Grazzi talli żort Nature.com. Qed tuża verżjoni tal-browser b'appoġġ limitat għas-CSS. Għall-aħjar esperjenza, nirrakkomandaw li tuża browser aġġornat (jew tiddiżattiva l-Modalità ta' Kompatibilità fl-Internet Explorer). Barra minn hekk, biex niżguraw appoġġ kontinwu, nuru s-sit mingħajr stili u JavaScript.
Juri karużell ta’ tliet slides f’daqqa. Uża l-buttuni Preċedenti u Li Jmiss biex timxi minn tliet slides kull darba, jew uża l-buttuni tas-slider fl-aħħar biex timxi minn tliet slides kull darba.
Organelli newrali li jiġbru lilhom infushom jirrappreżentaw pjattaforma in vitro promettenti għall-immudellar tal-iżvilupp u l-mard tal-bniedem. Madankollu, l-organojdi m'għandhomx il-konnettività li teżisti in vivo, li tillimita l-maturazzjoni u tipprevjeni l-integrazzjoni ma' ċirkwiti oħra li jikkontrollaw l-imġiba. Hawnhekk nuru li organojdi kortikali derivati minn ċelloli staminali umani trapjantati fil-kortiċi somatosensorjali ta' firien nudi tat-twelid jiżviluppaw tipi ta' ċelloli maturi li jintegraw f'ċirkwiti sensorji u relatati mal-motivazzjoni. L-MRI żvelat tkabbir ta' organojdi wara t-trapjant f'diversi linji ta' ċelloli staminali u annimali, filwaqt li analiżi b'qalba waħda żvelat progressjoni tal-kortikoġenesi u l-emerġenza ta' programm ta' traskrizzjoni dipendenti fuq l-attività. Tabilħaqq, in-newroni kortikali trapjantati juru proprjetajiet morfoloġiċi, sinaptiċi u tal-membrana interna aktar kumplessi mill-kontropartijiet in vitro tagħhom, li jippermettu l-iskoperta ta' difetti newronali f'pazjenti bis-sindromu ta' Timothy. It-traċċar anatomiku u funzjonali wera li l-organojdi trapjantati jirċievu inputs talamokortikali u kortikokortikali, u reġistrazzjonijiet in vivo tal-attività newrali jissuġġerixxu li dawn l-inputs jistgħu jiġġeneraw risponsi sensorji fiċ-ċelloli umani. Fl-aħħar nett, l-organojdi kortikali jestendu l-assoni fil-moħħ tal-firien, u l-attivazzjoni optoġenetika tagħhom twassal għal imġiba ta' tiftix ta' premju. Għalhekk, in-newroni tal-kortiċi umana trapjantati jimmaturaw u jipparteċipaw fiċ-ċirkwiti tal-ospitant li jikkontrollaw l-imġieba. Nistennew li dan l-approċċ jiffaċilita l-iskoperta ta' fenotipi fil-livell tal-ħjut f'ċelloli derivati mill-pazjent li ma jistgħux jiġu skoperti b'mezzi oħra.
L-iżvilupp tal-moħħ tal-bniedem huwa proċess notevoli ta' awto-organizzazzjoni fejn iċ-ċelloli jipproliferaw, jiddifferenzjaw, jemigraw, u jikkonnettjaw biex jiffurmaw ċirkwiti newronali funzjonali li jiġu rfinuti aktar permezz tal-esperjenza sensorja. Problema ewlenija fil-fehim tal-iżvilupp tal-moħħ tal-bniedem, speċjalment fil-kuntest tal-mard, hija n-nuqqas ta' aċċess għat-tessut tal-moħħ. Organelli awto-organizzati, inklużi organojdi tal-kortiċi umana (hCO; magħrufa wkoll bħala l-isfera tal-kortiċi umana), jistgħu jiġġeneraw 2,3,4,5,6. Madankollu, diversi limitazzjonijiet jillimitaw l-applikazzjoni usa' tagħhom għall-fehim tal-iżvilupp u l-funzjonament taċ-ċirkwiti newrali. B'mod partikolari, mhux ċar jekk il-maturazzjoni tal-hCO hijiex limitata min-nuqqas ta' ċerti inputs mikroambjentali u sensorji preżenti in vivo. Barra minn hekk, minħabba li l-hCOs mhumiex integrati f'ċirkwiti li jistgħu jiġġeneraw riżultati ta' mġiba, l-utilità tagħhom fil-mudellar ta' disturbi newropsikjatriċi ġenetikament kumplessi u ta' mġiba bħalissa hija limitata.
It-trapjant ta' hCO f'moħħ ħaj intatt jista' jegħleb dawn il-limitazzjonijiet. Studji preċedenti wrew li n-newroni umani trapjantati fil-kortiċi tal-ġrieden huma kapaċi jgħixu, jipproġettaw, u jikkomunikaw maċ-ċelloli tal-ġrieden7,8,9,10,11,12. Madankollu, dawn l-esperimenti ġeneralment isiru fuq annimali adulti, li jistgħu jillimitaw l-integrazzjoni sinaptika u assonali. Hawnhekk, niddeskrivu paradigma ta' trapjant fejn trapjantajna 3D hCO derivat minn ċelloli hiPS fil-kortiċi somatosensorjali primarja (S1) ta' firien immunodefiċjenti fi stadju bikri tal-iżvilupp tal-plastik. In-newroni hCO (t-hCO) trapjantati jgħaddu minn maturazzjoni sostanzjali, jirċievu inputs talamokortikali u kortikali-kortikali li jqanqlu risponsi sensorji, u jestendu projezzjonijiet assonali fil-moħħ tal-firien biex imexxu mġiba ta' tiftix ta' premju. Maturazzjoni estiża ta' t-hCO żvelat difetti newronali f'pazjenti bis-sindromu ta' Timothy (TS), disturb ġenetiku sever ikkawżat minn mutazzjonijiet fil-kanal tal-kalċju CaV1.2 tat-tip L sensittiv għall-vultaġġ (kodifikat minn CACNA1C).
