Nature.com saytiga tashrif buyurganingiz uchun tashakkur. Siz cheklangan CSS-ni qo'llab-quvvatlaydigan brauzer versiyasidan foydalanmoqdasiz. Eng yaxshi tajriba uchun yangilangan brauzerdan foydalanishni tavsiya qilamiz (yoki Internet Explorer-da Moslik rejimini o'chirib qo'ying). Bundan tashqari, doimiy qo'llab-quvvatlashni ta'minlash uchun biz saytni uslublar va JavaScriptlarsiz ko'rsatamiz.
Bir vaqtning o'zida uchta slayddan iborat karuselni ko'rsatadi. Bir vaqtning o'zida uchta slayd bo'ylab harakatlanish uchun "Oldingi" va "Keyingi" tugmalaridan foydalaning yoki bir vaqtning o'zida uchta slayd bo'ylab harakatlanish uchun oxiridagi slayder tugmalaridan foydalaning.
O'z-o'zidan yig'iladigan nerv organellalari inson rivojlanishi va kasalliklarini modellashtirish uchun istiqbolli in vitro platformadir. Biroq, organoidlarda in vivo mavjud bo'lgan aloqa yo'q, bu kamolotni cheklaydi va xatti-harakatlarni boshqaradigan boshqa davrlar bilan integratsiyani oldini oladi. Bu erda biz yangi tug'ilgan yalang'och kalamushlarning somatosensor korteksiga ko'chirilgan inson ildiz hujayralaridan olingan kortikal organoidlar hissiy va motivatsiya bilan bog'liq davrlarga integratsiyalashgan etuk hujayra turlarini rivojlantirayotganini ko'rsatamiz. MRI bir nechta ildiz hujayralari va hayvonlarda transplantatsiyadan keyingi organoid o'sishini aniqladi, bir yadroli tahlil esa kortikogenezning rivojlanishini va faoliyatga bog'liq transkripsiya dasturining paydo bo'lishini aniqladi. Haqiqatan ham, transplantatsiya qilingan kortikal neyronlar in vitro hamkasblariga qaraganda ancha murakkab morfologik, sinaptik va ichki membrana xususiyatlarini namoyish etadi, bu Timoti sindromi bo'lgan bemorlarda neyronal nuqsonlarni aniqlash imkonini beradi. Anatomik va funktsional kuzatish shuni ko'rsatdiki, transplantatsiya qilingan organellalar talamokortikal va kortikokortikal kirishlarni oladi va neyron faollikning in vivo yozuvlari bu kirishlar inson hujayralarida hissiy javoblarni yaratishi mumkinligini ko'rsatadi. Va nihoyat, kortikal organoidlar aksonlarni kalamush miyasi bo'ylab kengaytiradi va ularning optogenetik faollashuvi mukofotga intilish xatti-harakatlariga olib keladi. Shunday qilib, transplantatsiya qilingan inson korteksining neyronlari etuk bo'lib, mezbonning xatti-harakatlarini boshqaradigan davrlarida ishtirok etadi. Biz ushbu yondashuv bemordan olingan hujayralardagi iplar darajasidagi fenotiplarni aniqlashni osonlashtirishini kutamiz, ularni boshqa vositalar bilan aniqlash mumkin emas.
Rivojlanayotgan inson miyasi - bu o'z-o'zini tashkil qilishning ajoyib jarayoni bo'lib, unda hujayralar ko'payadi, farqlanadi, ko'chib ketadi va hissiy tajriba orqali yanada takomillashtiriladigan funktsional neyronal davrlarni hosil qilish uchun bog'lanadi. Inson miyasining rivojlanishini tushunishdagi asosiy muammo, ayniqsa kasallik kontekstida, miya to'qimalariga kirishning yo'qligi. O'z-o'zini tashkil etuvchi organellalar, shu jumladan inson korteksining organoidlari (hCO; inson korteksi sferasi deb ham ataladi) 2,3,4,5,6 hosil qilishi mumkin. Biroq, bir nechta cheklovlar ularning neyron zanjirlarining rivojlanishi va ishlashini tushunish uchun kengroq qo'llanilishini cheklaydi. Xususan, in vivo jonli ravishda mavjud bo'lgan ma'lum mikro-muhit va sensorli kirishlar yo'qligi bilan hCO ning etukligi cheklanganmi yoki yo'qmi aniq emas. Bundan tashqari, hCO'lar xulq-atvor natijalarini keltirib chiqaradigan sxemalarga integratsiyalanmaganligi sababli, ularning genetik jihatdan murakkab va xulq-atvorli neyropsikiyatrik kasalliklarni modellashtirishda foydaliligi hozirda cheklangan.
HCO ning buzilmagan tirik miyaga transplantatsiyasi bu cheklovlarni engib o'tishi mumkin. Oldingi tadqiqotlar shuni ko'rsatdiki, kemiruvchilar po'stlog'iga ko'chirilgan inson neyronlari omon qolish, loyihalash va kemiruvchilar hujayralari bilan aloqa qilish qobiliyatiga ega7,8,9,10,11,12. Biroq, bu tajribalar odatda kattalar hayvonlarida amalga oshiriladi, bu sinaptik va aksonal integratsiyani cheklashi mumkin. Bu erda biz transplantatsiya paradigmasini tasvirlaymiz, unda biz hiPS hujayralaridan olingan 3D hCO ni plastik rivojlanishning dastlabki bosqichida immunitet tanqisligi bo'lgan kalamushlarning asosiy somatosensor korteksiga (S1) ko'chirib o'tkazdik. Transplantatsiya qilingan hCO (t-hCO) neyronlari sezilarli darajada kamolotga uchraydi, talamokortikal va kortikal-kortikal kirishlarni oladi, ular sensorli javoblarni keltirib chiqaradi va mukofotga intilish xatti-harakatlarini boshqarish uchun kalamush miyasiga aksonal proektsiyalarni kengaytiradi. t-hCO ning kengaytirilgan etukligi Timoti sindromi (TS) bilan og'rigan bemorlarda neyronal nuqsonlarni aniqladi, bu kuchlanishga sezgir L-tipli CaV1.2 kaltsiy kanalidagi (CACNA1C tomonidan kodlangan) mutatsiyalar natijasida kelib chiqqan og'ir genetik kasallik.
In vivo jonli davrlarda inson kortikal neyronlarini o'rganish uchun biz stereotaktik tarzda buzilmagan 3D hCO ni erta postnatal atimik kalamushlarning S1 ga (tug'ruqdan keyingi 3-7 kunlar) ko'chirib o'tkazdik (1a-rasm va 1a-c-rasmning kengaytirilgan ma'lumotlari). Bu vaqtda talamokortikal va kortikokortikal aksonal proektsiyalar hali S1 innervatsiyasini tugatmagan (ref. 13). Shunday qilib, ushbu yondashuv t-hCO integratsiyasini maksimal darajada oshirish va endogen kontaktlarning zanglashiga olib keladigan ta'sirini kamaytirish uchun mo'ljallangan. Tirik hayvonlarda t-hCO ning joylashishini tasavvur qilish uchun biz transplantatsiya qilinganidan keyin 2-3 oy o'tgach, kalamushlarning T2 vaznli MRI miya rekonstruksiyalarini amalga oshirdik (1b-rasm va kengaytirilgan ma'lumotlar, 1d-rasm). t-hCO osongina kuzatildi va t-hCO ning hajm o'lchovlari sobit bo'laklardan hisoblanganlarga o'xshash edi (Kengaytirilgan ma'lumotlar 1d, e; P> 0,05). t-hCO osongina kuzatildi va t-hCO ning hajm o'lchovlari sobit bo'laklardan hisoblanganlarga o'xshash edi (Kengaytirilgan ma'lumotlar 1d, e; P> 0,05). t-hCO legko nablyudalis, a ob'emnye izmereniya t-hCO bilan bir xil analogik raschitannym uchun fiksrovannyh srezov (rasshirennye dannye, ris. 1d, e; P> 0,05). t-hCO osongina kuzatildi va volumetrik t-hCO o'lchovlari sobit bo'limlar uchun hisoblanganlarga o'xshash edi (kengaytirilgan ma'lumotlar, 1d-rasm, e; P> 0,05).t-hCO, t-hCO língíngíngíngíngíngíngíngíngíngíngíngíngíngíngíngíngíngíngíngíngíngíngíngíngíngíngíngíngíngíngíngíngíngíngíngíngíngíngíngíngíngíng1d、e；P > 0.05）t-hCO, t-hCO t-hCO legko nablyudalsya, a ob'emnye izmereniya t-hCO bilan bir xil analogik raschitannym uchun fiksrovannyh srezov (rashirennye dannye, ris. 1d, e; P> 0,05). t-hCO osongina kuzatildi va volumetrik t-hCO o'lchovlari sobit bo'limlar uchun hisoblanganlarga o'xshash edi (kengaytirilgan ma'lumotlar, 1d-rasm, e; P> 0,05).Biz transplantatsiya qilingan hayvonlarning 81 foizida transplantatsiya qilinganidan keyin taxminan 2 oy o'tgach t-hCO ni aniqladik (n = 72 hayvon; 10 hiPS hujayra chizig'idan hCO; 1-jadvalda hiPS hujayra chiziqlari). Ulardan 87% miya yarim korteksida joylashgan (1c-rasm). Xuddi shu transplantatsiya qilingan kalamushda bir nechta vaqt nuqtalarida ketma-ket MRI skanerlarini amalga oshirib, biz 3 oy ichida t-hCO hajmining to'qqiz baravar oshishini aniqladik (1d-rasm va kengaytirilgan ma'lumotlar, 1f-rasm). Transplantatsiya qilingan hayvonlarda transplantatsiyadan keyingi 12 oyda yuqori omon qolish darajasi (74%) bo'lgan (kengaytirilgan ma'lumotlar, 1g-rasm va qo'shimcha jadval 2) va aniq motor yoki xotira buzilishi, glioz yoki elektroensefalogramma (EEG) topilmadi. Ma'lumotlar 1g-rasm va qo'shimcha jadval 2). 1:00 va 3e).
a, Eksperimental dizayn sxemasi. hiPS hujayralaridan olingan hCO yangi tug'ilgan yalang'och kalamushlarning S1 ga differentsiatsiyaning 30-60 kunida ko'chirildi. b, transplantatsiya qilinganidan keyin 2 oy o'tgach, S1da t-hCO ni ko'rsatadigan T2 vaznli koronal va gorizontal MRI tasvirlari. O'lchov paneli, 2 mm. c, Har bir hiPS hujayra liniyasi (n = 108, bar ichidagi raqamlar hIPS hujayra chizig'i uchun t-hCO miqdorini ko'rsatadi) va kortikal yoki subkortikal joylashuvi (n = 88) uchun ko'rsatilgan engraftment muvaffaqiyat stavkalarining miqdori. d, 3 oy davomida t-hCO ning o'sishini ko'rsatadigan koronar arteriyaning MRI tasviri (chapda; shkala chizig'i, 3 mm) va mos keladigan 3D hajmli rekonstruksiya (shkala chizig'i, 3 mm). e, kalamush miya yarim korteksida t-hCO naqshlarini ko'rib chiqish. O'lchov paneli, 1 mm. f, yuqori chapdan o'ngga ko'rsatilgan t-hCO ning immunotsitokimyoviy tasvirlari (differensiatsiya paytida): PPP1R17 (4 oylik), NeuN (8 oylik), SOX9 va GFAP (8 oylik), PDGFRa; (8 oy), MAP2 (8 oy) va IBA1 (8 oy). Masshtab paneli, 20 mkm. HNA ning birgalikda ifodalanishi inson kelib chiqishi hujayralarini ko'rsatadi. g, snRNA-seq: Seurat integratsiyasidan so'ng barcha yuqori sifatli t-hCO yadrolarining birlashtirilgan manifold va proyeksiya (UMAP) o'lchamlarini kamaytirish tasviri (n = 3 t-hCO namunalari, n = 2 hiPS hujayra liniyasi). Astrositlar, astrositlar chizig'ining hujayralari; sikl prog, aylanma progenitatorlar; GluN DL, chuqur glutamaterjik neyronlar; GluN DL/SP, chuqur va sublamellar glutamaterjik neyronlar; GluN UL, yuqori qatlam glutamaterjik neyronlar; oligodendrositlar, oligodendrositlar; OPC, oligodendrosit progenitor hujayralari; RELN, reelin neyronlari. h, HCO glutamaterjik neyronlar bilan solishtirganda t-hCO glutamaterjik neyronlarda sezilarli darajada yuqori tartibga solingan (sozlangan P <0,05, katlama o'zgarishi> 2, yadrolarning kamida 10% da ifodalangan) genlarni Gen Ontologiyasi (GO) muddatli boyitish tahlili. h, HCO glutamaterjik neyronlar bilan solishtirganda t-hCO glutamaterjik neyronlarda sezilarli darajada yuqori tartibga solingan (sozlangan P <0,05, katlama o'zgarishi> 2, yadrolarning kamida 10% da ifodalangan) genlarni Gen Ontologiyasi (GO) muddatli boyitish tahlili. h, Analiz obogashcheniya terminov Gene Ontology (GO) uchun genlar uchun faol faollik (korrektsiyalangan P <0,05, kratnost izmeneniya > 2, ekspressiya bo'yicha krayney mere va 10% yader) glutamatergik neyron t-hCO neyroniy potamani glutamatergik neyron t-hCOlu sravigiy ko'rsatkichlari. h, HCO glutamaterjik neyronlar bilan solishtirganda t-hCO glutamaterjik neyronlarda sezilarli faollashuvga ega bo'lgan genlar uchun Gen Ontologiyasi (GO) muddatli boyitish tahlili (sozlangan P <0,05, katlama o'zgarishi> 2, kamida 10% yadrolarda ifoda). h，hCO līngīngīngīngčičiči, t-hCO līngīngīngīngīngīngīngīngīngīpīngīngīngīng 0.05 ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ） h ， hco hco līng y y i ， t-hco l i y y i , t-hco l i y y y l y y y y y y y y y 5 0 . líííí> 2 ， líčiči 10% lííííííí lílíníníníníínìííníínííín līngīngīngīng(GO) līngīngjīngjīng h, geny znachitelno faollashtiriladi (korrektirovannyy P <0,05, kratnost izmeneniya> 2, ekspressiruetsya po krayney mere v 10% yader) v glutatergicheskyh neyron tahlili t-hCO po sravneniyu o'z glutamatergicheskyh neyrohimicheskyy terim bo'yicha GO. h, genlar hCO glutamaterjik neyronlar bilan solishtirganda t-hCO glutamaterjik neyronlarda sezilarli darajada yuqoriga ko'tarildi (rostlangan P <0,05, qatlam o'zgarishi> 2, yadrolarning kamida 10% da ifodalangan) Boyitish muddatini Ontologik (GO) tahlil qilish.Nuqtali chiziq 0,05 aq qiymatini bildiradi. i, 22 snRNA-seq kattalar motor korteksi ma'lumotlar to'plamidan yorliq uzatish yordamida t-hCO da GluN hujayra turlarini UMAP tasvirlash. KT - kortikotalamik hujayralar, ET - ekstraserebral hujayralar, IT - ichki teleensefalik hujayralar, NP - proektsiyaga yaqin.
