Ташаккур ба шумо барои боздид аз Nature.com. Шумо версияи браузерро бо дастгирии маҳдуди CSS истифода мебаред. Барои таҷрибаи беҳтарин, мо тавсия медиҳем, ки шумо браузери навшударо истифода баред (ё Ҳолати мутобиқатро дар Internet Explorer хомӯш кунед). Илова бар ин, барои таъмини дастгирии доимӣ, мо сайтро бе услубҳо ва JavaScript нишон медиҳем.
Якбора карусели се слайдро намоиш медиҳад. Тугмаҳои Пешина ва Ояндаро истифода баред, то дар як вақт дар се слайд гузаред ё тугмаҳои слайдерро дар охир истифода баред, то дар як вақт аз се слайд гузаред.
Органеллҳои асабҳои худсохт як платформаи умедбахши in vitro барои моделсозии рушди инсон ва беморӣ мебошанд. Бо вуҷуди ин, органоидҳо алоқае надоранд, ки дар vivo вуҷуд доранд, ки камолотро маҳдуд мекунад ва интегратсияро бо дигар схемаҳое, ки рафторро назорат мекунанд, пешгирӣ мекунад. Дар ин ҷо мо нишон медиҳем, ки органоидҳои кортикалии аз ҳуҷайраҳои бунёдии инсон ба кортекси соматосенсории каламушҳои бараҳнаи навзод трансплантатсияшуда намудҳои ҳуҷайраҳои баркамолро инкишоф медиҳанд, ки ба давраҳои ҳассос ва ҳавасмандкунӣ муттаҳид мешаванд. MRI афзоиши органоидҳои пас аз трансплантатсияро дар якчанд хатҳои ҳуҷайраҳои бунёдӣ ва ҳайвонот ошкор кард, дар ҳоле ки таҳлили як ядроӣ пешрафти кортикогенез ва пайдоиши барномаи транскрипсияи аз фаъолият вобастаро нишон дод. Воқеан, нейронҳои кортикалии трансплантатсияшуда нисбат ба ҳамтоёни худ дар in vitro хосиятҳои мураккабтари морфологӣ, синаптикӣ ва мембранаи дохилӣ доранд, ки имкон медиҳанд, ки нуқсонҳои нейронӣ дар беморони гирифтори синдроми Тимотиюс ошкор карда шаванд. Пайгирии анатомӣ ва функсионалӣ нишон дод, ки органеллҳои трансплантатсияшуда воридоти таламокортикӣ ва кортикокортикиро мегиранд ва сабтҳои in vivo фаъолияти асабҳо нишон медиҳанд, ки ин воридҳо метавонанд дар ҳуҷайраҳои инсон аксуламалҳои ҳассосиро тавлид кунанд. Ниҳоят, органоидҳои кортикалӣ аксонҳоро дар тамоми майнаи каламуш паҳн мекунанд ва фаъолшавии оптогенетикии онҳо ба рафтори ҷустуҷӯи мукофот оварда мерасонад. Ҳамин тариқ, нейронҳои кортекси трансплантатсияшудаи инсон ба камол мерасанд ва дар схемаҳои мизбон, ки рафтори онҳоро назорат мекунанд, иштирок мекунанд. Мо интизорем, ки ин равиш ба ошкор кардани фенотипҳои сатҳи сатҳ дар ҳуҷайраҳои аз беморон гирифташуда, ки бо дигар воситаҳо ошкор карда намешаванд, мусоидат мекунад.
Мағзи сари инкишофёбандаи инсон як раванди аҷиби худидоракунӣ мебошад, ки дар он ҳуҷайраҳо афзоиш, тафовут, муҳоҷират ва пайвастшавӣ барои ташаккули схемаҳои функсионалии нейронӣ, ки тавассути таҷрибаи ҳассос бештар такмил меёбанд. Мушкилоти калидӣ дар фаҳмидани рушди мағзи сари инсон, бахусус дар заминаи беморӣ, набудани дастрасӣ ба бофтаи мағзи сар аст. Органеллаҳои худташкилкунанда, аз ҷумла органоидҳои кортекси инсон (hCO; инчунин ҳамчун сфераи кортекси инсон маълуманд), метавонанд 2,3,4,5,6 тавлид кунанд. Аммо, якчанд маҳдудиятҳо татбиқи васеътари онҳоро барои фаҳмидани рушд ва фаъолияти схемаҳои асаб маҳдуд мекунанд. Махсусан, маълум нест, ки камолоти hCO бо набудани воридоти муайяни микромуҳитӣ ва ҳассос дар vivo маҳдуд аст. Илова бар ин, азбаски hCOs ба схемаҳое дохил карда нашудаанд, ки метавонанд натиҷаҳои рафторро ба вуҷуд оранд, фоидаи онҳо дар моделсозии ихтилоли аз ҷиҳати генетикӣ мураккаб ва нейропсихиатрии рафторӣ дар айни замон маҳдуд аст.
Трансплантатсияи hCO ба мағзи зиндаи солим метавонад ин маҳдудиятҳоро бартараф кунад. Тадқиқотҳои қаблӣ нишон доданд, ки нейронҳои инсон, ки ба кортекси хояндаҳо кӯчонида шудаанд, қодиранд зинда монад, лоиҳакашӣ кунанд ва бо ҳуҷайраҳои ҳояндаҳо муошират кунанд7,8,9,10,11,12. Аммо, ин таҷрибаҳо одатан дар ҳайвоноти калонсол анҷом дода мешаванд, ки метавонанд интегратсияи синаптикӣ ва аксониро маҳдуд кунанд. Дар ин ҷо мо парадигмаи трансплантатсияро тавсиф мекунем, ки дар он мо 3D hCO-ро, ки аз ҳуҷайраҳои hiPS гирифта шудааст, ба кортекси ибтидоии соматосенсории (S1) каламушҳои норасоии масуният дар марҳилаи аввали рушди пластикӣ кӯчонидаем. Нейронҳои трансплантатсияшудаи hCO (t-hCO) камолоти назаррасро аз сар мегузаронанд, воридоти таламокортикалӣ ва кортикалӣ-кортикалӣ мегиранд, ки аксуламалҳои ҳассосро ба вуҷуд меоранд ва пешгӯиҳои аксониро ба майнаи каламуш паҳн мекунанд, то рафтори ҷустуҷӯи мукофотро пеш баранд. Камолоти густурдаи t-hCO нуқсонҳои нейроналиро дар беморони гирифтори синдроми Тимоти (TS), як бемории шадиди ирсӣ, ки дар натиҷаи мутатсияҳо дар канали калсиии ба шиддат ҳассос L-намуди CaV1.2 (бо CACNA1C рамзгузорӣ шудааст) ба вуҷуд омадааст, ошкор кардааст.
Барои омӯзиши нейронҳои кортикали инсон дар микросхемаҳои in vivo, мо ба таври стереотактикӣ 3D hCO-и солимро ба S1 аз каламушҳои барвақти пас аз таваллуд (рӯзҳои 3-7 пас аз таваллуд) интиқол додем (расми 1а ва маълумоти васеъшудаи расми 1a-c). Дар ин лахза проексияхои аксоналии таламокортикалй ва кортикокортикал иннерватсияи S1-и худро хануз ба охир нарасонидаанд (ис. 13). Ҳамин тариқ, ин равиш барои ҳадди аксар расонидани ҳамгироии t-hCO ва кам кардани таъсир ба схемаҳои эндогенӣ тарҳрезӣ шудааст. Барои тасаввур кардани ҷойгиршавии t-hCO дар ҳайвоноти зинда, мо барқарорсозии мағзи T2 вазншудаи MRI-и каламушҳо 2-3 моҳ пас аз трансплантатсия анҷом додем (расми 1b ва маълумоти васеъ, расми 1d). t-hCO ба осонӣ мушоҳида карда шуданд ва андозагирии ҳаҷми t-hCO ба онҳое, ки аз буридаҳои собит ҳисоб карда шудаанд, монанд буданд (Маълумоти васеъ Расми 1d,e; P> 0.05). t-hCO ба осонӣ мушоҳида карда шуданд ва андозагирии ҳаҷми t-hCO ба онҳое, ки аз буридаҳои собит ҳисоб карда шудаанд, монанд буданд (Маълумоти васеъ Расми 1d,e; P> 0.05). t-hCO легко наблюдались, як изофанависии t-hCO бо аналогии рассчитанҳо барои фиксированнҳо (расширенные данные, рис. 1d, e; P> 0,05). t-hCO ба осонӣ мушоҳида карда шуданд ва ченакҳои ҳаҷмии t-hCO ба онҳое, ки барои қисмҳои собит ҳисоб карда шудаанд, монанд буданд (маълумоти васеъ, расми 1d, e; P> 0.05).很容易观察到t-hCO，并且t-hCO的体积测量值与从固定切片计算的测量值相似（扩展数据图1d、e；P > 0.05）很容易观察到t-hCO，并且t-hCO t-hCO легко наблюдался, як изофанависии t-hCO бо аналогии рассчитанҳо барои фиксированнҳо (расширенные данные, рис. 1d, e; P> 0,05). t-hCO ба осонӣ мушоҳида карда шуд ва ченакҳои ҳаҷмии t-hCO ба онҳое, ки барои қисмҳои собит ҳисоб карда шудаанд, монанд буданд (маълумоти васеъ, расми 1d, e; P> 0.05).Мо t-hCO-ро дар 81% ҳайвоноти трансплантатсияшуда тақрибан 2 моҳ пас аз трансплантатсия муайян кардем (n = 72 ҳайвон; hCO аз 10 хати ҳуҷайраи hiPS; хатҳои ҳуҷайраи hiPS дар Ҷадвали иловагӣ 1). Аз ин 87% дар кортекси мағзи сар ҷойгир буданд (расми 1в). Бо анҷом додани сканҳои силсилавии MRI дар якчанд вақт дар як каламуши трансплантатсияшуда, мо дар тӯли 3 моҳ афзоиши нӯҳ маротиба дар ҳаҷми t-hCO-ро ёфтем (расми 1d ва маълумоти васеъ, расми 1f). Ҳайвонҳои трансплантатсияшуда дар 12 моҳи пас аз трансплантатсия сатҳи зинда мондани баланд (74%) доштанд (маълумоти васеъ, Расми 1g ва Ҷадвали иловагии 2) ва ҳеҷ гуна вайроншавии ошкори мотор ё хотира, глиоз ё электроэнцефалограмма (EEG) пайдо нашуд. Маълумот Расми 1g ва ҷадвали иловагии 2). 1 ва 3е).
а, Схемати тарҳрезии таҷрибавӣ. hCO, ки аз ҳуҷайраҳои hiPS гирифта шудааст, дар рӯзҳои 30-60 фарқият ба S1-и каламушҳои бараҳнаи навзод кӯч карда шуд. б, Тасвирҳои MRI-и короналӣ ва уфуқии T2-ро, ки t-hCO-ро дар S1 2 моҳ пас аз трансплантатсия нишон медиҳанд. Бари миқёс, 2 мм. в, Миқдори сатҳи муваффақияти ишғолкунӣ барои ҳар як хати ҳуҷайраи hiPS нишон дода шудааст (n = 108, рақамҳо дар дохили сутунҳо миқдори t-hCO барои як хати ҳуҷайраи hIPS нишон медиҳанд) ва ҷойгиршавии кортикалӣ ё субкортикалӣ (n = 88). г, тасвири MRI-и рагҳои коронарӣ (аз чап; бари миқёс, 3 мм) ва реконструкцияи ҳаҷмии мувофиқи 3D (бар шкала, 3 мм), ки афзоиши t-hCO дар тӯли 3 моҳро нишон медиҳад. д, Баррасии намунаҳои t-hCO дар кортекси мағзи каламушҳо. Бари миқёс, 1 ​​мм. f, Тасвирҳои намояндагии иммуноцитохимиявии t-hCO аз чап ба рост нишон дода шудаанд (ҳангоми тафовут): PPP1R17 (4 моҳа), NeuN (8 моҳа), SOX9 ва GFAP (8 моҳа), PDGFRα; (8 моҳ), MAP2 (8 моҳ) ва IBA1 (8 моҳ). Бари миқёс, 20 мкм. Якҷоя ифодаи HNA ҳуҷайраҳои пайдоиши инсонро нишон медиҳад. g, snRNA-seq: Тамошои коҳиши андозагирии якхела ва проексия (UMAP) пас аз ҳамгироии Seurat (n = 3 намунаҳои t-hCO, n = 2 хатҳои ҳуҷайраи hiPS). Астроситҳо, ҳуҷайраҳои хати астроситҳо; cyc prog, авлодони гардишкунанда; GluN DL, нейронҳои амиқи глутаматергикӣ; GluN DL/SP, нейронҳои глутаматергии амиқ ва зерипламелярӣ; GluN UL, қабати болоии нейронҳои глутаматергикӣ; олигодендроситҳо, олигодендроситҳо; OPC, ҳуҷайраҳои пешгузаштаи олигодендроситҳо; RELN, нейронҳои реелин. h, Таҳлили истилоҳи ғанисозии генҳои онтология (GO) дар муқоиса бо нейронҳои глутаматергии hCO t-hCO, ба таври назаррас боло танзим карда шудааст (тасҳеҳ P <0,05, тағирёбии қабат> 2, ки дар ҳадди аққал 10% ядроҳо ифода ёфтааст). h, Таҳлили истилоҳи ғанисозии генҳои онтология (GO) дар муқоиса бо нейронҳои глутаматергии hCO t-hCO, ба таври назаррас боло танзим карда шудааст (тасҳеҳ P <0,05, тағирёбии қабат> 2, ки дар ҳадди аққал 10% ядроҳо ифода ёфтааст). h, Анализ обогащения истилоҳоти Gene Ontology (GO) барои генов бо значительные активации (коррективадор P <0,05, кратность изменения > 2, экспрессия бо крайней мере дар 10% ядер) дар глутаматергических нейронҳои глутаматергических сравников t-hCOlucosraviche. h, Таҳлили ғанисозии истилоҳи Ген Онтология (GO) барои генҳо бо фаъолсозии назаррас (тасҳеҳ P<0.05, тағирёбии қабат> 2, ифода дар ҳадди аққал 10% ядроҳо) дар нейронҳои глутаматергии t-hCO дар муқоиса бо нейронҳои глутаматергики hCO. h，与hCO 谷氨酸能神经元相比，t-hCO 谷氨酸能神经元中基因显着上调（调整天0.05，倍数变化> 2，在至少10% 的细胞核中表达）的基因本体论(GO) 术语毌集。 h ， 与 hco 谷氨酸 能 元 相比 ， t-hco 谷氨酸 能 神经 元 基因 显着 上调 显着 上调 ０弈 p.变化 变化> 2 ， 至少 10% 的 核中 表达） 基因 基因 基因 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的的 的 的 的本体论(GO) 术语富集分析。 h, гени значительно фаъолсозӣ (корректированный P <0,05, кратность изменения> 2, экспрессируется по крайней мере в 10% ядер) дар таҳлили глутаматергических нейронҳои t-hCO бо сравнению бо глутаматергических нейронами hCO. h, генҳо ба таври назаррас боло танзим карда шуданд (тасҳеҳ P <0,05, тағирёбии қабат> 2, ки ҳадди аққал дар 10% ядроҳо ифода ёфтааст) дар нейронҳои глутаматергии t-hCO дар муқоиса бо нейронҳои глутаматергии hCO. Таҳлили онтологии (GO) истилоҳи ғанисозӣ.Хати нуқта арзиши aqро 0,05 нишон медиҳад. i, тасвири UMAP намудҳои ҳуҷайраҳои GluN дар t-hCO бо истифода аз интиқоли нишона аз маҷмӯаи маълумотҳои кортекси мотории калонсолон 22 snRNA-seq. КТ - ҳуҷайраҳои кортикоталамӣ, ET - ҳуҷайраҳои берун аз мағзи сар, IT - ҳуҷайраҳои дохилии теленсефаликӣ, NP - дар наздикии проекция.
