Takk for at du besøker Nature.com. Du bruker en nettleserversjon med begrenset CSS-støtte. For best mulig opplevelse anbefaler vi at du bruker en oppdatert nettleser (eller deaktiverer kompatibilitetsmodus i Internet Explorer). I tillegg, for å sikre kontinuerlig støtte, viser vi nettstedet uten stiler og JavaScript.
Viser en karusell med tre lysbilder samtidig. Bruk Forrige- og Neste-knappene for å gå gjennom tre lysbilder om gangen, eller bruk glidebryterknappene på slutten for å gå gjennom tre lysbilder om gangen.
Selvorganiserende nevrale organeller representerer en lovende in vitro-plattform for modellering av menneskelig utvikling og sykdom. Organoider mangler imidlertid den konnektiviteten som finnes in vivo, noe som begrenser modning og forhindrer integrasjon med andre kretser som kontrollerer atferd. Her viser vi at kortikale organoider avledet fra menneskelige stamceller transplantert inn i den somatosensoriske cortex hos nyfødte nakne rotter utvikler modne celletyper som integreres i sensoriske og motivasjonsrelaterte kretser. MR avslørte organoidvekst etter transplantasjon i flere stamcellelinjer og dyr, mens enkeltkjerneanalyse avslørte progresjon av kortikogenese og fremveksten av et aktivitetsavhengig transkripsjonsprogram. Faktisk viser transplanterte kortikale nevroner mer komplekse morfologiske, synaptiske og interne membranegenskaper enn deres in vitro-motparter, noe som tillater deteksjon av nevrale defekter hos pasienter med Timothys syndrom. Anatomisk og funksjonell sporing har vist at transplanterte organeller mottar thalamokortikale og kortikokortikale input, og in vivo-registreringer av nevral aktivitet antyder at disse inputene kan generere sensoriske responser i menneskelige celler. Til slutt utvider kortikale organoider aksoner gjennom rottehjernen, og deres optogenetiske aktivering fører til belønningssøkende atferd. Dermed modnes transplanterte humane cortex-nevroner og deltar i vertens kretser som kontrollerer atferd. Vi forventer at denne tilnærmingen vil legge til rette for deteksjon av fenotyper på trådnivå i pasientavledede celler som ikke kan detekteres på andre måter.
Den utviklende menneskelige hjernen er en bemerkelsesverdig selvorganiserende prosess der celler formerer seg, differensierer, migrerer og kobles sammen for å danne funksjonelle nevrale kretser som ytterligere raffineres gjennom sensorisk erfaring. Et sentralt problem i forståelsen av menneskelig hjerneutvikling, spesielt i sammenheng med sykdom, er mangelen på tilgang til hjernevev. Selvorganiserende organeller, inkludert menneskelige cortexorganoider (hCO; også kjent som den menneskelige cortex-sfæren), kan generere 2,3,4,5,6. Imidlertid begrenser flere begrensninger deres bredere anvendelse for å forstå utviklingen og funksjonen til nevrale kretser. Spesielt er det uklart om hCO-modning er begrenset av fraværet av visse mikro-miljømessige og sensoriske input som er tilstede in vivo. I tillegg, fordi hCO-er ikke er integrert i kretser som kan generere atferdsutfall, er deres nytteverdi i modellering av genetisk komplekse og atferdsmessige nevropsykiatriske lidelser for tiden begrenset.
Transplantasjon av hCO til en intakt levende hjerne kan overvinne disse begrensningene. Tidligere studier har vist at menneskelige nevroner transplantert inn i gnagerbarken er i stand til å overleve, projisere og kommunisere med gnagerceller 7,8,9,10,11,12. Imidlertid utføres disse eksperimentene vanligvis på voksne dyr, noe som kan begrense synaptisk og aksonal integrasjon. Her beskriver vi et transplantasjonsparadigme der vi transplanterte 3D hCO avledet fra hiPS-celler inn i den primære somatosensoriske cortex (S1) hos immunsviktige rotter på et tidlig stadium av plastisk utvikling. Transplanterte hCO (t-hCO) nevroner gjennomgår betydelig modning, mottar thalamokortikale og kortikal-kortikale input som fremkaller sensoriske responser, og utvider aksonale projeksjoner inn i rottehjernen for å drive belønningssøkende atferd. Forlenget modning av t-hCO har avdekket nevrale defekter hos pasienter med Timothys syndrom (TS), en alvorlig genetisk lidelse forårsaket av mutasjoner i den spenningsfølsomme L-type CaV1.2 kalsiumkanalen (kodet av CACNA1C).
For å studere humane kortikale nevroner i kretser in vivo, transplanterte vi stereotaktisk intakt 3D hCO inn i S1 hos tidlige postnatale atymiske rotter (dag 3–7 postnatalt) (fig. 1a og utvidede data i fig. 1a–c). På dette tidspunktet har de thalamokortikale og kortikokortikale aksonale projeksjonene ennå ikke fullført sin S1-innervasjon (ref. 13). Dermed er denne tilnærmingen utformet for å maksimere t-hCO-integrasjonen samtidig som den minimerer påvirkningen på endogene kretser. For å visualisere plasseringen av t-hCO hos levende dyr, utførte vi T2-vektede MR-hjernerekonstruksjoner av rotter 2–3 måneder etter transplantasjon (fig. 1b og utvidede data, fig. 1d). t-hCO3 ble lett observert, og volummålinger av t-hCO3 var lik de som ble beregnet fra faste snitt (utvidede data fig. 1d,e; P > 0,05). t-hCO3 ble lett observert, og volummålinger av t-hCO3 var lik de som ble beregnet fra faste snitt (utvidede data fig. 1d,e; P > 0,05). t-hCO легко наблюдались, а объемные измерения t-hCO были аналогичны рассчитанным for фиксированных расрезов, ( рис 1d, e; P> 0,05). t-hCO3 ble lett observert, og volumetriske t-hCO3-målinger var lik de som ble beregnet for faste seksjoner (utvidede data, fig. 1d, e; P > 0,05).很容易观察到t-hCO，并且t-hCO的体积测量值与从固定切片计算的测量值相似（扩展数据图1d、e；P > 0,05）。5）很容易观察到t-hCO，并且t-hCO t-hCO легко наблюдался, а объемные измерения t-hCO были аналогичны рассчитанным для фиксированных срезиов ( рис 1d, e; P> 0,05). t-hCO3 ble lett observert, og volumetriske t-hCO3-målinger var lik de som ble beregnet for faste seksjoner (utvidede data, fig. 1d, e; P > 0,05).Vi bestemte t-hCO₂ hos 81 % av de transplanterte dyrene omtrent 2 måneder etter transplantasjon (n = 72 dyr; hCO₂ fra 10 hiPS-cellelinjer; hiPS-cellelinjer i tilleggstabell 1). Av disse var 87 % lokalisert i hjernebarken (fig. 1c). Ved å utføre serielle MR-skanninger på flere tidspunkter i den samme transplanterte rotten, fant vi en ni ganger økning i t-hCO₂-volum innen 3 måneder (fig. 1d og utvidede data, fig. 1f). Transplanterte dyr hadde en høy overlevelsesrate (74 %) 12 måneder etter transplantasjon (utvidede data, fig. 1g og tilleggstabell 2), og ingen åpenbare motoriske eller hukommelsessvekkelser, gliose eller elektroencefalogram (EEG) ble funnet. Data fig. 1g og tilleggstabell 2). 1t–m og 3e).
a, Skjematisk fremstilling av eksperimentelt design. hCO₂ avledet fra hiPS-celler ble transplantert inn i S1 hos nyfødte nakne rotter på dag 30–60 med differensiering. b, T2-vektede koronale og horisontale MR-bilder som viser t-hCO₂ i S1 2 måneder etter transplantasjon. Skala, 2 mm. c, Kvantifisering av suksessrater for engraftment vist for hver hiPS-cellelinje (n = 108, tall innenfor søylene indikerer mengden t-hCO₂ per hIPS-cellelinje) og kortikal eller subkortikal plassering (n = 88). d, MR-bilde av en koronararterie (venstre; skala, 3 mm) og tilsvarende 3D-volumetrisk rekonstruksjon (skala, 3 mm) som viser en økning i t-hCO₂ over 3 måneder. e, Gjennomgang av t-hCO₂-mønstre i rottehjernebarken. Skala, 1 mm. f, Representative immunocytokjemiske bilder av t-hCO vist fra øverst til venstre til høyre (under differensiering): PPP1R17 (4 måneder gammel), NeuN (8 måneder gammel), SOX9 og GFAP (8 måneder gammel), PDGFRα; (8 måneder), MAP2 (8 måneder) og IBA1 (8 måneder). Skala, 20 µm. Koekspresjon av HNA indikerer celler av menneskelig opprinnelse. g, snRNA-sekvens: Unified manifold and projection (UMAP) dimensjonalitetsreduksjonsavbildning av alle t-hCO-kjerner av høy kvalitet etter Seurat-integrasjon (n=3 t-hCO-prøver, n=2 hiPS-cellelinjer). Astrocytter, celler i astrocyttlinjen; cyc prog, sirkulerende progenitorceller; GluN DL, dype glutamaterge nevroner; GluN DL/SP, dype og sublamellære glutamaterge nevroner; GluN UL, øvre lags glutamaterge nevroner; oligodendrocytter, oligodendrocytter; OPC, oligodendrocytt-progenitorceller; RELN, reelin-nevroner. h, Gene Ontology (GO) termberikelsesanalyse av gener signifikant oppregulert (justert P < 0,05, fold endring > 2, uttrykt i minst 10 % av kjernene) i t-hCO glutamaterge nevroner sammenlignet med hCO glutamaterge nevroner. h, Gene Ontology (GO) termberikelsesanalyse av gener signifikant oppregulert (justert P < 0,05, fold endring > 2, uttrykt i minst 10 % av kjernene) i t-hCO glutamaterge nevroner sammenlignet med hCO glutamaterge nevroner. h, Анализ обогащения терминов Gene Ontology (GO) for генов со значительной активацией (скорректированный P <0,05, сратность изкратность изктивацией по крайней мере в 10% ядер) в глутаматергических нейронах t-hCO på сравнению с глутаматергическими нейронах. h, Gene Ontology (GO) termberikelsesanalyse for gener med signifikant aktivering (justert P <0,05, fold endring >2, uttrykk i minst 10 % kjerner) i t-hCO glutamaterge nevroner sammenlignet med hCO glutamaterge nevroner. h，与hCO 谷氨酸能神经元相比，t-hCO 谷氨酸能神经元中基因显着上调（谎整0,05，倍数变化> 2，在至少10% 的细胞核中表达）的基因本体论(GO) 术识〈富术语密 h ， 与 hco 谷氨酸 能 元 相比 ， t-hco 谷氨酸 能 神经 元 基因 显着 上谼 p <0 ０合 .变化 变化> 2 ， 至少 10% 的 核中 表达） 基因 基因 基因 的 的 的 的 焚的 焚 的 焇 的的 的 的 的本体论(GO) 术语富集分析。 h, гены значительно активизировались (скорректированный P <0,05, кратность изменения> 2, экспрессируется по 1% краенев краене глутаматергических нейронах t-hCO по сравнению с глутаматергическими нейронами hCO Онтологическийский (GO) анализ. h, gener var signifikant oppregulert (justert P < 0,05, fold endring > 2, uttrykt i minst 10 % av kjernene) i t-hCO glutamaterge nevroner sammenlignet med hCO glutamaterge nevroner Ontologisk (GO) analyse av anrikningsleddet.Den stiplede linjen indikerer en aq-verdi på 0,05. i, UMAP-avbildning av GluN-celletyper i t-hCO ved bruk av merkeoverføring fra et referansedatasett med 22 snRNA-sekvenser for voksen motorisk cortex. CT — kortikothalamiske celler, ET — ekstracerebrale celler, IT — interne telencefale celler, NP — nærprojeksjon.
Deretter vurderte vi cytoarkitekturen og den generelle cellulære sammensetningen av t-hCO. Antistofffarging av rotteendotelceller avdekket vaskularisering med t-hCO, mens IBA1-farging avdekket tilstedeværelsen av rottemikroglia i hele transplantatet (fig. 1f og utvidede data, fig. 3c, d). Immunfarging avdekket humant nukleært antigen (HNA)-positive celler som kouttrykte PPP1R17 (kortikale progenitorer), NeuN (nevroner), SOX9 og GFAP (glia-avledede celler) eller PDGFRα (oligodendrocytt-progenitorer) (figur 1f). For å studere den cellulære sammensetningen av t-hCO ved enkeltcelleoppløsning, utførte vi enkeltkjerne-RNA-sekvensering (snRNA-seq) etter omtrent 8 måneder med differensiering. Bulkfiltrering og fjerning av rottekjerner ga 21 500 humane mononukleære kart av høy kvalitet (fig. 1g og utvidede data, fig. 4a, b). Ekspresjonsmønstre for typiske celletypemarkører identifiserte klynger av viktige kortikale celleklasser, inkludert dype og overfladiske glutamaterge nevroner, sirkulerende progenitorceller, oligodendrocytter og astrocyttavstamning (fig. 1g, utvidede data, fig. 4c og tilleggstabell 3). Immunfarging for SATB2 og CTIP2 viste at til tross for tilstedeværelsen av kortikale subtyper, viste t-hCO ikke klar anatomisk stratifisering (utvidede data, fig. 3a). Stadiematchet snRNA-sekvensering av hCO produserte stort sett like celleklasser, med noen få unntak, inkludert fravær av oligodendrocytter og tilstedeværelsen av GABAerge nevroner, noe som kan gjenspeile de tidligere rapporterte gunstige in vitro-forholdene for laterale progenitorceller15 (utvidede data, fig. 4f–i og tilleggstabell 4). Differensiell genekspresjonsanalyse avdekket signifikante forskjeller i glutamaterge nevroner mellom t-hCO og hCO (tilleggstabell 5), inkludert aktivering av sett med gener assosiert med nevronal modning som synaptisk signalering, dendrittisk lokalisering og spenningsstyrt kanalaktivitet (figur 1h og tilleggstabell 5). Følgelig viste kortikale glutamaterge t-hCO-nevroner akselerert transkripsjonell modning.