Keyin biz t-hCO ning sitoarxitekturasini va umumiy hujayra tarkibini baholadik. Sichqonlarning endotelial hujayralarining antikor bo'yalishi t-hCO bilan vaskulyarizatsiyani aniqladi, IBA1 bo'yalishi esa butun greft bo'ylab kalamush mikrogliyasining mavjudligini aniqladi (1f-rasm va kengaytirilgan ma'lumotlar, 3c,d-rasm). Immunitetni bo'yash PPP1R17 (kortikal progenitörler), NeuN (neyronlar), SOX9 va GFAP (glialdan olingan hujayralar) yoki PDGFRa (oligodendrositlar progenitatorlari) bilan birgalikda ifodalovchi inson yadro antijeni (HNA) musbat hujayralarini aniqladi (1f-rasm). Bir hujayrali rezolyutsiyada t-hCO ning uyali tarkibini o'rganish uchun biz taxminan 8 oylik farqlanishdan so'ng bir yadroli RNK ketma-ketligini (snRNA-seq) amalga oshirdik. Katta filtrlash va kalamush yadrolarini olib tashlash natijasida 21500 ta yuqori sifatli inson mononuklear xaritalari (1g-rasm va kengaytirilgan ma'lumotlar, 4a,b-rasm) olingan. Odatda hujayra tipidagi markerlarning ifoda namunalari asosiy kortikal hujayra sinflarining klasterlarini, shu jumladan chuqur va yuzaki glutamaterjik neyronlar, aylanma progenittorlar, oligodendrositlar va astrositlar nasl-nasabini aniqladi (1g-rasm, kengaytirilgan ma'lumotlar, 4c-rasm va 3-jadval). SATB2 va CTIP2 uchun immuno-bo'yoq kortikal pastki tiplar mavjudligiga qaramasdan, t-hCO aniq anatomik tabaqalanishni ko'rsatmaganligini ko'rsatdi (kengaytirilgan ma'lumotlar, 3a-rasm). bosqichga mos keladigan snRNA-seq hCO keng o'xshash hujayra sinflarini ishlab chiqardi, bir nechta istisnolardan tashqari, oligodendrositlarning yo'qligi va GABAergik neyronlarning mavjudligi, bu lateral progenitor hujayralar uchun avval xabar qilingan qulay in vitro sharoitlarini aks ettirishi mumkin15 (kengaytirilgan ma'lumotlar, 4f-rasm - i va qo'shimcha). Differentsial gen ekspressiyasi tahlili t-hCO va hCO o'rtasidagi glutamaterjik neyronlarda sezilarli farqlarni aniqladi (5-jadval), shu jumladan sinaptik signalizatsiya, dendritik lokalizatsiya va kuchlanish bilan bog'langan kanal faolligi kabi neyronlarning etukligi bilan bog'liq genlar to'plamining faollashuvi (1h-rasm va qo'shimcha jadval 5). 6-jadval). Shunga ko'ra, kortikal glutamaterjik t-hCO neyronlari tezlashtirilgan transkripsiya kamolotini ko'rsatdi.
T-hCO dagi ushbu transkripsiyaviy o'zgarishlar hCO in vitro va t-hCO in vivo o'rtasidagi morfologik farqlar bilan bog'liqmi yoki yo'qligini aniqlash uchun biz 7-8 oylik farqlanishdan so'ng o'tkir bo'limlarda bosqichma-bosqich biotsitin bilan to'ldirilgan hCO va hCO ni qayta tikladik. hCO neyronlari (2a-rasm). t-hCO neyronlari sezilarli darajada kattaroq bo'lib, soma diametridan 1,5 baravar, dendritlar ikki barobar ko'p va in vitro hCO bilan solishtirganda umumiy dendritik uzunlikda umumiy olti baravar ko'paygan (2b-rasm). Bundan tashqari, biz hCO neyronlariga qaraganda t-hCO neyronlarida dendritik tikanlarning sezilarli darajada yuqori zichligini kuzatdik (2c-rasm). Bu shuni ko'rsatadiki, t-hCO neyronlari keng dendritik cho'zilish va dallanishni boshdan kechiradi, bu esa hujayra proliferatsiyasining davom etishi bilan birgalikda transplantatsiyadan keyin t-hCO ning intensiv o'sishiga hissa qo'shishi mumkin (1d-rasm va kengaytirilgan ma'lumotlar 1f). Bu bizni elektrofiziologik xususiyatlarni o'rganishga undadi. Membrananing sig'imi sakkiz baravar yuqori (kengaytirilgan ma'lumotlar, 8d-rasm), dam olish holatidagi membrana potentsiali ko'proq hiperpolarizatsiyalangan (taxminan 20 mV) va joriy in'ektsiya hCO neyronlariga qaraganda t-hCO neyronlarida yuqori maksimal qo'zg'alish tezligini keltirib chiqardi. in vitro (2d-rasm), e), bu t-hCO ning kattaroq va murakkab morfologik xususiyatlariga mos keladi. Bundan tashqari, t-hCO neyronlarida o'z-o'zidan qo'zg'atuvchi postsinaptik oqim hodisalarining (EPSC) chastotasi sezilarli darajada yuqori bo'lgan (2f-rasm), bu t-hCO neyronlarida kuzatilgan dendritik tikanlar zichligi oshishi funktsional qo'zg'aluvchanlik bilan bog'liqligini ko'rsatadi. jinsiy sinaps. Biz etiketli glutamaterjik neyronlarni yozib olish orqali in vitro hCO neyronlarining etuk bo'lmagan xarakterini tasdiqladik (kengaytirilgan ma'lumotlar, 6a-c-rasm).
a, 8 oylik farqlanishdan keyin biotsitin bilan to'ldirilgan hCO va t-hCO neyronlarining 3D rekonstruktsiyasi. b, morfologik xususiyatlarning miqdoriy ko'rsatkichlari (n = 8 hCO neyronlari, n = 6 t-hCO neyronlari; ** P = 0,0084, * P = 0,0179 va *** P <0,0001). b, morfologik xususiyatlarning miqdoriy ko'rsatkichlari (n = 8 hCO neyronlari, n = 6 t-hCO neyronlari; ** P = 0,0084, * P = 0,0179 va *** P <0,0001). b, kolichestvennaya otsenka morfologik priznakov (n = 8 neyronov hCO, n = 6 neyron t-hCO; ** P = 0,0084, * P = 0,0179 va *** P <0,0001). b, morfologik xususiyatlarning miqdoriy ko'rsatkichlari (n = 8 hCO neyronlari, n = 6 t-hCO neyronlari; ** P = 0,0084, * P = 0,0179 va *** P <0,0001). b，kāngāngāngāngāngī（n = 8 yīhCO līngān， n = 6 t-hCO līngān；**P = 0,0084，*1**P <9*0. 0,0001）. b，kāngāngāngāngāngī（n = 8 yīhCO līngān， n = 6 t-hCO līngān；**P = 0,0084，*1**P <9*0. 0,0001）. b, kolichestvennaya otsenka morfologik priznakov (n = 8 neyronov hCO, n = 6 neyron t-hCO; ** P = 0,0084, * P = 0,0179 va *** P <0,0001). b, morfologik xususiyatlarning miqdoriy ko'rsatkichlari (n = 8 hCO neyronlari, n = 6 t-hCO neyronlari; ** P = 0,0084, * P = 0,0179 va *** P <0,0001).c, 8 oylik farqlanishdan keyin hCO va t-hCO dendritik shoxlarini 3D rekonstruksiya qilish. Qizil yulduzchalar taxminiy dendritik tikanlarni ko'rsatadi. Dendritik umurtqa pog'onasi zichligini aniqlash (n = 8 hCO neyronlari, n = 6 t-hCO neyronlari; ** P = 0,0092). d, dam olish membranasining potentsialini aniqlash (n = 25 hCO neyronlari, n = 16 t-hCO neyronlari; *** P <0,0001). d, dam olish membranasining potentsialini aniqlash (n = 25 hCO neyronlari, n = 16 t-hCO neyronlari; *** P <0,0001). d, kolichestvennaya otsenka membranno potentsial pokoya (n = 25 neyron hCO, n = 16 neyron t-hCO; *** P <0,0001). d, dam olish membranasining potentsial miqdorini aniqlash (n = 25 hCO neyronlari, n = 16 t-hCO neyronlari; *** P <0,0001). d，bēngčičičičnė（n = 25 hCO línjín, n = 16 t-hCO línjín；***P < 0,0001）。 d，bēngčičičičnė（n = 25 hCO línjín, n = 16 t-hCO línjín；***P < 0,0001）。 d, kolichestvennaya otsenka membranno potentsial pokoya (n = 25 neyron hCO, n = 16 neyron t-hCO; *** P <0,0001). d, dam olish membranasining potentsial miqdorini aniqlash (n = 25 hCO neyronlari, n = 16 t-hCO neyronlari; *** P <0,0001). e, hCO va t-hCO dagi takroriy ta'sir potentsiali otishma oqimining ko'payishi va maksimal otishni o'rganish tezligini aniqlash (n = 25 hCO neyronlari, n = 16 t-hCO neyronlari; *** P < 0,0001). e, hCO va t-hCO dagi takroriy ta'sir potentsiali otishma oqimining ko'payishi va maksimal otishni o'rganish tezligini aniqlash (n = 25 hCO neyronlari, n = 16 t-hCO neyronlari; *** P < 0,0001). e, hCO va t-hCO ning povtornoe vozbujdenie potentsial deystviya, vyzvannoe uvelicheniem toka, va kolichestvennaya otsenka maksimal skorosti vozbujdeniya (n = 25 neyron hCO, n = 16 neyron t-hCO; *** P <0, *** P <0,). e, hCO va t-hCO dagi harakat potentsialini qayta yoqish, joriy o'sish va maksimal otish tezligining miqdorini aniqlash (n = 25 hCO neyronlari, n = 16 t-hCO neyronlari; *** P <0,0001). t-hCO hCO t-hCO hCO hCO hCO hCO yhCO hCO lín dín, n = 16 yjt-hCO yínjín；***P < 0,0001）。 E ， līngčiči yīngčiči hco hco t-hco línčiči língčičičičičičičičiči, yēngčičičn ， yēngčičn ， līng （2ngīn ， n hco hco lín, n = 16 t-hco lín ； *** p <0,0001） 。 e, povtoryayuscheesya vozbujdenie potentsial deystviya hCO va t-hCO, vyzvannoe uvelicheniem podachi toka, va kolichestvennaya osenka maksimal skorosti vozbujdeniya (n = 25 neyron hCO, n = 16 neyron t-hCO0; ***1). e, hCO va t-hCO ta'sir potentsiallarining takroriy otishmasi joriy ta'minotning ko'payishi va maksimal otish tezligining miqdorini aniqlash (n = 25 hCO neyronlari, n = 16 t-hCO neyronlari; *** P <0,0001). f, 8 oylik differentsiatsiyada hCO va t-hCO neyronlarida spontan EPSCs (sEPSCs) va sinaptik hodisalarning chastotasini aniqlash (n = 25 hCO neyronlari, n = 17 t-hCO neyronlari; *** P <0.0001). f, 8 oylik differentsiatsiyada hCO va t-hCO neyronlarida spontan EPSCs (sEPSCs) va sinaptik hodisalarning chastotasini aniqlash (n = 25 hCO neyronlari, n = 17 t-hCO neyronlari; *** P <0.0001). f, spontannye EPSC (sEPSC) hCO va t-hCO neyronlari uchun 8 oylik differentsivlar va kolichestvennaya otsenka chastoty sinaptik sobitiy (n = 25 neyron hCO, n = 17 neyron t-hCO; *** P <0,00) . f, hCO va t-hCO neyronlarida o'z-o'zidan paydo bo'ladigan EPSC'lar (sEPSC'lar) 8 oylik sinaptik hodisa tezligini farqlash va miqdoriy aniqlashda (n = 25 hCO neyronlari, n = 17 t-hCO neyronlari; *** P <0.0001). F, 分化 8 ↑, HCO 和 和 和 和 T-HCO EPSCS (Septss), 以及突触事件频率的量化 (n = 25 HCO) línjín，n = 17 t-hCO línjín；***P < 0,0001） . F, 分化 8 ↑, HCO 和 和 和 和 T-HCO EPSCS (Septss), 以及突触事件频率的量匼 (n = 25 HCO) línjínjínjín（n = 25 hCO línjínjín（n = 25hCO P <0,0001） . f, o'z-o'zidan EPSC (sEPSC) hCO va t-hCO neyronlariga 8 oylik differentsivlar va kolichestvennaya osenka chastoty sinaptik sobitiy (n = 25 neyron hCO, n = 17 neyron t-hCO; *** P <0,00). f, hCO va t-hCO neyronlarida o'z-o'zidan EPSC'lar (sEPSC'lar) 8 oylik farqlash va sinaptik hodisa tezligini aniqlashda (n = 25 hCO neyronlari, n = 17 t-hCO neyronlari; *** P <0.0001).bf uchun, 1208-2 qatoridagi hCO va t-hCO parallel ravishda saqlanadigan bir xil farqlash partiyasidan olingan. g, Gen to'plamini boyitish tahlili (bir tomonlama Fisherning aniq testi) t-hCO glutamaterjik neyronlarida sezilarli darajada yuqori tartibga solinadigan (o'zgartirilgan P <0,05, qatlam o'zgarishi > 2, yadrolarning kamida 10% ida ifodalangan) hCO glutamaterjik neyronlar bilan solishtirganda (erta va kech genlar) (LRG) in vivo sichqonchani o'rganish16 natijasida aniqlangan faollikka bog'liq genlar va in vitro neyronlardan insonga xos LRGlar17. g, Gen to'plamini boyitish tahlili (bir tomonlama Fisherning aniq testi) t-hCO glutamaterjik neyronlarida sezilarli darajada yuqori tartibga solinadigan (o'zgartirilgan P <0,05, qatlam o'zgarishi > 2, yadrolarning kamida 10% ida ifodalangan) hCO glutamaterjik neyronlar bilan solishtirganda (erta va kech genlar) (LRG) in vivo sichqonchani o'rganish16 natijasida aniqlangan faollikka bog'liq genlar va in vitro neyronlardan insonga xos LRGlar17. g, analiz obagashcheniya nabor genov (odnostorniy toch neyroniy tahlil Fishera) genov so znachitelnoy faolatsiey (korrektirovlangan P <0,05, kratnost izmeneniya > 2, ekspressiya po menshey mere v 10% yader) glutamatergicheskih neyro-neyrotexnika seksiyalaridagi ekspressiya. hCO nabory genov kak rannego (ERG), tak va pozdnego (LRG) genov, faol zavisyatchix, in vivo16 ning issledovanii va identifikatorlari, va odamlar uchun LRG iz neynovlari in vitro17 uchun maxsus. g, hCO glutamaterjik neyronlar bilan solishtirganda t-hCO glutamaterjik neyronlarda sezilarli faollashuvga ega bo'lgan genlarning gen to'plamini boyitish (bir dumli Fisherning aniq testi) tahlili (sozlangan P <0,05, qatlam o'zgarishi > 2, yadrolarning kamida 10% ida ifodalangan) hCO glutamaterjik neyronlar to'plamlari va kech (ERG) ham erta aniqlangan faollik (ERG) sichqonlar16 va in vitro17 neyronlardan insonga xos LRGlar. G, T-HCO 谷氨酸能神经元与 HCO 谷氨酸能神经元相比, t -hCOlíngíngíngíngíngíngíníngíníníníníníínínípíníp<0.05 >2， 10% （ （ （ （ （ （ （ （ （ （ （ （ （ （ （ （ （ ） isher língíngíngíngíngíngíngíngíngíngíngíngíngíngíngíngíngíníngíníngíníngínjínjínjínjínjínjínjínjínjíníngíníngíníngíníngíníngíníngíníngíníngíníngíníngíníngíníngíníngíníngíníngíníngíníngíníngínínínínjánínjíníng (ERG) míngíngíngínjínííníínííníín 16 yíngíngíngííníínííníínííníínííníínínínínííníínííníínínííníní (LRG) (LRG) g ， t-hco līngčiči hco hco hco língčiči lín lín yín, t-hco língíngín <0,05 ， lēngči> 2 ， lēngčiči 10% līngčičičičičičičičičičičičičičičičičičičičičičičičičičičičičiči lng lzhi lín yín yín yín yííííí íííííí íííííí íííííí ííííí (lrg) 17 y y 17 y 17 y 17 y ljn lrg lRG。 g, glutatergicheskie nervyny t-hCO byli znachitelno aktivizirovani po sravneniyu s glutatergicheskimi neyronami hCO (korrektirovannyy P<0,05, kratnost izmeneniya> 2, ne mene 10% Analiz obagashcheniya nabororon genovan (oddiy) (ERG) va pozdnego geny, zavisyatchie ot aktivnosti otveta (LRG), identifikatorlar in vivo16 va neyronlar in vitro17, maxsus. g, t-hCO glutamaterjik neyronlar hCO glutamaterjik neyronlar bilan solishtirganda sezilarli darajada ko'tarildi (sozlangan P <0,05, qatlam o'zgarishi > 2, kamida 10% Erta javob (ERG) va kech javob genini boyitish tahlili (bir dumli Fisherning aniq testi) javob faolligiga bog'liq genlar (inL vitro) neyronlar.17 Insonga xos LRGlar.Nuqtali chiziq Bonferroni tomonidan tuzatilgan P qiymatini 0,05 ko'rsatadi. h, GluN gen ifodasi (har bir genning psevdo-paketi va miqyosi) t-hCO glutamaterjik neyronlarda LRG genlarining snRNA-seq replikalarida sezilarli darajada yuqori tartibga solingan. i, t-hCO (yuqori) va hCO (pastki) neyronlarda SCG2 ifodasini ko'rsatadigan immunostimulyatsiya. Oq strelkalar SCG2+ hujayralariga ishora qiladi. Masshtab paneli, 25 mkm. Ma'lumotlar o'rtacha ± standart og'ish sifatida ifodalanadi.
