გმადლობთ, რომ ეწვიეთ Nature.com-ს. თქვენ იყენებთ ბრაუზერის ვერსიას შეზღუდული CSS მხარდაჭერით. საუკეთესო გამოცდილებისთვის გირჩევთ გამოიყენოთ განახლებული ბრაუზერი (ან გამორთოთ თავსებადობის რეჟიმი Internet Explorer-ში). გარდა ამისა, მუდმივი მხარდაჭერის უზრუნველსაყოფად, ჩვენ ვაჩვენებთ საიტს სტილებისა და JavaScript-ის გარეშე.
ერთდროულად სამი სლაიდის კარუსელის ჩვენება. ერთდროულად სამ სლაიდს შორის გადასაადგილებლად გამოიყენეთ „წინა“ და „შემდეგი“ ღილაკები, ან ერთდროულად სამ სლაიდს შორის გადასაადგილებლად გამოიყენეთ ბოლოში არსებული სლაიდერის ღილაკები.
თვითაწყობადი ნერვული ორგანელები წარმოადგენენ პერსპექტიულ in vitro პლატფორმას ადამიანის განვითარებისა და დაავადებების მოდელირებისთვის. თუმცა, ორგანოიდებს არ გააჩნიათ ის კავშირი, რაც არსებობს in vivo, რაც ზღუდავს მომწიფებას და ხელს უშლის ქცევის მაკონტროლებელ სხვა წრედებთან ინტეგრაციას. აქ ჩვენ ვაჩვენებთ, რომ ახალშობილი შიშველი ვირთხების სომატოსენსორულ ქერქში გადანერგილი ადამიანის ღეროვანი უჯრედებიდან მიღებული კორტიკალური ორგანოიდები ავითარებენ მწიფე უჯრედების ტიპებს, რომლებიც ინტეგრირდებიან სენსორულ და მოტივაციასთან დაკავშირებულ წრედებში. მაგნიტურ-რეზონანსულმა ტომოგრაფიამ გამოავლინა ტრანსპლანტაციის შემდგომი ორგანოიდების ზრდა რამდენიმე ღეროვანი უჯრედების ხაზსა და ცხოველში, ხოლო ერთბირთვიანმა ანალიზმა გამოავლინა კორტიკოგენეზის პროგრესირება და აქტივობაზე დამოკიდებული ტრანსკრიფციის პროგრამის გაჩენა. მართლაც, გადანერგილი კორტიკალური ნეირონები ავლენენ უფრო რთულ მორფოლოგიურ, სინაფსურ და შიდა მემბრანულ თვისებებს, ვიდრე მათი in vitro ანალოგები, რაც საშუალებას იძლევა ნეირონული დეფექტების აღმოჩენის ტიმოთოს სინდრომის მქონე პაციენტებში. ანატომიურმა და ფუნქციურმა კვალიფიკაციამ აჩვენა, რომ გადანერგილი ორგანელები იღებენ თალამოკორტიკალურ და კორტიკოკორტიკალურ შეყვანებს და ნერვული აქტივობის in vivo ჩანაწერები მიუთითებს, რომ ამ შეყვანებს შეუძლიათ სენსორული რეაქციების გენერირება ადამიანის უჯრედებში. და ბოლოს, კორტიკალური ორგანოიდები ავრცელებენ აქსონებს ვირთხის ტვინში და მათი ოპტოგენეტიკური აქტივაცია იწვევს ჯილდოს ძიების ქცევას. ამგვარად, გადანერგილი ადამიანის ქერქის ნეირონები მწიფდებიან და მონაწილეობენ მასპინძლის ქცევის მაკონტროლებელ წრედებში. ჩვენ ველით, რომ ეს მიდგომა ხელს შეუწყობს პაციენტისგან მიღებულ უჯრედებში ჯაჭვის დონის ფენოტიპების აღმოჩენას, რომელთა აღმოჩენა სხვა საშუალებებით შეუძლებელია.
ადამიანის ტვინის განვითარებადი პროცესი თვითორგანიზების შესანიშნავი პროცესია, რომლის დროსაც უჯრედები მრავლდებიან, დიფერენცირდებიან, მიგრირებენ და უკავშირდებიან ფუნქციურ ნეირონულ წრედებს, რომლებიც შემდგომში იხვეწება სენსორული გამოცდილების მეშვეობით. ადამიანის ტვინის განვითარების გაგების ერთ-ერთი მთავარი პრობლემა, განსაკუთრებით დაავადების კონტექსტში, ტვინის ქსოვილზე წვდომის არარსებობაა. თვითორგანიზებადი ორგანელები, მათ შორის ადამიანის ქერქის ორგანოიდები (hCO; ასევე ცნობილი როგორც ადამიანის ქერქის სფერო), შეუძლიათ 2,3,4,5,6-ის გენერირება. თუმცა, რამდენიმე შეზღუდვა ზღუდავს მათ უფრო ფართო გამოყენებას ნერვული წრედების განვითარებისა და ფუნქციონირების გასაგებად. კერძოდ, გაურკვეველია, შეზღუდულია თუ არა hCO-ს მომწიფება გარკვეული მიკროგარემოსა და სენსორული შეყვანის არარსებობით in vivo. გარდა ამისა, იმის გამო, რომ hCO-ები არ არიან ინტეგრირებულნი წრედებში, რომლებსაც შეუძლიათ ქცევითი შედეგების გენერირება, მათი სარგებლიანობა გენეტიკურად რთული და ქცევითი ნეიროფსიქიატრიული დარღვევების მოდელირებაში ამჟამად შეზღუდულია.
hCO-ს ინტაქტურ ცოცხალ ტვინში გადანერგვას შეუძლია ამ შეზღუდვების გადალახვა. წინა კვლევებმა აჩვენა, რომ მღრღნელების ქერქში გადანერგილი ადამიანის ნეირონები ახერხებენ გადარჩენას, პროეცირებას და მღრღნელების უჯრედებთან კომუნიკაციას7,8,9,10,11,12. თუმცა, ეს ექსპერიმენტები, როგორც წესი, ზრდასრულ ცხოველებზე ტარდება, რამაც შეიძლება შეზღუდოს სინაფსური და აქსონური ინტეგრაცია. აქ ჩვენ აღვწერთ ტრანსპლანტაციის პარადიგმას, რომლის დროსაც ჩვენ გადავნერგეთ hiPS უჯრედებიდან მიღებული 3D hCO იმუნოდეფიციტური ვირთხების პირველად სომატოსენსორულ ქერქში (S1) პლასტიკური განვითარების ადრეულ ეტაპზე. გადანერგილი hCO (t-hCO) ნეირონები განიცდიან მნიშვნელოვან მომწიფებას, იღებენ თალამოკორტიკალურ და კორტიკალურ-კორტიკალურ შეყვანებს, რომლებიც იწვევენ სენსორულ რეაქციებს და ავრცელებენ აქსონალურ პროექციებს ვირთხის ტვინში ჯილდოს ძიების ქცევის გასაძლიერებლად. t-hCO-ს გახანგრძლივებულმა მომწიფებამ გამოავლინა ნეირონული დეფექტები ტიმოთოს სინდრომის (TS) მქონე პაციენტებში, მძიმე გენეტიკური დაავადება, რომელიც გამოწვეულია ძაბვისადმი მგრძნობიარე L-ტიპის CaV1.2 კალციუმის არხში (კოდირებულია CACNA1C-ით) მუტაციებით.
ადამიანის კორტიკალური ნეირონების in vivo შესწავლის მიზნით, ჩვენ სტერეოტაქტიკურად გადავნერგეთ ინტაქტური 3D hCO3 ადრეული პოსტნატალური ათიმიური ვირთხების S1-ში (მშობიარობის შემდგომი 3-7 დღეები) (სურ. 1ა და სურ. 1ა-გ-ს გაფართოებული მონაცემები). ამ ეტაპზე, თალამოკორტიკალური და კორტიკოკორტიკალური აქსონალური პროექციები ჯერ არ არის დასრულებული S1 ინერვაციით (მით. 13). ამრიგად, ეს მიდგომა შექმნილია t-hCO3 ინტეგრაციის მაქსიმიზაციისთვის და ენდოგენურ წრედებზე ზემოქმედების მინიმიზაციისთვის. ცოცხალ ცხოველებში t-hCO3-ს ადგილმდებარეობის ვიზუალიზაციისთვის, ტრანსპლანტაციიდან 2-3 თვის შემდეგ ჩავატარეთ ვირთხების T2-შეწონილი MRI ტვინის რეკონსტრუქციები (სურ. 1ბ და გაფართოებული მონაცემები, სურ. 1დ). t-hCO2 ადვილად დაფიქსირდა და t-hCO2-ის მოცულობითი გაზომვები მსგავსი იყო ფიქსირებული ნაჭრებიდან გამოთვლილი გაზომვებისა (გაფართოებული მონაცემები სურ. 1დ,ე; P > 0.05). t-hCO2 ადვილად დაფიქსირდა და t-hCO2-ის მოცულობითი გაზომვები მსგავსი იყო ფიქსირებული ნაჭრებიდან გამოთვლილი გაზომვებისა (გაფართოებული მონაცემები სურ. 1დ,ე; P > 0.05). t-hCO легко наблюдались, а объемные измерения t-hCO были аналогичны рассчитанным для фиксированных резов (расширенные данные, рис. 1d, e; P> 0,05). t-hCO2-ის დაკვირვება მარტივად მოხდა და მოცულობითი t-hCO2-ის გაზომვები მსგავსი იყო ფიქსირებული მონაკვეთებისთვის გამოთვლილი გაზომვებისა (გაფართოებული მონაცემები, სურ. 1დ, e; P > 0.05).很容易观察到t-hCO，并且t-hCO的体积测量值与从固定切片计算的测量值相似（扩展数据图1d、e；P > 0.05＼很容易观察到t-hCO，并且t-hCO t-hCO легко наблюдался, а объемные измерения t-hCO были аналогичны рассчитанным для фиксированных резов (расширенные данные, рис. 1d, e; P> 0,05). t-hCO2-ის დაკვირვება ადვილად ხდებოდა და მოცულობითი t-hCO2-ის გაზომვები ფიქსირებული მონაკვეთებისთვის გამოთვლილი გაზომვების მსგავსი იყო (გაფართოებული მონაცემები, სურ. 1დ, ე; P > 0.05).ტრანსპლანტაციიდან დაახლოებით 2 თვის შემდეგ (n = 72 ცხოველი; hCO 10 hiPS უჯრედული ხაზიდან; hiPS უჯრედული ხაზები დამატებით ცხრილში 1). აქედან 87% თავის ტვინის ქერქში იყო განლაგებული (სურ. 1გ). იმავე ტრანსპლანტირებულ ვირთხაში მრავალჯერადი დროის წერტილებში სერიული მაგნიტურ-რეზონანსული ტომოგრაფიის ჩატარებით, 3 თვის განმავლობაში t-hCO მოცულობის ცხრაჯერადი ზრდა აღმოვაჩინეთ (სურ. 1დ და გაფართოებული მონაცემები, სურ. 1ვ). ტრანსპლანტირებულ ცხოველებს ტრანსპლანტაციიდან 12 თვის შემდეგ მაღალი გადარჩენის მაჩვენებელი (74%) ჰქონდათ (გაფართოებული მონაცემები, სურ. 1გ და დამატებითი ცხრილი 2) და არ დაფიქსირებულა აშკარა მოტორული ან მეხსიერების დარღვევები, გლიოზი ან ელექტროენცეფალოგრამა (EEG). მონაცემები სურ. 1გ და დამატებითი ცხრილი 2). 1სთ-მთ და 3ე).
ა, ექსპერიმენტული დიზაინის სქემა. hiPS უჯრედებიდან მიღებული hCO გადანერგილი იქნა ახალშობილი შიშველი ვირთხების S1 უჯრედში დიფერენციაციის 30-60 დღეს. ბ, T2-შეწონილი კორონარული და ჰორიზონტალური MRI გამოსახულებები, რომლებიც აჩვენებს t-hCO-ს S1-ში ტრანსპლანტაციიდან 2 თვის შემდეგ. მასშტაბის ზოლი, 2 მმ. გ, თითოეული hiPS უჯრედული ხაზისთვის ნაჩვენებია ტრანსპლანტაციის წარმატების მაჩვენებლების რაოდენობრივი განსაზღვრა (n = 108, ზოლებში მოცემული რიცხვები მიუთითებს t-hCO-ს რაოდენობას hIPS უჯრედულ ხაზზე) და კორტიკალური ან სუბკორტიკალური მდებარეობა (n = 88). დ, კორონარული არტერიის MRI გამოსახულება (მარცხნივ; მასშტაბის ზოლი, 3 მმ) და შესაბამისი 3D მოცულობითი რეკონსტრუქცია (მასშტაბის ზოლი, 3 მმ), რომელიც აჩვენებს t-hCO-ს ზრდას 3 თვის განმავლობაში. ე, t-hCO-ს ნიმუშების მიმოხილვა ვირთხის ტვინის ქერქში. მასშტაბის ზოლი, 1 მმ. f, t-hCO-ს წარმომადგენლობითი იმუნოციტოქიმიური გამოსახულებები, ნაჩვენებია ზემოდან მარცხნიდან მარჯვნივ (დიფერენციაციის დროს): PPP1R17 (4 თვის), NeuN (8 თვის), SOX9 და GFAP (8 თვის), PDGFRα; (8 თვის), MAP2 (8 თვის) და IBA1 (8 თვის). მასშტაბის ზოლი, 20 µm. HNA-ს თანაექსპრესია მიუთითებს ადამიანის წარმოშობის უჯრედებზე. g, snRNA-seq: ყველა მაღალი ხარისხის t-hCO ბირთვის ერთიანი მანიფოლდის და პროექციის (UMAP) განზომილებიანობის შემცირების ვიზუალიზაცია Seurat-ის ინტეგრაციის შემდეგ (n=3 t-hCO ნიმუში, n=2 hiPS უჯრედული ხაზი). ასტროციტები, ასტროციტების ხაზის უჯრედები; cyc prog, მოცირკულირე წინამორბედები; GluN DL, ღრმა გლუტამატერგული ნეირონები; GluN DL/SP, ღრმა და სუბლამელარული გლუტამატერგული ნეირონები; GluN UL, ზედა ფენის გლუტამატერგული ნეირონები; ოლიგოდენდროციტები, ოლიგოდენდროციტები; OPC, ოლიგოდენდროციტების წინამორბედი უჯრედები; RELN, რეელინის ნეირონები. h, გენის ონტოლოგიის (GO) ტერმინით გამდიდრებული ანალიზით t-hCO გლუტამატერგულ ნეირონებში მნიშვნელოვნად მომატებული (კორექტირებული P < 0.05, ჯერადის ცვლილება > 2, გამოხატულია ბირთვების მინიმუმ 10%-ში) გენები hCO გლუტამატერგულ ნეირონებთან შედარებით. h, გენის ონტოლოგიის (GO) ტერმინით გამდიდრებული ანალიზით t-hCO გლუტამატერგულ ნეირონებში მნიშვნელოვნად მომატებული (კორექტირებული P < 0.05, ჯერადის ცვლილება > 2, გამოხატულია ბირთვების მინიმუმ 10%-ში) გენები hCO გლუტამატერგულ ნეირონებთან შედარებით. h, Анализ обогащения терминов გენის ონტოლოგია (GO) გენების მნიშვნელოვანი აქტივაციისთვის (скоректированный P <0,05, кратность изменения > 2, ექსპრესია по крайней мере 10% არა 10% იარო) hCO-ს გლუტამატერგიჩესური ნეირონები. h, გენის ონტოლოგიის (GO) ტერმინის გამდიდრების ანალიზი მნიშვნელოვანი აქტივაციის მქონე გენებისთვის (კორექტირებული P<0.05, ჯერადი ცვლილება >2, ექსპრესია ბირთვების მინიმუმ 10%-ში) t-hCO გლუტამატერგულ ნეირონებში hCO გლუტამატერგულ ნეირონებთან შედარებით. h，与hCO 谷氨酸能神经元相比，t-hCO 谷氨酸能神经元中基因显着上调（调P 0.05，倍数变化> 2，在至少10% 的细胞核中表达）的基因本体论(GO) 术语富集 h ， 与 hco 谷氨酸 能 元 相比 ， t-hco 谷氨酸 能 神经 元 基因 显 上萃 （5 弃 p.变化 变化> 2 ， 至少 10% 的 核中 表达） 基因 基因 基因 的 的 的 皚 的 的 的 的 的 的的 的 的 的本体论(GO) 术语富集分析。 h, გენერირებული მნიშვნელოვანი აქტივიზაცია (სკორექტირებელი P <0,05, შემცირების ცვლილებები> 2, 10% იადერში გამოხატული გამოხატულება) გლუტამატერგიული არარეგულარული t-hCO სრავნეიურობით Онтологический (GO) анализ термина обогащения. h, გენები მნიშვნელოვნად ამაღლებული იყო (კორექტირებული P < 0.05, ჯერადი ცვლილება > 2, ექსპრესირებული იყო ბირთვების მინიმუმ 10%-ში) t-hCO გლუტამატერგულ ნეირონებში hCO გლუტამატერგულ ნეირონებთან შედარებით. გამდიდრების ტერმინის ონტოლოგიური (GO) ანალიზი.წყვეტილი ხაზი მიუთითებს aq მნიშვნელობას 0.05. i, GluN უჯრედების ტიპების UMAP ვიზუალიზაცია t-hCO-ში, ზრდასრული ადამიანის მოტორული ქერქის 22 snRNA-seq საცნობარო მონაცემთა ნაკრებიდან ეტიკეტის გადაცემის გამოყენებით. CT — კორტიკოთალამური უჯრედები, ET — ექსტრაცერებრული უჯრედები, IT — შინაგანი ტელენსეფალური უჯრედები, NP — ახლო პროექცია.