For å belyse om disse transkripsjonelle endringene i t-hCO var relatert til morfologiske forskjeller mellom hCO in vitro og t-hCO in vivo, rekonstruerte vi stadium-matchede biocytinfylte hCO og hCO i akutte seksjoner etter 7–8 måneder med differensiering. hCO-nevroner (fig. 2a). t-hCO-nevroner var betydelig større, hadde 1,5 ganger soma-diameteren, dobbelt så mange dendritter og en samlet seksdobling i total dendrittisk lengde sammenlignet med in vitro hCO (fig. 2b). I tillegg observerte vi en betydelig høyere tetthet av dendrittiske spines i t-hCO-nevroner enn i hCO-nevroner (fig. 2c). Dette antyder at t-hCO-nevroner gjennomgår omfattende dendrittisk forlengelse og forgrening, som i kombinasjon med fortsatt celleproliferasjon kan bidra til den intensive veksten av t-hCO etter transplantasjon (fig. 1d og utvidede data fig. 1f). Dette fikk oss til å undersøke de elektrofysiologiske egenskapene. Membrankapasitansen var åtte ganger høyere (utvidede data, fig. 8d), membranpotensialet i hviletilstand var mer hyperpolarisert (omtrent 20 mV), og strøminjeksjon induserte en høyere maksimal eksitasjonsrate i t-hCO-nevroner enn i hCO-nevroner. in vitro (fig. 2d), e), noe som er i samsvar med de større og mer komplekse morfologiske trekkene til t-hCO. I tillegg var hyppigheten av spontane eksitatoriske postsynaptiske strømhendelser (EPSC) betydelig høyere i t-hCO-nevroner (fig. 2f), noe som tyder på at den økte tettheten av dendrittiske spines observert i t-hCO-nevroner var assosiert med funksjonell eksitabilitet. seksuell synapse. Vi bekreftet den umodne karakteren til hCO-nevroner in vitro ved å registrere merkede glutamaterge nevroner (utvidede data, fig. 6a-c).
a, 3D-rekonstruksjon av biocytinfylte hCO- og t-hCO-nevroner etter 8 måneder med differensiering. b, Kvantifisering av morfologiske trekk (n = 8 hCO-nevroner, n = 6 t-hCO-nevroner; **P = 0,0084, *P = 0,0179 og ***P < 0,0001). b, Kvantifisering av morfologiske trekk (n = 8 hCO-nevroner, n = 6 t-hCO-nevroner; **P = 0,0084, *P = 0,0179 og ***P < 0,0001). б, количественная оценка морфологических признаков (n = 8 нейронов hCO, n = 6 нейронов t-hCO; ** P = 0,0084, * P = 0,01***). b, kvantifisering av morfologiske trekk (n = 8 hCO-nevroner, n = 6 t-hCO-nevroner; **P = 0,0084, *P = 0,0179 og ***P < 0,0001). b，形态学特征的量化（n = 8 个hCO 神经元，n = 6 个t-hCO 神经元；**P = 0,0084，,0*P9 0. 0,0001）. b，形态学特征的量化（n = 8 个hCO 神经元，n = 6 个t-hCO 神经元；**P = 0,0084，,0*P9 0. 0,0001）. б, количественная оценка морфологических признаков (n = 8 нейронов hCO, n = 6 нейронов t-hCO; ** P = 0,0084, * P = 0,01***). b, kvantifisering av morfologiske trekk (n = 8 hCO-nevroner, n = 6 t-hCO-nevroner; **P = 0,0084, *P = 0,0179 og ***P < 0,0001).c, 3D-rekonstruksjon av hCO- og t-hCO-dendrittiske grener etter 8 måneder med differensiering. Røde stjerner indikerer antatte dendrittiske spines. Kvantifisering av dendrittisk spine-tetthet (n = 8 hCO-nevroner, n = 6 t-hCO-nevroner; **P = 0,0092). d, Kvantifisering av hvilemembranpotensialet (n = 25 hCO₃-nevroner, n = 16 t-hCO₃-nevroner; ***P < 0,0001). d, Kvantifisering av hvilemembranpotensialet (n = 25 hCO₃-nevroner, n = 16 t-hCO₃-nevroner; ***P < 0,0001). d, количественная оценка мембранного потенциала покоя (n = 25 нейронов hCO, n = 16 нейронов t-hCO; *** P <0,0001). d, kvantifisering av hvilemembranpotensial (n = 25 hCO₃-nevroner, n = 16 t-hCO₃-nevroner; ***P < 0,0001). d，静息膜电位的量化（n = 25 hCO 神经元，n = 16 t-hCO 神经元；***P < 0,0001）。 d，静息膜电位的量化（n = 25 hCO 神经元，n = 16 t-hCO 神经元；***P < 0,0001）。 d, количественная оценка мембранного потенциала покоя (n = 25 нейронов hCO, n = 16 нейронов t-hCO; *** P <0,0001). d, kvantifisering av hvilemembranpotensial (n = 25 hCO₃-nevroner, n = 16 t-hCO₃-nevroner; ***P < 0,0001). e, Repeterende aksjonspotensialavfyring i hCO og t-hCO indusert ved å øke strøminjeksjoner, og kvantifisering av maksimal avfyringshastighet (n = 25 hCO nevroner, n = 16 t-hCO nevroner; ***P < 0,0001). e, Repeterende aksjonspotensialavfyring i hCO og t-hCO indusert ved å øke strøminjeksjoner, og kvantifisering av maksimal avfyringshastighet (n = 25 hCO nevroner, n = 16 t-hCO nevroner; ***P < 0,0001). e, повторное возбуждение потенциала действия в hCO og t-hCO, вызванное увеличением тока, og количествия скорости возбуждения (n = 25 нейронов hCO, n = 16 нейронов t-hCO; *** P <0,0001). e, gjenopptenning av aksjonspotensial i hCO og t-hCO indusert av strømøkning og kvantifisering av maksimal avfyringshastighet (n = 25 hCO nevroner, n = 16 t-hCO nevroner; *** P < 0,0001). e，通过增加电流注入诱导的hCO 和t-hCO 重复动作电位放电，以及最大放电缇n =2个hCO 神经元，n = 16 个t-hCO 神经元；***P < 0,0001）. E ， 通过 增加 电流 注入 的 的 hco 和 t-hco 重复 电位 放电 ， 以及 最 夼 嚄 2 n = 2个 hco 神经 ， n = 16 个 t-hco 神经 ； *** p <0,0001） 。 e, повторяющееся возбуждение потенциала действия hCO og t-hCO, вызванное увеличением подачи токенкаич, и коцич максимальной скорости возбуждения (n = 25 нейронов hCO, n = 16 нейронов t-hCO; *** P <0,0001). e, repeterende avfyring av hCO3- og t-hCO3-aksjonspotensialer indusert av økt strømtilførsel og kvantifisering av maksimal avfyringshastighet (n = 25 hCO3-nevroner, n = 16 t-hCO3-nevroner; *** P < 0,0001). f, Spontane EPSC-er (sEPSC-er) i hCO- og t-hCO-nevroner etter 8 måneder med differensiering, og kvantifisering av hyppigheten av synaptiske hendelser (n = 25 hCO-nevroner, n = 17 t-hCO-nevroner; ***P < 0,0001). f, Spontane EPSC-er (sEPSC-er) i hCO- og t-hCO-nevroner etter 8 måneder med differensiering, og kvantifisering av hyppigheten av synaptiske hendelser (n = 25 hCO-nevroner, n = 17 t-hCO-nevroner; ***P < 0,0001). f, спонтанные EPSC (sEPSC) в нейронах hCO og t-hCO через 8 месяцев дифференцировки и количественная оценкастичестичаты событий (n = 25 нейронов hCO, n = 17 нейронов t-hCO; *** P <0,0001) . f, Spontane EPSC-er (sEPSC-er) i hCO- og t-hCO-nevroner etter 8 måneder med differensiering og kvantifisering av synaptiske hendelsesrater (n = 25 hCO-nevroner, n = 17 t-hCO-nevroner; ***P <0,0001). f，分化8 个月时hCO 和t-hCO 神经元中的自发性EPSCs (sEPSCs)，以及突触事件频率的5 CO神经元，n = 17 t-hCO 神经元；***P < 0,0001）. f，分化8 个月时hCO 和t-hCO 神经元中的自发性EPSCs (sEPSCs)，以及突触事件频率的神率的量匼（n = 25 hCO 神率的量匼（n = 25hCO P < 0,0001）. f, спонтанные EPSC (sEPSC) в нейронах hCO og t-hCO через 8 месяцев дифференцировки и количественная оценкастичестичаты событий (n = 25 нейронов hCO, n = 17 нейронов t-hCO; *** P <0,0001). f, Spontane EPSC-er (sEPSC-er) i hCO- og t-hCO-nevroner etter 8 måneder med differensiering og kvantifisering av synaptiske hendelsesrater (n = 25 hCO-nevroner, n = 17 t-hCO-nevroner; *** P <0,0001).For bf ble hCO3 og t-hCO3 i linje 1208-2 tatt fra samme differensieringsbatch som ble holdt parallelt. g, Gensettberikelsesanalyse (ensidig Fishers eksakte test) av gener signifikant oppregulert (justert P < 0,05, fold endring > 2, uttrykt i minst 10 % av kjernene) i t-hCO glutamaterge nevroner sammenlignet med hCO glutamaterge nevroner med gensett av både tidlig-respons (ERG) og sen-respons (LRG) aktivitetsavhengige gener identifisert fra en in vivo musestudie16 og menneskespesifikke LRG-er fra in vitro nevroner17. g, Gensettberikelsesanalyse (ensidig Fishers eksakte test) av gener signifikant oppregulert (justert P < 0,05, fold endring > 2, uttrykt i minst 10 % av kjernene) i t-hCO glutamaterge nevroner sammenlignet med hCO glutamaterge nevroner med gensett av både tidlig-respons (ERG) og sen-respons (LRG) aktivitetsavhengige gener identifisert fra en in vivo musestudie16 og menneskespesifikke LRG-er fra in vitro nevroner17. g, анализ обогащения набора генов (односторонний точный критерий Фишера) генов со значительной активацорек кратность изменения > 2, экспрессия по меньшей мере в 10% ядер) в глутаматергических нейровнах t-hCO по сратность глутаматергическими нейронами hCO наборы генов как раннего (ERG), так и позднего (LRG) генов, зависящих от aktiviteter, indikatorer og tjenester for datamaskiner in vivo16, og spesialiteter for LRG i in vitro17nov. g, analyse av gensettberikelse (ensidig Fishers eksakte test) av gener med signifikant aktivering (justert P < 0,05, fold endring > 2, uttrykk i minst 10 % av kjernene) i t-hCO glutamaterge nevroner sammenlignet med hCO glutamaterge nevronsett av både tidlige (ERG) og sene (LRG) aktivitetsavhengige gener identifisert i in vivo-mus og menneskespesifikke LRG-er fra nevroner in vitro. g，t-hCO谷氨酸能神经元与hCO谷氨酸能神经元相比，t -hCO谷氨酸能神经元显着上调（调整后P<0.05，倍数变化>2，在至少10%的细胞核中表达）的基因集富集分析（单侧F isher精确检验）从体内小鼠研究中鉴定的早期反应(ERG)和晚期反应(LRG) 活性依赖性基因的基因组16 和体外神经元17 中的人类特异 g ， t-hco 谷氨酸 神经 元 与 hco 谷氨酸 神经 元 相比 ， t-hco 谷氨酸 神经 兰 襞绸 兰 调<0,05 ， 倍数> 2 ， 至少 至少 10%的 细胞 核中 表达） 的 集富集 分析 缧单）体内 小鼠 研究 中 的 早期 反应 反应 反应 和 晚期 反应 反应 (lrg) 活性 基因 嚄 基因瞻 16神经元 17 中 中 17 中 17的人类特异性LRG. g, глутаматергические нейроны t-hCO были значительно активизированы по сравнению с глутаматергическическими нейронскими P<0,05, кратность изменения> 2, не менее 10% Анализ обогащения набора генов (односторонний точный тест Фирашерат) позднего гены, зависящие от активности ответа (LRG), идентифицированные в исследованиях на мышах in vivo16 og нейронах in vitro17. LRG, специфичные для человека. g, t-hCO glutamaterge nevroner var signifikant oppregulert sammenlignet med hCO glutamaterge nevroner (justert P < 0,05, fold endring > 2, minst 10 %. Tidlig respons (ERG) og sen respons genberikelsesanalyse (ensidig Fishers eksakte test) responsaktivitetsavhengige gener (LRG-er) identifisert i in vivo mus16 og in vitro nevroner.17 Menneskespesifikke LRG-er.Den stiplede linjen indikerer en Bonferroni-korrigert P-verdi på 0,05. h, GluN-genuttrykk (pseudopakke og skalering av hvert gen) var signifikant oppregulert i snRNA-sekvenseringsreplikaer av LRG-gener i t-hCO glutamaterge nevroner. i, immunfarging som viser SCG2-uttrykk i t-hCO (øvre) og hCO (nedre) nevroner. Hvite piler peker på SCG2+ celler. Skalalinje, 25 µm. Data er uttrykt som gjennomsnitt ± standardavvik.
