សូមអរគុណសម្រាប់ការទស្សនា Nature.com ។ អ្នកកំពុងប្រើកំណែកម្មវិធីរុករកតាមអ៊ីនធឺណិតដែលមានការគាំទ្រ CSS មានកំណត់។ សម្រាប់បទពិសោធន៍ដ៏ល្អបំផុត យើងសូមណែនាំឱ្យអ្នកប្រើកម្មវិធីរុករកតាមអ៊ីនធឺណិតដែលបានអាប់ដេត (ឬបិទមុខងារភាពឆបគ្នានៅក្នុង Internet Explorer)។ លើសពីនេះទៀត ដើម្បីធានាបាននូវការគាំទ្រជាបន្តបន្ទាប់ យើងបង្ហាញគេហទំព័រដោយគ្មានរចនាប័ទ្ម និង JavaScript។
បង្ហាញរង្វង់នៃស្លាយបីក្នុងពេលតែមួយ។ ប្រើប៊ូតុងមុន និងបន្ទាប់ ដើម្បីផ្លាស់ទីតាមស្លាយបីក្នុងពេលតែមួយ ឬប្រើប៊ូតុងគ្រាប់រំកិលនៅចុងបញ្ចប់ ដើម្បីផ្លាស់ទីតាមស្លាយបីក្នុងពេលតែមួយ។
សរីរាង្គសរសៃប្រសាទដែលប្រមូលផ្តុំដោយខ្លួនឯងតំណាងឱ្យវេទិកានៅក្នុង vitro ដ៏ជោគជ័យសម្រាប់គំរូនៃការអភិវឌ្ឍន៍មនុស្ស និងជំងឺ។ ទោះជាយ៉ាងណាក៏ដោយ organoids ខ្វះការភ្ជាប់ដែលមាននៅក្នុង vivo ដែលកំណត់ភាពចាស់ទុំ និងការពារការរួមបញ្ចូលជាមួយសៀគ្វីផ្សេងទៀតដែលគ្រប់គ្រងឥរិយាបថ។ នៅទីនេះយើងបង្ហាញថា សរីរាង្គ cortical ដែលកើតចេញពីកោសិកាដើមរបស់មនុស្សដែលត្រូវបានប្តូរទៅក្នុង Cortex somatosensory នៃកណ្តុរអាក្រាតកាយដែលទើបនឹងកើតបង្កើតប្រភេទកោសិកាដែលចាស់ទុំដែលបញ្ចូលទៅក្នុងសៀគ្វីដែលទាក់ទងនឹងអារម្មណ៍ និងការលើកទឹកចិត្ត។ MRI បានបង្ហាញពីការលូតលាស់សរីរាង្គក្រោយការប្តូរសរីរាង្គនៅក្នុងខ្សែកោសិកាដើម និងសត្វមួយចំនួន ខណៈពេលដែលការវិភាគស្នូលតែមួយបង្ហាញពីការវិវត្តនៃ corticogenesis និងការលេចឡើងនៃកម្មវិធីចម្លងអាស្រ័យលើសកម្មភាព។ ជាការពិត ណឺរ៉ូន cortical ដែលត្រូវបានប្តូរបង្ហាញនូវលក្ខណៈសម្បត្តិ morphological, synaptic និងភ្នាសខាងក្នុងស្មុគស្មាញជាងសមភាគី in vitro ដែលអនុញ្ញាតឱ្យរកឃើញពិការភាពសរសៃប្រសាទចំពោះអ្នកជំងឺដែលមានរោគសញ្ញា Timothy ។ ការតាមដានកាយវិភាគសាស្ត្រ និងមុខងារបានបង្ហាញថា សរីរាង្គដែលបានប្តូរទទួល thalamocortical និង corticocortical បញ្ចូល ហើយនៅក្នុង vivo ការថតសកម្មភាពសរសៃប្រសាទបង្ហាញថាធាតុបញ្ចូលទាំងនេះអាចបង្កើតការឆ្លើយតបខាងសតិអារម្មណ៍នៅក្នុងកោសិកាមនុស្ស។ ទីបំផុត សរីរាង្គ cortical ពង្រីក axons ពាសពេញខួរក្បាលកណ្តុរ ហើយការធ្វើឱ្យសកម្ម optogenetic របស់ពួកគេនាំទៅរកអាកប្បកិរិយាស្វែងរករង្វាន់។ ដូច្នេះ ណឺរ៉ូន Cortex របស់មនុស្សដែលបានប្តូរសរីរាង្គមានភាពចាស់ទុំ និងចូលរួមក្នុងសៀគ្វីរបស់ម៉ាស៊ីនដែលគ្រប់គ្រងឥរិយាបថ។ យើងរំពឹងថាវិធីសាស្រ្តនេះនឹងជួយសម្រួលដល់ការរកឃើញនៃ phenotypes កម្រិត strand-level នៅក្នុងកោសិកាដែលបានមកពីអ្នកជំងឺ ដែលមិនអាចត្រូវបានរកឃើញដោយមធ្យោបាយផ្សេងទៀត។
ខួរក្បាលរបស់មនុស្សដែលកំពុងអភិវឌ្ឍគឺជាដំណើរការរៀបចំដោយខ្លួនឯងដ៏គួរឱ្យកត់សម្គាល់ដែលកោសិការីកសាយ ផ្លាស់ប្តូរ ធ្វើចំណាកស្រុក និងតភ្ជាប់ដើម្បីបង្កើតជាសៀគ្វីសរសៃប្រសាទដែលមានមុខងារដែលត្រូវបានកែលម្អបន្ថែមទៀតតាមរយៈបទពិសោធន៍នៃអារម្មណ៍។ បញ្ហាសំខាន់ក្នុងការយល់ដឹងអំពីការអភិវឌ្ឍន៍ខួរក្បាលរបស់មនុស្ស ជាពិសេសនៅក្នុងបរិបទនៃជំងឺ គឺការខ្វះលទ្ធភាពចូលទៅកាន់ជាលិកាខួរក្បាល។ សរីរាង្គដែលរៀបចំដោយខ្លួនឯង រួមទាំងសរីរាង្គ Cortex របស់មនុស្ស (hCO ដែលត្រូវបានគេស្គាល់ថាជាលំហ Cortex របស់មនុស្ស) អាចបង្កើតបាន 2,3,4,5,6។ ទោះជាយ៉ាងណាក៏ដោយ ដែនកំណត់មួយចំនួនបានកំណត់ការអនុវត្តកាន់តែទូលំទូលាយរបស់ពួកគេក្នុងការយល់ដឹងអំពីការអភិវឌ្ឍន៍ និងដំណើរការនៃសៀគ្វីសរសៃប្រសាទ។ ជាពិសេស វាមិនច្បាស់ទេថា តើភាពចាស់ទុំរបស់ hCO ត្រូវបានកំណត់ដោយអវត្ដមាននៃធាតុចូលផ្នែកមីក្រូបរិស្ថាន និងអារម្មណ៍ជាក់លាក់ដែលមានវត្តមាននៅក្នុង vivo ដែរឬទេ។ លើសពីនេះ ដោយសារតែ hCOs មិនត្រូវបានបញ្ចូលទៅក្នុងសៀគ្វីដែលអាចបង្កើតលទ្ធផលអាកប្បកិរិយា ឧបករណ៍ប្រើប្រាស់របស់ពួកគេក្នុងការធ្វើគំរូពីជំងឺសរសៃប្រសាទ និងអាកប្បកិរិយាស្មុគស្មាញបច្ចុប្បន្នត្រូវបានកំណត់។
ការប្តូរ hCO ទៅក្នុងខួរក្បាលដែលមានជីវិតនៅដដែលអាចយកឈ្នះលើដែនកំណត់ទាំងនេះ។ ការសិក្សាពីមុនបានបង្ហាញថា ណឺរ៉ូនរបស់មនុស្សដែលបានប្តូរចូលទៅក្នុង Cortex របស់សត្វកកេរ គឺអាចរស់រានមានជីវិត គ្រោង និងទំនាក់ទំនងជាមួយកោសិកាសត្វកកេរ 7,8,9,10,11,12។ ទោះជាយ៉ាងណាក៏ដោយ ការពិសោធន៍ទាំងនេះជាធម្មតាត្រូវបានអនុវត្តលើសត្វពេញវ័យ ដែលអាចកំណត់ការរួមបញ្ចូល synaptic និង axonal ។ នៅទីនេះ យើងពណ៌នាអំពីគំរូនៃការប្តូរសរីរាង្គដែលយើងបានប្តូរ 3D hCO ដែលបានមកពីកោសិកា hiPS ចូលទៅក្នុងកោសិកា somatosensory Cortex បឋម (S1) នៃកណ្តុរដែលមិនមានភាពស៊ាំនៅដំណាក់កាលដំបូងនៃការអភិវឌ្ឍន៍ប្លាស្ទិក។ កោសិកាសរសៃប្រសាទ hCO (t-hCO) ឆ្លងកាត់ភាពចាស់ទុំច្រើន ទទួលបានធាតុបញ្ចូល thalamocortical និង cortical-cortical ដែលបង្កើតការឆ្លើយតបពីអារម្មណ៍ និងពង្រីកការព្យាករតាមអ័ក្សចូលទៅក្នុងខួរក្បាលកណ្តុរ ដើម្បីជំរុញឥរិយាបថស្វែងរករង្វាន់។ ភាពចាស់ទុំបន្ថែមនៃ t-hCO បានបង្ហាញពីពិការភាពសរសៃប្រសាទចំពោះអ្នកជំងឺដែលមានរោគសញ្ញា Timothy (TS) ដែលជាជំងឺហ្សែនធ្ងន់ធ្ងរដែលបណ្តាលមកពីការផ្លាស់ប្តូរនៅក្នុងឆានែលកាល់ស្យូម L-type CaV1.2 (អ៊ិនកូដដោយ CACNA1C) ។
ដើម្បីសិក្សាពីណឺរ៉ូន cortical របស់មនុស្សនៅក្នុងសៀគ្វីក្នុង vivo យើងបានប្តូរសរីរាង្គ 3D hCO ដដែលទៅក្នុង S1 នៃកណ្តុរ athymic ក្រោយសម្រាលដំបូង (ថ្ងៃទី 3-7 ក្រោយសម្រាល) (រូបភាពទី 1a និងទិន្នន័យដែលបានពង្រីកនៃរូបភាព 1a-c)។ នៅចំណុចនេះ ការព្យាករ thalamocortical និង corticocortical axonal មិនទាន់បានបញ្ចប់ S1 innervation របស់ពួកគេនៅឡើយទេ (យោង 13) ។ ដូច្នេះវិធីសាស្រ្តនេះត្រូវបានរចនាឡើងដើម្បីបង្កើនការរួមបញ្ចូល t-hCO ខណៈពេលដែលកាត់បន្ថយផលប៉ះពាល់លើសៀគ្វី endogenous ។ ដើម្បីស្រមៃមើលទីតាំងនៃ t-hCO នៅក្នុងសត្វមានជីវិត យើងបានធ្វើការបង្កើតឡើងវិញនូវខួរក្បាល MRI ទម្ងន់ T2 របស់សត្វកណ្តុរ 2-3 ខែបន្ទាប់ពីការប្តូរសរីរាង្គ (រូបភាពទី 1b និងទិន្នន័យបន្ថែម រូបទី 1 ឃ)។ t-hCO ត្រូវបានគេសង្កេតឃើញយ៉ាងងាយស្រួល ហើយការវាស់បរិមាណនៃ t-hCO គឺស្រដៀងគ្នាទៅនឹងអ្វីដែលគណនាពីចំណិតថេរ (ទិន្នន័យបន្ថែមរូបភាព 1d,e; P> 0.05) ។ t-hCO ត្រូវបានគេសង្កេតឃើញយ៉ាងងាយស្រួល ហើយការវាស់បរិមាណនៃ t-hCO គឺស្រដៀងគ្នាទៅនឹងអ្វីដែលគណនាពីចំណិតថេរ (ទិន្នន័យបន្ថែមរូបភាព 1d,e; P> 0.05) ។ t-hCO легко наблюдались, а объемные измерения t-hCO были аналогичны рассчитанным для фиксированшных рсеннованшер данные, рис។ 1d, អ៊ី; P> 0,05) ។ t-hCO ត្រូវបានគេសង្កេតឃើញយ៉ាងងាយស្រួល ហើយការវាស់វែង t-hCO volumetric គឺស្រដៀងគ្នាទៅនឹងអ្វីដែលត្រូវបានគណនាសម្រាប់ផ្នែកថេរ (ទិន្នន័យដែលបានពង្រីក រូបភព 1d, e; P> 0.05)។很内易观察到t-hCO，并且t-hCO的体积测量值与从固定切片计算的测量值相似（找式展0.05) ។很内易观察到t-hCO，并且t-hCO t-hCO легко наблюдался, а объемные измерения t-hCO были аналогичны рассчитанным для фиксированновых сраенновых данные, рис។ 1d, អ៊ី; P> 0,05) ។ t-hCO ត្រូវបានគេសង្កេតឃើញយ៉ាងងាយស្រួល ហើយការវាស់វែង t-hCO volumetric គឺស្រដៀងគ្នាទៅនឹងអ្វីដែលត្រូវបានគណនាសម្រាប់ផ្នែកថេរ (ទិន្នន័យដែលបានពង្រីក រូបភព 1d, e; P> 0.05)។យើងបានកំណត់ t-hCO ក្នុង 81% នៃសត្វស្ទូងប្រហែល 2 ខែបន្ទាប់ពីការប្តូរ (n = 72 សត្វ; hCO ពីខ្សែកោសិកា 10 hiPS; ខ្សែកោសិកា hiPS នៅក្នុងតារាងបន្ថែម 1) ។ ក្នុងចំណោមនោះ 87% មានទីតាំងនៅក្នុងខួរក្បាល (រូបភាពទី 1 គ)។ ដោយធ្វើការស្កែន MRI សៀរៀលនៅចំណុចច្រើនដងក្នុងកណ្តុរប្តូរដូចគ្នា យើងបានរកឃើញការកើនឡើងចំនួនប្រាំបួនដងនៃបរិមាណ t-hCO ក្នុងរយៈពេល 3 ខែ (រូបភាពទី 1 ឃ និងទិន្នន័យដែលបានពង្រីក រូបភព 1f) ។ សត្វដែលបានប្តូរមានអត្រារស់រានមានជីវិតខ្ពស់ (74%) នៅរយៈពេល 12 ខែក្រោយការប្តូរសរីរាង្គ (ទិន្នន័យដែលបានពង្រីក រូប 1g និងតារាងបន្ថែម 2) ហើយមិនបានរកឃើញម៉ូទ័រហួសប្រមាណ ឬការថយចុះការចងចាំ gliosis ឬ electroencephalogram (EEG) ទេ។ ទិន្នន័យរូបភាព 1g និងតារាងបន្ថែម 2). 1h–m និង 3e)។
a, គ្រោងការណ៍នៃការរចនាពិសោធន៍។ hCO ដែលបានមកពីកោសិកា hiPS ត្រូវបានប្តូរទៅក្នុង S1 នៃកណ្តុរអាក្រាតកាយដែលទើបនឹងកើតនៅថ្ងៃទី 30-60 នៃភាពខុសគ្នា។ b, រូបភាព MRI ដែលមានទម្ងន់ T2 និងផ្ដេកដែលបង្ហាញ t-hCO ក្នុង S1 2 ខែបន្ទាប់ពីការប្តូរសរីរាង្គ។ របារជញ្ជីង 2 ម។ c, បរិមាណនៃអត្រាជោគជ័យនៃការឆ្លាក់ដែលបង្ហាញសម្រាប់បន្ទាត់កោសិកា hiPS នីមួយៗ (n = 108 លេខនៅក្នុងរបារបង្ហាញពីចំនួន t-hCO ក្នុងមួយខ្សែកោសិកា hIPS) និងទីតាំង cortical ឬ subcortical (n = 88) ។ ឃ, រូបភាព MRI នៃសរសៃឈាមបេះដូង (ខាងឆ្វេង; របារមាត្រដ្ឋាន 3 ម. e, ការពិនិត្យឡើងវិញនៃគំរូ t-hCO នៅក្នុងខួរក្បាលរបស់កណ្តុរ។ របារជញ្ជីង 1 ម។ f, រូបភាព immunocytochemical តំណាងនៃ t-hCO ដែលបង្ហាញពីកំពូលឆ្វេងទៅស្តាំ (កំឡុងពេលខុសគ្នា): PPP1R17 (អាយុ 4 ខែ), NeuN (អាយុ 8 ខែ), SOX9 និង GFAP (អាយុ 8 ខែ), PDGFRα; (8 ខែ), MAP2 (8 ខែ) និង IBA1 (8 ខែ) ។ របារមាត្រដ្ឋាន, 20µm ។ ការបង្ហាញរួមគ្នានៃ HNA បង្ហាញពីកោសិកានៃប្រភពដើមរបស់មនុស្ស។ g, snRNA-seq៖ រូបភាពកាត់បន្ថយវិមាត្ររួម និងការព្យាករណ៍ (UMAP) នៃស្នូល t-hCO ដែលមានគុណភាពខ្ពស់ទាំងអស់បន្ទាប់ពីការរួមបញ្ចូល Seurat (n=3 គំរូ t-hCO, n=2 បន្ទាត់កោសិកា hiPS) ។ Astrocytes, កោសិកានៃបន្ទាត់ astrocyte; cyc prog, ចរាចរ progenitors; GluN DL, ណឺរ៉ូន glutamatergic ជ្រៅ; GluN DL/SP, ណឺរ៉ូន glutamatergic ជ្រៅ និង sublamellar; GluN UL, ស្រទាប់ខាងលើនៃសរសៃប្រសាទ glutamatergic; oligodendrocytes, oligodendrocytes; OPC, កោសិកា progenitor oligodendrocyte; RELN, ណឺរ៉ូនរីលីន។ h, ការវិភាគលើពាក្យ Gene Ontology (GO) នៃហ្សែនដែលត្រូវបានកែសម្រួលយ៉ាងសំខាន់ (បានកែតម្រូវ P < 0.05, ការផ្លាស់ប្តូរផ្នត់> 2, បង្ហាញក្នុងយ៉ាងហោចណាស់ 10% នៃស្នូល) នៅក្នុងណឺរ៉ូន glutamatergic t-hCO បើប្រៀបធៀបជាមួយសរសៃប្រសាទ hCO glutamatergic ។ h, ការវិភាគលើពាក្យ Gene Ontology (GO) នៃហ្សែនដែលត្រូវបានកែសម្រួលយ៉ាងសំខាន់ (បានកែតម្រូវ P < 0.05, ការផ្លាស់ប្តូរផ្នត់> 2, បង្ហាញក្នុងយ៉ាងហោចណាស់ 10% នៃស្នូល) នៅក្នុងណឺរ៉ូន glutamatergic t-hCO បើប្រៀបធៀបជាមួយសរសៃប្រសាទ hCO glutamatergic ។ h, Анализ обогащения терминов ហ្សែន Ontology (GO) для генов со значительной активацией (скорректированный P <0,05, скорректированный P <0,05, 2, экспрессия по крайней мере в 10% ядер) в глутаматергических нейронах t-hCO по сравнению с глусагм нейронами hCO ។ h, ការវិភាគលើពាក្យ Gene Ontology (GO) សម្រាប់ហ្សែនជាមួយនឹងការធ្វើឱ្យសកម្មសំខាន់ (បានកែតម្រូវ P<0.05, ការផ្លាស់ប្តូរផ្នត់>2, ការបញ្ចេញមតិនៅក្នុងស្នូលយ៉ាងហោចណាស់ 10%) នៅក្នុងណឺរ៉ូន t-hCO glutamatergic បើប្រៀបធៀបទៅនឹងសរសៃប្រសាទ hCO glutamatergic ។ ម៉ោង 2，在至少10%的细胞核中表达）的基因本体论(GO) 术语富集分析។ h，与 hco 谷氨酸能元相比，t-hco 谷氨酸能神经元基因显着上调（后变匎5>។ 2，至少 10%的核中表达）基因基因基因的的的的的核中表达。 h, гены значительно активизировались (скорректированный P <0,05, кратность изменения> 2, экспрессируе т 10% ядер) в глутаматергических нейронах t-hCO по сравнению с глутаматергическими нейронами hCO гинтолол термина обогащения ។ h, ហ្សែនត្រូវបានកែតម្រូវយ៉ាងខ្លាំង (បានកែតម្រូវ P < 0.05, ការផ្លាស់ប្តូរផ្នត់> 2, បង្ហាញយ៉ាងហោចណាស់ 10% នៃស្នូល) នៅក្នុងណឺរ៉ូន t-hCO glutamatergic បើប្រៀបធៀបទៅនឹង hCO glutamatergic neurons ការវិភាគ Ontological (GO) នៃពាក្យពង្រឹង។បន្ទាត់ចំនុចបង្ហាញពីតម្លៃ aq នៃ 0.05 ។ i, ការថតរូបភាព UMAP នៃប្រភេទកោសិកា GluN នៅក្នុង t-hCO ដោយប្រើការផ្ទេរស្លាកពីឯកសារយោង 22 snRNA-seq សំណុំទិន្នន័យ Cortex ម៉ូទ័រមនុស្សពេញវ័យ។ CT — កោសិកា corticothalamic, ET — កោសិកា extracerebral, IT — កោសិកា telencephalic ខាងក្នុង, NP — នៅជិតការព្យាករ។
បន្ទាប់មកយើងបានវាយតម្លៃស្ថាបត្យកម្ម cytoarchitecture និងសមាសភាពកោសិកាទាំងមូលនៃ t-hCO ។ ស្នាមប្រឡាក់អង់ទីករនៃកោសិកា endothelial របស់កណ្តុរបានបង្ហាញឱ្យឃើញពីការធ្វើសរសៃឈាមជាមួយ t-hCO ខណៈពេលដែលស្នាមប្រឡាក់ IBA1 បង្ហាញពីវត្តមានរបស់ microglia របស់កណ្តុរនៅទូទាំងអញ្ចាញធ្មេញ (រូបភាពទី 1f និងទិន្នន័យដែលបានពង្រីក រូប 3c, ឃ)។ Immunostaining បានបង្ហាញឱ្យឃើញនូវអង់ទីហ្សែននុយក្លេអ៊ែររបស់មនុស្ស (HNA) កោសិកាវិជ្ជមានដែលបង្ហាញពី PPP1R17 (អ្នកបន្តពូជ cortical), NeuN (ណឺរ៉ូន), SOX9 និង GFAP (កោសិកាដែលទទួលបានពី glial) ឬ PDGFRα (កោសិកាដើម oligodendrocyte) (រូបភាពទី 1f) ។ ដើម្បីសិក្សាសមាសភាពកោសិកានៃ t-hCO នៅដំណោះស្រាយកោសិកាតែមួយ យើងបានអនុវត្តលំដាប់ RNA ស្នូលតែមួយ (snRNA-seq) បន្ទាប់ពីភាពខុសគ្នាប្រហែល 8 ខែ។ ការច្រោះជាដុំៗ និងការដកយកស្នូលរបស់សត្វកណ្ដុរចេញ បានផ្តល់លទ្ធផល 21,500 ផែនទី mononuclear របស់មនុស្សដែលមានគុណភាពខ្ពស់ (រូបភាព 1g និងទិន្នន័យដែលបានពង្រីក រូបទី 4a, ខ)។ គំរូកន្សោមនៃសញ្ញាសម្គាល់ប្រភេទកោសិកាធម្មតាបានកំណត់ចង្កោមនៃថ្នាក់កោសិកា cortical សំខាន់ៗ រួមទាំងណឺរ៉ូន glutamatergic ជ្រៅ និងផ្ទៃខាងក្រៅ កោសិកាបន្តពូជ oligodendrocytes និងត្រកូល astrocyte (រូបភាព 1g ទិន្នន័យដែលបានពង្រីក រូបភព 4c និងតារាងបន្ថែម 3) ។ Immunostaining សម្រាប់ SATB2 និង CTIP2 បានបង្ហាញថាទោះបីជាមានវត្តមាននៃប្រភេទរងនៃ cortical ក៏ដោយ t-hCO មិនបង្ហាញពីការចាត់ថ្នាក់កាយវិភាគសាស្ត្រច្បាស់លាស់ (ទិន្នន័យដែលបានពង្រីក រូបភព 3a) ។ ដំណាក់កាលដែលផ្គូផ្គង snRNA-seq hCO បានបង្កើតថ្នាក់កោសិកាស្រដៀងគ្នាយ៉ាងទូលំទូលាយ ដោយមានករណីលើកលែងមួយចំនួន រួមទាំងអវត្តមាននៃ oligodendrocytes និងវត្តមានរបស់ណឺរ៉ូន GABAergic ដែលអាចឆ្លុះបញ្ចាំងពីលក្ខខណ្ឌអំណោយផលនៅក្នុង vitro ដែលបានរាយការណ៍ពីមុនសម្រាប់កោសិកា progenitor ក្រោយក្រោយ 15 (ទិន្នន័យដែលបានពង្រីក រូបភព 4f – Table4 និងបន្ថែម)។ ការវិភាគការបញ្ចេញហ្សែនឌីផេរ៉ង់ស្យែលបានបង្ហាញពីភាពខុសប្លែកគ្នាយ៉ាងសំខាន់នៅក្នុងណឺរ៉ូន glutamatergic រវាង t-hCO និង hCO (តារាងបន្ថែមទី 5) រួមទាំងការធ្វើឱ្យសកម្មនៃហ្សែនដែលត្រូវបានផ្សារភ្ជាប់ជាមួយនឹងភាពចាស់ទុំនៃសរសៃប្រសាទដូចជាការបញ្ជូនសញ្ញា synaptic ការធ្វើមូលដ្ឋានីយកម្ម dendritic និងសកម្មភាពឆានែលដែលមានតង់ស្យុង (រូបភាពទី 1h និងតារាងបន្ថែម 5) ។ តារាង 6) ។ ដូច្នោះហើយ ណឺរ៉ូន cortical glutamatergic t-hCO បង្ហាញភាពចាស់ទុំនៃប្រតិចារិកដែលបានពន្លឿន។
