Dankie dat u Nature.com besoek het. U gebruik 'n blaaierweergawe met beperkte CSS-ondersteuning. Vir die beste ervaring beveel ons aan dat u 'n opgedateerde blaaier gebruik (of Verenigbaarheidsmodus in Internet Explorer deaktiveer). Boonop, om voortgesette ondersteuning te verseker, wys ons die webwerf sonder style en JavaScript.
Wys 'n karrousel van drie skyfies gelyktydig. Gebruik die Vorige en Volgende knoppies om deur drie skyfies op 'n slag te beweeg, of gebruik die skuifknoppies aan die einde om deur drie skyfies op 'n slag te beweeg.
Selfassemblerende neurale organelle verteenwoordig 'n belowende in vitro-platform vir die modellering van menslike ontwikkeling en siektes. Organoïede het egter nie die konnektiwiteit wat in vivo bestaan ​​nie, wat volwassenheid beperk en integrasie met ander stroombane wat gedrag beheer, voorkom. Hier wys ons dat menslike stamsel-afgeleide kortikale organoïede wat in die somatosensoriese korteks van neonatale naakrotte oorgeplant word, volwasse seltipes ontwikkel wat in sensoriese en motiveringsverwante stroombane integreer. MRI het post-oorplanting organoïedgroei in verskeie stamsellyne en diere getoon, terwyl enkelkern-analise die progressie van kortikogenese en die opkoms van 'n aktiwiteitsafhanklike transkripsieprogram getoon het. Inderdaad, oorgeplante kortikale neurone vertoon meer komplekse morfologiese, sinaptiese en interne membraan-eienskappe as hul in vitro-eweknieë, wat die opsporing van neuronale defekte in pasiënte met Timothy se sindroom moontlik maak. Anatomiese en funksionele nasporing het getoon dat oorgeplante organelle talamokortikale en kortikokortikale insette ontvang, en in vivo-opnames van neurale aktiwiteit dui daarop dat hierdie insette sensoriese reaksies in menslike selle kan genereer. Laastens brei kortikale organoïede aksone deur die rotbrein uit, en hul optogenetiese aktivering lei tot beloningsoekende gedrag. Dus word oorgeplante menslike korteksneurone volwasse en neem deel aan die gasheer se stroombane wat gedrag beheer. Ons verwag dat hierdie benadering die opsporing van stringvlak-fenotipes in pasiënt-afgeleide selle sal vergemaklik wat nie deur ander metodes opgespoor kan word nie.
Die ontwikkelende menslike brein is 'n merkwaardige selforganiserende proses waarin selle vermeerder, differensieer, migreer en verbind om funksionele neuronale stroombane te vorm wat verder verfyn word deur sensoriese ervaring. 'n Sleutelprobleem in die begrip van menslike breinontwikkeling, veral in die konteks van siekte, is die gebrek aan toegang tot breinweefsel. Selforganiserende organelle, insluitend menslike korteksorganoïede (hCO; ook bekend as die menslike kortekssfeer), kan 2,3,4,5,6 genereer. Verskeie beperkings beperk egter hul breër toepassing op die begrip van die ontwikkeling en funksionering van neurale stroombane. In die besonder is dit onduidelik of hCO-volwassenheid beperk word deur die afwesigheid van sekere mikro-omgewings- en sensoriese insette wat in vivo teenwoordig is. Boonop, omdat hCO's nie geïntegreer is in stroombane wat gedragsuitkomste kan genereer nie, is hul nut in die modellering van geneties komplekse en gedrags-neuropsigiatriese afwykings tans beperk.
Die oorplanting van hCO3 in 'n intakte lewende brein kan hierdie beperkings oorkom. Vorige studies het getoon dat menslike neurone wat in die knaagdierkorteks oorgeplant is, in staat is om te oorleef, te projekteer en met knaagdierselle te kommunikeer7,8,9,10,11,12. Hierdie eksperimente word egter gewoonlik op volwasse diere uitgevoer, wat sinaptiese en aksonale integrasie kan beperk. Hier beskryf ons 'n oorplantingsparadigma waarin ons 3D hCO3 afgelei van hiPS-selle in die primêre somatosensoriese korteks (S1) van immunodefisiente rotte in 'n vroeë stadium van plastiese ontwikkeling oorgeplant het. Oorgeplante hCO3 (t-hCO3) neurone ondergaan aansienlike volwassenheid, ontvang talamokortikale en kortikaal-kortikale insette wat sensoriese reaksies ontlok, en brei aksonale projeksies in die rotbrein uit om beloningsoekende gedrag aan te dryf. Verlengde volwassenheid van t-hCO3 het neuronale defekte aan die lig gebring in pasiënte met Timothy se sindroom (TS), 'n ernstige genetiese afwyking wat veroorsaak word deur mutasies in die spanningsensitiewe L-tipe CaV1.2 kalsiumkanaal (gekodeer deur CACNA1C).
Om menslike kortikale neurone in stroombane in vivo te bestudeer, het ons stereotakties intakte 3D hCO in S1 van vroeë postnatale atimiese rotte oorgeplant (dae 3-7 postnataal) (Fig. 1a en uitgebreide data van Fig. 1a-c). Op hierdie stadium het die talamokortikale en kortikokortikale aksonale projeksies nog nie hul S1-innervasie voltooi nie (verw. 13). Dus is hierdie benadering ontwerp om t-hCO-integrasie te maksimeer terwyl die impak op endogene stroombane geminimaliseer word. Om die ligging van t-hCO in lewende diere te visualiseer, het ons T2-geweegde MRI-breinrekonstruksies van rotte 2-3 maande na oorplanting uitgevoer (Fig. 1b en uitgebreide data, Fig. 1d). t-hCO3 is geredelik waargeneem en volumemetings van t-hCO3 was soortgelyk aan dié wat vanaf vaste snitte bereken is (Uitgebreide Data Fig. 1d,e; P > 0.05). t-hCO3 is geredelik waargeneem en volumemetings van t-hCO3 was soortgelyk aan dié wat vanaf vaste snitte bereken is (Uitgebreide Data Fig. 1d,e; P > 0.05). t-hCO легко наблюдались, а объемные измерения t-hCO были аналогичны рассчитанным для фиксированныхрасрези, ( рис 1d, e; P> 0,05). t-hCO3 is maklik waargeneem, en volumetriese t-hCO3 metings was soortgelyk aan dié wat vir vaste seksies bereken is (uitgebreide data, Fig. 1d, e; P > 0.05).很容易观察到t-hCO，并且t-hCO的体积测量值与从固定切片计算的测量值相似（扩展数据图1d、e；P > 0.05）。很容易观察到t-hCO，并且t-hCO t-hCO легко наблюдался, а объемные измерения t-hCO были аналогичны рассчитанным для фиксированных срезиов ( рис 1d, e; P> 0,05). t-hCO3 is maklik waargeneem, en volumetriese t-hCO3-metings was soortgelyk aan dié wat vir vaste seksies bereken is (uitgebreide data, Fig. 1d, e; P > 0.05).Ons het t-hCO₂ in 81% van oorgeplante diere ongeveer 2 maande na oorplanting bepaal (n = 72 diere; hCO₂ van 10 hiPS-sellyne; hiPS-sellyne in Aanvullende Tabel 1). Hiervan was 87% in die serebrale korteks geleë (Fig. 1c). Deur seriële MRI-skanderings op verskeie tydspunte in dieselfde oorgeplante rot uit te voer, het ons 'n negevoudige toename in t-hCO₂ volume binne 3 maande gevind (Fig. 1d en uitgebreide data, Fig. 1f). Oorgeplante diere het 'n hoë oorlewingsyfer (74%) 12 maande na oorplanting gehad (uitgebreide data, Fig. 1g en Aanvullende Tabel 2), en geen openlike motoriese of geheueverswakkings, gliose of elektro-ensefalogram (EEG) is gevind nie. Data Fig. 1g en aanvullende tabel 2). 1h–m en 3e).
a, Skematiese voorstelling van eksperimentele ontwerp. hCO afgelei van hiPS-selle is oorgeplant in S1 van pasgebore naakrotte op dae 30-60 van differensiasie. b, T2-geweegde koronale en horisontale MRI-beelde wat t-hCO in S1 2 maande na oorplanting toon. Skaalbalk, 2 mm. c, Kwantifisering van inplantingsukseskoerse getoon vir elke hiPS-sellyn (n = 108, getalle binne stawe dui die hoeveelheid t-hCO per hIPS-sellyn aan) en kortikale of subkortikale ligging (n = 88). d, MRI-beeld van 'n koronêre arterie (links; skaalbalk, 3 mm) en ooreenstemmende 3D volumetriese rekonstruksie (skaalbalk, 3 mm) wat 'n toename in t-hCO oor 3 maande toon. e, Oorsig van t-hCO-patrone in rot serebrale korteks. Skaalbalk, 1 mm. f, Verteenwoordigende immunositochemiese beelde van t-hCO getoon van links bo na regs (tydens differensiasie): PPP1R17 (4 maande oud), NeuN (8 maande oud), SOX9 en GFAP (8 maande oud), PDGFRα; (8 maande), MAP2 (8 maande) en IBA1 (8 maande). Skaalbalk, 20 µm. Ko-ekspressie van HNA dui selle van menslike oorsprong aan. g, snRNA-volgorde: Verenigde manifold en projeksie (UMAP) dimensionaliteitsreduksiebeelding van alle hoëgehalte t-hCO-kerne na Seurat-integrasie (n=3 t-hCO monsters, n=2 hiPS-sellyne). Astrosiete, selle van die astrosietlyn; siklus prog, sirkulerende voorlopers; GluN DL, diep glutamatergiese neurone; GluN DL/SP, diep en sublamellêre glutamatergiese neurone; GluN UL, boonste laag glutamatergiese neurone; oligodendrosiete, oligodendrosiete; OPC, oligodendrosiet voorloperselle; RELN, reelin neurone. h, Geenontologie (GO) termverrykingsanalise van gene wat beduidend opgereguleer is (aangepaste P < 0.05, vouverandering > 2, uitgedruk in ten minste 10% van die kerne) in t-hCO glutamatergiese neurone in vergelyking met hCO glutamatergiese neurone. h, Geenontologie (GO) termverrykingsanalise van gene wat beduidend opgereguleer is (aangepaste P < 0.05, vouverandering > 2, uitgedruk in ten minste 10% van die kerne) in t-hCO glutamatergiese neurone in vergelyking met hCO glutamatergiese neurone. h, Анализ обогащения терминов Gene Ontology (GO) vir генов со значительной активацией (скорректированный P <0,05, сратность изкратность изктивацией по крайней мере в 10% ядер) in глутаматергических нейронах t-hCO deur сравнению met глутаматергическими нейронах. h, Geenontologie (GO) termverrykingsanalise vir gene met beduidende aktivering (aangepaste P<0.05, vouverandering >2, uitdrukking in ten minste 10% kerne) in t-hCO glutamatergiese neurone in vergelyking met hCO glutamatergiese neurone. h，与hCO 谷氨酸能神经元相比，t-hCO 谷氨酸能神经元中基因显着上调（谎整吁0.05，倍数变化> 2，在至少10% 的细胞核中表达）的基因本体论(GO) 术鐆〈富 h ， 与 hco 谷氨酸 能 元 相比 ， t-hco 谷氨酸 能 神经 元 基因 显着 上谼 p <0 ０同.变化 变化> 2 ， 至少 10% 的 核中 表达） 基因 基因 基因 的 的 的 的 的 的 焇 的的 的 的 的本体论(GO) 术语富集分析. h, гены значительно активизировались (скорректированный P <0,05, кратность изменения> 2, экспрессируется по 10% ) глутаматергических нейронах t-hCO vir сравнению met глутаматергическими нейронами hCO Онтологический (GO) анализими. h, gene was beduidend opgereguleer (aangepaste P < 0.05, vouverandering > 2, uitgedruk in ten minste 10% van die kerne) in t-hCO glutamatergiese neurone in vergelyking met hCO glutamatergiese neurone Ontologiese (GO) analise van die verrykingsterm.Die stippellyn dui 'n aq-waarde van 0.05 aan. i, UMAP-beelding van GluN-seltipes in t-hCO met behulp van etiketordrag vanaf 'n verwysings 22 snRNA-seq volwasse motoriese korteksdatastel. CT — kortikotalamiese selle, ET — ekstraserebrale selle, IT — interne telencefaliese selle, NP — nabye projeksie.
Ons het toe die sitoargitektuur en algehele sellulêre samestelling van t-hCO beoordeel. Teenliggaamkleuring van rot-endoteelselle het vaskularisasie met t-hCO getoon, terwyl IBA1-kleuring die teenwoordigheid van rot-mikroglia dwarsdeur die oorplanting getoon het (Fig. 1f en uitgebreide data, Fig. 3c,d). Immunokleuring het menslike kernantigeen (HNA) positiewe selle getoon wat PPP1R17 (kortikale voorlopers), NeuN (neurone), SOX9 en GFAP (glia-afgeleide selle) of PDGFRα (oligodendrosiet voorlopers) saam uitdruk (Figuur 1f). Om die sellulêre samestelling van t-hCO by enkelselresolusie te bestudeer, het ons enkelkern-RNA-volgordebepaling (snRNA-seq) uitgevoer na ongeveer 8 maande van differensiasie. Grootmaatfiltrering en verwydering van rotkerne het 21 500 hoëgehalte menslike mononukleêre kaarte opgelewer (Fig. 1g en uitgebreide data, Fig. 4a,b). Ekspressiepatrone van tipiese seltipemerkers het trosse van belangrike kortikale selklasse geïdentifiseer, insluitend diep en oppervlakkige glutamatergiese neurone, sirkulerende voorlopers, oligodendrosiete en astrosiet-afstamming (Fig. 1g, uitgebreide data, Fig. 4c, en Aanvullende Tabel 3). Immunokleuring vir SATB2 en CTIP2 het getoon dat t-hCO, ten spyte van die teenwoordigheid van kortikale subtipes, nie duidelike anatomiese stratifikasie getoon het nie (uitgebreide data, Fig. 3a). Stadium-gepaarde snRNA-seq hCO het breedweg soortgelyke selklasse geproduseer, met 'n paar uitsonderings, insluitend die afwesigheid van oligodendrosiete en die teenwoordigheid van GABAergiese neurone, wat die voorheen gerapporteerde gunstige in vitro-toestande vir laterale voorloperselle15 kan weerspieël (uitgebreide data, Fig. 4f - i en Aanvullende Tabel 4). Differensiële geenekspressie-analise het beduidende verskille in glutamatergiese neurone tussen t-hCO en hCO getoon (Aanvullende Tabel 5), insluitend die aktivering van stelle gene wat geassosieer word met neuronale volwassenheid soos sinaptiese seintranskripsie, dendritiese lokalisering en spanningsbeheerde kanaalaktiwiteit (Figuur 1h en Aanvullende Tabel 5). tabel 6). Gevolglik het kortikale glutamatergiese t-hCO neurone versnelde transkripsie-volwassenheid vertoon.
