د Nature.com د لیدنې لپاره مننه. تاسو د محدود CSS ملاتړ سره د براوزر نسخه کاروئ. د غوره تجربې لپاره، موږ سپارښتنه کوو چې تاسو یو تازه شوی براوزر وکاروئ (یا په انټرنیټ اکسپلورر کې د مطابقت حالت غیر فعال کړئ). سربیره پردې، د دوامداره ملاتړ ډاډ ترلاسه کولو لپاره، موږ سایټ پرته له سټایلونو او جاواسکریپټ څخه ښیو.
په یو وخت کې د دریو سلایډونو کیروسل ښیې. په یو وخت کې د دریو سلایډونو څخه د تیریدو لپاره د مخکیني او راتلونکي تڼیو څخه کار واخلئ، یا په پای کې د سلایډر تڼیو څخه کار واخلئ ترڅو په یو وخت کې درې سلایډونه څخه تیر شئ.
د ځان سره راټول شوي عصبي ارګانیلونه د انسان د پرمختګ او ناروغۍ د ماډل کولو لپاره د ویټرو پلیټ فارم یو ژمن پلیټ فارم استازیتوب کوي. په هرصورت، ارګانیلونه هغه ارتباط نلري چې په ویوو کې شتون لري، کوم چې د پخیدو محدودیت لري او د نورو سرکټونو سره یوځای کیدو مخه نیسي چې چلند کنټرولوي. دلته موږ ښیو چې د نوي زیږیدلي موږکانو سوماتوسینوري کورټیکس ته لیږدول شوي د انسان د سټیم حجرو څخه اخیستل شوي کورټیکل ارګانیلونه د بالغ حجرو ډولونه رامینځته کوي چې د حسي او هڅونې پورې اړوند سرکټونو کې مدغم کیږي. MRI په څو سټیم حجرو لینونو او څارویو کې د ټرانسپلانټ وروسته ارګانیل وده څرګنده کړه، پداسې حال کې چې د واحد کور تحلیل د کورټیکوجینیسیس پرمختګ او د فعالیت پورې تړلي ټرانسکرپشن پروګرام رامینځته کیدو څرګندونه وکړه. په حقیقت کې، ټرانسپلانټ شوي کورټیکل نیورونونه د دوی د ان ویټرو همکارانو په پرتله ډیر پیچلي مورفولوژیکي، سیناپټیک، او داخلي غشا ځانګړتیاوې ښیې، چې د تیموتي سنډروم ناروغانو کې د نیورونال نیمګړتیاو کشف کولو ته اجازه ورکوي. اناتوميکي او فعال تعقیب ښودلې چې ټرانسپلانټ شوي ارګانیلونه تالاموکورټیکل او کورټیکوکورټیکل ان پټونه ترلاسه کوي، او د عصبي فعالیت ان ویوو ریکارډونه وړاندیز کوي چې دا ان پټونه کولی شي په انساني حجرو کې حسي غبرګونونه رامینځته کړي. په پای کې، د کورټیکل ارګانایډونه د موږکانو په ټول دماغ کې محورونه غځوي، او د دوی آپټوجینیټیک فعالول د انعام غوښتونکي چلند لامل کیږي. په دې توګه، د انسان کورټیکس نیورونونه بالغ کیږي او د کوربه سرکټونو کې برخه اخلي چې چلند کنټرولوي. موږ تمه لرو چې دا طریقه به د ناروغ څخه اخیستل شوي حجرو کې د سټرینډ کچې فینوټایپونو کشف اسانه کړي چې د نورو وسیلو لخوا نشي کشف کیدی.
د انسان د مغز وده کول د ځان تنظیم کولو یوه د پام وړ پروسه ده چې پکې حجرې وده کوي، توپیر کوي، مهاجرت کوي، او د فعال عصبي سرکټونو جوړولو لپاره سره نښلوي چې د حسي تجربې له لارې نور هم ښه کیږي. د انسان د دماغ د ودې په پوهیدو کې یوه مهمه ستونزه، په ځانګړې توګه د ناروغۍ په شرایطو کې، د دماغ نسج ته د لاسرسي نشتوالی دی. د ځان تنظیم کونکي ارګانیلونه، په شمول د انسان کورټیکس ارګانایډونه (hCO؛ د انسان د کورټیکس ساحې په نوم هم پیژندل کیږي)، کولی شي 2,3,4,5,6 تولید کړي. په هرصورت، ډیری محدودیتونه د عصبي سرکټونو پراختیا او فعالیت پوهیدو لپاره د دوی پراخه غوښتنلیک محدودوي. په ځانګړې توګه، دا روښانه نده چې ایا د hCO پخیدل د ځینې مایکرو چاپیریالي او حسي معلوماتو نشتوالي له امله محدود دی چې په ویوو کې شتون لري. سربیره پردې، ځکه چې hCOs په سرکټونو کې مدغم شوي ندي چې کولی شي د چلند پایلې رامینځته کړي، د جینیاتي پیچلي او چلند نیوروپسیچیاټیک اختلالاتو ماډل کولو کې د دوی ګټورتوب اوس مهال محدود دی.
د HCO لیږد په یوه سالم ژوندي دماغ کې کولی شي دا محدودیتونه له منځه یوسي. پخوانیو مطالعاتو ښودلې چې د موږکانو په کورټیکس کې لیږدول شوي انساني نیورونونه د ژوندي پاتې کیدو، پروژې کولو او د موږکانو حجرو سره اړیکه نیولو توان لري 7,8,9,10,11,12. په هرصورت، دا تجربې معمولا په بالغ څارویو کې ترسره کیږي، کوم چې ممکن د سیناپټیک او اکسونل ادغام محدود کړي. دلته، موږ د ټرانسپلانټیشن یوه بیلګه تشریح کوو چې په هغه کې موږ د پلاستیکي پراختیا په لومړیو مرحلو کې د معافیتي کمښت لرونکي موږکانو لومړني سوماتوسینسري کورټیکس (S1) ته د hiPS حجرو څخه اخیستل شوي 3D hCO لیږد کړ. ټرانسپلانټ شوي hCO (t-hCO) نیورونونه د پام وړ پختوالي څخه تیریږي، د تالاموکورټیکل او کورټیکل-کورټیکل ان پټونه ترلاسه کوي چې حسي غبرګونونه رامینځته کوي، او د انعام غوښتونکي چلند چلولو لپاره د موږکانو دماغ ته د محوري اټکلونو غځول. د t-hCO غزیدلي پختوالي د تیموتي سنډروم (TS) ناروغانو کې عصبي نیمګړتیاوې څرګندې کړې، یو سخت جینیاتي اختلال چې د ولټاژ حساس L-ډول CaV1.2 کلسیم چینل کې د بدلونونو له امله رامینځته کیږي (د CACNA1C لخوا کوډ شوی).
د انسان د کورټیکل نیورونونو د مطالعې لپاره په ویوو سرکټونو کې، موږ په سټیریوټیک ډول د زیږون وروسته د لومړني اتیمیک موږکانو S1 ته بشپړ 3D hCO انتقال کړ (د زیږون وروسته 3-7 ورځې) (شکل 1a او د انځور 1a-c پراخ شوي معلومات). پدې مرحله کې، د تالاموکورټیکل او کورټیکوکورټیکل اکسونل پروجیکشنونو لا تر اوسه خپل S1 انرویشن بشپړ کړی نه دی (حواله 13). په دې توګه، دا طریقه د t-hCO ادغام اعظمي کولو لپاره ډیزاین شوې پداسې حال کې چې په داخلي سرکټونو اغیزه کمه کړي. په ژوندیو څارویو کې د t-hCO موقعیت لیدلو لپاره، موږ د ټرانسپلانټیشن څخه 2-3 میاشتې وروسته د موږکانو د T2 وزن لرونکي MRI دماغ بیارغونه ترسره کړه (شکل 1b او پراخ شوي معلومات، شکل 1d). t-hCO په اسانۍ سره مشاهده شو او د t-hCO حجم اندازه کول د هغو سره ورته وو چې د ثابتو ټوټو څخه محاسبه شوي وو (غزول شوي معلومات شکل 1d,e; P > 0.05). t-hCO په اسانۍ سره مشاهده شو او د t-hCO حجم اندازه کول د هغو سره ورته وو چې د ثابتو ټوټو څخه محاسبه شوي وو (غزول شوي معلومات شکل 1d,e; P > 0.05). t-hCO легко наблюдались, а объемные измерения t-hCO были аналогичны рассчитанным для фиксированных срезов (расшированных срезов, расшированных срезов, расшированных; P> 0,05). t-hCO په اسانۍ سره لیدل کیدی شو، او د حجمي t-hCO اندازه کول د هغو سره ورته وو چې د ثابتو برخو لپاره محاسبه شوي وو (پراخ شوي معلومات، شکل 1d، e؛ P > 0.05).很容易观察到t-hCO،并且t-hCO的体积测量值与从固定切片计算的测量值相似（扩展数据图1d、e；P > 0.05）.很容易观察到t-hCO،并且t-hCO t-hCO легко наблюдался, а объемные измерения t-hCO были аналогичны рассчитанным для фиксированных срезов (расшированных срезов, расшированных срезов, расшированных; P> 0,05). t-hCO په اسانۍ سره لیدل کیده، او د حجمي t-hCO اندازه کول د هغو سره ورته وو چې د ثابتو برخو لپاره محاسبه شوي وو (پراخ شوي معلومات، شکل 1d، e؛ P > 0.05).موږ د ټرانسپلانټیشن څخه نږدې دوه میاشتې وروسته په 81٪ ټرانسپلانټ شوي څارویو کې t-hCO2 مشخص کړ (n = 72 څاروي؛ د 10 hiPS حجرو لینونو څخه hCO2؛ په ضمیمه جدول 1 کې د hiPS حجرو لینونه). له دې څخه، 87٪ د دماغي کورټیکس کې موقعیت درلود (شکل 1c). په ورته ټرانسپلانټ شوي موږک کې په ډیری وخت ټکو کې د سیریل MRI سکینونو ترسره کولو سره، موږ د 3 میاشتو په اوږدو کې د t-hCO2 حجم کې نهه چنده زیاتوالی وموند (شکل 1d او پراخ شوي معلومات، شکل 1f). ټرانسپلانټ شوي څارویو د ټرانسپلانټیشن څخه وروسته په 12 میاشتو کې د لوړ ژوندي پاتې کیدو کچه (74٪) درلوده (پراخ شوي معلومات، شکل 1g او ضمیمه جدول 2)، او هیڅ ښکاره موټرو یا حافظې نیمګړتیاوې، ګلیوسیس، یا الیکټروانسفالوګرام (EEG) ونه موندل شول. د معلوماتو انځور 1g او ضمیمه جدول 2). 1h–m او 3e).
a، د تجربوي ډیزاین سکیمیک. د hiPS حجرو څخه اخیستل شوی hCO د توپیر په 30-60 ورځو کې د نوي زیږیدلي بربنډ موږکانو S1 ته لیږدول شوی. b، د T2 وزن لرونکي کورونل او افقي MRI انځورونه چې د ټرانسپلانټیشن څخه 2 میاشتې وروسته په S1 کې t-hCO ښیې. د پیمانه بار، 2 ملي میتر. c، د هر hiPS حجرو لاین لپاره ښودل شوي د نقاشۍ بریالیتوب نرخونو اندازه کول (n = 108، د بارونو دننه شمیرې د hIPS حجرو لاین په هر t-hCO اندازه ښیې) او د کورټیکل یا فرعي کورټیکل موقعیت (n = 88). d، د کورونري شریان MRI انځور (کیڼ اړخ؛ پیمانه بار، 3 ملي میتر) او اړونده 3D حجمي بیارغونه (پیمانه بار، 3 ملي میتر) چې د 3 میاشتو په اوږدو کې د t-hCO زیاتوالی ښیې. e، د موږک دماغي کورټیکس کې د t-hCO نمونو بیاکتنه. پیمانه بار، 1 ملي میتر. f، د t-hCO استازي امیونوسایتو کیمیکل انځورونه چې له پورته کیڼ څخه ښیې ته ښودل شوي (د توپیر په جریان کې): PPP1R17 (4 میاشتې عمر)، NeuN (8 میاشتې عمر)، SOX9 او GFAP (8 میاشتې عمر)، PDGFRα؛ (8 میاشتې)، MAP2 (8 میاشتې) او IBA1 (8 میاشتې). د پیمانه بار، 20 µm. د HNA ګډ څرګندونه د انسان اصلي حجرو ته اشاره کوي. g، snRNA-seq: د سیورات ادغام وروسته د ټولو لوړ کیفیت t-hCO نیوکلیوس متحد څو اړخیز او پروجیکشن (UMAP) ابعاد کمولو امیجنگ (n=3 t-hCO نمونې، n=2 hiPS حجرو لینونه). اسټروسایټونه، د اسټروسایټ لاین حجرات؛ سایک پروګ، گردش کونکي پروجینیټرونه؛ ګلو این DL، ژور ګلوټامیټرجیک نیورونونه؛ ګلو این DL/SP، ژور او سبلیملر ګلوټامیټرجیک نیورونونه؛ ګلو این UL، د پورتنۍ طبقې ګلوټامیټرجیک نیورونونه؛ اولیګوډینډروسایټونه، اولیګوډینډروسایټونه؛ OPC، اولیګوډینډروسایټ پروجینیټر حجرات؛ RELN، ریلن نیورونونه. h، د جین اونټولوژي (GO) اصطلاح د غني کولو تحلیل د جینونو د پام وړ لوړ شوي (تنظیم شوي P < 0.05، د فولډ بدلون > 2، د نیوکلی لږترلږه 10٪ کې څرګند شوی) د hCO ګلوټامیټرجیک نیورونونو سره پرتله کول. h، د جین اونټولوژي (GO) اصطلاح د غني کولو تحلیل د جینونو د پام وړ لوړ شوي (تنظیم شوي P < 0.05، د فولډ بدلون > 2، د نیوکلی لږترلږه 10٪ کې څرګند شوی) د hCO ګلوټامیټرجیک نیورونونو سره پرتله کول. h، Анализ обогащения терминов Gene Ontology (GO) для генов со значительной активацией по крайней мере в 10% ядер) в глутаматергических нейронах t-hCO по сравнению с глутаматергическими нейронами hCO. h، د جین اونټولوژي (GO) اصطلاح غني کولو تحلیل د hCO ګلوټامیټرجیک نیورونونو په پرتله په t-hCO ګلوټامیټرجیک نیورونونو کې د پام وړ فعالیدو سره (تنظیم شوی P<0.05، فولډ بدلون >2، لږترلږه 10٪ نیوکلی کې څرګندونه) سره. h، 与hCO 谷氨酸能神经元相比,t-hCO 谷氨酸能神经元中基因显着上调（调整后P <0.5 2، 在至少10% 的细胞核中表达）的基因本体论(GO) 术语富集分析. h ， 与 hco 谷氨酸 能 元 相比 ， t-hco 谷氨酸 能 神经 元 基因 显着 上调 （后 取 ， 变 变 5 p <变化> 2，至少 10% 的核中表达） 基因 基因 基因 的 的至少 10% 的核中表达） 基因 基因 的本体论(GO) 术语富集分析. h، гены значительно активизировались (скорректированный P <0,05, кратность изменения> 2, экспрессируется по крайней %01m) глутаматергических нейронах t-hCO по сравнению с глутаматергическими нейронами hCO Онтологический (GO) анализ тербоягианию. h، جینونه د hCO ګلوټامیترجیک نیورونونو په پرتله په t-hCO ګلوټامیترجیک نیورونونو کې د غني کولو اصطلاح د اونټولوژیکي (GO) تحلیل کې د پام وړ لوړ شوي (تنظیم شوي P < 0.05، د بدلون > 2، لږترلږه په 10٪ نیوکلیو کې څرګند شوي).نقطه شوې کرښه د 0.05 aq ارزښت په ګوته کوي. i، د 22 snRNA-seq بالغ موټرو کورټیکس ډیټاسیټ څخه د لیبل لیږد په کارولو سره په t-hCO کې د GluN حجرو ډولونو UMAP امیجنگ. CT - کورټیکوتالامیک حجرات، ET - د دماغ څخه بهر حجرات، IT - داخلي ټیلینسیفالیک حجرات، NP - د پروجیکشن ته نږدې.
