Gràcies per visitar Nature.com. Esteu utilitzant una versió del navegador amb compatibilitat limitada amb CSS. Per a una millor experiència, us recomanem que utilitzeu un navegador actualitzat (o que desactiveu el mode de compatibilitat a l'Internet Explorer). A més, per garantir una assistència contínua, mostrem el lloc web sense estils ni JavaScript.
Mostra un carrusel de tres diapositives alhora. Feu servir els botons Anterior i Següent per moure's per tres diapositives alhora o feu servir els botons lliscants del final per moure's per tres diapositives alhora.
Els orgànuls neuronals autoassemblants representen una plataforma in vitro prometedora per modelar el desenvolupament i les malalties humanes. Tanmateix, els organoides no tenen la connectivitat que existeix in vivo, cosa que limita la maduració i impedeix la integració amb altres circuits que controlen el comportament. Aquí mostrem que els organoides corticals derivats de cèl·lules mare humanes trasplantats a l'escorça somatosensorial de rates nues neonatals desenvolupen tipus de cèl·lules madures que s'integren en circuits sensorials i relacionats amb la motivació. La ressonància magnètica va revelar un creixement d'organoides posttrasplantament en diverses línies de cèl·lules mare i animals, mentre que l'anàlisi d'un sol nucli va revelar la progressió de la corticogènesi i l'aparició d'un programa de transcripció dependent de l'activitat. De fet, les neurones corticals trasplantades presenten propietats morfològiques, sinàptiques i de membrana interna més complexes que les seves contraparts in vitro, cosa que permet la detecció de defectes neuronals en pacients amb síndrome de Timothy. El rastreig anatòmic i funcional ha demostrat que els orgànuls trasplantats reben entrades talamocorticals i corticocorticals, i els registres in vivo de l'activitat neuronal suggereixen que aquestes entrades poden generar respostes sensorials en cèl·lules humanes. Finalment, els organoides corticals estenen els axons per tot el cervell de la rata, i la seva activació optogenètica condueix a un comportament de recerca de recompenses. Així, les neurones del còrtex humà trasplantat maduren i participen en els circuits de l'hoste que controlen el comportament. Esperem que aquest mètode faciliti la detecció de fenotips a nivell de cadena en cèl·lules derivades del pacient que no es poden detectar per altres mitjans.
El desenvolupament del cervell humà és un procés d'autoorganització remarcable en què les cèl·lules proliferen, es diferencien, migren i es connecten per formar circuits neuronals funcionals que es refinen encara més a través de l'experiència sensorial. Un problema clau per comprendre el desenvolupament del cervell humà, especialment en el context de la malaltia, és la manca d'accés al teixit cerebral. Els orgànuls autoorganitzats, inclosos els organoides de l'escorça humana (hCO; també conegut com a esfera de l'escorça humana), poden generar 2,3,4,5,6. Tanmateix, diverses limitacions limiten la seva aplicació més àmplia per comprendre el desenvolupament i el funcionament dels circuits neuronals. En particular, no està clar si la maduració de l'hCO està limitada per l'absència de certes entrades microambientals i sensorials presents in vivo. A més, com que les hCO no estan integrades en circuits que poden generar resultats conductuals, la seva utilitat en el modelatge de trastorns neuropsiquiàtrics genèticament complexos i conductuals és actualment limitada.
El trasplantament d'hCO a un cervell viu intacte pot superar aquestes limitacions. Estudis previs han demostrat que les neurones humanes trasplantades a l'escorça de rosegadors són capaces de sobreviure, projectar i comunicar-se amb cèl·lules de rosegadors7,8,9,10,11,12. Tanmateix, aquests experiments se solen dur a terme en animals adults, cosa que pot limitar la integració sinàptica i axonal. Aquí descrivim un paradigma de trasplantament en què vam trasplantar hCO 3D derivat de cèl·lules hiPS a l'escorça somatosensorial primària (S1) de rates immunodeficiència en una etapa primerenca del desenvolupament plàstic. Les neurones hCO (t-hCO) trasplantades experimenten una maduració substancial, reben entrades talamocorticals i corticocorticals que provoquen respostes sensorials i estenen projeccions axonals al cervell de rata per impulsar un comportament de recerca de recompenses. La maduració prolongada de la t-hCO ha revelat defectes neuronals en pacients amb síndrome de Timothy (TS), un trastorn genètic greu causat per mutacions al canal de calci CaV1.2 de tipus L sensible al voltatge (codificat per CACNA1C).
Per estudiar les neurones corticals humanes en circuits in vivo, vam trasplantar estereotàcticament hCO3 intacte en S1 de rates atímiques postnatals primerenques (dies 3-7 postnatals) (Fig. 1a i dades ampliades de la Fig. 1a-c). En aquest punt, les projeccions axonals talamocorticals i corticocorticals encara no han completat la seva innervació S1 (ref. 13). Per tant, aquest enfocament està dissenyat per maximitzar la integració de t-hCO3 alhora que minimitza l'impacte en els circuits endògens. Per visualitzar la ubicació de t-hCO3 en animals vius, vam realitzar reconstruccions cerebrals de ressonància magnètica ponderades en T2 de rates 2-3 mesos després del trasplantament (Fig. 1b i dades ampliades, Fig. 1d). El t-hCO es va observar fàcilment i les mesures de volum de t-hCO eren similars a les calculades a partir de llesques fixes (Dades ampliades Fig. 1d, e; P > 0,05). El t-hCO es va observar fàcilment i les mesures de volum de t-hCO eren similars a les calculades a partir de llesques fixes (Dades ampliades Fig. 1d, e; P > 0,05). t-hCO легко наблюдались, а объемные измерения t-hCO были аналогичны рассчитанным длеро фиксины (расширенные данные, рис. 1d, e; P> 0,05). Els t-hCO₃ es van observar fàcilment, i les mesures volumètriques de t-hCO₃ van ser similars a les calculades per a seccions fixes (dades ampliades, Fig. 1d, e; P > 0,05).很容易观察到t-hCO，并且t-hCO的体积测量值与从固定切片计算的测量值相似（扩展数据图1d、e；P > 0,05）很容易观察到t-hCO，并且t-hCO t-hCO легко наблюдался, а объемные измерения t-hCO были аналогичны рассчитанным для фиксрнызнирово (расширенные данные, рис. 1d, e; P> 0,05). El t-hCO₃ es va observar fàcilment, i les mesures volumètriques de t-hCO₃ van ser similars a les calculades per a seccions fixes (dades ampliades, Fig. 1d, e; P > 0,05).Vam determinar la t-hCO en el 81% dels animals trasplantats aproximadament 2 mesos després del trasplantament (n = 72 animals; hCO de 10 línies cel·lulars hiPS; línies cel·lulars hiPS a la Taula suplementària 1). D'aquests, el 87% es van localitzar a l'escorça cerebral (Fig. 1c). En realitzar exploracions de ressonància magnètica en sèrie en múltiples moments en la mateixa rata trasplantada, vam trobar un augment de nou vegades en el volum de t-hCO en 3 mesos (Fig. 1d i dades ampliades, Fig. 1f). Els animals trasplantats van tenir una alta taxa de supervivència (74%) als 12 mesos posteriors al trasplantament (dades ampliades, Fig. 1g i Taula suplementària 2), i no es van trobar deficiències motores o de memòria manifestes, gliosi ni electroencefalograma (EEG). Dades Fig. 1g i taula suplementària 2). 1h-m i 3e).
a, Esquema del disseny experimental. L'hCO derivat de cèl·lules hiPS es va trasplantar a S1 de rates nues nounades els dies 30-60 de diferenciació. b, Imatges de ressonància magnètica coronal i horitzontal ponderades en T2 que mostren t-hCO a S1 2 mesos després del trasplantament. Barra d'escala, 2 mm. c, Quantificació de les taxes d'èxit de l'empelt mostrades per a cada línia cel·lular hiPS (n = 108, els números dins de les barres indiquen la quantitat de t-hCO per línia cel·lular hIPS) i la ubicació cortical o subcortical (n = 88). d, Imatge de ressonància magnètica d'una artèria coronària (esquerra; barra d'escala, 3 mm) i reconstrucció volumètrica 3D corresponent (barra d'escala, 3 mm) que mostra un augment de t-hCO durant 3 mesos. e, Revisió dels patrons de t-hCO a l'escorça cerebral de rata. Barra d'escala, 1 mm. f, Imatges immunocitoquímiques representatives de t-hCO que es mostren de dalt a baix a l'esquerra a la dreta (durant la diferenciació): PPP1R17 (4 mesos d'edat), NeuN (8 mesos d'edat), SOX9 i GFAP (8 mesos d'edat), PDGFRα; (8 mesos), MAP2 (8 mesos) i IBA1 (8 mesos). Barra d'escala, 20 µm. La coexpressió de HNA indica cèl·lules d'origen humà. g, seq. de snRNA: imatges de reducció de la dimensionalitat de projecció i manifold unificat (UMAP) de tots els nuclis de t-hCO d'alta qualitat després de la integració de Seurat (n = 3 mostres de t-hCO, n = 2 línies cel·lulars hiPS). Astròcits, cèl·lules de la línia d'astròcits; progenitors circulants de cyc prog; GluN DL, neurones glutamatèrgiques profundes; GluN DL/SP, neurones glutamatèrgiques profundes i sublamel·lars; GluN UL, neurones glutamatèrgiques de la capa superior; oligodendròcits, oligodendròcits; OPC, cèl·lules progenitores d'oligodendròcits; RELN, neurones de reelina. h, anàlisi d'enriquiment de termes d'ontologia gènica (GO) de gens significativament regulats a l'alça (P ajustat < 0,05, canvi de plecs > 2, expressats en almenys el 10% dels nuclis) en neurones glutamatèrgiques t-hCO en comparació amb les neurones glutamatèrgiques hCO. h, anàlisi d'enriquiment de termes d'ontologia gènica (GO) de gens significativament regulats a l'alça (P ajustat < 0,05, canvi de plecs > 2, expressats en almenys el 10% dels nuclis) en neurones glutamatèrgiques t-hCO en comparació amb les neurones glutamatèrgiques hCO. h, Анализ обогащения терминов Gene Ontology (GO) для генов со значительной активацией (скоррективацией (скоррективацией, скоррективацией) изменения > 2, экспрессия по крайней мере в 10% ядер) в глутаматергических нейронах t-hCO по снира глутаматергическими нейронами hCO. h, anàlisi d'enriquiment de termes de Gene Ontology (GO) per a gens amb activació significativa (P ajustat <0,05, canvi de plecs > 2, expressió en almenys un 10% de nuclis) en neurones glutamatèrgiques t-hCO en comparació amb les neurones glutamatèrgiques hCO. h，与hCO 谷氨酸能神经元相比，t-hCO 谷氨酸能神经元中基因显着上调（谎P整0,05，倍数变化> 2，在至少10% 的细胞核中表达）的基因本体论(GO) 术语富核中表达）的基因本体论(GO) 术语富核中表达 h ， 与 hco 谷氨酸 能 元 相比 ， t-hco 谷氨酸 能 神经 元 基因 显着 上调 ０ 后， ， ， p.变化 变化> 2 ， 至少 10% 的 核中 表达） 基因 基因 基因 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的的 的 的 的本体论(GO) 术语富集分析。 h, гены значительно активизировались (скорректированный P <0,05, кратность изменения> 2, эсрусспия крайней мере в 10% ядер) в глутаматергических нейронах t-hCO по сравнению с глутаматергимих нескических t-hCO Онтологический (GO) анализ термина обогащения. h, els gens es van regular significativament a l'alça (P ajustat < 0,05, canvi de plecs > 2, expressat en almenys el 10% dels nuclis) en neurones glutamatèrgiques de t-hCO en comparació amb les neurones glutamatèrgiques de hCO. Anàlisi ontològica (GO) del terme d'enriquiment.La línia puntejada indica un valor aq de 0,05. i, imatges UMAP de tipus de cèl·lules GluN en t-hCO mitjançant la transferència d'etiquetes d'un conjunt de dades de referència de 22 snRNA-seq de l'escorça motora adulta. CT: cèl·lules corticotalàmiques, ET: cèl·lules extracerebrals, IT: cèl·lules telencefàliques internes, NP: projecció propera.
A continuació, vam avaluar la citoarquitectura i la composició cel·lular general del t-hCO. La tinció d'anticossos de les cèl·lules endotelials de rata va revelar vascularització amb t-hCO, mentre que la tinció d'IBA1 va revelar la presència de micròglia de rata a tot l'empelt (Fig. 1f i dades ampliades, Fig. 3c, d). La immunotinció va revelar cèl·lules positives per a l'antigen nuclear humà (HNA) que coexpressen PPP1R17 (progenitors corticals), NeuN (neurones), SOX9 i GFAP (cèl·lules derivades de la glia) o PDGFRα (progenitors d'oligodendròcits) (Figura 1f). Per estudiar la composició cel·lular del t-hCO a resolució de cèl·lula única, vam realitzar la seqüenciació d'ARN d'un sol nucli (snRNA-seq) després d'aproximadament 8 mesos de diferenciació. La filtració a granel i l'eliminació de nuclis de rata van produir 21.500 mapes mononuclears humans d'alta qualitat (Fig. 1g i dades ampliades, Fig. 4a, b). Els patrons d'expressió de marcadors típics de tipus cel·lular van identificar grups de les principals classes de cèl·lules corticals, incloent-hi neurones glutamatèrgiques profundes i superficials, progenitors circulants, oligodendròcits i llinatge d'astròcits (Fig. 1g, dades ampliades, Fig. 4c i Taula suplementària 3). La immunocoloració per a SATB2 i CTIP2 va mostrar que, malgrat la presència de subtipus corticals, la t-hCO no mostrava una estratificació anatòmica clara (dades ampliades, Fig. 3a). La hCO de seqüència de snRNA coincident per estadi va produir classes cel·lulars àmpliament similars, amb algunes excepcions, incloent-hi l'absència d'oligodendròcits i la presència de neurones GABAèrgiques, que poden reflectir les condicions in vitro favorables reportades anteriorment per a les cèl·lules progenitores laterals15 (dades ampliades, Fig. 4f-i i Taula suplementària 4). L'anàlisi diferencial de l'expressió gènica va revelar diferències significatives en les neurones glutamatèrgiques entre t-hCO i hCO (Taula suplementària 5), ​​inclosa l'activació de conjunts de gens associats amb la maduració neuronal com la senyalització sinàptica, la localització dendrítica i l'activitat del canal controlat per voltatge (Figura 1h i Taula suplementària 5). taula 6). En conseqüència, les neurones glutamatèrgiques corticals t-hCO van mostrar una maduració transcripcional accelerada.
