)。 FOS 発現の画像 (左) と定量化 (グループあたり n = 3、*P<0.05、**P<0.01、***P<0.001) を示します (右)。ＦＯＳの発現（左）および量化（各群ｎ＝３；*Ｐ＜０．０５、**Ｐ＜０．０１および***Ｐ＜０．００１）（右）の画像を示す。ＦＯＳの発現（左）および量化（各群ｎ＝３；*Ｐ＜０．０５、**Ｐ＜０．０１および***Ｐ＜０．００１）（右）の画像を示す。 Показаны изображения экспрессии FOS (слева) и количественного определения (n = 3 на группу; * P <0,05, ** P <0,01 и *** P <0,001) (справа)。 FOS 発現の画像 (左) と定量化 (グループあたり n = 3、*P<0.05、**P<0.01、***P<0.001) を示します (右)。スケールバー：100 µm。データは、BLA、基底外側扁桃、MDT、視床背内側核、PAG、中脳水道周囲灰白質の平均±標準誤差として表される。
最後に、t-hCOがラットの行動を調整できるかどうかを調べた。これを試験するために、hChR2-EYFP発現hCOをS1に移植し、90日後に光送達用に光ファイバーをt-hCOに埋め込んだ。次に、修正オペラント条件付けパラダイムでラットを訓練した（図​​5h）。動物を行動試験チャンバーに入れ、青色（473 nm）および赤色（635 nm）レーザー刺激を5秒間ランダムに与えた。動物は、青色光刺激中に舐めると水報酬を受け取り、赤色光刺激中に舐めなかった。訓練初日には、動物は青色または赤色光で刺激されたときに舐める行動に違いは見られなかった。しかし、15日目には、hChR2-EYFP発現hCOを移植された動物は、赤色光刺激と比較して青色光刺激時により活発に舐める行動を示した。舐める行動におけるこれらの変化は、コントロール蛍光体を発現している hCO を移植されたコントロール動物では観察されませんでした (学習成功率: hChR2 89%、EYFP 0%、図 5i-1 および補足ビデオ 2)。これらのデータは、t-hCO 細胞がラットのニューロンを活性化して報酬探索行動を刺激できることを示唆しています。どのラット t-hCO 神経回路がこれらの行動変化に関与しているかを調べるために、訓練された動物の t-hCO を光遺伝学的に活性化し、90 分後に組織を採取しました。免疫組織化学染色により、内側前頭前皮質、内側視床、中脳水道周囲灰白質など、動機づけ行動に関与するいくつかの脳領域で、活動依存性 FOS タンパク質の発現が明らかになりました。このタンパク質は、刺激を受けていないコントロール動物または動物 (rice. 5m) で発現していました。総合すると、これらのデータは、t-hCO がラットのニューロン活動を調節して行動を促進できることを示唆しています。
神経オルガノイドは、ヒトの発達と疾患をin vitroで研究するための有望なシステムですが、in vivoに存在する神経回路間の接続が欠如しているという制約があります。私たちは、免疫不全の生後早期ラットのS1細胞にhCOを移植し、in vivoでのヒト細胞の発達と機能を研究する新たなプラットフォームを開発しました。t-hCOがin vitroでは観察されない成熟細胞種を発達させ、t-hCOがげっ歯類の脳に解剖学的かつ機能的に統合されていることを示しました。t-hCOをげっ歯類の神経回路に統合することで、ヒトの細胞活動と研究対象の動物行動との関連を確立することができ、t-hCOニューロンがラットの神経活動を調節して行動反応を促進できることを示しました。
我々が開発したプラットフォームは、げっ歯類の脳へのヒト細胞移植に関するこれまでの研究に比べて、いくつかの利点があります。第一に、生後早期のラットの発達中の大脳皮質にhCOを移植することで、解剖学的および機能的な統合を促進できる可能性があります。第二に、t-hCO MRIモニタリングにより、生きた動物における移植片の位置と成長を研究することができ、長期にわたる多動物研究を実施し、複数のhiPS細胞株の信頼性を確立することができました。最後に、単離された単一細胞懸濁液ではなく、完全なオルガノイドを移植することで、ヒト細胞へのダメージが少なく、ラット脳におけるヒト大脳皮質ニューロンの統合と分化を促進できます。
このプラットフォームは進歩しているものの、時間的、空間的、種間の制約により、発達の初期段階で移植した後でも、高い忠実度でヒトの神経回路を形成することはできないことを私たちは認識しています。たとえば、t-hCO で観察される自発的な活動が、皮質発達中に観察される律動的な活動に類似した発達表現型を表すのか、それとも t-hCO には抑制性の細胞タイプが存在しないことが原因なのかは明らかではありません。同様に、t-hCO のラミネーションの欠如が鎖の連結性にどの程度影響するかも明らかではありません30。今後の研究では、ヒトミクログリア、ヒト内皮細胞、in vitro アセンブリ 6 を使用して示されるようにさまざまな割合の GABA 作動性介在ニューロンなど、他の細胞タイプを統合すること、および患者から採取した細胞で変化した t-hCO で神経統合と処理がどのように起こるかを理解することに焦点を当てます。転写、シナプス、行動レベル。
全体として、このin vivoプラットフォームは、in vitroヒト脳発達研究および疾患研究を補完する強力なリソースとなります。このプラットフォームにより、これまで発見が難しかった患者由来細胞において、新たなストランドレベルの表現型を発見し、新たな治療戦略を検証できるようになると期待しています。
既報の通り、HiPS細胞からhCO2.5を生成した。フィーダー細胞上で培養したhiPS細胞からhCO2.5を産生させるため、ディスパーゼ（0.35 mg/mL）を用いてhiPS細胞の無傷コロニーを培養皿から剥離し、hiPS細胞培養培地（Corning）を添加した超低接着プラスチック培養皿に移した。培地には、2種類のSMAD阻害剤であるドルソモルヒネ（5 μM; P5499, Sigma-Aldrich）とSB-431542（10 μM; 1614, Tocris）およびROCK阻害剤Y-27632（10 μM; S1049, Selleckchem）を添加した。最初の5日間は、hiPS細胞培地を毎日交換し、ドルソモルヒネとSB-431542を添加した。 懸濁後 6 日目に、神経スフェロイドを、ニューロベーサル A (10888、Life Technologies)、ビタミン A を含まない B-27 サプリメント (12587、Life Technologies)、GlutaMax (1:100、Life Technologies)、ペニシリンおよびストレプトマイシン (1:100、Life Technologies) を含む神経培地に移し、24 日目まで上皮成長因子 (EGF、20 ng ml−1、R&D Systems) および線維芽細胞成長因子 2 (FGF2、20 ng ml−1、R&D Systems) を補充しました。25 日目から 42 日目までは、脳由来神経栄養因子 (BDNF、20 ng ml−1、Peprotech) およびニューロトロフィン 3 (NT3、20 ng ml−1、Peprotech) を培地に補充し、1 日おきに培地を交換しました。 