بیا موږ د t-hCO سایتوآرکیټیکچر او د ټول حجروي جوړښت ارزونه وکړه. د موږک انډوتیلیل حجرو د انټي باډي رنګ کولو د t-hCO سره د رګونو رګونه ښکاره کړل، پداسې حال کې چې د IBA1 رنګ کولو په ټوله ګرافټ کې د موږک مایکروګلیا شتون څرګند کړ (انځور 1f او پراخ شوي معلومات، انځور 3c، d). د معافیت رنګ کولو د انسان اټومي انټيجن (HNA) مثبت حجرې په ګډه څرګندې کړې چې PPP1R17 (کورټیکل پروجینیټرونه)، NeuN (نیورونونه)، SOX9 او GFAP (ګلیال څخه اخیستل شوي حجرې) یا PDGFRα (اولیګوډینډروسایټ پروجینیټرونه) (انځور 1f). د واحد حجرو په ریزولوشن کې د t-hCO حجروي جوړښت مطالعه کولو لپاره، موږ د نږدې 8 میاشتو توپیر وروسته د واحد کور RNA ترتیب (snRNA-seq) ترسره کړ. د موږک نیوکلیو د لوی فلټر کولو او لرې کولو سره 21,500 لوړ کیفیت لرونکي انساني مونو نیوکلیر نقشې ترلاسه شوې (انځور 1g او پراخ شوي معلومات، انځور 4a، b). د حجرو د ډولونو د ځانګړو نښانونو د څرګندولو نمونې د لویو کورټیکل حجرو ټولګیو کلسترونه پیژندلي، پشمول د ژورو او سطحي ګلوټامیټرجیک نیورونونو، گردش کونکو پروجینیټرونو، اولیګوډینډروسایټونو، او اسټروسایټ نسب (انځور 1g، پراخ شوي معلومات، انځور 4c، او ضمیمه جدول 3). د SATB2 او CTIP2 لپاره د معافیت سټینینګ ښودلې چې د کورټیکل فرعي ډولونو شتون سره سره، t-hCO روښانه اناتوميکي طبقه بندي نه ده ښودلې (پراخ شوي معلومات، انځور 3a). د مرحلې سره سمون لرونکي snRNA-seq hCO په پراخه کچه ورته حجرو ټولګي تولید کړي، د یو څو استثناوو سره، په شمول د اولیګوډینډروسایټونو نشتوالی او د GABAergic نیورونونو شتون، کوم چې ممکن د لیټرل پروجینیټر حجرو لپاره د ویټرو شرایطو دمخه راپور شوي مناسب منعکس کړي 15 (پراخ شوي معلومات، انځور 4f - i او ضمیمه جدول 4). د جین د څرګندولو توپیري تحلیل د t-hCO او hCO ترمنځ د ګلوټامیترجیک نیورونونو کې د پام وړ توپیرونه څرګند کړل (ضمیمه جدول 5)، په شمول د نیورونال پختوالي سره تړلي جینونو سیټونو فعالول لکه سیناپټیک سیګنالینګ، ډینډریټیک ځایی کول، او د ولټاژ ګیټ شوي چینل فعالیت (شکل 1h او ضمیمه جدول 5). جدول 6). په دې اساس، د کورټیکل ګلوټامیترجیک t-hCO نیورونونو د ګړندي ټرانسکرپشنل پختوالي ښودنه وکړه.
د دې روښانه کولو لپاره چې ایا په t-hCO کې دا نقل شوي بدلونونه د hCO ان ویټرو او t-hCO ان ویوو ترمنځ مورفولوژیکي توپیرونو سره تړاو لري، موږ د 7-8 میاشتو توپیر وروسته په حاد برخو کې د مرحلې سره سمون لرونکي بایوسایټین ډک hCO او hCO بیا جوړ کړل. hCO نیورونونه (انځور 2a). t-hCO نیورونونه د پام وړ لوی وو، د سوما قطر 1.5 ځله، دوه چنده ډینډریټونه، او د ان ویټرو hCO په پرتله په ټول ډینډریټیک اوږدوالي کې شپږ چنده زیاتوالی درلود (انځور 2b). سربیره پردې، موږ د hCO نیورونونو په پرتله په t-hCO نیورونونو کې د ډینډریټیک نخاعو د پام وړ لوړ کثافت ولیدل (انځور 2c). دا وړاندیز کوي چې t-hCO نیورونونه د پراخه ډینډریټیک اوږدوالي او شاخ کولو څخه تیریږي، کوم چې د دوامداره حجرو تکثیر سره یوځای، ممکن د ټرانسپلانټیشن وروسته د t-hCO شدید ودې کې مرسته وکړي (انځور 1d او پراخ شوي معلومات انځور 1f). دې موږ وهڅول چې د الیکټرو فزیولوژیکي ملکیتونو پلټنه وکړو. د غشا ظرفیت اته ځله لوړ و (پراخ شوي معلومات، شکل 8d)، د آرام حالت غشا ظرفیت ډیر هایپرپولریز شوی و (تقریبا 20 mV)، او اوسني انجیکشن د hCO نیورونونو په پرتله په t-hCO نیورونونو کې د اعظمي حد لوړ جوش کچه رامینځته کړه. په ویټرو کې (شکل 2d)، e)، کوم چې د t-hCO لوی او ډیر پیچلي مورفولوژیکي ځانګړتیاو سره مطابقت لري. سربیره پردې، د ناڅاپي هڅونکي پوسټ سینپټیک اوسني پیښو (EPSC) فریکونسي په t-hCO نیورونونو کې د پام وړ لوړه وه (شکل 2f)، دا وړاندیز کوي چې په t-hCO نیورونونو کې لیدل شوي د ډینډریټیک نخاعو زیاتوالی کثافت د فعال هڅونې سره تړاو لري. جنسي ترکیب. موږ د ګلوټاماترجیک نیورونونو (پراخ شوي معلومات، شکل 6a-c) په ثبتولو سره په ویټرو کې د hCO نیورونونو نابالغ کرکټر تایید کړ.
الف، د بایوسایټین ډک hCO او t-hCO نیورونونو درې بعدي بیارغونه د 8 میاشتو توپیر وروسته. b، د مورفولوژیکي ځانګړتیاوو اندازه کول (n = 8 hCO نیورونونه، n = 6 t-hCO نیورونونه؛ **P = 0.0084، *P = 0.0179 او ***P < 0.0001). b، د مورفولوژیکي ځانګړتیاوو اندازه کول (n = 8 hCO نیورونونه، n = 6 t-hCO نیورونونه؛ **P = 0.0084، *P = 0.0179 او ***P < 0.0001). б, количественная оценка морфологических признаков (n = 8 нейронов hCO، n = 6 нейронов t-hCO؛ ** P = 0,0084, * P = 0,0179, * P = 0,0179, * P = 0,0179). b، د مورفولوژیکي ځانګړتیاوو اندازه کول (n=8 hCO نیورونونه، n=6 t-hCO نیورونونه؛ **P=0.0084، *P=0.0179، او ***P<0.0001). b，形态学特征的量化（n = 8 个hCO 神经元，n = 6 个t-hCO 神经元；**P = 0.0084，*P = 0.0179,*P = 0.0179 和*00） b，形态学特征的量化（n = 8 个hCO 神经元，n = 6 个t-hCO 神经元；**P = 0.0084，*P = 0.0179,*P = 0.0179 和*00） б, количественная оценка морфологических признаков (n = 8 нейронов hCO، n = 6 нейронов t-hCO؛ ** P = 0,0084, * P = 0,0179, * P = 0,0179, * P = 0,0179). b، د مورفولوژیکي ځانګړتیاوو اندازه کول (n=8 hCO نیورونونه، n=6 t-hCO نیورونونه؛ **P=0.0084، *P=0.0179، او ***P<0.0001).c، د hCO او t-hCO ډنډریټیک څانګو درې بعدي بیارغونه د 8 میاشتو توپیر وروسته. سره ستوري د فرضي ډنډریټیک نخاعو ښودنه کوي. د ډنډریټیک نخاع کثافت اندازه کول (n = 8 hCO نیورونونه، n = 6 t-hCO نیورونونه؛ **P = 0.0092). d، د استراحت غشا ظرفیت اندازه کول (n = 25 hCO نیورونونه، n = 16 t-hCO نیورونونه؛ ***P < 0.0001). d، د استراحت غشا ظرفیت اندازه کول (n = 25 hCO نیورونونه، n = 16 t-hCO نیورونونه؛ ***P < 0.0001). d، количественная оценка мембранного потенциала покоя (n = 25 нейронов hCO، n = 16 нейронов t-hCO؛ *** P <0,0001). d، د آرامۍ غشا احتمالي اندازه کول (n = 25 hCO نیورونونه، n = 16 t-hCO نیورونونه؛ ***P < 0.0001). d，静息膜电位的量化（n = 25 hCO 神经元，n = 16 t-hCO 神经元；***P <0.0001）. d，静息膜电位的量化（n = 25 hCO 神经元，n = 16 t-hCO 神经元；***P <0.0001）. d، количественная оценка мембранного потенциала покоя (n = 25 нейронов hCO، n = 16 нейронов t-hCO؛ *** P <0,0001). d، د آرامۍ غشا احتمالي اندازه کول (n = 25 hCO نیورونونه، n = 16 t-hCO نیورونونه؛ ***P < 0.0001). e، په hCO او t-hCO کې د عمل احتمالي تکراري ډزې د اوسني انجیکشنونو زیاتوالي او د اعظمي ډزو نرخ اندازه کولو له امله رامینځته کیږي (n = 25 hCO نیورونونه، n = 16 t-hCO نیورونونه؛ ***P < 0.0001). e، په hCO او t-hCO کې د عمل احتمالي تکراري ډزې د اوسني انجیکشنونو زیاتوالي او د اعظمي ډزو نرخ اندازه کولو له امله رامینځته کیږي (n = 25 hCO نیورونونه، n = 16 t-hCO نیورونونه؛ ***P < 0.0001). e، повторное возбуждение потенциала действия в hCO и t-hCO، вызванное увеличением тока, и количественная оценка максиала действия возбуждения (n = 25 нейронов hCO، n = 16 нейронов t-hCO؛ *** P <0,0001). e، په hCO او t-hCO کې د عمل احتمالي بیا ډزې کول د اوسني زیاتوالي او د اعظمي ډزو نرخ اندازه کولو له امله رامینځته شوي (n = 25 hCO نیورونونه، n = 16 t-hCO نیورونونه؛ *** P < 0.0001). e，通过增加电流注入诱导的hCO 和t-hCO 重复动作电位放电,以及最大放甾电神经元，n = 16 个t-hCO 神经元；*P <0.0001）. E ，通过增加电流注入的 的 hco 和 t-hco 重复 电位放电，以及最大的量化 （电 5 hco , n = 16 个 t-hco 神经 ； *** p <0.0001） . e، повторяющееся возбуждение потенциала действия hCO и t-hCO، вызванное увеличением подачи тока, и количественкаициальная количественкаициальная скорости возбуждения (n = 25 нейронов hCO، n = 16 нейронов t-hCO؛ *** P <0,0001). e، د hCO او t-hCO د عمل پوټینشیلونو تکراري ډزې چې د اوسني عرضې زیاتوالي او د اعظمي ډزو نرخ اندازه کولو له امله رامینځته کیږي (n = 25 hCO نیورونونه، n = 16 t-hCO نیورونونه؛ *** P < 0.0001). f، په hCO او t-hCO نیورونونو کې په ناڅاپي ډول EPSCs (sEPSCs) د 8 میاشتو توپیر په وخت کې، او د سیناپټیک پیښو د فریکونسۍ اندازه کول (n = 25 hCO نیورونونه، n = 17 t-hCO نیورونونه؛ ***P < 0.0001). f، په hCO او t-hCO نیورونونو کې په ناڅاپي ډول EPSCs (sEPSCs) د 8 میاشتو توپیر په وخت کې، او د سیناپټیک پیښو د فریکونسۍ اندازه کول (n = 25 hCO نیورونونه، n = 17 t-hCO نیورونونه؛ ***P < 0.0001). f، спонтанные EPSC (sEPSC) в нейронах hCO и t-hCO через 8 месяцев дифференцировки и количественная оценка частоты сипыткиты = сипыткити. нейронов hCO, n = 17 нейронов t-hCO; *** P <0,0001). f، په hCO او t-hCO نیورونونو کې په ناڅاپي EPSCs (sEPSCs) د سیناپټیک پیښو نرخونو د توپیر او مقدار کولو په 8 میاشتو کې (n=25 hCO نیورونونه، n=17 t-hCO نیورونونه؛ ***P<0.0001). f，分化8 个月时hCO 和t-hCO 神经元中的自发性EPSCs (sEPSCs)，以及突触事件频率的量化（烞烞n2hCO 17 t-hCO 神经元；**P <0.0001） . f，分化8 个月时hCO 和t-hCO 神经元中的自发性EPSCs (sEPSCs)，以及突触事件频率的量匼（n神率的量匼（n = 25 hCO 神率的量匼（n = 25hCO P < 0.0001） . f، спонтанные EPSC (sEPSC) в нейронах hCO и t-hCO через 8 месяцев дифференцировки и количественная оценка частоты сипыткиты = сипыткити. нейронов hCO، n = 17 нейронов t-hCO؛ *** P <0,0001). f، په hCO او t-hCO نیورونونو کې په ناڅاپي EPSCs (sEPSCs) د سیناپټیک پیښو نرخونو توپیر او اندازه کولو په 8 میاشتو کې (n = 25 hCO نیورونونه، n = 17 t-hCO نیورونونه؛ *** P<0.0001).د bf لپاره، په ۱۲۰۸-۲ کرښه کې hCO او t-hCO د ورته توپیر بیچ څخه اخیستل شوي چې په موازي ډول ساتل شوي. g، د جین سیټ غني کولو تحلیل (د فشر یو اړخیزه دقیق ازموینه) د جینونو د پام وړ لوړ تنظیم شوی (تنظیم شوی P < 0.05، د فولډ بدلون > 2، لږترلږه په 10٪ نیوکلی کې څرګند شوی) په t-hCO ګلوټامیټرجیک نیورونونو کې د hCO ګلوټامیټرجیک نیورونونو سره پرتله شوی چې د لومړني غبرګون (ERG) او ناوخته غبرګون (LRG) فعالیت پورې تړلي جینونو جین سیټونه د ان ویوو موږک مطالعې څخه پیژندل شوي 16 او د ان ویټرو نیورونونو څخه د انسان ځانګړي LRGs 17. g، د جین سیټ غني کولو تحلیل (د فشر یو اړخیزه دقیق ازموینه) د جینونو د پام وړ لوړ تنظیم شوی (تنظیم شوی P < 0.05، د فولډ بدلون > 2، لږترلږه په 10٪ نیوکلی کې څرګند شوی) په t-hCO ګلوټامیټرجیک نیورونونو کې د hCO ګلوټامیټرجیک نیورونونو سره پرتله شوی چې د لومړني غبرګون (ERG) او ناوخته غبرګون (LRG) فعالیت پورې تړلي جینونو جین سیټونه د ان ویوو موږک مطالعې څخه پیژندل شوي 16 او د ان ویټرو نیورونونو څخه د انسان ځانګړي LRGs 17. g, анализ обогащения набора генов (односторонний точный критерий Фишера) генов со значительной активацией изменения > 2, экспрессия по меньшей мере в 10% ядер) в глутаматергических нейронах t-hCO по сравнению с глутаматергических hCO наборы генов как раннего (ERG) , так и позднего (LRG) генов, зависящих от активности, идентифицированных в исследовании на мыследовании на мысичецих, vi для человека LRG из нейронов in vitro17. g، د جین سیټ غني کولو تحلیل (د یو لکۍ لرونکي فشر دقیق ازموینه) د جینونو د پام وړ فعالولو سره (تنظیم شوی P<0.05، د فولډ بدلون >2، د نیوکلی لږترلږه 10٪ کې څرګندونه) په t-hCO ګلوټامیټرجیک نیورونونو کې د hCO ګلوټامیټرجیک نیورونونو سیټونو په پرتله د لومړني (ERG) او ناوخته (LRG) فعالیت پورې تړلي جینونو سیټونه چې په ان ویوو موږکانو کې پیژندل شوي 16 او د انسان ځانګړي LRGs د ان ویټرو 17 نیورونونو څخه. g,t-hCO谷氨酸能神经元与hCO谷氨酸能神经元相比,t -hCO谷氨酸能神经元显着上调（调整后P<0.05,倍数变化>2،在至少10%的细胞核中表达）的基因集富集分析(单侧F) isher精确检验）从体内小鼠研究中鉴定的早期反应(ERG)和晚期反应(LRG) 活性依赖性基因的基因组16 和体外神经元17 中的人类特异性 g ， t-hco 谷氨酸 神经 元与 hco 谷氨酸 神经 元相比 ， t-hco 谷氨酸神经元谨酸 神经元谈开有元谐式元谐式元谐比比倍数> 2 ， 至少 至少 10%的 细胞 核中 表达） 的 集富集 分析 （单侧 fisher 精确）台可集研究 中中 早期早期 反应反应 反应反应 和晚期 晚期 (LRG) 活性 基因 基因 基因 的 的 的 的 基因组 神经元 神经元17 中 中 17 中 17的人类特异性LRG. g, глутаматергические нейроны t-hCO были значительно активизированы по сравнению с глутаматергическими нейронами hCO. P<0,05, кратность изменения> 2, не менее 10% Анализ обогащения набора генов (односторонний точный тест Фишера) ранотигера позднего гены, зависящие от активности ответа (LRG)، идентифицированные в исследованиях на мышах in vivo16 и нейронах in vitro17. LRG، специфичные для человека. g، t-hCO ګلوټامیترجیک نیورونونه د hCO ګلوټامیترجیک نیورونونو په پرتله د پام وړ لوړ شوي وو (تنظیم شوي P<0.05، فولډ بدلون >2، لږترلږه 10٪ لومړني غبرګون (ERG) او د ناوخته غبرګون جین بډایه کولو تحلیل (د یو لکۍ لرونکي فشر دقیق ازموینه) د غبرګون فعالیت پورې تړلي جینونه (LRGs) چې په ان ویوو موږک 16 او ان ویټرو نیورونونو کې پیژندل شوي. 17 د انسان ځانګړي LRGs.نقطه شوې کرښه د بونفروني اصلاح شوي P ارزښت 0.05 h ښیي، د GluN جین څرګندونه (د هر جین جعلي بسته او اندازه کول) د T-hCO ګلوټاماترجیک نیورونونو کې د LRG جینونو snRNA-seq نقلونو کې د پام وړ لوړ شوی و. i، د معافیت سټینینګ په T-hCO (پورته) او HCO (ښکته) نیورونونو کې د SCG2 څرګندونه ښیې. سپین تیرونه SCG2+ حجرو ته اشاره کوي. د پیمانه بار، 25 µm. معلومات د اوسط ± معیاري انحراف په توګه څرګند شوي.
