Terima kasih kerana melawat Nature.com. Anda menggunakan versi penyemak imbas dengan sokongan CSS terhad. Untuk pengalaman terbaik, kami mengesyorkan agar anda menggunakan penyemak imbas yang dikemas kini (atau lumpuhkan Mod Keserasian dalam Internet Explorer). Di samping itu, untuk memastikan sokongan berterusan, kami menunjukkan tapak tanpa gaya dan JavaScript.
Memaparkan karusel tiga slaid serentak. Gunakan butang Sebelum dan Seterusnya untuk bergerak melalui tiga slaid pada satu masa, atau gunakan butang gelangsar pada penghujung untuk bergerak melalui tiga slaid pada satu masa.
Organel neural pemasangan sendiri mewakili platform in vitro yang menjanjikan untuk memodelkan pembangunan dan penyakit manusia. Walau bagaimanapun, organoid tidak mempunyai ketersambungan yang wujud dalam vivo, yang mengehadkan kematangan dan menghalang penyepaduan dengan litar lain yang mengawal tingkah laku. Di sini kami menunjukkan bahawa organoid kortikal yang berasal dari sel stem manusia yang dipindahkan ke dalam korteks somatosensori tikus bogel neonatal membangunkan jenis sel matang yang berintegrasi ke dalam litar berkaitan deria dan motivasi. MRI mendedahkan pertumbuhan organoid selepas pemindahan dalam beberapa garisan sel stem dan haiwan, manakala analisis teras tunggal mendedahkan perkembangan kortiogenesis dan kemunculan program transkripsi yang bergantung kepada aktiviti. Sesungguhnya, neuron kortikal yang dipindahkan mempamerkan sifat morfologi, sinaptik dan membran dalaman yang lebih kompleks daripada rakan in vitro mereka, membolehkan pengesanan kecacatan neuron pada pesakit dengan sindrom Timothy. Pengesanan anatomi dan fungsi telah menunjukkan bahawa organel yang dipindahkan menerima input thalamocortical dan corticocortical, dan rakaman dalam vivo aktiviti saraf menunjukkan bahawa input ini boleh menjana tindak balas deria dalam sel manusia. Akhirnya, organoid kortikal memanjangkan akson ke seluruh otak tikus, dan pengaktifan optogenetik mereka membawa kepada tingkah laku mencari ganjaran. Oleh itu, neuron korteks manusia yang dipindahkan matang dan mengambil bahagian dalam litar hos yang mengawal tingkah laku. Kami mengharapkan pendekatan ini memudahkan pengesanan fenotip peringkat helai dalam sel yang diperolehi pesakit yang tidak dapat dikesan dengan cara lain.
Otak manusia yang sedang berkembang ialah proses penyusunan diri yang luar biasa di mana sel-sel membiak, membezakan, berhijrah, dan bersambung untuk membentuk litar neuron berfungsi yang diperhalusi lagi melalui pengalaman deria. Masalah utama dalam memahami perkembangan otak manusia, terutamanya dalam konteks penyakit, adalah kekurangan akses kepada tisu otak. Organel penyusun sendiri, termasuk organoid korteks manusia (hCO; juga dikenali sebagai sfera korteks manusia), boleh menjana 2,3,4,5,6. Walau bagaimanapun, beberapa batasan mengehadkan aplikasinya yang lebih luas untuk memahami pembangunan dan fungsi litar saraf. Khususnya, tidak jelas sama ada kematangan hCO dihadkan oleh ketiadaan input persekitaran mikro dan deria tertentu yang terdapat dalam vivo. Di samping itu, kerana hCO tidak disepadukan ke dalam litar yang boleh menjana hasil tingkah laku, utiliti mereka dalam memodelkan gangguan neuropsikiatri genetik dan tingkah laku yang kompleks pada masa ini adalah terhad.
Pemindahan hCO ke dalam otak hidup yang utuh boleh mengatasi batasan ini. Kajian terdahulu telah menunjukkan bahawa neuron manusia yang dipindahkan ke dalam korteks tikus dapat bertahan, memproyeksikan, dan berkomunikasi dengan sel tikus7,8,9,10,11,12. Walau bagaimanapun, eksperimen ini biasanya dilakukan pada haiwan dewasa, yang mungkin mengehadkan integrasi sinaptik dan akson. Di sini, kami menerangkan paradigma pemindahan di mana kami memindahkan 3D hCO yang diperoleh daripada sel hiPS ke dalam korteks somatosensori primer (S1) tikus immunodeficient pada peringkat awal pembangunan plastik. Neuron hCO (t-hCO) yang dipindahkan mengalami kematangan yang besar, menerima input thalamocortical dan kortikal-kortikal yang menimbulkan tindak balas deria, dan memanjangkan unjuran akson ke dalam otak tikus untuk memacu tingkah laku mencari ganjaran. Pematangan lanjutan t-hCO telah mendedahkan kecacatan neuron pada pesakit dengan sindrom Timothy (TS), gangguan genetik yang teruk yang disebabkan oleh mutasi dalam saluran kalsium CaV1.2 jenis sensitif voltan (dikodkan oleh CACNA1C).
Untuk mengkaji neuron kortikal manusia dalam litar dalam vivo, kami secara stereotaktik memindahkan hCO 3D utuh ke dalam S1 tikus athymic awal selepas bersalin (hari 3-7 selepas bersalin) (Rajah 1a dan data berkembang Rajah 1a-c). Pada ketika ini, unjuran akson thalamocortical dan corticocortical belum lagi melengkapkan pemuliharaan S1 mereka (rujuk 13). Oleh itu, pendekatan ini direka bentuk untuk memaksimumkan integrasi t-hCO sambil meminimumkan kesan ke atas litar endogen. Untuk menggambarkan lokasi t-hCO dalam haiwan hidup, kami melakukan pembinaan semula otak MRI berwajaran T2 bagi tikus 2-3 bulan selepas pemindahan (Rajah 1b dan data lanjutan, Rajah 1d). t-hCO mudah diperhatikan dan ukuran isipadu t-hCO adalah serupa dengan yang dikira daripada kepingan tetap (Data Lanjutan Rajah 1d,e; P > 0.05). t-hCO mudah diperhatikan dan ukuran isipadu t-hCO adalah serupa dengan yang dikira daripada kepingan tetap (Data Lanjutan Rajah 1d,e; P > 0.05). t-hCO легко наблюдались, а объемные измерения t-hCO были аналогичны рассчитанным для фиксированных срезов (рассид,риных срезов) 1d, e; P> 0,05). t-hCO mudah diperhatikan, dan ukuran t-hCO isipadu adalah serupa dengan yang dikira untuk bahagian tetap (data dikembangkan, Rajah 1d, e; P > 0.05).很容易观察到t-hCO，并且t-hCO的体积测量值与从固定切片计算的测量值相似（扩展数据图1h,e；P > 0.05）。很容易观察到t-hCO，并且t-hCO t-hCO легко наблюдался, а объемные измерения t-hCO были аналогичны рассчитанным для фиксированных срезов (рассид,риных срезов) 1d, e; P> 0,05). t-hCO mudah diperhatikan, dan ukuran t-hCO isipadu adalah serupa dengan yang dikira untuk bahagian tetap (data dikembangkan, Rajah 1d, e; P > 0.05).Kami menentukan t-hCO dalam 81% haiwan yang dipindahkan kira-kira 2 bulan selepas pemindahan (n = 72 haiwan; hCO daripada 10 garisan sel hiPS; garisan sel hiPS dalam Jadual Tambahan 1). Daripada jumlah ini, 87% terletak di korteks serebrum (Rajah 1c). Dengan melakukan imbasan MRI bersiri pada beberapa titik masa dalam tikus yang dipindahkan yang sama, kami mendapati peningkatan sembilan kali ganda dalam volum t-hCO dalam tempoh 3 bulan (Rajah 1d dan data yang diperluas, Rajah 1f). Haiwan yang dipindahkan mempunyai kadar kelangsungan hidup yang tinggi (74%) pada 12 bulan selepas pemindahan (data berkembang, Rajah 1g dan Jadual Tambahan 2), dan tiada gangguan motor atau ingatan yang terang-terangan, gliosis, atau electroencephalogram (EEG) ditemui. Data Rajah 1g dan jadual tambahan 2). 1h–m dan 3e).
a, Skema reka bentuk eksperimen. hCO yang diperoleh daripada sel hiPS telah dipindahkan ke dalam S1 tikus bogel yang baru lahir pada hari 30-60 pembezaan. b, imej MRI koronal dan mendatar berwajaran T2 menunjukkan t-hCO dalam S1 2 bulan selepas pemindahan. Bar skala, 2 mm. c, Kuantifikasi kadar kejayaan engraftment ditunjukkan untuk setiap baris sel hiPS (n = 108, nombor dalam bar menunjukkan jumlah t-hCO setiap baris sel hIPS) dan lokasi kortikal atau subkortikal (n = 88). d, imej MRI arteri koronari (kiri; bar skala, 3 mm) dan pembinaan semula isipadu 3D yang sepadan (bar skala, 3 mm) menunjukkan peningkatan dalam t-hCO dalam tempoh 3 bulan. e, Kajian semula corak t-hCO dalam korteks serebrum tikus. Bar skala, 1 mm. f, Imej imunositokimia perwakilan t-hCO ditunjukkan dari kiri atas ke kanan (semasa pembezaan): PPP1R17 (4 bulan), NeuN (8 bulan), SOX9 dan GFAP (8 bulan), PDGFRα; (8 bulan), MAP2 (8 bulan) dan IBA1 (8 bulan). Bar skala, 20 µm. Ungkapan bersama HNA menunjukkan sel asal manusia. g, snRNA-seq: Pengimejan pengurangan dimensi manifold dan unjuran bersatu (UMAP) bagi semua nukleus t-hCO berkualiti tinggi selepas penyepaduan Seurat (n=3 sampel t-hCO, n=2 garisan sel hiPS). Astrocytes, sel-sel garis astrocyte; cyc prog, progenitor yang beredar; GluN DL, neuron glutamatergik dalam; GluN DL/SP, neuron glutamatergik dalam dan sublamellar; GluN UL, neuron glutamatergik lapisan atas; oligodendrocytes, oligodendrocytes; OPC, sel progenitor oligodendrocyte; RELN, neuron reelin. h, analisis pengayaan istilah Gene Ontology (GO) gen dikawal dengan ketara (dilaraskan P <0.05, perubahan lipatan> 2, dinyatakan dalam sekurang-kurangnya 10% nukleus) dalam neuron glutamatergik t-hCO berbanding dengan neuron glutamatergik hCO. h, analisis pengayaan istilah Gene Ontology (GO) gen dikawal dengan ketara (dilaraskan P <0.05, perubahan lipatan> 2, dinyatakan dalam sekurang-kurangnya 10% nukleus) dalam neuron glutamatergik t-hCO berbanding dengan neuron glutamatergik hCO. h, Анализ обогащения терминов Gene Ontology (GO) для генов со значительной активацией (скорректированный P <0,05, кратмость ия экспрессия по крайней мере в 10% ядер) в глутаматергических нейронах t-hCO по сравнению с глутаматергических нейронах t-hCO по сравнению с глутаматергическиром . h, analisis pengayaan istilah Gene Ontology (GO) untuk gen dengan pengaktifan yang ketara (dilaraskan P<0.05, perubahan lipatan>2, ekspresi dalam sekurang-kurangnya 10% nukleus) dalam neuron glutamatergik t-hCO berbanding dengan neuron glutamatergik hCO. h，与hCO 谷氨酸能神经元相比，t-hCO 谷氨酸能神经元中基因显着上调（调整后P ， 0.后P 2，在至少10% 的细胞核中表达）的基因本体论(GO) 术语富集分析。 h ， 与 hco 谷氨酸 能 元 相比 ， t-hco 谷氨酸 能 神经 元 基因 显着 上调 （后 后 后 .变化> 2 ， 至少 10% 的 核中 表达） 基因 基因 基因 的 的 的 。术语富集分析。 h, гены значительно активизировались (скорректированный P <0,05, кратность изменения> 2, экспрессируется по крайне в 1% глутаматергических нейронах t-hCO по сравнению с глутаматергическими нейронами hCO Онтологический (GO) аглиз тебяониа h, gen telah dikawal dengan ketara (dilaraskan P <0.05, perubahan kali ganda> 2, dinyatakan dalam sekurang-kurangnya 10% nukleus) dalam neuron glutamatergik t-hCO berbanding dengan neuron glutamatergik hCO Ontological (GO) analisis istilah pengayaan.Garis putus-putus menunjukkan nilai aq 0.05. i, pengimejan UMAP jenis sel GluN dalam t-hCO menggunakan pemindahan label daripada rujukan 22 set data korteks motor dewasa snRNA-seq. CT — sel kortikotalamik, ET — sel ekstraserebral, IT — sel telencephalic dalaman, NP — berhampiran unjuran.
Kami kemudian menilai cytoarchitecture dan komposisi selular keseluruhan t-hCO. Pewarnaan antibodi sel endothelial tikus mendedahkan vaskularisasi dengan t-hCO, manakala pewarnaan IBA1 mendedahkan kehadiran mikroglia tikus sepanjang cantuman (Rajah 1f dan data berkembang, Rajah 3c, d). Imunostaining mendedahkan sel-sel positif antigen nuklear manusia (HNA) yang mengekspresikan bersama PPP1R17 (progenitor kortikal), NeuN (neuron), SOX9 dan GFAP (sel yang diperolehi glial) atau PDGFRα (progenitor oligodendrocyte) (Rajah 1f). Untuk mengkaji komposisi selular t-hCO pada resolusi sel tunggal, kami melakukan penjujukan RNA teras tunggal (snRNA-seq) selepas kira-kira 8 bulan pembezaan. Penapisan pukal dan penyingkiran nukleus tikus menghasilkan 21,500 peta mononuklear manusia berkualiti tinggi (Rajah 1g dan data yang diperluaskan, Rajah 4a, b). Corak ekspresi penanda jenis sel tipikal mengenal pasti kelompok kelas sel kortikal utama, termasuk neuron glutamatergik dalam dan cetek, progenitor yang beredar, oligodendrocytes, dan keturunan astrocyte (Rajah 1g, data berkembang, Rajah 4c, dan Jadual Tambahan 3). Imunostaining untuk SATB2 dan CTIP2 menunjukkan bahawa walaupun terdapat subtipe kortikal, t-hCO tidak menunjukkan stratifikasi anatomi yang jelas (data berkembang, Rajah 3a). snRNA-seq hCO dipadankan peringkat menghasilkan kelas sel yang hampir sama, dengan beberapa pengecualian, termasuk ketiadaan oligodendrocytes dan kehadiran neuron GABAergik, yang mungkin mencerminkan keadaan in vitro yang menguntungkan yang dilaporkan sebelum ini untuk sel progenitor sisi15 (data berkembang, Rajah 4f - i dan Jadual Tambahan 4). Analisis ekspresi gen pembezaan mendedahkan perbezaan ketara dalam neuron glutamatergik antara t-hCO dan hCO (Jadual Tambahan 5), termasuk pengaktifan set gen yang dikaitkan dengan kematangan neuron seperti isyarat sinaptik, penyetempatan dendritik, dan aktiviti saluran berpagar voltan (Rajah 1h dan Jadual Tambahan 5). jadual 6). Oleh itu, neuron t-hCO glutamatergik kortikal mempamerkan kematangan transkrip yang dipercepatkan.