Per aclarir si aquests canvis transcripcionals en t-hCO estaven relacionats amb diferències morfològiques entre hCO in vitro i t-hCO in vivo, vam reconstruir hCO i hCO plens de biocitines amb estadis coincidents en seccions agudes després de 7-8 mesos de diferenciació. Neurones hCO (Fig. 2a). Les neurones t-hCO eren significativament més grans, tenien 1,5 vegades el diàmetre del soma, el doble de dendrites i un augment general de sis vegades en la longitud dendrítica total en comparació amb l'hCO in vitro (Fig. 2b). A més, vam observar una densitat significativament més alta d'espines dendrítiques en les neurones t-hCO que en les neurones hCO (Fig. 2c). Això suggereix que les neurones t-hCO experimenten una elongació i ramificació dendrítiques extenses, que, en combinació amb la proliferació cel·lular contínua, pot contribuir al creixement intensiu de t-hCO després del trasplantament (Fig. 1d i Dades ampliades Fig. 1f). Això ens va impulsar a investigar les propietats electrofisiològiques. La capacitança de membrana era vuit vegades més alta (dades ampliades, Fig. 8d), el potencial de membrana en estat de repòs estava més hiperpolaritzat (aproximadament 20 mV) i la injecció de corrent va induir una taxa d'excitació màxima més alta en les neurones t-hCO que en les neurones hCO in vitro (Fig. 2d), e), cosa que és coherent amb les característiques morfològiques més grans i complexes de la t-hCO. A més, la freqüència d'esdeveniments de corrent postsinàptics excitatoris espontanis (EPSC) va ser significativament més alta en les neurones t-hCO (Fig. 2f), cosa que suggereix que l'augment de la densitat d'espines dendrítiques observat en les neurones t-hCO estava associat amb l'excitabilitat funcional de la sinapsi sexual. Vam confirmar el caràcter immadur de les neurones hCO in vitro registrant neurones glutamatèrgiques marcades (dades ampliades, Fig. 6a-c).
a, Reconstrucció 3D de neurones hCO i t-hCO plenes de biocitines després de 8 mesos de diferenciació. b, Quantificació de les característiques morfològiques (n = 8 neurones hCO, n = 6 neurones t-hCO; **P = 0,0084, *P = 0,0179 i ***P < 0,0001). b, Quantificació de les característiques morfològiques (n = 8 neurones hCO, n = 6 neurones t-hCO; **P = 0,0084, *P = 0,0179 i ***P < 0,0001). б, количественная оценка морфологических признаков (n = 8 нейронов hCO, n = 6 нейронка морфологических признаков) *** P <0,0001). b, quantificació de les característiques morfològiques (n = 8 neurones hCO, n = 6 neurones t-hCO; **P = 0,0084, *P = 0,0179 i ***P <0,0001). b，形态学特征的量化（n = 8 个hCO 神经元，n = 6 个t-hCO 神经元；**P = 0,0084，*P = 90,01*** 0,0001). b，形态学特征的量化（n = 8 个hCO 神经元，n = 6 个t-hCO 神经元；**P = 0,0084，*P = 90,01*** 0,0001). б, количественная оценка морфологических признаков (n = 8 нейронов hCO, n = 6 нейронка морфологических признаков) *** P <0,0001). b, quantificació de les característiques morfològiques (n = 8 neurones hCO, n = 6 neurones t-hCO; **P = 0,0084, *P = 0,0179 i ***P <0,0001).c, reconstrucció 3D de les branques dendrítiques d'hCO i t-hCO després de 8 mesos de diferenciació. Els asteriscs vermells indiquen possibles espines dendrítiques. Quantificació de la densitat de les espines dendrítiques (n = 8 neurones d'hCO, n = 6 neurones t-hCO; **P = 0,0092). d, Quantificació del potencial de membrana en repòs (n = 25 neurones hCO3, n = 16 neurones t-hCO3; ***P < 0,0001). d, Quantificació del potencial de membrana en repòs (n = 25 neurones hCO3, n = 16 neurones t-hCO3; ***P < 0,0001). d, количественная оценка мембранного потенциала покоя (n = 25 нейронов hCO, n = 16 нейронов t-hCO; *** P). d, quantificació del potencial de membrana en repòs (n = 25 neurones hCO3, n = 16 neurones t-hCO3; ***P < 0,0001). d，静息膜电位的量化（n = 25 hCO 神经元，n = 16 t-hCO 神经元；***P <0,0001）。 d，静息膜电位的量化（n = 25 hCO 神经元，n = 16 t-hCO 神经元；***P <0,0001）。 d, количественная оценка мембранного потенциала покоя (n = 25 нейронов hCO, n = 16 нейронов t-hCO; *** P). d, quantificació del potencial de membrana en repòs (n = 25 neurones hCO3, n = 16 neurones t-hCO3; ***P < 0,0001). e, Potencial d'acció repetitiva disparat en hCO3 i t-hCO3 induït per injeccions de corrent creixents i quantificació de la taxa de tret màxima (n = 25 neurones hCO3, n = 16 neurones t-hCO3; ***P < 0,0001). e, Potencial d'acció repetitiva disparat en hCO3 i t-hCO3 induït per injeccions de corrent creixents i quantificació de la taxa de tret màxima (n = 25 neurones hCO3, n = 16 neurones t-hCO3; ***P < 0,0001). e, повторное возбуждение потенциала действия в hCO и t-hCO, вызванное увеличением тока, и количением тока, и количнествия вызванное возбуждение максимальной скорости возбуждения (n = 25 нейронов hCO, n = 16 нейронов t-hCO; *** P <0,0001). e, reactivació del potencial d'acció en hCO3 i t-hCO3 induït per l'augment del corrent i la quantificació de la taxa de tret màxima (n = 25 neurones hCO3, n = 16 neurones t-hCO3; *** P < 0,0001). e，通过增加电流注入诱导的hCO 和t-hCO 重复动作电位放电，以及最大放甄大放电率率率电（2动作电位放电个hCO 神经元，n = 16 个t-hCO 神经元；***P <0,0001）。 E ， 通过 增加 电流 注入 的 的 hco 和 t-hco 重复 电位 放电 ， 以及 最 大 及 （ （ （ （ 2个 hco 神经 ， n = 16 个 t-hco 神经 ； *** p <0,0001） 。 e, повторяющееся возбуждение потенциала действия hCO i t-hCO, вызванное увеличением подакач, и и количественная оценка максимальной скорости возбуждения (n = 25 нейронов hCO, n = 16 нейронов t-hCO, n = 16 нейронов t-10,000*** P-10,00в t). e, tret repetitiu de potencials d'acció de hCO3 i t-hCO3 induïts per un augment del subministrament de corrent i quantificació de la taxa de tret màxima (n = 25 neurones hCO3, n = 16 neurones t-hCO3; *** P < 0,0001). f, EPSCs espontanis (sEPSCs) en neurones hCO i t-hCO als 8 mesos de diferenciació i quantificació de la freqüència d'esdeveniments sinàptics (n = 25 neurones hCO, n = 17 neurones t-hCO; ***P < 0,0001). f, EPSCs espontanis (sEPSCs) en neurones hCO i t-hCO als 8 mesos de diferenciació i quantificació de la freqüència d'esdeveniments sinàptics (n = 25 neurones hCO, n = 17 neurones t-hCO; ***P < 0,0001). f, спонтанные EPSC (sEPSC) в нейронах hCO и t-hCO через 8 месяцев дифференцировки и количествечная количествечная количества синаптических событий (n = 25 нейронов hCO, n = 17 нейронов t-hCO; *** P <0,0001) . f, EPSCs espontanis (sEPSCs) en neurones hCO i t-hCO als 8 mesos de diferenciació i quantificació de les taxes d'esdeveniments sinàptics (n = 25 neurones hCO, n = 17 neurones t-hCO; *** P < 0,0001). f，分化8 个月时hCO 和t-hCO 神经元中的自发性EPSCs (sEPSCs)，以及突触事件频率延频率元中的自发性EPSCs (sEPSC)神经元，n = 17 t-hCO 神经元；***P <0,0001） . f，分化8 个月时hCO 和t-hCO 神经元中的自发性EPSCs (sEPSCs)，以及突触事件频率延频率元中的自发性EPSCs (sEPSCs)神率的量匼（n = 25 hCO 神率的量匼（n = 25hCO P <0,0001） . f, спонтанные EPSC (sEPSC) в нейронах hCO и t-hCO через 8 месяцев дифференцировки и количествечная количествечная количества синаптических событий (n = 25 нейронов hCO, n = 17 нейронов t-hCO; *** P <0,0001). f, EPSCs espontanis (sEPSCs) en neurones hCO i t-hCO als 8 mesos de diferenciació i quantificació de les taxes d'esdeveniments sinàptics (n = 25 neurones hCO, n = 17 neurones t-hCO; *** P <0,0001).Per a bf, hCO3 i t-hCO3 de la línia 1208-2 es van prendre del mateix lot de diferenciació mantingut en paral·lel. g, Anàlisi d'enriquiment del conjunt de gens (prova exacta de Fisher unilateral) de gens significativament regulats a l'alça (P ajustada < 0,05, canvi de plecs > 2, expressats en almenys el 10% dels nuclis) en neurones glutamatèrgiques de t-hCO en comparació amb neurones glutamatèrgiques de hCO amb conjunts de gens de gens dependents de l'activitat tant de resposta primerenca (ERG) com de resposta tardana (LRG) identificats a partir d'un estudi in vivo en ratolins16 i LRG específics d'humans de neurones in vitro17. g, Anàlisi d'enriquiment del conjunt de gens (prova exacta de Fisher unilateral) de gens significativament regulats a l'alça (P ajustada < 0,05, canvi de plecs > 2, expressats en almenys el 10% dels nuclis) en neurones glutamatèrgiques de t-hCO en comparació amb neurones glutamatèrgiques de hCO amb conjunts de gens de gens dependents de l'activitat tant de resposta primerenca (ERG) com de resposta tardana (LRG) identificats a partir d'un estudi in vivo en ratolins16 i LRG específics d'humans de neurones in vitro17. g, анализ обогащения набора генов (односторонний точный критерий Фишера) генов со знаьчнитей (скорректированный P <0,05, кратность изменения > 2, экспрессия по меньшей мере в 10% ядетерь в гадетерь в гадетерь нейронах t-hCO по сравнению с глутаматергическими нейронами hCO наборы генов как раннего (ERG), так и позднего (LRG) генов, зависящих от активности, идентифицированнысах в овисящих мышах in vivo16, i специфических для человека LRG из нейронов in vitro17. g, anàlisi de l'enriquiment del conjunt de gens (prova exacta de Fisher unicua) de gens amb activació significativa (P ajustada <0,05, canvi de plec >2, expressió en almenys el 10% dels nuclis) en neurones glutamatèrgiques de t-hCO en comparació amb conjunts de neurones glutamatèrgiques de hCO de gens dependents de l'activitat tant primerencs (ERG) com tardans (LRG) identificats en ratolins in vivo16 i LRG específics d'humans de neurones in vitro17. g，t-hCO谷氨酸能神经元与hCO谷氨酸能神经元相比，t -hCO谷氨酸能神经元显着上调（调整后P<0,05，倍数变化>2，在至少10%的细胞核中表达）的基因集富集分析（单侧F isher精确检验）从体内小鼠研究中鉴定的早期反应(ERG)和晚期反应(LRG) 活性依赖性基因的基因组16 和体外神经元17 中的人类牧异怂性LRG。 g ， t-hco 谷氨酸 神经 元 与 hco 谷氨酸 神经 元 相比 ， t-hco 谷氨酸 神经 元 神经 元 临 元 比 ， t-hco <0,05 ， 倍数> 2 ， 至少 至少 10%的 细胞 核中 表达） 的 集富集 分析 （分析 （分析 （分析 （分析 （单（单） 核中 表达）体内 小鼠 研究 中 的 早期 反应 反应 反应 和 晚期 反应 反应 (lrg) 活性 基因 的 基因组 16 因组 反应 反应 (lrg)中 中 17 中 17的人类特异性LRG. g, глутаматергические нейроны t-hCO были значительно активизированы по сравнению с глутамчтесрованы нейронами hCO (скорректированный P<0,05, кратность изменения> 2, не менее 10% Анализ обоногаращебиораь изменения> (односторонний точный тест Фишера) раннего ответа (ERG) i позднего гены, зависящие от активности ответа (LRG), идентифицированные в исследованиях на мышах in vivo16 i нейронах in vitro17. LRG, специфичные для человека. g, les neurones glutamatèrgiques de t-hCO es van sobreexpressar significativament en comparació amb les neurones glutamatèrgiques de hCO (P ajustat <0,05, canvi de plec >2, almenys un 10%. Anàlisi d'enriquiment gènic de resposta precoç (ERG) i resposta tardana (prova exacta de Fisher unicua) de gens dependents de l'activitat de resposta (LRG) identificats en ratolins in vivo16 i neurones in vitro.17 LRG específics humans.La línia puntejada indica un valor P corregit per Bonferroni de 0,05. h, l'expressió del gen GluN (pseudo-paquet i escalat de cada gen) es va regular a l'alça significativament en rèpliques de snRNA-seq de gens LRG en neurones glutamatèrgiques t-hCO. i, immunocoloració que mostra l'expressió de SCG2 en neurones t-hCO (superior) i hCO (inferior). Les fletxes blanques apunten a les cèl·lules SCG2+. Barra d'escala, 25 µm. Les dades s'expressen com a mitjana ± desviació estàndard.