د t-hCO د زیات شوي فعالیت پراساس چې په ex vivo ټوټو کې لیدل شوي، snRNA-seq د hCO په پرتله په t-hCO کې د جین ټرانسکرپټونو فعالیت پورې تړلی لوړ تنظیم څرګند کړ. ګلوټامټرجیک t-hCO نیورونونو د جینونو لوړې کچې څرګندې کړې چې د ناوخته غبرګون فعالیت تنظیموي (انځور 2g،h)، کوم چې په موږک او انساني نیورونونو کې په تیرو مطالعاتو کې موندل شوي 16،17. د مثال په توګه، BDNF18، SCG2، او OSTN، د پریمیټ ځانګړي فعالیت تنظیم کونکي جین، د hCO نیورونونو په پرتله په t-hCO نیورونونو کې زیاتوالی ښودلی (انځور 2g-i). په دې توګه، t-hCO نیورونونو د hCO نیورونونو په پرتله د ټرانسکرپشنل، مورفولوژیکي، او فعال تحلیلونو لخوا د پختګۍ ځانګړتیاوې ښودلې.
د انسان د دماغ د ودې سره د t-hCO د پخېدو د تړاو د لا ارزونې لپاره، موږ د جنین او بالغ کورټیکل حجرو ډولونو 19,20 او بالغ 21,22 ټرانسکرپټومیک پرتله کول او همدارنګه د پراختیا په جریان کې د کورټیکل جین اظهار 23 په اړه پراخه معلومات ترسره کړل (پراخ شوي معلومات، شکل 5). د تیرو کارونو 24 سره، د 7-8 میاشتو توپیر کې د نړیوال hCO او t-hCO د ټرانسکرپټوم د پخېدو حالت په پراخه کچه د ان ویوو پراختیا وخت سره مطابقت لري او د جنین د وروستي ژوند سره خورا مساوي دی (پراخ شوي معلومات انځور 5a). د پام وړ، موږ د عمر سره مطابقت لرونکي hCO په پرتله په t-hCO کې د ټرانسکرپټوم د پخېدو زیاتوالی لیدلی، او همدارنګه د سیناپټوجینیسیس، اسټروجینیسیس، او مایلینیشن سره تړلي ټرانسکرپټوم فعالول (پراخ شوي معلومات، شکل 5b-d). په حجروي کچه، موږ په t-hCO کې د پتلي کورټیکس فرعي ډول شواهد وموندل، د ګلوټاماترجیک نیورونونو کلسترونه د بالغ L2/3، L5، او L6 نیورون فرعي ډولونو سره یوځای کیږي (شکل 1i). په مقابل کې، د امیندوارۍ په منځ کې د ګلوټامیټرجیک t-hCO نیورونونو او د جنین کورټیکل نیورونونو ترمنځ د کلستر اوورلیپ ډیر محدود و (پراخ شوي معلومات، شکل 5e-j). د دې لپاره چې معلومه کړو چې ایا t-hCO نیورونونه په فعاله توګه د انسان د زیږون وروسته نیوکورټیکل نیورونونو سره ورته دي، موږ د انسان د زیږون وروسته کورټیکس په تیزو برخو کې د انسان L2/3 پیرامیډال نیورونونو الیکټروفیزیولوژیکي ریکارډونه او اناتوميکي بیارغونه ترسره کړل (پراخ شوي معلومات، شکل 7a). د L2/3 پیرامیډال نیورونونو الیکټروفیزیولوژیکي ملکیتونه د t-hCO پیرامیډال نیورونونو سره ورته وو (پراخ شوي معلومات، شکل 7e). په مورفولوژیکي ډول، د زیږون وروسته د انسان نمونو څخه L2/3 نیورونونه د hCO په پرتله t-hCO سره ډیر ورته وو، که څه هم L2/3 حجرې اوږدې وې، په ټولیز ډول ډیرې څانګې درلودې، او د نخاع لوړ کثافت یې درلود (شکل 3g او پراخ شوي معلومات، شکل 7b-). G).
الف، د نوي زیږیدلي موږکانو ته د کنټرول او TS hiPS حجرو لینونو لخوا تولید شوي hCO لیږد. ب، د 8 میاشتو توپیر وروسته د بایوسایټین ډک t-hCO نیورونونو 3D بیارغونه. ج، د اوسط ډینډریټیک اوږدوالي اندازه کول (n = 19 کنټرول نیورونونه، n = 21 TS نیورونونه؛ **P = 0.0041). d، د کنټرول څخه د 3D بیا رغول شوي ډینډریټیک څانګې او TS t-hCO د توپیر په 8 میاشتو کې، او د ډینډریټیک نخاعي کثافت اندازه کول (n = 16 کنټرول نیورونونه، n = 21 TS نیورونونه، ***P < 0.0001). d، د کنټرول څخه د 3D بیا رغول شوي ډینډریټیک څانګې او TS t-hCO د توپیر په 8 میاشتو کې، او د ډینډریټیک نخاعي کثافت اندازه کول (n = 16 کنټرول نیورونونه، n = 21 TS نیورونونه، ***P < 0.0001). d, 3D-реконструкция дендритных ветвей из контроля и TS t-hCO через 8 месяцев дифференцировки и количественкая оцедритных оцедритнхенка шипов (n = 16 контрольных нейронов, n = 21 TS нейронов, *** P <0,0001). d، د کنټرول او t-hCO TS څخه د ډینډریټیک څانګو درې بعدي بیارغونه د 8 میاشتو توپیر او ډینډریټیک نخاعي کثافت اندازه کولو کې (n=16 کنټرول نیورونونه، n=21 TS نیورونونه، ***P<0.0001). d，分化8 个月时对照和TS t-hCO 的3D 重建树突分支，以及树突棘密度的量化（n = 16 个煥烹对照和21 个TS 神经元،***P <0.0001）. d ， 分化 8 个时对照和 ts t-hco 的 3d 重建 分支 分支 以及 树突棘密度量化縖 16元 ， n = 21 个 ts 神经 ， *** p <0.0001 ）. d, 3D-реконструкция дендритных ветвей контроля и TS t-hCO через 8 месяцев дифференцировки и количественная оцентвей контроля шипов (n = 16 контрольных нейронов, n = 21 TS нейронов, *** P <0,0001). d، د کنټرول ډنډریټیک څانګو او TS t-hCO3 درې بعدي بیارغونه د 8 میاشتو توپیر او د ډنډریټیک نخاع کثافت اندازه کولو کې (n=16 کنټرول نیورونونه، n=21 TS نیورونونه، ***P<0.0001).سره ستوري د فرضي ډینډریټیک نخاعې په ګوته کوي. e، په کنټرول کې د EPSCs او TS t-hCO نیورونونه د 8 میاشتو توپیر وروسته. f، د فریکونسۍ مجموعي پلاټ او د سیناپټیک پیښو د فریکونسۍ او طول اندازه کول (n=32 کنټرول نیورونونه، n=26 TS نیورونونه؛ **P=0.0076 او P=0.8102). g، د hCO او t-hCO کې د TS او کنټرول نیورونونو Scholl تحلیل. ډیش شوي کرښې د پرتله کولو لپاره د انسان L2/3 د زیږون وروسته پیرامید نیورونونه ښیې (n = 24 کنټرول t-hCO نیورونونه، n = 21 TS t-hCO نیورونونه، n = 8 کنټرول hCO نیورونونه، او n = 7 TS hCO نیورونونه). معلومات د اوسط ± معیاري انحراف په توګه څرګند شوي.
د t-hCO وړتیا چې د انسان د کورټیکس نیورونونو مورفولوژیکي او فعال ځانګړتیاوې په لوړه کچه نقل کړي موږ دې ته وهڅول چې وپلټو چې ایا t-hCO د ناروغۍ فینوټایپونو کشفولو لپاره کارول کیدی شي. موږ په TS تمرکز وکړ، یو شدید عصبي پراختیایی اختلال چې د CaV1.2 کوډ کولو جین کې د فعالیت د لاسته راوړلو بدلونونو له امله رامینځته کیږي، کوم چې په نیورونونو کې د فعالیت پورې تړلي جین لیږد پیل کوي. موږ hCO د دریو TS ناروغانو څخه ترلاسه کړ چې خورا عام بدیل (p.G406R) او درې کنټرولونه لري (انځور 3a). د ټرانسپلانټیشن وروسته، موږ وموندله چې د کنټرولونو په پرتله د TS نیورونونو کې د ډینډریټیک مورفولوژي بدله شوې وه (انځور 3b او پراخ شوي معلومات، انځور 8a، b)، د لومړني ډینډریټونو په شمیر کې دوه چنده زیاتوالی او په اوسط کې عمومي زیاتوالی او په ډینډریټیک اوږدوالي کې عمومي کمښت (انځور 3c او پراخ شوي معلومات، انځور 8c). دا د کنټرول نیورونونو په پرتله په TS کې د نخاعو د کثافت زیاتوالي او د EPSCs د زیاتیدونکي فریکونسۍ سره تړاو درلود (انځور 3d-f او پراخ شوي معلومات، انځور 8g). نور تحلیل د کنټرولونو په پرتله په t-hCO TS کې د غیر معمولي ډینډریټیک شاخ کولو نمونې څرګندې کړې، مګر د توپیر په ورته مرحله کې په ان ویټرو TS hCO کې نه (انځور 3g). دا زموږ د TS کې د فعالیت پورې تړلي ډینډریټیک انقباض پخوانیو راپورونو سره مطابقت لري او د دې ټرانسپلانټ پلیټ فارم وړتیا روښانه کوي چې په ویوو کې د ناروغۍ فینوټایپونه کشف کړي.
بیا موږ وپوښتل چې تر کومه حده د t-hCO حجرات په فعاله توګه په موږک S1 کې مدغم شوي دي. په موږکانو کې S1 د ipsilateral ventral basal او posterior thalamic nuclei څخه قوي synaptic inputs ترلاسه کوي، او همدارنګه د ipsilateral motor او secondary somatosensory cortices، او contralateral S1 (شکل 4a). د innervation نمونې د بیرته راګرځولو لپاره، موږ hCO د لیوني سپي ویروس-dG-GFP/AAV-G سره اخته کړ او hCO 3 ورځې وروسته S1 موږک ته انتقال کړ. موږ د ipsilateral S1 او ventral basal ganglia په نیورونونو کې د GFP کثافت څرګندونه ولیدله (شکل 4b، c). سربیره پردې، د thalamic مارکر netrin G1 د انټي باډي رنګ کول په t-hCO کې د thalamic پایونو شتون څرګند کړ (شکل 4d، e). د دې ارزولو لپاره چې ایا دا afferent اټکلونه کولی شي په t-hCO حجرو کې synaptic غبرګونونه رامینځته کړي، موږ د thalamocortical طبقې په تیزو برخو کې د انساني حجرو څخه د ټول حجرو ثبتونه ترسره کړل. د موږک S1، داخلي کپسول، سپینې مادې، t-hCO ته نږدې فایبرونو بریښنایی محرک یا په t-hCO کې د اپسین څرګندونکي تالامیک پایونو د آپټوجینیټیک فعالول د AMPA ریسیپټر ضد NBQX سره مخ شوي t-hCO نیورونونو کې د لنډ ځنډ EPSCs هڅوي. (انځور 4f، g او پراخ شوي معلومات، انځور 9a-g). دا معلومات ښیې چې t-hCO په اناتوميکي ډول د موږک دماغ کې مدغم شوی او د موږک کوربه نسج لخوا د فعالیدو وړ دی.
a، د لیوني سپي د تعقیب تجربې سکیماتي ډیاګرام. b، GFP او د انسان ځانګړي STEM121 څرګندونه د t-hCO او موږک دماغي کورټیکس (پورته پینل) ترمنځ. همدارنګه د موږک په ipsilateral ventral basal nucleus (VB) (لاندې کیڼ) او ipsilateral S1 (لاندې ښي) کې د GFP څرګندونه ښودل شوې ده. د پیمانه بار، 50 µm. سره مربعونه د دماغ هغه سیمې استازیتوب کوي چیرې چې عکسونه اخیستل شوي. c، د GFP څرګندولو حجرو اندازه کول (n = 4 موږک). d، e - په t-hCO کې د نیټرین G1+ تالامیک ټرمینلونه. d د t-hCO او VB نیوکلی لرونکي مرجان برخه ښیې. د پیمانه بار، 2 ملي میتر. e په t-hCO (کیڼ) او VB (ښي) نیورونونو کې د نیټرین G1 او STEM121 څرګندونه ښیې. د پیمانه بار، 50 µm. نارنجي نقطه شوې کرښه د t-hCO سرحد په ګوته کوي. f، g، د S1 موږک (f) یا داخلي کیپسول (g) کې د بریښنایی محرک وروسته د t-hCO نیورونونو اوسني نښې، د (ارغواني) یا پرته له (تور) NBQX (کیڼ اړخ) سره. د NBQX سره او پرته د EPSC امپلیټیډونه (n = 6 S1 نیورونونه، *P = 0.0119؛ او n = 6 داخلي کیپسول نیورونونه، **P = 0.0022) (مرکز). د t-hCO نیورونونو سلنه چې د موږک S1 (f) یا داخلي کیپسول (g) (ښي اړخ) د بریښنایی محرک په ځواب کې EPSC ښیې. aCSF، مصنوعي دماغي نخاعي مایع. h، د 2P امیجنگ تجربې سکیماتیک ډیاګرام (کیڼ اړخ). په t-hCO کې د GCaMP6s څرګندونه (منځنی). د پیمانه بار، 100 µm. د GCaMP6s (ښي اړخ) د فلوروسینس وخت تیریدل. i، د ناڅاپي فعالیت فلوروسینس Z-سکور. j، د مونچھونو هڅونې سکیماتیک انځور. k، په یوه آزموینه کې د 2P فلوروسینس ټراجیکټوري، د مثال په حجرو کې د صفر وخت (ډش شوي کرښه) کې د ویسکر انحراف سره سمون لري. l، د ټولو حجرو د نفوس اوسط z-سکور ځوابونه چې د صفر وخت (ډش شوي کرښه) (سور) یا په ناڅاپي ډول تولید شوي وخت سټمپونو (خړ) کې د ویسکر انحراف سره سمون لري. m. د آپټیکل نښه کولو په اړه د تجربې سکیمیک ډیاګرام. n، د نیلي لیزر محرک یا د ویسکر انحراف په جریان کې د t-hCO حجرو څخه خام ولټاژ منحني. سره تیرونه د رڼا (پورته) یا د ویسکر انحراف (لاندې) له امله رامینځته شوي لومړني سپکونه په ګوته کوي. خړ سیوري د ویسکر انحراف دورې په ګوته کوي. o، د لوړ رڼا څپې او د ویسکر انحراف غبرګونونه. p، د یوې هڅې سپکونه، د مثال په حجرو کې د ویسکر انحراف سره سمون لري. 0 د ویسکر انحراف (ډش شوي کرښه) په ګوته کوي. q، د ټولو فوتو حساس حجرو لپاره د نفوس اوسط z-سکور د ډزو کچه، د صفر وخت (ډش شوي کرښه) (سور) یا په ناڅاپي ډول تولید شوي وخت سټمپونو (خړ) کې د ویسکر انحراف سره سمون لري. r، د فوټو حساس واحدونو تناسب چې د ویسکر انحراف لخوا د پام وړ تعدیل شوی (n = 3 موږکان) (کیڼ اړخ ته). د زیډ سکور لوړ ځنډ (n = 3 موږکان؛ n = 5 (روښانه شنه)، n = 4 (تیره شنه)، او n = 4 (سیان) د ویسکر انحراف تعدیل واحدونه په هر موږک) (ښي اړخ ته). معلومات د اوسط ± معیاري انحراف په توګه څرګند شوي.
بیا موږ وپوښتل چې ایا t-hCO د حسي محرکاتو لخوا په ویوو کې فعال کیدی شي. موږ hCO د جینیاتي ډول کوډ شوي کلسیم شاخصونه GCaMP6 په S1 موږکانو کې لیږد کړل. د 150 ورځو وروسته، موږ د فایبر فوټومیټري یا دوه فوټون کلسیم امیجنگ ترسره کړ (انځور 4h او پراخ شوي معلومات، انځور 10a). موږ وموندله چې t-hCO حجرو همغږي شوي تال فعالیت ښودلی (انځور 4i، پراخ شوي معلومات، انځور 10b او ضمیمه ویډیو 1). د t-hCO فعالیت لوړ ځانګړتیا لپاره، موږ د انستیزیټ شوي ټرانسپلانټ موږکانو کې د حجرو څخه بهر الیکټروفیسولوژیکي ریکارډونه ترسره کړل (پراخ شوي معلومات، انځور 10c-f). موږ د MRI انځورونو څخه سټیریوټیکسیک همغږي تولید کړې؛ پدې توګه، دا ثبت شوي واحدونه د انسان نیورونونه استازیتوب کوي، که څه هم یوازې الیکټروفیسولوژي د اصلي نوعې ټاکلو ته اجازه نه ورکوي. موږ د فعالیت همغږي شوي ټوټې ولیدلې (پراخ شوي معلومات، انځور 10d). درزونه شاوخوا 460 ملی ثانیې دوام وکړ او د شاوخوا 2 ثانیو د چوپتیا دورې لخوا جلا شوي وو (پراخ شوي معلومات، شکل 10d، e). انفرادي واحدونو په اوسط ډول په هر برسټ کې شاوخوا درې ګولۍ ډزې وکړې، کوم چې د هر برسټ شاوخوا 73٪ راجستر شوي واحدونه دي. د انفرادي واحدونو فعالیتونه خورا اړونده وو، او دا اړیکې د هغو واحدونو په پرتله لوړې وې چې په غیر واکسین شوي څارویو کې پیژندل شوي چې د ورته شرایطو لاندې ثبت شوي (پراخ شوي معلومات، شکل 10f). د پیژندل شوي انسان څخه ترلاسه شوي نیورونونو د سپیک غبرګونونو نور مشخص کولو لپاره، موږ د hCO سره لیږدول شوي بې هوشي شوي موږکانو باندې د رڼا ټګ کولو تجربې ترسره کړې چې د رڼا حساس کیشن چینل روډوپسین 2 (hChR2) څرګندوي، چې له لارې یې t-hCO نیورونونه د نیلي رڼا محرکاتو په ځواب کې لنډ ځنډ (له 10 ملی ثانیو څخه کم) پیژندل کیږي (انځور 4m–o). د t-hCO نیورونونو په فریکونسیو کې د ناڅاپي فعالیت د ټوټې ښودنه وکړه چې د کلسیم امیجنگ کې لیدل شوي، او همدارنګه د رڼا نښه کولو په نشتوالي کې په t-hCO کې ترسره شوي الیکټروفیزیولوژیکي ثبتونه (پراخ شوي معلومات، شکل 10c-g). د hCO اړوند مرحلو کې هیڅ ناڅاپي فعالیت نه دی لیدل شوی چې په ویټرو کې ثبت شوي. د دې ارزولو لپاره چې ایا t-hCO د حسي محرکاتو لخوا فعال کیدی شي، موږ په لنډ ډول د موږک ویسکرز د t-hCO څخه لرې کړل (انځور 4j,m او پراخ شوي معلومات، شکل 10h,k). د پخوانیو مطالعاتو له مخې 8,10، د t-hCO حجرو فرعي سیټ د ویسکرز انعطاف په ځواب کې زیات فعالیت ښودلی، کوم چې هغه وخت نه و لیدل شوی کله چې معلومات د ناڅاپي وخت سټمپونو سره پرتله شوي (انځور 4k–q او پراخ شوي معلومات، شکل 10h–q). په حقیقت کې، د آپټو لیبل شوي واحد واحدونو شاوخوا 54٪ د ویسکرز محرک وروسته د پام وړ زیاتوالی ښودلی، چې شاوخوا 650 ms ته لوړ شوی (انځور 4r). په ګډه سره، دا معلومات وړاندیز کوي چې t-hCO مناسب فعال معلومات ترلاسه کوي او د چاپیریال محرکاتو لخوا فعال کیدی شي.
