Hvala vam što ste posjetili Nature.com. Koristite verziju preglednika s ograničenom CSS podrškom. Za najbolje iskustvo, preporučujemo da koristite ažuriranu verziju preglednika (ili da onemogućite način kompatibilnosti u Internet Exploreru). Osim toga, kako bismo osigurali kontinuiranu podršku, prikazujemo stranicu bez stilova i JavaScripta.
Prikazuje karusel od tri slajda odjednom. Koristite dugmad Prethodno i Sljedeće za kretanje kroz tri slajda odjednom ili koristite klizače na kraju za kretanje kroz tri slajda odjednom.
Samoorganizujuće neuronske organele predstavljaju obećavajuću in vitro platformu za modeliranje ljudskog razvoja i bolesti. Međutim, organoidima nedostaje povezanost koja postoji in vivo, što ograničava sazrijevanje i sprječava integraciju s drugim krugovima koji kontroliraju ponašanje. Ovdje pokazujemo da kortikalni organoidi izvedeni iz ljudskih matičnih ćelija transplantirani u somatosenzorni korteks neonatalnih golih pacova razvijaju zrele tipove ćelija koji se integriraju u senzorne i motivacijski povezane krugove. MRI je otkrio rast organoida nakon transplantacije u nekoliko linija matičnih ćelija i kod životinja, dok je analiza jedne jezgre otkrila progresiju kortikogeneze i pojavu transkripcijskog programa ovisnog o aktivnosti. Zaista, transplantirani kortikalni neuroni pokazuju složenija morfološka, ​​sinaptička i svojstva unutrašnjih membrana od svojih in vitro pandana, što omogućava otkrivanje neuronskih defekata kod pacijenata s Timothyjevim sindromom. Anatomsko i funkcionalno praćenje pokazalo je da transplantirani organeli primaju talamokortikalne i kortikokortikalne ulaze, a in vivo snimci neuronske aktivnosti sugeriraju da ovi ulazi mogu generirati senzorne odgovore u ljudskim ćelijama. Konačno, kortikalni organoidi produžuju aksone kroz mozak pacova, a njihova optogenetska aktivacija dovodi do ponašanja traženja nagrade. Dakle, transplantirani neuroni ljudskog korteksa sazrijevaju i učestvuju u krugovima domaćina koji kontroliraju ponašanje. Očekujemo da će ovaj pristup olakšati detekciju fenotipova na nivou lanca u ćelijama izvedenim od pacijenta koji se ne mogu detektovati drugim sredstvima.
Razvoj ljudskog mozga je izvanredan samoorganizirajući proces u kojem ćelije proliferiraju, diferenciraju se, migriraju i povezuju se formirajući funkcionalne neuronske krugove koji se dalje usavršavaju kroz senzorno iskustvo. Ključni problem u razumijevanju razvoja ljudskog mozga, posebno u kontekstu bolesti, jeste nedostatak pristupa moždanom tkivu. Samoorganizirajuće organele, uključujući organoide ljudskog korteksa (hCO; poznate i kao sfera ljudskog korteksa), mogu generirati 2,3,4,5,6. Međutim, nekoliko ograničenja ograničava njihovu širu primjenu na razumijevanje razvoja i funkcioniranja neuronskih krugova. Posebno nije jasno da li je sazrijevanje hCO ograničeno odsustvom određenih mikrookolinskih i senzornih ulaza prisutnih in vivo. Osim toga, budući da hCO nisu integrirani u krugove koji mogu generirati bihevioralne ishode, njihova korisnost u modeliranju genetski složenih i bihevioralnih neuropsihijatrijskih poremećaja trenutno je ograničena.
Transplantacija hCO u netaknuti živi mozak može prevazići ova ograničenja. Prethodne studije su pokazale da ljudski neuroni transplantirani u korteks glodara mogu preživjeti, projicirati i komunicirati sa ćelijama glodara7,8,9,10,11,12. Međutim, ovi eksperimenti se obično izvode na odraslim životinjama, što može ograničiti sinaptičku i aksonsku integraciju. Ovdje opisujemo paradigmu transplantacije u kojoj smo transplantirali 3D hCO izveden iz hiPS ćelija u primarni somatosenzorni korteks (S1) imunodeficijentnih pacova u ranoj fazi plastičnog razvoja. Transplantirani hCO (t-hCO) neuroni prolaze kroz značajno sazrijevanje, primaju talamokortikalne i kortikalno-kortikalne ulaze koji izazivaju senzorne odgovore i proširuju aksonske projekcije u mozak pacova kako bi potaknuli ponašanje traženja nagrade. Produženo sazrijevanje t-hCO otkrilo je neuronske defekte kod pacijenata sa Timothyjevim sindromom (TS), teškim genetskim poremećajem uzrokovanim mutacijama u naponski osjetljivom kalcijumskom kanalu L-tipa CaV1.2 (kodiranom od strane CACNA1C).
Kako bismo in vivo proučavali ljudske kortikalne neurone u krugovima, stereotaksički smo transplantirali intaktni 3D hCO u S1 ranih postnatalnih atimičnih pacova (3-7 dana nakon rođenja) (Slika 1a i prošireni podaci sa Slike 1a-c). U ovom trenutku, talamokortikalne i kortikokortikalne aksonske projekcije još nisu završile svoju S1 inervaciju (ref. 13). Stoga je ovaj pristup osmišljen kako bi se maksimizirala integracija t-hCO, a istovremeno minimizirao utjecaj na endogene krugove. Kako bismo vizualizirali lokaciju t-hCO kod živih životinja, izveli smo T2-ponderirane MRI rekonstrukcije mozga pacova 2-3 mjeseca nakon transplantacije (Slika 1b i prošireni podaci, Slika 1d). t-hCO2 su lako uočljivi, a mjerenja volumena t-hCO2 bila su slična onima izračunatim iz fiksnih slojeva (Prošireni podaci, slika 1d,e; P > 0,05). t-hCO2 su lako uočljivi, a mjerenja volumena t-hCO2 bila su slična onima izračunatim iz fiksnih slojeva (Prošireni podaci, slika 1d,e; P > 0,05). t-hCO je lako posmatrao, obimno izmerenje t-hCO bilo je slično rasčitano za fiksirane rezove (rasšireni podaci, ris. 1d, e; P> 0,05). t-hCO2 su lako uočljivi, a volumetrijska mjerenja t-hCO2 bila su slična onima izračunatim za fiksne presjeke (prošireni podaci, slika 1d, e; P > 0,05).很容易观察到t-hCO, 并且t-hCO的体积测量值与从固定切片计算的测量值相似 (扩展数据图1d、e；P > 0,05；)很容易观察到t-hCO, 并且t-hCO t-hCO se lako nagledao, obimno mjerenje t-hCO bilo je slično rasčitano za fiksirane rezove (rasšireni podaci, ris. 1d, e; P> 0,05). t-hCO2 je lako uočen, a volumetrijska mjerenja t-hCO2 bila su slična onima izračunatim za fiksne presjeke (prošireni podaci, slika 1d, e; P > 0,05).Odredili smo t-hCO kod 81% transplantiranih životinja otprilike 2 mjeseca nakon transplantacije (n = 72 životinje; hCO iz 10 hiPS ćelijskih linija; hiPS ćelijske linije u Dodatnoj tabeli 1). Od njih, 87% se nalazilo u moždanoj kori (Slika 1c). Izvođenjem serijskih MRI skeniranja u više vremenskih tačaka kod istog transplantiranog pacova, otkrili smo devetostruko povećanje volumena t-hCO unutar 3 mjeseca (Slika 1d i prošireni podaci, Slika 1f). Transplantirane životinje imale su visoku stopu preživljavanja (74%) 12 mjeseci nakon transplantacije (prošireni podaci, Slika 1g i Dodatna tabela 2), a nisu pronađena očigledna motorička ili memorijska oštećenja, glioza ili elektroencefalogram (EEG). Podaci (Slika 1g i dodatna tabela 2). 1h–m i 3e).
a, Shematski prikaz eksperimentalnog dizajna. hCO2 dobijen iz hiPS ćelija transplantiran je u S1 novorođenih golih pacova 30-60 dana diferencijacije. b, T2-ponderisane koronalne i horizontalne MRI slike koje prikazuju t-hCO2 u S1 2 mjeseca nakon transplantacije. Mjerna skala, 2 mm. c, Kvantifikacija stopa uspjeha presađivanja prikazana za svaku hiPS ćelijsku liniju (n = 108, brojevi unutar stupaca označavaju količinu t-hCO2 po hIPS ćelijskoj liniji) i kortikalnu ili subkortikalnu lokaciju (n = 88). d, MRI slika koronarne arterije (lijevo; mjerilo, 3 mm) i odgovarajuća 3D volumetrijska rekonstrukcija (mjera, 3 mm) koja pokazuje povećanje t-hCO2 tokom 3 mjeseca. e, Pregled t-hCO2 obrazaca u moždanoj kori pacova. Mjerna skala, 1 mm. f, Reprezentativne imunocitohemijske slike t-hCO prikazane od gore lijevo na desno (tokom diferencijacije): PPP1R17 (4 mjeseca star), NeuN (8 mjeseci star), SOX9 i GFAP (8 mjeseci star), PDGFRα; (8 mjeseci), MAP2 (8 mjeseci) i IBA1 (8 mjeseci). Mjerna traka, 20 µm. Koekspresija HNA ukazuje na ćelije ljudskog porijekla. g, snRNA-seq: Snimanje redukcije dimenzionalnosti ujedinjene mnogostrukosti i projekcije (UMAP) svih visokokvalitetnih t-hCO jezgara nakon Seurat integracije (n=3 t-hCO uzorka, n=2 hiPS ćelijske linije). Astrociti, ćelije astrocitne linije; cyc prog, cirkulirajući progenitori; GluN DL, duboki glutamatergični neuroni; GluN DL/SP, duboki i sublamelarni glutamatergični neuroni; GluN UL, glutamatergični neuroni gornjeg sloja; oligodendrociti, oligodendrociti; OPC, progenitorske ćelije oligodendrocita; RELN, reelin neuroni. h, Analiza obogaćivanja termina gena Ontology (GO) značajno pojačano izraženih gena (prilagođeno P < 0,05, promjena struka > 2, eksprimiranih u najmanje 10% jezgara) u t-hCO glutamatergičkim neuronima u poređenju sa hCO glutamatergičkim neuronima. h, Analiza obogaćivanja termina gena Ontology (GO) značajno pojačano izraženih gena (prilagođeno P < 0,05, promjena struka > 2, eksprimiranih u najmanje 10% jezgara) u t-hCO glutamatergičkim neuronima u poređenju sa hCO glutamatergičkim neuronima. h, Analiza pojmova genske ontologije (GO) za genove sa značajnom aktivacijom (korigovani P <0,05, kratnost izmjene > 2, ekspresija krajnje mjere u 10% jezgra) u glutamaterskim neuronama t-hCO u odnosu na glutamaterične neuroname hCO. h, Analiza obogaćivanja termina genske ontologije (GO) za gene sa značajnom aktivacijom (prilagođeno P <0,05, promjena struka >2, ekspresija u najmanje 10% jezgara) u t-hCO glutamatergičkim neuronima u poređenju sa hCO glutamatergičkim neuronima. h，与hCO 谷氨酸能神经元相比，t-hCO 谷氨酸能神经元中基因显着上调（调整（调整0,05, 倍数变化> 2，在至少10% 的细胞核中表达）的基因本体论(GO) 术语富雐ゆ寭富雐 h ， 与 hco 谷氨酸 能 元 相比 ， t-hco 谷氨酸 能 神经 元 基因 显着 上调 （05 ，0 .变化 变化> 2 ， 至少 10% 的 核中 表达） 基因 基因 基因 的 的 的 的 的的 的 的 的本体论(GO) 术语富集分析。 h, geny se značajno aktivirao (korigovani P <0,05, kratka izmena> 2, ekspresuje se u krajnjoj meri u 10% jezgre) u glutamaterskim neuronama t-hCO u odnosu na glutamatergičke neuroname hCO Ontološka (GO) analiza termina obogašenja. h, geni su bili značajno pojačano regulisani (korigovani P < 0,05, promjena struka > 2, eksprimirani u najmanje 10% jezgara) u t-hCO glutamatergičkim neuronima u poređenju sa hCO glutamatergičkim neuronima. Ontološka (GO) analiza termina obogaćivanja.Isprekidana linija označava vrijednost aq od 0,05. i, UMAP snimanje tipova GluN ćelija u t-hCO korištenjem transfera oznaka iz referentnog skupa podataka 22 snRNA-seq motornog korteksa odraslih. CT — kortikotalamičke ćelije, ET — ekstracerebralne ćelije, IT — interne telencefalne ćelije, NP — bliska projekcija.