Basant-se en l'augment de l'activitat de t-hCO observat en talls ex vivo, la seqüència de snRNA va revelar una regulació a l'alça dependent de l'activitat de les transcripcions gèniques en t-hCO en comparació amb hCO in vitro. Les neurones t-hCO glutamatèrgiques van expressar nivells més alts de gens que regulen l'activitat de resposta tardana (Fig. 2g, h), que es van trobar en estudis previs en neurones de ratolí i humanes16,17. Per exemple, BDNF18, SCG2 i OSTN, un gen regulador de l'activitat específic dels primats, van mostrar una major expressió en les neurones t-hCO en comparació amb les neurones hCO (Fig. 2g-i). Així, les neurones t-hCO van mostrar característiques de maduració millorades en comparació amb les neurones hCO mitjançant anàlisis transcripcionals, morfològiques i funcionals.
Per avaluar més a fons l'associació de la maduració de la t-hCO amb el desenvolupament del cervell humà, vam realitzar comparacions transcriptòmiques de tipus de cèl·lules corticals fetals i adultes19,20 i adultes21,22, així com dades exhaustives sobre l'expressió gènica cortical23 durant el desenvolupament (dades ampliades, Fig. 5). ). amb treballs anteriors24, l'estat de maduració del transcriptoma global de l'hCO i la t-hCO als 7-8 mesos de diferenciació és àmpliament coherent amb el temps de desenvolupament in vivo i és més equivalent a la vida fetal tardana (dades ampliades, Fig. 5a). Cal destacar que vam observar una major maduresa del transcriptoma en la t-hCO en comparació amb l'hCO de la mateixa edat, així com l'activació del transcriptoma associada amb la sinaptogènesi, l'astrogènesi i la mielinització (dades ampliades, Fig. 5b-d). A nivell cel·lular, vam trobar evidències d'un subtipus de còrtex més prim en la t-hCO, amb grups de neurones glutamatèrgiques que se superposen amb els subtipus de neurones adultes L2/3, L5 i L6 (Figura 1i). En canvi, la superposició de clústers entre les neurones glutamatèrgiques t-hCO i les neurones corticals fetals va ser més limitada a mitjan embaràs (dades ampliades, Figura 5e-j). Per determinar si les neurones t-hCO són ​​funcionalment similars a les neurones neocorticals postnatals humanes, vam realitzar registres electrofisiològics i reconstruccions anatòmiques de neurones piramidals L2/3 humanes en seccions nítides de l'escorça postnatal humana (dades ampliades, Fig. 7a). Les propietats electrofisiològiques de les neurones piramidals L2/3 eren similars a les de les neurones piramidals t-hCO (dades ampliades, Fig. 7e). Morfològicament, les neurones L2/3 de mostres humanes postnatals eren més similars a la t-hCO que a l'hCO, tot i que les cèl·lules L2/3 eren més llargues, contenien més branques en general i tenien una densitat de columna vertebral més alta (Fig. 3g i dades ampliades, Fig. 7b-). G).
a, trasplantament d'hCO₃ produït per línies cel·lulars de control i TS hiPS a rates neonatals. b, reconstrucció 3D de neurones t-hCO₃ plenes de biocitines després de 8 mesos de diferenciació. c, quantificació de la longitud dendrítica mitjana (n = 19 neurones de control, n = 21 neurones TS; **P = 0,0041). d, branques dendrítiques reconstruïdes en 3D a partir del control i TS t-hCO3 als 8 mesos de diferenciació, i quantificació de la densitat de l'espina dendrítica (n = 16 neurones de control, n = 21 neurones TS, ***P < 0,0001). d, branques dendrítiques reconstruïdes en 3D a partir del control i TS t-hCO3 als 8 mesos de diferenciació, i quantificació de la densitat de l'espina dendrítica (n = 16 neurones de control, n = 21 neurones TS, ***P < 0,0001). d, 3D-реконструкция дендритных ветвей из контроля и TS t-hCO через 8 месяцев диффференцев дифференцен контроля через оценка плотности дендритных шипов (n = 16 контрольных нейронов, n = 21 TS нейронов, *** P <0,0001). d, reconstrucció 3D de les branques dendrítiques del control i del t-hCO TS als 8 mesos de diferenciació i quantificació de la densitat de l'espina dendrítica (n = 16 neurones de control, n = 21 neurones TS, *** P < 0,0001). d，分化8 个月时对照和TS t-hCO 的3D 重建树突分支，以及树突棘密度的量化（n个对照神经元，n = 21 个TS 神经元，***P <0,0001）。 d ， 分化 8 个 时 对照 和 ts t-hco 的 3d 重建 分支 分支 以及 树突棘 密度 密度 重建 n神经 元 ， n = 21 个 ts 神经 ， *** p <0,0001 ）。 d, 3D-реконструкция дендритных ветвей контроля и TS t-hCO через 8 месяцев дифференцировей контроля и через оценка плотности дендритных шипов (n = 16 контрольных нейронов, n = 21 TS нейронов, *** P <0,0001). d, reconstrucció 3D de les branques dendrítiques de control i TS t-hCO3 als 8 mesos de diferenciació i quantificació de la densitat de l'espina dendrítica (n = 16 neurones de control, n = 21 neurones TS, *** P < 0,0001).Els asteriscs vermells indiquen putatives espines dendrítiques. e, EPSCs espontànies en neurones de control i TS t-hCO després de 8 mesos de diferenciació. f, diagrama de freqüència acumulada i quantificació de la freqüència i l'amplitud dels esdeveniments sinàptics (n = 32 neurones de control, n = 26 neurones TS; **P = 0,0076 i P = 0,8102). g, anàlisi de Scholl de les neurones TS i de control en hCO i t-hCO. Les línies discontínues mostren les neurones piramidals postnatals humanes L2/3 per a la comparació (n = 24 neurones t-hCO de control, n = 21 neurones t-hCO TS, n = 8 neurones hCO de control i n = 7 neurones hCO TS). Les dades s'expressen com a mitjana ± desviació estàndard.
La capacitat de la t-hCO per replicar les característiques morfològiques i funcionals de les neurones del còrtex humà a un alt nivell ens va impulsar a explorar si la t-hCO es podria utilitzar per detectar fenotips de malalties. Ens vam centrar en la TS, un trastorn greu del neurodesenvolupament causat per mutacions de guany de funció en el gen que codifica CaV1.2, que inicia la transcripció gènica dependent de l'activitat en les neurones. Vam obtenir hCO de tres pacients amb TS portadors de la substitució més comuna (p.G406R) i tres controls (Fig. 3a). Després del trasplantament, vam trobar que la morfologia dendrítica estava alterada en les neurones TS en comparació amb els controls (Fig. 3b i dades ampliades, Fig. 8a,b), amb un augment del doble en el nombre de dendrites primàries i un augment general de la disminució mitjana i general de la longitud dendrítica (Fig. 3c i dades ampliades, Fig. 8c). Això es va associar amb una major densitat d'espines i una major freqüència d'EPSCs espontànies en TS en comparació amb les neurones de control (Fig. 3d-f i dades ampliades, Fig. 8g). Una anàlisi més detallada va revelar patrons de ramificació dendrítica anormal en t-hCO TS en comparació amb els controls, però no en TS hCO in vitro en una etapa de diferenciació similar (Fig. 3g). Això és coherent amb els nostres informes anteriors de contracció dendrítica dependent de l'activitat en TS i destaca la capacitat d'aquesta plataforma de trasplantament per detectar fenotips de malaltia in vivo.
A continuació, ens vam preguntar fins a quin punt les cèl·lules t-hCO estan integrades funcionalment a la rata S1. En rosegadors, la S1 rep fortes entrades sinàptiques dels nuclis basals ventrals ipsilaterals i del talàmic posterior, així com de les escorces motora i somatosensorial secundària ipsilateral, i de la S1 contralateral (Fig. 4a). Per restaurar el patró d'innervació, vam infectar l'hCO amb el virus de la ràbia-dG-GFP/AAV-G i vam trasplantar l'hCO a la rata S1 3 dies després. Vam observar una densa expressió de GFP a les neurones de la S1 ipsilateral i dels ganglis basals ventrals 7-14 dies després del trasplantament (Fig. 4b, c). A més, la tinció d'anticossos del marcador talàmic netrina G1 va revelar la presència de terminacions talàmiques a la t-hCO (Fig. 4d, e). Per avaluar si aquestes projeccions aferents podrien provocar respostes sinàptiques a les cèl·lules t-hCO, vam realitzar enregistraments de cèl·lules senceres de cèl·lules humanes en seccions nítides de la capa talamocortical. L'estimulació elèctrica de la S1 de rata, la càpsula interna, la substància blanca, les fibres properes a la t-hCO o l'activació optogenètica de les terminacions talàmiques que expressen opsina en els EPSC de curta latència induïts per la t-hCO en les neurones t-hCO exposades a l'antagonista del receptor AMPA NBQX. (Fig. 4f, g i dades ampliades, Fig. 9a-g). Aquestes dades demostren que la t-hCO està integrada anatòmicament al cervell de la rata i pot ser activada pel teixit hoste de la rata.
a, Diagrama esquemàtic d'un experiment de seguiment de la ràbia. b, GFP i expressió de STEM121 específica d'humà entre t-hCO i l'escorça cerebral de rata (panell superior). També es mostra l'expressió de GFP al nucli basal ventral ipsilateral (VB) i S1 ipsilateral de rata (inferior a l'esquerra). Barra d'escala, 50 µm. Els quadrats vermells representen les àrees del cervell on es van prendre les imatges. c, quantificació de cèl·lules que expressen GFP (n = 4 rates). d, e — Terminals talàmics de netrina G1+ en t-hCO. d mostra una secció coronal que conté els nuclis de t-hCO i VB. Barra d'escala, 2 mm. e mostra l'expressió de netrina G1 i STEM121 en les neurones t-hCO (esquerra) i VB (dreta). Barra d'escala, 50 µm. La línia puntejada taronja indica la vora de t-hCO. f, g, Traces actuals de neurones t-hCO després de l'estimulació elèctrica en rata S1 (f) o càpsula interna (g), amb (morat) o sense (negre) NBQX (esquerra). Amplituds EPSC amb i sense NBQX (n = 6 neurones S1, *P = 0,0119; i n = 6 neurones de la càpsula interna, **P = 0,0022) (centre). Percentatge de neurones t-hCO que mostren EPSC en resposta a l'estimulació elèctrica de rata S1 (f) o càpsula interna (g) (dreta). aCSF, líquid cefaloraquidi artificial. h, diagrama esquemàtic de l'experiment d'imatge 2P (esquerra). Expressió de GCaMP6s en t-hCO (mig). Barra d'escala, 100 µm. Lapse de temps de fluorescència de GCaMP6s (dreta). i, puntuació Z de fluorescència d'activitat espontània. j, il·lustració esquemàtica de l'estimulació del bigoti. k, trajectòries de fluorescència 2P amb puntuació z en un assaig, alineades amb la desviació del bigoti en el temps zero (línia discontínua) en cèl·lules d'exemple. l, respostes de puntuació z mitjanes de la població de totes les cèl·lules alineades amb la desviació del bigoti en el temps zero (línia discontínua) (vermell) o marques de temps generades aleatòriament (gris). m. Diagrama esquemàtic de l'experiment sobre marcatge òptic. n, corbes de voltatge en brut d'una cèl·lula d'exemple t-hCO durant l'estimulació làser blau o la desviació del bigoti. Les fletxes vermelles indiquen els primers pics causats per la llum (a dalt) o causats per la desviació del bigoti (a baix). L'ombrejat gris indica períodes de desviació del bigoti. o, formes d'ona de llum màxima i respostes de desviació del bigoti. p, pics d'un sol intent, alineats amb la desviació dels bigoti a les cèl·lules de l'exemple. 0 indica la desviació del bigoti (línia discontínua). q, taxa de tret de puntuació z mitjana de la població per a totes les cèl·lules fotosensibles, alineada amb la desviació del bigoti en el temps zero (línia discontínua) (vermell) o marques de temps generades aleatòriament (gris). r, Proporció d'unitats fotosensibles modulades significativament per la desviació del bigoti (n = 3 rates) (esquerra). Latència màxima de la puntuació z (n = 3 rates; n = 5 (verd clar), n = 4 (verd fosc) i n = 4 (cian) unitats de modulació de la desviació del bigoti per rata) (dreta). Les dades s'expressen com a mitjana ± desviació estàndard.