بیا موږ څیړنه وکړه چې ایا t-hCO کولی شي په موږکانو کې د چلند کنټرول لپاره سرکټونه فعال کړي. موږ لومړی څیړنه وکړه چې ایا د t-hCO نیورونونو محورونه د موږک شاوخوا نسجونو ته خپریږي. موږ hCO د لینټیویرس سره اخته کړ چې hChR2 د EYFP سره یوځای شوی (hChR2-EYFP). د 110 ورځو وروسته، موږ د EYFP څرګندونه په دوه اړخیزه کورټیکل سیمو کې ولیدله، پشمول د اوریدونکي، موټرو، او سوماتوسینسري کورټیسس، او همدارنګه په فرعي کورټیکل سیمو کې، پشمول د سټرایټم، هپپوکیمپس، او تالاموس (انځور 5a). د دې ارزولو لپاره چې ایا دا افیرنټ پروجیکشنونه کولی شي د موږکانو په حجرو کې سیناپټیک غبرګونونه رامینځته کړي، موږ په نظري ډول د t-hCO حجرې فعالې کړې چې د موږک دماغي کورټیکس حجرو په تیزو دماغي برخو کې ثبتولو سره hChR2-EYFP څرګندوي. د موږکانو پیرامیډال کورټیکس نیورونونو کې د نیلي رڼا هڅول شوي لنډ ځنډ EPSCs سره د t-hCO محورونو فعالول، کوم چې د NBQX لخوا بند شوي وو (انځورونه 5b-g). برسېره پردې، دا غبرګونونه د ټیټروډوټوکسین (TTX) لخوا بند کیدی شي او د 4-امینوپیریډین (4-AP) لخوا بیرته راګرځیدلی شي، دا وړاندیز کوي چې دوی د مونوسینپټیک اړیکو له امله رامینځته شوي (انځور 5e).
a، د اکسون تعقیبولو سکیمیک ډیاګرام (کیڼ اړخ ته). t-hCO EYFP څرګندونه (ښي اړخ ته). د پیمانه بار، 100 µm. A1، د اوریدونکې کورټیکس، ACC، د مخکینۍ سینګولیٹ کورټیکس، d. سټریټم، ډورسل سټریټم، HPC، هپپوکیمپس؛ ډایفراګم، لیټرل سیپټم، mPFC، میډیل پری فرنټل کورټیکس، piri، piriform cortex، v. سټریټم، وینټرل سټریټم، VPM، د تلاموس وینټروپوسټومیډیل نیوکلیوس، VTA، د وینټرل ټیګینټل سیمه. سره مربع د دماغ هغه سیمې استازیتوب کوي چیرې چې عکسونه اخیستل شوي. b، د محرک تجربې سکیمیک ډیاګرام. c، d، په انسان کې د نیلي رڼا هڅول شوي فوتوکرنټ (پورته) او ولټاژ (لاندې) د غبرګون مثالونه (c) EYFP+ t-hCO یا موږک (d) EYFP- حجرات. e، f، د TTX او 4-AR (شنه)، TTX (خړ) یا aCSF (تور) (e) سره د t-hCO اکسونونو د نیلي رڼا هڅولو وروسته د موږک نیورونونو اوسني نښې، د (بنفشي) سره یا پرته له (تور) ) NBQX (e). g، د موږک حجرو کې د نیلي رڼا لخوا رامینځته شوي غبرګونونو ځنډ (n = 16 حجرې)؛ افقي بارونه اوسط ځنډ (7.13 ms) (کیڼ اړخ) ښیي. د رڼا څخه رامینځته شوي EPSCs طول البلد چې د NBQX سره یا پرته ثبت شوي (n = 7 حجرې؛ ***P < 0.0001) (منځنی). د رڼا څخه رامینځته شوي EPSCs طول البلد چې د NBQX سره یا پرته ثبت شوي (n = 7 حجرې؛ ***P < 0.0001) (منځنی). Амплитуда вызванных светом EPSC، зарегистрированных с или без NBQX (n = 7 клеток؛ ***P <0,0001) (в центре). د رڼا هڅول شوي EPSCs طول البلد چې د NBQX سره یا پرته ثبت شوي (n = 7 حجرې؛ ***P < 0.0001) (مرکز).使用或不使用NBQX 记录的光诱发EPSC 的振幅（n = 7 个细胞；***P < 0.0001）（中）.使用或不使用NBQX 记录的光诱发EPSC 的振幅（n = 7 个细胞；***P < 0.0001）（中）. Амплитуда вызванных светом EPSC، зарегистрированных с или без NBQX (n = 7 клеток؛ ***P <0,0001) (в центре). د رڼا هڅول شوي EPSCs طول البلد چې د NBQX سره یا پرته ثبت شوي (n = 7 حجرې؛ ***P < 0.0001) (مرکز).د موږکانو د حجرو سلنه چې EPSCs ښیي چې نیلي رڼا ته ځواب ورکوي (ښي خوا ته). h، د چلندي دندې سکیمیک ډیاګرام. d0، ورځ 0. i. د روزنې په لومړۍ ورځ (کیڼ اړخ ته) یا پنځلسمه ورځ (ښي خوا ته) د مثالي څارویو فعالیت. د لومړۍ ورځې (کیڼ اړخ) یا پنځلسمې ورځې (ښي اړخ مرکز) کې د ترسره شوي چاټلو اوسط شمیر (n = 150 نیلي رڼا آزموینې، n = 150 سره رڼا آزموینې؛ ***P < 0.0001). د لومړۍ ورځې (کیڼ اړخ) یا پنځلسمې ورځې (ښي اړخ مرکز) کې د ترسره شوي چاټلو اوسط شمیر (n = 150 نیلي رڼا آزموینې، n = 150 سره رڼا آزموینې؛ ***P < 0.0001). Среднее количество облизываний, выполненных в день 1 (слева) или день 15 (в центре справа) (n = 150 испытаний с = ситом 150 испытаний) испытаний с красным светом; ***P <0,0001). د لومړۍ ورځې (کیڼ اړخ) یا پنځلسمې ورځې (مرکز ښي اړخ) کې د ترسره شوي لیکونو اوسط شمیر (n = 150 نیلي رڼا آزموینې، n = 150 سره رڼا آزموینې؛ ***P < 0.0001).第1 天（左）或第15 天（右中）执行的平均舔次数（n = 150 次蓝光试验，n = 150次红光试验；**P <0.0001）.第1 天（左）或第15 天（右中）执行的平均舔次数（n = 150 次蓝光试验，n = 150次红光试验；*P <0.001 Среднее количество облизываний, выполненных в день 1 (слева) или день 15 (в центре справа) (n = 150 испытаний с = ситом 150 испытаний) испытаний с красным светом; ***P <0,0001). د لومړۍ ورځې (کیڼ اړخ) یا پنځلسمې ورځې (مرکز ښي اړخ) کې د ترسره شوي لیکونو اوسط شمیر (n = 150 نیلي رڼا آزموینې، n = 150 سره رڼا آزموینې؛ ***P < 0.0001).د لومړۍ ورځې (په مرکز کې کیڼ اړخ) یا پنځلسمې ورځې (ښي اړخ) کې د سره او نیلي رڼا آزموینو لپاره مجموعي لیکونه. NS، د پام وړ ندي. j,k, د ټولو څارویو چلند ځانګړتیاوې چې د t-hCO سره لیږدول شوي چې hChR2-EYFP (j) څرګندوي یا په لومړۍ یا پنځلسمه ورځ د فلوروفور (k) کنټرول کوي (hChR2-EYFP: n = 9 موږکان، ** P = 0.0049؛ کنټرول: n = 9، P = 0.1497). l، د غوره توب نمرې ارتقا (n = 9 hChR2، n = 9 کنټرول؛ **P < 0.001، ***P < 0.0001). l، د غوره توب نمرې ارتقا (n = 9 hChR2، n = 9 کنټرول؛ **P < 0.001، ***P < 0.0001). l، Эволюция показателя предпочтения (n = 9 hChR2، n = 9 контрольных؛ **P <0,001، ***P <0,0001). l، د غوره توب نمرې ارتقا (n = 9 hChR2، n = 9 کنټرولونه؛ **P < 0.001، ***P < 0.0001). l，偏好评分的演变（n = 9 hChR2，n = 9 对照；**P <0.001,*P <0.0001）. l，偏好评分的演变（n = 9 hChR2，n = 9 对照；**P <0.001,*P <0.0001）. l، Эволюция показателей предпочтения (n = 9 hChR2، n = 9 контролей؛ **P <0,001، ***P <0,0001). l، د غوره توب نمرو ارتقا (n = 9 hChR2، n = 9 کنټرولونه؛ **P < 0.001، ***P < 0.0001).m، په S1 کې د t-hCO د آپټوجینیټیک فعالولو په ځواب کې د FOS څرګندونه. د FOS څرګندونې انځورونه (کیڼ اړخ ته)، او اندازه کول (n = 3 په هر ګروپ کې؛ *P < 0.05، **P < 0.01 او ***P < 0.001) (ښي اړخ ته) ښودل شوي. د FOS څرګندونې انځورونه (کیڼ اړخ ته)، او اندازه کول (n = 3 په هر ګروپ کې؛ *P < 0.05، **P < 0.01 او ***P < 0.001) (ښي اړخ ته) ښودل شوي. Показаны изображения экспрессии FOS (слева) и количественного определения (n = 3 на группу؛ * P <0,05, ** P <0,01 и *** P <0,01) د FOS څرګندونې (کیڼ اړخ ته) او اندازه کولو انځورونه (n = 3 په هر ګروپ کې؛ *P<0.05، **P<0.01، او ***P<0.001) ښودل شوي (ښي اړخ ته).显示了FOS 表达（左）和量化（每组n = 3；*P < 0.05、**P < 0.01 和***P < 0.001）（叾叾ﾼ显示了FOS 表达（左）和量化（每组n = 3；*P < 0.05、**P < 0.01 和***P < 0.001）（叾叾ﾼ Показаны изображения экспрессии FOS (слева) и количественного определения (n = 3 на группу؛ * P <0,05, ** P <0,01 и *** P <0,01) د FOS څرګندونې (کیڼ اړخ ته) او اندازه کولو انځورونه (n = 3 په هر ګروپ کې؛ *P<0.05، **P<0.01، او ***P<0.001) ښودل شوي (ښي اړخ ته).د پیمانه بار، ۱۰۰ µm. معلومات د BLA، بیسولټرل ټونسیل، MDT، ډورسومیډیل تالامیک نیوکلیوس، PAG، پیریاکویډوکټل خړ د اوسط ± معیاري تېروتنې په توګه څرګند شوي.
په پای کې، موږ وپوښتل چې ایا t-hCO کولی شي د موږکانو چلند تعدیل کړي. د دې ازموینې لپاره، موږ hChR2-EYFP-څرګندونکی hCO په S1 کې بدل کړ، او 90 ورځې وروسته، موږ د رڼا رسولو لپاره نظري فایبرونه t-hCO ته نصب کړل. بیا موږ موږکانو ته د تعدیل شوي عملیاتي کنډیشن پاراډایم (انځور 5h) سره روزنه ورکړه. موږ څاروي د چلند ازموینې چیمبر کې ځای په ځای کړل او په ناڅاپي ډول یې 5 ثانیې نیلي (473 nm) او سره (635 nm) لیزر محرکات پلي کړل. څارویو د اوبو انعام ترلاسه کړ که چیرې دوی د نیلي رڼا محرک پرمهال چاټ کړي مګر د سره رڼا محرک پرمهال یې نه چاټ کړي. د روزنې په لومړۍ ورځ، څارویو د نیلي یا سره رڼا سره هڅولو په وخت کې د چاټ کولو کې هیڅ توپیر ونه ښود. په هرصورت، په 15مه ورځ، هغه څارویو چې د hCO سره لیږدول شوي hChR2-EYFP څرګندوي د سره رڼا محرک په پرتله د نیلي رڼا سره هڅولو په وخت کې ډیر فعال چاټ کول وښودل. د چاټلو په چلند کې دا بدلونونه په کنټرول شوي څارویو کې نه دي لیدل شوي چې د hCO سره لیږدول شوي چې د کنټرول فلوروفور څرګندونه کوي (د زده کړې بریالیتوب کچه: hChR2 89٪، EYFP 0٪، شکل 5i-1 او ضمیمه ویډیو 2). دا معلومات وړاندیز کوي چې د t-hCO حجرې کولی شي د انعام غوښتونکي چلند هڅولو لپاره د موږک نیورونونه فعال کړي. د دې موندلو لپاره چې کوم موږک t-hCO عصبي سرکټونه ممکن پدې چلند بدلونونو کې دخیل وي، موږ په 90 دقیقو وروسته په روزل شوي څارویو او راټول شوي نسجونو کې په آپټوجنیتیک ډول t-hCO فعال کړ. د امیونوهیسټو کیمیا د دماغ په څو برخو کې د فعالیت پورې تړلي FOS پروټین څرګندونه څرګنده کړه چې په هڅول شوي چلند کې ښکیل دي، پشمول د میډیل پری فرنټل کورټیکس، میډیل تالاموس، او پیریاکویډوکټل خړ ماده، کوم چې یا په غیر محرک کنټرول څارویو یا څارویو کې څرګند شوی. وريجې. 5m). یوځای اخیستل شوي، دا معلومات وړاندیز کوي چې t-hCO کولی شي د موږک نیورونال فعالیت تعدیل کړي ترڅو چلند چل کړي.
عصبي ارګانایډونه د انسان د ودې او ناروغۍ د مطالعې لپاره د امید وړ سیسټم استازیتوب کوي، مګر دوی د هغو سرکټونو ترمنځ د اړیکو نشتوالي له امله محدود دي چې په ویوو کې شتون لري. موږ یو نوی پلیټ فارم رامینځته کړی چې موږ پکې hCO د معافیت کمزوري شوي لومړني زیږون وروسته موږکانو S1 ته لیږدولی ترڅو د انسان د حجرو پراختیا او په ویوو کې فعالیت مطالعه کړي. موږ ښودلې چې t-hCO د بالغ حجرو ډولونه رامینځته کوي چې په ویټرو کې نه لیدل کیږي28 او دا چې t-hCO په اناتوميکي او فعاله توګه د موږکانو دماغ کې مدغم کیږي. د موږکانو عصبي سرکټونو کې د t-hCO ادغام موږ ته اجازه راکړه چې د انسان د حجروي فعالیت او د څارویو د چلند مطالعه کولو ترمنځ اړیکه رامینځته کړو، دا ښیې چې t-hCO نیورونونه کولی شي د موږکانو عصبي فعالیت تعدیل کړي ترڅو د چلند غبرګونونه پرمخ بوځي.
هغه پلیټ فارم چې موږ یې تشریح کوو د موږکانو دماغونو ته د انسانانو د حجرو د لیږد په اړه د پخوانیو څیړنو په پرتله ډیری ګټې لري. لومړی، موږ د زیږون وروسته د موږکانو د پراختیا کونکي کورټیکس ته hCO انتقال کړ، کوم چې ممکن د اناتومي او فعال ادغام اسانتیا برابر کړي. دوهم، د t-hCO MRI څارنې موږ ته اجازه راکړه چې په ژوندیو څارویو کې د ګرافټ موقعیت او وده مطالعه کړو، موږ ته اجازه راکړه چې اوږدمهاله څو څارویو مطالعات ترسره کړو او د څو hiPS حجرو لینونو اعتبار رامینځته کړو. په پای کې، موږ د جلا شوي واحد حجرو تعلیقونو پرځای، بشپړ ارګانایډونه انتقال کړل، کوم چې د انسانانو حجرو ته لږ ویجاړونکي دي او کولی شي د موږکانو دماغونو کې د انسانانو د کورټیکس نیورونونو ادغام او تولید ته وده ورکړي.