Пас аз он мо ситоархитектура ва таркиби умумии ҳуҷайравии t-hCO-ро арзёбӣ кардем. Ранг кардани антителоҳои ҳуҷайраҳои эндотелиалии каламуш рагҳоро бо t-hCO ошкор кард, дар ҳоле ки рангкунии IBA1 мавҷудияти микроглияи каламушро дар тамоми пайванд нишон дод (расми 1f ва маълумоти васеъ, расми 3c,d). Иммуностакунӣ ҳуҷайраҳои мусбати антигени ядроии инсонро (HNA) ошкор кард, ки PPP1R17 (пешгузаштагони кортикалӣ), NeuN (нейронҳо), SOX9 ва GFAP (ҳуҷайраҳои аз глиалӣ гирифташуда) ё PDGFRa (пешгузаштагони олигодендроситҳо) -ро ифода мекунанд (Расми 1f). Барои омӯзиши таркиби ҳуҷайравии t-hCO дар ҳалли ягонаи ҳуҷайра, мо пас аз тақрибан 8 моҳи тафриқавӣ пайдарпайии ягонаи РНК (snRNA-seq) анҷом додем. Филтркунии оммавӣ ва нест кардани ядроҳои каламушҳо 21,500 харитаи баландсифати як ядроии инсонро дод (расми 1g ва маълумоти васеъ, расми 4а,б). Намунаҳои ифодаи аломатҳои типи ҳуҷайраҳо кластерҳои синфҳои асосии ҳуҷайраҳои кортикалӣ, аз ҷумла нейронҳои глутаматергии амиқ ва рӯякӣ, пешгузаштагони гардишкунанда, олигодендроситҳо ва насли астроцитҳоро муайян карданд (расми 1g, маълумоти васеъ, расми 4c ва Ҷадвали иловагии 3). Иммуностакунӣ барои SATB2 ва CTIP2 нишон дод, ки сарфи назар аз мавҷудияти зергурӯҳҳои кортикалӣ, t-hCO стратификацияи анатомикиро равшан нишон намедиҳад (маълумоти васеъ, расми 3а). snRNA-seq hCO-и марҳилаи мувофиқ синфҳои ҳуҷайраҳои ба таври васеъ шабеҳро ба вуҷуд овард, ба истиснои чанд истисно, аз ҷумла набудани олигодендроситҳо ва мавҷудияти нейронҳои GABAergic, ки метавонанд шароити мусоиди қаблан гузоришшударо дар vitro барои ҳуҷайраҳои пешгузаштаи паҳлӯӣ инъикос кунанд15 (маълумоти васеъ, расми 4fpplement - i 4). Таҳлили экспрессияи дифференсиалии генҳо фарқиятҳои назаррасро дар нейронҳои глутаматергикӣ байни t-hCO ва hCO (Ҷадвали 5), аз ҷумла фаъолсозии маҷмӯи генҳои марбут ба камолоти нейронӣ ба монанди сигнализатсияи синаптикӣ, локализатсияи дендритӣ ва фаъолияти канали бо шиддат алоқамандро ошкор кард (Расми 1h ва Ҷадвали иловагӣ 5). ҷадвали 6). Мутаносибан, нейронҳои глутаматергикии кортикалӣ t-hCO камолоти тезонидашудаи транскрипсияро нишон доданд.
Барои муайян кардани он, ки оё ин тағиротҳои транскриптӣ дар t-hCO бо фарқиятҳои морфологии байни hCO in vitro ва t-hCO in vivo алоқаманд буданд, мо пас аз 7-8 моҳи тафовут, мо hCO ва hCO-ро дар марҳилаи мувофиқи биоситин пуршуда дар қисмҳои шадид барқарор кардем. Нейронҳои hCO (расми 2а). нейронҳои t-hCO ба таври назаррас калонтар буданд, диаметри 1,5 маротиба аз сома, ду маротиба зиёдтар дендритҳо доштанд ва дар муқоиса бо hCO in vitro (расми 2б) дарозии умумии дендритӣ шаш маротиба афзоиш ёфт. Илова бар ин, мо зичии баландтари сутунмӯҳраҳои дендритиро дар нейронҳои t-hCO нисбат ба нейронҳои hCO мушоҳида кардем (расми 2c). Ин аз он шаҳодат медиҳад, ки нейронҳои t-hCO аз дарозшавии васеъ ва шохаҳои дендритӣ мегузаранд, ки дар якҷоягӣ бо паҳншавии давомноки ҳуҷайраҳо, метавонанд ба афзоиши пуршиддати t-hCO пас аз трансплантатсия мусоидат кунанд (расми 1d ва маълумоти васеъ дар расми 1f). Ин моро водор кард, ки хосиятҳои электрофизиологиро тафтиш кунем. Иқтидори мембрана ҳашт маротиба баландтар буд (маълумоти васеъ, расми 8d), потенсиали мембранаи ҳолати оромӣ бештар гиперполяризатсияшуда (тақрибан 20 мВ) буд ва тазриқи ҷорӣ суръати баландтари ҳаяҷонро дар нейронҳои t-hCO нисбат ба нейронҳои hCO ба вуҷуд овард. in vitro (расми 2d), д), ки бо хусусиятҳои калонтар ва мураккабтари морфологии t-hCO мувофиқат мекунад. Илова бар ин, басомади рӯйдодҳои стихиявии ҳаяҷонбахши постсинаптикӣ (EPSC) дар нейронҳои t-hCO (расми 2f) ба таври назаррас баландтар буд, ки нишон медиҳад, ки зичии афзояндаи сутунмӯҳраҳои дендритикӣ дар нейронҳои t-hCO мушоҳидашуда бо ҳаяҷонбахшии функсионалӣ алоқаманд аст. синапси ҷинсӣ. Мо хусусияти беқуввати нейронҳои hCO-ро дар vitro тавассути сабти нейронҳои глутаматергикӣ тасдиқ кардем (маълумоти васеъ, расми 6a-c).
a, барқарорсозии 3D-и нейронҳои биоситин пур аз hCO ва t-hCO пас аз 8 моҳи тафовут. б, Миқдори хусусиятҳои морфологӣ (n = 8 neurons hCO, n = 6 t-hCO neurons; ** P = 0.0084, * P = 0.0179 ва *** P < 0.0001). б, Миқдори хусусиятҳои морфологӣ (n = 8 neurons hCO, n = 6 t-hCO neurons; ** P = 0.0084, * P = 0.0179 ва *** P < 0.0001). б, количественная оценка морфологических признаков (n = 8 нейронов hCO, n = 6 нейронов t-hCO; ** P = 0,0084, * P = 0,0179 ва *** P <0,0001). б, миқдори хусусиятҳои морфологӣ (n=8 neurons hCO, n=6 t-hCO neurons; **P = 0,0084, * P = 0,0179 ва *** P <0,0001). b，形态学特征的量化（n = 8 个hCO 神经元，n = 6 个t-hCO 神经元；**P = 0.0084，*P 7*0. 0,0001). b，形态学特征的量化（n = 8 个hCO 神经元，n = 6 个t-hCO 神经元；**P = 0.0084，*P 7*0. 0,0001). б, количественная оценка морфологических признаков (n = 8 нейронов hCO, n = 6 нейронов t-hCO; ** P = 0,0084, * P = 0,0179 ва *** P <0,0001). б, миқдори хусусиятҳои морфологӣ (n=8 neurons hCO, n=6 t-hCO neurons; **P = 0,0084, * P = 0,0179 ва *** P <0,0001).в, азнавсозии 3D шохаҳои hCO ва t-hCO dendritic пас аз 8 моҳи тафриқа. Ситораҳои сурх сутунмӯҳраҳои тахминии дендритиро нишон медиҳанд. Миқдори зичии сутунмӯҳраи dendritic (n = 8 neurons hCO, n = 6 t-hCO neurons; ** P = 0.0092). г, Миқдори потенсиали мембранаи оромӣ (n = 25 нейронҳои hCO, n = 16 t-hCO neurons; *** P <0.0001). г, Миқдори потенсиали мембранаи оромӣ (n = 25 нейронҳои hCO, n = 16 t-hCO neurons; *** P <0.0001). г, количественная оценка мембранного потенциали покоя (n = 25 нейронов hCO, n = 16 нейронов t-hCO; *** P <0,0001). г, миқдорбандии потенсиали мембранаи ором (n = 25 neurons hCO, n = 16 t-hCO neurons; *** P <0.0001). d，静息膜电位的量化（n = 25 hCO 神经元，n = 16 t-hCO 神经元；***P < 0,0001）。 d，静息膜电位的量化（n = 25 hCO 神经元，n = 16 t-hCO 神经元；***P < 0,0001）。 г, количественная оценка мембранного потенциали покоя (n = 25 нейронов hCO, n = 16 нейронов t-hCO; *** P <0,0001). г, миқдорбандии потенсиали мембранаи ором (n = 25 neurons hCO, n = 16 t-hCO neurons; *** P <0.0001). д, Оғози потенсиали амали такроршаванда дар hCO ва t-hCO, ки тавассути афзоиши тазриқи ҷорӣ ба вуҷуд омадааст ва миқдори максималии сӯзишворӣ (n = 25 нейронҳои hCO, n = 16 t-hCO нейронҳо; *** P <0.0001). д, Оғози потенсиали амали такроршаванда дар hCO ва t-hCO, ки тавассути афзоиши тазриқи ҷорӣ ба вуҷуд омадааст ва миқдори максималии сӯзишворӣ (n = 25 нейронҳои hCO, n = 16 t-hCO нейронҳо; *** P <0.0001). д, повторное возбуждение потенциала действия в hCO и t-hCO, вызванное увеличением тока, и количественная оценка возбуждения максимум нервию hCO, n = 16 нейронов t-hCO; *** P <0,000). д, дубора оташ задани потенсиали амалӣ дар hCO ва t-hCO, ки тавассути афзоиши ҷорӣ ва миқдори максималии сӯзишворӣ ба вуҷуд омадааст (n = 25 hCO нейронҳо, n = 16 t-hCO нейронҳо; *** P <0.0001). e，通过增加电流注入诱导的hCO 和t-hCO 重复动作电位放电，以及最大放电，以及最大放电（电，个hCO 神经元，n = 16 个t-hCO 神经元；***P < 0,0001）。 E ， 通过 增加 电流 注入 的 的 hco 和 t-hco 重复 电位 放电 ， 以及 最 大（缈2 = 5个 hco 神经 ， n = 16 个 t-hco 神经 ； *** p <0,0001） 。 д, повторяющееся возбуждение потенциала действия hCO и t-hCO, вызванное увеличением подачи тока, ва количественная оценка максимальной скорости (n = 25 нейронов hCO, n = 16 нейронов hCO, n = 16 нейронов t-hCO0 <0, P; ***0). д, оташфишонии такрории потенсиалҳои амали hCO ва t-hCO, ки бо зиёд шудани таъминоти ҷорӣ ва миқдорӣ суръати максималии оташфишонӣ (n = 25 hCO neurons, n = 16 t-hCO neurons; *** P < 0,0001). f, EPSCs стихиявӣ (sEPSCs) дар нейронҳои hCO ва t-hCO дар 8 моҳи тафовут ва миқдори басомади рӯйдодҳои синаптикӣ (n = 25 hCO neurons, n = 17 t-hCO neurons; *** P <0.0001). f, EPSC-ҳои стихиявӣ (sEPSCs) дар нейронҳои hCO ва t-hCO дар 8 моҳи тафовут ва миқдори басомади рӯйдодҳои синаптикӣ (n = 25 hCO neurons, n = 17 t-hCO neurons; *** P <0.0001) . f, spontannye EPSC (sEPSC) дар нейронҳои hCO ва t-hCO дар давоми 8 моҳ дифференциркунӣ ва количественная осенка частоти синаптических событий (n = 25 нейронов hCO, n = 17 нейронов t-hCO; *** P <0,000.) f, EPSC-ҳои стихиявӣ (sEPSCs) дар нейронҳои hCO ва t-hCO дар тӯли 8 моҳи тафриқа ва миқдори суръати ҳодисаҳои синаптикӣ (n = 25 нейронҳои hCO, n = 17 t-hCO нейронҳо; *** P <0.0001). f，分化8 个月时hCO 和t-hCO 神经元中的自发性EPSCs (sEPSCs)，以及突触事件频率的2CO 化化神经元，n = 17 t-hCO 神经元；***P <0,0001）. f，分化8 个月时hCO 和t-hCO 神经元中的自发性EPSCs (sEPSCs)，以及突触事件频率的5CO神率的量匼（n = 25 hCO 神率的量匼（n = 25hCO P <0,0001） . f, спонтании EPSC (sEPSC) дар нейронҳои hCO ва t-hCO дар тӯли 8 моҳ дифференцирҳо ва количественная осенка частоти синаптических собитӣ (n = 25 нейронов hCO, n = 17 нейронов t-hCO; *** P <0,001). f, EPSC-ҳои стихиявӣ (sEPSCs) дар нейронҳои hCO ва t-hCO дар 8 моҳи тафовут ва миқдори суръати ҳодисаҳои синаптикӣ (n = 25 hCO neurons, n = 17 t-hCO neurons; *** P <0.0001).Барои bf, hCO ва t-hCO дар хати 1208-2 аз ҳамон партияи дифференсионӣ гирифта шуданд, ки дар баробари нигоҳдорӣ нигоҳ дошта мешаванд. g, Таҳлили ғанисозии маҷмӯи генҳо (санҷиши дақиқи Фишери яктарафа) генҳои ба таври назаррас боло танзимшуда (тасҳеҳ P <0,05, тағирёбии қабат > 2, дар ҳадди аққал 10% ядроҳо ифода карда шудааст) дар нейронҳои глутаматергии t-hCO дар муқоиса бо нейронҳои глутаматергии hCO бо ҳам генезҳои барвақт ва ҳам дер-понрезҳо) (LRG) генҳои вобаста ба фаъолият, ки аз омӯзиши муш дар in vivo муайян карда шудаанд16 ва LRG-ҳои хоси инсон аз нейронҳои in vitro17. g, Таҳлили ғанисозии маҷмӯи генҳо (санҷиши дақиқи Фишери яктарафа) генҳои ба таври назаррас боло танзимшуда (тасҳеҳ P <0,05, тағирёбии қабат > 2, дар ҳадди аққал 10% ядроҳо ифода карда шудааст) дар нейронҳои глутаматергии t-hCO дар муқоиса бо нейронҳои глутаматергии hCO бо ҳам генезҳои барвақт ва ҳам дер-понрезҳо) (LRG) генҳои вобаста ба фаъолият, ки аз омӯзиши муш дар in vivo муайян карда шудаанд16 ва LRG-ҳои хоси инсон аз нейронҳои in vitro17. г, анализ обогащения набора генов (односторонний точ нейроный анализ Фишера) генов бо значительный активацией (корректированный P <0,05, кратность изменения > 2, экспрессия бо меньшей мере дар 10% ядер) дар глутаматергических нейронхои гамадор hCO наборы генов как rannego (ERG), так и позднего (LRG) genov, зависящих аз фаъол, идентификатсия дар исследовании дар мышах in vivo16, ва махсус барои одамон LRG аз нейрон дар vitro17. g, таҳлили ғанисозии маҷмӯи генҳо (санҷиши дақиқи Фишери як думдор) генҳо бо фаъолсозии назаррас (тасҳеҳ P<0,05, тағирёбии қабат >2, ифода дар ҳадди аққал 10% ядроҳо) дар нейронҳои глутаматергии t-hCO дар муқоиса бо нейронҳои глутаматергии hCO hCO ва маҷмӯи генҳои дер дар (ERG) муайяншуда (ERG) mice16 ва LRG-ҳои хоси инсон аз нейронҳо дар vitro17. g，t-hCO谷氨酸能神经元与hCO谷氨酸能神经元相比，t -hCO谷氨酸能神经元显着上调（调整后P<0.05，倍数变化>2，在至少10%的细胞核中表达）的基因集富集分析（单侧F isher精确检验）从体内小鼠研究中鉴定的早期反应(ERG)和晚期反应(LRG) 活性依赖性基因的基因组16 和体外神经元17 中的人类特开LRG。 g ， t-hco 谷氨酸 神经 元 与 hco 谷氨酸 神经 元 相比 ， t-hco 谷氨酸 神经 谷氨酸 神经 元 与 hco 谷氨酸 神经 元 相比<0.05 ， 倍数> 2 ， 至少 至少 10%的 细胞 核中 表达） 的 集富集 分析 （单缧（单羿体内 小鼠 研究 中 的 早期 反应 反应 反应 和 晚期 反应 反应 (lrg) 活性 活性 庄 盻性 基和 神经元 神经元 17 中 中 17 中 17的人类特异性LRG。 g, глутаматергические нейронии t-hCO бо значительных активизирование по сравнению бо глутаматергическими нейронам hCO (корректированный P<0,05, кратность изменения> 2, не менее 10% Анализ обогащения набора генов) (ERG) ва позднего гени, зависящие от активности ответа (LRG), идентифицирование дар исследования дар мышах in vivo16 ва нейронах in vitro17, махсус барои одамон. g, нейронҳои глутаматергии t-hCO дар муқоиса бо нейронҳои глутаматергии hCO (тасҳеҳ P<0,05, тағирёбии қабат >2, ҳадди аққал 10% Ҷавоби барвақт (ERG) ва таҳлили ғанисозии генҳои дер посух (санҷиши дақиқи Фишер як думдор)) ба таври назаррас афзоиш ёфтанд, ки аз генҳои вокуниш вобаста ба генҳо муайян карда шуданд (дар 6) нейронҳо.17 LRG-ҳои хоси инсон.Хати нуқта қимати P-и аз ҷониби Bonferroni ислоҳшуда 0,05-ро нишон медиҳад. h, ифодаи генҳои GluN (паҷтаи псевдо ва миқёси ҳар як ген) дар репликаҳои snRNA-seq генҳои LRG дар нейронҳои глутаматергии t-hCO ба таври назаррас танзим карда шуд. i, иммуностинг, ки ифодаи SCG2-ро дар нейронҳои t-hCO (болоӣ) ва hCO (поён) нишон медиҳад. Тирҳои сафед ба ҳуҷайраҳои SCG2+ ишора мекунанд. Бари миқёс, 25 мкм. Маълумот ҳамчун миёна ± инҳирофи стандартӣ ифода карда мешаванд.