A continuació, ens vam preguntar si la t-hCO es podia activar mitjançant estímuls sensorials in vivo. Vam trasplantar hCO que expressava els indicadors de calci codificats genèticament GCaMP6 a rates S1. Després de 150 dies, vam realitzar fotometria de fibra o imatges de calci de dos fotons (Fig. 4h i dades ampliades, Fig. 10a). Vam trobar que les cèl·lules t-hCO presentaven activitat rítmica sincronitzada (Figura 4i, Dades ampliades, Figura 10b i Vídeo suplementari 1). Per caracteritzar l'activitat màxima de la t-hCO, vam realitzar enregistraments electrofisiològics extracel·lulars en rates de trasplantament anestesiades (dades ampliades, Fig. 10c-f). Hem generat coordenades estereotàxiques a partir d'imatges de ressonància magnètica; per tant, aquestes unitats enregistrades representen neurones humanes putatives, tot i que l'electrofisiologia per si sola no permet determinar una espècie d'origen. Vam observar explosions d'activitat sincronitzades (dades ampliades, Fig. 10d). Les ràfegues van durar uns 460 ms i estaven separades per períodes de silenci d'uns 2 s (dades ampliades, Fig. 10d, e). Les unitats individuals van disparar una mitjana d'unes tres rondes per ràfega, que és aproximadament el 73% de les unitats registrades per ràfega. Les activitats de les unitats individuals estaven altament correlacionades, i aquestes correlacions eren més altes que les de les unitats identificades en animals no vacunats registrats en les mateixes condicions (dades ampliades, Fig. 10f). Per caracteritzar més a fons les respostes als pics de les neurones derivades d'humans identificades, vam realitzar experiments d'etiquetatge de llum en rates anestesiades trasplantades amb hCO3 que expressa el canal catiònic fotosensible rodopsina 2 (hChR2), a través del qual les neurones t-hCO3 reconeixen de curta latència (menys de 10 ms) en resposta a estímuls de llum blava (Fig. 4m-o). Les neurones t-hCO van mostrar esclats d'activitat espontània a freqüències similars a les observades en imatges de calci, així com en registres electrofisiològics realitzats en t-hCO en absència de marcatge lluminós (dades ampliades, Fig. 10c-g). No es va observar cap activitat espontània en les etapes corresponents de hCO enregistrades in vitro. Per avaluar si el t-hCO podia ser activat per estímuls sensorials, vam desviar breument els bigotis de rata lluny del t-hCO (Fig. 4j, m i dades ampliades, Fig. 10h, k). Segons estudis anteriors8,10, un subconjunt de cèl·lules t-hCO va mostrar una major activitat en resposta a la desviació dels bigotis, cosa que no es va observar quan es van comparar les dades amb marques de temps aleatòries (Fig. 4k-q i dades ampliades, Fig. 10h-q). De fet, aproximadament el 54% de les unitats individuals marcades amb optoetiqueta van mostrar una taxa d'activació significativament augmentada després de l'estimulació dels bigotis, amb un màxim d'uns 650 ms (Fig. 4r). En conjunt, aquestes dades suggereixen que el t-hCO rep entrades funcionals apropiades i es pot activar mitjançant estímuls ambientals.
A continuació, vam investigar si la t-hCO podia activar circuits en rates per controlar el comportament. Primer vam investigar si els axons de les neurones t-hCO es projecten als teixits circumdants de la rata. Vam infectar l'hCO amb un lentivirus que codifica hChR2 fusionat amb EYFP (hChR2-EYFP). Després de 110 dies, vam observar l'expressió d'EYFP a les regions corticals ipsilaterals, incloent-hi les escorces auditiva, motora i somatosensorial, així com a les regions subcorticals, incloent-hi l'estriat, l'hipocamp i el tàlem (Fig. 5a). Per avaluar si aquestes projeccions eferents podien provocar respostes sinàptiques en cèl·lules de rata, vam activar òpticament cèl·lules t-hCO que expressaven hChR2-EYFP mitjançant el registre de cèl·lules de l'escorça cerebral de rata en seccions cerebrals nítides. L'activació dels axons de t-hCO amb llum blava va induir EPSC de curta latència en neurones de l'escorça piramidal de rata, que van ser bloquejades per NBQX (Figs. 5b-g). A més, aquestes respostes podrien ser bloquejades per la tetrodotoxina (TTX) i restaurades per la 4-aminopiridina (4-AP), cosa que suggereix que van ser causades per connexions monosinàptiques (Fig. 5e).
a, Diagrama esquemàtic del seguiment dels axons (esquerra). Expressió EYFP de t-hCO3 (dreta). Barra d'escala, 100 µm. A1, escorça auditiva, ACC, escorça cingulada anterior, d. estriat, estriat dorsal, HPC, hipocamp; diafragma, septe lateral, mPFC, escorça prefrontal medial, piri, escorça piriforme, v. estriat, estriat ventral, VPM, nucli ventropostomedial del tàlem, VTA, regió tegmental ventral. Els quadrats vermells representen les àrees del cervell on es van prendre les imatges. b, Diagrama esquemàtic de l'experiment d'estimulació. c, d, Exemples de la resposta del fotocorrent induït per llum blava (a dalt) i el voltatge (a baix) en cèl·lules humanes (c) EYFP+ t-hCO3 o de rata (d) EYFP-. e, f, Traces actuals de neurones de rata després de l'estimulació amb llum blava dels axons de t-hCO amb TTX i 4-AR (verd), TTX (gris) o aCSF (negre) (e), amb (violeta) o sense (negre)) ) NBQX (e). g, latència de les respostes induïdes per llum blava en cèl·lules de rata (n = 16 cèl·lules); les barres horitzontals indiquen la latència mitjana (7,13 ms) (esquerra). Amplitud dels EPSC evocats per llum enregistrats amb o sense NBQX (n = 7 cèl·lules; ***P < 0,0001) (mig). Amplitud dels EPSC evocats per llum enregistrats amb o sense NBQX (n = 7 cèl·lules; ***P < 0,0001) (mig). Амплитуда вызванных светом EPSC, зарегистрированных с или без NBQX (n = 7 клеток; ***P <0,0001) (в трецен). Amplitud dels EPSC induïts per llum enregistrats amb o sense NBQX (n = 7 cèl·lules; ***P < 0,0001) (centre).使用或不使用NBQX 记录的光诱发EPSC 的振幅（n = 7 个细胞；***P < 0,0001）（中）。使用或不使用NBQX 记录的光诱发EPSC 的振幅（n = 7 个细胞；***P < 0,0001）（中）。 Амплитуда вызванных светом EPSC, зарегистрированных с или без NBQX (n = 7 клеток; ***P <0,0001) (в трецен). Amplitud dels EPSC induïts per llum enregistrats amb o sense NBQX (n = 7 cèl·lules; ***P < 0,0001) (centre).Percentatge de cèl·lules de rata que mostren EPSCs que responen a la llum blava (dreta). h, Diagrama esquemàtic d'una tasca conductual. d0, dia 0. i. Rendiment d'animals exemplars el dia 1 (esquerra) o el dia 15 (dreta) d'entrenament. El nombre mitjà de llepades realitzades el dia 1 (esquerra) o el dia 15 (centre dret) (n = 150 proves de llum blava, n = 150 proves de llum vermella; ***P < 0,0001). El nombre mitjà de llepades realitzades el dia 1 (esquerra) o el dia 15 (centre dret) (n = 150 proves de llum blava, n = 150 proves de llum vermella; ***P < 0,0001). Среднее количество облизываний, выполненных в день 1 (слева) или день 15 (в центре справа 150 (выполненных в день) синим светом, n = 150 испытаний с красным светом ***P <0,0001). Nombre mitjà de llepades realitzades el dia 1 (esquerra) o el dia 15 (centre dreta) (n = 150 proves de llum blava, n = 150 proves de llum vermella; ***P < 0,0001).第1 天（左）或第15 天（右中）执行的平均舔次数（n = 150 次蓝光试验（n = 150次红光试验；***P <0,0001）。第1 天（左）或第15 天（右中）执行的平均舔次数（n = 150 次蓝光试验（n = 150次红光试验；***P <0,001 Среднее количество облизываний, выполненных в день 1 (слева) или день 15 (в центре справа 150 (выполненных в день) синим светом, n = 150 испытаний с красным светом ***P <0,0001). Nombre mitjà de llepades realitzades el dia 1 (esquerra) o el dia 15 (centre dreta) (n = 150 proves de llum blava, n = 150 proves de llum vermella; ***P < 0,0001).Llamades acumulatives per a assajos de llum vermella i blava el dia 1 (centre esquerra) o el dia 15 (dreta). NS, no significatiu. j,k, Característiques del comportament de tots els animals trasplantats amb t-hCO que expressaven hChR2-EYFP (j) o fluoròfor de control (k) el dia 1 o 15 (hChR2-EYFP: n = 9 rates, ** P = 0,0049; control: n = 9, P = 0,1497). l, Evolució de la puntuació de preferència (n = 9 hChR2, n = 9 control; **P < 0,001, ***P < 0,0001). l, Evolució de la puntuació de preferència (n = 9 hChR2, n = 9 control; **P < 0,001, ***P < 0,0001). l, Эволюция показателя предпочтения (n = 9 hChR2, n = 9 контрольных; **P <0,001, ***P <0,0001). l, Evolució de la puntuació de preferència (n = 9 hChR2, n = 9 controls; **P < 0,001, ***P < 0,0001). l，偏好评分的演变（n = 9 hChR2，n = 9 对照；**P <0,001，***P <0,0001）。 l，偏好评分的演变（n = 9 hChR2，n = 9 对照；**P <0,001，***P <0,0001）。 l, Эволюция показателей предпочтения (n = 9 hChR2, n = 9 контролей; **P <0,001, ***P <0,0001). l, Evolució de les puntuacions de preferència (n = 9 hChR2, n = 9 controls; **P < 0,001, ***P < 0,0001).m, expressió de FOS en resposta a l'activació optogenètica de t-hCO en S1. Es mostren imatges de l'expressió de FOS (esquerra) i la quantificació (n = 3 per grup; *P < 0,05, **P < 0,01 i ***P < 0,001) (dreta). Es mostren imatges de l'expressió de FOS (esquerra) i la quantificació (n = 3 per grup; *P < 0,05, **P < 0,01 i ***P < 0,001) (dreta). Показаны изображения экспрессии FOS (слева) и количественного определения (n = 3 на группу;, * P**, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 1, 1 1 1 1 1 1 <0,001) (sправа). Es mostren imatges de l'expressió de FOS (esquerra) i la quantificació (n = 3 per grup; *P<0,05, **P<0,01 i ***P<0,001) (dreta).显示了FOS 表达（左）和量化（每组n = 3；*P < 0,05、**P < 0,01 和***P < 0,001）（叄右）显示了FOS 表达（左）和量化（每组n = 3；*P < 0,05、**P < 0,01 和***P < 0,001）（叄右） Показаны изображения экспрессии FOS (слева) и количественного определения (n = 3 на группу;, * P**, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 1, 1 1 1 1 1 1 <0,001) (sправа). Es mostren imatges de l'expressió de FOS (esquerra) i la quantificació (n = 3 per grup; *P<0,05, **P<0,01 i ***P<0,001) (dreta).Barra d'escala, 100 µm. Les dades s'expressen com a mitjana ± error estàndard de BLA, amígdala basolateral, MDT, nucli talàmic dorsomedial, PAG, gris periaqueductal.
Finalment, vam preguntar si la t-hCO podia modular el comportament de les rates. Per provar-ho, vam trasplantar hCO que expressava hChR2-EYFP a S1, i 90 dies després, vam implantar fibres òptiques a la t-hCO per a l'administració de llum. A continuació, vam entrenar les rates amb un paradigma de condicionament operant modificat (Fig. 5h). Vam col·locar els animals en una cambra de proves de comportament i vam aplicar aleatòriament estímuls làser blau (473 nm) i vermell (635 nm) de 5 segons. Els animals rebien una recompensa d'aigua si llepaven durant l'estimulació amb llum blava, però no llepaven durant l'estimulació amb llum vermella. El primer dia d'entrenament, els animals no van mostrar cap diferència en el llepat quan es van estimular amb llum blava o vermella. No obstant això, el dia 15, els animals trasplantats amb hCO que expressava hChR2-EYFP van mostrar un llepat més actiu quan es van estimular amb llum blava en comparació amb l'estimulació amb llum vermella. Aquests canvis en el comportament de llepar no es van observar en animals de control trasplantats amb hCO que expressaven el fluoròfor de control (taxa d'èxit d'aprenentatge: hChR2 89%, EYFP 0%, Figura 5i-1 i Vídeo Suplementari 2). Aquestes dades suggereixen que les cèl·lules t-hCO poden activar les neurones de rata per estimular el comportament de cerca de recompensa. Per esbrinar quins circuits neuronals de t-hCO de rata podrien estar implicats en aquests canvis de comportament, vam activar optogenèticament la t-hCO en animals entrenats i vam recollir teixits 90 minuts després. La immunohistoquímica va revelar l'expressió de la proteïna FOS dependent de l'activitat en diverses regions del cervell implicades en el comportament motivat, incloent-hi l'escorça prefrontal medial, el tàlem medial i la substància grisa periaqüeductal, que s'expressava en animals de control no estimulats o en animals. arròs. 5m). En conjunt, aquestes dades suggereixen que la t-hCO pot modular l'activitat neuronal de rata per impulsar el comportament.
Els organoides neuronals representen un sistema prometedor per estudiar el desenvolupament humà i les malalties in vitro, però estan limitats per la manca de connexions entre circuits que existeixen in vivo. Hem desenvolupat una nova plataforma en la qual hem trasplantat hCO a S1 de rates postnatals primerenques immunodeprimides per estudiar el desenvolupament i la funció de les cèl·lules humanes in vivo. Hem demostrat que la t-hCO desenvolupa tipus de cèl·lules madures que no s'observen in vitro28 i que la t-hCO està integrada anatòmicament i funcionalment al cervell dels rosegadors. La integració de la t-hCO als circuits neuronals dels rosegadors ens va permetre establir un vincle entre l'activitat cel·lular humana i el comportament animal estudiat, demostrant que les neurones t-hCO poden modular l'activitat neuronal de les rates per impulsar respostes conductuals.