懸濁後 6 日目に、神経スフェロイドを、ニューロベーサル A (10888、Life Technologies)、ビタミン A を含まない B-27 サプリメント (12587、Life Technologies)、GlutaMax (1:100、Life Technologies)、ペニシリンおよびストレプトマイシン (1:100、Life Technologies) を含む神経培地に移し、24 日目まで上皮成長因子 (EGF、20 ng ml−1、R&D Systems) および線維芽細胞成長因子 2 (FGF2、20 ng ml−1、R&D Systems) を補充しました。25 日目から 42 日目までは、脳由来神経栄養因子 (BDNF、20 ng ml−1、Peprotech) およびニューロトロフィン 3 (NT3、20 ng ml−1、Peprotech) を培地に補充し、1 日おきに培地を交換しました。懸濁後 6 日目に、神経スフェロイドを Neurobasal-A (10888、Life Technologies)、ビタミン A を含まない B-27 サプリメント (12587、Life Technologies)、GlutaMax (1:100、Life Technologies)、ペニシリンを含む神経培地に移しました。и стрептомицин (1:100, Life Technologies) и дополнены эпидермальным фактором роста (EGF; 20 нг/мл; R&D Systems) и фактором роста 2 (FGF2; 20 日/月; R&D Systems) 日 24 日。 およびストレプトマイシン（1:100、Life Technologies）を添加し、24日目まで上皮成長因子（EGF、20 ng/ml、R&D Systems）および線維芽細胞成長因子2（FGF2、20 ng/ml、R&D Systems）を補充した。25 日目から 42 日目まで、脳由来神経栄養因子 (BDNF; 20 ng ml-1、Peprotech) と神経栄養因子 3 (NT3; 20 ng ml-1、Peprotech) を培地に加え、1 日おきに培地を交換しました。浮遊の第6天で、神经球体を神経基底Aを含む（10888、Life Technologies）、生素Aを含まないB-27補填剤（12587、Life Technologies）、GlutaMax（1:100、Life）に移しました。 Technologies）、青霉素の神经培地中和青霉素（1:100、Life Technologies）、および表皮増殖因子（EGF; 20 ng ml-1; R&D Systems）および成型細胞増殖因子 2（FGF2; 20 ng ml-1; R&D Systems）を第 24 回まで使用天。浮遊の第6天では、神経基底核-aを含む（10888、Life Technologies）、生素aを含まないb-27補填剤（12587、Life Technologies）、グルタマックス（1:100、Life TechNOGIS青霉素）が含まれている。表皮増殖因子（（（20 ng ml-1; r&d Systems））を24日目まで神経過中培地中靱素（（1:100、Life Technologies））で培養した。 На 6-й день суспензии нейросферы были переведены на добавку, содержащую нейробазал-А (10888, Life Technologies), добавку В-27 без витамина А (12587、Life Technologies)、GlutaMax (1:100、Life Technologies)、пенициллин- нейтрализованный стрептомицин (1:100、Life Technologies) с добавлением эпидермального фактора роста (EGF; 20 нгмл-1; R&D Systems) および фактора роста фибробластов 2 (FGF2; 20 нгмл-1) 1; 6 日目に、ニューロスフェア懸濁液を、ニューロベーサル A (10888、Life Technologies)、ビタミン A を含まない B-27 サプリメント (12587、Life Technologies)、GlutaMax (1:100、Life Technologies)、ペニシリン中和ストレプトマイシン (1:100、Life Technologies) に上皮成長因子 (EGF、20 ng ml-1、R&D Systems) および線維芽細胞成長因子 2 (FGF2、20 ng ml-1) を添加したサプリメントに切り替えました。 R&D システム) 日 24 日。 R&D Systems は 24 日目まで営業します。25日目から42日目まで、脳由来神経栄養因子（BDNF; 20 ng ml-1、ペプロテック）と神経栄養因子3（NT3; 20 ng ml-1、ペプロテック）を1日おきに培養培地に添加しました。培地交換は1回です。43日目から、hCOは無添加のニューロベーサルA培地（NM; 1088022, Thermo Fisher）で維持し、4～6日ごとに培地交換を行った。フィーダーレス培養したhiPS細胞からhCOを得るため、hiPS細胞をAccutase（AT-104, Innovate Cell Technologies）と共に37℃で7分間インキュベートし、単一細胞に分散させた後、ROCK阻害剤Y-27632（10 μM; S1049, Selleckchem）を添加したEssential 8培地を用いて、AggreWell 800プレート（34815, STEMCELL Technologies）にウェルあたり3 × 106個の単一細胞密度で播種した。 24時間後、ウェル内の培地を、ドルソモルフィン（2.5 μM；P5499、Sigma-Aldrich）およびSB-431542（10 μM；1614、Tocrida）を添加したEssential 6培地（A1516401、Life Technologies）を含む培地にピペットで移し替えた。2日目から6日目までは、Essential 6培地をドルソモルフィンおよびSB-431542添加培地に毎日交換した。6日目からは、ニューロスフェア懸濁液をニューロベーサル培地に移し、上記のように維持した。
