Nature.com сайтына кіргеніңіз үшін рахмет. Сіз шектеулі CSS қолдауы бар шолғыш нұсқасын пайдаланып жатырсыз. Ең жақсы тәжірибе үшін жаңартылған шолғышты пайдалануды ұсынамыз (немесе Internet Explorer шолғышында үйлесімділік режимін өшіріңіз). Оған қоса, тұрақты қолдауды қамтамасыз ету үшін біз сайтты стильсіз және JavaScriptсіз көрсетеміз.
Бірден үш слайдтан тұратын карусельді көрсетеді. Бір уақытта үш слайд арқылы жылжу үшін «Алдыңғы» және «Келесі» түймелерін пайдаланыңыз немесе бір уақытта үш слайд арқылы жылжу үшін соңында сырғытпа түймелерін пайдаланыңыз.
Өздігінен жиналатын нейрондық органеллалар адамның дамуы мен ауруын модельдеу үшін перспективалы in vitro платформасын білдіреді. Дегенмен, органоидтарда in vivo бар байланыс жоқ, бұл жетілуді шектейді және мінез-құлықты басқаратын басқа тізбектермен интеграциялануға жол бермейді. Мұнда біз жаңа туған нәрестелердің жалаңаш егеуқұйрықтарының соматосенсорлық қыртысына трансплантацияланған адамның дің жасушаларынан алынған кортикальды органоидтар сенсорлық және мотивацияға байланысты тізбектерге біріктірілген жетілген жасуша түрлерін дамытатынын көрсетеміз. МРТ бірнеше дің жасушалары мен жануарларда трансплантациядан кейінгі органоидты өсуді анықтады, ал бір ядролы талдау кортиогенездің прогрессиясын және белсенділікке тәуелді транскрипция бағдарламасының пайда болуын анықтады. Шынында да, трансплантацияланған кортикальды нейрондар in vitro аналогтарына қарағанда күрделі морфологиялық, синаптикалық және ішкі мембраналық қасиеттерді көрсетеді, бұл Тимоти синдромы бар науқастарда нейрондық ақауларды анықтауға мүмкіндік береді. Анатомиялық және функционалдық бақылау трансплантацияланған органеллалар таламокортикальды және кортикокортикалық кірістерді алатынын көрсетті және жүйке белсенділігінің in vivo жазбалары бұл кірістер адам жасушаларында сенсорлық жауаптарды тудыруы мүмкін екенін көрсетеді. Ақырында, кортикальды органоидтар аксондарды егеуқұйрықтардың миында кеңейтеді және олардың оптогенетикалық белсендірілуі сыйақы іздейтін мінез-құлыққа әкеледі. Осылайша, трансплантацияланған адам қыртысының нейрондары жетіліп, мінез-құлықты басқаратын хосттың схемаларына қатысады. Біз бұл тәсіл басқа әдістермен анықталмайтын емделушіден алынған жасушалардағы жіптік деңгейдегі фенотиптерді анықтауды жеңілдетеді деп күтеміз.
Дамып келе жатқан адам миы - бұл сенсорлық тәжірибе арқылы одан әрі нақтыланатын функционалды нейрондық тізбектерді қалыптастыру үшін жасушалар көбейетін, сараланып, қоныс аударатын және қосылатын керемет өзін-өзі ұйымдастыру процесі. Адамның миының дамуын түсінудегі негізгі мәселе, әсіресе ауру контексінде, ми тініне қол жеткізудің болмауы. Өзін-өзі ұйымдастыратын органоидтар, соның ішінде адам қыртысының органоидтары (hCO; адам қыртысының сферасы деп те аталады) 2,3,4,5,6 құра алады. Дегенмен, бірнеше шектеулер олардың нейрондық тізбектердің дамуы мен жұмыс істеуін түсіну үшін кеңірек қолданылуын шектейді. Атап айтқанда, hCO пісіп-жетілуі in vivo белгілі бір микроорталық және сенсорлық кірістердің болмауымен шектеледі ме, бұл түсініксіз. Сонымен қатар, hCOs мінез-құлық нәтижелерін тудыратын схемаларға біріктірілмегендіктен, олардың генетикалық күрделі және мінез-құлық нейропсихиатриялық бұзылыстарын модельдеудегі пайдалылығы қазіргі уақытта шектеулі.
HCO-ны зақымдалмаған тірі миға трансплантациялау бұл шектеулерді жеңе алады. Алдыңғы зерттеулер кеміргіштердің қыртысына трансплантацияланған адамның нейрондары өмір сүре алатынын, проекциялай алатынын және кеміргіш жасушалармен байланыса алатынын көрсетті7,8,9,10,11,12. Дегенмен, бұл тәжірибелер әдетте ересек жануарларда орындалады, бұл синаптикалық және аксональды интеграцияны шектеуі мүмкін. Мұнда біз пластикалық дамудың ерте сатысында иммун тапшылығы бар егеуқұйрықтардың бастапқы соматосенсорлық қыртысына (S1) hiPS жасушаларынан алынған 3D hCO трансплантациялаған трансплантация парадигмасын сипаттаймыз. Трансплантацияланған hCO (t-hCO) нейрондары айтарлықтай жетілуден өтеді, сенсорлық реакцияларды тудыратын таламокортикалық және кортикальды-кортикальды кірістерді алады және марапатқа ұмтылатын мінез-құлық үшін егеуқұйрықтың миына аксональды проекцияларды кеңейтеді. t-hCO ұзартылған жетілуі кернеуге сезімтал L типті CaV1.2 кальций арнасының (CACNA1C кодталған) мутацияларынан туындаған ауыр генетикалық бұзылыс Тимоти синдромы (TS) бар науқастарда нейрондық ақауларды анықтады.
In vivo тізбектеріндегі адамның кортикальды нейрондарын зерттеу үшін біз стереотактикалық түрде бұзылмаған 3D hCO-ны босанғаннан кейінгі ерте атимиялық егеуқұйрықтардың S1-ге (босанғаннан кейінгі 3-7 күн) трансплантацияладық (1а-сурет және 1а-c суретінің кеңейтілген деректері). Осы кезде таламокортикальды және кортикокортикальды аксональды проекциялар S1 иннервациясын әлі аяқтаған жоқ (13 сілтеме). Осылайша, бұл тәсіл эндогендік тізбектерге әсерді азайту кезінде t-hCO интеграциясын барынша арттыруға арналған. Тірі жануарлардағы t-hCO орнын визуализациялау үшін біз трансплантациядан кейін 2-3 айдан кейін егеуқұйрықтардың T2 өлшенген МРТ миының реконструкциясын орындадық (сурет 1b және кеңейтілген деректер, сурет 1d). t-hCO оңай байқалды және t-hCO көлемдік өлшемдері бекітілген кесінділерден есептелгендерге ұқсас болды (кеңейтілген деректер суреті 1d,e; P > 0,05). t-hCO оңай байқалды және t-hCO көлемдік өлшемдері бекітілген кесінділерден есептелгендерге ұқсас болды (кеңейтілген деректер суреті 1d,e; P > 0,05). t-hCO легко наблюдались, а объемные измерения t-hCO және ұқсас ұқсастықтар фиксированных срезов (расширенные данные, рис. 1d, e; P> 0,05). t-hCO оңай байқалды, ал көлемдік t-hCO өлшемдері бекітілген қималар үшін есептелгендерге ұқсас болды (кеңейтілген деректер, 1d-сурет, e; P > 0,05).很容易观察到t-hCO，并且t-hCO的体积测量值与从固定切片计算的测量值相似（扩展数据图1d、e；P > 0,05）很容易观察到t-hCO，并且t-hCO t-hCO легко наблюдался, а объемные измерения t-hCO және ұқсас ұқсастықтар фиксированных срезов (расширенные данные, рис. 1d, e; P> 0,05). t-hCO оңай байқалды, ал көлемдік t-hCO өлшемдері бекітілген қималар үшін есептелгендерге ұқсас болды (кеңейтілген деректер, 1d-сурет, e; P > 0,05).Біз трансплантациядан кейін шамамен 2 айдан кейін трансплантацияланған жануарлардың 81% -ында t-hCO анықтадық (n = 72 жануар; hCO 10 hiPS жасуша линияларынан; hiPS жасуша сызықтары қосымша 1 кестеде). Олардың 87% ми қыртысында орналасты (1в-сурет). Бірдей трансплантацияланған егеуқұйрықта бірнеше уақыт нүктелерінде сериялық МРТ сканерлеуін орындау арқылы біз 3 ай ішінде t-hCO көлемінің тоғыз есе артқанын таптық (сурет 1d және кеңейтілген деректер, 1f-сурет). Трансплантацияланған жануарлардың трансплантациядан кейінгі 12 айда өмір сүру деңгейі жоғары болды (74%) (кеңейтілген деректер, 1g-сурет және 2-кесте) және айқын қозғалтқыш немесе есте сақтау бұзылыстары, глиоз немесе электроэнцефалограмма (ЭЭГ) табылған жоқ. Деректер 1g-сурет және қосымша кесте 2). 1 сағ – 3е).
а, Эксперименттік жобаның схемасы. hiPS жасушаларынан алынған hCO дифференциацияның 30-60 күндері жаңа туған жалаңаш егеуқұйрықтардың S1 ішіне трансплантацияланды. b, трансплантациядан кейін 2 айдан кейін S1-де t-hCO көрсететін T2 өлшенген корональды және көлденең МРТ суреттері. Масштаб жолағы, 2 мм. c, Әрбір hiPS ұяшық сызығы (n = 108, жолақтардағы сандар hIPS жасуша сызығына t-hCO мөлшерін көрсетеді) және кортикальды немесе субкортикальды орналасу (n = 88) үшін көрсетілген еңгізу сәттілігінің сандық көрсеткіші. d, 3 ай ішінде t-hCO жоғарылауын көрсететін коронарлық артерияның МРТ суреті (сол жақта; шкала жолағы, 3 мм) және сәйкес 3D көлемді қайта құру (шкала жолағы, 3 мм). e, егеуқұйрықтардың ми қыртысындағы t-hCO үлгілеріне шолу. Масштаб жолағы, 1 мм. f, жоғарғы солдан оңға қарай көрсетілген t-hCO репрезентативті иммуноцитохимиялық кескіндері (дифференциация кезінде): PPP1R17 (4 айлық), NeuN (8 айлық), SOX9 және GFAP (8 айлық), PDGFRα; (8 ай), MAP2 (8 ай) және IBA1 (8 ай). Масштаб жолағы, 20 мкм. HNA-ның бірлескен экспрессиясы адам шыққан жасушаларды көрсетеді. g, snRNA-seq: Seurat интеграциясынан кейін барлық жоғары сапалы t-hCO ядроларының біртұтас коллекторлық және проекциялық (UMAP) өлшемділігін азайту кескіні (n=3 t-hCO үлгілері, n=2 hiPS ұяшықтары). Астроциттер, астроциттер желісінің жасушалары; цикл прог, циркуляциялық тегі; GluN DL, терең глутаматергиялық нейрондар; GluN DL/SP, терең және қабат асты глутаматергиялық нейрондар; GluN UL, жоғарғы қабаттағы глутаматергиялық нейрондар; олигодендроциттер, олигодендроциттер; OPC, олигодендроциттердің ізашар жасушалары; RELN, реелиндік нейрондар. h, HCO глутаматергиялық нейрондарымен салыстырғанда t-hCO глутаматергиялық нейрондарда айтарлықтай жоғары реттелетін (түзетілген P <0,05, қатпарлы өзгеріс > 2, ядролардың кем дегенде 10% көрсетілген) гендердің Ген Онтологиясы (GO) терминін байыту талдауы. h, HCO глутаматергиялық нейрондарымен салыстырғанда t-hCO глутаматергиялық нейрондарда айтарлықтай жоғары реттелетін (түзетілген P <0,05, қатпарлы өзгеріс > 2, ядролардың кем дегенде 10% көрсетілген) гендердің Ген Онтологиясы (GO) терминін байыту талдауы. h, Анализ обогащения терминов Gene Ontology (GO) генов үшін белгілі белсенділік (көрсетілген P <0,05, кратность изменения > 2, экспрессия по крайней мере в 10% ядер) глутаматергических нейрондық t-hCO sravicheskyy нейрондық t-hCO sravhycheskyh срав. h, hCO глутаматергиялық нейрондарымен салыстырғанда t-hCO глутаматергиялық нейрондардағы маңызды активтендіру (түзетілген P<0,05, қатпарлы өзгеріс >2, өрнек) гендер үшін Ген Онтологиясы (GO) терминін байыту талдауы. h，与hCO 谷氨酸能神经元相比，t-hCO 谷氨酸能神经元中基因显着上调（调整国0.05，倍数变化> 2，在至少10% 的细胞核中表达）的基因本体论(GO) 术语毌集。 h ， 与 hco 谷氨酸 能 元 相比 ， t-hco 谷氨酸 能 神经 元 基因 显着 基因 显着 上调 ０05 бет变化 变化> 2 ， 至少 10% 的 核中 表达） 基因 基因 基因 的 的 的 的 的 的 的 的 的的 的 的 的本体论(GO) 术语富集分析。 h, гені значительно активизировались (корректированный P <0,05, кратность изменения> 2, экспрессируется по крайней мере в 10% ядер) в глутаматергических нейрондық талдау t-hCO бойынша сравнению сравнению глутаматергических нейрондық GO. h, hCO глутаматергиялық нейрондарымен салыстырғанда t-hCO глутаматергиялық нейрондарда гендер айтарлықтай жоғары реттелді (түзетілген P <0,05, қатпарлы өзгеріс > 2, ядролардың кемінде 10% көрсетілген) Байыту терминінің онтологиялық (GO) талдауы.Нүктелі сызық 0,05 aq мәнін көрсетеді. i, 22 snRNA-seq ересек мотор қыртысының деректер жинағынан жапсырманы тасымалдау арқылы t-hCO ішіндегі GluN жасушаларының түрлерінің UMAP кескіні. КТ — кортикоталамус жасушалары, ET — экстрацеребральды жасушалар, IT — ішкі теленцефаликалық жасушалар, NP — проекцияға жақын.