La plataforma que descrivim té diversos avantatges respecte a la investigació prèvia sobre el trasplantament de cèl·lules humanes a cervells de rosegadors. En primer lloc, vam trasplantar hCO3 a l'escorça en desenvolupament de rates postnatals primerenques, cosa que pot facilitar la integració anatòmica i funcional. En segon lloc, la monitorització per ressonància magnètica de t-hCO3 ens va permetre estudiar la posició i el creixement de l'empelt en animals vius, cosa que ens va permetre dur a terme estudis a llarg termini amb diversos animals i establir la fiabilitat de diverses línies cel·lulars hiPS. Finalment, vam trasplantar organoides intactes, en lloc de suspensions de cèl·lules individuals aïllades, que són menys destructives per a les cèl·lules humanes i poden promoure la integració i la generació de neurones de l'escorça humana en cervells de rates.
Reconeixem que, malgrat els avenços en aquesta plataforma, les restriccions temporals, espacials i entre espècies impedeixen la formació de circuits neuronals humans amb alta fidelitat, fins i tot després del trasplantament en una etapa primerenca del desenvolupament. Per exemple, no està clar si l'activitat espontània observada en t-hCO representa un fenotip de desenvolupament similar a l'activitat rítmica observada durant el desenvolupament cortical, o si es deu a l'absència de tipus de cèl·lules supressores presents en t-hCO. De la mateixa manera, no està clar fins a quin punt l'absència de laminació en t-hCO afecta la connectivitat de la cadena30. El treball futur se centrarà en la integració d'altres tipus de cèl·lules com la micròglia humana, les cèl·lules endotelials humanes i proporcions variables d'interneurones GABAèrgiques, tal com es mostra mitjançant l'assemblatge 6 in vitro, així com en la comprensió de com es pot produir la integració i el processament neuronal en els nivells transcripcionals, sinàptics i conductuals alterats de t-hCO en cèl·lules obtingudes de pacients.
En general, aquesta plataforma in vivo representa un recurs potent que pot complementar el desenvolupament del cervell humà in vitro i la investigació de malalties. Preveiem que aquesta plataforma ens permetrà descobrir nous fenotips a nivell de cadena en cèl·lules derivades de pacients que altrament serien difícils d'aconseguir i provar noves estratègies terapèutiques.
Vam generar hCO2.5 a partir de cèl·lules HiPS tal com s'ha descrit anteriorment. Per iniciar la producció d'hCO a partir de cèl·lules hiPS cultivades en capes d'alimentació, es van treure colònies intactes de cèl·lules hiPS de les plaques de cultiu utilitzant dispasa (0,35 mg/mL) i es van transferir a cultius de plàstic d'adhesió ultrabaixa que contenien plaques amb medi de cultiu cel·lular hiPS. (Corning) suplementat amb dos inhibidors de SMAD dorsomorfina (5 μM; P5499, Sigma-Aldrich) i SB-431542 (10 μM; 1614, Tocris) i inhibidor de ROCK Y-27632 (10 μM; S1049, Selleckchem). Durant els primers 5 dies, el medi cel·lular hiPS es va canviar diàriament i es va afegir dorsomorfina i SB-431542. El sisè dia en suspensió, els esferoides neurals es van transferir a un medi neural que contenia neurobasal-A (10888, Life Technologies), suplement B-27 sense vitamina A (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies), penicil·lina i estreptomicina (1:100, Life Technologies) i es va suplementar amb el factor de creixement epidèrmic (EGF; 20 ng ml−1; R&D Systems) i el factor de creixement de fibroblasts 2 (FGF2; 20 ng ml−1; R&D Systems) fins al dia 24. Del dia 25 al dia 42, el medi es va suplementar amb factor neurotròfic derivat del cervell (BDNF; 20 ng ml−1, Peprotech) i neurotrofina 3 (NT3; 20 ng ml−1; Peprotech) amb canvis de medi cada dos dies. El sisè dia en suspensió, els esferoides neurals es van transferir a un medi neural que contenia neurobasal-A (10888, Life Technologies), suplement B-27 sense vitamina A (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies), penicil·lina i estreptomicina (1:100, Life Technologies) i es va suplementar amb el factor de creixement epidèrmic (EGF; 20 ng ml−1; R&D Systems) i el factor de creixement de fibroblasts 2 (FGF2; 20 ng ml−1; R&D Systems) fins al dia 24. Del dia 25 al dia 42, el medi es va suplementar amb factor neurotròfic derivat del cervell (BDNF; 20 ng ml−1, Peprotech) i neurotrofina 3 (NT3; 20 ng ml−1; Peprotech) amb canvis de medi cada dos dies.El sisè dia en suspensió, els esferoides neurals es van transferir a un medi neural que contenia Neurobasal-A (10888, Life Technologies), suplement B-27 sense vitamina A (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies) i penicil·lina.i стрептомицин (1:100, Life Technologies) i дополнены эпидермальным фактором роста (EGF; 20 нг/мл; R&D Systems) i фактором роста фибробластов 2 (FGF2; 20 нг/мл; R&D Systems) fins a 24 го дня. i estreptomicina (1:100, Life Technologies) i suplementat amb factor de creixement epidèrmic (EGF; 20 ng/ml; R&D Systems) i factor de creixement de fibroblasts 2 (FGF2; 20 ng/ml; R&D Systems) fins al dia 24.Dels dies 25 al 42, es va afegir al medi factor neurotròfic derivat del cervell (BDNF; 20 ng ml-1, Peprotech) i neurotrofina 3 (NT3; 20 ng ml-1, Peprotech), canviant el medi cada dos dies.在悬浮的第6 天，将神经球体转移到含有neurobasal-A（10888，Life Technologies）、不含维生素-A27补充剂（12587，Life Technologies）、GlutaMax（1:100，Life Technologies）、青霉素的神经培养基中和链霉（Life:1000 Tecnologies）并辅以表皮生长因子（EGF；20 ng ml-1；R+D Sistemes）和成纤维细胞生长因子2（FGF2；20 ng ml-1；R+D Systems）直至第24 天。在 悬浮 的 第 第 6 天 将 神经 球体 转移 含有 含有 neurobasal-a （10888 ， Life Technologies， a Life Technologies） 縠 含有b-27 补充剂 （12587 ， Life Technologies） Glutamax （1: 100 ， Life TechNOGIS青霉素 的 神经 培养 基 中 链 ，100 （ Life 素 的Tecnologies） 表皮 生长 因子 （（（20 ng ml-1 ； Sistemes d'R+D） 成 纤维 细胞 生长 2 （fgf2 ； 20 ng ml- 1；Sistemes d'R+D）直至穬 24嬀 На 6-й день суспензии нейросферы были переведены на добавку, содержащую нейробаферы (Life Technologies), На 6-й день нейробаферы В-27 без витамина А (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies), пенициллин- нейтрализованный стрептомицицин, (1:)1000 Life Technologies добавлением эпидермального фактора роста (EGF; 20 нг мл-1; R+D Systems) i фактора роста фибробластов 2 (FGF2; 20 нг мл-1) 1; El dia 6, les suspensions de neuroesferes es van canviar a un suplement que contenia neurobasal-A (10888, Life Technologies), suplement B-27 sense vitamina A (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies), estreptomicina neutralitzada amb penicil·lina (1:100, Life Technologies) suplementat amb factor de creixement epidèrmic (EGF; 20 ng ml-1; R&D Systems) i factor de creixement de fibroblasts 2 (FGF2; 20 ng ml-1) 1; R+D Systems) fins a 24 anys. Sistemes d'R+D) fins al dia 24.Dels dies 25 al 42, es va afegir factor neurotròfic derivat del cervell (BDNF; 20 ng ml-1, Peprotech) i factor neurotròfic 3 (NT3; 20 ng ml-1, Peprotech) al medi de cultiu cada dos dies. Canviar el medi una vegada.A partir del dia 43, l'hCO₃ es va mantenir en un medi neurobasal-A sense suplements (NM; 1088022, Thermo Fisher) amb un canvi de medi cada 4-6 dies. Per obtenir hCO₃ a partir de cèl·lules hiPS cultivades en condicions sense alimentador, les cèl·lules hiPS es van incubar amb Accutase (AT-104, Innovate Cell Technologies) a 37 °C durant 7 minuts, es van dissociar en cèl·lules individuals i es van sembrar en plaques AggreWell 800 (34815, STEMCELL Technologies) a una densitat de 3 × 10⁶ cèl·lules individuals per pou en medi Essential 8 suplementat amb l'inhibidor de ROCK Y-27632 (10 μM; S1049, Selleckchem). Després de 24 hores, els medis dels pous es van pipetejar amunt i avall en medis que contenien medi Essential 6 (A1516401, Life Technologies) suplementat amb dorsomorfina (2,5 μM; P5499, Sigma-Aldrich) i SB-431542 (10 μM; 1614). , Tocrida). Dels dies 2 al 6, el medi Essential 6 es va substituir diàriament per dorsomorfina i suplement SB-431542. A partir del sisè dia, les suspensions de neuroesferes es van transferir al medi neurobasal i es van mantenir tal com s'ha descrit anteriorment.
Tots els procediments amb els animals es van dur a terme d'acord amb les directrius de cura dels animals aprovades pel Comitè Administratiu de Cura d'Animals de Laboratori (APLAC) de la Universitat de Stanford. Es van comprar o allotjar rates RNU eutímiques embarassades (rnu/+) (Charles River Laboratories). Els animals es van mantenir en un cicle de llum-fosc de 12 hores amb menjar i aigua ad libitum. Les cries de rata nues (FOXN1–/–) d'entre tres i set dies es van identificar pel creixement de bigotis immadurs abans del sacrifici. Els cadells (mascles i femelles) es van anestesiar amb isoflurà al 2-3% i es van col·locar en un marc estereotàxic. Es va realitzar una trepanació del crani amb un diàmetre d'aproximadament 2-3 mm per sobre de S1, mantenint la integritat de la duramàter. A continuació, es va utilitzar una agulla de 30-G (aproximadament 0,3 mm) just a l'exterior de la craniotomia per perforar la duramàter. A continuació, es va aplicar HCO3 a un parafilm prim de 3×3 cm i es va eliminar l'excés de medi. Utilitzant una xeringa Hamilton connectada a una agulla de calibre 23 G i 45°, injecteu suaument hCO3 a l'extrem més distal de l'agulla. A continuació, instal·leu la xeringa a la bomba de xeringa connectada al dispositiu estereotàxic. A continuació, col·loqueu la punta de l'agulla sobre un forat de punció de 0,3 mm d'amplada fet prèviament a la duramàter (z = 0 mm) i estrenyeu la xeringa 1-2 mm (z = aproximadament –1,5 mm) fins que l'agulla quedi entre la duramàter A. Es forma un segell dens. A continuació, aixequeu la xeringa fins al centre de la superfície cortical a z = -0,5 mm i injecteu hCO3 a una velocitat d'1-2 µl per minut. Després de completar la injecció d'hCO3, es retreu l'agulla a una velocitat de 0,2-0,5 mm per minut, es sutura la pell i el cadell es col·loca immediatament sobre una coixinet tèrmica fins a la recuperació completa. Alguns animals van ser trasplantats bilateralment.
Tots els procediments amb animals es van dur a terme d'acord amb les directrius de cura animal aprovades per l'APLAC de la Universitat de Stanford. Les rates (més de 60 dies després del trasplantament) van ser induïdes amb anestèsia al 5% d'isoflurà i anestesiades amb 1-3% d'isoflurà durant la visualització. Per a la visualització, es va utilitzar un escàner de forats horitzontals de 7 Tesla amb blindatge actiu Bruker (Bruker Corp.) amb un accionament de gradient d'International Electric Company (IECO), un insert de gradient blindat amb un diàmetre intern de 120 mm (600 mT/m, 1000 T/m/s) mitjançant AVANCE. III, RF multibobina de vuit canals i capacitats multinucli, i la plataforma Paravision 6.0.1 que l'acompanya. L'enregistrament es va realitzar mitjançant una bobina de RF volumètrica desacoblada activament amb un diàmetre intern de 86 mm i una bobina de RF criorefrigerada de quatre canals només per a recepció. Turbo-RARE axial 2D (temps de repetició = 2500 ms, temps d'eco = 33 ms, 2 mitjanes) amb 16 captures de tall, gruix de tall de 0,6 a 0,8 mm, que conté 256 × 256 mostres. Els senyals es van rebre mitjançant una bobina de RF volumètrica de transceptor en quadratura amb un diàmetre intern de 2 cm (Rapid MR International, LLC). Finalment, utilitzeu les funcions d'estimació de superfície integrades d'Imaris (BitPlane) per a la renderització 3D i l'anàlisi de volum. Un trasplantament reeixit es va definir com aquell en què es van formar àrees de senyal de ressonància magnètica ponderada en T2 continu a l'hemisferi trasplantat. El rebuig de l'empelt es va definir com un empelt que no va produir àrees de senyal de ressonància magnètica ponderada en T2 continu a l'hemisferi trasplantat. La t-hCO subcortical es va excloure de l'anàlisi posterior.