Biex nistudjaw in-newroni kortikali umani f'ċirkwiti in vivo, trapjantajna b'mod stereotattiku 3D hCO intatt f'S1 ta' firien atimiċi postnatali bikrija (jiem 3-7 wara t-twelid) (Fig. 1a u dejta estiża ta' Fig. 1a-c). F'dan il-punt, il-projezzjonijiet assonali talamokortikali u kortikokortikali għadhom ma lestewx l-innervazzjoni S1 tagħhom (ref. 13). Għalhekk, dan l-approċċ huwa mfassal biex jimmassimizza l-integrazzjoni tat-t-hCO filwaqt li jimminimizza l-impatt fuq iċ-ċirkwiti endoġeni. Biex nivviżwalizzaw il-post tat-t-hCO f'annimali ħajjin, wettaqna rikostruzzjonijiet tal-moħħ tal-MRI ppeżati bit-T2 tal-firien 2-3 xhur wara t-trapjant (Fig. 1b u dejta estiża, Fig. 1d). t-hCO ġew osservati faċilment u l-kejl tal-volum ta' t-hCO kienu simili għal dawk ikkalkulati minn flieli fissi (Data Estiża Fig. 1d,e; P > 0.05). t-hCO ġew osservati faċilment u l-kejl tal-volum ta' t-hCO kienu simili għal dawk ikkalkulati minn flieli fissi (Data Estiża Fig. 1d,e; P > 0.05). t-hCO легко наблюдались, а объемные измерения t-hCO были аналогичны рассчитанным длеро фиксины фиксины (расширенные данные, рис. 1d, e; P> 0,05). t-hCO2 ġew osservati faċilment, u l-kejl volumetriku ta' t-hCO2 kien simili għal dak ikkalkulat għal sezzjonijiet fissi (dejta estiża, Fig. 1d, e; P > 0.05).很容易观察到t-hCO，并且t-hCO的体积测量值与从固定切片计算的测量值相似（扩展数据图1d、e；P > 0.05）很容易观察到t-hCO，并且t-hCO t-hCO легко наблюдался, а объемные измерения t-hCO были аналогичны рассчитанным для фиксрнызово (расширенные данные, рис. 1d, e; P> 0,05). It-t-hCO2 ġie osservat faċilment, u l-kejl volumetriku tat-t-hCO2 kien simili għal dak ikkalkulat għal sezzjonijiet fissi (dejta estiża, Fig. 1d, e; P > 0.05).Iddeterminajna t-hCO f'81% tal-annimali trapjantati madwar xahrejn wara t-trapjant (n = 72 annimal; hCO minn 10 linji ta' ċelluli hiPS; linji ta' ċelluli hiPS fit-Tabella Supplimentari 1). Minn dawn, 87% kienu jinsabu fil-kortiċi ċerebrali (Fig. 1c). Billi wettaqna skens MRI serjali f'diversi punti ta' żmien fl-istess far trapjantat, sibna żieda ta' disa' darbiet fil-volum ta' t-hCO fi żmien 3 xhur (Fig. 1d u dejta estiża, Fig. 1f). L-annimali trapjantati kellhom rata għolja ta' sopravivenza (74%) 12-il xahar wara t-trapjant (dejta estiża, Fig. 1g u Tabella Supplimentari 2), u ma nstabu l-ebda indebolimenti evidenti tal-mutur jew tal-memorja, glijożi, jew elettroenċefalogramma (EEG). Dejta Fig. 1g u tabella supplimentari 2). 1h–m u 3e).
a, Skematika tad-disinn sperimentali. hCO derivat minn ċelluli hiPS ġie trapjantat f'S1 ta' firien nudi tat-twelid fil-jiem 30-60 ta' differenzjazzjoni. b, Immaġni MRI koronali u orizzontali ppeżati bit-T2 li juru t-hCO f'S1 xahrejn wara t-trapjant. Skala tal-bar, 2 mm. ċ, Kwantifikazzjoni tar-rati ta' suċċess tat-tilqim murija għal kull linja ta' ċelluli hiPS (n = 108, in-numri fil-bars jindikaw l-ammont ta' t-hCO għal kull linja ta' ċelluli hIPS) u l-post kortikali jew subkortikali (n = 88). d, Immaġni MRI ta' arterja koronarja (xellug; skala tal-bar, 3 mm) u rikostruzzjoni volumetrika 3D korrispondenti (skala tal-bar, 3 mm) li turi żieda fit-t-hCO fuq 3 xhur. e, Reviżjoni tax-xejriet tat-t-hCO fil-kortiċi ċerebrali tal-firien. Skala tal-bar, 1 mm. f, Immaġni immunoċitokimiċi rappreżentattivi ta' t-hCO murija minn fuq ix-xellug għal-lemin (matul id-differenzjazzjoni): PPP1R17 (4 xhur), NeuN (8 xhur), SOX9 u GFAP (8 xhur), PDGFRα; (8 xhur), MAP2 (8 xhur) u IBA1 (8 xhur). Skala, 20 µm. Il-ko-espressjoni ta' HNA tindika ċelloli ta' oriġini umana. g, snRNA-seq: Immaġni ta' tnaqqis tad-dimensjonalità tal-manifold unifikat u l-projezzjoni (UMAP) tan-nuklei kollha ta' t-hCO ta' kwalità għolja wara l-integrazzjoni ta' Seurat (n=3 kampjuni ta' t-hCO, n=2 linji ta' ċelloli hiPS). Astroċiti, ċelloli tal-linja ta' astroċiti; cyc prog, proġenituri li jiċċirkolaw; GluN DL, newroni glutamaterġiċi profondi; GluN DL/SP, newroni glutamaterġiċi profondi u sublamellari; GluN UL, newroni glutamaterġiċi tas-saff ta' fuq; oligodendroċiti, oligodendroċiti; OPC, ċelluli progenituri tal-oligodendroċiti; RELN, newroni tar-reelin. h, Analiżi tal-arrikkiment tat-terminu tal-Ontoloġija tal-Ġeni (GO) tal-ġeni li żdiedu b'mod sinifikanti (P aġġustat < 0.05, bidla fil-ħin > 2, espressa f'mill-inqas 10% tan-nuklei) fin-newroni glutamaterġiċi t-hCO meta mqabbla man-newroni glutamaterġiċi hCO. h, Analiżi tal-arrikkiment tat-terminu tal-Ontoloġija tal-Ġeni (GO) tal-ġeni li żdiedu b'mod sinifikanti (P aġġustat < 0.05, bidla fil-ħin > 2, espressa f'mill-inqas 10% tan-nuklei) fin-newroni glutamaterġiċi t-hCO meta mqabbla man-newroni glutamaterġiċi hCO. h, Анализ обогащения терминов Gene Ontology (GO) для генов со значительной активацией (скоррективацией (скоррективацией) изменения > 2, экспрессия по крайней мере в 10% ядер) в глутаматергических нейронах t-hCO по снира глутаматергическими нейронами hCO. h, Analiżi tal-arrikkiment tat-terminu tal-Ontoloġija tal-Ġeni (GO) għal ġeni b'attivazzjoni sinifikanti (P<0.05 aġġustat, bidla fil-ħin >2, espressjoni f'mill-inqas 10% tan-nuklei) f'newroni glutamaterġiċi t-hCO meta mqabbla ma' newroni glutamaterġiċi hCO. h，与hCO 谷氨酸能神经元相比，t-hCO 谷氨酸能神经元中基因显着上调（谎P整0.05，倍数变化> 2，在至少10% 的细胞核中表达）的基因本体论(GO) 术语富核中表达）的基因本体论(GO) 术语富核中表达） h ， 与 hco 谷氨酸 能 元 相比 ， t-hco 谷氨酸 能 神经 元 基因 显着 上调 ０ 后 （ ， ， ， ， ，变化 变化> 2 ， 至少 10% 的 核中 表达） 基因 基因 基因 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的的 的 的 的本体论(GO) 术语富集分析。 h, гены значительно активизировались (скорректированный P <0,05, кратность изменения> 2, эсрусспия крайней мере в 10% ядер) в глутаматергических нейронах t-hCO по сравнению с глутаматергиомна нескических Онтологический (GO) анализ термина обогащения. h, il-ġeni kienu regolati 'l fuq b'mod sinifikanti (P aġġustat < 0.05, bidla ta' drabi > 2, espressi f'mill-inqas 10% tan-nuklei) fin-newroni glutamaterġiċi t-hCO meta mqabbla man-newroni glutamaterġiċi hCO Analiżi Ontoloġika (GO) tat-terminu ta' arrikkiment.Il-linja bit-tikek tindika valur aq ta' 0.05. i, immaġini UMAP tat-tipi ta' ċelluli GluN f't-hCO bl-użu ta' trasferiment ta' tikketta minn sett ta' dejta ta' referenza ta' 22 snRNA-seq tal-kortiċi motorja adulta. CT — ċelluli kortikotalamiċi, ET — ċelluli extraċerebrali, IT — ċelluli telencefaliċi interni, NP — projezzjoni viċina.