შემდეგ შევაფასეთ t-hCO-ს ციტოარქიტექტურა და საერთო უჯრედული შემადგენლობა. ვირთხის ენდოთელური უჯრედების ანტისხეულებით შეღებვამ გამოავლინა t-hCO-თი ვასკულარიზაცია, ხოლო IBA1 შეღებვამ გამოავლინა ვირთხის მიკროგლიის არსებობა მთელ გრაფტში (სურ. 1f და გაფართოებული მონაცემები, სურ. 3c,d). იმუნოშეღებვამ გამოავლინა ადამიანის ბირთვული ანტიგენის (HNA) დადებითი უჯრედები, რომლებიც თანაგამოხატავენ PPP1R17-ს (კორტიკალური წინამორბედები), NeuN-ს (ნეირონები), SOX9-ს და GFAP-ს (გლიური წარმოშობის უჯრედები) ან PDGFRα-ს (ოლიგოდენდროციტების წინამორბედები) (სურათი 1f). t-hCO-ს უჯრედული შემადგენლობის ერთუჯრედიანი გარჩევადობის შესასწავლად, დაახლოებით 8 თვის დიფერენციაციის შემდეგ ჩავატარეთ ერთბირთვიანი რნმ-ის სეკვენირება (snRNA-seq). ვირთხის ბირთვების მასიური ფილტრაციით და მოცილებით მივიღეთ 21,500 მაღალი ხარისხის ადამიანის მონონუკლეარული რუკა (სურ. 1g და გაფართოებული მონაცემები, სურ. 4a,b). ტიპიური უჯრედული ტიპის მარკერების ექსპრესიის ნიმუშებმა გამოავლინა კორტიკალური უჯრედების ძირითადი კლასების კლასტერები, მათ შორის ღრმა და ზედაპირული გლუტამატერგული ნეირონები, მოცირკულირე წინამორბედები, ოლიგოდენდროციტები და ასტროციტების შტო (სურ. 1გ, გაფართოებული მონაცემები, სურ. 4გ და დამატებითი ცხრილი 3). SATB2-ისა და CTIP2-ის იმუნოშეღებვამ აჩვენა, რომ კორტიკალური ქვეტიპების არსებობის მიუხედავად, t-hCO არ ავლენდა მკაფიო ანატომიურ სტრატიფიკაციას (გაფართოებული მონაცემები, სურ. 3ა). სტადიასთან შესაბამისმა snRNA-seq hCO-მ წარმოქმნა ფართოდ მსგავსი უჯრედების კლასები, რამდენიმე გამონაკლისის გარდა, მათ შორის ოლიგოდენდროციტების არარსებობა და GABAergic ნეირონების არსებობა, რაც შეიძლება ასახავდეს ლატერალური წინამორბედი უჯრედებისთვის ადრე დაფიქსირებულ ხელსაყრელ in vitro პირობებს15 (გაფართოებული მონაცემები, სურ. 4ვ-ი და დამატებითი ცხრილი 4). დიფერენციალური გენის ექსპრესიის ანალიზმა გამოავლინა მნიშვნელოვანი განსხვავებები გლუტამატერგულ ნეირონებში t-hCO-სა და hCO-ს შორის (დამატებითი ცხრილი 5), მათ შორის ნეირონულ მომწიფებასთან დაკავშირებული გენების ნაკრებების გააქტიურება, როგორიცაა სინაფსური სიგნალიზაცია, დენდრიტული ლოკალიზაცია და ვოლტაჟდამოკიდებული არხის აქტივობა (სურათი 1h და დამატებითი ცხრილი 5). ცხრილი 6). შესაბამისად, კორტიკალურ გლუტამატერგულ t-hCO ნეირონებს აღენიშნებოდათ დაჩქარებული ტრანსკრიფციული მომწიფება.
იმის გასარკვევად, დაკავშირებული იყო თუ არა t-hCO-ში ეს ტრანსკრიფციული ცვლილებები hCO-ს in vitro და t-hCO-ს in vivo მორფოლოგიურ განსხვავებებთან, დიფერენციაციის 7-8 თვის შემდეგ მწვავე კვეთებში აღვადგინეთ სტადიის შესაბამისი ბიოციტინით სავსე hCO და hCO. hCO ნეირონები (სურ. 2ა). t-hCO ნეირონები მნიშვნელოვნად უფრო დიდი იყო, ჰქონდათ სომის დიამეტრი 1.5-ჯერ დიდი, ორჯერ მეტი დენდრიტი და დენდრიტების საერთო სიგრძე ექვსჯერ მეტი in vitro hCO-სთან შედარებით (სურ. 2ბ). გარდა ამისა, ჩვენ დავაკვირდით დენდრიტული ეკლების მნიშვნელოვნად მაღალ სიმკვრივეს t-hCO ნეირონებში, ვიდრე hCO ნეირონებში (სურ. 2გ). ეს მიუთითებს, რომ t-hCO ნეირონები განიცდიან დენდრიტების ფართო წაგრძელებას და განშტოებას, რაც, უჯრედების გაგრძელებულ პროლიფერაციასთან ერთად, შეიძლება ხელს უწყობდეს t-hCO-ს ინტენსიურ ზრდას ტრანსპლანტაციის შემდეგ (სურ. 1დ და გაფართოებული მონაცემები სურ. 1ვ). ამან გვაიძულა გამოგვეკვლია ელექტროფიზიოლოგიური თვისებები. მემბრანის ტევადობა რვაჯერ მეტი იყო (გაფართოებული მონაცემები, სურ. 8დ), მოსვენების მდგომარეობის მემბრანული პოტენციალი უფრო ჰიპერპოლარიზებული იყო (დაახლოებით 20 მვ) და დენის ინექცია t-hCO ნეირონებში უფრო მაღალ მაქსიმალურ აგზნების სიჩქარეს იწვევდა, ვიდრე hCO ნეირონებში. in vitro (სურ. 2დ), ე), რაც შეესაბამება t-hCO-ს უფრო დიდ და რთულ მორფოლოგიურ მახასიათებლებს. გარდა ამისა, სპონტანური აგზნების პოსტსინაფსური დენის მოვლენების (EPSC) სიხშირე მნიშვნელოვნად მაღალი იყო t-hCO ნეირონებში (სურ. 2ვ), რაც იმაზე მიუთითებს, რომ t-hCO ნეირონებში დაფიქსირებული დენდრიტული ეკლების გაზრდილი სიმკვრივე დაკავშირებული იყო ფუნქციურ აგზნებადობასთან. სექსუალურ სინაფსში. hCO ნეირონების მოუმწიფებელი ხასიათი in vitro დავადასტურეთ ეტიკეტირებული გლუტამატერგული ნეირონების ჩაწერით (გაფართოებული მონაცემები, სურ. 6ა-გ).
ა, ბიოციტინით სავსე hCO და t-hCO ნეირონების 3D რეკონსტრუქცია 8-თვიანი დიფერენციაციის შემდეგ. ბ, მორფოლოგიური მახასიათებლების რაოდენობრივი განსაზღვრა (n = 8 hCO3 ნეირონი, n = 6 t-hCO3 ნეირონი; **P = 0.0084, *P = 0.0179 და ***P < 0.0001). ბ, მორფოლოგიური მახასიათებლების რაოდენობრივი განსაზღვრა (n = 8 hCO3 ნეირონი, n = 6 t-hCO3 ნეირონი; **P = 0.0084, *P = 0.0179 და ***P < 0.0001). б, количественная оценка морфологических признаков (n = 8 ნეირონოვი hCO, n = 6 ნეირონოვი t-hCO; ** P = 0,0084, * P = 0,0179 и *** P <0,0001). ბ, მორფოლოგიური მახასიათებლების რაოდენობრივი განსაზღვრა (n=8 hCO3 ნეირონი, n=6 t-hCO3 ნეირონი; **P=0.0084, *P=0.0179 და ***P<0.0001). b，形态学特征的量化（n = 8 个hCO 神经元，n = 6 个t-hCO 神经元；**P = 0.0084，1*P = 0.0084，1*P = 0.0001). b，形态学特征的量化（n = 8 个hCO 神经元，n = 6 个t-hCO 神经元；**P = 0.0084，1*P = 0.0084，1*P = 0.0001). б, количественная оценка морфологических признаков (n = 8 ნეირონოვი hCO, n = 6 ნეირონოვი t-hCO; ** P = 0,0084, * P = 0,0179 и *** P <0,0001). ბ, მორფოლოგიური მახასიათებლების რაოდენობრივი განსაზღვრა (n=8 hCO3 ნეირონი, n=6 t-hCO3 ნეირონი; **P=0.0084, *P=0.0179 და ***P<0.0001).გ, hCO და t-hCO დენდრიტული ტოტების 3D რეკონსტრუქცია 8-თვიანი დიფერენციაციის შემდეგ. წითელი ვარსკვლავი მიუთითებს სავარაუდო დენდრიტულ ეკლებს. დენდრიტული ეკლის სიმკვრივის რაოდენობრივი განსაზღვრა (n = 8 hCO ნეირონი, n = 6 t-hCO ნეირონი; **P = 0.0092). დ, მოსვენების მემბრანული პოტენციალის რაოდენობრივი განსაზღვრა (n = 25 hCO3 ნეირონი, n = 16 t-hCO3 ნეირონი; ***P < 0.0001). დ, მოსვენების მემბრანული პოტენციალის რაოდენობრივი განსაზღვრა (n = 25 hCO3 ნეირონი, n = 16 t-hCO3 ნეირონი; ***P < 0.0001). d, colyчественная оценка мембранного потенциала покоя (n = 25 ნეირონოვი hCO, n = 16 ნეირონოვი t-hCO; *** P <0,0001). დ, მოსვენების მემბრანული პოტენციალის რაოდენობრივი განსაზღვრა (n = 25 hCO3 ნეირონი, n = 16 t-hCO3 ნეირონი; ***P < 0.0001). d，静息膜电位的量化（n = 25 hCO 神经元，n = 16 t-hCO 神经元；***P <0.0001）. d，静息膜电位的量化（n = 25 hCO 神经元，n = 16 t-hCO 神经元；***P <0.0001）. d, colyчественная оценка мембранного потенциала покоя (n = 25 ნეირონოვი hCO, n = 16 ნეირონოვი t-hCO; *** P <0,0001). დ, მოსვენების მემბრანული პოტენციალის რაოდენობრივი განსაზღვრა (n = 25 hCO3 ნეირონი, n = 16 t-hCO3 ნეირონი; ***P < 0.0001). ე, hCO და t-hCO 2-ში მოქმედების პოტენციალის განმეორებითი გააქტიურება, რომელიც გამოწვეულია დენის ინექციების გაზრდით და მაქსიმალური გააქტიურების სიხშირის რაოდენობრივი განსაზღვრა (n = 25 hCO ნეირონი, n = 16 t-hCO ნეირონი; ***P < 0.0001). ე, hCO და t-hCO 2-ში მოქმედების პოტენციალის განმეორებითი გააქტიურება, რომელიც გამოწვეულია დენის ინექციების გაზრდით და მაქსიმალური გააქტიურების სიხშირის რაოდენობრივი განსაზღვრა (n = 25 hCO ნეირონი, n = 16 t-hCO ნეირონი; ***P < 0.0001). e, კვლავ ანაზღაურება hCO-ში და t-hCO-ში. ე, მოქმედების პოტენციალის ხელახალი გააქტიურება hCO და t-hCO-ში, გამოწვეული დენის ზრდით და მაქსიმალური გააქტიურების სიჩქარის რაოდენობრივი განსაზღვრით (n = 25 hCO ნეირონი, n = 16 t-hCO ნეირონი; *** P < 0.0001). e，通过增加电流注入诱导的hCO 和t-hCO 重复动作电位放电，以及最大放电率个hCO 神经元，n = 16 个t-hCO 神经元；***P <0.0001）. E ， 通过 增加 电流 注入 的 的 hco 和 t-hco 重复 电位 放电 ， 以及 最 大 大 的 大个 hco 神经 ， n = 16 个 t-hco 神经 ； *** p <0.0001）. e, повторяющееся возбуждение потенциала действия hCO и t-hCO, вызванное увеличением подачи тока, и количественная оценка максимальной скорости возбуждения (n = 25 нейронов hCO; n n = 1 <00001). ე, hCO და t-hCO მოქმედების პოტენციალების განმეორებითი გააქტიურება, რომელიც გამოწვეულია დენის მიწოდების ზრდით და მაქსიმალური გააქტიურების სიხშირის რაოდენობრივი განსაზღვრა (n = 25 hCO ნეირონი, n = 16 t-hCO ნეირონი; *** P < 0.0001). f, სპონტანური EPSC-ები (sEPSC) hCO და t-hCO ნეირონებში დიფერენციაციის 8 თვის შემდეგ და სინაფსური მოვლენების სიხშირის რაოდენობრივი განსაზღვრა (n = 25 hCO ნეირონი, n = 17 t-hCO ნეირონი; ***P < 0.0001). f, სპონტანური EPSC-ები (sEPSC) hCO და t-hCO ნეირონებში დიფერენციაციის 8 თვის შემდეგ და სინაფსური მოვლენების სიხშირის რაოდენობრივი განსაზღვრა (n = 25 hCO ნეირონი, n = 17 t-hCO ნეირონი; ***P < 0.0001). f, სპონტანური EPSC (sEPSC) hCO-ში და t-hCO-ში 8 შუალედური დიფერენცირებისა და კოლიზიური ცოდნის კონცენტრაციის დროს (n = 25 ნეირონული hCO, n = 17 P-h,0,0 t). f, სპონტანური EPSC-ები (sEPSC) hCO და t-hCO ნეირონებში დიფერენციაციის 8 თვის შემდეგ და სინაფსური მოვლენების სიჩქარის რაოდენობრივი განსაზღვრა (n=25 hCO ნეირონი, n=17 t-hCO ნეირონი; ***P<0.0001). f，分化8 个月时hCO 和t-hCO 神经元中的自发性EPSCs (sEPSCs)，以及突触事件频率猏元中的自发性EPSCs)，以及突触事件频率猖性EPSCs.神经元，n = 17 t-hCO 神经元；***P <0.0001）. f，分化8 个月时hCO 和t-hCO 神经元中的自发性EPSCs (sEPSCs)，以及突触事件频率经元中的自发性EPSCs (sEPSCs)，以及突触事件频率缄鼚神率的量匼（n = 25 hCO 神率的量匼（n = 25hCO P <0.0001）. f, სპონტანური EPSC (sEPSC) hCO-ში და t-hCO-ში 8 შუალედური დიფერენცირებისა და კოლიზიური ცენზაციის დროს (n = 25 ნეირონოვი hCO, n = 17 PCO;0,0 t). f, სპონტანური EPSC-ები (sEPSC) hCO და t-hCO ნეირონებში დიფერენციაციის 8 თვის შემდეგ და სინაფსური მოვლენების სიჩქარის რაოდენობრივი განსაზღვრა (n = 25 hCO ნეირონი, n = 17 t-hCO ნეირონი; *** P<0.0001).bf-სთვის, 1208-2 ხაზში hCO და t-hCO აღებული იყო იმავე დიფერენციაციის პარტიიდან, რომელიც პარალელურად ინახებოდა. g, გენების გამდიდრების ანალიზი (ცალმხრივი ფიშერის ზუსტი ტესტი) მნიშვნელოვნად მომატებული (კორექტირებული P < 0.05, ჯერადი ცვლილება > 2, გამოხატული ბირთვების მინიმუმ 10%-ში) გენების მიმართ t-hCO გლუტამატერგულ ნეირონებში hCO გლუტამატერგულ ნეირონებთან შედარებით, როგორც ადრეული რეაქციის (ERG), ასევე გვიანი რეაქციის (LRG) აქტივობაზე დამოკიდებული გენების გენების ნაკრებებით, რომლებიც იდენტიფიცირებულია in vivo თაგვებზე ჩატარებული კვლევიდან16 და ადამიანის სპეციფიკური LRG-ებით in vitro ნეირონებიდან17. g, გენების გამდიდრების ანალიზი (ცალმხრივი ფიშერის ზუსტი ტესტი) მნიშვნელოვნად მომატებული (კორექტირებული P < 0.05, ჯერადი ცვლილება > 2, გამოხატული ბირთვების მინიმუმ 10%-ში) გენების მიმართ t-hCO გლუტამატერგულ ნეირონებში hCO გლუტამატერგულ ნეირონებთან შედარებით, როგორც ადრეული რეაქციის (ERG), ასევე გვიანი რეაქციის (LRG) აქტივობაზე დამოკიდებული გენების გენების ნაკრებებით, რომლებიც იდენტიფიცირებულია in vivo თაგვებზე ჩატარებული კვლევიდან16 და ადამიანის სპეციფიკური LRG-ებით in vitro ნეირონებიდან17. g, ანალიზის შედეგად მიღებული გენოები (одногоронний точный критерий Фишера) გენები მნიშვნელოვანი აქტივაცია (скоректированный P <0,05, კრატიულობაь изменения > 2, экспрессия по мень10% миреги) нейронах t-hCO по сравнению со глутаматергическими нейронами hCO наборы генови како раннего (ERG), так и позднего (LRG) გენოვი, დამცავი ოტ აქტივობები, დადენტიფიკაცია. исследовании на мышах in vivo16, и specificheskih для человека LRG из нейронов in vitro17. g, t-hCO გლუტამატერგულ ნეირონებში მნიშვნელოვანი აქტივაციის მქონე გენების გენების გამდიდრების ანალიზი (ცალმხრივი ფიშერის ზუსტი ტესტი) (კორექტირებული P<0.05, ჯერადი ცვლილება >2, ექსპრესია ბირთვების მინიმუმ 10%-ში) შედარებით ადრეული (ERG) და გვიანი (LRG) აქტივობა-დამოკიდებული გენების hCO გლუტამატერგული ნეირონების ნაკრებებთან, რომლებიც იდენტიფიცირებულია in vivo თაგვებში16 და ნეირონებში in vitro17 ადამიანის სპეციფიკურ LRG-ებში. g，t-hCO谷氨酸能神经元与hCO谷氨酸能神经元相比，t -hCO谷氨酸能神经元显着上调（调整后P<0.05，倍数变化>2，在至少10%的细胞核中表达）的基因集富集分析（单侧F isher精确检验）从体内小鼠研究中鉴定的早期反应(ERG)和晚期反应(LRG) 活性依赖性基因的基因组16 和体外神经元17 中的人类特R g ， t-hco 谷氨酸 神经 元 与 hco 谷氨酸 神经 元 相比 ， t-hco 谷氨酸 神经 氨酸 神经 刞萃 与2体内 小鼠 研究 中 的 早期 反应 反应 反应 和 晚期 反应 反应 (lrg) 活性 基因 的 基因组 16神经元 17 中 中 17 中 17 的人类特异性LRG. g, glutamatergicheskie neironы t-hCO значајно აქტიურია hCO-ს მიერ glutamatergicheskie neironami hCO (სკორექტირებელი P<0,05, მცირდება გაცვლითი> 2, არანაკლებ 10% ანალიზით точный тест Фишера) раннего ответа (ERG) и позднего гены, зависящие от активности ответа (LRG), идентифицированные в исследованиях на мышах in vivo16 და нейронах in vitro17, специфичные для человека. გ, t-hCO გლუტამატერგული ნეირონები მნიშვნელოვნად მომატებული იყო hCO გლუტამატერგულ ნეირონებთან შედარებით (კორექტირებული P <0.05, ჯერადი ცვლილება >2, მინიმუმ 10%). ადრეული პასუხის (ERG) და გვიანი პასუხის გენის გამდიდრების ანალიზი (ცალმხრივი ფიშერის ზუსტი ტესტი) რეაგირების აქტივობაზე დამოკიდებული გენები (LRGs) იდენტიფიცირებული იყო in vivo თაგვებში16 და in vitro ნეირონებში17. ადამიანის სპეციფიკური LRGs.წყვეტილი ხაზი მიუთითებს ბონფერონის კორეგირებულ P მნიშვნელობაზე 0.05. h, GluN გენის ექსპრესია (თითოეული გენის ფსევდოპაკეტი და მასშტაბირება) მნიშვნელოვნად მომატებული იყო LRG გენების snRNA-seq რეპლიკებში t-hCO გლუტამატერგულ ნეირონებში. i, იმუნოშეღებვა აჩვენებს SCG2 ექსპრესიას t-hCO (ზედა) და hCO (ქვედა) ნეირონებში. თეთრი ისრები მიუთითებს SCG2+ უჯრედებზე. მასშტაბის ზოლი, 25 µm. მონაცემები გამოხატულია საშუალო ± სტანდარტული გადახრით.