Содан кейін біз t-hCO цитоархитектурасын және жалпы жасушалық құрамын бағаладық. Егеуқұйрықтың эндотелий жасушаларының антиденелік бояуы t-hCO бар васкуляризацияны анықтады, ал IBA1 бояуы бүкіл егеуқұйрық микроглиясының болуын көрсетті (1f-сурет және кеңейтілген деректер, 3c,d-сурет). Иммунды бояу PPP1R17 (кортикальды ізашарлар), NeuN (нейрондар), SOX9 және GFAP (глиалдан алынған жасушалар) немесе PDGFRa (олигодендроциттердің ізашарлары) бірге экспрессиялайтын адамның ядролық антигені (HNA) оң жасушалары анықталды (1f-сурет). Бір жасуша рұқсатында t-hCO жасушалық құрамын зерттеу үшін біз шамамен 8 айлық саралаудан кейін бір ядролы РНҚ секвенирлеуін (snRNA-seq) орындадық. Жаппай сүзу және егеуқұйрық ядроларын жою 21500 жоғары сапалы адамның мононуклеарлық картасын берді (1g-сурет және кеңейтілген деректер, 4а,б-сурет). Типтік жасуша типті маркерлердің экспрессиялық үлгілері терең және үстірт глутаматергиялық нейрондарды, айналымдағы ізашарларды, олигодендроциттер мен астроциттердің линиясын қоса алғанда, негізгі кортикальды жасушалар кластерінің кластерлерін анықтады (сурет 1g, кеңейтілген деректер, 4c-сурет және қосымша кесте 3). SATB2 және CTIP2 үшін иммундық бояу кортикальды қосалқы типтердің болуына қарамастан, t-hCO айқын анатомиялық стратификацияны көрсетпейтінін көрсетті (кеңейтілген деректер, 3a-сурет). кезеңге сәйкес келетін snRNA-seq hCO жалпы ұқсас жасуша сыныптарын шығарды, бірнеше ерекшеліктерді қоспағанда, олигодендроциттердің болмауы және GABAergic нейрондарының болуы, олар бүйірлік прогенитор жасушалары үшін бұрын хабарланған қолайлы in vitro жағдайларын көрсетуі мүмкін15 (кеңейтілген деректер, 4f-сурет – i және қосымша). Дифференциалды ген экспрессиясының талдауы t-hCO және hCO (қосымша 5 кесте) арасындағы глутаматергиялық нейрондарда айтарлықтай айырмашылықтарды анықтады, соның ішінде синаптикалық сигнализация, дендритті локализация және кернеуге байланысты арнаның белсенділігі сияқты нейрондық жетілумен байланысты гендер жиынтығын белсендіру (1h және қосымша кесте 5). кесте 6). Тиісінше, кортикальды глутаматергиялық t-hCO нейрондары жеделдетілген транскрипциялық жетілуді көрсетті.
t-hCO-дағы бұл транскрипциялық өзгерістер hCO in vitro және t-hCO in vivo арасындағы морфологиялық айырмашылықтармен байланысты ма, жоқ па, соны анықтау үшін біз 7-8 айлық дифференциациядан кейін жедел бөлімдерде кезеңге сәйкес биоцитинмен толтырылған hCO және hCO қалпына келтірдік. hCO нейрондары (2а-сурет). t-hCO нейрондары айтарлықтай үлкен болды, сома диаметрінен 1,5 есе, дендриттер екі есе көп болды және in vitro hCO-мен салыстырғанда жалпы дендрит ұзындығының жалпы алты есе ұлғаюы болды (2б-сурет). Сонымен қатар, біз hCO нейрондарына қарағанда t-hCO нейрондарында дендритті тікенектердің айтарлықтай жоғары тығыздығын байқадық (Cурет 2c). Бұл t-hCO нейрондары кең дендритті ұзарту мен тармақталудан өтеді, бұл жасуша пролиферациясының жалғасуымен бірге трансплантациядан кейін t-hCO қарқынды өсуіне ықпал етуі мүмкін (сурет 1d және кеңейтілген деректер 1f-сурет). Бұл бізді электрофизиологиялық қасиеттерді зерттеуге итермеледі. Мембрананың сыйымдылығы сегіз есе жоғары болды (кеңейтілген деректер, 8d-сурет), тыныштық күйіндегі мембраналық потенциал гиперполяризацияланған (шамамен 20 мВ) және ағымдағы инъекция hCO нейрондарына қарағанда t-hCO нейрондарында жоғары максималды қозу жылдамдығын тудырды. in vitro (2d-сурет), e), бұл t-hCO-ның үлкенірек және күрделі морфологиялық ерекшеліктеріне сәйкес келеді. Сонымен қатар, t-hCO нейрондарында өздігінен қозғалатын постсинаптикалық ток оқиғаларының (EPSC) жиілігі айтарлықтай жоғары болды (2f-сурет), бұл t-hCO нейрондарында байқалатын дендритті омыртқаның тығыздығының жоғарылауы функционалдық қозғыштықпен байланысты екенін көрсетеді. жыныстық синапс. Біз hCO нейрондарының жетілмеген сипатын in vitro таңбаланған глутаматергиялық нейрондарды жазу арқылы растадық (кеңейтілген деректер, 6a-c сурет).
a, 8 айлық саралаудан кейін биоцитинмен толтырылған hCO және t-hCO нейрондарының 3D реконструкциясы. b, Морфологиялық белгілердің сандық көрсеткіштері (n = 8 hCO нейрондары, n = 6 t-hCO нейрондары; **P = 0,0084, *P = 0,0179 және ***P <0,0001). b, Морфологиялық белгілердің сандық көрсеткіштері (n = 8 hCO нейрондары, n = 6 t-hCO нейрондары; **P = 0,0084, *P = 0,0179 және ***P <0,0001). б, количественная оценка морфологических признаков (n = 8 нейронов hCO, n = 6 нейронов t-hCO; ** P = 0,0084, * P = 0,0179 және *** P <0,0001). b, морфологиялық белгілердің сандық көрсеткіштері (n=8 hCO нейрондары, n=6 t-hCO нейрондары; **P=0,0084, *P=0,0179 және ***P<0,0001). b，形态学特征的量化（n = 8 个hCO 神经元，n = 6 个t-hCO 神经元；**P = 0,0084，*1**P <9*0. 0,0001）. b，形态学特征的量化（n = 8 个hCO 神经元，n = 6 个t-hCO 神经元；**P = 0,0084，*1**P <9*0. 0,0001）. б, количественная оценка морфологических признаков (n = 8 нейронов hCO, n = 6 нейронов t-hCO; ** P = 0,0084, * P = 0,0179 және *** P <0,0001). b, морфологиялық белгілердің сандық көрсеткіштері (n=8 hCO нейрондары, n=6 t-hCO нейрондары; **P=0,0084, *P=0,0179 және ***P<0,0001).c, 8 айлық саралаудан кейін hCO және t-hCO дендритті тармақтарын 3D реконструкциялау. Қызыл жұлдызшалар болжамды дендритті омыртқаларды көрсетеді. Дендриттік омыртқа тығыздығының сандық көрсеткіші (n = 8 hCO нейрондары, n = 6 t-hCO нейрондары; ** P = 0,0092). d, Тыныштық мембранасының потенциалын сандық анықтау (n = 25 hCO нейрондары, n = 16 t-hCO нейрондары; *** P < 0,0001). d, Тыныштық мембранасының потенциалын сандық анықтау (n = 25 hCO нейрондары, n = 16 t-hCO нейрондары; *** P < 0,0001). d, количественная оценка мембраного потенциала покоя (n = 25 нейронов hCO, n = 16 нейронов t-hCO; *** P <0,0001). d, тыныштық мембранасының потенциалын анықтау (n = 25 hCO нейрондары, n = 16 t-hCO нейрондары; *** P < 0,0001). d，静息膜电位的量化（n = 25 hCO 神经元，n = 16 t-hCO 神经元；***P < 0,0001）。 d，静息膜电位的量化（n = 25 hCO 神经元，n = 16 t-hCO 神经元；***P < 0,0001）。 d, количественная оценка мембраного потенциала покоя (n = 25 нейронов hCO, n = 16 нейронов t-hCO; *** P <0,0001). d, тыныштық мембранасының потенциалын анықтау (n = 25 hCO нейрондары, n = 16 t-hCO нейрондары; *** P < 0,0001). e, Ток инъекцияларын ұлғайту арқылы туындаған hCO және t-hCO-да қайталанатын әрекет потенциалы жануы және максималды ату жылдамдығының сандық көрсеткіштері (n = 25 hCO нейрондары, n = 16 t-hCO нейрондары; *** P < 0,0001). e, Ток инъекцияларын ұлғайту арқылы туындаған hCO және t-hCO-да қайталанатын әрекет потенциалы жануы және максималды ату жылдамдығының сандық көрсеткіштері (n = 25 hCO нейрондары, n = 16 t-hCO нейрондары; *** P < 0,0001). е, hCO және t-hCO-дағы потенциалды жоғарылату, жоғары әсер ету тока, және количественная ценка максималды әсерді жою (n = 25 нейрон hCO, n = 16 нейронов t-hCO; *** P <00, *** P <0,). e, hCO және t-hCO-да әрекет потенциалының қайта жануы ағымдағы жоғарылау және максималды ату жылдамдығының сандық көрсеткіштері (n = 25 hCO нейрондары, n = 16 t-hCO нейрондары; *** P < 0,0001). e，通过增加电流注入诱导的hCO 和t-hCO 重复动作电位放电，以及最大放电，以及最大放电（5，个hCO 神经元，n = 16 个t-hCO 神经元；***P < 0,0001）。 E ， 通过 增加 电流 注入 的 的 hco 和 t-hco 重复 电位 放电 ， 以及 最 大 （ （ 大 （弖n个 hco 神经 ， n = 16 个 t-hco 神经 ； *** p <0,0001） 。 e, hCO және t-hCO потенциалының жоғарылауы, жоғары әсер етуші тока, және количественная ценка максимальды әсерді жою (n = 25 нейрон hCO, n = 16 нейрон t-hCO0; ***1). e, жоғары токпен қамтамасыз ету және максималды ату жылдамдығын сандық анықтау (n = 25 hCO нейрондары, n = 16 t-hCO нейрондары; *** P < 0,0001) арқылы туындаған hCO және t-hCO әрекет потенциалдарының қайталанатын атуы. f, дифференциацияның 8 айындағы hCO және t-hCO нейрондарындағы спонтанды EPSCs (sEPSCs) және синаптикалық оқиғалардың жиілігін анықтау (n = 25 hCO нейрондары, n = 17 t-hCO нейрондары; *** P < 0,0001). f, дифференциацияның 8 айындағы hCO және t-hCO нейрондарындағы спонтанды EPSCs (sEPSCs) және синаптикалық оқиғалардың жиілігін анықтау (n = 25 hCO нейрондары, n = 17 t-hCO нейрондары; *** P < 0,0001) . f, спонтанды EPSC (sEPSC) нейрондық hCO және t-hCO бойынша 8 месяцев дифференцирлеу және количественная оценка синаптических событий (n = 25 нейрон hCO, n = 17 нейрон t-hCO; *** P <0,00) . f, hCO және t-hCO нейрондарындағы стихиялы EPSCs (sEPSCs) 8 айдағы дифференциалдау және синаптикалық оқиға жылдамдығын анықтау (n = 25 hCO нейрондары, n = 17 t-hCO нейрондары; *** P <0.0001). f，分化8 个月时hCO 和t-hCO 神经元中的自发性EPSCs (sEPSCs)，以及突触事件频率猄CO（5）神经元，n = 17 t-hCO 神经元；***P < 0,0001） . f，分化8 个月时hCO 和t-hCO 神经元中的自发性EPSCs (sEPSCs)，以及突触事件频率的5CO神率的量匼（n = 25 hCO 神率的量匼（n = 25hCO P < 0,0001） . f, спонтанды EPSC (sEPSC) нейрондық hCO және t-hCO бойынша 8 месяцев дифференцирлеу және количественная оценка синаптических событий (n = 25 нейрон hCO, n = 17 нейрон t-hCO; *** P <0,00). f, hCO және t-hCO нейрондарындағы стихиялы EPSCs (sEPSCs) 8 айлық дифференциалдау және синаптикалық оқиға жылдамдығын анықтау (n = 25 hCO нейрондары, n = 17 t-hCO нейрондары; *** P <0.0001).bf үшін 1208-2 жолындағы hCO және t-hCO параллельді түрде сақталған бірдей дифференциалдау партиясынан алынды. g, Гендер жиынтығын байыту талдауы (бір жақты Фишердің нақты сынағы) t-hCO глутаматергиялық нейрондарда айтарлықтай жоғары реттелетін (түзетілген P < 0,05, қатпарлы өзгеріс > 2, кем дегенде 10% ядроларда көрсетілген) hCO глутаматергиялық нейрондармен салыстырғанда (ерте және кеш генпонресті) (LRG) белсенділікке тәуелді гендер тінтуірдің in vivo зерттеуінен16 және in vitro нейрондардан алынған адамға тән LRG17. g, Гендер жиынтығын байыту талдауы (бір жақты Фишердің нақты сынағы) t-hCO глутаматергиялық нейрондарда айтарлықтай жоғары реттелетін (түзетілген P < 0,05, қатпарлы өзгеріс > 2, кем дегенде 10% ядроларда көрсетілген) hCO глутаматергиялық нейрондармен салыстырғанда (ерте және кеш генпонресті) (LRG) белсенділікке тәуелді гендер тінтуірдің in vivo зерттеуінен16 және in vitro нейрондардан алынған адамға тән LRG17. g, анализ обогащения набора генов (односторонний точ нейрондық талдау Фишера) генов со значительной активации (көрсетілген P <0,05, кратность изменения > 2, экспрессия по меньшей мере в 10% ядер) глутаматергических нейрондық қысымның әсерінен глутаматергических нейрондық қысым. hCO наборы генов как раннего (ERG), так және позднего (LRG) генов, белсендіру, идентифицирование в исследовании в мышах in vivo16, және специфических мышах үшін адам үшін LRG in vitro17. g, t-hCO глутаматергиялық нейрондардағы маңызды активтендіруі (реттелген P<0,05, қатпарлы өзгеріс >2, ядролардың кем дегенде 10% экспрессиясы) бар гендердің гендік жиынтық байытылуын талдау (біржақты Фишердің дәл сынағы) hCO глутаматергиялық нейрондармен салыстырғанда ерте (ERG) гендердің ерте анықталған (ERG) белсенділіктері. тышқандар16 және нейрондардан алынған адамға тән LRG in vitro17. g，t-hCO谷氨酸能神经元与hCO谷氨酸能神经元相比，t -hCO谷氨酸能神经元显着上调（调整后P<0,05，倍数变化>2，在至少10%的细胞核中表达）的基因集富集分析（单侧F isher精确检验）从体内小鼠研究中鉴定的早期反应(ERG)和晚期反应(LRG) 活性依赖性基因的基因组16 和体外神经元17 中的人类特开LRG g ， t-hco 谷氨酸 神经 元 与 hco 谷氨酸 神经 元 相比 ， t-hco 谷氨酸 神经 元 与 hco 神经 元 与<0,05 ， 倍数> 2 ， 至少 至少 10%的 细胞 核中 表达） 的 集富集 分析 （单缧（单伈体内 小鼠 研究 中 的 早期 反应 反应 反应 和 晚期 反应 反应 (lrg) 活性 活性 庄 绛基和 神经元 神经元 17 中 17 中 17的人类特异性LRG。 g, глутаматергические нейрондық t-hCO арқылы значительно белсендіріледі по сравнению с глутаматергическими нейронам hCO (корректированный P<0,05, кратность изменения> 2, не менее 10% Анализ обогащения набора генов (бірақ) (ERG) және позднего гени, зависящие от активности ответа (LRG), идентифицирование в исследования на мышах in vivo16 және нейронах in vitro17, специфичные адам. g, t-hCO глутаматергиялық нейрондар hCO глутаматергиялық нейрондарымен салыстырғанда (түзетілген P<0,05, қатпардың өзгеруі >2, кем дегенде 10% Ерте жауап (ERG) және кеш жауап генін байыту талдауы (бір құйрықты Фишердің нақты сынағы) жауап белсенділігіне тәуелді гендер (inV vitro 16) анықталған) айтарлықтай жоғарылады. нейрондар.17 Адамға тән LRG.Нүктелі сызық Bonferroni түзетілген P мәнін 0,05 көрсетеді. h, GluN генінің экспрессиясы (әр геннің псевдопакет және масштабтауы) t-hCO глутаматергиялық нейрондардағы LRG гендерінің snRNA-seq репликаларында айтарлықтай жоғары реттелді. i, t-hCO (жоғарғы) және hCO (төменгі) нейрондарда SCG2 экспрессиясын көрсететін иммундық бояу. Ақ көрсеткілер SCG2+ ұяшықтарын көрсетеді. Масштаб жолағы, 25 мкм. Деректер орташа ± стандартты ауытқу ретінде көрсетіледі.