Imbagħad ivvalutajna ċ-ċitoarkitettura u l-kompożizzjoni ċellulari ġenerali tat-t-hCO. It-tbajja' bl-antikorpi taċ-ċelloli endoteljali tal-firien żvelat vaskularizzazzjoni bit-t-hCO, filwaqt li t-tbajja' bl-IBA1 żvelat il-preżenza ta' mikroglija tal-firien fit-tilqima kollha (Fig. 1f u dejta estiża, Fig. 3c,d). L-immuno-tbajja' żvelat ċelloli pożittivi għall-antiġen nukleari uman (HNA) li jesprimu flimkien PPP1R17 (proġenituri kortikali), NeuN (newroni), SOX9 u GFAP (ċelloli derivati mill-gliji) jew PDGFRα (proġenituri tal-oligodendroċiti) (Figura 1f). Biex nistudjaw il-kompożizzjoni ċellulari tat-t-hCO b'riżoluzzjoni ta' ċellula waħda, wettaqna sekwenzar tal-RNA b'qalba waħda (snRNA-seq) wara madwar 8 xhur ta' differenzjazzjoni. Il-filtrazzjoni bl-ingrossa u t-tneħħija tan-nuklei tal-firien taw 21,500 mappa mononukleari umana ta' kwalità għolja (Fig. 1g u dejta estiża, Fig. 4a,b). Mudelli ta' espressjoni ta' markaturi tipiċi tat-tip ta' ċelluli identifikaw gruppi ta' klassijiet ewlenin ta' ċelluli kortikali, inklużi newroni glutamaterġiċi profondi u superfiċjali, proġenituri li jiċċirkolaw, oligodendroċiti, u nisel ta' astroċiti (Fig. 1g, dejta estiża, Fig. 4c, u Tabella Supplimentari 3). Immunokolorazzjoni għal SATB2 u CTIP2 wriet li minkejja l-preżenza ta' sottotipi kortikali, t-hCO ma weriex stratifikazzjoni anatomika ċara (dejta estiża, Fig. 3a). snRNA-seq hCO imqabbla fl-istadju pproduċiet klassijiet ta' ċelluli ġeneralment simili, bi ftit eċċezzjonijiet, inkluża n-nuqqas ta' oligodendroċiti u l-preżenza ta' newroni GABAerġiċi, li jistgħu jirriflettu l-kundizzjonijiet in vitro favorevoli rrappurtati qabel għal ċelluli proġenituri laterali15 (dejta estiża, Fig. 4f – i u Tabella Supplimentari 4). Analiżi differenzjali tal-espressjoni tal-ġeni żvelat differenzi sinifikanti fin-newroni glutamaterġiċi bejn t-hCO u hCO (Tabella Supplimentari 5), inkluża l-attivazzjoni ta' settijiet ta' ġeni assoċjati mal-maturazzjoni newronali bħas-sinjalar sinaptiku, il-lokalizzazzjoni dendritika, u l-attività tal-kanali b'vultaġġ attiv (Figura 1h u Tabella Supplimentari 5). Għaldaqstant, in-newroni glutamaterġiċi kortikali t-hCO wrew maturazzjoni traskrizzjonali aċċellerata.
Biex niċċaraw jekk dawn il-bidliet traskrizzjonali fit-t-hCO kinux relatati ma' differenzi morfoloġiċi bejn l-hCO in vitro u t-hCO in vivo, irrikostrujna hCO u hCO mimlija bil-bijoċitina mqabbla fl-istadju f'sezzjonijiet akuti wara 7–8 xhur ta' differenzjazzjoni. Newroni tal-hCO (Fig. 2a). In-newroni tat-t-hCO kienu sinifikament akbar, kellhom 1.5 darbiet id-dijametru tas-soma, id-doppju tad-dendriti, u żieda ġenerali ta' sitt darbiet fit-tul dendritiku totali meta mqabbel mal-hCO in vitro (Fig. 2b). Barra minn hekk, osservajna densità sinifikament ogħla ta' spini dendritiċi fin-newroni tat-t-hCO milli fin-newroni tal-hCO (Fig. 2c). Dan jissuġġerixxi li n-newroni tat-t-hCO jgħaddu minn titwil u fergħat dendritiċi estensivi, li, flimkien ma' proliferazzjoni kontinwa taċ-ċelluli, jistgħu jikkontribwixxu għat-tkabbir intensiv tat-t-hCO wara t-trapjant (Fig. 1d u Dejta Estiża Fig. 1f). Dan wassalna biex ninvestigaw il-proprjetajiet elettrofiżjoloġiċi. Il-kapaċitanza tal-membrana kienet tmien darbiet ogħla (dejta estiża, Fig. 8d), il-potenzjal tal-membrana fl-istat ta' mistrieħ kien aktar iperpolarizzat (madwar 20 mV), u l-injezzjoni tal-kurrent wasslet għal rata massima ta' eċċitazzjoni ogħla fin-newroni t-hCO milli fin-newroni hCO. in vitro (Fig. 2d), e), li hija konsistenti mal-karatteristiċi morfoloġiċi akbar u aktar kumplessi ta' t-hCO. Barra minn hekk, il-frekwenza ta' avvenimenti ta' kurrent postsinaptiku eċċitatorju spontanju (EPSC) kienet sinifikament ogħla fin-newroni t-hCO (Fig. 2f), li tissuġġerixxi li d-densità miżjuda ta' spini dendritiċi osservata fin-newroni t-hCO kienet assoċjata ma' eċċitabilità funzjonali. sinapsi sesswali. Aħna kkonfermajna l-karattru immatur tan-newroni hCO in vitro billi rreġistrajna newroni glutamaterġiċi ttikkettjati (dejta estiża, Fig. 6a-c).