Zatim smo procijenili citoarhitekturu i ukupni ćelijski sastav t-hCO. Bojenje antitijelima endotelnih ćelija pacova otkrilo je vaskularizaciju sa t-hCO, dok je bojenje IBA1 otkrilo prisustvo mikroglije pacova u cijelom graftu (Slika 1f i prošireni podaci, Slika 3c,d). Imunobojenje je otkrilo ćelije pozitivne na ljudski nuklearni antigen (HNA) koje koeksprimiraju PPP1R17 (kortikalni progenitori), NeuN (neuroni), SOX9 i GFAP (glijalne ćelije) ili PDGFRα (oligodendrocitne progenitore) (Slika 1f). Da bismo proučili ćelijski sastav t-hCO pri rezoluciji pojedinačnih ćelija, izvršili smo sekvenciranje RNK jedne jezgre (snRNA-seq) nakon približno 8 mjeseci diferencijacije. Filtracija u skupnom stanju i uklanjanje jezgara pacova dali su 21.500 visokokvalitetnih mapa ljudskih mononukleara (Slika 1g i prošireni podaci, Slika 4a,b). Obrasci ekspresije tipičnih markera ćelijskog tipa identificirali su klastere glavnih klasa kortikalnih ćelija, uključujući duboke i površinske glutamatergičke neurone, cirkulirajuće progenitore, oligodendrocite i astrocitnu liniju (Slika 1g, prošireni podaci, Slika 4c i Dodatna tabela 3). Imunobojenje za SATB2 i CTIP2 pokazalo je da uprkos prisustvu kortikalnih podtipova, t-hCO nije pokazao jasnu anatomsku stratifikaciju (prošireni podaci, Slika 3a). snRNA-seq hCO sa usklađenim stadijem proizveo je uglavnom slične klase ćelija, uz nekoliko izuzetaka, uključujući odsustvo oligodendrocita i prisustvo GABAergičkih neurona, što može odražavati prethodno prijavljene povoljne in vitro uslove za lateralne progenitorske ćelije15 (prošireni podaci, Slika 4f-i i Dodatna tabela 4). Analiza diferencijalne genske ekspresije otkrila je značajne razlike u glutamatergičkim neuronima između t-hCO i hCO (Dodatna tabela 5), ​​uključujući aktivaciju skupova gena povezanih s neuronskim sazrijevanjem kao što su sinaptička signalizacija, dendritička lokalizacija i aktivnost naponski kontroliranih kanala (Slika 1h i Dodatna tabela 5, tabela 6). Shodno tome, kortikalni glutamatergički t-hCO neuroni pokazali su ubrzano transkripcijsko sazrijevanje.
Kako bismo razjasnili da li su ove transkripcijske promjene u t-hCO povezane s morfološkim razlikama između hCO in vitro i t-hCO in vivo, rekonstruirali smo stadijno usklađene hCO i hCO ispunjene biocitinom u akutnim presjecima nakon 7-8 mjeseci diferencijacije. hCO neuroni (Slika 2a). t-hCO neuroni su bili značajno veći, imali su 1,5 puta veći promjer some, dvostruko više dendrita i ukupno šesterostruko povećanje ukupne dužine dendrita u usporedbi s in vitro hCO (Slika 2b). Osim toga, uočili smo značajno veću gustoću dendritskih bodlji u t-hCO neuronima nego u hCO neuronima (Slika 2c). To sugerira da t-hCO neuroni prolaze kroz opsežno dendritično izduživanje i grananje, što, u kombinaciji s kontinuiranom proliferacijom stanica, može doprinijeti intenzivnom rastu t-hCO nakon transplantacije (Slika 1d i Prošireni podaci Sl. 1f). To nas je potaknulo da istražimo elektrofiziološka svojstva. Kapacitet membrane bio je osam puta veći (prošireni podaci, slika 8d), membranski potencijal u stanju mirovanja bio je hiperpolarizovaniji (približno 20 mV), a ubrizgavanje struje izazvalo je veću maksimalnu brzinu ekscitacije u t-hCO neuronima nego u hCO neuronima. in vitro (slika 2d), e), što je u skladu s većim i složenijim morfološkim karakteristikama t-hCO. Osim toga, učestalost spontanih ekscitacijskih postsinaptičkih strujnih događaja (EPSC) bila je značajno veća u t-hCO neuronima (slika 2f), što sugerira da je povećana gustoća dendritičnih bodlji uočena u t-hCO neuronima povezana s funkcionalnom ekscitabilnošću. seksualna sinapsa. Potvrdili smo nezreli karakter hCO neurona in vitro snimanjem obilježenih glutamatergičnih neurona (prošireni podaci, slike 6a-c).
a, 3D rekonstrukcija biocitinom ispunjenih hCO i t-hCO neurona nakon 8 mjeseci diferencijacije. b, Kvantifikacija morfoloških karakteristika (n = 8 hCO neurona, n = 6 t-hCO neurona; **P = 0,0084, *P = 0,0179 i ***P < 0,0001). b, Kvantifikacija morfoloških karakteristika (n = 8 hCO neurona, n = 6 t-hCO neurona; **P = 0,0084, *P = 0,0179 i ***P < 0,0001). b, količinska ocenka morfoloških priznakova (n = 8 neuronova hCO, n = 6 neuronova t-hCO; ** P = 0,0084, * P = 0,0179 i *** P <0,0001). b, kvantifikacija morfoloških karakteristika (n=8 hCO neurona, n=6 t-hCO neurona; **P=0,0084, *P=0,0179 i ***P<0,0001). b，形态学特征的量化 (n = 8 个hCO 神经元，n = 6 个t-hCO 神经元；**P = 0,0084，0*P790) 0,0001）. b，形态学特征的量化 (n = 8 个hCO 神经元，n = 6 个t-hCO 神经元；**P = 0,0084，0*P790) 0,0001）. b, količinska ocenka morfoloških priznakova (n = 8 neuronova hCO, n = 6 neuronova t-hCO; ** P = 0,0084, * P = 0,0179 i *** P <0,0001). b, kvantifikacija morfoloških karakteristika (n=8 hCO neurona, n=6 t-hCO neurona; **P=0,0084, *P=0,0179 i ***P<0,0001).c, 3D rekonstrukcija dendritičnih grana hCO i t-hCO nakon 8 mjeseci diferencijacije. Crvene zvjezdice označavaju pretpostavljene dendritične bodlje. Kvantifikacija gustoće dendritičnih bodlji (n = 8 hCO neurona, n = 6 t-hCO neurona; **P = 0,0092). d, Kvantifikacija mirujućeg membranskog potencijala (n = 25 hCO neurona, n = 16 t-hCO neurona; ***P < 0,0001). d, Kvantifikacija mirujućeg membranskog potencijala (n = 25 hCO neurona, n = 16 t-hCO neurona; ***P < 0,0001). d, količinska ocenka membranskog potencijala (n = 25 neuronova hCO, n = 16 neuronova t-hCO; *** P <0,0001). d, kvantifikacija membranskog potencijala u mirovanju (n = 25 hCO neurona, n = 16 t-hCO neurona; ***P < 0,0001). d，静息膜电位的量化 (n = 25 hCO 神经元, n = 16 t-hCO 神经元；***P < 0,0001）。 d，静息膜电位的量化 (n = 25 hCO 神经元, n = 16 t-hCO 神经元；***P < 0,0001）。 d, količinska ocenka membranskog potencijala (n = 25 neuronova hCO, n = 16 neuronova t-hCO; *** P <0,0001). d, kvantifikacija membranskog potencijala u mirovanju (n = 25 hCO neurona, n = 16 t-hCO neurona; ***P < 0,0001). e, Ponavljano aktiviranje akcionog potencijala u hCO i t-hCO izazvano povećanjem injekcija struje i kvantifikacija maksimalne brzine aktiviranja (n = 25 hCO neurona, n = 16 t-hCO neurona; ***P < 0,0001). e, Ponavljano aktiviranje akcionog potencijala u hCO i t-hCO izazvano povećanjem injekcija struje i kvantifikacija maksimalne brzine aktiviranja (n = 25 hCO neurona, n = 16 t-hCO neurona; ***P < 0,0001). e, ponovno aktiviranje potencijala djelovanja u hCO i t-hCO, izvanredno povećanje toka, i količinska ocjena maksimalne brzine buđenja (n = 25 neuronova hCO, n = 16 neuronova t-hCO; *** P <0,0001). e, ponovno aktiviranje akcionog potencijala u hCO i t-hCO izazvano povećanjem struje i kvantifikacijom maksimalne brzine aktiviranja (n = 25 hCO neurona, n = 16 t-hCO neurona; *** P < 0,0001). e，通过增加电流注入诱导的hCO 和t-hCO 重复动作电位放电，以及最大缚电野，以及最大缚电玏个hCO 神经元，n = 16 个t-hCO 神经元；***P <0,0001）。 E, 通过 增加 电流 注入 的 的 hco 和 t-hco 重复 电位 放电, 以及 最 大 ， 以及 最 大 ， n = 5 的 2个 hco 神经 ， n = 16 个 t-hco 神经 ； *** p <0,0001） 。 e, ponavljajuće povećanje potencijala djelovanja hCO i t-hCO, izvanredno povećanje vrijednosti toka i količinska ocjena maksimalne brzine buđenja (n = 25 neuronova hCO, n = 16 neuronova t-hCO; *** P <0,0001). e, ponovljeno aktiviranje akcionih potencijala hCO i t-hCO izazvanih povećanim dovodom struje i kvantifikacija maksimalne brzine aktiviranja (n = 25 hCO neurona, n = 16 t-hCO neurona; *** P < 0,0001). f, Spontane EPSC (sEPSC) u hCO i t-hCO neuronima nakon 8 mjeseci diferencijacije i kvantifikacija učestalosti sinaptičkih događaja (n = 25 hCO neurona, n = 17 t-hCO neurona; ***P < 0,0001). f, Spontane EPSC (sEPSC) u hCO i t-hCO neuronima nakon 8 mjeseci diferencijacije i kvantifikacija učestalosti sinaptičkih događaja (n = 25 hCO neurona, n = 17 t-hCO neurona; ***P < 0,0001). f, spontani EPSC (sEPSC) u neuronima hCO i t-hCO kroz 8 mjeseci diferencijacije i količinska procjena frekvencije sinaptičkih događaja (n = 25 neuronova hCO, n = 17 neurona t-hCO; *** P <0,0001) . f, Spontane EPSC (sEPSC) u hCO i t-hCO neuronima nakon 8 mjeseci diferencijacije i kvantifikacija stope sinaptičkih događaja (n=25 hCO neurona, n=17 t-hCO neurona; ***P<0,0001). f，分化8 个月时hCO 和t-hCO 神经元中的自发性EPSCs (sEPSCs)，以及突触事件频率的，以及突触事件频率的 ，，分化s神经元，n = 17 t-hCO 神经元；***P <0,0001）. f，分化8 个月时hCO 和t-hCO 神经元中的自发性EPSCs (sEPSCs)，以及突触事件频率的，以及突触事件频率的，以及突触事件频率的，神率的量匼 (n = 25 hCO 神率的量匼 (n = 25hCO P < 0,0001) . f, spontani EPSC (sEPSC) u neurona hCO i t-hCO kroz 8 mjeseci diferencijacije i količinsku procjenu frekvencije sinaptičkih događaja (n = 25 neuronova hCO, n = 17 neurona t-hCO; *** P <0,0001). f, Spontane EPSC (sEPSC) u hCO i t-hCO neuronima nakon 8 mjeseci diferencijacije i kvantifikacija stope sinaptičkih događaja (n = 25 hCO neurona, n = 17 t-hCO neurona; *** P<0,0001).Za bf, hCO i t-hCO u liniji 1208-2 uzeti su iz iste serije za diferencijaciju koja se održava paralelno. g, Analiza obogaćivanja genskog seta (jednostrani Fisherov egzaktni test) gena značajno pojačano reguliranih (prilagođeno P < 0,05, promjena struka > 2, eksprimiranih u najmanje 10% jezgara) u t-hCO glutamatergičkim neuronima u poređenju sa hCO glutamatergičkim neuronima sa genskim setovima i ranog odgovora (ERG) i kasnog odgovora (LRG) zavisnih od aktivnosti identifikovanih iz in vivo studije na miševima16 i ljudski specifičnim LRG-ovima iz in vitro neurona17. g, Analiza obogaćivanja genskog seta (jednostrani Fisherov egzaktni test) gena značajno pojačano reguliranih (prilagođeno P < 0,05, promjena struka > 2, eksprimiranih u najmanje 10% jezgara) u t-hCO glutamatergičkim neuronima u poređenju sa hCO glutamatergičkim neuronima sa genskim setovima i ranog odgovora (ERG) i kasnog odgovora (LRG) zavisnih od aktivnosti identifikovanih iz in vivo studije na miševima16 i ljudski specifičnim LRG-ovima iz in vitro neurona17. g, analiza obogašćenja nabora gena (odnosno točni kriterijum Fišera) gena sa značajnom aktivnošću (korigovani P <0,05, kratnost izmene > 2, ekspresija po manjoj meri u 10% jezgra) u glutamaterijskim neuronah t-hCO u skladu sa glutamaterijskim neuronima t-hCO u skladu sa glutamaterijskim genima i genima kao što je hCO nego (L ranljivim genima, hRGG) zavisne od aktivnosti, identifikovane u istraživanju na mišama in vivo16, i specifičnih za ljude LRG iz neurona in vitro17. g, analiza obogaćivanja genskog seta (jednostrani Fisherov egzaktni test) gena sa značajnom aktivacijom (korigovano P <0,05, promjena struka >2, ekspresija u najmanje 10% jezgara) u t-hCO glutamatergičkim neuronima u poređenju sa hCO glutamatergičkim neuronskim setovima i ranih (ERG) i kasnih (LRG) gena zavisnih od aktivnosti identifikovanih kod in vivo miševa16 i ljudski-specifičnih LRG-ova iz neurona in vitro17. g，t-hCO谷氨酸能神经元与hCO谷氨酸能神经元相比，t -hCO谷氨酸能神经元显着上调 (调整后P<0,05，倍数变化) >2，在至少10%的细胞核中表达）的基因集富集分析（单侧F isher精确检验）从体内小鼠研究中鉴定的早期反应(ERG)和晚期反应(LRG) 活性依赖性基因的基因组16 和体外神经元17 中的人类特异む g ， t-hco 谷氨酸 神经 元 与 hco 谷氨酸 神经 元 相比 ， t-hco 谷氨酸 神经 腃 与经 腃p <0,05 ， 倍数> 2 ， 至少 至少 10% 的 细胞 核中 表达） 的 集富集 分羮 （卉 （卉羆羕 （卉体内 小鼠 研究 中 的 早期 反应 反应 反应 和 晚期 反应 反应 (lrg) 活性 基因 的 基 基 16神经元 神经元 17 中 中 17 中 17 的人类特异性LRG。 g, glutamatergički neuroni t-hCO su značajno aktivirani u odnosu na glutamatergičke neuroname hCO (korigovani P<0,05, kratnost izmene> 2, ne manje od 10% analiza obogašćenja nabora gena (odnosno-točni test Fišera) ranneg identifikatora (ERG) i zavisne aktivnosti gena, ispitivanja LRG myšah in vivo16 i neuronah in vitro17, specifični za čovjeka. g, t-hCO glutamatergični neuroni su bili značajno pojačano regulirani u poređenju sa hCO glutamatergičnim neuronima (korigovano P <0,05, promjena struka >2, najmanje 10% Analiza obogaćivanja gena ranog odgovora (ERG) i kasnog odgovora (jednostrani Fisherov egzaktni test) geni zavisni od aktivnosti odgovora (LRG) identifikovani kod in vivo miševa16 i in vitro neurona.17 LRG specifični za čovjeka.Isprekidana linija označava Bonferronijevu korigovanu P vrijednost od 0,05. h-1, ekspresija GluN gena (pseudo-paket i skaliranje svakog gena) bila je značajno povišena u snRNA-seq replikama LRG gena u t-hCO glutamatergičkim neuronima. i, imunobojenje koje pokazuje ekspresiju SCG2 u t-hCO (gornji) i hCO (donji) neuronima. Bijele strelice pokazuju na SCG2+ ćelije. Mjerna traka, 25 µm. Podaci su izraženi kao srednja vrijednost ± standardna devijacija.