Ex vivo тіліктерінде байқалған t-hCO белсенділігінің жоғарылауына негізделген snRNA-seq in vitro hCO-мен салыстырғанда t-hCO-дағы ген транскрипттерінің белсенділікке тәуелді жоғарылауын анықтады. Глутаматергиялық t-hCO нейрондары тінтуір мен адамның нейрондарында алдыңғы зерттеулерде табылған кеш жауап белсенділігін реттейтін гендердің жоғары деңгейін білдірді (2g, h-сурет). Мысалы, BDNF18, SCG2 және OSTN, приматқа тән белсенділікті реттейтін ген, hCO нейрондарымен салыстырғанда t-hCO нейрондарында экспрессияның жоғарылауын көрсетті (2g-i-сурет). Осылайша, t-hCO нейрондары транскрипциялық, морфологиялық және функционалдық талдаулар арқылы hCO нейрондарымен салыстырғанда жақсартылған жетілу сипаттамаларын көрсетті.
t-hCO жетілуінің адам миының дамуымен байланысын одан әрі бағалау үшін біз ұрықтың және ересек кортикальды жасуша түрлерінің19,20 және ересек21,22 транскриптомиялық салыстыруларын, сондай-ақ даму кезінде кортикальды ген экспрессиясы23 туралы кең деректерді орындадық (кеңейтілген деректер, 5-сурет). ). алдыңғы жұмыс 24, жаһандық hCO және t-hCO транскриптомының пісіп-жетілуінің 7-8 айлық саралау күйі in vivo даму уақытына кеңінен сәйкес келеді және ұрықтың кеш өміріне ең баламалы (кеңейтілген деректер суреті 5a). Атап айтқанда, біз жасқа сәйкес hCO-мен салыстырғанда t-hCO-да транскриптомның жетілуін, сондай-ақ синаптогенез, астрогенез және миелинизациямен байланысты транскриптомды белсендіруді байқадық (кеңейтілген деректер, 5b-d сурет). Жасуша деңгейінде біз ересек L2/3, L5 және L6 нейрондық қосалқы типтерімен қабаттасатын глутаматергиялық нейрондардың кластерлері бар t-hCO-да жұқа кортекс қосалқы түрінің дәлелдерін таптық (1i-сурет). Керісінше, глутаматергиялық t-hCO нейрондары мен ұрықтың кортикальды нейрондары арасындағы кластерлік қабаттасу жүктіліктің ортасында шектелген (кеңейтілген деректер, 5e-j суреті). t-hCO нейрондарының адамның босанғаннан кейінгі неокортикальды нейрондарға функционалдық ұқсастығын анықтау үшін біз адамның босанғаннан кейінгі қыртысының өткір бөліктеріндегі адамның L2 / 3 пирамидалық нейрондарының электрофизиологиялық жазбаларын және анатомиялық реконструкцияларын орындадық (кеңейтілген деректер, 7a-сурет). L2/3 пирамидалық нейрондардың электрофизиологиялық қасиеттері t-hCO пирамидалық нейрондарының қасиеттеріне ұқсас болды (кеңейтілген деректер, 7e-сурет). Морфологиялық тұрғыдан, босанғаннан кейінгі адам үлгілерінен L2 / 3 нейрондары hCO-ға қарағанда t-hCO-ға көбірек ұқсас болды, дегенмен L2 / 3 жасушалары ұзағырақ болды, жалпы тармақтары көп болды және омыртқаның тығыздығы жоғары болды (сурет 3g және кеңейтілген деректер, сурет 7b-). G).
a, жаңа туған егеуқұйрықтарға бақылау және TS hiPS жасуша желілері арқылы өндірілген hCO трансплантациясы. b, 8 айлық саралаудан кейін биоцитинмен толтырылған t-hCO нейрондарының 3D реконструкциясы. c, орташа дендрит ұзындығының сандық көрсеткіші (n = 19 бақылау нейрондары, n = 21 TS нейрондары; **P = 0,0041). d, 8 айлық саралау кезінде бақылау және TS t-hCO-дан 3D-қайта қалпына келтірілген дендриттік тармақтар және дендриттік омыртқа тығыздығының сандық көрсеткіштері (n = 16 бақылау нейрондары, n = 21 TS нейрондары, *** P <0.0001). d, 8 айлық саралау кезінде бақылау және TS t-hCO-дан 3D-қайта қалпына келтірілген дендриттік тармақтар және дендриттік омыртқа тығыздығының сандық көрсеткіштері (n = 16 бақылау нейрондары, n = 21 TS нейрондары, *** P <0.0001). d, 3D-реконструкция дендритных ветвей из контроля және TS t-hCO через 8 месяцев дифференцировки және количественная оценка плотности дендритных шипов (n = 16 бақылау нейронов, n = 21 TS нейронов, *** P <0, *** P <0). d, 8 айлық саралау және дендритті омыртқаның тығыздығын сандық анықтау кезінде бақылау және t-hCO TS ден дендритті бұтақтарды 3D қайта құру (n = 16 бақылау нейрондары, n = 21 TS нейрондары, *** P <0.0001). d，分化8 个月时对照和TS t-hCO 的3D 重建树突分支，以及树突棘密度的量化（6个对照神经元，n = 21 个TS 神经元，***P <0,0001）。 d ， 分化 8 个 时 对照 和 ts t-hco 的 3d 重建 分支 分支 以及 树突棘 密度 （突棘 密度 （6n）神经 元 ， n = 21 个 ts 神经 ， *** p <0,0001 ）。 d, 3D-реконструкция дендритных ветвей контроля және TS t-hCO шегінде 8 месяцев дифференцировки және количественная оценка плотности дендритных шипов (n = 16 бақылау нейронов, n = 21 TS нейронов, *** P <0,0). d, 8 айлық саралау және дендритті омыртқаның тығыздығын сандық анықтау кезінде бақылау дендритті тармақтарын және TS t-hCO 3D қайта құру (n = 16 бақылау нейрондары, n = 21 TS нейрондары, *** P <0.0001).Қызыл жұлдызшалар болжамды дендритті омыртқаларды көрсетеді. e, 8 айлық саралаудан кейін бақылаудағы стихиялық EPSC және TS t-hCO нейрондары. f, жинақталған жиілік графигі және синаптикалық оқиғалардың жиілігі мен амплитудасының сандық көрсеткіші (n=32 басқару нейрондары, n=26 TS нейрондары; **P=0,0076 және P=0,8102). g, hCO және t-hCO-дағы TS және бақылау нейрондарының Шолл талдауы. Үзік сызықтар салыстыру үшін адамның L2/3 постнатальді пирамидалық нейрондарын көрсетеді (n = 24 бақылау t-hCO нейрондары, n = 21 TS t-hCO нейрондары, n = 8 бақылау hCO нейрондары және n = 7 TS hCO нейрондары). Деректер орташа ± стандартты ауытқу ретінде көрсетіледі
t-hCO-ның адам қыртысының нейрондарының морфологиялық және функционалдық ерекшеліктерін жоғары деңгейде қайталау қабілеті бізді t-hCO-ны аурудың фенотиптерін анықтау үшін қолдануға болатынын зерттеуге итермеледі. Біз нейрондарда белсенділікке тәуелді ген транскрипциясын бастайтын CaV1.2 кодтайтын гендегі функцияның күшеюі мутацияларынан туындаған ауыр нейродамуының бұзылуына назар аудардық. Біз hCO-ны ең көп таралған алмастыру (p.G406R) және үш бақылау (3a-сурет) алып жүретін үш TS пациентінен алдық. Трансплантациядан кейін біз TS нейрондарында дендритті морфологияның бақылаулармен салыстырғанда (3b-сурет және кеңейтілген деректер, 8а,б-сурет) өзгергенін анықтадық, бұл бастапқы дендриттердің санының екі есе артуымен және дендрит ұзындығының орташа және жалпы төмендеуінің жалпы өсуімен (Cурет 3c және кеңейтілген деректер, 8c сурет). Бұл бақылау нейрондарымен салыстырғанда омыртқаның тығыздығының жоғарылауымен және ТС-да өздігінен EPSC жиілігінің жоғарылауымен байланысты болды (3d-f суреті және кеңейтілген деректер, сурет 8g). Әрі қарай талдау бақылаулармен салыстырғанда t-hCO TS-де аномальды дендритті тармақталу үлгілерін анықтады, бірақ дифференциацияның ұқсас сатысында in vitro TS hCO емес (3g-сурет). Бұл TS-тегі белсенділікке тәуелді дендриттің кішіреюі туралы алдыңғы есептерімізге сәйкес келеді және осы трансплантация платформасының ауру фенотиптерін in vivo анықтау мүмкіндігін көрсетеді.
Содан кейін біз t-hCO жасушаларының S1 егеуқұйрығына қаншалықты функционалды түрде біріктірілгенін сұрадық. Кеміргіштердегі S1 ipsilateral ventral базальды және артқы таламус ядроларынан, сондай-ақ ipsilateral мотор және қайталама соматосенсорлық қыртыстардан және қарама-қарсы S1-ден күшті синаптикалық кірістер алады (4а-сурет). Иннервация үлгісін қалпына келтіру үшін біз hCO-ны құтыру вирусы-dG-GFP/AAV-G жұқтырдық және 3 күннен кейін hCO S1 егеуқұйрығына трансплантацияладық. Біз трансплантациядан кейін 7-14 күннен кейін ipsilateral S1 және вентральды базальды ганглияның нейрондарында тығыз GFP экспрессиясын байқадық (сурет 4b, c). Сонымен қатар, нетрин G1 таламикалық маркердің антиденелік бояуы t-hCO-да таламикалық ұштардың болуын анықтады (4d, e-сурет). Бұл афферентті проекциялар t-hCO жасушаларында синаптикалық жауаптарды тудыруы мүмкін екенін бағалау үшін біз таламокортикальды қабаттың өткір бөліктеріндегі адам жасушаларынан бүкіл жасуша жазбаларын орындадық. S1 егеуқұйрықтарын, ішкі капсулаларды, ақ затты, t-hCO маңындағы талшықтарды электрлік ынталандыру немесе AMPA рецепторларының антагонисті NBQX әсеріне ұшыраған t-hCO нейрондарындағы t-hCO индукцияланған қысқа кідіріс EPSC-леріндегі опсинді білдіретін таламус ұштарын оптогенетикалық белсендіру. (Cурет 4f, g және кеңейтілген деректер, сурет 9a–g). Бұл деректер t-hCO егеуқұйрықтардың миына анатомиялық түрде біріктірілгенін және егеуқұйрықтың иесі тінімен белсендірілетінін көрсетеді.