ex vivo ნაჭრებში დაფიქსირებული t-hCO-ს გაზრდილი აქტივობის საფუძველზე, snRNA-seq-მა გამოავლინა გენის ტრანსკრიპტების აქტივობა-დამოკიდებული ზერეგულაცია t-hCO-ში hCO-სთან შედარებით in vitro. გლუტამატერგული t-hCO ნეირონები გამოხატავდნენ გვიანი რეაქციის აქტივობის მარეგულირებელი გენების უფრო მაღალ დონეს (სურ. 2g,h), რაც აღმოჩენილი იყო თაგვისა და ადამიანის ნეირონებში ჩატარებულ წინა კვლევებში16,17. მაგალითად, BDNF18, SCG2 და OSTN, პრიმატებისთვის სპეციფიკური აქტივობის მარეგულირებელი გენი, ავლენდნენ გაზრდილ ექსპრესიას t-hCO ნეირონებში hCO ნეირონებთან შედარებით (სურ. 2g-i). ამრიგად, ტრანსკრიფციული, მორფოლოგიური და ფუნქციური ანალიზებით, t-hCO ნეირონებმა აჩვენეს გაძლიერებული მომწიფების მახასიათებლები hCO ნეირონებთან შედარებით.
t-hCO მომწიფების ადამიანის ტვინის განვითარებასთან კავშირის შემდგომი შეფასების მიზნით, ჩვენ ჩავატარეთ ნაყოფისა და ზრდასრული ადამიანის კორტიკალური უჯრედების ტიპების ტრანსკრიპტომიული შედარებები19,20 და ზრდასრული ადამიანის21,22, ასევე კორტიკალური გენის ექსპრესიის შესახებ ვრცელი მონაცემები23 განვითარების დროს (გაფართოებული მონაცემები, სურ. 5). წინა ნაშრომებთან ერთად24, დიფერენციაციის 7-8 თვის შემდეგ hCO-ს და t-hCO ტრანსკრიპტომის მომწიფების გლობალური სტატუსი ზოგადად შეესაბამება in vivo განვითარების დროს და ყველაზე მეტად ექვივალენტურია ნაყოფის გვიანი სიცოცხლისა (გაფართოებული მონაცემები სურ. 5ა). აღსანიშნავია, რომ ჩვენ დავაკვირდით t-hCO-ში ტრანსკრიპტომის მომწიფების ზრდას ასაკის შესაბამის hCO-სთან შედარებით, ასევე ტრანსკრიპტომის აქტივაციას, რომელიც დაკავშირებულია სინაფტოგენეზთან, ასტროგენეზთან და მიელინიზაციასთან (გაფართოებული მონაცემები, სურ. 5ბ-დ). უჯრედულ დონეზე, ჩვენ აღმოვაჩინეთ t-hCO-ში უფრო თხელი ქერქის ქვეტიპის მტკიცებულება, გლუტამატერგული ნეირონების კლასტერებით, რომლებიც გადაფარავს ზრდასრული L2/3, L5 და L6 ნეირონების ქვეტიპებს (სურათი 1i). ამის საპირისპიროდ, გლუტამატერგული t-hCO ნეირონებისა და ნაყოფის ქერქის ნეირონების კლასტერული გადაფარვა უფრო შეზღუდული იყო ორსულობის შუა პერიოდში (გაფართოებული მონაცემები, სურათი 5e-j). იმის დასადგენად, ფუნქციურად მსგავსია თუ არა t-hCO ნეირონები ადამიანის პოსტნატალურ ნეოკორტიკალურ ნეირონებთან, ჩვენ ჩავატარეთ ადამიანის L2/3 პირამიდული ნეირონების ელექტროფიზიოლოგიური ჩანაწერები და ანატომიური რეკონსტრუქციები ადამიანის პოსტნატალური ქერქის მკვეთრ მონაკვეთებში (გაფართოებული მონაცემები, სურათი 7a). L2/3 პირამიდული ნეირონების ელექტროფიზიოლოგიური თვისებები მსგავსი იყო t-hCO პირამიდული ნეირონების (გაფართოებული მონაცემები, სურათი 7e). მორფოლოგიურად, პოსტნატალური ადამიანის ნიმუშებიდან აღებული L2/3 ნეირონები უფრო ჰგავდა t-hCO-ს, ვიდრე hCO-ს, თუმცა L2/3 უჯრედები უფრო გრძელი იყო, საერთო ჯამში მეტ ტოტს შეიცავდა და უფრო მაღალი ხერხემლის სიმკვრივე ჰქონდა (სურ. 3g და გაფართოებული მონაცემები, სურათი 7b-). G).
ა, საკონტროლო და TS hiPS უჯრედული ხაზების მიერ წარმოებული hCO-ს ტრანსპლანტაცია ახალშობილ ვირთხებში. ბ, ბიოციტინით შევსებული t-hCO ნეირონების 3D რეკონსტრუქცია 8-თვიანი დიფერენციაციის შემდეგ. გ, დენდრიტების საშუალო სიგრძის რაოდენობრივი განსაზღვრა (n = 19 საკონტროლო ნეირონი, n = 21 TS ნეირონი; **P = 0.0041). d, 8 თვის დიფერენციაციის შემდეგ საკონტროლო და TS t-hCO3-დან დენდრიტული ტოტების 3D-რეკონსტრუქცია და დენდრიტული ხერხემლის სიმკვრივის რაოდენობრივი განსაზღვრა (n = 16 საკონტროლო ნეირონი, n = 21 TS ნეირონი, ***P < 0.0001). d, 8 თვის დიფერენციაციის შემდეგ საკონტროლო და TS t-hCO3-დან დენდრიტული ტოტების 3D-რეკონსტრუქცია და დენდრიტული ხერხემლის სიმკვრივის რაოდენობრივი განსაზღვრა (n = 16 საკონტროლო ნეირონი, n = 21 TS ნეირონი, ***P < 0.0001). d, 3D-реконструкция дендритных ветвей из контроля и TS t-hCO через 8 месяцев дифференцировки и количественная оценка плотности дендритных шипов (n = 16 კონტროლიьных нейронов, n = 10, n = 20, n = 20, n = 20, 16). d, საკონტროლო და t-hCO TS დენდრიტული ტოტების 3D რეკონსტრუქცია დიფერენციაციისა და დენდრიტული ხერხემლის სიმკვრივის რაოდენობრივი განსაზღვრის 8 თვის შემდეგ (n=16 საკონტროლო ნეირონი, n=21 TS ნეირონი, ***P<0.0001). d，分化8 个月时对照和TS t-hCO 的3D 重建树突分支，以及树突棘密度的量化 = 1）个对照神经元，n = 21 个TS 神经元，***P <0.0001）. d ， 分化 8 个 时 对照 和 ts t-hco 的 3d 重建 分支 分支 以及 树突棘 密度 1＇6n神经 元 ， n = 21 ც 神经 ， *** p <0.0001 ）. d, 3D-реконструкция дендритных ветвей контроля и TS t-hCO через 8 месяцев дифференцировки и количественная оценка плотности дендритных шипов (n = 16 контрольных нейронов, n = 20,0TS). დ, საკონტროლო დენდრიტული ტოტებისა და TS t-hCO3-ის 3D რეკონსტრუქცია დიფერენციაციისა და დენდრიტული ხერხემლის სიმკვრივის რაოდენობრივი განსაზღვრის 8 თვის შემდეგ (n=16 საკონტროლო ნეირონი, n=21 TS ნეირონი, ***P<0.0001).წითელი ვარსკვლავი მიუთითებს სავარაუდო დენდრიტულ ეკლებზე. e, სპონტანური EPSC-ები საკონტროლო და TS t-hCO ნეირონებში დიფერენციაციის 8 თვის შემდეგ. f, კუმულაციური სიხშირის დიაგრამა და სინაფსური მოვლენების სიხშირისა და ამპლიტუდის რაოდენობრივი განსაზღვრა (n=32 საკონტროლო ნეირონი, n=26 TS ნეირონი; **P=0.0076 და P=0.8102). g, TS და საკონტროლო ნეირონების შოლის ანალიზი hCO-სა და t-hCO-ში. წყვეტილი ხაზები აჩვენებს ადამიანის L2/3 პოსტნატალურ პირამიდულ ნეირონებს შედარებისთვის (n = 24 საკონტროლო t-hCO ნეირონი, n = 21 TS t-hCO ნეირონი, n = 8 საკონტროლო hCO ნეირონი და n = 7 TS hCO ნეირონი). მონაცემები გამოხატულია, როგორც საშუალო ± სტანდარტული გადახრა.
t-hCO-ს უნარი, მაღალ დონეზე გაიმეოროს ადამიანის ქერქის ნეირონების მორფოლოგიური და ფუნქციური მახასიათებლები, გვაფიქრებინა, გაგვეკვლია, შეიძლებოდა თუ არა t-hCO-ს გამოყენება დაავადების ფენოტიპების გამოსავლენად. ჩვენ ყურადღება გავამახვილეთ TS-ზე, ნეიროგანვითარების მძიმე დარღვევაზე, რომელიც გამოწვეულია CaV1.2-ის კოდირების გენში ფუნქციის მომატების მუტაციებით, რომელიც ნეირონებში აქტივობაზე დამოკიდებულ გენის ტრანსკრიფციას იწყებს. ჩვენ hCO მივიღეთ TS-ით დაავადებული სამი პაციენტიდან, რომლებსაც ყველაზე გავრცელებული ჩანაცვლება (p.G406R) ჰქონდათ და სამი საკონტროლო ჯგუფიდან (სურ. 3ა). ტრანსპლანტაციის შემდეგ აღმოვაჩინეთ, რომ დენდრიტული მორფოლოგია შეცვლილი იყო TS ნეირონებში საკონტროლო ჯგუფთან შედარებით (სურ. 3ბ და გაფართოებული მონაცემები, სურ. 8ა,ბ), პირველადი დენდრიტების რაოდენობის ორჯერადი ზრდით და დენდრიტული სიგრძის საშუალო და საერთო შემცირებით (სურ. 3გ და გაფართოებული მონაცემები, სურ. 8გ). ეს დაკავშირებული იყო ხერხემლის სიმკვრივის მატებასთან და სპონტანური EPSC-ების გაზრდილ სიხშირესთან TS-ში საკონტროლო ნეირონებთან შედარებით (სურ. 3დ-ვ და გაფართოებული მონაცემები, სურ. 8გ). შემდგომმა ანალიზმა გამოავლინა t-hCO3 TS-ში დენდრიტული განშტოების პათოლოგიური ნიმუშები საკონტროლო ჯგუფთან შედარებით, მაგრამ არა in vitro TS hCO3-ში დიფერენციაციის მსგავს ეტაპზე (სურ. 3g). ეს თანხვედრაშია ჩვენს წინა ანგარიშებთან TS-ში აქტივობაზე დამოკიდებული დენდრიტული შეკუმშვის შესახებ და ხაზს უსვამს ამ ტრანსპლანტაციის პლატფორმის უნარს, გამოავლინოს დაავადების ფენოტიპები in vivo.
შემდეგ ჩვენ ვიკითხეთ, თუ რამდენად არის t-hCO უჯრედები ფუნქციურად ინტეგრირებული ვირთხის S1-ში. მღრღნელებში S1 იღებს ძლიერ სინაფსურ შეყვანებს იფსილატერალური ვენტრალური ბაზალური და უკანა თალამუსის ბირთვებიდან, ასევე იფსილატერალური მოტორული და მეორადი სომატოსენსორული ქერქიდან და კონტრალატერალური S1-დან (სურ. 4ა). ინერვაციის ნიმუშის აღსადგენად, ჩვენ დავაინფიცირეთ hCO ცოფის ვირუსით-dG-GFP/AAV-G და 3 დღის შემდეგ hCO გადავუნერგეთ S1 ვირთხას. ტრანსპლანტაციიდან 7-14 დღის შემდეგ დავაკვირდით GFP-ის მკვრივ ექსპრესიას იფსილატერალური S1-ის და ვენტრალური ბაზალური განგლიების ნეირონებში (სურ. 4ბ, გ). გარდა ამისა, თალამუსის მარკერის ნეტრინ G1-ის ანტისხეულებით შეღებვამ გამოავლინა თალამუსის დაბოლოებების არსებობა t-hCO-ში (სურ. 4დ, ე). იმის შესაფასებლად, შეეძლოთ თუ არა ამ აფერენტულ პროექციებს სინაფსური რეაქციების გამოწვევა t-hCO უჯრედებში, ჩვენ ჩავატარეთ ადამიანის უჯრედების მთლიანი უჯრედების ჩანაწერები თალამოკორტიკალური შრის მკვეთრ მონაკვეთებზე. ვირთხის S1-ის, შიდა კაფსულის, თეთრი ნივთიერების, t-hCO-სთან ახლოს მდებარე ბოჭკოების ელექტრული სტიმულაცია ან ოპსინ-გამომხატველი თალამუსის დაბოლოებების ოპტოგენეტიკური აქტივაცია t-hCO-თი ინდუცირებულ მოკლე ლატენტურ EPSC-ებში t-hCO ნეირონებში, რომლებიც AMPA რეცეპტორის ანტაგონისტ NBQX-ის ზემოქმედების ქვეშ იმყოფებოდნენ. (სურ. 4f, g და გაფართოებული მონაცემები, სურ. 9a–g). ეს მონაცემები აჩვენებს, რომ t-hCO ანატომიურად ინტეგრირებულია ვირთხის ტვინში და შეუძლია მისი გააქტიურება ვირთხის მასპინძელი ქსოვილის მიერ.
ა, ცოფის თვალთვალის ექსპერიმენტის სქემატური დიაგრამა. ბ, GFP და ადამიანის სპეციფიკური STEM121 ექსპრესია t-hCO-სა და ვირთხის ცერებრალური ქერქის შორის (ზედა პანელი). ასევე ნაჩვენებია GFP ექსპრესია ვირთხის იფსილატერალურ ვენტრალურ ბაზალურ ბირთვში (VB) (ქვედა მარცხენა) და იფსილატერალურ S1-ში (ქვედა მარჯვენა). მასშტაბის ზოლი, 50 µm. წითელი კვადრატები წარმოადგენს ტვინის იმ უბნებს, სადაც გადაღებულია სურათები. გ, GFP-ის გამომხატველი უჯრედების რაოდენობრივი განსაზღვრა (n = 4 ვირთხა). დ, ე — Netrin G1+ თალამუსის ტერმინალები t-hCO-ში. დ გვიჩვენებს კორონალურ მონაკვეთს, რომელიც შეიცავს t-hCO და VB ბირთვებს. მასშტაბის ზოლი, 2 მმ. ე გვიჩვენებს Netrin G1-ის და STEM121-ის ექსპრესიას t-hCO (მარცხნივ) და VB (მარჯვნივ) ნეირონებში. მასშტაბის ზოლი, 50 µm. ნარინჯისფერი წერტილოვანი ხაზი მიუთითებს t-hCO-ს საზღვარს. f, g, t-hCO ნეირონების მიმდინარე კვალი ელექტრული სტიმულაციის შემდეგ S1 ვირთხაში (f) ან შიდა კაფსულაში (g), (იისფერი) ან მის გარეშე (შავი) NBQX (მარცხნივ). EPSC ამპლიტუდები NBQX-ით და მის გარეშე (n = 6 S1 ნეირონი, *P = 0.0119; და n = 6 შიდა კაფსულის ნეირონი, **P = 0.0022) (ცენტრში). t-hCO ნეირონების პროცენტული მაჩვენებელი, რომლებიც აჩვენებენ EPSC-ს ვირთხაში S1-ის (f) ან შიდა კაფსულის (g) (მარჯვნივ) ელექტრული სტიმულაციის საპასუხოდ. aCSF, ხელოვნური ცერებროსპინალური სითხე. h, 2P ვიზუალიზაციის ექსპერიმენტის სქემატური დიაგრამა (მარცხნივ). GCaMP6s-ის ექსპრესია t-hCO-ში (შუაში). მასშტაბის ზოლი, 100 µm. GCaMP6s-ის ფლუორესცენციის დროის შეფერხება (მარჯვნივ). i, სპონტანური აქტივობის ფლუორესცენციის Z-ქულა. j, ულვაშის სტიმულაციის სქემატური ილუსტრაცია. k, z-ქულიანი 2P ფლუორესცენციის ტრაექტორიები ერთ ცდაში, გასწორებული ულვაშის გადახრასთან ნულოვან დროს (წყვეტილი ხაზი) ​​სამაგალითო უჯრედებში. l, ყველა უჯრედის პოპულაციის საშუალოდ განსაზღვრული z-ქულის პასუხები, გასწორებული ულვაშის გადახრასთან ნულოვან დროს (წყვეტილი ხაზი) ​​(წითელი) ან შემთხვევით გენერირებული დროის ნიშნულები (ნაცრისფერი). m. ექსპერიმენტის სქემატური დიაგრამა ოპტიკური მარკირებისას. n, ნედლი ძაბვის მრუდები სამაგალითო t-hCO უჯრედიდან ლურჯი ლაზერული სტიმულაციის ან ულვაშის გადახრის დროს. წითელი ისრები მიუთითებს პირველ პიკებზე, რომლებიც გამოწვეულია სინათლით (ზედა) ან გამოწვეულია ულვაშის გადახრით (ქვედა). ნაცრისფერი დაჩრდილვა მიუთითებს ულვაშის გადახრის პერიოდებზე. o, პიკური სინათლის ტალღის ფორმები და ულვაშის გადახრის პასუხები. p, ერთი მცდელობის პიკები, გასწორებული ულვაშის გადახრასთან მაგალითის უჯრედებში. 0 მიუთითებს ულვაშის გადახრასთან (წყვეტილი ხაზი). q, პოპულაციის საშუალოდ განსაზღვრული z-ქულის გაშვების სიჩქარე ყველა ფოტომგრძნობიარე უჯრედისთვის, გასწორებული ულვაშის გადახრასთან ნულოვან დროს (წყვეტილი ხაზი) ​​(წითელი) ან შემთხვევით გენერირებული დროის ნიშნულები (ნაცრისფერი). r, ფოტომგრძნობიარე ერთეულების პროპორცია, რომლებიც მნიშვნელოვნად მოდულირდება ულვაშის გადახრით (n = 3 ვირთხა) (მარცხნივ). პიკური z-ქულის ლატენტობა (n = 3 ვირთხა; n = 5 (ღია მწვანე), n = 4 (მუქი მწვანე) და n = 4 (ცისფერი) ულვაშის გადახრის მოდულაციის ერთეული თითო ვირთხაზე) (მარჯვნივ). მონაცემები გამოხატულია, როგორც საშუალო ± სტანდარტული გადახრა.