Na osnovu povećane aktivnosti t-hCO uočene u ex vivo presjecima, snRNA-seq je otkrio pojačanu regulaciju genskih transkripata zavisnu od aktivnosti u t-hCO u poređenju sa hCO in vitro. Glutamatergični t-hCO neuroni su eksprimirali više nivoe gena koji regulišu aktivnost kasnog odgovora (Sl. 2g,h), što je pronađeno u prethodnim studijama na mišjim i ljudskim neuronima16,17. Na primjer, BDNF18, SCG2 i OSTN, gen koji reguliše aktivnost specifičan za primate, pokazali su povećanu ekspresiju u t-hCO neuronima u poređenju sa hCO neuronima (Sl. 2g-i). Dakle, t-hCO neuroni su pokazali poboljšane karakteristike sazrijevanja u poređenju sa hCO neuronima prema transkripcijskim, morfološkim i funkcionalnim analizama.
Kako bismo dalje procijenili povezanost sazrijevanja t-hCO s razvojem ljudskog mozga, izvršili smo transkriptomska poređenja tipova fetalnih i odraslih kortikalnih ćelija19,20 i odraslih21,22, kao i opsežne podatke o ekspresiji kortikalnih gena23 tokom razvoja (prošireni podaci, slika 5). U odnosu na prethodni rad24, globalni status sazrijevanja hCO i t-hCO transkriptoma u 7-8 mjeseci diferencijacije uglavnom je u skladu s vremenom razvoja in vivo i najviše je ekvivalentan kasnom fetalnom životu (Prošireni podaci, slika 5a). Značajno je da smo uočili povećanu zrelost transkriptoma u t-hCO u poređenju s hCO odgovarajuće dobi, kao i aktivaciju transkriptoma povezanu sa sinaptogenezom, astrogenezom i mijelinizacijom (prošireni podaci, slike 5b-d). Na ćelijskom nivou, pronašli smo dokaze o tanjem podtipu korteksa u t-hCO, s klasterima glutamatergičnih neurona koji se preklapaju s odraslim L2/3, L5 i L6 neuronskim podtipovima (slika 1i). Nasuprot tome, preklapanje klastera između glutamatergičnih t-hCO neurona i fetalnih kortikalnih neurona bilo je ograničenije u sredini trudnoće (prošireni podaci, Slika 5e-j). Da bismo utvrdili da li su t-hCO neuroni funkcionalno slični ljudskim postnatalnim neokortikalnim neuronima, izvršili smo elektrofiziološka snimanja i anatomske rekonstrukcije ljudskih L2/3 piramidalnih neurona u oštrim presjecima ljudskog postnatalnog korteksa (prošireni podaci, Slika 7a). Elektrofiziološka svojstva L2/3 piramidalnih neurona bila su slična svojstvima t-hCO piramidalnih neurona (prošireni podaci, Slika 7e). Morfološki, L2/3 neuroni iz postnatalnih ljudskih uzoraka bili su sličniji t-hCO nego hCO, iako su L2/3 ćelije bile duže, sadržavale su više grana ukupno i imale su veću gustoću kičme (Slika 3g i prošireni podaci, Slika 7b-). G).
a, transplantacija hCO proizvedenog kontrolnim i TS hiPS ćelijskim linijama u neonatalne pacove. b, 3D rekonstrukcija t-hCO neurona ispunjenih biocitinom nakon 8 mjeseci diferencijacije. c, kvantifikacija srednje dužine dendrita (n = 19 kontrolnih neurona, n = 21 TS neuron; **P = 0,0041). d, 3D rekonstruisane dendritične grane iz kontrolne i TS t-hCO nakon 8 mjeseci diferencijacije i kvantifikacija gustine dendritičnih spina (n = 16 kontrolnih neurona, n = 21 TS neuron, ***P < 0,0001). d, 3D rekonstruisane dendritične grane iz kontrolne i TS t-hCO nakon 8 mjeseci diferencijacije i kvantifikacija gustine dendritičnih spina (n = 16 kontrolnih neurona, n = 21 TS neuron, ***P < 0,0001). d, 3D-rekonstrukcija dendritnih vena iz kontrole i TS t-hCO kroz 8 mjeseci diferencijacije i količinske procjene plotnosti dendritnih šipova (n = 16 kontrolnih neuronova, n = 21 TS neuronova, *** P <0,0001). d, 3D rekonstrukcija dendritičnih grana iz kontrolne i t-hCO TS grupe nakon 8 mjeseci diferencijacije i kvantifikacija gustoće dendritičnih spina (n=16 kontrolnih neurona, n=21 TS neuron, ***P<0,0001). d，分化8 个月时对照和TS t-hCO 的3D 重建树突分支，以及树突棘密度的量化 = n16，个对照神经元，n = 21 个TS 神经元，***P < 0,0001）。 d ， 分化 8 个 时 对照 和 ts t-hco 的 3d 重建 分支 分支 以 及 树突棘 密匪 ️ = n16 量匪神经 元 ， n = 21 个 ts 神经 ， *** p <0,0001 ）。 d, 3D-rekonstrukcija kontrole dendritnih vena i TS t-hCO kroz 8 mjeseci diferencijacije i kvalitativne ocjene dendritnih šipova (n = 16 kontrolnih neurona, n = 21 TS neuronova, *** P <0,0001). d, 3D rekonstrukcija kontrolnih dendritičnih grana i TS t-hCO nakon 8 mjeseci diferencijacije i kvantifikacija gustoće dendritičnih spina (n=16 kontrolnih neurona, n=21 TS neuron, ***P<0,0001).Crvene zvjezdice označavaju pretpostavljene dendritične bodlje. e, spontane EPSC u kontrolnim i TS t-hCO neuronima nakon 8 mjeseci diferencijacije. f, kumulativni dijagram frekvencije i kvantifikacija frekvencije i amplitude sinaptičkih događaja (n=32 kontrolna neurona, n=26 TS neurona; **P=0,0076 i P=0,8102). g, Scholl analiza TS i kontrolnih neurona u hCO i t-hCO. Isprekidane linije prikazuju ljudske L2/3 postnatalne piramidalne neurone radi poređenja (n = 24 kontrolna t-hCO neurona, n = 21 TS t-hCO neuron, n = 8 kontrolnih hCO neurona i n = 7 TS hCO neurona). Podaci su izraženi kao srednja vrijednost ± standardna devijacija.
Sposobnost t-hCO da replicira morfološke i funkcionalne karakteristike neurona ljudskog korteksa na visokom nivou potaknula nas je da istražimo da li se t-hCO može koristiti za detekciju fenotipova bolesti. Fokusirali smo se na TS, teški neurološki razvojni poremećaj uzrokovan mutacijama dobitka funkcije u genu koji kodira CaV1.2, koji inicira transkripciju gena zavisnu od aktivnosti u neuronima. Dobili smo hCO od tri pacijenta sa TS-om koji nose najčešću supstituciju (p.G406R) i tri kontrolne grupe (slika 3a). Nakon transplantacije, otkrili smo da je dendritična morfologija promijenjena u TS neuronima u poređenju s kontrolnom grupom (slika 3b i prošireni podaci, slika 8a,b), s dvostrukim povećanjem broja primarnih dendrita i ukupnim povećanjem srednjeg i ukupnog smanjenja dužine dendrita (slika 3c i prošireni podaci, slika 8c). Ovo je bilo povezano s povećanom gustoćom bodlji i povećanom učestalošću spontanih EPSC-ova u TS-u u poređenju s kontrolnim neuronima (slika 3d-f i prošireni podaci, slika 8g). Daljnja analiza otkrila je obrasce abnormalnog dendritičnog grananja u t-hCO TS u poređenju s kontrolama, ali ne i u in vitro TS hCO u sličnoj fazi diferencijacije (Sl. 3g). Ovo je u skladu s našim prethodnim izvještajima o smanjenju dendritičnih stanica ovisnom o aktivnosti u TS i naglašava sposobnost ove transplantacijske platforme da detektuje fenotipove bolesti in vivo.
Zatim smo pitali u kojoj mjeri su t-hCO ćelije funkcionalno integrirane u S1 pacova. S1 kod glodara prima snažne sinaptičke impulse iz ipsilateralnih ventralnih bazalnih i posteriornih talamičkih jezgara, kao i ipsilateralnog motornog i sekundarnog somatosenzornog korteksa, te kontralateralnog S1 (Slika 4a). Da bismo obnovili obrazac inervacije, inficirali smo hCO virusom bjesnoće-dG-GFP/AAV-G i transplantirali hCO u S1 pacova 3 dana kasnije. Uočili smo gustu ekspresiju GFP-a u neuronima ipsilateralnog S1 i ventralnih bazalnih ganglija 7-14 dana nakon transplantacije (Slika 4b, c). Osim toga, bojenje talamičkog markera netrin G1 antitijelima otkrilo je prisustvo talamičkih završetaka u t-hCO (Slika 4d, e). Da bismo procijenili da li ove aferentne projekcije mogu izazvati sinaptičke odgovore u t-hCO ćelijama, izvršili smo snimanje cijelih ćelija iz ljudskih ćelija u oštrim presjecima talamokortikalnog sloja. Električna stimulacija S1 pacova, unutrašnje kapsule, bijele mase, vlakana u blizini t-hCO ili optogenetska aktivacija talamičkih završetaka koji eksprimiraju opsin u t-hCO inducirala je kratkolatentne EPSC-ove u t-hCO neuronima izloženim antagonistu AMPA receptora NBQX. (Slika 4f, g i prošireni podaci, Slika 9a-g). Ovi podaci pokazuju da je t-hCO anatomski integriran u mozak pacova i da ga može aktivirati tkivo domaćina pacova.