すべての動物実験は、スタンフォード大学実験動物管理委員会（APLAC）が承認した動物飼育ガイドラインに従って実施しました。妊娠した胸腺正常RNU（rnu/+）ラットはCharles River Laboratoriesから購入または飼育しました。動物は12時間の明暗サイクルで飼育し、餌と水は自由に摂取させました。生後3～7日のヌード（FOXN1–/–）ラットの仔は、淘汰前に未熟なひげの成長により識別しました。仔ラット（雄および雌）は2～3%イソフルランで麻酔し、定位固定フレームに配置しました。硬膜の完全性を維持しながら、S1の上部約2～3 mmの直径で頭蓋骨の穿孔を行いました。次に、開頭のすぐ外側から30-G針（約0.3 mm）を使用して硬膜を穿孔しました。次に、HCO を薄い 3×3 cm のパラフィルムに塗布し、余分な培地を取り除きます。23 G、45° 針を取り付けたハミルトン シリンジを使用して、針の最遠位端に hCO を静かに吸い込みます。次に、立体定位装置に接続されたシリンジ ポンプにシリンジを取り付けます。次に、硬膜 (z = 0 mm) にあらかじめ開けた 0.3 mm 幅の穿刺穴に針の先端を当て、針が硬膜 A の間に入り、密なシールが形成されるまで、シリンジを 1～2 mm (z = 約 -1.5 mm) 狭めます。次に、z = -0.5 mm の皮質表面の中心までシリンジを上げ、毎分 1～2 µl の速度で hCO を注入します。hCO の注入が完了したら、針を毎分 0.2～0.5 mm の速度で引き抜き、皮膚を縫合し、子犬をすぐに温かい加熱パッドの上に置いて完全に回復するまで待ちます。一部の動物では両側移植が行われました。
すべての動物実験は、スタンフォード大学APLAC承認の動物飼育ガイドラインに従って実施しました。ラット（移植後60日以上経過）は5%イソフルラン麻酔で導入し、撮影中は1～3%イソフルランで麻酔しました。画像化には、International Electric Company（IECO）製グラジエントドライブと内径120 mm（600 mT/m、1000 T/m/s）のシールド付きグラジエントインサートを備えた7テスラのアクティブシールド型水平ボアホールスキャナBruker（Bruker Corp.）を使用し、AVANCE. III、8チャンネルマルチコイルRFおよびマルチコア機能、および付属のParavision 6.0.1プラットフォームを使用しました。記録は、内径86 mmのアクティブデカップリング型容積型RFコイルと、受信専用の4チャンネルクライオ冷却RFコイルを使用して実施しました。軸方向 2D Turbo-RARE (繰り返し時間 = 2500 ms、エコー時間 = 33 ms、平均 2 回)、スライスキャプチャ 16 回、スライス厚 0.6～0.8 mm、256 × 256 サンプルを含む。信号は、内径 2 cm の直交トランシーバー容積測定 RF コイル (Rapid MR International, LLC) を使用して受信されました。最後に、組み込みの Imaris (BitPlane) 表面推定機能を使用して、3D レンダリングと容積分析を行いました。移植の成功は、移植半球に連続した T2 強調 MRI 信号領域が形成されたものと定義しました。移植片拒絶は、移植半球に連続した T2 強調 MRI 信号領域が生成されなかった移植片と定義しました。皮質下 t-hCO は、以降の分析から除外しました。
二光子カルシウムイメージングのためにhCO中でGCaMP6sを安定発現させるため、hiPS細胞にpLV[Exp]-EF1a::GcaMP6s-WPRE-Puroを感染させ、抗生物質を選択した。簡単に説明すると、細胞をEDTAで解離し、ポリブレン（5 μg/ml）およびウイルス15 μl存在下で、約300,000個の細胞密度でEssential 8培地1 mlに懸濁した。その後、細胞を懸濁液中で60分間インキュベートし、1ウェルあたり50,000個の細胞密度で播種した。細胞がコンフルエントになった後、細胞を5～10 μg/mlのピューロマイシンで5～10日間、または安定したコロニーが形成されるまで処理した。急性hCO感染は、以前報告した方法5に若干の改変を加えて実施した。簡単に説明すると、30～45日目のhCOを、100 µlの神経培地が入った1.5 mlエッペンドルフマイクロ遠心チューブに移します。次に、培地を約90 µl除去し、高力価レンチウイルス（0.5 x 108～1.2 x 109）3～6 µlをチューブに加え、hCOをインキュベーターに移して30分間培養します。その後、各チューブに培地を90～100 µl加え、チューブをインキュベーターに戻して一晩培養します。翌日、hCOを低接着プレート内の新鮮な神経培地に移します。7日後、hCOを24ウェルガラス底プレートに移し、感染品質の可視化と評価を行いました。pLV[Exp]-SYN1::EYFP-WPREおよびpLV[Exp]-SYN1::hChR2-EYFP-WPREはVectorBuilderで生成しました。レンチウイルスは宿主ゲノムに組み込まれ、感染細胞株でレポーター遺伝子の発現を可能にするため、ほとんどの実験で使用されています。狂犬病の追跡調査では、30～45日目にhCOをrabies-ΔG-eGFPとAAV-DJ-EF1a-CVS-G-WPRE-pGHpA（プラスミド番号67528、Addgene）で共感染させ、3日間十分に洗浄した後、ラットのS1期に移植し、7～14日間in vivoで維持しました。
免疫細胞化学では、動物を麻酔し、PBS で経心的に灌流した後、4% パラホルムアルデヒド（PBS 中の PFA、Electron Microscopy Sciences）で灌流しました。脳を 4% PFA で 2 時間または一晩 4°C で固定し、30% ショ糖を含む PBS で 48～72 時間凍結保存し、1:1、30% ショ糖: OCT（Tissue-Tek OCT Compound 4583、Sakura Finetek）に包埋し、クライオスタット（Leica）を使用して 30 µm の冠状切片を作製しました。厚切片の免疫組織化学では、動物を PBS で灌流し、ビブラトーム（Leica）を使用して脳を解剖し、300～400 µm の冠状切片を作成し、切片を 4% PFA で 30 分間固定しました。次に、凍結切片または厚切片を PBS で洗浄し、室温で 1 時間ブロックし (PBS で希釈した 10% 正常ロバ血清 (NDS) と 0.3% トリトン X-100)、4°C でブロッキング溶液でブロックしました。 – インキュベーション 凍結切片は一晩インキュベートし、厚切片は 5 日間インキュベートしました。 使用した一次抗体は以下のとおりです: 抗NeuN (マウス、1:500; ab104224、abcam)、抗CTIP2 (ラット、1:300; ab18465、abcam)、抗GFAP (ウサギ、1:1,000; Z0334、Dako)、抗GFP (ニワトリ、1:1,000; GTX13970、GeneTex)、抗HNA (マウス、1:200; ab191181、abcam)、抗NeuN (ウサギ、1:500; ABN78、Millipore)、抗PDGFRA (ウサギ、1:200; sc-338、Santa Cruz)、抗PPP1R17 (ウサギ、1:200; HPA047819、Atlas Antibodies)、抗RECA-1 (マウス、1:50; ab9774、abcam)、抗SCG2 (ウサギ、1:100; 20357-1-AP、Proteintech)、抗SOX9 (ヤギ、1:500; AF3075、R&D Systems)、Netrin G1a (ヤギ、1:100; AF1166、R&D Systems)、抗STEM121 (マウス、1:200; Y40410、Takara Bio)、抗SATB2 (マウス、1:50; ab51502、abcam)、抗GAD65/67 (ウサギ、1:400; ABN904、Millipore) および抗IBA1 (ヤギ、1:100; ab5076、abcam)。 