ដើម្បីបញ្ជាក់ថាតើការផ្លាស់ប្តូរប្រតិចារិកទាំងនេះនៅក្នុង t-hCO ត្រូវបានទាក់ទងទៅនឹងភាពខុសគ្នានៃរូបវិទ្យារវាង hCO នៅក្នុង vitro និង t-hCO នៅក្នុង vivo ដែរឬទេ យើងបានកសាងឡើងវិញនូវដំណាក់កាលដែលត្រូវគ្នានឹង hCO ដែលបំពេញដោយ biocytin និង hCO នៅក្នុងផ្នែកស្រួចស្រាវបន្ទាប់ពីភាពខុសគ្នា 7-8 ខែ។ ណឺរ៉ូន hCO (រូបភាព 2a) ។ ណឺរ៉ូន t-hCO មានទំហំធំជាង មានអង្កត់ផ្ចិតសូម៉ា 1.5 ដង ដេនឌ្រីត 2 ដង និងការកើនឡើងចំនួន 6 ដងនៃប្រវែងសរុបនៃ dendritic បើប្រៀបធៀបទៅនឹងនៅក្នុង vitro hCO (រូបភាព 2b) ។ លើសពីនេះទៀត យើងបានសង្កេតឃើញដង់ស៊ីតេខ្ពស់នៃឆ្អឹងខ្នង dendritic នៅក្នុងណឺរ៉ូន t-hCO ជាងនៅក្នុងណឺរ៉ូន hCO (រូបភាព 2c) ។ នេះបង្ហាញថាណឺរ៉ូន t-hCO ឆ្លងកាត់ការពន្លូត dendritic និងសាខាយ៉ាងទូលំទូលាយ ដែលរួមផ្សំជាមួយនឹងការបន្តរីកកោសិកា អាចរួមចំណែកដល់ការលូតលាស់ដែលពឹងផ្អែកខ្លាំងនៃ t-hCO បន្ទាប់ពីការប្តូរសរីរាង្គ (រូបភាពទី 1 ឃ និងទិន្នន័យបន្ថែម រូបភព 1f) ។ នេះបានជំរុញឱ្យយើងស៊ើបអង្កេតលក្ខណៈសម្បត្តិ electrophysiological ។ Membrane capacitance ខ្ពស់ជាងប្រាំបីដង (ទិន្នន័យដែលបានពង្រីក រូបភាពទី 8 ឃ) សក្តានុពលនៃភ្នាសនៃរដ្ឋដែលនៅសេសសល់គឺកាន់តែខ្ពស់ (ប្រហែល 20 mV) ហើយការចាក់បញ្ចូលបច្ចុប្បន្នបានជំរុញឱ្យមានអត្រារំភើបអតិបរមានៅក្នុងណឺរ៉ូន t-hCO ជាងនៅក្នុងណឺរ៉ូន hCO ។ in vitro (រូបភព។ 2d), e) ដែលស្របជាមួយនឹងលក្ខណៈ morphological ធំជាង និងស្មុគស្មាញជាងនៃ t-hCO ។ លើសពីនេះទៀត ភាពញឹកញាប់នៃព្រឹត្តិការណ៍ postsynaptic បច្ចុប្បន្នដោយឯកឯង (EPSC) គឺខ្ពស់ជាងយ៉ាងខ្លាំងនៅក្នុងណឺរ៉ូន t-hCO (រូបភាព 2f) ដែលបង្ហាញថាការកើនឡើងដង់ស៊ីតេនៃឆ្អឹងខ្នង dendritic ដែលបានសង្កេតឃើញនៅក្នុងសរសៃប្រសាទ t-hCO ត្រូវបានផ្សារភ្ជាប់ជាមួយនឹងភាពរំភើបនៃមុខងារ។ synapse ផ្លូវភេទ។ យើង​បាន​បញ្ជាក់​ពី​លក្ខណៈ​មិន​ពេញ​វ័យ​នៃ​ណឺរ៉ូន hCO ក្នុង vitro ដោយ​ការ​កត់ត្រា​នូវ​ណឺរ៉ូន glutamatergic ដែល​មាន​ស្លាក​សញ្ញា (ទិន្នន័យ​ដែល​បាន​ពង្រីក​រូបភាព 6a-c) ។
a, ការបង្កើតឡើងវិញ 3D នៃ hCO ដែលបំពេញដោយ biocytin និងណឺរ៉ូន t-hCO បន្ទាប់ពី 8 ខែនៃភាពខុសគ្នា។ b, បរិមាណនៃលក្ខណៈពិសេស morphological (n = 8 hCO ណឺរ៉ូន, n = 6 t-hCO ណឺរ៉ូន; ** P = 0.0084, * P = 0.0179 និង *** P < 0.0001) ។ b, បរិមាណនៃលក្ខណៈពិសេស morphological (n = 8 hCO ណឺរ៉ូន, n = 6 t-hCO ណឺរ៉ូន; ** P = 0.0084, * P = 0.0179 និង *** P < 0.0001) ។ б, количественная оценка морфологических признаков (n = 8 нейронов hCO, n = 6 нейронов t-hCO; ** P = 0,0084,0 *** P. 7) . b, បរិមាណនៃលក្ខណៈពិសេស morphological (n=8 hCO ណឺរ៉ូន, n=6 t-hCO ណឺរ៉ូន; **P=0.0084, *P=0.0179, និង ***P<0.0001)។ b，形态学特征的量化（n=8个hCO神经元，n=6个t-hCO神经元；**P = 0.0084，*P = 0.0179<0.0179<0. b，形态学特征的量化（n=8个hCO神经元，n=6个t-hCO神经元；**P = 0.0084，*P = 0.0179<0.0179<0. б, количественная оценка морфологических признаков (n = 8 нейронов hCO, n = 6 нейронов t-hCO; ** P = 0,0084,0 *** P. 7) . b, បរិមាណនៃលក្ខណៈពិសេស morphological (n=8 hCO ណឺរ៉ូន, n=6 t-hCO ណឺរ៉ូន; **P=0.0084, *P=0.0179, និង ***P<0.0001)។c, ការកសាងឡើងវិញ 3D នៃសាខា hCO និង t-hCO dendritic បន្ទាប់ពី 8 ខែនៃភាពខុសគ្នា។ សញ្ញាផ្កាយក្រហមបង្ហាញពីឆ្អឹងខ្នង dendritic ។ បរិមាណដង់ស៊ីតេឆ្អឹងខ្នង Dendritic (n = 8 hCO ណឺរ៉ូន, n = 6 t-hCO ណឺរ៉ូន; ** P = 0.0092) ។ d, បរិមាណនៃសក្ដានុពលនៃភ្នាសសម្រាក (n = 25 hCO ណឺរ៉ូន, n = 16 t-hCO ណឺរ៉ូន; ***P < 0.0001) ។ d, បរិមាណនៃសក្ដានុពលនៃភ្នាសសម្រាក (n = 25 hCO ណឺរ៉ូន, n = 16 t-hCO ណឺរ៉ូន; ***P < 0.0001) ។ d, количественная оценка мембранного потенциала покоя (n = 25 нейронов hCO, n = 16 нейронов t-hCO; *** P < 0,001) ។ d, បរិមាណសក្តានុពលនៃភ្នាសសម្រាក (n = 25 hCO ណឺរ៉ូន, n = 16 t-hCO ណឺរ៉ូន; ***P < 0.0001) ។ d，静息膜电位的量化(n = 25 hCO 神经元，n = 16 t-hCO神经元；***P < 0.0001) ។ d，静息膜电位的量化(n = 25 hCO 神经元，n = 16 t-hCO神经元；***P < 0.0001) ។ d, количественная оценка мембранного потенциала покоя (n = 25 нейронов hCO, n = 16 нейронов t-hCO; *** P < 0,001) ។ d, បរិមាណសក្តានុពលនៃភ្នាសសម្រាក (n = 25 hCO ណឺរ៉ូន, n = 16 t-hCO ណឺរ៉ូន; ***P < 0.0001) ។ e, ការបាញ់សក្តានុពលសកម្មភាពដដែលៗនៅក្នុង hCO និង t-hCO ដែលបង្កឡើងដោយការបង្កើនការចាក់បច្ចុប្បន្ន និងបរិមាណនៃអត្រាបាញ់អតិបរមា (n = 25 hCO ណឺរ៉ូន n = 16 t-hCO ណឺរ៉ូន *** P < 0.0001) ។ e, ការបាញ់សក្តានុពលសកម្មភាពដដែលៗនៅក្នុង hCO និង t-hCO ដែលបង្កឡើងដោយការបង្កើនការចាក់បច្ចុប្បន្ន និងបរិមាណនៃអត្រាបាញ់អតិបរមា (n = 25 hCO ណឺរ៉ូន n = 16 t-hCO ណឺរ៉ូន *** P < 0.0001) ។ e, повторное возбуждение потенциала действия в hCO и t-hCO, вызванное увеличением тока, и количонественая скорости возбуждения (n = 25 нейронов hCO, n = 16 нейронов t-hCO; *** P <0,0001) ។ e, សក្តានុពលសកម្មភាពនៃការបាញ់ឡើងវិញនៅក្នុង hCO និង t-hCO ដែលបង្កឡើងដោយការកើនឡើងនាពេលបច្ចុប្បន្ន និងបរិមាណនៃអត្រាបាញ់អតិបរមា (n = 25 hCO ណឺរ៉ូន n = 16 t-hCO ណឺរ៉ូន *** P < 0.0001) ។ e，通过增加电流注入诱导的hCO 和t-hCO 重复动作电位放电，以及最大放电率的量化 5 (n = 2)神经元，n = 16个t-hCO神经元；***P < 0.0001)។ E ，通过增加电流注入的的 hco 和 t-hco 重复电位放电，以及最大的量化（n = h 15 神 6个 t-hco 神经 ； *** p < 0.0001) ។ e, повторяющееся возбуждение потенциала действия hCO និង t-hCO, вызванное увеличением подачи тока, и кятлием максимальной скорости возбуждения (n = 25 нейронов hCO, n = 16 нейронов t-hCO; *** P <0,0001) ។ e ការបាញ់ម្តងហើយម្តងទៀតនៃសក្តានុពលសកម្មភាព hCO និង t-hCO ដែលបណ្តាលមកពីការកើនឡើងនៃការផ្គត់ផ្គង់បច្ចុប្បន្ន និងបរិមាណនៃអត្រាបាញ់អតិបរមា (n = 25 hCO ណឺរ៉ូន n = 16 t-hCO ណឺរ៉ូន *** P < 0.0001) ។ f, EPSCs ឯកឯង (sEPSCs) ក្នុង hCO និង t-hCO ណឺរ៉ូននៅ 8 ខែនៃភាពខុសគ្នា និងបរិមាណនៃប្រេកង់នៃព្រឹត្តិការណ៍ synaptic (n = 25 hCO ណឺរ៉ូន n = 17 t-hCO ណឺរ៉ូន; *** P < 0.0001) ។ f, Spontaneous EPSCs (sEPSCs) ក្នុង hCO និង t-hCO ណឺរ៉ូននៅ 8 ខែនៃភាពខុសគ្នា និងបរិមាណនៃប្រេកង់នៃព្រឹត្តិការណ៍ synaptic (n = 25 hCO ណឺរ៉ូន n = 17 t-hCO ណឺរ៉ូន; *** P < 0.0001) ។ f, спонтанные EPSC (sEPSC) в нейронах hCO и t-hCO через 8 месяцев дифференцировки и количесотвенная оциченка оциченка событий (n = 25 нейронов hCO, n = 17 нейронов t-hCO; *** P <0,0001) ។ f, EPSCs ដោយឯកឯង (sEPSCs) នៅក្នុងសរសៃប្រសាទ hCO និង t-hCO នៅ 8 ខែនៃភាពខុសគ្នា និងបរិមាណនៃអត្រាព្រឹត្តិការណ៍ synaptic (n=25 hCO ណឺរ៉ូន n=17 t-hCO ណឺរ៉ូន; ***P<0.0001) ។ f，分化8个月时hCO和t-hCO神经元中的自发性EPSCs (sEPSCs)，以及突触事件频率的量化n = 2 珃5 hCO (n = 2 t-hCO 神经元；***P < 0.0001) ។ f，分化8个月时hCO和t-hCO 神经元中的自发性EPSCs (sEPSCs)，以及突触事件频率的量匼的 2 hCO (n = 2 = 25 hCO 神率的量匼(n = 25hCO P < 0.0001) ។ f, спонтанные EPSC (sEPSC) в нейронах hCO и t-hCO через 8 месяцев дифференцировки и количесотвенная оциченка оциченка событий (n = 25 нейронов hCO, n = 17 нейронов t-hCO; *** P <0,0001) ។ f, spontaneous EPSCs (sEPSCs) ក្នុង hCO និង t-hCO neurons នៅ 8 ខែនៃភាពខុសគ្នានិងបរិមាណនៃអត្រាព្រឹត្តិការណ៍ synaptic (n = 25 hCO ណឺរ៉ូន, n = 17 t-hCO ណឺរ៉ូន; *** P<0.0001) ។សម្រាប់ bf, hCO និង t-hCO នៅក្នុងបន្ទាត់ 1208-2 ត្រូវបានគេយកចេញពីបណ្តុំនៃភាពខុសគ្នាដូចគ្នាដែលរក្សាស្របគ្នា។ g, ការវិភាគហ្សែនកំណត់ការពង្រឹង (ការធ្វើតេស្តពិតប្រាកដរបស់ Fisher ម្ខាង) នៃហ្សែនដែលត្រូវបានកែតម្រូវយ៉ាងសំខាន់ (បានកែតម្រូវ P < 0.05, ការផ្លាស់ប្តូរផ្នត់> 2, បង្ហាញក្នុងយ៉ាងហោចណាស់ 10% នៃស្នូល) នៅក្នុងណឺរ៉ូន t-hCO glutamatergic បើប្រៀបធៀបជាមួយ hCO glutamatergic neurons ជាមួយ ponrese ទាំងពីរ (Gene) (LRG) ហ្សែនពឹងផ្អែកលើសកម្មភាពដែលត្រូវបានសម្គាល់ពីការសិក្សារបស់កណ្តុរនៅក្នុង vivo និង LRGs ជាក់លាក់របស់មនុស្សពីណឺរ៉ូននៅក្នុង vitro17 ។ g, ការវិភាគហ្សែនកំណត់ការពង្រឹង (ការធ្វើតេស្តពិតប្រាកដរបស់ Fisher ម្ខាង) នៃហ្សែនដែលត្រូវបានកែតម្រូវយ៉ាងសំខាន់ (បានកែតម្រូវ P < 0.05, ការផ្លាស់ប្តូរផ្នត់> 2, បង្ហាញក្នុងយ៉ាងហោចណាស់ 10% នៃស្នូល) នៅក្នុងណឺរ៉ូន t-hCO glutamatergic បើប្រៀបធៀបជាមួយ hCO glutamatergic neurons ជាមួយ ponrese ទាំងពីរ (Gene) (LRG) ហ្សែនពឹងផ្អែកលើសកម្មភាពដែលត្រូវបានសម្គាល់ពីការសិក្សារបស់កណ្តុរនៅក្នុង vivo និង LRGs ជាក់លាក់របស់មនុស្សពីណឺរ៉ូននៅក្នុង vitro17 ។ g, анализ обогащения набора генов (односторонний точный критерий Фишера) генов со значительной активсцией активацией <0.05, кратность изменения > 2, экспрессия по меньшей мере в 10% ядер) в глутаматергических нейрона хнейрона глутаматергическими нейронами hCO наборы генов как раннего (ERG), так и позднего (LRG) генов, зависящих, от аносящих идентифицированных в исследовании на мышах in vivo16, и специфических для человека LRG из нейронов in vitro17 ។ g ការវិភាគលើការពង្រឹងសំណុំហ្សែន (ការធ្វើតេស្តពិតប្រាកដរបស់ Fisher កន្ទុយតែមួយ) នៃហ្សែនជាមួយនឹងការធ្វើឱ្យសកម្មយ៉ាងសំខាន់ (បានកែតម្រូវ P<0.05, ការផ្លាស់ប្តូរផ្នត់>2, ការបញ្ចេញមតិយ៉ាងហោចណាស់ 10% នៃស្នូល) នៅក្នុងណឺរ៉ូន t-hCO glutamatergic បើប្រៀបធៀបទៅនឹង hCO glutamatergic ណឺរ៉ូន Gpendend និងហ្សែន (ERD) ដំណាក់កាលដំបូង (ERD) ត្រូវបានកំណត់អត្តសញ្ញាណនៅក្នុង vivo កណ្តុរ 16 និង LRGs ជាក់លាក់របស់មនុស្សពីណឺរ៉ូននៅក្នុង vitro17 ។ g，t-hCO谷氨酸能神经元与hCO谷氨酸能神经元相比，t -hCO谷氨酸能神经元显着上调（调整后P<0.05，倍数变化>2，在至少10%的细胞核中表达）的基因集富集分析（单侧F isher精确检验)从体内小鼠研究中鉴定的早期反应(ERG)和晚期反应(LRG) 活性依赖性基因的基因组16 和体外神经元17 中的人类特异性LRG ។ g ，t-hco 谷氨酸神经元与 hco 谷氨酸神经元相比，t-hco 谷氨酸神经元< 上僟 5 氃倍数> 2，至少至少 10%的细胞核中表达）的集富集分析（单侧អ្នកនេសាទ精确）中集分析（的单侧精确）不魔珠精确）不魔内尼早期反应反应反应和晚期反应反应(lrg)活性基因的基因组 16 和神廏中 17 中 17的人类特异性LRG ។ g, глутаматергические нейроны t-hCO были значительно активизированы по сравнению с глутаоманергический (скорректированный P<0,05, кратность изменения> 2, не менее 10% Анализ обогащения набора генов (одностй онтейты Фишера) раннего ответа (ERG) и позднего гены, зависящие от активности ответа (LRG), идентифицирховваннылее in vivo16 និង нейронах in vitro17. g, t-hCO glutamatergic ណឺរ៉ូនត្រូវបានគ្រប់គ្រងយ៉ាងសំខាន់បើប្រៀបធៀបទៅនឹង hCO glutamatergic neurons (បានកែតម្រូវ P<0.05, fold change>2, យ៉ាងហោចណាស់ 10% ការឆ្លើយតបដំបូង (ERG) និងការវិភាគការបង្កើនហ្សែនការឆ្លើយតបយឺត (one-tailed Fisher's exact test) សកម្មភាពឆ្លើយតប អាស្រ័យទៅលើហ្សែន 6) និង void នៅក្នុងហ្សែន 6 (L ណឺរ៉ូន vitro.17 LRGs ជាក់លាក់របស់មនុស្ស។បន្ទាត់ចំនុចបង្ហាញពីតម្លៃ P ដែលត្រូវបានកែតម្រូវដោយ Bonferroni នៃ 0.05 ។ h, កន្សោមហ្សែន GluN (កញ្ចប់ pseudo- និងការធ្វើមាត្រដ្ឋាននៃហ្សែននីមួយៗ) ត្រូវបានគ្រប់គ្រងយ៉ាងខ្លាំងនៅក្នុងការចម្លង snRNA-seq នៃហ្សែន LRG នៅក្នុងសរសៃប្រសាទ t-hCO glutamatergic ។ i, immunostaining បង្ហាញកន្សោម SCG2 នៅក្នុងសរសៃប្រសាទ t-hCO (ខាងលើ) និង hCO (ទាប) ។ ព្រួញពណ៌សចង្អុលទៅកោសិកា SCG2+ ។ របារមាត្រដ្ឋាន, 25µm ។ ទិន្នន័យត្រូវបានបង្ហាញជាគម្លាតមធ្យម ± ស្តង់ដារ។
ដោយផ្អែកលើការកើនឡើងនៃសកម្មភាពរបស់ t-hCO ដែលបានសង្កេតនៅក្នុង ex vivo slices, snRNA-seq បានបង្ហាញពីការបង្កើនសកម្មភាពអាស្រ័យលើសកម្មភាពនៃការចម្លងហ្សែននៅក្នុង t-hCO បើប្រៀបធៀបទៅនឹង hCO in vitro ។ ណឺរ៉ូន Glutamatergic t-hCO បានបង្ហាញពីកម្រិតខ្ពស់នៃហ្សែនដែលគ្រប់គ្រងសកម្មភាពឆ្លើយតបយឺត (រូបភាព 2g, h) ដែលត្រូវបានរកឃើញនៅក្នុងការសិក្សាពីមុននៅក្នុងកណ្តុរ និងសរសៃប្រសាទរបស់មនុស្ស 16,17 ។ ឧទាហរណ៍ BDNF18, SCG2, និង OSTN ដែលជាហ្សែនគ្រប់គ្រងសកម្មភាពជាក់លាក់ primate បានបង្ហាញការកើនឡើងនៅក្នុងណឺរ៉ូន t-hCO បើធៀបទៅនឹងណឺរ៉ូន hCO (រូបភាព 2g-i)។ ដូច្នេះ ណឺរ៉ូន t-hCO បានបង្ហាញលក្ខណៈនៃភាពចាស់ទុំដែលប្រសើរឡើងបើប្រៀបធៀបទៅនឹងណឺរ៉ូន hCO ដោយការចម្លងតាមរូបវិទ្យា និងការវិភាគមុខងារ។
ដើម្បីវាយតម្លៃបន្ថែមលើការផ្សារភ្ជាប់នៃភាពចាស់ទុំ t-hCO ជាមួយនឹងការអភិវឌ្ឍន៍ខួរក្បាលរបស់មនុស្ស យើងបានធ្វើការប្រៀបធៀបប្រតិចារិកនៃកោសិកា cortical ទារក និងមនុស្សពេញវ័យប្រភេទ 19,20 និងមនុស្សពេញវ័យ 21,22 ក៏ដូចជាទិន្នន័យយ៉ាងទូលំទូលាយលើការបញ្ចេញហ្សែន cortical 23 កំឡុងពេលអភិវឌ្ឍ (ទិន្នន័យដែលបានពង្រីក, រូបភាពទី 5)។ ) ជាមួយនឹងការងារមុន 24 ស្ថានភាពកាលកំណត់នៃ hCO សកល និង t-hCO t-hCO នៅ 7-8 ខែនៃភាពខុសគ្នាគឺមានភាពស៊ីសង្វាក់គ្នាយ៉ាងទូលំទូលាយជាមួយនឹងពេលវេលាអភិវឌ្ឍន៍ vivo ហើយគឺសមមូលបំផុតទៅនឹងជីវិតគភ៌ចុង (ទិន្នន័យបន្ថែមរូបភាព 5a) ។ គួរកត់សម្គាល់ថា យើងបានសង្កេតឃើញការកើនឡើងនៃភាពចាស់ទុំនៃប្រតិចារិកនៅក្នុង t-hCO បើប្រៀបធៀបទៅនឹង hCO ដែលត្រូវគ្នានឹងអាយុ ក៏ដូចជាការធ្វើឱ្យសកម្មនៃប្រតិចារិកដែលត្រូវបានផ្សារភ្ជាប់ជាមួយនឹង synaptogenesis, astrogenesis និង myelination (ទិន្នន័យដែលបានពង្រីក រូបភព 5b-d) ។ នៅកម្រិតកោសិកា យើងបានរកឃើញភស្តុតាងនៃប្រភេទរង Cortex ស្តើងជាងនៅក្នុង t-hCO ជាមួយនឹងចង្កោមនៃណឺរ៉ូន glutamatergic ត្រួតលើគ្នាជាមួយនឹងប្រភេទរងនៃណឺរ៉ូន L2/3, L5, និង L6 (រូបភាព 1i) ។ ផ្ទុយទៅវិញ ការត្រួតស៊ីគ្នានៃចង្កោមរវាងណឺរ៉ូន glutamatergic t-hCO និងណឺរ៉ូន cortical របស់ទារកមានកម្រិតច្រើនជាងនៅក្នុងពាក់កណ្តាលនៃការមានផ្ទៃពោះ (ទិន្នន័យដែលបានពង្រីករូបភាព 5e-j) ។ ដើម្បីកំណត់ថាតើណឺរ៉ូន t-hCO មានមុខងារស្រដៀងនឹងណឺរ៉ូន neocortical ក្រោយសម្រាលរបស់មនុស្សដែរឬអត់ យើងបានធ្វើការកត់ត្រា electrophysiological និងការបង្កើតឡើងវិញកាយវិភាគវិទ្យានៃសរសៃប្រសាទពីរ៉ាមីត L2/3 របស់មនុស្សនៅក្នុងផ្នែកមុតស្រួចនៃ Cortex ក្រោយសម្រាលរបស់មនុស្ស (ទិន្នន័យដែលបានពង្រីក រូបភព 7a)។ លក្ខណៈសម្បត្តិ electrophysiological នៃណឺរ៉ូនពីរ៉ាមីត L2/3 គឺស្រដៀងគ្នាទៅនឹងណឺរ៉ូនសាជីជ្រុង t-hCO (ទិន្នន័យដែលបានពង្រីក រូបភព 7e)។ Morphologically ណឺរ៉ូន L2/3 ពីសំណាកមនុស្សក្រោយសម្រាលគឺស្រដៀងទៅនឹង t-hCO ជាង hCO ទោះបីជាកោសិកា L2/3 វែងជាង មានសាខាច្រើនជាងមុន និងមានដង់ស៊ីតេឆ្អឹងខ្នងខ្ពស់ជាង (រូបភាព 3g និងទិន្នន័យពង្រីក រូបភព 7b-)។ ឆ).