a, Shematski dijagram eksperimenta praćenja bjesnoće. b, GFP i ljudska ekspresija STEM121 između t-hCO i moždane kore pacova (gornji panel). Također je prikazana ekspresija GFP-a u ipsilateralnom ventralnom bazalnom jezgru (VB) pacova (dolje lijevo) i ipsilateralnom S1 (dolje desno). Mjerna traka, 50 µm. Crveni kvadrati predstavljaju područja mozga gdje su snimljene slike. c, kvantifikacija ćelija koje eksprimiraju GFP (n = 4 pacova). d, e — Netrin G1+ talamički terminali u t-hCO. d prikazuje koronalni presjek koji sadrži t-hCO i VB jezgre. Mjerna traka, 2 mm. e prikazuje ekspresiju Netrin G1 i STEM121 u t-hCO (lijevo) i VB (desno) neuronima. Mjerna traka, 50 µm. Narandžasta isprekidana linija označava granicu t-hCO. f, g, Trenutni tragovi t-hCO neurona nakon električne stimulacije kod S1 pacova (f) ili unutrašnje kapsule (g), sa (ljubičasto) ili bez (crno) NBQX (lijevo). Amplitude EPSC sa i bez NBQX (n = 6 S1 neurona, *P = 0,0119; i n = 6 neurona unutrašnje kapsule, **P = 0,0022) (sredina). Procenat t-hCO neurona koji pokazuju EPSC kao odgovor na električnu stimulaciju S1 pacova (f) ili unutrašnje kapsule (g) (desno). aCSF, vještačka cerebrospinalna tečnost. h, shematski dijagram 2P eksperimenta snimanja (lijevo). Ekspresija GCaMP6s u t-hCO (sredina). Mjerna traka, 100 µm. Vremenski interval fluorescencije GCaMP6s (desno). i, Z-rezultat spontane aktivnosti fluorescencije. j, shematski prikaz stimulacije brkova. k, z-vrijednost 2P fluorescentnih trajektorija u jednom ispitivanju, poravnata s odstupanjem brkova u vremenu nula (isprekidana linija) u primjernim ćelijama. l, populacijski prosječni z-vrijednosti odgovora svih ćelija poravnata s odstupanjem brkova u vremenu nula (isprekidana linija) (crvena) ili nasumično generirane vremenske oznake (sivo). m. Shematski dijagram eksperimenta optičkog označavanja. n, Sirove krivulje napona iz primjerne t-hCO ćelije tokom stimulacije plavim laserom ili otklona brkova. Crvene strelice označavaju prve šiljke uzrokovane svjetlošću (gore) ili uzrokovane otklonom brkova (dolje). Sivo sjenčanje označava periode otklona brkova. o, Vršni oblici svjetlosnih valova i odgovori otklona brkova. p, šiljci jednog pokušaja, poravnati s odstupanjem brkova u ćelijama primjera. 0 označava odstupanje brkova (isprekidana linija). q, populacijski prosječna brzina okidanja z-vrijednosti za sve fotosenzitivne ćelije, poravnata s odstupanjem brkova u vremenu nula (isprekidana linija) (crvena) ili nasumično generirane vremenske oznake (sivo). r, Udio fotosenzitivnih jedinica značajno moduliranih devijacijom brkova (n = 3 pacova) (lijevo). Vršna latencija z-skora (n = 3 pacova; n = 5 (svijetlozelena), n = 4 (tamnozelena) i n = 4 (cijan) jedinice modulacije devijacije brkova po pacovu) (desno). Podaci su izraženi kao srednja vrijednost ± standardna devijacija
Zatim smo se pitali da li se t-hCO može aktivirati senzornim stimulusima in vivo. Transplantirali smo hCO koji eksprimira genetski kodirane indikatore kalcija GCaMP6 u S1 pacove. Nakon 150 dana, izvršili smo vlaknastu fotometriju ili dvofotonsko snimanje kalcija (Slika 4h i prošireni podaci, Slika 10a). Otkrili smo da t-hCO ćelije pokazuju sinhronizovanu ritmičku aktivnost (Slika 4i, Prošireni podaci, Slika 10b i Dodatni video 1). Da bismo okarakterisali vršnu aktivnost t-hCO, izvršili smo ekstracelularne elektrofiziološke snimke kod anesteziranih transplantiranih pacova (prošireni podaci, Slika 10c-f). Generisali smo stereotaksičke koordinate iz MRI slika; stoga, ove snimljene jedinice predstavljaju pretpostavljene ljudske neurone, iako sama elektrofiziologija ne dozvoljava određivanje vrste porijekla. Posmatrali smo sinhronizovane nalete aktivnosti (prošireni podaci, Slika 10d). Naleti su trajali oko 460 ms i bili su odvojeni periodima tišine od oko 2 s (prošireni podaci, Slika 10d, e). Pojedinačne jedinice su u prosjeku ispalile oko tri metka po rafalu, što je približno 73% registrovanih jedinica po rafalu. Aktivnosti pojedinačnih jedinica bile su visoko korelirane, a te korelacije su bile veće od onih kod jedinica identifikovanih kod nevakcinisanih životinja snimljenih pod istim uslovima (prošireni podaci, Slika 10f). Da bismo dalje karakterizirali odgovore šiljaka identifikovanih neurona ljudskog porijekla, izveli smo eksperimente svjetlosnog označavanja na anesteziranim pacovima kojima je transplantiran hCO koji eksprimira svjetlosno osjetljivi kationski kanal rodopsin 2 (hChR2), putem kojeg t-hCO neuroni prepoznaju kratku latenciju (manje od 10 ms) kao odgovor na stimuluse plave svjetlosti (Slika 4m–o). t-hCO neuroni su pokazali nalete spontane aktivnosti na frekvencijama sličnim onima uočenim u snimanju kalcija, kao i elektrofiziološkim snimcima izvršenim u t-hCO u odsustvu svjetlosnog označavanja (prošireni podaci, Slika 10c-g). Nije uočena spontana aktivnost u odgovarajućim fazama hCO snimljenim in vitro. Da bismo procijenili da li se t-hCO može aktivirati senzornim stimulusima, nakratko smo skrenuli brkove pacova dalje od t-hCO (Sl. 4j,m i prošireni podaci, Sl. 10h,k). Prema prethodnim studijama8,10, podskup t-hCO ćelija pokazao je povećanu aktivnost kao odgovor na skretanje brkova, što nije uočeno kada su podaci upoređeni sa slučajnim vremenskim oznakama (Sl. 4k-q i prošireni podaci, Sl. 10h-q). Zaista, oko 54% opto-obilježenih pojedinačnih jedinica pokazalo je značajno povećanu stopu uzbuđenja nakon stimulacije brkova, dostižući vrhunac na oko 650 ms (Sl. 4r). Uzeti zajedno, ovi podaci sugeriraju da t-hCO prima odgovarajuće funkcionalne ulaze i da se može aktivirati stimulusima iz okoline.
Zatim smo istražili da li t-hCO može aktivirati sklopove kod pacova kako bi kontrolisali ponašanje. Prvo smo istražili da li se aksoni t-hCO neurona projektuju u okolna tkiva pacova. Inficirali smo hCO lentivirusom koji kodira hChR2 spojen sa EYFP (hChR2-EYFP). Nakon 110 dana, uočili smo ekspresiju EYFP u ipsilateralnim kortikalnim regijama, uključujući slušne, motorne i somatosenzorne kortekse, kao i u subkortikalnim regijama, uključujući striatum, hipokampus i talamus (Slika 5a). Da bismo procijenili da li ove eferentne projekcije mogu izazvati sinaptičke odgovore u ćelijama pacova, optički smo aktivirali t-hCO ćelije koje eksprimiraju hChR2-EYFP snimanjem ćelija moždane kore pacova u oštrim presjecima mozga. Aktivacija t-hCO aksona plavim svjetlom indukovala je EPSC-ove kratke latencije u neuronima piramidalne kore pacova, koji su blokirani pomoću NBQX (Slike 5b-g). Osim toga, ove reakcije bi mogle biti blokirane tetrodotoksinom (TTX) i obnovljene 4-aminopiridinom (4-AP), što ukazuje na to da su uzrokovane monosinaptičkim vezama (Sl. 5e).
a, Shematski dijagram praćenja aksona (lijevo). Ekspresija t-hCO EYFP (desno). Mjerna traka, 100 µm. A1, slušni korteks, ACC, prednji cingularni korteks, d. striatum, dorzalni striatum, HPC, hipokampus; Dijafragma, lateralni septum, mPFC, medijalni prefrontalni korteks, piri, piriformni korteks, v. striatum, ventralni striatum, VPM, ventropostomedijalno jezgro talamusa, VTA, ventralna tegmentalna regija. Crveni kvadrati predstavljaju područja mozga gdje su snimljene slike. b, Shematski dijagram eksperimenta stimulacije. c, d, Primjeri odgovora fotostruje indukovane plavom svjetlošću (gore) i napona (dolje) u ljudskim (c) EYFP+ t-hCO ili pacovskim (d) EYFP- ćelijama. e, f, Trenutni tragovi neurona pacova nakon stimulacije plavom svjetlošću t-hCO aksona sa TTX i 4-AR (zeleno), TTX (sivo) ili aCSF (crno) (e), sa (ljubičasto) ili bez (crno) ) ) NBQX (e). g, latencija odgovora izazvanih plavom svjetlošću u ćelijama pacova (n = 16 ćelija); horizontalne trake označavaju prosječnu latenciju (7,13 ms) (lijevo). Amplituda EPSC-ova izazvanih svjetlošću snimljenih sa ili bez NBQX-a (n = 7 ćelija; ***P < 0,0001) (sredina). Amplituda EPSC-ova izazvanih svjetlošću snimljenih sa ili bez NBQX-a (n = 7 ćelija; ***P < 0,0001) (sredina). Amplituda izzvanog svetom EPSC, registrovanih sa ili bez NBQX (n = 7 ćelija; ***P <0,0001) (u centru). Amplituda svjetlošću indukovanih EPSC-ova zabilježenih sa ili bez NBQX-a (n = 7 ćelija; ***P < 0,0001) (centar).使用或不使用NBQX 记录的光诱发EPSC 的振幅（n = 7 个细胞；***P < 0,0001）(キ）)使用或不使用NBQX 记录的光诱发EPSC 的振幅（n = 7 个细胞；***P < 0,0001）(キ）) Amplituda izzvanog svetom EPSC, registrovanih sa ili bez NBQX (n = 7 ćelija; ***P <0,0001) (u centru). Amplituda svjetlošću indukovanih EPSC-ova zabilježenih sa ili bez NBQX-a (n = 7 ćelija; ***P < 0,0001) (centar).Procenat ćelija pacova koje pokazuju EPSC-ove koji reaguju na plavo svjetlo (desno). h, Shematski dijagram zadatka ponašanja. d0, dan 0. i. Performanse životinja na 1. (lijevo) ili 15. (desno) dan treninga. Prosječan broj lizanja izvršenih 1. dana (lijevo) ili 15. dana (desno u sredini) (n = 150 pokušaja s plavim svjetlom, n = 150 pokušaja s crvenim svjetlom; ***P < 0,0001). Prosječan broj lizanja izvršenih 1. dana (lijevo) ili 15. dana (desno u sredini) (n = 150 pokušaja s plavim svjetlom, n = 150 pokušaja s crvenim svjetlom; ***P < 0,0001). Srednji broj oblizivanih, ispunjenih u 1. dan (slijed) ili 15. dan (u središnjoj spravi) (n = 150 ispitanih sa sinim svijetom, n = 150 ispitanih s crvenim svijetom; ***P <0,0001). Prosječan broj lizanja izvršenih 1. dana (lijevo) ili 15. dana (desno u sredini) (n = 150 pokušaja s plavim svjetlom, n = 150 pokušaja s crvenim svjetlom; ***P < 0,0001).第1 天（左）或第15 天 (右中)执行的平均舔次数 (n = 150 次蓝光试验, n = 15,0n次红光试验；***P < 0,0001）。第1 天（左）或第15 天 (右中)执行的平均舔次数 (n = 150 次蓝光试验, n = 15,0n次红光试验；***P < 0,001 Srednji broj oblizivanih, ispunjenih u 1. dan (slijed) ili 15. dan (u središnjoj spravi) (n = 150 ispitanih sa sinim svijetom, n = 150 ispitanih s crvenim svijetom; ***P <0,0001). Prosječan broj lizanja izvršenih 1. dana (lijevo) ili 15. dana (desno u sredini) (n = 150 pokušaja s plavim svjetlom, n = 150 pokušaja s crvenim svjetlom; ***P < 0,0001).Kumulativni lizanja za ispitivanja crvenog i plavog svjetla 1. dana (lijevo u sredini) ili 15. dana (desno). NS, nije značajno. j,k, Karakteristike ponašanja svih životinja kojima je transplantiran t-hCO eksprimirajući hChR2-EYFP (j) ili kontrolni fluorofor (k) 1. ili 15. dana (hChR2-EYFP: n = 9 pacova, ** P = 0,0049; kontrola: n = 9, P = 0,1497). l, Evolucija rezultata preferencija (n = 9 hChR2, n = 9 kontrola; **P < 0,001, ***P < 0,0001). l, Evolucija rezultata preferencija (n = 9 hChR2, n = 9 kontrola; **P < 0,001, ***P < 0,0001). l, evolucija pokazivača preferencija (n = 9 hChR2, n = 9 kontrolnih; **P <0,001, ***P <0,0001). l, Evolucija rezultata preferencija (n = 9 hChR2, n = 9 kontrola; **P < 0,001, ***P < 0,0001). l, 偏好评分的演变 (n = 9 hChR2, n = 9 对照；**P < 0,001,***P < 0,0001)。 l, 偏好评分的演变 (n = 9 hChR2, n = 9 对照；**P < 0,001,***P < 0,0001)。 l, Évolûciâ pokazatelej predpočteniâ (n = 9 hChR2, n = 9 kontrola; **P <0,001, ***P <0,0001). l, Evolucija rezultata preferencija (n = 9 hChR2, n = 9 kontrola; **P < 0,001, ***P < 0,0001).m, Ekspresija FOS kao odgovor na optogenetsku aktivaciju t-hCO u S1. Prikazane su slike ekspresije FOS-a (lijevo) i kvantifikacije (n = 3 po grupi; *P < 0,05, **P < 0,01 i ***P < 0,001) (desno). Prikazane su slike ekspresije FOS-a (lijevo) i kvantifikacije (n = 3 po grupi; *P < 0,05, **P < 0,01 i ***P < 0,001) (desno). Prikazane slike ekspresije FOS (sleva) i količinskog određivanja (n = 3 u grupi; * P <0,05, ** P <0,01 i *** P <0,001) (sprave). Slike ekspresije FOS-a (lijevo) i kvantifikacije (n = 3 po grupi; *P<0,05, **P<0,01 i ***P<0,001) prikazane su (desno).显示了FOS 表达 (左）和量化 (每组n = 3；*P < 0,05、**P < 0,01 和***P < 0,001)＾的右显示了FOS 表达 (左）和量化 (每组n = 3；*P < 0,05、**P < 0,01 和***P < 0,001)＾的右 Prikazane slike ekspresije FOS (sleva) i količinskog određivanja (n = 3 u grupi; * P <0,05, ** P <0,01 i *** P <0,001) (sprave). Slike ekspresije FOS-a (lijevo) i kvantifikacije (n = 3 po grupi; *P<0,05, **P<0,01 i ***P<0,001) prikazane su (desno).Mjerna traka, 100 µm. Podaci su izraženi kao srednja vrijednost ± standardna greška BLA, bazolateralnog tonzila, MDT, dorzomedijalnog talamičkog jezgra, PAG, periakveduktalne sive boje.
Konačno, pitali smo da li t-hCO može modulirati ponašanje pacova. Da bismo to testirali, transplantirali smo hCO koji eksprimira hChR2-EYFP u S1, a 90 dana kasnije, implantirali smo optička vlakna u t-hCO za isporuku svjetlosti. Zatim smo trenirali pacove modificiranom paradigmom operantnog uslovljavanja (Sl. 5h). Životinje smo stavili u komoru za testiranje ponašanja i nasumično primijenili 5 sekundi plavih (473 nm) i crvenih (635 nm) laserskih stimulusa. Životinje su dobile nagradu u obliku vode ako su lizale tokom stimulacije plavim svjetlom, ali nisu lizale tokom stimulacije crvenim svjetlom. Prvog dana treninga, životinje nisu pokazale razliku u lizanju kada su stimulirane plavim ili crvenim svjetlom. Međutim, 15. dana, životinje kojima je transplantiran hCO koji eksprimira hChR2-EYFP pokazale su aktivnije lizanje kada su stimulirane plavim svjetlom u poređenju sa stimulacijom crvenim svjetlom. Ove promjene u ponašanju lizanja nisu uočene kod kontrolnih životinja kojima je transplantiran hCO koji eksprimira kontrolni fluorofor (stopa uspjeha učenja: hChR2 89%, EYFP 0%, slika 5i-1 i dodatni video 2). Ovi podaci ukazuju na to da t-hCO ćelije mogu aktivirati neurone pacova kako bi stimulirale ponašanje traženja nagrade. Da bismo saznali koji bi t-hCO neuronski krugovi pacova mogli biti uključeni u ove promjene u ponašanju, optogenetski smo aktivirali t-hCO kod dresiranih životinja i sakupili tkiva 90 minuta kasnije. Imunohistohemija je otkrila ekspresiju FOS proteina, ovisnog o aktivnosti, u nekoliko regija mozga uključenih u motivirano ponašanje, uključujući medijalni prefrontalni korteks, medijalni talamus i periakveduktalnu sivu tvar, koja je eksprimirana ili kod nestimuliranih kontrolnih životinja ili kod životinja. riža. 5m). Uzeti zajedno, ovi podaci ukazuju na to da t-hCO može modulirati neuronsku aktivnost pacova kako bi potaknuo ponašanje.