a, Құтыруды бақылау тәжірибесінің схемалық диаграммасы. b, GFP және t-hCO және егеуқұйрықтың церебральды қыртысы арасындағы адамға тән STEM121 экспрессиясы (жоғарғы панель). Сондай-ақ егеуқұйрықтың вентральды базальды ядросында (VB) (төменгі сол жақта) және ipsilateral S1 (төменгі оң жақта) GFP экспрессиясы көрсетілген. Масштаб жолағы, 50 мкм. Қызыл квадраттар мидың суреттер түсірілген аймақтарын білдіреді. c, GFP (n = 4 егеуқұйрық) білдіретін жасушалардың сандық көрсеткіші. d, e — t-hCO-дағы Netrin G1+ таламикалық терминалдар. d құрамында t-hCO және VB ядролары бар тәж бөлімі көрсетілген. Масштаб жолағы, 2 мм. e t-hCO (сол жақта) және VB (оң жақта) нейрондарындағы Netrin G1 және STEM121 өрнектерін көрсетеді. Масштаб жолағы, 50 мкм. Қызғылт сары нүктелі сызық t-hCO шекарасын көрсетеді. f, g, S1 егеуқұйрығында (f) немесе ішкі капсулада (g) электрлік ынталандырудан кейінгі t-hCO нейрондарының ағымдағы іздері, (күлгін) немесе жоқ (қара) NBQX (сол жақта). NBQX бар және онсыз EPSC амплитудалары (n = 6 S1 нейрондары, *P = 0,0119; және n = 6 ішкі капсула нейрондары, **P = 0,0022) (орталық). S1 (f) егеуқұйрық немесе ішкі капсула (g) (оң жақта) электрлік ынталандыруға жауап ретінде EPSC көрсететін t-hCO нейрондарының пайызы. aCSF, жасанды цереброспинальды сұйықтық. h, 2P кескіндеу экспериментінің схемалық диаграммасы (сол жақта). GCaMP6-ның t-hCO-дағы көрінісі (ортаңғы). Масштаб жолағы, 100 мкм. GCaMP6s флуоресценциясының уақыт аралығы (оң жақта). i, флуоресценцияның спонтанды белсенділігінің Z-балы. j, мұртты ынталандырудың схемалық суреті. k, бір сынақта z баллды 2P флуоресценция траекториялары, мысал ұяшықтарындағы нөл уақытындағы мұртша ауытқуымен (үзік сызық) тураланған. l, барлық ұяшықтардың популяция бойынша орташа алынған z-балы жауаптары нөл уақытындағы мұртша ауытқуымен тураланған (үзік сызық) (қызыл) немесе кездейсоқ құрылған уақыт белгілері (сұр). м. Оптикалық таңбалау бойынша тәжірибенің схемалық схемасы. n, Көгілдір лазерді ынталандыру немесе мұрттың ауытқуы кезіндегі мысал t-hCO ұяшығынан алынған шикі кернеу қисықтары. Қызыл көрсеткілер жарықтың әсерінен (жоғарғы) немесе мұрттың (төменгі) ауытқуынан туындаған алғашқы тітіркенулерді көрсетеді. Сұр реңк сақинаның ауытқу кезеңдерін көрсетеді. o, Ең жоғары жарық толқындары және мұрттың ауытқу реакциялары. p, мысалдың ұяшықтарындағы мұртшалардың ауытқуына сәйкес келетін бір әрекеттің ұштары. 0 сақалдың ауытқуын көрсетеді (үзік сызық). q, нөл (үзік сызық) (қызыл) немесе кездейсоқ құрылған уақыт белгілері (сұр) уақыттағы мұртша ауытқуына тураланған барлық фотосезімтал ұяшықтар үшін популяция бойынша орташа алынған z-балы жану жылдамдығы. r, мұртша ауытқуымен айтарлықтай модуляцияланған фотосезімтал бірліктердің үлесі (n = 3 егеуқұйрық) (сол жақта). Ең жоғары z-балы кідіріс (n = 3 егеуқұйрық; n = 5 (ашық жасыл), n = 4 (қара жасыл) және n = 4 (көгілдір) егеуқұйрық үшін мұрттың ауытқуын модуляциялау бірлігі) (оң жақта). Деректер орташа ± стандартты ауытқу ретінде көрсетіледі
Содан кейін біз in vivo сенсорлық ынталандыру арқылы t-hCO белсендірілуі мүмкін бе деп сұрадық. S1 егеуқұйрықтарына GCaMP6 генетикалық кодталған кальций индикаторларын білдіретін hCO трансплантациялады. 150 күннен кейін біз талшықты фотометрияны немесе екі фотонды кальцийді бейнелеуді орындадық (сурет 4h және кеңейтілген деректер, 10а-сурет). Біз t-hCO жасушаларының синхрондалған ырғақты белсенділікті көрсететінін анықтадық (4i-сурет, кеңейтілген деректер, 10b-сурет және қосымша бейне 1). Ең жоғары t-hCO белсенділігін сипаттау үшін біз анестезирленген трансплантацияланған егеуқұйрықтарда жасушадан тыс электрофизиологиялық жазбаларды орындадық (кеңейтілген деректер, 10c-f-сурет). Біз MRI суреттерінен стереотаксикалық координаттарды жасадық; осылайша, бұл жазылған бірліктер болжамды адам нейрондарын білдіреді, дегенмен тек электрофизиология шығу тегі түрін анықтауға мүмкіндік бермейді. Біз белсенділіктің синхрондалған жарылыстарын байқадық (кеңейтілген деректер, 10d-сурет). Жарылыстар шамамен 460 мс созылды және олар шамамен 2 секундтық тыныштық кезеңдерімен бөлінген (кеңейтілген деректер, 10d, e-сурет). Жеке бөлімшелер бір атқылау үшін орташа есеппен үш раунд атысты, бұл бір атқылау үшін тіркелген бірліктердің шамамен 73% құрайды. Жеке бөлімшелердің қызметі жоғары корреляцияға ие болды және бұл корреляция бірдей шарттарда жазылған вакцинацияланбаған жануарларда анықталған бірліктерге қарағанда жоғары болды (кеңейтілген деректер, 10f-сурет). Анықталған адамнан алынған нейрондардың өсу реакцияларын одан әрі сипаттау үшін біз t-hCO нейрондары қысқа кідіріспен тану (көк жарыққа 10 мс-ден аз жауап) болатын жарыққа сезімтал катион каналын родопсин 2 (hChR2) білдіретін hCO трансплантацияланған анестезияланған егеуқұйрықтарға жарықты белгілеу эксперименттерін орындадық. t-hCO нейрондары кальцийді бейнелеуде байқалатын жиіліктегі спонтанды белсенділіктің жарылыстарын көрсетті, сондай-ақ жарық таңбалауы болмаған кезде t-hCO-да орындалатын электрофизиологиялық жазбалар (кеңейтілген деректер, 10c-g сурет). In vitro тіркелген hCO сәйкес кезеңдерде өздігінен белсенділік байқалған жоқ. t-hCO сенсорлық ынталандыру арқылы белсендірілуі мүмкін екенін бағалау үшін біз егеуқұйрықтың мұрттарын t-hCO-дан қысқаша бұрдық (сурет 4j, m және кеңейтілген деректер, 10h, k-сурет). Алдыңғы зерттеулерге сәйкес8,10, t-hCO жасушаларының ішкі жиынтығы мұрттың ауытқуына жауап ретінде белсенділіктің жоғарылауын көрсетті, бұл деректерді кездейсоқ уақыт белгілерімен салыстырған кезде байқалмады (4k-q суреті және кеңейтілген деректер, 10h-q сурет). Шынында да, опто-таңбаланған жалғыз бірліктердің шамамен 54% -ы сақалды ынталандырудан кейін қозу жылдамдығының айтарлықтай жоғарылауын көрсетті, ол шамамен 650 мс шыңына жетті (4r-сурет). Біріктірілген бұл деректер t-hCO тиісті функционалды кірістерді алатынын және қоршаған ортаны ынталандыру арқылы белсендірілуі мүмкін екенін көрсетеді.
Содан кейін біз t-hCO мінез-құлықты бақылау үшін егеуқұйрықтардағы тізбектерді белсендіре алатындығын зерттедік. Біз алдымен t-hCO нейрондарының аксондары егеуқұйрықтың айналасындағы тіндерге енетінін зерттедік. Біз hCO-ны EYFP (hChR2-EYFP) біріктірілген hChR2 кодтайтын лентивируспен жұқтырдық. 110 күннен кейін біз есту, қозғалтқыш және соматосенсорлық қыртыстарды қоса алғанда, ipsilateral кортикальды аймақтарда, сондай-ақ стриатумды, гиппокампты және таламусты қоса, субкортикалық аймақтарда EYFP экспрессиясын байқадық (Cурет 5a). Бұл эфферентті проекциялар егеуқұйрық жасушаларында синаптикалық реакцияларды тудыруы мүмкін екенін бағалау үшін біз өткір ми бөлімдеріндегі егеуқұйрық ми қыртысының жасушаларын жазу арқылы hChR2-EYFP білдіретін t-hCO жасушаларын оптикалық белсендірдік. Көк жарықпен t-hCO аксондарын белсендіру NBQX арқылы бұғатталған егеуқұйрық пирамидалық кортекс нейрондарында қысқа кешіктірілген EPSC-терді тудырды (сурет 5b-g). Сонымен қатар, бұл жауаптарды тетродотоксинмен (TTX) бұғаттауға және 4-аминопиридинмен (4-AP) қалпына келтіруге болады, бұл олардың моносинапстық байланыстардан туындағанын болжайды (5e-сурет).
a, Аксонды бақылаудың схемалық диаграммасы (сол жақта). t-hCO EYFP өрнегі (оң жақта). Масштаб жолағы, 100 мкм. А1, есту қыртысы, АКС, алдыңғы саңылау қыртысы, д. жолақ, дорсальды жолақ, HPC, гиппокамп; Диафрагма, бүйірлік қалқа, mPFC, медиальды префронтальды қыртыс, пири, пириформа қыртысы, v.striatum, вентральды жолақ, VPM, таламустың вентропостомедиальды ядросы, VTA, вентральды тегментальды аймақ. Қызыл квадраттар мидың суреттер түсірілген аймақтарын білдіреді. б, ынталандыру экспериментінің схемалық диаграммасы. c, d, Адам (c) EYFP+ t-hCO немесе егеуқұйрық (d) EYFP- жасушаларындағы көк жарықпен индукцияланған фототок (жоғарғы) және кернеу (төменгі) реакциясының мысалдары. e, f, TTX және 4-AR (жасыл), TTX (сұр) немесе aCSF (қара) (e), (күлгін) немесе онсыз (қара) ) ) NBQX (e) бар t-hCO аксондарын көк жарықпен ынталандырудан кейін егеуқұйрық нейрондарының ағымдағы іздері. g, егеуқұйрық жасушаларында көк жарықпен индукцияланған жауаптардың кешігуі (n = 16 жасуша); көлденең жолақтар орташа кідірісті (7,13 мс) көрсетеді (сол жақта). NBQX бар немесе онсыз жазылған жарық тудыратын EPSC амплитудасы (n = 7 ұяшық; ***P <0,0001) (ортаңғы). NBQX бар немесе онсыз жазылған жарық тудыратын EPSC амплитудасы (n = 7 ұяшық; ***P <0,0001) (ортаңғы). Амплитуда вызванных светом EPSC, зарегистрированных с немесе NBQX (n = 7 клеток; ***P <0,0001) (орталықта). NBQX бар немесе онсыз жазылған жарықпен индукцияланған EPSC амплитудасы (n = 7 ұяшық; ***P < 0,0001) (орталық).使用或不使用NBQX 记录的光诱发EPSC 的振幅（n = 7 个细胞；***P < 0,0001）（中）使用或不使用NBQX 记录的光诱发EPSC 的振幅（n = 7 个细胞；***P < 0,0001）（中） Амплитуда вызванных светом EPSC, зарегистрированных с немесе NBQX (n = 7 клеток; ***P <0,0001) (орталықта). NBQX бар немесе онсыз жазылған жарықпен индукцияланған EPSC амплитудасы (n = 7 ұяшық; ***P < 0,0001) (орталық).Көк жарыққа жауап беретін EPSC-терді көрсететін егеуқұйрық жасушаларының пайызы (оң жақта). h, Мінез-құлық тапсырмасының схемалық диаграммасы. d0, күн 0. i. Жаттығудың 1-ші күні (сол жақта) немесе 15-ші күні (оң жақта) үлгілі жануарларды орындау. 1-ші күні (сол жақта) немесе 15-ші күні (оң жақта) орындалған жалаулардың орташа саны (n = 150 көк жарық, n = 150 қызыл жарық сынақтары; *** P < 0,0001). 1-ші күні (сол жақта) немесе 15-ші күні (оң жақта) орындалған жалаулардың орташа саны (n = 150 көк жарық, n = 150 қызыл жарық сынақтары; *** P < 0,0001). Среднее количество облизываний, выполненных в день 1 (слева) немесе день 15 (в центре справа) (n = 150 испытаний с синим светом, n = 150 испытаний с красным светом; ***P <0,0001). 1-ші күні (сол жақта) немесе 15-ші күні (ортаңғы оң жақта) орындалған жалаулардың орташа саны (n = 150 көк жарық сынақтары, n = 150 қызыл жарық сынақтары; *** P < 0,0001).第1 天（左）或第15 天（右中）执行的平均舔次数（n = 150 次蓝光试验，n =次红光试验；***P <0,0001）。第1 天（左）或第15 天（右中）执行的平均舔次数（n = 150 次蓝光试验，n =次红光试验；***P < 0,001 Среднее количество облизываний, выполненных в день 1 (слева) немесе день 15 (в центре справа) (n = 150 испытаний с синим светом, n = 150 испытаний с красным светом; ***P <0,0001). 1-ші күні (сол жақта) немесе 15-ші күні (ортаңғы оң жақта) орындалған жалаулардың орташа саны (n = 150 көк жарық сынақтары, n = 150 қызыл жарық сынақтары; *** P < 0,0001).1-ші күндегі (ортаңғы сол жақта) немесе 15-ші күндегі (оң жақта) қызыл және көк жарық сынақтары үшін жинақталған жалаулар. NS, маңызды емес. j,k, 1 немесе 15-ші күні hChR2-EYFP (j) немесе бақылау фторфорын (k) білдіретін t-hCO трансплантацияланған барлық жануарлардың мінез-құлық сипаттамалары (hChR2-EYFP: n = 9 егеуқұйрық, ** P = 0,0049; бақылау: n = 9, P = 0,19). l, Артықшылық баллының эволюциясы (n = 9 hChR2, n = 9 бақылау; **P <0,001, ***P <0,0001). l, Артықшылық баллының эволюциясы (n = 9 hChR2, n = 9 бақылау; **P <0,001, ***P <0,0001). l, Эволюция показателя предпочтения (n = 9 hChR2, n = 9 бақылау; **P <0,001, ***P <0,0001). l, Артықшылық көрсеткішінің эволюциясы (n = 9 hChR2, n = 9 бақылау; **P <0,001, ***P <0,0001). l，偏好评分的演变（n = 9 hChR2，n = 9 对照；**P <0,001，***P <0,0001）。 l，偏好评分的演变（n = 9 hChR2，n = 9 对照；**P <0,001，***P <0,0001）。 l, Эволюция показателей предпочтения (n = 9 hChR2, n = 9 бақылау; **P <0,001, ***P <0,0001). l, Артықшылық ұпайларының эволюциясы (n = 9 hChR2, n = 9 бақылау; **P <0,001, ***P <0,0001).m, S1-де t-hCO-ның оптогенетикалық активтенуіне жауап ретінде FOS экспрессиясы. FOS өрнегі (сол жақта) және сандық анықтау (топ үшін n = 3; *P <0,05, **P <0,01 және ***P <0,001) (оң жақта) көрсетілген. FOS өрнегі (сол жақта) және сандық анықтау (топ үшін n = 3; *P <0,05, **P <0,01 және ***P <0,001) (оң жақта) көрсетілген. Показаны изображения экспрессии FOS (слева) және количественное определения (n = 3 на группу; * P <0,05, ** P <0,01 және *** P <0,001) (справа). FOS өрнегі (сол жақта) және сандық анықтау (топ үшін n = 3; *P<0,05, **P<0,01 және ***P<0,001) кескіндері көрсетілген (оң жақта).显示了FOS 表达（左）和量化（每组n = 3；*P <0,05、**P <0,01 和***P < 0,001）（右）（右）显示了FOS 表达（左）和量化（每组n = 3；*P <0,05、**P <0,01 和***P < 0,001）（右）（右） Показаны изображения экспрессии FOS (слева) және количественное определения (n = 3 на группу; * P <0,05, ** P <0,01 және *** P <0,001) (справа). FOS өрнегі (сол жақта) және сандық анықтау (топ үшін n = 3; *P<0,05, **P<0,01 және ***P<0,001) кескіндері көрсетілген (оң жақта).Масштаб жолағы, 100 мкм. Деректер BLA орташа ± стандартты қатесі, базолатеральды бадамша безі, MDT, дорсодиальды таламикалық ядро, PAG, периакведуктальды сұр ретінде көрсетіледі.
Соңында біз t-hCO егеуқұйрықтардың мінез-құлқын модуляциялай алатынын сұрадық. Мұны тексеру үшін біз hChR2-EYFP-экспрессиялайтын hCO-ны S1-ге ауыстырдық, ал 90 күннен кейін жарық беру үшін t-hCO-ға оптикалық талшықтарды имплантацияладық. Содан кейін біз егеуқұйрықтарды өзгертілген оперантты кондициялау парадигмасымен оқыттық (5h-сурет). Біз жануарларды мінез-құлық сынақ камерасына орналастырдық және кездейсоқ 5 секундтық көк (473 нм) және қызыл (635 нм) лазерлік ынталандыруды қолдандық. Жануарлар көк жарықты ынталандыру кезінде жалап, бірақ қызыл жарықты ынталандыру кезінде жаламаса, су сыйлығын алды. Жаттығудың бірінші күнінде жануарлар көк немесе қызыл жарықпен қоздырылғанда жалауда ешқандай айырмашылықты көрсетпеді. Дегенмен, 15-ші күні hChR2-EYFP экспрессиясы бар hCO трансплантацияланған жануарлар қызыл жарықты ынталандырумен салыстырғанда көк жарықпен ынталандырылғанда белсендірек жалау көрсетті. Жалау мінез-құлқындағы бұл өзгерістер бақылау флюорофорын білдіретін hCO трансплантацияланған бақылау жануарларында байқалмады (үйрену табысының деңгейі: hChR2 89%, EYFP 0%, 5i-1 сурет және 2-қосымша бейне). Бұл деректер t-hCO жасушалары марапатқа ұмтылатын мінез-құлықты ынталандыру үшін егеуқұйрық нейрондарын белсендіре алатындығын көрсетеді. Бұл мінез-құлық өзгерістеріне қандай егеуқұйрықтың t-hCO нейрондық тізбектері қатыса алатынын білу үшін біз 90 минуттан кейін үйретілген жануарлар мен жиналған тіндерде t-hCO-ны оптогенетикалық белсендірдік. Иммуногистохимия мотивацияланған мінез-құлыққа қатысатын мидың бірнеше аймақтарында белсенділікке тәуелді FOS протеинінің экспрессиясын анықтады, соның ішінде медиальды префронтальды кортекс, медиальды таламус және периакведуктальды сұр зат, не ынталандырылмаған бақылау жануарларында немесе жануарларда көрсетілген. күріш. 5 м). Біріктірілген бұл деректер t-hCO мінез-құлықты басқару үшін егеуқұйрықтардың нейрондық белсенділігін модуляциялай алатынын көрсетеді.