Basert på den økte aktiviteten til t-hCO observert i ex vivo-skiver, viste snRNA-seq en aktivitetsavhengig oppregulering av gentranskripter i t-hCO sammenlignet med hCO in vitro. Glutamatergiske t-hCO-nevroner uttrykte høyere nivåer av gener som regulerer sen responsaktivitet (fig. 2g, h), som ble funnet i tidligere studier i mus- og menneskenevroner16,17. For eksempel viste BDNF18, SCG2 og OSTN, et primatspesifikt aktivitetsregulerende gen, økt uttrykk i t-hCO-nevroner sammenlignet med hCO-nevroner (fig. 2g-i). Dermed viste t-hCO-nevroner forbedrede modningsegenskaper sammenlignet med hCO-nevroner ved transkripsjonelle, morfologiske og funksjonelle analyser.
For å ytterligere evaluere sammenhengen mellom t-hCO-modning og utvikling av menneskelig hjerne, utførte vi transkriptomiske sammenligninger av føtale og voksne kortikale celletyper19,20 og voksne21,22, samt omfattende data om kortikal genuttrykk23 under utvikling (utvidede data, fig. 5). Med tidligere arbeid24 er den globale hCO- og t-hCO-transkriptommodningsstatusen ved 7–8 måneder med differensiering stort sett konsistent med in vivo-utviklingstid og er mest ekvivalent med sent fosterliv (utvidede data, fig. 5a). Det er verdt å merke seg at vi observerte økt transkriptommodning i t-hCO sammenlignet med aldersmatchet hCO, samt transkriptomaktivering assosiert med synaptogenese, astrogenese og myelinisering (utvidede data, fig. 5b-d). På cellenivå fant vi bevis på en tynnere kortekssubtype i t-hCO, med klynger av glutamaterge nevroner som overlapper med voksne L2/3-, L5- og L6-nevronsubtyper (figur 1i). I motsetning til dette var klyngeoverlappingen mellom glutamaterge t-hCO-nevroner og føtale kortikale nevroner mer begrenset midt i svangerskapet (utvidede data, figur 5e-j). For å avgjøre om t-hCO-nevroner funksjonelt sett ligner på humane postnatale neokortikale nevroner, utførte vi elektrofysiologiske opptak og anatomiske rekonstruksjoner av humane L2/3 pyramidale nevroner i skarpe snitt av den humane postnatale cortex (utvidede data, figur 7a). De elektrofysiologiske egenskapene til L2/3 pyramidale nevroner var lik de til t-hCO pyramidale nevroner (utvidede data, figur 7e). Morfologisk var L2/3-nevroner fra postnatale humane prøver mer lik t-hCO enn hCO, selv om L2/3-celler var lengre, inneholdt flere grener totalt sett og hadde en høyere ryggradenetthet (figur 3g og utvidede data, figur 7b-). G).
a, transplantasjon av hCO produsert av kontroll- og TS hiPS-cellelinjer til nyfødte rotter. b, 3D-rekonstruksjon av biocytinfylte t-hCO-nevroner etter 8 måneder med differensiering. c, kvantifisering av gjennomsnittlig dendrittisk lengde (n = 19 kontrollnevroner, n = 21 TS-nevroner; **P = 0,0041). d, 3D-rekonstruerte dendrittiske grener fra kontroll og TS t-hCO ved 8 måneder med differensiering, og kvantifisering av dendrittisk ryggradstetthet (n = 16 kontrollnevroner, n = 21 TS-nevroner, ***P < 0,0001). d, 3D-rekonstruerte dendrittiske grener fra kontroll og TS t-hCO ved 8 måneder med differensiering, og kvantifisering av dendrittisk ryggradstetthet (n = 16 kontrollnevroner, n = 21 TS-nevroner, ***P < 0,0001). d, 3D-rekonstruerende plattformer og TS t-hCO har 8 måneders databaser og konferansesenter дендритных шипов (n = 16 контрольных нейронов, n = 21 TS нейронов, *** P <0,0001). d, 3D-rekonstruksjon av dendrittiske grener fra kontroll og t-hCO TS etter 8 måneder med differensiering og kvantifisering av dendrittisk ryggradstetthet (n = 16 kontrollnevroner, n = 21 TS-nevroner, ***P <0,0001). d，分化8 个月时对照和TS t-hCO 的3D 重建树突分支，以及树突棘密度的量n=1,6个对照神经元，n = 21 个TS 神经元，***P < 0,0001）. d ， 分化 8 个 时 对照 和 ts t-hco 的 3d 重建 分支 分支 以及 树突棘 导度 1n 度 1n神经 元 ， n = 21 个 ts 神经 ， *** p <0,0001 ）。 d, 3D-rekonstruerende kommunikasjon og TS t-hCO har 8 måneders administrasjons- og kostnadskontroll дендритных шипов (n = 16 контрольных нейронов, n = 21 TS нейронов, *** P <0,0001). d, 3D-rekonstruksjon av kontrolldendrittiske grener og TS t-hCO etter 8 måneder med differensiering og kvantifisering av dendrittisk ryggradstetthet (n = 16 kontrollnevroner, n = 21 TS-nevroner, ***P <0,0001).Røde stjerner indikerer antatte dendrittiske spines. e, spontane EPSC-er i kontroll- og TS t-hCO-nevroner etter 8 måneder med differensiering. f, kumulativ frekvensplott og kvantifisering av frekvens og amplitude av synaptiske hendelser (n = 32 kontrollnevroner, n = 26 TS-nevroner; **P = 0,0076 og P = 0,8102). g, Scholl-analyse av TS- og kontrollnevroner i hCO og t-hCO. Stiplede linjer viser humane L2/3 postnatale pyramidale nevroner for sammenligning (n = 24 kontroll t-hCO-nevroner, n = 21 TS t-hCO-nevroner, n = 8 kontroll hCO-nevroner og n = 7 TS hCO-nevroner). Data er uttrykt som gjennomsnitt ± standardavvik.
t-hCOs evne til å replikere de morfologiske og funksjonelle trekkene til humane cortex-nevroner på et høyt nivå fikk oss til å undersøke om t-hCO kunne brukes til å oppdage sykdomsfenotyper. Vi fokuserte på TS, en alvorlig nevroutviklingsforstyrrelse forårsaket av gain-of-function-mutasjoner i genet som koder for CaV1.2, som initierer aktivitetsavhengig gentranskripsjon i nevroner. Vi innhentet hCO fra tre TS-pasienter som bar den vanligste substitusjonen (p.G406R) og tre kontroller (fig. 3a). Etter transplantasjon fant vi at dendrittisk morfologi var endret i TS-nevroner sammenlignet med kontroller (fig. 3b og utvidede data, fig. 8a,b), med en dobling i antall primære dendritter og en generell økning i gjennomsnittlig og generell reduksjon i dendrittisk lengde (fig. 3c og utvidede data, fig. 8c). Dette var assosiert med en økt tetthet av pigger og en økt frekvens av spontane EPSC-er i TS sammenlignet med kontrollnevroner (fig. 3d–f og utvidede data, fig. 8g). Videre analyse avdekket mønstre av unormal dendrittisk forgrening i t-hCO TS sammenlignet med kontrollgruppen, men ikke i in vitro TS hCO på et lignende differensieringsstadium (fig. 3g). Dette er i samsvar med våre tidligere rapporter om aktivitetsavhengig dendrittisk krymping i TS og fremhever denne transplantasjonsplattformens evne til å oppdage sykdomsfenotyper in vivo.
Vi spurte deretter i hvilken grad t-hCO-celler er funksjonelt integrert i rotte S1. S1 hos gnagere mottar sterke synaptiske input fra de ipsilaterale ventrale basale og posteriore thalamuskjernene, samt de ipsilaterale motoriske og sekundære somatosensoriske korteksene, og kontralateral S1 (fig. 4a). For å gjenopprette innervasjonsmønsteret infiserte vi hCO med rabiesvirus-dG-GFP/AAV-G og transplanterte hCO inn i S1-rotte 3 dager senere. Vi observerte tett GFP-ekspresjon i nevroner i ipsilaterale S1 og ventrale basalganglier 7–14 dager etter transplantasjon (fig. 4b, c). I tillegg avslørte antistofffarging av thalamusmarkøren netrin G1 tilstedeværelsen av thalamusender i t-hCO (fig. 4d, e). For å evaluere om disse afferente projeksjonene kunne fremkalle synaptiske responser i t-hCO-celler, utførte vi helcelleopptak fra humane celler i skarpe snitt av det thalamokortikale laget. Elektrisk stimulering av rotte S1, indre kapsel, hvit substans, fibre nær t-hCO eller optogenetisk aktivering av opsin-uttrykkende thalamusender i t-hCO induserte EPSC-er med kort latens i t-hCO-nevroner eksponert for AMPA-reseptorantagonisten NBQX. (Fig. 4f, g og utvidede data, fig. 9a–g). Disse dataene viser at t-hCO er anatomisk integrert i rottehjernen og kan aktiveres av rottevertsvev.
a, Skjematisk diagram av et rabiessporingseksperiment. b, GFP og menneskespesifikk STEM121-ekspresjon mellom t-hCO og rottehjernebark (øvre panel). GFP-ekspresjon i den ipsilaterale ventrale basalkjernen (VB) hos rotter (nederst til venstre) og ipsilaterale S1 (nederst til høyre) er også vist. Målestokk, 50 µm. De røde firkantene representerer områdene i hjernen der bildene ble tatt. c, kvantifisering av celler som uttrykker GFP (n = 4 rotter). d, e — Netrin G1+ thalamusterminaler i t-hCO. d viser en koronal seksjon som inneholder t-hCO- og VB-kjerner. Målestokk, 2 mm. e viser Netrin G1- og STEM121-ekspresjon i t-hCO- (venstre) og VB- (høyre) nevroner. Målestokk, 50 µm. Den oransje stiplede linjen indikerer t-hCO-grensen. f, g, Nåværende spor av t-hCO-nevroner etter elektrisk stimulering i S1-rotte (f) eller intern kapsel (g), med (lilla) eller uten (svart) NBQX (venstre). EPSC-amplituder med og uten NBQX (n = 6 S1-nevroner, *P = 0,0119; og n = 6 interne kapselnevroner, **P = 0,0022) (midten). Prosentandel av t-hCO-nevroner som viser EPSC som respons på elektrisk stimulering av rotte-S1 (f) eller intern kapsel (g) (høyre). aCSF, kunstig cerebrospinalvæske. h, skjematisk diagram av 2P-avbildningseksperimentet (venstre). Ekspresjon av GCaMP6-er i t-hCO (midten). Skala, 100 µm. Fluorescenstidsforløp av GCaMP6-er (høyre). i, Z-score for spontan aktivitetsfluorescens. j, skjematisk illustrasjon av bartstimulering. k, z-skårede 2P-fluorescensbaner i én prøve, justert med værhårsavvik ved tid null (stiplet linje) i eksempelceller. l, populasjonsgjennomsnittlige z-skåreresponser for alle celler justert med værhårsavvik ved tid null (stiplet linje) (rød) eller tilfeldig genererte tidsstempler (grå). m. Skjematisk diagram av eksperimentet med optisk merking. n, Rå spenningskurver fra en eksempel-t-hCO-celle under blå laserstimulering eller værhårsavbøyning. Røde piler indikerer de første toppene forårsaket av lys (øverst) eller forårsaket av værhårsavbøyning (nederst). Grå skyggelegging indikerer perioder med værhårsavbøyning. o, Topplysbølgeformer og værhårsavbøyningsresponser. p, toppene i et enkelt forsøk, justert med avviket til værhårene i cellene i eksemplet. 0 indikerer værhårsavvik (stiplet linje). q, populasjonsgjennomsnittlig z-skåre-avfyringshastighet for alle lysfølsomme celler, justert med værhårsavvik ved tid null (stiplet linje) (rød) eller tilfeldig genererte tidsstempler (grå). r, Andel lysfølsomme enheter signifikant modulert av værhåravvik (n = 3 rotter) (venstre). Maksimal z-score latens (n ​​= 3 rotter; n = 5 (lysegrønn), n = 4 (mørkegrønn) og n = 4 (cyan) værhåravbøyningsmodulasjonsenheter per rotte) (høyre). Data er uttrykt som gjennomsnitt ± standardavvik.