შემდეგ ვიკითხეთ, შეიძლებოდა თუ არა t-hCO-ს გააქტიურება სენსორული სტიმულებით in vivo. S1 ვირთხებში გადავნერგეთ გენეტიკურად კოდირებული კალციუმის ინდიკატორების GCaMP6 გამომხატველი hCO. 150 დღის შემდეგ ჩავატარეთ ბოჭკოვანი ფოტომეტრია ან ორფოტონიანი კალციუმის ვიზუალიზაცია (სურ. 4h და გაფართოებული მონაცემები, სურ. 10a). აღმოვაჩინეთ, რომ t-hCO უჯრედები ავლენდნენ სინქრონიზებულ რიტმულ აქტივობას (სურათი 4i, გაფართოებული მონაცემები, სურათი 10b და დამატებითი ვიდეო 1). პიკური t-hCO აქტივობის დასახასიათებლად, ანესთეზირებულ ტრანსპლანტირებულ ვირთხებში ჩავატარეთ უჯრედგარე ელექტროფიზიოლოგიური ჩანაწერები (გაფართოებული მონაცემები, სურ. 10c-f). მაგნიტურ-რეზონანსული ტომოგრაფიული სურათებიდან გამოვიმუშავეთ სტერეოტაქსური კოორდინატები; ამრიგად, ეს ჩაწერილი ერთეულები წარმოადგენს სავარაუდო ადამიანის ნეირონებს, თუმცა მხოლოდ ელექტროფიზიოლოგია არ იძლევა წარმოშობის სახეობის განსაზღვრის საშუალებას. ჩვენ დავაკვირდით აქტივობის სინქრონიზებულ აფეთქებებს (გაფართოებული მონაცემები, სურ. 10d). აფეთქებები დაახლოებით 460 მილიწამს გაგრძელდა და ერთმანეთისგან დაახლოებით 2 წამიანი დუმილის პერიოდები გამოეყო (გაფართოებული მონაცემები, სურ. 10დ, ე). ცალკეული ერთეულები საშუალოდ დაახლოებით სამ გასროლას ისროდნენ თითო აფეთქებაზე, რაც დაახლოებით 73%-ია რეგისტრირებული ერთეულების თითო აფეთქებაზე. ცალკეული ერთეულების აქტივობები მაღალ კორელაციაში იყო და ეს კორელაციები უფრო მაღალი იყო, ვიდრე იმავე პირობებში ჩაწერილ არავაქცინირებულ ცხოველებში იდენტიფიცირებული ერთეულების (გაფართოებული მონაცემები, სურ. 10ვ). იდენტიფიცირებული ადამიანიდან მიღებული ნეირონების პიკური რეაქციების დასახასიათებლად, ჩვენ ჩავატარეთ სინათლის მონიშვნის ექსპერიმენტები ანესთეზირებულ ვირთხებზე, რომლებსაც გადანერგილი ჰქონდათ hCO3, რომელიც გამოხატავდა სინათლისადმი მგრძნობიარე კათიონურ არხს როდოპსინ 2-ს (hChR2), რომლის მეშვეობითაც t-hCO3 ნეირონები ახდენდნენ მოკლე ლატენტურობის (10 მილიწამზე ნაკლები) ამოცნობას ლურჯი სინათლის სტიმულებზე საპასუხოდ (სურ. 4მ–ო). t-hCO ნეირონებმა აჩვენეს სპონტანური აქტივობის აფეთქებები სიხშირეებზე, რომლებიც მსგავსია კალციუმის ვიზუალიზაციისას დაფიქსირებული სიხშირეებისა, ასევე t-hCO-ში ჩატარებული ელექტროფიზიოლოგიური ჩანაწერებისას სინათლის მარკირების არარსებობისას (გაფართოებული მონაცემები, სურ. 10c-g). in vitro ჩაწერილი hCO-ს შესაბამის ეტაპებზე სპონტანური აქტივობა არ დაფიქსირებულა. იმის შესაფასებლად, შეიძლებოდა თუ არა t-hCO-ს გააქტიურება სენსორული სტიმულებით, ჩვენ მოკლედ გადავუხვიეთ ვირთხის ულვაშები t-hCO-სგან (სურ. 4j,m და გაფართოებული მონაცემები, სურ. 10h,k). წინა კვლევების თანახმად8,10, t-hCO უჯრედების ქვეჯგუფმა აჩვენა გაზრდილი აქტივობა ულვაშის გადახრის საპასუხოდ, რაც არ დაფიქსირებულა მონაცემების შემთხვევით დროის შტამპებთან შედარებისას (სურ. 4k–q და გაფართოებული მონაცემები, სურ. 10h–q). მართლაც, ოპტო-მონიშნული ცალკეული ერთეულების დაახლოებით 54%-მა აჩვენა მნიშვნელოვნად გაზრდილი აგზნების სიჩქარე ულვაშის სტიმულაციის შემდეგ, პიკს მიაღწია დაახლოებით 650 ms-ზე (სურ. 4r). ეს მონაცემები ერთად აღებული მიუთითებს, რომ t-hCO იღებს შესაბამის ფუნქციურ შეყვანებს და შეიძლება გააქტიურდეს გარემო სტიმულებით.
შემდეგ ჩვენ გამოვიკვლიეთ, შეეძლო თუ არა t-hCO-ს ვირთხებში ქცევის კონტროლისთვის საჭირო წრედების გააქტიურება. თავდაპირველად გამოვიკვლიეთ, პროეცირდება თუ არა t-hCO ნეირონების აქსონები ვირთხის მიმდებარე ქსოვილებში. ჩვენ დავაინფიცირეთ hCO ლენტივირუსით, რომელიც აკოდირებს hChR2-ს, რომელიც შერწყმულია EYFP-თან (hChR2-EYFP). 110 დღის შემდეგ, ჩვენ დავაკვირდით EYFP-ის ექსპრესიას იფსილატერალურ კორტიკალურ რეგიონებში, მათ შორის აუდიტორულ, მოტორულ და სომატოსენსორულ ქერქში, ასევე სუბკორტიკალურ რეგიონებში, მათ შორის სტრიატუმში, ჰიპოკამპსა და თალამუსში (სურ. 5ა). იმის შესაფასებლად, შეეძლოთ თუ არა ამ ეფერენტულ პროექციებს სინაფსური რეაქციების გამოწვევა ვირთხის უჯრედებში, ჩვენ ოპტიკურად გავააქტიურეთ hChR2-EYFP-ის გამომხატველი t-hCO უჯრედები ვირთხის ცერებრალური ქერქის უჯრედების ჩაწერით ტვინის მკვეთრ მონაკვეთებში. t-hCO აქსონების ლურჯი შუქით გააქტიურებამ გამოიწვია მოკლე ლატენტური EPSC-ები ვირთხის პირამიდული ქერქის ნეირონებში, რომლებიც დაბლოკილი იყო NBQX-ით (სურ. 5ბ–გ). გარდა ამისა, ამ რეაქციების დაბლოკვა შესაძლებელია ტეტროდოტოქსინით (TTX) და აღდგენა 4-ამინოპირიდინით (4-AP), რაც იმაზე მიუთითებს, რომ ისინი გამოწვეულია მონოსინაფსური კავშირებით (სურ. 5ე).
a, აქსონის თვალთვალის სქემატური დიაგრამა (მარცხნივ). t-hCO EYFP ექსპრესია (მარჯვნივ). შკალის ზოლი, 100 µm. A1, სმენის ქერქი, ACC, წინა საზარდულის ქერქი, d. სტრიატუმი, დორსალური სტრიატუმი, HPC, ჰიპოკამპი; დიაფრაგმა, ლატერალური ძგიდე, mPFC, მედიალური პრეფრონტალური ქერქი, პირი, პირიფორმული ქერქი, v. სტრიატუმი, ვენტრალური სტრიატუმი, VPM, თალამუსის ვენტროპოსტომედიური ბირთვი, VTA, ვენტრალური ტეგმენტალური რეგიონი. წითელი კვადრატები წარმოადგენს ტვინის იმ უბნებს, სადაც გადაღებულია სურათები. b, სტიმულაციის ექსპერიმენტის სქემატური დიაგრამა. c, d, ლურჯი სინათლით ინდუცირებული ფოტოდენის (ზედა) და ძაბვის (ქვედა) რეაქციის მაგალითები ადამიანის (c) EYFP+ t-hCO ან ვირთხის (d) EYFP- უჯრედებში. e, f, ვირთხის ნეირონების მიმდინარე კვალი t-hCO აქსონების ლურჯი სინათლით სტიმულაციის შემდეგ TTX-ით და 4-AR-ით (მწვანე), TTX-ით (ნაცრისფერი) ან aCSF-ით (შავი) (e), (იისფერი) ან მის გარეშე (შავი) ) ) NBQX-ით (e). g, ლურჯი სინათლით გამოწვეული რეაქციების ლატენტობა ვირთხის უჯრედებში (n = 16 უჯრედი); ჰორიზონტალური ზოლები მიუთითებს საშუალო ლატენტობაზე (7.13 ms) (მარცხნივ). სინათლით გამოწვეული EPSC-ების ამპლიტუდა, რომელიც ჩაწერილია NBQX-ით ან მის გარეშე (n = 7 უჯრედი; ***P < 0.0001) (შუა). სინათლით გამოწვეული EPSC-ების ამპლიტუდა, რომელიც ჩაწერილია NBQX-ით ან მის გარეშე (n = 7 უჯრედი; ***P < 0.0001) (შუა). EPSC დარეგისტრირებულია ან NBQX-ის გარეშე (n = 7 კმ; ***P <0,0001) (ცენტრში). სინათლით ინდუცირებული EPSC-ების ამპლიტუდა, ჩაწერილი NBQX-ით ან მის გარეშე (n = 7 უჯრედი; ***P < 0.0001) (ცენტრში).使用或不使用NBQX 记录的光诱发EPSC 的振幅（n = 7 个细胞；***P <0.0001）（中）使用或不使用NBQX 记录的光诱发EPSC 的振幅（n = 7 个细胞；***P <0.0001）（中） EPSC დარეგისტრირებულია ან NBQX-ის გარეშე (n = 7 კმ; ***P <0,0001) (ცენტრში). სინათლით ინდუცირებული EPSC-ების ამპლიტუდა, ჩაწერილი NBQX-ით ან მის გარეშე (n = 7 უჯრედი; ***P < 0.0001) (ცენტრში).ვირთხის უჯრედების პროცენტული მაჩვენებელი, რომლებიც აჩვენებენ ლურჯ სინათლეზე რეაგირებენ EPSC-ებს (მარჯვნივ). h, ქცევითი დავალების სქემატური დიაგრამა. d0, დღე 0. i. სამაგალითო ცხოველების შესრულება ვარჯიშის 1-ელ (მარცხნივ) ან მე-15 (მარჯვნივ) დღეს. ლიკვიდაციების საშუალო რაოდენობა, რომლებიც ჩატარდა პირველ დღეს (მარცხნივ) ან მე-15 დღეს (მარჯვენა, ცენტრი) (n = 150 ლურჯი სინათლის ტესტი, n = 150 წითელი სინათლის ტესტი; ***P < 0.0001). ლიკვიდაციების საშუალო რაოდენობა, რომლებიც ჩატარდა პირველ დღეს (მარცხნივ) ან მე-15 დღეს (მარჯვენა, ცენტრი) (n = 150 ლურჯი სინათლის ტესტი, n = 150 წითელი სინათლის ტესტი; ***P < 0.0001). Среднее количество облизываний, выполненных в день 1 (слева) ან день 15 (в центре справа) (n = 150 испытаний со синим светом, n = 150 испытаний с красным светом; ***P <0,000). ლიკვიდაციის საშუალო რაოდენობა პირველ (მარცხნივ) ან მე-15 დღეს (ცენტრში, მარჯვენა მხარეს) (n = 150 ლურჯი სინათლის ტესტირება, n = 150 წითელი სინათლის ტესტირება; ***P < 0.0001).第1 天（左）或第15 天（右中）执行的平均舔次数（n = 150 次蓝光试验，150n =次红光试验；***P <0.0001）.第1 天（左）或第15 天（右中）执行的平均舔次数（n = 150 次蓝光试验，150n =次红光试验；***P <0.001 Среднее количество облизываний, выполненных в день 1 (слева) ან день 15 (в центре справа) (n = 150 испытаний со синим светом, n = 150 испытаний с красным светом; ***P <0,000). ლიკვიდაციის საშუალო რაოდენობა პირველ (მარცხნივ) ან მე-15 დღეს (ცენტრში, მარჯვენა მხარეს) (n = 150 ლურჯი სინათლის ტესტირება, n = 150 წითელი სინათლის ტესტირება; ***P < 0.0001).წითელი და ლურჯი სინათლის ცდების კუმულაციური ლიკვიდაციები პირველ დღეს (ცენტრში მარცხნივ) ან მე-15 დღეს (მარჯვნივ). NS, არ არის მნიშვნელოვანი. j,k, ყველა ცხოველის ქცევითი მახასიათებლები, რომლებსაც გადანერგილი ჰქონდათ t-hCO3-ით გამომხატველი hChR2-EYFP (j) ან საკონტროლო ფლუოროფორით (k) პირველ ან მე-15 დღეს (hChR2-EYFP: n = 9 ვირთხა, ** P = 0.0049; კონტროლი: n = 9, P = 0.1497). l, პრეფერენციული ქულის ევოლუცია (n = 9 hChR2, n = 9 კონტროლი; **P < 0.001, ***P < 0.0001). l, პრეფერენციული ქულის ევოლუცია (n = 9 hChR2, n = 9 კონტროლი; **P < 0.001, ***P < 0.0001). l, Эволюция показателя предпочтения (n = 9 hChR2, n = 9 კონტროლიьных; **P <0,001, ***P <0,0001). l, პრეფერენციული ქულის ევოლუცია (n = 9 hChR2, n = 9 კონტროლი; **P < 0.001, ***P < 0.0001). l，偏好评分的演变（n = 9 hChR2，n = 9 对照；**P <0.001，***P <0.0001）. l，偏好评分的演变（n = 9 hChR2，n = 9 对照；**P <0.001，***P <0.0001）. l, Эволюция показателей предпочтения (n = 9 hChR2, n = 9 კონტროლი; **P <0,001, ***P <0,0001). l, პრეფერენციული ქულების ევოლუცია (n = 9 hChR2, n = 9 საკონტროლო ჯგუფი; **P < 0.001, ***P < 0.0001).m, FOS ექსპრესია S1-ში t-hCO-ს ოპტოგენეტიკური აქტივაციის საპასუხოდ. ნაჩვენებია FOS ექსპრესიის სურათები (მარცხნივ) და რაოდენობრივი განსაზღვრა (n = 3 ჯგუფზე; *P < 0.05, **P < 0.01 და ***P < 0.001) (მარჯვნივ). ნაჩვენებია FOS ექსპრესიის სურათები (მარცხნივ) და რაოდენობრივი განსაზღვრა (n = 3 ჯგუფზე; *P < 0.05, **P < 0.01 და ***P < 0.001) (მარჯვნივ). Показаны изображения экспрессии FOS (слева) და კოლექტიური განსაზღვრა (n = 3 ჯგუფში; * P <0,05, ** P <0,01 და *** P <0,001) (სმართა). ნაჩვენებია FOS ექსპრესიის სურათები (მარცხნივ) და რაოდენობრივი განსაზღვრის (n = 3 ჯგუფზე; *P<0.05, **P<0.01 და ***P<0.001) (მარჯვნივ).显示了FOS 表达（左）和量化（每组n = 3；*P <0.05、**P <0.01 和***P <0.001）（右显示了FOS 表达（左）和量化（每组n = 3；*P <0.05、**P <0.01 和***P <0.001）（右 Показаны изображения экспрессии FOS (слева) და კოლექტიური განსაზღვრა (n = 3 ჯგუფში; * P <0,05, ** P <0,01 და *** P <0,001) (სმართა). ნაჩვენებია FOS ექსპრესიის სურათები (მარცხნივ) და რაოდენობრივი განსაზღვრის (n = 3 ჯგუფზე; *P<0.05, **P<0.01 და ***P<0.001) (მარჯვნივ).შკალის ზოლი, 100 µm. მონაცემები გამოხატულია BLA-ს, ბაზოლატერალური ტონზილის, MDT-ის, დორსომედიალური თალამუსის ბირთვის, PAG-ის, პერიაკვედუკტალური ნაცრისფერის საშუალო ± სტანდარტული შეცდომით.
და ბოლოს, ჩვენ ვიკითხეთ, შეეძლო თუ არა t-hCO3-ს ვირთხების ქცევის მოდულირება. ამის შესამოწმებლად, ჩვენ hChR2-EYFP-ის გამომხატველი hCO3 გადავნერგეთ S1-ში და 90 დღის შემდეგ, სინათლის მიწოდებისთვის ოპტიკური ბოჭკოები ჩავდეთ t-hCO3-ში. შემდეგ ვირთხები მოვამზადეთ მოდიფიცირებული ოპერანტული განპირობების პარადიგმით (სურ. 5h). ცხოველები მოვათავსეთ ქცევითი ტესტის კამერაში და შემთხვევით გამოვიყენეთ 5 წამიანი ლურჯი (473 ნმ) და წითელი (635 ნმ) ლაზერული სტიმულები. ცხოველებმა მიიღეს წყლის ჯილდო, თუ ისინი ლოკავდნენ ლურჯი სინათლის სტიმულაციის დროს, მაგრამ არ ლოკავდნენ წითელი სინათლის სტიმულაციის დროს. ვარჯიშის პირველ დღეს, ცხოველებს არ აღენიშნებოდათ განსხვავება ლურჯი ან წითელი სინათლის სტიმულაციის დროს ლოკვაში. თუმცა, მე-15 დღეს, ცხოველებს, რომლებსაც გადანერგილი ჰქონდათ hChR2-EYFP-ის გამომხატველი hCO3 გადანერგილი, უფრო აქტიური ლოკვა აჩვენეს ლურჯი სინათლის სტიმულაციის დროს, წითელი სინათლის სტიმულაციასთან შედარებით. ლოკვის ქცევის ეს ცვლილებები არ დაფიქსირებულა საკონტროლო ცხოველებში, რომლებსაც გადანერგილი ჰქონდათ hCO, რომელიც გამოხატავდა საკონტროლო ფლუოროფორს (სწავლის წარმატების მაჩვენებელი: hChR2 89%, EYFP 0%, სურათი 5i-1 და დამატებითი ვიდეო 2). ეს მონაცემები მიუთითებს, რომ t-hCO უჯრედებს შეუძლიათ ვირთხის ნეირონების გააქტიურება ჯილდოს ძიების ქცევის სტიმულირებისთვის. იმის გასარკვევად, თუ რომელი ვირთხის t-hCO ნეირონული წრედები შეიძლება იყოს ჩართული ამ ქცევით ცვლილებებში, ჩვენ ოპტოგენეტიკურად გავააქტიურეთ t-hCO გაწვრთნილ ცხოველებში და 90 წუთის შემდეგ შევაგროვეთ ქსოვილები. იმუნოჰისტოქიმიამ გამოავლინა აქტივობაზე დამოკიდებული FOS ცილის ექსპრესია ტვინის რამდენიმე რეგიონში, რომლებიც მონაწილეობენ მოტივირებულ ქცევაში, მათ შორის მედიალურ პრეფრონტალურ ქერქს, მედიალურ თალამუსს და პერიაკვედუკტურ ნაცრისფერ ნივთიერებაში, რომელიც ექსპრესირებული იყო ან არასტიმულირებულ საკონტროლო ცხოველებში, ან ცხოველებში. ბრინჯი. 5მ). ერთად აღებული, ეს მონაცემები მიუთითებს, რომ t-hCO-ს შეუძლია ვირთხის ნეირონული აქტივობის მოდულირება ქცევის წარმართვის მიზნით.