Нейрондық органоидтар адамның дамуы мен ауруын in vitro жағдайында зерттеудің перспективалық жүйесін білдіреді, бірақ олар in vivo бар тізбектер арасындағы байланыстардың болмауымен шектеледі. Біз in vivo адамның жасушаларының дамуы мен қызметін зерттеу үшін иммундық тапшылығы бар ерте постнатальдық егеуқұйрықтардың S1 ішіне hCO трансплантациялаған жаңа платформа әзірледік. Біз t-hCO in vitro28 байқалмаған жетілген жасуша түрлерін дамытатынын және t-hCO кеміргіштердің миына анатомиялық және функционалды түрде біріктірілгенін көрсеттік. t-hCO-ның кеміргіштердің нейрондық схемаларына интеграциясы адамның жасушалық белсенділігі мен зерттелген жануарлардың мінез-құлқы арасындағы байланысты орнатуға мүмкіндік берді, бұл t-hCO нейрондары мінез-құлық реакцияларын жүргізу үшін егеуқұйрықтардың нейрондық белсенділігін модуляциялай алатындығын көрсетті.
Біз сипаттайтын платформа адам жасушаларын кеміргіштердің миына трансплантациялау бойынша алдыңғы зерттеулерге қарағанда бірнеше артықшылықтарға ие. Біріншіден, біз hCO-ны ерте постнатальдық егеуқұйрықтардың дамып келе жатқан кортексіне ауыстырдық, бұл анатомиялық және функционалдық интеграцияны жеңілдетуі мүмкін. Екіншіден, t-hCO MRI мониторингі бізге тірі жануарлардағы трансплантаттың орналасуын және өсуін зерттеуге мүмкіндік берді, бұл бізге ұзақ мерзімді көп жануарларды зерттеулер жүргізуге және бірнеше hiPS жасушаларының сенімділігін орнатуға мүмкіндік берді. Ақырында, біз адам жасушаларына аз деструктивті болып табылатын және егеуқұйрықтардың миындағы адам қыртысы нейрондарының интеграциясы мен генерациясына ықпал ете алатын оқшауланған бір жасушалы суспензиялардың орнына, бүтін органоидтарды трансплантацияладық.
Біз осы платформадағы жетістіктерге қарамастан, уақытша, кеңістіктік және түр аралық шектеулер дамудың ерте сатысында трансплантациядан кейін де адамның нейрондық тізбектерінің жоғары дәлдікпен қалыптасуына кедергі келтіретінін мойындаймыз. Мысалы, t-hCO-да байқалатын стихиялық белсенділік кортикальды даму кезінде байқалатын ырғақты белсенділікке ұқсас даму фенотипін білдіре ме, әлде бұл t-hCO-да бар супрессивті жасуша түрлерінің болмауына байланысты ма, анық емес. Сол сияқты, t-hCO ламинациясының жоқтығы тізбектің қосылуына қаншалықты әсер ететіні белгісіз30. Болашақ жұмыс адамның микроглиялары, адамның эндотелий жасушалары және 6-жинақтау in vitro көмегімен көрсетілген GABAergic интернейрондарының әртүрлі пропорциялары сияқты басқа жасуша түрлерін біріктіруге, сондай-ақ өзгертілген t-hCO-да нейрондық интеграция мен өңдеудің қалай жүзеге асатынын түсінуге бағытталған. пациенттерден алынған жасушалардағы транскрипциялық, синаптикалық және мінез-құлық деңгейлері.
Тұтастай алғанда, бұл in vivo платформасы адам миының in vitro дамуын және ауруды зерттеуді толықтыра алатын қуатты ресурс болып табылады. Біз бұл платформа пациенттерден алынған жасушаларда жаңа тізбектік фенотиптерді табуға және жаңа терапиялық стратегияларды сынауға мүмкіндік береді деп күтеміз.
Біз бұрын сипатталғандай HiPS жасушаларынан hCO2.5 жасадық. Фидер қабаттарында өсірілген hiPS жасушаларынан hCO өндірісін бастау үшін hiPS жасушаларының бүлінбеген колониялары диспас (0,35 мг/мл) көмегімен культуралық ыдыстардан жойылды және hiPS жасушаларының культура ортасы бар ыдыстары бар өте төмен бекітілген пластикалық дақылдарға ауыстырылды. (Корнинг) екі SMAD тежегіштері дорсоморфинмен (5 мкм; P5499, Sigma-Aldrich) және SB-431542 (10 мкм; 1614, Tocris) және ROCK ингибиторы Y-27632 (10 мкМ; S1049, Selleckchem) толықтырылған. Алғашқы 5 күн ішінде hiPS жасушалық ортасы күн сайын өзгертіліп, дорсоморфин және SB-431542 қосылды. Алтыншы күні суспензияда нейробазалық-А (10888, Life Technologies), А дәрумені жоқ B-27 қоспасы (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies), пенициллин және Life Technologies (1100), пенициллин және: эпидермальды өсу факторымен (EGF; 20 нг мл-1; R&D Systems) және фибробласт өсу факторы 2 (FGF2; 20 нг мл-1; R&D Systems) 24-ші күнге дейін толықтырылған. 25-тен 42-ші күнге дейін орта мидан алынған нейротрофиялық фактормен (BD1-0, BD1-0) толықтырылды. нейротрофин 3 (NT3; 20 нг мл-1; Пепротех) орташа өзгеретін күн сайын. Алтыншы күні суспензияда нейробазалық-А (10888, Life Technologies), А дәрумені жоқ B-27 қоспасы (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies), пенициллин және Life Technologies (1100), пенициллин және: эпидермальды өсу факторымен (EGF; 20 нг мл-1; R&D Systems) және фибробласт өсу факторы 2 (FGF2; 20 нг мл-1; R&D Systems) 24-ші күнге дейін толықтырылған. 25-тен 42-ші күнге дейін орта мидан алынған нейротрофиялық фактормен (BD1-0, BD1-0) толықтырылды. нейротрофин 3 (NT3; 20 нг мл-1; Пепротех) орташа өзгеретін күн сайын.Суспензияда алтыншы күні нейрондық сфероидтар Neurobasal-A (10888, Life Technologies), А витамині жоқ B-27 қоспасы (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies), пенициллин бар нейрондық ортаға ауыстырылды.және стрептомицин (1:100, Life Technologies) және қосымша эпидермальды факторлар (EGF; 20 нг/мл; R&D Systems) және 2 факторы (FGF2; 20 нг/мл; R&D Systems) 24-ге дейін. және стрептомицин (1:100, Life Technologies) және эпидермиялық өсу факторымен (EGF; 20 нг/мл; R&D Systems) және 2-фибробласт өсу факторымен (FGF2; 20 нг/мл; R&D Systems) 24-ші күнге дейін толықтырылған.25-тен 42-ші күнге дейін ортаға мидан алынған нейротрофиялық фактор (BDNF; 20 нг мл-1, Пепротех) және нейротрофин 3 (NT3; 20 нг мл-1, Пепротех) қосылды, ортаны екі күн сайын ауыстырды.在悬浮的第6 天，将神经球体转移到含有neurobasal-A（10888，Life Technologies）、不含维A2生生补充剂（12587，Life Technologies）、GlutaMax（1:100，Life Technologies）、青霉素的神经培养基中弈0（1） Technologies）并辅以表皮生长因子（EGF；20 нг мл-1；R&D Systems）和成纤维细胞生长因子2（F2（F2（GF Systems）直至第24 天。在 悬浮 的 第 第 6 天 将 神经 球体 转移 含有 含有 neurobasal-a （10888 ， Life Technologies－ 维维的 b-27 补充剂 （12587 ， Life Technologies） Glutamax （1: 100 ， Life TechNOGIS青霉素 的 神经 培养 神经 培养 基100 ， Life Technologies） 表皮 生长 因子 （（（（20 нг мл-1 ； r & d Systems） 成 纤维 细胞 生长 细胞 生长 2（fg2（fng 1；R&D Systems）直至第24天。 Добавку, содержащую нейробазал-А (10888, Life Technologies), добавку В-27 без витамина А (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies) үшін 6-й день суспензиялы нейросферилер мен переведенділер. стрептомицин (1:100, Life Technologies) эпидермальді факторларға қарсы (EGF; 20 нг мл-1; R&D Systems) және 20 нг мл-1 (FGF2; 20 нг мл-1) 1; 6-шы күні нейросфералық суспензиялар құрамында нейробазал-А (10888, Life Technologies), А дәрумені жоқ B-27 қоспасы (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies), пенициллинмен бейтараптандырылған Life Technologies (10101) пенициллинмен бейтараптандырылған қоспасы бар қоспаға ауыстырылды. эпидермиялық өсу факторымен (EGF; 20 нг мл-1; R&D Systems) және 2 фибробласт өсу факторымен (FGF2; 20 нг мл-1) 1 толықтырылған; R&D Systems) дейін 24-ге дейін. R&D Systems) 24 күнге дейін.25-тен 42-ші күнге дейін өсірілетін ортаға екі күн сайын мидан алынған нейротрофиялық фактор (BDNF; 20 нг мл-1, Пепротех) және нейротрофиялық фактор 3 (NT3; 20 нг мл-1, Пепротех) қосылды. Орташа өзгеріс бір рет.43-ші күннен бастап hCO толықтырылмаған нейробазальды-А ортада (NM; 1088022, Thermo Fisher) орташа әр 4-6 күн сайын өзгеріп отырды. Фидерсіз жағдайларда өсірілген hiPS жасушаларынан hCO алу үшін, hiPS жасушалары Accutase (AT-104, Innovate Cell Technologies) 37°C температурада 7 минут инкубацияланды, бір ұяшықтарға диссоциацияланды және AggreWell 800 пластиналарына (34815, STEMCELL Technologies бір ұяшыққа 1 × 3 денсациясында) қапталды. Y-27632 ROCK тежегішімен толықтырылған Essential 8 ортасы (10 мкм; S1049, Selleckchem). 24 сағаттан кейін ұңғымалардағы орталар дорсоморфинмен (2,5 мкМ; P5499, Sigma-Oldrich) және SB-431542 (10 мкМ4) қосылған Essential 6 ортасы (A1516401, Life Technologies) бар ортаға жоғары және төмен тамызылды. , Токрида). 2-ден 6-ға дейін Essential 6 ортасы күн сайын дорсоморфинмен және SB-431542 қоспасымен ауыстырылды. Алтыншы күннен бастап нейросфералық суспензиялар нейробазальды ортаға ауыстырылды және жоғарыда сипатталғандай сақталды.
Жануарлардың барлық процедуралары Стэнфорд университетінің зертханалық жануарларды күту бойынша әкімшілік комитеті (APLAC) бекіткен жануарларды күту нұсқауларына сәйкес орындалды. Жүкті эвтимиялық RNU (rnu/+) егеуқұйрықтар сатып алынды (Charles River Laboratories) немесе орналастырылды. Жануарлар 12 сағаттық жарық-қараңғы циклде азық-түлік пен суды ad libitumмен ұстады. Үш күннен жеті күнге дейінгі жалаңаш (FOXN1–/–) егеуқұйрықтардың күшіктері жойылғанға дейін жетілмеген мұрттардың өсуі арқылы анықталды. Күшіктер (еркек және аналық) 2-3% изофлуранмен жансыздандырылды және стереотаксикалық жақтауға орналастырылды. Dura mater тұтастығын сақтай отырып, диаметрі S1-ден шамамен 2-3 мм жоғары бас сүйегінің трепанациясы жасалды. Содан кейін 30-Г инені (шамамен 0,3 мм) краниотомиядан тыс жерде, дураны тесу үшін пайдаланыңыз. Содан кейін жұқа 3×3 см парафильмге HCO жағып, артық ортаны алып тастаңыз. 23 G, 45° инеге бекітілген Гамильтон шприцін пайдаланып, hCO-ны иненің ең алыс шетіне ақырын тартыңыз. Содан кейін шприцті стереотаксикалық құрылғыға қосылған шприц сорғысына орнатыңыз. Содан кейін иненің ұшын дурада бұрын жасалған ені 0,3 мм тесетін тесікке (z = 0 мм) қойып, шприцті 1-2 мм (z = шамамен –1,5 мм) ине A dura mater-дің арасына дейін тарылтыңыз. тығыз тығыздағыш пайда болады. Содан кейін шприцті кортикальды бетінің ортасына z = -0,5 мм жоғары көтеріп, минутына 1-2 мкл жылдамдықпен hCO енгізіңіз. hCO инъекциясы аяқталғаннан кейін инені минутына 0,2-0,5 мм жылдамдықпен тартып алады, терісі тігіледі, ал күшік толық қалпына келгенше дереу жылы жылыту төсеміне орналастырылады. Кейбір жануарлар екі жақты трансплантацияланды.
Жануарларға арналған барлық процедуралар Стэнфорд университетінің APLAC мақұлдаған жануарларды күту нұсқауларына сәйкес орындалды. Егеуқұйрықтар (трансплантациядан кейін 60 күннен астам) 5% изофлуран анестезиясымен индукцияланды және бейнелеу кезінде 1-3% изофлуранмен жансыздандырылды. Көрнекілік үшін AVANCE көмегімен 7 Tesla белсенді экрандалған көлденең ұңғыма сканері Bruker (Bruker Corp.) Халықаралық электр компаниясының (IECO) градиент жетегі, ішкі диаметрі 120 мм (600 мТ/м, 1000 Т/м/с) экрандалған градиент кірістіру пайдаланылды. III, сегіз арналы көп катушкалар РЖ және көп ядролы мүмкіндіктер және ілеспе Paravision 6.0.1 платформасы. Жазу ішкі диаметрі 86 мм белсенді ажыратылған көлемді РЖ катушкасын және тек қабылдауға арналған төрт арналы крио салқындатылған РЖ катушкасын пайдаланып орындалды. Осьтік 2D Turbo-RARE (қайталау уақыты = 2500 мс, жаңғырық уақыты = 33 мс, 2 орташа мән) 16 кесінді түсіру, кесінді қалыңдығы 0,6–0,8 мм, құрамында 256 × 256 үлгі бар. Сигналдар ішкі диаметрі 2 см (Rapid MR International, LLC) квадратуралық қабылдағыштың көлемді RF катушкасының көмегімен алынды. Соңында, 3D көрсету және көлемді талдау үшін кірістірілген Imaris (BitPlane) бетті бағалау функцияларын пайдаланыңыз. Табысты трансплантация трансплантацияланған жарты шарда үздіксіз T2 өлшенген МРТ сигналының аймақтары пайда болған трансплантация ретінде анықталды. Трансплантаттың қабылданбауы трансплантацияланған жарты шарда үздіксіз T2 өлшенген МРТ сигналының аймақтарын жасамайтын трансплантат ретінде анықталды. Субкортикалық t-hCO кейінгі талдаудан алынып тасталды.