Om te verduidelik of hierdie transkripsieveranderinge in t-hCO verband hou met morfologiese verskille tussen hCO in vitro en t-hCO in vivo, het ons stadium-gepaarde biocytien-gevulde hCO en hCO in akute snitte gerekonstrueer na 7-8 maande van differensiasie. hCO neurone (Fig. 2a). t-hCO neurone was aansienlik groter, het 1.5 keer die soma-deursnee, twee keer soveel dendriete, en 'n algehele sesvoudige toename in totale dendritiese lengte in vergelyking met in vitro hCO (Fig. 2b). Daarbenewens het ons 'n aansienlik hoër digtheid van dendritiese stekels in t-hCO neurone waargeneem as in hCO neurone (Fig. 2c). Dit dui daarop dat t-hCO neurone uitgebreide dendritiese verlenging en vertakking ondergaan, wat, in kombinasie met voortgesette selproliferasie, kan bydra tot die intensiewe groei van t-hCO na oorplanting (Fig. 1d en Uitgebreide Data Fig. 1f). Dit het ons aangespoor om die elektrofisiologiese eienskappe te ondersoek. Membraankapasitansie was agt keer hoër (uitgebreide data, Fig. 8d), die rustoestandmembraanpotensiaal was meer hiperpolariseer (ongeveer 20 mV), en stroominspuiting het 'n hoër maksimum opwekkingstempo in t-hCO neurone veroorsaak as in hCO neurone. in vitro (Fig. 2d), e), wat ooreenstem met die groter en meer komplekse morfologiese kenmerke van t-hCO. Daarbenewens was die frekwensie van spontane opwindende postsinaptiese stroomgebeurtenisse (EPSC) aansienlik hoër in t-hCO neurone (Fig. 2f), wat daarop dui dat die verhoogde digtheid van dendritiese stekels wat in t-hCO neurone waargeneem is, geassosieer was met funksionele opwinding. seksuele sinaps. Ons het die onvolwasse karakter van hCO neurone in vitro bevestig deur gemerkte glutamatergiese neurone op te neem (uitgebreide data, Fig. 6a-c).
a, 3D-rekonstruksie van biocytien-gevulde hCO3- en t-hCO3-neurone na 8 maande van differensiasie. b, Kwantifisering van morfologiese kenmerke (n = 8 hCO neurone, n = 6 t-hCO neurone; **P = 0.0084, *P = 0.0179 en ***P < 0.0001). b, Kwantifisering van morfologiese kenmerke (n = 8 hCO neurone, n = 6 t-hCO neurone; **P = 0.0084, *P = 0.0179 en ***P < 0.0001). б, количественная оценка морфологических признаков (n = 8 нейронов hCO, n = 6 нейронов t-hCO; ** P = 0,0084, * P = 0,01***). b, kwantifisering van morfologiese kenmerke (n=8 hCO neurone, n=6 t-hCO neurone; **P=0.0084, *P=0.0179, en ***P<0.0001). b，形态学特征的量化（n = 8 个hCO 神经元，n = 6 个t-hCO 神经元；**P = 0.0084， 1*P9 0.0084,0*P9 0. 0,0001). b，形态学特征的量化（n = 8 个hCO 神经元，n = 6 个t-hCO 神经元；**P = 0.0084， 1*P9 0.0084,0*P9 0. 0,0001). б, количественная оценка морфологических признаков (n = 8 нейронов hCO, n = 6 нейронов t-hCO; ** P = 0,0084, * P = 0,01***). b, kwantifisering van morfologiese kenmerke (n=8 hCO neurone, n=6 t-hCO neurone; **P=0.0084, *P=0.0179, en ***P<0.0001).c, 3D-rekonstruksie van hCO3- en t-hCO3-dendritiese takke na 8 maande van differensiasie. Rooi sterretjies dui vermeende dendritiese stekels aan. Kwantifisering van dendritiese ruggraatdigtheid (n = 8 hCO3-neurone, n = 6 t-hCO3-neurone; **P = 0.0092). d, Kwantifisering van die rustende membraanpotensiaal (n = 25 hCO neurone, n = 16 t-hCO neurone; ***P < 0.0001). d, Kwantifisering van die rustende membraanpotensiaal (n = 25 hCO neurone, n = 16 t-hCO neurone; ***P < 0.0001). d, количественная оценка мембранного потенциала покоя (n = 25 нейронов hCO, n = 16 нейронов t-hCO; *** P <0,0001). d, kwantifisering van rustende membraanpotensiaal (n = 25 hCO neurone, n = 16 t-hCO neurone; ***P < 0.0001). d，静息膜电位的量化（n = 25 hCO 神经元，n = 16 t-hCO 神经元；***P < 0,0001）. d，静息膜电位的量化（n = 25 hCO 神经元，n = 16 t-hCO 神经元；***P < 0,0001）. d, количественная оценка мембранного потенциала покоя (n = 25 нейронов hCO, n = 16 нейронов t-hCO; *** P <0,0001). d, kwantifisering van rustende membraanpotensiaal (n = 25 hCO neurone, n = 16 t-hCO neurone; ***P < 0.0001). e, Herhalende aksiepotensiaal-afvuur in hCO3 en t-hCO3 geïnduseer deur toenemende stroominspuitings, en kwantifisering van die maksimale afvuurtempo (n = 25 hCO3 neurone, n = 16 t-hCO3 neurone; ***P < 0.0001). e, Herhalende aksiepotensiaal-afvuur in hCO3 en t-hCO3 geïnduseer deur toenemende stroominspuitings, en kwantifisering van die maksimale afvuurtempo (n = 25 hCO3 neurone, n = 16 t-hCO3 neurone; ***P < 0.0001). e, повторное возбуждение потенциала действия в hCO en t-hCO, вызванное увеличением тока, en количествия моценкия скорости возбуждения (n = 25 нейронов hCO, n = 16 нейронов t-hCO; *** P <0,0001). e, herontbranding van aksiepotensiaal in hCO3 en t-hCO3 geïnduseer deur stroomtoename en kwantifisering van maksimum ontbrandingstempo (n = 25 hCO3 neurone, n = 16 t-hCO3 neurone; *** P < 0.0001). e，通过增加电流注入诱导的hCO 和t-hCO 重复动作电位放电，以及最大放甄缇n =2个hCO 神经元，n = 16 个t-hCO 神经元；***P < 0,0001）. E ， 通过 增加 电流 注入 的 的 hco 和 t-hco 重复 电位 放电 ， 以及 最 夼 嚌 n = 2个 hco 神经 ， n = 16 个 t-hco 神经 ； *** p <0.0001） 。 bv максимальной скорости возбуждения (n = 25 нейронов hCO, n = 16 нейронов t-hCO; *** P <0,0001). e, herhaalde afvuur van hCO3- en t-hCO3-aksiepotensiale geïnduseer deur verhoogde stroomtoevoer en kwantifisering van maksimum afvuurtempo (n = 25 hCO3-neurone, n = 16 t-hCO3-neurone; *** P < 0.0001). f, Spontane EPSC's (sEPSC's) in hCO- en t-hCO-neurone na 8 maande van differensiasie, en kwantifisering van die frekwensie van sinaptiese gebeurtenisse (n = 25 hCO-neurone, n = 17 t-hCO-neurone; ***P < 0.0001). f, Spontane EPSC's (sEPSC's) in hCO- en t-hCO-neurone na 8 maande van differensiasie, en kwantifisering van die frekwensie van sinaptiese gebeurtenisse (n = 25 hCO-neurone, n = 17 t-hCO-neurone; ***P < 0.0001). f, спонтанные EPSC (sEPSC) in нейронах hCO en t-hCO через 8 месяцев дифференцировки en количественная оценка часипты событий (n = 25 нейронов hCO, n = 17 нейронов t-hCO; *** P <0,0001) . f, Spontane EPSC's (sEPSC's) in hCO- en t-hCO-neurone na 8 maande van differensiasie en kwantifisering van sinaptiese gebeurtenistempo's (n=25 hCO-neurone, n=17 t-hCO-neurone; ***P<0.0001). f，分化8 个月时hCO 和t-hCO 神经元中的自发性EPSC's (sEPSC's)，以及突触事件频率的5 hCO神经元，n = 17 t-hCO 神经元；***P < 0,0001） . f，分化8 个月时hCO 和t-hCO 神经元中的自发性EPSC's (sEPSCs)，以及突触事件频率的5 hCO神率的量匼（n = 25 hCO 神率的量匼（n = 25hCO P < 0,0001）. f, спонтанные EPSC (sEPSC) in нейронах hCO en t-hCO через 8 месяцев дифференцировки en количественная оценка часипты событий (n = 25 нейронов hCO, n = 17 нейронов t-hCO; *** P <0,0001). f, Spontane EPSC's (sEPSC's) in hCO- en t-hCO-neurone na 8 maande van differensiasie en kwantifisering van sinaptiese gebeurtenistempo's (n = 25 hCO-neurone, n = 17 t-hCO-neurone; *** P<0.0001).Vir bf is hCO3 en t-hCO3 in lyn 1208-2 geneem uit dieselfde differensiasiebondel wat parallel gehou is. g, Geenverrykingsanalise (eensydige Fisher se presiese toets) van gene wat beduidend opgereguleer is (aangepaste P < 0.05, vouverandering > 2, uitgedruk in ten minste 10% van die kerne) in t-hCO glutamatergiese neurone in vergelyking met hCO glutamatergiese neurone met geenstelle van beide vroeë-respons (ERG) en laat-respons (LRG) aktiwiteitsafhanklike gene wat geïdentifiseer is uit 'n in vivo muisstudie16 en mensspesifieke LRG's van in vitro neurone17. g, Geenverrykingsanalise (eensydige Fisher se presiese toets) van gene wat beduidend opgereguleer is (aangepaste P < 0.05, vouverandering > 2, uitgedruk in ten minste 10% van die kerne) in t-hCO glutamatergiese neurone in vergelyking met hCO glutamatergiese neurone met geenstelle van beide vroeë-respons (ERG) en laat-respons (LRG) aktiwiteitsafhanklike gene wat geïdentifiseer is uit 'n in vivo muisstudie16 en mensspesifieke LRG's van in vitro neurone17. g, анализ обогащения набора генов (односторонний точный критерий Фишера) генов со значительной активацорний (sk.0,5,0 кратность изменения > 2, экспрессия по меньшей мере в 10% ядер) в глутаматергических нейровнах t-hCO по сратность глутаматергическими нейронами hCO наборы генов как раннего (ERG), так и позднего (LRG) генов, зависящих от Aktiwiteite, komponente vir rekenaars in vivo16, en aanbiedings vir LRG in vitro17. g, analise van geenstelverryking (eensydige Fisher se presiese toets) van gene met beduidende aktivering (aangepaste P<0.05, vouverandering >2, uitdrukking in ten minste 10% van die kerne) in t-hCO glutamatergiese neurone in vergelyking met hCO glutamatergiese neuronstelle van beide vroeë (ERG) en laat (LRG) aktiwiteitsafhanklike gene wat in in vivo muise16 en mensspesifieke LRG's van neurone in vitro17 geïdentifiseer is. g，t-hCO谷氨酸能神经元与hCO谷氨酸能神经元相比，t -hCO谷氨酸能神经元显着上调（调整后P<0.05，倍数变化>2，在至少10%的细胞核中表达）的基因集富集分析（单侧F isher精确检验）从体内小鼠研究中鉴定的早期反应(ERG)和晚期反应(LRG) 活性依赖性基因的基因组16 和体外神经元17 中的人类特异 g ， t-hco 谷氨酸 神经 元 与 hco 谷氨酸 神经 元 相比 ， t-hco 谷氨酸 襞经 兰 襞经 兰<0.05 ， 倍数> 2 ， 至少 至少 10%的 细胞 核中 表达） 的 集富集 分析 Ｇ单） （单体内 小鼠 研究 中 的 早期 反应 反应 反应 和 晚期 反应 反应 (lrg) 活性 基因 的 基因 经 16神经元 17 中 中 17 中 17的人类特异性LRG. g, глутаматергические нейроны t-hCO были значительно активизированы по сравнению с глутаматергическическими нейко ( P<0,05, gradering 2, min 10% позднего гены, зависящие от активности ответа (LRG), идентифицированные в исследованиях на мышах in vivo16 en нейронах in vitro17. LRG, специфичные для человека. g, t-hCO glutamatergiese neurone was beduidend opgereguleer in vergelyking met hCO glutamatergiese neurone (aangepaste P<0.05, vouverandering >2, ten minste 10%). Vroeë respons (ERG) en laat respons geenverrykingsanalise (eensydige Fisher se presiese toets) responsaktiwiteitsafhanklike gene (LRG's) geïdentifiseer in in vivo muise16 en in vitro neurone.17 Menslike spesifieke LRG's.Die stippellyn dui 'n Bonferroni-gekorrigeerde P-waarde van 0.05 aan. h, GluN-geenekspressie (pseudo-pakket en skalering van elke geen) was beduidend opgereguleer in snRNA-seq replikas van LRG-gene in t-hCO glutamatergiese neurone. i, immunokleuring wat SCG2-ekspressie in t-hCO (boonste) en hCO (onderste) neurone toon. Wit pyle wys na SCG2+ selle. Skaalbalk, 25 µm. Data word uitgedruk as gemiddelde ± standaardafwyking.