ნეირონული ორგანოიდები წარმოადგენენ პერსპექტიულ სისტემას ადამიანის განვითარებისა და დაავადებების შესასწავლად in vitro, თუმცა ისინი შეზღუდულია in vivo არსებულ წრედებს შორის კავშირების ნაკლებობით. ჩვენ შევიმუშავეთ ახალი პლატფორმა, რომლის ფარგლებშიც hCO3 გადავიტანეთ იმუნოკომპრომეტირებული ადრეული პოსტნატალური ვირთხების S1 უჯრედებში, რათა შეგვესწავლა ადამიანის უჯრედების განვითარება და ფუნქციონირება in vivo. ჩვენ ვაჩვენეთ, რომ t-hCO3 ავითარებს მწიფე უჯრედების ტიპებს, რომლებიც არ შეინიშნება in vitro28 და რომ t-hCO3 ანატომიურად და ფუნქციურად ინტეგრირებულია მღრღნელების ტვინში. t-hCO3-ის ინტეგრაციამ მღრღნელების ნერვულ წრედებში საშუალება მოგვცა დაგვედასტურებინა კავშირი ადამიანის უჯრედულ აქტივობასა და შესწავლილ ცხოველთა ქცევას შორის, რაც აჩვენებს, რომ t-hCO3 ნეირონებს შეუძლიათ ვირთხის ნეირონული აქტივობის მოდულირება ქცევითი რეაქციების განსახორციელებლად.
ჩვენს მიერ აღწერილ პლატფორმას რამდენიმე უპირატესობა აქვს ადამიანის უჯრედების მღრღნელების ტვინში გადანერგვის შესახებ წინა კვლევებთან შედარებით. პირველ რიგში, ჩვენ hCO3 გადავნერგეთ ადრეული პოსტნატალური ვირთხების განვითარებად ქერქში, რამაც შეიძლება ხელი შეუწყოს ანატომიურ და ფუნქციურ ინტეგრაციას. მეორეც, t-hCO3 მაგნიტურ-რეზონანსული ტომოგრაფიის მონიტორინგმა საშუალება მოგვცა შეგვესწავლა ტრანსპლანტატის პოზიცია და ზრდა ცოცხალ ცხოველებში, რამაც საშუალება მოგვცა ჩაგვეტარებინა გრძელვადიანი მრავალცხოველიანი კვლევები და დაგვედგენინა რამდენიმე hiPS უჯრედული ხაზის სანდოობა. და ბოლოს, ჩვენ გადავნერგეთ ხელუხლებელი ორგანოიდები, იზოლირებული ერთუჯრედიანი სუსპენზიების ნაცვლად, რომლებიც ნაკლებად დამანგრეველია ადამიანის უჯრედებისთვის და შეუძლიათ ხელი შეუწყონ ადამიანის ქერქის ნეირონების ინტეგრაციას და გენერაციას ვირთხის ტვინში.
ჩვენ ვაღიარებთ, რომ ამ პლატფორმის განვითარების მიუხედავად, დროითი, სივრცითი და სახეობრივად ჯვარედინი შეზღუდვები ხელს უშლის ადამიანის ნეირონული წრედების მაღალი სიზუსტით ფორმირებას, განვითარების ადრეულ ეტაპზე ტრანსპლანტაციის შემდეგაც კი. მაგალითად, გაურკვეველია, წარმოადგენს თუ არა t-hCO-ში დაფიქსირებული სპონტანური აქტივობა განვითარების ფენოტიპს, რომელიც მსგავს რიტმულ აქტივობას წარმოადგენს კორტიკალური განვითარების დროს, თუ ეს გამოწვეულია t-hCO-ში სუპრესიული უჯრედების ტიპების არარსებობით. ანალოგიურად, გაურკვეველია, რამდენად მოქმედებს t-hCO-ში ლამინაციის არარსებობა ჯაჭვურ კავშირზე30. მომავალი სამუშაოები ფოკუსირებული იქნება სხვა უჯრედების ტიპების ინტეგრირებაზე, როგორიცაა ადამიანის მიკროგლია, ადამიანის ენდოთელური უჯრედები და გაბაერგული ინტერნეირონების სხვადასხვა პროპორციები, როგორც ეს ნაჩვენებია in vitro ასამბლეის 6 გამოყენებით, ასევე იმის გაგებაზე, თუ როგორ შეიძლება მოხდეს ნეირონული ინტეგრაცია და დამუშავება შეცვლილ t-hCO-ში. ტრანსკრიფციული, სინაფსური და ქცევითი დონეები პაციენტებისგან მიღებულ უჯრედებში.
საერთო ჯამში, ეს in vivo პლატფორმა წარმოადგენს ძლიერ რესურსს, რომელსაც შეუძლია შეავსოს in vitro ადამიანის ტვინის განვითარება და დაავადებათა კვლევა. ჩვენ ვვარაუდობთ, რომ ეს პლატფორმა საშუალებას მოგვცემს აღმოვაჩინოთ ახალი ჯაჭვის დონის ფენოტიპები პაციენტისგან მიღებულ უჯრედებში, რომლებიც სხვაგვარად ძნელად შესამჩნევია და გამოვცადოთ ახალი თერაპიული სტრატეგიები.
HiPS უჯრედებიდან hCO2.5 წარმოებული იქნა ადრე აღწერილი მეთოდით. ​​მკვებავ შრეებზე კულტივირებული hiPS უჯრედებიდან hCO-ს წარმოების დასაწყებად, hiPS უჯრედების ხელუხლებელი კოლონიები ამოღებული იქნა კულტურის ჭურჭლიდან დისპაზის (0.35 მგ/მლ) გამოყენებით და გადატანილი იქნა ულტრადაბალი მიმაგრების პლასტმასის კულტურებში, რომლებიც შეიცავდნენ hiPS უჯრედული კულტურის გარემოს. (Corning) დამატებული იყო ორი SMAD ინჰიბიტორი დორზომორფინი (5 μM; P5499, Sigma-Aldrich) და SB-431542 (10 μM; 1614, Tocris) და ROCK ინჰიბიტორი Y-27632 (10 μM; S1049, Selleckchem). პირველი 5 დღის განმავლობაში, hiPS უჯრედული გარემო ყოველდღიურად იცვლებოდა და ემატებოდა დორზომორფინი და SB-431542. სუსპენზიაში მეექვსე დღეს, ნერვული სფეროიდები გადატანილი იქნა ნეირონულ გარემოში, რომელიც შეიცავდა ნეირობაზალ-A-ს (10888, Life Technologies), B-27 დანამატს A ვიტამინის გარეშე (12587, Life Technologies), GlutaMax-ს (1:100, Life Technologies), პენიცილინს და სტრეპტომიცინს (1:100, Life Technologies) და 24-ე დღემდე დაემატა ეპიდერმული ზრდის ფაქტორი (EGF; 20 ნგ მლ-1; R&D Systems) და ფიბრობლასტების ზრდის ფაქტორი 2 (FGF2; 20 ნგ მლ-1; R&D Systems). 25-ე დღიდან 42-ე დღემდე, გარემოში დაემატა ტვინიდან მიღებული ნეიროტროფიული ფაქტორი (BDNF; 20 ნგ მლ-1, Peprotech) და ნეიროტროფინ 3 (NT3; 20 ნგ მლ-1; Peprotech), გარემოს ცვლილებით ყოველ მეორე დღეს. სუსპენზიაში მეექვსე დღეს, ნერვული სფეროიდები გადატანილი იქნა ნეირონულ გარემოში, რომელიც შეიცავდა ნეირობაზალ-A-ს (10888, Life Technologies), B-27 დანამატს A ვიტამინის გარეშე (12587, Life Technologies), GlutaMax-ს (1:100, Life Technologies), პენიცილინს და სტრეპტომიცინს (1:100, Life Technologies) და 24-ე დღემდე დაემატა ეპიდერმული ზრდის ფაქტორი (EGF; 20 ნგ მლ-1; R&D Systems) და ფიბრობლასტების ზრდის ფაქტორი 2 (FGF2; 20 ნგ მლ-1; R&D Systems). 25-ე დღიდან 42-ე დღემდე, გარემოში დაემატა ტვინიდან მიღებული ნეიროტროფიული ფაქტორი (BDNF; 20 ნგ მლ-1, Peprotech) და ნეიროტროფინ 3 (NT3; 20 ნგ მლ-1; Peprotech), გარემოს ცვლილებით ყოველ მეორე დღეს.სუსპენზიაში მეექვსე დღეს, ნეირონული სფეროიდები გადატანილი იქნა ნერვულ გარემოში, რომელიც შეიცავდა ნეირობაზალ-A-ს (10888, Life Technologies), B-27 დანამატს A ვიტამინის გარეშე (12587, Life Technologies), გლუტამაქსს (1:100, Life Technologies) და პენიცილინს.и стрептомицин (1:100, Life Technologies) და дополнены эпидермальным фактором роста (EGF; 20 нг/мл; R&D Systems) и фактором роста фибробластов 2 (FGF2; 20 ნგ/მლ; R&D Systems) 24-მდე. და სტრეპტომიცინი (1:100, Life Technologies) და ეპიდერმული ზრდის ფაქტორით (EGF; 20 ნგ/მლ; R&D Systems) და ფიბრობლასტების ზრდის ფაქტორი 2-ით (FGF2; 20 ნგ/მლ; R&D Systems) 24-ე დღემდე.25-ე დღიდან 42-ე დღემდე, გარემოს ყოველ მეორე დღეს ცვლიდნენ, რაც თავის მხრივ, ტვინიდან წარმოებული ნეიროტროფული ფაქტორის (BDNF; 20 ნგ მლ-1, პეპროტეკი) და ნეიროტროფინ 3-ის (NT3; 20 ნგ მლ-1, პეპროტეკი) დამატებას უწყობდა ხელს.在悬浮的第6 天，将神经球体转移到含有neurobasal-A（10888，Life Technologies）、不含维A7生补充剂 (12587，Life Technologies）、GlutaMax（1:100，Life Technologies）、青霉素的神经培养基中和10Life Technologies. ტექნოლოგიები）并辅以表皮生长因子（EGF；20 ნგ ml-1；R&D სისტემები）和成纤维细胞生长因子2（FGF2；20ng ml-1；R&D სისტემები）直至第24天。在 悬浮 的 第 第 6 天 将 神经 球体 转移 含有 含有 neurobasal-a （10888 神经 球体 转移 含有 含有 neurobasal-a （10888 神经b-27 补充剂 (12587 ， Life Technologies） Glutamax 1: 100 ， Life TechNOGIS; ， ცხოვრების ტექნოლოგიები） 表皮 生长 因子 (((20ნგმლ-1) R&D სისტემები) 6-й день суспензии нейросферы были переведены на добавку, содержащую нейробазал-А (10888, Life Technologies), добавку В-27 без витамин А (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100), пенициный Технологии стрептомицин (1:100, Life Technologies) со добавлением эпидермального фактора роста (EGF; 20 ng ml-1; R&D Systems) и фактора роста фибробластов 2 (FGF2; 20 ng ml-1) 1; მე-6 დღეს, ნეიროსფეროების სუსპენზიები შეიცვალა ნეირობაზალ-A-ს (10888, Life Technologies), B-27 დანამატით A ვიტამინის გარეშე (12587, Life Technologies), GlutaMax-ით (1:100, Life Technologies), პენიცილინ-ნეიტრალიზებული სტრეპტომიცინის (1:100, Life Technologies) შემცველი დანამატით, რომელიც გამდიდრებულია ეპიდერმული ზრდის ფაქტორით (EGF; 20 ნგ მლ-1; R&D Systems) და ფიბრობლასტების ზრდის ფაქტორით 2 (FGF2; 20 ნგ მლ-1) 1; R&D Systems) 24-ე დღე. კვლევისა და განვითარების სისტემები) 24-ე დღემდე.25-ე დღიდან 42-ე დღიდან, კულტივირების გარემოში დღეგამოშვებით ემატებოდა ტვინის მიერ წარმოებული ნეიროტროფული ფაქტორი (BDNF; 20 ნგ მლ-1, Peprotech) და ნეიროტროფული ფაქტორი 3 (NT3; 20 ნგ მლ-1, Peprotech). გარემოს შეცვლა ერთხელ ხდებოდა.43-ე დღიდან დაწყებული, hCO2 შენარჩუნდა ნეირობაზალ-A-ს გარეშე გარემოში (NM; 1088022, Thermo Fisher) გარემოს ყოველ 4-6 დღეში ერთხელ შეცვლით. საკვების გარეშე კულტივირებული hiPS უჯრედებიდან hCO2-ს მისაღებად, hiPS უჯრედები ინკუბირებული იქნა Accutase-ით (AT-104, Innovate Cell Technologies) 37°C ტემპერატურაზე 7 წუთის განმავლობაში, გამოიყო ერთეულ უჯრედებად და განთავსდა AggreWell 800 ფირფიტებზე (34815, STEMCELL Technologies) 3 × 106 ერთუჯრედიანი უჯრედის სიმკვრივით თითო ჭაში Essential 8 გარემოში, რომელიც გამდიდრებულია ROCK ინჰიბიტორით Y-27632 (10 μM; S1049, Selleckchem). 24 საათის შემდეგ, ჭებში არსებული მედიუმი პიპეტით გადაიტანეს Essential 6 მედიის (A1516401, Life Technologies) შემცველ მედიუმში, რომელიც შეიცავდა დორზომორფინს (2.5 μM; P5499, Sigma-Aldrich) და SB-431542-ს (10 μM; 1614). , Tocrida). მე-2-დან მე-6 დღემდე, Essential 6 მედიუმი ყოველდღიურად იცვლებოდა დორზომორფინით და SB-431542 დანამატით. მეექვსე დღიდან ნეიროსფეროების სუსპენზიები გადაიტანეს ნეირობაზალურ მედიუმში და შენარჩუნდა ზემოთ აღწერილი წესით.
ცხოველებთან დაკავშირებული ყველა პროცედურა ჩატარდა სტენფორდის უნივერსიტეტის ლაბორატორიული ცხოველთა მოვლის ადმინისტრაციული კომიტეტის (APLAC) მიერ დამტკიცებული ცხოველთა მოვლის სახელმძღვანელო პრინციპების შესაბამისად. შეძენილი იქნა ორსული ევთიმური RNU (rnu/+) ვირთხები (Charles River Laboratories) ან განთავსებული იქნა საცხოვრებელში. ცხოველები იმყოფებოდნენ 12-საათიან სინათლე-ბნელი ციკლით, საკვებითა და წყლით შეუზღუდავი რაოდენობით. სამიდან შვიდი დღის ასაკის შიშველი (FOXN1–/–) ვირთხის ლეკვები იდენტიფიცირებული იქნა მოუმწიფებელი ულვაშების ზრდით, სანამ დაიხოცებოდნენ. ლეკვებს (მამრებს და დედლებს) ანესთეზია ჩაუტარდათ 2-3%-იანი იზოფლურანით და მოათავსეს სტერეოტაქსიურ ჩარჩოზე. თავის ქალას ტრეპანაცია ჩატარდა დაახლოებით 2-3 მმ დიამეტრით S1-ზე ზემოთ, მაგარი გარსის მთლიანობის შენარჩუნებით. შემდეგ კრანიოტომიის გარეთ გამოიყენეთ 30-G ნემსი (დაახლოებით 0.3 მმ) მაგარი გარსის გასახვრეტად. შემდეგ წაუსვით HCO3 თხელ 3×3 სმ პარაფილმს და მოაშორეთ ზედმეტი საშუალება. 23 G, 45°-იანი ნემსზე მიმაგრებული ჰამილტონის შპრიცის გამოყენებით, ფრთხილად შეუშვით hCO3 ნემსის ყველაზე დისტალურ ბოლოში. შემდეგ შპრიცი მოათავსეთ სტერეოტაქსურ მოწყობილობასთან დაკავშირებულ შპრიცის ტუმბოზე. შემდეგ ნემსის წვერი მოათავსეთ მაგარი გარსის წინასწარ გაკეთებულ 0.3 მმ სიგანის ხვრელზე (z = 0 მმ) და შეამცირეთ შპრიცი 1-2 მმ-ით (z = დაახლოებით –1.5 მმ) მანამ, სანამ ნემსი არ მოხვდება მაგარი გარსის A ნაწილს შორის. მკვრივი ბეჭედი არ წარმოიქმნება. შემდეგ ასწიეთ შპრიცი კორტიკალური ზედაპირის ცენტრამდე z = -0.5 მმ-ზე და შეიყვანეთ hCO3 წუთში 1-2 µლ სიჩქარით. hCO3 ინექციის დასრულების შემდეგ, ნემსი უკან იწევს წუთში 0.2-0.5 მმ სიჩქარით, კანი იკერება და ლეკვი დაუყოვნებლივ დგება თბილ გამათბობელ საფენზე სრულ გამოჯანმრთელებამდე. ზოგიერთ ცხოველს ორმხრივი გადანერგვა ჩაუტარდა.
ცხოველებზე ჩატარებული ყველა პროცედურა ჩატარდა სტენფორდის უნივერსიტეტის APLAC-ის მიერ დამტკიცებული ცხოველთა მოვლის სახელმძღვანელო პრინციპების შესაბამისად. ვირთხებს (ტრანსპლანტაციიდან 60 დღეზე მეტი ხნის შემდეგ) ჩაუტარდათ 5%-იანი იზოფლურანის ანესთეზია და ვიზუალიზაციის დროს ანესთეზია ჩაუტარდათ 1-3%-იანი იზოფლურანის შემცველი ანესთეზიით. ვიზუალიზაციისთვის გამოყენებული იქნა 7 ტესლა სიმძლავრის აქტიურად დაცული ჰორიზონტალური ჭაბურღილის სკანერი Bruker (Bruker Corp.) International Electric Company (IECO) გრადიენტული წამყვანით, დაცული გრადიენტული ჩანართი 120 მმ შიდა დიამეტრით (600 მტ/მ, 1000 ტ/მ/წმ), AVANCE.III-ის გამოყენებით, რვაარხიანი მრავალსპირიანი რადიოსიხშირული და მრავალბირთვიანი შესაძლებლობებით და თანმხლები Paravision 6.0.1 პლატფორმით. ჩაწერა განხორციელდა აქტიურად გამოყოფილი მოცულობითი რადიოსიხშირული კოჭის გამოყენებით 86 მმ შიდა დიამეტრით და ოთხარხიანი კრიოგაცივებული რადიოსიხშირული კოჭის გამოყენებით მხოლოდ მიღებისთვის. ღერძული 2D Turbo-RARE (გამეორების დრო = 2500 ms, ექოს დრო = 33 ms, 2 საშუალო) 16 ჭრილის გადაღებით, ჭრილის სისქე 0.6–0.8 მმ, 256 × 256 ნიმუშის შემცველობით. სიგნალები მიღებული იქნა კვადრატული გადამცემ-მიმღების მოცულობითი RF კოჭის გამოყენებით 2 სმ შიდა დიამეტრით (Rapid MR International, LLC). და ბოლოს, გამოიყენეთ ჩაშენებული Imaris (BitPlane) ზედაპირის შეფასების ფუნქციები 3D რენდერინგისა და მოცულობის ანალიზისთვის. წარმატებული ტრანსპლანტაცია განისაზღვრა, როგორც ის, რომლის დროსაც გადანერგილ ნახევარსფეროში ჩამოყალიბდა უწყვეტი T2-შეწონილი MRI სიგნალის არეები. ტრანსპლანტატის უარყოფა განისაზღვრა, როგორც ტრანსპლანტატი, რომელმაც არ წარმოქმნა უწყვეტი T2-შეწონილი MRI სიგნალის არეები გადანერგილ ნახევარსფეროში. სუბკორტიკალური t-hCO გამოირიცხა შემდგომი ანალიზიდან.