a, Rikostruzzjoni 3D ta' newroni hCO u t-hCO mimlija bil-bijoċitina wara 8 xhur ta' differenzjazzjoni. b, Kwantifikazzjoni tal-karatteristiċi morfoloġiċi (n = 8 newroni hCO, n = 6 newroni t-hCO; **P = 0.0084, *P = 0.0179 u ***P < 0.0001). b, Kwantifikazzjoni tal-karatteristiċi morfoloġiċi (n = 8 newroni hCO, n = 6 newroni t-hCO; **P = 0.0084, *P = 0.0179 u ***P < 0.0001). б, количественная оценка морфологических признаков (n = 8 нейронов hCO, n = 6 нейронка морфологических признаков) *** P <0,0001). b, kwantifikazzjoni tal-karatteristiċi morfoloġiċi (n=8 newroni hCO, n=6 newroni t-hCO; **P=0.0084, *P=0.0179, u ***P<0.0001). b，形态学特征的量化（n = 8 个hCO 神经元，n = 6 个t-hCO 神经元；**P = 0.0084，*P = 90 帪t-hCO 神经元；**P = 0.0084，*P = 90 形态学特征的量化0.0001）。 b，形态学特征的量化（n = 8 个hCO 神经元，n = 6 个t-hCO 神经元；**P = 0.0084，*P = 90 帪t-hCO 神经元；**P = 0.0084，*P = 90 形态学特征的量化0.0001）。 б, количественная оценка морфологических признаков (n = 8 нейронов hCO, n = 6 нейронка морфологических признаков) *** P <0,0001). b, kwantifikazzjoni tal-karatteristiċi morfoloġiċi (n=8 newroni hCO, n=6 newroni t-hCO; **P=0.0084, *P=0.0179, u ***P<0.0001).ċ, Rikostruzzjoni 3D tal-fergħat dendritiċi tal-hCO u t-hCO wara 8 xhur ta' differenzjazzjoni. Asterisks ħomor jindikaw spini dendritiċi putattivi. Kwantifikazzjoni tad-densità tas-sinsla dendritika (n = 8 newroni hCO, n = 6 newroni t-hCO; **P = 0.0092). d, Kwantifikazzjoni tal-potenzjal tal-membrana waqt il-mistrieħ (n = 25 newron hCO3, n = 16-il newron t-hCO3; ***P < 0.0001). d, Kwantifikazzjoni tal-potenzjal tal-membrana waqt il-mistrieħ (n = 25 newron hCO3, n = 16-il newron t-hCO3; ***P < 0.0001). d, количественная оценка мембранного потенциала покоя (n = 25 нейронов hCO, n = 16 нейронов t-hCO; 00 *** P). d, kwantifikazzjoni tal-potenzjal tal-membrana waqt il-mistrieħ (n = 25 newron hCO3, n = 16-il newron t-hCO3; ***P < 0.0001). d，静息膜电位的量化（n = 25 hCO 神经元，n = 16 t-hCO 神经元；***P < 0.0001）。 d，静息膜电位的量化（n = 25 hCO 神经元，n = 16 t-hCO 神经元；***P < 0.0001）。 d, количественная оценка мембранного потенциала покоя (n = 25 нейронов hCO, n = 16 нейронов t-hCO; 00 *** P). d, kwantifikazzjoni tal-potenzjal tal-membrana waqt il-mistrieħ (n = 25 newron hCO3, n = 16-il newron t-hCO3; ***P < 0.0001). e, Potenzjal ta' azzjoni ripetittiva li jispara f'hCO u t-hCO indott minn injezzjonijiet ta' kurrent li jiżdiedu, u kwantifikazzjoni tar-rata massima ta' sparar (n = 25 newron hCO, n = 16-il newron t-hCO; ***P < 0.0001). e, Potenzjal ta' azzjoni ripetittiva li jispara f'hCO u t-hCO indott minn injezzjonijiet ta' kurrent li jiżdiedu, u kwantifikazzjoni tar-rata massima ta' sparar (n = 25 newron hCO, n = 16-il newron t-hCO; ***P < 0.0001). e, повторное возбуждение потенциала действия в hCO и t-hCO, вызванное увеличением тока, и количением тока, и консанкаволич максимальной скорости возбуждения (n = 25 нейронов hCO, n = 16 нейронов t-hCO; *** P <0,0001). e, potenzjal ta' azzjoni li jerġa' jispara f'hCO u t-hCO ikkawżat minn żieda fil-kurrent u kwantifikazzjoni tar-rata massima ta' sparar (n = 25 newron hCO, n = 16-il newron t-hCO; *** P < 0.0001). e，通过增加电流注入诱导的hCO 和t-hCO 重复动作电位放电，以及最大放电率率率动作电位放电，以及最大放电率率甄5个hCO 神经元，n = 16 个t-hCO 神经元；***P < 0.0001）。 E ， 通过 增加 电流 注入 的 的 hco 和 t-hco 重复 电位 放电 ， 以及 最 大 及 （ （ （ 2 大个 hco 神经 ， n = 16 个 t-hco 神经 ； *** p <0.0001） 。 e, повторяющееся возбуждение потенциала действия hCO и t-hCO, вызванное увеличением подакач, и и количественная оценка максимальной скорости возбуждения (n = 25 нейронов hCO, n = 16 нейронов hCO, n = 16 нейронов t-10,00в ***0
Abbażi tal-attività miżjuda ta' t-hCO osservata fi flieli ex vivo, snRNA-seq żvela żieda dipendenti fuq l-attività tat-traskrizzjonijiet tal-ġeni f't-hCO meta mqabbla ma' hCO in vitro. In-newroni glutamaterġiċi tat-t-hCO esprimew livelli ogħla ta' ġeni li jirregolaw l-attività ta' rispons tard (Fig. 2g,h), li nstabu fi studji preċedenti fin-newroni tal-ġrieden u tal-bnedmin16,17. Pereżempju, BDNF18, SCG2, u OSTN, ġene li jirregola l-attività speċifiku għall-primati, urew espressjoni miżjuda fin-newroni tat-t-hCO meta mqabbla man-newroni tal-hCO (Fig. 2g-i). Għalhekk, in-newroni tat-t-hCO wrew karatteristiċi ta' maturazzjoni mtejba meta mqabbla man-newroni tal-hCO permezz ta' analiżijiet traskrizzjonali, morfoloġiċi, u funzjonali.
Biex nevalwaw aktar l-assoċjazzjoni tal-maturazzjoni tat-t-hCO mal-iżvilupp tal-moħħ tal-bniedem, wettaqna paraguni traskrittomiċi tat-tipi ta' ċelluli kortikali tal-fetu u tal-adulti19,20 u tal-adulti21,22 kif ukoll dejta estensiva dwar l-espressjoni tal-ġeni kortikali23 matul l-iżvilupp (dejta estiża, Fig. 5). ). ma' xogħol preċedenti24, l-istatus globali tal-maturazzjoni tat-traskrittoma tal-hCO u t-hCO f'7–8 xhur ta' differenzjazzjoni huwa ġeneralment konsistenti maż-żmien tal-iżvilupp in vivo u huwa l-aktar ekwivalenti għall-aħħar ħajja tal-fetu (Dejta Estiża Fig. 5a). Notevolment, osservajna maturità akbar tat-traskrittoma fit-t-hCO meta mqabbla ma' hCO tal-istess età, kif ukoll attivazzjoni tat-traskrittoma assoċjata mas-sinaptoġenesi, l-astroġenesi, u l-mijelinazzjoni (dejta estiża, Fig. 5b-d). Fil-livell ċellulari, sibna evidenza ta' sottotip ta' kortiċi irqaq fit-t-hCO, bi gruppi ta' newroni glutamaterġiċi li jikkoinċidu mas-sottotipi ta' newroni adulti L2/3, L5, u L6 (Figura 1i). B'kuntrast, is-sovrappożizzjoni ta' gruppi bejn in-newroni glutamaterġiċi t-hCO u n-newroni kortikali tal-fetu kienet aktar limitata f'nofs it-tqala (dejta estiża, Figura 5e-j). Biex niddeterminaw jekk in-newroni t-hCO humiex funzjonalment simili għan-newroni neokortikali wara t-twelid tal-bniedem, wettaqna reġistrazzjonijiet elettrofiżjoloġiċi u rikostruzzjonijiet anatomiċi tan-newroni piramidali L2/3 tal-bniedem f'sezzjonijiet preċiżi tal-kortiċi wara t-twelid tal-bniedem (dejta estiża, Fig. 7a). Il-proprjetajiet elettrofiżjoloġiċi tan-newroni piramidali L2/3 kienu simili għal dawk tan-newroni piramidali t-hCO (dejta estiża, Fig. 7e). Morfoloġikament, in-newroni L2/3 minn kampjuni umani wara t-twelid kienu aktar simili għal t-hCO milli għal hCO, għalkemm iċ-ċelloli L2/3 kienu itwal, kien fihom aktar fergħat b'mod ġenerali, u kellhom densità ogħla tas-sinsla tad-dahar (Fig. 3g u dejta estiża, Fig. 7b-). G).