使用した一次抗体は以下のとおりです: 抗NeuN (マウス、1:500; ab104224、abcam)、抗CTIP2 (ラット、1:300; ab18465、abcam)、抗GFAP (ウサギ、1:1,000; Z0334、Dako)、抗GFP (ニワトリ、1:1,000; GTX13970、GeneTex)、抗HNA (マウス、1:200; ab191181、abcam)、抗NeuN (ウサギ、1:500; ABN78、Millipore)、抗PDGFRA (ウサギ、1:200; sc-338、Santa Cruz)、抗PPP1R17 (ウサギ、1:200; HPA047819、Atlas Antibodies)、抗RECA-1 (マウス、1:50; ab9774、abcam)、抗SCG2 (ウサギ、1:100; 20357-1-AP、Proteintech)、抗SOX9 (ヤギ、1:500; AF3075、R&D Systems)、Netrin G1a (ヤギ、1:100; AF1166、R&D Systems)、抗STEM121 (マウス、1:200; Y40410、Takara Bio)、抗SATB2 (マウス、1:50; ab51502、abcam)、抗GAD65/67 (ウサギ、1:400; ABN904、Millipore) および抗IBA1 (ヤギ、1:100; ab5076、abcam)。 Использовались следующие первичные антитела: анти-NeuN (мысиные、1:500; ab104224、abcam)、анти-CTIP2 (крысиные、1:300; abcam) ab18465、abcam)、анти-GFAP (кроличьи、1:1000; Z0334、Dako)、анти--GFP (курица、1:1000; GTX13970、GeneTex)、анти-HNA (мыличьи、1:200; Z0334、Dako) ab191181、abcam)、анти-NeuN (кролик、1:500; ABN78、Millipore)、анти-PDGFRA (кролик、1:200; sc-338、Санта-Круз)、анти-PPP1R17 (кролик、1:200; HPA047819、Atlas Antibodies)、 анти-RECA-1 (колик、1:50; ab9774、abcam)、анти-SCG2 (кролик、1:100; 20357-1-AP、Proteintech)、анти-SOX9 (козий、1:500; AF3075、R&D Systems)、 нетрин G1a (козий、1:100; AF1166、R&D Systems)、анти-STEM121 (мызиный、1:200; Y40410、タカラバイオ)、анти-SATB2 (мысь、1:50; ab51502、abcam)、анти-GAD65/67 (кролик、1:400; Y40410、タカラバイオ) ABN904、Millipore) および анти-IBA1 (коза、1:100; аб5076、абкам)。 使用した一次抗体は以下の通りである：抗NeuN（マウス、1:500; ab104224、abcam）、抗CTIP2（ラット、1:300; ab18465、abcam）、抗GFAP（ウサギ、1:1000; Z0334、Dako）、抗GFP（ニワトリ、1:1000; GTX13970、GeneTex）、抗HNA（マウス、1:200; ab191181、abcam）、抗NeuN（ウサギ、1:500; ABN78、Millipore）、抗PDGFRA（ウサギ、1:200; sc-338、Santa Cruz）、抗PPP1R17（ウサギ、1:200; HPA047819、Atlas Antibodies）、抗RECA-1（マウス、抗SCG2（ウサギ、1:100; ab9774、abcam）、抗SOX9（ヤギ、1:500; AF3075、R&D Systems）、ネトリンG1a（ヤギ、1:100; AF1166、R&D Systems）、抗STEM121（マウス、1:200; Y40410、Takara Bio）、抗SATB2（マウス、1:50; ab51502、abcam）、抗GAD65/67（ウサギ、1:400; ABN904、Millipore）および抗IBA1（ヤギ、1:100; ab5076、abkam）。使用した抗は：抗NeuN（小マウス、1:500；ab104224、abcam）抗CTIP2（大マウス、1:300；ab18465、abcam）、抗GFAP（兔、1:1,000；Z0334、Dako）、抗GF P（鸡，1:1,000；GTX13970，GeneTex）、抗HNA（ネズミ、1:200；ab191181、abcam）、抗NeuN（兔、1:500；ABN78、Millipore）、抗PDGFRA（兔、 1:200；sc-338、サンタクルーズ）、抗PPP1R17（兔、1:200；HPA047819、アトラス） 抗体）、抗RECA-1（ネズミ、1:50；ab9774、abcam）、抗SCG2（兔） 、1:100；20357-1-AP、プロテインテック）、抗SOX9（山羊、1:500；AF3075、R&D Systems）、Netrin G1a（山羊、1:100；AF1166、R&Dシステム）、抗STEM121（ネズミ、1:200;使用した抗は：抗NeuN（小マウス、1:500；ab104224、abcam）抗CTIP2（大マウス、1:300；ab18465、abcam）、抗GFAP（兔、1:1,000；Z0334、Dako）、抗-GFP（鸡，1:1,000；GTX13970，GeneTex）、抗HNA（ネズミ、1:200；ab191181、abcam）、抗NeuN（兔、1:500；ABN78、ミリポア％弔、抗1: 200；sc-338、サンタクルーズ）、抗PPP1R17（兔、1:200；HPA047819、アトラス） 抗体）、抗RECA-1（ネズミ、1:50；ab9774、abcam）、抗SCG2 100；20357-1-AP、プロテインテック）、抗SOX9（山羊、1:500；AF3075、R&D Systems）、Netrin G1a（山羊、1:100；AF1166、R&D Systems）頏1:20、 ;Y40410、タカラバイオ）、抗SATB2（マウス、1:50；ab51502、abcam）、抗GAD65/67（ウサギ、1:400；ABN904、ミリポア）および抗IBA1（ヤギ、1:100；ab5076、abcam）。使用した一次抗体は、抗NeuN（マウス、1:500; ab104224、abcam）、抗CTIP2（ラット、1:300; ab18465、abcam）、抗GFAP（ウサギ、1:1000; Z0334、Dako）でした。 、抗GFP（ニワトリ、1:1000; GTX13970、GeneTex）、抗HNA（マウス、1:200; ab191181、abcam）、抗NeuN（ウサギ、1:500; ABN78、Millipore）、抗PDGFRA（ウサギ、1:200; sc-338、Santa Cruz）、抗PPP1R17（ウサギ、1:200; HPA047819、Atlas抗体）、抗RECA-1（マウス、1:50; ab9774、abcam）、抗SCG2（ウサギ）、1:100。