a, ការប្តូរ hCO ដែលផលិតដោយការគ្រប់គ្រង និងបន្ទាត់កោសិកា TS hiPS ចូលទៅក្នុងកណ្តុរដែលទើបនឹងកើត។ b, ការបង្កើតឡើងវិញ 3D នៃណឺរ៉ូន t-hCO ដែលបំពេញដោយ biocytin បន្ទាប់ពី 8 ខែនៃភាពខុសគ្នា។ c, បរិមាណនៃប្រវែងមធ្យម dendritic (n = 19 ណឺរ៉ូនគ្រប់គ្រង, n = 21 ណឺរ៉ូន TS; ** P = 0.0041) ។ d, 3D-reconstructed dendritic branch from control and TS t-hCO at 8 months of differentiation, and quantification of dendritic spine density (n = 16 control neurons, n = 21 TS neurons, ***P < 0.0001) ។ d, 3D-reconstructed dendritic branch from control and TS t-hCO at 8 months of differentiation, and quantification of dendritic spine density (n = 16 control neurons, n = 21 TS neurons, ***P < 0.0001) ។ d, 3D-реконструкция дендритных ветвей из контроля и TS t-hCO через 8 месяцев дифференцировки и колиез плотности дендритных шипов (n = 16 контрольных нейронов, n = 21 TS нейронов, *** P<0,0001). d, ការបង្កើតឡើងវិញ 3D នៃសាខា dendritic ពីការគ្រប់គ្រង និង t-hCO TS នៅ 8 ខែនៃភាពខុសគ្នា និងបរិមាណដង់ស៊ីតេឆ្អឹងខ្នង dendritic (n=16 ណឺរ៉ូនគ្រប់គ្រង, n=21 ណឺរ៉ូន TS, ***P<0.0001) ។ d，分化8 个月时对照和TS t-hCO的3D 重建树突分支，以及树突棘密度的量化（n = 16 煞珸珦煞姸21 个TS 神经元，***P < 0.0001). d，分化 8个时对照和 ts t-hco的 3d 重建分支分支以及树突棘密媖重建分支以及树突棘密媖（縏化量化 6元 , n = 21 个 ts 神经 , *** p < 0.0001 ) ។ d, 3D-реконструкция дендритных ветвей контроля и TS t-hCO через 8 месяцев дифференцировки и нкавличест плотности дендритных шипов (n = 16 контрольных нейронов, n = 21 TS нейронов, *** P<0,0001). d, ការកសាងឡើងវិញ 3D នៃសាខា dendritic គ្រប់គ្រង និង TS t-hCO នៅ 8 ខែនៃភាពខុសគ្នា និងបរិមាណដង់ស៊ីតេឆ្អឹងខ្នង dendritic (n=16 ណឺរ៉ូនគ្រប់គ្រង, n=21 ណឺរ៉ូន TS, ***P<0.0001) ។សញ្ញាផ្កាយក្រហមបង្ហាញពីឆ្អឹងខ្នង dendritic ។ e, EPSCs ដោយឯកឯងនៅក្នុងការគ្រប់គ្រង និងសរសៃប្រសាទ TS t-hCO បន្ទាប់ពី 8 ខែនៃភាពខុសគ្នា។ f, គ្រោងប្រេកង់ប្រមូលផ្តុំ និងបរិមាណនៃប្រេកង់ និងទំហំនៃព្រឹត្តិការណ៍ synaptic (n=32 ណឺរ៉ូនគ្រប់គ្រង, n=26 ណឺរ៉ូន TS; **P=0.0076 និង P=0.8102)។ g, ការវិភាគ Scholl នៃ TS និងណឺរ៉ូនគ្រប់គ្រងនៅក្នុង hCO និង t-hCO ។ បន្ទាត់ដាច់ ៗ បង្ហាញពីណឺរ៉ូនពីរ៉ាមីតក្រោយសម្រាល L2/3 របស់មនុស្សសម្រាប់ការប្រៀបធៀប (n = 24 ណឺរ៉ូនគ្រប់គ្រង t-hCO, n = 21 TS t-hCO ណឺរ៉ូន, n = 8 ណឺរ៉ូនគ្រប់គ្រង hCO និង n = 7 TS hCO ណឺរ៉ូន) ។ ទិន្នន័យត្រូវបានបង្ហាញជាគម្លាតមធ្យម ± ស្តង់ដារ
សមត្ថភាពរបស់ t-hCO ក្នុងការចម្លងលក្ខណៈ morphological និងមុខងារនៃណឺរ៉ូន Cortex របស់មនុស្សនៅកម្រិតខ្ពស់បានជំរុញឱ្យយើងស្វែងយល់ថាតើ t-hCO អាចត្រូវបានប្រើដើម្បីរកមើល phenotypes ជំងឺដែរឬទេ។ យើងបានផ្តោតលើ TS ដែលជាជំងឺអភិវឌ្ឍន៍ប្រព័ន្ធប្រសាទធ្ងន់ធ្ងរដែលបណ្តាលមកពីការផ្លាស់ប្តូរមុខងារទទួលបាននៅក្នុងការអ៊ិនកូដហ្សែន CaV1.2 ដែលចាប់ផ្តើមការចម្លងហ្សែនអាស្រ័យលើសកម្មភាពនៅក្នុងណឺរ៉ូន។ យើងទទួលបាន hCO ពីអ្នកជំងឺ TS បីនាក់ដែលមានការជំនួសទូទៅបំផុត (p.G406R) និងការគ្រប់គ្រងចំនួនបី (រូបភាព 3a) ។ បន្ទាប់ពីការប្តូរសរីរាង្គ យើងបានរកឃើញថា សរីរវិទ្យា dendritic ត្រូវបានផ្លាស់ប្តូរនៅក្នុងណឺរ៉ូន TS បើប្រៀបធៀបទៅនឹងវត្ថុបញ្ជា (រូបភាព 3b និងទិន្នន័យដែលបានពង្រីក រូបភព 8a,b) ជាមួយនឹងការកើនឡើងចំនួនពីរដងនៃចំនួន dendrites បឋម និងការកើនឡើងជាមធ្យម និងការថយចុះជាទូទៅនៃប្រវែង dendritic (រូបភាព 3c និងទិន្នន័យបន្ថែម រូបភព 8c)។ នេះត្រូវបានផ្សារភ្ជាប់ជាមួយនឹងការកើនឡើងនៃដង់ស៊ីតេនៃឆ្អឹងខ្នង និងការកើនឡើងនៃប្រេកង់នៃ EPSCs ដោយឯកឯងនៅក្នុង TS បើប្រៀបធៀបទៅនឹងណឺរ៉ូនគ្រប់គ្រង (រូបភាព 3d–f និងទិន្នន័យដែលបានពង្រីក រូបភព 8g)។ ការវិភាគបន្ថែមបានបង្ហាញពីគំរូនៃការបែងចែក dendritic មិនធម្មតានៅក្នុង t-hCO TS បើប្រៀបធៀបទៅនឹងវត្ថុបញ្ជា ប៉ុន្តែមិនមែននៅក្នុង vitro TS hCO នៅដំណាក់កាលស្រដៀងគ្នានៃភាពខុសគ្នា (រូបភាព 3g) ។ នេះគឺស្របជាមួយនឹងរបាយការណ៍ពីមុនរបស់យើងអំពីការរួញតូច dendritic ដែលពឹងផ្អែកលើសកម្មភាពនៅក្នុង TS និងបង្ហាញពីសមត្ថភាពនៃវេទិកាប្តូរសរីរាង្គនេះក្នុងការរកឃើញ phenotypes ជំងឺនៅក្នុង vivo ។
បន្ទាប់មកយើងបានសួរថាតើកោសិកា t-hCO ត្រូវបានរួមបញ្ចូលមុខងារទៅក្នុងកណ្តុរ S1 កម្រិតណា។ S1 នៅក្នុងសត្វកកេរទទួលបានធាតុបញ្ចូល synaptic ខ្លាំងពី ipsilateral ventral basal និង posterior thalamic nuclei ក៏ដូចជា ipsilateral motor និង second somatosensory cortices និង contralateral S1 (Fig ។ 4a) ។ ដើម្បីស្តារលំនាំខាងក្នុងឡើងវិញ យើងបានឆ្លងមេរោគ hCO ជាមួយនឹងមេរោគឆ្កែឆ្កួត-dG-GFP/AAV-G ហើយបានប្តូរ hCO ទៅក្នុងកណ្តុរ S1 3 ថ្ងៃក្រោយមក។ យើងបានសង្កេតឃើញកន្សោម GFP ក្រាស់នៅក្នុងសរសៃប្រសាទនៃ ipsilateral S1 និង ventral ganglia basal ganglia 7-14 ថ្ងៃបន្ទាប់ពីការប្តូរ (រូបភាព 4b, គ) ។ លើសពីនេះទៀត ស្នាមប្រឡាក់អង្គបដិប្រាណនៃសញ្ញាសម្គាល់ thalamic netrin G1 បង្ហាញពីវត្តមាននៃការបញ្ចប់ thalamic នៅក្នុង t-hCO (រូបភាព 4d, e) ។ ដើម្បីវាយតម្លៃថាតើការព្យាករណ៍ដែលគួរឱ្យចាប់អារម្មណ៍ទាំងនេះអាចទាញយកការឆ្លើយតប synaptic នៅក្នុងកោសិកា t-hCO ដែរឬទេ យើងបានធ្វើការកត់ត្រាកោសិកាទាំងមូលពីកោសិកាមនុស្សនៅក្នុងផ្នែកមុតស្រួចនៃស្រទាប់ thalamocortical ។ ការរំញោចអគ្គិសនីនៃកណ្តុរ S1, កន្សោមខាងក្នុង, សារធាតុពណ៌ស, សរសៃនៅជិត t-hCO ឬការធ្វើឱ្យសកម្ម optogenetic នៃ opsin-expressing thalamic endings នៅក្នុង t-hCO induced short-latency EPSCs នៅក្នុងសរសៃប្រសាទ t-hCO ដែលប៉ះពាល់ទៅនឹង AMPA receptor antagonist NBQX ។ (រូបភាព 4f, g និងទិន្នន័យបន្ថែម រូប 9a–g)។ ទិន្នន័យទាំងនេះបង្ហាញថា t-hCO ត្រូវបានរួមបញ្ចូលដោយកាយវិភាគសាស្ត្រទៅក្នុងខួរក្បាលរបស់កណ្តុរ ហើយអាចត្រូវបានធ្វើឱ្យសកម្មដោយជាលិកាសត្វកណ្តុរ។
a, ដ្យាក្រាមគ្រោងការណ៍នៃការពិសោធន៍តាមដានជំងឺឆ្កែឆ្កួត។ b, GFP និងកន្សោម STEM121 របស់មនុស្សជាក់លាក់រវាង t-hCO និង rat cerebral Cortex (បន្ទះខាងលើ)។ បានបង្ហាញផងដែរគឺកន្សោម GFP នៅក្នុង rat ipsilateral ventral basal nucleus (VB) (ខាងឆ្វេងខាងក្រោម) និង ipsilateral S1 (ខាងស្តាំក្រោម)។ របារមាត្រដ្ឋាន, 50 µm ។ ការ៉េក្រហមតំណាងឱ្យតំបន់នៃខួរក្បាលដែលរូបភាពត្រូវបានថត។ c, បរិមាណនៃកោសិកាដែលបង្ហាញ GFP (n = 4 កណ្តុរ) ។ d, e — Netrin G1+ ស្ថានីយ thalamic នៅក្នុង t-hCO ។ d បង្ហាញផ្នែក coronal ដែលមានស្នូល t-hCO និង VB ។ របារជញ្ជីង 2 ម។ e បង្ហាញកន្សោម Netrin G1 និង STEM121 នៅក្នុងណឺរ៉ូន t-hCO (ឆ្វេង) និង VB (ស្តាំ) ។ របារមាត្រដ្ឋាន, 50 µm ។ បន្ទាត់ចំនុចពណ៌ទឹកក្រូចបង្ហាញពីព្រំដែន t-hCO ។ f, g, ដានបច្ចុប្បន្ននៃណឺរ៉ូន t-hCO បន្ទាប់ពីការរំញោចអគ្គិសនីនៅក្នុង S1 rat (f) ឬកន្សោមខាងក្នុង (g), ជាមួយ (ពណ៌ស្វាយ) ឬគ្មាន (ខ្មៅ) NBQX (ខាងឆ្វេង) ។ EPSC ពង្រីកដោយមាន និងគ្មាន NBQX (n = 6 S1 ណឺរ៉ូន * P = 0.0119; និង n = 6 ណឺរ៉ូនខាងក្នុងកន្សោម ** P = 0.0022) (កណ្តាល) ។ ភាគរយនៃណឺរ៉ូន t-hCO បង្ហាញ EPSC ក្នុងការឆ្លើយតបទៅនឹងការរំញោចអគ្គិសនីរបស់កណ្តុរ S1 (f) ឬកន្សោមខាងក្នុង (g) (ស្តាំ) ។ aCSF, សារធាតុរាវ cerebrospinal សិប្បនិម្មិត។ h ដ្យាក្រាមគំនូសតាងនៃការពិសោធន៍រូបភាព 2P (ឆ្វេង)។ ការបញ្ចេញមតិនៃ GCaMP6s នៅក្នុង t-hCO (កណ្តាល) ។ របារមាត្រដ្ឋាន, 100 µm ។ ការរំលងពេលវេលានៃពន្លឺនៃ GCaMP6s (ស្តាំ)។ i, Z-score នៃ fluorescence សកម្មភាពដោយឯកឯង។ j, គំនូរព្រាងនៃការជំរុញពុកមាត់។ k, z-scored 2P fluorescence trajectories នៅក្នុងការសាកល្បងមួយ តម្រឹមជាមួយនឹងគម្លាត whisker នៅពេលវេលាសូន្យ (បន្ទាត់ដាច់) ក្នុងក្រឡាឧទាហរណ៍។ l ការឆ្លើយតបពិន្ទុ z ជាមធ្យមចំនួនប្រជាជននៃកោសិកាទាំងអស់ដែលតម្រឹមជាមួយគម្លាតវីស្គីនៅពេលវេលាសូន្យ (បន្ទាត់ដាច់ ៗ) (ក្រហម) ឬត្រាពេលវេលាដែលបានបង្កើតដោយចៃដន្យ (ប្រផេះ) ។ ម ដ្យាក្រាមគ្រោងការណ៍នៃការពិសោធន៍លើការសម្គាល់អុបទិក។ n, ខ្សែកោងវ៉ុលឆៅពីឧទាហរណ៍ t-hCO cell កំឡុងពេលរំញោចឡាស៊ែរពណ៌ខៀវ ឬការផ្លាត whisker ។ សញ្ញាព្រួញពណ៌ក្រហមបង្ហាញពីការកើនឡើងដំបូងដែលបណ្តាលមកពីពន្លឺ (ខាងលើ) ឬបណ្តាលមកពីការផ្លាតរបស់វីស្គី (បាត)។ ស្រមោលពណ៌ប្រផេះបង្ហាញពីរយៈពេលនៃការផ្លាតរបស់វីស្គី។ o ទម្រង់រលកពន្លឺកំពូល និងការឆ្លើយតបការផ្លាតរបស់វីស្គី។ p, spikes នៃការប៉ុនប៉ងតែមួយ តម្រឹមជាមួយគម្លាតនៃ whiskers នៅក្នុងកោសិកានៃឧទាហរណ៍។ 0 បង្ហាញពីគម្លាតវីស្គី (បន្ទាត់ដាច់ ៗ) ។ q អត្រាការបាញ់ពិន្ទុ z ជាមធ្យមចំនួនប្រជាជនសម្រាប់កោសិកាដែលងាយនឹងពន្លឺទាំងអស់ តម្រឹមជាមួយគម្លាតវីស្គីនៅម៉ោងសូន្យ (បន្ទាត់ដាច់ៗ) (ក្រហម) ឬត្រាពេលវេលាដែលបានបង្កើតដោយចៃដន្យ (ប្រផេះ)។ r, សមាមាត្រនៃឯកតារស្មីសំយោគត្រូវបានកែប្រែយ៉ាងសំខាន់ដោយគម្លាតវីស្គី (n = 3 កណ្តុរ) (ឆ្វេង) ។ Peak z-score latency (n = 3 rats; n = 5 (ពណ៌បៃតងខ្ចី), n = 4 (ពណ៌បៃតងងងឹត) និង n = 4 (cyan) whisker deflection modulation units per rat) (ស្តាំ)។ ទិន្នន័យត្រូវបានបង្ហាញជាគម្លាតមធ្យម ± ស្តង់ដារ
បន្ទាប់មកយើងបានសួរថាតើ t-hCO អាចត្រូវបានធ្វើឱ្យសកម្មដោយការរំញោចអារម្មណ៍នៅក្នុង vivo ដែរឬទេ។ យើងបានប្តូរ hCO ដែលបង្ហាញពីសូចនាករកាល់ស្យូមដែលបានអ៊ិនកូដហ្សែន GCaMP6 ទៅជាកណ្តុរ S1 ។ បន្ទាប់ពី 150 ថ្ងៃ យើងបានអនុវត្តការថតរូបជាតិសរសៃ ឬរូបភាពកាល់ស្យូមពីរសន្លឹក (រូបភាព 4h និងទិន្នន័យដែលបានពង្រីក រូប 10a)។ យើងបានរកឃើញថាកោសិកា t-hCO បង្ហាញសកម្មភាពចង្វាក់ដែលធ្វើសមកាលកម្ម (រូបភាពទី 4i ទិន្នន័យដែលបានពង្រីក រូបភាពទី 10 ខ និងវីដេអូបន្ថែម 1) ។ ដើម្បីកំណត់លក្ខណៈនៃសកម្មភាព peak t-hCO យើងបានអនុវត្តការថត electrophysiological extracellular នៅក្នុងកណ្តុរប្តូរដោយប្រើថ្នាំសន្លប់ (ទិន្នន័យដែលបានពង្រីក រូបភព 10c-f)។ យើងបានបង្កើតកូអរដោនេស្តេរ៉េអូតាកស៊ីពីរូបភាព MRI ។ ដូច្នេះ ឯកតាដែលបានកត់ត្រាទាំងនេះតំណាងឱ្យកោសិកាប្រសាទរបស់មនុស្ស បើទោះបីជា electrophysiology តែម្នាក់ឯងមិនអនុញ្ញាតឱ្យកំណត់ប្រភេទដើមកំណើតក៏ដោយ។ យើងសង្កេតឃើញសកម្មភាពផ្ទុះដែលធ្វើសមកាលកម្ម (ទិន្នន័យដែលបានពង្រីក រូប 10d)។ ការផ្ទុះនេះមានរយៈពេលប្រហែល 460 ms ហើយត្រូវបានបំបែកដោយរយៈពេលស្ងាត់ប្រហែល 2 វិនាទី (ទិន្នន័យដែលបានពង្រីក រូបភព 10d, e)។ អង្គភាពនីមួយៗបានបាញ់ជាមធ្យមប្រហែល 3 ជុំក្នុងមួយផ្ទុះដែលមានប្រហែល 73% នៃអង្គភាពដែលបានចុះឈ្មោះក្នុងមួយការផ្ទុះ។ សកម្មភាពរបស់អង្គភាពនីមួយៗមានទំនាក់ទំនងគ្នាយ៉ាងខ្លាំង ហើយការជាប់ទាក់ទងទាំងនេះគឺខ្ពស់ជាងអង្គភាពដែលបានកំណត់អត្តសញ្ញាណនៅក្នុងសត្វដែលមិនបានចាក់វ៉ាក់សាំងដែលត្រូវបានកត់ត្រានៅក្រោមលក្ខខណ្ឌដូចគ្នា (ទិន្នន័យដែលបានពង្រីក រូបភព 10f)។ ដើម្បីកំណត់លក្ខណៈបន្ថែមទៀតនៃការឆ្លើយតបកើនឡើងនៃណឺរ៉ូនដែលកើតចេញពីមនុស្សដែលបានកំណត់អត្តសញ្ញាណ យើងបានធ្វើការពិសោធដាក់ស្លាកពន្លឺលើកណ្តុរដែលត្រូវបានចាក់ថ្នាំស្ពឹកដោយ hCO ដែលបង្ហាញពីឆានែល cation ប្រកាន់អក្សរតូចធំ rhodopsin 2 (hChR2) ដែលតាមរយៈនោះ ណឺរ៉ូន t-hCO ការទទួលស្គាល់រយៈពេលខ្លី (តិចជាង 10 ms ពណ៌ខៀវ) ក្នុងការឆ្លើយតបទៅនឹងពន្លឺពណ៌ខៀវ។ ណឺរ៉ូន t-hCO បង្ហាញការផ្ទុះនៃសកម្មភាពដោយឯកឯងនៅប្រេកង់ស្រដៀងទៅនឹងអ្វីដែលត្រូវបានគេសង្កេតឃើញនៅក្នុងរូបភាពកាល់ស្យូម ក៏ដូចជាការថតដោយ electrophysiological ដែលធ្វើឡើងនៅក្នុង t-hCO ក្នុងករណីដែលគ្មានការសម្គាល់ពន្លឺ (ទិន្នន័យដែលបានពង្រីករូបភាព 10c-g) ។ មិនមានសកម្មភាពដោយឯកឯងត្រូវបានគេសង្កេតឃើញនៅក្នុងដំណាក់កាលដែលត្រូវគ្នានៃ hCO ដែលបានកត់ត្រានៅក្នុង vitro ។ ដើម្បីវាយតម្លៃថាតើ t-hCO អាចត្រូវបានធ្វើឱ្យសកម្មដោយការរំញោចអារម្មណ៍ យើងបានបង្វែរយ៉ាងខ្លីនូវសត្វកណ្តុរឱ្យឆ្ងាយពី t-hCO (រូបភាព 4j,m និងទិន្នន័យបន្ថែម រូបភព 10h,k)។ យោងតាមការសិក្សាពីមុន 8,10 សំណុំរងនៃកោសិកា t-hCO បានបង្ហាញពីសកម្មភាពកើនឡើងក្នុងការឆ្លើយតបទៅនឹងការផ្លាតរបស់ whisker ដែលមិនត្រូវបានគេសង្កេតឃើញនៅពេលដែលទិន្នន័យត្រូវបានប្រៀបធៀបជាមួយនឹងការបោះត្រាពេលវេលាចៃដន្យ (រូបភាព 4k–q និងទិន្នន័យដែលបានពង្រីក រូបភព 10h–q) ។ ជាការពិតណាស់ ប្រហែល 54% នៃគ្រឿងទោលដែលមានស្លាកសញ្ញា opto បានបង្ហាញពីការកើនឡើងយ៉ាងខ្លាំងនូវអត្រារំជួលចិត្តបន្ទាប់ពីការរំញោច whisker ដែលឈានដល់កម្រិតកំពូលប្រហែល 650 ms (រូបភាព 4r) ។ រួមគ្នា ទិន្នន័យទាំងនេះបង្ហាញថា t-hCO ទទួលបានធាតុចូលមុខងារសមស្រប ហើយអាចត្រូវបានធ្វើឱ្យសកម្មដោយការរំញោចបរិស្ថាន។