Дар асоси афзоиши фаъолнокии t-hCO, ки дар буридаҳои ex vivo мушоҳида шудааст, snRNA-seq танзими вобастагии транскриптҳои генро дар t-hCO дар муқоиса бо hCO in vitro ошкор кард. Нейронҳои глутаматергикӣ t-hCO сатҳи баландтари генҳоро танзим мекунанд, ки фаъолияти вокуниши дерро танзим мекунанд (расми 2g, h), ки дар таҳқиқоти қаблӣ дар нейронҳои муш ва инсон пайдо шудаанд16,17. Масалан, BDNF18, SCG2 ва OSTN, як гени танзимкунандаи фаъолият барои приматҳо, дар муқоиса бо нейронҳои hCO (расми 2g-i) ифодаи зиёдро дар нейронҳои t-hCO нишон доданд. Ҳамин тариқ, нейронҳои t-hCO дар муқоиса бо нейронҳои hCO тавассути таҳлилҳои транскриптӣ, морфологӣ ва функсионалӣ хусусиятҳои мукаммали камолотро нишон доданд.
Барои арзёбии минбаъдаи робитаи камолоти t-hCO бо рушди майнаи инсон, мо муқоисаи транскриптомии намудҳои ҳуҷайраҳои кортикалии ҳомила ва калонсолон19,20 ва калонсолон21,22 ва инчунин маълумоти васеъро дар бораи ифодаи генҳои кортикалӣ23 ҳангоми рушд анҷом додем (маълумоти васеъ, расми 5). ). бо кори қаблӣ 24, ҳолати глобалии hCO ва t-hCO transcriptome камолот дар 7-8 моҳи тафовут ба таври васеъ бо вақти рушди in vivo мувофиқ аст ва бештар ба ҳаёти дер ҳомила баробар аст (Маълумоти васеъ Расми. 5a). Қобили зикр аст, ки мо афзоиши камолоти транскриптомро дар t-hCO дар муқоиса бо hCO-и синну солаш, инчунин фаъолсозии транскриптомро, ки бо синаптогенез, астрогенез ва миелинизатсия алоқаманданд, мушоҳида кардем (маълумоти васеъ, расми 5b-d). Дар сатҳи ҳуҷайра, мо далелҳои лоғартари кортексро дар t-hCO ёфтем, ки кластерҳои нейронҳои глутаматергикӣ бо зертипҳои нейронҳои калонсолон L2 / 3, L5 ва L6 мувофиқат мекунанд (Расми 1i). Баръакси ин, такрори кластер байни нейронҳои глутаматергикӣ t-hCO ва нейронҳои кортикалии ҳомила дар нимаи ҳомиладорӣ маҳдудтар буд (маълумоти васеъ, расми 5e-j). Барои муайян кардани он, ки оё нейронҳои t-hCO аз ҷиҳати функсионалӣ ба нейронҳои neocortical postnatal инсон монанданд, мо сабтҳои электрофизиологӣ ва реконструкцияи анатомии нейронҳои пирамидавии L2 / 3-ро дар қисматҳои тези кортекси пас аз таваллуди инсон анҷом додем (маълумоти васеъ, расми 7а). Хусусиятҳои электрофизиологии нейронҳои пирамидаии L2 / 3 ба нейронҳои пирамидавии t-hCO монанд буданд (маълумоти васеъ, расми 7e). Морфологӣ, нейронҳои L2 / 3 аз намунаҳои пас аз таваллуди инсон ба t-hCO нисбат ба hCO бештар монанд буданд, гарчанде ҳуҷайраҳои L2 / 3 дарозтар буданд, дар маҷмӯъ шохаҳои бештар доранд ва зичии сутунмӯҳра баландтар буданд (расми 3g ва маълумоти васеъ, расми 7b-). Г).
a, трансплантатсияи hCO, ки тавассути хатҳои ҳуҷайраи назорат ва TS hiPS ба каламушҳои навзод тавлид шудааст. б, таҷдиди 3D нейронҳои t-hCO-и бо биоситин пуршуда пас аз 8 моҳи тафовут. в, миқдори миёнаи дарозии дендритӣ (n = 19 нейронҳои назоратӣ, n = 21 TS нейронҳо; ** P = 0.0041). г, шохаҳои дендритии 3D аз нав сохташуда аз назорат ва TS t-hCO дар 8 моҳи тафовут ва миқдори зичии сутунмӯҳраи дендритикӣ (n = 16 нейронҳои назоратӣ, n = 21 нейронҳои TS, *** P <0.0001). г, шохаҳои дендритии 3D аз нав сохташуда аз назорат ва TS t-hCO дар 8 моҳи тафовут ва миқдори зичии сутунмӯҳраи дендритикӣ (n = 16 нейронҳои назоратӣ, n = 21 нейронҳои TS, *** P <0.0001). г, 3D-реконструкцияи дендритных ветвей аз назорат ва TS t-hCO дар давоми 8 моҳ дифференцироӣ ва количественная осенка плотности дендритних шипов (n = 16 нейронҳои назоратӣ, n = 21 TS нейронов, *** P <0,). г, 3D таҷдиди шохаҳои дендритӣ аз назорат ва t-hCO TS дар 8 моҳи тафриқа ва миқдори зичии сутунмӯҳраи дендритикӣ (n = 16 нейронҳои назоратӣ, n = 21 TS нейронҳо, *** P <0.0001). d，分化8 个月时对照和TS t-hCO 的3D 重建树突分支，以及树突棘密度的量化（6个对照神经元，n = 21 个TS 神经元，***P <0,0001）。 d ， 分化 8 个 时 对照 和 ts t-hco 的 3d 重建 分支 分支 以及 树突棘 密度 （6n）神经 元 ， n = 21 个 ts 神经 ， *** p <0,0001 ）。 г, 3D-реконструкцияи дендритных ветвей контроля ва TS t-hCO дар давоми 8 мох дифференциировки ва количественная оценка плотности дендритных шипов (n = 16 назорати нейронов, n = 21 TS нейронов, *** P <0,00). г, 3D таҷдиди шохаҳои дендритии назоратӣ ва TS t-hCO дар 8 моҳи тафриқа ва миқдорӣ зичии сутунмӯҳра (n = 16 нейронҳои назоратӣ, n = 21 нейронҳои TS, *** P <0.0001).Ситораҳои сурх сутунмӯҳраҳои тахминии дендритиро нишон медиҳанд. д, EPSC-ҳои стихиявӣ дар назорат ва нейронҳои TS t-hCO пас аз 8 моҳи тафовут. f, сюжети басомади ҷамъшаванда ва миқдори басомад ва амплитудаи ҳодисаҳои синаптикӣ (n=32 нейронҳои назоратӣ, n=26 нейронҳои TS; **P = 0,0076 ва P = 0,8102). g, Таҳлили Шолл TS ва нейронҳои назоратӣ дар hCO ва t-hCO. Хатҳои рахнашуда нейронҳои пирамидавии баъдинаталии L2/3-и инсонро барои муқоиса нишон медиҳанд (n = 24 нейронҳои назорати t-hCO, n = 21 TS t-hCO нейронҳо, n = 8 нейронҳои hCO назоратӣ ва n = 7 нейронҳои TS hCO). Маълумот ҳамчун миёнаи ± инҳирофи стандартӣ ифода карда мешаванд
Қобилияти t-hCO барои такрор кардани хусусиятҳои морфологӣ ва функсионалии нейронҳои кортекси инсон дар сатҳи баланд моро водор кард, ки фаҳмем, ки оё t-hCO метавонад барои ошкор кардани фенотипҳои беморӣ истифода шавад. Мо ба TS, як ихтилоли шадиди рушди асабӣ, ки дар натиҷаи мутатсияҳои афзояндаи функсия дар ген кодгузори CaV1.2 ба вуҷуд омадааст, ки транскрипсияи генҳои аз фаъолият вобастаро дар нейронҳо оғоз мекунад, тамаркуз кардем. Мо hCO-ро аз се беморони TS, ки ивазкунандаи маъмултарин (p.G406R) ва се назоратро ба даст меоранд (расми 3а). Пас аз трансплантатсия, мо фаҳмидем, ки морфологияи дендритӣ дар нейронҳои TS нисбат ба назорат (расми 3b ва маълумоти васеъ, расми 8а, б), бо ду маротиба зиёд шудани шумораи дендритҳои ибтидоӣ ва афзоиши умумии миёна ва умумии камшавии дарозии дендритӣ (расми 3c ва маълумоти васеъ, расми 8c). Ин бо афзоиши зичии сутунмӯҳраҳо ва афзоиши басомади EPSC-ҳои стихиявӣ дар TS дар муқоиса бо нейронҳои назоратӣ алоқаманд буд (расми 3d-f ва маълумоти васеъ, расми 8g). Таҳлили минбаъда намунаҳои шохаҳои ғайримуқаррарии дендритикиро дар t-hCO TS дар муқоиса бо назорат нишон дод, аммо на дар in vitro TS hCO дар марҳилаи шабеҳи фарқият (расми 3g). Ин ба гузоришҳои қаблии мо дар бораи коҳишёбии дендритҳои вобаста ба фаъолият дар TS мувофиқ аст ва қобилияти ин платформаи трансплантатсияро барои ошкор кардани фенотипҳои бемориро дар vivo таъкид мекунад.
Пас аз он мо пурсидем, ки то чӣ андоза ҳуҷайраҳои t-hCO функсионалӣ ба каламуш S1 муттаҳид шудаанд. S1 дар хояндаҳо аз ядроҳои вентралии базалӣ ва ақибонаи таламӣ, инчунин кортикҳои мотории ифлос ва дуюмдараҷаи соматосенсорӣ ва S1 муқобили синаптикӣ воридоти қавӣ мегирад (расми 4а). Барои барқарор кардани шакли иннерватсия, мо hCO-ро бо вируси раби-dG-GFP/AAV-G сироят кардем ва пас аз 3 рӯз hCO-ро ба каламуш S1 кӯчондем. Мо ифодаи зиччи GFP-ро дар нейронҳои ipsilateral S1 ва ganglia basal ventral 7-14 рӯз пас аз трансплантатсия мушоҳида кардем (расми 4б, в). Илова бар ин, ранг кардани антитело аз маркери таламии нетрин G1 мавҷудияти ақсоҳои таламиро дар t-hCO ошкор кард (расми 4d, д). Барои муайян кардани он, ки оё ин пешгӯиҳои афферентӣ метавонанд аксуламалҳои синаптикиро дар ҳуҷайраҳои t-hCO ба вуҷуд оранд, мо сабтҳои пурраи ҳуҷайраҳоро аз ҳуҷайраҳои инсон дар қисматҳои тези қабати таламокортикалӣ анҷом додем. Ҳавасмандкунии электрикии каламуш S1, капсулаи дохилӣ, моддаи сафед, нахҳо дар наздикии t-hCO ё фаъолсозии оптогенетикии ақсоҳои таламикии опсин дар t-hCO боиси EPSC-ҳои кӯтоҳмуддат дар нейронҳои t-hCO, ки ба антагонисти ресепторҳои AMPA NBQX дучор мешаванд. (Расми 4f, g ва маълумоти васеъ, Расми 9а-г). Ин маълумотҳо нишон медиҳанд, ки t-hCO аз ҷиҳати анатомӣ ба мағзи каламуш дохил карда шудааст ва қодир аст аз ҷониби бофтаи мизбони каламуш фаъол карда шавад.
а, Диаграммаи схематикии таҷрибаҳои пайгирии разия. b, GFP ва ифодаи мушаххаси STEM121 ба инсон байни t-hCO ва кортекси мағзи каламуш (панели боло). Инчунин ифодаи GFP дар каламуш ядрои базалии вентралии ipsilateral (VB) (чап поён) ва ipsilateral S1 (рост поён) нишон дода шудааст. Бари миқёс, 50 ​​мкм. Майдончаҳои сурх минтақаҳои майнаро, ки дар он тасвирҳо гирифта шудаанд, намояндагӣ мекунанд. в, миқдори ҳуҷайраҳои ифодакунандаи GFP (n = 4 каламушҳо). d, e - терминалҳои Netrin G1 + thalamic дар t-hCO. d қисмати тоҷро нишон медиҳад, ки ядроҳои t-hCO ва VB доранд. Бари миқёс, 2 мм. e ифодаи Netrin G1 ва STEM121-ро дар нейронҳои t-hCO (чап) ва VB (рост) нишон медиҳад. Бари миқёс, 50 ​​мкм. Хати нуқтаи норанҷӣ сарҳади t-hCO-ро нишон медиҳад. f, g, Намоишҳои ҷории нейронҳои t-hCO пас аз ҳавасмандкунии электрикӣ дар каламуш S1 (f) ё капсулаи дохилӣ (g), бо (арғувон) ё бе (сиёҳ) NBQX (аз чап). Амплитудаҳои EPSC бо ва бидуни NBQX (n = 6 нейронҳои S1, * P = 0,0119; ва n = 6 нейронҳои дохилии капсула, ** P = 0,0022) (марказ). Фоизи нейронҳои t-hCO, ки EPSC-ро дар посух ба ҳавасмандкунии электрикии каламуш S1 (f) ё капсулаи дохилӣ (g) (аз рост) нишон медиҳанд. aCSF, моеъи сунъии мағзи сар. ч, диаграммаи схематикии тачрибахои тасвирии 2P (аз чап). Ифодаи GCaMP6s дар t-hCO (миёна). Бари миқёс, 100 мкм. Вақти флуоресцентии GCaMP6s (аз рост). ман, Z-холи флуоресценти фаъолияти стихиявӣ. j, тасвири схематикии њавасмандгардонии мўйлаб. k, z траекторияҳои флуорессенси 2P-ро дар як озмоиш баҳо дод, ки бо инҳироф дар вақти сифр (хати рахна) дар ҳуҷайраҳои мисол мувофиқат карда шудааст. l, вокунишҳои миёнаи z-холҳои ҳамаи ҳуҷайраҳо, ки бо инҳироф дар вақти сифр (хати хат) (сурх) ё тамғаҳои вақтҳои тасодуфӣ тавлидшуда (хокистарӣ) мувофиқанд. м. Диаграммаи схематикии таҷриба оид ба тамғагузории оптикӣ. n, Каҷҳои шиддати хом аз як ҳуҷайраи намунаи t-hCO ҳангоми ҳавасмандкунии лазерии кабуд ё каҷшавии висклер. Тирчаҳои сурх хӯшаҳои аввалро нишон медиҳанд, ки аз рӯшноӣ (боло) ба вуҷуд омадаанд ё аз каҷравии мушт (поён). Сояи хокистарӣ давраҳои каҷшавии мӯйро нишон медиҳад. o, Шаклҳои мавҷҳои нури авҷ ва аксуламалҳои каҷравӣ. р, хӯшаҳои як кӯшиши, мувофиқ бо инҳироф аз whiskers дар ҳуҷайраҳои мисол. 0 нишон медиҳад, ки инҳироф (хатти қаҳваранг). q, суръати оташфишонии z-холҳои аз рӯи аҳолӣ ба ҳисоби миёна барои ҳамаи ҳуҷайраҳои ҳассос, ки бо инҳироф дар вақти сифр (хати рахна) (сурх) ё тамғаҳои вақтҳои тасодуфӣ тавлидшуда (хокистарӣ) мувофиқат мекунанд. r, Таносуби воҳидҳои ҳассос ба таври назаррас аз ҷониби инҳирофии виск (n = 3 каламушҳо) (аз чап). Қуллаи ниҳоии z-хол (n = 3 каламушҳо; n = 5 (сабзи сабук), n = 4 (сабзи торик) ва n = 4 (кабуд) ададҳои модуляцияи фишурдани вискӣ дар як каламуш) (рост). Маълумот ҳамчун миёна ± инҳирофи стандартӣ ифода карда мешаванд
Пас аз он мо пурсидем, ки оё t-hCO метавонад тавассути ангезаҳои ҳассос дар vivo фаъол карда шавад. Мо hCO-ро трансплантатсия кардем, ки нишондиҳандаҳои калтсийи аз ҷиҳати генетикӣ рамзшуда GCaMP6-ро ба каламушҳои S1 ифода мекунанд. Пас аз 150 рӯз, мо фотометрияи нахӣ ё тасвири дуфотонии кальцийро анҷом додем (расми 4h ва маълумоти васеъ, расми 10а). Мо дарёфтем, ки ҳуҷайраҳои t-hCO фаъолияти ҳамоҳангшудаи ритмиро намоиш доданд (Расми 4i, Маълумоти васеъшуда, Расми 10b ва Видеои иловагӣ 1). Барои тавсиф кардани фаъолияти қуллаи t-hCO, мо сабтҳои электрофизиологии берун аз ҳуҷайраро дар каламушҳои трансплантатсияи анестетикӣ анҷом додем (маълумоти васеъ, расми 10c-f). Мо аз тасвирҳои MRI координатҳои стереотаксикӣ тавлид кардем; ҳамин тавр, ин воҳидҳои сабтшуда нейронҳои тахминии инсонро ифода мекунанд, гарчанде танҳо электрофизиология имкон намедиҳад, ки намуди пайдоиш муайян карда шавад. Мо таркишҳои ҳамоҳангшудаи фаъолиятро мушоҳида кардем (маълумоти васеъ, расми 10d). Таркишҳо тақрибан 460 мс давом карданд ва бо давраҳои хомӯшии тақрибан 2 сония ҷудо карда шуданд (маълумоти васеъ, расми 10d, e). Воҳидҳои инфиродӣ дар як таркиш ба ҳисоби миёна тақрибан се тир парронданд, ки тақрибан 73% воҳидҳои ба қайд гирифташуда дар як таркишро ташкил медиҳад. Фаъолияти воҳидҳои алоҳида ба ҳам зич алоқаманд буд ва ин коррелятсияҳо нисбат ба воҳидҳое, ки дар ҳайвоноти ваксиннашуда дар як шароит сабт шудаанд, баландтар буданд (маълумоти васеъ, расми 10f). Барои тавсифи минбаъдаи аксуламалҳои хӯшаи нейронҳои аз ҷониби инсон муайяншуда, мо таҷрибаҳои аломатгузории рӯшноиро дар каламушҳои наркозшуда бо hCO кӯчонидашуда анҷом додем, ки канали катионҳои ба рӯшноӣ ҳассосро ифода мекунад родопсин 2 (hChR2), ки тавассути он нейронҳои t-hCO шинохти кӯтоҳмуддатро дар бар мегиранд (камтар аз 10 ба стимуляторҳои кабуд дар). Нейронҳои t-hCO таркишҳои фаъолияти стихиявӣ дар басомадҳои шабеҳ ба онҳое, ки дар тасвири калсий мушоҳида мешаванд, инчунин сабтҳои электрофизиологӣ дар t-hCO ҳангоми набудани аломати равшанӣ (маълумоти васеъ, расми 10c-g) нишон доданд. Дар марҳилаҳои мувофиқи hCO, ки in vitro сабт шудааст, фаъолияти стихиявӣ мушоҳида нашудааст. Барои арзёбии он, ки оё t-hCO-ро тавассути ангезаҳои ҳассос фаъол кардан мумкин аст, мо ба таври мухтасар мӯйҳои каламушро аз t-hCO дур кардем (расми 4j, m ва маълумоти васеъ, расми 10h, k). Тибқи таҳқиқоти қаблӣ8,10, як зермаҷмӯи ҳуҷайраҳои t-hCO дар вокуниш ба каҷравии вискӣ фаъолнокии афзоишро нишон доданд, ки ҳангоми муқоисаи маълумот бо тамғаҳои тасодуфии вақт мушоҳида карда нашуд (расми 4k-q ва маълумоти васеъ, расми 10h-q). Воқеан, тақрибан 54% воҳидҳои ягонаи опто-марказшуда пас аз ҳавасмандкунии вискӣ суръати ба таври назаррас афзоишёфтаро нишон доданд, ки ба авҷи он тақрибан 650 мс мерасад (расми 4р). Якҷоя гирифта, ин маълумотҳо нишон медиҳанд, ки t-hCO воридоти функсионалии мувофиқро мегирад ва метавонад тавассути ангезаҳои муҳити зист фаъол карда шавад.