Екі фотонды кальцийді бейнелеу үшін hCO-да GCaMP6s тұрақты экспрессиялау үшін hiPS жасушалары pLV[Exp]-EF1a::GcaMP6s-WPRE-Puro жұқтырылды, содан кейін антибиотиктер таңдалды. Қысқаша айтқанда, жасушалар ЭДТА-мен диссоциацияланды және полибрен (5 мкг/мл) және 15 мкл вирустың қатысуымен шамамен 300 000 жасуша тығыздығындағы 1 мл Essential 8 ортасында тоқтатылды. Содан кейін жасушалар суспензияда 60 минут инкубацияланды және бір ұңғымаға 50 000 жасуша тығыздығына себілді. Қосылғаннан кейін жасушалар 5-10 мкг мл-1 пуромицинмен 5-10 күн бойы немесе тұрақты колониялар пайда болғанша өңделген. Жедел hCO инфекциясы бұрын сипатталғандай5 кейбір модификациялармен орындалды. Қысқаша айтқанда, 100 мкл жүйке ортасы бар 1,5 мл Эппендорф микроцентрифуга түтіктеріне 30-45 hCO күнді ауыстырыңыз. Содан кейін шамамен 90 мкл орта жойылады, түтікке 3-6 мкл жоғары титрлі лентивирус (0,5 x 108-ден 1,2 x 109-ға дейін) қосылады және hCO инкубаторға 30 минутқа жіберіледі. Содан кейін әр түтікке 90–100 мкл ортаны қосып, түтіктерді түні бойы инкубаторға қайтарыңыз. Келесі күні hCO-ны төмен бекітілген пластиналардағы жаңа жүйке ортасына ауыстырыңыз. 7 күннен кейін hCO визуализация және инфекция сапасын бағалау үшін 24 шұңқырлы шыны түбі пластиналарына ауыстырылды. pLV[Exp]-SYN1::EYFP-WPRE және pLV[Exp]-SYN1::hChR2-EYFP-WPRE VectorBuilder арқылы жасалды. Лентивирус көптеген эксперименттерде пайдаланылады, себебі ол жұқтырған жасуша желілерінде репортер генінің экспрессиясына мүмкіндік беретін хост геномына біріктірілген. Құтыруды бақылау үшін 30-45 hCO күн құтыру-ΔG-eGFP және AAV-DJ-EF1a-CVS-G-WPRE-pGHpA (плазмид №67528, Addgene) бірге жұқтырылды, 3 күн бойы мұқият жуылды және S1 жылы егеуқұйрықтарға ауыстырылды және 7-күн ішінде егеуқұйрықтарға ауыстырылды.
Иммуноцитохимия үшін жануарлар жансыздандырылды және PBS, содан кейін 4% параформальдегидпен транскардиалды түрде перфузияланды (PBS ішіндегі PFA; Electron Microscopy Sciences). Милар 4% PFA-да 2 сағат бойы немесе түнде 4°C температурада бекітілді, 48-72 сағат бойы PBS-де 30% сахарозада криоконсервацияланды және 1:1, 30% сахарозаға ендірілді: OCT (Tissue-Tek OCT Compound 4583, Sakura Finetek) және coron a 0mk-да cstatyom секциясы арқылы жасалды. (Лейка). Қалың кесінділердің иммуногистохимиясы үшін жануарларға PBS перфузиясы жүргізілді, ми 300-400 мкм-де вибратомды (Leica) пайдаланып, корональды түрде кесілді және кесінділер 30 минут бойы 4% PFA арқылы бекітілді. Содан кейін криосекциялар немесе қалың кесінділер PBS-пен жуылды, бөлме температурасында 1 сағат бойы блокталды (10% қалыпты есек сарысуы (NDS) және PBS-те сұйылтылған 0,3% Triton X-100) және 4°C блоктау ерітіндісімен блокталды. – Инкубациялық криосекциялар түнде инкубацияланды және қалың кесінділер 5 күн бойы инкубацияланды. Пайдаланылған негізгі антиденелер: анти-NeuN (тінтуір, 1:500; ab104224, abcam) анти-CTIP2 (егеуқұйрық, 1:300; ab18465, abcam), анти-GFAP (қоян, 1:1,000; Z0334, Dako), анти-GFP, GTX100 (chick;19,10en); GeneTex), анти-HNA (тінтуір, 1:200; ab191181, abcam), анти-NeuN (қоян, 1:500; ABN78, Millipore), анти-PDGFRA (қоян, 1:200; sc-338, Санта-Круз), анти-PPP1R17 (қоян, H419: қоян, H208; Антиденелер), анти-RECA-1 (тышқан, 1:50; ab9774, abcam), анти-SCG2 (қоян, 1:100; 20357-1-AP, Proteintech), анти-SOX9 (ешкі, 1:500; AF3075, R&D Systems), Netrin, R1610; Жүйелер), анти-STEM121 (тінтуір, 1:200; Y40410, Takara Bio), анти-SATB2 (тінтуір, 1:50; ab51502, abcam), анти-GAD65/67 (қоян, 1:400; ABN904, Millipore) және анти-IBA1 (goat, ab100;). Пайдаланылған негізгі антиденелер: анти-NeuN (тінтуір, 1:500; ab104224, abcam) анти-CTIP2 (егеуқұйрық, 1:300; ab18465, abcam), анти-GFAP (қоян, 1:1,000; Z0334, Dako), анти, GFP (chick 1:100; GeneTex), анти-HNA (тінтуір, 1:200; ab191181, abcam), анти-NeuN (қоян, 1:500; ABN78, Millipore), анти-PDGFRA (қоян, 1:200; sc-338, Санта-Круз), анти-PPP1R17 (қоян, H419: қоян, H208; Антиденелер), анти-RECA-1 (тінтуір, 1:50; ab9774, abcam), анти-SCG2 (қоян , 1:100; 20357-1-AP, Proteintech), анти-SOX9 (ешкі, 1:500; AF3075, R&D Systems), Netrin G061; R&D Systems), анти-STEM121 (тінтуір , 1:200; Y40410, Takara Bio), анти-SATB2 (тінтуір, 1:50; ab51502, abcam), анти-GAD65/67 (қоян, 1:400; ABN904, Millipore) және анти-IBA101; abcam). Использовались следующие первичные антитела: анти-NeuN (мышиные, 1:500; ab104224, abcam), анти-CTIP2 (крысиные, 1:300; ab18465, abcam), анти-GFAP (кроличьи, 1:1030), анти; (курица, 1:1000; GTX13970, GeneTex), анти-HNA (мышь, 1:200; ab191181, abcam), анти-NeuN (кролик, 1:500; ABN78, Millipore), анти-PDGFRA (кролик, 1:200, анти-PDGFRA, anti-Sc3P780, СанК3P7-1; (кролик, 1:200; HPA047819, Atlas Antibodies), анти-RECA-1 (мышь, 1:50; ab9774, abcam), анти-SCG2 (кролик , 1:100; 20357-1-AP, Proteintech), анти-SOX9 (koziy, & Systems, ROS307; нетрин G1a (козий, 1:100; AF1166, R&D Systems), анти-STEM121 (мышиный , 1:200; Y40410, Takara Bio), анти-SATB2 (мышь, 1:50; ab51502, abcam), анти-GAD65/640N (AB40N) Millipore) және анти-IBA1 (коза, 1 :100; аб5076, абкам). Қолданылған негізгі антиденелер: анти-NeuN (тінтуір, 1:500; ab104224, abcam), анти-CTIP2 (егеуқұйрық, 1:300; ab18465, abcam), анти-GFAP (қоян, 1:1000; Z0334, Dako), анти-GFP (тауық, GTX100); анти-HNA (тінтуір, 1:200; ab191181, abcam), анти-NeuN (қоян, 1:500; ABN78, Millipore), анти-PDGFRA (қоян, 1:200; sc-338, Санта-Круз), анти-PPP1R17 (қоян, H1908, At; Antibo) анти-RECA-1 (тінтуір, 1:50; ab9774, abcam), анти- SCG2 (қоян, 1:100; 20357-1-AP, Proteintech), анти-SOX9 (ешкі, 1:500; AF3075, R&D Systems), netrin G1a (eшкі, R&D Systems):100;16,&1- STEM121 (тінтуір, 1:200; Y40410, Takara Bio), анти-SATB2 (тінтуір, 1:50; ab51502, abcam), анти-GAD65/67 (қоян, 1:400; ABN904, Millipore) және анти-IBA1 (ешкі, abkam, 1507).使用的一抗是：抗NeuN（小鼠＠,1:500；ab104224，abcam）抗CTIP2（大鼠＠,1:3 00；ab18465，abcam），抗GFAP（兔，1:1,000；Z0334，Dako），抗-GF P（鸡，1:1,000；GTX13970，GeneTex），抗HNA（小鼠＠,1:200；ab1911 81，abcam），抗NeuN（兔，1:500；ABN78，Millipore），抗PDGFRA（兔， 1:200；sc-338，Санта Круз），抗PPP1R17（兔，1:200；HPA047819，Атлас抗体），抗RECA-1（小鼠＠,1:50；ab9774，abcam），抗SCG2（兔）, 1:100；20357-1-AP，Proteintech），抗SOX9（山羊，1:500；AF3075，R&D Systems），Netrin G1a（山羊6（6（AF110，1:11 Systems），抗STEM121（小鼠, 1:200;使用的一抗是：抗NeuN（小鼠＠,1:500；ab104224，abcam）抗CTIP2（大鼠＠＠，1 :300；ab18465，abcam），抗GFAP（兔，1:1,000；Z0334，Dako），抗-GFP（鸡，1:1,000；GTX13970，GeneTex），抗HNA（小鼠＠,1:200；ab 191181，abcam），抗NeuN（兔，1:500；ABN78，Millipore％弔４,抗1: 200；sc-338，Santa Cruz），抗PPP1R17（兔，1:200；HPA047819，Атлас抗体），抗RECA-1（小鼠＠,1:50；ab9774，abcam），抗SCG2 100；20357-1-AP，Proteintech），抗SOX9（山羊，1:500；AF3075，R&D Systems），Netrin G1a（山羊；AF；110D, 1:10 Жүйелер）頏1:20, ;Y40410, Takara Bio), анти-SATB2 (тінтуір, 1:50; ab51502, abcam), анти-GAD65/67 (қоян, 1:400; ABN904, Millipore) және анти-IBA1 (ешкі, 1:100; ab5076, abcam)。Қолданылған негізгі антиденелер: анти-NeuN (тінтуір, 1:500; ab104224, abcam), анти-CTIP2 (егеуқұйрық, 1:300; ab18465, abcam), анти-GFAP (қоян, 1:1000; Z0334, Dako) . , анти-GFP (тауық, 1:1000; GTX13970, GeneTex), анти-HNA (тінтуір, 1:200; ab191181, abcam), анти-NeuN (қоян, 1:500; ABN78, Millipore), анти-PDGFRA ( қоян, C13:20, SC18;-) анти-PPP1R17 (қоян, 1:200; HPA047819, Atlas антиденесі), анти-RECA-1 (тінтуір, 1:50; ab9774, abcam), анти- SCG2 (қоян), 1:100;20357-1-AP, Proteintech), анти-SOX9 (коза, 1:500; AF3075, R&D Systems), Нетрин G1a (коза, 1:100; AF1166, R&D Systems), анти -STEM121 (мышь, 1:200, Y40410; Takara, Biyomyş), 1:50; ab51502, abcam), анти-GAD65/67 (кролик, 1:400; ABN904, Millipore) және анти-IBA1 (коза, 1:100; аб5076, абкам). 20357-1-AP, Proteintech), анти-SOX9 (ешкі, 1:500; AF3075, R&D Systems), Netrin G1a (ешкі, 1:100; AF1166, R&D Systems), анти-STEM121 (тінтуір, 1:200; Takaramo, Antiuse (Y4041)), 1:50; ab51502, abcam), анти-GAD65/67 (қоян, 1:400; ABN904, Millipore) және анти-IBA1 (ешкі, 1:100; ab5076, abkam).Содан кейін кесінділер PBS-пен жуылды және бөлме температурасында (мұздатылған кесінділер) 1 сағат немесе түні бойы 4°C (қалың кесінділер) ішінде қайталама антиденелермен инкубацияланды. Блоктау ерітіндісінде 1:1000 сұйылтылған Alexa Fluor қайталама антиденесі (Life Technologies) пайдаланылды. PBS көмегімен жуғаннан кейін ядролар Hoechst 33258 (Life Technologies) көмегімен бейнеленді. Соңында, слайдтар Aquamount (Polysciences) көмегімен қабықшалары бар микроскопқа (Fisher Scientific) орналастырылды және суреттегі Keyence флуоресцентті микроскопында (BZ-X анализаторы) немесе Leica TCS SP8 конфокальды микроскопында (Las-X) талданды. Суреттер ImageJ бағдарламасының (Фиджи) көмегімен өңделді. t-hCO және егеуқұйрық кортексіндегі адам нейрондарының үлесін анықтау үшін егеуқұйрық қыртысының шетінде немесе жанында t-hCO ортасында ені 387,5 мкм төртбұрышты кескіндер алынды. Трансплантаттың жиектері тіндердің мөлдірлігінің, HNA+ ядроларының және/немесе тіндердің автофлуоресценциясының болуының өзгеруін бағалау арқылы анықталды. Әрбір суретте NeuN+ және HNA+ жасушаларының жалпы саны сол аймақтағы NeuN+ жасушаларының жалпы санына бөлінген. Кескін жазықтығында ядролары бар ұяшықтар ғана есептелуін қамтамасыз ету үшін есептеуге тек Hoechst+ болып табылатын ұяшықтар ғана қосылады. Статистикалық қатені азайту үшін кемінде 1 мм бөлінген екі кескіннің орташа мәні алынды.