Neuralni organoidi predstavljaju obećavajući sistem za proučavanje ljudskog razvoja i bolesti in vitro, ali su ograničeni nedostatkom veza između krugova koji postoje in vivo. Razvili smo novu platformu u kojoj smo transplantirali hCO u S1 imunokompromitovanih ranih postnatalnih pacova kako bismo proučavali razvoj i funkciju ljudskih ćelija in vivo. Pokazali smo da t-hCO razvija zrele tipove ćelija koji nisu uočeni in vitro28 i da je t-hCO anatomski i funkcionalno integriran u mozak glodara. Integracija t-hCO u neuralne krugove glodara omogućila nam je da uspostavimo vezu između ljudske ćelijske aktivnosti i proučavanog ponašanja životinja, pokazujući da t-hCO neuroni mogu modulirati neuronsku aktivnost pacova kako bi pokrenuli bihevioralne reakcije.
Platforma koju opisujemo ima nekoliko prednosti u odnosu na prethodna istraživanja o transplantaciji ljudskih ćelija u mozgove glodara. Prvo, transplantirali smo hCO u korteks mozga pacova u razvoju u ranoj postnatalnoj fazi, što može olakšati anatomsku i funkcionalnu integraciju. Drugo, t-hCO MRI praćenje nam je omogućilo proučavanje položaja i rasta transplantata kod živih životinja, što nam je omogućilo provođenje dugoročnih studija na više životinja i utvrđivanje pouzdanosti nekoliko hiPS ćelijskih linija. Konačno, transplantirali smo intaktne organoide, umjesto izoliranih suspenzija pojedinačnih ćelija, koje su manje destruktivne za ljudske ćelije i mogu promovirati integraciju i stvaranje neurona ljudskog korteksa u mozgu pacova.
Potvrđujemo da uprkos napretku na ovoj platformi, vremenska, prostorna i međuvrsna ograničenja sprečavaju formiranje ljudskih neuronskih krugova sa visokom vjernošću, čak i nakon transplantacije u ranoj fazi razvoja. Na primjer, nije jasno da li spontana aktivnost uočena u t-hCO predstavlja razvojni fenotip sličan ritmičkoj aktivnosti uočenoj tokom kortikalnog razvoja ili je to zbog odsustva supresivnih tipova ćelija prisutnih u t-hCO. Slično tome, nije jasno u kojoj mjeri odsustvo laminacije u t-hCO utiče na povezanost lanca30. Budući rad će se fokusirati na integraciju drugih tipova ćelija kao što su ljudska mikroglija, ljudske endotelne ćelije i različiti udjeli GABAergičkih interneurona, kao što je prikazano korištenjem sklopa 6 in vitro, kao i na razumijevanje kako se neuronska integracija i obrada mogu dogoditi u izmijenjenim t-hCO transkripcijskim, sinaptičkim i bihevioralnim nivoima u ćelijama dobijenim od pacijenata.
Sveukupno, ova in vivo platforma predstavlja moćan resurs koji može dopuniti in vitro istraživanje razvoja ljudskog mozga i bolesti. Očekujemo da će nam ova platforma omogućiti otkrivanje novih fenotipova na nivou lanca u inače nedostižnim ćelijama izvedenim od pacijenata i testiranje novih terapijskih strategija.
Generirali smo hCO2.5 iz HiPS ćelija kao što je prethodno opisano. Da bismo pokrenuli proizvodnju hCO2 iz hiPS ćelija kultiviranih na hranjivim slojevima, intaktne kolonije hiPS ćelija su uklonjene iz posuda za kulturu pomoću dispaze (0,35 mg/mL) i prebačene u plastične kulture sa ultra-niskim prianjanjem koje sadrže posude sa hiPS medijumom za kulturu ćelija. (Corning) dopunjenim sa dva SMAD inhibitora dorsomorfinom (5 μM; P5499, Sigma-Aldrich) i SB-431542 (10 μM; 1614, Tocris) i ROCK inhibitorom Y-27632 (10 μM; S1049, Selleckchem). Tokom prvih 5 dana, medij hiPS ćelija je mijenjan svakodnevno i dodavani su dorsomorfin i SB-431542. Šestog dana u suspenziji, neuronske sferoidi su preneseni u neuronski medij koji sadrži neurobazalni A (10888, Life Technologies), dodatak B-27 bez vitamina A (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies), penicilin i streptomicin (1:100, Life Technologies) i dopunjen epidermalnim faktorom rasta (EGF; 20 ng ml−1; R&D Systems) i faktorom rasta fibroblasta 2 (FGF2; 20 ng ml−1; R&D Systems) do 24. dana. Od 25. do 42. dana, medij je dopunjen neurotrofičnim faktorom izvedenim iz mozga (BDNF; 20 ng ml−1, Peprotech) i neurotrofinom 3 (NT3; 20 ng ml−1; Peprotech) uz promjenu medija svaki drugi dan. Šestog dana u suspenziji, neuronske sferoidi su preneseni u neuronski medij koji sadrži neurobazalni A (10888, Life Technologies), dodatak B-27 bez vitamina A (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies), penicilin i streptomicin (1:100, Life Technologies) i dopunjen epidermalnim faktorom rasta (EGF; 20 ng ml−1; R&D Systems) i faktorom rasta fibroblasta 2 (FGF2; 20 ng ml−1; R&D Systems) do 24. dana. Od 25. do 42. dana, medij je dopunjen neurotrofičnim faktorom izvedenim iz mozga (BDNF; 20 ng ml−1, Peprotech) i neurotrofinom 3 (NT3; 20 ng ml−1; Peprotech) uz promjenu medija svaki drugi dan.Šestog dana u suspenziji, neuronske sferoide su prebačene u neuronski medij koji sadrži Neurobasal-A (10888, Life Technologies), dodatak B-27 bez vitamina A (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies) i penicilin.i streptomicin (1:100, Life Technologies) i dopunjuju epidermalni faktor rasta (EGF; 20 ng/ml; R&D Systems) i faktor rasta fibroblastova 2 (FGF2; 20 ng/ml; R&D Systems) do 24 dana. i streptomicin (1:100, Life Technologies) i dopunjen epidermalnim faktorom rasta (EGF; 20 ng/ml; R&D Systems) i faktorom rasta fibroblasta 2 (FGF2; 20 ng/ml; R&D Systems) do 24. dana.Od 25. do 42. dana, u medij su dodavani neurotrofični faktor izveden iz mozga (BDNF; 20 ng ml-1, Peprotech) i neurotrofin 3 (NT3; 20 ng ml-1, Peprotech), a medij se mijenjao svaki drugi dan.在悬浮的第6 天,将神经球体转移到含有neurobasal-A (10888, Life Technologies)、不含维生, 不含维生补充剂 (12587), Life Technologies）, GlutaMax (1:100, Life Technologies) Technologies）并辅以表皮生长因子（EGF；20 ng ml-1；R&D Systems) Sistemi）直至第24 天。在 悬浮 的 第 第 6 天 将 神经 球体 转移 含有 含有 neurobasal-a （10888 ， Life Technologies０ 不的 b-27 补充剂 (12587, Life Technologies) Glutamax (1: 100), Life TechNOGIS 青霉素 的 神经 培养 埓 （缜霻 基100 ， Life Technologies） 表皮 生长 因子 （ ((20 ng ml-1 ； r & d Systems) 成 纤维 细胞 生长 2 （fgf2 ； 20 ng ml- 1；R& Sistemi）直至第24天。 Na 6-dnevnu suspenziju neurosfere su prevedene u dopunu, koja sadrži neurobazal-A (10888, Life Technologies), dopunu V-27 bez vitamina A (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies), penicilin-100 nejtralizovanog penicilina Technologies) s dodatkom epidermalnog faktora rasta (EGF; 20 ng ml-1; R&D Systems) i faktora rasta fibroblastova 2 (FGF2; 20 ng ml-1) 1; Šestog dana, suspenzije neurosfera su prebačene na dodatak prehrani koji sadrži neurobazal-A (10888, Life Technologies), dodatak B-27 bez vitamina A (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies), streptomicin neutraliziran penicilinom (1:100, Life Technologies) dopunjen epidermalnim faktorom rasta (EGF; 20 ng ml-1; R&D Systems) i faktorom rasta fibroblasta 2 (FGF2; 20 ng ml-1)1; R&D Systems) do 24-go dana. Sistemi za istraživanje i razvoj) do 24. dana.Od 25. do 42. dana, neurotrofični faktor izveden iz mozga (BDNF; 20 ng ml-1, Peprotech) i neurotrofični faktor 3 (NT3; 20 ng ml-1, Peprotech) dodavani su u medij za kulturu svaki drugi dan. Podloga se mijenja jednom.Počevši od 43. dana, hCO₂ je održavan u nedopunjenom neurobazalnom-A mediju (NM; 1088022, Thermo Fisher) uz promjenu medija svaka 4-6 dana. Da bi se dobio hCO₂ iz hiPS ćelija kultiviranih u uslovima bez hranilice, hiPS ćelije su inkubirane sa Accutase (AT-104, Innovate Cell Technologies) na 37°C tokom 7 minuta, disocirane na pojedinačne ćelije i nasađene na AggreWell 800 ploče (34815, STEMCELL Technologies) pri gustini od 3 × 10⁶ pojedinačnih ćelija po jažici u Essential 8 mediju dopunjenom ROCK inhibitorom Y-27632 (10 μM; S1049, Selleckchem). Nakon 24 sata, mediji u jažicama su pipetom prebačeni u medije koji sadrže Essential 6 medij (A1516401, Life Technologies) dopunjen dorzomorfinom (2,5 μM; P5499, Sigma-Aldrich) i SB-431542 (10 μM; 1614). (Tocrida). Od 2. do 6. dana, Essential 6 medij je svakodnevno zamjenjivan dorzomorfinom i dodatkom SB-431542. Od šestog dana, suspenzije neurosfera su prebačene u neurobazalni medij i održavane kao što je gore opisano.
Svi postupci na životinjama provedeni su u skladu sa smjernicama za njegu životinja koje je odobrio Administrativni odbor za njegu laboratorijskih životinja Univerziteta Stanford (APLAC). Gravidni eutimni RNU (rnu/+) pacovi su kupljeni (Charles River Laboratories) ili smješteni. Životinje su držane na 12-satnom ciklusu svjetlosti i tame s hranom i vodom ad libitum. Mladunci golih (FOXN1–/–) pacova starosti od tri do sedam dana identificirani su rastom nezrelih brkova prije uništavanja. Štenci (muški i ženski) su anestezirani sa 2-3% izoflurana i postavljeni na stereotaksični okvir. Izvršena je trepanacija lobanje promjera približno 2-3 mm iznad S1 uz održavanje integriteta dura mater. Zatim se koristi igla 30-G (približno 0,3 mm) neposredno izvan kraniotomije za probijanje dure. Nakon toga, na tanki parafilm dimenzija 3×3 cm nanijeti HCO3 i ukloniti višak medija. Koristeći Hamiltonovu špricu pričvršćenu na iglu 23 G, 45°, nježno uvucite hCO₃ u najdistalniji kraj igle. Zatim postavite špricu na pumpu za špricu povezanu sa stereotaksičnim uređajem. Nakon toga, postavite vrh igle preko prethodno napravljene rupe za ubod širine 0,3 mm u duri (z = 0 mm) i suzite špricu 1-2 mm (z = približno -1,5 mm) dok se igla ne nađe između dure mater A. Ne formira se gusto zatvaranje. Zatim podignite špricu do središta kortikalne površine pri z = -0,5 mm i ubrizgajte hCO₃ brzinom od 1-2 µl u minuti. Nakon završetka injekcije hCO₃, igla se uvlači brzinom od 0,2-0,5 mm u minuti, koža se zašije, a štene se odmah stavlja na toplu grijaću podlogu do potpunog oporavka. Neke životinje su transplantirane bilateralno.
Svi postupci na životinjama provedeni su u skladu sa smjernicama za njegu životinja koje je odobrio Univerzitet Stanford APLAC. Pacovi (stariji od 60 dana nakon transplantacije) anestezirani su 5% izofluranom i anestezirani sa 1-3% izoflurana tokom snimanja. Za vizualizaciju je korišten aktivno zaštićeni horizontalni skener za bušotine od 7 Tesla, Bruker (Bruker Corp.) sa gradijentnim pogonom International Electric Company (IECO), zaštićenim gradijentnim umetkom unutrašnjeg prečnika 120 mm (600 mT/m, 1000 T/m/s) koristeći AVANCE.III, osmokanalne višekanalne RF i višejezgrene mogućnosti, te prateću Paravision 6.0.1 platformu. Snimanje je izvršeno korištenjem aktivno dekuplovane volumetrijske RF zavojnice unutrašnjeg prečnika 86 mm i četverokanalne kriogenski hlađene RF zavojnice samo za prijem. Aksijalni 2D Turbo-RARE (vrijeme ponavljanja = 2500 ms, vrijeme odjeka = 33 ms, 2 prosjeka) sa 16 snimaka slojeva, debljina sloja 0,6–0,8 mm, koji sadrži 256 × 256 uzoraka. Signali su primljeni korištenjem kvadraturne primopredajne volumetrijske RF zavojnice s unutarnjim promjerom od 2 cm (Rapid MR International, LLC). Konačno, korištene su ugrađene Imaris (BitPlane) funkcije procjene površine za 3D renderiranje i analizu volumena. Uspješna transplantacija definirana je kao ona u kojoj su se u transplantiranoj hemisferi formirala područja kontinuiranog T2-ponderiranog MRI signala. Odbacivanje grafta definirano je kao graft koji nije proizveo područja kontinuiranog T2-ponderiranog MRI signala u transplantiranoj hemisferi. Subkortikalni t-hCO2 je isključen iz naknadne analize.