موږ دا منو چې په دې پلیټ فارم کې د پرمختګ سره سره، د وخت، فضا او متقابل ډول محدودیتونه د لوړ وفادارۍ سره د انسان د عصبي سرکټونو د جوړولو مخه نیسي، حتی د پراختیا په لومړیو مرحلو کې د ټرانسپلانټیشن وروسته. د مثال په توګه، دا روښانه نده چې ایا په t-hCO کې لیدل شوی ناڅاپي فعالیت د کورټیکل پراختیا په جریان کې لیدل شوي تال فعالیت ته ورته پرمختیایي فینوټایپ استازیتوب کوي، یا ایا دا په t-hCO کې د موجود فشارونکي حجرو ډولونو نشتوالي له امله دی. په ورته ډول، دا روښانه نده چې په t-hCO کې د لامینیشن نشتوالی تر کومه حده د زنځیر اتصال اغیزه کوي 30. راتلونکی کار به د نورو حجرو ډولونو لکه د انسان مایکروګلیا، د انسان انډوتیلیل حجرو، او د GABAergic انټرنیورونونو مختلف تناسبونو یوځای کولو باندې تمرکز وکړي لکه څنګه چې د اسمبلۍ 6 په ویټرو کې ښودل شوي، او همدارنګه پوهیدل چې څنګه عصبي ادغام او پروسس په بدل شوي t-hCO کې واقع کیدی شي. د ناروغانو څخه ترلاسه شوي حجرو کې ټرانسکرپشنل، سیناپټیک او چلند کچه.
په ټولیز ډول، دا ان ویوو پلیټ فارم یوه پیاوړې سرچینه استازیتوب کوي چې کولی شي د انسان دماغ پراختیا او د ناروغیو څیړنې بشپړ کړي. موږ تمه لرو چې دا پلیټ فارم به موږ ته اجازه راکړي چې د ناروغانو څخه ترلاسه شوي حجرو کې د نوي سټرینډ کچې فینوټایپونه کشف کړو او د درملنې نوي ستراتیژیانې و ازموو.
موږ د HiPS حجرو څخه hCO2.5 تولید کړ لکه څنګه چې مخکې تشریح شوي. د فیډر پرتونو کې د کلتور شوي hiPS حجرو څخه د hCO تولید پیل کولو لپاره، د hiPS حجرو سالم کالونۍ د ډیسپیس (0.35 mg/mL) په کارولو سره د کلتور لوښو څخه لرې شوې او د هایPS حجرو کلتور میډیم سره د لوښو لرونکي الټرا ټیټ ضمیمه پلاستيکي کلتورونو ته لیږدول شوې. (کارنینګ) د دوه SMAD مخنیوی کونکو ډورسومورفین (5 μM؛ P5499، سیګما-الډریچ) او SB-431542 (10 μM؛ 1614، توکریس) او ROCK مخنیوی کونکو Y-27632 (10 μM؛ S1049، سیلیککیم) سره ضمیمه شوې. د لومړیو 5 ورځو په جریان کې، د hiPS حجرو میډیم هره ورځ بدل شو او ډورسومورفین او SB-431542 اضافه شول. د تعلیق په شپږمه ورځ، عصبي سپیرویډونه د عصبي میډیم ته لیږدول شوي چې نیوروباسال-A (10888، ژوند ټیکنالوژي)، د ویټامین A پرته B-27 ضمیمه (12587، ژوند ټیکنالوژي)، ګلوټا میکس (1:100، ژوند ټیکنالوژي)، پنسلین او سټریپټومیسین (1:100، ژوند ټیکنالوژي) لري او د ایپیډرمل ودې فکتور (EGF؛ 20 ng ml−1؛ R&D سیسټمونه) او فایبروبلاست ودې فکتور 2 (FGF2؛ 20 ng ml−1؛ R&D سیسټمونه) سره تر 24 ورځې پورې ضمیمه شوي. له 25 ورځې څخه تر 42 ورځې پورې، میډیم د دماغ څخه اخیستل شوي نیوروټروفیک فاکتور (BDNF؛ 20 ng ml−1، Peprotech) او نیوروټروفین 3 (NT3؛ 20 ng ml−1؛ Peprotech) سره ضمیمه شوی و چې هره بله ورځ یې منځنۍ بدلونونه درلودل. د تعلیق په شپږمه ورځ، عصبي سپیرویډونه د عصبي میډیم ته لیږدول شوي چې نیوروباسال-A (10888، ژوند ټیکنالوژي)، د ویټامین A پرته B-27 ضمیمه (12587، ژوند ټیکنالوژي)، ګلوټا میکس (1:100، ژوند ټیکنالوژي)، پنسلین او سټریپټومیسین (1:100، ژوند ټیکنالوژي) لري او د ایپیډرمل ودې فکتور (EGF؛ 20 ng ml−1؛ R&D سیسټمونه) او فایبروبلاست ودې فکتور 2 (FGF2؛ 20 ng ml−1؛ R&D سیسټمونه) سره تر 24 ورځې پورې ضمیمه شوي. له 25 ورځې څخه تر 42 ورځې پورې، میډیم د دماغ څخه اخیستل شوي نیوروټروفیک فاکتور (BDNF؛ 20 ng ml−1، Peprotech) او نیوروټروفین 3 (NT3؛ 20 ng ml−1؛ Peprotech) سره ضمیمه شوی و چې هره بله ورځ یې منځنۍ بدلونونه درلودل.د تعلیق په شپږمه ورځ، عصبي کرویونه د عصبي میډیم ته لیږدول شوي چې پکې نیوروباسال-A (10888، ژوند ټیکنالوژي)، د ویټامین A پرته د B-27 ضمیمه (12587، ژوند ټیکنالوژي)، ګلوټا میکس (1:100، ژوند ټیکنالوژي)، پنسلین شامل وو.и стрептомицин (1:100, د ژوند ټیکنالوژي) и дополнены эпидермальным фактором роста (EGF; 20 ng/мл; R&D Systems) и фактором роста; د R&D سیسټمونه) د 24 ورځو لپاره. او سټریپټومیسین (۱:۱۰۰، لایف ټیکنالوژي) او د ایپیډرمل ودې فکتور (EGF؛ ۲۰ ng/ml؛ R&D سیسټمونه) او فایبروبلاست ودې فکتور ۲ (FGF2؛ ۲۰ ng/ml؛ R&D سیسټمونه) سره ضمیمه شوي تر ۲۴ ورځې پورې.له ۲۵ څخه تر ۴۲ ورځو پورې، د دماغ څخه اخیستل شوي نیوروټروفیک فکتور (BDNF؛ ۲۰ ng ml-۱، پیپروټیک) او نیوروټروفین ۳ (NT3؛ ۲۰ ng ml-۱، پیپروټیک) په میډیم کې اضافه شول، او هره بله ورځ میډیم بدل شو.在悬浮的第6 天，将神经球体转移到含有neurobasal-A（10888,Life Technologies）、不含维生素A B27补充剂（12587，Life Technologies）、GlutaMax（1:100，Life Technologies）、青霉素的神经培养基中和链01Life تکنالوژي）并辅以表皮生长因子（EGF；20 ng ml-1；R&D سیسټمونه）和成纤维细胞生长因子2（FGF2；20ng ml-1；R&D Systems）直至第24 天.在 悬浮 的第 第 6 天 将 神经 球体 转移 含有 含有 neurobasal-a （10888 ， Life Technologies） a 納矻 7补充剂 （12587 ， Life Technologies ） Glutamax （ 1: 100 ， Life TechNOGIS 青霉素 的 神经 培养 基 中 链霉素 1 Life ， 1（0（ Life تکنالوژي） 表皮 生长 因子 （（（20 ng ml-1 ； r & d Systems） 成 纤维 细胞 生长 2 （fgf2 ； 20 ng ml- 1；R&D Systems）笩囤 2；R&D سیسټمونه NA 6-й день суспензии нейросферы были переведены на добавку, содержащую нейробазал-А (10888, د ژوند ټیکنالوژي)، дубавку 2 витамина А (12587, د ژوند ټیکنالوژي)، GlutaMax (1:100، د ژوند ټیکنالوژي)، пенициллин- нейтрализованный стрептомицин (1:100, د ژوند ټیکنالوژي) فاکټور روسټا (EGF؛ 20 ng ml-1؛ د R&D سیسټمونه) او фактора роста фибробластов 2 (FGF2; 20 ng ml-1) 1; په شپږمه ورځ، د نیوروسفیر تعلیقونه د نیوروباسال-A (10888، ژوند ټیکنالوژیو)، د ویټامین A پرته د B-27 ضمیمه (12587، ژوند ټیکنالوژیو)، ګلوټا میکس (1:100، ژوند ټیکنالوژیو)، د پنسلین بې طرفه سټریپټومیسین (1:100، ژوند ټیکنالوژیو) سره ضمیمه شوي ضمیمه شوي د ایپیډرمل ودې فکتور (EGF؛ 20 ng ml-1؛ R&D سیسټمونه) او فایبروبلاست ودې فکتور 2 (FGF2؛ 20 ng ml-1) 1؛ سره ضمیمه شوي ضمیمه شوي ضمیمه شوي. د R&D سیسټمونه) د 24 ورځو لپاره. (د R&D سیسټمونه) تر ۲۴ ورځې پورې.له ۲۵ څخه تر ۴۲ ورځو پورې، د دماغ څخه اخیستل شوي نیوروټروفیک فکتور (BDNF؛ ۲۰ ng ml-۱، پیپروټیک) او نیوروټروفیک فکتور ۳ (NT3؛ ۲۰ ng ml-۱، پیپروټیک) هره بله ورځ د کلتور په منځ کې اضافه شول. منځنۍ اندازه یو ځل بدله شوه.د ۴۳مې ورځې څخه پیل، hCO په غیر بشپړ شوي نیوروباسال-A میډیم (NM; 1088022, Thermo Fisher) کې ساتل شوی و چې په هرو ۴-۶ ورځو کې منځنۍ بدلون راځي. د بې فیډر شرایطو لاندې د کرل شوي hiPS حجرو څخه hCO ترلاسه کولو لپاره، hiPS حجرې د Accutase (AT-104, Innovate Cell Technologies) سره د 7 دقیقو لپاره په 37°C کې انکیوبیټ شوي، په واحد حجرو کې جلا شوي، او په AggreWell 800 پلیټونو (34815, STEMCELL Technologies) کې د 3 × 106 واحد حجرو کثافت سره په Essential 8 میډیم کې د ROCK inhibitor Y-27632 (10 μM; S1049, Selleckchem) سره ضمیمه شوي. د ۲۴ ساعتونو وروسته، په څاه ګانو کې رسنۍ پورته او ښکته په هغه رسنیو کې اچول شوې چې د اسینشل ۶ رسنۍ (A1516401، لایف ټیکنالوژیو) پکې شاملې وې چې د ډورسومورفین (2.5 μM؛ P5499، سیګما-الډریچ) او SB-431542 (10 μM؛ 1614) سره ضمیمه شوې وې. ، توکریډا). له دوهمې څخه تر شپږمې ورځې پورې، اسینشل ۶ رسنۍ هره ورځ د ډورسومورفین او ضمیمه SB-431542 سره بدله شوه. له شپږمې ورځې څخه، د نیوروسفیر تعلیقونه نیوروباسال رسنۍ ته لیږدول شوي او لکه څنګه چې پورته تشریح شوي ساتل شوي.
د څارویو ټولې کړنلارې د څارویو پاملرنې لارښوونو سره سم ترسره شوې چې د سټینفورډ پوهنتون د لابراتوار څارویو پاملرنې اداري کمیټې (APLAC) لخوا تصویب شوي. امیندواره ایوتیمیک RNU (rnu/+) موږکان (چارلس سیند لابراتوارونه) اخیستل شوي یا ساتل شوي. څاروي د خوړو او اوبو سره د 12 ساعتونو رڼا-تیاره دوره کې ساتل شوي. د دریو څخه تر اوو ورځو عمر لرونکي بربنډ (FOXN1–/–) موږکان د غوڅولو دمخه د نابالغ ویښتو ودې لخوا پیژندل شوي. ګوډاګي (نارینه او ښځینه) د 2-3٪ ایزوفلورین سره بې هوشي شوي او په سټیریوټیکسیک چوکاټ کې ځای په ځای شوي. د S1 څخه پورته شاوخوا 2-3 ملي میتر قطر سره د کوپړۍ ټریپانیشن ترسره شو پداسې حال کې چې د ډیورا میټر بشپړتیا ساتل کیږي. بیا د ډیورا سوري کولو لپاره د کرینیوټومي څخه بهر د 30-G ستنې (تقریبا 0.3 ملي میتر) څخه کار واخلئ. بیا HCO په یوه پتلي 3×3 سانتي متره پارافیلم باندې تطبیق کړئ او اضافي میډیم لرې کړئ. د هامیلټن سرنج په کارولو سره چې د 23 G، 45° ستنې سره وصل وي، په نرمۍ سره hCO د ستنې تر ټولو لرې پای ته کش کړئ. بیا سرنج د سرینج پمپ باندې نصب کړئ چې د سټیریوټیکسیک وسیلې سره وصل وي. بیا د ستنې سر په ډیورا کې د 0.3 ملي میتر پراخ پنکچر سوري باندې ځای په ځای کړئ (z = 0 ملي میتر) او سرنج 1-2 ملي میتر (z = نږدې -1.5 ملي میتر) تنګ کړئ تر هغه چې ستنه د ډیورا میټر A ترمنځ وي. یو ګڼ مهر جوړ شي. بیا سرنج د کورټیکل سطحې مرکز ته په z = -0.5 ملي میتر کې پورته کړئ او hCO د 1-2 µl په یوه دقیقه کې انجیکشن کړئ. د hCO انجیکشن بشپړیدو وروسته، ستنه د 0.2-0.5 ملي میتر په یوه دقیقه کې بیرته راګرځول کیږي، پوټکی ګنډل کیږي، او سپی سمدلاسه د بشپړ رغیدو پورې په ګرم تودوخې پیډ کې کیښودل کیږي. ځینې څاروي په دوه اړخیزه توګه لیږدول شوي.
د څارویو ټولې کړنلارې د سټینفورډ پوهنتون APLAC لخوا تصویب شوي څارویو پاملرنې لارښوونو سره سم ترسره شوې. موږکان (د ټرانسپلانټیشن څخه 60 ورځو څخه ډیر وروسته) د 5٪ ایزوفلورین انستیزیا سره هڅول شوي او د عکس اخیستنې پرمهال د 1-3٪ ایزوفلورین سره بې هوښه شوي. د لید لپاره، د 7 ټیسلا فعاله محافظت افقی بورهول سکینر بروکر (بروکر کارپوریشن) د نړیوال بریښنا شرکت (IECO) ګریډینټ ډرایو سره، د 120 ملي میتر داخلي قطر سره یو محافظت ګریډینټ داخل (600 mT/m، 1000 T/m/s) د AVANCE په کارولو سره کارول شوی. III، اته چینل ملټي کویل RF او ملټي کور وړتیاوې، او ورسره ملګری پارا ویژن 6.0.1 پلیټ فارم. ثبت کول د 86 ملي میتر داخلي قطر سره د فعاله جلا شوي حجمیتریک RF کویل او یوازې د ترلاسه کولو لپاره د څلور چینل کریو کول شوي RF کویل په کارولو سره ترسره شوي. محوري 2D ټربو-RARE (د تکرار وخت = 2500 ms، د ایکو وخت = 33 ms، 2 اوسط) د 16 سلائس کیپچرونو سره، د سلائس ضخامت 0.6-0.8 mm، چې 256 × 256 نمونې لري. سیګنالونه د 2 سانتي مترو داخلي قطر سره د کواډریچر ټرانسیور حجمیتریک RF کویل په کارولو سره ترلاسه شوي (Rapid MR International, LLC). په پای کې، د 3D رینډرینګ او حجم تحلیل لپاره د جوړ شوي Imaris (BitPlane) سطحې اټکل افعال وکاروئ. یو بریالی ټرانسپلانټ د هغه په ​​توګه تعریف شوی چې په کې د دوامداره T2-وزن لرونکي MRI سیګنال ساحې په ټرانسپلانټ شوي نیمه کره کې رامینځته شوي. د ګرافټ رد کول د ګرافټ په توګه تعریف شوي چې په ټرانسپلانټ شوي نیمه کره کې د دوامداره T2-وزن لرونکي MRI سیګنال ساحې تولید نه کړې. فرعي کورټیکل t-hCO د راتلونکي تحلیل څخه خارج شوی و.