Vi spurte deretter om t-hCO kunne aktiveres av sensoriske stimuli in vivo. Vi transplanterte hCO som uttrykker de genetisk kodede kalsiumindikatorene GCaMP6 inn i S1-rotter. Etter 150 dager utførte vi fiberfotometri eller to-foton kalsiumavbildning (figur 4h og utvidede data, figur 10a). Vi fant at t-hCO-celler viste synkronisert rytmisk aktivitet (figur 4i, utvidede data, figur 10b og tilleggsvideo 1). For å karakterisere topp t-hCO-aktivitet utførte vi ekstracellulære elektrofysiologiske opptak i bedøvede transplantasjonsrotter (utvidede data, figur 10c-f). Vi har generert stereotaksiske koordinater fra MR-bilder; dermed representerer disse registrerte enhetene antatte menneskelige nevroner, selv om elektrofysiologi alene ikke tillater bestemmelse av en opprinnelsesart. Vi observerte synkroniserte aktivitetsutbrudd (utvidede data, figur 10d). Utbruddene varte i omtrent 460 ms og ble atskilt av stillhetsperioder på omtrent 2 sekunder (utvidede data, fig. 10d, e). Individuelle enheter avfyrte i gjennomsnitt omtrent tre skudd per utbrudd, som er omtrent 73 % av registrerte enheter per utbrudd. Aktiviteten til de individuelle enhetene var sterkt korrelert, og disse korrelasjonene var høyere enn for enheter identifisert hos uvaksinerte dyr registrert under de samme forholdene (utvidede data, fig. 10f). For å karakterisere piggresponsene til identifiserte humane nevroner ytterligere, utførte vi lysmerkingseksperimenter på bedøvede rotter transplantert med hCO3 som uttrykker den lysfølsomme kationkanalen rhodopsin 2 (hChR2), gjennom hvilken t-hCO3-nevroner gjenkjenner kort latens (mindre enn 10 ms) som respons på blå lysstimuli (fig. 4m–o). t-hCO-nevroner viste utbrudd av spontan aktivitet ved frekvenser som ligner på de som observeres i kalsiumavbildning, samt elektrofysiologiske opptak utført i t-hCO i fravær av lysmarkering (utvidede data, fig. 10c-g). Ingen spontan aktivitet ble observert i de tilsvarende stadiene av hCO registrert in vitro. For å vurdere om t-hCO kunne aktiveres av sensoriske stimuli, avledet vi kort rottehårene bort fra t-hCO (fig. 4j,m og utvidede data, fig. 10h,k). I følge tidligere studier8,10 viste en delmengde av t-hCO-celler økt aktivitet som respons på hårhåravbøyning, noe som ikke ble observert da dataene ble sammenlignet med tilfeldige tidsstempler (fig. 4k–q og utvidede data, fig. 10h–q). Faktisk viste omtrent 54 % av de optomerkede enkeltenhetene en betydelig økt opphisselsesrate etter hårhårstimulering, med en topp på omtrent 650 ms (fig. 4r). Samlet sett tyder disse dataene på at t-hCO mottar passende funksjonelle innspill og kan aktiveres av miljøstimuli.
Deretter undersøkte vi om t-hCO kunne aktivere kretser hos rotter for å kontrollere atferd. Vi undersøkte først om aksonene til t-hCO-nevroner projiserer inn i det omkringliggende vevet hos rotten. Vi infiserte hCO med et lentivirus som koder for hChR2 fusjonert med EYFP (hChR2-EYFP). Etter 110 dager observerte vi EYFP-ekspresjon i ipsilaterale kortikale regioner, inkludert auditiv, motorisk og somatosensorisk cortex, samt i subkortikale regioner, inkludert striatum, hippocampus og thalamus (fig. 5a). For å vurdere om disse efferente projeksjonene kunne fremkalle synaptiske responser i rotteceller, aktiverte vi optisk t-hCO-celler som uttrykte hChR2-EYFP ved å registrere rottehjernebarkceller i skarpe hjernesnitt. Aktivering av t-hCO-aksoner med blått lys induserte EPSC-er med kort latens i rottepyramidale cortex-nevroner, som ble blokkert av NBQX (fig. 5b–g). I tillegg kunne disse responsene blokkeres av tetrodotoksin (TTX) og gjenopprettes av 4-aminopyridin (4-AP), noe som tyder på at de var forårsaket av monosynaptiske forbindelser (fig. 5e).
a, Skjematisk diagram av aksonsporing (venstre). t-hCO EYFP-ekspresjon (høyre). Skalalinje, 100 µm. A1, auditiv cortex, ACC, anterior cingulate cortex, d. striatum, dorsal striatum, HPC, hippocampus; Diafragma, lateral septum, mPFC, medial prefrontal cortex, piri, piriform cortex, v. striatum, ventral striatum, VPM, ventropostomedial kjerne i thalamus, VTA, ventral tegmental region. De røde firkantene representerer områdene i hjernen der bildene ble tatt. b, Skjematisk diagram av stimuleringseksperimentet. c, d, Eksempler på responsen til blått lysindusert fotostrøm (øverst) og spenning (nederst) i humane (c) EYFP+ t-hCO eller rotte (d) EYFP- celler. e, f, Nåværende spor av rotteneuroner etter blålysstimulering av t-hCO-aksoner med TTX og 4-AR (grønn), TTX (grå) eller aCSF (svart) (e), med (fiolett) eller uten (svart)) NBQX (e). g, latens av responser indusert av blått lys i rotteceller (n = 16 celler); horisontale søyler indikerer gjennomsnittlig latens (7,13 ms) (venstre). Amplitude av lysfremkalte EPSC-er registrert med eller uten NBQX (n = 7 celler; ***P < 0,0001) (midten). Amplitude av lysfremkalte EPSC-er registrert med eller uten NBQX (n = 7 celler; ***P < 0,0001) (midten). Амплитуда вызванных светом EPSC, зарегистрированных с или без NBQX (n = 7 клеток; ***P <0,0001) (ved senter). Amplitude av lysinduserte EPSC-er registrert med eller uten NBQX (n = 7 celler; ***P < 0,0001) (midten).使用或不使用NBQX 记录的光诱发EPSC 的振幅（n = 7 个细胞；***P < 0,0001）（中）。使用或不使用NBQX 记录的光诱发EPSC 的振幅（n = 7 个细胞；***P < 0,0001）（中）。 Амплитуда вызванных светом EPSC, зарегистрированных с или без NBQX (n = 7 клеток; ***P <0,0001) (ved senter). Amplitude av lysinduserte EPSC-er registrert med eller uten NBQX (n = 7 celler; ***P < 0,0001) (midten).Prosentandel av rotteceller som viser EPSC-er som reagerer på blått lys (høyre). h, Skjematisk diagram av en atferdsoppgave. d0, dag 0. i. Ytelse til eksemplariske dyr på dag 1 (venstre) eller dag 15 (høyre) av treningen. Gjennomsnittlig antall slikkinger utført på dag 1 (venstre) eller dag 15 (høyre, midten) (n = 150 forsøk med blått lys, n = 150 forsøk med rødt lys; ***P < 0,0001). Gjennomsnittlig antall slikkinger utført på dag 1 (venstre) eller dag 15 (høyre, midten) (n = 150 forsøk med blått lys, n = 150 forsøk med rødt lys; ***P < 0,0001). Среднее количество облизываний, выполненных в день 1 (слева) eller день 15 (ved центре справа) (n = 150 исправа) n = 150 испытаний с красным светом ***P <0,0001). Gjennomsnittlig antall slikkinger utført på dag 1 (venstre) eller dag 15 (midt til høyre) (n = 150 forsøk med blått lys, n = 150 forsøk med rødt lys; ***P < 0,0001).第1 天（左）或第15 天（右中）执行的平均舔次数（n = 150 次蓝光试验,150n = 150次红光试验；***P < 0,0001）.第1 天（左）或第15 天（右中）执行的平均舔次数（n = 150 次蓝光试验,150n = 150次红光试验；***P < 0,001 Среднее количество облизываний, выполненных в день 1 (слева) eller день 15 (ved центре справа) (n = 150 исправа) n = 150 испытаний с красным светом ***P <0,0001). Gjennomsnittlig antall slikkinger utført på dag 1 (venstre) eller dag 15 (midt til høyre) (n = 150 forsøk med blått lys, n = 150 forsøk med rødt lys; ***P < 0,0001).Kumulative slikk for forsøk med rødt og blått lys på dag 1 (midt til venstre) eller dag 15 (høyre). NS, ikke signifikant. j,k, Atferdsegenskaper hos alle dyr transplantert med t-hCO som uttrykker hChR2-EYFP (j) eller kontrollfluorofor (k) på dag 1 eller 15 (hChR2-EYFP: n = 9 rotter, ** P = 0,0049; kontroll: n = 9, P = 0,1497). l, Utvikling av preferansescore (n = 9 hChR2, n = 9 kontroll; **P < 0,001, ***P < 0,0001). l, Utvikling av preferansescore (n = 9 hChR2, n = 9 kontroll; **P < 0,001, ***P < 0,0001). l, Эволюция показателя предпочтения (n = 9 hChR2, n = 9 контрольных; **P <0,001, ***P <0,0001). l, Utvikling av preferansescore (n = 9 hChR2, n = 9 kontroller; **P < 0,001, ***P < 0,0001). l，偏好评分的演变（n = 9 hChR2，n = 9 对照；**P < 0,001，***P < 0,0001）. l，偏好评分的演变（n = 9 hChR2，n = 9 对照；**P < 0,001，***P < 0,0001）. l, Эволюция показателей предпочтения (n = 9 hChR2, n = 9 контролей; **P <0,001, ***P <0,0001). l, Utvikling av preferansepoeng (n = 9 hChR2, n = 9 kontroller; **P < 0,001, ***P < 0,0001).m, FOS-ekspresjon som respons på optogenetisk aktivering av t-hCO i S1. Bilder av FOS-ekspresjon (venstre) og kvantifisering (n = 3 per gruppe; *P < 0,05, **P < 0,01 og ***P < 0,001) (høyre) vises. Bilder av FOS-ekspresjon (venstre) og kvantifisering (n = 3 per gruppe; *P < 0,05, **P < 0,01 og ***P < 0,001) (høyre) vises. Показаны изображения экспрессии FOS (слева) и количественного определения (n = 3 per spill; * P <0,05, <01 ** P <0***) (справа). Bilder av FOS-ekspresjon (venstre) og kvantifisering (n = 3 per gruppe; *P < 0,05, **P < 0,01 og ***P < 0,001) er vist (høyre).显示了FOS 表达（左）和量化（每组n = 3；*P < 0.05、**P < 0.01 和***P < 0.001）（像㏳）（像㏳）显示了FOS 表达（左）和量化（每组n = 3；*P < 0.05、**P < 0.01 和***P < 0.001）（像㏳）（像㏳） Показаны изображения экспрессии FOS (слева) и количественного определения (n = 3 per spill; * P <0,05, <01 ** P <0***) (справа). Bilder av FOS-ekspresjon (venstre) og kvantifisering (n = 3 per gruppe; *P < 0,05, **P < 0,01 og ***P < 0,001) er vist (høyre).Skalalinje, 100 µm. Data er uttrykt som gjennomsnitt ± standardfeil for BLA, basolateral mandel, MDT, dorsomedial thalamuskjerne, PAG, periaqueductal grå.
Til slutt spurte vi om t-hCO kunne modulere rotteatferd. For å teste dette transplanterte vi hChR2-EYFP-uttrykkende hCO inn i S1, og 90 dager senere implanterte vi optiske fibre i t-hCO for lystilførsel. Deretter trente vi rottene med et modifisert operant betingingsparadigme (fig. 5h). Vi plasserte dyrene i et atferdstestkammer og påførte tilfeldig 5 sekunders blå (473 nm) og rød (635 nm) laserstimuli. Dyrene fikk en vannbelønning hvis de slikket under blått lysstimulering, men ikke slikket under rødt lysstimulering. På den første treningsdagen viste dyrene ingen forskjell i slikking når de ble stimulert med blått eller rødt lys. På dag 15 viste imidlertid dyr transplantert med hCO som uttrykte hChR2-EYFP mer aktiv slikking når de ble stimulert med blått lys sammenlignet med rødt lysstimulering. Disse endringene i slikkeatferd ble ikke observert hos kontrolldyr transplantert med hCO som uttrykte kontrollfluoroforen (læringssuksessrate: hChR2 89 %, EYFP 0 %, figur 5i-1 og tilleggsvideo 2). Disse dataene antyder at t-hCO-celler kan aktivere rottenevroner for å stimulere belønningssøkende atferd. For å finne ut hvilke rotte t-hCO-nevrale kretser som kan være involvert i disse atferdsendringene, aktiverte vi optogenetisk t-hCO hos trente dyr og høstet vev 90 minutter senere. Immunhistokjemi avdekket uttrykk av det aktivitetsavhengige FOS-proteinet i flere hjerneområder involvert i motivert atferd, inkludert mediale prefrontale cortex, mediale thalamus og periaqueductal grå substans, som ble uttrykt enten i ustimulerte kontrolldyr eller hos dyr. ris. 5m). Samlet sett antyder disse dataene at t-hCO kan modulere rottenevronal aktivitet for å drive atferd.