Ex vivo tilimlarda kuzatilgan t-hCO ning faolligi oshishiga asoslanib, snRNA-seq in vitro hCO ga nisbatan t-hCO dagi gen transkriptlarining faollikka bog'liq yuqori regulyatsiyasini aniqladi. Glutamaterjik t-hCO neyronlari sichqoncha va inson neyronlarida oldingi tadqiqotlarda topilgan kech javob faolligini (2g, h-rasm) tartibga soluvchi genlarning yuqori darajasini ifoda etdi16,17. Misol uchun, BDNF18, SCG2 va OSTN, primatga xos faoliyatni tartibga soluvchi gen, hCO neyronlari bilan solishtirganda t-hCO neyronlarida ifodaning kuchayganligini ko'rsatdi (2g-i-rasm). Shunday qilib, t-hCO neyronlari transkripsiya, morfologik va funktsional tahlillar orqali hCO neyronlariga nisbatan rivojlangan kamolotga xos xususiyatlarni namoyish etdi.
T-hCO kamolotining inson miyasi rivojlanishi bilan bog'liqligini yanada baholash uchun biz xomilalik va kattalar kortikal hujayra turlarini transkriptomik taqqoslashni amalga oshirdik19,20 va kattalar21,22, shuningdek rivojlanish jarayonida kortikal gen ifodasi23 bo'yicha keng ma'lumotlar (kengaytirilgan ma'lumotlar, 5-rasm). ). oldingi ish bilan 24 , global hCO va t-hCO transkriptomasining 7-8 oylik farqlashda kamolotga etish holati in Vivo jonli rivojlanish vaqtiga keng mos keladi va kech homila hayotiga eng mos keladi (Kengaytirilgan ma'lumotlar 5a). Ta'kidlash joizki, biz yoshga mos keladigan hCO ga nisbatan t-hCO da transkriptom etukligini, shuningdek, sinaptogenez, astrogenez va miyelinatsiya bilan bog'liq bo'lgan transkriptom faollashuvini kuzatdik (kengaytirilgan ma'lumotlar, 5b-d-rasm). Hujayra darajasida biz t-hCO ning yupqaroq korteks pastki turiga dalil topdik, glutamaterjik neyronlar klasterlari kattalar L2 / 3, L5 va L6 neyron subtiplari bilan bir-biriga mos keladi (1i-rasm). Bundan farqli o'laroq, glutamaterjik t-hCO neyronlari va homila kortikal neyronlari o'rtasidagi klaster o'zaro bog'liqligi homiladorlikning o'rtalarida ancha cheklangan edi (kengaytirilgan ma'lumotlar, 5e-j-rasm). T-hCO neyronlari insonning postnatal neokortikal neyronlariga funktsional jihatdan o'xshash yoki yo'qligini aniqlash uchun biz insonning postnatal korteksining o'tkir qismlarida elektrofizyologik yozuvlar va inson L2 / 3 piramidal neyronlarining anatomik rekonstruksiyalarini amalga oshirdik (kengaytirilgan ma'lumotlar, 7a-rasm). L2 / 3 piramidal neyronlarining elektrofizyologik xususiyatlari t-hCO piramidal neyronlariga o'xshash edi (kengaytirilgan ma'lumotlar, 7e-rasm). Morfologik jihatdan, tug'ruqdan keyingi inson namunalaridan L2 / 3 neyronlari hCO ga qaraganda t-hCO ga ko'proq o'xshash edi, garchi L2 / 3 hujayralari uzunroq bo'lsa-da, umuman olganda ko'proq filiallarni o'z ichiga olgan va yuqori umurtqa pog'onasi zichligiga ega edi (3g-rasm va kengaytirilgan ma'lumotlar, 7b-rasm). G).
a, nazorat va TS hiPS hujayra liniyalari tomonidan ishlab chiqarilgan hCO ning yangi tug'ilgan kalamushlarga transplantatsiyasi. b, 8 oylik farqlanishdan keyin biotsitin bilan to'ldirilgan t-hCO neyronlarining 3D rekonstruktsiyasi. c, o'rtacha dendritik uzunlik miqdorini aniqlash (n = 19 nazorat neyronlari, n = 21 TS neyronlari; ** P = 0,0041). d, 8 oylik differentsiatsiyada nazorat va TS t-hCO dan 3D-qayta tiklangan dendritik shoxlari va dendritik o'murtqa zichligi miqdorini aniqlash (n = 16 nazorat neyronlari, n = 21 TS neyronlari, *** P <0,0001). d, 8 oylik differentsiatsiyada nazorat va TS t-hCO dan 3D-qayta tiklangan dendritik shoxlari va dendritik o'murtqa zichligi miqdorini aniqlash (n = 16 nazorat neyronlari, n = 21 TS neyronlari, *** P <0,0001). d, 3D-rekonstruksiya dendritnyx vetvey iz nazorat va TS t-hCO cherez 8 mesyatsev differentsirovki va kolichestvennaya otsenka plotnosti dendritnyx shipov (n = 16 nazorat neyronov, n = 21 TS neyron, ***0 P <0,). d, 8 oylik differentsiatsiya va dendritik o'murtqa zichlik miqdorini aniqlashda nazorat va t-hCO TS dan dendritik shoxlarni 3D rekonstruksiya qilish (n = 16 nazorat neyronlari, n = 21 TS neyronlari, *** P <0.0001). d，jjīnī8 t-hCO t-hCO t-hCO 3D d，jēngčičičičičičičičičičičiičičičičičičičičičičičičn =16 yjjínjínjín, n = 21 tíngíínín,***P <0,0001）。 d ， lēng 8 y ng t-hco ts t-hco 3d t-hco lín lín lín lín lín yín lín lín lín lín lín yín yín yín 6ng yīī ， n = 21 ts ts i ， *** p <0,0001）。 d, 3D-rekonstruksiya dendritnyx vetvey kontrolya va TS t-hCO cherez 8 mesyatsev differentsirovki va kolichestvennaya otsenka plotnosti dendritnyx shipov (n = 16 nazorat neyronov, n = 21 TS neyron, *** P <0,0). d, 8 oylik farqlash va dendritik o'murtqa zichlik miqdorini aniqlashda nazorat dendritik shoxlari va TS t-hCO ning 3D rekonstruktsiyasi (n = 16 nazorat neyronlari, n = 21 TS neyronlari, *** P <0.0001).Qizil yulduzchalar taxminiy dendritik tikanlarni ko'rsatadi. e, nazoratdagi spontan EPSC'lar va 8 oylik farqlanishdan keyin TS t-hCO neyronlari. f, sinaptik hodisalarning chastotasi va amplitudasining to'plangan chastotasi va miqdorini aniqlash (n = 32 nazorat neyronlari, n = 26 TS neyronlari; ** P = 0,0076 va P = 0,8102). g, hCO va t-hCO dagi TS va nazorat neyronlarining Scholl tahlili. Chiziqli chiziqlar taqqoslash uchun insonning L2/3 postnatal piramidal neyronlarini ko'rsatadi (n = 24 nazorat t-hCO neyronlari, n = 21 TS t-hCO neyronlari, n = 8 nazorat hCO neyronlari va n = 7 TS hCO neyronlari). Ma'lumotlar o'rtacha ± standart og'ish sifatida ifodalanadi
T-hCO ning inson korteksi neyronlarining morfologik va funktsional xususiyatlarini yuqori darajada takrorlash qobiliyati bizni kasallik fenotiplarini aniqlash uchun t-hCO dan foydalanish mumkinligini o'rganishga undadi. Biz neyronlarda faollikka bog'liq gen transkripsiyasini boshlaydigan CaV1.2 kodlovchi gendagi funktsiyaning ortishi mutatsiyalari natijasida kelib chiqqan og'ir neyrorivojlanish buzilishiga e'tibor qaratdik. Biz hCO ni eng keng tarqalgan almashtirishni (p.G406R) va uchta nazoratni (3a-rasm) tashuvchi uchta TS bemoridan oldik. Transplantatsiyadan so'ng, biz dendritik morfologiyani nazorat qilish bilan solishtirganda TS neyronlarida o'zgartirilganligini aniqladik (3b-rasm va kengaytirilgan ma'lumotlar, 8a,b-rasm), asosiy dendritlar sonining ikki baravar ko'payishi va dendritik uzunlikning o'rtacha va umumiy pasayishining umumiy o'sishi (3c-rasm va kengaytirilgan ma'lumotlar, 8c-rasm). Bu nazorat neyronlari bilan solishtirganda TS da umurtqa pog'onasining zichligi va spontan EPSC chastotasining ortishi bilan bog'liq edi (3d-f-rasm va kengaytirilgan ma'lumotlar, 8g-rasm). Keyingi tahlillar nazorat bilan solishtirganda t-hCO TS da g'ayritabiiy dendritik shoxlanish naqshlarini aniqladi, ammo in vitro TS hCO ni farqlashning o'xshash bosqichida emas (3g-rasm). Bu TSdagi faollikka bog'liq dendritik qisqarish haqidagi oldingi hisobotlarimiz bilan mos keladi va ushbu transplantatsiya platformasining kasallik fenotiplarini in vivo jonli aniqlash qobiliyatini ta'kidlaydi.
Keyin biz t-hCO hujayralari qanchalik funktsional ravishda S1 kalamushiga birlashtirilganligini so'radik. Kemiruvchilardagi S1 ipsilateral ventral bazal va posterior talamik yadrolardan, shuningdek, ipsilateral motor va ikkilamchi somatosensor kortekslardan va qarama-qarshi S1dan kuchli sinaptik kirishlarni oladi (4a-rasm). Innervatsiya naqshini tiklash uchun biz hCO ni quturgan virusi-dG-GFP/AAV-G bilan yuqtirdik va hCO ni 3 kundan keyin S1 kalamushiga ko'chirib o'tkazdik. Transplantatsiyadan 7-14 kun o'tgach, ipsilateral S1 va ventral bazal gangliyaning neyronlarida zich GFP ifodasini kuzatdik (4b-rasm, c). Bundan tashqari, talamik marker netrin G1 ning antikor bo'yalishi t-hCO da talamik tugunlarning mavjudligini aniqladi (4d-rasm, e). Ushbu afferent proektsiyalar t-hCO hujayralarida sinaptik javoblarni keltirib chiqarishi mumkinligini baholash uchun biz talamokortikal qatlamning o'tkir qismlarida inson hujayralaridan butun hujayra yozuvlarini o'tkazdik. S1 kalamushining elektr stimulyatsiyasi, ichki kapsula, oq modda, t-hCO yaqinidagi tolalar yoki AMPA retseptorlari antagonisti NBQX ta'siriga uchragan t-hCO neyronlarida qisqa kechikishli EPSC'larda t-hCO ning opsinni ifodalovchi talamik uchlarini optogenetik faollashtirish. (4f-rasm, g va kengaytirilgan ma'lumotlar, 9a-g-rasm). Ushbu ma'lumotlar shuni ko'rsatadiki, t-hCO anatomik ravishda kalamush miyasiga birlashtirilgan va kalamush xost to'qimalari tomonidan faollashishi mumkin.