បន្ទាប់មក យើងបានស៊ើបអង្កេតថាតើ t-hCO អាចធ្វើសកម្មភាពសៀគ្វីនៅក្នុងសត្វកណ្តុរដើម្បីគ្រប់គ្រងឥរិយាបថដែរឬទេ។ យើងបានស៊ើបអង្កេតដំបូងថាតើ axons នៃ t-hCO ណឺរ៉ូនគ្រោងចូលទៅក្នុងជាលិកាជុំវិញនៃកណ្តុរ។ យើងបានឆ្លងមេរោគ hCO ជាមួយនឹង lentivirus encoding hChR2 បញ្ចូលទៅក្នុង EYFP (hChR2-EYFP)។ បន្ទាប់ពី 110 ថ្ងៃ យើងបានសង្កេតឃើញការបញ្ចេញមតិរបស់ EYFP នៅក្នុងតំបន់ ipsilateral cortical រួមទាំង auditory ម៉ូទ័រ និង cortices somatosensory ក៏ដូចជានៅក្នុងតំបន់ subcortical រួមទាំង striatum hippocampus និង thalamus (រូបភាព 5a) ។ ដើម្បីវាយតម្លៃថាតើការព្យាករណ៍ប្រកបដោយប្រសិទ្ធភាពទាំងនេះអាចទាញយកការឆ្លើយតប synaptic នៅក្នុងកោសិកាកណ្តុរ យើងបានធ្វើឱ្យកោសិកា t-hCO ដំណើរការដោយអុបទិកដែលបង្ហាញពី hChR2-EYFP ដោយកត់ត្រាកោសិកាខួរក្បាលរបស់កណ្តុរនៅក្នុងផ្នែកខួរក្បាលមុតស្រួច។ ការធ្វើឱ្យសកម្មនៃ t-hCO axons ជាមួយនឹងពន្លឺពណ៌ខៀវបានជំរុញឱ្យ EPSCs ភាពយឺតយ៉ាវខ្លីនៅក្នុងណឺរ៉ូន Cortex ពីរ៉ាមីត ដែលត្រូវបានរារាំងដោយ NBQX (រូបភាព 5b-g) ។ លើសពីនេះទៀតការឆ្លើយតបទាំងនេះអាចត្រូវបានរារាំងដោយ tetrodotoxin (TTX) និងត្រូវបានស្ដារឡើងវិញដោយ 4-aminopyridine (4-AP) ដែលបង្ហាញថាពួកគេត្រូវបានបង្កឡើងដោយការភ្ជាប់ monosynaptic (រូបភាព 5e) ។
a, ដ្យាក្រាមគំនូសតាងនៃការតាមដានអ័ក្ស (ខាងឆ្វេង) ។ t-hCO EYFP កន្សោម (ស្តាំ) ។ របារមាត្រដ្ឋាន, 100 µm ។ A1, auditory Cortex, ACC, anterior cingulate Cortex, ឃ. striatum, dorsal striatum, HPC, hippocampus; Diaphragm, lateral septum, mPFC, medial prefrontal Cortex, piri, piriform Cortex, v. striatum, ventral striatum, VPM, ventropostomedial nucleus នៃ thalamus, VTA, តំបន់ ventral tegmental ។ ការ៉េក្រហមតំណាងឱ្យតំបន់នៃខួរក្បាលដែលរូបភាពត្រូវបានថត។ ខ, ដ្យាក្រាមគ្រោងការណ៍នៃការពិសោធន៍រំញោច។ c, d, ឧទាហរណ៍នៃការឆ្លើយតបនៃ photocurrent ពន្លឺពណ៌ខៀវ (កំពូល) និងវ៉ុល (ខាងក្រោម) នៅក្នុងមនុស្ស (c) EYFP+ t-hCO ឬ rat (d) EYFP- cells ។ e, f, ដានបច្ចុប្បន្ននៃណឺរ៉ូនកណ្តុរបន្ទាប់ពីការរំញោចពន្លឺពណ៌ខៀវនៃ t-hCO axons ជាមួយ TTX និង 4-AR (បៃតង), TTX (ប្រផេះ) ឬ aCSF (ខ្មៅ) (e), ជាមួយ (violet) ឬគ្មាន (ខ្មៅ)) NBQX (e) ។ g, ភាពយឺតយ៉ាវនៃការឆ្លើយតបដែលបណ្តាលមកពីពន្លឺពណ៌ខៀវនៅក្នុងកោសិកាកណ្តុរ (n = 16 កោសិកា); របារផ្ដេកបង្ហាញពីភាពយឺតយ៉ាវជាមធ្យម (7.13 ms) (ឆ្វេង) ។ ទំហំនៃ EPSCs ដែលបញ្ចេញពន្លឺបានកត់ត្រាដោយមាន ឬគ្មាន NBQX (n = 7 cells; ***P < 0.0001) (កណ្តាល)។ ទំហំនៃ EPSCs ដែលបញ្ចេញពន្លឺបានកត់ត្រាដោយមាន ឬគ្មាន NBQX (n = 7 cells; ***P < 0.0001) (កណ្តាល)។ Амплитуда вызванных светом EPSC, зарегистрированных с или без NBQX (n = 7 клеток; ***P <0,0001) (ក្នុង центре) ។ ទំហំនៃ EPSCs ដែលបង្កើតដោយពន្លឺដែលត្រូវបានកត់ត្រាដោយមាន ឬគ្មាន NBQX (n = 7 cells; ***P < 0.0001) (កណ្តាល)។使用或不使用NBQX 记录的光诱发EPSC的振幅(n = 7个细胞；***P < 0.0001) (中) ។使用或不使用NBQX 记录的光诱发EPSC的振幅(n = 7个细胞；***P < 0.0001) (中) ។ Амплитуда вызванных светом EPSC, зарегистрированных с или без NBQX (n = 7 клеток; ***P <0,0001) (ក្នុង центре) ។ ទំហំនៃ EPSCs ដែលបង្កើតដោយពន្លឺដែលត្រូវបានកត់ត្រាដោយមាន ឬគ្មាន NBQX (n = 7 cells; ***P < 0.0001) (កណ្តាល)។ភាគរយនៃកោសិកាកណ្តុរដែលបង្ហាញពី EPSCs ដែលឆ្លើយតបទៅនឹងពន្លឺពណ៌ខៀវ (ស្តាំ)។ h, ដ្យាក្រាមគ្រោងការណ៍នៃកិច្ចការអាកប្បកិរិយា។ d0, ថ្ងៃ 0. i. ការសម្តែងសត្វគំរូនៅថ្ងៃទី 1 (ឆ្វេង) ឬថ្ងៃទី 15 (ស្តាំ) នៃការបណ្តុះបណ្តាល។ ចំនួនមធ្យមនៃការលិតធ្វើឡើងនៅថ្ងៃទី 1 (ឆ្វេង) ឬថ្ងៃទី 15 (កណ្តាលខាងស្តាំ) (n = 150 blue light trials, n = 150 red light trials; ***P < 0.0001)។ ចំនួនមធ្យមនៃការលិតធ្វើឡើងនៅថ្ងៃទី 1 (ឆ្វេង) ឬថ្ងៃទី 15 (កណ្តាលខាងស្តាំ) (n = 150 blue light trials, n = 150 red light trials; ***P < 0.0001)។ Среднее количество облизываний, выполненных в день 1 (слева) или день 15 (в центре справа) (n = 150 сним исним светом, n = 150 испытаний с красным светом ***P <0,0001)។ ចំនួនមធ្យមនៃការ licks ធ្វើឡើងនៅថ្ងៃទី 1 (ឆ្វេង) ឬថ្ងៃទី 15 (កណ្តាលស្តាំ) (n = 150 blue light trials, n = 150 red light trials; ***P < 0.0001)។第1天（左）或第15天（右中）执行的平均舔次数（n=150次蓝光试验，n=150次红匉。；150欯红匉。；第1天（左）或第15天（右中）执行的平均舔次数（n=150次蓝光试验，n=150次红匉； 150欯红匉 Среднее количество облизываний, выполненных в день 1 (слева) или день 15 (в центре справа) (n = 150 сним исним светом, n = 150 испытаний с красным светом ***P <0,0001)។ ចំនួនមធ្យមនៃការ licks ធ្វើឡើងនៅថ្ងៃទី 1 (ឆ្វេង) ឬថ្ងៃទី 15 (កណ្តាលស្តាំ) (n = 150 blue light trials, n = 150 red light trials; ***P < 0.0001)។ការ​លិត​បន្តបន្ទាប់​គ្នា​សម្រាប់​ការ​សាកល្បង​ពន្លឺ​ពណ៌​ក្រហម និង​ខៀវ​នៅ​ថ្ងៃ​ទី 1 (កណ្ដាល​ឆ្វេង) ឬ​ថ្ងៃ​ទី 15 (ស្ដាំ)។ NS មិនសំខាន់ទេ។ j,k, ចរិតលក្ខណៈនៃសត្វទាំងអស់ដែលបានប្តូរជាមួយ t-hCO បង្ហាញ hChR2-EYFP (j) ឬគ្រប់គ្រង fluorophore (k) នៅថ្ងៃទី 1 ឬ 15 (hChR2-EYFP: n = 9 កណ្តុរ, ** P = 0.0049; ការគ្រប់គ្រង: n = 9, P = 0.1497) ។ l, ការវិវត្តនៃពិន្ទុចំណូលចិត្ត (n = 9 hChR2, n = 9 control; **P < 0.001, ***P < 0.0001) ។ l, ការវិវត្តនៃពិន្ទុចំណូលចិត្ត (n = 9 hChR2, n = 9 control; **P < 0.001, ***P < 0.0001) ។ l, Эволюция показателя предпочтения (n = 9 hChR2, n = 9 контрольных; **P <0,001, ***P <0,0001) ។ l, ការវិវត្តនៃពិន្ទុចំណូលចិត្ត (n = 9 hChR2, n = 9 controls; **P < 0.001, ***P < 0.0001) ។ l，偏好评分的演变(n = 9 hChR2,n = 9对照；**P < 0.001,***P < 0.0001)។ l，偏好评分的演变(n = 9 hChR2,n = 9对照；**P < 0.001,***P < 0.0001)។ l, Эволюция показателей предпочтения (n = 9 hChR2, n = 9 контролей; **P <0,001, ***P <0,0001) ។ l, ការវិវត្តនៃពិន្ទុចំណូលចិត្ត (n = 9 hChR2, n = 9 controls; **P < 0.001, ***P < 0.0001) ។m, ការបញ្ចេញមតិ FOS ក្នុងការឆ្លើយតបទៅនឹងការធ្វើឱ្យសកម្ម optogenetic នៃ t-hCO នៅក្នុង S1 ។ រូបភាពនៃការបញ្ចេញមតិ FOS (ឆ្វេង) និងបរិមាណ (n = 3 ក្នុងមួយក្រុម; *P < 0.05, ** P < 0.01 និង *** P < 0.001) (ស្តាំ) ត្រូវបានបង្ហាញ។ រូបភាពនៃការបញ្ចេញមតិ FOS (ឆ្វេង) និងបរិមាណ (n = 3 ក្នុងមួយក្រុម; *P < 0.05, ** P < 0.01 និង *** P < 0.001) (ស្តាំ) ត្រូវបានបង្ហាញ។ Показаны изображения экспрессии FOS (слева) и количественного определения (n = 3 на группу; * P<0,05, **при ***0,01). រូបភាពនៃការបញ្ចេញមតិ FOS (ឆ្វេង) និងបរិមាណ (n = 3 ក្នុងមួយក្រុម; *P<0.05, **P<0.01, និង ***P<0.001) ត្រូវបានបង្ហាញ (ស្តាំ)។显示了FOS 表达（左）和量化（每组n = 3；*P< 0.05、**P < 0.01和***P < 0.001）（右）的图像។显示了FOS 表达（左）和量化（每组n = 3；*P< 0.05、**P < 0.01和***P < 0.001）（右）的图像។ Показаны изображения экспрессии FOS (слева) и количественного определения (n = 3 на группу; * P<0,05, **при ***0,01). រូបភាពនៃការបញ្ចេញមតិ FOS (ឆ្វេង) និងបរិមាណ (n = 3 ក្នុងមួយក្រុម; *P<0.05, **P<0.01, និង ***P<0.001) ត្រូវបានបង្ហាញ (ស្តាំ)។របារមាត្រដ្ឋាន, 100 µm ។ ទិន្នន័យត្រូវបានបង្ហាញថាជាកំហុសស្តង់ដារមធ្យម±នៃ BLA, basolateral tonsil, MDT, dorsomedial thalamic nucleus, PAG, periaqueductal gray ។
ជាចុងក្រោយ យើងបានសួរថាតើ t-hCO អាចកែប្រែឥរិយាបថរបស់កណ្តុរបានដែរឬទេ។ ដើម្បីសាកល្បងវា យើងបានប្តូរ hChR2-EYFP-expressing hCO ទៅក្នុង S1 ហើយ 90 ថ្ងៃក្រោយមក យើងបានបញ្ចូលសរសៃអុបទិកទៅក្នុង t-hCO សម្រាប់ផ្តល់ពន្លឺ។ បន្ទាប់មក ពួកយើងបានបង្ហាត់សត្វកណ្ដុរជាមួយនឹងគំរូម៉ាស៊ីនត្រជាក់ដែលបានកែប្រែ (រូបភាព 5 ម៉ោង)។ យើងបានដាក់សត្វទៅក្នុងបន្ទប់ពិសោធន៍អាកប្បកិរិយា ហើយបានអនុវត្តដោយចៃដន្យ 5 វិនាទីពណ៌ខៀវ (473 nm) និងក្រហម (635 nm) ឡាស៊ែររំញោច។ សត្វបានទទួលរង្វាន់ទឹក ប្រសិនបើពួកគេលិទ្ធកំឡុងពេលភ្ញោចពន្លឺពណ៌ខៀវ ប៉ុន្តែមិនបានលិទ្ធក្នុងអំឡុងពេលភ្ញោចពន្លឺក្រហម។ នៅថ្ងៃដំបូងនៃការហ្វឹកហាត់ សត្វមិនមានភាពខុសប្លែកគ្នាក្នុងការលិតនៅពេលភ្ញោចពន្លឺពណ៌ខៀវ ឬក្រហម។ ទោះជាយ៉ាងណាក៏ដោយនៅថ្ងៃទី 15 សត្វដែលបានប្តូរជាមួយ hCO ដែលបង្ហាញពី hChR2-EYFP បានបង្ហាញពីការលិទ្ធកាន់តែសកម្មនៅពេលដែលត្រូវបានជំរុញដោយពន្លឺពណ៌ខៀវបើប្រៀបធៀបទៅនឹងការភ្ញោចពន្លឺក្រហម។ ការផ្លាស់ប្តូរទាំងនេះនៅក្នុងឥរិយាបទ licking មិនត្រូវបានគេសង្កេតឃើញនៅក្នុងសត្វគ្រប់គ្រងដែលត្រូវបានប្តូរជាមួយ hCO ដែលបង្ហាញពី fluorophore វត្ថុបញ្ជា (អត្រាជោគជ័យក្នុងការរៀន: hChR2 89%, EYFP 0%, រូបភាព 5i-1 និងវីដេអូបន្ថែម 2) ។ ទិន្នន័យទាំងនេះបង្ហាញថាកោសិកា t-hCO អាចធ្វើសកម្មភាពសរសៃប្រសាទកណ្តុរដើម្បីជំរុញឥរិយាបថស្វែងរករង្វាន់។ ដើម្បីរកមើលថាតើសៀគ្វីសរសៃប្រសាទរបស់សត្វកណ្តុរ t-hCO មួយណាអាចជាប់ពាក់ព័ន្ធនៅក្នុងការផ្លាស់ប្តូរអាកប្បកិរិយាទាំងនេះ យើងបានធ្វើឱ្យសកម្ម t-hCO យ៉ាងសកម្មនៅក្នុងសត្វដែលបានទទួលការបណ្តុះបណ្តាល និងប្រមូលផលជាលិកាក្នុងរយៈពេល 90 នាទីក្រោយមក។ Immunohistochemistry បានបង្ហាញពីការបញ្ចេញមតិនៃប្រូតេអ៊ីន FOS ដែលពឹងផ្អែកលើសកម្មភាពនៅក្នុងតំបន់ខួរក្បាលជាច្រើនដែលពាក់ព័ន្ធនឹងអាកប្បកិរិយាដែលជំរុញទឹកចិត្ត រួមមាន ខួរក្បាល prefrontal cortex, medial thalamus និង periaqueductal gray matter ដែលត្រូវបានបង្ហាញទាំងនៅក្នុងសត្វដែលមិនមានការត្រួតពិនិត្យ ឬនៅក្នុងសត្វ។ អង្ករ។ ៥ម)។ សរុបមក ទិន្នន័យទាំងនេះបង្ហាញថា t-hCO អាចកែប្រែសកម្មភាពសរសៃប្រសាទរបស់កណ្តុរដើម្បីជំរុញឥរិយាបថ។
សរីរាង្គសរសៃប្រសាទតំណាងឱ្យប្រព័ន្ធដែលរំពឹងទុកសម្រាប់ការសិក្សាអំពីការអភិវឌ្ឍមនុស្ស និងជំងឺនៅក្នុង vitro ប៉ុន្តែពួកវាត្រូវបានកំណត់ដោយការខ្វះខាតនៃការតភ្ជាប់រវាងសៀគ្វីដែលមាននៅក្នុង vivo ។ យើងបានបង្កើតវេទិកាប្រលោមលោកមួយដែលយើងបានប្តូរ hCO ទៅក្នុង S1 នៃកណ្តុរក្រោយសម្រាលដែលមានភាពស៊ាំនឹងមេរោគ ដើម្បីសិក្សាពីការអភិវឌ្ឍន៍កោសិកាមនុស្ស និងមុខងារនៅក្នុង vivo ។ យើងបានបង្ហាញថា t-hCO បង្កើតប្រភេទកោសិកាចាស់ទុំ ដែលមិនត្រូវបានគេសង្កេតឃើញនៅក្នុង vitro28 ហើយថា t-hCO ត្រូវបានបញ្ចូលក្នុងកាយវិភាគសាស្ត្រ និងមុខងារទៅក្នុងខួរក្បាលសត្វកកេរ។ ការរួមបញ្ចូលនៃ t-hCO ទៅក្នុងសៀគ្វីសរសៃប្រសាទសត្វកកេរបានអនុញ្ញាតឱ្យយើងបង្កើតទំនាក់ទំនងរវាងសកម្មភាពកោសិការបស់មនុស្ស និងបានសិក្សាពីអាកប្បកិរិយារបស់សត្វ ដោយបង្ហាញថា ណឺរ៉ូន t-hCO អាចកែប្រែសកម្មភាពសរសៃប្រសាទរបស់សត្វកណ្តុរដើម្បីជំរុញការឆ្លើយតបនៃអាកប្បកិរិយា។
វេទិកា​ដែល​យើង​ពិពណ៌នា​មាន​អត្ថប្រយោជន៍​ជា​ច្រើន​លើ​ការ​ស្រាវ​ជ្រាវ​មុន​អំពី​ការ​ប្តូរ​កោសិកា​មនុស្ស​ទៅ​ក្នុង​ខួរក្បាល​សត្វ​កកេរ។ ទីមួយ យើងបានប្តូរ hCO ទៅក្នុងកោសិកាដែលកំពុងលូតលាស់នៃកណ្តុរក្រោយសម្រាលដំបូង ដែលអាចជួយសម្រួលដល់ការរួមបញ្ចូលផ្នែកកាយវិភាគវិទ្យា និងមុខងារ។ ទីពីរ ការត្រួតពិនិត្យ t-hCO MRI បានអនុញ្ញាតឱ្យយើងសិក្សាពីទីតាំងអញ្ចាញធ្មេញ និងការលូតលាស់នៅក្នុងសត្វរស់ ដែលអនុញ្ញាតឱ្យយើងធ្វើការសិក្សាពហុសត្វរយៈពេលវែង និងបង្កើតភាពជឿជាក់នៃកោសិកា hiPS ជាច្រើន។ ទីបំផុត យើងបានប្តូរសរីរាង្គដែលនៅដដែល ជាជាងការព្យួរកោសិកាតែមួយដាច់ដោយឡែក ដែលមិនសូវបំផ្លាញកោសិកាមនុស្ស និងអាចលើកកម្ពស់ការរួមបញ្ចូល និងការបង្កើតកោសិកាសរសៃប្រសាទរបស់មនុស្សនៅក្នុងខួរក្បាលកណ្តុរ។
យើងទទួលស្គាល់ថា ទោះបីជាមានភាពជឿនលឿននៅក្នុងវេទិកានេះក៏ដោយ ឧបសគ្គខាងសាច់ឈាម លំហ និងឆ្លងប្រភេទអាចរារាំងការបង្កើតសៀគ្វីសរសៃប្រសាទរបស់មនុស្សជាមួយនឹងភាពស្មោះត្រង់ខ្ពស់ ទោះបីជាបន្ទាប់ពីការប្តូរសរីរាង្គនៅដំណាក់កាលដំបូងនៃការអភិវឌ្ឍន៍ក៏ដោយ។ ជាឧទាហរណ៍ វាមិនច្បាស់ទេថាតើសកម្មភាពដោយឯកឯងដែលបានសង្កេតនៅក្នុង t-hCO តំណាងឱ្យ phenotype វិវត្តន៍ស្រដៀងទៅនឹងសកម្មភាពចង្វាក់ដែលបានសង្កេតក្នុងអំឡុងពេលនៃការអភិវឌ្ឍន៍ cortical ឬថាតើវាបណ្តាលមកពីអវត្តមាននៃប្រភេទកោសិកាដែលបង្ក្រាបមានវត្តមាននៅក្នុង t-hCO ។ ដូចគ្នានេះដែរវាមិនច្បាស់ថាអវត្ដមាននៃស្រទាប់ខាងក្នុងនៅក្នុង t-hCO ប៉ះពាល់ដល់ការភ្ជាប់ខ្សែសង្វាក់កម្រិតណានោះទេ។ ការងារនាពេលអនាគតនឹងផ្តោតលើការរួមបញ្ចូលប្រភេទកោសិកាផ្សេងទៀតដូចជា microglia របស់មនុស្ស កោសិកា endothelial មនុស្ស និងសមាមាត្រផ្សេងគ្នានៃ GABAergic interneurons ដូចដែលបានបង្ហាញដោយប្រើការជួបប្រជុំគ្នា 6 in vitro ក៏ដូចជាការយល់ដឹងពីរបៀបដែលការរួមបញ្ចូល និងដំណើរការសរសៃប្រសាទអាចកើតឡើងនៅក្នុង t-hCO ដែលត្រូវបានផ្លាស់ប្តូរ។ កម្រិតនៃការចម្លង, synaptic និងអាកប្បកិរិយានៅក្នុងកោសិកាដែលទទួលបានពីអ្នកជំងឺ។