ორფოტონიანი კალციუმის ვიზუალიზაციისთვის GCaMP6s-ის სტაბილური ექსპრესიისთვის hCO3-ში, hiPS უჯრედები დაინფიცირდა pLV[Exp]-EF1a::GcaMP6s-WPRE-Puro-ით, რასაც მოჰყვა ანტიბიოტიკების შერჩევა. მოკლედ, უჯრედები დისოცირდა EDTA-სთან და სუსპენზირდა 1 მლ Essential 8 გარემოში დაახლოებით 300,000 უჯრედის სიმკვრივით, პოლიბრენის (5 μg/მლ) და 15 μl ვირუსის თანაობისას. შემდეგ უჯრედები ინკუბირებული იქნა სუსპენზიაში 60 წუთის განმავლობაში და დათესეს 50,000 უჯრედის სიმკვრივით თითო ჭაში. შეერთების შემდეგ, უჯრედები დამუშავდა 5-10 μg ml-1 პურომიცინით 5-10 დღის განმავლობაში ან სტაბილური კოლონიების გამოჩენამდე. მწვავე hCO ინფექცია ჩატარდა ადრე აღწერილი მეთოდით5, გარკვეული მოდიფიკაციებით. მოკლედ, 30-45 დღეს hCO3 გადაიტანეს 1.5 მლ ეპენდორფის მიკროცენტრიფუგის მილებში, რომლებიც შეიცავდნენ 100 μl ნერვული გარემოს. შემდეგ გარემოს დაახლოებით 90 µლ ამოღებულია, მილში ემატება 3-6 µლ მაღალი ტიტრის ლენტივირუსი (0.5 x 108-დან 1.2 x 109-მდე) და hCO3 გადადის ინკუბატორში 30 წუთის განმავლობაში. შემდეგ თითოეულ მილში ემატება 90-100 µლ გარემო და მილები ღამით დააბრუნეთ ინკუბატორში. მეორე დღეს, hCO3 გადაიტანეთ ახალ ნერვულ გარემოში დაბალი მიმაგრების ფირფიტებში. 7 დღის შემდეგ, hCO3 გადაიტანეს 24-ჭაბურღილიან მინის ფსკერიან ფირფიტებში ვიზუალიზაციისა და ინფექციის ხარისხის შეფასების მიზნით. pLV[Exp]-SYN1::EYFP-WPRE და pLV[Exp]-SYN1::hChR2-EYFP-WPRE გენერირებულია VectorBuilder-ის მიერ. ლენტივირუსი გამოიყენება ექსპერიმენტების უმეტესობაში, რადგან ის ინტეგრირებულია მასპინძელ გენომში, რაც საშუალებას იძლევა რეპორტიორი გენის ექსპრესიის ინფიცირებულ უჯრედულ ხაზებში. ცოფის შემდგომი დაკვირვებისთვის, 30-45 დღეს hCO კოინფიცირებული იყო ცოფის საწინააღმდეგო ΔG-eGFP-ით და AAV-DJ-EF1a-CVS-G-WPRE-pGHpA-ით (პლაზმიდი #67528, Addgene), საფუძვლიანად გაირეცხა 3 დღის განმავლობაში, გადანერგილი იქნა ვირთხებში S1-ში და შენარჩუნებული იქნა in vivo 7-14 დღის განმავლობაში.
იმუნოციტოქიმიური ანალიზისთვის, ცხოველებს ჩაუტარდათ ანესთეზია და ტრანსკარდიულად პერფუზია PBS-ით, რასაც მოჰყვებოდა 4%-იანი პარაფორმალდეჰიდი (PFA PBS-ში; Electron Microscopy Sciences). ტვინი ფიქსირდებოდა 4%-იან PFA-ში 2 საათის განმავლობაში ან მთელი ღამით 4°C ტემპერატურაზე, კრიოკონსერვირებული იყო 30%-იან საქაროზაში PBS-ში 48-72 საათის განმავლობაში და ჩადგმული იყო 1:1, 30%-იან საქაროზაში: OCT (Tissue-Tek OCT Compound 4583, Sakura Finetek) და კორონარული კვეთები გაკეთდა 30 µm-ზე კრიოსტატის (Leica) გამოყენებით. სქელი კვეთების იმუნოჰისტოქიმიური ანალიზისთვის, ცხოველებს ჩაუტარდათ PBS-ით პერფუზია და ტვინი დისექცია და კორონარული კვეთა მოხდა 300-400 µm-ზე ვიბრატომის (Leica) გამოყენებით და კვეთები ფიქსირდებოდა 4%-იანი PFA-თი 30 წუთის განმავლობაში. შემდეგ კრიოსექციები ან სქელი ნაკვეთები გაირეცხა PBS-ით, დაიბლოკა 1 საათის განმავლობაში ოთახის ტემპერატურაზე (10%-იანი ნორმალური ვირის შრატი (NDS) და 0.3%-იანი Triton X-100 განზავებული PBS-ში) და დაიბლოკა ბლოკირების ხსნარით 4°C ტემპერატურაზე. – ინკუბაცია კრიოსექციები ინკუბირებული იყო მთელი ღამით, ხოლო სქელი ნაკვეთები - 5 დღის განმავლობაში. გამოყენებული პირველადი ანტისხეულები იყო: ანტი-NeuN (თაგვი, 1:500; ab104224, abcam) ანტი-CTIP2 (ვირთხა, 1:300; ab18465, abcam), ანტი-GFAP (კურდღელი, 1:1,000; Z0334, Dako), ანტი-GFP (ქათამი, 1:1,000; GTX13970, GeneTex), ანტი-HNA (თაგვი, 1:200; ab191181, abcam), ანტი-NeuN (კურდღელი, 1:500; ABN78, Millipore), ანტი-PDGFRA (კურდღელი, 1:200; sc-338, Santa Cruz), ანტი-PPP1R17 (კურდღელი, 1:200; HPA047819, Atlas Antibodies), ანტი-RECA-1 (თაგვი, 1:50; ab9774, abcam), ანტი-SCG2 (კურდღელი, 1:100; 20357-1-AP, Proteintech), ანტი-SOX9 (თხა, 1:500; AF3075, R&D Systems), Netrin G1a (თხა, 1:100; AF1166, R&D Systems), ანტი-STEM121 (თაგვი, 1:200; Y40410, Takara Bio), ანტი-SATB2 (თაგვი, 1:50; ab51502, abcam), ანტი-GAD65/67 (კურდღელი, 1:400; ABN904, Millipore) და ანტი-IBA1 (თხა, 1:100; ab5076, abcam). გამოყენებული პირველადი ანტისხეულები იყო: ანტი-NeuN (თაგვი, 1:500; ab104224, abcam) ანტი-CTIP2 (ვირთხა, 1:300; ab18465, abcam), ანტი-GFAP (კურდღელი, 1:1,000; Z0334, Dako), ანტი-GFP (ქათამი, 1:1,000; GTX13970, GeneTex), ანტი-HNA (თაგვი, 1:200; ab191181, abcam), ანტი-NeuN (კურდღელი, 1:500; ABN78, Millipore), ანტი-PDGFRA (კურდღელი, 1:200; sc-338, Santa Cruz), ანტი-PPP1R17 (კურდღელი, 1:200; HPA047819, Atlas Antibodies), ანტი-RECA-1 (თაგვი, 1:50; ab9774, abcam), ანტი-SCG2 (კურდღელი, 1:100; 20357-1-AP, Proteintech), ანტი-SOX9 (თხა, 1:500; AF3075, R&D Systems), Netrin G1a (თხა, 1:100; AF1166, R&D Systems), ანტი-STEM121 (თაგვი, 1:200; Y40410, Takara Bio), ანტი-SATB2 (თაგვი, 1:50; ab51502, abcam), ანტი-GAD65/67 (კურდღელი, 1:400; ABN904, Millipore) და ანტი-IBA1 (თხა, 1:100; ab5076, abcam). Использовались следующие первичные антитела: anti-NeuN (mыshinыe, 1:500; ab104224, abcam), ანტი-CTIP2 (крысиные, 1:300; ab18465, abcam), ანტი-GFAP (1:010) -GFP (курица, 1:1000; GTX13970, GeneTex), ანტი-HNA (мышь, 1:200; ab191181, abcam), ანტი-NeuN (кролик, 1:500; ABN78, Millipore), ანტი-PDGFRA (кролик, 3,1: ანტი-PPP1R17 (кролик, 1:200; HPA047819, ატლასის ანტისხეულები), ანტი-RECA-1 (მышь, 1:50; ab9774, abcam), ანტი-SCG2 (кролик, 1:100; 20357-1-tech, SO, Pro 1:500; AF3075, R&D Systems), нетрин G1a (козий, 1:100; AF1166, R&D Systems), анти-STEM121 (мышиный, 1:200; Y40410, Takara Bio), анти-SATB2,1:5; ანტი-GAD65/67 (კროლიკი, 1:400; ABN904, Millipore) და ანტი-IBA1 (კოზა, 1:100; აბ5076, აბკამ). გამოყენებული პირველადი ანტისხეულები იყო: ანტი-NeuN (თაგვი, 1:500; ab104224, abcam), ანტი-CTIP2 (ვირთხა, 1:300; ab18465, abcam), ანტი-GFAP (კურდღელი, 1:1000; Z0334, Dako), ანტი-GFP (ქათამი, 1:1000; GTX13970, GeneTex), ანტი-HNA (თაგვი, 1:200; ab191181, abcam), ანტი-NeuN (კურდღელი, 1:500; ABN78, Millipore), ანტი-PDGFRA (კურდღელი, 1:200; sc-338, Santa Cruz), ანტი-PPP1R17 (კურდღელი, 1:200; HPA047819, Atlas Antibodies), ანტი-RECA-1 (თაგვი, 1:50; ab9774, abcam), ანტი-SCG2 (კურდღელი, 1:100; 20357-1-AP, Proteintech), ანტი-SOX9 (თხა, 1:500; AF3075, R&D Systems), ნეტრინ G1a (თხა, 1:100; AF1166, R&D Systems), ანტი-STEM121 (თაგვი, 1:200; Y40410, Takara Bio), ანტი-SATB2 (თაგვი, 1:50; ab51502, abcam), ანტი-GAD65/67 (კურდღელი, 1:400; ABN904, Millipore) და ანტი-IBA1 (თხა, 1:100; ab5076, abkam).სურათი 00；ab18465,abcam）,抗GFAP（兔，1:1000；Z0334，Dako），抗-GF P (鸡, 1: 1,000, GTX13970, GeneTex), 抗HNA, 小鼠, 1:200, ab1911 81, abcam,, 抗NeuN, 兔, 1:500, ABN78, Millipore, 抗PDGFRA, 兔, 1:200；sc-338，სანტა კრუზი），抗PPP1R17（兔，1:200；HPA047819，ატლასი抗体），抗RECA-1（小鼠，1:50；ab9774，abcam），抗SCG2（兔）, 1:100;20357-1-AP,Proteintech,,抗SOX9,山羊,1:500,AF3075,R&D სისტემები,Netrin G1a（山羊（山羊，山羊，山羊，山羊，6，1:1D，1:AF10 სისტემები, STEM121, 1:200;სურათი :300, ab18465, abcam,, 抗GFAP, 兔, 1: 1,000, Z0334, Dako, 抗-GFP (鸡), 1:1,000, GTX13970, GeneTex), 抗HNA (小鼠), 1:200, ab 191181, abcam,, 抗NeuN, 兔, 1:500, ABN78, Millipore, 弔, 抗1: 200；sc-338，სანტა კრუზი），抗PPP1R17（兔，1:200；HPA047819，ატლასი抗体），抗RECA-1（小鼠，1:50；ab9774，abcam），抗SCG2 100, 20357-1-AP, Proteintech, SOX9, AF3075, R&D სისტემები, Netrin G1a, 山羊, 1:110, 6, AFR, 1:100 სისტემები) 1:20, ;Y40410, Takara Bio), ანტი-SATB2 (თაგვი, 1:50; ab51502, abcam), ანტი-GAD65/67 (კურდღელი, 1:400; ABN904, Millipore) და ანტი-IBA1 (თხა, 1:100; ab5076, abcam).გამოყენებული პირველადი ანტისხეულები იყო: ანტი-NeuN (თაგვი, 1:500; ab104224, abcam), ანტი-CTIP2 (ვირთხა, 1:300; ab18465, abcam), ანტი-GFAP (კურდღელი, 1:1000; Z0334, Dako). , ანტი-GFP (ქათამი, 1:1000; GTX13970, GeneTex), ანტი-HNA (თაგვი, 1:200; ab191181, abcam), ანტი-NeuN (კურდღელი, 1:500; ABN78, Millipore), ანტი-PDGFRA (კურდღელი, 1:200; sc-338, სანტა კრუზი), ანტი-PPP1R17 (კურდღელი, 1:200; HPA047819, ატლასის ანტისხეული), ანტი-RECA-1 (თაგვი, 1:50; ab9774, abcam), ანტი-SCG2 (კურდღელი), 1:100;20357-1-AP, Proteintech), ანტი-SOX9 (коза, 1:500; AF3075, R&D Systems), Нетрин G1a (კოზა, 1:100; AF1166, R&D Systems), ანტი -STEM121 (мышь, 1:2010,Tak-S)Tak. (мышь, 1:50; ab51502, abcam), ანტი-GAD65/67 (кролик, 1:400; ABN904, Millipore) და ანტი-IBA1 (კოზა, 1:100; აბ5076, აბკამ). 20357-1-AP, Proteintech), ანტი-SOX9 (თხა, 1:500; AF3075, R&D Systems), Netrin G1a (თხა, 1:100; AF1166, R&D Systems), ანტი-STEM121 (თაგვი, 1:200; Y40410, Takara Bio), ანტი-SATB2 (თაგვი, 1:50; ab51502, abcam), ანტი-GAD65/67 (კურდღელი, 1:400; ABN904, Millipore) და ანტი-IBA1 (თხა, 1:100; ab5076, abkam).შემდეგ კვეთები გაირეცხა PBS-ით და ინკუბირებული იქნა მეორად ანტისხეულთან ერთად 1 საათის განმავლობაში ოთახის ტემპერატურაზე (გაყინული კვეთები) ან მთელი ღამით 4°C-ზე (სქელი კვეთები). გამოყენებული იქნა Alexa Fluor-ის მეორადი ანტისხეული (Life Technologies), განზავებული ბლოკირების ხსნარში 1:1000 პროპორციით. PBS-ით გარეცხვის შემდეგ, ბირთვები ვიზუალიზებული იქნა Hoechst 33258-ით (Life Technologies). დაბოლოს, სლაიდები მოათავსეს მიკროსკოპზე საფარიანი ლენტებით (Fisher Scientific) Aquamount-ის (Polysciences) გამოყენებით და გაანალიზდა Keyence-ის ფლუორესცენტურ მიკროსკოპზე (BZ-X ანალიზატორი) ან Leica TCS SP8 კონფოკალურ მიკროსკოპზე (Las-X) გამოსახულებაზე. სურათები დამუშავდა ImageJ პროგრამის (Fiji) გამოყენებით. ადამიანის ნეირონების პროპორციის დასადგენად t-hCO-სა და ვირთხის ქერქში, გადაღებულია 387.5 μm სიგანის მართკუთხა სურათები t-hCO-ს ცენტრში, ვირთხის ქერქის კიდესთან ან მის მახლობლად. ტრანსპლანტატის კიდეები განისაზღვრა ქსოვილის გამჭვირვალობის, HNA+ ბირთვების და/ან ქსოვილის ავტოფლუორესცენციის არსებობის ცვლილებების შეფასებით. თითოეულ გამოსახულებაში NeuN+ და HNA+ უჯრედების საერთო რაოდენობა გაიყო იმავე არეში NeuN+ უჯრედების საერთო რაოდენობაზე. იმის უზრუნველსაყოფად, რომ მხოლოდ გამოსახულების სიბრტყეში ბირთვის მქონე უჯრედები დაითვალოს, გამოთვლაში მხოლოდ ის უჯრედები შედის, რომლებიც ასევე Hoechst+-ია. სტატისტიკური შეცდომის შესამცირებლად საშუალოდ გამოითვალა ორი გამოსახულება, რომელთა დაშორება მინიმუმ 1 მმ-ია.
ნიმუშის აღებამდე ერთი კვირით ადრე, hCO3 გადანერგილი ცხოველები (დაახლოებით 8 თვის დიფერენციაციის შემდეგ) მოათავსეთ ბნელ ოთახში, სენსორული სტიმულაციის მინიმიზაციის მიზნით, ულვაშებით მოჭრილი. ბირთვების იზოლაცია ჩატარდა ადრე აღწერილი მეთოდით, გარკვეული ცვლილებებით. მოკლედ, t-hCO3 და hCO3 განადგურდა სარეცხი საშუალებებით მექანიკური უჯრედული ლიზისის და 2 მლ მინის ქსოვილის საფქვავის გამოყენებით (D8938, Sigma-Aldrich/KIMBLE). შემდეგ ნედლი ბირთვები გაფილტრული იქნა 40 µm ფილტრის გამოყენებით და ცენტრიფუგირებული იქნა 320 გ-ზე 10 წუთის განმავლობაში 4°C ტემპერატურაზე, სანამ ჩატარდებოდა საქაროზას სიმკვრივის გრადიენტი. ცენტრიფუგირების საფეხურის შემდეგ (320 გ 20 წუთის განმავლობაში 4°C ტემპერატურაზე), ნიმუშები ხელახლა სუსპენზირებული იქნა 0.04% BSA/PBS-ში µl-1 RNase ინჰიბიტორის 0.2 ერთეულის დამატებით (40 u µl-1, AM2682, Ambion) და გატარებული იქნა 40 µm ნაკადის ფილტრში. დისოცირებული ბირთვები შემდეგ ხელახლა სუსპენზირებული იქნა 0.02% BSA შემცველ PBS-ში და ჩატვირთული იქნა Chromium Single Cell 3′ ჩიპზე (ნავარაუდოდ, აღდგენა 8000 უჯრედი თითო ზოლში). snRNA-seq ბიბლიოთეკები მომზადდა Chromium Single cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics)-ის გამოყენებით. snRNA-seq ბიბლიოთეკები მომზადდა Chromium Single cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics)-ის გამოყენებით. Biblioteki snRNA-seq были приготовлены со помош Chromium Single cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics). snRNA-seq ბიბლიოთეკები მომზადდა Chromium Single cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics)-ის გამოყენებით. snRNA-seq 文库是使用Chromium Singlecell 3′ GEM、Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics) 制备的。 snRNA-seq 文库是使用Chromium Singlecell 3′ GEM、Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics) 制备的。 Biblioteku snRNA-seq მზადდება Chromium Single Cell 3′ GEM, ბიბლიოთეკა და გელი მძივების ნაკრები v3 (10x Genomics). snRNA-seq ბიბლიოთეკა მომზადდა Chromium Single Cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics)-ის გამოყენებით.სხვადასხვა ნიმუშებიდან აღებული ბიბლიოთეკები გაერთიანდა და სეკვენირებული იქნა Admera Health-ის მიერ NovaSeq S4-ზე (Illumina).