a, Quturishni kuzatish tajribasining sxematik diagrammasi. b, GFP va t-hCO va kalamush miya yarim korteksi (yuqori panel) o'rtasidagi insonga xos STEM121 ifodasi. Shuningdek, kalamush ipsilateral ventral bazal yadrosi (VB) (pastki chap) va ipsilateral S1 (pastki o'ng) da GFP ifodasi ko'rsatilgan. Masshtab paneli, 50 mkm. Qizil kvadratlar miyaning tasvirlar olingan joylarini ifodalaydi. c, GFPni ifodalovchi hujayralar miqdorini aniqlash (n = 4 kalamush). d, e - t-hCO da Netrin G1 + talamik terminallar. d t-hCO va VB yadrolarini o'z ichiga olgan koronal qismni ko'rsatadi. O'lchov paneli, 2 mm. e t-hCO (chapda) va VB (o'ngda) neyronlarda Netrin G1 va STEM121 ifodasini ko'rsatadi. Masshtab paneli, 50 mkm. To'q sariq nuqta chiziq t-hCO chegarasini ko'rsatadi. f, g, S1 kalamushida (f) yoki ichki kapsulada (g) elektr stimulyatsiyasidan keyin t-hCO neyronlarining joriy izlari, (binafsha rang) yoki bo'lmasdan (qora) NBQX (chapda). NBQX bilan va NBQXsiz EPSC amplitudalari (n = 6 S1 neyronlari, * P = 0,0119; va n = 6 ichki kapsula neyronlari, ** P = 0,0022) (markaz). S1 (f) kalamush yoki ichki kapsulaning (g) (o'ngda) elektr stimulyatsiyasiga javoban EPSC ni ko'rsatadigan t-hCO neyronlarining ulushi. aCSF, sun'iy miya omurilik suyuqligi. h, 2P tasvirlash tajribasining sxematik diagrammasi (chapda). GCaMP6 ning t-hCO dagi ifodasi (o'rtada). Masshtab paneli, 100 mkm. GCaMP6 ning lyuminestsent vaqtining uzilishi (o'ngda). i, o'z-o'zidan faollik floresansining Z-balli. j, mo'ylovni stimulyatsiya qilishning sxematik tasviri. k, z-balli 2P floresan traektoriyalari bir sinovda, misol hujayralardagi nol vaqtdagi mo'ylov og'ishi bilan moslangan (chiziq chiziq). l, nol vaqtdagi mo'ylov og'ishi (chiziq chiziq) (qizil) yoki tasodifiy yaratilgan vaqt belgilari (kulrang) bilan moslangan barcha hujayralarning populyatsiya bo'yicha o'rtacha z-skorli javoblari. m. Optik markalash bo'yicha tajribaning sxematik diagrammasi. n, Ko'k lazer stimulyatsiyasi yoki mo'ylovning burilishi paytida t-hCO xujayrasidan olingan xom kuchlanish egri chiziqlari. Qizil o'qlar yorug'lik (yuqori) yoki mo'ylovning egilishi (pastki) natijasida paydo bo'lgan birinchi tikanlarni ko'rsatadi. Kulrang soyalar mo'ylovning burilish davrlarini ko'rsatadi. o, Eng yuqori yorug'lik to'lqin shakllari va mo'ylovning burilish reaktsiyalari. p, bitta urinishning boshoqlari, misolning hujayralarida mo'ylovlarning og'ishi bilan mos keladi. 0 mo'ylovning og'ishini bildiradi (chiziq chiziq). q, barcha fotosensitiv hujayralar uchun populyatsiya bo'yicha o'rtacha z-skorli otishni o'rganish tezligi, nol vaqtdagi mo'ylov og'ishi (chiziq chiziq) (qizil) yoki tasodifiy yaratilgan vaqt belgilari (kulrang). r, Mo'ylovning og'ishi (n = 3 kalamush) bilan sezilarli darajada modulyatsiyalangan fotosensitiv birliklarning nisbati (chapda). Eng yuqori z-skorli kechikish (n = 3 ta kalamush; n = 5 (och yashil), n = 4 (to‘q yashil) va har bir kalamush uchun n = 4 (ko‘k) mo‘ylov burilish modulyatsiyasi birliklari) (o‘ngda). Ma'lumotlar o'rtacha ± standart og'ish sifatida ifodalanadi
Keyin biz t-hCO ning in vivo jonli ravishda hissiy stimullar bilan faollashishi mumkinligini so'radik. Biz genetik kodlangan kaltsiy ko'rsatkichlari GCaMP6 ni ifodalovchi hCO ni S1 kalamushlariga ko'chirdik. 150 kundan so'ng biz tolali fotometriya yoki ikkita fotonli kaltsiy tasvirini o'tkazdik (4h-rasm va kengaytirilgan ma'lumotlar, 10a-rasm). Biz t-hCO xujayralari sinxronlashtirilgan ritmik faollikni namoyish qilishini aniqladik (4i-rasm, kengaytirilgan ma'lumotlar, 10b-rasm va qo'shimcha video 1). Eng yuqori t-hCO faolligini tavsiflash uchun biz behushlik qilingan transplantatsiya kalamushlarida hujayradan tashqari elektrofizyologik yozuvlarni o'tkazdik (kengaytirilgan ma'lumotlar, 10c-f-rasm). MRI tasvirlaridan stereotaksik koordinatalarni yaratdik; Shunday qilib, bu qayd qilingan birliklar taxminiy inson neyronlarini ifodalaydi, garchi elektrofiziologiyaning o'zi kelib chiqish turini aniqlashga imkon bermaydi. Biz faoliyatning sinxronlashtirilgan portlashlarini kuzatdik (kengaytirilgan ma'lumotlar, 10d-rasm). Portlashlar taxminan 460 milodiy davom etdi va ular taxminan 2 soniyalik sukunat davrlari bilan ajratildi (kengaytirilgan ma'lumotlar, 10d-rasm, e). Alohida birliklar har bir portlashda o'rtacha uch marta o'q uzdi, bu har bir portlash uchun ro'yxatdan o'tgan birliklarning taxminan 73% ni tashkil qiladi. Alohida birliklarning faoliyati yuqori darajada bog'liq edi va bu korrelyatsiyalar bir xil sharoitlarda qayd etilgan emlanmagan hayvonlarda aniqlangan birliklarga qaraganda yuqori edi (kengaytirilgan ma'lumotlar, 10f-rasm). Aniqlangan odamdan olingan neyronlarning tikanli reaktsiyalarini yanada tavsiflash uchun biz hCO bilan transplantatsiya qilingan behushlik qilingan kalamushlarda yorug'likka sezgir kation kanali rodopsin 2 (hChR2) ni ifodalovchi yorug'lik belgilarini aniqlash tajribalarini o'tkazdik, bu orqali t-hCO neyronlari qisqa kechikishda tan olinadi (ko'k nurga javob 10 ms dan kam). t-hCO neyronlari kaltsiy ko'rishda kuzatilganlarga o'xshash chastotalarda o'z-o'zidan paydo bo'ladigan faollikning portlashlarini, shuningdek, yorug'lik belgilari bo'lmagan holda t-hCO da amalga oshirilgan elektrofizyologik yozuvlarni ko'rsatdi (kengaytirilgan ma'lumotlar, 10c-g-g). In vitroda qayd etilgan hCO ning tegishli bosqichlarida spontan faollik kuzatilmadi. T-hCO ning sensorli stimullar bilan faollashishi mumkinligini baholash uchun biz kalamush mo'ylovlarini t-hCO dan qisqacha chetga surib qo'ydik (4j, m-rasm va kengaytirilgan ma'lumotlar, 10h, k-rasm). Oldingi tadqiqotlarga ko'ra8,10, t-hCO hujayralarining kichik to'plami mo'ylovning burilishiga javoban faollikni oshirdi, bu ma'lumotlar tasodifiy vaqt belgilari bilan solishtirilganda kuzatilmadi (4k-q-rasm va kengaytirilgan ma'lumotlar, 10h-q-rasm). Haqiqatan ham, opto-yorliqlangan yagona birliklarning taxminan 54% mo'ylovli stimulyatsiyadan so'ng sezilarli darajada ortib borayotgan qo'zg'alish tezligini ko'rsatdi, bu esa taxminan 650 ms ga etadi (4r-rasm). Birgalikda bu ma'lumotlar shuni ko'rsatadiki, t-hCO tegishli funktsional kirishlarni oladi va atrof-muhit stimullari bilan faollashishi mumkin.
Keyin biz t-hCO ning xatti-harakatlarni nazorat qilish uchun kalamushlarda zanjirlarni faollashtirishi mumkinligini tekshirdik. Biz birinchi navbatda t-hCO neyronlarining aksonlari kalamushning atrofdagi to'qimalariga tushishini tekshirdik. Biz hCO ni EYFP (hChR2-EYFP) bilan birlashtirilgan hChR2 kodlovchi lentivirus bilan yuqtirdik. 110 kundan so'ng, biz EYFP ifodasini ipsilateral kortikal hududlarda, shu jumladan eshitish, vosita va somatosensor kortekslarda, shuningdek, subkortikal hududlarda, shu jumladan striatum, hipokampus va talamusda kuzatdik (5a-rasm). Ushbu efferent proektsiyalar kalamush hujayralarida sinaptik reaktsiyalarni keltirib chiqarishi mumkinligini baholash uchun biz o'tkir miya bo'limlarida kalamush miya yarim korteksi hujayralarini yozib olish orqali hChR2-EYFPni ifodalovchi t-hCO hujayralarini optik faollashtirdik. T-hCO aksonlarining ko'k chiroq bilan faollashishi NBQX tomonidan bloklangan kalamush piramidal korteks neyronlarida qisqa muddatli EPSC'larni keltirib chiqardi (5b-g-rasm). Bundan tashqari, bu javoblar tetrodotoksin (TTX) tomonidan bloklanishi va 4-aminopiridin (4-AP) tomonidan tiklanishi mumkin, bu ularning monosinaptik ulanishlar tufayli yuzaga kelganligini ko'rsatadi (5e-rasm).
a, akson kuzatuvining sxematik diagrammasi (chapda). t-hCO EYFP ifodasi (o'ngda). Masshtab paneli, 100 mkm. A1, eshitish qobig'i, ACC, oldingi singulat korteks, d. striatum, dorsal striatum, HPC, hipokampus; Diafragma, lateral septum, mPFC, medial prefrontal korteks, piri, piriform korteks, v. striatum, ventral striatum, VPM, talamusning ventropostomedial yadrosi, VTA, ventral tegmental mintaqa. Qizil kvadratlar miyaning tasvirlar olingan joylarini ifodalaydi. b, Rag'batlantirish tajribasining sxematik diagrammasi. c, d, Inson (c) EYFP+ t-hCO yoki kalamush (d) EYFP-hujayralarida ko'k yorug'likdan kelib chiqadigan fototok (yuqori) va kuchlanish (pastki) javobiga misollar. e, f, t-hCO aksonlarini TTX va 4-AR (yashil), TTX (kulrang) yoki aCSF (qora) (e), (binafsha) bilan yoki bo'lmasdan (qora) ) ) NBQX (e) bilan ko'k yorug'lik stimulyatsiyasidan keyin kalamush neyronlarining joriy izlari. g, kalamush hujayralarida ko'k nur bilan qo'zg'atilgan javoblarning kechikishi (n = 16 hujayra); gorizontal chiziqlar o'rtacha kechikishni (7,13 ms) ko'rsatadi (chapda). NBQX (n = 7 hujayra; *** P < 0,0001) (o'rtada) bilan yoki NBQXsiz qayd etilgan yorug'lik uyg'otuvchi EPSC amplitudasi. NBQX (n = 7 hujayra; *** P < 0,0001) (o'rtada) bilan yoki NBQXsiz qayd etilgan yorug'lik uyg'otuvchi EPSC amplitudasi. Amplituda vyzvannyh svetom EPSC, zaregistrirovannyh s yoki NBQX (n = 7 kletok; ***P <0,0001) (v tsentr). NBQX (n = 7 hujayra; *** P < 0.0001) (markazda) bilan yoki NBQX bo'lmagan holda qayd etilgan yorug'lik induktsiyali EPSC amplitudasi.nbqngjnjnbnbnbqnjngyngyjnjn EPSC língzhín (n = 7 yjínjín；***P < 0.0001）（mān）nbqngjnjnbnbnbqnjngyngyjnjn EPSC língzhín (n = 7 yjínjín；***P < 0.0001）（mān） Amplituda vyzvannyh svetom EPSC, zaregistrirovannyh s yoki NBQX (n = 7 kletok; ***P <0,0001) (v tsentr). NBQX (n = 7 hujayra; *** P < 0.0001) (markazda) bilan yoki NBQX bo'lmagan holda qayd etilgan yorug'lik induktsiyali EPSC amplitudasi.Moviy nurga javob beradigan EPSClarni ko'rsatadigan kalamush hujayralarining foizi (o'ngda). h, Xulq-atvor vazifasining sxematik diagrammasi. d0, kun 0. i. 1-kuni (chapda) yoki 15-kuni (o'ngda) namunali hayvonlarning bajarilishi. 1-kuni (chapda) yoki 15-kuni (o'ng markazda) amalga oshirilgan yalashlarning o'rtacha soni (n = 150 ko'k chiroq sinovi, n = 150 qizil chiroq sinovi; *** P <0,0001). 1-kuni (chapda) yoki 15-kuni (o'ng markazda) amalga oshirilgan yalashlarning o'rtacha soni (n = 150 ko'k chiroq sinovi, n = 150 qizil chiroq sinovi; *** P <0,0001). Srednee kolichestvo oblizyvaniy, vypolnennyx v den 1 (sleva) yoki den 15 (v tsentre sprava) (n = 150 ispytaniy s sinim svetom, n = 150 ispytaniy s sinim svetom; ***P <0,0001). 1-kuni (chapda) yoki 15-kuni (markaziy o'ngda) amalga oshirilgan o'rtacha yalash soni (n = 150 ko'k chiroq sinovi, n = 150 qizil chiroq sinovi; *** P <0,0001).1 y ng y y 15 y n y y y y y y y y n n = 150 y y 1 5 y n = língjíngínì***P <0,0001）。1 y ng y y 15 y n y y y y y y y y n n = 150 y y 1 5 y n = língíngìnì***P < 0,001 Srednee kolichestvo oblizyvaniy, vypolnennyx v den 1 (sleva) yoki den 15 (v tsentre sprava) (n = 150 ispytaniy s sinim svetom, n = 150 ispytaniy s sinim svetom; ***P <0,0001). 1-kuni (chapda) yoki 15-kuni (markaziy o'ngda) amalga oshirilgan o'rtacha yalash soni (n = 150 ko'k chiroq sinovi, n = 150 qizil chiroq sinovi; *** P <0,0001).1-kuni (oʻrtada chapda) yoki 15-kunida (oʻngda) qizil va koʻk yorugʻlik sinovlari uchun jamlangan yaladi. NS, muhim emas. j, k, 1 yoki 15-kunlarda hChR2-EYFP (j) yoki nazorat floroforini (k) ifodalovchi t-hCO bilan transplantatsiya qilingan barcha hayvonlarning xulq-atvor xususiyatlari (hChR2-EYFP: n = 9 kalamush, ** P = 0,0049; nazorat: n = 9, P = 0,14). l, Afzallik darajasining evolyutsiyasi (n = 9 hChR2, n = 9 nazorat; **P <0,001, ***P <0,0001). l, Afzallik darajasining evolyutsiyasi (n = 9 hChR2, n = 9 nazorat; **P <0,001, ***P <0,0001). l, Evolyutsiya pokazatelya predpochteniya (n = 9 hChR2, n = 9 nazorat; **P <0,001, ***P <0,0001). l, Afzallik darajasining evolyutsiyasi (n = 9 hChR2, n = 9 nazorat; **P <0,001, ***P <0,0001). l，kāngīngīngīngīn（n = 9 hChR2，n = 9 dín；**P <0,001，***P <0,0001）。 l，kāngīngīngīngīn（n = 9 hChR2，n = 9 dín；**P <0,001，***P <0,0001）。 l, evolyutsiya pokazateley predpochteniya (n = 9 hChR2, n = 9 nazorat; **P <0,001, ***P <0,0001). l, Afzallik ko'rsatkichlarining evolyutsiyasi (n = 9 hChR2, n = 9 nazorat; ** P < 0,001, *** P < 0,0001).m, S1da t-hCO ning optogenetik faollashuviga javoban FOS ifodasi. FOS ifodasi (chapda) va miqdoriy ko'rsatkichlari (guruh uchun n = 3; * P < 0,05, ** P < 0,01 va *** P < 0,001) (o'ngda) ko'rsatilgan. FOS ifodasi (chapda) va miqdoriy ko'rsatkichlari (guruh uchun n = 3; * P < 0,05, ** P < 0,01 va *** P < 0,001) (o'ngda) ko'rsatilgan. Pokazany izobrajeniya ekspressii FOS (sleva) va kolichestvennogo opredeleniya (n = 3 na gruppu; * P <0,05, ** P <0,01 va *** P <0,001) (sprava). FOS ifodasi (chapda) va miqdoriy ko'rsatkichlari (guruh uchun n = 3; * P<0,05, **P<0,01 va ***P<0,001) ko'rsatilgan (o'ngda).FOS língínjín = 3；*P < 0.05 ** P < 0.01 *** P < 0.001 dín）FOS língínjín = 3；*P < 0.05 ** P < 0.01 *** P < 0.001 dín） Pokazany izobrajeniya ekspressii FOS (sleva) va kolichestvennogo opredeleniya (n = 3 na gruppu; * P <0,05, ** P <0,01 va *** P <0,001) (sprava). FOS ifodasi (chapda) va miqdoriy ko'rsatkichlari (guruh uchun n = 3; * P<0,05, **P<0,01 va ***P<0,001) ko'rsatilgan (o'ngda).Masshtab paneli, 100 mkm. Ma'lumotlar BLA, bazolateral bodomsimon bez, MDT, dorsomedial talamik yadro, PAG, periaqueduktal kulrang o'rtacha ± standart xato sifatida ifodalanadi.