សរុបមក នេះនៅក្នុង vivo platform តំណាងឱ្យធនធានដ៏មានអានុភាពដែលអាចបំពេញបន្ថែមក្នុងការអភិវឌ្ឍន៍ខួរក្បាលរបស់មនុស្ស និងការស្រាវជ្រាវជំងឺ។ យើងរំពឹងថាវេទិកានេះនឹងអនុញ្ញាតឱ្យយើងរកឃើញ phenotypes កម្រិត strand-level ថ្មីនៅក្នុងកោសិកាដែលបានមកពីអ្នកជំងឺដែលងាយយល់ ហើយសាកល្បងយុទ្ធសាស្រ្តព្យាបាលថ្មី។
យើងបានបង្កើត hCO2.5 ពីកោសិកា HiPS ដូចដែលបានពិពណ៌នាពីមុន។ ដើម្បីចាប់ផ្តើមការផលិត hCO ពីកោសិកា hiPS ដែលដាំដុះនៅលើស្រទាប់ feeder អាណានិគមនៅដដែលនៃកោសិកា hiPS ត្រូវបានយកចេញពីចានវប្បធម៌ដោយប្រើ dispase (0.35 mg/mL) ហើយផ្ទេរទៅវប្បធម៌ផ្លាស្ទិចដែលភ្ជាប់ទាបបំផុតដែលមានចានជាមួយឧបករណ៍ផ្ទុកកោសិកា hiPS ។ (Corning) បន្ថែមដោយ SMAD inhibitors dorsomorphine ពីរ (5 μM; P5499, Sigma-Aldrich) និង SB-431542 (10 μM; 1614, Tocris) និង ROCK inhibitor Y-27632 (10 μM; S1049, Selleckchem) ។ ក្នុងអំឡុងពេល 5 ថ្ងៃដំបូង ឧបករណ៍ផ្ទុកកោសិកា hiPS ត្រូវបានផ្លាស់ប្តូរជារៀងរាល់ថ្ងៃ ហើយ dorsomorphine និង SB-431542 ត្រូវបានបន្ថែម។ នៅថ្ងៃទីប្រាំមួយនៅក្នុងការព្យួរ សារធាតុសរសៃប្រសាទត្រូវបានផ្ទេរទៅឧបករណ៍ផ្ទុកសរសៃប្រសាទដែលមានសារធាតុ neurobasal-A (10888, Life Technologies), អាហារបំប៉ន B-27 ដោយគ្មានវីតាមីន A (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies), Penicillin និង 1000 ជីវិតបន្ថែមជាមួយនឹងបច្ចេកវិទ្យា streptomycin។ កត្តាលូតលាស់នៃអេពីដេមិច (EGF; 20 ng ml−1; R&D Systems) និងកត្តាលូតលាស់ fibroblast 2 (FGF2; 20 ng ml−1; R&D Systems) រហូតដល់ថ្ងៃទី 24 ។ ចាប់ពីថ្ងៃទី 25 ដល់ថ្ងៃទី 42 ឧបករណ៍ផ្ទុកត្រូវបានបំពេញបន្ថែមដោយកត្តា neurotrophic ដែលមកពីខួរក្បាល (BDNF; 20 NT បច្ចេកវិទ្យា 3 ml) និង ng ml-1; Peprotech) ជាមួយនឹងការផ្លាស់ប្តូរមធ្យមជារៀងរាល់ថ្ងៃ។ នៅថ្ងៃទីប្រាំមួយនៅក្នុងការព្យួរ សារធាតុសរសៃប្រសាទត្រូវបានផ្ទេរទៅឧបករណ៍ផ្ទុកសរសៃប្រសាទដែលមានសារធាតុ neurobasal-A (10888, Life Technologies), អាហារបំប៉ន B-27 ដោយគ្មានវីតាមីន A (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies), Penicillin និង 1000 ជីវិតបន្ថែមជាមួយនឹងបច្ចេកវិទ្យា streptomycin។ កត្តាលូតលាស់នៃអេពីដេមិច (EGF; 20 ng ml−1; R&D Systems) និងកត្តាលូតលាស់ fibroblast 2 (FGF2; 20 ng ml−1; R&D Systems) រហូតដល់ថ្ងៃទី 24 ។ ចាប់ពីថ្ងៃទី 25 ដល់ថ្ងៃទី 42 ឧបករណ៍ផ្ទុកត្រូវបានបំពេញបន្ថែមដោយកត្តា neurotrophic ដែលមកពីខួរក្បាល (BDNF; 20 NT បច្ចេកវិទ្យា 3 ml) និង ng ml-1; Peprotech) ជាមួយនឹងការផ្លាស់ប្តូរមធ្យមជារៀងរាល់ថ្ងៃ។នៅថ្ងៃទីប្រាំមួយនៅក្នុងការផ្អាក សារធាតុសរសៃប្រសាទត្រូវបានផ្ទេរទៅឧបករណ៍ផ្ទុកសរសៃប្រសាទដែលមាន Neurobasal-A (10888, Life Technologies), អាហារបំប៉ន B-27 ដោយគ្មានវីតាមីន A (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies), Penicillin ។និង стрептомицин (1:100, Life Technologies) និង дополнены эпидермальным фактором роста (EGF; 20 нг/мл; R&D Systems) និង факто фибробластов 2 (FGF2; 20 нг/мл; R&D Systems) до 24-го дня. និង streptomycin (1:100, Life Technologies) និងបន្ថែមជាមួយនឹងកត្តាលូតលាស់នៃអេពីដេមិច (EGF; 20 ng/ml; R&D Systems) និងកត្តាលូតលាស់ fibroblast 2 (FGF2; 20 ng/ml; R&D Systems) រហូតដល់ថ្ងៃទី 24 ។ចាប់ពីថ្ងៃទី 25 ដល់ថ្ងៃទី 42 កត្តា neurotrophic បានមកពីខួរក្បាល (BDNF; 20 ng ml-1, Peprotech) និង neurotrophin 3 (NT3; 20 ng ml-1, Peprotech) ត្រូវបានបន្ថែមទៅឧបករណ៍ផ្ទុក ដោយផ្លាស់ប្តូរឧបករណ៍ផ្ទុកជារៀងរាល់ថ្ងៃផ្សេងទៀត។在悬浮的第6天，将神经球体转移到含有neurobasal-A（10888，Life Technologies）、不含维生素A，B-27，7，128剅បច្ចេកវិទ្យា), GlutaMax (1:100, Life Technologies), 青霉素的神经培养基中和链霉素 (1:100, Life Technologies) 并辅以表嚿四 EG ml-1； R&D Systems)和成纤维细胞生长因子2 (FGF2；20 ng ml-1； R&D Systems)直至第24天។在悬浮的第第6天将神经球体转移含有含有 neurobasal-a（10888，Life Technologies）不吉维兟素2 (12587, Life Technologies) Glutamax （1:100，Life TechNOGIS青霉素的神经培养基中链霉素（1:100，Life Technologies因盐销盐盐盐畿宿行） ((20 ng ml-1 ； r & d Systems) 成纤维细胞生长 2 (fgf2 ； 20 ng ml- 1； R&D Systems) 直至第24天។ На 6-й день суспензии нейросферы были переведены на добавку, содержащую нейробазал-А (10888, Life Technologies-2 задеку), витамина А (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies), пенициллин- нейтрализованный стрептомицин (1:100, Life Technologies) эпидермального фактора роста (EGF; 20 нг мл-1; R&D Systems) និង фактора роста фибробластов 2 (FGF2; 20 нг); 1м-1 នៅថ្ងៃទី 6 ការព្យួរប្រព័ន្ធប្រសាទត្រូវបានប្តូរទៅជាអាហារបំប៉នដែលមានសារធាតុ neurobasal-A (10888, Life Technologies), អាហារបំប៉ន B-27 ដោយគ្មានវីតាមីន A (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies), penicillin-neutralized streptomycin, អាហារបំប៉ន 100der Life: (EGF; 20 ng ml-1; R&D Systems) និងកត្តាលូតលាស់ fibroblast 2 (FGF2; 20 ng ml-1) 1; ប្រព័ន្ធ R&D) សម្រាប់ 24-го дня ។ ប្រព័ន្ធ R&D) រហូតដល់ថ្ងៃទី ២៤។ចាប់ពីថ្ងៃទី 25 ដល់ថ្ងៃទី 42 កត្តា neurotrophic បានមកពីខួរក្បាល (BDNF; 20 ng ml-1, Peprotech) និងកត្តា neurotrophic 3 (NT3; 20 ng ml-1, Peprotech) ត្រូវបានបន្ថែមទៅឧបករណ៍ផ្ទុកវប្បធម៌ជារៀងរាល់ថ្ងៃ។ ការផ្លាស់ប្តូរមធ្យមម្តង។ចាប់ផ្តើមពីថ្ងៃទី 43 hCO ត្រូវបានរក្សានៅក្នុងឧបករណ៍ផ្ទុក neurobasal-A ដែលមិនបានបំពេញបន្ថែម (NM; 1088022, Thermo Fisher) ជាមួយនឹងការផ្លាស់ប្តូរមធ្យមរៀងរាល់ 4-6 ថ្ងៃ។ ដើម្បីទទួលបាន hCO ពីកោសិកា hiPS ដែលត្រូវបានដាំដុះក្រោមលក្ខខណ្ឌគ្មានចំណី កោសិកា hiPS ត្រូវបាន incubated ជាមួយ Accutase (AT-104, Innovate Cell Technologies) នៅ 37°C សម្រាប់ 7 នាទី បំបែកទៅជាកោសិកាតែមួយ ហើយដាក់នៅលើចាន AggreWell 800 (34815, STEMCELL Technologies ក្នុង 10 Esential Cells) ក្នុងមួយកោសិកាតែមួយ 8 មធ្យមបន្ថែមដោយ ROCK inhibitor Y-27632 (10 μM; S1049, Selleckchem) ។ បន្ទាប់ពី 24 ម៉ោង ប្រព័ន្ធផ្សព្វផ្សាយនៅក្នុងអណ្តូងត្រូវបានបញ្ចូនឡើងលើ និងចុះក្រោមទៅក្នុងប្រព័ន្ធផ្សព្វផ្សាយដែលមាន Essential 6 media (A1516401, Life Technologies) បន្ថែមដោយ dorsomorphine (2.5 μM; P5499, Sigma-Aldrich) និង SB-431542 (10 μM; 161 μM); , តូគ្រីដា) ។ ចាប់ពីថ្ងៃទី 2 ដល់ថ្ងៃទី 6 ឧបករណ៍ផ្ទុក Essential 6 ត្រូវបានជំនួសជារៀងរាល់ថ្ងៃដោយ dorsomorphine និងបន្ថែម SB-431542 ។ ចាប់ពីថ្ងៃទីប្រាំមួយ ការព្យួរប្រព័ន្ធប្រសាទត្រូវបានផ្ទេរទៅឧបករណ៍ផ្ទុក neurobasal និងរក្សាដូចបានរៀបរាប់ខាងលើ។
នីតិវិធីសត្វទាំងអស់ត្រូវបានអនុវត្តដោយអនុលោមតាមការណែនាំអំពីការថែទាំសត្វដែលត្រូវបានអនុម័តដោយគណៈកម្មាធិការរដ្ឋបាលថែទាំសត្វនៃមន្ទីរពិសោធន៍នៃសាកលវិទ្យាល័យស្ទែនហ្វដ (APLAC) ។ កណ្តុរ euthymic RNU (rnu/+) មានផ្ទៃពោះត្រូវបានទិញ (មន្ទីរពិសោធន៍ Charles River) ឬដាក់ផ្ទះ។ សត្វត្រូវបានរក្សាទុកនៅលើវដ្ដពន្លឺ-ងងឹតរយៈពេល 12 ម៉ោងជាមួយនឹងអាហារ និងទឹក។ កូនកណ្តុរអាក្រាតកាយ (FOXN1–/–) ដែលមានអាយុពី 3 ទៅ 7 ថ្ងៃ ត្រូវបានកំណត់អត្តសញ្ញាណដោយការរីកលូតលាស់នៃសត្វកណ្ដុរដែលមិនទាន់ពេញវ័យមុនពេលធ្វើការកាត់។ កូនឆ្កែ (ប្រុស និងស្រី) ត្រូវបានគេចាក់ថ្នាំស្ពឹកជាមួយនឹង 2-3% isoflurane ហើយដាក់នៅលើស៊ុមស្តេរ៉េអូតាស៊ីក។ ការវះកាត់លលាដ៍ក្បាលដែលមានអង្កត់ផ្ចិតប្រហែល 2-3 មីលីម៉ែត្រពីលើ S1 ត្រូវបានអនុវត្តខណៈពេលដែលរក្សាបាននូវភាពសុចរិតនៃ dura mater ។ បន្ទាប់មកប្រើម្ជុល 30-G (ប្រហែល 0.3 ម.ម) នៅខាងក្រៅនៃការវះកាត់ដើម្បីទម្លុះ dura ។ បន្ទាប់មកលាប HCO ទៅប៉ារ៉ាហ្វីលស្តើង 3×3 សង់ទីម៉ែត្រ ហើយយកឧបករណ៍ផ្ទុកលើសចេញ។ ដោយប្រើសឺរាុំង Hamilton ភ្ជាប់ទៅនឹងម្ជុល 23 G, 45° គូរ hCO ថ្នមៗចូលទៅក្នុងចុងចុងបំផុតនៃម្ជុល។ បន្ទាប់មកដំឡើងសឺរាុំងនៅលើស្នប់សឺរាុំងដែលភ្ជាប់ទៅនឹងឧបករណ៍ស្តេរ៉េអូតាស៊ីក។ បនា្ទាប់មកដាក់ចុងម្ជុលលើរន្ធដាល់ទទឹង 0.3 ម.ម ដ្រលបានធ្វើពីមុនក្នុង dura (z = 0 mm) ហើយបង្រួមសឺរាុំង 1-2 mm (z = ប្រហែល -1.5 mm) រហូតដល់ម្ជុលស្ថិតនៅចន្លោះ dura mater A. ត្រាក្រាស់មួយត្រូវបានបង្កើតឡើង។ បន្ទាប់មកលើកសឺរាុំងទៅកណ្តាលនៃផ្ទៃ cortical នៅ z = -0.5 mm ហើយចាក់ hCO ក្នុងអត្រា 1-2 µl ក្នុងមួយនាទី។ បន្ទាប់ពីបញ្ចប់ការចាក់ hCO ម្ជុលត្រូវបានដកចេញក្នុងអត្រា 0.2-0.5 មីលីម៉ែត្រក្នុងមួយនាទី ស្បែកត្រូវបានដេរ ហើយកូនឆ្កែត្រូវបានដាក់ភ្លាមៗនៅលើកំរាលកំដៅរហូតដល់ការជាសះស្បើយពេញលេញ។ សត្វខ្លះត្រូវបានស្ទូងទ្វេភាគី។
នីតិវិធីសត្វទាំងអស់ត្រូវបានអនុវត្តដោយអនុលោមតាមគោលការណ៍ណែនាំថែទាំសត្វដែលត្រូវបានអនុម័តដោយសាកលវិទ្យាល័យស្ទែនហ្វដ APLAC ។ សត្វកណ្ដុរ (ច្រើនជាង 60 ថ្ងៃបន្ទាប់ពីការប្តូរសរីរាង្គ) ត្រូវបានបង្កឡើងដោយការប្រើថ្នាំសន្លប់ 5% isoflurane និងត្រូវបានចាក់ថ្នាំស្ពឹកជាមួយនឹង 1-3% isoflurane អំឡុងពេលថត។ សម្រាប់ការមើលឃើញ ឧបករណ៍ស្កែនរន្ធផ្តេក 7 Tesla បានការពារយ៉ាងសកម្ម Bruker (Bruker Corp.) ជាមួយនឹងក្រុមហ៊ុន International Electric Company (IECO) gradient drive ដែលជាស្រទាប់ការពារដែលមានអង្កត់ផ្ចិតខាងក្នុង 120 mm (600 mT/m, 1000 T/m/s) ដោយប្រើ AVANCE។ III សមត្ថភាព RF ពហុស្នូលប្រាំបីឆានែល និងពហុស្នូល និងវេទិកា Paravision 6.0.1 អមមកជាមួយ។ ការកត់ត្រាត្រូវបានអនុវត្តដោយប្រើឧបករណ៏ RF volumetric ដែលត្រូវបានបំបែកយ៉ាងសកម្មជាមួយនឹងអង្កត់ផ្ចិតខាងក្នុង 86 មីលីម៉ែត្រ និងឧបករណ៏ RF ត្រជាក់ 4 ឆានែលសម្រាប់ការទទួលតែប៉ុណ្ណោះ។ Axial 2D Turbo-RARE (ពេលវេលាធ្វើម្តងទៀត = 2500 ms, ពេលវេលាអេកូ = 33 ms, 2 មធ្យម) ជាមួយនឹងការចាប់យក 16 ចំណិត, កម្រាស់ចំណិត 0.6-0.8 ម, ដែលមានគំរូ 256 × 256 ។ សញ្ញាត្រូវបានទទួលដោយប្រើ quadrature transceiver volumetric coil RF ដែលមានអង្កត់ផ្ចិតខាងក្នុង 2 សង់ទីម៉ែត្រ (Rapid MR International, LLC) ។ ជាចុងក្រោយ សូមប្រើមុខងារប៉ាន់ស្មានផ្ទៃដែលភ្ជាប់មកជាមួយ Imaris (BitPlane) សម្រាប់ការបង្ហាញ 3D និងការវិភាគកម្រិតសំឡេង។ ការប្តូរសរីរាង្គដោយជោគជ័យត្រូវបានកំណត់ថាជាតំបន់ដែលសញ្ញា MRI ទម្ងន់ T2 បន្តត្រូវបានបង្កើតឡើងនៅក្នុងអឌ្ឍគោលដែលបានប្តូរ។ ការច្រានចោលអំពើពុករលួយត្រូវបានកំណត់ថាជាអំពើពុករលួយដែលមិនបង្កើតតំបន់នៃសញ្ញា MRI ដែលមានទម្ងន់ T2 បន្តនៅក្នុងអឌ្ឍគោលដែលបានប្តូរ។ Subcortical t-hCO ត្រូវបានដកចេញពីការវិភាគជាបន្តបន្ទាប់។
ដើម្បីបង្ហាញ GCaMP6s ប្រកបដោយស្ថេរភាពនៅក្នុង hCO សម្រាប់ការថតរូបភាពកាល់ស្យូម 2-photon កោសិកា hiPS ត្រូវបានឆ្លងមេរោគ pLV[Exp]-EF1a::GcaMP6s-WPRE-Puro បន្តដោយការជ្រើសរើសថ្នាំអង់ទីប៊ីយោទិច។ ដោយសង្ខេប កោសិកាត្រូវបានផ្តាច់ជាមួយនឹង EDTA និងផ្អាកក្នុង 1 មីលីលីត្រនៃសារធាតុ Essential 8 ដែលមានដង់ស៊ីតេប្រហែល 300,000 កោសិកានៅក្នុងវត្តមាននៃសារធាតុ polybrine (5 μg/ml) និង 15 μl នៃមេរោគ។ បន្ទាប់មកកោសិកាត្រូវបាន incubated in suspension for 60 minutes and seed at a density of 50,000 cell per well. បន្ទាប់ពីការប្រសព្វ កោសិកាត្រូវបានព្យាបាលដោយ 5-10 μg ml-1 puromycin រយៈពេល 5-10 ថ្ងៃ ឬរហូតដល់អាណានិគមមានស្ថេរភាពលេចឡើង។ ការឆ្លងមេរោគ hCO ស្រួចស្រាវត្រូវបានអនុវត្តដូចដែលបានពិពណ៌នាពីមុន 5 ជាមួយនឹងការកែប្រែមួយចំនួន។ ដោយសង្ខេប ផ្ទេរថ្ងៃ 30-45 hCO ទៅក្នុងបំពង់ 1.5 មីលីលីត្រ Eppendorf microcentrifuge ដែលមានផ្ទុកសរសៃប្រសាទ 100 μl។ បន្ទាប់មកប្រហែល 90 µl នៃឧបករណ៍ផ្ទុកត្រូវបានដកចេញ 3-6 µl នៃ titer lentivirus ខ្ពស់ (ពី 0.5 x 108 ដល់ 1.2 x 109) ត្រូវបានបន្ថែមទៅក្នុងបំពង់ ហើយ hCO ត្រូវបានផ្ទេរទៅកន្លែងភ្ញាស់រយៈពេល 30 នាទី។ បន្ទាប់មកបន្ថែម 90-100 µl នៃមធ្យមទៅក្នុងបំពង់នីមួយៗ ហើយត្រឡប់បំពង់ទៅកន្លែងភ្ញាស់ពេញមួយយប់។ នៅថ្ងៃបន្ទាប់ ផ្ទេរ hCO ទៅឧបករណ៍ផ្ទុកសរសៃប្រសាទស្រស់នៅក្នុងចានភ្ជាប់ទាប។ បន្ទាប់ពី 7 ថ្ងៃ hCO ត្រូវបានផ្ទេរទៅចានបាតកញ្ចក់ 24 អណ្តូងសម្រាប់ការមើលឃើញនិងវាយតម្លៃគុណភាពនៃការឆ្លង។ pLV[Exp]-SYN1::EYFP-WPRE និង pLV[Exp]-SYN1::hChR2-EYFP-WPRE ត្រូវបានបង្កើតឡើងដោយ VectorBuilder។ Lentivirus ត្រូវបានប្រើនៅក្នុងការពិសោធន៍ភាគច្រើន ព្រោះវាត្រូវបានដាក់បញ្ចូលទៅក្នុងហ្សែនមេ ដែលអនុញ្ញាតឱ្យមានការបញ្ចេញហ្សែនអ្នករាយការណ៍នៅក្នុងខ្សែកោសិកាដែលឆ្លងមេរោគ។ សម្រាប់ការតាមដានជំងឺឆ្កែឆ្កួត ថ្ងៃទី 30-45 hCO ត្រូវបានឆ្លងមេរោគឆ្កែឆ្កួត-ΔG-eGFP និង AAV-DJ-EF1a-CVS-G-WPRE-pGHpA (plasmid #67528, Addgene) លាងសម្អាតឱ្យបានហ្មត់ចត់រយៈពេល 3 ថ្ងៃ រួចស្ទូងចូលទៅក្នុងសត្វកណ្តុរនៅ S1 និងរក្សាទុកក្នុងរយៈពេល 7-14 ថ្ងៃ។