Үлгіні жинаудан бір апта бұрын hCO трансплантациясы жануарларын (шамамен 8 ай саралау) сенсорлық ынталандыруды азайту үшін мұрттары кесілген қараңғы бөлмеге қойыңыз. Ядроларды оқшаулау бұрын сипатталғандай, кейбір өзгертулермен орындалды. Қысқаша айтқанда, t-hCO және hCO тазартқыш-механикалық жасуша лизисі және 2 мл шыны тіндік ұнтақтағыш (D8938, Sigma-Aldrich/KIMBLE) арқылы жойылды. Содан кейін шикі ядролар 40 мкм сүзгіні пайдаланып сүзілді және сахароза тығыздығы градиентін орындамас бұрын 4 °C температурада 10 минут бойы 320 г центрифугадан өтті. Центрифугалау қадамынан кейін (4°C температурада 20 минут ішінде 320 г) үлгілер 0,2 бірлік мкл-1 RNase тежегішін (40 u мкл-1, AM2682, Ambion) қосу арқылы 0,04% BSA/PBS ішінде қайта суспензияланды және 40 мкм ағынды сүзгіден өтті. Содан кейін диссоциацияланған ядролар құрамында 0,02% BSA бар PBS-де қайта суспензияға ұшырады және Chromium Single Cell 3′ чипіне жүктелді (әр жолақ үшін болжамды қалпына келтіру 8000 жасуша). snRNA-seq кітапханалары Chromium Single cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics) көмегімен дайындалған. snRNA-seq кітапханалары Chromium Single cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics) көмегімен дайындалған. Chromium Single cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics) snRNA-seq библиотеки. snRNA-seq кітапханалары Chromium Single cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics) көмегімен дайындалған. snRNA-seq 文库是使用Chromium Single cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics) 制备的。 snRNA-seq 文库是使用Chromium Single cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics) 制备的。 Chromium Single Cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics). snRNA-seq кітапханасы Chromium Single Cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics) көмегімен дайындалған.Әртүрлі үлгілерден алынған кітапханалар NovaSeq S4 (Illumina) жүйесінде Admera Health арқылы жинақталған және реттелген.
Әрбір болжамды ядролық штрих-код үшін геннің экспрессия деңгейлері 10x Genomics CellRanger талдау бағдарламалық пакеті (6.1.2 нұсқасы) көмегімен сандық түрде анықталды. Атап айтқанда, оқылған көрсеткіштер mkref пәрменімен жасалған адам (GRCh38, Ensemble, 98 нұсқа) және егеуқұйрық (Rnor_6.0, Ensemble, 100 нұсқа) анықтамалық геномдарының тіркесімімен және сандық анықтау үшін –include-introns=TRUE пәрменімен санау көмегімен интрон аймақтарымен салыстырылған көрсеткіштермен сәйкестендірілді. t-hCO үлгілері үшін адам ядролары барлық салыстырылған көрсеткіштердің кем дегенде 95% адам геномына сәйкес келетін консервативті талап негізінде анықталды. Барлық кейінгі талдаулар R бумасы (4.1.2 нұсқасы) Seurat (4.1.1 нұсқасы)32 арқылы CellRanger сүзгіленген штрих-код массивінің шығысында орындалды.
Кейінгі талдауға тек жоғары сапалы ядролардың қосылуын қамтамасыз ету үшін әрбір үлгі үшін итерациялық сүзу процесі жүзеге асырылды. Біріншіден, 1000-нан аз бірегей гендер табылған және жалпы митохондриялардың 20% -дан астамы бар төмен сапалы ядролар анықталады және жойылады. Кейіннен шикі гендік санның матрицасы sctransform(vst.flavor=”v2″) функциясын пайдалана отырып, реттелген теріс биномдық регрессия арқылы қалыпқа келтірілді, ол сондай-ақ әдепкі параметрлерді пайдалана отырып, 3000 ең айнымалы гендерді анықтады. Өлшемді азайту жоғарғы айнымалы гендерде әдепкі өлшемдер жиынының (Principal параметрі P) көмегімен әдепкі өлшем деректері арқылы орындалды. 30 (dims = 30 тізе учаскелерін визуалды тексеру негізінде таңдалды және барлық үлгілер мен ансамбльдік талдаулар үшін пайдаланылды) Содан кейін біз гендерді әдеттен тыс төмен (10 процентильден төмен медиана), аномальды жоғары гендік саннан жоғары (9-ден жоғары гендік сан) жіктеу үшін итерациялық кластерлеудің бірнеше раундтарын орындадық (разряд = 1). төмен сапалы кластерлер және/немесе DoubletFinder33 пакеті арқылы анықталған күдікті егіздердің жоғары үлесі (t-hCO үлгілері (n=3) және hCO үлгілері (n=3) жоғарыда сипатталған басқа параметр ретінде сипатталған жоғарыда.
Төмен сапалы ядроларды жойғаннан кейін біріктірілген деректер жинағы топтастырылды (разряд = 0,5) және UMAP34 визуализация мақсаттары үшін ендірілді. Әрбір кластер үшін маркер гендер қалыпқа келтірілген ген өрнек деректерінен есептелген әдепкі параметрлері бар FindMarkers функциясы арқылы анықталды. Біз ұрықтың және ересек кортикальды анықтамалық деректер жиынын 19,20,21,35 маркер генінің экспрессиясымен және аннотациясымен біріктіру арқылы негізгі жасуша сыныптарын анықтаймыз және жіктейміз. Атап айтқанда, айналымдағы прекурсорлар MKI67 және TOP2A өрнектері арқылы анықталды. Прогениторлық кластерлер митоздық транскрипттердің жоқтығымен, кеш метафазадағы ұрықтың кортексінде сипатталған мультипотентті глиальды гениторлық кластерлермен жоғары сәйкестікпен және EGFR және OLIG1 экспрессиясымен анықталды. Біз астроцит терминін астроциттердің кеш радиалды глиядан астроциттердің жетілуіне дейінгі бірнеше дифференциация күйлерін қамту үшін қолданамыз. Астроцит кластерлері SLC1A3 және AQP4 жоғары деңгейлерін көрсетеді және ұрықтың радиалды глиясының және/немесе ересек астроциттердің ішкі түрлерімен картаға түсіру үшін көрсетілді. OPC PDGFRA және SOX10, ал олигодендроциттер миелинизация маркерлерін (MOG және MYRF) көрсетеді. Глутаматергиялық нейрондар нейрондық транскрипттердің болуы (SYT1 және SNAP25), GABAergic маркерлерінің (GAD2) болмауы және NEUROD6, SLC17A7, BCL11B немесе SATB2 экспрессиясы арқылы анықталды. GluN нейрондары әрі қарай жоғарғы (SATB2 экспрессиясы және BCL11B жоғалуы) және терең (BCL11B экспрессиясы) ішкі сыныптарына бөлінді. Болжалды субпластиналық (SP) нейрондары терең GluN маркерлеріне қосымша ST18 және SORCS1 сияқты белгілі SP18 маркерлерін білдіреді. Хороид плексус тәрізді жасушалар TTR экспрессиясы арқылы анықталды, ал менингеальды жасушалар фибробластпен байланысты гендер мен анықтамалық деректер жиынтығының карталанған пиальді/тамыр жасушаларын экспрессиялады.
t-hCO және hCO ішкі сыныптары арасындағы ген экспрессиясының дифференциалды талдауы Libra R бумасы (1.0.0 нұсқасы) арқылы іске асырылған үлгілерде ойнатылатын жаңадан жасалған псевдо-пакеттік әдіс арқылы орындалды. Атап айтқанда, әр үлгі репликациясы үшін берілген жасуша сыныбына арналған ұяшықтардағы гендер санын қосу арқылы топтар үшін edgeR журналының ықтималдылық сынақтары (3.36.0 нұсқасы, R бумасы) орындалды. Жылу картасын визуализациялау үшін нормаланған миллионға (CPM) мәндер edgeR (cpm() функциясы) арқылы есептеледі және масштабталады (орташа = 0, стандартты ауытқу = 1 жету үшін). Елеулі жоғары реттелетін t-hCO GluN гендерін гендік онтология (GO) байыту талдауы орындалды (Бенджамин-Хочберг t-hCO GluN жасушаларының кем дегенде 10%-ында көрсетілген 0,05-тен төмен P мәнін түзетеді және өзгерістің кемінде 2 есе есе артуы). ToppGene Suite (https://toppgene.cchmc.org/) арқылы орындалады37. Біз ToppFun қолданбасын әдепкі параметрлері бар қолданамыз және GO аннотацияланған гипергеометриялық сынақтардан есептелген Бенджамин-Хочберг түзетілген P-мәндері туралы есеп береміз.
Біздің snRNA-seq кластерлерін бастапқы біржасушалы РНҚ-секв немесе ересек snRNA-seq19,20,21,22 анықтамалық зерттеулеріндегі аннотацияланған ұяшық кластерлерімен сәйкестендіру үшін біз жұптастырылған деректер жиынын біріктіру тәсілін қолдандық. Деректер жиындары арасындағы кластердің қабаттасуларын біріктіру және салыстыру үшін Seurat жүйесінде SCTransform (v2) қалыпқа келтіру жұмыс процесін пайдаландық (жоғарыдағыдай бірдей параметрлерді пайдалана отырып). Жеке деректер жиындары есептеу тиімділігі үшін 500 ұяшыққа немесе бастапқы кластерге өзектерге дейін кездейсоқ түрде қосылды. Бұрын сипатталған ұқсас тәсілді пайдалана отырып, кластердің қабаттасуы сілтеме кластерінің белгісімен қабаттасатын әрбір біріктірілген кластердегі ұяшықтардың немесе ядролардың үлесі ретінде анықталды. GluN-терді әрі қарай жіктеу үшін біз GluN ұяшықтарына анықтамалық деректер жиыны белгілерін тағайындау үшін GluN ішкі жиын деректеріне арналған Seurat's TransferData жұмыс процесін пайдаландық.
t-hCO және hCO үлгілерінің жаһандық транскриптомының жетілу күйін бағалау үшін біз жалған көлемді үлгілерді адам миының дамуын қамтитын үлкен РНҚ тізбегінен тұратын BrainSpan/psychENCODE23 үлгісімен салыстырдық. Біз Кортикальды үлгілерден 10 аптадан кейін және кейінірек, бұрын BrainSpan кортикальды үлгілерінде белсенді деп анықталған 5567 гендерде (текше үлгісін пайдалану арқылы жас бойынша түсіндірілетін даму дисперсиясында 50%-дан жоғары ретінде анықталған) 5567 гендерде (біздің деректерімізбен бірге) кортикальды үлгілердің біріктірілген үлгі бойынша қалыпқа келтірілген ген экспрессиясы матрицасында PCA жүргіздік. Бұған қоса, біз бұрын сипатталғандай теріс емес матрицалық факторизацияны қолдана отырып, нейродамудың негізгі транскриптомдық белгілерімен байланысты гендерді алдық. Теріс емес матрицаны факторизациялау процедурасы арқылы есептелген іріктеме салмақтары суретте көрсетілген. Zhu et al.38 сипаттаған бес қолдың әрқайсысы үшін кеңейтілген деректермен 5b. Қайтадан, белсенділікке тәуелді транскрипциялық маркерлер бұрын жарияланған зерттеулерден алынған. Атап айтқанда, ERG және LRG қосымша 3-кестеден көрнекі ынталандырудан кейін тінтуірдің көрнекі кортексінің snRNA-seq жинағы арқылы анықталған глутаматергиялық нейрондарда айтарлықтай жоғарылады Hrvatin et al.16. Адаммен байытылған LRGs KCl-белсендірілген адам ұрық миының мәдениеттерінен алынды және ынталандырудан кейін 6 сағаттан кейін жиналды, ал сүзілген гендер адамдарда айтарлықтай жоғарылады, бірақ кеміргіштерде емес (қосымша 4 кесте). Осы гендік жиынтықтарды пайдалана отырып, гендер жиынтығын байытуды талдау бір жақты Фишердің дәл сынағы арқылы орындалды.
Егеуқұйрықтарды изофлуранмен жансыздандырыңыз, миды алып тастаңыз және құрамында 234 мМ сахароза, 11 мМ глюкоза, 26 мМ NaHCO3, 25 М 25мл бар бөлімдер үшін салқын (шамамен 4°C) оттегімен қаныққан (95% O2 және 5% CO2) сахароза ерітіндісіне салыңыз. NaH2PO4, 10 мМ MgSO4 және 0,5 мМ CaCl2 (шамамен 310 мОсм). Құрамында t-hCO бар егеуқұйрық миының тәж бөліктері (300–400 мкм) бұрын сипатталғандай Leica VT1200 вибратомы арқылы жасалды39. Содан кейін бөлімдер мыналардан дайындалған aCSF бар үздіксіз бөлме температурасында оттегімен кесу камерасына ауыстырылды: 10 мМ глюкоза, 26 мМ NaHCO3, 2,5 мМ KCl, 1,25 мм NaHPO4, 1 mM MgSO4, 2 мМ CaCl26mOl (2 мМ CaCl26ms (NaHCO3)). жазудан кемінде 45 минут бұрын. Бөлімдер суға батырылған камерада жазылды, онда олар үздіксіз aCSF (95% O2 және 5% CO2 құты) арқылы перфузияланды. Барлық деректер бөлме температурасында жазылды. t-hCO нейрондары құрамында 127 мМ калий глюконаты, 8 мМ NaCl, 4 мМ магний ATP, 0,3 мМ натрий GTP, 10 мМ HEPES және 0,6 мМ HEPES және ішкі реттелген 0,6 pTA, OH2 ерітіндісі бар ерітіндімен толтырылған боросиликатты шыны тамшуырмен аяқталды, OH2. (290 мОсм). Қалпына келтіру үшін тіркеу ерітіндісіне биоцитин (0,2%) қосылды.
Деректер MultiClamp 700B күшейткіші (молекулярлық құрылғылар) және Digidata 1550B цифрландыруы (молекулярлық құрылғылар) арқылы алынды, 2 кГц жиілікте төмен жиілікте сүзіледі, 20 кГц жиілікте цифрланады және Clampfit (молекулярлық құрылғылар), Origin (OriginPro) көмегімен талданды. 2021b, OriginLab). және теңшелетін MATLAB функциялары (Mathworks). Қосылу потенциалы JPCalc көмегімен есептелді және жазбалар -14 мВ есептелген мәнге түзетілді. IV операция -250-ден 750 пА-ға дейінгі 10-25 пА қадамдардағы ток қадамдарының сериясынан тұрады.
Таламус, ақ зат және S1 афференттері, бұрын сипатталғандай, hCO нейрондарының патч-қысқышпен жазылуы кезінде таламокортикалық кесінділерде электрлік ынталандырылды. Қысқаша айтқанда, ми 10 ° бұрышпен қисайтылған 3D басып шығару үстеліне орналастырылды және мидың алдыңғы бөлігі 35 ° бұрышпен кесілді. Содан кейін миды кесілген бетке жабыстырды және таламокортикальды шығыңқы аксондарды сақтай отырып, кесінді. Биполярлы вольфрам электродтары (0,5 МΩ) екінші микроманипуляторға орнатылды және әр жасушаға төрт аймақты (ішкі капсула, ақ зат, S1 және hCO) ынталандыру үшін стратегиялық түрде орналастырылды. 0,03–0,1 Гц жиілікте 300 мкА фазалық ынталандырудан кейін синаптикалық жауаптарды жазыңыз.
hChR2-экспрессиялайтын hCO нейрондары 480 нм-де белсендірілді және LED (Prizmatix) арқылы жасалған жарық импульстары жасушалардың жанында hChR2 экспрессиясын жазу үшін ×40 объектісі (0,9 NA; Olympus) арқылы қолданылды. Жарықтандыру өрісінің диаметрі шамамен 0,5 мм және жалпы қуаты 10-20 мВт. Импульс ені 10 мс-ке орнатылды, бұл мінез-құлықты оқыту эксперименті кезінде берілген импульске сәйкес келеді. 1-ден 20 Гц-ке дейінгі әртүрлі ынталандыру жиіліктері пайдаланылды, бірақ сандық анықтау үшін серияның бірінші импульсі ғана пайдаланылды. Синаптикалық ингибиторлық немесе жеңілдететін жолдарға әсерін азайту үшін пойыздар арасындағы аралық әдетте 30 секундтан көп. hChR2 реакциясының моносинаптикалық екенін тексеру үшін EPSC реакциясы жоғалғанша ваннаға TTX (1 мкм) қолдандық, содан кейін 4-аминопиридинді (4-AP; 100 мкм) қолдандық. Әдетте, жауап бірнеше минут ішінде қайтарылады, жарық диодты жану мен EPSC генерациясы арасында сәл ұзағырақ кідіріс. NBQX (10 мкм) жауаптың AMPA рецепторларымен қозғалатынын тексеру үшін пайдаланылды.