Сипас мо таҳқиқ кардем, ки оё t-hCO метавонад схемаҳоро дар каламушҳо барои назорати рафтор фаъол созад. Мо аввал таҳқиқ кардем, ки аксонҳои нейронҳои t-hCO ба бофтаҳои атрофи каламуш ворид мешаванд. Мо hCO-ро бо рамзгузории лентивируси hChR2, ки ба EYFP (hChR2-EYFP) пайваст карда шудааст, сироят кардем. Пас аз 110 рӯз, мо ифодаи EYFP-ро дар минтақаҳои кортикалии ipsilateral, аз ҷумла cortices шунавоӣ, моторӣ ва somatosensory, инчунин дар минтақаҳои subcortical, аз ҷумла striatum, Hippocampus ва таламус мушоҳида (расми 5a). Барои муайян кардани он, ки оё ин пешгӯиҳои эфферентӣ метавонанд аксуламалҳои синаптикиро дар ҳуҷайраҳои каламуш ба вуҷуд оранд, мо ҳуҷайраҳои t-hCO-ро, ки hChR2-EYFP-ро ифода мекунанд, тавассути сабти ҳуҷайраҳои кортекси мағзи каламуш дар қисмҳои тези майна ба таври оптикӣ фаъол кардем. Фаъолсозии аксонҳои t-hCO бо нури кабуд EPSC-ҳои кӯтоҳмуддатро дар нейронҳои пирамидавии кортекси каламушҳо ба вуҷуд оварданд, ки аз ҷониби NBQX баста шуданд (расми 5b-g). Илова бар ин, ин посухҳоро метавон бо тетродотоксин (TTX) маҳкам кард ва аз ҷониби 4-аминопиридин (4-АП) барқарор карда шавад, ки нишон медиҳад, ки онҳо аз пайвастагиҳои моносинаптикӣ ба вуҷуд омадаанд (расми 5e).
а, Диаграммаи схематикии пайгирии аксон (аз чап). ифодаи t-hCO EYFP (аз рост). Бари миқёс, 100 мкм. А1, кортекси шунавоӣ, АКС, кортекси пешини сингулятӣ, г. стриатум, стриатуми дорсалӣ, HPC, гиппокамп; Диафрагма, септуми паҳлӯӣ, mPFC, кортекси миёнаравӣ, пирӣ, кортекси пириформ, v. striatum, striatum ventral, VPM, ядрои вентропостомедиалии таламус, VTA, минтақаи tegmental ventral. Майдончаҳои сурх минтақаҳои майнаро, ки дар он тасвирҳо гирифта шудаанд, намояндагӣ мекунанд. б, Диаграммаи схематикии таҷрибаи ҳавасмандкунӣ. c, d, Намунаҳои аксуламали фотоҷараёни аз нури кабуд ба вуҷуд омада (боло) ва шиддат (поён) дар инсон (в) EYFP+ t-hCO ё каламуш (г) ҳуҷайраҳои EYFP. e, f, Нишонаҳои ҷории нейронҳои каламуш пас аз ҳавасмандкунии нури кабуди аксонҳои t-hCO бо TTX ва 4-AR (сабз), TTX (хокистарӣ) ё aCSF (сиёҳ) (д), бо (бунафш) ё бе (сиёҳ) ) ) NBQX (д). g, таъхири посухҳое, ки бо нури кабуд дар ҳуҷайраҳои каламуш ба вуҷуд омадаанд (n = 16 ҳуҷайра); сутунҳои уфуқӣ таъхири миёнаро нишон медиҳанд (7,13 мс) (аз чап). Амплитудаи EPSC-ҳои рӯшноӣ, ки бо NBQX ё бе NBQX сабт шудаанд (n = 7 ҳуҷайра; *** P <0,0001) (миёна). Амплитудаи EPSC-ҳои рӯшноӣ, ки бо NBQX ё бе NBQX сабт шудаанд (n = 7 ҳуҷайра; *** P <0,0001) (миёна). Амплитуда вызванных светом EPSC, зарегистрированных с ё бе NBQX (n = 7 клеток; ***P <0,0001) (дар марказ). Амплитудаи EPSC-ҳои рӯшноӣ, ки бо NBQX ё бе NBQX сабт шудаанд (n = 7 ҳуҷайра; *** P < 0,0001) (марказ).使用或不使用NBQX 记录的光诱发EPSC 的振幅（n = 7 个细胞；***P < 0,0001）（中）使用或不使用NBQX 记录的光诱发EPSC 的振幅（n = 7 个细胞；***P < 0,0001）（中） Амплитуда вызванных светом EPSC, зарегистрированных с ё бе NBQX (n = 7 клеток; ***P <0,0001) (дар марказ). Амплитудаи EPSC-ҳои рӯшноӣ, ки бо NBQX ё бе NBQX сабт шудаанд (n = 7 ҳуҷайра; *** P < 0,0001) (марказ).Фоизи ҳуҷайраҳои каламушҳо, ки EPSC-ро нишон медиҳанд, ки ба нури кабуд ҷавоб медиҳанд (аз рост). ч, Диаграммаи схематикии вазифаи рафтор. d0, рӯзи 0. i. Баромади хайвоноти намунавй дар рузи 1 (аз чап) ё рузи 15 (аз рост) машгулият. Миқдори миёнаи лесидҳо дар рӯзи 1 (чап) ё рӯзи 15 (маркази рост) (n = 150 озмоиши нури кабуд, n = 150 озмоиши нури сурх; *** P <0.0001). Миқдори миёнаи лесидҳо дар рӯзи 1 (чап) ё рӯзи 15 (маркази рост) (n = 150 озмоиши нури кабуд, n = 150 озмоиши нури сурх; *** P <0.0001). Среднее количество облизываний, выполненных в день 1 (слева) ё день 15 (дар маркази справа) (n = 150 испытаний с синим светом, n = 150 испытаний с синим светом; ***P <0,0001). Миқдори миёнаи лесидҳое, ки дар рӯзи 1 (чап) ё рӯзи 15 (аз рост) анҷом дода шудаанд (n = 150 озмоиши нури кабуд, n = 150 озмоиши чароғи сурх; *** P <0.0001).第1 天（左）或第15 天（右中）执行的平均舔次数（n = 150 次蓝光试验，，n =次红光试验；***P <0,0001）。第1 天（左）或第15 天（右中）执行的平均舔次数（n = 150 次蓝光试验，，n =次红光试验；***P < 0,001 Среднее количество облизываний, выполненных в день 1 (слева) ё день 15 (дар маркази справа) (n = 150 испытаний с синим светом, n = 150 испытаний с синим светом; ***P <0,0001). Миқдори миёнаи лесидҳое, ки дар рӯзи 1 (чап) ё рӯзи 15 (аз рост) анҷом дода шудаанд (n = 150 озмоиши нури кабуд, n = 150 озмоиши чароғи сурх; *** P <0.0001).Ласҳои ҷамъшуда барои озмоишҳои нури сурх ва кабуд дар рӯзи 1 (маркази чап) ё рӯзи 15 (аз рост). NS, муҳим нест. j,k, Хусусиятҳои рафтори ҳамаи ҳайвонҳое, ки бо t-hCO трансплантатсия карда шудаанд, ки hChR2-EYFP (j) ё назорати фторфор (к) дар рӯзи 1 ё 15 (hChR2-EYFP: n = 9 каламушҳо, ** P = 0,0049; назорат: n = 9, P = 0,149). l, Эволюцияи холҳои афзалият (n = 9 hChR2, n = 9 назорат; **P <0.001, ***P <0.0001). l, Эволюцияи холҳои афзалият (n = 9 hChR2, n = 9 назорат; **P <0.001, ***P <0.0001). л, Эволюция показателя предпочтения (n = 9 hChR2, n = 9 назорат; **P <0,001, ***P <0,0001). l, Эволюцияи холҳои афзалият (n = 9 hChR2, n = 9 назорат; **P <0.001, ***P <0.0001). l，偏好评分的演变（n = 9 hChR2，n = 9 对照；**P <0,001，***P <0,0001）。 l，偏好评分的演变（n = 9 hChR2，n = 9 对照；**P <0,001，***P <0,0001）。 л, Эволюция показателей предпочтения (n = 9 hChR2, n = 9 контролей; **P <0,001, ***P <0,0001). l, Эволюцияи холҳои афзалият (n = 9 hChR2, n = 9 назорат; **P <0.001, ***P <0.0001).м, ифодаи FOS дар посух ба фаъолсозии оптогенетикии t-hCO дар S1. Тасвирҳои ифодаи FOS (аз чап) ва миқдорӣ (n = 3 дар як гурӯҳ; *P <0,05, **P <0,01 ва ***P <0,001) (рост) нишон дода шудаанд. Тасвирҳои ифодаи FOS (аз чап) ва миқдорӣ (n = 3 дар як гурӯҳ; *P <0,05, **P <0,01 ва ***P <0,001) (рост) нишон дода шудаанд. Показани изображения экспрессии FOS (слева) ва количественное определения (n = 3 дар гурӯҳ; * P <0,05, ** P <0,01 ва *** P <0,001) (справа). Тасвирҳои ифодаи FOS (аз чап) ва миқдорӣ (n = 3 дар як гурӯҳ; *P<0.05, **P<0.01 ва ***P<0.001) нишон дода шудаанд (аз рост).显示了FOS 表达（左）和量化（每组n = 3；*P < 0,05、**P <0,01 和***P < 0,001）（右）（右）显示了FOS 表达（左）和量化（每组n = 3；*P < 0,05、**P <0,01 和***P < 0,001）（右）（右） Показани изображения экспрессии FOS (слева) ва количественное определения (n = 3 дар гурӯҳ; * P <0,05, ** P <0,01 ва *** P <0,001) (справа). Тасвирҳои ифодаи FOS (аз чап) ва миқдорӣ (n = 3 дар як гурӯҳ; *P<0.05, **P<0.01 ва ***P<0.001) нишон дода шудаанд (аз рост).Бари миқёс, 100 мкм. Маълумот ҳамчун хатои миёна ± стандартии BLA, бодомакҳои базолатералӣ, MDT, ядрои таламикии дорсомедиалӣ, PAG, хокистарии periaqueductal ифода карда мешаванд.
Дар ниҳоят, мо пурсидем, ки оё t-hCO метавонад рафтори каламушҳоро тағйир диҳад. Барои санҷидани ин, мо hChR2-EYFP-ифодакунандаи hCO-ро ба S1 кӯчондем ва пас аз 90 рӯз мо нахҳои оптикиро ба t-hCO барои интиқоли рӯшноӣ имплантатсия кардем. Сипас мо каламушҳоро бо парадигмаи тағирёфтаи кондитсионерӣ таълим додем (расми 5h). Мо ҳайвонотро дар камераи санҷиши рафтор ҷойгир кардем ва ба таври тасодуфӣ 5 сония ангезаҳои лазерии кабуд (473 нм) ва сурх (635 нм) татбиқ кардем. Ҳайвонҳо мукофоти об гирифтанд, агар онҳо ҳангоми ҳавасмандкунии нури кабуд лесида бошанд, аммо ҳангоми ҳавасмандкунии нури сурх лесид. Дар рӯзи аввали омӯзиш, ҳайвонҳо дар лесидан ҳангоми ангезиш бо нури кабуд ё сурх фарқият нишон надоданд. Аммо, дар рӯзи 15, ҳайвонҳое, ки бо hCO-и ифодакунандаи hChR2-EYFP трансплантатсия карда шудаанд, ҳангоми ҳавасмандкунӣ бо нури кабуд нисбат ба ҳавасмандкунии нури сурх лесидани фаъолтар нишон доданд. Ин тағирот дар рафтори лесидан дар ҳайвонҳои назоратӣ, ки бо hCO трансплантатсия карда шудаанд, ки флюорофори назоратро ифода мекунанд, мушоҳида карда нашуд (Меъёри муваффақияти омӯзиш: hChR2 89%, EYFP 0%, Расми 5i-1 ва Видеои иловагӣ 2). Ин маълумотҳо нишон медиҳанд, ки ҳуҷайраҳои t-hCO метавонанд нейронҳои каламушҳоро фаъол созанд, то рафтори ҷустуҷӯи мукофотро ҳавасманд кунанд. Барои фаҳмидани он, ки кадом схемаҳои асабии каламуш t-hCO метавонад дар ин тағйироти рафторӣ иштирок кунад, мо пас аз 90 дақиқа t-hCO-ро дар ҳайвонҳои омӯзонидашуда ва бофтаҳои ҷамъовардашуда ба таври оптогенетикӣ фаъол кардем. Иммуногистохимия ифодаи протеини аз фаъолият вобастагии FOS-ро дар якчанд минтақаҳои мағзи сар, ки дар рафтори ангезанда иштирок мекунанд, ошкор намуд, аз ҷумла кортекси медиалии префронталӣ, таламуси миёна ва материяи хокистарии периакведукталӣ, ки дар ҳайвонҳои назоратии бе ҳавасманд ё дар ҳайвонот ифода ёфтааст. биринҷ. 5м). Якҷоя гирифта, ин маълумотҳо нишон медиҳанд, ки t-hCO метавонад фаъолияти нейронҳои каламушҳоро барои пешбурди рафтор тағйир диҳад.