សម្រាប់ immunocytochemistry សត្វត្រូវបានចាក់ថ្នាំស្ពឹក និងប្តូរបេះដូងជាមួយ PBS អមដោយ 4% paraformaldehyde (PFA នៅក្នុង PBS; Electron Microscopy Sciences)។ ខួរក្បាលត្រូវបានជួសជុលក្នុង 4% PFA រយៈពេល 2 ម៉ោង ឬមួយយប់នៅសីតុណ្ហភាព 4 ° C, រក្សាទុកក្នុង 30% sucrose ក្នុង PBS រយៈពេល 48-72 ម៉ោង និងបានបង្កប់ក្នុង 1:1, 30% sucrose: OCT (Tissue-Tek OCT Compound 4583, Sakura Finetek crys) ត្រូវបានបង្កើតឡើងនៅកម្រិត 3 µ (លីកា) ។ សម្រាប់ immunohistochemistry នៃផ្នែកក្រាស់ សត្វត្រូវបានបំភាន់ជាមួយ PBS ហើយខួរក្បាលត្រូវបានកាត់ចេញ និងបែងចែកជាផ្នែកនៅកម្រិត 300-400 µm ដោយប្រើ vibratome (Leica) ហើយផ្នែកត្រូវបានជួសជុលជាមួយនឹង PFA 4% រយៈពេល 30 នាទី។ បន្ទាប់មក សូលុយស្យុង ឬផ្នែកក្រាស់ៗត្រូវបានទឹកនាំទៅដោយ PBS ដែលត្រូវបានរារាំងរយៈពេល 1 ម៉ោងនៅសីតុណ្ហភាពបន្ទប់ (10% សេរ៉ូមសត្វលាធម្មតា (NDS) និង 0.3% Triton X-100 ពនឺក្នុង PBS) និងរារាំងដោយដំណោះស្រាយទប់ស្កាត់នៅ 4 ° C ។ – ការ​ភ្ញាស់​ត្រូវ​បាន​ភ្ញាស់​ពេញ​មួយ​យប់ ហើយ​ផ្នែក​ក្រាស់​ត្រូវ​បាន​ភ្ញាស់​រយៈពេល ៥ ថ្ងៃ។ អង្គបដិប្រាណបឋមដែលប្រើគឺ៖ ប្រឆាំងនឹង NeuN (កណ្ដុរ, 1:500; ab104224, abcam) ប្រឆាំង CTIP2 (rat, 1:300; ab18465, abcam), ប្រឆាំងនឹង GFAP (ទន្សាយ, 1:1,000; Z0334, Dako), anti-GFP (: ​​01,000; anti-GFP; GTX13970, GeneTex), ប្រឆាំង HNA (កណ្ដុរ, 1:200; ab191181, abcam), ប្រឆាំង NeuN (ទន្សាយ, 1:500; ABN78, Millipore), ប្រឆាំង PDGFRA (ទន្សាយ, 1:200; sc-338, Santa Cruz, 117), ប្រឆាំង - PP: HPA047819, Atlas Antibodies), ប្រឆាំង RECA-1 (កណ្ដុរ, 1:50; ab9774, abcam), ប្រឆាំង SCG2 (ទន្សាយ, 1:100; 20357-1-AP, Proteintech), ប្រឆាំង SOX9 (ពពែ, 1:500; AF&rinats, Nets, G) 1:100; AF1166, R&D Systems), ប្រឆាំង STEM121 (កណ្ដុរ, 1:200; Y40410, Takara Bio), ប្រឆាំង SATB2 (កណ្ដុរ, 1:50; ab51502, abcam), ប្រឆាំង GAD65/67 (ទន្សាយ, IBNA14, 1:4900; 1:100; ab5076, abcam) ។ អង្គបដិប្រាណបឋមដែលប្រើគឺ៖ ប្រឆាំងនឹង NeuN (កណ្ដុរ, 1:500; ab104224, abcam) ប្រឆាំងនឹង CTIP2 (rat, 1:300; ab18465, abcam), ប្រឆាំងនឹង GFAP (ទន្សាយ, 1:1,000; Z0334, Dako), anti-GFP (: ​​1,000); GTX13970, GeneTex), ប្រឆាំង HNA (កណ្ដុរ, 1:200; ab191181, abcam), ប្រឆាំង NeuN (ទន្សាយ, 1:500; ABN78, Millipore), ប្រឆាំង PDGFRA (ទន្សាយ, 1:200; sc-338, Santa Cruz, 117), ប្រឆាំង - PP: HPA047819, Atlas Antibodies), ប្រឆាំង RECA-1 (កណ្ដុរ, 1:50; ab9774, abcam), ប្រឆាំង SCG2 (ទន្សាយ, 1:100; 20357-1-AP, Proteintech), ប្រឆាំង SOX9 (ពពែ, 1:500; AF&Net, G1075), 1:100; AF1166, R&D Systems), ប្រឆាំង STEM121 (កណ្ដុរ , 1:200; Y40410, Takara Bio), ប្រឆាំង SATB2 (កណ្តុរ, 1:50; ab51502, abcam), ប្រឆាំង GAD65/67 (ទន្សាយ, 1:4900; ប្រឆាំង SATB, 1:400; 1:100; ab5076, abcam) ។ Использовались следующие первичные антитела: анти-NeuN (мышиные, 1:500; ab104224, abcam), анти-CTIP2 (кр, 80, 1 сины) abcam), анти-GFAP (кроличьи, 1:1000; Z0334, Dako), анти- -GFP (курица, 1:1000; GTX13970, GeneTex), анти-HNA (мышь, 8:1910), 1,1910 анти-NeuN (кролик, 1:500; ABN78, Millipore), анти-PDGFRA (кролик, 1:200; sc-338, Санта-Круз), анти-PPP1R17 (кролик, 1:200; អង្គបដិប្រាណ), анти-RECA-1 (мышь, 1:50; ab9774, abcam), анти-SCG2 (кролик , 1:100; 20357-1-AP, Proteintech), анти-SOX9 (козий, 1:35&07; AF) нетрин G1a (козий, 1:100; AF1166, R&D Systems), анти-STEM121 (мышиный, 1:200; Y40410, Takara Bio), анти-SATB2 (мышь, 1:150), анти-GAD65/67 (кролик, 1:400; ABN904, Millipore) និង анти-IBA1 (коза, 1:100; аб5076, абкам)។ អង្គបដិប្រាណចម្បងដែលប្រើគឺ៖ ប្រឆាំង NeuN (កណ្តុរ, 1:500; ab104224, abcam), anti-CTIP2 (rat, 1:300; ab18465, abcam), ប្រឆាំងនឹង GFAP (ទន្សាយ, 1:1000; Z0334, Dako), anti-GFP; 100, GFP (មាន់) GeneTex), ប្រឆាំង HNA (កណ្ដុរ, 1:200; ab191181, abcam), ប្រឆាំង-NeuN (ទន្សាយ, 1:500; ABN78, Millipore), ប្រឆាំងនឹង PDGFRA (ទន្សាយ, 1:200; sc-338, Santa Cruz), ប្រឆាំង-PPP1R17, 204PA, ទន្សាយ; អង់ទីគ័រ), ប្រឆាំង RECA-1 (កណ្តុរ, 1:50; ab9774, abcam), ប្រឆាំង-SCG2 (ទន្សាយ, 1:100; 20357-1-AP, ប្រូតេអីុច), ប្រឆាំង SOX9 (ពពែ, 1:500; AF3075, ប្រព័ន្ធ R&D: 1030, G1a, netrin, AF10, 61a ប្រព័ន្ធ R&D), ប្រឆាំង STEM121 (កណ្តុរ, 1:200; Y40410, Takara Bio), ប្រឆាំង SATB2 (កណ្ដុរ, 1:50; ab51502, abcam), ប្រឆាំង GAD65/67 (ទន្សាយ, 1:400; ABN904, Millipore: 10, 10 goat, 67) អាប់ខេម) ។使用的一抗是：抗NeuN（小鼠，1:500；ab104224，abcam）抗CTIP2（大鼠，1:3 00；ab18465,abcam),抗GFAP(兔,1:1,000；Z0334,Dako),抗-GF P (鸡, 1: 1,000; GTX13970, GeneTex), 抗HNA (小鼠, 1:200；ab191181, abcam), 抗NeuN (兔, 1: 500； ABN78, Millipore), 抗PDG 1:200；sc-338,Santa Cruz),抗PPP1R17（兔，1:200；HPA047819，Atlas抗体），抗RECA-1（小鼠，1:50；ab9774，SCAM） 1:100；20357-1-AP,Proteintech),抗SOX9(山羊,1:500；AF3075,R&D Systems),Netrin G1a(山羊,1:100；AF1166, R&D Systems) 1:20,000, ST使用的一抗是：抗NeuN（小鼠，1:500；ab104224，abcam）抗CTIP2（大鼠，1:300；ab18465，abcam），抗GFAP（兔，3，漛000） -GFP (鸡, 1: 1,000; GTX13970, GeneTex), 抗HNA (小鼠, 1:200；ab191181, abcam), 抗NeuN (兔, 1: 500； ABN78, Millipore, 1400, 100; 200；sc-338，Santa Cruz），抗PPP1R17（兔，1:200；HPA047819，Atlas抗体），抗RECA-1（小鼠，1:50；ab9774，SCG2， 100；20357-1-AP，Proteintech），抗SOX9（山羊，1:500；AF3075，R&D Systems），Netrin G1a（山羊，1:100；AF1166，R&D Systems），1:20Y40410, Takara Bio), ប្រឆាំង SATB2 (កណ្តុរ, 1:50; ab51502, abcam), ប្រឆាំង GAD65/67 (ទន្សាយ, 1:400; ABN904, Millipore) និងប្រឆាំង IBA1 (ពពែ, 1:100; ab5076, abcam)។អង្គបដិប្រាណចម្បងដែលប្រើគឺ៖ ប្រឆាំងនឺណឺ (កណ្ដុរ, 1:500; ab104224, abcam), ប្រឆាំង CTIP2 (កណ្តុរ, 1:300; ab18465, abcam), ប្រឆាំងនឹង GFAP (ទន្សាយ, 1:1000; Z0334, ដាកូ) ។ ប្រឆាំង GFP (មាន់, 1:1000; GTX13970, GeneTex), ប្រឆាំង HNA (កណ្តុរ, 1:200; ab191181, abcam), ប្រឆាំងនឹង NeuN (ទន្សាយ, 1:500; ABN78, Millipore), ប្រឆាំងនឹង PDGFRA (08 ទន្សាយ; 1: 000, ទន្សាយ; ប្រឆាំងនឹង PPP1R17 (ទន្សាយ, 1:200; HPA047819, អង់ទីករ Atlas), ប្រឆាំងនឹង RECA-1 (កណ្តុរ, 1:50; ab9774, abcam), ប្រឆាំងនឹង SCG2 (ទន្សាយ), 1:100;20357-1-AP, Proteintech), анти-SOX9 (коза, 1:500; AF3075, R&D Systems), Нетрин G1a (коза, 1:100; AF1166, R&D Systems), анть, (1:2012) Y40410, Takara Bio), анти-SATB2 (мышь, 1:50; ab51502, abcam), анти-GAD65/67 (кролик, 1:400; ABN904, Millipore) និង анти-IBA70, 1 ко: អាបបាម៉ា) ។ 20357-1-AP, Proteintech), ប្រឆាំង SOX9 (ពពែ, 1:500; AF3075, ប្រព័ន្ធ R&D), Netrin G1a (ពពែ, 1:100; AF1166, ប្រព័ន្ធ R&D), ប្រឆាំង STEM121 (កណ្ដុរ, 1:200; ប្រឆាំងមូស, Takara241) 1:50; ab51502, abcam), ប្រឆាំង GAD65/67 (ទន្សាយ, 1:400; ABN904, Millipore) និងប្រឆាំង IBA1 (ពពែ, 1:100; ab5076, abkam)។បន្ទាប់មកផ្នែកត្រូវបានទឹកនាំទៅដោយ PBS និង incubated ជាមួយអង្គបដិប្រាណបន្ទាប់បន្សំរយៈពេល 1 ម៉ោងនៅសីតុណ្ហភាពបន្ទប់ (ផ្នែកដែលបង្កក) ឬពេញមួយយប់នៅ 4 ° C (ផ្នែកក្រាស់) ។ អង្គបដិប្រាណបន្ទាប់បន្សំ Alexa Fluor (Life Technologies) ពនរ 1:1000 ក្នុងដំណោះស្រាយទប់ស្កាត់ត្រូវបានគេប្រើ។ បន្ទាប់ពីលាងសម្អាតជាមួយ PBS ស្នូលត្រូវបានគេមើលឃើញដោយ Hoechst 33258 (Life Technologies) ។ ជាចុងក្រោយ ស្លាយត្រូវបានដាក់នៅលើមីក្រូទស្សន៍ដែលមានគម្រប (Fisher Scientific) ដោយប្រើ Aquamount (Polysciences) និងវិភាគលើមីក្រូទស្សន៍ fluorescent Keyence (BZ-X analyzer) ឬ Leica TCS SP8 confocal microscope (Las-X) នៅលើរូបភាព។ រូបភាពត្រូវបានដំណើរការដោយប្រើកម្មវិធី ImageJ (Fiji) ។ ដើម្បីគណនាសមាមាត្រនៃណឺរ៉ូនរបស់មនុស្សនៅក្នុង t-hCO និង Cortex របស់កណ្តុរ រូបភាពចតុកោណកែងទទឹង 387.5 μm ត្រូវបានថតនៅចំកណ្តាលនៃ t-hCO នៅ ឬជិតគែមនៃ Cortex របស់កណ្តុរ។ រឹម Graft ត្រូវបានកំណត់ដោយការវាយតម្លៃការផ្លាស់ប្តូរនៃតម្លាភាពជាលិកា ស្នូល HNA+ និង/ឬវត្តមាននៃ autofluorescence ជាលិកា។ នៅក្នុងរូបភាពនីមួយៗ ចំនួនសរុបនៃកោសិកា NeuN+ និង HNA+ ត្រូវបានបែងចែកដោយចំនួនសរុបនៃកោសិកា NeuN+ នៅក្នុងតំបន់ដូចគ្នា។ ដើម្បីធានាថាមានតែកោសិកាដែលមានស្នូលនៅក្នុងប្លង់រូបភាពប៉ុណ្ណោះដែលត្រូវបានរាប់ មានតែកោសិកាដែលមាន Hoechst+ ប៉ុណ្ណោះដែលត្រូវបានបញ្ចូលក្នុងការគណនា។ រូបភាពពីរដែលបំបែកដោយយ៉ាងហោចណាស់ 1 ម.ម ត្រូវបានគេគិតជាមធ្យម ដើម្បីកាត់បន្ថយកំហុសស្ថិតិ។
មួយសប្តាហ៍មុនពេលប្រមូលសំណាក សូមដាក់សត្វប្តូរ hCO (ប្រហែល 8 ខែនៃភាពខុសគ្នា) នៅក្នុងបន្ទប់ងងឹតមួយជាមួយនឹងវីស្គីដែលត្រូវបានតុបតែងដើម្បីកាត់បន្ថយការរំញោចអារម្មណ៍។ ភាពឯកោនៃស្នូលត្រូវបានអនុវត្តដូចដែលបានពិពណ៌នាពីមុនដោយមានការកែប្រែមួយចំនួន។ ដោយសង្ខេប t-hCO និង hCO ត្រូវបានបំផ្លាញដោយប្រើ detergent-mechanical cell lysis និងម៉ាស៊ីនកិនជាលិកាកែវ 2ml (D8938, Sigma-Aldrich/KIMBLE)។ បន្ទាប់មកស្នូលឆៅត្រូវបានច្រោះដោយប្រើតម្រង 40 µm និង centrifuged នៅ 320 ក្រាមសម្រាប់រយៈពេល 10 នាទីនៅសីតុណ្ហភាព 4 ° C មុនពេលអនុវត្តជម្រាលដង់ស៊ីតេ sucrose ។ បន្ទាប់ពីជំហាន centrifugation (320 ក្រាមសម្រាប់រយៈពេល 20 នាទីនៅ 4 ° C) សំណាកត្រូវបានផ្អាកឡើងវិញក្នុង 0.04% BSA/PBS ជាមួយនឹងការបន្ថែម 0.2 ឯកតានៃ µl-1 RNase inhibitor (40 u µl-1, AM2682, Ambion) និងឆ្លងកាត់តម្រងលំហូរ 40 μm។ បន្ទាប់មក ស្នូលដែលបែកខ្ញែកត្រូវបានផ្អាកឡើងវិញនៅក្នុង PBS ដែលមាន 0.02% BSA និងផ្ទុកនៅលើបន្ទះឈីប Chromium Single Cell 3′ (ប៉ាន់ស្មានការស្ដារឡើងវិញនៃកោសិកា 8,000 ក្នុងមួយផ្លូវ)។ បណ្ណាល័យ snRNA-seq ត្រូវបានរៀបចំជាមួយ Chromium Single cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics) ។ បណ្ណាល័យ snRNA-seq ត្រូវបានរៀបចំជាមួយ Chromium Single cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics) ។ Библиотеки snRNA-seq были приготовлены с помощью Chromium Single cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics) ។ បណ្ណាល័យ snRNA-seq ត្រូវបានរៀបចំដោយប្រើ Chromium Single cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics) ។ snRNA-seq 文库是使用Chromium Single cell 3′ GEM、Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics) 制备的។ snRNA-seq 文库是使用Chromium Single cell 3′ GEM、Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics) 制备的។ Библиотеку snRNA-seq готовили с использованием Chromium Single Cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics) ។ បណ្ណាល័យ snRNA-seq ត្រូវបានរៀបចំដោយប្រើ Chromium Single Cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics) ។បណ្ណាល័យ​ពី​គំរូ​ផ្សេងៗ​ត្រូវ​បាន​ដាក់​បញ្ចូល​គ្នា​តាម​លំដាប់​ដោយ Admera Health លើ NovaSeq S4 (Illumina)។