Gebaseer op die verhoogde aktiwiteit van t-hCO wat in ex vivo-snitte waargeneem is, het snRNA-seq 'n aktiwiteitsafhanklike opregulering van geentranskripte in t-hCO getoon in vergelyking met hCO in vitro. Glutamatergiese t-hCO-neurone het hoër vlakke van gene wat laatresponsaktiwiteit reguleer, uitgedruk (Fig. 2g,h), wat in vorige studies in muis- en menslike neurone gevind is16,17. Byvoorbeeld, BDNF18, SCG2 en OSTN, 'n primaat-spesifieke aktiwiteitsregulerende geen, het verhoogde uitdrukking in t-hCO-neurone getoon in vergelyking met hCO-neurone (Fig. 2g-i). Dus het t-hCO-neurone verbeterde rypwordingseienskappe getoon in vergelyking met hCO-neurone deur transkripsionele, morfologiese en funksionele ontledings.
Om die verband tussen t-hCO-volwassenheid en menslike breinontwikkeling verder te evalueer, het ons transkriptomiese vergelykings van fetale en volwasse kortikale seltipes19,20 en volwassenes21,22 uitgevoer, asook uitgebreide data oor kortikale geenekspressie23 tydens ontwikkeling (uitgebreide data, Fig. 5). Met vorige werk24 is die globale hCO- en t-hCO-transkriptoomvolwassenheidsstatus na 7-8 maande van differensiasie breedweg in ooreenstemming met in vivo-ontwikkelingstyd en is dit die meeste gelykstaande aan laat fetale lewe (Uitgebreide Data Fig. 5a). Dit is opmerklik dat ons verhoogde transkriptoomvolwassenheid in t-hCO waargeneem het in vergelyking met ouderdomsgepaarde hCO, sowel as transkriptoomaktivering wat verband hou met sinaptogenese, astrogenese en miëlinisering (uitgebreide data, Fig. 5b-d). Op sellulêre vlak het ons bewyse gevind van 'n dunner korteks-subtipe in t-hCO, met trosse glutamatergiese neurone wat oorvleuel met volwasse L2/3-, L5- en L6-neuronsubtipes (Figuur 1i). In teenstelling hiermee was die oorvleueling van groepe tussen glutamatergiese t-hCO neurone en fetale kortikale neurone meer beperk in middel-swangerskap (uitgebreide data, Figuur 5e-j). Om te bepaal of t-hCO neurone funksioneel soortgelyk is aan menslike postnatale neokortikale neurone, het ons elektrofisiologiese opnames en anatomiese rekonstruksies van menslike L2/3 piramidale neurone in skerp dele van die menslike postnatale korteks uitgevoer (uitgebreide data, Fig. 7a). Die elektrofisiologiese eienskappe van L2/3 piramidale neurone was soortgelyk aan dié van t-hCO piramidale neurone (uitgebreide data, Fig. 7e). Morfologies was L2/3 neurone van postnatale menslike monsters meer soortgelyk aan t-hCO as aan hCO, alhoewel L2/3 selle langer was, oor die algemeen meer takke bevat het en 'n hoër ruggraatdigtheid gehad het (Fig. 3g en uitgebreide data, Fig. 7b-). G).
a, oorplanting van hCO geproduseer deur kontrole- en TS hiPS-sellyne in neonatale rotte. b, 3D-rekonstruksie van biocytien-gevulde t-hCO-neurone na 8 maande van differensiasie. c, kwantifisering van gemiddelde dendritiese lengte (n = 19 kontrole-neurone, n = 21 TS-neurone; **P = 0.0041). d, 3D-gerekonstrueerde dendritiese takke van kontrole en TS t-hCO na 8 maande van differensiasie, en kwantifisering van dendritiese ruggraatdigtheid (n = 16 kontrole-neurone, n = 21 TS-neurone, ***P < 0.0001). d, 3D-gerekonstrueerde dendritiese takke van kontrole en TS t-hCO na 8 maande van differensiasie, en kwantifisering van dendritiese ruggraatdigtheid (n = 16 kontrole-neurone, n = 21 TS-neurone, ***P < 0.0001). d, 3D-rekonstrueksie ветвей из контроля en TS t-hCO het 8 месяцев диференцировки en контроличе дендритных шипов (n = 16 контрольных нейронов, n = 21 TS нейронов, *** P <0,0001). d, 3D-rekonstruksie van dendritiese takke van kontrole en t-hCO TS na 8 maande van differensiasie en dendritiese ruggraatdigtheidskwantifisering (n=16 kontroleneurone, n=21 TS-neurone, ***P<0.0001). d，分化8 个月时对照和TS t-hCO 的3D 重建树突分支，以及树突棘密度的量n 化1,6个对照神经元，n = 21 个TS 神经元，***P < 0,0001）. d ， 分化 8 个 时 对照 和 ts t-hco 的 3d 重建 分支 分支 以及 树突棘 导度 1 帖n 度 1n神经 元 ， n = 21 个 ts 神经 ， *** p <0,0001 ）。 d, 3D-rekonstrueringsdienste en TS t-hCO het 8 maande statistieke en beheermaatreëls дендритных шипов (n = 16 контрольных нейронов, n = 21 TS нейронов, *** P <0,0001). d, 3D-rekonstruksie van kontrole dendritiese takke en TS t-hCO na 8 maande van differensiasie en dendritiese ruggraatdigtheidskwantifisering (n=16 kontrole neurone, n=21 TS neurone, ***P<0.0001).Rooi sterretjies dui vermeende dendritiese stekels aan. e, spontane EPSC's in kontrole- en TS t-hCO neurone na 8 maande van differensiasie. f, kumulatiewe frekwensiegrafiek en kwantifisering van frekwensie en amplitude van sinaptiese gebeurtenisse (n = 32 kontrole-neurone, n = 26 TS neurone; **P = 0.0076 en P = 0.8102). g, Scholl-analise van TS- en kontrole-neurone in hCO en t-hCO. Stippellyne toon menslike L2/3 postnatale piramidale neurone vir vergelyking (n = 24 kontrole t-hCO neurone, n = 21 TS t-hCO neurone, n = 8 kontrole hCO neurone, en n = 7 TS hCO neurone). Data word uitgedruk as die gemiddelde ± standaardafwyking.
Die vermoë van t-hCO om die morfologiese en funksionele kenmerke van menslike korteksneurone op 'n hoë vlak te herhaal, het ons aangespoor om te ondersoek of t-hCO gebruik kan word om siektefenotipes op te spoor. Ons het gefokus op TS, 'n ernstige neuro-ontwikkelingsversteuring wat veroorsaak word deur wins-van-funksie-mutasies in die geen wat vir CaV1.2 kodeer, wat aktiwiteitsafhanklike geentranskripsie in neurone begin. Ons het hCO verkry van drie TS-pasiënte wat die mees algemene substitusie (p.G406R) dra en drie kontroles (Fig. 3a). Na oorplanting het ons gevind dat dendritiese morfologie in TS-neurone verander is in vergelyking met kontroles (Fig. 3b en uitgebreide data, Fig. 8a,b), met 'n tweevoudige toename in die aantal primêre dendriete en 'n algehele toename in gemiddelde en algehele afname in dendritiese lengte (Fig. 3c en uitgebreide data, Fig. 8c). Dit is geassosieer met 'n verhoogde digtheid van stekels en 'n verhoogde frekwensie van spontane EPSC's in TS in vergelyking met kontrole-neurone (Fig. 3d-f en uitgebreide data, Fig. 8g). Verdere analise het patrone van abnormale dendritiese vertakking in t-hCO TS in vergelyking met kontroles aan die lig gebring, maar nie in in vitro TS hCO op 'n soortgelyke stadium van differensiasie nie (Fig. 3g). Dit stem ooreen met ons vorige verslae van aktiwiteitsafhanklike dendritiese krimping in TS en beklemtoon die vermoë van hierdie oorplantingsplatform om siektefenotipes in vivo op te spoor.
Ons het toe gevra tot watter mate t-hCO-selle funksioneel in rot S1 geïntegreer is. S1 in knaagdiere ontvang sterk sinaptiese insette van die ipsilaterale ventrale basale en posterior talamiese kerne, sowel as die ipsilaterale motoriese en sekondêre somatosensoriese korteks, en kontralaterale S1 (Fig. 4a). Om die innervasiepatroon te herstel, het ons hCO met hondsdolheidvirus-dG-GFP/AAV-G besmet en hCO 3 dae later in S1-rot oorgeplant. Ons het digte GFP-uitdrukking in neurone van die ipsilaterale S1 en ventrale basale ganglia 7-14 dae na oorplanting waargeneem (Fig. 4b, c). Daarbenewens het teenliggaamkleuring van die talamiese merker netrin G1 die teenwoordigheid van talamiese eindes in t-hCO aan die lig gebring (Fig. 4d, e). Om te evalueer of hierdie afferente projeksies sinaptiese reaksies in t-hCO-selle kon ontlok, het ons heelselopnames van menslike selle in skerp dele van die talamokortikale laag uitgevoer. Elektriese stimulasie van rot S1, interne kapsule, witstof, vesels naby t-hCO of optogenetiese aktivering van opsin-ekspressiewe talamiese eindes in t-hCO geïnduseerde kort-latensie EPSC's in t-hCO neurone blootgestel aan die AMPA-reseptor antagonis NBQX. (Fig. 4f, g en uitgebreide data, Fig. 9a-g). Hierdie data toon dat t-hCO anatomies in die rotbrein geïntegreer is en deur rotgasheerweefsel geaktiveer kan word.
a, Skematiese diagram van 'n hondsdolheidopsporingseksperiment. b, GFP en mensspesifieke STEM121-uitdrukking tussen t-hCO en rot serebrale korteks (boonste paneel). Ook getoon word GFP-uitdrukking in die rot ipsilaterale ventrale basale kern (VB) (links onder) en ipsilaterale S1 (regs onder). Skaalbalk, 50 µm. Die rooi vierkante verteenwoordig die areas van die brein waar die beelde geneem is. c, kwantifisering van selle wat GFP uitdruk (n = 4 rotte). d, e — Netrin G1+ talamiese terminale in t-hCO. d toon 'n koronale snit wat t-hCO en VB kerne bevat. Skaalbalk, 2 mm. e toon Netrin G1 en STEM121-uitdrukking in t-hCO (links) en VB (regs) neurone. Skaalbalk, 50 µm. Die oranje stippellyn dui die t-hCO-grens aan. f, g, Huidige spore van t-hCO neurone na elektriese stimulasie in S1 rot (f) of interne kapsule (g), met (pers) of sonder (swart) NBQX (links). EPSC amplitudes met en sonder NBQX (n = 6 S1 neurone, *P = 0.0119; en n = 6 interne kapsule neurone, **P = 0.0022) (middel). Persentasie van t-hCO neurone wat EPSC toon in reaksie op elektriese stimulasie van rot S1 (f) of interne kapsule (g) (regs). aCSF, kunsmatige serebrospinale vloeistof. h, skematiese diagram van die 2P-beeldingseksperiment (links). Ekspressie van GCaMP6s in t-hCO (middel). Skaalbalk, 100 µm. Fluoresensie tydsverloop van GCaMP6s (regs). i, Z-telling van spontane aktiwiteit fluoresensie. j, skematiese illustrasie van snor stimulasie. k, z-gegradeerde 2P-fluoresensietrajekte in een proefneming, in lyn met snorafwyking op tyd nul (stippellyn) in voorbeeldselle. l, populasiegemiddelde z-tellingresponse van alle selle in lyn met snorafwyking op tyd nul (stippellyn) (rooi) of ewekansig gegenereerde tydstempels (grys). m. Skematiese diagram van die eksperiment oor optiese merk. n, Rou spanningskurwes van 'n voorbeeld t-hCO-sel tydens blou laserstimulasie of snorafbuiging. Rooi pyle dui die eerste spykers aan wat deur lig veroorsaak word (bo) of veroorsaak word deur snorafbuiging (onder). Grys skaduwee dui periodes van snorafbuiging aan. o, Piekliggolfvorms en snorafbuigingsreaksies. p, spykers van 'n enkele poging, in lyn met die afwyking van die snorre in die selle van die voorbeeld. 0 dui snorafwyking aan (stippellyn). q, populasiegemiddelde z-telling-vuurtempo vir alle fotosensitiewe selle, in lyn met snorafwyking op tyd nul (stippellyn) (rooi) of ewekansig gegenereerde tydstempels (grys). r, Proporsie van fotosensitiewe eenhede wat beduidend gemoduleer word deur snorafwyking (n = 3 rotte) (links). Piek z-telling latensie (n = 3 rotte; n = 5 (liggroen), n = 4 (donkergroen), en n = 4 (siaan) snorafbuigingsmodulasie-eenhede per rot) (regs). Data word uitgedruk as gemiddelde ± standaardafwyking.