د دوه فوټون کلسیم امیجینګ لپاره په hCO کې د GCaMP6s په ثابت ډول څرګندولو لپاره، د hiPS حجرې د pLV[Exp]-EF1a::GcaMP6s-WPRE-Puro سره اخته شوې وې او بیا د انټي بیوټیکونو انتخاب وشو. په لنډه توګه، حجرې د EDTA سره جلا شوې او د پولیبرین (5 μg/ml) او 15 μl ویروس په شتون کې د نږدې 300,000 حجرو کثافت کې د 1 ملی لیتر Essential 8 میډیم کې ځړول شوې. بیا حجرې د 60 دقیقو لپاره په تعلیق کې انکیوب شوي او په هر څاه کې د 50,000 حجرو کثافت کې تخم شوي. د یوځای کیدو وروسته، حجرې د 5-10 ورځو لپاره یا تر هغه وخته پورې درملنه شوې چې مستحکم کالونۍ څرګندې شي. د حاد hCO انتان لکه څنګه چې مخکې تشریح شوی 5 د ځینو تعدیلاتو سره ترسره شو. په لنډه توګه، د ورځې 30-45 hCO په 1.5 ملی لیتر ایپینډورف مایکرو سینټرفیوج ټیوبونو کې چې 100 μl عصبي میډیم لري انتقال کړئ. بیا شاوخوا ۹۰ µl د میډیم څخه لرې کیږي، ۳-۶ µl د لوړ ټایټر لینټی ویروس (له ۰.۵ x ۱۰۸ څخه تر ۱.۲ x ۱۰۹ پورې) ټیوب ته اضافه کیږي، او hCO د ۳۰ دقیقو لپاره انکیوبیټر ته لیږدول کیږي. بیا په هر ټیوب کې ۹۰-۱۰۰ µl میډیم اضافه کړئ او ټیوبونه د شپې له خوا انکیوبیټر ته بیرته راستانه کړئ. بله ورځ، hCO د ټیټ ضمیمه پلیټونو کې تازه عصبي میډیم ته انتقال کړئ. د ۷ ورځو وروسته، hCO د انفیکشن کیفیت لیدلو او ارزونې لپاره ۲۴ څاه شیشې لاندې پلیټونو ته لیږدول شوی. pLV[Exp]-SYN1::EYFP-WPRE او pLV[Exp]-SYN1::hChR2-EYFP-WPRE د ویکتور بلډر لخوا تولید شوي. لینټی ویروس په ډیری تجربو کې کارول کیږي ځکه چې دا د کوربه جینوم سره مدغم شوی، چې د اخته شوي حجرو لینونو کې د راپور ورکوونکي جین څرګندولو ته اجازه ورکوي. د لیوني سپي د تعقیب لپاره، د ورځې 30-45 hCO د لیوني سپي-ΔG-eGFP او AAV-DJ-EF1a-CVS-G-WPRE-pGHpA (پلازمیډ #67528، اډجین) سره یوځای اخته شوی و، د 3 ورځو لپاره په بشپړه توګه مینځل شوی و، او په S1 کې موږکانو ته لیږدول شوی و او د 7-14 ورځو لپاره په ژوند کې ساتل شوی و.
د امونوسایتو کیمیا لپاره، څاروي بې هوشه شوي او د PBS سره ټرانسکارډیلي پرفیوز شوي وو او بیا یې 4٪ پارافارمالډیهایډ (PBA کې PFA؛ الیکټرون مایکروسکوپي ساینسز). دماغونه د 2 ساعتونو لپاره یا د شپې لپاره په 4 ° C کې په 4٪ PFA کې تنظیم شوي وو، د 48-72 ساعتونو لپاره په PBS کې په 30٪ سوکروز کې کریوپریزر شوي وو، او په 1:1، 30٪ سوکروز کې ځای پر ځای شوي وو: OCT (Tissue-Tek OCT Compound 4583، Sakura Finetek) او د کورونل برخې په 30 µm کې د کریوسټاټ (Leica) په کارولو سره جوړې شوې وې. د موټی برخو د امیونوهیسټو کیمیا لپاره، څاروي د PBS سره پرفیوز شوي وو، او دماغ د وایبراتوم (Leica) په کارولو سره په 300-400 µm کې په کورونلي ډول جلا او جلا شوی و او برخې د 30 دقیقو لپاره د 4٪ PFA سره تنظیم شوي وې. بیا کرایوسیکشنونه یا غټې برخې د PBS سره ومینځل شوې، د خونې په تودوخه کې د یو ساعت لپاره بندې شوې (۱۰٪ نورمال ډون سیرم (NDS) او ۰.۳٪ ټریټن X-۱۰۰ په PBS کې حل شوی) او د ۴ درجو سانتی ګراد په تودوخه کې د بلاک کولو محلول سره بندې شوې. - انکیوبیشن کرایوسیکشنونه د شپې لخوا انکیوب شوي او غټې برخې د ۵ ورځو لپاره انکیوب شوي. لومړني کارول شوي انټي باډي دا وو: د نیون ضد (موږک، 1:500؛ ab104224، abcam) د CTIP2 ضد (موږک، 1:300؛ ab18465، abcam)، د GFAP ضد (خرگوش، 1:1,000؛ Z0334، ډاکو)، د GFP ضد (چرګ، 1:1,000؛ GTX13970، جینټیکس)، د HNA ضد (موږک، 1:200؛ ab191181، abcam)، د نیون ضد (خرگوش، 1:500؛ ABN78، ملیپور)، د PDGFRA ضد (خرگوش، 1:200؛ sc-338، سانتا کروز)، د PPP1R17 ضد (خرگوش، 1:200؛ HPA047819، اتلس انټي باډي)، د RECA-1 ضد (موږک، ۱:۵۰؛ ab9774، abcam)، د SCG2 ضد (خرگوش، ۱:۱۰۰؛ ۲۰۳۵۷-۱-AP، پروټینټیک)، د SOX9 ضد (وزه، ۱:۵۰۰؛ AF3075، R&D سیسټمونه)، نیټرین G1a (وزه، ۱:۱۰۰؛ AF1166، R&D سیسټمونه)، د STEM121 ضد (موږک، ۱:۲۰۰؛ Y40410، تاکارا بایو)، د SATB2 ضد (موږک، ۱:۵۰؛ ab51502، abcam)، د GAD65/67 ضد (خرگوش، ۱:۴۰۰؛ ABN904، ملیپور) او د IBA1 ضد (وزه، ۱:۱۰۰؛ ab5076، abcam). لومړني کارول شوي انټي باډي دا وو: د نیون ضد (موږک، 1:500؛ ab104224، abcam) د CTIP2 ضد (موږک، 1:300؛ ab18465، abcam)، د GFAP ضد (خرگوش، 1:1,000؛ Z0334، ډاکو)، د GFP ضد (چرګ، 1:1,000؛ GTX13970، جینټیکس)، د HNA ضد (موږک، 1:200؛ ab191181، abcam)، د نیون ضد (خرگوش، 1:500؛ ABN78، ملیپور)، د PDGFRA ضد (خرگوش، 1:200؛ sc-338، سانتا کروز)، د PPP1R17 ضد (خرگوش، 1:200؛ HPA047819، اتلس انټي باډي)، د RECA-1 ضد (موږک، ۱:۵۰؛ ab9774، abcam)، د SCG2 ضد (خرگوش، ۱:۱۰۰؛ ۲۰۳۵۷-۱-AP، پروټینټیک)، د SOX9 ضد (وزه، ۱:۵۰۰؛ AF3075، R&D سیسټمونه)، نیټرین G1a (وزه، ۱:۱۰۰؛ AF1166، R&D سیسټمونه)، د STEM121 ضد (موږک، ۱:۲۰۰؛ Y40410، تاکارا بایو)، د SATB2 ضد (موږک، ۱:۵۰؛ ab51502، abcam)، د GAD65/67 ضد (خرگوش، ۱:۴۰۰؛ ABN904، ملیپور) او د IBA1 ضد (وزه، ۱:۱۰۰؛ ab5076، abcam). Использовались следующие первичные انتټيلا: ANTI-NeuN (мышиные, 1:500; ab104224, abcam), анти-CTIP2 (крысиные, abcam , 164, abcam) ANTI-GFAP (кроличьи, 1:1000; Z0334, Dako), ANTI--GFP (курица, 1:1000; GTX13970, GeneTex), анти-HNA (мышь, 1:200; ab1N191eu), ab1N191eu (کرولیک، 1:500؛ ABN78، ملی پور) انټي-PDGFRA (کروليک، 1:200؛ sc-338، سانتا-کروز)، انټي-PPP1R17 (کروليک، 1:200؛ HPA047819، اتلس انټي باډيز)، انټي-RECA-1 (мышь;74, ab) انټي-SCG2 (کروليک , 1:100; 20357-1-AP، پروټینټیک)، انټي-SOX9 (کوزی، 1:500؛ AF3075، R&D سیسټمونه)، انټرن G1a (کوزی، 1:100، RAFs)، سیسټمونه ANTI-STEM121 (мышиный , 1:200; Y40410, Takara Bio), анти-SATB2 (мышь, 1:50; ab51502, abcam), анти-GAD65/67 (crolic, 1:400; ABN904, Millipore) и анти-IBA1 (коза, 1:100; абкама7). لومړني کارول شوي انټي باډي دا وو: د نیون ضد (موږک، 1:500؛ ab104224، abcam)، د CTIP2 ضد (موږک، 1:300؛ ab18465، abcam)، د GFAP ضد (خرگوش، 1:1000؛ Z0334، ډاکو)، د GFP ضد (چرګ، 1:1000؛ GTX13970، جینټیکس)، د HNA ضد (موږک، 1:200؛ ab191181، abcam)، د نیون ضد (خرگوش، 1:500؛ ABN78، ملیپور)، د PDGFRA ضد (خرگوش، 1:200؛ sc-338، سانتا کروز)، د PPP1R17 ضد (خرگوش، 1:200؛ HPA047819، اتلس انټي باډي)، د RECA-1 ضد (موږک، ۱:۵۰؛ ab9774، abcam)، د SCG2 ضد (خرگوش، ۱:۱۰۰؛ ۲۰۳۵۷-۱-AP، پروټینټیک)، د SOX9 ضد (وزه، ۱:۵۰۰؛ AF3075، R&D سیسټمونه)، نیټرین G1a (وزه، ۱:۱۰۰؛ AF1166، R&D سیسټمونه)، د STEM121 ضد (موږک، ۱:۲۰۰؛ Y40410، تاکارا بایو)، د SATB2 ضد (موږک، ۱:۵۰؛ ab51502، abcam)، د GAD65/67 ضد (خرگوش، ۱:۴۰۰؛ ABN904، ملیپور) او د IBA1 ضد (وزه، ۱:۱۰۰؛ ab5076، abkam).使用的一抗是：抗NeuN（小鼠, 1:500；ab104224, abcam）抗CTIP2（大鼠, 1:3 00；ab18465, abcam）, 抗GFAP（兔, 1:1,000；Z0334, Dako）,抗-GF P（鸡, 1:1,000；GTX13970,GeneTex）,抗HNA（小鼠,1:200；ab1911 81،ابکام）،抗NeuN（兔, 1:500；ABN78, ملی پور）,抗PDGFRA（兔, 1:200；sc-338, سانتا کروز）, 抗PPP1R17（兔, 1:200；HPA047819, اطلس抗体）,抗RECA-1（小鼠, 1:50；ab9774, abcam）,抗SCG2（兔）, 1:100；20357-1-AP، پروټین ټیک）,抗SOX9（山羊,1:500；AF3075,R&D Systems）,Netrin G1a（山羊,1:100；AF1166,R سیسټمونه)، 抗STEM121（小鼠، 1:200؛使用的一抗是：抗NeuN（小鼠, 1:500；ab104224, abcam）抗CTIP2（大鼠,1 :300；ab18465, abcam）,抗GFAP；Z0334, Dako）,抗-GFP（鸡；GTX13970,GeneTex）,抗HNA（小鼠,1:200；ab 191181، abcam）، 抗NeuN（兔، 1:500；ABN78، ملی پور％弔،抗1: 200；sc-338، سانتا کروز）، 抗PPP1R17（兔, 1:200；HPA047819, اطلس 抗体）,抗RECA-1（小鼠, 1:50；Ab97）（小鼠, 1:50； SC47） 100；20357-1-AP، پروټین ټیک）،抗SOX9（山羊,1:500；AF3075,R&D سیسټمونه）,Netrin G1a（山羊,1:100；AF1166,R&0s:R&0;Y40410، تاکارا بایو)، د SATB2 ضد (موږک، 1:50؛ ab51502، abcam)، د GAD65/67 ضد (خرگوش، 1:400؛ ABN904، ملی پور) او د IBA1 ضد (وزه، 1:100؛ ab5076، abcam).لومړني کارول شوي انټي باډي دا وو: د نیون ضد (موږک، 1:500؛ ab104224، abcam)، د CTIP2 ضد (موږک، 1:300؛ ab18465، abcam)، د GFAP ضد (خرگوش، 1:1000؛ Z0334، ډاکو). ، د GFP ضد (چرګ، 1:1000؛ GTX13970، جینټیکس)، د HNA ضد (موږک، 1:200؛ ab191181، abcam)، د NeuN ضد (خرگوش، 1:500؛ ABN78، ملی پور)، د PDGFRA ضد (خرگوش، 1:200؛ sc-338، سانتا کروز)، د PPP1R17 ضد (خرگوش، 1:200؛ HPA047819، اتلس انټي باډي)، د RECA-1 ضد (موږک، 1:50؛ ab9774، abcam)، د SCG2 ضد (خرگوش)، 1:100؛20357-1-AP، پروټینټیک)، انټي-SOX9 (کوزا، 1:500؛ AF3075، R&D سیسټمونه)، نیټرین G1a (کوزا، 1:100؛ AF1166، R&D سیسټمونه)، انټي -STEM121;Y40121; تکارا بایو)، анти-SATB2 (мышь, 1:50; ab51502, abcam), анти-GAD65/67 (кролик, 1:400; ABN904, Millipore) и анти-IBA1 (коза, 1:100, бама6); 20357-1-AP، پروټینټیک)، انټي-SOX9 (وزه، 1:500؛ AF3075، R&D سیسټمونه)، نیټرین G1a (وزه، 1:100؛ AF1166، R&D سیسټمونه)، انټي-STEM121 (موږک، 1:200؛ Y40410، تاکارا بایو)، انټي-SATB2 (موږک، 1:50؛ ab51502، abcam)، انټي-GAD65/67 (خرگوش، 1:400؛ ABN904، ملیپور)، او انټي-IBA1 (وزه، 1:100؛ ab5076، abkam).بیا برخې د PBS سره مینځل شوې او د خونې په تودوخه (کنګل شوي برخې) کې د 1 ساعت لپاره یا د شپې په 4 درجو سانتي ګراد (ضخامت برخې) کې د ثانوي انټي باډي سره انکیوبیټ شوې. د الیکسا فلور ثانوي انټي باډي (لائف ټیکنالوژیانې) د بلاک کولو محلول کې 1:1000 حل شوی کارول شوی. د PBS سره مینځلو وروسته، نیوکلی د هوچسټ 33258 (لائف ټیکنالوژیانې) سره لیدل شوي. په پای کې، سلایډونه د اکواوماؤنټ (پولی ساینس) په کارولو سره د پوښونو سره په مایکروسکوپ کې ځای په ځای شوي او د کینس فلوروسینټ مایکروسکوپ (BZ-X تحلیل کونکي) یا د لییکا TCS SP8 کنفوکل مایکروسکوپ (Las-X) په عکس کې تحلیل شوي. انځورونه د ImageJ پروګرام (Fiji) په کارولو سره پروسس شوي. د t-hCO او د موږک کورټیکس کې د انسان نیورونونو تناسب اندازه کولو لپاره، 387.5 μm پراخ مستطیل عکسونه د t-hCO په مرکز کې، د موږک کورټیکس په څنډه کې یا نږدې اخیستل شوي. د ګرافټ حاشیې د نسجونو شفافیت، HNA+ نیوکلی، او/یا د نسجونو د اتومات فلوروسینس شتون کې د بدلونونو ارزولو له لارې ټاکل شوي. په هر انځور کې، د NeuN+ او HNA+ حجرو ټول شمیر په ورته ساحه کې د NeuN+ حجرو ټول شمیر سره ویشل شوي. د دې لپاره چې ډاډ ترلاسه شي چې یوازې هغه حجرې چې د عکس په الوتکه کې نیوکلی لري شمیرل کیږي، یوازې هغه حجرې چې Hoechst+ هم دي په محاسبه کې شاملې دي. دوه انځورونه چې لږترلږه 1 ملي میتر سره جلا شوي د احصایوي غلطۍ کمولو لپاره اوسط شوي.
د نمونې راټولولو څخه یوه اونۍ دمخه، د hCO لیږدونکي څاروي (تقریبا 8 میاشتې توپیر) په تیاره خونه کې ځای په ځای کړئ چې د حسي محرک کمولو لپاره د ویښتو سره پرې شوي وي. د هستې جلا کول لکه څنګه چې مخکې تشریح شوي، د ځینو تعدیلاتو سره ترسره شول. په لنډه توګه، t-hCO او hCO د صابون میخانیکي حجرو لیسیس او د 2 ملی لیتر شیشې نسج ګرینډر (D8938، سیګما-الډریچ/KIMBLE) په کارولو سره ویجاړ شول. خام هسته بیا د 40 µm فلټر په کارولو سره فلټر شوه او د 320 g کې د 10 دقیقو لپاره په 4 °C کې سینټرفیوج شوه مخکې لدې چې د سوکروز کثافت تدریجي ترسره شي. د سینټرفیوجیشن مرحلې وروسته (320 g د 20 دقیقو لپاره په 4 °C کې)، نمونې په 0.04٪ BSA/PBS کې د 0.2 واحدونو µl-1 RNase مخنیوی کونکي (40 u µl-1، AM2682، امبیون) اضافه کولو سره بیا وځنډول شوې او د 40 µm جریان فلټر څخه تیرې شوې. جلا شوي هسته بیا په PBS کې چې 0.02٪ BSA لري بیا وځنډول شوه او د کرومیم واحد حجرو 3′ چپ ته بار شوه (په هر لین کې د 8,000 حجرو اټکل شوی رغونه). د snRNA-seq کتابتونونه د کرومیم واحد حجرو 3′ GEM، کتابتون او جیل بیډ کټ v3 (10x جینومکس) سره چمتو شوي. د snRNA-seq کتابتونونه د کرومیم واحد حجرو 3′ GEM، کتابتون او جیل بیډ کټ v3 (10x جینومکس) سره چمتو شوي. Библиотеки snRNA-seq были приготовлены с помощью Chromium Single cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x جینومکس). د snRNA-seq کتابتونونه د کرومیم واحد حجرو 3′ GEM، کتابتون او جیل بیډ کټ v3 (10x جینومکس) په کارولو سره چمتو شوي. snRNA-seq 文库是使用Chromium Single cell 3′ GEM 、Library & Gel Bead Kit v3 (10x جینومکس) 制备的. snRNA-seq 文库是使用Chromium Single cell 3′ GEM 、Library & Gel Bead Kit v3 (10x جینومکس) 制备的. Библиотеку snRNA-seq готовили с использованием Chromium Single Cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x جینومکس). د snRNA-seq کتابتون د کرومیم واحد حجرو 3′ GEM، کتابتون او جیل بیډ کټ v3 (10x جینومکس) په کارولو سره چمتو شوی و.د مختلفو نمونو کتابتونونه د اډمیرا روغتیا لخوا په نووا سیک S4 (ایلومینا) کې راټول او ترتیب شوي وو.