Per expressar establement GCaMP6s en hCO3 per a imatges de calci de dos fotons, les cèl·lules hiPS es van infectar amb pLV[Exp]-EF1a::GcaMP6s-WPRE-Puro seguit de la selecció d'antibiòtics. Breument, les cèl·lules es van dissociar amb EDTA i es van suspendre en 1 ml de medi Essential 8 a una densitat d'aproximadament 300.000 cèl·lules en presència de polibrè (5 μg/ml) i 15 μl de virus. A continuació, les cèl·lules es van incubar en suspensió durant 60 minuts i es van sembrar a una densitat de 50.000 cèl·lules per pou. Després de la confluència, les cèl·lules es van tractar amb 5-10 μg ml-1 de puromicina durant 5-10 dies o fins que van aparèixer colònies estables. La infecció aguda per hCO3 es va realitzar com s'ha descrit anteriorment5 amb algunes modificacions. Breument, transferir hCO3 els dies 30-45 a tubs de microcentrífuga Eppendorf d'1,5 ml que contenien 100 µl de medi nerviós. A continuació, es retiren aproximadament 90 µl del medi, s'afegeixen al tub de 3 a 6 µl de lentivirus d'alt títol (de 0,5 x 108 a 1,2 x 109) i l'hCO3 es transfereix a la incubadora durant 30 minuts. A continuació, afegiu-hi de 90 a 100 µl de medi a cada tub i torneu els tubs a la incubadora durant la nit. L'endemà, transferiu l'hCO3 al medi nerviós fresc en plaques de baixa fixació. Després de 7 dies, l'hCO3 es va transferir a plaques amb fons de vidre de 24 pous per a la visualització i l'avaluació de la qualitat de la infecció. Els pLV[Exp]-SYN1::EYFP-WPRE i els pLV[Exp]-SYN1::hChR2-EYFP-WPRE es van generar mitjançant VectorBuilder. Els lentivirus s'utilitzen en la majoria d'experiments perquè estan integrats al genoma de l'hoste, cosa que permet l'expressió del gen reporter en línies cel·lulars infectades. Per al seguiment de la ràbia, es va coinfectar hCO entre el dia 30 i 45 amb rabies-ΔG-eGFP i AAV-DJ-EF1a-CVS-G-WPRE-pGHpA (plasmidi #67528, Addgene), es va rentar a fons durant 3 dies i es va trasplantar a rates en S1 i es va mantenir in vivo durant 7-14 dies.
Per a la immunocitoquímica, els animals van ser anestesiats i perfosos transcàrdicament amb PBS seguit de paraformaldehid al 4% (PFA en PBS; Electron Microscopy Sciences). Els cervells es van fixar en PFA al 4% durant 2 hores o durant la nit a 4 °C, es van criopreservar en sacarosa al 30% en PBS durant 48-72 hores i es van incloure en sacarosa al 30%: OCT (Tissue-Tek OCT Compound 4583, Sakura Finetek) 1:1 i es van fer seccions coronals a 30 µm mitjançant un criòstat (Leica). Per a la immunohistoquímica de seccions gruixudes, els animals es van perfondre amb PBS i el cervell es va disseccionar i seccionar coronalment a 300-400 µm mitjançant un vibratom (Leica) i les seccions es van fixar amb PFA al 4% durant 30 minuts. A continuació, les crioseccions o seccions gruixudes es van rentar amb PBS, es van bloquejar durant 1 hora a temperatura ambient (sèrum normal de ruc al 10% (NDS) i Tritó X-100 al 0,3% diluït en PBS) i es van bloquejar amb una solució de bloqueig a 4 °C. – Incubació Les crioseccions es van incubar durant la nit i les seccions gruixudes es van incubar durant 5 dies. Els anticossos primaris utilitzats van ser: anti-NeuN (ratolí, 1:500; ab104224, abcam) anti-CTIP2 (rata, 1:300; ab18465, abcam), anti-GFAP (conill, 1:1.000; Z0334, Dako), anti-GFP (pollastre, 1:1.000; GTX13970, GeneTex), anti-HNA (ratolí, 1:200; ab191181, abcam), anti-NeuN (conill, 1:500; ABN78, Millipore), anti-PDGFRA (conill, 1:200; sc-338, Santa Cruz), anti-PPP1R17 (conill, 1:200; HPA047819, Atlas Antibodies), anti-RECA-1 (ratolí, 1:50;). ab9774, abcam), anti-SCG2 (conill, 1:100; 20357-1-AP, Proteintech), anti-SOX9 (cabra, 1:500; AF3075, R&D Systems), Netrina G1a (cabra, 1:100; AF1166, R&D Systems), anti-STEM121 (ratolí, 1:200; Y40410, Takara Bio), anti-SATB2 (ratolí, 1:50; ab51502, abcam), anti-GAD65/67 (conill, 1:400; ABN904, Millipore) i anti-IBA1 (cabra, 1:100; ab5076, abcam). Els anticossos primaris utilitzats van ser: anti-NeuN (ratolí, 1:500; ab104224, abcam) anti-CTIP2 (rata, 1:300; ab18465, abcam), anti-GFAP (conill, 1:1.000; Z0334, Dako), anti-GFP (pollastre, 1:1.000; GTX13970, GeneTex), anti-HNA (ratolí, 1:200; ab191181, abcam), anti-NeuN (conill, 1:500; ABN78, Millipore), anti-PDGFRA (conill, 1:200; sc-338, Santa Cruz), anti-PPP1R17 (conill, 1:200; HPA047819, Atlas Antibodies), anti-RECA-1 (ratolí, 1:50;). ab9774, abcam), anti-SCG2 (conill, 1:100; 20357-1-AP, Proteintech), anti-SOX9 (cabra, 1:500; AF3075, R&D Systems), Netrina G1a (cabra, 1:100; AF1166, R&D Systems), anti-STEM121 (ratolí, 1:200; Y40410, Takara Bio), anti-SATB2 (ratolí, 1:50; ab51502, abcam), anti-GAD65/67 (conill, 1:400; ABN904, Millipore) i anti-IBA1 (cabra, 1:100; ab5076, abcam). Использовались следующие первичные антитела: анти-NeuN (мышиные, 1:500; ab104224, abcam), анти-CTIP:с12ные (Использовались) ab18465, abcam), анти-GFAP (кроличьи, 1:1000; Z0334, Dako), анти- -GFP (курица, 1:1000; GTX13970, GeneTex), анти-HNA (,м,11:1:1000) abcam), анти-NeuN (кролик, 1:500; ABN78, Millipore), анти-PDGFRA (кролик, 1:200; sc-338, Санта-Круз), анти-PPP1R17 (кролик, 1:200; HPA047819, Atlas Antibodies), анти-RECA-1 (мыш40, ab97:5ь, ab97:5ь; анти-SCG2 (кролик , 1:100; 20357-1-AP, Proteintech), анти-SOX9 (козий, 1:500; AF3075, R&D Systems), нетрин G1a (коз110й, 6:1160), анти-SCG2 анти-STEM121 (мышиный , 1:200; Y40410, Takara Bio), анти-SATB2 (мышь, 1:50; ab51502, abcam), анти-GAD65/67 (кролик, 1:400; ABN904, Millipore) i анти-IBA1 (коза, 1 :100; абб5076, мабка). Els anticossos primaris utilitzats van ser: anti-NeuN (ratolí, 1:500; ab104224, abcam), anti-CTIP2 (rata, 1:300; ab18465, abcam), anti-GFAP (conill, 1:1000; Z0334, Dako), anti-GFP (pollastre, 1:1000; GTX13970, GeneTex), anti-HNA (ratolí, 1:200; ab191181, abcam), anti-NeuN (conill, 1:500; ABN78, Millipore), anti-PDGFRA (conill, 1:200; sc-338, Santa Cruz), anti-PPP1R17 (conill, 1:200; HPA047819, Atlas Antibodies), anti-RECA-1 (ratolí, 1:50;). ab9774, abcam), anti-SCG2 (conill, 1:100; 20357-1-AP, Proteintech), anti-SOX9 (cabra, 1:500; AF3075, R&D Systems), netrina G1a (cabra, 1:100; AF1166, R&D Systems), anti-STEM121 (ratolí, 1:200; Y40410, Takara Bio), anti-SATB2 (ratolí, 1:50; ab51502, abcam), anti-GAD65/67 (conill, 1:400; ABN904, Millipore) i anti-IBA1 (cabra, 1:100; ab5076, abkam).使用的一抗是：抗NeuN（小鼠，1:500；ab104224，abcam）抗CTIP2（大鼠，1:3 00；ab18465，abcam），抗GFAP（兔，1:1,000；Z0334，Dako），抗-GF P（鸡，1:1.000；GTX13970，GeneTex），抗HNA（小鼠，1:200；ab1911 81，abcam），抗NeuN（兔，1:500；ABN78，Millipore），抗PDGFRA（兔， 1:200；sc-338，Santa Cruz），抗PPP1R17（兔，1:200；HPA047819，Atles抗体），抗RECA-1（小鼠，1:50；ab9774，abcam），抗SCG2（兔）, 1:100；20357-1-AP，Proteintech），抗SOX9（山羊，1:500；AF3075，R+D Systems），Netrin G1a（山羊（山羊，1:101D；；AF1006； Sistemes），抗STEM121（小鼠, 1:200;使用的一抗是：抗NeuN（小鼠，1:500；ab104224，abcam）抗CTIP2（大鼠＠1 :300；ab18465，abcam），抗GFAP（兔，1:1,000；Z0334，Dako），抗-GFP（鸡，1:1.000；GTX13970，GeneTex），抗HNA（小鼠，1:200；ab 191181，abcam），抗NeuN（兔，1:500；ABN78，Millipore％弔，抗1: 200；sc-338，Santa Cruz），抗PPP1R17（兔，1:200；HPA047819，Atles抗体），抗RECA-1（小鼠，1:50；ab9774，abcam），抗SCG2 100；20357-1-AP，Proteintech），抗SOX9（山羊，1:500；AF3075，R+D Systems），Netrin G1a（山羊（山羊；1:1006；AFR&D； Sistemes）頏1:20, ;Y40410, Takara Bio), anti-SATB2 (ratolí, 1:50; ab51502, abcam), anti-GAD65/67 (conill, 1:400; ABN904, Millipore) i anti-IBA1 (cabra, 1:100; ab5076, abcam).Els anticossos primaris utilitzats van ser: anti-NeuN (ratolí, 1:500; ab104224, abcam), anti-CTIP2 (rata, 1:300; ab18465, abcam), anti-GFAP (conill, 1:1000; Z0334, Dako). , anti-GFP (pollastre, 1:1000; GTX13970, GeneTex), anti-HNA (ratolí, 1:200; ab191181, abcam), anti-NeuN (conill, 1:500; ABN78, Millipore), anti-PDGFRA (conill, 1:200; sc-338, Santa Cruz), anti-PPP1R17 (conill, 1:200; HPA047819, anticòs Atlas), anti-RECA-1 (ratolí, 1:50; ab9774, abcam), anti-SCG2 (conill), 1:100;20357-1-AP, Proteintech), анти-SOX9 (коза, 1:500; AF3075, R&D Systems), Нетрин G1a (коза, 1:100; AF1166, R&D Systems), анти (;мы12ь, -STEM, ; Y40410, Takara Bio), анти-SATB2 (мышь, 1:50; ab51502, abcam), анти-GAD65/67 (кролик, 1:400; ABN904, Millipore) i анти-IBA1, (; кролик, 1:400, Millipore) i анти-IBA1, (; абкам). 20357-1-AP, Proteintech), anti-SOX9 (cabra, 1:500; AF3075, R&D Systems), Netrina G1a (cabra, 1:100; AF1166, R&D Systems), anti-STEM121 (ratolí, 1:200; Y40410, Takara Bio), anti-SATB2 (ratolí, 1:50; ab51502, abcam), anti-GAD65/67 (conill, 1:400; ABN904, Millipore) i anti-IBA1 (cabra, 1:100; ab5076, abkam).Les seccions es van rentar amb PBS i es van incubar amb un anticòs secundari durant 1 hora a temperatura ambient (seccions congelades) o durant la nit a 4 °C (seccions gruixudes). Es va utilitzar l'anticòs secundari Alexa Fluor (Life Technologies) diluït 1:1000 en solució de bloqueig. Després de rentar-les amb PBS, els nuclis es van visualitzar amb un Hoechst 33258 (Life Technologies). Finalment, els portaobjectes es van col·locar en un microscopi amb cobreobjectes (Fisher Scientific) utilitzant un Aquamount (Polysciences) i es van analitzar en un microscopi fluorescent Keyence (analitzador BZ-X) o un microscopi confocal Leica TCS SP8 (Las-X) sobre la imatge. Les imatges es van processar amb el programa ImageJ (Fiji). Per quantificar la proporció de neurones humanes en t-hCO i l'escorça de rata, es van prendre imatges rectangulars de 387,5 μm d'amplada al centre del t-hCO, a la vora o a prop de l'escorça de rata. Els marges de l'empelt es van determinar avaluant els canvis en la transparència dels teixits, els nuclis HNA+ i/o la presència d'autofluorescència dels teixits. A cada imatge, el nombre total de cèl·lules NeuN+ i HNA+ es va dividir pel nombre total de cèl·lules NeuN+ a la mateixa àrea. Per garantir que només es comptin les cèl·lules amb nuclis al pla de la imatge, només s'inclouen en el càlcul les cèl·lules que també són Hoechst+. Es va fer la mitjana de dues imatges separades per almenys 1 mm per reduir l'error estadístic.