Ons het toe gevra of t-hCO deur sensoriese stimuli in vivo geaktiveer kan word. Ons het hCO wat die geneties gekodeerde kalsiumaanwysers GCaMP6 uitdruk, in S1-rotte oorgeplant. Na 150 dae het ons veselfotometrie of twee-foton kalsiumbeelding uitgevoer (Fig. 4h en uitgebreide data, Fig. 10a). Ons het gevind dat t-hCO-selle gesinchroniseerde ritmiese aktiwiteit vertoon het (Figuur 4i, Uitgebreide Data, Fig. 10b en Aanvullende Video 1). Om piek t-hCO-aktiwiteit te karakteriseer, het ons ekstrasellulêre elektrofisiologiese opnames in verdoofde oorplantingsrotte uitgevoer (uitgebreide data, Fig. 10c-f). Ons het stereotaksiese koördinate uit MRI-beelde gegenereer; dus verteenwoordig hierdie opgeneemde eenhede vermeende menslike neurone, hoewel elektrofisiologie alleen nie toelaat dat 'n spesie van oorsprong bepaal word nie. Ons het gesinchroniseerde uitbarstings van aktiwiteit waargeneem (uitgebreide data, Fig. 10d). Die sarsies het ongeveer 460 ms geduur en is geskei deur stilteperiodes van ongeveer 2 s (uitgebreide data, Fig. 10d, e). Individuele eenhede het gemiddeld ongeveer drie rondtes per sarsie afgevuur, wat ongeveer 73% van die geregistreerde eenhede per sarsie is. Die aktiwiteite van individuele eenhede was hoogs gekorreleer, en hierdie korrelasies was hoër as dié van eenhede wat geïdentifiseer is in ongeënte diere wat onder dieselfde toestande aangeteken is (uitgebreide data, Fig. 10f). Om die piekresponse van geïdentifiseerde mensafgeleide neurone verder te karakteriseer, het ons ligmerking-eksperimente uitgevoer op verdoofde rotte wat oorgeplant is met hCO3 wat die ligsensitiewe kationkanaal rhodopsin 2 (hChR2) uitdruk, waardeur t-hCO3 neurone kort-latensie-herkenning (minder as 10 ms) in reaksie op blou ligstimuli ervaar (Fig. 4m-o). t-hCO neurone het uitbarstings van spontane aktiwiteit getoon teen frekwensies soortgelyk aan dié wat in kalsiumbeelding waargeneem is, sowel as elektrofisiologiese opnames wat in t-hCO uitgevoer is in die afwesigheid van ligmarkering (uitgebreide data, Fig. 10c-g). Geen spontane aktiwiteit is waargeneem in die ooreenstemmende stadiums van hCO wat in vitro aangeteken is nie. Om te bepaal of t-hCO deur sensoriese stimuli geaktiveer kon word, het ons die rotsnorre kortliks weg van t-hCO afgebuig (Fig. 4j,m en uitgebreide data, Fig. 10h,k). Volgens vorige studies8,10 het 'n subgroep van t-hCO selle verhoogde aktiwiteit getoon in reaksie op snor-afbuiging, wat nie waargeneem is toe die data vergelyk is met ewekansige tydstempels nie (Fig. 4k-q en uitgebreide data, Fig. 10h-q). Inderdaad, ongeveer 54% van die opto-gemerkte enkeleenhede het 'n beduidend verhoogde opwekkingstempo na snor-stimulasie getoon, met 'n piek van ongeveer 650 ms (Fig. 4r). Saamgevat dui hierdie data daarop dat t-hCO toepaslike funksionele insette ontvang en deur omgewingstimuli geaktiveer kan word.
Ons het toe ondersoek of t-hCO stroombane in rotte kon aktiveer om gedrag te beheer. Ons het eers ondersoek of die aksone van t-hCO neurone in die omliggende weefsels van die rot projekteer. Ons het hCO besmet met 'n lentivirus wat vir hChR2 kodeer, wat met EYFP gefuseer is (hChR2-EYFP). Na 110 dae het ons EYFP-uitdrukking in ipsilaterale kortikale streke waargeneem, insluitend die ouditiewe, motoriese en somatosensoriese korteks, sowel as in subkortikale streke, insluitend die striatum, hippokampus en talamus (Fig. 5a). Om te bepaal of hierdie efferente projeksies sinaptiese reaksies in rotselle kon ontlok, het ons t-hCO selle wat hChR2-EYFP uitdruk, opties geaktiveer deur rot serebrale kortekselle in skerp breinsnitte op te neem. Aktivering van t-hCO aksone met blou lig het kort-latensie EPSC's in rot piramidale korteksneurone geïnduseer, wat deur NBQX geblokkeer is (Fig. 5b-g). Daarbenewens kan hierdie reaksies deur tetrodotoksien (TTX) geblokkeer word en deur 4-aminopiridien (4-AP) herstel word, wat daarop dui dat hulle deur monosinaptiese verbindings veroorsaak is (Fig. 5e).
a, Skematiese diagram van aksonopsporing (links). t-hCO EYFP-uitdrukking (regs). Skaalbalk, 100 µm. A1, ouditiewe korteks, ACC, anterior cingulêre korteks, d. striatum, dorsale striatum, HPC, hippokampus; Diafragma, laterale septum, mPFC, mediale prefrontale korteks, piri, piriforme korteks, v. striatum, ventrale striatum, VPM, ventropostomediale kern van die talamus, VTA, ventrale tegmentale streek. Die rooi vierkante verteenwoordig die areas van die brein waar die beelde geneem is. b, Skematiese diagram van die stimulasie-eksperiment. c, d, Voorbeelde van die reaksie van bloulig-geïnduseerde fotostroom (bo) en spanning (onder) in menslike (c) EYFP+ t-hCO of rot (d) EYFP- selle. e, f, Huidige spore van rotneurone na blouligstimulasie van t-hCO-aksone met TTX en 4-AR (groen), TTX (grys) of aCSF (swart) (e), met (violet) of sonder (swart)) NBQX (e). g, latensie van reaksies geïnduseer deur blou lig in rotselle (n = 16 selle); horisontale stawe dui gemiddelde latensie aan (7.13 ms) (links). Amplitude van lig-opgewekte EPSC's aangeteken met of sonder NBQX (n = 7 selle; ***P < 0.0001) (middel). Amplitude van lig-opgewekte EPSC's aangeteken met of sonder NBQX (n = 7 selle; ***P < 0.0001) (middel). amplitude van die EPSC, registrasie vir NBQX (n = 7 клеток; ***P <0,0001) (in sentraal). Amplitude van lig-geïnduseerde EPSC's aangeteken met of sonder NBQX (n = 7 selle; ***P < 0.0001) (middel).使用或不使用NBQX 记录的光诱发EPSC 的振幅（n = 7 个细胞；***P < 0.0001）（中）。使用或不使用NBQX 记录的光诱发EPSC 的振幅（n = 7 个细胞；***P < 0.0001）（中）。 amplitude van die EPSC, registrasie vir NBQX (n = 7 клеток; ***P <0,0001) (in sentraal). Amplitude van lig-geïnduseerde EPSC's aangeteken met of sonder NBQX (n = 7 selle; ***P < 0.0001) (middel).Persentasie rotselle wat EPSC's toon wat op blou lig reageer (regs). h, Skematiese diagram van 'n gedragstaak. d0, dag 0. i. Prestasie van voorbeeldige diere op dag 1 (links) of dag 15 (regs) van opleiding. Die gemiddelde aantal lekke wat op dag 1 (links) of dag 15 (regs in die middel) uitgevoer is (n = 150 blouligproewe, n = 150 rooiligproewe; ***P < 0.0001). Die gemiddelde aantal lekke wat op dag 1 (links) of dag 15 (regs in die middel) uitgevoer is (n = 150 blouligproewe, n = 150 rooiligproewe; ***P < 0.0001). Среднее количество облизываний, выполненных в день 1 (слева) или день 15 (met центре справа) (n = 150 исправа) n = 150 испытаний с красным светом ***P <0,0001). Gemiddelde aantal lekke uitgevoer op dag 1 (links) of dag 15 (middel regs) (n = 150 blouligproewe, n = 150 rooiligproewe; ***P < 0.0001).第1 天（左）或第15 天（右中）执行的平均舔次数（n = 150 次蓝光试验,150n = 150次红光试验；***P < 0,0001）.第1 天（左）或第15 天（右中）执行的平均舔次数（n = 150 次蓝光试验,150n = 150次红光试验；***P < 0,001 Среднее количество облизываний, выполненных в день 1 (слева) или день 15 (met центре справа) (n = 150 исправа) n = 150 испытаний с красным светом ***P <0,0001). Gemiddelde aantal lekke uitgevoer op dag 1 (links) of dag 15 (middel regs) (n = 150 blouligproewe, n = 150 rooiligproewe; ***P < 0.0001).Kumulatiewe lekke vir rooi en blou ligproewe op dag 1 (middel links) of dag 15 (regs). NS, nie beduidend nie. j,k, Gedragseienskappe van alle diere oorgeplant met t-hCO wat hChR2-EYFP (j) of kontrole fluorofoor (k) op dag 1 of 15 uitdruk (hChR2-EYFP: n = 9 rotte, ** P = 0.0049; kontrole: n = 9, P = 0.1497). l, Evolusie van voorkeurtelling (n = 9 hChR2, n = 9 kontrole; **P < 0.001, ***P < 0.0001). l, Evolusie van voorkeurtelling (n = 9 hChR2, n = 9 kontrole; **P < 0.001, ***P < 0.0001). l, Эволюция показателя предпочтения (n = 9 hChR2, n = 9 контрольных; **P <0,001, ***P <0,0001). l, Evolusie van voorkeurtelling (n = 9 hChR2, n = 9 kontroles; **P < 0.001, ***P < 0.0001). l，偏好评分的演变（n = 9 hChR2，n = 9 对照；**P < 0.001，***P < 0.0001）. l，偏好评分的演变（n = 9 hChR2，n = 9 对照；**P < 0.001，***P < 0.0001）. l, Эволюция показателей предпочтения (n = 9 hChR2, n = 9 контролей; **P <0,001, ***P <0,0001). l, Evolusie van voorkeurtellings (n = 9 hChR2, n = 9 kontroles; **P < 0.001, ***P < 0.0001).m, FOS-ekspressie in reaksie op optogenetiese aktivering van t-hCO in S1. Beelde van FOS-uitdrukking (links) en kwantifisering (n = 3 per groep; *P < 0.05, **P < 0.01 en ***P < 0.001) (regs) word getoon. Beelde van FOS-uitdrukking (links) en kwantifisering (n = 3 per groep; *P < 0.05, **P < 0.01 en ***P < 0.001) (regs) word getoon. Показаны изображения экспрессии FOS (слева) en количественного определения (n = 3 vir speletjies; * P <0,05, <01** P <0,0***) (spreuk). Beelde van FOS-uitdrukking (links) en kwantifisering (n = 3 per groep; *P<0.05, **P<0.01, en ***P<0.001) word getoon (regs).显示了FOS 表达（左）和量化（每组n = 3；*P < 0.05、**P < 0.01 和***P < 0.001）（像〳）（像〳）显示了FOS 表达（左）和量化（每组n = 3；*P < 0.05、**P < 0.01 和***P < 0.001）（像〳）（像〳） Показаны изображения экспрессии FOS (слева) en количественного определения (n = 3 vir speletjies; * P <0,05, <01** P <0,0***) (spreuk). Beelde van FOS-uitdrukking (links) en kwantifisering (n = 3 per groep; *P<0.05, **P<0.01, en ***P<0.001) word getoon (regs).Skaalbalk, 100 µm. Data word uitgedruk as gemiddelde ± standaardfout van BLA, basolaterale tonsil, MDT, dorsomediale talamiese kern, PAG, periaqueductale grys.
Laastens het ons gevra of t-hCO rotgedrag kon moduleer. Om dit te toets, het ons hChR2-EYFP-uitdrukkende hCO in S1 oorgeplant, en 90 dae later het ons optiese vesels in t-hCO ingeplant vir ligtoediening. Ons het toe die rotte opgelei met 'n gewysigde operante kondisioneringsparadigma (Fig. 5h). Ons het die diere in 'n gedragstoetskamer geplaas en lukraak 5 sekondes blou (473 nm) en rooi (635 nm) laserstimuli toegepas. Diere het 'n waterbeloning ontvang as hulle tydens blou ligstimulasie gelek het, maar nie tydens rooi ligstimulasie gelek het nie. Op die eerste dag van opleiding het die diere geen verskil in lek getoon toe hulle met blou of rooi lig gestimuleer is nie. Op dag 15 het diere wat met hCO oorgeplant is wat hChR2-EYFP uitdruk, egter meer aktiewe lek getoon toe hulle met blou lig gestimuleer is in vergelyking met rooi ligstimulasie. Hierdie veranderinge in lekgedrag is nie waargeneem in kontrolediere wat oorgeplant is met hCO wat die kontrolefluorofoor uitdruk nie (leersukseskoers: hChR2 89%, EYFP 0%, Figuur 5i-1 en Aanvullende Video 2). Hierdie data dui daarop dat t-hCO-selle rotneurone kan aktiveer om beloningsoekende gedrag te stimuleer. Om uit te vind watter rot t-hCO neurale stroombane by hierdie gedragsveranderinge betrokke mag wees, het ons t-hCO optogeneties in opgeleide diere geaktiveer en weefsels 90 minute later geoes. Immunohistochemie het die uitdrukking van die aktiwiteitsafhanklike FOS-proteïen in verskeie breinstreke wat betrokke is by gemotiveerde gedrag, getoon, insluitend die mediale prefrontale korteks, mediale talamus en periaqueductale grysstof, wat óf in ongestimuleerde kontrolediere óf in diere uitgedruk is. rys. 5m). Saamgeneem dui hierdie data daarop dat t-hCO rotneurone-aktiwiteit kan moduleer om gedrag te dryf.