កម្រិតកន្សោមហ្សែនសម្រាប់របារកូដនុយក្លេអ៊ែរដាក់នីមួយៗត្រូវបានកំណត់បរិមាណដោយប្រើកញ្ចប់កម្មវិធីវិភាគ 10x Genomics CellRanger (កំណែ 6.1.2)។ ជាពិសេស ការអានត្រូវបានផ្គូផ្គងជាមួយនឹងការរួមបញ្ចូលគ្នានៃមនុស្ស (GRCh38, Ensemble, កំណែ 98) និង rat (Rnor_6.0, Ensemble, version 100) genomes យោងដែលបានបង្កើតដោយប្រើពាក្យបញ្ជា mkref និងប្រើការរាប់ជាមួយនឹងពាក្យបញ្ជា –include-introns=TRUE ចំពោះបរិមាណរួមមានការអានដែលបានគូសផែនទីទៅកាន់តំបន់ intron ។ សម្រាប់សំណាក t-hCO ស្នូលរបស់មនុស្សត្រូវបានគេកំណត់អត្តសញ្ញាណដោយផ្អែកលើតម្រូវការអភិរក្សដែលយ៉ាងហោចណាស់ 95% នៃការអានដែលបានធ្វើផែនទីទាំងអស់ត្រូវគ្នានឹងហ្សែនរបស់មនុស្ស។ ការវិភាគជាបន្តបន្ទាប់ទាំងអស់ត្រូវបានអនុវត្តលើលទ្ធផលអារេបាកូដដែលបានត្រងចេញពី CellRanger ដោយប្រើកញ្ចប់ R (កំណែ 4.1.2) Seurat (កំណែ 4.1.1)32 ។
ដើម្បីធានាថាមានតែស្នូលដែលមានគុណភាពខ្ពស់ប៉ុណ្ណោះដែលត្រូវបានបញ្ចូលក្នុងការវិភាគជាបន្តបន្ទាប់ ដំណើរការចម្រោះម្តងហើយម្តងទៀតត្រូវបានអនុវត្តសម្រាប់គំរូនីមួយៗ។ ទីមួយ ស្នូលដែលមានគុណភាពទាបដែលមានហ្សែនពិសេសតិចជាង 1000 ត្រូវបានរកឃើញ ហើយច្រើនជាង 20% នៃ mitochondria សរុបត្រូវបានកំណត់ និងដកចេញ។ ក្រោយមក ម៉ាទ្រីសចំនួនហ្សែនឆៅត្រូវបានធ្វើឱ្យមានលក្ខណៈធម្មតាដោយការតំរែតំរង់លេខទ្វេជាអវិជ្ជមានជាទៀងទាត់ដោយប្រើមុខងារ sctransform(vst.flavor=”v2″) ដែលកំណត់ហ្សែនអថេរច្រើនបំផុតចំនួន 3000 ដោយប្រើប៉ារ៉ាម៉ែត្រលំនាំដើម។ ការកាត់បន្ថយវិមាត្រត្រូវបានអនុវត្តលើហ្សែនអថេរខាងលើដោយប្រើការវិភាគ Principal (ប៉ារ៉ាម៉ែត្រ Compon ទិន្នន័យ) 30 (dims = 30 ត្រូវបានជ្រើសរើសដោយផ្អែកលើការត្រួតពិនិត្យដែលមើលឃើញនៃទីតាំងជង្គង់ និងប្រើសម្រាប់គំរូទាំងអស់ និងការវិភាគក្រុម) បន្ទាប់មកយើងបានអនុវត្តជុំជាច្រើននៃការធ្វើចង្កោមដដែលៗ (ដំណោះស្រាយ = 1) ដើម្បីចាត់ថ្នាក់ហ្សែនដោយផ្អែកលើចំនួនហ្សែនទាបមិនធម្មតា (មធ្យមខាងក្រោម 10 ភាគរយ) កម្រិតហ្សែនចំនួន 5 លើសចំនួនច្រើនមិនប្រក្រតី។ កំណត់អត្តសញ្ញាណ និងលុបកោសិកា putative ដែលមានគុណភាពទាប និង/ឬសមាមាត្រខ្ពស់នៃកូនភ្លោះដែលសង្ស័យដែលត្រូវបានកំណត់ដោយប្រើកញ្ចប់ DoubletFinder33 (មធ្យមពិន្ទុ DoubletFinder ខាងលើភាគរយទី 95) និងសំណាក hCO (n=3) ត្រូវបានរួមបញ្ចូលដោយឡែកពីគ្នាដោយប្រើមុខងារ IntegrateData filters ខាងលើ អនុវត្តដូចដែលបានពិពណ៌នាខាងលើ។
បន្ទាប់​ពី​យក​ខឺណែល​ដែល​មាន​គុណភាព​ទាប​ចេញ សំណុំ​ទិន្នន័យ​រួម​ត្រូវ​បាន​ដាក់​ជា​ក្រុម (ដំណោះស្រាយ = 0.5) ហើយ​បាន​បង្កប់​ក្នុង​គោល​បំណង​មើល​ឃើញ UMAP34 ។ ហ្សែន Marker សម្រាប់ចង្កោមនីមួយៗត្រូវបានកំណត់ដោយប្រើមុខងារ FindMarkers ជាមួយនឹងប៉ារ៉ាម៉ែត្រលំនាំដើមដែលបានគណនាពីទិន្នន័យកន្សោមហ្សែនធម្មតា។ យើងកំណត់អត្តសញ្ញាណ និងចាត់ថ្នាក់កោសិកាសំខាន់ៗដោយរួមបញ្ចូលគ្នានូវសំណុំទិន្នន័យយោង cortical របស់ទារក និងមនុស្សពេញវ័យ ជាមួយនឹងកន្សោមហ្សែនសញ្ញាសម្គាល់ 19,20,21,35 និងចំណារពន្យល់។ ជាពិសេសមុនគេចរាចរត្រូវបានកំណត់អត្តសញ្ញាណដោយការបញ្ចេញមតិរបស់ MKI67 និង TOP2A ។ ចង្កោម Progenitor ត្រូវបានកំណត់ដោយអវត្តមាននៃ mitotic transcripts ការត្រួតស៊ីគ្នាខ្ពស់ជាមួយនឹងចង្កោម progenitor glial ច្រើនដែលត្រូវបានពិពណ៌នានៅក្នុងចុង metaphase fetal Cortex និងការបញ្ចេញមតិ EGFR និង OLIG1 ។ យើងប្រើពាក្យ astrocyte ដើម្បីរួមបញ្ចូលរដ្ឋមួយចំនួននៃភាពខុសគ្នានៃ astrocyte ពី glia រ៉ាឌីកាល់យឺតរហូតដល់ភាពចាស់ទុំនៃ astrocytes ។ ចង្កោម Astrocyte បង្ហាញពីកម្រិតខ្ពស់នៃ SLC1A3 និង AQP4 ហើយត្រូវបានបង្ហាញដើម្បីគូសផែនទីជាមួយប្រភេទរងនៃ glia រ៉ាឌីកាល់របស់ទារក និង/ឬ astrocytes មនុស្សពេញវ័យ។ OPCs បង្ហាញ PDGFRA និង SOX10 ខណៈពេលដែល oligodendrocytes បង្ហាញសញ្ញាសម្គាល់ myelination (MOG និង MYRF) ។ ណឺរ៉ូន Glutamatergic ត្រូវបានកំណត់អត្តសញ្ញាណដោយវត្តមាននៃប្រតិចារិកសរសៃប្រសាទ (SYT1 និង SNAP25) អវត្ដមាននៃសញ្ញាសម្គាល់ GABAergic (GAD2) និងការបង្ហាញនៃ NEUROD6, SLC17A7, BCL11B ឬ SATB2 ។ ណឺរ៉ូន GluN ត្រូវបានបែងចែកបន្ថែមទៀតទៅជា ខាងលើ (កន្សោម SATB2 និងការបាត់បង់ BCL11B) និងជ្រៅ (BCL11B expression) ថ្នាក់រង។ ណឺរ៉ូន Putative subplate (SP) បង្ហាញសញ្ញាសម្គាល់ SP18 ដែលគេស្គាល់ដូចជា ST18 និង SORCS1 បន្ថែមពីលើសញ្ញាសម្គាល់ GluN ជ្រៅ។ កោសិកាដែលស្រដៀងនឹង Choroid plexus ត្រូវបានកំណត់អត្តសញ្ញាណដោយកន្សោម TTR ហើយកោសិកាស្រដៀងនឹង meningeal បង្ហាញហ្សែនដែលទាក់ទងនឹង fibroblast និងកោសិកា pial/vascular ដែលបានគូសផែនទីនៃសំណុំទិន្នន័យយោង។
ការវិភាគឌីផេរ៉ង់ស្យែលនៃការបញ្ចេញហ្សែនរវាងក្រុមរង t-hCO និង hCO ត្រូវបានអនុវត្តដោយប្រើវិធីសាស្ត្រ pseudo-batch ដែលទើបបង្កើតថ្មីដែលផលិតឡើងវិញនៅក្នុងគំរូដែលបានអនុវត្តដោយប្រើកញ្ចប់ Libra R (កំណែ 1.0.0) ។ ជាពិសេស ការធ្វើតេស្តភាពស្រដៀងគ្នានៃកំណត់ហេតុ edgeR (កំណែ 3.36.0, កញ្ចប់ R) ត្រូវបានអនុវត្តសម្រាប់ក្រុមដោយបូកសរុបចំនួនហ្សែននៅក្នុងកោសិកាសម្រាប់ថ្នាក់កោសិកាដែលបានផ្តល់ឱ្យសម្រាប់ការចម្លងគំរូនីមួយៗ។ សម្រាប់ការមើលឃើញផែនទីកំដៅ តម្លៃធម្មតាក្នុងមួយលាន (CPM) ត្រូវបានគណនាដោយប្រើមុខងារ edgeR (cpm()) និងធ្វើមាត្រដ្ឋាន (ដើម្បីសម្រេចបានមធ្យម = 0 គម្លាតស្តង់ដារ = 1)។ ការវិភាគការបង្កើនហ្សែន Ontology (GO) នៃហ្សែន t-hCO GluN ដែលត្រូវបានគ្រប់គ្រងយ៉ាងសំខាន់ត្រូវបានអនុវត្ត (Benjamini-Hochberg បានកែតម្លៃ P តិចជាង 0.05 បង្ហាញក្នុងយ៉ាងហោចណាស់ 10% នៃកោសិកា t-hCO GluN និងការកើនឡើងនៃការផ្លាស់ប្តូរយ៉ាងហោចណាស់ 2 ដង) ។ អនុវត្តដោយប្រើ TopGene Suite (https://toppgene.cchmc.org/) 37. យើងប្រើកម្មវិធី ToppFun ជាមួយនឹងប៉ារ៉ាម៉ែត្រលំនាំដើម ហើយរាយការណ៍ពីតម្លៃ P ដែលបានកែ Benjamini-Hochberg ដែលបានគណនាពីការធ្វើតេស្តធរណីមាត្រដែលកំណត់ដោយ GO ។
ដើម្បីផ្គូផ្គងចង្កោម snRNA-seq របស់យើងជាមួយនឹងចង្កោមកោសិកាដែលបានកំណត់ចំណាំពីការសិក្សាយោងនៃកោសិកា RNA-seq បឋមតែមួយ ឬមនុស្សពេញវ័យ snRNA-seq19,20,21,22 យើងបានអនុវត្តវិធីសាស្រ្តរួមបញ្ចូលសំណុំទិន្នន័យដែលបានផ្គូផ្គង។ យើងបានប្រើលំហូរការងារធម្មតារបស់ SCTransform (v2) នៅក្នុង Seurat ដើម្បីរួមបញ្ចូល និងប្រៀបធៀបការត្រួតគ្នានៃចង្កោមរវាងសំណុំទិន្នន័យ (ដោយប្រើប៉ារ៉ាម៉ែត្រដូចគ្នាដូចខាងលើ)។ សំណុំទិន្នន័យនីមួយៗត្រូវបានដាក់ជាបន្តបន្ទាប់ដោយចៃដន្យរហូតដល់ 500 កោសិកា ឬស្នូលក្នុងមួយចង្កោមដើមសម្រាប់ប្រសិទ្ធភាពនៃការគណនា។ ដោយប្រើវិធីសាស្រ្តស្រដៀងគ្នាដូចដែលបានពិពណ៌នាពីមុន ការត្រួតលើគ្នានៃចង្កោមត្រូវបានកំណត់ថាជាសមាមាត្រនៃកោសិកា ឬស្នូលនៅក្នុងចង្កោមនីមួយៗដែលត្រួតលើគ្នាជាមួយស្លាកនៃចង្កោមយោង។ ដើម្បីចាត់ថ្នាក់ GluNs បន្ថែមទៀត យើងបានប្រើលំហូរការងារ TransferData របស់ Seurat សម្រាប់ទិន្នន័យសំណុំរង GluN ដើម្បីផ្តល់ស្លាកសំណុំទិន្នន័យយោងទៅក្រឡា GluN របស់យើង។
ដើម្បីវាយតម្លៃស្ថានភាពនៃភាពចាស់ទុំនៃប្រតិចារិកសកលនៃសំណាក t-hCO និង hCO យើងបានប្រៀបធៀបសំណាក pseudo-bulk របស់យើងជាមួយនឹង BrainSpan/psychENCODE23 ដែលមានលំដាប់ RNA ដ៏ធំមួយដែលលាតសន្ធឹងលើការអភិវឌ្ឍន៍ខួរក្បាលរបស់មនុស្ស។ យើងបានអនុវត្ត PCA លើម៉ាទ្រីសនៃការបញ្ចេញហ្សែនធម្មតានៃគំរូរួមបញ្ចូលគ្នាពីគំរូ cortical 10 សប្តាហ៍បន្ទាប់ពីការមានគភ៌ និងក្រោយមកនៅក្នុងហ្សែន 5567 (រួមជាមួយនឹងទិន្នន័យរបស់យើង) ដែលពីមុនត្រូវបានគេកំណត់ថាសកម្មនៅក្នុងសំណាកខួរក្បាល BrainSpan cortical (កំណត់ថាធំជាង 50% នៅក្នុងភាពប្រែប្រួលនៃការអភិវឌ្ឍន៍ដែលពន្យល់ដោយអាយុ 38 ឆ្នាំ) ។ លើសពីនេះ យើងទទួលបានហ្សែនដែលជាប់ទាក់ទងនឹងហត្ថលេខាប្រតិចារិកសំខាន់ៗនៃការអភិវឌ្ឍន៍ប្រព័ន្ធប្រសាទ ដោយប្រើកត្តាម៉ាទ្រីសដែលមិនអវិជ្ជមានដូចដែលបានពិពណ៌នាពីមុន។ ទម្ងន់គំរូដែលបានគណនាដោយប្រើដំណើរការកត្តាម៉ាទ្រីសមិនអវិជ្ជមានត្រូវបានគ្រោងនៅក្នុងរូបភព។ 5b ជាមួយនឹងទិន្នន័យដែលបានពង្រីកសម្រាប់ហត្ថលេខានីមួយៗក្នុងចំណោមហត្ថលេខាទាំងប្រាំដែលបានពិពណ៌នាដោយ Zhu et al.38 ។ ជា​ថ្មី​ម្តង​ទៀត សញ្ញា​សម្គាល់​ប្រតិចារិក​អាស្រ័យ​លើ​សកម្មភាព​គឺ​បាន​មក​ពី​ការ​សិក្សា​ដែល​បាន​បោះពុម្ព​ផ្សាយ​កន្លង​មក។ ជាពិសេស ERG និង LRG ត្រូវបានគ្រប់គ្រងយ៉ាងខ្លាំងនៅក្នុងណឺរ៉ូន glutamatergic ដែលត្រូវបានសម្គាល់ដោយការប្រមូលផ្តុំ Cortex snRNA-seq របស់កណ្តុរបន្ទាប់ពីការរំញោចដែលមើលឃើញពីតារាងបន្ថែម 3 Hrvatin et al.16 ។ LRGs ដែលសំបូរទៅដោយមនុស្ស ត្រូវបានគេទទួលបានពីវប្បធម៌ខួរក្បាលគភ៌របស់មនុស្សដែលបានធ្វើឱ្យសកម្ម KCl និងប្រមូលផលក្រោយការភ្ញោចរយៈពេល 6 ម៉ោង ហើយហ្សែនដែលបានច្រោះត្រូវបានគ្រប់គ្រងយ៉ាងសំខាន់ចំពោះមនុស្ស ប៉ុន្តែមិនមែននៅក្នុងសត្វកកេរទេ (តារាងបន្ថែម 4)។ ការវិភាគលើការបង្កើនហ្សែនដោយប្រើសំណុំហ្សែនទាំងនេះត្រូវបានអនុវត្តដោយប្រើការធ្វើតេស្តពិតប្រាកដរបស់ Fisher ផ្លូវតែមួយ។
ចាក់ថ្នាំកណ្តុរជាមួយ isoflurane យកខួរក្បាលចេញ ហើយដាក់នៅកន្លែងត្រជាក់ (ប្រហែល 4°C) សូលុយស្យុង sucrose ដែលមានអុកស៊ីហ្សែន (95% O2 និង 5% CO2) សម្រាប់ផ្នែកដែលមាន៖ 234 mM sucrose, 11 mM glucose, 26 mM NaHCO3, 2.5 mM KCl, .1. NaH2PO4, 10 mM MgSO4 និង 0.5 mM CaCl2 (ប្រហែល 310 mOsm) ។ ផ្នែកខួរក្បាលរបស់កណ្តុរ (300-400 μm) ដែលមាន t-hCO ត្រូវបានផលិតដោយប្រើរំញ័រ Leica VT1200 ដូចដែលបានពិពណ៌នាពីមុន 39 ។ បន្ទាប់មកផ្នែកត្រូវបានផ្ទេរទៅបន្ទប់ផ្នែកដែលមានអុកស៊ីហ្សែនសីតុណ្ហភាពបន្ទប់ជាបន្តបន្ទាប់ដែលមាន aCSF រៀបចំពី: 10 mM គ្លុយកូស, 26 mM NaHCO3, 2.5 mM KCl, 1.25 mM NaHPO4, 1 mM MgSO4, 2 mM CaCl2 និង 126 mM NaCl (298 mOsm) ។ យ៉ាងហោចណាស់ 45 នាទីមុនពេលថត។ ផ្នែកត្រូវបានកត់ត្រានៅក្នុងអង្គជំនុំជម្រះជ្រមុជទឹកដែលពួកគេត្រូវបានបន្តដោយ aCSF (95% O2 និង 5% CO2 vial) ។ ទិន្នន័យទាំងអស់ត្រូវបានកត់ត្រានៅសីតុណ្ហភាពបន្ទប់។ ណឺរ៉ូន t-hCO ត្រូវបានបញ្ចប់ដោយបំពង់កែវ borosilicate ពោរពេញទៅដោយដំណោះស្រាយដែលមានប៉ូតាស្យូម gluconate 127 mM, 8 mM NaCl, 4 mM ម៉ាញេស្យូម ATP, 0.3 mM sodium GTP, 10 mM HEPES, និង 0.6 mM EGTA, pH 7.2, ដំណោះស្រាយខាងក្នុង 20 mKO (29 mK) ។ ដើម្បីស្តារឡើងវិញ សារធាតុ biocytin (0.2%) ត្រូវបានបន្ថែមទៅក្នុងដំណោះស្រាយថត។
ទិន្នន័យត្រូវបានទទួលដោយប្រើឧបករណ៍បំពងសំឡេង MultiClamp 700B (ឧបករណ៍ម៉ូលេគុល) និង Digidata 1550B digitizer (ឧបករណ៍ម៉ូលេគុល) low-pass filtered at 2 kHz, digitized at 20 kHz និងវិភាគដោយប្រើ Clampfit (Molecular Devices) Origin (OriginPro)។ 2021b, OriginLab) ។ និងមុខងារ MATLAB ផ្ទាល់ខ្លួន (Mathworks)។ សក្តានុពលប្រសព្វត្រូវបានគណនាដោយប្រើ JPCalc ហើយធាតុត្រូវបានកែតម្រូវទៅតម្លៃដែលបានគណនានៃ -14 mV ។ ប្រតិបត្តិការ IV មានស៊េរីនៃជំហានបច្ចុប្បន្នក្នុងជំហាន 10-25 pA ពី -250 ទៅ 750 pA ។
សារធាតុ thalamus, សារធាតុពណ៌ស និង S1 afferents ត្រូវបានជំរុញដោយអគ្គិសនីនៅក្នុងបន្ទះ thalamocortical កំឡុងពេលថតបំណះបំណះនៃសរសៃប្រសាទ hCO ដូចដែលបានពិពណ៌នាពីមុន។ ដោយសង្ខេប ខួរក្បាលត្រូវបានដាក់នៅលើតុបោះពុម្ព 3D ផ្អៀងនៅមុំ 10° ហើយផ្នែកខាងមុខនៃខួរក្បាលត្រូវបានកាត់នៅមុំ 35°។ បន្ទាប់មក ខួរក្បាល​ត្រូវបាន​ស្អិត​ជាប់​នឹង​ផ្ទៃ​ដែល​កាត់ និង​កាត់​ជា​ផ្នែក​ដោយ​រក្សា​អ័ក្ស​ដែល​លេចចេញ​ដោយ thalamocortical ។ អេឡិចត្រូត bipolar tungsten (0.5 MΩ) ត្រូវបានដំឡើងនៅលើ micromanipulator ទីពីរ និងដាក់ជាយុទ្ធសាស្រ្តដើម្បីជំរុញតំបន់ចំនួនបួនក្នុងមួយកោសិកា (កន្សោមខាងក្នុង សារធាតុពណ៌ស S1 និង hCO) ។ កត់ត្រាការឆ្លើយតប synaptic បន្ទាប់ពី 300 μA phasic stimulation នៅ 0.03-0.1 Hz ។
ណឺរ៉ូន hChR2-expressing hCO ត្រូវបានធ្វើឱ្យសកម្មនៅ 480 nm ហើយពន្លឺដែលបង្កើតដោយ LED (Prizmatix) ត្រូវបានអនុវត្តតាមរយៈវត្ថុបំណង ×40 (0.9 NA; Olympus) ដើម្បីកត់ត្រាកន្សោម hChR2 នៅជិតកោសិកា។ អង្កត់ផ្ចិតនៃវាលបំភ្លឺគឺប្រហែល 0.5 មីលីម៉ែត្រហើយថាមពលសរុបគឺ 10-20 mW ។ ទទឹងជីពចរត្រូវបានកំណត់ទៅ 10 ms ដែលត្រូវនឹងជីពចរដែលបានផ្តល់ឱ្យក្នុងអំឡុងពេលពិសោធន៍សិក្សាអាកប្បកិរិយា។ ប្រេកង់រំញោចផ្សេងៗត្រូវបានគេប្រើចាប់ពី 1 ដល់ 20 Hz ប៉ុន្តែមានតែជីពចរដំបូងនៃស៊េរីប៉ុណ្ណោះដែលត្រូវបានប្រើសម្រាប់បរិមាណ។ ចន្លោះពេលរវាងរថភ្លើងជាធម្មតាមានរយៈពេលយូរជាង 30 s ដើម្បីកាត់បន្ថយឥទ្ធិពលលើ synaptic inhibitory ឬការសម្របសម្រួលផ្លូវ។ ដើម្បីសាកល្បងថាតើការឆ្លើយតប hChR2 គឺ monosynaptic ទេ យើងបានអនុវត្ត TTX (1 μM) ទៅក្នុងអាងងូតទឹករហូតដល់ប្រតិកម្ម EPSC បាត់ ហើយបន្ទាប់មកអនុវត្ត 4-aminopyridine (4-AP; 100 μM) ។ ជាធម្មតា ការឆ្លើយតបនឹងត្រលប់មកវិញក្នុងរយៈពេលពីរបីនាទី ដោយមានការពន្យារពេលយូរបន្តិចរវាងការបាញ់ LED និងការបង្កើត EPSC ។ NBQX (10 μM) ត្រូវបានប្រើដើម្បីសាកល្បងថាតើការឆ្លើយតបត្រូវបានជំរុញដោយអ្នកទទួល AMPA ។