20357-1-AP、プロテインテック）、-SOX9 (カ、1:500; AF3075、R&D Systems)、Нетрин G1a (カ、1:100; AF1166、R&D Systems)、-STEM121 (カ、1:200; AF3075、R&D Systems) Y40410、タカラバイオ)、анти-SATB2 (мылик、1:50; ab51502、abcam)、анти-GAD65/67 (кролик、1:400; ABN904、Millipore)、анти-IBA1 (коза、1:100; аб5076、ああ）。 抗SOX9（ヤギ、1:500; AF3075、R&D Systems）、Netrin G1a（ヤギ、1:100; AF1166、R&D Systems）、抗STEM121（マウス、1:200; Y40410、Takara Bio）、抗SATB2（マウス、1:50; ab51502、abcam）、抗GAD65/67（ウサギ、1:400; ABN904、Millipore）、および抗IBA1（ヤギ、1:100; ab5076、abkam）。切片はその後 PBS で洗浄し、二次抗体とともに室温で 1 時間 (凍結切片)、または 4°C で一晩 (厚切片) インキュベートしました。ブロッキング溶液で 1:1000 に希釈した Alexa Fluor 二次抗体 (Life Technologies) を使用しました。PBS で洗浄した後、核を Hoechst 33258 (Life Technologies) で視覚化しました。最後に、スライドを Aquamount (Polysciences) を用いてカバーガラス付きの顕微鏡 (Fisher Scientific) に置き、Keyence 蛍光顕微鏡 (BZ-X analyzer) または Leica TCS SP8 共焦点顕微鏡 (Las-X) で画像解析しました。画像は ImageJ プログラム (Fiji) を使用して処理しました。t-hCO およびラット皮質におけるヒトニューロンの割合を定量化するために、t-hCO の中心、ラット皮質の端またはその近くで幅 387.5 μm の長方形の画像を撮影しました。移植マージンは、組織の透明度、HNA+核、および／または組織の自己蛍光の有無の変化を評価することで決定しました。各画像において、NeuN+細胞とHNA+細胞の総数を、同じ領域内のNeuN+細胞の総数で割りました。画像面内に核を持つ細胞のみをカウントするため、Hoechst+細胞も含む細胞のみを計算に含めました。統計誤差を低減するため、1 mm以上離れた2枚の画像を平均化しました。
サンプル採取の1週間前、hCO移植動物（分化後約8ヶ月）を暗室に置き、感覚刺激を最小限に抑えるためヒゲをトリミングする。核の単離は、前報と同様に行ったが、一部改変を加えた。t-hCOおよびhCOは、界面活性剤を用いた機械的細胞溶解法と2 mLガラス組織グラインダー（D8938、Sigma-Aldrich/KIMBLE）を用いて破壊した。粗核は40 µmフィルターを用いてろ過し、4 °C、320 gで10分間遠心分離した後、ショ糖密度勾配遠心を行った。遠心分離（320 g、4℃で20分間）後、サンプルを0.04% BSA/PBSに再懸濁し、0.2単位/μLのRNase阻害剤（40 u/μL、AM2682、Ambion）を添加し、40 µmフローフィルターでろ過した。解離した核は0.02% BSAを含むPBSに再懸濁し、Chromium Single Cell 3′チップにロードした（レーンあたり推定8,000個の細胞を回収）。 snRNA-seq ライブラリは、Chromium Single cell 3′ GEM、Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics) を使用して準備されました。 snRNA-seq ライブラリは、Chromium Single cell 3′ GEM、Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics) を使用して準備されました。 snRNA-seq は、クロム単細胞 3 ' GEM、ライブラリー & ゲル ビーズ キット v3 (10x ゲノミクス) を提供します。 snRNA-seq ライブラリは、Chromium Single cell 3′ GEM、Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics) を使用して準備されました。 snRNA-seq ドキュメントは、Chromium Single cell 3' GEM、Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics) を使用して作成されました。 snRNA-seq ドキュメントは、Chromium Single cell 3' GEM、Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics) を使用して作成されました。 snRNA-seq を入手するには、クロム単細胞 3 ' GEM、ライブラリおよびゲル ビーズ キット v3 (10x ゲノミクス) を使用します。 snRNA-seq ライブラリは、Chromium Single Cell 3′ GEM、Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics) を使用して準備されました。さまざまなサンプルからのライブラリがプールされ、Admera Health によって NovaSeq S4 (Illumina) でシーケンスされました。
10x Genomics CellRanger解析ソフトウェアパッケージ（バージョン6.1.2）を用いて、各推定核バーコードの遺伝子発現レベルを定量化した。具体的には、mkrefコマンドを用いて作成したヒト（GRCh38、Ensemble、バージョン98）およびラット（Rnor_6.0、Ensemble、バージョン100）の参照ゲノムとリードを照合し、イントロン領域にマッピングされたリードを含むように、countコマンドに–include-introns=TRUEコマンドを指定して定量化した。t-hCOサンプルについては、マッピングされたリードの少なくとも95%がヒトゲノムと一致するという保守的な要件に基づいてヒト核を同定した。以降の解析は、CellRangerからフィルタリングされたバーコードアレイ出力に対して、Rパッケージ（バージョン4.1.2）およびSeurat（バージョン4.1.1）32を用いて実施した。