Neurale organoïede verteenwoordig 'n belowende stelsel vir die bestudering van menslike ontwikkeling en siektes in vitro, maar hulle word beperk deur die gebrek aan verbindings tussen stroombane wat in vivo bestaan. Ons het 'n nuwe platform ontwikkel waarin ons hCO in S1 van immuungekompromitteerde vroeë postnatale rotte oorgeplant het om menslike selontwikkeling en -funksie in vivo te bestudeer. Ons het getoon dat t-hCO volwasse seltipes ontwikkel wat nie in vitro waargeneem word nie28 en dat t-hCO anatomies en funksioneel in die knaagdierbrein geïntegreer is. Die integrasie van t-hCO in knaagdierneurale stroombane het ons toegelaat om 'n verband tussen menslike sellulêre aktiwiteit en bestudeerde dieregedrag te vestig, wat toon dat t-hCO neurone rotneurone-aktiwiteit kan moduleer om gedragsreaksies te dryf.
Die platform wat ons beskryf, het verskeie voordele bo vorige navorsing oor die oorplanting van menslike selle in knaagdierbreine. Eerstens het ons hCO3 in die ontwikkelende korteks van vroeë postnatale rotte oorgeplant, wat anatomiese en funksionele integrasie kan vergemaklik. Tweedens het t-hCO3 MRI-monitering ons toegelaat om oorplantingsposisie en -groei in lewende diere te bestudeer, wat ons in staat stel om langtermyn multi-dierstudies uit te voer en die betroubaarheid van verskeie hiPS-sellyne vas te stel. Laastens het ons intakte organoïede oorgeplant, eerder as geïsoleerde enkelsel-suspensies, wat minder vernietigend vir menslike selle is en die integrasie en generering van menslike korteksneurone in rotbreine kan bevorder.
Ons erken dat ten spyte van vooruitgang in hierdie platform, temporale, ruimtelike en kruisspesiebeperkings die vorming van menslike neurale stroombane met hoë getrouheid verhoed, selfs na oorplanting in 'n vroeë stadium van ontwikkeling. Dit is byvoorbeeld nie duidelik of die spontane aktiwiteit wat in t-hCO waargeneem word, 'n ontwikkelingsfenotipe verteenwoordig soortgelyk aan die ritmiese aktiwiteit wat tydens kortikale ontwikkeling waargeneem word nie, of dit te wyte is aan die afwesigheid van onderdrukkende seltipes wat in t-hCO teenwoordig is. Net so is dit nie duidelik in watter mate die afwesigheid van laminering in t-hCO kettingkonnektiwiteit beïnvloed nie30. Toekomstige werk sal fokus op die integrasie van ander seltipes soos menslike mikroglia, menslike endoteelselle en verskillende verhoudings van GABAergiese interneurone soos getoon met behulp van samestelling 6 in vitro, asook om te verstaan ​​hoe neurale integrasie en verwerking in veranderde t-hCO transkripsie-, sinaptiese en gedragsvlakke in selle wat van pasiënte verkry is.
Oor die algemeen verteenwoordig hierdie in vivo-platform 'n kragtige hulpbron wat in vitro menslike breinontwikkeling en siektenavorsing kan aanvul. Ons verwag dat hierdie platform ons in staat sal stel om nuwe stringvlak-fenotipes in andersins ontwykende pasiënt-afgeleide selle te ontdek en nuwe terapeutiese strategieë te toets.
Ons het hCO2.5 uit HiPS-selle gegenereer soos voorheen beskryf. Om hCO2-produksie uit hiPS-selle wat op voedingslae gekweek is, te begin, is intakte kolonies hiPS-selle uit kultuurskottels verwyder met behulp van dispase (0.35 mg/ml) en oorgedra na ultra-lae-aanhegtingsplastiekkulture wat skottels met hiPS-selkultuurmedium (Corning) bevat, aangevul met twee SMAD-inhibeerders dorsomorfien (5 μM; P5499, Sigma-Aldrich) en SB-431542 (10 μM; 1614, Tocris) en ROCK-inhibeerder Y-27632 (10 μM; S1049, Selleckchem). Gedurende die eerste 5 dae is die hiPS-selmedium daagliks vervang en dorsomorfien en SB-431542 is bygevoeg. Op die sesde dag in suspensie is neurale sferoïede oorgedra na 'n neurale medium wat neurobasaal-A (10888, Life Technologies), B-27-aanvulling sonder vitamien A (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies), penisillien en streptomisien (1:100, Life Technologies) bevat en aangevul is met die epidermale groeifaktor (EGF; 20 ng ml−1; R&D Systems) en fibroblastgroeifaktor 2 (FGF2; 20 ng ml−1; R&D Systems) tot dag 24. Van dag 25 tot dag 42 is die medium aangevul met brein-afgeleide neurotrofiese faktor (BDNF; 20 ng ml−1, Peprotech) en neurotrofien 3 (NT3; 20 ng ml−1; Peprotech) met mediumveranderings elke tweede dag. Op die sesde dag in suspensie is neurale sferoïede oorgedra na 'n neurale medium wat neurobasaal-A (10888, Life Technologies), B-27-aanvulling sonder vitamien A (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies), penisillien en streptomisien (1:100, Life Technologies) bevat en aangevul is met die epidermale groeifaktor (EGF; 20 ng ml−1; R&D Systems) en fibroblastgroeifaktor 2 (FGF2; 20 ng ml−1; R&D Systems) tot dag 24. Van dag 25 tot dag 42 is die medium aangevul met brein-afgeleide neurotrofiese faktor (BDNF; 20 ng ml−1, Peprotech) en neurotrofien 3 (NT3; 20 ng ml−1; Peprotech) met mediumveranderings elke tweede dag.Op die sesde dag in suspensie is die neurale sferoïede oorgedra na 'n neurale medium wat Neurobasal-A (10888, Life Technologies), B-27-aanvulling sonder vitamien A (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies), penisillien bevat.и стрептомицин (1:100, Life Technologies) en дополнены эпидермальным фактором роста (EGF; 20 нг/ml; R&D Systems) en факторофи робста20GF; нг/мл; R&D-stelsels) tot 24-dag. en streptomisien (1:100, Life Technologies) en aangevul met epidermale groeifaktor (EGF; 20 ng/ml; R&D Systems) en fibroblastgroeifaktor 2 (FGF2; 20 ng/ml; R&D Systems) tot dag 24.Van dae 25 tot 42 is brein-afgeleide neurotrofiese faktor (BDNF; 20 ng ml-1, Peprotech) en neurotrofien 3 (NT3; 20 ng ml-1, Peprotech) by die medium gevoeg, en die medium is elke tweede dag vervang.在悬浮的第6 天，将神经球体转移到含有neurobasal-A（10888，Life Technologies）、不含维生焠B-27生焠补充剂（12587，Life Technologies）、GlutaMax（1:100，Life Technologies）、青霉素的神经培养基丠和铼霉:100， Tegnologieë）并辅以表皮生长因子（EGF；20 ng ml-1；R&D Systems）和成纤维细胞生长因子2（FGF2；20 ng ml-1；R&D Systems）直至第24 天.在 悬浮 的 第 第 6 天 将 神经 球体 转移 含有 含有 neurobasal-a （10888 ， Life Technologies０ 焫 縻b-27. Tegnologieë） 表皮 生长 因子 （（（20 ng ml-1 ； r & d Systems） 成 纤维 细胞 生长 2 （fgf2 ； 20 ng ml- 1；R&D SystemsＳ因㬛2 На 6-й день суспензии нейросферы были переведены на добавку, содержащую нейробазал-А (10888, Life Technologies), tot 27. А (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies), пенициллин- нейтрализованный стрептомицин (1:100, Life Technologies) с добавлением эпицин (EGF; 20 нг мл-1; R&D Systems) en фактора роста фибробластов 2 (FGF2; 20 нг ml-1) 1; Op dag 6 is neurosfeersuspensies oorgeskakel na 'n aanvulling wat neurobasal-A (10888, Life Technologies), B-27-aanvulling sonder vitamien A (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies), penisillien-geneutraliseerde streptomisien (1:100, Life Technologies) aangevul met epidermale groeifaktor (EGF; 20 ng ml-1; R&D Systems) en fibroblastgroeifaktor 2 (FGF2; 20 ng ml-1) bevat. R&D-stelsels) tot 24 dae. R&D-stelsels) tot dag 24.Van dae 25 tot 42 is brein-afgeleide neurotrofiese faktor (BDNF; 20 ng ml-1, Peprotech) en neurotrofiese faktor 3 (NT3; 20 ng ml-1, Peprotech) elke tweede dag by die kweekmedium gevoeg. Mediumverandering een keer.Vanaf dag 43 is hCO₂ gehandhaaf in ongesupplementeerde neurobasale-A medium (NM; 1088022, Thermo Fisher) met mediumverandering elke 4-6 dae. Om hCO₂ te verkry van hiPS-selle wat onder voedingslose toestande gekweek is, is hiPS-selle vir 7 minute met Accutase (AT-104, Innovate Cell Technologies) by 37°C geïnkubeer, in enkelselle gedissosieer en op AggreWell 800-plate (34815, STEMCELL Technologies) teen 'n digtheid van 3 × 10⁶ enkelselle per putjie in Essential 8-medium aangevul met die ROCK-inhibeerder Y-27632 (10 μM; S1049, Selleckchem) uitgeplaat. Na 24 uur is die media in die putjies op en af ​​gepipetteer in media wat Essential 6-media bevat (A1516401, Life Technologies) aangevul met dorsomorfien (2.5 μM; P5499, Sigma-Aldrich) en SB-431542 (10 μM; 1614), Tocrida. Van dae 2 tot 6 is Essential 6-medium daagliks vervang met dorsomorfien en aanvulling SB-431542. Vanaf die sesde dag is die neurosfeersuspensies na die neurobasale medium oorgedra en soos hierbo beskryf in stand gehou.
Alle dierprosedures is uitgevoer in ooreenstemming met die dieresorgriglyne wat deur die Stanford Universiteit Laboratorium Dieresorg Administratiewe Komitee (APLAC) goedgekeur is. Dragtige eutimiese RNU (rnu/+) rotte is aangekoop (Charles River Laboratories) of gehuisves. Diere is op 'n 12-uur lig-donker siklus gehou met kos en water ad libitum. Naak (FOXN1–/–) rotwelpies van drie tot sewe dae oud is geïdentifiseer deur die groei van onvolwasse snorre voor uitdunning. Welpies (manlik en wyfie) is verdoof met 2-3% isofluraan en op 'n stereotaksiese raam geplaas. 'n Trepanasie van die skedel met 'n deursnee van ongeveer 2-3 mm bo S1 is uitgevoer terwyl die integriteit van die dura mater gehandhaaf is. Gebruik dan 'n 30-G naald (ongeveer 0.3 mm) net buite die kraniotomie om die dura deur te steek. Dien dan HCO3 toe op 'n dun 3×3 cm parafilm en verwyder oortollige medium. Gebruik 'n Hamilton-spuit wat aan 'n 23 G, 45° naald gekoppel is, en trek versigtig hCO₂ in die mees distale punt van die naald op. Installeer dan die spuit op die spuitpomp wat aan die stereotaksiese toestel gekoppel is. Plaas dan die punt van die naald oor 'n voorheen gemaakte 0.3 mm wye gaatjie in die dura (z = 0 mm) en vernou die spuit 1-2 mm (z = ongeveer –1.5 mm) totdat die naald tussen die dura mater A is. 'n digte seël word gevorm. Lig dan die spuit na die middel van die kortikale oppervlak by z = -0.5 mm en spuit hCO₂ in teen 'n tempo van 1-2 µl per minuut. Na voltooiing van die hCO₂ inspuiting word die naald teruggetrek teen 'n tempo van 0.2-0.5 mm per minuut, die vel word vasgeheg en die hondjie word onmiddellik op 'n warm verwarmingskussing geplaas tot volledige herstel. Sommige diere is bilateraal oorgeplant.
Alle dierprosedures is uitgevoer in ooreenstemming met Stanford Universiteit se APLAC-goedgekeurde dieresorgriglyne. Rotte (groter as 60 dae na oorplanting) is geïnduseer met 5% isofluraan-narkose en verdoof met 1-3% isofluraan tydens beeldvorming. Vir visualisering is 'n 7 Tesla aktief afgeskermde horisontale boorgatskandeerder Bruker (Bruker Corp.) met 'n International Electric Company (IECO) gradiëntaandrywer, 'n afgeskermde gradiëntinsetsel met 'n interne deursnee van 120 mm (600 mT/m, 1000 T/m/s) gebruik met behulp van AVANCE. III, agtkanaal-multispoel RF- en multikernvermoëns, en die gepaardgaande Paravision 6.0.1-platform. Opname is uitgevoer met behulp van 'n aktief ontkoppelde volumetriese RF-spoel met 'n interne deursnee van 86 mm en 'n vierkanaal-krio-verkoelde RF-spoel slegs vir ontvangs. Aksiale 2D Turbo-RARE (herhalingstyd = 2500 ms, eggotyd = 33 ms, 2 gemiddeldes) met 16 snyopnames, snydikte 0.6–0.8 mm, wat 256 × 256 monsters bevat. Die seine is ontvang met behulp van 'n kwadratuur-sender-ontvanger volumetriese RF-spoel met 'n interne deursnee van 2 cm (Rapid MR International, LLC). Gebruik laastens die ingeboude Imaris (BitPlane) oppervlakberamingsfunksies vir 3D-weergawes en volume-analise. 'n Suksesvolle oorplanting is gedefinieer as een waarin areas van kontinue T2-geweegde MRI-sein in die oorgeplante hemisfeer gevorm is. Transplantaatverwerping is gedefinieer as 'n oorplanting wat nie areas van kontinue T2-geweegde MRI-sein in die oorgeplante hemisfeer geproduseer het nie. Subkortikale t-hCO is van daaropvolgende analise uitgesluit.