Da bi se stabilno eksprimirali GCaMP6s u hCO2 za dvofotonsko snimanje kalcija, hiPS ćelije su inficirane sa pLV[Exp]-EF1a::GcaMP6s-WPRE-Puro, nakon čega je slijedila selekcija antibiotika. Ukratko, ćelije su disocirane sa EDTA i suspendirane u 1 ml Essential 8 medija pri gustoći od približno 300.000 ćelija u prisustvu polibrena (5 μg/ml) i 15 μl virusa. Ćelije su zatim inkubirane u suspenziji 60 minuta i zasijane pri gustoći od 50.000 ćelija po jažici. Nakon konfluencije, ćelije su tretirane sa 5-10 μg ml-1 puromicina tokom 5-10 dana ili dok se nisu pojavile stabilne kolonije. Akutna hCO infekcija je izvedena kao što je prethodno opisano5 uz neke modifikacije. Ukratko, hCO2 je prebačen 30.-45. dana u 1,5 ml Eppendorf mikrocentrifugalne epruvete koje sadrže 100 µl nervnog medija. Zatim se ukloni približno 90 µl medija, u epruvetu se doda 3-6 µl lentivirusa visokog titra (od 0,5 x 108 do 1,2 x 109), a hCO2 se prenese u inkubator na 30 minuta. Nakon toga, u svaku epruvetu se doda 90-100 µl medija i epruvete se vrate u inkubator preko noći. Sljedećeg dana, hCO2 se prenese u svježi nervni medij u pločama sa niskim pričvršćivanjem. Nakon 7 dana, hCO2 je prenesen na ploče sa 24 jažice sa staklenim dnom radi vizualizacije i procjene kvaliteta infekcije. pLV[Exp]-SYN1::EYFP-WPRE i pLV[Exp]-SYN1::hChR2-EYFP-WPRE su generisani pomoću VectorBuildera. Lentivirus se koristi u većini eksperimenata jer je integrisan u genom domaćina, omogućavajući ekspresiju reporterskog gena u zaraženim ćelijskim linijama. Za praćenje bjesnoće, hCO je od 30. do 45. dana koinficiran sa virusom bjesnoće-ΔG-eGFP i AAV-DJ-EF1a-CVS-G-WPRE-pGHpA (plazmid #67528, Addgene), temeljito ispran 3 dana, te transplantiran u pacove u S1 i održavan in vivo 7-14 dana.
Za imunocitohemiju, životinje su anestezirane i transkardijalno perfuzirane sa PBS-om, a zatim sa 4% paraformaldehidom (PFA u PBS-u; Electron Microscopy Sciences). Mozgovi su fiksirani u 4% PFA tokom 2 sata ili preko noći na 4°C, krioprezervirani u 30% saharozi u PBS-u tokom 48-72 sata, te ugrađeni u 1:1, 30% saharozu:OCT (Tissue-Tek OCT Compound 4583, Sakura Finetek) i koronalni rezovi su napravljeni na 30 µm korištenjem kriostata (Leica). Za imunohistohemiju debelih rezova, životinje su perfuzirane sa PBS-om, a mozak je diseciran i koronalno sekcioniran na 300-400 µm korištenjem vibratoma (Leica) i rezovi su fiksirani sa 4% PFA tokom 30 minuta. Zatim su kriosekcije ili debeli presjeci isprani PBS-om, blokirani 1 sat na sobnoj temperaturi (10% normalnog magarećeg seruma (NDS) i 0,3% Triton X-100 razrijeđenog u PBS-u) i blokirani rastvorom za blokiranje na 4°C. – Inkubacija Kriosekcije su inkubirane preko noći, a debeli presjeci su inkubirani 5 dana. Primarna korištena antitijela bila su: anti-NeuN (miš, 1:500; ab104224, abcam) anti-CTIP2 (pacov, 1:300; ab18465, abcam), anti-GFAP (zec, 1:1.000; Z0334, Dako), anti-GFP (piletina, 1:1.000; GTX13970, GeneTex), anti-HNA (miš, 1:200; ab191181, abcam), anti-NeuN (zec, 1:500; ABN78, Millipore), anti-PDGFRA (zec, 1:200; sc-338, Santa Cruz), anti-PPP1R17 (zec, 1:200; HPA047819, Atlas antitijela), anti-RECA-1 (miš, 1:50; ab9774, abcam), anti-SCG2 (zec, 1:100; 20357-1-AP, Proteintech), anti-SOX9 (koza, 1:500; AF3075, R&D Systems), Netrin G1a (koza, 1:100; AF1166, R&D Systems), anti-STEM121 (miš, 1:200; Y40410, Takara Bio), anti-SATB2 (miš, 1:50; ab51502, abcam), anti-GAD65/67 (zec, 1:400; ABN904, Millipore) i anti-IBA1 (koza, 1:100; ab5076, abcam). Primarno korištena antitijela bila su: anti-NeuN (miš, 1:500; ab104224, abcam) anti-CTIP2 (pacov, 1:300; ab18465, abcam), anti-GFAP (zec, 1:1.000; Z0334, Dako), anti-GFP (piletina, 1:1.000; GTX13970, GeneTex), anti-HNA (miš, 1:200; ab191181, abcam), anti-NeuN (zec, 1:500; ABN78, Millipore), anti-PDGFRA (zec, 1:200; sc-338, Santa Cruz), anti-PPP1R17 (zec, 1:200; HPA047819, Atlas antitijela), anti-RECA-1 (miš, 1:50; ab9774, abcam), anti-SCG2 (zec, 1:100; 20357-1-AP, Proteintech), anti-SOX9 (koza, 1:500; AF3075, R&D Systems), Netrin G1a (koza, 1:100; AF1166, R&D Systems), anti-STEM121 (miš, 1:200; Y40410, Takara Bio), anti-SATB2 (miš, 1:50; ab51502, abcam), anti-GAD65/67 (zec, 1:400; ABN904, Millipore) i anti-IBA1 (koza, 1:100; ab5076, abcam). Iskoristili su sledeće pervičnye antitela: anti-NeuN (mišinye, 1:500; ab104224, abcam), anti-CTIP2 (krysinye, 1:300; ab18465, abcam), anti-GFAP (kroličʹi, 1:1000; Z0334, Dako1:0,00; GTX13970, GeneTex), anti-HNA (myšʹ, 1:200; ab191181, abcam), anti-NeuN (krolik, 1:500; ABN78, Millipore), anti-PDGFRA (krolik, 1:200; sc-338, Santa-Kruz), anti-PPP1R17 (krolik, 1:200; HPA047819, Atlas Antibodies), anti-RECA-1 (myšʹ, 1:50; ab9774, abcam), anti-SCG2 (krolik , 1:100; 20357-1-AP, Proteintech), anti-SOX, 50 koz, 5 SOX; R&D Systems), netrin G1a (kozij, 1:100; AF1166, R&D Systems), anti-STEM121 (myšinyj , 1:200; Y40410, Takara Bio), anti-SATB2 (myšʹ, 1:50; ab51502, abcam/, anti-GAD65) 1:400; ABN904, Millipore) i anti-IBA1 (koza, 1:100; ab5076, abkam). Primarna korištena antitijela bila su: anti-NeuN (miš, 1:500; ab104224, abcam), anti-CTIP2 (pacov, 1:300; ab18465, abcam), anti-GFAP (zec, 1:1000; Z0334, Dako), anti-GFP (piletina, 1:1000; GTX13970, GeneTex), anti-HNA (miš, 1:200; ab191181, abcam), anti-NeuN (zec, 1:500; ABN78, Millipore), anti-PDGFRA (zec, 1:200; sc-338, Santa Cruz), anti-PPP1R17 (zec, 1:200; HPA047819, Atlas antitijela), anti-RECA-1 (miš, 1:50; ab9774), abcam), anti-SCG2 (zec, 1:100; 20357-1-AP, Proteintech), anti-SOX9 (koza, 1:500; AF3075, R&D Systems), netrin G1a (koza, 1:100; AF1166, R&D Systems), anti-STEM121 (miš, 1:200; Y40410, Takara Bio), anti-SATB2 (miš, 1:50; ab51502, abcam), anti-GAD65/67 (zec, 1:400; ABN904, Millipore) i anti-IBA1 (koza, 1:100; ab5076, abkam).使用的一抗是：抗NeuN (小鼠,1:500；ab104224,abcam)抗CTIP2 (大鼠，1:3) 00；ab18465,abcam）,抗GFAP (兔,1:1,000；Z0334,Dako)，抗-GF P (鸡, 1:1,000; GTX13970, GeneTex), 抗HNA (小鼠, 1:200; ab1911 81，abcam），抗NeuN（兔，1:500；ABN78,Millipore），抗PDGFRA (兔，) 1:200；sc-338, Santa Cruz）, 抗PPP1R17 (兔, 1:200；HPA047819, Atlas抗体）,抗RECA-1 (小鼠,1:50；ab9774,abcam)，抗SCG2 (兔）, 1:100；20357-1-AP,Proteintech）,抗SOX9 (山羊，1:500；AF3075,R&D Systems)，Netrin G1a（山羊，1:100；AF1166, R&D Systems）,抗STEM121 (小鼠, 1:200;使用的一抗是：抗NeuN (小鼠,1:500；ab104224,abcam)抗CTIP2 (大鼠，1) :300；ab18465,abcam）,抗GFAP（兔,1:1,000；Z0334,Dako），抗-GFP (鸡, 1:1,000; GTX13970, GeneTex), 抗HNA (小鼠, 1:200); 191181, abcam, 抗NeuN (兔, 1:500); ABN78, Millipore％弔, 1: 200；sc-338，Santa Cruz）,抗PPP1R17 (兔,1:200；HPA047819，Atlas抗体）,抗RECA-1 (小鼠,1:50；ab9774,abcam)，抗SCG2 100；20357-1-AP,Proteintech）,抗SOX9 (山羊,1:500；AF3075,R&D Systems)，Netrin G1a（山羊，1:106，1:106 Sistemi）頏1:20, ;Y40410, Takara Bio), anti-SATB2 (miš, 1:50; ab51502, abcam), anti-GAD65/67 (zec, 1:400; ABN904, Millipore) i anti-IBA1 (koza, 1:100; ab5076, abcam).Primarno korištena antitijela bila su: anti-NeuN (miš, 1:500; ab104224, abcam), anti-CTIP2 (pacov, 1:300; ab18465, abcam), anti-GFAP (zec, 1:1000; Z0334, Dako). , anti-GFP (piletina, 1:1000; GTX13970, GeneTex), anti-HNA (miš, 1:200; ab191181, abcam), anti-NeuN (zec, 1:500; ABN78, Millipore), anti-PDGFRA (zec, 1:200; sc-338, Santa Cruz), anti-PPP1R17 (zec, 1:200; HPA047819, Atlas antitijelo), anti-RECA-1 (miš, 1:50; ab9774, abcam), anti-SCG2 (zec), 1:100;20357-1-AP, Proteintech), anti-SOX9 (koza, 1:500; AF3075, R&D Systems), Netrin G1a (koza, 1:100; AF1166, R&D Systems), anti -STEM121 (myšʹ, 1:200; 1:200; Y400, Y40) 1:50; ab51502, abcam), anti-GAD65/67 (krolik, 1:400; ABN904, Millipore) i anti-IBA1 (koza, 1:100; ab5076, abkam). 20357-1-AP, Proteintech), anti-SOX9 (koza, 1:500; AF3075, R&D Systems), Netrin G1a (koza, 1:100; AF1166, R&D Systems), anti-STEM121 (miš, 1:200; Y40410, Takara Bio), anti-SATB2 (miš, 1:50; ab51502, abcam), anti-GAD65/67 (zec, 1:400; ABN904, Millipore) i anti-IBA1 (koza, 1:100; ab5076, abkam).Presjeci su zatim isprani PBS-om i inkubirani sa sekundarnim antitijelom tokom 1 sata na sobnoj temperaturi (zamrznuti presjeci) ili preko noći na 4°C (debeli presjeci). Korišteno je sekundarno antitijelo Alexa Fluor (Life Technologies) razrijeđeno 1:1000 u rastvoru za blokiranje. Nakon ispiranja PBS-om, jezgre su vizualizirane pomoću Hoechst 33258 (Life Technologies). Konačno, preparati su postavljeni na mikroskop sa pokrovnim stakalcima (Fisher Scientific) korištenjem Aquamount-a (Polysciences) i analizirani na Keyence fluorescentnom mikroskopu (BZ-X analizator) ili Leica TCS SP8 konfokalnom mikroskopu (Las-X) na slici. Slike su obrađene korištenjem programa ImageJ (Fiji). Da bi se kvantificirao udio ljudskih neurona u t-hCO i korteksu pacova, snimljene su pravokutne slike širine 387,5 μm u centru t-hCO, na ili blizu ruba korteksa pacova. Granice grafta su određene procjenom promjena u transparentnosti tkiva, HNA+ jezgrima i/ili prisustvom autofluorescencije tkiva. Na svakoj slici, ukupan broj NeuN+ i HNA+ ćelija podijeljen je ukupnim brojem NeuN+ ćelija u istom području. Kako bi se osiguralo da se broje samo ćelije s jezgrama u ravni slike, u proračun su uključene samo ćelije koje su također Hoechst+. Dvije slike razdvojene za najmanje 1 mm usrednjene su kako bi se smanjila statistička greška.