Untuk menjelaskan sama ada perubahan transkrip dalam t-hCO ini berkaitan dengan perbezaan morfologi antara hCO in vitro dan t-hCO dalam vivo, kami membina semula hCO dan hCO yang dipenuhi biocytin yang dipadankan peringkat dalam bahagian akut selepas 7-8 bulan pembezaan. neuron hCO (Rajah 2a). Neuron t-hCO adalah lebih besar dengan ketara, mempunyai 1.5 kali diameter soma, dua kali lebih banyak dendrit, dan peningkatan keseluruhan enam kali ganda dalam jumlah panjang dendritik berbanding dengan hCO in vitro (Rajah 2b). Di samping itu, kami memerhatikan ketumpatan duri dendritik yang jauh lebih tinggi dalam neuron t-hCO berbanding neuron hCO (Rajah 2c). Ini menunjukkan bahawa neuron t-hCO mengalami pemanjangan dan percabangan dendritik yang meluas, yang, dalam kombinasi dengan percambahan sel yang berterusan, boleh menyumbang kepada pertumbuhan intensif t-hCO selepas pemindahan (Rajah 1d dan Data Lanjutan Rajah 1f). Ini mendorong kami untuk menyiasat sifat elektrofisiologi. Kapasiti membran adalah lapan kali lebih tinggi (data berkembang, Rajah 8d), potensi membran keadaan rehat adalah lebih hiperpolarisasi (kira-kira 20 mV), dan suntikan arus mendorong kadar pengujaan maksimum yang lebih tinggi dalam neuron t-hCO berbanding neuron hCO. in vitro (Rajah 2d), e), yang konsisten dengan ciri morfologi t-hCO yang lebih besar dan lebih kompleks. Di samping itu, kekerapan kejadian semasa pascasinaptik rangsangan spontan (EPSC) adalah lebih tinggi dengan ketara dalam neuron t-hCO (Rajah 2f), menunjukkan bahawa peningkatan ketumpatan duri dendritik yang diperhatikan dalam neuron t-hCO dikaitkan dengan keceriaan berfungsi. sinaps seksual. Kami mengesahkan watak tidak matang neuron hCO secara in vitro dengan merekodkan neuron glutamatergik berlabel (data dikembangkan, Rajah 6a-c).
a, pembinaan semula 3D neuron hCO dan t-hCO yang dipenuhi biocytin selepas 8 bulan pembezaan. b, Kuantifikasi ciri morfologi (n = 8 neuron hCO, n = 6 neuron t-hCO; **P = 0.0084, *P = 0.0179 dan ***P <0.0001). b, Kuantifikasi ciri morfologi (n = 8 neuron hCO, n = 6 neuron t-hCO; **P = 0.0084, *P = 0.0179 dan ***P <0.0001). б, количественная оценка морфологических признаков (n = 8 нейронов hCO, n = 6 нейронов t-hCO; ** P = 0,0084, * P = 0,01). b, kuantifikasi ciri morfologi (n=8 neuron hCO, n=6 neuron t-hCO; ** P=0.0084, * P=0.0179, dan *** P<0.0001). b，形态学特征的量化（n = 8 个hCO 神经元，n = 6 个t-hCO 神经元；**P = 0.0084，*P = 0.0179 。 0.0179 。 b，形态学特征的量化（n = 8 个hCO 神经元，n = 6 个t-hCO 神经元；**P = 0.0084，*P = 0.0179 。 0.0179 。 б, количественная оценка морфологических признаков (n = 8 нейронов hCO, n = 6 нейронов t-hCO; ** P = 0,0084, * P = 0,01). b, kuantifikasi ciri morfologi (n=8 neuron hCO, n=6 neuron t-hCO; ** P=0.0084, * P=0.0179, dan *** P<0.0001).c, pembinaan semula 3D cawangan dendritik hCO dan t-hCO selepas 8 bulan pembezaan. Asterisk merah menunjukkan duri dendritik yang diduga. Kuantifikasi ketumpatan tulang belakang dendritik (n = 8 neuron hCO, n = 6 neuron t-hCO; **P = 0.0092). d, Kuantifikasi potensi membran rehat (n = 25 neuron hCO, n = 16 neuron t-hCO; *** P <0.0001). d, Kuantifikasi potensi membran rehat (n = 25 neuron hCO, n = 16 neuron t-hCO; *** P <0.0001). d, количественная оценка мембранного потенциала покоя (n = 25 нейронов hCO, n = 16 нейронов t-hCO; *** P <0,0001). d, kuantifikasi potensi membran berehat (n = 25 neuron hCO, n = 16 neuron t-hCO; *** P <0.0001). d，静息膜电位的量化（n = 25 hCO 神经元，n = 16 t-hCO 神经元；***P < 0.0001）。 d，静息膜电位的量化（n = 25 hCO 神经元，n = 16 t-hCO 神经元；***P < 0.0001）。 d, количественная оценка мембранного потенциала покоя (n = 25 нейронов hCO, n = 16 нейронов t-hCO; *** P <0,0001). d, kuantifikasi potensi membran berehat (n = 25 neuron hCO, n = 16 neuron t-hCO; *** P <0.0001). e, Penembakan potensi tindakan berulang dalam hCO dan t-hCO disebabkan oleh peningkatan suntikan semasa, dan kuantifikasi kadar tembakan maksimum (n = 25 neuron hCO, n = 16 neuron t-hCO; *** P <0.0001). e, Penembakan potensi tindakan berulang dalam hCO dan t-hCO disebabkan oleh peningkatan suntikan semasa, dan kuantifikasi kadar tembakan maksimum (n = 25 neuron hCO, n = 16 neuron t-hCO; *** P <0.0001). e, повторное возбуждение потенциала действия di hCO dan t-hCO, вызванное увеличением тока, dan количественная оценка слоксистом возбуждения (n = 25 нейронов hCO, n = 16 нейронов t-hCO; *** P <0,0001). e, penembakan semula potensi tindakan dalam hCO dan t-hCO disebabkan oleh peningkatan semasa dan kuantifikasi kadar tembakan maksimum (n = 25 neuron hCO, n = 16 neuron t-hCO; *** P <0.0001). e，通过增加电流注入诱导的hCO 和t-hCO 重复动作电位放电，以及最大放电率的量化 = 5 COn神经元，n = 16 个t-hCO 神经元；***P < 0.0001）。 E ， 通过 增加 电流 注入 的 的 hco 和 t-hco 重复 电位 放电 ， 以及 最 大 的 量化 （（n5 （n ， n = 16 个 t-hco 神经 ； *** p <0.0001） 。 e, повторяющееся возбуждение потенциала действия hCO dan t-hCO, вызванное увеличением подачи тока, dan количественка млаки скорости возбуждения (n = 25 нейронов hCO, n = 16 нейронов t-hCO; *** P <0,0001). e, penembakan berulang bagi potensi tindakan hCO dan t-hCO disebabkan oleh peningkatan bekalan arus dan kuantifikasi kadar tembakan maksimum (n = 25 neuron hCO, n = 16 neuron t-hCO; *** P <0.0001). f, EPSC spontan (sEPSCs) dalam neuron hCO dan t-hCO pada 8 bulan pembezaan, dan kuantifikasi kekerapan kejadian sinaptik (n = 25 neuron hCO, n = 17 neuron t-hCO; *** P <0.0001). f, EPSC spontan (sEPSCs) dalam neuron hCO dan t-hCO pada 8 bulan pembezaan, dan kuantifikasi kekerapan kejadian sinaptik (n = 25 neuron hCO, n = 17 neuron t-hCO; *** P <0.0001). f, спонтанные EPSC (sEPSC) dalam нейронах hCO dan t-hCO через 8 месяцев дифференцировки dan количественная оценка частотыч синтич = 5 нейронов hCO, n = 17 нейронов t-hCO; *** P <0,0001) . f, EPSC spontan (sEPSCs) dalam neuron hCO dan t-hCO pada 8 bulan pembezaan dan kuantifikasi kadar peristiwa sinaptik (n=25 neuron hCO, n=17 neuron t-hCO; *** P <0.0001). f，分化8 个月时hCO 和t-hCO 神经元中的自发性EPSCs (sEPSCs)，以及突触事件频率的量化（n CO = 化（n 的量化（n 17 t-hCO 神经元；***P < 0.0001） . f，分化8 个月时hCO 和t-hCO 神经元中的自发性EPSCs (sEPSCs)，以及突触事件频率的量匼（n CO = 2（n神率的量匼（n = 25 hCO 神率的量匼（n = 25hCO P < 0.0001） . f, спонтанные EPSC (sEPSC) dalam нейронах hCO dan t-hCO через 8 месяцев дифференцировки dan количественная оценка частотыч синтич = 5 нейронов hCO, n = 17 нейронов t-hCO; f, EPSC spontan (sEPSCs) dalam neuron hCO dan t-hCO pada 8 bulan pembezaan dan kuantifikasi kadar peristiwa sinaptik (n = 25 neuron hCO, n = 17 neuron t-hCO; *** P<0.0001).Untuk bf, hCO dan t-hCO dalam baris 1208-2 telah diambil daripada kumpulan pembezaan yang sama yang dikekalkan secara selari. g, analisis pengayaan set gen (ujian tepat Fisher satu sisi) gen dikawal dengan ketara (diselaraskan P <0.05, perubahan lipatan > 2, dinyatakan dalam sekurang-kurangnya 10% nukleus) dalam neuron glutamatergik t-hCO berbanding dengan hCO glutamatergik dengan set gen kedua-dua neuron tindak balas awal (ERG) yang dikenal pasti (bergantung kepada aktiviti viG) dan gen yang dikenal pasti lewat (ERG) dan gen tindak balas awal (ERG) yang dikenal pasti. kajian tetikus16 dan LRG khusus manusia daripada neuron in vitro17. g, analisis pengayaan set gen (ujian tepat Fisher satu sisi) gen dikawal dengan ketara (diselaraskan P <0.05, perubahan lipatan > 2, dinyatakan dalam sekurang-kurangnya 10% nukleus) dalam neuron glutamatergik t-hCO berbanding dengan hCO glutamatergik dengan set gen kedua-dua neuron tindak balas awal (ERG) yang dikenal pasti (bergantung kepada aktiviti viG) dan gen yang dikenal pasti lewat (ERG) dan gen tindak balas awal (ERG) yang dikenal pasti. kajian tetikus16 dan LRG khusus manusia daripada neuron in vitro17. g, анализ обогащения набора генов (односторонний точный критерий Фишера) генов со значительной активацией (скорй0, ректирой) изменения > 2, экспрессия по меньшей мере в 10% ядер) в глутаматергических нейронах t-hCO по сравнению стеримича стеримичам hCO наборы генов как раннего (ERG), так и позднего (LRG) генов, зависящих от активности, идентифицированных в иванных в иванных в иснисла в иснисла и специфических для человека LRG из нейронов in vitro17. g, analisis pengayaan set gen (ujian tepat Fisher satu ekor) gen dengan pengaktifan yang ketara (diselaraskan P<0.05, perubahan lipatan>2, ekspresi dalam sekurang-kurangnya 10% nukleus) dalam neuron glutamatergik t-hCO berbanding set neuron glutamatergik hCO bagi kedua-dua aktiviti awal (ERG) dan gen (LRG) yang dikenal pasti dalam aktiviti bergantung kepada manusia (LRG) lewat (LRG) yang dikenal pasti lewat. LRG daripada neuron secara in vitro17. g，t-hCO谷氨酸能神经元与hCO谷氨酸能神经元相比，t -hCO谷氨酸能神经元显着上调（调整后P<0.05，倍数变化>2，在至少10%的细胞核中表达）的基因集富集分析（单侧F isher精确检验）从体内小鼠研究中鉴定的早期反应(ERG)和晚期反应(LRG) 活性依赖性基因的基因组16 和体外神经元17 中的人类特异性LRG。 g ， t-hco 谷氨酸 神经 元 与 hco 谷氨酸 神经 元 相比 ， t-hco 谷氨酸 神经 元 上调 元 上调 5 p. ， 倍数> 2 ， 至少 至少 10%的 细胞 核中 表达） 的 集富集 分析 （单侧 fisher 精确）研究 中 的 早期 反应 反应 反应 和 晚期 反应 反应 (lrg) 活性 基因 的 基应 和 晚期 反应 反应 (lrg) 活性 基因 的 基因 的 基因 璌 16神经元 17 中 中 17 中 17的人类特异性LRG。 g, глутаматергические нейроны t-hCO были значительно активизированы по сравнению с глутаматергическими нейсронами hCO P<0,05, кратность изменения> 2, не менее 10% Анализ обогащения набора генов (односторонний точный тест Фишетра) ран позднего гены, зависящие от активности ответа (LRG), идентифицированные в исследованиях на мышах in vivo16 dan in vivo16 и нейрисч для человека. g, neuron glutamatergik t-hCO telah dikawal dengan ketara berbanding dengan neuron glutamatergik hCO (dilaraskan P<0.05, perubahan lipatan >2, sekurang-kurangnya 10% Tindak balas awal (ERG) dan analisis pengayaan gen tindak balas lewat (ujian tepat Fisher satu ekor) gen bergantung aktiviti tindak balas (LRGs) yang dikenal pasti secara in vivo dan neuron LRG spesifik in vivo16 manusia.Garis putus-putus menunjukkan nilai P dibetulkan Bonferroni sebanyak 0.05. h, ekspresi gen GluN (pakej pseudo dan penskalaan setiap gen) dikawal dengan ketara dalam replika snRNA-seq gen LRG dalam neuron glutamatergik t-hCO. i, immunostaining menunjukkan ekspresi SCG2 dalam neuron t-hCO (atas) dan hCO (bawah). Anak panah putih menghala ke sel SCG2+. Bar skala, 25 µm. Data dinyatakan sebagai min ± sisihan piawai.