Una setmana abans de la recollida de mostres, col·loqueu els animals trasplantats amb hCO3 (aproximadament 8 mesos de diferenciació) en una habitació fosca amb els bigotis retallats per minimitzar l'estimulació sensorial. L'aïllament dels nuclis es va realitzar tal com s'ha descrit anteriorment, amb algunes modificacions. Breument, el t-hCO3 i l'hCO3 es van destruir mitjançant lisi cel·lular mecànica amb detergent i un molinet de teixit de vidre de 2 ml (D8938, Sigma-Aldrich/KIMBLE). Els nuclis crus es van filtrar amb un filtre de 40 µm i es van centrifugar a 320 g durant 10 minuts a 4 °C abans de realitzar un gradient de densitat de sacarosa. Després del pas de centrifugació (320 g durant 20 min a 4 °C), les mostres es van resuspendre en 0,04% BSA/PBS amb l'addició de 0,2 unitats d'inhibidor de RNasa µl-1 (40 u µl-1, AM2682, Ambion) i es van passar a través d'un filtre de flux de 40 µm. Els nuclis dissociats es van resuspendre en PBS que contenia un 0,02% de BSA i es van carregar en un xip de Chromium Single Cell 3′ (recuperació estimada de 8.000 cèl·lules per carril). Les biblioteques de snRNA-seq es van preparar amb el kit Chromium Single cell 3′ GEM, Library & Gel Bead v3 (10x Genomics). Les biblioteques de snRNA-seq es van preparar amb el kit Chromium Single cell 3′ GEM, Library & Gel Bead v3 (10x Genomics). Библиотеки snRNA-seq были приготовлены с помощью Chromium Single cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics). Les biblioteques de snRNA-seq es van preparar utilitzant Chromium Single cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics). snRNA-seq 文库是使用Chromium Single Cell 3′ GEM、Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics) 制备的。 snRNA-seq 文库是使用Chromium Single Cell 3′ GEM、Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics) 制备的。 Библиотеку snRNA-seq готовили с использованием Chromium Single Cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics). La biblioteca de snRNA-seq es va preparar utilitzant Chromium Single Cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics).Admera Health va agrupar i seqüenciar biblioteques de diferents mostres sobre NovaSeq S4 (Illumina).
Els nivells d'expressió gènica per a cada possible codi de barres nuclear es van quantificar mitjançant el paquet de programari d'anàlisi 10x Genomics CellRanger (versió 6.1.2). Específicament, les lectures es van comparar amb una combinació de genomes de referència humans (GRCh38, Ensemble, versió 98) i de rata (Rnor_6.0, Ensemble, versió 100) creats amb l'ordre mkref i utilitzant count amb l'ordre –include-introns=TRUE per quantificar i incloure lectures mapades a regions d'introns. Per a les mostres de t-hCO, els nuclis humans es van identificar basant-se en el requisit conservador que almenys el 95% de totes les lectures mapades coincideixin amb el genoma humà. Totes les anàlisis posteriors es van realitzar en una matriu de codis de barres filtrada de sortida de CellRanger mitjançant el paquet R (versió 4.1.2) Seurat (versió 4.1.1)32.
Per garantir que només s'incloguin nuclis d'alta qualitat en l'anàlisi posterior, es va implementar un procés de filtratge iteratiu per a cada mostra. Primer, s'identifiquen i s'eliminen els nuclis de baixa qualitat amb menys de 1000 gens únics trobats i més del 20% del total de mitocondris. Posteriorment, la matriu numèrica de gens en brut es va normalitzar mitjançant una regressió binomial negativa regularitzada utilitzant la funció sctransform(vst.flavor="v2", que també va identificar els 3000 gens més variables utilitzant paràmetres per defecte. La reducció de la dimensió es va realitzar en els gens variables superiors mitjançant l'Anàlisi de Components Principals (PCA) amb paràmetres per defecte utilitzant una dimensió del conjunt de dades de 30 (dims = 30 es va triar a partir de la inspecció visual dels llocs del genoll i es va utilitzar per a totes les mostres i anàlisis de conjunt). A continuació, vam realitzar diverses rondes de clústering iteratiu (resolució = 1) per classificar els gens en funció del recompte de gens anormalment baix (mitjana per sota del percentil 10), el recompte de gens mitocondrials anormalment alt (mitjana per sobre del percentil 95) per identificar i eliminar cèl·lules putatives de baixa qualitat. clústers i/o una alta proporció de bessons sospitosos identificats mitjançant el paquet DoubletFinder33 (puntuació mitjana de DoubletFinder per sobre del percentil 95). Les mostres de t-hCO (n = 3) i les mostres de hCO (n = 3) es van integrar per separat mitjançant la funció IntegrateData amb els paràmetres anteriors. A continuació es va dur a terme una altra ronda de filtratge qualitatiu del conjunt de dades integrat tal com s'ha descrit anteriorment.
Després d'eliminar els nuclis de baixa qualitat, el conjunt de dades integrat es va agrupar (resolució = 0,5) i es va incrustar per a la visualització d'UMAP34. Els gens marcadors per a cada clúster es van determinar mitjançant la funció FindMarkers amb paràmetres per defecte calculats a partir de dades d'expressió gènica normalitzades. Identifiquem i classifiquem les principals classes cel·lulars combinant conjunts de dades de referència corticals fetals i adultes amb l'expressió de gens marcadors 19,20,21,35 i l'anotació. En particular, els precursors circulants es van identificar per l'expressió de MKI67 i TOP2A. Els clústers progenitors es van definir per l'absència de transcrits mitòtics, una alta superposició amb clústers de progenitors glials multipotents descrits a l'escorça fetal en metafase tardana i l'expressió d'EGFR i OLIG1. Utilitzem el terme astròcit per englobar diversos estats de diferenciació dels astròcits, des de la glia radial tardana fins a la maduració dels astròcits. Els clústers d'astròcits expressen alts nivells de SLC1A3 i AQP4 i s'ha demostrat que es mapegen amb subtipus de glia radial fetal i/o astròcits adults. Els OPC expressen PDGFRA i SOX10, mentre que els oligodendròcits expressen marcadors de mielinització (MOG i MYRF). Les neurones glutamatèrgiques es van identificar per la presència de transcrits neuronals (SYT1 i SNAP25), l'absència de marcadors GABAèrgics (GAD2) i l'expressió de NEUROD6, SLC17A7, BCL11B o SATB2. Les neurones GluN es van dividir encara més en subclasses superiors (expressió SATB2 i pèrdua de BCL11B) i profundes (expressió BCL11B). Les neurones putatives de la subplaca (SP) expressen marcadors SP18 coneguts com ST18 i SORCS1, a més dels marcadors GluN profunds. Les cèl·lules semblants al plexe coroide es van identificar mitjançant l'expressió de TTR, i les cèl·lules semblants a les meníngies van expressar gens associats a fibroblasts i van mapar cèl·lules pials/vasculars del conjunt de dades de referència.
L'anàlisi diferencial de l'expressió gènica entre les subclasses de t-hCO i hCO es va dur a terme mitjançant un mètode pseudo-batch recentment desenvolupat reproduït en mostres implementades amb el paquet Libra R (versió 1.0.0). Específicament, es van realitzar proves de log-likelihood edgeR (versió 3.36.0, paquet R) per a grups sumant el nombre de gens en cèl·lules per a una classe cel·lular determinada per a cada replicació de la mostra. Per a la visualització del mapa de calor, es calculen els valors normalitzats per milió (CPM) mitjançant edgeR (funció cpm()) i s'escalegen (per aconseguir una mitjana = 0, desviació estàndard = 1). Es va realitzar una anàlisi d'enriquiment de Gene Ontology (GO) dels gens GluN de t-hCO significativament regulats a l'alça (valor P corregit per Benjamini-Hochberg inferior a 0,05 expressat en almenys el 10% de les cèl·lules GluN de t-hCO i un augment del canvi d'almenys 2 vegades). Es va realitzar mitjançant ToppGene Suite (https://toppgene.cchmc.org/)37. Fem servir l'aplicació ToppFun amb paràmetres predeterminats i informem de valors P corregits per Benjamini-Hochberg calculats a partir de proves hipergeomètriques anotades per GO.
Per fer coincidir els nostres clústers de seqüència d'ARN de snRNA amb clústers de cèl·lules anotats d'estudis de referència de seqüència d'ARN unicel·lular primària o seqüència d'ARN de snRNA adulta19,20,21,22, vam aplicar un enfocament d'integració de conjunts de dades aparellats. Vam utilitzar el flux de treball de normalització SCTransform (v2) a Seurat per integrar i comparar les superposicions de clústers entre conjunts de dades (utilitzant els mateixos paràmetres que els anteriors). Els conjunts de dades individuals es van subgrupar aleatòriament fins a 500 cèl·lules o nuclis per clúster original per a l'eficiència computacional. Utilitzant un enfocament similar al descrit anteriorment, la superposició de clústers es va definir com la proporció de cèl·lules o nuclis de cada clúster agrupat que se superposaven amb l'etiqueta del clúster de referència. Per classificar encara més les GluN, vam utilitzar el flux de treball TransferData de Seurat per a dades de subconjunts de GluN per assignar etiquetes de conjunts de dades de referència a les nostres cèl·lules GluN.
Per avaluar l'estat de maduració del transcriptoma global de les mostres de t-hCO i hCO, vam comparar les nostres mostres pseudo-bulk amb BrainSpan/psychENCODE23, que consisteix en una gran seqüència d'ARN que abasta el desenvolupament del cervell humà. Vam realitzar un PCA en una matriu d'expressió gènica normalitzada per patrons combinats de mostres corticals 10 setmanes després de la concepció i posteriorment, en 5567 gens (juntament amb les nostres dades) que s'havien identificat prèviament com a actius en mostres corticals de BrainSpan (definides com a superiors al 50% en la variància del desenvolupament explicada per l'edat mitjançant un model cúbic)38. A més, vam derivar gens associats amb les principals signatures del transcriptoma del neurodesenvolupament mitjançant la factorització de matrius no negativa, tal com s'ha descrit anteriorment. Els pesos de la mostra calculats mitjançant el procediment de factorització de matrius no negativa es representen a les figures 5b amb dades ampliades per a cadascuna de les cinc signatures descrites per Zhu et al.38. De nou, els marcadors transcripcionals dependents de l'activitat es van derivar d'estudis publicats anteriorment. En particular, ERG i LRG es van sobreexpressar significativament en neurones glutamatèrgiques identificades per la col·lecció de snRNA-seq de l'escorça visual del ratolí després de l'estimulació visual de la Taula Suplementària 3 Hrvatin et al.16. Els LRG enriquits en humans es van obtenir de cultius de cervell fetal humà activats amb KCl i es van recol·lectar 6 hores després de l'estimulació, i els gens filtrats es van sobreexpressar significativament en humans però no en rosegadors (Taula Suplementària 4). L'anàlisi de l'enriquiment del conjunt de gens utilitzant aquests conjunts de gens es va realitzar mitjançant una prova exacta de Fisher unidireccional.
Anestesiar les rates amb isoflurà, treure els cervells i col·locar-los en una solució de sacarosa oxigenada (95% O2 i 5% CO2) freda (aproximadament a 4 °C) per a les seccions que contenen: 234 mM de sacarosa, 11 mM de glucosa, 26 mM de NaHCO3, 2,5 mM de KCl, 1,25 mM de NaH2PO4, 10 mM de MgSO4 i 0,5 mM de CaCl2 (uns 310 mOsm). Es van fer seccions coronals de cervell de rata (300–400 µm) que contenien t-hCO3 utilitzant un vibratom Leica VT1200 tal com s'ha descrit anteriorment39. Les seccions es van transferir a una cambra de seccionament amb oxigenació contínua a temperatura ambient que contenia aCSF preparat a partir de: 10 mM de glucosa, 26 mM de NaHCO3, 2,5 mM de KCl, 1,25 mM de NaHPO4, 1 mM de MgSO4, 2 mM de CaCl2 i 126 mM de NaCl (298 mOsm). almenys 45 minuts abans del registre. Les seccions es van registrar en una cambra immersa on es van perfondre contínuament amb aCSF (vial de 95% d'O2 i 5% de CO2). Totes les dades es van registrar a temperatura ambient. Les neurones t-hCO3 es van acabar amb una pipeta de vidre de borosilicat omplerta amb una solució que contenia 127 mM de gluconat de potassi, 8 mM de NaCl, 4 mM d'ATP de magnesi, 0,3 mM de GTP de sodi, 10 mM de HEPES i 0,6 mM d'EGTA, pH 7,2, solució interna ajustada amb KOH (290 mOsm). Per tal de recuperar-se, es va afegir biocistina (0,2%) a la solució d'enregistrament.
Les dades es van adquirir mitjançant un amplificador MultiClamp 700B (Molecular Devices) i un digitalitzador Digidata 1550B (Molecular Devices), es van filtrar de pas baix a 2 kHz, es van digitalitzar a 20 kHz i es van analitzar mitjançant Clampfit (Molecular Devices), Origin (OriginPro). 2021b, OriginLab) i funcions personalitzades de MATLAB (Mathworks). El potencial d'unió es va calcular mitjançant JPCalc i les entrades es van ajustar al valor calculat de -14 mV. L'operació IV consisteix en una sèrie de passos de corrent en passos de 10-25 pA, de -250 a 750 pA.
El tàlem, la substància blanca i els aferents S1 es van estimular elèctricament en talls talamocorticals durant l'enregistrament amb pegat de les neurones hCO3, tal com s'ha descrit anteriorment. Breument, el cervell es va col·locar sobre una taula d'impressió 3D inclinada en un angle de 10° i la part frontal del cervell es va tallar en un angle de 35°. A continuació, el cervell es va enganxar a la superfície tallada i es va seccionar, preservant els axons talamocorticals que sobresurten. Es van muntar elèctrodes bipolars de tungstè (0,5 MΩ) en un segon micromanipulador i es van posicionar estratègicament per estimular quatre regions per cèl·lula (càpsula interna, substància blanca, S1 i hCO3). Registreu les respostes sinàptiques després d'una estimulació fàsica de 300 µA a 0,03–0,1 Hz.