Sedmicu dana prije uzimanja uzoraka, životinje s transplantiranim hCO₃ (otprilike 8 mjeseci diferencijacije) stavite u tamnu prostoriju sa podrezanim brkovima kako bi se minimizirala senzorna stimulacija. Izolacija jezgara izvršena je kao što je prethodno opisano, uz neke modifikacije. Ukratko, t-hCO₃ i hCO₃ uništeni su korištenjem deterdžentno-mehaničke lize ćelija i staklenog mlina za tkivo od 2 ml (D8938, Sigma-Aldrich/KIMBLE). Sirove jezgre su zatim filtrirane korištenjem filtera od 40 µm i centrifugirane na 320 g tokom 10 minuta na 4 °C prije izvođenja gradijenta gustoće saharoze. Nakon koraka centrifugiranja (320 g tokom 20 minuta na 4 °C), uzorci su resuspendirani u 0,04% BSA/PBS uz dodatak 0,2 jedinice µl-1 inhibitora RNase (40 u µl-1, AM2682, Ambion) i propušteni kroz protočni filter od 40 µm. Disocirane jezgre su zatim resuspendirane u PBS-u koji sadrži 0,02% BSA i nanesene na Chromium Single Cell 3′ čip (procijenjeni oporavak 8.000 ćelija po traci). snRNA-seq biblioteke su pripremljene pomoću Chromium Single cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics). snRNA-seq biblioteke su pripremljene pomoću Chromium Single cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics). Biblioteke snRNA-seq pripremljene su uz pomoć Chromium Single cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics). snRNA-seq biblioteke su pripremljene korištenjem Chromium Single cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics). snRNA-seq 文库是使用Chromium Single cell 3′ GEM、Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics) 制备的。 snRNA-seq 文库是使用Chromium Single cell 3′ GEM、Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics) 制备的。 Biblioteka snRNA-seq pripremila je korištenje Chromium Single Cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics). snRNA-seq biblioteka je pripremljena korištenjem Chromium Single Cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics).Biblioteke iz različitih uzoraka su objedinjene i sekvencirane pomoću Admera Health na NovaSeq S4 (Illumina).
Nivoi ekspresije gena za svaki pretpostavljeni nuklearni barkod kvantificirani su korištenjem softverskog paketa za analizu 10x Genomics CellRanger (verzija 6.1.2). Konkretno, očitanja su upoređena s kombinacijom ljudskih (GRCh38, Ensemble, verzija 98) i pacovskih (Rnor_6.0, Ensemble, verzija 100) referentnih genoma kreiranih naredbom mkref i korištenjem naredbe count s naredbom –include-introns=TRUE za kvantifikaciju uključenih očitanja mapiranih na intronske regije. Za uzorke t-hCO2, ljudska jezgra su identificirana na osnovu konzervativnog zahtjeva da najmanje 95% svih mapiranih očitanja odgovara ljudskom genomu. Sve naknadne analize provedene su na filtriranom izlazu niza barkodova iz CellRangera korištenjem R paketa (verzija 4.1.2) Seurat (verzija 4.1.1)32.
Kako bi se osiguralo da se u naknadnu analizu uključe samo visokokvalitetne jezgre, za svaki uzorak je implementiran iterativni proces filtriranja. Prvo se identificiraju i uklanjaju jezgre niskog kvaliteta s manje od 1000 pronađenih jedinstvenih gena i više od 20% ukupnih mitohondrija. Nakon toga, matrica sirovog broja gena normalizirana je regulariziranom negativnom binomnom regresijom korištenjem funkcije sctransform(vst.flavor=”v2″), koja je također identificirala 3000 najvarijabilnijih gena koristeći zadane parametre. Redukcija dimenzije izvršena je na gornjim varijabilnim genima korištenjem analize glavnih komponenti (PCA) sa zadanim parametrima koristeći dimenziju skupa podataka od 30 (dims = 30 odabran je na osnovu vizualnog pregleda mjesta koljena i korišten je za sve uzorke i analize ansambla). Zatim smo izvršili nekoliko rundi iterativnog klasteriranja (rezolucija = 1) kako bismo klasificirali gene na osnovu abnormalno niskog broja gena (medijana ispod 10. percentila), abnormalno visokog broja mitohondrijskih gena (medijana iznad 95. percentila) kako bismo identificirali i uklonili pretpostavljene ćelije niskog kvaliteta, klastere i/ili visok udio sumnjivih blizanaca identificiranih korištenjem paketa DoubletFinder33 (prosječni DoubletFinder rezultat iznad 95. percentila). t-hCO uzorci (n=3) i hCO uzorci (n=3) integrirani su odvojeno korištenjem funkcije IntegrateData s gore navedenim parametrima. Zatim Još jedan krug kvalitativnog filtriranja integriranog skupa podataka izvršen je kao što je gore opisano.
Nakon uklanjanja jezgara niskog kvaliteta, integrirani skup podataka je grupiran (rezolucija = 0,5) i ugrađen u svrhu vizualizacije UMAP34. Marker geni za svaki klaster određeni su korištenjem funkcije FindMarkers sa zadanim parametrima izračunatim iz normaliziranih podataka o ekspresiji gena. Identificiramo i klasificiramo glavne klase ćelija kombinirajući referentne skupove podataka fetalne i adultne korteksa s ekspresijom marker gena 19,20,21,35 i anotacijom. Posebno, cirkulirajući prekursori identificirani su ekspresijom MKI67 i TOP2A. Progenitorski klasteri definirani su odsustvom mitotičkih transkripata, visokim preklapanjem s multipotentnim glijalnim progenitorskim klasterima opisanim u kasnoj metafazi fetalnog korteksa, te ekspresijom EGFR i OLIG1. Termin astrocit koristimo da obuhvatimo nekoliko stanja diferencijacije astrocita, od kasne radijalne glije do sazrijevanja astrocita. Astrocitni klasteri eksprimiraju visoke nivoe SLC1A3 i AQP4 i pokazalo se da se mapiraju sa podtipovima fetalne radijalne glije i/ili adultnih astrocita. OPC-i eksprimiraju PDGFRA i SOX10, dok oligodendrociti eksprimiraju markere mijelinacije (MOG i MYRF). Glutamatergični neuroni su identificirani prisustvom neuronskih transkripata (SYT1 i SNAP25), odsustvom GABAergičnih markera (GAD2) i ekspresijom NEUROD6, SLC17A7, BCL11B ili SATB2. GluN neuroni su dalje podijeljeni u gornje (ekspresija SATB2 i gubitak BCL11B) i duboke (ekspresija BCL11B) podklase. Putativni neuroni podploče (SP) eksprimiraju poznate SP18 markere kao što su ST18 i SORCS1 pored dubokih GluN markera. Ćelije slične horoidnom pleksusu identificirane su ekspresijom TTR, a ćelije slične meningealnima eksprimirale su gene povezane s fibroblastima i mapirale pijalne/vaskularne ćelije referentnog skupa podataka.
Diferencijalna analiza ekspresije gena između t-hCO i hCO podklasa provedena je korištenjem novo razvijene pseudo-batch metode reproducirane u uzorcima implementiranim korištenjem Libra R paketa (verzija 1.0.0). Konkretno, edgeR log-likelihood testovi (verzija 3.36.0, paket R) provedeni su za grupe sumiranjem broja gena u ćelijama za datu klasu ćelija za svaku replikaciju uzorka. Za vizualizaciju toplotne mape, normalizirane vrijednosti na milion (CPM) izračunate su korištenjem edgeR (cpm() funkcija) i skalirane (da bi se postigla srednja vrijednost = 0, standardna devijacija = 1). Izvršena je analiza obogaćivanja Gene Ontology (GO) značajno pojačanih t-hCO GluN gena (P vrijednost korigovana Benjamini-Hochbergom manja od 0,05 eksprimirana u najmanje 10% t-hCO GluN ćelija i povećanje promjene od najmanje 2 puta) korištenjem ToppGene Suite (https://toppgene.cchmc.org/)37. Koristimo aplikaciju ToppFun sa zadanim parametrima i izvještavamo o P-vrijednostima korigiranim Benjamini-Hochbergom, izračunatim iz hipergeometrijskih testova označenih GO-om.
Da bismo uparili naše snRNA-seq klastere sa označenim ćelijskim klasterima iz referentnih studija primarne jednoćelijske RNA-seq ili adultne snRNA-seq19,20,21,22, primijenili smo pristup integracije uparenih skupova podataka. Koristili smo SCTransform (v2) tok normalizacije u Seuratu za integraciju i poređenje preklapanja klastera između skupova podataka (koristeći iste parametre kao gore). Pojedinačni skupovi podataka su nasumično podskupljeni do 500 ćelija ili jezgara po originalnom klasteru radi računarske efikasnosti. Koristeći sličan pristup kao što je prethodno opisano, preklapanje klastera je definirano kao udio ćelija ili jezgara u svakom združenom klasteru koji se preklapa s oznakom referentnog klastera. Za daljnju klasifikaciju GluN-ova, koristili smo Seuratov tok rada TransferData za podatke o podskupovima GluN-a kako bismo dodijelili oznake referentnih skupova podataka našim GluN ćelijama.
Da bismo procijenili status sazrijevanja globalnog transkriptoma uzoraka t-hCO i hCO, uporedili smo naše pseudo-bulk uzorke sa BrainSpan/psychENCODE23, koji se sastoji od velike RNK sekvence koja obuhvata razvoj ljudskog mozga. Izvršili smo PCA na kombinovanoj matrici genske ekspresije normalizovanoj po obrascu iz kortikalnih uzoraka 10 sedmica nakon začeća i kasnije, u 5567 gena (zajedno sa našim podacima) koji su prethodno identifikovani kao aktivni u BrainSpan kortikalnim uzorcima (definisani kao više od 50% u razvojnoj varijansi objašnjenoj godinama korišćenjem kubnog modela)38. Pored toga, izveli smo gene povezane sa glavnim transkriptomskim potpisima neurorazvoja koristeći ne-negativnu faktorizaciju matrice kao što je prethodno opisano. Težine uzorka izračunate korišćenjem postupka ne-negativne faktorizacije matrice prikazane su na slici 5b sa proširenim podacima za svaki od pet potpisa koje su opisali Zhu i saradnici38. Ponovo, transkripcioni markeri zavisni od aktivnosti izvedeni su iz prethodno objavljenih studija. Posebno, ERG i LRG su bili značajno pojačano regulirani u glutamatergičkim neuronima identificiranim kolekcijom snRNA-seq iz vizualnog korteksa miša nakon vizualne stimulacije iz Dodatne tabele 3 Hrvatin i sar.16. LRG-ovi obogaćeni ljudima dobiveni su iz kultura ljudskog fetalnog mozga aktiviranih KCl-om i sakupljeni 6 sati nakon stimulacije, a filtrirani geni su bili značajno pojačano regulirani kod ljudi, ali ne i kod glodara (Dodatna tabela 4). Analiza obogaćivanja genskog seta korištenjem ovih genskih setova provedena je korištenjem jednosmjernog Fisherovog egzaktnog testa.
Anestezirajte pacove izofluranom, izvadite mozgove i stavite ih u hladan (približno 4°C) oksigenirani (95% O2 i 5% CO2) rastvor saharoze za presjeke koji sadrže: 234 mM saharoze, 11 mM glukoze, 26 mM NaHCO3, 2,5 mM KCl, 1,25 mM NaH2PO4, 10 mM MgSO4 i 0,5 mM CaCl2 (oko 310 mOsm). Koronalni presjeci mozga pacova (300–400 µm) koji sadrže t-hCO2 napravljeni su korištenjem Leica VT1200 vibratoma kao što je prethodno opisano39. Presjeci su zatim preneseni u komoru za sekcioniranje s kontinuiranom oksigenacijom na sobnoj temperaturi koja sadrži aCSF pripremljen od: 10 mM glukoze, 26 mM NaHCO3, 2,5 mM KCl, 1,25 mM NaHPO4, 1 mM MgSO4, 2 mM CaCl2 i 126 mM NaCl (298 mOsm). najmanje 45 minuta prije snimanja. Presjeci su snimljeni u uronjenoj komori gdje su kontinuirano perfuzirani sa aCSF (bočica sa 95% O2 i 5% CO2). Svi podaci su snimljeni na sobnoj temperaturi. t-hCO neuroni su terminirani pipetom od borosilikatnog stakla napunjenom rastvorom koji sadrži 127 mM kalijum glukonata, 8 mM NaCl, 4 mM magnezijum ATP, 0,3 mM natrijum GTP, 10 mM HEPES i 0,6 mM EGTA, pH 7,2, unutrašnji rastvor podešen sa KOH (290 mOsm). Radi oporavka, u rastvor za snimanje je dodan biocitin (0,2%).
Podaci su prikupljeni korištenjem MultiClamp 700B pojačala (Molecular Devices) i Digidata 1550B digitalizatora (Molecular Devices), filtrirani niskopropusnim filterom na 2 kHz, digitalizirani na 20 kHz i analizirani korištenjem Clampfit-a (Molecular Devices), Origin-a (OriginPro). 2021b, OriginLab) i prilagođenih MATLAB funkcija (Mathworks). Potencijal spoja je izračunat korištenjem JPCalc-a, a unosi su prilagođeni izračunatoj vrijednosti od -14 mV. Operacija IV se sastoji od niza strujnih koraka u koracima od 10-25 pA, od -250 do 750 pA.