Nihoyat, biz t-hCO kalamushlarning xatti-harakatlarini modulyatsiya qila oladimi, deb so'radik. Buni sinab ko'rish uchun biz hChR2-EYFP ifodalovchi hCO ni S1 ga ko'chirdik va 90 kundan keyin yorug'lik etkazib berish uchun optik tolalarni t-hCO ga joylashtirdik. Keyin kalamushlarni o'zgartirilgan operant konditsioner paradigmasi bilan o'rgatganmiz (5h-rasm). Biz hayvonlarni xulq-atvor sinov kamerasiga joylashtirdik va tasodifiy 5 soniya ko'k (473 nm) va qizil (635 nm) lazer stimulyatorlarini qo'lladik. Hayvonlar ko'k yorug'lik qo'zg'alganda yalagan bo'lsa, lekin qizil yorug'lik qo'zg'alganda yalamasa, suv mukofoti oldi. Treningning birinchi kunida hayvonlar ko'k yoki qizil chiroq bilan rag'batlantirilganda yalashda farq ko'rsatmadi. Biroq, 15-kuni hChR2-EYFP ifodalovchi hCO bilan transplantatsiya qilingan hayvonlar, qizil yorug'lik stimulyatsiyasiga nisbatan ko'k chiroq bilan qo'zg'atilganda faolroq yalashni ko'rsatdi. Boshqarish floroforini ifodalovchi hCO bilan transplantatsiya qilingan nazorat hayvonlarida yalash xatti-harakatlaridagi bu o'zgarishlar kuzatilmadi (o'rganish muvaffaqiyat darajasi: hChR2 89%, EYFP 0%, 5i-1-rasm va qo'shimcha video 2). Ushbu ma'lumotlar shuni ko'rsatadiki, t-hCO hujayralari mukofotga intilish xatti-harakatlarini rag'batlantirish uchun kalamush neyronlarini faollashtirishi mumkin. Qaysi kalamush t-hCO neyron davrlari ushbu xatti-harakatlar o'zgarishida ishtirok etishi mumkinligini bilish uchun biz 90 daqiqadan so'ng o'qitilgan hayvonlarda va yig'ib olingan to'qimalarda t-hCO ni optogenetik faollashtirdik. Immunohistokimyo faollikka bog'liq bo'lgan FOS oqsilining harakatga bog'liq bo'lgan bir nechta miya mintaqalarida, shu jumladan medial prefrontal korteks, medial talamus va periaqueduktal kulrang moddada ifodalanganligini aniqladi, bu stimullanmagan nazorat hayvonlarida yoki hayvonlarda ifodalangan. guruch. 5 m). Birgalikda olingan ma'lumotlar, t-hCO xatti-harakatni boshqarish uchun kalamush neyron faolligini modulyatsiya qilishi mumkinligini ko'rsatadi.
Nerv organoidlari in vitroda inson rivojlanishi va kasalliklarini o'rganish uchun istiqbolli tizimdir, ammo ular in vivo mavjud bo'lgan davrlar o'rtasidagi aloqalarning yo'qligi bilan cheklangan. Biz yangi platformani ishlab chiqdik, unda immunitet tanqisligi bo'lgan erta postnatal kalamushlarning S1 ga hCO ni ko'chirib o'tkazdik, unda inson hujayralari rivojlanishi va in vivo jonli ishlashini o'rganish uchun. Biz t-hCO vitro28da kuzatilmagan etuk hujayra turlarini rivojlanishini va t-hCO ning anatomik va funktsional ravishda kemiruvchilar miyasiga birlashtirilganligini ko'rsatdik. T-hCO ning kemiruvchilarning neyron davrlariga integratsiyalashuvi bizga inson hujayra faoliyati va o'rganilgan hayvonlarning xatti-harakatlari o'rtasida bog'liqlikni o'rnatishga imkon berdi, bu t-hCO neyronlari xatti-harakatlarga javob berish uchun kalamush neyron faolligini modulyatsiya qilishini ko'rsatdi.
Biz tasvirlab bergan platforma inson hujayralarini kemiruvchilar miyasiga ko‘chirib o‘tkazish bo‘yicha oldingi tadqiqotlarga nisbatan bir qancha afzalliklarga ega. Birinchidan, biz hCO ni erta postnatal kalamushlarning rivojlanayotgan korteksiga ko'chirdik, bu anatomik va funktsional integratsiyani osonlashtirishi mumkin. Ikkinchidan, t-hCO MRI monitoringi bizga tirik hayvonlarda greft holatini va o'sishini o'rganishga imkon berdi, bu bizga uzoq muddatli ko'p hayvonlarni o'rganish va bir nechta hiPS hujayra liniyalarining ishonchliligini aniqlash imkonini berdi. Nihoyat, biz inson hujayralari uchun kamroq halokatli bo'lgan va kalamush miyasida inson korteks neyronlarining integratsiyasi va paydo bo'lishiga yordam beradigan izolyatsiya qilingan bitta hujayrali suspenziyalar o'rniga, buzilmagan organoidlarni transplantatsiya qildik.
Biz tan olamizki, ushbu platformadagi yutuqlarga qaramay, vaqtinchalik, fazoviy va o'zaro faoliyat turlari cheklovlari, hatto rivojlanishning dastlabki bosqichida transplantatsiya qilinganidan keyin ham, yuqori aniqlik bilan inson neyron davrlarini shakllantirishga to'sqinlik qiladi. Misol uchun, t-hCO da kuzatilgan o'z-o'zidan paydo bo'ladigan faollik kortikal rivojlanish jarayonida kuzatilgan ritmik faollikka o'xshash rivojlanish fenotipini ifodalaydimi yoki bu t-hCO da mavjud bo'lgan bostiruvchi hujayra turlarining yo'qligi bilan bog'liqmi, aniq emas. Xuddi shunday, t-hCO da laminatsiyaning yo'qligi zanjir ulanishiga qanchalik ta'sir qilishi aniq emas30. Kelgusi ish inson mikrogliyasi, inson endotelial hujayralari va GABAergik interneyronlarning turli nisbatlari kabi boshqa hujayra turlarini in vitro yig'ish 6 yordamida ko'rsatilganidek integratsiyalashga, shuningdek o'zgartirilgan t-hCO da neyron integratsiya va qayta ishlash qanday sodir bo'lishi mumkinligini tushunishga qaratilgan. bemorlardan olingan hujayralardagi transkripsiya, sinaptik va xatti-harakatlar darajasi.
Umuman olganda, bu in vivo platformasi in vitro inson miyasi rivojlanishi va kasalliklarni o'rganishni to'ldiradigan kuchli manbadir. Umid qilamizki, ushbu platforma bemor tomonidan olingan hujayralardagi yangi zanjir darajasidagi fenotiplarni kashf qilish va yangi terapevtik strategiyalarni sinab ko'rish imkonini beradi.
Yuqorida aytib o'tilganidek, biz HiPS hujayralaridan hCO2.5 hosil qildik. Oziqlantiruvchi qatlamlarda o'stirilgan hiPS hujayralaridan hCO ishlab chiqarishni boshlash uchun hiPS hujayralarining buzilmagan koloniyalari dispase (0,35 mg / ml) yordamida madaniy idishlardan olib tashlandi va hiPS hujayra madaniyat muhiti bo'lgan idishlarni o'z ichiga olgan ultra past biriktiruvchi plastik kulturalarga o'tkazildi. (Corning) ikkita SMAD inhibitori dorsomorfin (5 mkM; P5499, Sigma-Aldrich) va SB-431542 (10 mkM; 1614, Tocris) va ROCK inhibitori Y-27632 (10 mkM; S1049, Selleckchem) bilan to'ldirilgan. Birinchi 5 kun davomida hiPS hujayra muhiti har kuni o'zgartirildi va dorsomorfin va SB-431542 qo'shildi. Suspenziyaning oltinchi kuni neyrobazal-A (10888, Life Technologies), A vitaminisiz B-27 qo'shimchasi (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies), penitsillin va Life Technologies (1100), neyrobazal-A (10888, Life Technologies), neyrobazal sferoidlar neyron muhitga o'tkazildi. 24-kungacha epidermal o'sish omili (EGF; 20 ng ml-1; R&D Systems) va fibroblast o'sish omili 2 (FGF2; 20 ng ml-1; R&D Systems) bilan to'ldiriladi. 25 kundan 42 kungacha vosita miyadan olingan neyrotrofik omil (BD-2) va Petex-ml-2 bilan to'ldirildi. neyrotrofin 3 (NT3; 20 ng ml-1; Peprotech) har kuni o'rtacha o'zgarishlar bilan. Suspenziyaning oltinchi kuni neyrobazal-A (10888, Life Technologies), A vitaminisiz B-27 qo'shimchasi (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies), penitsillin va Life Technologies (1100), neyrobazal-A (10888, Life Technologies), neyrobazal sferoidlar neyron muhitga o'tkazildi. 24-kungacha epidermal o'sish omili (EGF; 20 ng ml-1; R&D Systems) va fibroblast o'sish omili 2 (FGF2; 20 ng ml-1; R&D Systems) bilan to'ldiriladi. 25 kundan 42 kungacha vosita miyadan olingan neyrotrofik omil (BD-2) va Petex-ml-2 bilan to'ldirildi. neyrotrofin 3 (NT3; 20 ng ml-1; Peprotech) har kuni o'rtacha o'zgarishlar bilan.Oltinchi kuni suspenziyada neyrobazal-A (10888, Life Technologies), vitamin A bo'lmagan B-27 qo'shimchasi (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies), penitsillinni o'z ichiga olgan asabiy sferoidlar asabiy muhitga o'tkazildi.va streptomitsin (1:100, Life Technologies) va qo'shimcha epidermal omil rosta (EGF; 20 ng/ml; R&D Systems) va faktor rosta fibroblastov 2 (FGF2; 20 ng/ml; R&D Systems) dan 24 gacha. va streptomitsin (1:100, Life Technologies) va 24-kungacha epidermal o'sish omili (EGF; 20 ng/ml; R&D Systems) va fibroblast o'sish omili 2 (FGF2; 20 ng/ml; R&D tizimlari) bilan to'ldiriladi.25 dan 42 kungacha muhitga miyadan olingan neyrotrofik omil (BDNF; 20 ng ml-1, Peprotech) va neyrotrofin 3 (NT3; 20 ng ml-1, Peprotech) qo'shildi, har kuni muhit o'zgartirildi.míngíííí6 yínínííníínínínínínínínínínínínínėnínėnėnėnėnėnėnėnėneurobasal-A（10888，Life Technologies）、dčnglībībībīlīb 12587，Life Technologies）、GlutaMax（1:100，Life Technologies） Technologies ） ng ng ng ng ng ng ng ng ng ng ng ng y ng ng ng ng ng ng ng ng ng ng ng ng ng ng ml-1 ； R&D Systems ） ng ng ng ng ng ng ng ng ng ng ng ng ng ng ng ng ng ng ng ng ng ng ng ng ng ng ng ng ng y ng ng y ng ng y ng ng ng ng ng ng ng ng ng ng Tizimlar） 24 máng6 lín lín lín yín lín línín línínín yínínín néurobasal-a (10888), Life Technologies） b-27 língín （12587 ， Life Technologies） Glutamax （1: 100 ， Life TechNOGIS língín :） 100 ， Life Technologies ） chăngčiči （（（（20 ng ml-1； r & d Systems） línjīfg 2（fng 2（fg 2； 1；Ar-ge tizimlari） mán 24 yáng. 6-y den neyrobazal-A (10888, Life Technologies), dobavku V-27 (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies), soderjashuchuyu neyrobazal-A (10888) streptomitsin (1:100, Life Technologies) epidermal omil rosta (EGF; 20 ng ml-1; R&D Systems) va faktor rosta fibroblastov 2 (FGF2; 20 ng ml-1) 1; 6-kuni neyrosfera suspenziyalari tarkibida neyrobazal-A (10888, Life Technologies), A vitaminisiz B-27 qo'shimchasi (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies), penitsillin-neytralizatsiyalangan Life Technologies (1:01) ni o'z ichiga olgan qo'shimchaga almashtirildi. epidermal o'sish omili (EGF; 20 ng ml-1; R&D Systems) va fibroblast o'sish omili 2 (FGF2; 20 ng ml-1) 1 bilan to'ldirilgan; R&D Systems) 24 kungacha. R&D tizimlari) 24-kungacha.25 dan 42 kungacha har kuni madaniyat muhitiga miyadan olingan neyrotrofik omil (BDNF; 20 ng ml-1, Peprotech) va neyrotrofik omil 3 (NT3; 20 ng ml-1, Peprotech) qo'shildi. O'rtacha bir marta o'zgartirish.43-kundan boshlab hCO 4-6 kunda bir marta o'zgarib turadigan qo'shimchasiz neyrobazal-A muhitida (NM; 1088022, Thermo Fisher) saqlanadi. Oziqlantiruvchisiz sharoitda yetishtirilgan hiPS hujayralaridan hCO ni olish uchun hiPS xujayralari Accutase (AT-104, Innovate Cell Technologies) bilan 7 daqiqa davomida 37 ° C da inkubatsiya qilindi, bitta hujayralarga ajratildi va AggreWell 800 plastinkalariga qo'yildi (34815, STEMCELL Technologies 1 × 3 quduqda) ROCK inhibitori Y-27632 (10 mkM; S1049, Selleckchem) bilan to'ldirilgan Essential 8 muhiti. 24 soatdan so'ng, quduqlardagi muhit dorsomorfin (2,5 mkM; P5499, Sigma-Aldrich) va SB-431542 (10 mkM4;) bilan to'ldirilgan Essential 6 muhiti (A1516401, Life Technologies) o'z ichiga olgan muhitga yuqoriga va pastga pipetlandi. , Tokrida). 2 kundan 6 kungacha Essential 6 muhiti har kuni dorsomorfin va SB-431542 qo'shimchasi bilan almashtirildi. Oltinchi kundan boshlab neyrosfera suspenziyalari neyrobazal muhitga o'tkazildi va yuqorida ta'riflanganidek saqlanib qoldi.
Hayvonlarning barcha protseduralari Stenford universiteti laboratoriya hayvonlarini parvarish qilish bo'yicha ma'muriy qo'mitasi (APLAC) tomonidan tasdiqlangan hayvonlarni parvarish qilish bo'yicha ko'rsatmalarga muvofiq amalga oshirildi. Homilador eutimik RNU (rnu /+) kalamushlari sotib olindi (Charlz daryosi laboratoriyalari) yoki uy-joy. Hayvonlar oziq-ovqat va suv ad libitum bilan 12 soatlik yorug'lik-zulmat tsiklida saqlangan. Uchdan etti kungacha bo'lgan yalang'och (FOXN1–/–) kalamush kuchuklari o'ldirilishdan oldin etuk bo'lmagan mo'ylovlarning o'sishi bilan aniqlangan. Kuchukchalar (erkak va urg'ochi) 2-3% izofluran bilan behushlik qilindi va stereotaksik ramkaga joylashtirildi. Dura materning yaxlitligini saqlab, S1 dan taxminan 2-3 mm diametrli bosh suyagining trepanatsiyasi amalga oshirildi. Keyin durani teshish uchun kraniotomiya tashqarisida 30-G igna (taxminan 0,3 mm) foydalaning. Keyin HCO ni yupqa 3 × 3 sm parafilmga qo'llang va ortiqcha muhitni olib tashlang. 23 G, 45 ° ignaga biriktirilgan Hamilton shpritsidan foydalanib, hCO ni ignaning eng distal uchiga muloyimlik bilan torting. Keyin shpritsni stereotaksik qurilmaga ulangan shprits pompasiga o'rnating. Keyin ignaning uchini durada oldindan qilingan 0,3 mm kenglikdagi teshilish teshigi ustiga qo'ying (z = 0 mm) va igna dura mater A orasiga kelguncha shpritsni 1-2 mm (z = taxminan -1,5 mm) toraytiring. zich muhr hosil bo'ladi. Keyin shpritsni kortikal yuzaning o'rtasiga z = -0,5 mm ga ko'taring va hCO ni daqiqada 1-2 µl tezlikda AOK qiling. HCO in'ektsiyasi tugagandan so'ng, igna daqiqada 0,2-0,5 mm tezlikda tortiladi, teriga tikiladi va kuchukcha to'liq tiklanishigacha darhol issiq isitish yostig'iga joylashtiriladi. Ba'zi hayvonlar ikki tomonlama transplantatsiya qilingan.