Nevrale organoider representerer et lovende system for å studere menneskelig utvikling og sykdom in vitro, men de er begrenset av mangelen på forbindelser mellom kretser som eksisterer in vivo. Vi har utviklet en ny plattform der vi transplanterte hCO inn i S1 hos immunkompromitterte tidlige postnatale rotter for å studere menneskelig celleutvikling og -funksjon in vivo. Vi har vist at t-hCO utvikler modne celletyper som ikke observeres in vitro28, og at t-hCO er anatomisk og funksjonelt integrert i gnagerhjernen. Integreringen av t-hCO i gnagernes nevrale kretser tillot oss å etablere en kobling mellom menneskelig cellulær aktivitet og studert dyreatferd, noe som viser at t-hCO-nevroner kan modulere rottenevronal aktivitet for å drive atferdsresponser.
Plattformen vi beskriver har flere fordeler i forhold til tidligere forskning på transplantasjon av menneskeceller inn i gnagerhjerner. Først transplanterte vi hCO inn i den utviklende cortexen hos tidlige postnatale rotter, noe som kan legge til rette for anatomisk og funksjonell integrasjon. For det andre tillot t-hCO MR-monitorering oss å studere transplantatposisjon og vekst hos levende dyr, slik at vi kunne gjennomføre langsiktige studier med flere dyr og etablere påliteligheten til flere hiPS-cellelinjer. Til slutt transplanterte vi intakte organoider, i stedet for isolerte enkeltcellesuspensjoner, som er mindre ødeleggende for menneskeceller og kan fremme integrering og generering av menneskelige cortexneuroner i rottehjerner.
Vi erkjenner at til tross for fremskritt innen denne plattformen, forhindrer tidsmessige, romlige og artsoverskridende begrensninger dannelsen av menneskelige nevrale kretser med høy gjengivelseskvalitet, selv etter transplantasjon på et tidlig utviklingsstadium. For eksempel er det ikke klart om den spontane aktiviteten observert i t-hCO representerer en utviklingsfenotype som ligner på den rytmiske aktiviteten observert under kortikal utvikling, eller om den skyldes fraværet av undertrykkende celletyper tilstede i t-hCO. På samme måte er det ikke klart i hvilken grad fraværet av laminering i t-hCO påvirker kjedekonnektiviteten30. Fremtidig arbeid vil fokusere på å integrere andre celletyper som humane mikroglia, humane endotelceller og varierende andeler av GABAerge internevroner som vist ved bruk av assembly 6 in vitro, samt å forstå hvordan nevral integrasjon og prosessering kan forekomme i endrede t-hCO transkripsjonelle, synaptiske og atferdsmessige nivåer i celler hentet fra pasienter.
Alt i alt representerer denne in vivo-plattformen en kraftig ressurs som kan utfylle in vitro-forskning på utvikling av menneskelig hjerne og sykdommer. Vi forventer at denne plattformen vil gjøre det mulig for oss å oppdage nye fenotyper på trådnivå i ellers unnvikende pasientavledede celler og teste nye terapeutiske strategier.
Vi genererte hCO2.5 fra HiPS-celler som beskrevet tidligere. For å starte hCO2-produksjon fra hiPS-celler dyrket på materlag, ble intakte kolonier av hiPS-celler fjernet fra kulturskåler ved bruk av dispase (0,35 mg/ml) og overført til plastkulturer med ultralav festeevne som inneholdt skåler med hiPS-cellekulturmedium (Corning) tilsatt to SMAD-hemmere dorsomorfin (5 μM; P5499, Sigma-Aldrich) og SB-431542 (10 μM; 1614, Tocris) og ROCK-hemmer Y-27632 (10 μM; S1049, Selleckchem). I løpet av de første 5 dagene ble hiPS-cellemediet byttet daglig, og dorsomorfin og SB-431542 ble tilsatt. På den sjette dagen i suspensjon ble nevrale sfæroider overført til nevralt medium som inneholdt neurobasal-A (10888, Life Technologies), B-27-tilskudd uten vitamin A (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies), penicillin og streptomycin (1:100, Life Technologies) og supplert med epidermal vekstfaktor (EGF; 20 ng ml−1; R&D Systems) og fibroblastvekstfaktor 2 (FGF2; 20 ng ml−1; R&D Systems) frem til dag 24. Fra dag 25 til dag 42 ble mediet supplert med hjerneavledet nevrotrofisk faktor (BDNF; 20 ng ml−1, Peprotech) og nevrotrofin 3 (NT3; 20 ng ml−1; Peprotech) med mediumbytte annenhver dag. På den sjette dagen i suspensjon ble nevrale sfæroider overført til nevralt medium som inneholdt neurobasal-A (10888, Life Technologies), B-27-tilskudd uten vitamin A (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies), penicillin og streptomycin (1:100, Life Technologies) og supplert med epidermal vekstfaktor (EGF; 20 ng ml−1; R&D Systems) og fibroblastvekstfaktor 2 (FGF2; 20 ng ml−1; R&D Systems) frem til dag 24. Fra dag 25 til dag 42 ble mediet supplert med hjerneavledet nevrotrofisk faktor (BDNF; 20 ng ml−1, Peprotech) og nevrotrofin 3 (NT3; 20 ng ml−1; Peprotech) med mediumbytte annenhver dag.På den sjette dagen i suspensjon ble de nevrale sfæroidene overført til et nevralt medium som inneholdt Neurobasal-A (10888, Life Technologies), B-27-tilskudd uten vitamin A (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies) og penicillin.и стрептомицин (1:100, Life Technologies) og дополнены эпидермальным фактором роста (EGF; 20 нг/ml; R&D Systems) og фактором робста20F; нг/мл; FoU-systemer) til 24-го дня. og streptomycin (1:100, Life Technologies) og supplert med epidermal vekstfaktor (EGF; 20 ng/ml; R&D Systems) og fibroblastvekstfaktor 2 (FGF2; 20 ng/ml; R&D Systems) frem til dag 24.Fra dag 25 til 42 ble hjerneavledet nevrotrofisk faktor (BDNF; 20 ng ml-1, Peprotech) og nevrotrofin 3 (NT3; 20 ng ml-1, Peprotech) tilsatt mediet, og mediet ble byttet annenhver dag.在悬浮的第6 天，将神经球体转移到含有neurobasal-A（10888，Life Technologies）、不含维生焠B-27生焠补充剂（12587，Life Technologies）、GlutaMax（1:100，Life Technologies）、青霉素的神经培养基丠和铼霉1:链霉Technologies）并辅以表皮生长因子（EGF；20 ng ml-1；FoU Systems）和成纤维细胞生长因子2（FGF2；20 ng ml-1；R&D Systems）直至第24 天.在 悬浮 的 第 第 6 天 将 神经 球体 转移 含有 含有 nevrobasal-a （10888 ， Life Technologies０ 焟 焫 縍b-27 补充剂 （12587 ， Life Technologies） Glutamax （1: 100 ， Life TechNOGIS青霉素 的 祴经 培养 基 中 链鈠 1（链霉 ） 缌链霉Teknologier） 表皮 生长 因子 （（（20 ng ml-1 ； r & d Systems） 成 纤维 细胞 生长 2 （fgf2 ； 20 ng ml- 1；R&D SystemsＳ瀩瀬24Ｓ На 6-й день суспензии нейросферы были переведены на добавку, содержащую нейробазал-А (10888, Life Technologies), til 27. desember А (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies), пенициллин- нейтрализованный стрептомицин (1:100, Life Technologies) с добавлением фальпицин (EGF; 20 нг мл-1; R&D Systems) og фактора роста фибробластов 2 (FGF2; 20 нг ml-1) 1; På dag 6 ble nevrosfæresuspensjonene byttet til et tilskudd som inneholdt neurobasal-A (10888, Life Technologies), B-27-tilskudd uten vitamin A (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies), penicillin-nøytralisert streptomycin (1:100, Life Technologies) tilsatt epidermal vekstfaktor (EGF; 20 ng ml-1; R&D Systems) og fibroblastvekstfaktor 2 (FGF2; 20 ng ml-1)1; FoU-systemer) til 24-dager. FoU-systemer) frem til dag 24.Fra dag 25 til 42 ble hjerneavledet nevrotrofisk faktor (BDNF; 20 ng ml-1, Peprotech) og nevrotrofisk faktor 3 (NT3; 20 ng ml-1, Peprotech) tilsatt kulturmediet annenhver dag. Mediumbytte én gang.Fra dag 43 ble hCO opprettholdt i ikke-supplert neurobasal-A-medium (NM; 1088022, Thermo Fisher) med mediumbytte hver 4.–6. dag. For å oppnå hCO fra hiPS-celler dyrket under forhold uten fôr, ble hiPS-celler inkubert med Accutase (AT-104, Innovate Cell Technologies) ved 37 °C i 7 minutter, dissosiert til enkeltceller og platet ut på AggreWell 800-plater (34815, STEMCELL Technologies) med en tetthet på 3 × 106 enkeltceller per brønn i Essential 8-medium tilsatt ROCK-hemmeren Y-27632 (10 μM; S1049, Selleckchem). Etter 24 timer ble mediet i brønnene pipettert opp og ned i medier som inneholdt Essential 6-medium (A1516401, Life Technologies) tilsatt dorsomorfin (2,5 μM; P5499, Sigma-Aldrich) og SB-431542 (10 μM; 1614, Tocrida). Fra dag 2 til 6 ble Essential 6-medium erstattet daglig med dorsomorfin og tilskudd SB-431542. Fra den sjette dagen ble nevrosfæresuspensjonene overført til det nevrobasale mediet og vedlikeholdt som beskrevet ovenfor.
Alle dyreprosedyrer ble utført i samsvar med retningslinjene for dyrepleie godkjent av Stanford University Laboratory Animal Care Administrative Committee (APLAC). Drektige, euthymiske RNU (rnu/+) rotter ble kjøpt inn (Charles River Laboratories) eller huset. Dyrene ble holdt i en 12-timers lys-mørke-syklus med mat og vann ad libitum. Nakne (FOXN1–/–) rotteunger i alderen tre til syv dager ble identifisert ved vekst av umodne værhår før avliving. Valper (hanner og hunner) ble bedøvet med 2–3 % isofluran og plassert på en stereotaksisk ramme. En trepanasjon av skallen med en diameter på omtrent 2–3 mm over S1 ble utført samtidig som dura mater ble opprettholdt. Bruk deretter en 30-G nål (omtrent 0,3 mm) like utenfor kraniotomien for å gjennombore dura. Påfør deretter HCO3 på en tynn 3 × 3 cm parafilm og fjern overflødig medium. Bruk en Hamilton-sprøyte festet til en 23 G, 45° nål, og trekk forsiktig hCO3 inn i den mest distale enden av nålen. Installer deretter sprøyten på sprøytepumpen som er koblet til den stereotaksiske enheten. Plasser deretter nålespissen over et tidligere laget 0,3 mm bredt punkteringshull i dura (z = 0 mm) og smaln sprøyten 1–2 mm (z = omtrent –1,5 mm) til nålen er mellom dura mater A. En tett forsegling dannes. Løft deretter sprøyten til midten av den kortikale overflaten ved z = -0,5 mm og injiser hCO3 med en hastighet på 1–2 µl per minutt. Etter at hCO3-injeksjonen er fullført, trekkes nålen tilbake med en hastighet på 0,2–0,5 mm per minutt, huden sys sammen, og valpen plasseres umiddelbart på en varm varmepute til den er fullstendig rekonvalesens. Noen dyr ble transplantert bilateralt.
Alle dyreprosedyrer ble utført i samsvar med Stanford Universitys APLAC-godkjente retningslinjer for dyrepleie. Rotter (mer enn 60 dager etter transplantasjon) ble indusert med 5 % isoflurananestesi og bedøvet med 1–3 % isofluran under avbildning. For visualisering ble en 7 Tesla aktivt skjermet horisontal borehullsskanner fra Bruker (Bruker Corp.) med en International Electric Company (IECO) gradientdriver, en skjermet gradientinnsats med en indre diameter på 120 mm (600 mT/m, 1000 T/m/s) brukt ved bruk av AVANCE. III, åttekanals flerspole-RF og flerkjernefunksjoner, og den tilhørende Paravision 6.0.1-plattformen. Opptaket ble utført ved bruk av en aktivt frakoblet volumetrisk RF-spole med en indre diameter på 86 mm og en firekanals kryokjølt RF-spole kun for mottak. Aksial 2D Turbo-RARE (repetisjonstid = 2500 ms, ekkotid = 33 ms, 2 gjennomsnitt) med 16 snittopptak, snitttykkelse 0,6–0,8 mm, inneholdende 256 × 256 prøver. Signalene ble mottatt ved hjelp av en kvadratur-transceiver volumetrisk RF-spole med en indre diameter på 2 cm (Rapid MR International, LLC). Til slutt ble de innebygde Imaris (BitPlane) overflateestimeringsfunksjonene brukt for 3D-gjengivelse og volumanalyse. En vellykket transplantasjon ble definert som en der områder med kontinuerlig T2-vektet MR-signal ble dannet i den transplanterte hemisfæren. Transplantatavstøtning ble definert som et transplantat som ikke produserte områder med kontinuerlig T2-vektet MR-signal i den transplanterte hemisfæren. Subkortikal t-hCO ble ekskludert fra påfølgende analyse.