高品質な核のみが後続の解析に含まれるように、各サンプルに対して反復フィルタリング処理を実施しました。まず、1000個未満の固有遺伝子が見つかり、ミトコンドリア総数の20%を超える低品質の核を特定し、除去します。その後、生の遺伝子数マトリックスは、sctransform(vst.flavor=”v2″)関数を用いた正則化負二項回帰によって正規化され、デフォルトパラメータを用いて最も変動の大きい3000個の遺伝子も特定されました。変動の大きい遺伝子については、データセット次元を30（膝部位の目視検査に基づいて次元数30を選択し、すべてのサンプルおよびアンサンブル解析に使用）とし、デフォルトパラメータを用いた主成分分析（PCA）を用いて次元削減を行いました。次に、反復クラスタリング（解像度1）を複数回実施し、異常に低い遺伝子数（中央値が10パーセンタイル未満）および異常に高いミトコンドリア遺伝子数（中央値が95パーセンタイル以上）に基づいて遺伝子を分類し、低品質の推定細胞を特定して除去しました。また、DoubletFinder33パッケージを用いて特定されたクラスターおよび/または疑わしい双子の割合が高いこと（平均DoubletFinderスコアが95パーセンタイル以上）も特定しました。t-hCOサンプル(n=3) および hCO サンプル (n=3) は、IntegrateData 関数を用いて上記のパラメータで個別に積分されました。その後、積分されたデータセットに対して、前述のように定性的なフィルタリングを再度実行しました。
低品質のカーネルを除去した後、統合データセットをグループ化し（解像度 = 0.5）、UMAP34 で視覚化できるように埋め込みました。各クラスターのマーカー遺伝子は、正規化された遺伝子発現データから計算されたデフォルトのパラメータを使用して FindMarkers 関数で決定しました。胎児および成人の皮質参照データセットをマーカー遺伝子発現 19,20,21,35 および注釈と組み合わせることで、主要な細胞クラスを特定して分類します。特に、循環前駆細胞は MKI67 および TOP2A の発現によって特定されました。前駆細胞クラスターは、有糸分裂転写がないこと、後期中期胎児皮質で説明される多能性グリア前駆細胞クラスターとの高い重複、および EGFR および OLIG1 の発現によって定義されました。「アストロサイト」という用語は、後期放射状グリアからアストロサイトの成熟まで、アストロサイトの分化のいくつかの状態を包括するために使用します。アストロサイトクラスターはSLC1A3およびAQP4を高レベルで発現しており、胎児放射状グリアおよび/または成体アストロサイトのサブタイプにマッピングされることが示されています。OPCはPDGFRAおよびSOX10を発現し、オリゴデンドロサイトは髄鞘形成マーカー（MOGおよびMYRF）を発現します。グルタミン酸作動性ニューロンは、ニューロン転写産物（SYT1およびSNAP25）の存在、GABA作動性マーカー（GAD2）の欠如、およびNEUROD6、SLC17A7、BCL11B、またはSATB2の発現によって識別されました。GluNニューロンはさらに、上位サブクラス（SATB2発現およびBCL11Bの消失）と深層サブクラス（BCL11B発現）に分類されました。推定サブプレート（SP）ニューロンは、深層GluNマーカーに加えて、ST18やSORCS1などの既知のSP18マーカーを発現します。脈絡叢様細胞はTTR発現によって識別され、髄膜様細胞は線維芽細胞関連遺伝子を発現し、参照データセットの軟膜/血管細胞をマッピングしました。
t-hCOおよびhCOサブクラス間の遺伝子発現の差分解析は、Libra Rパッケージ（バージョン1.0.0）を使用して実装されたサンプルで再現された、新たに開発された疑似バッチ法を使用して実施されました。具体的には、各サンプル複製について、特定の細胞クラスの細胞内の遺伝子数を合計することにより、グループに対してedgeR対数尤度検定（バージョン3.36.0、パッケージR）を実施しました。ヒートマップの視覚化では、正規化された百万分率（CPM）値がedgeR（cpm()関数）を使用して計算され、スケーリングされました（平均= 0、標準偏差= 1を達成するように）。有意にアップレギュレーションされたt-hCO GluN遺伝子の遺伝子オントロジー（GO）エンリッチメント解析を実施しました（Benjamini-Hochberg補正P値が0.05未満で、t-hCO GluN細胞の少なくとも10％で発現し、変化の倍数が少なくとも2倍増加）。 ToppGene Suite (https://toppgene.cchmc.org/)37を用いて実施しました。ToppFunアプリをデフォルトパラメータで使用し、GOアノテーション付き超幾何検定から算出したBenjamini-Hochberg補正P値を報告します。
snRNA-seqクラスターを、一次シングルセルRNA-seqまたは成人snRNA-seq19,20,21,22の参照研究から得られた注釈付き細胞クラスターと一致させるために、ペアデータセット統合アプローチを適用しました。データセット間のクラスターの重複を統合・比較するために、SeuratのSCTransform（v2）正規化ワークフローを使用しました（上記と同じパラメータを使用）。計算効率を高めるため、個々のデータセットは、元のクラスターあたり最大500個の細胞またはコアまでランダムにサブセット化されました。前述のアプローチと同様のアプローチを使用して、クラスターの重複は、参照クラスターのラベルと重複する各プールされたクラスター内の細胞または核の割合として定義されました。GluNをさらに分類するために、SeuratのGluNサブセットデータ用TransferDataワークフローを使用して、参照データセットのラベルをGluN細胞に割り当てました。
t-hCOおよびhCOサンプルの全体的トランスクリプトームの成熟状態を評価するため、疑似バルクサンプルを、ヒト脳の発達過程を網羅する大規模RNA配列からなるBrainSpan/psychENCODE23と比較しました。受胎後10週目以降の皮質サンプルから得られたパターン正規化遺伝子発現マトリックスを組み合わせ、PCAを実施しました。これらの遺伝子は、BrainSpan皮質サンプルにおいて活性と特定されていた5567個の遺伝子（本研究のデータと併せて）を対象としています（3次モデルを用いて年齢による発達変動を説明できる場合、50%を超えると定義）38。さらに、前述のように非負値行列因子分解を用いて、神経発達の主要なトランスクリプトームシグネチャーに関連する遺伝子を導出しました。非負値行列因子分解法を用いて算出されたサンプル重みは、Zhuら38によって記載された5つのシグネチャーそれぞれの拡張データとともに、図5bにプロットされています。ここでも、活性依存転写マーカーは、以前に発表された研究から導出されました。特に、ERGとLRGは、補足表3のHrvatin et al.16による視覚刺激後のマウス視覚皮質snRNA-seqコレクションで同定されたグルタミン酸作動性ニューロンにおいて有意に上昇していた。ヒト由来のLRGは、KCl活性化ヒト胎児脳培養から得られ、刺激後6時間で回収された。フィルタリングされた遺伝子はヒトでは有意に上昇していたが、げっ歯類では上昇していなかった（補足表4）。これらの遺伝子セットを用いた遺伝子セットエンリッチメントの解析は、一元配置Fisherの正確検定を用いて行われた。