a, trapjant ta' hCO prodott minn linji ta' ċelluli ta' kontroll u TS hiPS f'firien tat-twelid. b, rikostruzzjoni 3D ta' newroni t-hCO mimlija bil-bijoċitina wara 8 xhur ta' differenzjazzjoni. ċ, kwantifikazzjoni tat-tul dendritiku medju (n = 19-il newron ta' kontroll, n = 21 newron TS; **P = 0.0041). d, fergħat dendritiċi rikostruwiti 3D minn kontroll u TS t-hCO fi 8 xhur ta' differenzjazzjoni, u kwantifikazzjoni tad-densità tas-sinsla dendritika (n = 16-il newron ta' kontroll, n = 21 newron TS, ***P < 0.0001). d, fergħat dendritiċi rikostruwiti 3D minn kontroll u TS t-hCO fi 8 xhur ta' differenzjazzjoni, u kwantifikazzjoni tad-densità tas-sinsla dendritika (n = 16-il newron ta' kontroll, n = 21 newron TS, ***P < 0.0001). d, 3D-реконструкция дендритных ветвей из контроля и TS t-hCO через 8 месяцев диффференцев дифференциро вслинцировковко оценка плотности дендритных шипов (n = 16 контрольных нейронов, n = 21 TS нейронов, *** P <0,0001). d, rikostruzzjoni 3D ta' fergħat dendritiċi minn kontroll u t-hCO TS fi 8 xhur ta' differenzjazzjoni u kwantifikazzjoni tad-densità tas-sinsla dendritika (n=16-il newron ta' kontroll, n=21 newron TS, ***P<0.0001). d，分化8 个月时对照和TS t-hCO 的3D 重建树突分支，以及树突棘密度的量化（n 16个对照神经元，n = 21 个TS 神经元，***P < 0.0001）。 d ， 分化 8 个 时 对照 和 ts t-hco 的 3d 重建 分支 分支 以及 树突棘 密度 密度 重建 n神经 元 ， n = 21 个 ts 神经 ， *** p <0.0001 ）。 d, 3D-реконструкция дендритных ветвей контроля и TS t-hCO через 8 месяцев дифференцирововей контроля и ировески через оценка плотности дендритных шипов (n = 16 контрольных нейронов, n = 21 TS нейронов, *** P <0,0001). d, rikostruzzjoni 3D tal-fergħat dendritiċi ta' kontroll u TS t-hCO2 fi 8 xhur ta' differenzjazzjoni u kwantifikazzjoni tad-densità tas-sinsla dendritika (n=16-il newron ta' kontroll, n=21 newron TS, ***P<0.0001).L-asteriski ħomor jindikaw spini dendritiċi putattivi. e, EPSCs spontanei fin-newroni ta' kontroll u TS t-hCO wara 8 xhur ta' differenzjazzjoni. f, plott tal-frekwenza kumulattiva u kwantifikazzjoni tal-frekwenza u l-amplitudni tal-avvenimenti sinaptiċi (n=32 newron ta' kontroll, n=26 newron TS; **P=0.0076 u P=0.8102). g, Analiżi Scholl tan-newroni TS u ta' kontroll f'hCO u t-hCO. Linji mqattgħin juru newroni piramidali postnatali umani L2/3 għal paragun (n = 24 newron ta' kontroll t-hCO, n = 21 newron TS t-hCO, n = 8 newroni ta' kontroll hCO, u n = 7 newron TS hCO). Id-dejta hija espressa bħala l-medja ± devjazzjoni standard.
Il-kapaċità tat-t-hCO li jirreplika l-karatteristiċi morfoloġiċi u funzjonali tan-newroni tal-kortiċi umani f'livell għoli wasslitna biex nesploraw jekk it-t-hCO jistax jintuża biex jinstabu fenotipi tal-mard. Iffokajna fuq it-TS, disturb newroloġiku sever tal-iżvilupp ikkawżat minn mutazzjonijiet ta' żieda fil-funzjoni fil-ġene li jikkodifika CaV1.2, li jibda t-traskrizzjoni tal-ġeni dipendenti fuq l-attività fin-newroni. Ksibna hCO minn tliet pazjenti bit-TS li jġorru l-aktar sostituzzjoni komuni (p.G406R) u tliet kontrolli (Fig. 3a). Wara t-trapjant, sibna li l-morfoloġija dendritika kienet mibdula fin-newroni tat-TS meta mqabbla mal-kontrolli (Fig. 3b u dejta estiża, Fig. 8a,b), b'żieda doppja fin-numru ta' dendriti primarji u żieda ġenerali fil-medja u tnaqqis ġenerali fit-tul dendritiku (Fig. 3c u dejta estiża, Fig. 8c). Dan kien assoċjat ma' densità akbar ta' spini u frekwenza akbar ta' EPSCs spontanei fit-TS meta mqabbla man-newroni tal-kontroll (Fig. 3d–f u dejta estiża, Fig. 8g). Analiżi ulterjuri żvelat mudelli ta' fergħat dendritiċi anormali f't-hCO TS meta mqabbla mal-kontrolli, iżda mhux f'TS hCO in vitro fi stadju simili ta' differenzjazzjoni (Fig. 3g). Dan huwa konsistenti mar-rapporti preċedenti tagħna ta' tnaqqis dendritiku dipendenti fuq l-attività f'TS u jenfasizza l-abbiltà ta' din il-pjattaforma tat-trapjant li tiskopri fenotipi tal-mard in vivo.
Imbagħad staqsejna sa liema punt iċ-ċelloli t-hCO huma funzjonalment integrati fil-firien S1. S1 fil-ġrieden jirċievi inputs sinaptiċi qawwija min-nuklei bażali ventrali ipsilaterali u talamiċi posterjuri, kif ukoll mill-kortiċi somatosensorjali motorji u sekondarji ipsilaterali, u S1 kontralaterali (Fig. 4a). Biex nirrestawraw il-mudell ta' innervazzjoni, infettajna hCO bil-virus tar-rabbja-dG-GFP/AAV-G u trapjantajna hCO fil-firien S1 3 ijiem wara. Osservajna espressjoni densa ta' GFP fin-newroni tal-gangli bażali ventrali S1 ipsilaterali u 7–14-il jum wara t-trapjant (Fig. 4b, c). Barra minn hekk, it-tbajja' tal-markatur talamiku netrin G1 żvelat il-preżenza ta' truf talamiċi f't-hCO (Fig. 4d, e). Biex nevalwaw jekk dawn il-projezzjonijiet afferenti jistgħux iqanqlu risponsi sinaptiċi fiċ-ċelloli t-hCO, wettaqna reġistrazzjonijiet ta' ċelloli sħaħ minn ċelloli umani f'sezzjonijiet preċiżi tas-saff talamokortikali. Stimulazzjoni elettrika ta' S1 tal-firien, kapsula interna, materja bajda, fibri ħdejn t-hCO jew attivazzjoni optoġenetika ta' trufijiet talamiċi li jesprimu opsin f'EPSCs ta' latenza qasira indotti minn t-hCO fin-newroni t-hCO esposti għall-antagonist tar-riċettur AMPA NBQX. (Fig. 4f, g u dejta estiża, Fig. 9a–g). Din id-dejta turi li t-hCO huwa integrat anatomikament fil-moħħ tal-firien u jista' jiġi attivat mit-tessut ospitanti tal-firien.