Om GCaMP6s stabiel in hCO₂ vir twee-foton kalsiumbeelding uit te druk, is hiPS-selle besmet met pLV[Exp]-EF1a::GcaMP6s-WPRE-Puro, gevolg deur die seleksie van antibiotika. Kortliks, selle is gedissosieer met EDTA en gesuspendeer in 1 ml Essential 8-medium teen 'n digtheid van ongeveer 300 000 selle in die teenwoordigheid van polibreen (5 μg/ml) en 15 μl virus. Die selle is toe vir 60 minute in suspensie geïnkubeer en gesaai teen 'n digtheid van 50 000 selle per putjie. Na konfluensie is selle behandel met 5-10 μg ml-1 puromisien vir 5-10 dae of totdat stabiele kolonies verskyn het. Akute hCO₂-infeksie is uitgevoer soos voorheen beskryf5 met 'n paar wysigings. Kortliks, oordra dag 30-45 hCO₂ na 1.5 ml Eppendorf-mikrosentrifugebuise wat 100 μl senumedium bevat. Dan word ongeveer 90 µl van die medium verwyder, 3-6 µl hoëtiter lentivirus (van 0.5 x 108 tot 1.2 x 109) word by die buis gevoeg, en die hCO3 word vir 30 minute na die inkubeerder oorgedra. Voeg dan 90-100 µl medium by elke buis en plaas die buise oornag terug in die inkubeerder. Die volgende dag, dra hCO3 oor na vars senumedium in lae-aanhegtingsplate. Na 7 dae is hCO3 oorgedra na 24-putjie glasbodemplate vir visualisering en evaluering van infeksiekwaliteit. pLV[Exp]-SYN1::EYFP-WPRE en pLV[Exp]-SYN1::hChR2-EYFP-WPRE is deur VectorBuilder gegenereer. Lentivirus word in die meeste eksperimente gebruik omdat dit in die gasheergenoom geïntegreer is, wat verslaggewergeen-ekspressie in besmette sellyne moontlik maak. Vir hondsdolheid-opvolg is dag 30-45 hCO ko-besmet met hondsdolheid-ΔG-eGFP en AAV-DJ-EF1a-CVS-G-WPRE-pGHpA (plasmied #67528, Addgene), deeglik gewas vir 3 dae, en oorgeplant in rotte in S1 en in vivo gehou vir 7-14 dae.
Vir immunositokemie is diere verdoof en transkardiaal geperfuseer met PBS, gevolg deur 4% paraformaldehied (PFA in PBS; Elektronmikroskopiewetenskappe). Breine is vir 2 uur of oornag by 4°C in 4% PFA gefikseer, vir 48-72 uur in 30% sukrose in PBS kriopreserveer, en ingebed in 1:1, 30% sukrose: OCT (Tissue-Tek OCT Compound 4583, Sakura Finetek) en koronale snitte is teen 30 µm gemaak met behulp van 'n kriostaat (Leica). Vir immunohistochemie van dik snitte is diere met PBS geperfuseer, en die brein is gedissekteer en koronaal gesny teen 300-400 µm met behulp van 'n vibratoom (Leica) en die snitte is vir 30 minute met 4% PFA gefikseer. Toe is krioseksies of dik snitte met PBS gewas, vir 1 uur by kamertemperatuur geblokkeer (10% normale donkieserum (NDS) en 0.3% Triton X-100 verdun in PBS) en geblokkeer met blokkeringsoplossing by 4°C. – Inkubasie Krioseksies is oornag geïnkubeer en dik snitte is vir 5 dae geïnkubeer. Primêre teenliggaampies wat gebruik is, was: anti-NeuN (muis, 1:500; ab104224, abcam) anti-CTIP2 (rot, 1:300; ab18465, abcam), anti-GFAP (konyn, 1:1 000; Z0334, Dako), anti-GFP (hoender, 1:1 000; GTX13970, GeneTex), anti-HNA (muis, 1:200; ab191181, abcam), anti-NeuN (konyn, 1:500; ABN78, Millipore), anti-PDGFRA (konyn, 1:200; sc-338, Santa Cruz), anti-PPP1R17 (konyn, 1:200; HPA047819, Atlas Antibodies), anti-RECA-1 (muis, 1:50; ab9774, abcam), anti-SCG2 (konyn, 1:100; 20357-1-AP, Proteintech), anti-SOX9 (bok, 1:500; AF3075, R&D Systems), Netrin G1a (bok, 1:100; AF1166, R&D Systems), anti-STEM121 (muis, 1:200; Y40410, Takara Bio), anti-SATB2 (muis, 1:50; ab51502, abcam), anti-GAD65/67 (konyn, 1:400; ABN904, Millipore) en anti-IBA1 (bok, 1:100; ab5076, abcam). Primêre teenliggaampies wat gebruik is, was: anti-NeuN (muis, 1:500; ab104224, abcam) anti-CTIP2 (rot, 1:300; ab18465, abcam), anti-GFAP (konyn, 1:1 000; Z0334, Dako), anti-GFP (hoender, 1:1 000; GTX13970, GeneTex), anti-HNA (muis, 1:200; ab191181, abcam), anti-NeuN (konyn, 1:500; ABN78, Millipore), anti-PDGFRA (konyn, 1:200; sc-338, Santa Cruz), anti-PPP1R17 (konyn, 1:200; HPA047819, Atlas Antibodies), anti-RECA-1 (muis, 1:50; ab9774, abcam), anti-SCG2 (konyn, 1:100; 20357-1-AP, Proteintech), anti-SOX9 (bok, 1:500; AF3075, R&D Systems), Netrin G1a (bok, 1:100; AF1166, R&D Systems), anti-STEM121 (muis, 1:200; Y40410, Takara Bio), anti-SATB2 (muis, 1:50; ab51502, abcam), anti-GAD65/67 (konyn, 1:400; ABN904, Millipore) en anti-IBA1 (bok, 1:100; ab5076, abcam). Использовались следующие первичные антитела: анти-NeuN (мышиные, 1:500; ab104224, abcam), анти-CTIP2 (крысин:305, abcam, abcam, abcam, abcam, abcam, abcam, abcam, abcam), анти-GFAP (кроличьи, 1:1000; Z0334, Dako), анти- -GFP (курица, 1:1000; GTX13970, GeneTex), анти-HNA (мышь, 1:200; ab19118), (тикаm,-Neu, ab19118), 1:500; ABN78, Millipore), анти-PDGFRA (кролик, 1:200; sc-338, Санта-Круз), анти-PPP1R17 (кролик, 1:200; HPA047819, Atlas Antibodies), анти-RECA-1 (мышь, 1:50; ab9774, abcam), анти-SCG2, анти-SCG2; 20357-1-AP, Proteintech), анти-SOX9 (козий, 1:500; AF3075, R&D Systems), нетрин G1a (козий, 1:100; AF1166, R&D Systems), анти-STEM121 (мыный, 120ши; м20ши; Y40410, Takara Bio), анти-SATB2 (мышь, 1:50; ab51502, abcam), анти-GAD65/67 (кролик, 1:400; ABN904, Millipore) en анти-IBA1 (коза, 1:100; аб5076, абкам). Die primêre teenliggaampies wat gebruik is, was: anti-NeuN (muis, 1:500; ab104224, abcam), anti-CTIP2 (rot, 1:300; ab18465, abcam), anti-GFAP (haas, 1:1000; Z0334, Dako), anti-GFP (hoender, 1:1000; GTX13970, GeneTex), anti-HNA (muis, 1:200; ab191181, abcam), anti-NeuN (haas, 1:500; ABN78, Millipore), anti-PDGFRA (haas, 1:200; sc-338, Santa Cruz), anti-PPP1R17 (haas, 1:200; HPA047819, Atlas Antibodies), anti-RECA-1 (muis, 1:50; ab9774, abcam), anti-SCG2 (konyn, 1:100; 20357-1-AP, Proteintech), anti-SOX9 (bok, 1:500; AF3075, R&D Systems), netrien G1a (bok, 1:100; AF1166, R&D Systems), anti-STEM121 (muis, 1:200; Y40410, Takara Bio), anti-SATB2 (muis, 1:50; ab51502, abcam), anti-GAD65/67 (konyn, 1:400; ABN904, Millipore) en anti-IBA1 (bok, 1:100; ab5076, abkam).使用的一抗是：抗NeuN（小鼠，1:500；ab104224，abcam）抗CTIP2（大鼠，1:3 00；ab18465，abcam），抗GFAP（兔，1:1,000；Z0334，Dako），抗-GF P（鸡，1:1,000；GTX13970，GeneTex），抗HNA（小鼠，1:200；ab1911 81，abcam），抗NeuN（兔，1:500；ABN78，Millipore），抗PDGFRA（兔， 1:200；sc-338，Santa Cruz），抗PPP1R17（兔，1:200；HPA047819，Atlas抗体），抗RECA-1（小鼠，1:50；ab9774，abcam），抗SCG2（兔）, 1:100；20357-1-AP，Proteintech），抗SOX9（山羊，1:500；AF3075，R&D Systems），Netrin G1a（山羊，（山羊＼，，1:10AF，1:10 Systems），抗STEM121（小鼠, 1:200;使用的一抗是：抗NeuN（小鼠，1:500；ab104224，abcam）抗CTIP2（大鼠，1 :300；ab18465，abcam），抗GFAP（兔，1:1,000；Z0334，Dako），抗-GFP（鸡，1:1,000；GTX13970，GeneTex），抗HNA（小鼠，1:200；ab 191181，abcam），抗NeuN（兔，1:500；ABN78，Millipore％弔，抗1: 200；sc-338，Santa Cruz），抗PPP1R17（兔，1:200；HPA047819，Atlas抗体），抗RECA-1（小鼠，1:50；ab9774，abcam），抗SCG2 nr Stelsels）頏1:20, ;Y40410, Takara Bio), anti-SATB2 (muis, 1:50; ab51502, abcam), anti-GAD65/67 (haas, 1:400; ABN904, Millipore) en anti-IBA1 (bok, 1:100; ab5076, abcam).Die primêre teenliggaampies wat gebruik is, was: anti-NeuN (muis, 1:500; ab104224, abcam), anti-CTIP2 (rot, 1:300; ab18465, abcam), anti-GFAP (konyn, 1:1000; Z0334, Dako). , anti-GFP (hoender, 1:1000; GTX13970, GeneTex), anti-HNA (muis, 1:200; ab191181, abcam), anti-NeuN (konyn, 1:500; ABN78, Millipore), anti-PDGFRA (konyn, 1:200; sc-338, Santa Cruz), anti-PPP1R17 (konyn, 1:200; HPA047819, Atlas-teenliggaam), anti-RECA-1 (muis, 1:50; ab9774, abcam), anti-SCG2 (konyn), 1:100;20357-1-AP, Proteintech), анти-SOX9 (коза, 1:500; AF3075, R&D Systems), Нетрин G1a (коза, 1:100; AF1166, R&D Systems), анти -STEM120, мы4ш100, мы4ш100; Bio), анти-SATB2 (мышь, 1:50; ab51502, abcam), анти-GAD65/67 (кролик, 1:400; ABN904, Millipore) en анти-IBA1 (коза, 1:100; аба5076; аба5076). 20357-1-AP, Proteintech), anti-SOX9 (bok, 1:500; AF3075, R&D Systems), Netrin G1a (bok, 1:100; AF1166, R&D Systems), anti-STEM121 (muis, 1:200; Y40410, Takara Bio), anti-SATB2 (muis, 1:50; ab51502, abcam), anti-GAD65/67 (haas, 1:400; ABN904, Millipore), en anti-IBA1 (bok, 1:100; ab5076, abkam).Seksies is toe met PBS gewas en vir 1 uur by kamertemperatuur (bevrore seksies) of oornag by 4°C (dik seksies) met sekondêre teenliggaam geïnkubeer. Alexa Fluor sekondêre teenliggaam (Life Technologies) verdun 1:1000 in blokkeringsoplossing is gebruik. Na was met PBS is die kerne gevisualiseer met 'n Hoechst 33258 (Life Technologies). Laastens is die skyfies op 'n mikroskoop met dekglasies (Fisher Scientific) geplaas met behulp van 'n Aquamount (Polysciences) en op 'n Keyence fluoreserende mikroskoop (BZ-X ontleder) of 'n Leica TCS SP8 konfokale mikroskoop (Las-X) op die beeld geanaliseer. Die beelde is verwerk met behulp van die ImageJ-program (Fiji). Om die proporsie menslike neurone in t-hCO en die rotkorteks te kwantifiseer, is 387.5 μm wye reghoekige beelde geneem in die middel van die t-hCO, by of naby die rand van die rotkorteks. Oorplantingsmarges is bepaal deur veranderinge in weefseldeursigtigheid, HNA+ kerne en/of die teenwoordigheid van weefseloutofluoresensie te bepaal. In elke beeld is die totale aantal NeuN+ en HNA+ selle gedeel deur die totale aantal NeuN+ selle in dieselfde area. Om te verseker dat slegs selle met kerne in die beeldvlak getel word, word slegs selle wat ook Hoechst+ is in die berekening ingesluit. Twee beelde wat met ten minste 1 mm geskei is, is gemiddeld om die statistiese fout te verminder.