For å stabilt uttrykke GCaMP6-er i hCO for to-foton kalsiumavbildning, ble hiPS-celler infisert med pLV[Exp]-EF1a::GcaMP6s-WPRE-Puro, etterfulgt av valg av antibiotika. Kort fortalt ble cellene dissosiert med EDTA og suspendert i 1 ml Essential 8-medium med en tetthet på omtrent 300 000 celler i nærvær av polybren (5 μg/ml) og 15 μl virus. Cellene ble deretter inkubert i suspensjon i 60 minutter og sådd med en tetthet på 50 000 celler per brønn. Etter konfluens ble cellene behandlet med 5–10 μg ml-1 puromycin i 5–10 dager, eller til stabile kolonier dukket opp. Akutt hCO-infeksjon ble utført som tidligere beskrevet5 med noen modifikasjoner. Kort fortalt, overfør dag 30–45 hCO til 1,5 ml Eppendorf-mikrosentrifugerør som inneholdt 100 μl nervemedium. Deretter fjernes omtrent 90 µl av mediet, 3–6 µl høytiter lentivirus (fra 0,5 x 108 til 1,2 x 109) tilsettes røret, og hCO3 overføres til inkubatoren i 30 minutter. Tilsett deretter 90–100 µl medium til hvert rør og sett rørene tilbake i inkubatoren over natten. Neste dag overføres hCO3 til friskt nervemedium i plater med lav festeevne. Etter 7 dager ble hCO3 overført til 24-brønns glassbunnplater for visualisering og evaluering av infeksjonskvalitet. pLV[Exp]-SYN1::EYFP-WPRE og pLV[Exp]-SYN1::hChR2-EYFP-WPRE ble generert av VectorBuilder. Lentivirus brukes i de fleste eksperimenter fordi det er integrert i vertsgenomet, noe som tillater reportergenuttrykk i infiserte cellelinjer. For oppfølging av rabies ble hCO på dag 30–45 koinfisert med rabies-ΔG-eGFP og AAV-DJ-EF1a-CVS-G-WPRE-pGHpA (plasmid #67528, Addgene), vasket grundig i 3 dager og transplantert til rotter i S1 og holdt in vivo i 7–14 dager.
For immunocytokjemi ble dyrene bedøvet og transkardielt perfusert med PBS, etterfulgt av 4 % paraformaldehyd (PFA i PBS; Electron Microscopy Sciences). Hjernene ble fiksert i 4 % PFA i 2 timer eller over natten ved 4 °C, kryokonservert i 30 % sukrose i PBS i 48–72 timer og innstøpt i 1:1, 30 % sukrose:OCT (Tissue-Tek OCT Compound 4583, Sakura Finetek), og koronale snitt ble laget ved 30 µm ved bruk av en kryostat (Leica). For immunhistokjemi av tykke snitt ble dyrene perfusert med PBS, og hjernen ble dissekert og seksjonert koronalt ved 300–400 µm ved bruk av en vibratom (Leica), og snittene ble fiksert med 4 % PFA i 30 minutter. Deretter ble kryosnitt eller tykke snitt vasket med PBS, blokkert i 1 time ved romtemperatur (10 % normalt eselserum (NDS) og 0,3 % Triton X-100 fortynnet i PBS) og blokkert med blokkeringsløsning ved 4 °C. – Inkubasjon Kryosnittene ble inkubert over natten, og tykke snitt ble inkubert i 5 dager. Primære antistoffer som ble brukt var: anti-NeuN (mus, 1:500; ab104224, abcam) anti-CTIP2 (rotte, 1:300; ab18465, abcam), anti-GFAP (kanin, 1:1000; Z0334, Dako), anti-GFP (kylling, 1:1000; GTX13970, GeneTex), anti-HNA (mus, 1:200; ab191181, abcam), anti-NeuN (kanin, 1:500; ABN78, Millipore), anti-PDGFRA (kanin, 1:200; sc-338, Santa Cruz), anti-PPP1R17 (kanin, 1:200; HPA047819, Atlas Antibodies), anti-RECA-1 (mus, 1:50; ab9774, abcam), anti-SCG2 (kanin, 1:100; 20357-1-AP, Proteintech), anti-SOX9 (geit, 1:500; AF3075, R&D Systems), Netrin G1a (geit, 1:100; AF1166, R&D Systems), anti-STEM121 (mus, 1:200; Y40410, Takara Bio), anti-SATB2 (mus, 1:50; ab51502, abcam), anti-GAD65/67 (kanin, 1:400; ABN904, Millipore) og anti-IBA1 (geit, 1:100; ab5076, abcam). Primære antistoffer som ble brukt var: anti-NeuN (mus, 1:500; ab104224, abcam) anti-CTIP2 (rotte, 1:300; ab18465, abcam), anti-GFAP (kanin, 1:1000; Z0334, Dako), anti-GFP (kylling, 1:1000; GTX13970, GeneTex), anti-HNA (mus, 1:200; ab191181, abcam), anti-NeuN (kanin, 1:500; ABN78, Millipore), anti-PDGFRA (kanin, 1:200; sc-338, Santa Cruz), anti-PPP1R17 (kanin, 1:200; HPA047819, Atlas Antibodies), anti-RECA-1 (mus, 1:50; ab9774, abcam), anti-SCG2 (kanin, 1:100; 20357-1-AP, Proteintech), anti-SOX9 (geit, 1:500; AF3075, R&D Systems), Netrin G1a (geit, 1:100; AF1166, R&D Systems), anti-STEM121 (mus, 1:200; Y40410, Takara Bio), anti-SATB2 (mus, 1:50; ab51502, abcam), anti-GAD65/67 (kanin, 1:400; ABN904, Millipore) og anti-IBA1 (geit, 1:100; ab5076, abcam). Использовались следующие первичные антитела: анти-NeuN (мышиные, 1:500; ab104224, abcam), анти-CTIP2 (крысины6, abcam), abcam, abcam анти-GFAP (кроличьи, 1:1000; Z0334, Dako), анти- -GFP (курица, 1:1000; GTX13970, GeneTex), анти-HNA (мышь, 1:200; ab19118; ab19118) 1:500; ABN78, Millipore), анти-PDGFRA (кролик, 1:200; sc-338, Санта-Круз), анти-PPP1R17 (кролик, 1:200; HPA047819, Atlas Antibodies), анти-RECA-1 (мышь, 1:50; ab9774, abcam), анти-SCG2 (scg2, анти-SCG2; 20357-1-AP, Proteintech), анти-SOX9 (козий, 1:500; AF3075, R&D Systems), нетрин G1a (козий, 1:100; AF1166, R&D Systems), анти-STEM121 (мыный: 20ши; Y40410, Takara Bio), анти-SATB2 (мышь, 1:50; ab51502, abcam), анти-GAD65/67 (кролик, 1:400; ABN904, Millipore) og анти-IBA1 (коза, 1:100; аб5076, абкам). De primære antistoffene som ble brukt var: anti-NeuN (mus, 1:500; ab104224, abcam), anti-CTIP2 (rotte, 1:300; ab18465, abcam), anti-GFAP (kanin, 1:1000; Z0334, Dako), anti-GFP (kylling, 1:1000; GTX13970, GeneTex), anti-HNA (mus, 1:200; ab191181, abcam), anti-NeuN (kanin, 1:500; ABN78, Millipore), anti-PDGFRA (kanin, 1:200; sc-338, Santa Cruz), anti-PPP1R17 (kanin, 1:200; HPA047819, Atlas Antibodies), anti-RECA-1 (mus, 1:50; ab9774, abcam), anti-SCG2 (kanin, 1:100; 20357-1-AP, Proteintech), anti-SOX9 (geit, 1:500; AF3075, R&D Systems), netrin G1a (geit, 1:100; AF1166, R&D Systems), anti-STEM121 (mus, 1:200; Y40410, Takara Bio), anti-SATB2 (mus, 1:50; ab51502, abcam), anti-GAD65/67 (kanin, 1:400; ABN904, Millipore) og anti-IBA1 (geit, 1:100; ab5076, abkam).使用的一抗是：抗NeuN（小鼠，1:500；ab104224，abcam）抗CTIP2（大鼠，1:3 00；ab18465，abcam），抗GFAP（兔，1:1,000；Z0334，Dako），抗-GF P（鸡，1:1,000；GTX13970，GeneTex），抗HNA（小鼠，1:200；ab1911 81，abcam），抗NeuN（兔，1:500；ABN78，Millipore），抗PDGFRA（兔， 1:200；sc-338，Santa Cruz），抗PPP1R17（兔，1:200；HPA047819，Atlas抗体），抗RECA-1（小鼠，1:50；ab9774，abcam），抗SCG2（兔） , 1:100；20357-1-AP，Proteintech），抗SOX9（山羊，1:500；AF3075，R&D Systems），Netrin G1a（山羊，，100，1:10 Systems），抗STEM121（小鼠, 1:200;使用的一抗是：抗NeuN（小鼠，1:500；ab104224，abcam）抗CTIP2（大鼠，1 :300；ab18465，abcam），抗GFAP（兔，1:1,000；Z0334，Dako），抗-GFP（鸡，1:1,000；GTX13970，GeneTex），抗HNA（小鼠，1:200；ab 191181，abcam），抗NeuN（兔，1:500；ABN78，Millipore％弔，抗1: 200；sc-338，Santa Cruz），抗PPP1R17（兔，1:200；HPA047819，Atlas抗体），抗RECA-1（小鼠，1:50；ab9774，abcam），抗SCG2 nr Systemer）頏1:20, ;Y40410, Takara Bio), anti-SATB2 (mus, 1:50; ab51502, abcam), anti-GAD65/67 (kanin, 1:400; ABN904, Millipore) og anti-IBA1 (geit, 1:100; ab5076, abcam).De primære antistoffene som ble brukt var: anti-NeuN (mus, 1:500; ab104224, abcam), anti-CTIP2 (rotte, 1:300; ab18465, abcam), anti-GFAP (kanin, 1:1000; Z0334, Dako). , anti-GFP (kylling, 1:1000; GTX13970, GeneTex), anti-HNA (mus, 1:200; ab191181, abcam), anti-NeuN (kanin, 1:500; ABN78, Millipore), anti-PDGFRA (kanin, 1:200; sc-338, Santa Cruz), anti-PPP1R17 (kanin, 1:200; HPA047819, Atlas-antistoff), anti-RECA-1 (mus, 1:50; ab9774, abcam), anti-SCG2 (kanin), 1:100;20357-1-AP, Proteintech), анти-SOX9 (коза, 1:500; AF3075, R&D Systems), Нетрин G1a (коза, 1:100; AF1166, R&D Systems), анти -STEM1021, мы1ш400ь, мы1ш400ь; Bio), анти-SATB2 (мышь, 1:50; ab51502, abcam), анти-GAD65/67 (кролик, 1:400; ABN904, Millipore) og анти-IBA1 (коза, 1:100; аба76; аба50ка). 20357-1-AP, Proteintech), anti-SOX9 (geit, 1:500; AF3075, R&D Systems), Netrin G1a (geit, 1:100; AF1166, R&D Systems), anti-STEM121 (mus, 1:200; Y40410, Takara Bio), anti-SATB2 (mus, 1:50; ab51502, abcam), anti-GAD65/67 (kanin, 1:400; ABN904, Millipore) og anti-IBA1 (geit, 1:100; ab5076, abkam).Snittene ble deretter vasket med PBS og inkubert med sekundært antistoff i 1 time ved romtemperatur (frosne snitt) eller over natten ved 4 °C (tykke snitt). Alexa Fluor sekundært antistoff (Life Technologies) fortynnet 1:1000 i blokkeringsløsning ble brukt. Etter vask med PBS ble kjernene visualisert med en Hoechst 33258 (Life Technologies). Til slutt ble objektglassene plassert på et mikroskop med dekkglass (Fisher Scientific) ved hjelp av en Aquamount (Polysciences) og analysert på et Keyence fluorescerende mikroskop (BZ-X analysator) eller et Leica TCS SP8 konfokalmikroskop (Las-X) på bildet. Bildene ble behandlet ved hjelp av ImageJ-programmet (Fiji). For å kvantifisere andelen humane nevroner i t-hCO og rottebarken ble det tatt 387,5 μm brede rektangulære bilder i midten av t-hCO, ved eller nær kanten av rottebarken. Transplantatmarginer ble bestemt ved å vurdere endringer i vevstransparens, HNA+ kjerner og/eller tilstedeværelsen av vevsautofluorescens. I hvert bilde ble det totale antallet NeuN+ og HNA+ celler delt på det totale antallet NeuN+ celler i samme område. For å sikre at bare celler med kjerner i bildeplanet telles, inkluderes bare celler som også er Hoechst+ i beregningen. To bilder atskilt med minst 1 mm ble gjennomsnittsberegnet for å redusere den statistiske feilen.