Hayvonlarning barcha protseduralari Stenford universiteti APLAC tomonidan tasdiqlangan hayvonlarni parvarish qilish bo'yicha ko'rsatmalarga muvofiq amalga oshirildi. Kalamushlar (transplantatsiya qilinganidan keyin 60 kundan ortiq) 5% izofluran anesteziyasi bilan induktsiya qilingan va tasvirlash paytida 1-3% izofluran bilan behushlik qilingan. Vizualizatsiya qilish uchun AVANCE yordamida 7 Tesla faol himoyalangan gorizontal quduq skaneri Bruker (Bruker Corp.) Xalqaro elektr kompaniyasi (IECO) gradient haydovchisi, ichki diametri 120 mm (600 mT/m, 1000 T/m/s) bo‘lgan ekranlangan gradient qo‘shimchasi ishlatilgan. III, sakkiz kanalli ko'p bobinli RF va ko'p yadroli imkoniyatlar va unga hamroh bo'lgan Paravision 6.0.1 platformasi. Yozish ichki diametri 86 mm bo'lgan faol ajratilgan volumetrik RF lasan va faqat qabul qilish uchun to'rt kanalli krio-sovutuvchi RF bobini yordamida amalga oshirildi. Eksenel 2D Turbo-NODIR (takrorlash vaqti = 2500 ms, aks-sado vaqti = 33 ms, 2 o'rtacha) 16 ta bo'lakni suratga olish, tilim qalinligi 0,6-0,8 mm, 256 × 256 namunani o'z ichiga oladi. Signallar ichki diametri 2 sm (Rapid MR International, MChJ) bo'lgan to'rtburchak qabul qiluvchi hajmli RF bobini yordamida qabul qilindi. Nihoyat, 3D renderlash va hajm tahlili uchun oʻrnatilgan Imaris (BitPlane) sirtini baholash funksiyalaridan foydalaning. Muvaffaqiyatli transplantatsiya transplantatsiya qilingan yarim sharda uzluksiz T2 og'irlikdagi MRI signali joylari shakllangani sifatida aniqlandi. Transplantatsiyani rad etish transplantatsiya qilingan yarim sharda doimiy T2 vaznli MRI signali joylarini ishlab chiqarmaydigan greft sifatida aniqlandi. Subkortikal t-hCO keyingi tahlildan chiqarildi.
Ikki fotonli kaltsiyni tasvirlash uchun hCO dagi GCaMP6 ni barqaror ifodalash uchun hiPS hujayralari pLV[Exp]-EF1a::GcaMP6s-WPRE-Puro bilan infektsiyalangan, so'ngra antibiotiklar tanlangan. Qisqacha aytganda, hujayralar EDTA bilan ajralib chiqdi va 1 ml Essential 8 muhitida polibren (5 mkg / ml) va 15 mkl virus ishtirokida taxminan 300 000 hujayra zichligida to'xtatildi. Keyin hujayralar suspenziyada 60 daqiqa davomida inkubatsiya qilindi va har bir quduqqa 50 000 hujayra zichligida ekildi. Qo'shilgandan so'ng, hujayralar 5-10 mkg ml-1 puromisin bilan 5-10 kun davomida yoki barqaror koloniyalar paydo bo'lguncha davolandi. O'tkir hCO infektsiyasi ba'zi o'zgartirishlar bilan ilgari ta'riflanganidek amalga oshirildi5. Qisqacha aytganda, kunlik 30-45 hCO ni 100 mkl asab muhiti bo'lgan 1,5 ml Eppendorf mikrosentrifuga naychalariga o'tkazing. Keyin taxminan 90 µl muhit chiqariladi, 3-6 µl yuqori titrli lentivirus (0,5 x 108 dan 1,2 x 109 gacha) naychaga qo'shiladi va hCO 30 daqiqa davomida inkubatorga o'tkaziladi. Keyin har bir kolbaga 90-100 mkl muhit qo'shing va naychalarni bir kechada inkubatorga qaytaring. Ertasi kuni hCO ni yangi nerv muhitiga past biriktiruvchi plitalarga o'tkazing. 7 kundan so'ng, hCO 24-quduqli shisha taglik plitalariga ko'rish va infektsiya sifatini baholash uchun o'tkazildi. pLV[Exp]-SYN1::EYFP-WPRE va pLV[Exp]-SYN1::hChR2-EYFP-WPRE VectorBuilder tomonidan yaratilgan. Lentivirus ko'pgina tajribalarda qo'llaniladi, chunki u mezbon genomiga integratsiyalashgan bo'lib, infektsiyalangan hujayra liniyalarida muxbir genini ifodalashga imkon beradi. Quturishni kuzatish uchun 30-45 hCO kun quturgan-DG-eGFP va AAV-DJ-EF1a-CVS-G-WPRE-pGHpA (plazmid №67528, Addgene) bilan birgalikda yuqtirildi, 3 kun davomida yaxshilab yuvildi va S1-da 7 kun davomida kalamushlarga ko'chirildi.
Immunotsitokimyo uchun hayvonlar anesteziya qilingan va PBS bilan transkardial perfuziya qilingan, keyin 4% paraformaldegid (PBS da PFA; Elektron mikroskopiya fanlari). Miyalar 4% PFAda 2 soat yoki bir kechada 4°C da fiksatsiya qilindi, 30% saxarozada PBSda 48-72 soat davomida krioservalanadi va 1:1, 30% saxaroza ichiga kiritiladi: OCT (Tissue-Tek OCT Compound 4583, Sakura Finetek) va koron 0 mkm bo'linmasi yordamida hosil bo'ldi. (Leika). Qalin bo'laklarning immunohistokimyosini o'tkazish uchun hayvonlarga PBS yuborildi va miya dissektsiya qilindi va vibratom (Leica) yordamida koronal 300-400 mkm bo'lindi va bo'limlar 30 daqiqa davomida 4% PFA bilan o'rnatildi. Keyin kriyoseksiyalar yoki qalin qismlar PBS bilan yuviladi, xona haroratida 1 soat davomida bloklanadi (10% normal eshak zardobi (NDS) va PBSda suyultirilgan 0,3% Triton X-100) va 4 ° C da blokirovka qiluvchi eritma bilan bloklanadi. – Inkubatsiya kriozeksiyalari bir kechada inkubatsiya qilindi va qalin qismlar 5 kun davomida inkubatsiya qilindi. Ishlatilgan asosiy antikorlar: anti-NeuN (sichqoncha, 1:500; ab104224, abcam) anti-CTIP2 (kalamush, 1:300; ab18465, abcam), anti-GFAP (quyon, 1:1,000; Z0334, Dako), anti-GFP, G17,10; GeneTex), anti-HNA (sichqoncha, 1:200; ab191181, abcam), anti-NeuN (quyon, 1:500; ABN78, Millipore), anti-PDGFRA (quyon, 1:200; sc-338, Santa Cruz), anti-PPP1R17 (quyon, H:20819; Antikorlar), anti-RECA-1 (sichqoncha, 1:50; ab9774, abcam), anti-SCG2 (quyon, 1:100; 20357-1-AP, Proteintech), anti-SOX9 (echki, 1:500; AF3075, R&D Systems), Netrin, R01a; Tizimlar), anti-STEM121 (sichqoncha, 1:200; Y40410, Takara Bio), anti-SATB2 (sichqoncha, 1:50; ab51502, abcam), anti-GAD65/67 (quyon, 1:400; ABN904, Millipore) va anti-IBA1 (goat, ab17, ab10;). Ishlatilgan asosiy antikorlar: anti-NeuN (sichqoncha, 1:500; ab104224, abcam) anti-CTIP2 (kalamush, 1:300; ab18465, abcam), anti-GFAP (quyon, 1:1,000; Z0334, Dako), anti-GFP (chick, G17,10; GeneTex), anti-HNA (sichqoncha, 1:200; ab191181, abcam), anti-NeuN (quyon, 1:500; ABN78, Millipore), anti-PDGFRA (quyon, 1:200; sc-338, Santa Cruz), anti-PPP1R17 (quyon, H:20819; Antikorlar), anti-RECA-1 (sichqoncha, 1:50; ab9774, abcam), anti-SCG2 (quyon, 1:100; 20357-1-AP, Proteintech), anti-SOX9 (echki, 1:500; AF3075, R&D Systems), Netrin, G061; R&D tizimlari), anti-STEM121 (sichqoncha, 1:200; Y40410, Takara Bio), anti-SATB2 (sichqoncha, 1:50; ab51502, abcam), anti-GAD65/67 (quyon, 1:400; ABN904, Millipore) va anti-IBA1, ab701; abcam). Ispolzovalis sleduyushchie pervichnye antitela: anti-NeuN (myshinye, 1:500; ab104224, abcam), anti-CTIP2 (krysinye, 1:300; ab18465, abcam), anti-GFAP (krolichi, 1:10ko), anti-FAP (krolichi, DaFko - 1:10) (kuritsa, 1:1000; GTX13970, GeneTex), anti-HNA (mysh, 1:200; ab191181, abcam), anti-NeuN (krolik, 1:500; ABN78, Millipore), anti-PDGFRA (krolik, 1:208, sc3PP1R1), anti-PDGF1; (krolik, 1:200; HPA047819, Atlas Antikorlar), anti-RECA-1 (mysh, 1:50; ab9774, abcam), anti-SCG2 (krolik , 1:100; 20357-1-AP, Proteintech), anti-SOX9 (koziy50D0; netrin G1a (koziy, 1:100; AF1166, R&D Systems), anti-STEM121 (myshinyy , 1:200; Y40410, Takara Bio), anti-SATB2 (mysh, 1:50; ab51502, abcam), anti-GAD65/67,AB409; Millipore) va anti-IBA1 (koza, 1 :100; ab5076, abkam). Ishlatilgan asosiy antikorlar: anti-NeuN (sichqoncha, 1:500; ab104224, abcam), anti-CTIP2 (kalamush, 1:300; ab18465, abcam), anti-GFAP (quyon, 1:1000; Z0334, Dako), anti-GFP: Gene, GTX100; anti-HNA (sichqoncha, 1:200; ab191181, abcam), anti-NeuN (quyon, 1:500; ABN78, Millipore), anti-PDGFRA (quyon, 1:200; sc-338, Santa Cruz), anti-PPP1R17 (quyon, H1907; At, Antibolas); anti-RECA-1 (sichqoncha, 1:50; ab9774, abcam), anti- SCG2 (quyon, 1:100; 20357-1-AP, Proteintech), anti-SOX9 (echki, 1:500; AF3075, R&D Systems), netrin G1a (echki, R16; tizimi), anti-R16; STEM121 (sichqoncha, 1:200; Y40410, Takara Bio), anti-SATB2 (sichqoncha, 1:50; ab51502, abcam), anti-GAD65/67 (quyon, 1:400; ABN904, Millipore) va anti-IBA1 (echki, abkam, 1:507).chnjnjngjnjnwyngy:màn NeuN（yjīn＠＠, 1:500；ab104224，abcam）mān CTIP2（yīngīn＠, 1:3 00；ab18465，abcam），gFAP（兔，1:1,000；Z0334，Dako），bcam-GF P（bànＡ，1:1,000；GTX13970，GeneTex），hnHNA（jàngīn＠, 1:200；ab1911 81，abcam），mānNeuN（n，,1:500；ABN78，Millipore），mānPDGFRA（dā， 1:200；sc-338，Santa Kruz），抗PPP1R17（兔，1:200；HPA047819，Atlas màngín）），mān RECA-1（jàngān＠, 1:50；ab9774，abcam），mānSCG2（yān）, 1:100；20357-1-AP，Proteintech），mān SOX9（mān＊，1:500；AF3075，Ar-ge tizimlari），Netrin G1a；20357-1-AP，6（6（0（11AF，1:11 Tizimlar），mān STEM121（jīng, 1:200;shnzngyjnzhīnīn:wàn NeuN（yjīn＠＠, 1:500；ab104224，abcam）mān CTIP2（bàngjīn＠, 1 :300；ab18465，abcam），gFAP（兔，1:1,000；Z0334，Dako），mān -GFP（yànＡ，1:1,000；GTX13970，GeneTex），hnHNA（jàngàng＠, 1:200；ab 191181，abcam），mānNeuN（yān，,1:500；ABN78，Millipore％４４，mān 1: 200；sc-338，Santa Kruz），pPP1R17（yān，1:200；HPA047819，Atlas màngān）），mān RECA-1（bàngān＠, 1:50；ab9774，abcam），mānSCG2 100；20357-1-AP，Proteintech），mān SOX9（lān＊，1:500；AF3075，Ar-ge tizimlari），Netrin G1a（6；R6；, AF110, 1:10& Tizimlar）1:20, ;Y40410, Takara Bio), anti-SATB2 (sichqoncha, 1:50; ab51502, abcam), anti-GAD65/67 (quyon, 1:400; ABN904, Millipore) va anti-IBA1 (echki, 1:100; ab5076, abcam)。Amaldagi asosiy antikorlar: anti-NeuN (sichqoncha, 1:500; ab104224, abcam), anti-CTIP2 (kalamush, 1:300; ab18465, abcam), anti-GFAP (quyon, 1:1000; Z0334, Dako). , anti-GFP (tovuq, 1:1000; GTX13970, GeneTex), anti-HNA (sichqoncha, 1:200; ab191181, abcam), anti-NeuN (quyon, 1:500; ABN78, Millipore), anti-PDGFRA ( quyon, C3:20, sc10;-), anti-PPP1R17 (quyon, 1:200; HPA047819, Atlas antikor), anti-RECA-1 (sichqoncha, 1:50; ab9774, abcam), anti- SCG2 (quyon), 1:100;20357-1-AP, Proteintech), anti-SOX9 (koza, 1:500; AF3075, R&D Systems), Netrin G1a (koza, 1:100; AF1166, R&D Systems), anti-STEM121 (mysh, 1:200, Takaramysh, Y4041), 1:50; ab51502, abcam), anti-GAD65/67 (krolik, 1:400; ABN904, Millipore) va anti-IBA1 (koza, 1:100; ab5076, abkam). 20357-1-AP, Proteintech), anti-SOX9 (echki, 1:500; AF3075, R&D Systems), Netrin G1a (echki, 1:100; AF1166, R&D Systems), anti-STEM121 (sichqoncha, 1:200; Takaramo, Y4041) 1:50; ab51502, abcam), anti-GAD65/67 (quyon, 1:400; ABN904, Millipore) va anti-IBA1 (echki, 1:100; ab5076, abkam).Keyin bo'limlar PBS bilan yuvildi va ikkilamchi antikor bilan 1 soat davomida xona haroratida (muzlatilgan qismlar) yoki kechasi 4 ° C da (qalin bo'laklar) inkubatsiya qilindi. Bloklovchi eritmada 1:1000 nisbatda suyultirilgan Alexa Fluor ikkilamchi antikori (Life Technologies) ishlatilgan. PBS bilan yuvilgandan so'ng, yadrolar Hoechst 33258 (Life Technologies) bilan ingl. Nihoyat, slaydlar Aquamount (Polysciences) yordamida qopqoqli mikroskopga (Fisher Scientific) joylashtirildi va rasmda Keyence floresan mikroskopida (BZ-X analizatori) yoki Leica TCS SP8 konfokal mikroskopida (Las-X) tahlil qilindi. Rasmlar ImageJ dasturi (Fiji) yordamida qayta ishlandi. T-hCO va kalamush korteksidagi inson neyronlarining ulushini aniqlash uchun t-hCO markazida, kalamush korteksining chetida yoki yaqinida 387,5 mkm kenglikdagi to'rtburchaklar tasvirlar olingan. Graft chegaralari to'qimalarning shaffofligi, HNA + yadrolari va / yoki to'qimalarning avtofluoresansidagi o'zgarishlarni baholash orqali aniqlandi. Har bir rasmda NeuN + va HNA + hujayralarining umumiy soni bir xil hududdagi NeuN + hujayralarining umumiy soniga bo'lingan. Faqat tasvir tekisligida yadrolari bo'lgan hujayralar hisoblanishini ta'minlash uchun hisob-kitobga faqat Hoechst+ bo'lgan hujayralar kiritiladi. Statistik xatolikni kamaytirish uchun kamida 1 mm bilan ajratilgan ikkita rasm o'rtacha hisoblangan.