a, Dijagramma skematika ta' esperiment ta' traċċar tar-rabbja. b, GFP u espressjoni ta' STEM121 speċifika għall-bniedem bejn t-hCO u l-kortiċi ċerebrali tal-firien (pannell ta' fuq). Murija wkoll l-espressjoni ta' GFP fin-nukleu bażali ventrali ipsilaterali (VB) tal-firien (xellug t'isfel) u S1 ipsilaterali (lemin t'isfel). Skala tal-bar, 50 µm. Il-kwadri ħomor jirrappreżentaw iż-żoni tal-moħħ fejn ittieħdu l-immaġini. ċ, kwantifikazzjoni taċ-ċelloli li jesprimu GFP (n = 4 firien). d, e — Terminali talamiċi Netrin G1+ f't-hCO. d turi sezzjoni koronali li fiha n-nuklei t-hCO u VB. Skala tal-bar, 2 mm. e turi l-espressjoni ta' Netrin G1 u STEM121 fin-newroni t-hCO (xellug) u VB (lemin). Skala tal-bar, 50 µm. Il-linja bit-tikek oranġjo tindika l-bordura tat-t-hCO. f, g, Traċċi tal-kurrent tan-newroni t-hCO wara stimulazzjoni elettrika fil-firien S1 (f) jew fil-kapsula interna (g), b'NBQX (vjola) jew mingħajru (iswed) (xellug). Amplitudnijiet tal-EPSC b'NBQX u mingħajru (n = 6 newroni S1, *P = 0.0119; u n = 6 newroni tal-kapsula interna, **P = 0.0022) (ċentru). Perċentwal ta' newroni t-hCO li juru EPSC b'reazzjoni għall-istimulazzjoni elettrika tal-firien S1 (f) jew fil-kapsula interna (g) (lemin). aCSF, fluwidu ċerebrospinali artifiċjali. h, dijagramma skematika tal-esperiment tal-immaġini 2P (xellug). Espressjoni ta' GCaMP6s f't-hCO (nofs). Skala bar, 100 µm. Time lapse tal-fluworexxenza ta' GCaMP6s (lemin). i, Punteġġ Z tal-attività spontanja tal-fluworexxenza. j, illustrazzjoni skematika tal-istimulazzjoni tal-mustaċċi. k, trajettorji ta' fluworexxenza 2P b'punteġġ z fi prova waħda, allinjati mad-devjazzjoni tal-whisker fil-ħin żero (linja mqattgħa) f'ċelloli ta' eżempju. l, risponsi ta' punteġġ z medja tal-popolazzjoni taċ-ċelloli kollha allinjati mad-devjazzjoni tal-whisker fil-ħin żero (linja mqattgħa) (aħmar) jew timestamps iġġenerati b'mod każwali (griż). m. Dijagramma skematika tal-esperiment fuq l-immarkar ottiku. n, Kurvi tal-vultaġġ mhux ipproċessati minn ċellula t-hCO ta' eżempju waqt stimulazzjoni bil-lejżer blu jew deflessjoni tal-whisker. Vleġeġ ħomor jindikaw l-ewwel spikes ikkawżati mid-dawl (fuq) jew ikkawżati minn deflessjoni tal-whisker (isfel). Dell griż jindika perjodi ta' deflessjoni tal-whisker. o, Forom tal-mewġ tad-dawl massimu u risponsi ta' deflessjoni tal-whisker. p, spikes ta' tentattiv wieħed, allinjati mad-devjazzjoni tal-whiskers fiċ-ċelloli tal-eżempju. 0 jindika devjazzjoni tal-whisker (linja mqattgħa). q, rata ta' sparar ta' punteġġ z medja tal-popolazzjoni għaċ-ċelloli fotosensittivi kollha, allinjata mad-devjazzjoni tal-whisker fil-ħin żero (linja mqattgħa) (aħmar) jew timestamps iġġenerati b'mod każwali (griż). r, Proporzjon ta' unitajiet fotosensittivi modulati b'mod sinifikanti mid-devjazzjoni tal-whisker (n = 3 firien) (xellug). Latency tal-punteġġ z massimu (n = 3 firien; n = 5 (aħdar ċar), n = 4 (aħdar skur), u n = 4 (ċjan) unitajiet ta' modulazzjoni tad-devjazzjoni tal-whisker għal kull far) (lemin). Id-dejta hija espressa bħala medja ± devjazzjoni standard
Imbagħad staqsejna jekk t-hCO setax jiġi attivat minn stimuli sensorji in vivo. Trapjantajna hCO li jesprimi l-indikaturi tal-kalċju ġenetikament kodifikati GCaMP6 f'firien S1. Wara 150 jum, wettaqna fotometrija tal-fibra jew immaġini tal-kalċju b'żewġ fotoni (Fig. 4h u dejta estiża, Fig. 10a). Sibna li ċ-ċelloli t-hCO wrew attività ritmika sinkronizzata (Figura 4i, Dejta Estiża, Figura 10b u Vidjo Supplimentari 1). Biex nikkaratterizzaw l-attività massima ta' t-hCO, wettaqna reġistrazzjonijiet elettrofiżjoloġiċi extraċellulari f'firien trapjantati anestetizzati (dejta estiża, Fig. 10c-f). Iġġenerajna koordinati stereotassiċi minn immaġini MRI; għalhekk, dawn l-unitajiet irreġistrati jirrappreżentaw newroni umani putattivi, għalkemm l-elettrofiżjoloġija waħedha ma tippermettix li tiġi ddeterminata speċi ta' oriġini. Osservajna tifqigħat sinkronizzati ta' attività (dejta estiża, Fig. 10d). Il-fqigħiet damu madwar 460 ms u kienu separati b'perjodi ta' silenzju ta' madwar 2 sekondi (dejta estiża, Fig. 10d, e). Unitajiet individwali sparaw medja ta' madwar tliet rawnds għal kull fqigħ, li huwa madwar 73% tal-unitajiet irreġistrati għal kull fqigħ. L-attivitajiet tal-unitajiet individwali kienu korrelati ħafna, u dawn il-korrelazzjonijiet kienu ogħla minn dawk tal-unitajiet identifikati f'annimali mhux imlaqqma rreġistrati taħt l-istess kundizzjonijiet (dejta estiża, Fig. 10f). Biex nikkaratterizzaw aktar ir-risponsi tal-ispikes tan-newroni derivati mill-bniedem identifikati, wettaqna esperimenti ta' dawl-tagging fuq firien anestetizzati trapjantati b'hCO li jesprimi l-kanal tal-katjoni sensittiv għad-dawl rhodopsin 2 (hChR2), li permezz tiegħu n-newroni t-hCO għandhom rikonoxximent ta' latenza qasira (inqas minn 10 ms) b'reazzjoni għal stimuli tad-dawl blu (Fig. 4m–o). In-newroni t-hCO wrew tifqigħat ta’ attività spontanja fi frekwenzi simili għal dawk osservati fl-immaġini tal-kalċju, kif ukoll reġistrazzjonijiet elettrofiżjoloġiċi mwettqa f’t-hCO fin-nuqqas ta’ mmarkar bid-dawl (dejta estiża, Fig. 10c-g). Ma ġiet osservata l-ebda attività spontanja fl-istadji korrispondenti ta’ hCO rreġistrati in vitro. Biex nivvalutaw jekk t-hCO setax jiġi attivat minn stimuli sensorji, iddevjajna fil-qosor il-whiskers tal-firien 'il bogħod minn t-hCO (Fig. 4j,m u dejta estiża, Fig. 10h,k). Skont studji preċedenti8,10, sottosett ta’ ċelluli t-hCO wera żieda fl-attività b’reazzjoni għad-deflessjoni tal-whisker, li ma ġietx osservata meta d-dejta tqabblet ma’ timestamps każwali (Fig. 4k–q u dejta estiża, Fig. 10h–q). Tabilħaqq, madwar 54% tal-unitajiet singoli opto-tikkettati wrew rata ta’ attivazzjoni miżjuda b’mod sinifikanti wara l-istimulazzjoni tal-whisker, li laħqet il-quċċata ta’ madwar 650 ms (Fig. 4r). Meħuda flimkien, din id-dejta tissuġġerixxi li t-hCO jirċievi inputs funzjonali xierqa u jista' jiġi attivat minn stimuli ambjentali.