د هر فرضي اټومي بارکوډ لپاره د جین د څرګندولو کچه د 10x جینومکس سیل رینجر تحلیل سافټویر پیکج (نسخه 6.1.2) په کارولو سره اندازه شوې. په ځانګړې توګه، لوستل د انسان (GRCh38، انسمبل، نسخه 98) او موږک (Rnor_6.0، انسمبل، نسخه 100) حوالې جینومونو ترکیب سره سمون خوري چې د mkref قوماندې سره رامینځته شوي او د –include-introns=TRUE قوماندې سره د شمېرنې په کارولو سره د انټرون سیمو ته نقشه شوي لوستل شامل دي. د t-hCO نمونو لپاره، د انسان نیوکلی د محافظه کار اړتیا پراساس پیژندل شوي چې لږترلږه د ټولو نقشه شوي لوستلو 95٪ د انسان جینوم سره سمون لري. ټول وروسته تحلیلونه د R پیکج (نسخه 4.1.2) سیورات (نسخه 4.1.1) 32 په کارولو سره د سیل رینجر څخه د فلټر شوي بارکوډ صف محصول کې ترسره شوي.
د دې لپاره چې ډاډ ترلاسه شي چې یوازې لوړ کیفیت لرونکي هستې په راتلونکي تحلیل کې شاملې دي، د هرې نمونې لپاره د تکراري فلټر کولو پروسه پلي شوه. لومړی، د ټیټ کیفیت لرونکي هستې چې له 1000 څخه کم ځانګړي جینونه موندل شوي او د ټول مایټوکونډریا له 20٪ څخه ډیر پیژندل شوي او لرې شوي. وروسته، د خام جین شمیره میټریکس د منظم شوي منفي دوه اړخیز ریګریشن لخوا د sctransform(vst.flavor=”v2″) فعالیت په کارولو سره نورمال شو، کوم چې د ډیفالټ پیرامیټرو په کارولو سره 3000 خورا متغیر جینونه هم پیژندل. د ابعاد کمول د اصلي اجزاو تحلیل (PCA) په کارولو سره د 30 ډیفالټ پیرامیټرو سره ترسره شو (dims = 30 د زنګون سایټونو د بصري تفتیش پراساس غوره شوی او د ټولو نمونو او انسامبل تحلیلونو لپاره کارول شوی). بیا موږ د تکراري کلسترینګ (ریزولوشن = 1) څو پړاوونه ترسره کړل ترڅو د غیر معمولي ټیټ جین شمیر (د 10 سلنې څخه ښکته میډیان)، غیر معمولي لوړ مایټوکونډریال جین شمیر (د 95 سلنې څخه پورته میډیان) پراساس جینونه طبقه بندي کړو ترڅو د ټیټ کیفیت لرونکي حجرو پیژندلو او لرې کولو لپاره. کلسترونه او/یا د شکمنو دوه ګوني ماشومانو لوړه تناسب چې د DoubletFinder33 کڅوړې په کارولو سره پیژندل شوي (د 95 سلنې څخه پورته د DoubletFinder نمره معنی لري). د t-hCO نمونې (n=3) او hCO نمونې (n=3) په جلا توګه د کارولو سره مدغم شوي. د پورته پیرامیټرو سره د ډیټا فعالیت یوځای کول. بیا د مدغم شوي ډیټا سیټ د کیفیتي فلټر کولو بل پړاو ترسره شو لکه څنګه چې پورته تشریح شوی.
د ټیټ کیفیت لرونکو دانو له لرې کولو وروسته، مدغم شوی ډیټاسیټ ګروپ شو (ریزولوشن = 0.5) او د UMAP34 لید موخو لپاره ځای پر ځای شو. د هر کلستر لپاره د مارکر جینونه د FindMarkers فعالیت په کارولو سره د نورمال شوي جین اظهار ډیټا څخه محاسبه شوي ډیفالټ پیرامیټرو سره ټاکل شوي. موږ د جنین او بالغ کورټیکل حوالې ډیټاسیټ سره د مارکر جین اظهار 19,20,21,35 او تشریح سره یوځای کولو سره د لوی حجرو ټولګي پیژنو او طبقه بندي کوو. په ځانګړي توګه، گردش کونکي مخکیني د MKI67 او TOP2A د څرګندولو لخوا پیژندل شوي. د پروجینیټر کلسترونه د مایټوټیک ټرانسکرپټونو نشتوالي، د ناوخته میټا فیز جنین کورټیکس کې تشریح شوي ملټي پوټینټ ګلیال پروجینیټر کلسترونو سره لوړ اوورلیپ، او EGFR او OLIG1 څرګندونه لخوا تعریف شوي. موږ د اسټروسایټ اصطلاح کاروو ترڅو د اسټروسایټ توپیر ډیری حالتونه شامل کړو، د ناوخته ریډیل ګلیا څخه د اسټروسایټونو پخیدو پورې. د اسټروسایټ کلسترونه د SLC1A3 او AQP4 لوړه کچه څرګندوي او ښودل شوي چې د جنین ریډیل ګلیا او/یا بالغ اسټروسایټونو فرعي ډولونو سره نقشه کوي. OPCs د PDGFRA او SOX10 څرګندونه کوي پداسې حال کې چې اولیګوډینډروسایټونه د مایلینیشن نښه کونکي (MOG او MYRF) څرګندوي. ګلوټامټرجیک نیورونونه د نیورونال ټرانسکرپټونو (SYT1 او SNAP25) شتون، د GABAergic نښه کونکي (GAD2) نشتوالي، او د NEUROD6، SLC17A7، BCL11B، یا SATB2 څرګندولو له لارې پیژندل شوي. د GluN نیورونونه نور په پورتنۍ (SATB2 څرګندونه او د BCL11B له لاسه ورکول) او ژور (BCL11B څرګندونه) فرعي ټولګیو ویشل شوي. پوټیټیو فرعي پلیټ (SP) نیورونونه د ژورو GluN نښه کونکو سربیره د SP18 پیژندل شوي نښه کونکي لکه ST18 او SORCS1 څرګندوي. د کورایډ پلیکسس په څیر حجرې د TTR څرګندولو له لارې پیژندل شوي، او د میننجیل په څیر حجرو د فایبروبلاست پورې اړوند جینونه او د حوالې ډیټا سیټ نقشه شوي پایل/رګونو حجرې څرګندې کړې.
د t-hCO او hCO فرعي ټولګیو ترمنځ د جین څرګندولو توپیري تحلیل د نوي رامینځته شوي سیوډو بیچ میتود په کارولو سره ترسره شو چې په نمونو کې تولید شوی چې د لیبرا R پیکج (نسخه 1.0.0) په کارولو سره پلي شوي. په ځانګړي توګه، د edgeR لاګ احتمال ازموینې (نسخه 3.36.0، پیکج R) د هر نمونې نقل لپاره د ورکړل شوي حجرو ټولګي لپاره په حجرو کې د جینونو شمیر لنډولو سره د ډلو لپاره ترسره شوې. د تودوخې نقشې لید لپاره، د هر ملیون نورمال شوي (CPM) ارزښتونه د edgeR (cpm() فعالیت) په کارولو سره محاسبه کیږي او اندازه کیږي (د اوسط = 0، معیاري انحراف = 1 ترلاسه کولو لپاره). د پام وړ لوړ شوي t-hCO GluN جینونو د جین اونټولوژي (GO) بډایه کولو تحلیل ترسره شو (د بینجامیني-هچبرګ اصلاح شوی P ارزښت له 0.05 څخه کم د t-hCO GluN حجرو لږترلږه 10٪ کې څرګند شوی او لږترلږه 2 ځله د بدلون زیاتوالی). د ToppGene Suite (https://toppgene.cchmc.org/)37 په کارولو سره ترسره شو. موږ د ToppFun ایپ د ډیفالټ پیرامیټرو سره کاروو او د GO-تشریح شوي هایپرجیومیټریک ازموینو څخه محاسبه شوي د بنجامیني-هوچبرګ اصلاح شوي P-ارزښتونو راپور ورکوو.
د snRNA-seq کلسترونو سره د لومړني واحد حجروي RNA-seq یا بالغ snRNA-seq19,20,21,22 د حوالې مطالعاتو څخه د تشریح شوي حجروي کلسترونو سره د مطابقت لپاره، موږ د جوړه شوي ډیټاسیټ ادغام طریقه پلي کړه. موږ په سیورات کې د SCTransform (v2) نورمال کولو کاري فلو کارولی ترڅو د ډیټاسیټ ترمنځ د کلستر اوورلیپس مدغم او پرتله کړو (د پورته ورته پیرامیټرو په کارولو سره). انفرادي ډیټاسیټونه په تصادفي ډول د محاسبې موثریت لپاره په هر اصلي کلستر کې تر 500 حجرو یا کورونو پورې فرعي سیټ شوي وو. د ورته طریقې په کارولو سره لکه څنګه چې مخکې تشریح شوي، د کلستر اوورلیپ د هر پول شوي کلستر کې د حجرو یا نیوکلی تناسب په توګه تعریف شوی و چې د حوالې کلستر لیبل سره اوورلیپ شوی. د GluNs نور طبقه بندي کولو لپاره، موږ د GluN سبسیټ ډیټا لپاره د سیورات د ټرانسفر ډیټا کاري فلو کارولی ترڅو زموږ GluN حجرو ته د حوالې ډیټاسیټ لیبلونه وټاکو.
د t-hCO او hCO نمونو د نړیوال ټرانسکرپټوم د پخېدو حالت ارزولو لپاره، موږ خپل جعلي-بلک نمونې د BrainSpan/psychENCODE23 سره پرتله کړې، کوم چې د انسان د دماغ پراختیا پراخه RNA ترتیب لري. موږ د تصور څخه 10 اونۍ وروسته او وروسته، په 5567 جینونو کې (زموږ د معلوماتو سره یوځای) د کورټیکل نمونو څخه د ګډ نمونې-نورمال شوي جین اظهار میټریکس باندې PCA ترسره کړ چې دمخه د BrainSpan کورټیکل نمونو کې فعال پیژندل شوي وو (د کیوبیک ماډل په کارولو سره د عمر لخوا تشریح شوي پراختیایی توپیر کې 50٪ څخه ډیر تعریف شوی) 38. سربیره پردې، موږ د غیر منفي میټریکس فکتوریزیشن په کارولو سره د عصبي پراختیا د لوی ټرانسکرپټوم لاسلیکونو سره تړلي جینونه ترلاسه کړل لکه څنګه چې مخکې تشریح شوي. د غیر منفي میټریکس فکتوریزیشن پروسې په کارولو سره محاسبه شوي نمونې وزنونه په شکل 5b کې د ژو او نورو لخوا تشریح شوي پنځه لاسلیکونو هر یو لپاره د پراخ شوي معلوماتو سره پلاټ شوي دي. 38. بیا، د فعالیت پورې تړلي ټرانسکرپشنل مارکرونه د مخکې خپاره شوي مطالعاتو څخه اخیستل شوي. په ځانګړې توګه، ERG او LRG د ګلوټامیټرجیک نیورونونو کې د پام وړ لوړ شوي وو چې د موږک بصري کورټیکس snRNA-seq ټولګې لخوا د ضمیمه جدول 3 Hrvatin et al.16 څخه د لید محرک وروسته پیژندل شوي. د انسان بډایه شوي LRGs د KCl فعال شوي انساني جنین دماغ کلتورونو څخه ترلاسه شوي او د محرک وروسته 6 ساعته راټول شوي، او فلټر شوي جینونه په انسانانو کې د پام وړ لوړ شوي وو مګر په موږکانو کې نه (ضمیمه جدول 4). د دې جین سیټونو په کارولو سره د جین سیټ بډایه کولو تحلیل د یو اړخیز فشر دقیق ازموینې په کارولو سره ترسره شو.
موږکان د ایزوفلورین سره بې هوشي کړئ، دماغونه لرې کړئ او په سړه (تقریبا 4 درجې سانتي ګراد) اکسیجن لرونکي (95٪ O2 او 5٪ CO2) سوکروز محلول کې د لاندې برخو لپاره ځای په ځای کړئ: 234 mM سوکروز، 11 mM ګلوکوز، 26 mM NaHCO3، 2.5 mM KCl، 1.25 mM. NaH2PO4، 10 mM MgSO4 او 0.5 mM CaCl2 (شاوخوا 310 mOsm). د موږکانو د دماغ د مرۍ برخې (300-400 µm) چې t-hCO3 لري د Leica VT1200 وایبراتوم په کارولو سره جوړ شوي لکه څنګه چې مخکې تشریح شوي 39. بیا برخې د خونې د تودوخې د اکسیجنیشن سره د برخې کولو خونې ته لیږدول شوې چې د aCSF سره د لاندې څخه چمتو شوي: 10 mM ګلوکوز، 26 mM NaHCO3، 2.5 mM KCl، 1.25 mM NaHPO4، 1 mM MgSO4، 2 mM CaCl2 او 126 mM NaCl (298 mOsm). لږترلږه د ثبت کولو څخه 45 دقیقې دمخه. برخې په یوه ډوب شوي خونې کې ثبت شوې چیرې چې دوی په دوامداره توګه د aCSF (95٪ O2 او 5٪ CO2 وایل) سره خوشبو شوي. ټول معلومات د خونې په حرارت کې ثبت شوي. t-hCO نیورونونه د بوروسیلیکیټ شیشې پایپټ سره پای ته ورسیدل چې د 127 mM پوټاشیم ګلوکونیټ، 8 mM NaCl، 4 mM مګنیزیم ATP، 0.3 mM سوډیم GTP، 10 mM HEPES، او 0.6 mM EGTA، pH 7.2، داخلي محلول سره ډک شوی و چې د KOH (290 mOsm) سره تنظیم شوی و. د رغیدو لپاره، بایوسایټین (0.2٪) د ثبت کولو محلول ته اضافه شو.
معلومات د ملټي کلیمپ ۷۰۰ بي امپلیفیر (مالیکولر وسایل) او ډیجیډاټا ۱۵۵۰ بي ډیجیټایزر (مالیکولر وسایل) په کارولو سره ترلاسه شوي، په ۲ کیلو هرټز کې ټیټ پاس فلټر شوی، په ۲۰ کیلو هرټز کې ډیجیټل شوی، او د کلیمپ فټ (مالیکولر وسایل)، اوریجن (اوریجن پرو). ۲۰۲۱ ب، اوریجن لیب) او دودیز MATLAB افعال (میتھ ورکس) په کارولو سره تحلیل شوي. د جنکشن پوټینشیل د JPCalc په کارولو سره محاسبه شوی او داخلې د -۱۴ mV محاسبه شوي ارزښت سره تنظیم شوي. عملیات IV د ۱۰-۲۵ pA مرحلو کې د اوسني ګامونو لړۍ لري، له -۲۵۰ څخه تر ۷۵۰ pA پورې.
لکه څنګه چې مخکې تشریح شوي، د hCO نیورونونو د پیچ-کلیمپ ثبتولو په جریان کې د تالاموس، سپینې مادې، او S1 افیرنټ په بریښنایی ډول د تالاموس کارټیکل سلائسونو کې هڅول شوي وو. په لنډه توګه، دماغ د 10 درجې زاویه کې د 3D چاپ کولو میز کې کیښودل شو، او د دماغ مخکینۍ برخه په 35 درجې زاویه کې پرې شوه. بیا دماغ د پرې شوي سطحې سره چپک شو او برخه یې ورکړل شوه، د تالاموس کارټیکل خپریدونکي محورونه یې وساتل. بایپولر ټنګسټن الکترودونه (0.5 MΩ) په دوهم مایکرو مینیپولټر کې نصب شوي او په ستراتیژیک ډول موقعیت لري ترڅو په هر حجره کې څلور سیمې هڅوي (داخلي کیپسول، سپینې مادې، S1 او hCO). د 0.03-0.1 Hz کې د 300 µA فازیک محرک وروسته سیناپټیک غبرګونونه ثبت کړئ.
د hChR2 څرګندونکي hCO نیورونونه په 480 nm کې فعال شول او د LED (Prizmatix) لخوا رامینځته شوي رڼا نبضونه د ×40 هدف (0.9 NA؛ اولمپس) له لارې پلي شول ترڅو حجرو ته نږدې د hChR2 څرګندونه ثبت کړي. د روښانه شوي ساحې قطر نږدې 0.5 ملي میتر دی او ټول ځواک 10-20 میګاواټه دی. د نبض عرض 10 ms ته ټاکل شوی و، کوم چې د چلند زده کړې تجربې په جریان کې ورکړل شوي نبض سره مطابقت لري. د 1 څخه تر 20 Hz پورې مختلف محرک فریکونسۍ کارول شوې، مګر یوازې د لړۍ لومړۍ نبض د مقدار کولو لپاره کارول شوې. د اورګاډو ترمنځ وقفې معمولا د 30 ثانیو څخه اوږدې وي ترڅو د سیناپټیک مخنیوي یا اسانتیا لارو باندې اغیزه کمه کړي. د دې لپاره چې ازموینه وکړو چې ایا د hChR2 غبرګون مونوسینپټیک و، موږ په حمام کې TTX (1 μM) پلي کړ تر هغه چې د EPSC غبرګون ورک شو، او بیا 4-aminopyridine (4-AP؛ 100 μM) پلي کړ. معمولا، ځواب په څو دقیقو کې بیرته راځي، د LED ډزو او EPSC تولید ترمنځ یو څه اوږد ځنډ سره. NBQX (10 μM) د دې ازموینې لپاره کارول شوی و چې ایا ځواب د AMPA ریسیپټرونو لخوا پرمخ وړل کیږي.