ផ្នែក hCO Sharp ត្រូវបានបង្កើតឡើងដូចដែលបានពិពណ៌នាពីមុន។ ដោយសង្ខេប ផ្នែក hCO ត្រូវបានបង្កប់ក្នុង 4% agarose និងផ្ទេរទៅកោសិកាដែលមាន 126 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM NaH2PO4, 1 mM MgSO4, 2 mM CaCl2, 26 mM NaHCO3 និង 10 mM d-ose(0+s) - 3 mMg ចូលទៅក្នុងផ្នែក 20µg ។ នៅសីតុណ្ហភាពបន្ទប់ដោយប្រើរំញ័រ Leica VT1200 ហើយរក្សាទុកក្នុង ASF នៅសីតុណ្ហភាពបន្ទប់។ បន្ទាប់មក ការថតបំណះជំរុំនៃកោសិកាទាំងមូលត្រូវបានអនុវត្តនៅលើផ្នែក hCO ក្រោមមីក្រូទស្សន៍ SliceScope ផ្ទាល់ (វិទ្យាសាស្រ្ត)។ ផ្នែកត្រូវបានបំភាន់ជាមួយ aCSF (95% O2 និង 5% CO2) ហើយសញ្ញាកោសិកាត្រូវបានកត់ត្រានៅសីតុណ្ហភាពបន្ទប់។ ណឺរ៉ូន hCO ត្រូវបានអនុវត្តដោយប្រើបំពង់កែវ borosilicate ដែលពោរពេញទៅដោយដំណោះស្រាយដែលមាន 127 mM ប៉ូតាស្យូម gluconate, 8 mM NaCl, 4 mM ម៉ាញេស្យូម ATP, 0.3 mM sodium GTP, 10 mM HEPES និង 0.6 mM EGTA, pH ខាងក្នុង 7, 2, កែតម្រូវដោយ KOH (osmolarity) ។ សម្រាប់គោលបំណងស្តារឡើងវិញ បន្ថែម 0.2% Biocytin ទៅក្នុងដំណោះស្រាយផ្ទៃក្នុង។
ទិន្នន័យត្រូវបានទទួលដោយ Clampex (Clampex 11.1, Molecular Devices) ដោយប្រើ MultiClamp 700B amplifier (Molecular Devices) និង Digidata 1550B digitizer (Molecular Devices) low-pass filtered at 2 kHz, digitized at 20 kHz, and fited analysis using 1.Clample devices, and analytical version of 1. មុខងារ MATLAB ផ្ទាល់ខ្លួន (MATLAB 2019b, Mathworks)។ សក្តានុពលប្រសព្វត្រូវបានគណនាដោយប្រើ JPCalc ហើយធាតុត្រូវបានកែតម្រូវទៅនឹងសក្តានុពលប្រសព្វដែលបានគណនានៃ -14 mV ។ ប្រតិបត្តិការ IV មានស៊េរីនៃជំហានបច្ចុប្បន្ននៅក្នុងជំហាន 5-10 pA ពី -50 ទៅ 250 pA ។
សម្រាប់ការបង្កើតឡើងវិញនូវរូបវិទ្យានៃសរសៃប្រសាទដែលខ្ទាស់ 0.2% biocytin (Sigma-Aldrich) ត្រូវបានបន្ថែមទៅក្នុងដំណោះស្រាយផ្ទៃក្នុង។ កោសិកាត្រូវបានបឋមយ៉ាងហោចណាស់ 15 នាទីបន្ទាប់ពីការលួចចូល។ បន្ទាប់មកបំពង់ត្រូវបានទាញយឺតៗក្នុងរយៈពេល 1-2 នាទីរហូតដល់ភ្នាសដែលបានចុះបញ្ជីត្រូវបានផ្សាភ្ជាប់ទាំងស្រុង។ បន្ទាប់ពីនីតិវិធីផ្នែកសរីរវិទ្យា ផ្នែកត្រូវបានជួសជុលពេញមួយយប់នៅសីតុណ្ហភាព 4 ° C. ក្នុង 4% PFA លាងជាមួយ PBS X3 និងពនឺ 1:1000 ជាមួយ streptavidin-conjugated DyLight 549 ឬ DyLight 405 (Vector Labs) ។ កោសិកាដែលពោរពេញទៅដោយសារធាតុ biocytin (2%; Sigma-Aldrich) ត្រូវបានដាក់ស្លាកកំឡុងពេលថតបិទភ្ជាប់នៅសីតុណ្ហភាពបន្ទប់រយៈពេល 2 ម៉ោង។ បន្ទាប់មកផ្នែកទាំងនោះត្រូវបានតំឡើងនៅលើស្លាយមីក្រូទស្សន៍ដោយប្រើ Aquamount (Thermo Scientific) ហើយបានមើលឃើញនៅថ្ងៃបន្ទាប់នៅលើមីក្រូទស្សន៍បង្រួបបង្រួម Leica TCS SP8 ដោយប្រើគោលបំណងពន្លិចប្រេងជាមួយនឹងជំរៅលេខ×40 1.3 ការពង្រីក ×0.9–1.0, xy ។ អត្រាគំរូគឺប្រហែល 7 ភីកសែលក្នុងមួយមីក្រូ។ ជង់ Z នៅចន្លោះពេល 1 µm ត្រូវបានគេទទួលបានជាស៊េរី ហើយ z-stack mosaics និងការដេរដោយស្វ័យប្រវត្តិដែលមានមូលដ្ឋានលើ Leica ត្រូវបានអនុវត្តដើម្បីគ្របដណ្តប់មែកធាង dendritic ទាំងមូលនៃណឺរ៉ូននីមួយៗ។ បន្ទាប់មកណឺរ៉ូនត្រូវបានតាមដានពាក់កណ្តាលដោយដៃដោយប្រើចំណុចប្រទាក់ neuTube 40 ហើយឯកសារ SWC ត្រូវបានបង្កើត។ បន្ទាប់មកឯកសារត្រូវបានផ្ទុកឡើងទៅកម្មវិធីជំនួយ SimpleNeuriteTracer41 Fiji (ImageJ, កំណែ 2.1.0; NIH)។
ជាលិកា cortical របស់មនុស្សត្រូវបានទទួលដោយមានការយល់ព្រមជាដំណឹងយោងទៅតាមពិធីការដែលត្រូវបានអនុម័តដោយក្រុមប្រឹក្សាត្រួតពិនិត្យស្ថាប័ននៃសាកលវិទ្យាល័យស្ទែនហ្វដ។ សំណាកពីរនៃជាលិកាក្រោយសម្រាលរបស់មនុស្ស (អាយុ 3 ឆ្នាំ និង 18 ឆ្នាំ) ត្រូវបានទទួលដោយការវះកាត់នៃ Cortex ផ្នែកខាងមុខ (កណ្តាលផ្នែកខាងមុខ) ដែលជាផ្នែកមួយនៃការវះកាត់សម្រាប់ជំងឺឆ្កួតជ្រូក។ ក្រោយពេលវះកាត់ ប្រមូលផលជាលិកាក្នុងទឹកកក NMDG-aCSF ដែលមាន៖ 92 mM NMDG, 2.5 mM KCl, 1.25 mM NaH2PO4, 30 mM NaHCO3, 20 mM HEPES, 25 mM glucose, 2 mM thiourea, 5 mM sodium pyruate, 5 mM sodium ascorb ។ CaCl2 4H2O និង 10 mM MgSO4 7H2O ។ Titrate ទៅ pH 7.3-7.4 ជាមួយនឹងអាស៊ីត hydrochloric ប្រមូលផ្តុំ។ ជាលិកាត្រូវបានបញ្ជូនទៅមន្ទីរពិសោធន៍ក្នុងរយៈពេល 30 នាទីហើយផ្នែក coronal ត្រូវបានគេយកទៅតាមនីតិវិធីដែលបានពិពណ៌នាខាងលើ។
នីតិវិធីសត្វទាំងអស់ត្រូវបានអនុវត្តដោយអនុលោមតាមគោលការណ៍ណែនាំថែទាំសត្វដែលត្រូវបានអនុម័តដោយសាកលវិទ្យាល័យស្ទែនហ្វដ APLAC ។ សត្វកណ្ដុរ (ច្រើនជាង 140 ថ្ងៃក្រោយការប្តូរសរីរាង្គ) ត្រូវបានបង្កឡើងដោយការប្រើថ្នាំសន្លប់ 5% អ៊ីសូហ្វលូរ៉ាន និងចាក់ថ្នាំស្ពឹកជាមួយនឹង 1-3% អ៊ីសូហ្វលូរ៉ាន បញ្ចូលក្នុងការវះកាត់។ សត្វត្រូវបានដាក់ក្នុងស៊ុមស្តេរ៉េអូតាស៊ីក (Kopf) ហើយ buprenorphine (SR) ត្រូវបានចាក់បញ្ចូលក្រោមស្បែក។ លលាដ៍ក្បាលត្រូវបានលាតត្រដាង សម្អាត ហើយវីសឆ្អឹង 3-5 ត្រូវបានបញ្ចូល។ ដើម្បីកំណត់គោលដៅ t-hCO យើងបានបង្កើតកូអរដោនេ stereotaxic ពីរូបភាព MRI ។ រន្ធ burr មួយត្រូវបានខួងនៅកន្លែងចាប់អារម្មណ៍ ហើយសរសៃ (អង្កត់ផ្ចិត 400 µm, NA 0.48, Doric) ត្រូវបានបន្ទាប 100 µm ខាងក្រោមផ្ទៃ hCO និងធានាដល់លលាដ៍ក្បាលដោយស៊ីម៉ងត៍ធ្មេញដែលអាចព្យាបាលកាំរស្មីយូវី (Relyx) ។
ការថតរូបភាពតាមសរសៃត្រូវបានអនុវត្តដូចដែលបានពិពណ៌នាពីមុន 42. ដើម្បីកត់ត្រាសកម្មភាពដោយឯកឯង សត្វកណ្ដុរត្រូវបានគេដាក់ក្នុងទ្រុងស្អាត ហើយខ្សែកាបអុបទិកដែលមានអង្កត់ផ្ចិត 400 µm (Doric) ដែលភ្ជាប់ទៅនឹងប្រព័ន្ធទទួលទិន្នន័យ ហ្វាយបឺអុបទិក ហ្វូតូម៉ែត្រត្រូវបានភ្ជាប់ទៅខ្សែកាបអុបទិកដែលបានដាក់បញ្ចូល។ ក្នុងអំឡុងពេលថតសកម្មភាពម៉ូតូរយៈពេល 10 នាទី សត្វមានសេរីភាពក្នុងការរុករកទ្រុង។ ដើម្បីកត់ត្រាសកម្មភាពដែលកើតឡើង សត្វកណ្ដុរ (ច្រើនជាង 140 ថ្ងៃបន្ទាប់ពីការប្តូរសរីរាង្គ) ត្រូវបានចាក់ថ្នាំស្ពឹកជាមួយនឹង 5% isoflurane សម្រាប់ induction និង 1-3% isoflurane សម្រាប់ការថែទាំ។ ដាក់សត្វនៅក្នុងស៊ុម stereotactic (Kopf) ហើយវីស្គីនៅផ្នែកម្ខាងនៃ t-hCO ត្រូវបានកាត់ចេញប្រហែល 2 សង់ទីម៉ែត្រ និងឆ្លងកាត់សំណាញ់ដែលភ្ជាប់ទៅនឹង piezoelectric actuator (PI) ។ ខ្សែបំណះអុបទិក 400 µm (Doric) ត្រូវបានភ្ជាប់ទៅខ្សែកាបអុបទិកដែលបានផ្សាំ និងភ្ជាប់ទៅប្រព័ន្ធទទួលទិន្នន័យ។ វីស្គីនៅផ្នែកម្ខាងនៃ t-hCO ត្រូវបានផ្លាត 50 ដង (2 mm នៅ 20 Hz, 2 s ក្នុងមួយបទបង្ហាញ) នៅពេលចៃដន្យដោយ piezoelectric drive ក្នុងរយៈពេល 20 នាទី។ ប្រើកញ្ចប់ជំនួយ Arduino MATLAB ដើម្បីគ្រប់គ្រងពេលវេលាផ្លាតជាមួយនឹងលេខកូដ MATLAB ផ្ទាល់ខ្លួន។ ព្រឹត្តិការណ៍ត្រូវបានធ្វើសមកាលកម្មទៅនឹងកម្មវិធីទទួលទិន្នន័យដោយប្រើជីពចរត្រង់ស៊ីស្ទ័រ-ត្រង់ស៊ីស្ទ័រ (TTL) ។
សត្វកណ្ដុរ (ច្រើនជាង 140 ថ្ងៃក្រោយការប្តូរសរីរាង្គ) ត្រូវបានបង្កឡើងដោយការប្រើថ្នាំសន្លប់ 5% អ៊ីសូហ្វលូរ៉ាន និងចាក់ថ្នាំស្ពឹកជាមួយនឹង 1-3% អ៊ីសូហ្វលូរ៉ាន បញ្ចូលក្នុងការវះកាត់។ សត្វត្រូវបានគេដាក់នៅក្នុងស៊ុមស្តេរ៉េអូតាស៊ីក (Kopf) ហើយ buprenorphine SR និង dexamethasone ត្រូវបានចាក់បញ្ចូលក្រោមស្បែក។ លលាដ៍ក្បាលត្រូវបានលាតត្រដាង សម្អាត ហើយវីសឆ្អឹង 3-5 ត្រូវបានបញ្ចូល។ ដើម្បីកំណត់គោលដៅ t-hCO យើងបានបង្កើតកូអរដោនេ stereotaxic ពីរូបភាព MRI ។ ការធ្វើកោសល្យវិច័យរាងជារង្វង់ (មានអង្កត់ផ្ចិតប្រហែល 1 សង់ទីម៉ែត្រ) ត្រូវបានអនុវត្តជាមួយនឹងការហ្វឹកហាត់ល្បឿនលឿនដោយផ្ទាល់ពីលើ hCO ដែលបានប្តូរ។ នៅពេលដែលឆ្អឹងគឺស្តើងតាមដែលអាចធ្វើទៅបាន ប៉ុន្តែមុនពេលខួងតាមឆ្អឹងទាំងមូល ប្រើ forceps ដើម្បីយកឌីសឆ្អឹងអាងត្រគាកដែលនៅសេសសល់ចេញ ដើម្បីបង្ហាញ t-hCO មូលដ្ឋាន។ Craniotomy ត្រូវបានបំពេញដោយអំបិលមាប់មគ ហើយគម្រប និងម្ជុលក្បាលពិសេសមួយត្រូវបានភ្ជាប់ទៅនឹងលលាដ៍ក្បាលជាមួយនឹងស៊ីម៉ងត៍ធ្មេញដែលព្យាបាលដោយកាំរស្មីយូវី (Relyx)។
ការថតរូបពីរសន្លឹកត្រូវបានអនុវត្តដោយប្រើមីក្រូទស្សន៍ Bruker multiphoton ជាមួយនឹងគោលបំណង Nikon LWD (×16, 0.8 NA) ។ ការថតរូបភាព GCaMP6 ត្រូវបានអនុវត្តនៅ 920 nm ជាមួយនឹងការពង្រីក 1.4x single z-plane និង 8x ជាមធ្យម 7.5 fps ។ សត្វកណ្ដុរត្រូវបានបង្កឡើងដោយការប្រើថ្នាំសន្លប់ isoflurane 5% និងរក្សាដោយ 1-3% isoflurane ។ សត្វកណ្ដុរ​ត្រូវ​បាន​ដាក់​នៅ​ក្នុង​ក្បាល​ដែល​បាន​បង្កើត​ឡើង​ដោយ​ខ្លួន​ឯង ហើយ​ដាក់​នៅ​ក្រោម​កញ្ចក់។ ការថតផ្ទៃខាងក្រោយរយៈពេល 3 នាទីនៃសកម្មភាពម៉ូទ័រត្រូវបានទទួល។ ក្នុងរយៈពេល 20 នាទីនៃការថតនោះ 50 puffs (បទបង្ហាញនីមួយៗមានប្រវែង 100 ms) ត្រូវបានបញ្ជូនដោយចៃដន្យទៅកាន់ whisker pad ទល់មុខ t-hCO ដោយប្រើ picospricer ។ ប្រើកញ្ចប់ជំនួយ Arduino MATLAB ដើម្បីគ្រប់គ្រងពេលវេលាផ្ទុះជាមួយនឹងលេខកូដ MATLAB ផ្ទាល់ខ្លួន។ ធ្វើសមកាលកម្មព្រឹត្តិការណ៍ជាមួយកម្មវិធីទិញទិន្នន័យ (PrairieView 5.5) ដោយប្រើ TTL pulses ។ សម្រាប់ការវិភាគ រូបភាពត្រូវបានកែសម្រាប់ចលនា xy ដោយប្រើការកែតម្រូវ affine នៅក្នុងកម្មវិធី MoCo ដែលបានចាប់ផ្តើមនៅក្នុងប្រទេសហ្វីជី។ ការស្រង់ចេញនូវដាន fluorescent ពីកោសិកានីមួយៗដោយប្រើ CNMF-E43 ។ Fluorescence ត្រូវ​បាន​ស្រង់​ចេញ​សម្រាប់​តំបន់​នីមួយៗ​នៃ​ការ​ចាប់​អារម្មណ៍ បំប្លែង​ទៅ​ជា​ខ្សែកោង dF/F ហើយ​បន្ទាប់​មក​បំប្លែង​ទៅ​ជា z-scores។
សត្វកណ្ដុរ (ច្រើនជាង 140 ថ្ងៃក្រោយការប្តូរសរីរាង្គ) ត្រូវបានបង្កឡើងដោយការប្រើថ្នាំសន្លប់ 5% អ៊ីសូហ្វលូរ៉ាន និងចាក់ថ្នាំស្ពឹកជាមួយនឹង 1-3% អ៊ីសូហ្វលូរ៉ាន បញ្ចូលក្នុងការវះកាត់។ សត្វត្រូវបានគេដាក់នៅក្នុងស៊ុមស្តេរ៉េអូតាស៊ីក (Kopf) ហើយ buprenorphine SR និង dexamethasone ត្រូវបានចាក់បញ្ចូលក្រោមស្បែក។ វីស្គីនៅផ្នែកម្ខាងនៃ t-hCO ត្រូវបានកាត់ប្រហែល 2 សង់ទីម៉ែត្រហើយត្រូវបានខ្សែស្រឡាយតាមរយៈសំណាញ់ដែលភ្ជាប់ទៅនឹងឧបករណ៍ piezoelectric actuator ។ លលាដ៍ក្បាលត្រូវបានលាតត្រដាង និងសម្អាត។ វីសដីដែកអ៊ីណុកត្រូវបានភ្ជាប់ទៅលលាដ៍ក្បាល។ ដើម្បីកំណត់គោលដៅ t-hCO យើងបានបង្កើតកូអរដោនេ stereotaxic ពីរូបភាព MRI ។ ធ្វើការវះកាត់ក្រវាញរាងជារង្វង់ (មានអង្កត់ផ្ចិតប្រហែល 1 សង់ទីម៉ែត្រ) ជាមួយនឹងការហ្វឹកហាត់ល្បឿនលឿននៅពីលើ t-hCO ។ នៅពេលដែលឆ្អឹងគឺស្តើងតាមដែលអាចធ្វើទៅបាន ប៉ុន្តែមុនពេលខួងតាមឆ្អឹងទាំងមូល ប្រើ forceps ដើម្បីយកឌីសឆ្អឹងអាងត្រគាកដែលនៅសេសសល់ចេញ ដើម្បីបង្ហាញ t-hCO មូលដ្ឋាន។ កោសិកានីមួយៗត្រូវបានកត់ត្រាដោយប្រើ 32-channel ឬ 64-channel high-density silicon probes (Cambridge Neurotech) ដែលភ្ជាប់មកជាមួយវីសដី និងត្រូវបានពង្រីកជាមុនជាមួយនឹង RHD amplifiers (Intan)។ ប្រើឧបាយកលដើម្បីបន្ទាបអេឡិចត្រូតទៅកាន់ទីតាំងគោលដៅ តាមរយៈការវះកាត់ខួរឆ្អឹងខ្នង ដែលត្រូវបានបំពេញដោយអំបិលមាប់មគ។ ការប្រមូលទិន្នន័យត្រូវបានអនុវត្តនៅប្រេកង់ 30 kHz ដោយប្រើប្រព័ន្ធទទួលទិន្នន័យ Open Ephys ។ ការថតបានបន្តតែនៅពេលដែលយើងបានរកឃើញសកម្មភាពដោយឯកឯងនៃចង្វាក់ដែលទាក់ទងគ្នាយ៉ាងខ្លាំងនៅក្នុងជាង 10 ប៉ុស្តិ៍ ដែលបង្ហាញថាអេឡិចត្រូតមានទីតាំងនៅក្នុងប្រហោងឆ្អឹង (ផ្អែកលើទិន្នន័យរូបភាពកាល់ស្យូមពីររូបថត)។ ការថតផ្ទៃខាងក្រោយរយៈពេល 10 នាទីនៃសកម្មភាពម៉ូទ័រត្រូវបានទទួល។ វីស្គីនៅផ្នែកម្ខាងនៃ t-hCO ត្រូវបានផ្លាត 50 ដង (2 mm នៅ 20 Hz, 2 s ក្នុងមួយបទបង្ហាញ) នៅពេលចៃដន្យដោយ piezoelectric drive ក្នុងរយៈពេល 20 នាទី។ ដោយប្រើកញ្ចប់ជំនួយ MATLAB សម្រាប់ Arduino (MATLAB 2019b) គ្រប់គ្រងពេលវេលាផ្លាតជាមួយនឹងលេខកូដ MATLAB ផ្ទាល់ខ្លួន។ ប្រើ TTL pulses ដើម្បីធ្វើសមកាលកម្មព្រឹត្តិការណ៍ជាមួយកម្មវិធីទិញទិន្នន័យ។
សម្រាប់ការពិសោធន៍សម្គាល់អុបទិក ខ្សែបំណះអុបទិក 200 µm (Doric) ភ្ជាប់ទៅនឹងឡាស៊ែរ 473 nm (Omicron) ត្រូវបានភ្ជាប់ទៅនឹងសរសៃអុបទិក 200 µm ដែលដាក់នៅពីលើផ្នែកវះកាត់ឆ្អឹង។ ភ្លាមៗមុនពេលនេះ លៃតម្រូវថាមពល jumper ទៅ 20 mW ។ ប្រើឧបាយកលដើម្បីបន្ទាបអេឡិចត្រូតទៅកាន់ទីតាំងគោលដៅ តាមរយៈការវះកាត់ខួរក្បាល ដែលត្រូវបានបំពេញដោយអំបិលមាប់មគ។ នៅដើមដំបូងនៃការថត ពន្លឺចំនួន 473 nm (ប្រេកង់ 2 ​​Hz, រយៈពេលជីពចរ 10 ms) ត្រូវបានបញ្ចេញ។ កោសិកា Photosensitive ត្រូវបានកំណត់ថាជាកោសិកាដែលបង្ហាញពីការឆ្លើយតបកើនឡើងក្នុងរយៈពេល 10 ms នៃពន្លឺក្នុង 70% ឬច្រើនជាងនេះនៃការសាកល្បង។