Berdasarkan peningkatan aktiviti t-hCO yang diperhatikan dalam kepingan ex vivo, snRNA-seq mendedahkan pengawalseliaan transkrip gen yang bergantung kepada aktiviti dalam t-hCO berbanding dengan hCO in vitro. Neuron t-hCO glutamatergik menyatakan tahap gen yang lebih tinggi yang mengawal aktiviti tindak balas lewat (Rajah 2g, h), yang ditemui dalam kajian terdahulu dalam neuron tikus dan manusia16,17. Sebagai contoh, BDNF18, SCG2, dan OSTN, gen pengawal selia aktiviti khusus primat, menunjukkan peningkatan ekspresi dalam neuron t-hCO berbanding neuron hCO (Rajah 2g-i). Oleh itu, neuron t-hCO mempamerkan ciri kematangan yang dipertingkatkan berbanding dengan neuron hCO melalui analisis transkrip, morfologi, dan fungsi.
Untuk menilai lebih lanjut perkaitan kematangan t-hCO dengan perkembangan otak manusia, kami melakukan perbandingan transkriptomi jenis sel kortikal janin dan dewasa19,20 dan dewasa21,22 serta data yang luas mengenai ekspresi gen kortikal23 semasa pembangunan (data diperluas, Rajah 5). ). dengan kerja sebelumnya 24, status pematangan transkriptom hCO dan t-hCO global pada 7-8 bulan pembezaan secara umumnya konsisten dengan masa pembangunan in vivo dan paling bersamaan dengan hayat janin lewat (Data Lanjutan Rajah 5a). Terutama, kami memerhatikan peningkatan kematangan transkriptom dalam t-hCO berbanding dengan hCO yang dipadankan dengan umur, serta pengaktifan transkrip yang dikaitkan dengan sinaptogenesis, astrogenesis, dan mielinasi (data berkembang, Rajah 5b-d). Di peringkat selular, kami mendapati bukti subtipe korteks yang lebih nipis dalam t-hCO, dengan kelompok neuron glutamatergik bertindih dengan subtipe neuron L2/3, L5, dan L6 dewasa (Rajah 1i). Sebaliknya, pertindihan kelompok antara neuron t-hCO glutamatergik dan neuron kortikal janin lebih terhad pada pertengahan kehamilan (data yang diperluas, Rajah 5e-j). Untuk menentukan sama ada neuron t-hCO berfungsi sama dengan neuron neokortikal selepas bersalin manusia, kami melakukan rakaman elektrofisiologi dan pembinaan semula anatomi neuron piramid L2/3 manusia dalam bahagian tajam korteks selepas bersalin manusia (data yang diperluas, Rajah 7a). Sifat elektrofisiologi neuron piramid L2/3 adalah serupa dengan neuron piramid t-hCO (data berkembang, Rajah 7e). Dari segi morfologi, neuron L2/3 daripada sampel manusia selepas bersalin lebih serupa dengan t-hCO berbanding dengan hCO, walaupun sel L2/3 lebih panjang, mengandungi lebih banyak cawangan secara keseluruhan, dan mempunyai ketumpatan tulang belakang yang lebih tinggi (Rajah 3g dan data yang diperluas, Rajah 7b-). G).
a, pemindahan hCO yang dihasilkan oleh kawalan dan garisan sel TS hiPS ke dalam tikus neonatal. b, pembinaan semula 3D neuron t-hCO yang dipenuhi biocytin selepas 8 bulan pembezaan. c, kuantifikasi min panjang dendritik (n = 19 neuron kawalan, n = 21 neuron TS; **P = 0.0041). d, cawangan dendritik yang dibina semula 3D daripada kawalan dan TS t-hCO pada 8 bulan pembezaan, dan kuantifikasi ketumpatan tulang belakang dendritik (n = 16 neuron kawalan, n = 21 neuron TS, *** P <0.0001). d, cawangan dendritik yang dibina semula 3D daripada kawalan dan TS t-hCO pada 8 bulan pembezaan, dan kuantifikasi ketumpatan tulang belakang dendritik (n = 16 neuron kawalan, n = 21 neuron TS, *** P <0.0001). d, 3D-реконструкция дендритных ветвей из контроля и TS t-hCO через 8 месяцев дифференцировки и количествентка столоция дендритных шипов (n = 16 контрольных нейронов, n = 21 TS нейронов, *** P <0,0001). d, pembinaan semula 3D cawangan dendritik daripada kawalan dan t-hCO TS pada 8 bulan pembezaan dan kuantifikasi ketumpatan tulang belakang dendritik (n=16 neuron kawalan, n=21 neuron TS, *** P<0.0001). d，分化8 个月时对照和TS t-hCO 的3D 重建树突分支，以及树突棘密度的量化（n = 16 个化（n = 16 个化21 个TS 神经元，***P < 0.0001）。 d ， 分化 8 个 时 对照 和 ts t-hco 的 3d 重建 分支 分支 以及 树突棘 密度 量化 （n 化 （n元 ， n = 21 个 ts 神经 ， *** p <0.0001 ）。 d, 3D-peringkat дендритных ветвей контроля dan TS t-hCO через 8 месяцев дендритных ветвей контроля и TS t-hCO через 8 месяцев дендритных ветвей контроля и TS t-hCO через 8 месяцев дифференцировки dan количественная отнхисти шипов (n = 16 контрольных нейронов, n = 21 TS нейронов, *** P <0,0001). d, pembinaan semula 3D cawangan dendritik kawalan dan TS t-hCO pada 8 bulan pembezaan dan kuantifikasi ketumpatan tulang belakang dendritik (n=16 neuron kawalan, n=21 neuron TS, *** P<0.0001).Asterisk merah menunjukkan duri dendritik yang diduga. e, EPSC spontan dalam kawalan dan neuron TS t-hCO selepas 8 bulan pembezaan. f, plot kekerapan terkumpul dan kuantifikasi kekerapan dan amplitud peristiwa sinaptik (n=32 neuron kawalan, n=26 neuron TS; **P=0.0076 dan P=0.8102). g, Analisis Scholl TS dan neuron kawalan dalam hCO dan t-hCO. Garis putus-putus menunjukkan neuron piramidal L2/3 selepas bersalin manusia untuk perbandingan (n = 24 mengawal neuron t-hCO, n = 21 neuron TS t-hCO, n = 8 mengawal neuron hCO, dan n = 7 neuron TS hCO). Data dinyatakan sebagai min ± sisihan piawai
Keupayaan t-hCO untuk meniru ciri morfologi dan fungsi neuron korteks manusia pada tahap yang tinggi mendorong kami untuk meneroka sama ada t-hCO boleh digunakan untuk mengesan fenotip penyakit. Kami memberi tumpuan kepada TS, gangguan perkembangan saraf yang teruk yang disebabkan oleh mutasi perolehan fungsi dalam pengekodan gen CaV1.2, yang memulakan transkripsi gen yang bergantung kepada aktiviti dalam neuron. Kami memperoleh hCO daripada tiga pesakit TS yang membawa penggantian yang paling biasa (p.G406R) dan tiga kawalan (Rajah 3a). Selepas pemindahan, kami mendapati bahawa morfologi dendritik telah diubah dalam neuron TS berbanding dengan kawalan (Rajah 3b dan data berkembang, Rajah 8a, b), dengan peningkatan dua kali ganda dalam bilangan dendrit primer dan peningkatan keseluruhan dalam min dan penurunan keseluruhan dalam panjang dendritik (Rajah 3c dan data lanjutan, Rajah 8c). Ini dikaitkan dengan peningkatan ketumpatan duri dan peningkatan kekerapan EPSC spontan dalam TS berbanding dengan neuron kawalan (Rajah 3d–f dan data yang diperluas, Rajah 8g). Analisis lanjut mendedahkan corak percabangan dendritik yang tidak normal dalam t-hCO TS berbanding dengan kawalan, tetapi tidak dalam in vitro TS hCO pada peringkat pembezaan yang serupa (Rajah 3g). Ini selaras dengan laporan terdahulu kami tentang pengecutan dendritik yang bergantung kepada aktiviti dalam TS dan menyerlahkan keupayaan platform pemindahan ini untuk mengesan fenotip penyakit dalam vivo.
Kami kemudian bertanya sejauh mana sel t-hCO diintegrasikan secara fungsional ke dalam tikus S1. S1 dalam tikus menerima input sinaptik yang kuat daripada basal ventral ipsilateral dan nukleus thalamic posterior, serta motor ipsilateral dan korteks somatosensori sekunder, dan kontralateral S1 (Rajah 4a). Untuk memulihkan corak innervation, kami menjangkiti hCO dengan virus rabies-dG-GFP/AAV-G dan memindahkan hCO ke dalam tikus S1 3 hari kemudian. Kami memerhatikan ekspresi GFP padat dalam neuron ipsilateral S1 dan ganglia basal ventral 7-14 hari selepas pemindahan (Rajah 4b, c). Di samping itu, pewarnaan antibodi penanda thalamic netrin G1 mendedahkan kehadiran hujung talamik dalam t-hCO (Rajah 4d, e). Untuk menilai sama ada unjuran aferen ini boleh menimbulkan tindak balas sinaptik dalam sel t-hCO, kami melakukan rakaman sel keseluruhan dari sel manusia di bahagian tajam lapisan thalamocortical. Rangsangan elektrik tikus S1, kapsul dalaman, bahan putih, gentian berhampiran t-hCO atau pengaktifan optogenetik pengakhiran thalamic ekspresin opsin dalam EPSC kependaman pendek yang disebabkan oleh t-hCO dalam neuron t-hCO yang terdedah kepada antagonis reseptor AMPA NBQX. (Rajah 4f, g dan data lanjutan, Rajah 9a–g). Data ini menunjukkan bahawa t-hCO diintegrasikan secara anatomi ke dalam otak tikus dan dapat diaktifkan oleh tisu tuan rumah tikus.
a, Gambarajah skematik eksperimen pengesanan rabies. b, GFP dan ekspresi STEM121 khusus manusia antara t-hCO dan korteks serebrum tikus (panel atas). Juga ditunjukkan ialah ekspresi GFP dalam nukleus basal ventral ipsilateral tikus (VB) (kiri bawah) dan S1 ipsilateral (kanan bawah). Bar skala, 50 µm. Petak merah mewakili kawasan otak tempat imej diambil. c, kuantifikasi sel yang menyatakan GFP (n = 4 tikus). d, e — Terminal thalamic Netrin G1+ dalam t-hCO. d menunjukkan bahagian koronal yang mengandungi nukleus t-hCO dan VB. Bar skala, 2 mm. e menunjukkan ekspresi Netrin G1 dan STEM121 dalam neuron t-hCO (kiri) dan VB (kanan). Bar skala, 50 µm. Garis putus-putus oren menunjukkan sempadan t-hCO. f, g, Kesan semasa neuron t-hCO selepas rangsangan elektrik dalam tikus S1 (f) atau kapsul dalaman (g), dengan (ungu) atau tanpa (hitam) NBQX (kiri). Amplitud EPSC dengan dan tanpa NBQX (n = 6 neuron S1, *P = 0.0119; dan n = 6 neuron kapsul dalaman, **P = 0.0022) (tengah). Peratusan neuron t-hCO menunjukkan EPSC sebagai tindak balas kepada rangsangan elektrik tikus S1 (f) atau kapsul dalaman (g) (kanan). aCSF, cecair serebrospinal tiruan. h, gambarajah skematik eksperimen pengimejan 2P (kiri). Ungkapan GCaMP6s dalam t-hCO (tengah). Bar skala, 100 µm. Selang masa pendarfluor GCaMP6s (kanan). i, Z-skor pendarfluor aktiviti spontan. j, ilustrasi skematik rangsangan misai. k, trajektori pendarfluor 2P skor z dalam satu percubaan, sejajar dengan sisihan misai pada masa sifar (garis putus-putus) dalam sel contoh. l, respons z-skor purata populasi bagi semua sel sejajar dengan sisihan misai pada masa sifar (garis putus-putus) (merah) atau cap masa yang dijana secara rawak (kelabu). m. Gambarajah skematik eksperimen pada penandaan optik. n, Lengkung voltan mentah daripada contoh sel t-hCO semasa rangsangan laser biru atau pesongan misai. Anak panah merah menunjukkan pancang pertama yang disebabkan oleh cahaya (atas) atau disebabkan oleh pesongan misai (bawah). Lorek kelabu menunjukkan tempoh pesongan misai. o, Bentuk gelombang cahaya puncak dan tindak balas pesongan misai. p, pancang percubaan tunggal, sejajar dengan sisihan misai dalam sel contoh. 0 menunjukkan sisihan misai (garis putus-putus). q, kadar penembakan skor z purata populasi untuk semua sel fotosensitif, sejajar dengan sisihan misai pada masa sifar (garis putus-putus) (merah) atau cap masa yang dijana secara rawak (kelabu). r, Perkadaran unit fotosensitif dimodulasi dengan ketara oleh sisihan kumis (n = 3 tikus) (kiri). Kependaman skor z puncak (n = 3 tikus; n = 5 (hijau muda), n = 4 (hijau gelap) dan n = 4 (cyan) unit modulasi pesongan misai setiap tikus) (kanan). Data dinyatakan sebagai min ± sisihan piawai
Kami kemudian bertanya sama ada t-hCO boleh diaktifkan oleh rangsangan deria dalam vivo. Kami memindahkan hCO yang menyatakan penunjuk kalsium yang dikodkan secara genetik GCaMP6 ke dalam tikus S1. Selepas 150 hari, kami melakukan fotometri gentian atau pengimejan kalsium dua foton (Rajah 4h dan data berkembang, Rajah 10a). Kami mendapati bahawa sel t-hCO mempamerkan aktiviti berirama yang disegerakkan (Rajah 4i, Data Dikembangkan, Rajah 10b dan Video Tambahan 1). Untuk mencirikan aktiviti t-hCO puncak, kami melakukan rakaman elektrofisiologi ekstraselular dalam tikus pemindahan bius (data berkembang, Rajah 10c-f). Kami telah menghasilkan koordinat stereotaksik daripada imej MRI; Oleh itu, unit yang direkodkan ini mewakili neuron manusia yang disangkal, walaupun elektrofisiologi sahaja tidak membenarkan spesies asal ditentukan. Kami memerhatikan letusan aktiviti yang disegerakkan (data dikembangkan, Rajah 10d). Letupan berlangsung kira-kira 460 ms dan dipisahkan oleh tempoh senyap kira-kira 2 s (data dikembangkan, Rajah 10d, e). Unit individu melepaskan purata kira-kira tiga pusingan setiap letusan, iaitu kira-kira 73% daripada unit berdaftar setiap letusan. Aktiviti unit individu sangat berkorelasi, dan korelasi ini lebih tinggi daripada unit yang dikenal pasti dalam haiwan yang tidak divaksinasi yang direkodkan dalam keadaan yang sama (data dikembangkan, Rajah 10f). Untuk mencirikan lagi tindak balas lonjakan neuron yang dikenal pasti yang diperolehi oleh manusia, kami melakukan eksperimen penandaan cahaya pada tikus yang telah dibius yang dipindahkan dengan hCO yang menyatakan saluran kation sensitif cahaya rhodopsin 2 (hChR2), yang melaluinya neuron t-hCO pengecaman kependaman pendek (kurang daripada 10 ms) sebagai tindak balas kepada rangsangan cahaya biru (Fiog. 4im-Fig). Neuron t-hCO mempamerkan letusan aktiviti spontan pada frekuensi yang serupa dengan yang diperhatikan dalam pengimejan kalsium, serta rakaman elektrofisiologi yang dilakukan dalam t-hCO tanpa ketiadaan penandaan cahaya (data berkembang, Rajah 10c-g). Tiada aktiviti spontan diperhatikan dalam peringkat hCO yang sepadan yang direkodkan secara in vitro. Untuk menilai sama ada t-hCO boleh diaktifkan oleh rangsangan deria, kami secara ringkas memesongkan misai tikus daripada t-hCO (Rajah 4j, m dan data lanjutan, Rajah 10h, k). Menurut kajian terdahulu8,10, subset sel t-hCO menunjukkan peningkatan aktiviti sebagai tindak balas kepada pesongan misai, yang tidak diperhatikan apabila data dibandingkan dengan setem masa rawak (Rajah 4k–q dan data berkembang, Rajah 10h–q). Malah, kira-kira 54% daripada unit tunggal berlabel opto menunjukkan kadar rangsangan yang meningkat dengan ketara selepas rangsangan misai, memuncak pada kira-kira 650 ms (Rajah 4r). Diambil bersama, data ini mencadangkan bahawa t-hCO menerima input berfungsi yang sesuai dan boleh diaktifkan oleh rangsangan persekitaran.