Sharp hCO бөлімдері бұрын сипатталғандай жасалды. Қысқаша айтқанда, hCO секциялары 4% агарозаға ендірілген және құрамында 126 мМ NaCl, 2,5 мМ KCl, 1,25 мМ NaH2PO4, 1 мМ MgSO4, 2 мМ CaCl2, 26 мМ NaHCO3 және d-lucos (M) кесілген (M) бар жасушаларға ауыстырылды. Leica VT1200 вибраторы арқылы бөлме температурасында 200–300 мкм және бөлме температурасында ASF ішінде сақталады. Содан кейін тікелей SliceScope микроскопының (Scientifica) астында hCO секцияларында тұтас жасушалардың патч-кемп жазбасы орындалды. Бөлімдер aCSF (95% O2 және 5% CO2) арқылы перфузияланды және ұяшық сигналдары бөлме температурасында жазылды. hCO нейрондары құрамында 127 мМ калий глюконаты, 8 мМ NaCl, 4 мМ магний ATP, 0,3 мМ натрий GTP, 10 мМ HEPES және 0,6 мМ EGTA бар ерітіндімен толтырылған боросиликатты шыны тамшуыр арқылы қолданылды. 290). Қалпына келтіру мақсатында ішкі ерітіндіге 0,2% Биоцитин қосыңыз.
Деректер Clampex (Clampex 11.1, Molecular Devices) көмегімен MultiClamp 700B күшейткіші (молекулярлық құрылғылар) және Digidata 1550B цифрлауыш (молекулярлық құрылғылар) арқылы алынды, 2 кГц жиілікте төмен жиілікте сүзіледі, 20 кГц жиілікте цифрланады және Clamp10 үшін талдау жасалды. құрылғылар) және теңшелетін MATLAB функциялары (MATLAB 2019b, Mathworks). Қосылу әлеуеті JPCalc көмегімен есептелді және жазбалар -14 мВ есептелген түйісу потенциалына түзетілді. IV операция -50-ден 250 пА-ға дейінгі 5-10 пА қадамдарындағы ток қадамдарының сериясынан тұрады.
Қысылған нейрондарды морфологиялық реконструкциялау үшін ішкі ерітіндіге 0,2% биоцитин (Сигма-Олдрих) қосылды. Ұяшықтар бұзылғаннан кейін кем дегенде 15 минут бойы өңделеді. Содан кейін тамшуыр 1-2 минут ішінде тіркелген мембрана толығымен жабылғанша баяу тартылады. Бөлім физиологиялық процедурасынан кейін кесінділер түні бойы 4°C температурада 4% PFA ішінде бекітілді, PBS X3-пен жуылды және стрептавидинмен конъюгацияланған DyLight 549 немесе DyLight 405 (Vector Labs) көмегімен 1:1000 сұйылтылған. Биоцитинмен толтырылған жасушалар (2%; Сигма-Олдрих) бөлме температурасында 2 сағат бойы патч қысқышын жазу кезінде таңбаланған. Содан кейін кесінділер Aquamount (Thermo Scientific) көмегімен микроскопиялық слайдтарға орнатылды және келесі күні сандық апертурасы ×40 1,3, үлкейтуі ×0,9–1,0, xy бар майға батыру объектісін пайдаланып Leica TCS SP8 конфокальды микроскопта бейнеленді. Сынама алу жылдамдығы микрон үшін шамамен 7 пиксельді құрайды. 1 мкм аралықтағы Z-стектері сериялық түрде алынды және әрбір нейронның бүкіл дендритті ағашын жабу үшін z-стек мозаикасы және Leica негізіндегі автоматты тігіс орындалды. Содан кейін нейрондар neuTube 40 интерфейсі арқылы жартылай қолмен бақыланды және SWC файлдары жасалды. Содан кейін файлдар SimpleNeuriteTracer41 Fiji плагиніне жүктеп салынды (ImageJ, 2.1.0 нұсқасы; NIH).
Адамның кортикальды тіндері Стэнфорд университетінің Институционалдық шолу кеңесі бекіткен хаттамаға сәйкес ақпараттандырылған келісіммен алынды. Адамның босанғаннан кейінгі тінінің екі үлгісі (3 және 18 жаста) рефрактерлік эпилепсияға операцияның бөлігі ретінде маңдай қыртысының (ортаңғы фронтальды гирус) резекциясы арқылы алынды. Резекциядан кейін тіндерді мұздай салқын NMDG-aCSF ішіне жинаңыз: 92 мМ NMDG, 2,5 мМ KCl, 1,25 мМ NaH2PO4, 30 мМ NaHCO3, 20 мм HEPES, 25 мМ глюкоза, 2 мМба5 мкм. 3 мМ натрий пируваты, 0,5 мМ CaCl2 4H2O және 10 мМ MgSO4 7H2O. Концентрлі тұз қышқылымен рН 7,3-7,4 дейін титрлейді. Тіндер зертханаға 30 минут ішінде жеткізіліп, жоғарыда сипатталған процедураға сәйкес корональды кесінділер алынды.
Жануарларға арналған барлық процедуралар Стэнфорд университетінің APLAC мақұлдаған жануарларды күту нұсқауларына сәйкес орындалды. Егеуқұйрықтар (трансплантациядан кейінгі 140 күннен астам) 5% изофлуран анестезиясымен индукцияланды және операция кезінде 1-3% изофлуранмен жансыздандырылды. Жануарлар стереотаксикалық жақтауға (Kopf) орналастырылды және тұрақты босап шығатын бупренорфин (SR) тері астына енгізілді. Бас сүйегінің бетін ашып, тазартып, 3-5 сүйек бұрандаларын салады. t-hCO мақсатына жету үшін біз MRI кескіндерінен стереотаксикалық координаттарды жасадық. Қызықтыру орнында бұрғылау тесігі бұрғыланды және талшықтар (диаметрі 400 мкм, NA 0,48, Дорик) hCO бетінен 100 мкм төмен түсірілді және бас сүйегіне ультракүлгін сәулесімен емделетін тіс цементімен (Relyx) бекітілді.
Талшықты фотометриялық жазбалар бұрын сипатталғандай орындалды42. Спонтанды белсенділікті жазу үшін егеуқұйрықтар таза торға орналастырылды және талшықты-оптикалық фотометриялық деректерді жинау жүйесіне қосылған 400 мкм диаметрлі талшықты-оптикалық патч-кабель (Дорик) имплантацияланған талшықты-оптикалық кабельге қосылды. Қозғалыс белсенділігін 10 минуттық жазу кезінде жануарлар торды еркін зерттеді. Қоздырылған белсенділікті тіркеу үшін егеуқұйрықтар (трансплантациядан кейін 140 күннен астам) индукция үшін 5% изофлуранмен және техникалық қызмет көрсету үшін 1-3% изофлуранмен жансыздандырылды. Жануарды стереотактикалық жақтауға (Kopf) орналастырыңыз және t-hCO-ның қарама-қарсы жағындағы мұртшалар шамамен 2 см-ге дейін кесіледі және пьезоэлектрлік жетекке (PI) қосылған тор арқылы өтеді. 400 мкм талшықты-оптикалық патч-кабель (Дорик) имплантацияланған талшыққа қосылып, деректерді жинау жүйесіне қосылды. Содан кейін t-hCO-ның қарама-қарсы жағындағы мұртшалар 20 минуттық жазу кезеңінде пьезоэлектрлік жетек арқылы кездейсоқ уақытта 50 рет (20 Гц жиілікте 2 мм, әр көрсетілім үшін 2 с) ауытқиды. Теңшелетін MATLAB коды арқылы ауытқу уақытын басқару үшін Arduino MATLAB қолдау пакетін пайдаланыңыз. Оқиғалар транзисторлық-транзисторлық логикалық (TTL) импульстарды пайдаланып деректерді жинау бағдарламалық құралымен синхрондалады.
Егеуқұйрықтар (трансплантациядан кейінгі 140 күннен астам) 5% изофлуран анестезиясымен индукцияланды және операция кезінде 1-3% изофлуранмен жансыздандырылды. Жануарлар стереотаксикалық жақтауға (Kopf) орналастырылды және бупренорфин СР мен дексаметазон тері астына енгізілді. Бас сүйегінің бетін ашып, тазартып, 3-5 сүйек бұрандаларын салады. t-hCO мақсатына жету үшін біз MRI кескіндерінен стереотаксикалық координаттарды жасадық. Дөңгелек краниотомия (диаметрі шамамен 1 см) трансплантацияланған hCO үстіне тікелей жоғары жылдамдықты бұрғылау арқылы орындалды. Сүйек мүмкіндігінше жұқа болғаннан кейін, бірақ бүкіл сүйекті теспей тұрып, негізгі t-hCO анықтау үшін қалған бүтін жамбас дискісін алу үшін қысқышты пайдаланыңыз. Краниотомия залалсыздандырылған физиологиялық ерітіндімен толтырылды, бас сүйегіне ультракүлгін сәулесі бар стоматологиялық цементпен (Relyx) жабын және арнайы бас түйреуіш бекітілді.
Екі фотонды бейнелеу Nikon LWD (×16, 0,8 NA) объектісі бар Bruker мультифотонды микроскоптың көмегімен орындалды. GCaMP6 кескіні 1,4x бір z-жазықтық үлкейтуімен және 8x орташа 7,5 кадр/с ұлғайтумен 920 нм-де орындалды. Егеуқұйрықтар 5% изофлуран анестезиясымен индукцияланды және 1-3% изофлуранмен ұсталды. Егеуқұйрықтар арнайы жасалған бас қондырғыға орналастырылып, линзаның астына орналастырылды. Қозғалыс белсенділігінің 3 минуттық фондық жазбасы алынды. 20 минуттық жазу барысында пикопрайзердің көмегімен t-hCO-ға қарама-қарсы мұрт төсеміне 50 тыныс алу (әрбір көрсетілім ұзындығы 100 мс) кездейсоқ жеткізілді. Теңшелетін MATLAB коды арқылы жарылыс уақытын басқару үшін Arduino MATLAB қолдау пакетін пайдаланыңыз. TTL импульстерін пайдаланып, деректерді жинау бағдарламалық құралымен (PrairieView 5.5) оқиғаларды синхрондаңыз. Талдау үшін кескіндер Фиджиде іске қосылған MoCo бағдарламасында аффинді түзету арқылы xy қозғалысы үшін түзетілді. CNMF-E43 көмегімен жеке жасушалардан флуоресцентті іздерді алу. Флуоресценция қызықтыратын әрбір аймақ үшін алынды, dF/F қисықтарына түрлендірілді, содан кейін z-баллдарына түрлендірілді.
Егеуқұйрықтар (трансплантациядан кейінгі 140 күннен астам) 5% изофлуран анестезиясымен индукцияланды және операция кезінде 1-3% изофлуранмен жансыздандырылды. Жануарлар стереотаксикалық жақтауға (Kopf) орналастырылды және бупренорфин СР мен дексаметазон тері астына енгізілді. t-hCO-ның қарама-қарсы жағындағы мұртшалар шамамен 2 см-ге дейін кесіліп, пьезоэлектрлік жетекке қосылған тор арқылы бұрандалды. Бас сүйегі ашылып, тазаланады. Бас сүйегіне тот баспайтын болаттан жасалған бұранда бекітілген. t-hCO мақсатына жету үшін біз MRI кескіндерінен стереотаксикалық координаттарды жасадық. Дөңгелек краниотомияны (диаметрі шамамен 1 см) жоғары жылдамдықты бұрғымен t-hCO-дан сәл жоғары орындаңыз. Сүйек мүмкіндігінше жұқа болғаннан кейін, бірақ бүкіл сүйекті теспей тұрып, негізгі t-hCO анықтау үшін қалған бүтін жамбас дискісін алу үшін қысқышты пайдаланыңыз. Жеке ұяшықтар жерге тұйықталған бұрандаларға негізделген және RHD күшейткіштерімен (Intan) алдын ала күшейтілген 32 арналы немесе 64 арналы жоғары тығыздықтағы кремний зондтары (Кэмбридж Нейротех) арқылы жазылды. Стерильді физиологиялық ерітіндімен толтырылған краниотомия арқылы электродтарды мақсатты жерге түсіру үшін манипуляторды пайдаланыңыз. Деректерді жинау Open Ephys деректерді жинау жүйесін пайдалану арқылы 30 кГц жиілікте орындалды. Жазу 10-нан астам арнада жоғары корреляциялық ырғақты стихиялық белсенділікті анықтаған кезде ғана жалғасты, бұл электродтардың трансплантацияда орналасқанын болжайды (кальцийдің екі фотонды бейнелеу деректеріне негізделген). Қозғалыс белсенділігінің 10 минуттық фондық жазбасы алынды. Содан кейін t-hCO-ның қарама-қарсы жағындағы мұртшалар 20 минуттық жазу кезеңінде пьезоэлектрлік жетек арқылы кездейсоқ уақытта 50 рет (20 Гц жиілікте 2 мм, әр көрсетілім үшін 2 с) ауытқиды. Arduino (MATLAB 2019b) үшін MATLAB қолдау пакетін пайдаланып, MATLAB теңшелетін кодымен ауытқу уақытын басқарыңыз. Оқиғаларды деректерді жинау бағдарламалық құралымен синхрондау үшін TTL импульстерін пайдаланыңыз.
Оптикалық таңбалау эксперименттері үшін 473 нм лазерге (Omicron) қосылған 200 мкм оптикалық патч сымы (Дорик) краниотомия үстіне орналастырылған 200 мкм оптикалық талшыққа қосылды. Бұған дейін бірден секіргіш қуатын 20 мВт етіп реттеңіз. Стерильді физиологиялық ерітіндімен толтырылған краниотомия арқылы электродтарды мақсатты жерге түсіру үшін манипуляторды пайдаланыңыз. Жазудың басында 473 нм жарықтың он импульсі (жиілігі 2 Гц, импульс ұзақтығы 10 мс) шығарылды. Фотосезімтал жасушалар сынақтардың 70% немесе одан да көп бөлігінде жарықтың 10 мс шегінде ұшқын реакциясын көрсететін жасушалар ретінде анықталды.