Органоидҳои асабӣ як системаи ояндадори омӯзиши рушди инсон ва бемориҳоро дар in vitro муаррифӣ мекунанд, аммо онҳо бо набудани робитаҳо байни схемаҳое, ки дар vivo вуҷуд доранд, маҳдуданд. Мо як платформаи наверо таҳия кардем, ки дар он мо hCO-ро ба S1 аз каламушҳои барвақти пасазнаталии пас аз таваллуд трансплантатсия кардем, то инкишоф ва фаъолияти ҳуҷайраҳои инсон дар vivo омӯхта шавад. Мо нишон додем, ки t-hCO намудҳои ҳуҷайраҳои баркамолро, ки дар vitro28 мушоҳида нашудаанд, инкишоф медиҳад ва t-hCO аз ҷиҳати анатомӣ ва функсионалӣ ба майнаи хояндаҳо муттаҳид шудааст. Интегратсияи t-hCO ба микросхемаҳои асабии хояндаҳо ба мо имкон дод, ки робитаи байни фаъолияти ҳуҷайравии инсон ва рафтори ҳайвоноти омӯхташударо барқарор кунем ва нишон дод, ки нейронҳои t-hCO метавонанд фаъолияти нейронии каламушҳоро барои пешбурди аксуламалҳои рафторӣ тағйир диҳанд.
Платформае, ки мо тавсиф мекунем, нисбат ба тадқиқоти қаблӣ оид ба трансплантатсияи ҳуҷайраҳои инсон ба майнаи хояндаҳо як қатор бартариҳо дорад. Аввалан, мо hCO-ро ба кортекси инкишофёбандаи каламушҳои баъдинаталӣ интиқол додем, ки метавонад ба ҳамгироии анатомӣ ва функсионалӣ мусоидат кунад. Дуюм, мониторинги MRI t-hCO ба мо имкон дод, ки мавқеи пайванд ва афзоиши ҳайвоноти зиндаро омӯзем, ки ба мо имкон дод, ки таҳқиқоти дарозмуддати ҳайвонотро гузаронем ва эътимоднокии якчанд хатҳои ҳуҷайраи hiPS-ро муқаррар кунем. Ниҳоят, мо органоидҳои солимро трансплантатсия кардем, на суспензияҳои алоҳидаи якҳуҷайра, ки барои ҳуҷайраҳои инсон камтар харобиоваранд ва метавонанд ба ҳамгироӣ ва тавлиди нейронҳои кортекси инсон дар майнаи каламуш мусоидат кунанд.
Мо эътироф менамоем, ки сарфи назар аз пешрафтҳо дар ин платформа, маҳдудиятҳои муваққатӣ, фазоӣ ва байнинамудҳо ба ташаккули схемаҳои асабҳои инсон бо садоқати баланд, ҳатто пас аз трансплантатсия дар марҳилаи аввали рушд монеъ мешаванд. Масалан, маълум нест, ки фаъолияти стихиявии дар t-hCO мушоҳидашуда як фенотипи рушди шабеҳ ба фаъолияти ритмикӣ, ки ҳангоми рушди кортикалӣ мушоҳида мешавад ё ин ки оё он аз сабаби набудани намудҳои супрессивии ҳуҷайраҳои дар t-hCO мавҷудбуда аст. Ба ҳамин монанд, маълум нест, ки то чӣ андоза набудани ламинатсия дар t-hCO ба пайвастшавии занҷир30 таъсир мерасонад. Корҳои оянда ба ҳамгироии дигар намудҳои ҳуҷайраҳо, аз қабили микроглияи инсон, ҳуҷайраҳои эндотелиалии инсон ва таносуби гуногуни интернейронҳои GABAergic, ки бо истифода аз Ассамблеяи 6 in vitro нишон дода шудаанд, инчунин фаҳмидани он, ки чӣ гуна ҳамгироӣ ва коркарди асаб дар тағирёфтаи t-hCO рух медиҳад. сатҳи транскриптӣ, синаптикӣ ва рафторӣ дар ҳуҷайраҳои аз беморон гирифташуда.
Дар маҷмӯъ, ин платформаи in vivo як манбаи пуриқтидорест, ки метавонад дар in vitro рушди мағзи сари инсон ва таҳқиқоти бемориро мукаммал созад. Мо интизорем, ки ин платформа ба мо имкон медиҳад, ки фенотипҳои сатҳи навро дар ҳуҷайраҳои ба таври дигар дастнорас аз беморон кашф кунем ва стратегияҳои нави терапевтиро санҷем.
Мо hCO2.5-ро аз ҳуҷайраҳои HiPS, тавре ки дар боло тавсиф шудааст, тавлид кардем. Барои оғози истеҳсоли hCO аз ҳуҷайраҳои hiPS, ки дар қабатҳои ғизоӣ парвариш карда шудаанд, колонияҳои солимии ҳуҷайраҳои hiPS аз табақҳои фарҳангӣ бо истифода аз dispase (0,35 мг/мл) хориҷ карда шуданд ва ба фарҳангҳои пластикии ултра пасти замима интиқол дода шуданд, ки дорои табақҳо бо муҳити фарҳангии ҳуҷайраҳои hiPS мебошанд. (Корнинг) бо ду ингибитори SMAD Дорсоморфин (5 μM; P5499, Sigma-Aldrich) ва SB-431542 (10 μM; 1614, Tocris) ва ингибитори ROCK Y-27632 (10 μM; S1049, Selleckchem) илова карда шудааст. Дар давоми 5 рӯзи аввал, муҳити ҳуҷайраи hiPS ҳар рӯз иваз карда шуд ва дорсоморфин ва SB-431542 илова карда шуданд. Дар рӯзи шашуми суспензия, сфероидҳои асаб ба муҳити асабӣ интиқол дода шуданд, ки дорои нейробазал-А (10888, Life Technologies), иловаи B-27 бе витамини А (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies), пенициллин ва LifeTechnologies (110) ва: бо омили афзоиши эпидермалӣ (EGF; 20 нг мл-1; R&D Systems) ва омили афзоиши фибробласт 2 (FGF2; 20 нг мл-1; Systems R&D) то рӯзи 24. Аз рӯзи 25 то рӯзи 42, миёна бо омили нейротрофии аз мағзи сар гирифташуда (BDN-2) илова карда шуд. нейротрофин 3 (NT3; 20 нг мл-1; Пепротех) бо тағирёбии миёна ҳар рӯз. Дар рӯзи шашуми суспензия, сфероидҳои асаб ба муҳити асабӣ интиқол дода шуданд, ки дорои нейробазал-А (10888, Life Technologies), иловаи B-27 бе витамини А (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies), пенициллин ва LifeTechnologies (110) ва: бо омили афзоиши эпидермалӣ (EGF; 20 нг мл-1; R&D Systems) ва омили афзоиши фибробласт 2 (FGF2; 20 нг мл-1; Systems R&D) то рӯзи 24. Аз рӯзи 25 то рӯзи 42, миёна бо омили нейротрофии аз мағзи сар гирифташуда (BDN-2) илова карда шуд. нейротрофин 3 (NT3; 20 нг мл-1; Пепротех) бо тағирёбии миёна ҳар рӯз.Дар рӯзи шашуми суспензия, сфероидҳои асаб ба муҳити асабӣ интиқол дода шуданд, ки дорои Neurobasal-A (10888, Life Technologies), B-27 бе витамини А (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies), пенициллин мебошанд.и стрептомицин (1:100, Life Technologies) ва дополнении эпидермалии омилҳои роста (EGF; 20 нг/мл; R&D Systems) ва омилҳои роста фибробластов 2 (FGF2; 20 нг/мл; R&D Systems) то 24-то. ва стрептомицин (1:100, Life Technologies) ва бо омили афзоиши эпидермалӣ (EGF; 20 нг/мл; R&D Systems) ва омили афзоиши фибробласт 2 (FGF2; 20 нг/мл; Systems R&D) то рӯзи 24 илова карда шудааст.Аз рӯзҳои 25 то 42 ба муҳити атроф омили нейротрофии мағзи сар (BDNF; 20 нг мл-1, Пепротех) ва нейротрофин 3 (NT3; 20 нг мл-1, Пепротех) илова карда шуданд, ки миёнаро ҳар рӯз иваз мекунанд.在悬浮的第6 天，将神经球体转移到含有neurobasal-A（10888，Life Technologies）、不含维A2-生补充剂（12587，Life Technologies）、GlutaMax（1:100，Life Technologies）、青霉素的神经培养基中剂1） Technologies）并辅以表皮生长因子（EGF；20 ng ml-1；Sistemҳои R&D）和成纤维维细胞生长因子F2（F2（R&D Systems）直至第24 天。在 悬浮 的 第 第 6 天 将 神经 球体 转移 含有 含有 neurobasal-a （10888 a ， Life Technologies 维维的 b-27 补充剂 （12587 ， Life Technologies） Glutamax （1: 100 ， Life TechNOGIS青霉素 的 神经 培养 神经 培养 基100 ， Life Technologies） 表皮 生长 因子 （（（20 ng ml-1 ； r & d Systems） 成 纤维 细胞 生长 细胞 生长 2（fg2； 1；Системаҳои R&D）直至第24天。 Дар 6-й деннь суспензияи нейросферӣ ва переведенӣ дар добавку, содержащюю нейробазал-А (10888, Life Technologies), добавку В-27 бе витамина А (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies), стрептомицин (1:100, Life Technologies) бо таъсири эпидермалии омилҳои роста (EGF; 20 нг мл-1; R&D Systems) ва омили роста фибробластов 2 (FGF2; 20 нг мл-1) 1; Дар рӯзи 6, суспензияҳои нейросфера ба иловаи дорои нейробазал-А (10888, Life Technologies), иловаи B-27 бе витамини А (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies), пенициллин-нейтрализатсияшудаи Life Technologies (01) иваз карда шуданд. бо омили афзоиши эпидермалӣ (EGF; 20 нг мл-1; R&D Systems) ва омили афзоиши фибробласт 2 (FGF2; 20 нг мл-1) 1; R&D Systems) то 24-сола. Системаҳои R&D) то рӯзи 24.Аз рӯзҳои 25 то 42 ба муҳити парвариш ҳар рӯз омили нейротрофии мағзи сар (BDNF; 20 нг мл-1, Пепротех) ва омили нейротрофии 3 (NT3; 20 нг мл-1, Пепротех) илова карда шуданд. Тағйирёбии миёна як маротиба.Аз рӯзи 43 сар карда, hCO дар муҳити илованашудаи нейробазал-А (NM; 1088022, Thermo Fisher) бо тағирёбии миёна ҳар 4-6 рӯз нигоҳ дошта мешуд. Барои ба даст овардани hCO аз ҳуҷайраҳои hiPS, ки дар шароити ғизоӣ парвариш карда шудаанд, ҳуҷайраҳои hiPS бо Accutase (AT-104, Innovate Cell Technologies) дар 37 ° C дар тӯли 7 дақиқа инкубатсия карда шуданд, ба ҳуҷайраҳои ягона тақсим карда шуданд ва дар AggreWell 800 плитаҳои (34815, STEMCELL дар як ҳуҷайраи 360 Technologies) ҷойгир карда шуданд. Муҳити Essential 8, ки бо ингибитори ROCK Y-27632 (10 μM; S1049, Selleckchem) илова карда шудааст. Пас аз 24 соат, медиа дар чоҳҳо ба боло ва поён пипета карда шуданд, ки медиаи дорои Essential 6 (A1516401, Life Technologies) бо дорсоморфин (2,5 мкМ; P5499, Sigma-Aldrich) ва SB-431542 (10 μM4; , Токрида). Аз рӯзҳои 2 то 6, миёнаравии Essential 6 ҳар рӯз бо дорсоморфин ва иловаи SB-431542 иваз карда шуд. Аз рӯзи шашум, суспензияҳои нейросфера ба муҳити нейробазал интиқол дода шуданд ва тавре ки дар боло тавсиф карда шудаанд, нигоҳ дошта шуданд.
Ҳама расмиёти ҳайвонот мувофиқи дастурҳои нигоҳубини ҳайвонот, ки аз ҷониби Кумитаи маъмурии нигоҳубини ҳайвоноти лабораторияи Донишгоҳи Стэнфорд (APLAC) тасдиқ шудааст, анҷом дода шуданд. Каламушҳои ҳомиладори эвтимикии RNU (rnu/+) харида шуданд (Лабораторияҳои Чарлз Ривер) ё ҷойгир карда шуданд. Ҳайвонот дар давраи 12-соатаи рӯшноӣ ва торикӣ бо ғизо ва об ad libitum нигоҳ дошта мешуданд. Сагбачаҳои каламушҳои бараҳна (FOXN1–/–) аз се то ҳафтрӯза аз рӯи афзоиши мӯйҳои беқувват пеш аз нест кардан муайян карда шуданд. Сагбачаҳо (мард ва зан) бо изофлуран 2-3% наркоз карда, дар чаҳорчӯбаи стереотаксикӣ ҷойгир карда шуданд. Трепанатсияи косахонаи сар бо диаметраш тақрибан 2-3 мм аз S1 боло бо нигоҳ доштани бутунии матери дура анҷом дода шуд. Сипас сӯзани 30-G (тақрибан 0,3 мм) берун аз краниотомия барои сӯрох кардани дураро истифода баред. Сипас HCO-ро ба парафилми тунуки 3×3 см молед ва муҳити зиёдатиро хориҷ кунед. Бо истифода аз сӯзандоруи Гамильтон, ки ба сӯзани 23 Г, 45° пайваст карда шудааст, hCO-ро бо нармӣ ба канори аз ҳама дуртарини сӯзан кашед. Сипас сӯзандоруро ба насоси сӯзандоруи ба дастгоҳи стереотаксикӣ пайвастшуда насб кунед. Сипас нӯги сӯзанро болои сӯрохи сӯрохии қаблан сохташудаи 0,3 мм дар дура (z = 0 мм) ҷойгир кунед ва сӯзандоруро то 1–2 мм (z = тақрибан -1,5 мм) танг кунед, то сӯзан дар байни dura mater A. мӯҳри зич пайдо шавад. Сипас сӯзандоруро ба маркази сатҳи кортикалӣ дар z = -0,5 мм баланд кунед ва hCO-ро бо суръати 1-2 мкл дар як дақиқа ворид кунед. Пас аз ба итмом расидани сӯзандоруи hCO, сӯзанро бо суръати 0,2-0,5 мм дар як дақиқа кашида, пӯстро дӯхта, сагбачаро фавран ба рӯйпӯши гармидиҳии гарм то барқароршавии пурра мегузоранд. Баъзе хайвонот дутарафа трансплантация карда шуданд.
Ҳама расмиёти ҳайвонот мувофиқи дастурҳои нигоҳубини ҳайвонот аз ҷониби Донишгоҳи Стэнфорд, ки аз ҷониби APLAC тасдиқ шудааст, анҷом дода шуданд. Каламушҳо (зиёда аз 60 рӯз пас аз трансплантатсия) бо анестезияи 5% изофлуран индуксия карда шуданд ва ҳангоми тасвир бо 1-3% изофлуран наркоз карда шуданд. Барои визуализатсия, сканери горизонталии чоҳҳои уфуқии 7 Tesla Bruker (Bruker Corp.) бо гардонандаи градиентии Ширкати Байналмилалии Электрикӣ (IECO), василаи градиенти муҳофизатшаванда бо диаметри дохилии 120 мм (600 мТ/м, 1000 Т/м/с) бо истифода аз AVANCE истифода шуд. III, ҳашт канали бисёркалонаи RF ва қобилиятҳои бисёраслӣ ва платформаи ҳамроҳи Paravision 6.0.1. Сабт бо истифода аз як кати фаъоли ҷудошудаи ҳаҷмии РБ бо диаметри дохилии 86 мм ва як кати чорканалии крио сардшудаи РБ танҳо барои қабул анҷом дода шуд. Axial 2D Turbo-NARE (вақти такрор = 2500 мс, вақти аксбардорӣ = 33 мс, 2 миёна) бо 16 сабти бурида, ғафсии буридаи 0,6–0,8 мм, дорои 256 × 256 намуна. Сигналҳо бо истифода аз чорчӯбаи интиқолдиҳандаи ҳаҷмии RF бо диаметри дохилии 2 см (Rapid MR International, LLC) қабул карда шуданд. Ниҳоят, функсияҳои баҳодиҳии рӯизаминии Imaris (BitPlane) -ро барои намоиши 3D ва таҳлили ҳаҷм истифода баред. Трансплантатсияи бомуваффақият ҳамчун яке аз он муайян карда шуд, ки дар он минтақаҳои сигнали MRI-и бардавом T2 дар нимкураи трансплантатсияшуда ташаккул ёфтаанд. Рад кардани пайванд ҳамчун пайванде муайян карда шуд, ки дар нимкураи трансплантатсияшуда минтақаҳои сигнали MRI-и бардавом T2-ро ба вуҷуд наовард. t-hCO subcortical аз таҳлили минбаъда хориҷ карда шуд.