Imbagħad investigajna jekk t-hCO setax jattiva ċirkwiti fil-firien biex jikkontrolla l-imġieba. L-ewwel investigajna jekk l-assoni tan-newroni t-hCO jipproġettawx fit-tessuti tal-madwar tal-firien. Infettajna l-hCO b'lentivirus li jikkodifika hChR2 imdewweb ma' EYFP (hChR2-EYFP). Wara 110 ijiem, osservajna l-espressjoni ta' EYFP f'reġjuni kortikali ipsilaterali, inklużi l-kortiċi awditorji, motorji, u somatosensorjali, kif ukoll f'reġjuni subkortikali, inkluż l-istriatum, l-ippokampus, u t-talamu (Fig. 5a). Biex nivvalutaw jekk dawn il-projezzjonijiet efferenti jistgħux iqanqlu risponsi sinaptiċi fiċ-ċelloli tal-firien, attivajna ottikament ċelloli t-hCO li jesprimu hChR2-EYFP billi rreġistrajna ċelloli tal-kortiċi ċerebrali tal-firien f'sezzjonijiet preċiżi tal-moħħ. L-attivazzjoni tal-assoni t-hCO bid-dawl blu kkawżat EPSCs ta' latenza qasira fin-newroni tal-kortiċi piramidali tal-firien, li ġew imblukkati minn NBQX (Figs. 5b–g). Barra minn hekk, dawn ir-risponsi jistgħu jiġu mblukkati minn tetrodotoxin (TTX) u rrestawrati minn 4-aminopyridine (4-AP), li jissuġġerixxi li kienu kkawżati minn konnessjonijiet monosinaptiċi (Fig. 5e).
a, Dijagramma skematika tat-traċċar tal-assoni (xellug). Espressjoni ta' t-hCO EYFP (lemin). Skala, 100 µm. A1, kortiċi awditorji, ACC, kortiċi ċingulati anterjuri, d. strijatum, strijatum dorsali, HPC, ippokampus; Dijaframma, septum laterali, mPFC, kortiċi prefrontali medjali, piri, kortiċi piriformi, v. strijatum, strijatum ventrali, VPM, nukleu ventropostomedjali tat-talamu, VTA, reġjun tegmentali ventrali. Il-kwadri ħomor jirrappreżentaw iż-żoni tal-moħħ fejn ittieħdu l-immaġini. b, Dijagramma skematika tal-esperiment ta' stimulazzjoni. ċ, d, Eżempji tar-rispons tal-fotokurrent indott mid-dawl blu (fuq) u l-vultaġġ (isfel) f'ċelloli umani (ċ) EYFP+ t-hCO jew ċelloli tal-firien (d) EYFP-. e, f, Traċċi kurrenti ta' newroni tal-firien wara stimulazzjoni b'dawl blu tal-assoni t-hCO b'TTX u 4-AR (aħdar), TTX (griż) jew aCSF (iswed) (e), b'(vjola) jew mingħajr (iswed)) ) NBQX (e). g, latency tar-risponsi indotti minn dawl blu fiċ-ċelloli tal-firien (n = 16-il ċellula); vireg orizzontali jindikaw latency medja (7.13 ms) (xellug). Amplitudni ta' EPSCs evokati mid-dawl irreġistrati b'NBQX jew mingħajru (n = 7 ċelluli; ***P < 0.0001) (fin-nofs). Amplitudni ta' EPSCs evokati mid-dawl irreġistrati b'NBQX jew mingħajru (n = 7 ċelluli; ***P < 0.0001) (fin-nofs). Амплитуда вызванных светом EPSC, зарегистрированных с или без NBQX (n = 7 клеток; ***P <0,0001) (втрен). Amplitudni ta' EPSCs indotti mid-dawl irreġistrati b'NBQX jew mingħajru (n = 7 ċelluli; ***P < 0.0001) (ċentru).使用或不使用NBQX 记录的光诱发EPSC 的振幅（n = 7 个细胞；***P < 0.0001）（中）。使用或不使用NBQX 记录的光诱发EPSC 的振幅（n = 7 个细胞；***P < 0.0001）（中）。 Амплитуда вызванных светом EPSC, зарегистрированных с или без NBQX (n = 7 клеток; ***P <0,0001) (втрен). Amplitudni ta' EPSCs indotti mid-dawl irreġistrati b'NBQX jew mingħajru (n = 7 ċelluli; ***P < 0.0001) (ċentru).Perċentwal ta' ċelloli tal-firien li juru EPSCs li jirrispondu għad-dawl blu (lemin). h, Dijagramma skematika ta' kompitu ta' mġiba. d0, jum 0. i. Prestazzjoni ta' annimali eżemplari fl-ewwel jum (xellug) jew fil-15-il jum (lemin) tat-taħriġ. L-għadd medju ta' laqgħat imwettqa fl-ewwel jum (xellug) jew fil-15-il jum (ċentru tal-lemin) (n = 150 prova b'dawl blu, n = 150 prova b'dawl aħmar; ***P < 0.0001). L-għadd medju ta' laqgħat imwettqa fl-ewwel jum (xellug) jew fil-15-il jum (ċentru tal-lemin) (n = 150 prova b'dawl blu, n = 150 prova b'dawl aħmar; ***P < 0.0001). Среднее количество облизываний, выполненных в день 1 (слева) или день 15 (в центре справ150 (спра 150) синим светом, n = 150 испытаний с красным светом ***P <0,0001). Numru medju ta' laqgħat imwettqa fl-ewwel jum (xellug) jew fil-15-il jum (ċentru lemin) (n = 150 prova b'dawl blu, n = 150 prova b'dawl aħmar; ***P < 0.0001).第1 天（左）或第15 天（右中）执行的平均舔次数（n = 150 次蓝光试验（n = 150次红光试验；***P <0.0001）。第1 天（左）或第15 天（右中）执行的平均舔次数（n = 150 次蓝光试验（n = 150次红光试验；***P < 0.001 Среднее количество облизываний, выполненных в день 1 (слева) или день 15 (в центре справ150 (спра 150) синим светом, n = 150 испытаний с красным светом ***P <0,0001). Numru medju ta' laqgħat imwettqa fl-ewwel jum (xellug) jew fil-15-il jum (ċentru lemin) (n = 150 prova b'dawl blu, n = 150 prova b'dawl aħmar; ***P < 0.0001).Laqgħat kumulattivi għal provi tad-dawl aħmar u blu fl-ewwel jum (ċentru xellug) jew fil-15-il jum (lemin). NS, mhux sinifikanti. j,k, Karatteristiċi ta' mġiba tal-annimali kollha trapjantati b't-hCO li jesprimi hChR2-EYFP (j) jew fluworoforu ta' kontroll (k) fl-ewwel jew il-15-il jum (hChR2-EYFP: n = 9 firien, ** P = 0.0049; kontroll: n = 9, P = 0.1497). l, Evoluzzjoni tal-punteġġ tal-preferenza (n = 9 hChR2, n = 9 kontroll; **P < 0.001, ***P < 0.0001). l, Evoluzzjoni tal-punteġġ tal-preferenza (n = 9 hChR2, n = 9 kontroll; **P < 0.001, ***P < 0.0001). l, Эволюция показателя предпочтения (n = 9 hChR2, n = 9 контрольных; **P <0,001, ***P <0,0001). l, Evoluzzjoni tal-punteġġ tal-preferenza (n = 9 hChR2, n = 9 kontrolli; **P < 0.001, ***P < 0.0001). l，偏好评分的演变（n = 9 hChR2，n = 9 对照；**P <0.001，***P <0.0001）。 l，偏好评分的演变（n = 9 hChR2，n = 9 对照；**P <0.001，***P <0.0001）。 l, Эволюция показателей предпочтения (n = 9 hChR2, n = 9 контролей; **P <0,001, ***P <0,0001). l, Evoluzzjoni tal-punteġġi tal-preferenza (n = 9 hChR2, n = 9 kontrolli; **P < 0.001, ***P < 0.0001).m, espressjoni ta' FOS b'reazzjoni għall-attivazzjoni optogenetika ta' t-hCO f'S1. Stampi tal-espressjoni FOS (xellug), u kwantifikazzjoni (n = 3 għal kull grupp; *P < 0.05, **P < 0.01 u ***P < 0.001) (lemin) huma murija. Stampi tal-espressjoni FOS (xellug), u kwantifikazzjoni (n = 3 għal kull grupp; *P < 0.05, **P < 0.01 u ***P < 0.001) (lemin) huma murija. Показаны изображения экспрессии FOS (слева) и количественного определения (n = 3 на групрессии, * P *** 0,0 5,0 < P *** 0,0 5,0 1 1 1 <0,001) (справа). Stampi tal-espressjoni FOS (xellug) u l-kwantifikazzjoni (n = 3 għal kull grupp; *P<0.05, **P<0.01, u ***P<0.001) huma murija (lemin).显示了FOS 表达（左）和量化（每组n = 3；*P < 0.05、**P < 0.01 和***P < 0.001）（叄右）显示了FOS 表达（左）和量化（每组n = 3；*P < 0.05、**P < 0.01 和***P < 0.001）（叄右） Показаны изображения экспрессии FOS (слева) и количественного определения (n = 3 на групрессии, * P *** 0,0 5,0 < P *** 0,0 5,0 1 1 1 <0,001) (справа). Stampi tal-espressjoni FOS (xellug) u l-kwantifikazzjoni (n = 3 għal kull grupp; *P<0.05, **P<0.01, u ***P<0.001) huma murija (lemin).Skala, 100 µm. Id-dejta hija espressa bħala medja ± żball standard ta' BLA, tonsilla bażolaterali, MDT, nukleu talamiku dorsomedjali, PAG, griż perjakwedutali.