Talamus, bijela masa i S1 aferentne vene su električno stimulisane u talamokortikalnim presjecima tokom patch-clamp snimanja hCO neurona, kao što je prethodno opisano. Ukratko, mozak je postavljen na sto za 3D štampanje nagnut pod uglom od 10°, a prednji dio mozga je prerezan pod uglom od 35°. Mozak je zatim zalijepljen na prerezanu površinu i prerezan, čuvajući talamokortikalne izbočene aksone. Bipolarne volframove elektrode (0,5 MΩ) su montirane na drugi mikromanipulator i strateški postavljene da stimulišu četiri regije po ćeliji (unutrašnja kapsula, bijela masa, S1 i hCO). Zabilježite sinaptičke odgovore nakon fazne stimulacije od 300 µA na 0,03–0,1 Hz.
hChR2-eksprimirajući hCO neuroni su aktivirani na 480 nm, a svjetlosni impulsi generirani LED diodom (Prizmatix) su primijenjeni kroz objektiv ×40 (0.9 NA; Olympus) kako bi se zabilježila ekspresija hChR2 u blizini ćelija. Prečnik osvijetljenog polja je približno 0,5 mm, a ukupna snaga je 10-20 mW. Širina impulsa je postavljena na 10 ms, što odgovara impulsu datom tokom eksperimenta bihevioralnog učenja. Korištene su različite frekvencije stimulacije, od 1 do 20 Hz, ali je samo prvi impuls serije korišten za kvantifikaciju. Intervali između nizova su obično duži od 30 s kako bi se minimizirao učinak na sinaptičke inhibitorne ili olakšavajuće puteve. Da bismo testirali da li je hChR2 odgovor monosinaptički, primijenili smo TTX (1 μM) u kupku dok EPSC reakcija nije nestala, a zatim smo primijenili 4-aminopiridin (4-AP; 100 μM). Tipično, odgovor se vraća u roku od nekoliko minuta, sa nešto dužim kašnjenjem između paljenja LED diode i generisanja EPSC. NBQX (10 μM) je korišten za testiranje da li je odgovor uzrokovan AMPA receptorima.
Oštri hCO rezovi su kreirani kao što je prethodno opisano. Ukratko, hCO rezovi su ugrađeni u 4% agarozu i preneseni u ćelije koje sadrže 126 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM NaH2PO4, 1 mM MgSO4, 2 mM CaCl2, 26 mM NaHCO3 i 10 mM d-(+)-glukozu. Rezovi su izrezani na 200–300 µm na sobnoj temperaturi pomoću Leica VT1200 vibratora i pohranjeni u ASF na sobnoj temperaturi. Zatim je izvršeno patch-camp snimanje cijelih ćelija na hCO rezovima pod direktnim SliceScope mikroskopom (Scientifica). Rezovi su perfuzirani sa aCSF (95% O2 i 5% CO2) i ćelijski signali su snimljeni na sobnoj temperaturi. hCO neuroni su naneseni korištenjem pipete od borosilikatnog stakla napunjene rastvorom koji sadrži 127 mM kalijum glukonata, 8 mM NaCl, 4 mM magnezijum ATP, 0,3 mM natrijum GTP, 10 mM HEPES i 0,6 mM EGTA, internog pH 7,2, podešenog sa KOH (osmolarnost 290). Za potrebe regeneracije, dodati 0,2% Biocytin u interni rastvor.
Podaci su prikupljeni pomoću programa Clampex (Clampex 11.1, Molecular Devices) korištenjem pojačala MultiClamp 700B (Molecular Devices) i digitalizatora Digidata 1550B (Molecular Devices), filtrirani niskopropusnim filterom na 2 kHz, digitalizirani na 20 kHz i analizirani korištenjem programa Clampfit (verzija 10.6) za analizu (Molecular Devices) i prilagođenih MATLAB funkcija (MATLAB 2019b, Mathworks). Potencijal spoja izračunat je pomoću JPCalc-a, a unosi su prilagođeni izračunatom potencijalu spoja od -14 mV. Operacija IV sastoji se od niza strujnih koraka u koracima od 5-10 pA od -50 do 250 pA.
Za morfološku rekonstrukciju stisnutih neurona, u unutrašnji rastvor je dodato 0,2% biocitina (Sigma-Aldrich). Ćelije se pripremaju najmanje 15 minuta nakon "hackinga". Pipeta se zatim polako uvlači 1-2 minute dok se registrovana membrana potpuno ne zatvori. Nakon postupka fiziologije presjeka, presjeci su fiksirani preko noći na 4°C u 4% PFA, isprani sa PBS X3 i razrijeđeni 1:1000 sa streptavidinom konjugiranim DyLight 549 ili DyLight 405 (Vector Labs). Ćelije napunjene biocitinom (2%; Sigma-Aldrich) su označene tokom snimanja patch clamp metodom na sobnoj temperaturi tokom 2 sata. Presjeci su zatim montirani na mikroskopska slajdova pomoću Aquamount-a (Thermo Scientific) i vizualizirani sljedećeg dana na konfokalnom mikroskopu Leica TCS SP8 korištenjem uljno-imerzijskog objektiva sa numeričkom aperturom ×40 1,3, uvećanjem ×0,9–1,0, xy. Brzina uzorkovanja je približno 7 piksela po mikronu. Z-složenci u intervalima od 1 µm su dobijeni serijski, a z-složeni mozaici i automatsko spajanje zasnovano na Leica tehnologiji su izvršeni kako bi se pokrilo cijelo dendritično stablo svakog neurona. Neuroni su zatim praćeni polu-ručno korištenjem neuTube 40 interfejsa i generisane su SWC datoteke. Datoteke su zatim prenesene u SimpleNeuriteTracer41 Fiji dodatak (ImageJ, verzija 2.1.0; NIH).
Ljudsko kortikalno tkivo je dobijeno uz informirani pristanak u skladu s protokolom koji je odobrio Institucionalni odbor za reviziju Univerziteta Stanford. Dva uzorka ljudskog postporođajnog tkiva (3 i 18 godina starosti) dobijena su resekcijom frontalnog korteksa (srednji frontalni girus) kao dio operacije refraktorne epilepsije. Nakon resekcije, tkivo je uzeto u ledeno hladnom NMDG-aCSF-u koji sadrži: 92 mM NMDG, 2,5 mM KCl, 1,25 mM NaH2PO4, 30 mM NaHCO3, 20 mM HEPES, 25 mM glukoze, 2 mM tiouree, 5 mM natrijum askorbata, 3 mM natrijum piruvata, 0,5 mM CaCl2 4H2O i 10 mM MgSO4 7H2O. Titrirati do pH 7,3-7,4 koncentrovanom hlorovodičnom kiselinom. Tkiva su dostavljena u laboratoriju u roku od 30 minuta, a koronalni rezovi su uzeti prema gore opisanom postupku.
Svi postupci na životinjama provedeni su u skladu sa smjernicama za njegu životinja koje je odobrio Univerzitet Stanford APLAC. Pacovi (stariji od 140 dana nakon transplantacije) anestezirani su 5% izofluranom i anestezirani sa 1-3% izoflurana intraoperativno. Životinje su smještene u stereotaksični okvir (Kopf) i potkožno im je ubrizgan buprenorfin (SR) s produženim oslobađanjem. Lobanja je izložena, očišćena i umetnuto je 3-5 koštanih vijaka. Za ciljanje t-hCO2, generirali smo stereotaksičke koordinate iz MRI slika. Na mjestu interesa izbušena je rupa od svrdla, a vlakna (promjera 400 µm, NA 0,48, Doric) su spuštena 100 µm ispod površine hCO2 i pričvršćena za lobanju UV-stvrdnjavajućim zubnim cementom (Relyx).
Snimanja optičkom fotometrijom su izvršena kao što je prethodno opisano42. Da bi se zabilježila spontana aktivnost, pacovi su smješteni u čisti kavez, a optički patch kabel (Doric) promjera 400 µm (Doric) povezan sa sistemom za akviziciju podataka optičkom fotometrijom povezan je sa implantiranim optičkim kabelom. Tokom 10-minutnog snimanja motoričke aktivnosti, životinje su mogle slobodno istraživati ​​kavez. Da bi se zabilježila evocirana aktivnost, pacovi (više od 140 dana nakon transplantacije) su anestezirani sa 5% izoflurana za indukciju i 1-3% izoflurana za održavanje. Životinja je smještena u stereotaktički okvir (Kopf), a brkovi na suprotnoj strani t-hCO2 su podrezani na oko 2 cm i provučeni kroz mrežicu povezanu sa piezoelektričnim aktuatorom (PI). Optički patch kabel (Doric) promjera 400 µm (Doric) povezan je sa implantiranim vlaknom i sistemom za akviziciju podataka. Brkovi na suprotnoj strani t-hCO su zatim skrenuti 50 puta (2 mm na 20 Hz, 2 s po prezentaciji) u nasumičnim vremenima pomoću piezoelektričnog pogona tokom perioda snimanja od 20 minuta. Koristite Arduino MATLAB Support Package za kontrolu vremena skrenuća pomoću prilagođenog MATLAB koda. Događaji su sinhronizovani sa softverom za akviziciju podataka korištenjem impulsa tranzistor-tranzistorske logike (TTL).
Pacovi (stariji od 140 dana nakon transplantacije) su anestezirani 5% izofluranom i anestezirani sa 1-3% izoflurana intraoperativno. Životinje su smještene u stereotaksični okvir (Kopf) i buprenorfin SR i deksametazon su im injektirani potkožno. Lubanja je izložena, očišćena i umetnuto je 3-5 koštanih vijaka. Za ciljanje t-hCO2, generirali smo stereotaksičke koordinate iz MRI slika. Kružna kraniotomija (promjera približno 1 cm) izvedena je bušilicom velike brzine direktno iznad transplantiranog hCO2. Kada je kost što tanja, ali prije bušenja kroz cijelu kost, upotrijebite forceps za uklanjanje preostalog netaknutog karličnog diska kako biste otkrili t-hCO2 ispod. Kraniotomija je napunjena sterilnom fiziološkom otopinom, a pokrovno staklo i posebna igla za glavu pričvršćeni su na lubanju UV-stvrdnutim zubnim cementom (Relyx).
Dvofotonsko snimanje je izvršeno korištenjem Bruker multifotonskog mikroskopa s Nikon LWD (×16, 0.8 NA) objektivom. GCaMP6 snimanje je izvršeno na 920 nm s 1,4x uvećanjem u jednoj z-ravni i 8x prosjekom od 7,5 fps. Pacovi su anestezirani 5% izofluranom i održavani sa 1-3% izoflurana. Pacovi su smješteni u prilagođeni nosač za glavu i postavljeni ispod sočiva. Dobijen je 3-minutni pozadinski snimak motoričke aktivnosti. Tokom 20 minuta snimanja, 50 udaha (svaka prezentacija dužine 100 ms) nasumično je isporučeno na jastučić brkova nasuprot t-hCO2 pomoću pikospricera. Koristite Arduino MATLAB Support Package za kontrolu vremena bursta pomoću prilagođenog MATLAB koda. Sinhronizujte događaje sa softverom za akviziciju podataka (PrairieView 5.5) koristeći TTL impulse. Za analizu, slike su korigovane za xy kretanje korištenjem afine korekcije u MoCo programu pokrenutom na Fidžiju. Ekstrakcija fluorescentnih tragova iz pojedinačnih ćelija korištenjem CNMF-E43. Fluorescencija je ekstrahirana za svaku regiju od interesa, pretvorena u dF/F krivulje, a zatim pretvorena u z-vrijednosti.
Pacovi (stariji od 140 dana nakon transplantacije) su anestezirani 5% izofluranom i anestezirani sa 1-3% izoflurana intraoperativno. Životinje su smještene u stereotaksični okvir (Kopf) i buprenorfin SR i deksametazon su im injektirani potkožno. Brkovi na suprotnoj strani t-hCO su odrezani na oko 2 cm i provučeni kroz mrežicu povezanu s piezoelektričnim aktuatorom. Lubanja je izložena i očišćena. Vijak za uzemljenje od nehrđajućeg čelika je pričvršćen na lubanju. Za ciljanje t-hCO, generirali smo stereotaksičke koordinate iz MRI slika. Izvršite kružnu kraniotomiju (približno 1 cm u promjeru) bušilicom velike brzine odmah iznad t-hCO. Kada je kost što tanja, ali prije bušenja kroz cijelu kost, koristite forceps za uklanjanje preostalog netaknutog zdjeličnog diska kako biste otkrili t-hCO ispod. Pojedinačne ćelije su snimane korištenjem 32-kanalnih ili 64-kanalnih silikonskih sondi visoke gustoće (Cambridge Neurotech) uzemljenih na vijke za uzemljenje i prethodno pojačanih RHD pojačalima (Intan). Koristite manipulator za spuštanje elektroda na ciljno mjesto kroz kraniotomiju, koja je napunjena sterilnim fiziološkim rastvorom. Prikupljanje podataka je izvršeno na frekvenciji od 30 kHz korištenjem Open Ephys sistema za akviziciju podataka. Snimanje je nastavljeno samo kada smo detektovali visoko koreliranu ritmičku spontanu aktivnost u više od 10 kanala, što sugerira da su se elektrode nalazile u graftu (na osnovu podataka dvofotonskog snimanja kalcija). Dobijen je 10-minutni pozadinski snimak motoričke aktivnosti. Brkovi na suprotnoj strani t-hCO2 su zatim skrenuti 50 puta (2 mm na 20 Hz, 2 s po prezentaciji) u nasumičnim vremenima pomoću piezoelektričnog pogona tokom 20-minutnog perioda snimanja. Koristeći MATLAB paket podrške za Arduino (MATLAB 2019b), kontrolišite vrijeme skrenuća pomoću prilagođenog MATLAB koda. Koristite TTL impulse za sinhronizaciju događaja sa softverom za akviziciju podataka.
Za eksperimente optičkog označavanja, optički patch kabel od 200 µm (Doric) povezan s laserom od 473 nm (Omicron) povezan je s optičkim vlaknom od 200 µm postavljenim preko kraniotomije. Neposredno prije toga, podesite snagu kratkospojnika na 20 mW. Koristite manipulator za spuštanje elektroda do ciljnog mjesta kroz kraniotomiju, koja je napunjena sterilnim fiziološkim rastvorom. Na početku snimanja, emitirano je deset svjetlosnih impulsa od 473 nm (frekvencija 2 Hz, trajanje impulsa 10 ms). Fotosenzitivne ćelije definirane su kao ćelije koje su pokazale šiljasti odgovor unutar 10 ms svjetlosti u 70% ili više pokušaja.