د hCO تیزې برخې لکه څنګه چې مخکې تشریح شوې وې رامینځته شوې. په لنډه توګه، د hCO برخې په 4٪ اګاروز کې ځای پرځای شوې او حجرو ته لیږدول شوې چې 126 mM NaCl، 2.5 mM KCl، 1.25 mM NaH2PO4، 1 mM MgSO4، 2 mM CaCl2، 26 mM NaHCO3 او 10 mM d-(+) -ګلوکوز لري. برخې د خونې په تودوخه کې د Leica VT1200 وایبرټر په کارولو سره په 200-300 µm کې پرې شوې او د خونې په تودوخه کې په ASF کې زیرمه شوې. بیا، د ټولو حجرو پیچ کیمپ ثبت کول د مستقیم سلائس سکوپ مایکروسکوپ (ساینټیفیکا) لاندې د hCO برخو کې ترسره شول. برخې د aCSF (95٪ O2 او 5٪ CO2) سره خوشبو شوې او د حجرو سیګنالونه د خونې په تودوخه کې ثبت شوي. د hCO نیورونونه د بوروسیلیکیټ شیشې پایپټ په کارولو سره پلي شوي چې د 127 mM پوټاشیم ګلوکونیټ، 8 mM NaCl، 4 mM مګنیزیم ATP، 0.3 mM سوډیم GTP، 10 mM HEPES، او 0.6 mM EGTA، داخلي pH 7، 2، د KOH (osmolarity 290) سره تنظیم شوي محلول څخه ډک شوي. د رغیدو موخو لپاره، داخلي محلول ته 0.2٪ بایوسایټین اضافه کړئ.
معلومات د کلیمپیکس (کلیمپیکس ۱۱.۱، مالیکولر وسایل) لخوا د ملټي کلیمپ ۷۰۰B امپلیفیر (مالیکولر وسایل) او ډیجیډاټا ۱۵۵۰B ډیجیټایزر (مالیکولر وسایل) په کارولو سره ترلاسه شوي، په ۲ kHz کې ټیټ پاس فلټر شوی، په ۲۰ kHz کې ډیجیټل شوی، او د تحلیل لپاره د کلیمپیټ (نسخه ۱۰.۶) په کارولو سره تحلیل شوی، مالیکولر وسایل) او دودیز MATLAB دندې (MATLAB ۲۰۱۹b، Mathworks). د جنکشن پوټینشیل د JPCalc په کارولو سره محاسبه شوی او داخلې د -۱۴ mV محاسبه شوي جنکشن پوټینشیل سره تنظیم شوي. عملیات IV د -۵۰ څخه تر ۲۵۰ pA پورې د ۵-۱۰ pA مرحلو کې د اوسني ګامونو لړۍ لري.
د پنچ شوي نیورونونو مورفولوژیکي بیارغونې لپاره، 0.2٪ بایوسایټین (سیګما-الډریچ) داخلي محلول ته اضافه شو. حجرې د هیک کولو وروسته لږترلږه 15 دقیقو لپاره پرائم کیږي. بیا پایپټ د 1-2 دقیقو لپاره ورو ورو راښکته کیږي تر هغه چې راجستر شوی غشا په بشپړ ډول مهر شي. د برخې فزیولوژي پروسې وروسته، برخې د شپې په 4 ° C کې په 4٪ PFA کې تنظیم شوې، د PBS X3 سره مینځل شوې، او د سټریپټاویډین-کنجوګیټډ ډای لایټ 549 یا ډای لایټ 405 (ویکٹر لابراتوار) سره 1:1000 حل شوې. د بایوسایټین (2٪؛ سیګما-الډریچ) سره ډک شوي حجرې د پیچ ​​کلیمپ ثبتولو پرمهال د خونې په حرارت کې د 2 ساعتونو لپاره لیبل شوي. برخې بیا د اکواوماؤنټ (ترمو ساینټیفیک) په کارولو سره په مایکروسکوپي سلایډونو کې نصب شوې او بله ورځ په لییکا TCS SP8 کنفوکال مایکروسکوپ کې د تیلو ډوبولو هدف په کارولو سره د شمیري اپرچر ×40 1.3، میګنیفیکیشن ×0.9–1.0، xy سره لیدل شوي. د نمونې اخیستلو کچه په هر مایکرون کې نږدې 7 پکسله ده. د 1 µm وقفې سره Z-سټیکونه په ترتیب سره ترلاسه شوي، او د Z-سټیک موزیکونه او د لییکا پر بنسټ اتوماتیک سټیچینګ د هر نیورون د ډینډریټیک ونې پوښلو لپاره ترسره شوي. بیا نیورونونه د neuTube 40 انٹرفیس په کارولو سره په نیمه لاسي ډول تعقیب شوي او د SWC فایلونه تولید شوي. بیا فایلونه SimpleNeuriteTracer41 فیجي پلگ ان ته اپلوډ شوي (ImageJ، نسخه 2.1.0؛ NIH).
د انسان د کورټیکل نسج د سټینفورډ پوهنتون د اداري بیاکتنې بورډ لخوا تصویب شوي پروتوکول سره سم د باخبره رضایت سره ترلاسه شو. د انسان د زیږون وروسته نسج دوه نمونې (۳ او ۱۸ کلنې) د فرنټل کورټیکس (منځني فرنټل ګیرس) د ری ایکشن له لارې د ری ایکشن مرۍ لپاره د جراحي برخې په توګه ترلاسه شوې. د ری ایکشن وروسته، نسج په یخ سړه NMDG-aCSF کې راټول کړئ چې پکې شامل دي: ۹۲ mM NMDG، ۲.۵ mM KCl، ۱.۲۵ mM NaH2PO4، ۳۰ mM NaHCO3، ۲۰ mM HEPES، ۲۵ mM ګلوکوز، ۲ mM تیوریا، ۵ mM سوډیم اسکوربیټ، ۳ mM سوډیم پیروویټ، ۰.۵ mM CaCl2 ۴H۲O او ۱۰ mM MgSO۴ ۷H۲O. د متمرکز هایدروکلوریک اسید سره pH ۷.۳-۷.۴ ته ټیټریټ کړئ. نسجونه د 30 دقیقو دننه لابراتوار ته وسپارل شول او د پورته تشریح شوي طرزالعمل سره سم د کورونال برخې واخیستل شوې.
د څارویو ټولې کړنلارې د سټینفورډ پوهنتون APLAC لخوا تصویب شوي څارویو پاملرنې لارښوونو سره سم ترسره شوې. موږکان (د ټرانسپلانټیشن وروسته له 140 ورځو څخه ډیر) د 5٪ ایزوفلورین انستیزیا سره هڅول شوي او د 1-3٪ ایزوفلورین سره په جراحي ډول بې هوښه شوي. څاروي په سټیریوټیکسیک چوکاټ (Kopf) کې ځای په ځای شوي او دوامداره خوشې شوي بوپرینورفین (SR) د فرعي برخې په توګه انجیکشن شوي. کوپړۍ ښکاره شوې، پاکه شوې او د 3-5 هډوکي پیچونه داخل شوي. د t-hCO په نښه کولو لپاره، موږ د MRI عکسونو څخه سټیریوټیکسیک همغږي تولید کړې. د علاقې په ځای کې د بور سوري ډرل شوی او فایبرونه (400 µm قطر، NA 0.48، Doric) د hCO سطحې څخه 100 µm لاندې ښکته شوي او د UV درملنې وړ غاښونو سیمنټ (Relyx) سره کوپړۍ ته خوندي شوي.
د فایبر فوټومیټریک ثبتونه لکه څنګه چې مخکې تشریح شوي ترسره شول 42. د ناڅاپي فعالیت ثبتولو لپاره، موږکان په یوه پاکه پنجره کې ځای پر ځای شول او د 400 µm قطر فایبر آپټیک پیچ کیبل (ډوریک) چې د فایبر آپټیک فوټومیټریک ډیټا ترلاسه کولو سیسټم سره وصل و د نصب شوي فایبر آپټیک کیبل سره وصل شو. د موټرو فعالیت د 10 دقیقو ثبتولو په جریان کې، څاروي د پنجرې سپړلو لپاره آزاد وو. د رامینځته شوي فعالیت ثبتولو لپاره، موږکان (د ټرانسپلانټیشن څخه 140 ورځو څخه ډیر وروسته) د انډکشن لپاره د 5٪ ایزوفلورین او د ساتنې لپاره 1-3٪ ایزوفلورین سره بې هوشي شوي وو. څاروی په سټیریوټیکیک چوکاټ (Kopf) کې ځای په ځای کړئ او د t-hCO مخالف اړخ کې ویښتان شاوخوا 2 سانتي مترو ته پرې کیږي او د پیزو الیکټریک ایکچویټر (PI) سره وصل شوي میش څخه تیریږي. د 400 µm فایبر آپټیک پیچ کیبل (ډوریک) د نصب شوي فایبر سره وصل شو او د معلوماتو ترلاسه کولو سیسټم سره وصل شو. د t-hCO په مخالف اړخ کې ویښتان بیا د 20 دقیقو ثبت کولو دورې په اوږدو کې د پیزو الیکټریک ډرایو لخوا په ناڅاپي وختونو کې 50 ځله (2 ملي میتر په 20 هرټز، په هر پریزنټیشن کې 2 ثانیې) انحراف شوي. د دودیز MATLAB کوډ سره د انحراف وخت کنټرولولو لپاره د Arduino MATLAB ملاتړ کڅوړه وکاروئ. پیښې د ټرانزیسټر-ټرانزیسټر منطق (TTL) نبضونو په کارولو سره د معلوماتو ترلاسه کولو سافټویر سره همغږي کیږي.
موږکان (د ټرانسپلانټیشن وروسته له ۱۴۰ ورځو څخه زیات) د ۵٪ ایزوفلورین انستیزیا سره هڅول شوي او د ۱-۳٪ ایزوفلورین سره د عملیاتو په جریان کې بې هوشي شوي. څاروي په سټیریوټیکسیک چوکاټ (Kopf) کې ځای په ځای شوي وو او بوپرینورفین SR او ډیکسامیتازون د پوستکي لاندې انجیکشن شوي وو. کوپړۍ ښکاره شوې، پاکه شوې او د هډوکو ۳-۵ پیچونه داخل شوي دي. د t-hCO په نښه کولو لپاره، موږ د MRI انځورونو څخه سټیریوټیکسیک همغږي تولید کړې. یو ګرد کرینیوټومي (تقریبا ۱ سانتي متره قطر) د لوړ سرعت ډرل سره په مستقیم ډول د ټرانسپلانټ شوي hCO په سر ترسره شو. یوځل چې هډوکي د امکان تر حده پتلی شي، مګر د ټول هډوکي له لارې د سوراخ کولو دمخه، د پاتې بشپړ شریان ډیسک لرې کولو لپاره فورسپس وکاروئ ترڅو لاندې t-hCO ښکاره شي. کرینیوټومي د جراثیمي مالګین سره ډکه شوې وه، او د پوښ سلیپ او یو ځانګړی سر پن د UV-درمل شوي غاښونو سیمنټ (ریلیکس) سره د کوپړۍ سره وصل شوی و.
د دوه فوټون امیجنگ د بروکر ملټي فوټون مایکروسکوپ په کارولو سره د نیکون LWD (×16, 0.8 NA) هدف سره ترسره شو. د GCaMP6 امیجنگ په 920 nm کې د 1.4x واحد z-plane میګنیفیکیشن او 8x اوسط 7.5 fps سره ترسره شو. موږکان د 5٪ isoflurane انستیزیا سره هڅول شوي او د 1-3٪ isoflurane سره ساتل شوي. موږکان په دودیز جوړ شوي سر فکسچر کې ځای په ځای شوي او د لینز لاندې ځای په ځای شوي. د موټرو فعالیت 3 دقیقې شالید ثبت ترلاسه شو. د ثبت کولو د 20 دقیقو په جریان کې، 50 پفونه (هر پریزنټیشن 100 ms اوږد) په ناڅاپي ډول د picospricer په کارولو سره د t-hCO مخالف ویسکر پیډ ته وسپارل شول. د دودیز MATLAB کوډ سره د برسټ وخت کنټرول لپاره د Arduino MATLAB ملاتړ کڅوړه وکاروئ. د TTL نبضونو په کارولو سره د معلوماتو ترلاسه کولو سافټویر (PrairieView 5.5) سره پیښې همغږي کړئ. د تحلیل لپاره، انځورونه د فیجي په MoCo پروګرام کې د افائن سمون په کارولو سره د xy حرکت لپاره سم شوي وو. د CNMF-E43 په کارولو سره د انفرادي حجرو څخه د فلوروسینټ نښو استخراج. فلوروسینس د هرې علاقې لپاره استخراج شو، dF/F منحنی ته بدل شو، او بیا د z-سکورونو ته بدل شو.
موږکان (د ټرانسپلانټیشن وروسته له ۱۴۰ ورځو څخه زیات) د ۵٪ ایزوفلورین انستیزیا سره هڅول شوي او د ۱-۳٪ ایزوفلورین سره د عملیاتو په جریان کې بې هوښه شوي. څاروي په سټیریوټیکسیک چوکاټ (Kopf) کې ځای په ځای شوي وو او بوپرینورفین SR او ډیکسامیتازون په فرعي ډول انجیکشن شوي وو. د t-hCO مخالف اړخ کې ویښتان شاوخوا ۲ سانتي متره پورې پرې شوي او د پیزو الیکټریک ایکچویټر سره وصل شوي میش له لارې تار شوي. کوپړۍ ښکاره شوې او پاکه شوې. د سټینلیس سټیل ځمکني سکرو د کوپړۍ سره وصل دی. د t-hCO په نښه کولو لپاره، موږ د MRI عکسونو څخه سټیریوټیکسیک همغږي تولید کړې. د t-hCO پورته د لوړ سرعت ډرل سره یو ګرد کرینیوټومی (تقریبا 1 سانتي متره قطر) ترسره کړئ. یوځل چې هډوکي د امکان تر حده پتلی وي، مګر د ټول هډوکي له لارې د سوراخ کولو دمخه، د پاتې سالم شروني ډیسک لرې کولو لپاره فورسپس وکاروئ ترڅو لاندې t-hCO ښکاره شي. انفرادي حجرې د 32-چینل یا 64-چینل لوړ کثافت سیلیکون پروبونو (کیمبرج نیوروټیک) په کارولو سره ثبت شوې چې د ځمکې سکرو ته ځمکه شوي او د RHD امپلیفیرونو (انتان) سره دمخه امپلیف شوي. د کرینیوټومي له لارې د هدف سایټ ته د الکترودونو ښکته کولو لپاره د مینیپلیټر څخه کار واخلئ، کوم چې د جراثیمي مالګین څخه ډک شوی. د معلوماتو راټولول د اوپن ایفیس ډیټا ترلاسه کولو سیسټم په کارولو سره د 30 kHz فریکونسۍ کې ترسره شو. ثبت یوازې هغه وخت دوام وکړ کله چې موږ په 10 څخه زیاتو چینلونو کې خورا اړونده تالیفیک ناڅاپي فعالیت وموند، وړاندیز کوي چې الکترودونه په ګرافټ کې موقعیت لري (د دوه فوټون کلسیم امیجنگ ډیټا پراساس). د موټرو فعالیت 10 دقیقې شالید ثبت کول ترلاسه شول. د t-hCO مخالف اړخ کې ویسکرز بیا د 20 دقیقو ثبت کولو مودې په اوږدو کې د پیزو الیکټریک ډرایو لخوا په ناڅاپي وختونو کې 50 ځله (2 ملي میتر په 20 هرټز، په هر پریزنټیشن کې 2 ثانیې) انحراف شوي. د Arduino لپاره د MATLAB ملاتړ کڅوړې (MATLAB 2019b) کارول، د دودیز MATLAB کوډ سره د انحراف وخت کنټرول کړئ. د معلوماتو ترلاسه کولو سافټویر سره د پیښو همغږي کولو لپاره د TTL نبضونه وکاروئ.
د نظري نښه کولو تجربو لپاره، د 200 µm آپټیکل پیچ کارډ (ډوریک) چې د 473 nm لیزر (Omicron) سره وصل و، د 200 µm آپټیکل فایبر سره وصل شو چې د کرینیوټومي په سر کې ځای پر ځای شوی و. له دې سمدلاسه مخکې، د جمپر ځواک 20 میګاواټه ته تنظیم کړئ. د کرینیوټومي له لارې د هدف ځای ته د الکترودونو د ښکته کولو لپاره د مینیپولټر څخه کار واخلئ، کوم چې د جراثیمي مالګین څخه ډک شوی. د ثبت په پیل کې، د رڼا لس نبضونه 473 nm (فریکونسي 2 Hz، د نبض موده 10 ms) خارج شوي. د عکس العمل حساس حجرات د هغو حجرو په توګه تعریف شوي چې په 70٪ یا ډیرو ازموینو کې د 10 ms رڼا دننه د سپیک غبرګون ښودلی.