Namuna olishdan bir hafta oldin, hCO transplantatsiyasi hayvonlarini (taxminan 8 oylik farqlanish) sensorli stimulyatsiyani kamaytirish uchun mo'ylovlari kesilgan qorong'i xonaga joylashtiring. Yadrolarni izolyatsiyalash avval aytib o'tilganidek, ba'zi o'zgarishlar bilan amalga oshirildi. Qisqacha aytganda, t-hCO va hCO2 detarjan-mexanik hujayra lizisi va 2 ml shisha to'qimalarni maydalagich (D8938, Sigma-Aldrich/KIMBLE) yordamida yo'q qilindi. Keyin xom yadrolar 40 mkm filtr yordamida filtrlangan va saxaroza zichligi gradientini amalga oshirishdan oldin 320 g da 10 daqiqa davomida 4 ° C da santrifüj qilingan. Santrifüjlash bosqichidan so'ng (4°C da 20 daqiqa davomida 320 g) namunalar 0,04% BSA/PBSda 0,2 birlik µl-1 RNase inhibitori (40 u µl-1, AM2682, Ambion) qo‘shilgan holda qayta suspenziya qilindi va 40 µm oqim filtridan o‘tkazildi. Keyin dissotsiatsiyalangan yadrolar 0,02% BSA o'z ichiga olgan PBSda qayta suspenziya qilindi va Chromium Single Cell 3′ chipiga yuklandi (har bir chiziqda 8000 ta hujayraning tiklanishi taxmin qilinmoqda). snRNA-seq kutubxonalari Chromium Single cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics) bilan tayyorlangan. snRNA-seq kutubxonalari Chromium Single cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics) bilan tayyorlangan. Bibliotekki snRNA-seq byli prigotovleny s pomoshchyu Chromium Single cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics). SnRNA-seq kutubxonalari Chromium Single cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics) yordamida tayyorlangan. snRNA-seq míngjínčiči Chromium Single cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics) snRNA-seq míngjínčiči Chromium Single cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics) Biblioteku snRNA-seq gotovili va ispolzovaniem Chromium Single Cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics). SnRNA-seq kutubxonasi Chromium Single Cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics) yordamida tayyorlangan.Turli namunalardagi kutubxonalar NovaSeq S4 (Illumina) da Admera Health tomonidan birlashtirilgan va ketma-ketlashtirilgan.
Har bir taxminiy yadro shtrix-kodi uchun genlarni ifodalash darajalari 10x Genomics CellRanger tahlil dasturiy paketi (6.1.2-versiya) yordamida hisoblangan. Xususan, o‘qishlar mkref buyrug‘i bilan yaratilgan inson (GRCh38, Ensemble, 98-versiya) va kalamush (Rnor_6.0, Ensemble, 100-versiya) mos yozuvlar genomlari kombinatsiyasiga moslashtirildi va miqdorni aniqlashda –include-introns=TRUE buyrug‘i yordamida count yordamida intron hududlariga ko‘rsatilgan o‘qishlar kiradi. T-hCO namunalari uchun inson yadrolari barcha xaritalangan o'qishlarning kamida 95% inson genomiga mos kelishi haqidagi konservativ talab asosida aniqlangan. Barcha keyingi tahlillar R paketi (4.1.2-versiya) Seurat (4.1.1-versiya)32 yordamida CellRanger-dan filtrlangan shtrix-kod massiv chiqishida amalga oshirildi.
Keyingi tahlilga faqat yuqori sifatli yadrolar kiritilishini ta'minlash uchun har bir namuna uchun iterativ filtrlash jarayoni amalga oshirildi. Birinchidan, 1000 dan kam noyob genlar topilgan va umumiy mitoxondriyalarning 20% ​​dan ortig'i bo'lgan past sifatli yadrolar aniqlanadi va chiqariladi. Keyinchalik, xom genlar soni matritsasi sctransform(vst.flavor=”v2″) funksiyasidan foydalangan holda muntazam manfiy binomial regressiya orqali normallashtirildi, u ham standart parametrlardan foydalangan holda 3000 ta eng oʻzgaruvchan genni aniqladi.Oʻlchamni kamaytirish yuqori oʻzgaruvchan genlarda asosiy oʻlchov maʼlumotlari (CA) standart oʻlchami yordamida amalga oshirildi. 30 (dims = 30 tizza joylarini vizual tekshirish asosida tanlandi va barcha namunalar va ansambl tahlillari uchun foydalanildi) keyin biz genlarni g'ayritabiiy darajada past (10 foizdan past o'rtacha), g'ayritabiiy darajada yuqori mitochondriile va 9 foizdan yuqori identifikatsiyalash asosida tasniflash uchun iterativ klasterlashning bir necha raundini (rezolyutsiya = 1) amalga oshirdik. past sifatli klasterlar va/yoki shubhali egizaklarning katta qismi DoubletFinder 95 foizdan yuqori bo'lgan t-hCO namunalari (n=3) va IntegrateData funksiyasi yordamida alohida-alohida integratsiya qilingan yuqorida.
Past sifatli yadrolarni olib tashlaganingizdan so'ng, o'rnatilgan ma'lumotlar to'plami guruhlangan (ravshanligi = 0,5) va UMAP34 vizualizatsiya maqsadlari uchun o'rnatilgan. Har bir klaster uchun marker genlari normallashtirilgan gen ifodasi ma'lumotlaridan hisoblangan standart parametrlar bilan FindMarkers funksiyasi yordamida aniqlandi. Biz homila va kattalar kortikal ma'lumot to'plamlarini marker gen ifodasi 19,20,21,35 va izoh bilan birlashtirib, asosiy hujayra sinflarini aniqlaymiz va tasniflaymiz. Xususan, aylanma prekursorlar MKI67 va TOP2A ifodasi bilan aniqlangan. Progenitor klasterlar mitotik transkriptlarning yo'qligi, kech metafaza xomilalik korteksida tasvirlangan multipotent glial progenitor klasterlar bilan yuqori darajada mos kelishi va EGFR va OLIG1 ifodasi bilan aniqlangan. Biz astrosit atamasidan astrositlar differensiatsiyasining bir necha holatini, kech radial gliadan astrositlarning etukligiga qadar foydalanamiz. Astrositlar klasterlari SLC1A3 va AQP4 ning yuqori darajasini ifodalaydi va homila radial glia va/yoki kattalar astrositlarining pastki turlari bilan xaritada ko'rsatilgan. OPClar PDGFRA va SOX10 ni, oligodendrositlar esa miyelinatsiya belgilarini (MOG va MYRF) ifodalaydi. Glutamaterjik neyronlar neyronal transkriptlarning mavjudligi (SYT1 va SNAP25), GABAergik markerlarning yo'qligi (GAD2) va NEUROD6, SLC17A7, BCL11B yoki SATB2 ifodasi bilan aniqlangan. GluN neyronlari yana yuqori (SATB2 ifodasi va BCL11B ning yo'qolishi) va chuqur (BCL11B ifodasi) kichik sinflarga bo'lingan. Putative subplate (SP) neyronlari chuqur GluN markerlariga qo'shimcha ravishda ST18 va SORCS1 kabi ma'lum SP18 markerlarini ifodalaydi. Choroid pleksusga o'xshash hujayralar TTR ifodasi bilan aniqlandi va meningealga o'xshash hujayralar fibroblastlar bilan bog'liq genlarni va mos yozuvlar ma'lumotlar to'plamining xaritalangan pial / qon tomir hujayralarini ifoda etdi.
T-hCO va hCO kichik sinflari o'rtasidagi gen ekspressiyasining differentsial tahlili Libra R paketi (versiya 1.0.0) yordamida amalga oshirilgan namunalarda qayta ishlab chiqarilgan yangi ishlab chiqilgan psevdo-partiya usuli yordamida amalga oshirildi. Xususan, har bir namuna replikatsiyasi uchun ma'lum bir hujayra sinfi uchun hujayralardagi genlar sonini yig'ish orqali guruhlar uchun edgeR log-ehtimollik testlari (3.36.0 versiyasi, R paketi) o'tkazildi. Issiqlik xaritasini vizualizatsiya qilish uchun normallashtirilgan million boshiga (CPM) qiymatlar edgeR (cpm () funktsiyasi) yordamida hisoblanadi va masshtablanadi (o'rtacha = 0, standart og'ish = 1 ga erishish uchun). Gen ontologiyasi (GO) sezilarli darajada yuqori tartibga solingan t-hCO GluN genlarini boyitish tahlili o'tkazildi (Benjamini-Hochberg t-hCO GluN hujayralarining kamida 10 foizida ifodalangan 0,05 dan kam bo'lgan P qiymatini tuzatdi va o'zgarishning kamida 2 barobar ko'payishi). ToppGene Suite (https://toppgene.cchmc.org/)37 yordamida amalga oshiriladi. Biz ToppFun ilovasidan standart parametrlar bilan foydalanamiz va GO izohli gipergeometrik testlardan hisoblangan Benjamini-Xochberg tomonidan tuzatilgan P-qiymatlari haqida hisobot beramiz.
Bizning snRNA-seq klasterlarimizni birlamchi bitta hujayrali RNK-seq yoki kattalar snRNA-seq19,20,21,22 bo'yicha o'tkazilgan ma'lumotnoma tadqiqotlaridagi izohli hujayra klasterlari bilan moslashtirish uchun biz ma'lumotlar to'plamining juftlashgan integratsiya yondashuvini qo'lladik. Biz Seurat-da SCTransform (v2) normalizatsiya ish jarayonidan ma'lumotlar to'plamlari orasidagi klasterlarning o'zaro bog'liqliklarini birlashtirish va solishtirish uchun foydalandik (yuqoridagi parametrlardan foydalangan holda). Hisoblash samaradorligi uchun individual ma'lumotlar to'plamlari tasodifiy ravishda 500 tagacha hujayralar yoki yadrolar bilan to'ldirildi. Yuqorida aytib o'tilganidek, shunga o'xshash yondashuvdan foydalangan holda, klasterning bir-biriga mos kelishi mos yozuvlar klasterining yorlig'i bilan qoplangan har bir yig'ilgan klasterdagi hujayralar yoki yadrolarning nisbati sifatida aniqlandi. GluNlarni yanada tasniflash uchun biz GluN hujayralariga mos yozuvlar maʼlumotlar toʻplami yorliqlarini belgilash uchun GluN quyi toʻplami maʼlumotlari uchun Seuratning TransferData ish jarayonidan foydalandik.
T-hCO va hCO namunalarining global transkriptomasining etuklik holatini baholash uchun biz soxta ommaviy namunalarimizni inson miyasi rivojlanishini qamrab oluvchi katta RNK ketma-ketligidan iborat BrainSpan/psychENCODE23 bilan solishtirdik. Biz kontseptsiyadan 10 hafta o'tgach va keyinroq, BrainSpan kortikal namunalarida faol deb aniqlangan 5567 genda (bizning ma'lumotlarimiz bilan birga) kortikal namunalardagi birlashtirilgan naqsh bilan normallashtirilgan gen ekspresyon matritsasi bo'yicha PCA ni o'tkazdik (kubik model yordamida yoshga qarab tushuntirilgan rivojlanish tafovutida 50% dan ko'proq sifatida belgilangan). Bundan tashqari, biz yuqorida tavsiflanganidek, salbiy bo'lmagan matritsa faktorizatsiyasidan foydalangan holda, neyrorivojlanishning asosiy transkriptom belgilari bilan bog'liq genlarni oldik. Manfiy bo'lmagan matritsalarni faktorizatsiya qilish protsedurasi yordamida hisoblangan namuna og'irliklari 2-rasmda keltirilgan. Zhu va boshqalar tomonidan tasvirlangan beshta imzoning har biri uchun kengaytirilgan ma'lumotlar bilan 5b.38. Shunga qaramay, faoliyatga bog'liq bo'lgan transkripsiya belgilari ilgari nashr etilgan tadqiqotlardan olingan. Xususan, ERG va LRG qo'shimcha 3-jadval Hrvatin va boshq.16 dan vizual stimulyatsiyadan so'ng sichqonchaning vizual korteksi snRNA-seq to'plami tomonidan aniqlangan glutamaterjik neyronlarda sezilarli darajada oshirildi. Inson tomonidan boyitilgan LRGlar KCl bilan faollashtirilgan inson xomilalik miya madaniyatidan olingan va stimulyatsiyadan 6 soat o'tgach yig'ilgan va filtrlangan genlar odamlarda sezilarli darajada ko'tarilgan, ammo kemiruvchilarda emas (4-qo'shimcha jadval). Ushbu gen to'plamlari yordamida gen to'plamini boyitish tahlili bir tomonlama Fisherning aniq testi yordamida amalga oshirildi.
Kalamushlarni izofluran bilan behushlik qiling, miyalarni olib tashlang va sovuq (taxminan 4 ° C) kislorodli (95% O2 va 5% CO2) saxaroza eritmasiga soling: 234 mM saxaroza, 11 mM glyukoza, 26 mM NaHCO3, K25.Ml. NaH2PO4, 10 mM MgSO4 va 0,5 mM CaCl2 (taxminan 310 mOsm). T-hCO ni o'z ichiga olgan kalamush miya koronal bo'limlari (300-400 mkm) yuqorida aytib o'tilganidek, Leica VT1200 vibratomi yordamida qilingan39. Keyin bo'limlar 10 mM glyukoza, 26 mM NaHCO3, 2,5 mM KCl, 1,25 mM NaHPO4, 1 mM MgSO4, 2 mM CaCl2 va NaH29Ms dan tayyorlangan aCSF ni o'z ichiga olgan doimiy xona harorati oksijenatsiyasi bilan kesma kameraga o'tkazildi. yozishdan kamida 45 daqiqa oldin. Bo'limlar suvga cho'milgan kamerada qayd etildi, u erda ular doimiy ravishda aCSF (95% O2 va 5% CO2 flakon) bilan perfuziya qilinadi. Barcha ma'lumotlar xona haroratida qayd etilgan. t-hCO neyronlari 127 mM kaliy glyukonat, 8 mM NaCl, 4 mM magniy ATP, 0,3 mM natriy GTP, 10 mM HEPES va 0,6 mM HEPES o'z ichiga olgan eritma bilan to'ldirilgan borosilikat shisha pipetka bilan tugatildi, 0,6 mM, KOH2, KOH2. (290 mOsm). Qayta tiklash uchun yozib olish eritmasiga biotsitin (0,2%) qo'shildi.
Ma'lumotlar MultiClamp 700B kuchaytirgichi (Molekulyar qurilmalar) va Digidata 1550B raqamlashtiruvchisi (Molekulyar qurilmalar) yordamida olingan, 2 kHz chastotada past chastotali filtrlangan, 20 kHz chastotada raqamlashtirilgan va Clampfit (Molekulyar qurilmalar), Origin (OriginPro) yordamida tahlil qilingan. 2021b, OriginLab). va maxsus MATLAB funksiyalari (Mathworks). Birlashma potentsiali JPCalc yordamida hisoblab chiqilgan va yozuvlar -14 mV hisoblangan qiymatga moslashtirilgan. IV operatsiya -250 dan 750 pA gacha bo'lgan 10-25 pA bosqichlarida bir qator joriy bosqichlardan iborat.