თითოეული სავარაუდო ბირთვული შტრიხკოდის გენის ექსპრესიის დონე რაოდენობრივად განისაზღვრა 10x Genomics CellRanger ანალიზის პროგრამული პაკეტის (ვერსია 6.1.2) გამოყენებით. კერძოდ, წაკითხვები შედარებული იყო ადამიანის (GRCh38, Ensemble, ვერსია 98) და ვირთხის (Rnor_6.0, Ensemble, ვერსია 100) საცნობარო გენომების კომბინაციასთან, რომლებიც შეიქმნა mkref ბრძანებით და count-ის გამოყენებით –include-introns=TRUE ბრძანებით, რათა რაოდენობრივად განესაზღვრათ ინტრონულ რეგიონებთან მიმაგრებული წაკითხვები. t-hCO3 ნიმუშებისთვის, ადამიანის ბირთვები იდენტიფიცირებული იქნა იმ კონსერვატიული მოთხოვნის საფუძველზე, რომ ყველა მიმაგრებული წაკითხვის მინიმუმ 95% ემთხვეოდეს ადამიანის გენომს. ყველა შემდგომი ანალიზი ჩატარდა CellRanger-დან გამომავალ გაფილტრულ შტრიხკოდების მასივზე R პაკეტის (ვერსია 4.1.2) Seurat (ვერსია 4.1.1)32 გამოყენებით.
იმის უზრუნველსაყოფად, რომ შემდგომ ანალიზში მხოლოდ მაღალი ხარისხის ბირთვები იყოს ჩართული, თითოეული ნიმუშისთვის განხორციელდა განმეორებითი ფილტრაციის პროცესი. პირველ რიგში, იდენტიფიცირებული და ამოღებულია დაბალი ხარისხის ბირთვები, რომლებშიც აღმოჩენილია 1000-ზე ნაკლები უნიკალური გენი და მიტოქონდრიების საერთო რაოდენობის 20%-ზე მეტი. შემდგომში, გენის რაოდენობის ნედლი მატრიცა ნორმალიზებული იქნა რეგულარიზებული უარყოფითი ბინომური რეგრესიით sctransform(vst.flavor=”v2″) ფუნქციის გამოყენებით, რომელმაც ასევე გამოავლინა 3000 ყველაზე ცვალებადი გენი ნაგულისხმევი პარამეტრების გამოყენებით. ზედა ცვლადი გენების განზომილების შემცირება განხორციელდა პრინციპული კომპონენტის ანალიზის (PCA) გამოყენებით ნაგულისხმევი პარამეტრებით, მონაცემთა ნაკრების 30 განზომილების გამოყენებით (dims = 30 შეირჩა მუხლის ადგილების ვიზუალური დათვალიერების საფუძველზე და გამოყენებული იქნა ყველა ნიმუშისა და ანსამბლის ანალიზისთვის). შემდეგ ჩვენ ჩავატარეთ იტერაციული კლასტერიზაციის რამდენიმე რაუნდი (გარჩევადობა = 1), რათა გენები კლასიფიცირებულიყო გენების ანომალიურად დაბალი რაოდენობის (საშუალო მაჩვენებელი მე-10 პროცენტილზე ნაკლები), მიტოქონდრიული გენების ანომალიურად მაღალი რაოდენობის (საშუალო მაჩვენებელი 95-ე პროცენტილზე მეტი) საფუძველზე, რათა გამოგვევლინა და ამეღო დაბალი ხარისხის სავარაუდო უჯრედები. კლასტერები და/ან საეჭვო ტყუპების მაღალი პროპორცია იდენტიფიცირებული იქნა DoubletFinder33 პაკეტის გამოყენებით (საშუალო DoubletFinder ქულა 95-ე პროცენტილზე მეტი). t-hCO3 ნიმუშები (n=3) და hCO3 ნიმუშები (n=3) ცალ-ცალკე ინტეგრირებული იქნა IntegrateData ფუნქციის გამოყენებით ზემოთ მოცემულთან. პარამეტრები. შემდეგ ინტეგრირებული მონაცემთა ნაკრების თვისებრივი ფილტრაციის კიდევ ერთი რაუნდი ჩატარდა ზემოთ აღწერილი მეთოდით.
დაბალი ხარისხის ბირთვების ამოღების შემდეგ, ინტეგრირებული მონაცემთა ნაკრები დაჯგუფდა (გარჩევადობა = 0.5) და ჩაშენდა UMAP34 ვიზუალიზაციის მიზნებისთვის. თითოეული კლასტერის მარკერის გენები განისაზღვრა FindMarkers ფუნქციის გამოყენებით, ნორმალიზებული გენის ექსპრესიის მონაცემებიდან გამოთვლილი ნაგულისხმევი პარამეტრებით. ჩვენ ვადგენთ და ვახარისხებთ უჯრედების ძირითად კლასებს ნაყოფისა და ზრდასრული ადამიანის კორტიკალური საცნობარო მონაცემთა ნაკრებების მარკერის გენის ექსპრესიასთან 19,20,21,35 და ანოტაციასთან გაერთიანებით. კერძოდ, მოცირკულირე წინამორბედები იდენტიფიცირებული იქნა MKI67 და TOP2A ექსპრესიით. წინამორბედი კლასტერები განისაზღვრა მიტოზური ტრანსკრიპტების არარსებობით, გვიან მეტაფაზურ ნაყოფის ქერქში აღწერილ მულტიპოტენციურ წინამორბედ კლასტერებთან მაღალი გადაფარვით და EGFR და OLIG1 ექსპრესიით. ჩვენ ვიყენებთ ტერმინს „ასტროციტი“, რათა მოვცეთ ასტროციტების დიფერენციაციის რამდენიმე მდგომარეობა, გვიანი რადიალური გლიიდან ასტროციტების მომწიფებამდე. ასტროციტების კლასტერები გამოხატავენ SLC1A3-ის და AQP4-ის მაღალ დონეს და ნაჩვენებია, რომ ისინი შეესაბამება ნაყოფის რადიალური გლიის და/ან ზრდასრული ადამიანის ასტროციტების ქვეტიპებს. OPC-ები გამოხატავენ PDGFRA-ს და SOX10-ს, ხოლო ოლიგოდენდროციტები გამოხატავენ მიელინიზაციის მარკერებს (MOG და MYRF). გლუტამატერგული ნეირონები იდენტიფიცირებული იქნა ნეირონული ტრანსკრიპტების (SYT1 და SNAP25) არსებობით, GABAergic მარკერების (GAD2) არარსებობით და NEUROD6, SLC17A7, BCL11B ან SATB2 ექსპრესიით. GluN ნეირონები შემდგომში დაიყო ზედა (SATB2 ექსპრესია და BCL11B-ის დაკარგვა) და ღრმა (BCL11B ექსპრესია) ქვეკლასებად. სავარაუდო ქვეფირფიტის (SP) ნეირონები ღრმა GluN მარკერებთან ერთად გამოხატავენ ცნობილ SP18 მარკერებს, როგორიცაა ST18 და SORCS1. ქოროიდული წნულის მსგავსი უჯრედები იდენტიფიცირებული იქნა TTR ექსპრესიით, ხოლო მენინგეალური უჯრედები გამოხატავდნენ ფიბრობლასტებთან ასოცირებულ გენებს და მონიშნული ჰქონდათ საცნობარო მონაცემთა ნაკრების ფიბრობლასტებთან/სისხლძარღვოვან უჯრედებს.
t-hCO და hCO ქვეკლასებს შორის გენის ექსპრესიის დიფერენციალური ანალიზი ჩატარდა ახლად შემუშავებული ფსევდო-ჯგუფური მეთოდის გამოყენებით, რომელიც რეპროდუცირებული იყო Libra R პაკეტის (ვერსია 1.0.0) გამოყენებით განხორციელებულ ნიმუშებში. კერძოდ, ჯგუფებისთვის ჩატარდა edgeR ლოგარითმული ალბათობის ტესტები (ვერსია 3.36.0, პაკეტი R) თითოეული ნიმუშის რეპლიკაციისთვის უჯრედებში გენების რაოდენობის შეჯამებით. სითბური რუკის ვიზუალიზაციისთვის, ნორმალიზებული მილიონზე (CPM) მნიშვნელობები გამოითვლება edgeR-ის (cpm() ფუნქცია) გამოყენებით და მასშტაბირდება (საშუალო = 0, სტანდარტული გადახრა = 1-ის მისაღწევად). ჩატარდა მნიშვნელოვნად მომატებული t-hCO GluN გენების გენის ონტოლოგიის (GO) გამდიდრების ანალიზი (ბენჯამინი-ჰოხბერგის კორექტირებული P მნიშვნელობა 0.05-ზე ნაკლები, გამოხატული t-hCO GluN უჯრედების მინიმუმ 10%-ში და ცვლილების მინიმუმ 2-ჯერადი ზრდა). ჩატარდა ToppGene Suite-ის (https://toppgene.cchmc.org/)37 გამოყენებით. ჩვენ ვიყენებთ ToppFun აპლიკაციას ნაგულისხმევი პარამეტრებით და წარმოგიდგენთ ბენჯამინი-ჰოხბერგის კორექტირებულ P-მნიშვნელობებს, რომლებიც გამოითვლება GO-ანოტირებული ჰიპერგეომეტრიული ტესტებიდან.
ჩვენი snRNA-seq კლასტერების პირველადი ერთუჯრედიანი RNA-seq-ის ან ზრდასრული snRNA-seq19,20,21,22 საცნობარო კვლევებიდან აღებულ ანოტირებულ უჯრედულ კლასტერებთან შესადარებლად, ჩვენ გამოვიყენეთ დაწყვილებული მონაცემთა ნაკრების ინტეგრაციის მიდგომა. მონაცემთა ნაკრებებს შორის კლასტერების გადაფარვების ინტეგრირებისა და შესადარებლად გამოვიყენეთ Seurat-ის SCTransform (v2) ნორმალიზაციის სამუშაო პროცესი (იგივე პარამეტრების გამოყენებით, რაც ზემოთ იყო აღწერილი). გამოთვლითი ეფექტურობისთვის, ინდივიდუალური მონაცემთა ნაკრებები შემთხვევით დაიყო 500 უჯრედამდე ან ბირთვამდე თითოეულ ორიგინალ კლასტერში. ადრე აღწერილი მსგავსი მიდგომის გამოყენებით, კლასტერის გადაფარვა განისაზღვრა, როგორც უჯრედების ან ბირთვების პროპორცია თითოეულ გაერთიანებულ კლასტერში, რომლებიც გადაფარავდნენ საცნობარო კლასტერის ეტიკეტს. GluN-ების შემდგომი კლასიფიკაციისთვის, ჩვენი GluN უჯრედებისთვის საცნობარო მონაცემთა ნაკრების ეტიკეტების მინიჭების მიზნით, გამოვიყენეთ Seurat-ის TransferData სამუშაო პროცესი GluN ქვესიმრავლის მონაცემებისთვის.
t-hCO და hCO ნიმუშების გლობალური ტრანსკრიპტომის მომწიფების სტატუსის შესაფასებლად, ჩვენ შევადარეთ ჩვენი ფსევდო-ბულქსური ნიმუშები BrainSpan/psychENCODE23-ს, რომელიც შედგება ადამიანის ტვინის განვითარების მომცველი დიდი რნმ-ის თანმიმდევრობისგან. ჩვენ ჩავატარეთ PCA კორტიკალური ნიმუშებიდან აღებულ კომბინირებულ შაბლონ-ნორმალიზებული გენის ექსპრესიის მატრიცაზე კონცეფციიდან 10 კვირის შემდეგ და მოგვიანებით, 5567 გენში (ჩვენს მონაცემებთან ერთად), რომლებიც ადრე იდენტიფიცირებული იყო, როგორც აქტიური BrainSpan-ის კორტიკალურ ნიმუშებში (განისაზღვრება, როგორც განვითარების ვარიაციის 50%-ზე მეტი, რაც აიხსნება ასაკით კუბური მოდელის გამოყენებით)38. გარდა ამისა, ჩვენ გამოვიყენეთ ნეიროგანვითარების ძირითად ტრანსკრიპტომურ ხელმოწერებთან დაკავშირებული გენები არაუარყოფითი მატრიცული ფაქტორიზაციის გამოყენებით, როგორც ეს ადრე იყო აღწერილი. არაუარყოფითი მატრიცული ფაქტორიზაციის პროცედურის გამოყენებით გამოთვლილი ნიმუშის წონა გამოსახულია ნახ. 5b-ში, ჟუს და სხვების მიერ აღწერილი ხუთი ხელმოწერიდან თითოეულის გაფართოებული მონაცემებით38. კვლავ, აქტივობაზე დამოკიდებული ტრანსკრიფციული მარკერები მიღებული იქნა ადრე გამოქვეყნებული კვლევებიდან. კერძოდ, ERG და LRG მნიშვნელოვნად მომატებული იყო გლუტამატერგულ ნეირონებში, რომლებიც იდენტიფიცირებული იყო თაგვის ვიზუალური ქერქის snRNA-seq შეგროვებით, ვიზუალური სტიმულაციის შემდეგ, დამატებითი ცხრილიდან 3 (ჰრვატინი და სხვ.16). ადამიანის მიერ გამდიდრებული LRG-ები მიღებული იქნა KCl-აქტივირებული ადამიანის ნაყოფის ტვინის კულტურებიდან და შეგროვდა სტიმულაციიდან 6 საათის შემდეგ, ხოლო გაფილტრული გენები მნიშვნელოვნად მომატებული იყო ადამიანებში, მაგრამ არა მღრღნელებში (დამატებითი ცხრილი 4). ამ გენების ნაკრებების გამოყენებით გენების ნაკრების გამდიდრების ანალიზი ჩატარდა ცალმხრივი ფიშერის ზუსტი ტესტის გამოყენებით.
ვირთხებს ანესთეზია გაუკეთეთ იზოფლურანით, ამოიღეთ ტვინი და მოათავსეთ ცივ (დაახლოებით 4°C) ჟანგბადით გამდიდრებულ (95% O2 და 5% CO2) საქაროზის ხსნარში შემდეგი კვეთებისთვის: 234 mM საქაროზა, 11 mM გლუკოზა, 26 mM NaHCO3, 2.5 mM KCl, 1.25 mM NaH2PO4, 10 mM MgSO4 და 0.5 mM CaCl2 (დაახლოებით 310 mOsm). ვირთხის ტვინის კორონარული კვეთები (300–400 µm), რომლებიც შეიცავდნენ t-hCO3-ს, დამზადდა Leica VT1200 ვიბრატომის გამოყენებით, როგორც ადრე იყო აღწერილი39. შემდეგ კვეთები გადატანილი იქნა კვეთის კამერაში ოთახის ტემპერატურის უწყვეტი ოქსიგენაციით, რომელიც შეიცავდა aCSF-ს, მომზადებული შემდეგი ნივთიერებებისგან: 10 mM გლუკოზა, 26 mM NaHCO3, 2.5 mM KCl, 1.25 mM NaHPO4, 1 mM MgSO4, 2 mM CaCl2 და 126 mM NaCl (298 mOsm). ჩაწერამდე სულ მცირე 45 წუთით ადრე. კვეთები ჩაიწერა ჩაძირულ კამერაში, სადაც ისინი უწყვეტად პერფუზირებული იყო aCSF-ით (95% O2 და 5% CO2 ფლაკონი). ყველა მონაცემი ჩაიწერა ოთახის ტემპერატურაზე. t-hCO3 ნეირონები დასრულდა ბოროსილიკატური მინის პიპეტით, რომელიც შევსებული იყო 127 mM კალიუმის გლუკონატის, 8 mM NaCl-ის, 4 mM მაგნიუმის ATP-ის, 0.3 mM ნატრიუმის GTP-ის, 10 mM HEPES-ის და 0.6 mM EGTA-ს შემცველი ხსნარით, pH 7.2, შიდა ხსნარი დარეგულირებული KOH-ით (290 mOsm). აღსადგენად, ჩამწერ ხსნარს დაემატა ბიოციტინი (0.2%).
მონაცემები მიღებული იქნა MultiClamp 700B გამაძლიერებლის (Molecular Devices) და Digidata 1550B დიგიტალიზატორის (Molecular Devices) გამოყენებით, დაბალი სიხშირის ფილტრით 2 kHz-ზე, დიგიტალიზებული 20 kHz-ზე და გაანალიზებული Clampfit-ის (Molecular Devices), Origin-ის (OriginPro) (2021b, OriginLab) და MATLAB-ის მორგებული ფუნქციების (Mathworks) გამოყენებით. შეერთების პოტენციალი გამოითვალა JPCalc-ის გამოყენებით და ჩანაწერები დაკორექტირდა -14 mV გამოთვლილ მნიშვნელობამდე. ოპერაცია IV შედგება დენის ნაბიჯების სერიისგან 10-25 pA ნაბიჯებით, -250-დან 750 pA-მდე.
თალამუსი, თეთრი ნივთიერება და S1 აფერენტები ელექტრულად სტიმულირდნენ თალამოკორტიკალურ ნაჭრებში hCO3 ნეირონების პაჩ-კლიმპ ჩაწერის დროს, როგორც ადრე იყო აღწერილი. მოკლედ, ტვინი მოათავსეს 3D ბეჭდვის მაგიდაზე, რომელიც დახრილი იყო 10°-იანი კუთხით, ხოლო ტვინის წინა ნაწილი 35°-იანი კუთხით გაიჭრა. შემდეგ ტვინი მიამაგრეს ნაჭერ ზედაპირზე და დაიჭრა, თალამოკორტიკალური ამობურცული აქსონების შენარჩუნებით. ბიპოლარული ვოლფრამის ელექტროდები (0.5 MΩ) დამონტაჟდა მეორე მიკრომანიპულატორზე და სტრატეგიულად განლაგდა უჯრედზე ოთხი რეგიონის (შიდა კაფსულა, თეთრი ნივთიერება, S1 და hCO3) სტიმულირებისთვის. სინაფსური რეაქციები ჩაიწერა 300 µA ფაზური სტიმულაციის შემდეგ 0.03–0.1 ჰც სიხშირით.
hChR2-ის გამომხატველი hCO ნეირონები გააქტიურდა 480 ნმ-ზე და LED (Prizmatix)-ის მიერ გენერირებული სინათლის იმპულსები გამოიყენებოდა ×40 ობიექტივის (0.9 NA; Olympus) მეშვეობით, რათა ჩაწერილიყო უჯრედებთან ახლოს hChR2-ის ექსპრესია. განათებული ველის დიამეტრი დაახლოებით 0.5 მმ-ია, ხოლო საერთო სიმძლავრე 10-20 მვტ. იმპულსის სიგანე დაყენებული იყო 10 ms-ზე, რაც შეესაბამება ქცევითი სწავლების ექსპერიმენტის დროს მიცემულ იმპულსს. გამოყენებული იქნა სხვადასხვა სტიმულაციის სიხშირე, 1-დან 20 ჰც-მდე, მაგრამ რაოდენობრივი განსაზღვრისთვის გამოყენებული იქნა სერიის მხოლოდ პირველი იმპულსი. მატარებლებს შორის ინტერვალები, როგორც წესი, 30 წამზე მეტია, რათა მინიმუმამდე იქნას დაყვანილი სინაფსურ ინჰიბიტორულ ან ხელშემწყობ გზებზე გავლენა. იმის შესამოწმებლად, იყო თუ არა hChR2 პასუხი მონოსინაფსური, აბაზანაში შევიტანეთ TTX (1 μM) EPSC რეაქციის გაქრობამდე, შემდეგ კი შევიტანეთ 4-ამინოპირიდინი (4-AP; 100 μM). როგორც წესი, პასუხი რამდენიმე წუთში ბრუნდება, LED-ის ჩართვასა და EPSC-ის წარმოქმნას შორის ოდნავ უფრო ხანგრძლივი დაყოვნებით. NBQX (10 μM) გამოყენებული იქნა იმის შესამოწმებლად, გამოწვეულია თუ არა პასუხი AMPA რეცეპტორებით.