Барои мӯътадил ифода кардани GCaMP6s дар hCO барои тасвири дуфотонии калсий, ҳуҷайраҳои hiPS бо pLV[Exp]-EF1a::GcaMP6s-WPRE-Puro ва пас аз интихоби антибиотикҳо сироят карда шуданд. Хулоса, ҳуҷайраҳо бо EDTA ҷудо карда шуданд ва дар 1 мл муҳити Essential 8 бо зичии тақрибан 300,000 ҳуҷайра дар ҳузури полибрен (5 мкг / мл) ва 15 мкл вирус боздошта шуданд. Пас аз он ҳуҷайраҳо дар суспензия барои 60 дақиқа инкубатсия карда шуданд ва дар зичии 50,000 ҳуҷайра дар як чоҳ тухм карда шуданд. Пас аз омехта шудан, ҳуҷайраҳо бо 5-10 мкг мл-1 пуромицин дар давоми 5-10 рӯз ё то пайдо шудани колонияҳои устувор коркард карда шуданд. Сирояти шадиди hCO тавре ки қаблан тавсиф шуда буд5 бо баъзе тағиротҳо анҷом дода шуд. Ба таври мухтасар, дар рӯзи 30-45 hCO ба қубурҳои микроцентрифугаи 1,5 мл Эппендорф, ки дорои 100 мкл муҳити асаб мебошанд, интиқол диҳед. Сипас тақрибан 90 мкл муҳити атроф хориҷ карда мешавад, 3-6 мкл лентивируси титрашон баланд (аз 0,5 x 108 то 1,2 х 109) ба найча илова карда мешавад ва hCO ба инкубатор барои 30 дақиқа интиқол дода мешавад. Сипас ба ҳар як найча 90-100 мкл миёна илова кунед ва найҳоро шабона ба инкубатор баргардонед. Рӯзи дигар, интиқоли hCO ба миёна асаб тару тоза дар заррин замима паст. Пас аз 7 рӯз, hCO барои визуализатсия ва арзёбии сифати сироят ба плитаҳои поёни шишагии 24-чоҳ интиқол дода шуд. pLV[Exp]-SYN1::EYFP-WPRE ва pLV[Exp]-SYN1::hChR2-EYFP-WPRE аз ҷониби VectorBuilder тавлид шудаанд. Лентивирус дар аксари таҷрибаҳо истифода мешавад, зеро он ба геноми мизбон дохил карда шудааст ва имкон медиҳад, ки генҳои хабарнигор дар хатҳои ҳуҷайраҳои сироятшуда ифода карда шаванд. Барои пайгирии бемории қум, рӯзи 30-45 hCO бо rabies-ΔG-eGFP ва AAV-DJ-EF1a-CVS-G-WPRE-pGHpA (плазмиди # 67528, Addgene) сироят карда шуд, дар тӯли 3 рӯз бодиққат шуста шуд ва дар S1 рӯз ба каламушҳо кӯчонида шуд ва нигоҳдорӣ карда шуд.
Барои иммуноцитохимия, ҳайвонҳо наркоз карда шуданд ва ба таври транскардиалӣ бо PBS ва пас аз 4% параформальдегид (PFA дар PBS; Илмҳои микроскопияи электронӣ) перфузия карда шуданд. Майнаҳо дар 4% PFA барои 2 соат ё дар як шабонарӯз дар 4 ° C муқаррар карда шуданд, дар 30% сахароза дар PBS барои 48-72 соат криоконсерватсия карда шуданд ва дар 1: 1, 30% сахароза ворид карда шуданд: OCT (Tissue-Tek OCT Compound 4583, Сакура Финетек) ва бо истифода аз секцияи корон дар 0 мкм сохта шуданд. (Лейка). Барои иммуногистохимияи қисмҳои ғафс, ҳайвонот бо PBS перфузия карда шуданд ва мағзи сар бо истифода аз vibratome (Leica) дар 300-400 мкм ҷудо карда, тоҷӣ тақсим карда шуд ва бахшҳо бо 4% PFA барои 30 дақиқа мустаҳкам карда шуданд. Сипас криосекцияҳо ё қисмҳои ғафс бо PBS шуста, барои 1 соат дар ҳарорати хонагӣ маҳкам карда шуданд (10% хунобаи муқаррарии хар (NDS) ва 0,3% Triton X-100 дар PBS маҳлул карда шудааст) ва бо маҳлули блокатор дар 4 ° C баста шуданд. – Инкубатсия Криосекцияҳо як шабонарӯз инкубатсия карда шуданд ва қисмҳои ғафс барои 5 рӯз инкубатсия карда шуданд. Антителоҳои ибтидоии истифодашуда инҳо буданд: зидди NeuN (муш, 1:500; ab104224, abcam) зидди CTIP2 (каламуш, 1:300; ab18465, abcam), зидди GFAP (харгӯш, 1:1,000; Z0334, Dako), зидди GFP, GTX190en; GeneTex), зидди HNA (муш, 1:200; ab191181, abcam), зидди NeuN (харгӯш, 1:500; ABN78, Millipore), зидди PDGFRA (харгӯш, 1:200; sc-338, Санта Круз), зидди PPP1R17 (харгӯш, H4019:2010) Антитело), ​​анти-RECA-1 (муш, 1:50; ab9774, abcam), зидди SCG2 (харгӯш, 1:100; 20357-1-AP, Proteintech), зидди SOX9 (буз, 1:500; AF3075, R&D Systems), Netrin, R&D; Системаҳо), зидди STEM121 (муш, 1:200; Y40410, Takara Bio), зидди SATB2 (муш, 1:50; ab51502, abcam), зидди GAD65/67 (харгӯш, 1:400; ABN904, Millipore) ва зидди IBA1 (goat, abcam50,). Антителоҳои ибтидоии истифодашуда инҳо буданд: зидди NeuN (муш, 1:500; ab104224, abcam) зидди CTIP2 (каламуш, 1:300; ab18465, abcam), зидди GFAP (харгӯш, 1:1,000; Z0334, Dako), зидди -GFP (chick, GTX190en); GeneTex), зидди HNA (муш, 1:200; ab191181, abcam), зидди NeuN (харгӯш, 1:500; ABN78, Millipore), зидди PDGFRA (харгӯш, 1:200; sc-338, Санта Круз), зидди PPP1R17 (харгӯш, H4019:2010) Антитело), ​​анти-RECA-1 (муш, 1:50; ab9774, abcam), зидди SCG2 (харгӯш, 1:100; 20357-1-AP, Proteintech), зидди SOX9 (буз, 1:500; AF3075, R&D Systems), Netrin G061; Системаҳои R&D), зидди STEM121 (муш, 1:200; Y40410, Takara Bio), зидди SATB2 (муш, 1:50; ab51502, abcam), зидди GAD65/67 (харгӯш, 1:400; ABN904, Millipore) ва зидди-IBA51 (ab,0701;) abcam). Использовались следующие первичные антитела: анти-NeuN (мышиные, 1:500; ab104224, abcam), анти-CTIP2 (крысиные, 1:300; ab18465, abcam), анти-GFAP (кроличьи, 1:0340), анти; (курица, 1:1000; GTX13970, GeneTex), анти-HNA (мышь, 1:200; ab191181, abcam), анти-NeuN (кролик, 1:500; ABN78, Millipore), анти-PDGFRA (кролик, 1:200, анти-PDGFRA, анти-HNA, 1:2080, СанК301-1); (кролик, 1:200; HPA047819, Atlas Antiboes), анти-RECA-1 (мышь, 1:50; ab9774, abcam), анти-SCG2 (кролик, 1:100; 20357-1-AP, Proteintech), анти-SOX9 (R350, Systems), нетрин G1a (козий, 1:100; AF1166, R&D Systems), анти-STEM121 (мышиный , 1:200; Y40410, Takara Bio), анти-SATB2 (мышь, 1:50; ab51502, abcam), анти-GAD65/640N (ABC) Millipore) ва анти-IBA1 (коза, 1 :100; аб5076, абкам). Антителоҳои ибтидоии истифодашуда инҳо буданд: зидди NeuN (муш, 1:500; ab104224, abcam), зидди CTIP2 (каламуш, 1:300; ab18465, abcam), зидди GFAP (харгӯш, 1:1000; Z0334, Dako), зидди GFP (chicken, GTX190), зидди HNA (муш, 1:200; ab191181, abcam), зидди NeuN (харгӯш, 1:500; ABN78, Millipore), зидди PDGFRA (харгӯш, 1:200; sc-338, Санта Круз), зидди PPP1R17 (харгӯш, H1907, At Antibo), зидди RECA-1 (муш, 1:50; ab9774, abcam), зидди SCG2 (харгӯш, 1:100; 20357-1-AP, Proteintech), зидди SOX9 (буз, 1:500; AF3075, R&D Systems), netrin G1a (буз, R&D Systems):106;- STEM121 (муш, 1:200; Y40410, Takara Bio), зидди SATB2 (муш, 1:50; ab51502, abcam), зидди GAD65/67 (харгӯш, 1:400; ABN904, Millipore) ва зидди IBA1 (буз, abkam; 15010).使用的一抗是：抗NeuN（小鼠＠,1:500；ab104224，abcam）抗CTIP2（大鼠＠,1:3 00；ab18465，abcam），抗GFAP（兔，1:1,000；Z0334，Dako）,抗-GF P（鸡，1:1,000；GTX13970，GeneTex），抗HNA（小鼠＠,1:200；ab1911 81，abcam），抗NeuN（兔，1:500；ABN78，Millipore），抗PDGFRA（兔， 1:200；sc-338，Санта Круз），抗PPP1R17（兔，1:200；HPA047819，Атлас抗体），抗RECA-1（小鼠＠,1:50；ab9774，abcam），抗SCG2（兔）, 1:100；20357-1-AP，Proteintech），抗SOX9（山羊，1:500；AF3075， Systems R&D）, Netrin G1a（山羊0（山羊0，6；1:11 Системаҳо），抗STEM121（小鼠, 1:200;使用的一抗是：抗NeuN（小鼠＠,1:500；ab104224，abcam）抗CTIP2（大鼠＠，1 :300；ab18465，abcam），抗GFAP（兔，1:1,000；Z0334，Dako），抗-GFP（鸡，1:1,000；GTX13970，GeneTex），抗HNA（小鼠＠,1:200；ab 191181，abcam），抗NeuN（兔，1:500；ABN78，Millipore％弔４,抗1: 200；sc-338，Санта Круз），抗PPP1R17（兔，1:200；HPA047819，Атлас抗体），抗RECA-1（小鼠＠,1:50；ab9774，abcam），抗SCG2 100；20357-1-AP，Proteintech），抗SOX9（山羊，1:500；AF3075，R&D Systems），Netrin G1a（山羊；, AF110D, 1:10D Системаҳо）頏1:20, ;Y40410, Takara Bio), зидди SATB2 (муш, 1:50; ab51502, abcam), зидди GAD65/67 (харгӯш, 1:400; ABN904, Millipore) ва зидди IBA1 (буз, 1:100; ab5076, abcam)。Антителоҳои ибтидоии истифодашуда инҳо буданд: зидди NeuN (муш, 1:500; ab104224, abcam), зидди CTIP2 (каламуш, 1:300; ab18465, abcam), зидди GFAP (харгӯш, 1:1000; Z0334, Дако). , зидди GFP (мурғ, 1:1000; GTX13970, GeneTex), зидди HNA (муш, 1:200; ab191181, abcam), зидди NeuN (харгӯш, 1:500; ABN78, Millipore), зидди PDGFRA (харгӯш, SC30, C:20, 1;- зидди PPP1R17 (харгӯш, 1:200; HPA047819, антитело Атлас), анти-RECA-1 (муш, 1:50; ab9774, abcam), зидди SCG2 (харгӯш), 1:100;20357-1-AP, Proteintech), анти-SOX9 (коза, 1:500; AF3075, R&D Systems), Нетрин G1a (коза, 1:100; AF1166, R&D Systems), анти -STEM121 (мышь, 1:200; Y4041, Takara, Y4041) 1:50; ab51502, abcam), анти-GAD65/67 (кролик, 1:400; ABN904, Millipore) ва анти-IBA1 (коза, 1:100; аб5076, абкам). 20357-1-AP, Proteintech), зидди SOX9 (буз, 1:500; AF3075, R&D Systems), Netrin G1a (буз, 1:100; AF1166, R&D Systems), зидди STEM121 (муш, 1:200; anti-Takaramo, Y4021), 1:50; ab51502, abcam), зидди GAD65/67 (харгӯш, 1:400; ABN904, Millipore) ва зидди IBA1 (буз, 1:100; ab5076, abkam).Пас аз он қисмҳо бо PBS шуста шуданд ва бо антитело дуюмдараҷа барои 1 соат дар ҳарорати хонагӣ (қисмҳои яхкардашуда) ё шабона дар 4 ° C (қисмҳои ғафс) инкубатсия карда шуданд. Антиденои дуюмдараҷаи Alexa Fluor (Life Technologies) дар маҳлули блоккунанда дар 1:1000 маҳлул карда шуд. Пас аз шустан бо PBS, ядроҳо бо Hoechst 33258 (Life Technologies) визуалӣ карда шуданд. Ниҳоят, слайдҳо дар микроскоп бо пӯшишҳо (Fisher Scientific) бо истифода аз Aquamount (Polysciences) ҷойгир карда шуданд ва дар микроскопи флуоресцентии Keyence (анализатори BZ-X) ё микроскопи конфокалии Leica TCS SP8 (Las-X) дар тасвир таҳлил карда шуданд. Тасвирҳо бо истифода аз барномаи ImageJ (Фиҷи) коркард карда шуданд. Барои муайян кардани таносуби нейронҳои инсон дар t-hCO ва кортекси каламуш, дар маркази t-hCO, дар канори кортекси каламуш ё дар наздикии 387,5 мкм тасвирҳои росткунҷа гирифта шуданд. Маржаҳои пайванд тавассути арзёбии тағирот дар шаффофияти бофтаҳо, ядроҳои HNA+ ва/ё мавҷудияти автофлуорессенсияи бофта муайян карда шуданд. Дар ҳар як тасвир шумораи умумии ҳуҷайраҳои NeuN+ ва HNA+ ба шумораи умумии ҳуҷайраҳои NeuN+ дар ҳамон минтақа тақсим карда шуд. Барои он, ки танҳо ҳуҷайраҳои дорои ядроҳо дар ҳамвории тасвир ҳисоб карда мешаванд, ба ҳисоб танҳо ҳуҷайраҳое дохил карда мешаванд, ки Hoechst+ мебошанд. Барои кам кардани хатогиҳои оморӣ ду тасвире, ки на камтар аз 1 мм аз ҳам ҷудо карда шудаанд, ба ҳисоби миёна гирифта шуданд.
Як ҳафта пеш аз ҷамъоварии намуна, ҳайвонҳои трансплантатсияи hCO-ро (тақрибан 8 моҳи тафовут) дар як ҳуҷраи торик бо мӯйҳои мӯй барои кам кардани ҳавасмандкунии ҳассос ҷойгир кунед. Ҷудокунии ядроҳо тавре анҷом дода шуд, ки қаблан тавсиф шуда буд, бо баъзе тағйирот. Ба таври мухтасар, t-hCO ва hCO бо истифодаи лизиси механикии ҳуҷайраҳои шустушӯй ва суфтакунандаи бофтаи шишагии 2 мл (D8938, Sigma-Aldrich/KIMBLE) нобуд карда шуданд. Пас аз он ядроҳои хом бо истифода аз филтри 40 мкм филтр карда шуданд ва пеш аз иҷрои градиенти зичии сахароза дар 320 г барои 10 дақиқа дар 4 °C центрифуга карда шуданд. Пас аз марҳилаи центрифугакунӣ (320 г барои 20 дақиқа дар 4°C), намунаҳо дар 0,04% BSA/PBS бо иловаи 0,2 воҳиди ингибитори μl-1 RNase (40 uµl-1, AM2682, Ambion) дубора боздошта шуданд ва аз филтри 40 мкм гузаштанд. Сипас ядроҳои ҷудошуда дар PBS дорои 0,02% BSA дубора боздошта шуданд ва ба чипи Chromium Single Cell 3' бор карда шуданд (барқароршавии тахминии 8,000 ҳуҷайра дар як хат). Китобхонаҳои snRNA-seq бо ҳуҷайраи Chromium Single 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics) омода карда шуданд. Китобхонаҳои snRNA-seq бо ҳуҷайраи Chromium Single 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics) омода карда шуданд. Библиотеки snRNA-seq бо истифода аз помощью Chromium Single cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics). Китобхонаҳои snRNA-seq бо истифода аз Chromium Single cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics) омода карда шуданд. snRNA-seq 文库是使用Chromium Single cell 3′ GEM、Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics) 制备的。 snRNA-seq 文库是使用Chromium Single cell 3′ GEM、Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics) 制备的。 Библиотеку snRNA-seq бо истифода аз Chromium Single Cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics). Китобхонаи snRNA-seq бо истифода аз Chromium Single Cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics) омода карда шудааст.Китобхонаҳо аз намунаҳои гуногун аз ҷониби Admera Health дар NovaSeq S4 (Illumina) ҷамъ оварда шуданд.