Kami kemudian menyiasat sama ada t-hCO boleh mengaktifkan litar dalam tikus untuk mengawal tingkah laku. Kami mula-mula menyiasat sama ada akson neuron t-hCO projek ke dalam tisu sekeliling tikus. Kami menjangkiti hCO dengan pengekodan lentivirus hChR2 yang digabungkan dengan EYFP (hChR2-EYFP). Selepas 110 hari, kami memerhatikan ekspresi EYFP di kawasan kortikal ipsilateral, termasuk korteks pendengaran, motor, dan somatosensori, serta di kawasan subkortikal, termasuk striatum, hippocampus, dan talamus (Rajah 5a). Untuk menilai sama ada unjuran eferen ini boleh menimbulkan tindak balas sinaptik dalam sel tikus, kami secara optik mengaktifkan sel t-hCO yang menyatakan hChR2-EYFP dengan merekodkan sel korteks serebrum tikus dalam bahagian otak yang tajam. Pengaktifan akson t-hCO dengan EPSC kependaman pendek disebabkan cahaya biru dalam neuron korteks piramid tikus, yang disekat oleh NBQX (Rajah 5b–g). Di samping itu, tindak balas ini boleh disekat oleh tetrodotoxin (TTX) dan dipulihkan oleh 4-aminopyridine (4-AP), menunjukkan bahawa ia disebabkan oleh sambungan monosynaptic (Rajah 5e).
a, Gambarajah skematik penjejakan akson (kiri). Ekspresi t-hCO EYFP (kanan). Bar skala, 100 µm. A1, korteks pendengaran, ACC, korteks cingulate anterior, d. striatum, striatum dorsal, HPC, hippocampus; Diafragma, septum sisi, mPFC, korteks prefrontal medial, piri, korteks piriform, v. striatum, striatum ventral, VPM, nukleus ventropostomedial talamus, VTA, kawasan tegmental ventral. Petak merah mewakili kawasan otak tempat imej diambil. b, Gambarajah skematik eksperimen rangsangan. c, d, Contoh tindak balas arus foto (atas) dan voltan (bawah) akibat cahaya biru dalam manusia (c) EYFP+ t-hCO atau tikus (d) sel EYFP-. e, f, Kesan semasa neuron tikus selepas rangsangan cahaya biru akson t-hCO dengan TTX dan 4-AR (hijau), TTX (kelabu) atau aCSF (hitam) (e), dengan (ungu) atau tanpa (hitam) ) ) NBQX (e). g, kependaman tindak balas yang disebabkan oleh cahaya biru dalam sel tikus (n = 16 sel); bar mendatar menunjukkan kependaman purata (7.13 ms) (kiri). Amplitud EPSC yang ditimbulkan cahaya direkodkan dengan atau tanpa NBQX (n = 7 sel; ***P <0.0001) (tengah). Amplitud EPSC yang ditimbulkan cahaya direkodkan dengan atau tanpa NBQX (n = 7 sel; ***P <0.0001) (tengah). Амплитуда вызванных светом EPSC, зарегистрированных с atau без NBQX (n = 7 клеток; ***P <0,0001) (dalam центре). Amplitud EPSC yang disebabkan oleh cahaya direkodkan dengan atau tanpa NBQX (n = 7 sel; *** P <0.0001) (tengah).使用或不使用NBQX 记录的光诱发EPSC 的振幅（n = 7 个细胞；***P < 0.0001）（中）。使用或不使用NBQX 记录的光诱发EPSC 的振幅（n = 7 个细胞；***P < 0.0001）（中）。 Амплитуда вызванных светом EPSC, зарегистрированных с atau без NBQX (n = 7 клеток; ***P <0,0001) (dalam центре). Amplitud EPSC yang disebabkan oleh cahaya direkodkan dengan atau tanpa NBQX (n = 7 sel; *** P <0.0001) (tengah).Peratusan sel tikus menunjukkan EPSC yang bertindak balas kepada cahaya biru (kanan). h, Gambarajah skematik tugas tingkah laku. d0, hari 0. i. Persembahan haiwan teladan pada hari 1 (kiri) atau hari 15 (kanan) latihan. Purata bilangan jilatan yang dilakukan pada hari 1 (kiri) atau hari 15 (tengah kanan) (n = 150 percubaan cahaya biru, n = 150 ujian cahaya merah; ***P <0.0001). Purata bilangan jilatan yang dilakukan pada hari 1 (kiri) atau hari 15 (tengah kanan) (n = 150 percubaan cahaya biru, n = 150 ujian cahaya merah; ***P <0.0001). Среднее количество облизываний, выполненных в день 1 (слева) atau день 15 (в центре справа) (n = 150 испытаний с свитоний с = сито5м испытаний с красным светом; ***P <0,0001). Purata bilangan jilatan yang dilakukan pada hari 1 (kiri) atau hari 15 (tengah kanan) (n = 150 percubaan cahaya biru, n = 150 ujian cahaya merah; ***P <0.0001).第1 天（左）或第15 天（右中）执行的平均舔次数（n = 150 次蓝光试验，n = 150次红光试验；***P < 0.0001）。第1 天（左）或第15 天（右中）执行的平均舔次数（n = 150 次蓝光试验，n = 150次红光试验；***P < 0.001 Среднее количество облизываний, выполненных в день 1 (слева) atau день 15 (в центре справа) (n = 150 испытаний с свитоний с = сито5м испытаний с красным светом; ***P <0,0001). Purata bilangan jilatan yang dilakukan pada hari 1 (kiri) atau hari 15 (tengah kanan) (n = 150 percubaan cahaya biru, n = 150 ujian cahaya merah; ***P <0.0001).Jilat kumulatif untuk percubaan cahaya merah dan biru pada hari 1 (kiri tengah) atau hari 15 (kanan). NS, tidak penting. j, k, Ciri-ciri tingkah laku semua haiwan yang dipindahkan dengan t-hCO yang menyatakan hChR2-EYFP (j) atau mengawal fluorophore (k) pada hari 1 atau 15 (hChR2-EYFP: n = 9 tikus, ** P = 0.0049; kawalan: n = 9, P = 0.1497). l, Evolusi skor keutamaan (n = 9 hChR2, n = 9 kawalan; **P <0.001, ***P <0.0001). l, Evolusi skor keutamaan (n = 9 hChR2, n = 9 kawalan; **P <0.001, ***P <0.0001). l, Эволюция показателя предпочтения (n = 9 hChR2, n = 9 контрольных; **P <0,001, ***P <0,0001). l, Evolusi skor keutamaan (n = 9 hChR2, n = 9 kawalan; **P <0.001, ***P <0.0001). l，偏好评分的演变（n = 9 hChR2，n = 9 对照；**P < 0.001，***P < 0.0001）。 l，偏好评分的演变（n = 9 hChR2，n = 9 对照；**P < 0.001，***P < 0.0001）。 l, Эволюция показателей предпочтения (n = 9 hChR2, n = 9 контролей; **P <0,001, ***P <0,0001). l, Evolusi skor keutamaan (n = 9 hChR2, n = 9 kawalan; **P <0.001, ***P <0.0001).m, ungkapan FOS sebagai tindak balas kepada pengaktifan optogenetik t-hCO dalam S1. Imej ungkapan FOS (kiri), dan kuantifikasi (n = 3 setiap kumpulan; *P <0.05, **P <0.01 dan ***P <0.001) (kanan) ditunjukkan. Imej ungkapan FOS (kiri), dan kuantifikasi (n = 3 setiap kumpulan; *P <0.05, **P <0.01 dan ***P <0.001) (kanan) ditunjukkan. Показаны изображения экспрессии FOS (слева) dan количественного определения (n = 3 untuk группу; * P <0,05, ** P <0,01 dan *** P <0,01,00) Imej ungkapan FOS (kiri) dan kuantifikasi (n = 3 setiap kumpulan; *P<0.05, **P<0.01, dan ***P<0.001) ditunjukkan (kanan).显示了FOS 表达（左）和量化（每组n = 3；*P < 0.05、**P < 0.01 和***P < 0.001））（叾）显示了FOS 表达（左）和量化（每组n = 3；*P < 0.05、**P < 0.01 和***P < 0.001））（叾） Показаны изображения экспрессии FOS (слева) dan количественного определения (n = 3 untuk группу; * P <0,05, ** P <0,01 dan *** P <0,01,00) Imej ungkapan FOS (kiri) dan kuantifikasi (n = 3 setiap kumpulan; *P<0.05, **P<0.01, dan ***P<0.001) ditunjukkan (kanan).Bar skala, 100 µm. Data dinyatakan sebagai min ± ralat piawai BLA, tonsil basolateral, MDT, nukleus thalamic dorsomedial, PAG, kelabu periaqueductal.
Akhirnya, kami bertanya sama ada t-hCO boleh memodulasi tingkah laku tikus. Untuk menguji ini, kami memindahkan hChR2-EYFP-mengekspresikan hCO ke dalam S1, dan 90 hari kemudian, kami menanam gentian optik ke dalam t-hCO untuk penghantaran ringan. Kami kemudiannya melatih tikus dengan paradigma pelaziman operan yang diubah suai (Rajah 5h). Kami meletakkan haiwan di dalam ruang ujian tingkah laku dan secara rawak menggunakan rangsangan laser biru (473 nm) dan merah (635 nm) 5 saat secara rawak. Haiwan menerima ganjaran air jika mereka menjilat semasa rangsangan cahaya biru tetapi tidak menjilat semasa rangsangan cahaya merah. Pada hari pertama latihan, haiwan itu tidak menunjukkan perbezaan dalam menjilat apabila dirangsang dengan cahaya biru atau merah. Walau bagaimanapun, pada hari ke-15, haiwan yang dipindahkan dengan hCO mengekspresikan hChR2-EYFP menunjukkan lebih aktif menjilat apabila dirangsang dengan cahaya biru berbanding dengan rangsangan cahaya merah. Perubahan dalam tingkah laku menjilat ini tidak diperhatikan dalam haiwan kawalan yang dipindahkan dengan hCO yang menyatakan fluorophore kawalan (kadar kejayaan pembelajaran: hChR2 89%, EYFP 0%, Rajah 5i-1 dan Video Tambahan 2). Data ini mencadangkan bahawa sel t-hCO boleh mengaktifkan neuron tikus untuk merangsang tingkah laku mencari ganjaran. Untuk mengetahui litar saraf t-hCO tikus mana yang mungkin terlibat dalam perubahan tingkah laku ini, kami secara optogenetik mengaktifkan t-hCO dalam haiwan terlatih dan menuai tisu 90 minit kemudian. Imunohistokimia mendedahkan ekspresi protein FOS yang bergantung kepada aktiviti di beberapa kawasan otak yang terlibat dalam tingkah laku yang bermotivasi, termasuk korteks prefrontal medial, talamus medial, dan bahan kelabu periaqueductal, yang dinyatakan sama ada dalam haiwan kawalan yang tidak dirangsang atau dalam haiwan. nasi. 5m). Diambil bersama, data ini mencadangkan bahawa t-hCO boleh memodulasi aktiviti neuron tikus untuk memacu tingkah laku.