Les neurones hCO que expressen hChR2 es van activar a 480 nm i es van aplicar polsos de llum generats per un LED (Prizmatix) a través d'un objectiu ×40 (0.9 NA; Olympus) per registrar l'expressió d'hChR2 a prop de les cèl·lules. El diàmetre del camp il·luminat és d'aproximadament 0,5 mm i la potència total és de 10-20 mW. L'amplada del pols es va establir a 10 ms, que correspon al pols donat durant l'experiment d'aprenentatge conductual. Es van utilitzar diverses freqüències d'estimulació, d'1 a 20 Hz, però només es va utilitzar el primer pols de la sèrie per a la quantificació. Els intervals entre trens solen ser superiors a 30 s per minimitzar l'efecte sobre les vies inhibitòries o facilitadores sinàptiques. Per provar si la resposta d'hChR2 era monosinàptica, vam aplicar TTX (1 μM) al bany fins que la reacció EPSC va desaparèixer i després vam aplicar 4-aminopiridina (4-AP; 100 μM). Normalment, es retorna una resposta en pocs minuts, amb un retard lleugerament més llarg entre l'encesa del LED i la generació d'EPSC. Es va utilitzar NBQX (10 μM) per comprovar si la resposta està impulsada pels receptors AMPA.
Es van crear seccions nítides d'hCO3 tal com s'ha descrit anteriorment. Breument, les seccions d'hCO3 es van incloure en agarosa al 4% i es van transferir a cèl·lules que contenien 126 mM de NaCl, 2,5 mM de KCl, 1,25 mM de NaH2PO4, 1 mM de MgSO4, 2 mM de CaCl2, 26 mM de NaHCO3 i 10 mM de d-(+)-glucosa. Les seccions es van tallar a 200–300 µm a temperatura ambient utilitzant un vibrador Leica VT1200 i es van emmagatzemar en ASF a temperatura ambient. A continuació, es va realitzar un registre patch-camp de cèl·lules senceres en seccions d'hCO3 sota un microscopi directe SliceScope (Scientifica). Les seccions es van perfondre amb aCSF (95% d'O2 i 5% de CO2) i els senyals cel·lulars es van registrar a temperatura ambient. Les neurones d'hCO3 es van aplicar mitjançant una pipeta de vidre borosilicat plena d'una solució que contenia 127 mM de gluconat de potassi, 8 mM de NaCl, 4 mM d'ATP de magnesi, 0,3 mM de GTP de sodi, 10 mM d'HEPES i 0,6 mM d'EGTA, pH intern 7,2, ajustat amb KOH (osmolaritat 290). Per a la recuperació, afegiu un 0,2% de biocistina a la solució interna.
Les dades es van adquirir mitjançant Clampex (Clampex 11.1, Molecular Devices) utilitzant un amplificador MultiClamp 700B (Molecular Devices) i un digitalitzador Digidata 1550B (Molecular Devices), es van filtrar de pas baix a 2 kHz, es van digitalitzar a 20 kHz i es van analitzar mitjançant Clampfit (versió 10.6) per a l'anàlisi, dispositius moleculars) i funcions personalitzades de MATLAB (MATLAB 2019b, Mathworks). El potencial d'unió es va calcular mitjançant JPCalc i les entrades es van ajustar al potencial d'unió calculat de -14 mV. L'operació IV consisteix en una sèrie de passos de corrent en passos de 5-10 pA de -50 a 250 pA.
Per a la reconstrucció morfològica de les neurones pinçades, es va afegir un 0,2% de biocitina (Sigma-Aldrich) a la solució interna. Les cèl·lules es preparen durant almenys 15 minuts després del picatge. A continuació, s'injecta lentament la pipeta durant 1-2 minuts fins que la membrana registrada estigui completament segellada. Seguint el procediment de fisiologia de la secció, les seccions es van fixar durant la nit a 4 °C en PFA al 4%, es van rentar amb PBS X3 i es van diluir 1:1000 amb DyLight 549 o DyLight 405 conjugats amb estreptavidina (Vector Labs). Les cèl·lules omplides de biocitina (2%; Sigma-Aldrich) es van marcar durant el registre amb pinça de patch a temperatura ambient durant 2 hores. A continuació, les seccions es van muntar en portaobjectes de microscòpia utilitzant un Aquamount (Thermo Scientific) i es van visualitzar l'endemà en un microscopi confocal Leica TCS SP8 utilitzant un objectiu d'immersió en oli amb una obertura numèrica ×40 1,3, augment ×0,9–1,0, xy. La taxa de mostreig és d'aproximadament 7 píxels per micra. Es van obtenir piles Z a intervals d'1 µm en sèrie, i es van realitzar mosaics de pila Z i unió automàtica basada en Leica per cobrir tot l'arbre dendrític de cada neurona. A continuació, es va fer un seguiment semimanual de les neurones mitjançant la interfície neuTube 40 i es van generar fitxers SWC. Els fitxers es van carregar al connector SimpleNeuriteTracer41 Fiji (ImageJ, versió 2.1.0; NIH).
El teixit cortical humà es va obtenir amb consentiment informat d'acord amb un protocol aprovat pel Consell de Revisió Institucional de la Universitat de Stanford. Es van obtenir dues mostres de teixit humà postpart (de 3 i 18 anys) mitjançant resecció de l'escorça frontal (gir frontal mitjà) com a part d'una cirurgia per a l'epilèpsia refractària. Després de la resecció, es va recollir teixit en NMDG-aCSF fred com el gel que contenia: 92 mM NMDG, 2,5 mM KCl, 1,25 mM NaH2PO4, 30 mM NaHCO3, 20 mM HEPES, 25 mM glucosa, 2 mM tiourea, 5 mM ascorbat de sodi, 3 mM piruvat de sodi, 0,5 mM CaCl2 4H2O i 10 mM MgSO4 7H2O. Es va valorar a pH 7,3-7,4 amb àcid clorhídric concentrat. Els teixits es van lliurar al laboratori en 30 minuts i es van prendre seccions coronals d'acord amb el procediment descrit anteriorment.
Tots els procediments en animals es van dur a terme d'acord amb les directrius de cura animal aprovades per l'APLAC de la Universitat de Stanford. Les rates (més de 140 dies després del trasplantament) van ser induïdes amb anestèsia al 5% d'isoflurà i anestesiades amb 1-3% d'isoflurà intraoperatòriament. Els animals es van col·locar en un marc estereotàxic (Kopf) i es va injectar buprenorfina d'alliberament sostingut (SR) per via subcutània. El crani s'exposa, es neteja i s'insereixen de 3 a 5 cargols ossis. Per atacar el t-hCO3, vam generar coordenades estereotàxiques a partir d'imatges de ressonància magnètica. Es va perforar un forat al lloc d'interès i es van baixar fibres (400 µm de diàmetre, NA 0,48, dòric) 100 µm per sota de la superfície de l'hCO3 i es van fixar al crani amb ciment dental curable per UV (Relyx).
Els enregistraments fotomètrics de fibra es van realitzar tal com s'ha descrit anteriorment42. Per registrar l'activitat espontània, les rates es van col·locar en una gàbia neta i es va connectar un cable de fibra òptica de 400 µm de diàmetre (Doric) connectat a un sistema d'adquisició de dades fotomètriques de fibra òptica al cable de fibra òptica implantat. Durant el registre de 10 minuts de l'activitat motora, els animals van poder explorar la gàbia lliurement. Per registrar l'activitat evocada, les rates (més de 140 dies després del trasplantament) van ser anestesiades amb un 5% d'isoflurà per a la inducció i un 1-3% d'isoflurà per al manteniment. Col·loqueu l'animal en un marc estereotàctic (Kopf) i els bigotis del costat oposat del t-hCO3 es retallen a uns 2 cm i es passen a través d'una malla connectada a un actuador piezoelèctric (PI). Es va connectar un cable de fibra òptica de 400 µm (Doric) a la fibra implantada i al sistema d'adquisició de dades. Els bigotis del costat oposat del t-hCO3 es van desviar 50 vegades (2 mm a 20 Hz, 2 s per presentació) a l'atzar mitjançant un accionament piezoelèctric durant un període d'enregistrament de 20 minuts. Utilitzeu el paquet de suport Arduino MATLAB per controlar el temps de desviació amb codi MATLAB personalitzat. Els esdeveniments es sincronitzen amb el programari d'adquisició de dades mitjançant polsos de lògica transistor-transistor (TTL).
Es va induir rates (més de 140 dies després del trasplantament) amb anestèsia al 5% d'isoflurà i es van anestesiar amb isoflurà a l'1-3% intraoperatòriament. Els animals es van col·locar en un marc estereotàxic (Kopf) i es van injectar buprenorfina SR i dexametasona per via subcutània. Es va exposar el crani, es va netejar i s'hi van inserir de 3 a 5 cargols ossis. Per atacar el t-hCO, vam generar coordenades estereotàxiques a partir d'imatges de ressonància magnètica. Es va realitzar una craniotomia circular (aproximadament 1 cm de diàmetre) amb un trepant d'alta velocitat directament sobre l'hCO trasplantat. Un cop l'os sigui el més prim possible, però abans de perforar tot l'os, es van utilitzar pinces per extreure el disc pèlvic intacte restant per revelar el t-hCO subjacent. La craniotomia es va omplir amb solució salina estèril i es van fixar un cobreobjectes i una agulla de cap especial al crani amb ciment dental curat amb UV (Relyx).
Les imatges de dos fotons es van realitzar mitjançant un microscopi multifotònic Bruker amb un objectiu Nikon LWD (×16, 0.8 NA). Les imatges de GCaMP6 es van realitzar a 920 nm amb un augment de pla z únic d'1.4x i una mitjana de 8x de 7.5 fps. Les rates van ser induïdes amb anestèsia d'isoflurà al 5% i mantingudes amb isoflurà a l'1-3%. Les rates es van col·locar en un capçal fet a mida i es van posicionar sota la lent. Es va obtenir un enregistrament de fons de 3 minuts de l'activitat motora. Durant el transcurs de 20 minuts d'enregistrament, es van administrar aleatòriament 50 bufades (cada presentació de 100 ms de durada) al coixinet de bigotis oposat al t-hCO3 mitjançant un picosprecer. Utilitzeu el paquet de suport Arduino MATLAB per controlar el temps de ràfega amb codi MATLAB personalitzat. Sincronitzeu els esdeveniments amb el programari d'adquisició de dades (PrairieView 5.5) mitjançant polsos TTL. Per a l'anàlisi, les imatges es van corregir per moviment xy mitjançant correcció afí al programa MoCo llançat a Fiji. Extracció de traces fluorescents de cèl·lules individuals mitjançant CNMF-E43. Es va extreure la fluorescència per a cada regió d'interès, es va convertir a corbes dF/F i després es va convertir a puntuacions z.
Es va induir el trasplantament amb rates (més de 140 dies després del trasplantament) amb anestèsia al 5% d'isoflurà i es va anestesiar amb isoflurà de l'1 al 3% intraoperatòriament. Els animals es van col·locar en un marc estereotàxic (Kopf) i es van injectar buprenorfina SR i dexametasona per via subcutània. Els bigotis del costat oposat del t-hCO es van tallar a uns 2 cm i es van passar a través d'una malla connectada a un actuador piezoelèctric. Es va exposar i netejar el crani. Es va fixar un cargol de terra d'acer inoxidable al crani. Per atacar el t-hCO, vam generar coordenades estereotàxiques a partir d'imatges de ressonància magnètica. Es va realitzar una craniotomia circular (aproximadament 1 cm de diàmetre) amb un trepant d'alta velocitat just per sobre del t-hCO. Un cop l'os sigui el més prim possible, però abans de perforar tot l'os, es van utilitzar pinces per extreure el disc pèlvic intacte restant per revelar el t-hCO subjacent. Es van registrar cèl·lules individuals mitjançant sondes de silici d'alta densitat de 32 o 64 canals (Cambridge Neurotech) connectades a terra a cargols de terra i preamplificades amb amplificadors RHD (Intan). Utilitzeu el manipulador per baixar els elèctrodes fins al lloc objectiu a través de la craniotomia, que s'omple amb solució salina estèril. La recollida de dades es va realitzar a una freqüència de 30 kHz mitjançant el sistema d'adquisició de dades Open Ephys. El registre va continuar només quan vam detectar una activitat espontània rítmica altament correlacionada en més de 10 canals, cosa que suggereix que els elèctrodes estaven ubicats a l'empelt (basant-se en dades d'imatges de calci de dos fotons). Es va obtenir un registre de fons de 10 minuts de l'activitat motora. Els bigotis del costat oposat del t-hCO3 es van desviar 50 vegades (2 mm a 20 Hz, 2 s per presentació) a l'atzar mitjançant un accionament piezoelèctric durant un període de registre de 20 minuts. Utilitzant el paquet de suport MATLAB per a Arduino (MATLAB 2019b), controleu el temps de desviació amb codi MATLAB personalitzat. Utilitzeu polsos TTL per sincronitzar esdeveniments amb programari d'adquisició de dades.
Per als experiments de marcatge òptic, es va connectar un cable de connexió òptica de 200 µm (Doric) connectat a un làser de 473 nm (Omicron) a una fibra òptica de 200 µm col·locada sobre la craniotomia. Immediatament abans d'això, ajusteu la potència del jumper a 20 mW. Utilitzeu el manipulador per baixar els elèctrodes fins al lloc objectiu a través de la craniotomia, que està plena de solució salina estèril. Al començament de l'enregistrament, es van emetre deu polsos de llum de 473 nm (freqüència 2 Hz, durada del pols 10 ms). Les cèl·lules fotosensibles es van definir com a cèl·lules que van mostrar una resposta de punta dins dels 10 ms de llum en el 70% o més dels assajos.