Сатҳи ифодаи ген барои ҳар як штрих-коди тахминии ҳастаӣ бо истифода аз бастаи нармафзори таҳлили 10x Genomics CellRanger (версияи 6.1.2) миқдораш муайян карда шуд. Махсусан, хонишҳо бо омезиши геномҳои истинод ба инсон (GRCh38, Ensemble, версияи 98) ва каламуш (Rnor_6.0, Ensemble, версияи 100) мувофиқ карда шуданд, ки бо фармони mkref сохта шудаанд ва бо истифода аз count бо фармони –include-introns=TRUE барои миқдор хонишҳоеро дар бар мегиранд, ки ба минтақаҳои интрон харита шудаанд. Барои намунаҳои t-hCO, ядроҳои инсон дар асоси талаботи консервативӣ муайян карда шуданд, ки ҳадди аққал 95% тамоми хондани хариташуда ба геноми инсон мувофиқат мекунанд. Ҳама таҳлилҳои минбаъда дар баромади массиви штрих-коди филтршуда аз CellRanger бо истифода аз бастаи R (версияи 4.1.2) Seurat (версияи 4.1.1)32 анҷом дода шуданд.
Барои таъмини он, ки ба таҳлили минбаъда танҳо ядроҳои баландсифат дохил карда шаванд, барои ҳар як намуна раванди филтркунии такрорӣ амалӣ карда шуд. Аввалан, ядроҳои пастсифат бо камтар аз 1000 генҳои беназир пайдо карда мешаванд ва зиёда аз 20% митохондрияҳои умумӣ муайян ва хориҷ карда мешаванд. Баъдан, матритсаи рақами генҳои хом бо истифода аз функсияи sctransform(vst.flavor=”v2″) бо регрессияи манфии биномиалии муқарраршуда ба эътидол оварда шуд, ки он инчунин 3000 генҳои бештари тағйирёбандаро бо истифода аз параметрҳои пешфарз муайян кард.Коҳишдиҳии андоза дар генҳои тағирёбандаи болоӣ бо истифода аз маълумоти муқарраршудаи параметри Analysis (Component CA) бо истифода аз параметрҳои муқарраршудаи Аналӣ анҷом дода шуд. 30 (dims = 30 дар асоси санҷиши визуалии сайтҳои зону интихоб карда шуд ва барои ҳама намунаҳо ва таҳлилҳои ансамблӣ истифода шуд) Мо пас аз он мо якчанд даври кластеркунии такрориро анҷом додем (қатъ = 1) барои тасниф кардани генҳо дар асоси шумораи ғайримуқаррарии генҳо (медиан дар поён аз 10 фоиз), генҳои ғайримуқаррарӣ ба баланд будани митохондриалӣ ва хориҷ кардани 9% ҳуҷайраҳои пастсифат ва/ё миқдори зиёди дугоникҳои гумонбаршуда бо истифода аз бастаи DoubletFinder33 (ба ҳисоби миёна намунаҳои t-hCO 95-ум) ва намунаҳои hCO (n = 3) бо истифода аз интегратсияи дигар параметрҳои филтрӣ иҷро карда шуданд боло.
Пас аз нест кардани ядроҳои пастсифат, маҷмӯи додаҳои интегралӣ гурӯҳбандӣ карда шуд (қатънома = 0.5) ва барои мақсадҳои визуализатсияи UMAP34 ворид карда шуданд. Генҳои маркер барои ҳар як кластер бо истифода аз функсияи FindMarkers бо параметрҳои пешфарз, ки аз маълумоти муқарраршудаи ифодаи ген ҳисоб карда шудаанд, муайян карда шуданд. Мо синфҳои асосии ҳуҷайраҳоро тавассути омезиши маҷмӯи маълумотҳои кортикалии ҳомила ва калонсолон бо ифодаи генҳои маркерӣ 19,20,21,35 ва эзоҳ муайян ва тасниф мекунем. Аз ҷумла, прекурсорҳои гардишкунанда бо ифодаи MKI67 ва TOP2A муайян карда шуданд. Кластерҳои прогениторӣ бо набудани транскриптҳои митозӣ, такрори баланд бо кластерҳои бисёрпотенти глиалӣ, ки дар кортекси ҳомила дер метафаза тавсиф шудаанд ва ифодаи EGFR ва OLIG1 муайян карда шуданд. Мо истилоҳи астроцитро барои фаро гирифтани якчанд ҳолати дифференсиатсияи астроситҳо, аз глияи дер радиалӣ то камолоти астроцитҳо истифода мебарем. Кластерҳои астроситҳо сатҳи баланди SLC1A3 ва AQP4-ро ифода мекунанд ва нишон дода шудаанд, ки бо зергурӯҳҳои глияи радиалии ҳомила ва/ё астроситҳои калонсолон харита карда шаванд. OPCҳо PDGFRA ва SOX10-ро ифода мекунанд, дар ҳоле ки олигодендроситҳо маркерҳои миелинатсияро (MOG ва MYRF) ифода мекунанд. Нейронҳои глутаматергикӣ бо мавҷудияти транскриптҳои нейронӣ (SYT1 ва SNAP25), набудани маркерҳои GABAergic (GAD2) ва ифодаи NEUROD6, SLC17A7, BCL11B ё SATB2 муайян карда шуданд. Нейронҳои GluN минбаъд ба зерсинфҳои болоӣ (ифодаи SATB2 ва талафоти BCL11B) ва амиқ (ифодаи BCL11B) тақсим карда шуданд. Нейронҳои тахминии зерплата (SP) ба ғайр аз маркерҳои амиқи GluN аломатҳои маълуми SP18-ро ба монанди ST18 ва SORCS1 ифода мекунанд. Ҳуҷайраҳои ба монанди плексусҳои choroid бо ифодаи TTR муайян карда шуданд ва ҳуҷайраҳои ба менингеал монанд генҳои бо фибробласт алоқаманд ва ҳуҷайраҳои хариташудаи пиал/рагҳои маҷмӯи маълумотҳои истинодро ифода карданд.
Таҳлили дифференсиалии ифодаи генҳо байни зерсинфҳои t-hCO ва hCO бо истифода аз усули псевдо-партияи нав таҳияшуда, ки дар намунаҳое, ки бо истифода аз бастаи Libra R (версияи 1.0.0) амалӣ карда шудаанд, анҷом дода шуд. Махсусан, санҷишҳои эҳтимолии log-эҳтимолияти edgeR (версияи 3.36.0, бастаи R) барои гурӯҳҳо тавассути ҷамъбасти шумораи генҳо дар ҳуҷайраҳо барои синфи додашудаи ҳуҷайра барои ҳар як такрори намуна анҷом дода шуданд. Барои визуализатсияи харитаи гармӣ, арзишҳои ба як миллион (CPM) муқарраршуда бо истифода аз функсияи edgeR (cpm ()) ва миқёс (барои ноил шудан ба миёна = 0, инҳирофи стандартӣ = 1) ҳисоб карда мешаванд. Таҳлили ғанисозии генҳои онтологияи генҳои t-hCO GluN (GO) анҷом дода шуд (Бенҷамини-Хочберг арзиши P-ро аз 0,05 камтар ислоҳ кард, ки дар на камтар аз 10% ҳуҷайраҳои t-hCO GluN ва як маротиба афзоиш ёфтани тағирот на камтар аз 2 маротиба). бо истифода аз ToppGene Suite (https://toppgene.cchmc.org/)37 анҷом дода мешавад. Мо барномаи ToppFun-ро бо параметрҳои пешфарз истифода мебарем ва дар бораи арзишҳои ислоҳшудаи Бенҷамини-Хочберг гузориш медиҳем, ки аз санҷишҳои гипергеометрии GO-аннотатсионӣ ҳисоб карда шудаанд.
Барои мувофиқ кардани кластерҳои snRNA-seq-и мо бо кластерҳои тафсиршудаи ҳуҷайраҳо аз таҳқиқоти истинодӣ дар як ҳуҷайраи RNA-seq ё snRNA-seq19,20,21,22, мо равиши ҳамгироии маҷмӯи додаҳоро истифода бурдем. Мо ҷараёни кории нормализатсияи SCTransform (v2) -ро дар Seurat барои ҳамгироӣ ва муқоисаи такрори кластер байни маҷмӯи додаҳо истифода кардем (бо истифода аз ҳамон параметрҳои дар боло). Маҷмӯи додаҳои инфиродӣ ба таври тасодуфӣ то 500 ячейка ё ядроҳо дар як кластери аслӣ барои самаранокии ҳисобкунӣ ҷойгир карда шуданд. Бо истифода аз равиши шабеҳе, ки қаблан тавсиф шуда буд, такрори кластер ҳамчун таносуби ҳуҷайраҳо ё ядроҳо дар ҳар як кластери ҷамъшуда, ки бо нишони кластери истинод мувофиқат мекунанд, муайян карда шуд. Барои таснифоти минбаъдаи GluNҳо, мо ҷараёни кории TransferData-и Seurat-ро барои маълумоти зермаҷмӯаи GluN барои таъин кардани тамғакоғазҳои маҷмӯаи маълумот ба ҳуҷайраҳои GluN-и худ истифода бурдем.
Барои арзёбии ҳолати камолоти транскриптомии глобалии намунаҳои t-hCO ва hCO, мо намунаҳои псевдо-уммавии худро бо BrainSpan/psychENCODE23 муқоиса кардем, ки аз пайдарпаии калони РНК иборат аст, ки рушди майнаи инсонро фаро мегирад. Мо PCA-ро дар матритсаи ифодаи генҳои омехтаи бо намунаи муқарраршуда аз намунаҳои кортикалӣ 10 ҳафтаи пас аз консепсия ва баъдтар, дар 5567 ген (якҷоя бо маълумоти мо), ки қаблан дар намунаҳои кортикалии BrainSpan фаъол муайян карда шуда буданд, анҷом додем (бештар аз 50% дар фарқияти рушд бо синну сол бо истифода аз модели кубӣ шарҳ дода шудааст). Илова бар ин, мо генҳоеро ба даст овардем, ки бо имзоҳои асосии транскриптомии рушди нейрон бо истифода аз факторизатсияи матритсаи ғайриманфӣ, ки қаблан тавсиф шудааст, алоқаманданд. Вазнҳои намунавӣ, ки бо истифода аз тартиби факторизатсияи матритсаи ғайриманфӣ ҳисоб карда шудаанд, дар расми расми оварда шудаанд. 5b бо маълумоти васеъ барои ҳар як аз панҷ имзои тавсифкардаи Чжу ва дигарон.38. Боз, маркерҳои транскрипсияи вобаста ба фаъолият аз таҳқиқоти қаблан нашршуда гирифта шудаанд. Аз ҷумла, ERG ва LRG дар нейронҳои глутаматергикӣ, ки аз ҷониби коллексияи кортекси визуалии муш snRNA-seq пас аз ҳавасмандкунии визуалӣ аз Ҷадвали иловагии 3 Hrvatin et al.16 муайян карда шудааст, ба таври назаррас афзоиш ёфтанд. LRG-ҳои аз ҷониби инсон ғанишуда аз фарҳангҳои майнаи ҳомилаи инсон бо KCl фаъол карда шуданд ва 6 соат пас аз ҳавасмандкунӣ ҷамъоварӣ карда шуданд ва генҳои филтршуда дар одамон ба таври назаррас танзим карда шуданд, аммо на дар хояндаҳо (Ҷадвали иловагӣ 4). Таҳлили ғанисозии маҷмӯи генҳо бо истифода аз ин маҷмӯи генҳо бо истифода аз санҷиши дақиқи яктарафаи Фишер анҷом дода шуд.
Каламушҳоро бо изофлуран наркоз кунед, мағзи сарро хориҷ кунед ва дар маҳлули оксигендор (95% О2 ва 5% СО2) хунук (тақрибан 4°С) ҷойгир кунед, ки дар онҳо: 234 мм сахароза, 11 мм глюкоза, 26 мм NaHCO3, 2M25m. NaH2PO4, 10 mM MgSO4 ва 0,5 mM CaCl2 (тақрибан 310 мОсм). Қисмҳои тоҷи майнаи каламушҳо (300-400 мкм) дорои t-hCO бо истифода аз vibratome Leica VT1200, тавре ки қаблан тавсиф шудааст39 сохта шудаанд. Пас аз он қисмҳо ба камераи секционӣ бо оксигенатсияи доимии ҳарорати хонагӣ интиқол дода шуданд, ки дорои aCSF аз: 10 mM глюкоза, 26 mM NaHCO3, 2.5 mM KCl, 1.25 mM NaHPO4, 1 mM MgSO4, 2 mM CaCl26ms (NaHPO4) тайёр карда шудаанд. на камтар аз 45 дақиқа пеш аз сабт. Қисмҳо дар камераи таъмидшуда сабт карда шуданд, ки дар он ҷо онҳо пайваста бо aCSF (95% O2 ва 5% СО2 шиша) об карда мешуданд. Ҳама маълумотҳо дар ҳарорати хонагӣ сабт карда шуданд. Нейронҳои t-hCO бо як пипеткаи шишагии боросиликати пур аз маҳлули дорои 127 мм глюконати калий, 8 мМ NaCl, 4 мМ магний ATP, 0,3 мМ натрий GTP, 10 мМ HEPES ва 0,6 мМ HEPES ва маҳлули 0,6, pH2, KM7 танзим карда шуданд. (290 мОсм). Барои барқароршавӣ ба маҳлули сабт биоситин (0,2%) илова карда шуд.
Маълумот бо истифода аз пурқувваткунандаи MultiClamp 700B (Дастгоҳҳои молекулавӣ) ва рақамисозии Digidata 1550B (Дастгоҳҳои молекулавӣ) ба даст оварда шуд, ки гузариши паст дар 2 кГц филтр карда шуда, дар 20 кГц рақамӣ карда шуд ва бо истифода аз Clampfit (Дастгоҳҳои молекулавӣ), Origin (OriginPro) таҳлил карда шуд. 2021b, OriginLab). ва функсияҳои фармоишии MATLAB (Mathworks). Потенсиали пайвастшавӣ бо истифода аз JPCalc ҳисоб карда шуд ва сабтҳо ба арзиши ҳисобшудаи -14 мВ тасҳеҳ карда шуданд. Амалиёти IV аз як қатор қадамҳои ҷорӣ дар қадамҳои 10-25 pA, аз -250 то 750 pA иборат аст.
Таламус, моддаи сафед ва афферентҳои S1, тавре ки қаблан тавсиф шуда буд, ҳангоми сабти патч-клипи нейронҳои hCO дар буридаи таламокортикалӣ ба таври электрикӣ ҳавасманд карда шуданд. Ба таври мухтасар, майна дар як мизи чопи 3D ҷойгир карда шуд, ки ба кунҷи 10 ° майл карда шудааст ва қисми пеши майна бо кунҷи 35 ° бурида шуд. Пас аз он майна ба сатҳи бурида часпонида шуда, аксонҳои барҷастаи таламокорталиро нигоҳ дошта, ба қисмҳо ҷудо карда шуданд. Электродҳои вольфрами биполярӣ (0,5 MΩ) ба микроманипулятори дуюм насб карда шуданд ва аз ҷиҳати стратегӣ барои ҳавасманд кардани чор минтақа дар як ҳуҷайра (капсулаи дарунӣ, моддаи сафед, S1 ва hCO) ҷойгир карда шуданд. Ҷавобҳои синаптикиро пас аз ҳавасмандкунии фасикии 300 мкА дар 0,03–0,1 Гц сабт кунед.