Een week voor monsterversameling, plaas hCO3-oorplantingsdiere (ongeveer 8 maande van differensiasie) in 'n donker kamer met snorre wat geknip is om sensoriese stimulasie te verminder. Isolasie van kerne is uitgevoer soos voorheen beskryf, met 'n paar wysigings. Kortliks, t-hCO3 en hCO3 is vernietig deur middel van detergent-meganiese sellise en 'n 2 ml glasweefselmaalmasjien (D8938, Sigma-Aldrich/KIMBLE). Die ru-kerne is toe afgefiltreer met behulp van 'n 40 µm filter en gesentrifugeer teen 320 g vir 10 minute by 4 °C voordat 'n sukrosedigtheidsgradiënt uitgevoer is. Na die sentrifugeringstap (320 g vir 20 min by 4 °C), is die monsters hersuspendeer in 0.04% BSA/PBS met die byvoeging van 0.2 eenhede µl-1 RNase-inhibeerder (40 u µl-1, AM2682, Ambion) en deur 'n 40 µm vloeifilter gelei. Die gedissosieerde kerne is toe hersuspendeer in PBS wat 0.02% BSA bevat en op 'n Chromium Single Cell 3′-skyfie gelaai (geraamde herwinning van 8 000 selle per baan). snRNA-seq-biblioteke is voorberei met die Chromium Single cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics). snRNA-seq-biblioteke is voorberei met die Chromium Single cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics). Библиотеки snRNA-seq были приготовлены с помощью Chromium Enkelsel 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics). Die snRNA-seq-biblioteke is voorberei met behulp van Chromium Single cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics). snRNA-seq 文库是使用Chromium Enkelsel 3′ GEM、Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics) 制备的。 snRNA-seq 文库是使用Chromium Enkelsel 3′ GEM、Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics) 制备的。 Библиотеку snRNA-seq готовили с использованием Chromium Single Cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics). Die snRNA-seq-biblioteek is voorberei met behulp van Chromium Single Cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics).Biblioteke van verskillende monsters is saamgevoeg en deur Admera Health op NovaSeq S4 (Illumina) gesekwensieer.
Geenekspressievlakke vir elke vermeende kernstrepieskode is gekwantifiseer met behulp van die 10x Genomics CellRanger-analisesagtewarepakket (weergawe 6.1.2). Spesifiek is die lesings vergelyk met 'n kombinasie van menslike (GRCh38, Ensemble, weergawe 98) en rot (Rnor_6.0, Ensemble, weergawe 100) verwysingsgenome wat met die mkref-opdrag geskep is en met behulp van count met die –include-introns=TRUE-opdrag om lesings wat na intronstreke gekarteer is, te kwantifiseer. Vir t-hCO-monsters is menslike kerne geïdentifiseer gebaseer op die konserwatiewe vereiste dat ten minste 95% van alle gekarteerde lesings ooreenstem met die menslike genoom. Alle daaropvolgende ontledings is uitgevoer op 'n gefiltreerde strepieskode-skikking wat van die CellRanger afkomstig is met behulp van die R-pakket (weergawe 4.1.2) Seurat (weergawe 4.1.1)32.
Om te verseker dat slegs hoëgehalte-kerne in die daaropvolgende analise ingesluit word, is 'n iteratiewe filterproses vir elke monster geïmplementeer. Eerstens word laegehalte-kerne met minder as 1000 unieke gene gevind en meer as 20% van die totale mitochondria geïdentifiseer en verwyder. Vervolgens is die rou geennommermatriks genormaliseer deur geregulariseerde negatiewe binomiale regressie met behulp van die sctransform(vst.flavor=”v2″)-funksie, wat ook die 3000 mees veranderlike gene geïdentifiseer het met behulp van standaardparameters. Dimensievermindering is uitgevoer op die boonste veranderlike gene met behulp van Hoofkomponentanalise (PCA) met standaardparameters met behulp van 'n datasteldimensie van 30 (dims = 30 is gekies op grond van visuele inspeksie van knie-plekke en gebruik vir alle monsters en ensemble-ontledings). Ons het toe verskeie rondes van iteratiewe groepering (resolusie = 1) uitgevoer om gene te klassifiseer op grond van abnormaal lae geentelling (mediaan onder 10de persentiel), abnormaal hoë mitochondriale geentelling (mediaan bo 95ste persentiel) om vermeende selle van lae gehalte te identifiseer en te verwyder. Groepe en/of 'n hoë proporsie vermeende tweelinge wat geïdentifiseer is met behulp van die DoubletFinder33-pakket (gemiddelde DoubletFinder-telling bo die 95ste persentiel). t-hCO-monsters (n=3) en hCO-monsters (n=3) is afsonderlik geïntegreer met behulp van die IntegrateData-funksie met die bogenoemde parameters. Daarna 'n Ander rondte kwalitatiewe filtrering van die geïntegreerde datastel is uitgevoer soos hierbo beskryf.
Nadat die lae kwaliteit pitte verwyder is, is die geïntegreerde datastel gegroepeer (resolusie = 0.5) en ingebed vir UMAP34-visualiseringsdoeleindes. Merkergene vir elke groep is bepaal met behulp van die FindMarkers-funksie met standaardparameters bereken uit genormaliseerde geenekspressiedata. Ons identifiseer en klassifiseer hoofselklasse deur fetale en volwasse kortikale verwysingsdatastelle te kombineer met merkergeenekspressie 19,20,21,35 en annotasie. In die besonder is sirkulerende voorlopers geïdentifiseer deur die uitdrukking van MKI67 en TOP2A. Voorlopergroepe is gedefinieer deur die afwesigheid van mitotiese transkripsies, hoë oorvleueling met multipotente gliale voorlopergroepe wat in die laat metafase fetale korteks beskryf word, en EGFR- en OLIG1-uitdrukking. Ons gebruik die term astrosiet om verskeie toestande van astrosietdifferensiasie te omvat, van laat radiale glia tot volwassenheid van astrosiete. Astrosietgroepe druk hoë vlakke van SLC1A3 en AQP4 uit en daar is getoon dat dit karteer met subtipes van fetale radiale glia en/of volwasse astrosiete. OPC's druk PDGFRA en SOX10 uit terwyl oligodendrosiete miëlieniseringsmerkers (MOG en MYRF) uitdruk. Glutamatergiese neurone is geïdentifiseer deur die teenwoordigheid van neuronale transkripsies (SYT1 en SNAP25), die afwesigheid van GABAergiese merkers (GAD2), en die uitdrukking van NEUROD6, SLC17A7, BCL11B, of SATB2. GluN-neurone is verder verdeel in boonste (SATB2-uitdrukking en verlies van BCL11B) en diep (BCL11B-uitdrukking) subklasse. Vermeende subplaat (SP) neurone druk bekende SP18-merkers soos ST18 en SORCS1 uit, benewens diep GluN-merkers. Choroïedpleksus-agtige selle is geïdentifiseer deur TTR-uitdrukking, en meningeale-agtige selle het fibroblast-geassosieerde gene uitgedruk en pial/vaskulêre selle van die verwysingsdatastel gekarteer.
Differensiële analise van geenekspressie tussen t-hCO en hCO subklasse is uitgevoer met behulp van 'n nuut ontwikkelde pseudo-bondelmetode wat gereproduseer is in monsters wat geïmplementeer is met behulp van die Libra R-pakket (weergawe 1.0.0). Spesifiek is edgeR log-waarskynlikheidstoetse (weergawe 3.36.0, pakket R) vir groepe uitgevoer deur die aantal gene in selle vir 'n gegewe selsklas vir elke monsterreplikasie op te som. Vir hittekaartvisualisering word genormaliseerde per miljoen (CPM) waardes bereken met behulp van edgeR (cpm() funksie) en geskaal (om gemiddelde = 0, standaardafwyking = 1 te bereik). Geenontologie (GO) verrykingsanalise van beduidend opgereguleerde t-hCO GluN gene is uitgevoer (Benjamini-Hochberg gekorrigeerde P-waarde van minder as 0.05 uitgedruk in ten minste 10% van t-hCO GluN selle en 'n voutoename in verandering van ten minste 2 keer) uitgevoer met behulp van ToppGene Suite (https://toppgene.cchmc.org/)37. Ons gebruik die ToppFun-app met standaardparameters en rapporteer Benjamini-Hochberg-gekorrigeerde P-waardes bereken uit GO-geannoteerde hipergeometriese toetse.
Om ons snRNA-seq-groepe te pas by geannoteerde selgroepe uit verwysingsstudies van primêre enkelsel-RNA-seq of volwasse snRNA-seq19,20,21,22, het ons 'n gepaarde datastel-integrasiebenadering toegepas. Ons het die SCTransform (v2) normaliseringswerkvloei in Seurat gebruik om groepoorvleuelings tussen datastelle te integreer en te vergelyk (met behulp van dieselfde parameters as hierbo). Individuele datastelle is ewekansig tot 500 selle of kerne per oorspronklike groep vir berekeningsdoeltreffendheid verdeel. Deur 'n soortgelyke benadering as voorheen beskryf te gebruik, is groepoorvleueling gedefinieer as die proporsie selle of kerne in elke saamgevoegde groep wat oorvleuel het met die etiket van die verwysingsgroep. Om GluN's verder te klassifiseer, het ons Seurat se TransferData-werkvloei vir GluN-subgroepdata gebruik om verwysingsdatasteletikette aan ons GluN-selle toe te ken.
Om die volwassenheidsstatus van die globale transkriptoom van t-hCO en hCO monsters te bepaal, het ons ons pseudo-bulk monsters vergelyk met BrainSpan/psychENCODE23, wat bestaan ​​uit 'n groot RNA-volgorde wat menslike breinontwikkeling omspan. Ons het PCA uitgevoer op 'n gekombineerde patroon-genormaliseerde geenekspressiematriks van kortikale monsters 10 weke na bevrugting en later, in 5567 gene (saam met ons data) wat voorheen as aktief in BrainSpan kortikale monsters geïdentifiseer is (gedefinieer as groter as 50% in ontwikkelingsvariansie verklaar deur ouderdom met behulp van 'n kubieke model)38. Daarbenewens het ons gene afgelei wat verband hou met belangrike transkriptoomhandtekeninge van neuro-ontwikkeling deur gebruik te maak van nie-negatiewe matriksfaktorisering soos voorheen beskryf. Die monstergewigte wat bereken is met behulp van die nie-negatiewe matriksfaktoriseringsprosedure word in Fig. 5b geplot met uitgebreide data vir elk van die vyf handtekeninge wat deur Zhu et al.38 beskryf word. Weereens is aktiwiteitsafhanklike transkripsiemerkers afgelei van voorheen gepubliseerde studies. In die besonder was ERG en LRG beduidend opgereguleer in glutamatergiese neurone wat geïdentifiseer is deur die muis visuele korteks snRNA-seq-versameling na visuele stimulasie uit Aanvullende Tabel 3 Hrvatin et al.16. Menslik verrykte LRG's is verkry uit KCl-geaktiveerde menslike fetale breinkulture en 6 uur na stimulasie geoes, en die gefiltreerde gene was beduidend opgereguleer in mense, maar nie in knaagdiere nie (Aanvullende Tabel 4). Analise van geenstelverryking met behulp van hierdie geenstelle is uitgevoer met behulp van 'n eenrigting Fisher se presiese toets.
Verdoof rotte met isofluraan, verwyder breine en plaas in koue (ongeveer 4°C) geoksigeneerde (95% O2 en 5% CO2) sukrose-oplossing vir snitte wat bevat: 234 mM sukrose, 11 mM glukose, 26 mM NaHCO3, 2.5 mM KCl, 1.25 mM NaH2PO4, 10 mM MgSO4 en 0.5 mM CaCl2 (ongeveer 310 mOsm). Rotbrein koronale snitte (300–400 µm) wat t-hCO3 bevat, is gemaak met behulp van 'n Leica VT1200 vibratome soos voorheen beskryf39. Snitte is toe oorgedra na 'n snykamer met deurlopende kamertemperatuur-oksigenasie wat aCSF bevat, voorberei uit: 10 mM glukose, 26 mM NaHCO3, 2.5 mM KCl, 1.25 mM NaHPO4, 1 mM MgSO4, 2 mM CaCl2 en 126 mM NaCl (298 mOsm), ten minste 45 minute voor opname. Snitte is opgeneem in 'n ondergedompelde kamer waar hulle deurlopend geperfuseer is met aCSF (95% O2 en 5% CO2 flessie). Alle data is by kamertemperatuur opgeneem. t-hCO neurone is getermineer met 'n borosilikaatglaspipet gevul met 'n oplossing wat 127 mM kaliumglukonaat, 8 mM NaCl, 4 mM magnesium ATP, 0.3 mM natrium GTP, 10 mM HEPES, en 0.6 mM EGTA, pH 7.2, interne oplossing aangepas met KOH (290 mOsm) bevat. Om te herwin, is biositien (0.2%) by die opname-oplossing gevoeg.
Data is verkry met behulp van 'n MultiClamp 700B-versterker (Molecular Devices) en 'n Digidata 1550B-digitaliseerder (Molecular Devices), laagdeurlaatfiltreer teen 2 kHz, gedigitaliseer teen 20 kHz, en geanaliseer met behulp van Clampfit (Molecular Devices), Origin (OriginPro, 2021b, OriginLab) en persoonlike MATLAB-funksies (Mathworks). Die verbindingspotensiaal is bereken met behulp van JPCalc en die inskrywings is aangepas na die berekende waarde van -14 mV. Operasie IV bestaan ​​uit 'n reeks stroomstappe in 10-25 pA-stappe, van -250 tot 750 pA.