ბასრი hCO3 სექციები შეიქმნა ადრე აღწერილი მეთოდით. ​​მოკლედ, hCO3 სექციები ჩასმული იქნა 4%-იან აგაროზაში და გადატანილი იქნა უჯრედებში, რომლებიც შეიცავდნენ 126 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM NaH2PO4, 1 mM MgSO4, 2 mM CaCl2, 26 mM NaHCO3 და 10 mM d-(+)-გლუკოზას. სექციები დაიჭრა 200–300 µm-ზე ოთახის ტემპერატურაზე Leica VT1200 ვიბრატორის გამოყენებით და შეინახეს ASF-ში ოთახის ტემპერატურაზე. შემდეგ, hCO3 სექციებზე ჩატარდა მთლიანი უჯრედების პაჩ-კემპის ჩაწერა პირდაპირი SliceScope მიკროსკოპის (Scientifica) ქვეშ. სექციები გაჟღენთილი იყო aCSF-ით (95% O2 და 5% CO2) და უჯრედული სიგნალები ჩაიწერა ოთახის ტემპერატურაზე. hCO ნეირონები დაემატა ბოროსილიკატური მინის პიპეტის გამოყენებით, რომელიც სავსე იყო 127 mM კალიუმის გლუკონატის, 8 mM NaCl-ის, 4 mM მაგნიუმის ATP-ის, 0.3 mM ნატრიუმის GTP-ის, 10 mM HEPES-ის და 0.6 mM EGTA-ს შემცველი ხსნარით, შიდა pH 7, 2, კორექტირებული KOH-ით (ოსმოლარობა 290). აღდგენის მიზნით, შიდა ხსნარს დაუმატეთ 0.2% ბიოციტინი.
მონაცემები მოპოვებული იქნა Clampex-ის (Clampex 11.1, Molecular Devices) მიერ MultiClamp 700B გამაძლიერებლის (Molecular Devices) და Digidata 1550B დიგიტალიზატორის (Molecular Devices) გამოყენებით, დაბალი სიხშირეების ფილტრაციის შემდეგ 2 kHz-ზე, დიგიტალიზაციის შემდეგ 20 kHz-ზე და ანალიზირებული იქნა Clampfit-ის (ვერსია 10.6) ანალიზისთვის (მოლეკულური მოწყობილობები) და MATLAB-ის მორგებული ფუნქციების (MATLAB 2019b, Mathworks) გამოყენებით. შეერთების პოტენციალი გამოითვალა JPCalc-ის გამოყენებით და ჩანაწერები დაკორექტირდა -14 mV-ის გამოთვლილ შეერთების პოტენციალზე. ოპერაცია IV შედგება დენის ნაბიჯების სერიისგან 5-10 pA საფეხურებით -50-დან 250 pA-მდე.
დაჭიმული ნეირონების მორფოლოგიური რეკონსტრუქციისთვის, შიდა ხსნარს დაემატა 0.2%-იანი ბიოციტინი (Sigma-Aldrich). უჯრედები დაშლის შემდეგ მინიმუმ 15 წუთის განმავლობაში იწვება. შემდეგ პიპეტი ნელა შეიწოვება 1-2 წუთის განმავლობაში, სანამ რეგისტრირებული მემბრანა სრულად არ დაილუქება. კვეთის ფიზიოლოგიური პროცედურის შემდეგ, კვეთები დააფიქსირეს ღამით 4°C ტემპერატურაზე 4%-იან PFA-ში, გარეცხეს PBS X3-ით და განზავდნენ 1:1000 სტრეპტავიდინთან კონიუგირებული DyLight 549-ით ან DyLight 405-ით (Vector Labs). ბიოციტინით (2%; Sigma-Aldrich) შევსებული უჯრედები მონიშნული იქნა პატჩ-კლიპის ჩაწერის დროს ოთახის ტემპერატურაზე 2 საათის განმავლობაში. შემდეგ კვეთები დამონტაჟდა მიკროსკოპის სლაიდებზე Aquamount-ის (Thermo Scientific) გამოყენებით და მეორე დღეს ვიზუალიზებული იქნა Leica TCS SP8 კონფოკალურ მიკროსკოპით, ზეთში ჩაძირვის ობიექტივის გამოყენებით, რიცხვითი აპერტურით ×40 1.3, გადიდებით ×0.9–1.0, xy. შერჩევის სიხშირე დაახლოებით 7 პიქსელია მიკრონზე. Z-სტეკები 1 µm ინტერვალებით მიღებული იქნა სერიულად, ხოლო z-სტეკის მოზაიკა და Leica-ზე დაფუძნებული ავტომატური ნაკერი შესრულდა თითოეული ნეირონის მთელი დენდრიტული ხის დასაფარად. შემდეგ ნეირონების თვალყურის დევნება მოხდა ნახევრად ხელით neuTube 40 ინტერფეისის გამოყენებით და შეიქმნა SWC ფაილები. შემდეგ ფაილები აიტვირთა SimpleNeuriteTracer41 Fiji დანამატში (ImageJ, ვერსია 2.1.0; NIH).
ადამიანის კორტიკალური ქსოვილი მიღებული იქნა ინფორმირებული თანხმობით, სტენფორდის უნივერსიტეტის ინსტიტუციური მიმოხილვის საბჭოს მიერ დამტკიცებული პროტოკოლის შესაბამისად. რეფრაქტერული ეპილეფსიის ოპერაციის ფარგლებში, შუბლის ქერქის (შუა შუბლის გორგოლაჭოვანი ხვრელის) რეზექციით მიღებული იქნა ადამიანის მშობიარობის შემდგომი ქსოვილის ორი ნიმუში (3 და 18 წლის). რეზექციის შემდეგ, ქსოვილი ამოღებულ იქნა ყინულივით ცივ NMDG-aCSF-ში, რომელიც შეიცავდა: 92 mM NMDG, 2.5 mM KCl, 1.25 mM NaH2PO4, 30 mM NaHCO3, 20 mM HEPES, 25 mM გლუკოზა, 2 mM თიოშარდოვანა, 5 mM ნატრიუმის ასკორბატი, 3 mM ნატრიუმის პირუვატი, 0.5 mM CaCl2 4H2O და 10 mM MgSO4 7H2O. ტიტრაცია განხორციელდა pH 7.3-7.4-მდე კონცენტრირებული მარილმჟავათი. ქსოვილები ლაბორატორიაში 30 წუთის განმავლობაში გადაეცა და კორონარული კვეთები აღებული იქნა ზემოთ აღწერილი პროცედურის შესაბამისად.
ცხოველებზე ჩატარებული ყველა პროცედურა ჩატარდა სტენფორდის უნივერსიტეტის APLAC-ის მიერ დამტკიცებული ცხოველთა მოვლის სახელმძღვანელო პრინციპების შესაბამისად. ვირთხებს (ტრანსპლანტაციიდან 140 დღეზე მეტი ხნის შემდეგ) ჩაუტარდათ 5%-იანი იზოფლურანის ანესთეზია და ინტრაოპერაციულად ანესთეზია 1-3%-იანი იზოფლურანით. ცხოველები მოათავსეს სტერეოტაქსიურ ჩარჩოში (Kopf) და კანქვეშ გაუკეთეს შენელებული გამოთავისუფლების ბუპრენორფინი (SR). თავის ქალა გამოიფინა, გაიწმინდა და ჩასვეს 3-5 ძვლის ხრახნი. t-hCO3-ის სამიზნედ გადასაადგილებლად, მაგნიტურ-რეზონანსული ტომოგრაფიული სურათებიდან მივიღეთ სტერეოტაქსიური კოორდინატები. სასურველ ადგილას გაკეთდა ხვრელი და ბოჭკოები (400 µm დიამეტრი, NA 0.48, დორიული) ჩაუშვეს hCO3 ზედაპირიდან 100 µm ქვემოთ და მიამაგრეს თავის ქალაზე ულტრაიისფერი გამოსხივებისადმი მდგრადი სტომატოლოგიური ცემენტით (Relyx).
ბოჭკოვანი ფოტომეტრიული ჩანაწერები ჩატარდა ადრე აღწერილი მეთოდით42. სპონტანური აქტივობის აღსაწერად, ვირთხები მოათავსეს სუფთა გალიაში და იმპლანტირებულ ბოჭკოვან კაბელს დაუკავშირდა 400 µm დიამეტრის ბოჭკოვანი ოპტიკური პაჩ კაბელი (Doric), რომელიც დაკავშირებული იყო ბოჭკოვანი ფოტომეტრიული მონაცემთა შეგროვების სისტემასთან. მოტორული აქტივობის 10-წუთიანი ჩაწერის დროს, ცხოველებს შეეძლოთ გალიის დათვალიერება. გამოწვეული აქტივობის აღსაწერად, ვირთხებს (ტრანსპლანტაციიდან 140 დღეზე მეტი ხნის შემდეგ) ანესთეზია ჩაუტარდათ 5%-იანი იზოფლურანის ინდუქციისთვის და 1-3%-იანი იზოფლურანის შესანარჩუნებლად. ცხოველი მოათავსეს სტერეოტაქსიურ ჩარჩოში (Kopf) და t-hCO3-ის მოპირდაპირე მხარეს არსებული ულვაშები დაახლოებით 2 სმ-მდე შეამოკლეს და გაატარეს პიეზოელექტრულ აქტივატორთან (PI) დაკავშირებულ ბადეში. 400 µm ბოჭკოვანი ოპტიკური პაჩ კაბელი (Doric) დაუკავშირეს იმპლანტირებულ ბოჭკოს და შემდეგ მონაცემთა შეგროვების სისტემას. t-hCO3-ის მოპირდაპირე მხარეს არსებული ულვაშები შემდეგ 50-ჯერ (2 მმ 20 ჰც-ზე, 2 წამი თითო პრეზენტაციაზე) გადახრილი იქნა შემთხვევით დროს პიეზოელექტრული დრაივით 20 წუთიანი ჩაწერის პერიოდის განმავლობაში. გამოიყენეთ Arduino MATLAB-ის მხარდაჭერის პაკეტი გადახრის დროის სამართავად მორგებული MATLAB კოდით. ​​მოვლენები სინქრონიზებულია მონაცემთა შეგროვების პროგრამულ უზრუნველყოფასთან ტრანზისტორ-ტრანზისტორული ლოგიკის (TTL) იმპულსების გამოყენებით.
ვირთხებს (ტრანსპლანტაციიდან 140 დღეზე მეტი ხნის შემდეგ) ჩაუტარდათ ინდუცირება 5%-იანი იზოფლურანის ანესთეზიით და ინტრაოპერაციულად ანესთეზია 1-3%-იანი იზოფლურანის ხსნარით. ცხოველები მოთავსდნენ სტერეოტაქსიურ ჩარჩოში (Kopf) და კანქვეშ გაუკეთეს ბუპრენორფინი SR და დექსამეტაზონი. თავის ქალა გამოიფინა, გაიწმინდა და ჩასვეს 3-5 ძვლის ხრახნი. t-hCO3-ის სამიზნედ გამოსაყენებლად, მაგნიტურ-რეზონანსული ტომოგრაფიული სურათებიდან მივიღეთ სტერეოტაქსიური კოორდინატები. წრიული კრანიოტომია (დაახლოებით 1 სმ დიამეტრის) ჩატარდა მაღალსიჩქარიანი ბურღით პირდაპირ გადანერგილ hCO3-ზე. მას შემდეგ, რაც ძვალი მაქსიმალურად გათხელდება, მაგრამ მთელი ძვლის გაბურღვამდე, პინცეტის გამოყენებით ამოიღეს დარჩენილი ხელუხლებელი მენჯის დისკი, რათა გამოვლენილიყო ქვეშ არსებული t-hCO3. კრანიოტომია შეივსო სტერილური ფიზიოლოგიური ხსნარით და თავის ქალაზე დამაგრებული იყო საფარი და სპეციალური თავის ქინძისთავი ულტრაიისფერი სხივებით გამაგრებული სტომატოლოგიური ცემენტით (Relyx).
ორფოტონიანი ვიზუალიზაცია ჩატარდა Bruker-ის მრავალფოტონიანი მიკროსკოპის გამოყენებით Nikon LWD (×16, 0.8 NA) ობიექტივით. GCaMP6 ვიზუალიზაცია ჩატარდა 920 ნმ-ზე, 1.4x ერთ z-სიბრტყიან გადიდებით და 8x საშუალო სიჩქარით, 7.5 fps-ით. ვირთხები ინდუცირებული იყვნენ 5%-იანი იზოფლურანის ანესთეზიით და შენარჩუნებული იყვნენ 1-3% იზოფლურანით. ვირთხები მოათავსეს სპეციალურად დამზადებულ თავის ფიქსაციაში და მოათავსეს ლინზის ქვეშ. მოტორული აქტივობის 3-წუთიანი ფონური ჩანაწერი იქნა მიღებული. 20 წუთიანი ჩანაწერის განმავლობაში, 50 შესხურება (თითოეული პრეზენტაცია 100 ms ხანგრძლივობით) შემთხვევით იქნა მიწოდებული t-hCO3-ის მოპირდაპირე მხარეს მდებარე ულვაშებიან ბალიშზე picospricer-ის გამოყენებით. გამოიყენეთ Arduino MATLAB-ის მხარდაჭერის პაკეტი აფეთქების დროის საკონტროლებლად საკუთარი MATLAB კოდით. ​​მოვლენების სინქრონიზაცია მონაცემთა შეგროვების პროგრამულ უზრუნველყოფასთან (PrairieView 5.5) TTL იმპულსების გამოყენებით. ანალიზისთვის, სურათები შესწორდა xy მოძრაობისთვის ფიჯიში დაწყებულ MoCo პროგრამაში აფინური კორექციის გამოყენებით. ფლუორესცენციის კვალის ექსტრაქცია ცალკეული უჯრედებიდან CNMF-E43-ის გამოყენებით. ფლუორესცენცია ექსტრაგირებული იქნა თითოეული საინტერესო რეგიონისთვის, გადაყვანილი იქნა dF/F მრუდებად და შემდეგ გადაყვანილ იქნა z-ქულებად.
ვირთხებს (ტრანსპლანტაციიდან 140 დღეზე მეტი ხნის შემდეგ) ჩაუტარდათ 5%-იანი იზოფლურანის ანესთეზია და ინტრაოპერაციულად ანესთეზია 1-3%-იანი იზოფლურანით. ცხოველები მოათავსეს სტერეოტაქსიურ ჩარჩოში (Kopf) და კანქვეშ გაუკეთეს ბუპრენორფინი SR და დექსამეტაზონი. t-hCO-ს მოპირდაპირე მხარეს არსებული ულვაშები დაახლოებით 2 სმ-მდე დაჭრეს და გაატარეს პიეზოელექტრულ აქტივატორთან დაკავშირებულ ბადეში. თავის ქალა გამოიკვეთა და გაიწმინდა. თავის ქალაზე მიმაგრებულია უჟანგავი ფოლადის დამიწების ხრახნი. t-hCO-ს სამიზნედ ჩასატარებლად, მაგნიტურ-რეზონანსული ტომოგრაფიის სურათებიდან მივიღეთ სტერეოტაქსიური კოორდინატები. მაღალსიჩქარიანი ბურღით ჩაატარეთ წრიული კრანიოტომია (დაახლოებით 1 სმ დიამეტრის) t-hCO-ს ზემოთ. როგორც კი ძვალი მაქსიმალურად გათხელდება, მაგრამ მთელი ძვლის გაბურღვამდე, პინცეტის გამოყენებით ამოიღეთ დარჩენილი ხელუხლებელი მენჯის დისკი, რათა გამოავლინოს ქვეშ არსებული t-hCO. ინდივიდუალური უჯრედები ჩაიწერა 32-არხიანი ან 64-არხიანი მაღალი სიმკვრივის სილიკონის ზონდების (Cambridge Neurotech) გამოყენებით, რომლებიც დამიწებული იყო დამიწების ხრახნებზე და წინასწარ გაძლიერებული იყო RHD გამაძლიერებლებით (Intan). მანიპულატორის გამოყენებით, ელექტროდები ჩავდეთ სამიზნე ადგილას კრანიოტომიის მეშვეობით, რომელიც სავსეა სტერილური ფიზიოლოგიური ხსნარით. მონაცემების შეგროვება განხორციელდა 30 kHz სიხშირით Open Ephys მონაცემთა შეგროვების სისტემის გამოყენებით. ჩაწერა გაგრძელდა მხოლოდ მაშინ, როდესაც 10-ზე მეტ არხში აღმოვაჩინეთ მაღალკორელირებული რიტმული სპონტანური აქტივობა, რაც იმაზე მიუთითებს, რომ ელექტროდები განლაგებული იყო გრაფტში (ორფოტონიანი კალციუმის ვიზუალიზაციის მონაცემების საფუძველზე). მიღებული იქნა მოტორული აქტივობის 10-წუთიანი ფონური ჩანაწერი. t-hCO3-ის მოპირდაპირე მხარეს არსებული ულვაშები შემდეგ გადახრილი იქნა 50-ჯერ (2 მმ 20 ჰც-ზე, 2 წმ თითო წარმოდგენაზე) შემთხვევით დროს პიეზოელექტრული ამძრავით 20 წუთიანი ჩაწერის პერიოდის განმავლობაში. Arduino-სთვის MATLAB-ის მხარდაჭერის პაკეტის (MATLAB 2019b) გამოყენებით, გადახრის დროის კონტროლი მორგებული MATLAB კოდით. გამოიყენეთ TTL იმპულსები მოვლენების მონაცემთა შეგროვების პროგრამულ უზრუნველყოფასთან სინქრონიზაციისთვის.
ოპტიკური მარკირების ექსპერიმენტებისთვის, 200 µმ ​​ოპტიკური პატჩ კაბელი (Doric), რომელიც დაკავშირებული იყო 473 ნმ ლაზერთან (Omicron), დაკავშირებული იყო კრანიოტომიის თავზე განთავსებულ 200 µმ ​​ოპტიკურ ბოჭკოსთან. ამის წინ, ჯუმპერის სიმძლავრე დაარეგულირეთ 20 მვტ-მდე. მანიპულატორის გამოყენებით, კრანიოტომიის გავლით, რომელიც სავსეა სტერილური ფიზიოლოგიური ხსნარით, ელექტროდები სამიზნე ადგილას ჩაუშვით. ჩაწერის დასაწყისში გამოსხივდა 473 ნმ სინათლის ათი იმპულსი (სიხშირე 2 ჰც, იმპულსის ხანგრძლივობა 10 ms). ფოტომგრძნობიარე უჯრედები განისაზღვრა, როგორც უჯრედები, რომლებმაც ცდების 70%-ში ან მეტში სინათლის 10 ms-ის ფარგლებში პიკური რეაქცია გამოავლინეს.