Нейронҳои hChR2-ифодакунандаи hCO дар 480 нм фаъол карда шуданд ва импулсҳои нуре, ки аз ҷониби LED (Prizmatix) тавлид шудаанд, тавассути ҳадафи ×40 (0,9 NA; Olympus) барои сабти ифодаи hChR2 дар наздикии ҳуҷайраҳо истифода шуданд. Диаметри майдони равшаншуда тақрибан 0,5 мм ва қувваи умумии 10-20 мВт мебошад. Паҳнои набз ба 10 мс муқаррар карда шуд, ки ин ба набзе, ки дар таҷрибаи омӯзиши рафтор дода шудааст, мувофиқат мекунад. Басомадҳои гуногуни ҳавасмандкунӣ аз 1 то 20 Гц истифода мешуданд, аммо барои муайян кардани миқдор танҳо набзи аввали силсила истифода мешуд. Фосилаи байни қаторҳо одатан аз 30 сония зиёдтар аст, то таъсир ба ингибитори синаптикӣ ё роҳҳои осонкунанда кам карда шавад. Барои санҷидани он, ки аксуламали hChR2 моносинаптикӣ буд, мо TTX (1 μM) ба ванна то аз байн рафтани реаксияи EPSC татбиқ кардем ва сипас 4-аминопиридинро (4-AP; 100 мкм) истифода бурдем. Одатан, посух дар тӯли чанд дақиқа бо таъхири каме дарозтар байни оташи LED ва тавлиди EPSC бармегардад. NBQX (10 μM) барои санҷидани он, ки вокуниш аз ҷониби ретсепторҳои AMPA идора карда мешавад, истифода шудааст.
Қисмҳои hCO Sharp тавре ки қаблан тавсиф шуда буданд, сохта шудаанд. Хулоса, қисмҳои hCO дар 4% агароза ворид карда шуданд ва ба ҳуҷайраҳои дорои 126 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM NaH2PO4, 1 mM MgSO4, 2 mM CaCl2, 26 мМ NaHCO3 ва d-lucom дар M бурида шуданд. 200-300 мкм дар ҳарорати хонагӣ бо истифода аз вибратори Leica VT1200 ва дар ASF дар ҳарорати хонагӣ нигоҳ дошта мешавад. Сипас, сабти патч-лагери тамоми ҳуҷайраҳо дар қисмҳои hCO дар зери микроскопи мустақими SliceScope (Scientifica) анҷом дода шуд. Қисмҳо бо aCSF (95% O2 ва 5% CO2) перфузия карда шуданд ва сигналҳои ҳуҷайра дар ҳарорати хонагӣ сабт карда шуданд. Нейронҳои hCO бо истифода аз пипеткаи шишаи боросиликатӣ, ки бо маҳлули дорои 127 мм глюконати калий, 8 мм NaCl, 4 мм магний ATP, 0,3 мм натрий GTP, 10 мм HEPES ва 0,6 мМ EGTA бо OH2, танзим карда шудааст, татбиқ карда шуданд. 290). Барои барқарорсозӣ, ба маҳлули дохилӣ 0,2% Биоситин илова кунед.
Маълумот аз ҷониби Clampex (Clampex 11.1, Molecular Devices) бо истифода аз як пурқувваткунандаи MultiClamp 700B (Дастгоҳҳои молекулавӣ) ва рақамисозии Digidata 1550B (дастгоҳҳои молекулавӣ) ба даст оварда шуданд, гузариши паст дар 2 кГц филтр карда шуданд, дар 20 кГц рақамӣ карда шуданд ва бо истифода аз версияи Clamp60 таҳлил карда шуданд. дастгоҳҳо) ва функсияҳои фармоишии MATLAB (MATLAB 2019b, Mathworks). Потенсиали пайвастшавӣ бо истифода аз JPCalc ҳисоб карда шуд ва сабтҳо ба потенсиали ҳисобшудаи пайвастшавӣ -14 мВ тасҳеҳ карда шуданд. Амалиёти IV аз як қатор қадамҳои ҷорӣ дар қадамҳои 5-10 pA аз -50 то 250 pA иборат аст.
Барои барқарорсозии морфологии нейронҳои фишурда, ба маҳлули дохилӣ 0,2% биоситин (Сигма-Олдрих) илова карда шуд. Ҳуҷайраҳо пас аз ҳакерӣ ҳадди аққал 15 дақиқа омода карда мешаванд. Пас аз он пипетка оҳиста дар давоми 1-2 дақиқа то он даме ки мембранаи сабтшуда пурра мӯҳр карда шавад, кашида мешавад. Пас аз тартиби физиологии бахш, қисмҳо дар як шабонарӯз дар 4 ° C дар 4% PFA собит карда шуданд, бо PBS X3 шуста шуданд ва 1:1000 бо стрептавидин пайвастшудаи DyLight 549 ё DyLight 405 (Vector Labs) маҳлул карда шуданд. Ҳуҷайраҳои пур аз биоситин (2%; Sigma-Oldrich) ҳангоми сабти тазиқи часпак дар ҳарорати хонагӣ барои 2 соат нишонгузорӣ карда шуданд. Сипас бахшҳо ба слайдҳои микроскопӣ бо истифода аз Aquamount (Thermo Scientific) насб карда шуданд ва рӯзи дигар дар микроскопи конфокалии Leica TCS SP8 бо истифода аз объекти обдиҳии равған бо диафрагмаи ададӣ × 40 1,3, калоншавӣ × 0,9–1,0, xy визуалӣ карда шуданд. Сатҳи интихоб тақрибан 7 пиксел барои як микрон аст. Z-стекҳо дар фосилаи 1 мкм ба таври пайдарпай ба даст оварда шуданд ва мозаикаи z-стек ва дӯхтани худкор дар асоси Leica барои пӯшонидани тамоми дарахти дендритии ҳар як нейрон анҷом дода шуданд. Сипас нейронҳо бо истифода аз интерфейси neuTube 40 ба таври нимдастӣ пайгирӣ карда шуданд ва файлҳои SWC тавлид шуданд. Пас аз он файлҳо ба плагини SimpleNeuriteTracer41 Fiji бор карда шуданд (ImageJ, версияи 2.1.0; NIH).
Бофтаи кортикали инсон бо розигии огоҳшуда тибқи протоколе, ки аз ҷониби Шӯрои баррасии институтсионалии Донишгоҳи Стэнфорд тасдиқ шудааст, гирифта шудааст. Ду намунаи бофтаи пас аз таваллуди инсон (3 ва 18 сола) бо роҳи резекцияи кортекси фронталӣ (гируси миёнаи фронталӣ) ҳамчун як қисми ҷарроҳӣ барои эпилепсияҳои тобовар ба даст оварда шуд. Пас аз резекция, матоъро дар яхбандии NMDG-aCSF ҷамъоварӣ кунед, ки дорои: 92 мм NMDG, 2,5 мм KCl, 1,25 мм NaH2PO4, 30 мМ NaHCO3, 20 мм HEPES, 25 мМ глюкоза, 2 мммбамт, 3 мм пирувати натрий, 0,5 мм CaCl2 4H2O ва 10 мМ MgSO4 7H2O. То рН 7,3-7,4 бо кислотаи консентратсияи гидрохлорид титр кунед. Бофтаҳо дар давоми 30 дақиқа ба лаборатория оварда шуда, мувофиқи тартиби дар боло тавсифшуда сексияҳои коронарӣ гирифта шуданд.
Ҳама расмиёти ҳайвонот мувофиқи дастурҳои нигоҳубини ҳайвонот аз ҷониби Донишгоҳи Стэнфорд, ки аз ҷониби APLAC тасдиқ шудааст, анҷом дода шуданд. Каламушҳо (зиёда аз 140 рӯз пас аз трансплантатсия) бо анестезияи 5% изофлуран индуксия карда шуданд ва ҳангоми ҷарроҳӣ бо 1-3% изофлуран наркоз карда шуданд. Ҳайвонҳо дар чаҳорчӯбаи стереотаксикӣ (Kopf) ҷойгир карда шуданд ва бупренорфин (SR) ба зери пӯст тазриқ карда шуд. Косахонаи сарро кушода, тоза карда, 3-5 винти устухонро мегузоранд. Барои ҳадафи t-hCO, мо аз тасвирҳои MRI координатҳои стереотаксикӣ тавлид кардем. Дар ҷои мавриди таваҷҷӯҳ сӯрохи бурр парма карда шуд ва нахҳо (диаметри 400 микрон, NA ​​0,48, Дорик) 100 микрон аз сатҳи hCO фуроварда шуданд ва ба косахонаи сар бо сементи дандонпизишкии ултрабунафш муолиҷашаванда (Relyx) пайваст карда шуданд.
Сабтҳои нахи фотометрӣ тавре ки қаблан тавсиф шуда буд42 анҷом дода шуданд. Барои сабти фаъолияти стихиявӣ, каламушҳо дар қафаси тоза ҷойгир карда шуданд ва сими нахи оптикии диаметри 400 микрон (Дорик) ба системаи ба даст овардани маълумотҳои фотометрии нахи оптикӣ ба сими нахи оптикии имплантатсия пайваст карда шуд. Ҳангоми сабти 10 дақиқаи фаъолияти моторӣ, ҳайвонҳо барои омӯхтани қафас озод буданд. Барои сабт кардани фаъолияти эҳёшуда, каламушҳо (зиёда аз 140 рӯз пас аз трансплантатсия) бо 5% изофлуран барои индуксия ва 1-3% изофлуран барои нигоҳдорӣ наркоз карда шуданд. Ҷойгир кардани ҳайвон дар чаҳорчӯбаи стереотактикӣ (Kopf) ва whiskers дар тарафи муқобили t-hCO доранд, тақрибан 2 см бурида ва тавассути як шабакаи пайваст ба як actuator piezoelektrik (PI) гузашт. Кабели нахи оптикии 400 мкм (Дорик) ба нахи имплантатсия пайваст карда шуд ва ба системаи ҷамъоварии маълумот пайваст карда шуд. Пас аз он, мӯйҳо дар тарафи муқобили t-hCO 50 маротиба (2 мм дар 20 Гц, 2 с дар як намоиш) дар вақтҳои тасодуфӣ тавассути диски пьезоэлектрикӣ дар тӯли 20 дақиқа сабт карда шуданд. Маҷмӯи дастгирии Arduino MATLAB-ро барои назорат кардани вақти каҷравӣ бо рамзи фармоишии MATLAB истифода баред. Ҳодисаҳо бо нармафзори ба даст овардани маълумот бо истифода аз импулсҳои транзистор-транзистор (TTL) ҳамоҳанг карда мешаванд.
Каламушҳо (зиёда аз 140 рӯз пас аз трансплантатсия) бо анестезияи 5% изофлуран индуксия карда шуданд ва ҳангоми ҷарроҳӣ бо 1-3% изофлуран наркоз карда шуданд. Ҳайвонот дар чаҳорчӯбаи стереотаксикӣ (Kopf) ҷойгир карда шуданд ва бупренорфин SR ва дексаметазон ба зери пӯст сӯзандору карда шуданд. Косахонаи сарро кушода, тоза карда, 3-5 винти устухонро мегузоранд. Барои ҳадафи t-hCO, мо аз тасвирҳои MRI координатҳои стереотаксикӣ тавлид кардем. Краниотомияи даврашакл (диаметри тақрибан 1 см) бо пармакунии баландсуръат мустақиман дар болои hCO трансплантатсия карда шуд. Пас аз он ки устухон ба қадри имкон борик шавад, аммо пеш аз парма кардани тамоми устухон, бо истифода аз пинцет барои хориҷ кардани диски боқимондаи коси коса барои ошкор кардани t-hCO-и аслӣ. Краниотомия бо шӯри безарар пур карда шуд ва ба косахонаи сар бо сементи дандонпизишкии ултрабунафш муолиҷашуда (Relyx) пӯшиш ва пинчаи махсуси сар часпонида шуд.
Тасвири дуфотонӣ бо истифода аз микроскопи мултифотонии Bruker бо ҳадафи Nikon LWD (×16, 0,8 NA) анҷом дода шуд. Тасвирҳои GCaMP6 дар 920 нм бо 1,4x васеъкунии ягонаи z-ҳавопаймо ва 8х ба ҳисоби миёна 7,5 кадр / сония иҷро карда шуданд. Каламушҳо бо анестезияи 5% изофлуран ва бо 1-3% изофлуран нигоҳ дошта шуданд. Каламушҳо дар як дастгоҳи сари фармоишӣ ҷойгир карда шуданд ва дар зери линза ҷойгир карда шуданд. Сабти заминавии 3 дақиқаии фаъолияти моторӣ ба даст оварда шуд. Дар тӯли 20 дақиқаи сабт, 50 пуф (ҳар як презентатсия 100 мс дарозӣ) ба таври тасодуфӣ бо истифода аз пикоспрайзер ба лавҳаи муътабари муқобили t-hCO интиқол дода шуд. Маҷмӯи дастгирии Arduino MATLAB-ро барои назорат кардани вақти таркиш бо рамзи фармоишии MATLAB истифода баред. Ҳодисаҳоро бо нармафзори ба даст овардани маълумот (PrairieView 5.5) бо истифода аз импулсҳои TTL ҳамоҳанг созед. Барои таҳлил, тасвирҳо барои ҳаракати xy бо истифода аз ислоҳи аффин дар барномаи MoCo, ки дар Фиҷи оғоз шудаанд, ислоҳ карда шуданд. Истихроҷи микросхемаҳои флуоресцентӣ аз ҳуҷайраҳои алоҳида бо истифода аз CNMF-E43. Флуоресцент барои ҳар як минтақаи мавриди таваҷҷӯҳ истихроҷ карда шуд, ба каҷҳои dF/F табдил дода шуд ва сипас ба холҳои z табдил ёфт.
Каламушҳо (зиёда аз 140 рӯз пас аз трансплантатсия) бо анестезияи 5% изофлуран индуксия карда шуданд ва ҳангоми ҷарроҳӣ бо 1-3% изофлуран наркоз карда шуданд. Ҳайвонот дар чаҳорчӯбаи стереотаксикӣ (Kopf) ҷойгир карда шуданд ва бупренорфин SR ва дексаметазон ба зери пӯст сӯзандору карда шуданд. Мӯйҳои дар тарафи муқобили t-hCO тақрибан 2 см бурида ва тавассути торе, ки ба фаъолкунандаи пьезоэлектрикӣ пайваст карда шудаанд, ришта карда шуданд. Косахонаи сар кушода ва тоза карда мешавад. Ба косахонаи сар винти заминии аз пӯлоди зангногир пайваст карда шудааст. Барои ҳадафи t-hCO, мо аз тасвирҳои MRI координатҳои стереотаксикӣ тавлид кардем. Иҷрои craniotomy даврашакл (тақрибан 1 см дар диаметри) бо парма суръати баланд танҳо дар боло t-hCO. Пас аз он ки устухон ба қадри имкон борик шавад, аммо пеш аз парма кардани тамоми устухон, бо истифода аз пинцет барои хориҷ кардани диски боқимондаи коси коса барои ошкор кардани t-hCO-и аслӣ. Ҳуҷайраҳои инфиродӣ бо истифода аз зондҳои кремнийи зичии баланди 32-канал ё 64-канал сабт карда шуданд (Кэмбридж Нейротех), ки ба винтҳои заминӣ асос ёфтаанд ва бо тақвиятдиҳандаҳои RHD (Intan) пешакӣ пурқувват карда шудаанд. Манипуляторро истифода баред, то электродҳоро ба макони мақсаднок тавассути краниотомия, ки бо шӯри хушк пур карда шудааст, паст кунед. Ҷамъоварии маълумот дар басомади 30 kHz бо истифода аз системаи ба даст овардани маълумот Open Ephys анҷом дода шуд. Сабт танҳо вақте идома ёфт, ки мо дар зиёда аз 10 канал фаъолияти стихиявии ритмиии ба ҳам алоқамандро ошкор кардем, ки ин нишон медиҳад, ки электродҳо дар пайванд ҷойгир шудаанд (дар асоси маълумотҳои дуфотонии калсий). Сабти заминавии 10-дақиқаии фаъолияти моторӣ ба даст оварда шуд. Пас аз он, мӯйҳо дар тарафи муқобили t-hCO 50 маротиба (2 мм дар 20 Гц, 2 с дар як намоиш) дар вақтҳои тасодуфӣ тавассути диски пьезоэлектрикӣ дар тӯли 20 дақиқа сабт карда шуданд. Бо истифода аз бастаи дастгирии MATLAB барои Arduino (MATLAB 2019b), вақти каҷро бо рамзи фармоишии MATLAB назорат кунед. Барои ҳамоҳангсозии рӯйдодҳо бо нармафзори ба даст овардани маълумот импулсҳои TTL-ро истифода баред.
Барои таҷрибаҳои аломатгузории оптикӣ, як сими оптикии 200 мкм (Дорик) ба лазери 473 нм (Omicron) пайваст карда шуд, ба нахи оптикии 200 мкм дар болои краниотомия ҷойгир карда шуд. Дарҳол пеш аз ин, қувваи jumperро ба 20 мВт танзим кунед. Манипуляторро истифода баред, то электродҳоро ба макони мақсаднок тавассути краниотомия, ки бо шӯри хушк пур карда шудааст, паст кунед. Дар ибтидои сабт даҳ импульси нури 473 нм (басомад 2 Гц, давомнокии импулс 10 мс) бароварда шуд. Ҳуҷайраҳои ҳассос ҳамчун ҳуҷайраҳое муайян карда шуданд, ки дар 70% ё бештар аз озмоишҳо дар давоми 10 мс нур вокуниши хӯша нишон доданд.