Organoid saraf mewakili sistem yang menjanjikan untuk mengkaji perkembangan manusia dan penyakit secara in vitro, tetapi ia dihadkan oleh kekurangan sambungan antara litar yang wujud dalam vivo. Kami telah membangunkan platform baru di mana kami memindahkan hCO ke dalam S1 tikus postnatal awal yang tidak imunokompromi untuk mengkaji perkembangan dan fungsi sel manusia dalam vivo. Kami telah menunjukkan bahawa t-hCO membangunkan jenis sel matang yang tidak diperhatikan secara in vitro28 dan t-hCO secara anatomi dan berfungsi disepadukan ke dalam otak tikus. Penyepaduan t-hCO ke dalam litar saraf tikus membolehkan kami mewujudkan hubungan antara aktiviti selular manusia dan tingkah laku haiwan yang dikaji, menunjukkan bahawa neuron t-hCO boleh memodulasi aktiviti neuron tikus untuk memacu tindak balas tingkah laku.
Platform yang kami huraikan mempunyai beberapa kelebihan berbanding penyelidikan terdahulu mengenai pemindahan sel manusia ke dalam otak tikus. Pertama, kami memindahkan hCO ke dalam korteks yang sedang berkembang tikus selepas bersalin awal, yang boleh memudahkan integrasi anatomi dan berfungsi. Kedua, pemantauan t-hCO MRI membenarkan kami mengkaji kedudukan cantuman dan pertumbuhan haiwan hidup, membolehkan kami menjalankan kajian berbilang haiwan jangka panjang dan mewujudkan kebolehpercayaan beberapa garisan sel hiPS. Akhirnya, kami memindahkan organoid yang utuh, dan bukannya penggantungan sel tunggal yang terpencil, yang kurang merosakkan sel manusia dan boleh menggalakkan integrasi dan penjanaan neuron korteks manusia dalam otak tikus.
Kami mengakui bahawa walaupun kemajuan dalam platform ini, kekangan temporal, spatial dan rentas spesies menghalang pembentukan litar saraf manusia dengan kesetiaan yang tinggi, walaupun selepas pemindahan pada peringkat awal pembangunan. Sebagai contoh, tidak jelas sama ada aktiviti spontan yang diperhatikan dalam t-hCO mewakili fenotip perkembangan yang serupa dengan aktiviti berirama yang diperhatikan semasa perkembangan kortikal, atau sama ada ia disebabkan oleh ketiadaan jenis sel penindas yang terdapat dalam t-hCO. Begitu juga, tidak jelas sejauh mana ketiadaan laminasi dalam t-hCO mempengaruhi ketersambungan rantai30. Kerja masa depan akan menumpukan pada penyepaduan jenis sel lain seperti mikroglia manusia, sel endothelial manusia, dan pelbagai perkadaran interneuron GABAergik seperti yang ditunjukkan menggunakan pemasangan 6 in vitro, serta memahami bagaimana integrasi dan pemprosesan saraf boleh berlaku dalam t-hCO yang diubah. tahap transkrip, sinaptik dan tingkah laku dalam sel yang diperoleh daripada pesakit.
Secara keseluruhan, platform in vivo ini mewakili sumber yang berkuasa yang boleh melengkapkan pembangunan otak manusia secara in vitro dan penyelidikan penyakit. Kami menjangkakan bahawa platform ini akan membolehkan kami menemui fenotip peringkat helai novel dalam sel yang diperolehi pesakit yang sukar difahami dan menguji strategi terapeutik baharu.
Kami menjana hCO2.5 daripada sel HiPS seperti yang diterangkan sebelum ini. Untuk memulakan pengeluaran hCO daripada sel hiPS yang dikultur pada lapisan penyuap, koloni sel hiPS yang utuh telah dikeluarkan daripada hidangan kultur menggunakan dispase (0.35 mg/mL) dan dipindahkan ke kultur plastik lampiran ultra rendah yang mengandungi hidangan dengan medium kultur sel hiPS. (Corning) ditambah dengan dua perencat SMAD dorsomorphine (5 μM; P5499, Sigma-Aldrich) dan SB-431542 (10 μM; 1614, Tocris) dan perencat ROCK Y-27632 (10 μM; S1049, Selleckchem). Dalam tempoh 5 hari pertama, medium sel hiPS ditukar setiap hari dan dorsomorphine dan SB-431542 telah ditambah. Pada hari keenam dalam penggantungan, sferoid saraf dipindahkan ke medium saraf yang mengandungi neurobasal-A (10888, Life Technologies), suplemen B-27 tanpa vitamin A (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies), penisilin dan streptomycin (1:100, Life Technologies) dan ditambah dengan faktor pertumbuhan e (1ml− nggf; 2 ml; Sistem R&D) dan faktor pertumbuhan fibroblas 2 (FGF2; 20 ng ml−1; Sistem R&D) sehingga hari ke 24. Dari hari ke 25 hingga hari ke 42, medium telah ditambah dengan faktor neurotropik yang berasal dari otak (BDNF; 20 ng ml−1, Peprotech) dan neurotropin 3 (NT3; 20 ng ml) perubahan sederhana setiap hari (NT3; 20 ng ml). Pada hari keenam dalam penggantungan, sferoid saraf dipindahkan ke medium saraf yang mengandungi neurobasal-A (10888, Life Technologies), suplemen B-27 tanpa vitamin A (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies), penisilin dan streptomycin (1:100, Life Technologies) dan ditambah dengan faktor pertumbuhan e (1ml− nggf; 2 ml; Sistem R&D) dan faktor pertumbuhan fibroblas 2 (FGF2; 20 ng ml−1; Sistem R&D) sehingga hari ke 24. Dari hari ke 25 hingga hari ke 42, medium telah ditambah dengan faktor neurotropik yang berasal dari otak (BDNF; 20 ng ml−1, Peprotech) dan neurotropin 3 (NT3; 20 ng ml) perubahan sederhana setiap hari (NT3; 20 ng ml).Pada hari keenam dalam penggantungan, sferoid saraf dipindahkan ke medium saraf yang mengandungi Neurobasal-A (10888, Life Technologies), suplemen B-27 tanpa vitamin A (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies), penisilin.и стрептомицин (1:100, Life Technologies) dan дополнены эпидермальным фактором роста (EGF; 20 нг/мл; R&D Systems) dan фактором роста фибр; 2мбро Sistem R&D) hingga 24-го дня. dan streptomycin (1:100, Life Technologies) dan ditambah dengan faktor pertumbuhan epidermis (EGF; 20 ng/ml; Sistem R&D) dan faktor pertumbuhan fibroblast 2 (FGF2; 20 ng/ml; Sistem R&D) sehingga hari ke-24.Dari hari 25 hingga 42, faktor neurotropik yang berasal dari otak (BDNF; 20 ng ml-1, Peprotech) dan neurotrophin 3 (NT3; 20 ng ml-1, Peprotech) telah ditambah kepada medium, menukar medium setiap hari.在悬浮的第6 天，将神经球体转移到含有neurobasal-A（10888，Life Technologies）、不含维生素A 的B-27补充剂（12587，Life Technologies）、GlutaMax（1:100，Life Technologies）、青霉素的神经培养基中和链霉素0，1:10（ Technologies）并辅以表皮生长因子（EGF；20 ng ml-1；Sistem R&D）和成纤维细胞生长因子2（FGF ngR&D；20 Sistem）直至第24 天。在 悬浮 的 第 第 6 天 将 神经 球体 转移 含有 含有 neurobasal-a （10888 ， Life Technologies） 不 含 的索2 b补充剂 （12587 ， Life Technologies） Glutamax （1: 100 ， Life TechNOGIS青霉素 的 神经 培养 基 中 链霉素 （0（素 （0（素 （0（素 （0（素生长 因子 （（（20 ng ml-1 ； r & d Systems） 成 纤维 细胞 生长 2 （fgf2 ； 20 ng ml- 1；笛紬华＇ На 6-й день суспензии нейросферы были переведены на добавку, содержащую нейросферы-А (10888, Life Technologies), бобавав 7 А (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies), пенициллин- нейтрализованный стрептомицин (1:100, Life Technologies) с добавлением эпидермальако эпидермальакото нг мл-1; Sistem R&D) dan фактора роста фибробластов 2 (FGF2; 20 нг мл-1) 1; Pada hari ke-6, penggantungan neurosfera ditukar kepada suplemen yang mengandungi neurobasal-A (10888, Life Technologies), suplemen B-27 tanpa vitamin A (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies), streptomycin-neutralized penicillin (1:100, Life Technologies) ditambah dengan faktor pertumbuhan epidermal 12 (EGF; 12). faktor pertumbuhan fibroblas 2 (FGF2; 20 ng ml-1) 1; Sistem R&D) hingga 24-го дня. Sistem R&D) sehingga hari ke-24.Dari hari 25 hingga 42, faktor neurotropik yang berasal dari otak (BDNF; 20 ng ml-1, Peprotech) dan faktor neurotropik 3 (NT3; 20 ng ml-1, Peprotech) telah ditambah kepada medium kultur setiap hari. Sederhana tukar sekali.Bermula dari hari ke-43, hCO dikekalkan dalam medium neurobasal-A yang tidak ditambah (NM; 1088022, Thermo Fisher) dengan perubahan sederhana setiap 4-6 hari. Untuk mendapatkan hCO daripada sel hiPS yang dibiakkan di bawah keadaan tanpa penyuap, sel hiPS diinkubasi dengan Accutase (AT-104, Innovate Cell Technologies) pada suhu 37°C selama 7 minit, dipisahkan ke dalam sel tunggal, dan disalut pada plat AggreWell 800 (34815, STEMCELL Technologies) pada ketumpatan sel tunggal perencat 106 per telaga 3 × 106. Y-27632 (10 μM; S1049, Selleckchem). Selepas 24 jam, media di dalam telaga telah dipipet ke atas dan ke bawah ke dalam media yang mengandungi media Essential 6 (A1516401, Life Technologies) ditambah dengan dorsomorphine (2.5 μM; P5499, Sigma-Aldrich) dan SB-431542 (10 μM; 1614). , Tocrida). Dari hari 2 hingga 6, medium Essential 6 diganti setiap hari dengan dorsomorphine dan suplemen SB-431542. Dari hari keenam, penggantungan neurosfera dipindahkan ke medium neurobasal dan dikekalkan seperti yang diterangkan di atas.
Semua prosedur haiwan dilakukan mengikut garis panduan penjagaan haiwan yang diluluskan oleh Jawatankuasa Pentadbiran Penjagaan Haiwan Makmal Universiti Stanford (APLAC). Tikus euthymic RNU (rnu/+) hamil telah dibeli (Charles River Laboratories) atau ditempatkan. Haiwan dipelihara dalam kitaran gelap terang selama 12 jam dengan makanan dan air secara ad libitum. Anak tikus bogel (FOXN1–/–) berumur tiga hingga tujuh hari dikenal pasti melalui pertumbuhan misai yang tidak matang sebelum dimusnahkan. Anak anjing (jantan dan betina) telah dibius dengan 2-3% isoflurane dan diletakkan pada bingkai stereotaksik. Trepanasi tengkorak dengan diameter lebih kurang 2-3 mm di atas S1 dilakukan sambil mengekalkan integriti dura mater. Kemudian gunakan jarum 30-G (kira-kira 0.3 mm) di luar kraniotomi untuk menusuk dura. Kemudian sapukan HCO pada parafilem nipis 3×3 cm dan keluarkan lebihan medium. Menggunakan picagari Hamilton yang dilekatkan pada jarum 23 G, 45°, tarik hCO secara perlahan ke hujung jarum yang paling distal. Kemudian pasang picagari pada pam picagari yang disambungkan ke peranti stereotaksik. Kemudian letakkan hujung jarum di atas lubang tusukan selebar 0.3 mm yang dibuat sebelum ini dalam dura (z = 0 mm) dan sempitkan picagari 1–2 mm (z = lebih kurang –1.5 mm) sehingga jarum berada di antara dura mater A. kedap padat terbentuk. Kemudian naikkan picagari ke tengah permukaan kortikal pada z = -0.5 mm dan suntik hCO pada kadar 1-2 µl seminit. Selepas selesai suntikan hCO, jarum ditarik balik pada kadar 0.2-0.5 mm seminit, kulit dijahit, dan anak anjing segera diletakkan di atas pad pemanas hangat sehingga pemulihan lengkap. Sesetengah haiwan telah dipindahkan secara dua hala.
Semua prosedur haiwan dilakukan mengikut garis panduan penjagaan haiwan yang diluluskan oleh Stanford University APLAC. Tikus (lebih daripada 60 hari selepas pemindahan) diinduksi dengan anestesia isoflurane 5% dan dibius dengan isoflurane 1-3% semasa pengimejan. Untuk visualisasi, pengimbas lubang gerudi mendatar 7 Tesla secara aktif dilindungi Bruker (Bruker Corp.) dengan pemacu kecerunan Syarikat Elektrik Antarabangsa (IECO), sisipan kecerunan terlindung dengan diameter dalaman 120 mm (600 mT/m, 1000 T/m/s) telah digunakan menggunakan AVANCE. III, RF berbilang gegelung lapan saluran dan keupayaan berbilang teras, dan platform Paravision 6.0.1 yang disertakan. Rakaman dilakukan menggunakan gegelung RF volumetrik yang dipisahkan secara aktif dengan diameter dalaman 86 mm dan gegelung RF penyejukan cryo empat saluran untuk penerimaan sahaja. Axial 2D Turbo-RARE (masa ulangan = 2500 ms, masa gema = 33 ms, 2 purata) dengan 16 tangkapan hirisan, ketebalan kepingan 0.6–0.8 mm, mengandungi 256 × 256 sampel. Isyarat telah diterima menggunakan gegelung RF volumetrik transceiver kuadratur dengan diameter dalaman 2 cm (Rapid MR International, LLC). Akhir sekali, gunakan fungsi anggaran permukaan Imaris (BitPlane) terbina dalam untuk pemaparan 3D dan analisis volum. Pemindahan yang berjaya ditakrifkan sebagai satu di mana kawasan isyarat MRI berwajaran T2 berterusan terbentuk di hemisfera yang dipindahkan. Penolakan cantuman ditakrifkan sebagai cantuman yang tidak menghasilkan kawasan isyarat MRI berwajaran T2 berterusan dalam hemisfera yang dipindahkan. Subkortikal t-hCO dikecualikan daripada analisis seterusnya.