ラットをイソフルランで麻酔し、脳を摘出し、冷（約4℃）酸素化（95% O2および5% CO2）ショ糖溶液に浸し、切片を作成する。切片の成分は、ショ糖234 mM、グルコース11 mM、NaHCO3 26 mM、KCl 2.5 mM、NaH2PO4 1.25 mM、MgSO4 10 mM、CaCl2 0.5 mM（約310 mOsm）である。t-hCOを含むラット脳冠状切片（300～400 µm）は、以前報告した39と同様に、ライカVT1200ビブラトームを用いて作製した。その後、切片は、10 mMグルコース、26 mM NaHCO3、2.5 mM KCl、1.25 mM NaHPO4、1 mM MgSO4、2 mM CaCl2、および126 mM NaCl（298 mOsm）から調製したaCSFを含む、室温で連続的に酸素供給可能な切片作製チャンバーに移され、記録の少なくとも45分前に浸漬されました。切片は、aCSF（95% O2および5% CO2バイアル）で連続的に灌流された浸漬チャンバー内で記録されました。すべてのデータは室温で記録されました。 t-hCOニューロンは、127 mMグルコン酸カリウム、8 mM NaCl、4 mMマグネシウムATP、0.3 mM GTPナトリウム、10 mM HEPES、0.6 mM EGTA（pH 7.2）を含む溶液を満たしたホウケイ酸ガラスピペットで終結させた。内部溶液はKOH（290 mOsm）で調整した。回復させるために、記録溶液にビオシチン（0.2%）を添加した。
データは、MultiClamp 700Bアンプ（Molecular Devices社）とDigidata 1550Bデジタイザー（Molecular Devices社）を用いて取得し、2 kHzでローパスフィルタ処理した後、20 kHzでデジタル化し、Clampfit（Molecular Devices社）、Origin（OriginPro、2021b、OriginLab）、およびカスタムMATLAB関数（Mathworks社）を用いて解析しました。接合電位はJPCalcを用いて計算し、入力値は計算値-14 mVに合わせて調整しました。操作IVは、-250 pAから750 pAまで、10～25 pAステップの一連の電流ステップで構成されています。
既報と同様に、hCOニューロンのパッチクランプ記録中に、視床皮質スライスにおいて視床、白質、およびS1求心性神経を電気刺激した。簡単に説明すると、脳を10°傾斜させた3Dプリント台に置き、脳の前部を35°の角度で切断した。次に、脳を切断面に接着し、視床皮質から突出する軸索を保存しながら薄切した。双極タングステン電極（0.5 MΩ）を2台目のマイクロマニピュレーターに取り付け、細胞ごとに4つの領域（内包、白質、S1、hCO）を刺激するように戦略的に配置した。0.03～0.1 Hzで300 µAの位相刺激を与えた後、シナプス応答を記録した。
hChR2発現hCOニューロンを480 nmで活性化し、LED（Prizmatix）で発生した光パルスを×40対物レンズ（0.9 NA、オリンパス）を通して照射し、細胞近傍のhChR2発現を記録した。照射野の直径は約0.5 mmで、総出力は10～20 mWである。パルス幅は、行動学習実験中に与えられたパルスに対応する10 msに設定した。1～20 Hzの様々な刺激周波数を使用したが、定量化には最初のパルスのみを使用した。シナプス抑制経路または促進経路への影響を最小限に抑えるため、トレイン間の間隔は通常30秒以上である。hChR2応答が単シナプス性であるかどうかを試験するために、EPSC反応が消失するまで浴槽にTTX（1 μM）を添加し、その後4-アミノピリジン（4-AP、100 μM）を添加した。通常、数分以内に反応が返されますが、LEDの点灯とEPSCの生成の間には若干の遅延があります。この反応がAMPA受容体によって引き起こされるかどうかをテストするために、NBQX（10 μM）を使用しました。
前述の方法に従い、鮮明なhCO切片を作製した。hCO切片を4%アガロースに包埋し、126 mM NaCl、2.5 mM KCl、1.25 mM NaH2PO4、1 mM MgSO4、2 mM CaCl2、26 mM NaHCO3、および10 mM d-(+)-グルコースを含む細胞に移植した。切片は、Leica VT1200バイブレーターを用いて室温で200～300 µmの厚さに切り出し、室温でASF（細胞膜）中に保存した。その後、hCO切片に対し、SliceScope（Scientifica）直接顕微鏡下で全細胞のパッチキャンプ記録を実施した。切片はaCSF（95% O2および5% CO2）で灌流し、室温で細胞シグナルを記録した。 hCOニューロンは、127 mMグルコン酸カリウム、8 mM NaCl、4 mMマグネシウムATP、0.3 mMナトリウムGTP、10 mM HEPES、0.6 mM EGTAを含む溶液を満たしたホウケイ酸ガラスピペットを用いて塗布した。内部pHは7.2、KOHで調整（浸透圧290）。回復のために、内部溶液に0.2%ビオシチンを添加した。
データは、Clampex（Clampex 11.1、Molecular Devices）でMultiClamp 700Bアンプ（Molecular Devices）とDigidata 1550Bデジタイザー（Molecular Devices）を用いて取得し、2 kHzでローパスフィルタリングした後、20 kHzでデジタル化し、Clampfit（バージョン10.6、Molecular Devices）およびカスタムMATLAB関数（MATLAB 2019b、Mathworks）を用いて解析しました。接合電位はJPCalcを用いて計算し、入力値は計算された接合電位-14 mVに合わせて調整しました。操作IVは、-50 pAから250 pAまで、5～10 pAステップの一連の電流ステップで構成されています。
挟んだニューロンの形態学的再構成のため、0.2%ビオシチン（Sigma-Aldrich）を内部溶液に加えた。ハッキング後、細胞は少なくとも15分間プライミングされた。その後、ピペットを1～2分間ゆっくりと引き込み、登録された膜が完全に密閉されるまで続けた。切片生理学的手順に従い、切片を4% PFAで4℃で一晩固定し、PBSで3回洗浄した後、ストレプトアビジン標識DyLight 549またはDyLight 405（Vector Labs）で1:1000に希釈した。ビオシチン（2%、Sigma-Aldrich）で満たされた細胞は、室温で2時間、パッチクランプ記録中に標識された。切片はAquamount（Thermo Scientific）を用いて顕微鏡スライドにマウントし、翌日、開口数×40 1.3、倍率×0.9～1.0、xyの油浸対物レンズを用いてLeica TCS SP8共焦点顕微鏡で観察しました。サンプリングレートは約7ピクセル/ミクロンです。1ミクロン間隔でZスタックを連続的に取得し、各ニューロンの樹状突起全体をカバーするためにZスタックモザイクとLeicaベースの自動ステッチングを実行しました。その後、neuTube 40インターフェースを用いてニューロンを半手動で追跡し、SWCファイルを生成しました。これらのファイルは、SimpleNeuriteTracer41 Fijiプラグイン（ImageJ、バージョン2.1.0、NIH）にアップロードしました。