En uke før prøveinnsamling, plasser hCO3-transplantasjonsdyr (omtrent 8 måneder med differensiering) i et mørkt rom med værhår trimmet for å minimere sensorisk stimulering. Isolering av kjerner ble utført som beskrevet tidligere, med noen modifikasjoner. Kort fortalt ble t-hCO3 og hCO3 ødelagt ved hjelp av detergent-mekanisk cellelyse og en 2 ml glassvevsmølle (D8938, Sigma-Aldrich/KIMBLE). De rå kjernene ble deretter filtrert av ved hjelp av et 40 µm filter og sentrifugert ved 320 g i 10 minutter ved 4 °C før en sukrosetetthetsgradient ble utført. Etter sentrifugeringstrinnet (320 g i 20 minutter ved 4 °C) ble prøvene resuspendert i 0,04 % BSA/PBS med tilsetning av 0,2 enheter µl-1 RNase-hemmer (40 u µl-1, AM2682, Ambion) og ført gjennom et 40 µm strømningsfilter. De dissosierte kjernene ble deretter resuspendert i PBS som inneholdt 0,02 % BSA og lastet på en Chromium Single Cell 3′-brikke (estimert gjenvinning på 8000 celler per bane). snRNA-sekvenseringsbiblioteker ble fremstilt med Chromium Single cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics). snRNA-sekvenseringsbiblioteker ble fremstilt med Chromium Single cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics). Библиотеки snRNA-seq были приготовлены с помощью Chromium Single cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics). snRNA-seq-bibliotekene ble fremstilt ved bruk av Chromium Single cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics). snRNA-seq 文库是使用Chromium Single cell 3′ GEM、Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics) 制备的。 snRNA-seq 文库是使用Chromium Single cell 3′ GEM、Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics) 制备的。 Библиотеку snRNA-seq готовили использованием Chromium Single Cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics). snRNA-seq-biblioteket ble fremstilt ved bruk av Chromium Single Cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics).Biblioteker fra forskjellige prøver ble samlet og sekvensert av Admera Health på NovaSeq S4 (Illumina).
Genekspresjonsnivåer for hver antatte kjernestrekkode ble kvantifisert ved hjelp av 10x Genomics CellRanger-analyseprogramvarepakken (versjon 6.1.2). Mer spesifikt ble avlesningene matchet mot en kombinasjon av humane (GRCh38, Ensemble, versjon 98) og rotte (Rnor_6.0, Ensemble, versjon 100) referansegenomer opprettet med mkref-kommandoen og ved bruk av count med –include-introns=TRUE-kommandoen for å kvantifisere inkluderte avlesninger kartlagt til intronregioner. For t-hCO-prøver ble humane kjerner identifisert basert på det konservative kravet om at minst 95 % av alle kartlagte avlesninger samsvarer med det menneskelige genomet. Alle påfølgende analyser ble utført på en filtrert strekkodematrise som ble sendt ut fra CellRanger ved hjelp av R-pakken (versjon 4.1.2) Seurat (versjon 4.1.1)32.
For å sikre at kun kjerner av høy kvalitet inkluderes i den påfølgende analysen, ble en iterativ filtreringsprosess implementert for hver prøve. Først identifiseres og fjernes kjerner av lav kvalitet med færre enn 1000 unike gener funnet og mer enn 20 % av det totale antallet mitokondrier. Deretter ble den rå gennummermatrisen normalisert ved regularisert negativ binomial regresjon ved bruk av sctransform(vst.flavor=”v2″)-funksjonen, som også identifiserte de 3000 mest variable genene ved bruk av standardparametere. Dimensjonsreduksjon ble utført på de øvre variable genene ved bruk av Principal Component Analysis (PCA) med standardparametere ved bruk av en datasettdimensjon på 30 (dims = 30 ble valgt basert på visuell inspeksjon av kneområdene og brukt for alle prøver og ensembleanalyser). Vi utførte deretter flere runder med iterativ klynging (oppløsning = 1) for å klassifisere gener basert på unormalt lavt gentall (median under 10. persentil), unormalt høyt mitokondrie-gentall (median over 95. persentil) for å identifisere og fjerne antatte celler av lav kvalitet. klynger og/eller en høy andel mistenkte tvillinger identifisert ved bruk av DoubletFinder33-pakken (gjennomsnittlig DoubletFinder-poengsum over 95. persentil). t-hCO-prøver (n=3) og hCO-prøver (n=3) ble integrert separat ved bruk av IntegrateData-funksjonen med parameterne ovenfor. Deretter en ny runde med kvalitativ filtrering av det integrerte datasettet ble utført som beskrevet ovenfor.
Etter å ha fjernet kjernene av lav kvalitet, ble det integrerte datasettet gruppert (oppløsning = 0,5) og innebygd for UMAP34-visualiseringsformål. Markørgener for hver klynge ble bestemt ved hjelp av FindMarkers-funksjonen med standardparametere beregnet fra normaliserte genuttrykksdata. Vi identifiserer og klassifiserer hovedcelleklasser ved å kombinere referansedatasett for føtal og voksen kortikal celle med markørgenuttrykk [19, 20, 21, 35] og annotering. Spesielt ble sirkulerende forløpere identifisert ved uttrykk av MKI67 og TOP2A. Progenitorklynger ble definert ved fravær av mitotiske transkripter, høy overlapping med multipotente gliale progenitorklynger beskrevet i sen metafase føtal cortex, og EGFR- og OLIG1-uttrykk. Vi bruker begrepet astrocytt for å omfatte flere tilstander av astrocyttdifferensiering, fra sen radial glia til modning av astrocytter. Astrocyttklynger uttrykker høye nivåer av SLC1A3 og AQP4 og har vist seg å kartlegges med subtyper av føtal radial glia og/eller voksne astrocytter. OPC-er uttrykker PDGFRA og SOX10, mens oligodendrocytter uttrykker myeliniseringsmarkører (MOG og MYRF). Glutamaterge nevroner ble identifisert ved tilstedeværelsen av nevrale transkripter (SYT1 og SNAP25), fraværet av GABAerge markører (GAD2) og uttrykket av NEUROD6, SLC17A7, BCL11B eller SATB2. GluN-nevroner ble videre delt inn i øvre (SATB2-ekspresjon og tap av BCL11B) og dype (BCL11B-ekspresjon) underklasser. Antatte subplate-nevroner (SP) uttrykker kjente SP18-markører som ST18 og SORCS1 i tillegg til dype GluN-markører. Choroid plexus-lignende celler ble identifisert ved TTR-ekspresjon, og meningeal-lignende celler uttrykte fibroblasassosierte gener og kartla pial/vaskulære celler fra referansedatasettet.
Differensialanalyse av genuttrykk mellom t-hCO og hCO underklasser ble utført ved hjelp av en nyutviklet pseudo-batch-metode reprodusert i prøver implementert ved hjelp av Libra R-pakken (versjon 1.0.0). Mer spesifikt ble edgeR log-likelihood-tester (versjon 3.36.0, pakke R) utført for grupper ved å summere antall gener i celler for en gitt celleklasse for hver prøvereplikasjon. For visualisering av varmekart beregnes normaliserte per million (CPM) verdier ved hjelp av edgeR (cpm() funksjon) og skaleres (for å oppnå gjennomsnitt = 0, standardavvik = 1). Gene Ontology (GO) berikelsesanalyse av signifikant oppregulerte t-hCO GluN gener ble utført (Benjamini-Hochberg-korrigert P-verdi på mindre enn 0,05 uttrykt i minst 10 % av t-hCO GluN celler og en fold økning i endring på minst 2 ganger) utført ved hjelp av ToppGene Suite (https://toppgene.cchmc.org/)37. Vi bruker ToppFun-appen med standardparametere og rapporterer Benjamini-Hochberg-korrigerte P-verdier beregnet fra GO-annoterte hypergeometriske tester.
For å matche våre snRNA-sekvenseringsklynger med annoterte celleklynger fra referansestudier av primær enkeltcellet RNA-sekvensering eller voksen snRNA-sekvensering19,20,21,22, anvendte vi en paret datasettintegrasjonsmetode. Vi brukte SCTransform (v2) normaliseringsarbeidsflyten i Seurat for å integrere og sammenligne klyngeoverlappinger mellom datasett (ved å bruke de samme parameterne som ovenfor). Individuelle datasett ble tilfeldig delsett med opptil 500 celler eller kjerner per opprinnelig klynge for beregningseffektivitet. Ved å bruke en lignende tilnærming som beskrevet tidligere, ble klyngeoverlapping definert som andelen celler eller kjerner i hver samlet klynge som overlappet med etiketten til referanseklyngen. For å klassifisere GluN-er ytterligere, brukte vi Seurats TransferData-arbeidsflyt for GluN-delsettdata for å tilordne referansedatasettetiketter til våre GluN-celler.
For å vurdere modningsstatusen til det globale transkriptomet av t-hCO og hCO prøver, sammenlignet vi våre pseudo-bulkprøver med BrainSpan/psychENCODE23, som består av en stor RNA-sekvens som spenner over menneskelig hjerneutvikling. Vi utførte PCA på en kombinert mønsternormalisert genuttrykksmatrise fra kortikale prøver 10 uker etter unnfangelse og senere, i 5567 gener (sammen med våre data) som tidligere ble identifisert som aktive i BrainSpan kortikale prøver (definert som større enn 50 % i utviklingsvarians forklart av alder ved bruk av en kubisk modell)38. I tillegg utledet vi gener assosiert med viktige transkriptomsignaturer av nevroutvikling ved bruk av ikke-negativ matrisefaktorisering som tidligere beskrevet. Prøvevektene beregnet ved bruk av den ikke-negative matrisefaktoriseringsprosedyren er plottet i figur 5b med utvidede data for hver av de fem signaturene beskrevet av Zhu et al.38. Igjen ble aktivitetsavhengige transkripsjonsmarkører utledet fra tidligere publiserte studier. Spesielt var ERG og LRG signifikant oppregulert i glutamaterge nevroner identifisert av snRNA-sekvenssamlingen i musens visuelle cortex etter visuell stimulering fra tilleggstabell 3 Hrvatin et al.16. Humane berikede LRG-er ble oppnådd fra KCl-aktiverte humane føtale hjernekulturer og høstet 6 timer etter stimulering, og de filtrerte genene var signifikant oppregulert hos mennesker, men ikke hos gnagere (tilleggstabell 4). Analyse av gensettberikelse ved bruk av disse gensettene ble utført ved hjelp av en enveis Fishers eksakte test.
Bedøv rotter med isofluran, fjern hjerner og plasser dem i kald (omtrent 4 °C) oksygenert (95 % O2 og 5 % CO2) sukroseløsning for snitt som inneholder: 234 mM sukrose, 11 mM glukose, 26 mM NaHCO3, 2,5 mM KCl, 1,25 mM NaH2PO4, 10 mM MgSO4 og 0,5 mM CaCl2 (omtrent 310 mOsm). Koronale snitt av rottehjerne (300–400 µm) som inneholdt t-hCO3 ble laget ved hjelp av et Leica VT1200 vibratom som beskrevet tidligere39. Snittene ble deretter overført til et seksjoneringskammer med kontinuerlig oksygenering ved romtemperatur som inneholdt aCSF fremstilt fra: 10 mM glukose, 26 mM NaHCO3, 2,5 mM KCl, 1,25 mM NaHPO4, 1 mM MgSO4, 2 mM CaCl2 og 126 mM NaCl (298 mOsm), minst 45 minutter før opptak. Snittene ble registrert i et nedsenket kammer hvor de kontinuerlig ble perfusert med aCSF (95 % O2 og 5 % CO2-ampulle). Alle data ble registrert ved romtemperatur. t-hCO-nevroner ble avsluttet med en borsilikatglasspipette fylt med en løsning som inneholdt 127 mM kaliumglukonat, 8 mM NaCl, 4 mM magnesium ATP, 0,3 mM natrium GTP, 10 mM HEPES og 0,6 mM EGTA, pH 7,2, intern løsning justert med KOH (290 mOsm). For å gjenvinne ble biocytin (0,2 %) tilsatt opptaksløsningen.
Data ble samlet inn ved hjelp av en MultiClamp 700B-forsterker (Molecular Devices) og en Digidata 1550B-digitalisator (Molecular Devices), lavpassfiltrert ved 2 kHz, digitalisert ved 20 kHz og analysert ved hjelp av Clampfit (Molecular Devices), Origin (OriginPro, 2021b, OriginLab) og tilpassede MATLAB-funksjoner (Mathworks). Koblingspotensialet ble beregnet ved hjelp av JPCalc, og oppføringene ble justert til den beregnede verdien på -14 mV. Operasjon IV består av en serie strømtrinn i trinn på 10–25 pA, fra -250 til 750 pA.