Untuk mengekspresikan GCaMP6s secara stabil dalam hCO untuk pengimejan kalsium dua foton, sel hiPS telah dijangkiti dengan pLV[Exp]-EF1a::GcaMP6s-WPRE-Puro diikuti dengan pemilihan antibiotik. Secara ringkas, sel telah dipisahkan dengan EDTA dan digantung dalam 1 ml medium Essential 8 pada ketumpatan kira-kira 300,000 sel dengan kehadiran polybrene (5 μg/ml) dan 15 μl virus. Sel-sel tersebut kemudiannya diinkubasi dalam ampaian selama 60 minit dan disemai pada ketumpatan 50,000 sel setiap telaga. Selepas pertemuan, sel telah dirawat dengan 5-10 μg ml-1 puromycin selama 5-10 hari atau sehingga koloni yang stabil muncul. Jangkitan hCO akut dilakukan seperti yang diterangkan sebelum ini5 dengan beberapa pengubahsuaian. Secara ringkas, pindahkan hari 30-45 hCO ke dalam 1.5 ml tiub mikrosentrifuge Eppendorf yang mengandungi 100 µl medium saraf. Kemudian kira-kira 90 µl medium dikeluarkan, 3-6 µl lentivirus titer tinggi (dari 0.5 x 108 hingga 1.2 x 109) ditambah ke dalam tiub, dan hCO dipindahkan ke inkubator selama 30 minit. Kemudian tambahkan 90–100 µl medium pada setiap tiub dan kembalikan tiub ke dalam inkubator semalaman. Keesokan harinya, pindahkan hCO ke medium saraf segar dalam plat pelekatan rendah. Selepas 7 hari, hCO dipindahkan ke plat bawah kaca 24-telaga untuk visualisasi dan penilaian kualiti jangkitan. pLV[Exp]-SYN1::EYFP-WPRE dan pLV[Exp]-SYN1::hChR2-EYFP-WPRE telah dijana oleh VectorBuilder. Lentivirus digunakan dalam kebanyakan eksperimen kerana ia disepadukan ke dalam genom perumah, membenarkan ekspresi gen wartawan dalam talian sel yang dijangkiti. Untuk susulan rabies, hari 30-45 hCO telah dijangkiti bersama dengan rabies-ΔG-eGFP dan AAV-DJ-EF1a-CVS-G-WPRE-pGHpA (plasmid #67528, Addgene), dibasuh dengan teliti selama 3 hari, dan dipindahkan ke dalam tikus dalam S1 dan dikekalkan dalam 7-14 hari.
Untuk imunositokimia, haiwan telah dibius dan diserap secara transkardial dengan PBS diikuti oleh 4% paraformaldehid (PFA dalam PBS; Sains Mikroskopi Elektron). Otak telah ditetapkan dalam 4% PFA selama 2 jam atau semalaman pada suhu 4°C, kriopelihara dalam 30% sukrosa dalam PBS selama 48-72 jam, dan tertanam dalam 1:1, 30% sukrosa: OCT (Kompaun OCT Tisu-Tek 4583 , Sakura Finetek) dan kriuk koronal 30ostat dibuat pada bahagian koronal 30s. Untuk imunohistokimia bahagian tebal, haiwan telah diserap dengan PBS, dan otak dibedah dan dipotong secara koronal pada 300-400 µm menggunakan vibratome (Leica) dan bahagian itu telah ditetapkan dengan 4% PFA selama 30 minit. Kemudian cryosections atau bahagian tebal dibasuh dengan PBS, disekat selama 1 jam pada suhu bilik (10% normal donkey serum (NDS) dan 0.3% Triton X-100 dicairkan dalam PBS) dan disekat dengan larutan penyekat pada 4°C. – Inkubasi Cryosections diinkubasi semalaman dan bahagian tebal diinkubasi selama 5 hari. Antibodi utama yang digunakan ialah: anti-NeuN (tetikus, 1:500; ab104224, abcam) anti-CTIP2 (tikus, 1:300; ab18465, abcam), anti-GFAP (arnab, 1:1,000; Z0334, Dako), anti-GFP (ayam, Genex, 1000) anti-HNA (tetikus, 1:200; ab191181, abcam), anti-NeuN (arnab, 1:500; ABN78, Millipore), anti-PDGFRA (arnab, 1:200; sc-338, Santa Cruz), anti-PPP1R17 (arnab, HPA0, Atlasbo1; HPA0, 2478) anti-RECA-1 (tetikus, 1:50; ab9774, abcam), anti-SCG2 (arnab, 1:100; 20357-1-AP, Proteintech), anti-SOX9 (kambing, 1:500; AF3075, Sistem R&D), Netrin G1A: 1006, R&D, Sistem Netrin G106, R&D anti-STEM121 (tetikus, 1:200; Y40410, Takara Bio), anti-SATB2 (tetikus, 1:50; ab51502, abcam), anti-GAD65/67 (arnab, 1:400; ABN904, Millipore) dan anti-IBA1 (kambing, 1:50). Antibodi utama yang digunakan ialah: anti-NeuN (tikus, 1:500; ab104224, abcam) anti-CTIP2 (tikus, 1:300; ab18465, abcam), anti-GFAP (arnab, 1:1,000; Z0334, Dako), anti -GFP: GTX3000 (ayam, Genex), anti-GFP (ayam) anti-HNA (tetikus, 1:200; ab191181, abcam), anti-NeuN (arnab, 1:500; ABN78, Millipore), anti-PDGFRA (arnab, 1:200; sc-338, Santa Cruz), anti-PPP1R17 (arnab, HPA0, Atlasbo1; HPA0, 2478) anti-RECA-1 (tetikus, 1:50; ab9774, abcam), anti-SCG2 (arnab , 1:100; 20357-1-AP, Proteintech), anti-SOX9 (kambing, 1:500; AF3075, Sistem R&D), Netrin AF: 106, R&D, Sistem Netrin G1a (kambing06) anti-STEM121 (tetikus , 1:200; Y40410, Takara Bio), anti-SATB2 (tetikus, 1:50; ab51502, abcam), anti-GAD65/67 (arnab, 1:400; ABN904, Millipore) dan anti-IBA1 :107; a107; abcam. Использовались следующие первичные антитела: анти-NeuN (мышиные, 1:500; ab104224, abcam), анти-CTIP2 (крысиные; 5,1:304;6; анти-GFAP (кроличьи, 1:1000; Z0334, Dako), анти- -GFP (курица, 1:1000; GTX13970, GeneTex), анти-HNA (мышь, 1:200; ab191181, abнтиклик), (ab191181, abнтиклик), 1.500 ab9774, abcam), анти-SCG2 (кролик , 1:100; 20357-1-AP, Proteintech), анти-SOX9 (козий, 1:500; AF3075, Sistem R&D), нетрин G1a, нетрин G1a (козий, 1:500; AF3075, Sistem R&D), нетрин G1a (козий, AF10; R&D) анти-STEM121 (мышиный , 1:200; Y40410, Takara Bio), анти-SATB2 (мышь, 1:50; ab51502, abcam), анти-GAD65/67 (кролик, 1:4040; Miliore; (коза, 1 :100; аб5076, абкам). Antibodi utama yang digunakan ialah: anti-NeuN (tetikus, 1:500; ab104224, abcam), anti-CTIP2 (tikus, 1:300; ab18465, abcam), anti-GFAP (arnab, 1:1000; Z0334, Dako), anti-GFP1009; GTX10700; anti-HNA (tetikus, 1:200; ab191181, abcam), anti-NeuN (arnab, 1:500; ABN78, Millipore), anti-PDGFRA ( arnab, 1:200; sc-338, Santa Cruz), anti-PPP1R17 (arnab, HPA, 20478; HPA, 2047) anti-RECA-1 (tetikus, 1:50; ab9774, abcam), anti- SCG2 (arnab, 1:100; 20357-1-AP, Proteintech), anti-SOX9 (kambing, 1:500; AF3075, R&D Systems), netrin G1AF: 1006; 1006; Sistem R&D STEM121 (tetikus, 1:200; Y40410, Takara Bio), anti-SATB2 (tetikus, 1:50; ab51502, abcam), anti-GAD65/67 (arnab, 1:400; ABN904, Millipore) dan anti-IBA1 (kambing, 1:50).使用的一抗是：抗NeuN（小鼠，1:500；ab104224，abcam）抗CTIP2（大鼠，1:3 00；ab18465，abcam），抗GFAP（兔，1:1,000；Z0334，Dako），抗-GF P（鸡，1:1,000；GTX13970，GeneTex），抗HNA（小鼠，1:200；ab1911 81，abcam），抗NeuN（兔，1:500；ABN78，Millipore），抗PDGFRA（兔， 1:200；sc-338，Santa Cruz），抗PPP1R17（兔，1:200；HPA047819，Atlas抗体），抗RECA-1（小鼠，1:50；ab9774，abcam），抗SCG2（兔） , 1:100；20357-1-AP，Proteintech），抗SOX9（山羊，1:500；AF3075，Sistem R&D），Netrin G1a（山羊，1:100；AF1166，R&D Sistem），抗STEM121（小鼠, 1:200;使用的一抗是：抗NeuN（小鼠，1:500；ab104224，abcam）抗CTIP2（大鼠，1 :300；ab18465，abcam），抗GFAP（兔，1:1,000；Z0334，Dako），抗-GFP（鸡，1:1,000；GTX13970，GeneTex），抗HNA（小鼠，1:200；ab191181，abcam），抗NeuN（兔，1:500；ABN 7 200；sc-338，Santa Cruz），抗PPP1R17（兔，1:200；HPA047819，Atlas 抗体），抗RECA-1（小鼠，1:50；ab9774，ab9774，2 100；20357-1-AP，Proteintech），抗SOX9（山羊，1:500；AF3075，Sistem R&D），Netrin G1a（山羊，1:100；AF1166，Sistem R&D1:Y40410, Takara Bio), anti-SATB2 (tikus, 1:50; ab51502, abcam), anti-GAD65/67 (arnab, 1:400; ABN904, Millipore) dan anti-IBA1 (kambing, 1:100; ab5076, abcam).Antibodi utama yang digunakan ialah: anti-NeuN (tikus, 1:500; ab104224, abcam), anti-CTIP2 (tikus, 1:300; ab18465, abcam), anti-GFAP (arnab, 1:1000; Z0334, Dako) . , anti-GFP (ayam, 1:1000; GTX13970, GeneTex), anti-HNA (tetikus, 1:200; ab191181, abcam), anti-NeuN (arnab, 1:500; ABN78, Millipore), anti-PDGFRA ( arnab, 1:2318, Santa Cruz), 1 (arnab, 1:200; HPA047819, antibodi Atlas), anti-RECA-1 (tetikus, 1:50; ab9774, abcam), anti- SCG2 (arnab), 1:100;20357-1-AP, Proteintech), анти-SOX9 (коза, 1:500; AF3075, R&D Systems), Нетрин G1a (коза, 1:100; AF1166, R&D Systems), анти -STEM121; мы2ь0, Bio анти-SATB2 (мышь, 1:50; ab51502, abcam), анти-GAD65/67 (кролик, 1:400; ABN904, Millipore) dan анти-IBA1 (коза, 1:100; аб5076, аб5076). 20357-1-AP, Proteintech), anti-SOX9 (kambing, 1:500; AF3075, Sistem R&D), Netrin G1a (kambing, 1:100; AF1166, Sistem R&D), anti-STEM121 (tetikus, 1:200; Tabkara Bio, 500; Tabkara, tikus, 5, SAT, Y404; ab51502, abcam), anti-GAD65/67 (arnab, 1:400; ABN904, Millipore), dan anti-IBA1 (kambing, 1:100; ab5076, abkam).Bahagian kemudian dibasuh dengan PBS dan diinkubasi dengan antibodi sekunder selama 1 jam pada suhu bilik (bahagian beku) atau semalaman pada 4 ° C (bahagian tebal). Antibodi sekunder Alexa Fluor (Life Technologies) mencairkan 1:1000 dalam larutan penyekat telah digunakan. Selepas mencuci dengan PBS, nukleus divisualisasikan dengan Hoechst 33258 (Life Technologies). Akhir sekali, slaid diletakkan pada mikroskop dengan coverlips (Fisher Scientific) menggunakan Aquamount (Polysciences) dan dianalisis pada mikroskop pendarfluor Keyence (penganalisis BZ-X) atau mikroskop confocal Leica TCS SP8 (Las-X) pada imej. Imej telah diproses menggunakan program ImageJ (Fiji). Untuk mengukur perkadaran neuron manusia dalam t-hCO dan korteks tikus, imej segi empat tepat lebar 387.5 μm diambil di tengah t-hCO, pada atau berhampiran tepi korteks tikus. Margin cantuman ditentukan dengan menilai perubahan dalam ketelusan tisu, nukleus HNA+, dan/atau kehadiran autofluoresensi tisu. Dalam setiap imej, jumlah bilangan sel NeuN+ dan HNA+ dibahagikan dengan jumlah bilangan sel NeuN+ di kawasan yang sama. Untuk memastikan bahawa hanya sel dengan nukleus dalam satah imej dikira, hanya sel yang juga Hoechst+ disertakan dalam pengiraan. Dua imej yang dipisahkan oleh sekurang-kurangnya 1 mm telah dipuratakan untuk mengurangkan ralat statistik.