スタンフォード大学倫理委員会の承認を受けたプロトコルに従い、インフォームドコンセントを得てヒト皮質組織を採取した。難治性てんかんの手術の一環として、前頭皮質（中前頭回）を切除し、ヒト産後組織2検体（3歳および18歳）を採取した。切除後、組織を氷冷したNMDG-aCSF（92 mM NMDG、2.5 mM KCl、1.25 mM NaH2PO4、30 mM NaHCO3、20 mM HEPES、25 mMグルコース、2 mMチオ尿素、5 mMアスコルビン酸ナトリウム、3 mMピルビン酸ナトリウム、0.5 mM CaCl2 4H2O、10 mM MgSO4 7H2Oを含む）で採取した。濃塩酸でpH 7.3～7.4に滴定した。組織は30分以内に研究室に運ばれ、上記の手順に従って冠状切片が採取されました。
すべての動物実験は、スタンフォード大学APLAC承認の動物ケアガイドラインに従って実施しました。ラット（移植後140日以上経過）は、5%イソフルラン麻酔で導入し、術中に1～3%イソフルランで麻酔しました。動物は立体定位固定装置（Kopf社製）に設置し、徐放性ブプレノルフィン（SR）を皮下注射しました。頭蓋骨を露出させ、洗浄した後、3～5本の骨ネジを挿入しました。t-hCOを標的とするため、MRI画像から立体定位座標を生成しました。対象部位に穿頭孔を穿孔し、ファイバー（直径400µm、NA 0.48、Doric社製）をhCO表面から100µm下まで挿入し、UV硬化型歯科用セメント（Relyx社製）で頭蓋骨に固定しました。
ファイバー光度測定記録は前述のとおり実施した42。自発運動を記録するため、ラットを清潔なケージに入れ、光ファイバー光度測定データ収集システムに接続された直径 400 µm の光ファイバー パッチ ケーブル (Doric) を、埋め込まれた光ファイバー ケーブルに接続した。10 分間の運動活動記録中、動物はケージ内を自由に探索できた。誘発活動を記録するため、ラット (移植後 140 日以上) を、導入用に 5% イソフルラン、維持用に 1-3% イソフルランで麻酔した。動物を定位フレーム (Kopf) に入れ、t-hCO の反対側のヒゲを約 2 cm にトリミングし、圧電アクチュエーター (PI) に接続されたメッシュに通した。400 µm の光ファイバー パッチ ケーブル (Doric) を埋め込まれたファイバーに接続し、データ収集システムに接続した。 t-hCOの反対側のヒゲは、20分間の記録期間中、圧電駆動装置によってランダムなタイミングで50回（20Hzで2mm、1回の提示につき2秒間）偏向されました。Arduino MATLABサポートパッケージを使用し、カスタムMATLABコードで偏向時間を制御します。イベントは、トランジスタ・トランジスタ・ロジック（TTL）パルスを使用してデータ収集ソフトウェアと同期されます。
移植後140日以上経過したラットは、5%イソフルラン麻酔で導入され、術中に1～3%イソフルランで麻酔された。動物はステレオタキシーフレーム（Kopf）に設置され、ブプレノルフィン徐放剤とデキサメタゾンが皮下注射された。頭蓋骨を露出させ、洗浄した後、3～5本の骨スクリューを挿入した。t-hCOを標的とするため、MRI画像からステレオタキシー座標を作成した。移植されたhCOの真上に高速ドリルを用いて円形開頭術（直径約1cm）を実施した。骨を可能な限り薄くした後、骨全体をドリルで貫通させる前に、鉗子を用いて残存する無傷の骨盤椎間板を除去し、その下にあるt-hCOを露出させた。開頭部には滅菌生理食塩水が充填され、カバーガラスと特殊なヘッドピンが UV 硬化型歯科用セメント (Relyx) で頭蓋骨に固定されました。
二光子イメージングは​​、Bruker多光子顕微鏡とNikon LWD（×16、0.8 NA）対物レンズを用いて実施しました。GCaMP6イメージングは​​、920 nm、単一Z面倍率1.4倍、平均7.5 fpsの8倍で実施しました。ラットは5%イソフルラン麻酔で誘導され、1～3%イソフルランで維持されました。ラットは特注の頭部固定具に入れられ、レンズの下に配置されました。運動活動の3分間のバックグラウンド記録が得られました。20分間の記録中に、ピコスプライサーを用いて、t-hCOの反対側のウィスカーパッドに50回のパフ（各提示時間100ミリ秒）がランダムに照射されました。Arduino MATLABサポートパッケージを使用し、カスタムMATLABコードでバースト時間を制御します。イベントは、TTLパルスを使用してデータ収集ソフトウェア（PrairieView 5.5）と同期します。解析のために、フィジーで起動したMoCoプログラムを用いて、アフィン補正により画像のXY方向の動きを補正しました。CNMF-E43を用いて個々の細胞から蛍光トレースを抽出しました。蛍光は関心領域ごとに抽出され、dF/F曲線に変換された後、Zスコアに変換されました。
移植後140日以上経過したラットを5%イソフルラン麻酔で導入し、術中に1～3%イソフルランで麻酔した。動物を立体定位固定装置（Kopf）に装着し、ブプレノルフィン徐放剤とデキサメタゾンを皮下注射した。t-hCOの反対側のヒゲを約2cmに切断し、圧電アクチュエータに接続されたメッシュに通した。頭蓋骨を露出させ、洗浄した。ステンレス製の研磨ネジを頭蓋骨に取り付けた。t-hCOを標的とするため、MRI画像から立体定位固定座標を作成した。t-hCOの直上で高速ドリルを用いて円形開頭（直径約1cm）を行った。骨を可能な限り薄くした後、骨全体をドリルで穴を開ける前に、鉗子を使用して残っている無傷の骨盤椎間板を取り除き、その下の t-hCO を露出させます。個々の細胞は、アース ネジに接地され、RHD アンプ (Intan) で事前増幅された 32 チャネルまたは 64 チャネルの高密度シリコン プローブ (Cambridge Neurotech) を使用して記録されました。マニピュレータを使用して、滅菌生理食塩水で満たされた開頭部から電極をターゲット サイトまで下ろします。データ収集は、Open Ephys データ取得システムを使用して 30 kHz の周波数で実行されました。記録は、10 を超えるチャネルで相関の高い律動的な自発活動が検出された場合のみ継続され、電極が移植片内にあることが示唆されました (2 光子カルシウムイメージング データに基づく)。10 分間の運動活動のバックグラウンド記録が得られました。 t-hCOの反対側のヒゲは、20分間の記録期間中、圧電駆動装置によってランダムなタイミングで50回（20Hzで2mm、1回の提示につき2秒間）偏向されました。MATLAB Support Package for Arduino (MATLAB 2019b) を使用し、カスタムMATLABコードで偏向時間を制御します。TTLパルスを使用して、データ収集ソフトウェアとイベントを同期させます。
光マーキング実験では、473 nmレーザー（Omicron社製）に接続された200 µm光パッチコード（Doric社製）を、開頭部上に配置された200 µm光ファイバーに接続した。この実験の直前に、ジャンパー出力を20 mWに調整する。マニピュレータを用いて、滅菌生理食塩水を満たした開頭部を通して電極を標的部位まで降ろす。記録開始時に、473 nmの光パルス（周波数2 Hz、パルス幅10 ms）を10回照射した。光感受性細胞は、試行の70%以上において10 ms以内に光刺激に対するスパイク反応を示した細胞と定義した。