Talamus, oq materiya va S1 afferentlari, yuqorida aytib o'tilganidek, hCO neyronlarini yamoq-qisqich bilan yozish paytida talamokortikal bo'laklarda elektr rag'batlantirildi. Qisqacha aytganda, miya 10 ° burchak ostida egilgan 3D bosib chiqarish stoliga qo'yildi va miyaning old qismi 35 ° burchak ostida kesildi. Keyin miya kesilgan yuzaga yopishtirilgan va talamokortikal chiqadigan aksonlarni saqlab, qismlarga bo'lingan. Bipolyar volfram elektrodlari (0,5 MŌ) ikkinchi mikromanipulyatorga o'rnatildi va har bir hujayra uchun to'rtta hududni (ichki kapsula, oq modda, S1 va hCO) rag'batlantirish uchun strategik tarzda joylashtirilgan. 0,03–0,1 Gts chastotada 300 mkA fazik stimulyatsiyadan keyin sinaptik javoblarni yozib oling.
hChR2 ifodalovchi hCO neyronlari 480 nm da faollashtirildi va LED (Prizmatix) tomonidan yaratilgan yorug'lik impulslari hujayralar yaqinidagi hChR2 ifodasini qayd etish uchun ×40 ob'ektiv (0,9 NA; Olympus) orqali qo'llanildi. Yoritilgan maydon diametri taxminan 0,5 mm va umumiy quvvati 10-20 mVt. Pulsning kengligi 10 ms ga o'rnatildi, bu xatti-harakatni o'rganish tajribasi paytida berilgan pulsga to'g'ri keladi. 1 dan 20 Gts gacha bo'lgan turli xil stimulyatsiya chastotalari ishlatilgan, ammo miqdorni aniqlash uchun faqat seriyaning birinchi zarbasi ishlatilgan. Sinaptik tormozlovchi yoki osonlashtiruvchi yo'llarga ta'sirini kamaytirish uchun poezdlar orasidagi intervallar odatda 30 sekunddan ko'proq. HChR2 javobining monosinaptik ekanligini tekshirish uchun biz EPSC reaktsiyasi yo'qolguncha hammomga TTX (1 mkM) qo'lladik va keyin 4-aminopiridinni (4-AP; 100 mkM) qo'lladik. Odatda, javob bir necha daqiqa ichida qaytariladi, LEDni yoqish va EPSC yaratish o'rtasida biroz uzoqroq kechikish mavjud. NBQX (10 mkM) javob AMPA retseptorlari tomonidan boshqarilishini tekshirish uchun ishlatilgan.
Sharp hCO bo'limlari yuqorida tavsiflanganidek yaratilgan. Qisqacha aytganda, hCO bo'linmalari 4% agaroza ichiga joylashtirildi va 126 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM NaH2PO4, 1 mM MgSO4, 2 mM CaCl2, 26 mM NaHCO3 va 10 mM (10 mM) ni o'z ichiga olgan hujayralarga o'tkazildi. Leica VT1200 vibrator yordamida xona haroratida 200–300 mkm va xona haroratida ASF da saqlanadi. Keyinchalik, to'g'ridan-to'g'ri SliceScope mikroskopi (Scientifica) ostida hCO bo'limlarida butun hujayralarni patch-lager yozish amalga oshirildi. Bo'limlar aCSF (95% O2 va 5% CO2) bilan perfuziya qilindi va xona haroratida hujayra signallari qayd etildi. hCO neyronlari 127 mM kaliy glyukonat, 8 mM NaCl, 4 mM magniy ATP, 0,3 mM natriy GTP, 10 mM HEPES va 0,6 mM EGTA o'z ichiga olgan eritma bilan to'ldirilgan borosilikat shisha pipetka yordamida qo'llanildi. 290). Qayta tiklash maqsadida ichki eritmaga 0,2% Biocytin qo'shing.
Ma'lumotlar Clampex (Clampex 11.1, Molecular Devices) tomonidan MultiClamp 700B kuchaytirgichi (molekulyar qurilmalar) va Digidata 1550B raqamlashtiruvchisi (molekulyar qurilmalar) yordamida olingan, 2 kHz chastotada past chastotali filtrlangan, 20 kHz chastotada raqamlangan va Clamp10 uchun tahlil qilingan, tahlil qilingan. qurilmalar) va maxsus MATLAB funksiyalari (MATLAB 2019b, Mathworks). Birlashma potentsiali JPCalc yordamida hisoblab chiqilgan va yozuvlar -14 mV hisoblangan ulanish potentsialiga moslashtirilgan. IV operatsiya -50 dan 250 pA gacha bo'lgan 5-10 pA qadamlardagi bir qator oqim bosqichlaridan iborat.
Chimchilgan neyronlarni morfologik qayta tiklash uchun ichki eritmaga 0,2% biotsitin (Sigma-Aldrich) qo'shildi. Hujayralar buzishdan keyin kamida 15 daqiqa davomida astarlanadi. Keyin ro'yxatga olingan membrana to'liq yopilguncha pipetka 1-2 daqiqa davomida asta-sekin tortiladi. Bo'lim fiziologiyasi protsedurasidan so'ng, bo'limlar bir kechada 4 ° C da 4% PFAda o'rnatildi, PBS X3 bilan yuvildi va streptavidin bilan birlashtirilgan DyLight 549 yoki DyLight 405 (Vector Labs) bilan 1:1000 nisbatda suyultirildi. Biotsitin bilan to'ldirilgan hujayralar (2%; Sigma-Aldrich) xona haroratida 2 soat davomida yamoq qisqichini yozish paytida etiketlangan. Keyin bo'limlar Aquamount (Thermo Scientific) yordamida mikroskop slaydlariga o'rnatildi va ertasi kuni Leica TCS SP8 konfokal mikroskopida raqamli diafragma × 40 1,3, kattalashtirish × 0,9-1,0, xy bo'lgan moyga botirish ob'ektividan foydalangan holda vizualizatsiya qilindi. Namuna olish tezligi mikron uchun taxminan 7 piksel. 1 mkm oraliqda Z-stoklar ketma-ket ravishda olindi va har bir neyronning butun dendritik daraxtini qoplash uchun z-stack mozaikalari va Leica-ga asoslangan avtomatik tikuv amalga oshirildi. Keyin neuTube 40 interfeysi yordamida neyronlar yarim qo'lda kuzatildi va SWC fayllari yaratildi. Keyin fayllar SimpleNeuriteTracer41 Fiji plaginiga yuklandi (ImageJ, 2.1.0 versiyasi; NIH).
Inson kortikal to'qimalari Stenford universitetining institutsional tekshiruv kengashi tomonidan tasdiqlangan protokolga muvofiq xabardor qilingan rozilik bilan olingan. Odam tug'ruqdan keyingi to'qimalarining ikkita namunasi (3 va 18 yosh) o'tga chidamli epilepsiya uchun jarrohlik operatsiyasining bir qismi sifatida frontal korteksni (o'rta frontal girus) rezektsiya qilish orqali olingan. Rezektsiyadan so'ng to'qimalarni muzdek sovuq NMDG-aCSFda yig'ib oling: 92 mM NMDG, 2,5 mM KCl, 1,25 mM NaH2PO4, 30 mM NaHCO3, 20 mM HEPES, 25 mM glyukoza, 2 so'm mMb, mM, mM, 3 mM natriy piruvat, 0,5 mM CaCl2 4H2O va 10 mM MgSO4 7H2O. Konsentrlangan xlorid kislota bilan pH 7,3-7,4 gacha titrlanadi. To'qimalar 30 minut ichida laboratoriyaga yetkazildi va yuqorida ko'rsatilgan tartibda koronal kesmalar olindi.
Hayvonlarning barcha protseduralari Stenford universiteti APLAC tomonidan tasdiqlangan hayvonlarni parvarish qilish bo'yicha ko'rsatmalarga muvofiq amalga oshirildi. Kalamushlar (transplantatsiyadan keyin 140 kundan ortiq) 5% izofluran anesteziyasi bilan induktsiya qilingan va operatsiya davomida 1-3% izofluran bilan behushlik qilingan. Hayvonlar stereotaksik ramkaga (Kopf) joylashtirildi va doimiy ravishda chiqariladigan buprenorfin (SR) teri ostiga yuborildi. Bosh suyagi ochiladi, tozalanadi va 3-5 ta suyak vintlari kiritiladi. T-hCO ni nishonga olish uchun biz MRI tasvirlaridan stereotaksik koordinatalarni yaratdik. Qiziqarli joyda burg'ulash teshigi burg'ulandi va tolalar (diametri 400 mkm, NA 0,48, Dorik) hCO 2 yuzasidan 100 mkm pastga tushirildi va bosh suyagiga UV nuriga chidamli stomatologik tsement (Relyx) bilan mahkamlandi.
Elyaf fotometrik yozuvlar avval tavsiflanganidek amalga oshirildi42. Spontan faollikni qayd qilish uchun kalamushlar toza qafasga joylashtirildi va optik tolali fotometrik ma'lumotlarni yig'ish tizimiga ulangan 400 mkm diametrli optik tolali patch kabel (Dorik) implantatsiya qilingan optik tolali kabelga ulandi. Harakat faolligini 10 daqiqalik yozib olish paytida hayvonlar qafasni o'rganishda erkin edi. Uyg'otilgan faollikni qayd etish uchun kalamushlar (transplantatsiya qilinganidan keyin 140 kundan ortiq) induksiya uchun 5% izofluran va parvarishlash uchun 1-3% izofluran bilan behushlik qilindi. Hayvonni stereotaktik ramkaga (Kopf) joylashtiring va t-hCO ning qarama-qarshi tomonidagi mo'ylovlar taxminan 2 sm gacha kesiladi va piezoelektrik aktuatorga (PI) ulangan to'rdan o'tadi. Implantatsiya qilingan tolaga 400 mkm optik tolali patch kabel (Dorik) ulangan va ma'lumotlarni yig'ish tizimiga ulangan. So'ngra t-hCO ning qarama-qarshi tomonidagi mo'ylovlar 20 daqiqalik ro'yxatga olish davrida piezoelektrik haydovchi tomonidan tasodifiy vaqtlarda 50 marta (20 Gts chastotada 2 mm, har bir taqdimot uchun 2 soniya) burilib ketdi. Maxsus MATLAB kodi bilan og'ish vaqtini boshqarish uchun Arduino MATLAB qo'llab-quvvatlash paketidan foydalaning. Hodisalar tranzistor-tranzistorli mantiq (TTL) impulslari yordamida ma'lumotlarni yig'ish dasturiga sinxronlashtiriladi.
Kalamushlar (transplantatsiyadan keyin 140 kundan ortiq) 5% izofluran anesteziyasi bilan induktsiya qilingan va operatsiya davomida 1-3% izofluran bilan behushlik qilingan. Hayvonlar stereotaksik ramkaga (Kopf) joylashtirildi va buprenorfin SR va deksametazon teri ostiga yuborildi. Bosh suyagi ochiladi, tozalanadi va 3-5 ta suyak vintlari kiritiladi. T-hCO ni nishonga olish uchun biz MRI tasvirlaridan stereotaksik koordinatalarni yaratdik. Transplantatsiya qilingan hCO ning to'g'ridan-to'g'ri yuqori tezlikda matkap bilan dumaloq kraniotomiya (diametri taxminan 1 sm) amalga oshirildi. Suyak iloji boricha yupqalashgandan so'ng, lekin butun suyakni burg'ulashdan oldin, t-hCO ni aniqlash uchun qolgan tos bo'shlig'ini olib tashlash uchun forsepslardan foydalaning. Kraniotomiya steril fiziologik eritma bilan to'ldirilgan va bosh suyagiga ultrabinafsha nurlari bilan ishlangan dental sement (Relyx) bilan qopqoq va maxsus bosh pin biriktirilgan.
Ikki fotonli tasvirlash Nikon LWD (×16, 0,8 NA) ob'yektivli Bruker multifoton mikroskopi yordamida amalga oshirildi. GCaMP6 tasviri 920 nm da 1,4x bitta z-tekislik kattalashtirish va 8x o'rtacha 7,5 kadr/s bilan amalga oshirildi. Kalamushlar 5% izofluran anesteziyasi bilan induktsiya qilindi va 1-3% izofluran bilan saqlangan. Kalamushlar maxsus tayyorlangan bosh moslamasiga joylashtirildi va linzalar ostiga joylashtirildi. Harakat faoliyatining 3 daqiqalik fon yozuvi olindi. Yozib olishning 20 daqiqasi davomida pikospriser yordamida 50 ta puf (har bir taqdimot 100 ms uzunlikdagi) tasodifiy ravishda t-hCO ga qarama-qarshi bo'lgan mo'ylov yostig'iga yetkazildi. Maxsus MATLAB kodi bilan portlash vaqtini boshqarish uchun Arduino MATLAB qo'llab-quvvatlash paketidan foydalaning. TTL impulslari yordamida hodisalarni ma'lumotlarni yig'ish dasturi (PrairieView 5.5) bilan sinxronlashtiring. Tahlil qilish uchun tasvirlar Fijida boshlangan MoCo dasturida afin tuzatish yordamida xy harakati uchun tuzatildi. CNMF-E43 yordamida alohida hujayralardan lyuminestsent izlarni olish. Qiziqarli har bir hudud uchun lyuminestsent olingan, dF/F egri chizig'iga aylantirilgan va keyin z-ballarga aylantirilgan.
Kalamushlar (transplantatsiyadan keyin 140 kundan ortiq) 5% izofluran anesteziyasi bilan induktsiya qilingan va operatsiya davomida 1-3% izofluran bilan behushlik qilingan. Hayvonlar stereotaksik ramkaga (Kopf) joylashtirildi va buprenorfin SR va deksametazon teri ostiga yuborildi. T-hCO ning qarama-qarshi tomonidagi mo'ylovlar taxminan 2 sm gacha kesilgan va piezoelektrik aktuatorga ulangan mash orqali o'ralgan. Bosh suyagi ochiladi va tozalanadi. Bosh suyagiga zanglamaydigan po'latdan yasalgan murvat biriktirilgan. T-hCO ni nishonga olish uchun biz MRI tasvirlaridan stereotaksik koordinatalarni yaratdik. T-hCO dan bir oz yuqorida yuqori tezlikda matkap bilan dairesel kraniotomiya (diametri taxminan 1 sm) bajaring. Suyak iloji boricha yupqalashgandan so'ng, lekin butun suyakni burg'ulashdan oldin, t-hCO ni aniqlash uchun qolgan tos bo'shlig'ini olib tashlash uchun forsepslardan foydalaning. Individual hujayralar 32-kanal yoki 64-kanalli yuqori zichlikdagi kremniy problari (Cambridge Neurotech) yordamida ro'yxatga olindi, tuproqli vintlardek erga ulangan va RHD kuchaytirgichlari (Intan) bilan oldindan kuchaytirilgan. Steril sho'r suv bilan to'ldirilgan kraniotomiya orqali elektrodlarni maqsadli joyga tushirish uchun manipulyatordan foydalaning. Ma'lumotlarni yig'ish Open Ephys ma'lumotlarni yig'ish tizimi yordamida 30 kHz chastotada amalga oshirildi. Ro'yxatga olish faqat 10 dan ortiq kanallarda yuqori darajada bog'liq ritmik spontan faollikni aniqlaganimizda davom etdi, bu elektrodlar greftda joylashganligini ko'rsatdi (ikki fotonli kaltsiyni tasvirlash ma'lumotlari asosida). Motor faoliyatining 10 daqiqalik fon yozuvi olindi. So'ngra t-hCO ning qarama-qarshi tomonidagi mo'ylovlar 20 daqiqalik ro'yxatga olish davrida piezoelektrik haydovchi tomonidan tasodifiy vaqtlarda 50 marta (20 Gts chastotada 2 mm, har bir taqdimot uchun 2 soniya) burilib ketdi. Arduino uchun MATLAB qo'llab-quvvatlash paketidan (MATLAB 2019b) foydalanib, maxsus MATLAB kodi bilan og'ish vaqtini boshqaring. Hodisalarni ma'lumotlarni yig'ish dasturi bilan sinxronlashtirish uchun TTL impulslaridan foydalaning.
Optik belgilash tajribalari uchun 473 nm lazerga (Omicron) ulangan 200 mkm optik patch shnur (Dorik) kraniotomiya ustiga o'rnatilgan 200 mkm optik tolaga ulangan. Bundan oldin darhol jumper quvvatini 20 mVt ga sozlang. Steril sho'r suv bilan to'ldirilgan kraniotomiya orqali elektrodlarni maqsadli joyga tushirish uchun manipulyatordan foydalaning. Yozuv boshida 473 nm yorug'likning o'nta zarbasi (chastotasi 2 Gts, zarba davomiyligi 10 ms) chiqarildi. Fotosensitiv hujayralar sinovlarning 70% yoki undan ko'prog'ida 10 ms yorug'lik ichida keskin reaktsiyani ko'rsatadigan hujayralar sifatida aniqlandi.