Seminggu sebelum pengumpulan sampel, letakkan haiwan pemindahan hCO (kira-kira 8 bulan pembezaan) di dalam bilik gelap dengan kumis dipangkas untuk meminimumkan rangsangan deria. Pengasingan nukleus telah dilakukan seperti yang diterangkan sebelum ini, dengan beberapa pengubahsuaian. Secara ringkas, t-hCO dan hCO telah dimusnahkan menggunakan lisis sel detergen-mekanikal dan pengisar tisu kaca 2 ml (D8938, Sigma-Aldrich / KIMBLE). Nukleus mentah kemudiannya ditapis menggunakan penapis 40 µm dan disentrifugasi pada 320 g selama 10 minit pada suhu 4 °C sebelum melakukan kecerunan ketumpatan sukrosa. Selepas langkah sentrifugasi (320 g selama 20 minit pada 4°C), sampel digantung semula dalam 0.04% BSA/PBS dengan penambahan 0.2 unit perencat µl-1 RNase (40 u µl-1, AM2682, Ambion) dan melalui penapis aliran 40 µm. Nukleus yang dipisahkan kemudiannya digantung semula dalam PBS yang mengandungi 0.02% BSA dan dimuatkan ke dalam cip Chromium Single Cell 3′ (anggaran pemulihan 8,000 sel setiap lorong). Perpustakaan snRNA-seq telah disediakan dengan Chromium Single cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics). Perpustakaan snRNA-seq telah disediakan dengan Chromium Single cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics). Библиотеки snRNA-seq были приготовлены с помощью Chromium Sel Tunggal 3′ GEM, Perpustakaan & Kit Manik Gel v3 (10x Genomics). Pustaka snRNA-seq telah disediakan menggunakan Chromium Single cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics). snRNA-seq 文库是使用Chromium Sel Tunggal 3′ PERMATA、Perpustakaan & Kit Manik Gel v3 (10x Genomics) 制备的。 snRNA-seq 文库是使用Chromium Sel Tunggal 3′ PERMATA、Perpustakaan & Kit Manik Gel v3 (10x Genomics) 制备的。 Библиотеку snRNA-seq готовили с использованием Chromium Sel Tunggal 3′ PERMATA, Perpustakaan & Kit Manik Gel v3 (10x Genomics). Pustaka snRNA-seq telah disediakan menggunakan Chromium Single Cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics).Perpustakaan daripada sampel yang berbeza telah dikumpulkan dan disusun oleh Admera Health pada NovaSeq S4 (Illumina).
Tahap ekspresi gen untuk setiap kod bar nuklear dikira menggunakan pakej perisian analisis 10x Genomics CellRanger (versi 6.1.2). Secara khusus, bacaan dipadankan dengan gabungan genom rujukan manusia (GRCh38, Ensemble, versi 98) dan tikus (Rnor_6.0, Ensemble, versi 100) yang dicipta dengan arahan mkref dan menggunakan kiraan dengan perintah –include-introns=TRUE untuk kuantiti termasuk bacaan yang dipetakan ke kawasan intron. Untuk sampel t-hCO, nukleus manusia telah dikenal pasti berdasarkan keperluan konservatif bahawa sekurang-kurangnya 95% daripada semua bacaan dipetakan sepadan dengan genom manusia. Semua analisis seterusnya dilakukan pada output tatasusunan kod bar yang ditapis daripada CellRanger menggunakan pakej R (versi 4.1.2) Seurat (versi 4.1.1)32.
Untuk memastikan hanya nukleus berkualiti tinggi dimasukkan ke dalam analisis seterusnya, proses penapisan berulang telah dilaksanakan untuk setiap sampel. Pertama, nukleus berkualiti rendah dengan kurang daripada 1000 gen unik ditemui dan lebih daripada 20% daripada jumlah mitokondria dikenal pasti dan dikeluarkan. Selepas itu, matriks nombor gen mentah telah dinormalisasikan dengan regresi binomial negatif yang teratur menggunakan fungsi sctransform(vst.flavor=”v2″), yang turut mengenal pasti 3000 gen yang paling banyak berubah menggunakan parameter lalai. Pengurangan dimensi dilakukan pada gen pembolehubah atas menggunakan Analisis Komponen Utama (PCA) dengan parameter lalai berdasarkan visual = 330 (dipilih berdasarkan set data visual). pemeriksaan tapak lutut dan digunakan untuk semua sampel dan analisis ensembel). Kami kemudian melakukan beberapa pusingan pengelompokan berulang (resolusi = 1) untuk mengklasifikasikan gen berdasarkan kiraan gen yang luar biasa rendah (median di bawah persentil ke-10), kiraan gen mitokondria yang luar biasa tinggi (median di atas persentil ke-95) untuk mengenal pasti dan mengeluarkan sel-sel yang disyaki berkadar tinggi dan berkadar rendah3 (min skor DoubletFinder di atas peratusan ke-95 sampel t-hCO (n=3) dan sampel hCO (n=3) telah disepadukan secara berasingan menggunakan fungsi IntegrateData dengan parameter di atas Kemudian satu lagi pusingan penapisan kualitatif set data bersepadu dilakukan seperti yang diterangkan di atas.
Selepas mengalih keluar kernel berkualiti rendah, set data bersepadu telah dikumpulkan (resolusi = 0.5) dan dibenamkan untuk tujuan visualisasi UMAP34. Gen penanda untuk setiap kelompok ditentukan menggunakan fungsi FindMarkers dengan parameter lalai yang dikira daripada data ekspresi gen yang dinormalkan. Kami mengenal pasti dan mengklasifikasikan kelas sel utama dengan menggabungkan set data rujukan kortikal janin dan dewasa dengan ekspresi gen penanda 19,20,21,35 dan anotasi. Khususnya, prekursor yang beredar telah dikenal pasti oleh ungkapan MKI67 dan TOP2A. Kluster progenitor ditakrifkan oleh ketiadaan transkrip mitosis, pertindihan tinggi dengan kluster progenitor glial multipoten yang diterangkan dalam korteks janin metafasa lewat, dan ekspresi EGFR dan OLIG1. Kami menggunakan istilah astrocyte untuk merangkumi beberapa keadaan pembezaan astrosit, daripada glia jejari lewat hingga kematangan astrosit. Kelompok astrocyte menyatakan tahap tinggi SLC1A3 dan AQP4 dan telah ditunjukkan untuk memetakan dengan subtipe glia jejari janin dan/atau astrosit dewasa. OPC mengekspresikan PDGFRA dan SOX10 manakala oligodendrocytes mengekspresikan penanda mielin (MOG dan MYRF). Neuron glutamatergik dikenal pasti dengan kehadiran transkrip neuron (SYT1 dan SNAP25), ketiadaan penanda GABAergic (GAD2), dan ekspresi NEUROD6, SLC17A7, BCL11B, atau SATB2. Neuron GluN dibahagikan lagi kepada subkelas atas (ungkapan SAB2 dan kehilangan BCL11B) dan dalam (ungkapan BCL11B). Neuron subplate Putative (SP) mengekspresikan penanda SP18 yang diketahui seperti ST18 dan SORCS1 sebagai tambahan kepada penanda GluN dalam. Sel-sel seperti plexus Choroid telah dikenal pasti oleh ekspresi TTR, dan sel-sel seperti meningeal menyatakan gen yang berkaitan dengan fibroblast dan sel pial/vaskular yang dipetakan bagi set data rujukan.
Analisis pembezaan ekspresi gen antara subkelas t-hCO dan hCO dilakukan menggunakan kaedah kumpulan pseudo-batch yang baru dibangunkan dalam sampel yang dilaksanakan menggunakan pakej Libra R (versi 1.0.0). Khususnya, ujian kemungkinan log edgeR (versi 3.36.0, pakej R) dilakukan untuk kumpulan dengan menjumlahkan bilangan gen dalam sel untuk kelas sel tertentu untuk setiap replikasi sampel. Untuk visualisasi peta haba, nilai normalized per million (CPM) dikira menggunakan fungsi edgeR (cpm()) dan diskalakan (untuk mencapai min = 0, sisihan piawai = 1). Analisis pengayaan Gene Ontology (GO) bagi gen t-hCO GluN yang dikawal dengan ketara telah dilakukan (Benjamini-Hochberg membetulkan nilai P kurang daripada 0.05 yang dinyatakan dalam sekurang-kurangnya 10% sel t-hCO GluN dan peningkatan kali ganda dalam perubahan sekurang-kurangnya 2 kali). dilakukan menggunakan ToppGene Suite (https://toppgene.cchmc.org/)37. Kami menggunakan apl ToppFun dengan parameter lalai dan melaporkan nilai P yang diperbetulkan Benjamini-Hochberg yang dikira daripada ujian hipergeometri beranotasi GO.
Untuk memadankan kluster snRNA-seq kami dengan kluster sel beranotasi daripada kajian rujukan RNA-seq sel tunggal utama atau snRNA-seq19,20,21,22 dewasa, kami menggunakan pendekatan penyepaduan dataset berpasangan. Kami menggunakan aliran kerja normalisasi SCTransform (v2) dalam Seurat untuk menyepadukan dan membandingkan pertindihan kelompok antara set data (menggunakan parameter yang sama seperti di atas). Set data individu telah disubset secara rawak sehingga 500 sel atau teras bagi setiap kelompok asal untuk kecekapan pengiraan. Menggunakan pendekatan yang serupa seperti yang diterangkan sebelum ini, pertindihan kluster ditakrifkan sebagai perkadaran sel atau nukleus dalam setiap kluster terkumpul yang bertindih dengan label kluster rujukan. Untuk mengklasifikasikan GluN selanjutnya, kami menggunakan aliran kerja TransferData Seurat untuk data subset GluN untuk menetapkan label set data rujukan kepada sel GluN kami.
Untuk menilai status kematangan transkriptom global sampel t-hCO dan hCO, kami membandingkan sampel pseudo-pukal kami dengan BrainSpan/psychENCODE23, yang terdiri daripada jujukan RNA besar yang merangkumi perkembangan otak manusia. Kami melakukan PCA pada gabungan matriks ekspresi gen yang dinormalisasi corak daripada sampel kortikal 10 minggu selepas pembuahan dan kemudian, dalam 5567 gen (bersama-sama dengan data kami) yang sebelum ini dikenal pasti sebagai aktif dalam sampel kortikal BrainSpan (ditakrifkan sebagai lebih daripada 50% dalam varians perkembangan yang dijelaskan mengikut umur menggunakan model padu)38. Di samping itu, kami memperoleh gen yang dikaitkan dengan tandatangan transkrip utama pembangunan saraf menggunakan pemfaktoran matriks bukan negatif seperti yang diterangkan sebelum ini. Berat sampel yang dikira menggunakan prosedur pemfaktoran matriks bukan negatif diplot dalam Rajah. 5b dengan data yang diperluaskan untuk setiap lima tandatangan yang diterangkan oleh Zhu et al.38. Sekali lagi, penanda transkrip bergantung kepada aktiviti diperoleh daripada kajian yang diterbitkan sebelum ini. Khususnya, ERG dan LRG telah dikawal dengan ketara dalam neuron glutamatergik yang dikenal pasti oleh koleksi snRNA-seq korteks visual tetikus selepas rangsangan visual daripada Jadual Tambahan 3 Hrvatin et al.16. LRG yang diperkayakan oleh manusia diperolehi daripada kultur otak janin manusia yang diaktifkan KCl dan dituai 6 jam selepas rangsangan, dan gen yang ditapis dikawal dengan ketara pada manusia tetapi tidak pada tikus (Jadual Tambahan 4). Analisis pengayaan set gen menggunakan set gen ini dilakukan menggunakan ujian tepat Fisher sehala.
Bius tikus dengan isoflurane, keluarkan otak dan letakkan dalam larutan sukrosa beroksigen (kira-kira 4°C) sejuk (95% O2 dan 5% CO2) untuk bahagian yang mengandungi: 234 mM sukrosa, 11 mM glukosa, 26 mM NaHCO3, 2.5 mM KCl, 1.25 mM. NaH2PO4, 10 mM MgSO4 dan 0.5 mM CaCl2 (kira-kira 310 mOsm). Bahagian koronal otak tikus (300–400 µm) yang mengandungi t-hCO telah dibuat menggunakan vibratom Leica VT1200 seperti yang diterangkan sebelum ini39. Bahagian kemudiannya dipindahkan ke ruang keratan dengan pengoksigenan suhu bilik berterusan yang mengandungi aCSF yang disediakan daripada: 10 mM glukosa, 26 mM NaHCO3, 2.5 mM KCl, 1.25 mM NaHPO4, 1 mM MgSO4, 2 mM CaCl2 dan 126 mM NaCl (298 mO). sekurang-kurangnya 45 minit sebelum rakaman. Bahagian telah direkodkan di dalam ruang yang direndam di mana ia terus diperas dengan aCSF (95% O2 dan 5% botol CO2). Semua data direkodkan pada suhu bilik. Neuron t-hCO telah ditamatkan dengan pipet kaca borosilikat yang diisi dengan larutan yang mengandungi 127 mM kalium glukonat, 8 mM NaCl, 4 mM magnesium ATP, 0.3 mM natrium GTP, 10 mM HEPES, dan 0.6 mM EGTA, pH 7.2, larutan dalaman diselaraskan dengan KOH (m290 mOs). Untuk memulihkan, biocytin (0.2%) telah ditambah kepada penyelesaian rakaman.
Data diperoleh menggunakan penguat MultiClamp 700B (Peranti Molekul) dan digitizer Digidata 1550B (Peranti Molekul), laluan rendah ditapis pada 2 kHz, didigitalkan pada 20 kHz, dan dianalisis menggunakan Clampfit (Peranti Molekul), Origin (OriginPro). 2021b, OriginLab). dan fungsi MATLAB tersuai (Mathworks). Potensi simpang dikira menggunakan JPCalc dan entri diselaraskan kepada nilai terkira -14 mV. Operasi IV terdiri daripada satu siri langkah semasa dalam 10-25 pA langkah, dari -250 hingga 750 pA.
Talamus, jirim putih, dan aferen S1 telah dirangsang secara elektrik dalam kepingan talamokortikal semasa rakaman pengapit tampalan neuron hCO, seperti yang diterangkan sebelum ini. Secara ringkas, otak diletakkan di atas meja cetakan 3D yang dicondongkan pada sudut 10°, dan bahagian hadapan otak dipotong pada sudut 35°. Otak kemudiannya dilekatkan pada permukaan yang dipotong dan dibelah, memelihara akson yang menonjol thalamocortical. Elektrod tungsten bipolar (0.5 MΩ) telah dipasang pada mikromanipulator kedua dan diposisikan secara strategik untuk merangsang empat kawasan setiap sel (kapsul dalam, bahan putih, S1 dan hCO). Rekod tindak balas sinaptik selepas 300 µA rangsangan fasa pada 0.03–0.1 Hz.