Die talamus, witstof en S1-afferente is elektries gestimuleer in talamokortikale snitte tydens pleister-klem-opname van hCO-neurone, soos voorheen beskryf. Kortliks, die brein is op 'n 3D-druktafel geplaas wat teen 'n hoek van 10° gekantel is, en die voorkant van die brein is teen 'n hoek van 35° gesny. Die brein is toe aan die snyoppervlak vasgeplak en deursnee gegaan, wat die talamokortikale uitstekende aksone behoue ​​laat bly. Bipolêre wolframelektrodes (0.5 MΩ) is op 'n tweede mikromanipulator gemonteer en strategies geposisioneer om vier streke per sel te stimuleer (binneste kapsule, witstof, S1 en hCO). Teken sinaptiese reaksies aan na 300 µA fasiese stimulasie teen 0.03–0.1 Hz.
hChR2-ekspressiewe hCO neurone is geaktiveer teen 480 nm en ligpulse wat deur 'n LED (Prizmatix) gegenereer is, is deur 'n ×40 objektief (0.9 NA; Olympus) toegepas om hChR2-ekspressie naby die selle op te neem. Die verligte velddiameter is ongeveer 0.5 mm en die totale krag is 10-20 mW. Die pulswydte is op 10 ms gestel, wat ooreenstem met die puls wat tydens die gedragsleer-eksperiment gegee is. Verskeie stimulasiefrekwensies is gebruik, van 1 tot 20 Hz, maar slegs die eerste puls van die reeks is vir kwantifisering gebruik. Die intervalle tussen treine is gewoonlik langer as 30 s om die effek op sinaptiese inhiberende of fasiliterende bane te minimaliseer. Om te toets of die hChR2-respons monosinapties was, het ons TTX (1 μM) op die bad toegepas totdat die EPSC-reaksie verdwyn het, en toe 4-aminopiridien (4-AP; 100 μM) toegepas. Tipies word 'n respons binne 'n paar minute terugbesorg, met 'n effens langer vertraging tussen LED-aanvuur en EPSC-generering. NBQX (10 μM) is gebruik om te toets of die reaksie deur AMPA-reseptore aangedryf word.
Skerp hCO₃-snitte is geskep soos voorheen beskryf. Kortliks, hCO₃-snitte is in 4% agarose ingebed en oorgedra na selle wat 126 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM NaH₂PO₄, 1 mM MgSO₄, 2 mM CaCl₂, 26 mM NaHCO₃ en 10 mM d-(+)-glukose bevat. Snitte is by kamertemperatuur teen 200–300 µm gesny met behulp van 'n Leica VT1200-vibrator en by kamertemperatuur in ASF gestoor. Daarna is 'n "patch-camp"-opname van hele selle op hCO₃-snitte onder 'n direkte SliceScope-mikroskoop (Scientifica) uitgevoer. Snitte is geperfuseer met aCSF (95% O₂ en 5% CO₂) en selseine is by kamertemperatuur opgeneem. hCO-neurone is toegedien met behulp van 'n borosilikaatglaspipet gevul met 'n oplossing wat 127 mM kaliumglukonaat, 8 mM NaCl, 4 mM magnesium ATP, 0.3 mM natrium GTP, 10 mM HEPES en 0.6 mM EGTA bevat, interne pH 7, 2, aangepas met KOH (osmolariteit 290). Vir herwinningsdoeleindes, voeg 0.2% Biocytin by die interne oplossing.
Data is verkry deur Clampex (Clampex 11.1, Molecular Devices) met behulp van 'n MultiClamp 700B-versterker (Molecular Devices) en 'n Digidata 1550B-digitaliseerder (Molecular Devices), laagdeurlaatfiltreer teen 2 kHz, gedigitaliseer teen 20 kHz, en geanaliseer met behulp van Clampfit (weergawe 10.6) vir analise, molekulêre toestelle) en persoonlike MATLAB-funksies (MATLAB 2019b, Mathworks). Die aansluitingspotensiaal is bereken met behulp van JPCalc en die inskrywings is aangepas na die berekende aansluitingspotensiaal van -14 mV. Operasie IV bestaan ​​uit 'n reeks stroomstappe in 5-10 pA-stappe van -50 tot 250 pA.
Vir morfologiese rekonstruksie van vasgeknypte neurone is 0.2% biositien (Sigma-Aldrich) by die interne oplossing gevoeg. Die selle word vir ten minste 15 minute na die inhakking voorberei. Die pipet word dan stadig vir 1-2 minute ingetrek totdat die geregistreerde membraan heeltemal verseël is. Na aanleiding van die snitfisiologieprosedure is die snitte oornag by 4°C in 4% PFA gefikseer, met PBS X3 gewas en 1:1000 verdun met streptavidien-gekonjugeerde DyLight 549 of DyLight 405 (Vector Labs). Selle gevul met biositien (2%; Sigma-Aldrich) is tydens pleisterklemopname by kamertemperatuur vir 2 uur gemerk. Die snitte is toe op mikroskopieskyfies gemonteer met behulp van 'n Aquamount (Thermo Scientific) en die volgende dag gevisualiseer op 'n Leica TCS SP8 konfokale mikroskoop met behulp van 'n olie-immersieobjektief met 'n numeriese diafragma ×40 1.3, vergroting ×0.9–1.0, xy. Die monsternemingstempo is ongeveer 7 pixels per mikron. Z-stapels met 1 µm-intervalle is serieel verkry, en z-stapelmosaïeke en Leica-gebaseerde outomatiese stikwerk is uitgevoer om die hele dendritiese boom van elke neuron te bedek. Neurone is toe semi-handmatig opgespoor met behulp van die neuTube 40-koppelvlak en SWC-lêers is gegenereer. Die lêers is toe opgelaai na die SimpleNeuriteTracer41 Fiji-inprop (ImageJ, weergawe 2.1.0; NIH).
Menslike kortikale weefsel is verkry met ingeligte toestemming volgens 'n protokol wat goedgekeur is deur die Institusionele Hersieningsraad van Stanford Universiteit. Twee monsters van menslike postpartumweefsel (3 en 18 jaar oud) is verkry deur reseksie van die frontale korteks (middelste frontale girus) as deel van chirurgie vir refraktêre epilepsie. Na reseksie, oes weefsel in yskoue NMDG-aCSF wat bevat: 92 mM NMDG, 2.5 mM KCl, 1.25 mM NaH2PO4, 30 mM NaHCO3, 20 mM HEPES, 25 mM glukose, 2 mM tioureum, 5 mM natriumaskorbaat, 3 mM natriumpiruvaat, 0.5 mM CaCl2 4H2O en 10 mM MgSO4 7H2O. Titreer tot pH 7.3-7.4 met gekonsentreerde soutsuur. Weefsels is binne 30 minute na die laboratorium afgelewer en koronale snitte is geneem volgens die prosedure wat hierbo beskryf is.
Alle dierprosedures is uitgevoer in ooreenstemming met Stanford Universiteit se APLAC-goedgekeurde dieresorgriglyne. Rotte (groter as 140 dae na oorplanting) is geïnduseer met 5% isofluraan-narkose en intraoperatief verdoof met 1-3% isofluraan. Diere is in 'n stereotaksiese raam (Kopf) geplaas en volgehoue ​​vrystelling van buprenorfien (SR) is subkutaan ingespuit. Die skedel word blootgestel, skoongemaak en 3-5 beenskroewe word geplaas. Om t-hCO3 te teiken, het ons stereotaksiese koördinate uit MRI-beelde gegenereer. 'n Boorgat is geboor op die plek van belang en vesels (400 µm deursnee, NA 0.48, Doric) is 100 µm onder die hCO3-oppervlak verlaag en aan die skedel vasgemaak met UV-uithardbare tandsement (Relyx).
Veselfotometriese opnames is uitgevoer soos voorheen beskryf42. Om spontane aktiwiteit op te neem, is rotte in 'n skoon hok geplaas en 'n veseloptiese koppelingskabel (Doric) met 'n diameter van 400 µm, gekoppel aan 'n veseloptiese fotometriese data-insamelingstelsel, is aan die geïmplanteerde veseloptiese kabel gekoppel. Gedurende die 10-minuut opname van motoriese aktiwiteit was die diere vry om die hok te verken. Om die opgewekte aktiwiteit op te neem, is rotte (meer as 140 dae na oorplanting) verdoof met 5% isofluraan vir induksie en 1-3% isofluraan vir onderhoud. Plaas die dier in 'n stereotaktiese raam (Kopf) en die snorre aan die teenoorgestelde kant van die t-hCO word tot ongeveer 2 cm gesny en deur 'n gaas gelei wat aan 'n piezo-elektriese aktuator (PI) gekoppel is. 'n 400 µm veseloptiese koppelingskabel (Doric) is aan die geïmplanteerde vesel gekoppel en aan die data-insamelingstelsel gekoppel. Die snorre aan die teenoorgestelde kant van t-hCO3 is toe 50 keer (2 mm teen 20 Hz, 2 s per aanbieding) op ewekansige tye deur 'n piezo-elektriese aandrywer oor 'n opnameperiode van 20 minute gedeflekteer. Gebruik die Arduino MATLAB-ondersteuningspakket om defleksietyd met persoonlike MATLAB-kode te beheer. Gebeure word met die data-insamelingsagteware gesinkroniseer deur transistor-transistor-logika (TTL)-pulse te gebruik.
Rotte (groter as 140 dae na oorplanting) is geïnduseer met 5% isofluraan-narkose en intraoperatief verdoof met 1-3% isofluraan. Diere is in 'n stereotaksiese raam (Kopf) geplaas en buprenorfien SR en deksametasoon is subkutaan ingespuit. Die skedel word blootgestel, skoongemaak en 3-5 beenskroewe word geplaas. Om t-hCO te teiken, het ons stereotaksiese koördinate vanaf MRI-beelde gegenereer. 'n Sirkelvormige kraniotomie (ongeveer 1 cm in deursnee) is met 'n hoëspoedboor direk oor die oorgeplante hCO uitgevoer. Sodra die been so dun as moontlik is, maar voordat daar deur die hele been geboor word, gebruik 'n tang om die oorblywende intakte bekkenskyf te verwyder om die onderliggende t-hCO te openbaar. Die kraniotomie is met steriele soutoplossing gevul, en 'n dekglas en 'n spesiale koppen is aan die skedel vasgemaak met UV-geharde tandsement (Relyx).
Twee-foton beelding is uitgevoer met behulp van 'n Bruker multifoton mikroskoop met 'n Nikon LWD (×16, 0.8 NA) objektief. GCaMP6 beelding is uitgevoer teen 920 nm met 1.4x enkele z-vlak vergroting en 8x gemiddeld van 7.5 fps. Rotte is geïnduseer met 5% isofluraan narkose en in stand gehou met 1-3% isofluraan. Die rotte is in 'n pasgemaakte kopbevestiging geplaas en onder die lens geposisioneer. 'n 3-minuut agtergrond opname van motoriese aktiwiteit is verkry. Oor die verloop van 20 minute se opname is 50 pufies (elke aanbieding 100 ms lank) ewekansig aan die snorpad teenoor t-hCO afgelewer met behulp van 'n picospricer. Gebruik die Arduino MATLAB Ondersteuningspakket om barstyd te beheer met pasgemaakte MATLAB kode. Sinkroniseer gebeure met data-insamelingsagteware (PrairieView 5.5) met behulp van TTL pulse. Vir analise is die beelde gekorrigeer vir xy beweging met behulp van affiene korreksie in die MoCo program wat in Fidji van stapel gestuur is. Ekstraksie van fluoreserende spore van individuele selle met behulp van CNMF-E43. Fluoresensie is vir elke streek van belang geëkstraheer, omgeskakel na dF/F-krommes, en dan omgeskakel na z-tellings.
Rotte (groter as 140 dae na oorplanting) is geïnduseer met 5% isofluraan-narkose en intraoperatief verdoof met 1-3% isofluraan. Diere is in 'n stereotaksiese raam (Kopf) geplaas en buprenorfien SR en deksametasoon is subkutaan ingespuit. Die snorre aan die teenoorgestelde kant van die t-hCO is tot ongeveer 2 cm gesny en deur 'n gaas geryg wat aan 'n piezo-elektriese aktuator gekoppel is. Die skedel word blootgestel en skoongemaak. 'n Vlekvrye staal-grondskroef word aan die skedel geheg. Om t-hCO te teiken, het ons stereotaksiese koördinate vanaf MRI-beelde gegenereer. Voer 'n sirkelvormige kraniotomie (ongeveer 1 cm in deursnee) uit met 'n hoëspoedboor net bokant die t-hCO. Sodra die been so dun as moontlik is, maar voordat jy deur die hele been boor, gebruik 'n tang om die oorblywende intakte bekkenskyf te verwyder om die onderliggende t-hCO te openbaar. Individuele selle is opgeneem met behulp van 32-kanaal of 64-kanaal hoë-digtheid silikon probes (Cambridge Neurotech) geaard aan grondskroewe en vooraf versterk met RHD versterkers (Intan). Gebruik die manipulator om die elektrodes na die teikenplek te laat sak deur die kraniotomie, wat met steriele soutoplossing gevul is. Data-insameling is uitgevoer teen 'n frekwensie van 30 kHz met behulp van die Open Ephys data-insamelingstelsel. Die opname het slegs voortgeduur toe ons hoogs gekorreleerde ritmiese spontane aktiwiteit in meer as 10 kanale opgespoor het, wat daarop dui dat die elektrodes in die oorplanting geleë was (gebaseer op twee-foton kalsium beelddata). 'n 10-minuut agtergrond opname van motoriese aktiwiteit is verkry. Die snorre aan die teenoorgestelde kant van t-hCO3 is toe 50 keer (2 mm teen 20 Hz, 2 s per aanbieding) op ewekansige tye gedeflekteer deur 'n piezo-elektriese aandrywer oor 'n 20 minute opnameperiode. Gebruik die MATLAB Support Package vir Arduino (MATLAB 2019b) om die defleksietyd met persoonlike MATLAB-kode te beheer. Gebruik TTL-pulse om gebeurtenisse met data-insamelingsagteware te sinkroniseer.
Vir optiese merkeksperimente is 'n 200 µm optiese verbindingskoord (Dories) gekoppel aan 'n 473 nm laser (Omikron) gekoppel aan 'n 200 µm optiese vesel wat oor die kraniotomie geplaas is. Pas die springkrag onmiddellik voor dit aan na 20 mW. Gebruik die manipulator om die elektrodes na die teikenplek te laat sak deur die kraniotomie, wat met steriele soutoplossing gevul is. Aan die begin van die opname is tien ligpulse van 473 nm (frekwensie 2 Hz, pulsduur 10 ms) uitgestraal. Fotosensitiewe selle is gedefinieer as selle wat 'n piekrespons binne 10 ms lig in 70% of meer van die proewe vertoon het.