Thalamus, hvit substans og S1-afferenter ble elektrisk stimulert i thalamokortikale snitt under patch-clamp-registrering av hCO-nevroner, som beskrevet tidligere. Kort fortalt ble hjernen plassert på et 3D-printingsbord vippet i en 10° vinkel, og forsiden av hjernen ble kuttet i en 35° vinkel. Hjernen ble deretter limt til den kuttede overflaten og delt i seksjoner, slik at de thalamokortikale utstående aksonene ble bevart. Bipolare wolframelektroder (0,5 MΩ) ble montert på en andre mikromanipulator og strategisk plassert for å stimulere fire regioner per celle (indre kapsel, hvit substans, S1 og hCO). Registrer synaptiske responser etter 300 µA fasisk stimulering ved 0,03–0,1 Hz.
hChR2-uttrykkende hCO-nevroner ble aktivert ved 480 nm, og lyspulser generert av en LED (Prizmatix) ble påført gjennom et ×40-objektiv (0,9 NA; Olympus) for å registrere hChR2-ekspresjon nær cellene. Diameteren på det belyste feltet er omtrent 0,5 mm, og den totale effekten er 10–20 mW. Pulsbredden ble satt til 10 ms, som tilsvarer pulsen gitt under atferdslæringseksperimentet. Ulike stimuleringsfrekvenser ble brukt, fra 1 til 20 Hz, men bare den første pulsen i serien ble brukt til kvantifisering. Intervallene mellom togene er vanligvis lengre enn 30 sekunder for å minimere effekten på synaptiske hemmende eller tilretteleggende veier. For å teste om hChR2-responsen var monosynaptisk, påførte vi TTX (1 μM) på badet til EPSC-reaksjonen forsvant, og deretter påførte vi 4-aminopyridin (4-AP; 100 μM). Vanligvis returneres en respons innen få minutter, med en litt lengre forsinkelse mellom LED-avfyring og EPSC-generering. NBQX (10 μM) ble brukt til å teste om responsen er drevet av AMPA-reseptorer.
Skarpe hCO₂-seksjoner ble laget som beskrevet tidligere. Kort fortalt ble hCO₂-seksjoner innstøpt i 4 % agarose og overført til celler som inneholdt 126 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM NaH₂PO₄, 1 mM MgSO₄, 2 mM CaCl₂, 26 mM NaHCO₃ og 10 mM d-(+)-glukose i seksjonene. Seksjonene ble kuttet ved 200–300 µm ved romtemperatur ved bruk av en Leica VT1200-vibrator og lagret i ASF ved romtemperatur. Deretter ble patch-camp-registrering av hele celler utført på hCO₂-seksjoner under et direkte SliceScope-mikroskop (Scientifica). Seksjonene ble perfusert med aCSF (95 % O₂ og 5 % CO₂), og cellesignaler ble registrert ved romtemperatur. hCO-nevroner ble påført ved hjelp av en borsilikatglasspipette fylt med en løsning som inneholdt 127 mM kaliumglukonat, 8 mM NaCl, 4 mM magnesium ATP, 0,3 mM natrium GTP, 10 mM HEPES og 0,6 mM EGTA, intern pH 7, 2, justert med KOH (osmolaritet 290). For gjenvinningsformål, tilsett 0,2 % Biocytin til den interne løsningen.
Data ble samlet inn av Clampex (Clampex 11.1, Molecular Devices) ved hjelp av en MultiClamp 700B-forsterker (Molecular Devices) og en Digidata 1550B-digitalisator (Molecular Devices), lavpassfiltrert ved 2 kHz, digitalisert ved 20 kHz og analysert ved hjelp av Clampfit (versjon 10.6) for analyse (molekylære enheter) og tilpassede MATLAB-funksjoner (MATLAB 2019b, Mathworks). Koblingspotensialet ble beregnet ved hjelp av JPCalc, og oppføringene ble justert til det beregnede koblingspotensialet på -14 mV. Operasjon IV består av en serie strømtrinn i trinn på 5–10 pA fra -50 til 250 pA.
For morfologisk rekonstruksjon av klemte nevroner ble 0,2 % biocytin (Sigma-Aldrich) tilsatt den interne løsningen. Cellene primes i minst 15 minutter etter hakking. Pipetten trekkes deretter sakte inn i 1–2 minutter til den registrerte membranen er fullstendig forseglet. Etter snittfysiologisk prosedyre ble snittene fiksert over natten ved 4 °C i 4 % PFA, vasket med PBS X3 og fortynnet 1:1000 med streptavidin-konjugert DyLight 549 eller DyLight 405 (Vector Labs). Celler fylt med biocytin (2 %; Sigma-Aldrich) ble merket under patch clamp-opptak ved romtemperatur i 2 timer. Snittene ble deretter montert på mikroskopiobjektglass ved hjelp av en Aquamount (Thermo Scientific) og visualisert dagen etter på et Leica TCS SP8 konfokalmikroskop med et oljeimmersionsobjektiv med en numerisk apertur ×40 1,3, forstørrelse ×0,9–1,0, xy. Samplingsfrekvensen er omtrent 7 piksler per mikron. Z-stabler med intervaller på 1 µm ble tatt serielt, og z-stack-mosaikker og Leica-basert auto-stitching ble utført for å dekke hele det dendrittiske treet til hvert nevron. Nevroner ble deretter sporet semimanuelt ved hjelp av neuTube 40-grensesnittet, og SWC-filer ble generert. Filene ble deretter lastet opp til SimpleNeuriteTracer41 Fiji-pluginen (ImageJ, versjon 2.1.0; NIH).
Humant kortikalt vev ble innhentet med informert samtykke i henhold til en protokoll godkjent av Institutional Review Board ved Stanford University. To prøver av humant postpartumvev (3 og 18 år gamle) ble innhentet ved reseksjon av frontal cortex (midtre frontal gyrus) som en del av kirurgi for refraktær epilepsi. Etter reseksjon, høstet vev i iskald NMDG-aCSF som inneholdt: 92 mM NMDG, 2,5 mM KCl, 1,25 mM NaH2PO4, 30 mM NaHCO3, 20 mM HEPES, 25 mM glukose, 2 mM tiourea, 5 mM natriumaskorbat, 3 mM natriumpyruvat, 0,5 mM CaCl2 4H2O og 10 mM MgSO4 7H2O. Titrer til pH 7,3–7,4 med konsentrert saltsyre. Vevet ble levert til laboratoriet innen 30 minutter, og koronale snitt ble tatt i henhold til prosedyren beskrevet ovenfor.
Alle dyreprosedyrer ble utført i samsvar med Stanford Universitys APLAC-godkjente retningslinjer for dyrepleie. Rotter (mer enn 140 dager etter transplantasjon) ble indusert med 5 % isoflurananestesi og bedøvet med 1–3 % isofluran intraoperativt. Dyrene ble plassert i en stereotaksisk ramme (Kopf), og buprenorfin (SR) med vedvarende frigivelse ble injisert subkutant. Hodeskallen ble eksponert, rengjort, og 3–5 beinskruer ble satt inn. For å målrette t-hCO3 genererte vi stereotaksiske koordinater fra MR-bilder. Et hull ble boret på det aktuelle stedet, og fibre (400 µm diameter, NA 0,48, dorisk) ble senket 100 µm under hCO3-overflaten og festet til hodeskallen med UV-herdbar tannsement (Relyx).
Fiberfotometriske opptak ble utført som tidligere beskrevet42. For å registrere spontan aktivitet ble rottene plassert i et rent bur, og en fiberoptisk patchkabel (Doric) med en diameter på 400 µm, koblet til et fiberoptisk fotometrisk datainnsamlingssystem, ble koblet til den implanterte fiberoptiske kabelen. I løpet av den 10 minutter lange registreringen av motorisk aktivitet kunne dyrene fritt utforske buret. For å registrere den fremkalte aktiviteten ble rottene (mer enn 140 dager etter transplantasjon) bedøvet med 5 % isofluran for induksjon og 1–3 % isofluran for vedlikehold. Plasser dyret i en stereotaktisk ramme (Kopf), og værhårene på motsatt side av t-hCO3 trimmes til ca. 2 cm og føres gjennom et nett koblet til en piezoelektrisk aktuator (PI). En 400 µm fiberoptisk patchkabel (Doric) ble koblet til den implanterte fiberen og koblet til datainnsamlingssystemet. Værhårene på motsatt side av t-hCO ble deretter avbøyd 50 ganger (2 mm ved 20 Hz, 2 s per presentasjon) på tilfeldige tidspunkter av en piezoelektrisk drivenhet over en 20-minutters opptaksperiode. Bruk Arduino MATLAB Support Package til å kontrollere avbøyningstiden med tilpasset MATLAB-kode. Hendelser synkroniseres med datainnsamlingsprogramvaren ved hjelp av transistor-transistor-logikk (TTL)-pulser.
Rotter (mer enn 140 dager etter transplantasjon) ble indusert med 5 % isoflurananestesi og bedøvet med 1–3 % isofluran intraoperativt. Dyrene ble plassert i en stereotaksisk ramme (Kopf), og buprenorfin SR og deksametason ble injisert subkutant. Hodeskallen eksponeres, rengjøres, og 3–5 beinskruer settes inn. For å målrette t-hCO genererte vi stereotaksiske koordinater fra MR-bilder. En sirkulær kraniotomi (omtrent 1 cm i diameter) ble utført med et høyhastighetsbor rett over den transplanterte hCO. Når beinet er så tynt som mulig, men før det bores gjennom hele beinet, brukes tang til å fjerne den gjenværende intakte bekkenskiven for å avdekke underliggende t-hCO. Kraniotomien ble fylt med sterilt saltvann, og et dekkglass og en spesiell hodepinne ble festet til hodeskallen med UV-herdet tannsement (Relyx).
To-foton-avbildning ble utført ved hjelp av et Bruker multifotonmikroskop med et Nikon LWD (×16, 0,8 NA) objektiv. GCaMP6-avbildning ble utført ved 920 nm med 1,4x enkelt z-plan forstørrelse og 8x gjennomsnitt på 7,5 fps. Rottene ble indusert med 5 % isoflurananestesi og vedlikeholdt med 1–3 % isofluran. Rottene ble plassert i en spesiallaget hodefeste og plassert under linsen. Et 3-minutters bakgrunnsopptak av motorisk aktivitet ble oppnådd. I løpet av 20 minutters opptak ble 50 drag (hver presentasjon 100 ms lang) tilfeldig levert til værhårputen motsatt t-hCO ved hjelp av en picospricer. Bruk Arduino MATLAB Support Package for å kontrollere burst-tid med tilpasset MATLAB-kode. Synkroniser hendelser med datainnsamlingsprogramvare (PrairieView 5.5) ved hjelp av TTL-pulser. For analyse ble bildene korrigert for xy-bevegelse ved hjelp av affin korreksjon i MoCo-programmet lansert på Fiji. Ekstraksjon av fluorescerende spor fra individuelle celler ved bruk av CNMF-E43. Fluorescens ble ekstrahert for hvert område av interesse, konvertert til dF/F-kurver og deretter konvertert til z-score.
Rotter (mer enn 140 dager etter transplantasjon) ble indusert med 5 % isoflurananestesi og bedøvet med 1–3 % isofluran intraoperativt. Dyrene ble plassert i en stereotaktisk ramme (Kopf), og buprenorfin SR og deksametason ble injisert subkutant. Værhårene på motsatt side av t-hCO ble kuttet til ca. 2 cm og tredd gjennom et nett koblet til en piezoelektrisk aktuator. Hodeskallen eksponeres og rengjøres. En jordskrue i rustfritt stål festes til hodeskallen. For å målrette t-hCO genererte vi stereotaksiske koordinater fra MR-bilder. Utfør en sirkulær kraniotomi (omtrent 1 cm i diameter) med et høyhastighetsbor rett over t-hCO. Når beinet er så tynt som mulig, men før du borer gjennom hele beinet, bruk tang til å fjerne den gjenværende intakte bekkenskiven for å avdekke underliggende t-hCO. Individuelle celler ble registrert ved hjelp av 32-kanals eller 64-kanals høydensitets silisiumprober (Cambridge Neurotech) jordet til jordskruer og forhåndsforsterket med RHD-forsterkere (Intan). Bruk manipulatoren til å senke elektrodene til målstedet gjennom kraniotomi, som er fylt med steril saltvann. Datainnsamlingen ble utført ved en frekvens på 30 kHz ved hjelp av Open Ephys datainnsamlingssystem. Opptaket fortsatte bare når vi oppdaget sterkt korrelert rytmisk spontan aktivitet i mer enn 10 kanaler, noe som tyder på at elektrodene var plassert i transplantatet (basert på to-foton kalsiumavbildningsdata). Et 10-minutters bakgrunnsopptak av motorisk aktivitet ble oppnådd. Værhårene på motsatt side av t-hCO3 ble deretter avbøyet 50 ganger (2 mm ved 20 Hz, 2 s per presentasjon) til tilfeldige tider av en piezoelektrisk drivenhet over en 20-minutters opptaksperiode. Ved hjelp av MATLAB Support Package for Arduino (MATLAB 2019b), kontroller avbøyningstiden med tilpasset MATLAB-kode. Bruk TTL-pulser til å synkronisere hendelser med datainnsamlingsprogramvare.
For optiske markeringseksperimenter ble en 200 µm optisk patchkabel (Doric) koblet til en 473 nm laser (Omicron) koblet til en 200 µm optisk fiber plassert over kraniotomien. Rett før dette, juster jumpereffekten til 20 mW. Bruk manipulatoren til å senke elektrodene til målstedet gjennom kraniotomien, som er fylt med steril saltvannsoppløsning. Ved begynnelsen av opptaket ble det sendt ut ti lyspulser på 473 nm (frekvens 2 Hz, pulsvarighet 10 ms). Lysfølsomme celler ble definert som celler som viste en spikerespons innen 10 ms lys i 70 % eller mer av forsøkene.