Neuron hCO yang mengekspresikan hChR2 diaktifkan pada 480 nm dan denyutan cahaya yang dihasilkan oleh LED (Prizmatix) digunakan melalui objektif × 40 (0.9 NA; Olympus) untuk merekodkan ekspresi hChR2 berhampiran sel. Diameter medan bercahaya adalah lebih kurang 0.5 mm dan jumlah kuasa ialah 10-20 mW. Lebar nadi ditetapkan kepada 10 ms, yang sepadan dengan nadi yang diberikan semasa eksperimen pembelajaran tingkah laku. Pelbagai frekuensi rangsangan telah digunakan, dari 1 hingga 20 Hz, tetapi hanya nadi pertama siri digunakan untuk kuantifikasi. Selang antara kereta api biasanya lebih lama daripada 30 saat untuk meminimumkan kesan pada laluan perencatan sinaptik atau memudahkan. Untuk menguji sama ada tindak balas hChR2 adalah monosynaptic, kami menggunakan TTX (1 μM) ke dalam tab mandi sehingga tindak balas EPSC hilang, dan kemudian menggunakan 4-aminopyridine (4-AP; 100 μM). Lazimnya, respons dikembalikan dalam beberapa minit, dengan kelewatan yang lebih lama antara penyalaan LED dan penjanaan EPSC. NBQX (10 μM) digunakan untuk menguji sama ada tindak balas didorong oleh reseptor AMPA.
Bahagian hCO tajam telah dicipta seperti yang diterangkan sebelum ini. Secara ringkasnya, bahagian hCO telah tertanam dalam 4% agarose dan dipindahkan ke sel yang mengandungi 126 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM NaH2PO4, 1 mM MgSO4, 2 mM CaCl2, 26 mM NaHCO3 dan 10 mM d-(+) -0glucose di potong ke dalam Bahagian 3. µm pada suhu bilik menggunakan penggetar Leica VT1200 dan disimpan dalam ASF pada suhu bilik. Kemudian, rakaman tampalan keseluruhan sel dilakukan pada bahagian hCO di bawah mikroskop SliceScope langsung (Scientifica). Bahagian telah diserap dengan aCSF (95% O2 dan 5% CO2) dan isyarat sel direkodkan pada suhu bilik. Neuron hCO digunakan menggunakan pipet kaca borosilikat yang diisi dengan larutan yang mengandungi 127 mM kalium glukonat, 8 mM NaCl, 4 mM magnesium ATP, 0.3 mM natrium GTP, 10 mM HEPES, dan 0.6 mM EGTA, pH dalaman 7, 2, diselaraskan dengan KOH (osmolarity). Untuk tujuan pemulihan, tambahkan 0.2% Biocytin ke dalam larutan dalaman.
Data diperolehi oleh Clampex (Clampex 11.1, Peranti Molekul) menggunakan penguat MultiClamp 700B (Peranti Molekul) dan digitizer Digidata 1550B (Peranti Molekul), laluan rendah ditapis pada 2 kHz, didigitalkan pada 20 kHz, dan dianalisis menggunakan fungsi Clampfit (versi 10, MAT) tersuai. (MATLAB 2019b, Mathworks). Potensi simpang dikira menggunakan JPCalc dan entri diselaraskan kepada potensi simpang yang dikira -14 mV. Operasi IV terdiri daripada satu siri langkah semasa dalam 5-10 langkah pA dari -50 hingga 250 pA.
Untuk pembinaan semula morfologi neuron yang terjepit, 0.2% biocytin (Sigma-Aldrich) telah ditambah kepada penyelesaian dalaman. Sel-sel disiapkan selama sekurang-kurangnya 15 minit selepas penggodaman. Pipet kemudian ditarik masuk perlahan-lahan selama 1-2 minit sehingga membran yang didaftarkan dimeterai sepenuhnya. Berikutan prosedur fisiologi bahagian, bahagian telah ditetapkan semalaman pada suhu 4° C. dalam 4% PFA, dibasuh dengan PBS X3, dan dicairkan 1:1000 dengan DyLight 549 atau DyLight 405 (Vector Labs) terkonjugasi streptavidin. Sel-sel yang diisi dengan biocytin (2%; Sigma-Aldrich) telah dilabelkan semasa rakaman pengapit tampalan pada suhu bilik selama 2 jam. Bahagian tersebut kemudiannya dipasang pada slaid mikroskop menggunakan Aquamount (Thermo Scientific) dan divisualisasikan pada hari berikutnya pada mikroskop confocal Leica TCS SP8 menggunakan objektif rendaman minyak dengan apertur berangka ×40 1.3, pembesaran ×0.9–1.0, xy. Kadar pensampelan adalah lebih kurang 7 piksel setiap mikron. Tindanan Z pada selang 1 µm diperoleh secara bersiri, dan mozek timbunan z dan jahitan auto berasaskan Leica dilakukan untuk menutup keseluruhan pokok dendritik setiap neuron. Neuron kemudiannya dijejaki secara separa manual menggunakan antara muka neuTube 40 dan fail SWC dijana. Fail tersebut kemudiannya dimuat naik ke pemalam SimpleNeuriteTracer41 Fiji (ImageJ, versi 2.1.0; NIH).
Tisu kortikal manusia diperoleh dengan persetujuan termaklum mengikut protokol yang diluluskan oleh Lembaga Kajian Institusi Universiti Stanford. Dua sampel tisu selepas bersalin manusia (3 dan 18 tahun) diperoleh melalui reseksi korteks hadapan (gyrus frontal tengah) sebagai sebahagian daripada pembedahan untuk epilepsi refraktori. Selepas reseksi, tuai tisu dalam NMDG-aCSF sejuk ais yang mengandungi: 92 mM NMDG, 2.5 mM KCl, 1.25 mM NaH2PO4, 30 mM NaHCO3, 20 mM HEPES, 25 mM glukosa, 2 mM thiourea mM bate, natrium mM bate, 5 mM bate mM. 0.5 mM CaCl2 4H2O dan 10 mM MgSO4 7H2O. Titrasi kepada pH 7.3-7.4 dengan asid hidroklorik pekat. Tisu dihantar ke makmal dalam masa 30 minit dan bahagian koronal diambil mengikut prosedur yang diterangkan di atas.
Semua prosedur haiwan dilakukan mengikut garis panduan penjagaan haiwan yang diluluskan oleh Stanford University APLAC. Tikus (lebih daripada 140 hari selepas pemindahan) diinduksi dengan anestesia isoflurane 5% dan dibius dengan 1-3% isoflurane intraoperatif. Haiwan diletakkan dalam bingkai stereotaxic (Kopf) dan buprenorphine pelepasan berterusan (SR) disuntik secara subkutan. Tengkorak terdedah, dibersihkan dan 3-5 skru tulang dimasukkan. Untuk menyasarkan t-hCO, kami menghasilkan koordinat stereotaksik daripada imej MRI. Lubang burr digerudi di tapak yang menarik dan gentian (diameter 400 µm, NA 0.48, Doric) diturunkan 100 µm di bawah permukaan hCO dan diikat pada tengkorak dengan simen pergigian yang boleh dirawat UV (Relyx).
Rakaman fotometri gentian telah dilakukan seperti yang diterangkan sebelum ini42. Untuk merekodkan aktiviti spontan, tikus diletakkan di dalam sangkar yang bersih dan kabel tampalan gentian optik berdiameter 400 µm (Doric) yang disambungkan kepada sistem pemerolehan data fotometrik gentian optik disambungkan kepada kabel gentian optik yang ditanam. Semasa rakaman aktiviti motor selama 10 minit, haiwan itu bebas meneroka sangkar. Untuk merekodkan aktiviti yang ditimbulkan, tikus (lebih daripada 140 hari selepas pemindahan) telah dibius dengan 5% isoflurane untuk induksi dan 1-3% isoflurane untuk penyelenggaraan. Letakkan haiwan itu dalam bingkai stereotaktik (Kopf) dan misai pada bahagian bertentangan t-hCO dipotong kepada kira-kira 2 cm dan melalui jaringan yang disambungkan kepada penggerak piezoelektrik (PI). Kabel tampalan gentian optik 400 µm (Doric) disambungkan ke gentian yang diimplan dan disambungkan ke sistem pemerolehan data. Misai pada bahagian bertentangan t-hCO kemudiannya dipesongkan 50 kali (2 mm pada 20 Hz, 2 s setiap pembentangan) pada masa rawak oleh pemacu piezoelektrik dalam tempoh rakaman 20 minit. Gunakan Pakej Sokongan MATLAB Arduino untuk mengawal masa pesongan dengan kod MATLAB tersuai. Peristiwa disegerakkan kepada perisian pemerolehan data menggunakan denyutan logik transistor-transistor (TTL).
Tikus (lebih daripada 140 hari selepas pemindahan) diinduksi dengan anestesia isoflurane 5% dan dibius dengan 1-3% isoflurane intraoperatif. Haiwan diletakkan dalam bingkai stereotaxic (Kopf) dan buprenorphine SR dan dexamethasone disuntik secara subkutan. Tengkorak terdedah, dibersihkan dan 3-5 skru tulang dimasukkan. Untuk menyasarkan t-hCO, kami menghasilkan koordinat stereotaksik daripada imej MRI. Kraniotomi bulat (diameter kira-kira 1 cm) dilakukan dengan gerudi berkelajuan tinggi terus ke atas hCO yang dipindahkan. Setelah tulang menjadi nipis yang mungkin, tetapi sebelum menggerudi seluruh tulang, gunakan forsep untuk mengeluarkan baki cakera pelvis utuh untuk mendedahkan t-hCO yang mendasari. Craniotomy telah diisi dengan garam steril, dan penutup penutup dan pin kepala khas dilekatkan pada tengkorak dengan simen pergigian UV-cured (Relyx).
Pengimejan dua foton dilakukan menggunakan mikroskop multifoton Bruker dengan objektif Nikon LWD (× 16, 0.8 NA). Pengimejan GCaMP6 dilakukan pada 920 nm dengan pembesaran z-plane 1.4x tunggal dan purata 8x 7.5 fps. Tikus diinduksi dengan anestesia isoflurane 5% dan dikekalkan dengan isoflurane 1-3%. Tikus-tikus itu diletakkan dalam lekapan kepala yang dibuat khas dan diletakkan di bawah kanta. Rakaman latar belakang 3 minit aktiviti motor diperolehi. Sepanjang 20 minit rakaman, 50 sedutan (setiap persembahan sepanjang 100 ms) dihantar secara rawak ke pad misai bertentangan dengan t-hCO menggunakan picospricer. Gunakan Pakej Sokongan MATLAB Arduino untuk mengawal masa pecah dengan kod MATLAB tersuai. Segerakkan peristiwa dengan perisian pemerolehan data (PrairieView 5.5) menggunakan denyutan TTL. Untuk analisis, imej telah diperbetulkan untuk gerakan xy menggunakan pembetulan affine dalam program MoCo yang dilancarkan di Fiji. Pengekstrakan jejak pendarfluor daripada sel individu menggunakan CNMF-E43. Pendarfluor telah diekstrak untuk setiap kawasan yang diminati, ditukar kepada lengkung dF/F, dan kemudian ditukar kepada skor-z.
Tikus (lebih daripada 140 hari selepas pemindahan) diinduksi dengan anestesia isoflurane 5% dan dibius dengan 1-3% isoflurane intraoperatif. Haiwan diletakkan dalam bingkai stereotaxic (Kopf) dan buprenorphine SR dan dexamethasone disuntik secara subkutan. Misai pada bahagian bertentangan t-hCO dipotong kepada kira-kira 2 cm dan diulirkan melalui jaringan yang disambungkan kepada penggerak piezoelektrik. Tengkorak terdedah dan dibersihkan. Skru tanah keluli tahan karat dipasang pada tengkorak. Untuk menyasarkan t-hCO, kami menghasilkan koordinat stereotaksik daripada imej MRI. Lakukan kraniotomi bulat (diameter kira-kira 1 cm) dengan gerudi berkelajuan tinggi tepat di atas t-hCO. Setelah tulang menjadi nipis yang mungkin, tetapi sebelum menggerudi seluruh tulang, gunakan forsep untuk mengeluarkan baki cakera pelvis utuh untuk mendedahkan t-hCO yang mendasari. Sel individu direkodkan menggunakan probe silikon berketumpatan tinggi 32 saluran atau 64 saluran (Cambridge Neurotech) yang dibumikan pada skru pembumian dan pra-dikuatkan dengan penguat RHD (Intan). Gunakan manipulator untuk menurunkan elektrod ke tapak sasaran melalui kraniotomi, yang diisi dengan garam steril. Pengumpulan data dilakukan pada frekuensi 30 kHz menggunakan sistem pemerolehan data Open Ephys. Rakaman diteruskan hanya apabila kami mengesan aktiviti spontan berirama yang sangat berkorelasi dalam lebih daripada 10 saluran, menunjukkan bahawa elektrod terletak dalam cantuman (berdasarkan data pengimejan kalsium dua foton). Rakaman latar belakang 10 minit aktiviti motor diperolehi. Misai pada bahagian bertentangan t-hCO kemudiannya dipesongkan 50 kali (2 mm pada 20 Hz, 2 s setiap pembentangan) pada masa rawak oleh pemacu piezoelektrik dalam tempoh rakaman 20 minit. Menggunakan Pakej Sokongan MATLAB untuk Arduino (MATLAB 2019b), kawal masa pesongan dengan kod MATLAB tersuai. Gunakan denyutan TTL untuk menyegerakkan acara dengan perisian pemerolehan data.
Untuk eksperimen penandaan optik, kord tampalan optik 200 µm (Doric) yang disambungkan kepada laser 473 nm (Omicron) telah disambungkan kepada gentian optik 200 µm yang diletakkan di atas kraniotomi. Sejurus sebelum ini, laraskan kuasa pelompat kepada 20 mW. Gunakan manipulator untuk menurunkan elektrod ke tapak sasaran melalui kraniotomi, yang diisi dengan garam steril. Pada permulaan rakaman, sepuluh denyutan cahaya 473 nm (frekuensi 2 Hz, tempoh nadi 10 ms) telah dipancarkan. Sel fotosensitif ditakrifkan sebagai sel yang menunjukkan tindak balas pancang dalam 10 ms cahaya dalam 70% atau lebih daripada ujian.