Fl-aħħarnett, staqsejna jekk t-hCO setax jimmodula l-imġiba tal-firien. Biex nittestjaw dan, trapjantajna hCO li jesprimi hChR2-EYFP f'S1, u 90 jum wara, impjantajna fibri ottiċi f't-hCO għall-kunsinna tad-dawl. Imbagħad ħarriġna l-firien b'paradigma modifikata ta' kondizzjonament operant (Fig. 5h). Poġġejna l-annimali f'kamra tat-test tal-imġiba u applikajna b'mod każwali stimuli bil-lejżer blu (473 nm) u aħmar (635 nm) ta' 5 sekondi. L-annimali rċevew premju tal-ilma jekk lagħqu waqt l-istimulazzjoni bid-dawl blu iżda ma lagħqux waqt l-istimulazzjoni bid-dawl aħmar. Fl-ewwel jum ta' taħriġ, l-annimali ma wrew l-ebda differenza fl-ilgħaq meta stimulati b'dawl blu jew aħmar. Madankollu, fil-jum 15, annimali trapjantati b'hCO li jesprimi hChR2-EYFP urew ilgħaq aktar attiv meta stimulati bid-dawl blu meta mqabbla mal-istimulazzjoni bid-dawl aħmar. Dawn il-bidliet fl-imġiba tal-lagħaq ma ġewx osservati f'annimali ta' kontroll trapjantati b'hCO li jesprimi l-fluworoforu ta' kontroll (rata ta' suċċess tat-tagħlim: hChR2 89%, EYFP 0%, Figura 5i-1 u Vidjo Supplimentari 2). Din id-dejta tissuġġerixxi li ċ-ċelloli t-hCO jistgħu jattivaw in-newroni tal-firien biex jistimulaw imġiba li tfittex premju. Biex niskopru liema ċirkwiti newrali tat-t-hCO tal-firien jistgħu jkunu involuti f'dawn il-bidliet fl-imġiba, attivajna t-hCO b'mod optoġenetiku f'annimali mħarrġa u ħsadna t-tessuti 90 minuta wara. L-immunoistokimika żvelat espressjoni tal-proteina FOS dipendenti fuq l-attività f'diversi reġjuni tal-moħħ involuti f'imġiba motivata, inkluż il-kortiċi prefrontali medjali, it-talamu medjali, u l-materja griża perjakwedutali, li ġiet espressa jew f'annimali ta' kontroll mhux stimulati jew f'annimali. ross. 5m). Meħuda flimkien, din id-dejta tissuġġerixxi li t-hCO jista' jimmodula l-attività newronali tal-firien biex imexxi l-imġiba.
L-organojdi newrali jirrappreżentaw sistema promettenti għall-istudju tal-iżvilupp uman u l-mard in vitro, iżda huma limitati min-nuqqas ta' konnessjonijiet bejn iċ-ċirkwiti li jeżistu in vivo. Żviluppajna pjattaforma ġdida fejn trapjantajna l-hCO f'S1 ta' firien immunokompromessi bikrija wara t-twelid biex nistudjaw l-iżvilupp u l-funzjoni taċ-ċelloli umani in vivo. Urejna li t-hCO jiżviluppa tipi ta' ċelloli maturi mhux osservati in vitro28 u li t-hCO huwa integrat anatomikament u funzjonalment fil-moħħ tal-ġrieden. L-integrazzjoni ta' t-hCO fiċ-ċirkwiti newrali tal-ġrieden ippermettilna nistabbilixxu rabta bejn l-attività ċellulari umana u l-imġiba studjata tal-annimali, u dan juri li n-newroni t-hCO jistgħu jimmodulaw l-attività newronali tal-firien biex imexxu r-risponsi ta' mġiba.
Il-pjattaforma li qed niddeskrivu għandha diversi vantaġġi fuq ir-riċerka preċedenti dwar it-trapjant ta' ċelloli umani f'imħuħ ta' annimali gerriema. L-ewwel, trapjantajna l-hCO3 fil-kortiċi li qed jiżviluppaw ta' firien wara t-twelid bikri, li jista' jiffaċilita l-integrazzjoni anatomika u funzjonali. It-tieni, il-monitoraġġ tal-MRI tat-t-hCO3 ippermettielna nistudjaw il-pożizzjoni tat-tilqim u t-tkabbir f'annimali ħajjin, li ppermettielna nwettqu studji fit-tul fuq diversi annimali u nistabbilixxu l-affidabbiltà ta' diversi linji ta' ċelloli hiPS. Fl-aħħar nett, trapjantajna organojdi intatti, aktar milli sospensjonijiet iżolati ta' ċelloli singoli, li huma inqas distruttivi għaċ-ċelloli umani u jistgħu jippromwovu l-integrazzjoni u l-ġenerazzjoni ta' newroni tal-kortiċi umani f'imħuħ tal-firien.
Aħna nirrikonoxxu li minkejja l-avvanzi f'din il-pjattaforma, restrizzjonijiet temporali, spazjali, u bejn l-ispeċi jipprevjenu l-formazzjoni ta' ċirkwiti newrali umani b'fedeltà għolja, anke wara trapjant fi stadju bikri tal-iżvilupp. Pereżempju, mhux ċar jekk l-attività spontanja osservata fit-t-hCO tirrappreżentax fenotip ta' żvilupp simili għall-attività ritmika osservata waqt l-iżvilupp kortikali, jew jekk hijiex dovuta għan-nuqqas ta' tipi ta' ċelluli soppressivi preżenti fit-t-hCO. Bl-istess mod, mhux ċar sa liema punt in-nuqqas ta' laminazzjoni fit-t-hCO jaffettwa l-konnettività tal-katina30. Ix-xogħol futur se jiffoka fuq l-integrazzjoni ta' tipi oħra ta' ċelluli bħal mikroglia umana, ċelluli endoteljali umani, u proporzjonijiet varji ta' interneuroni GABAerġiċi kif muri bl-użu tal-assemblaġġ 6 in vitro, kif ukoll il-fehim ta' kif l-integrazzjoni u l-ipproċessar newrali jistgħu jseħħu f'livelli mibdula ta' t-hCO, traskrizzjoni, sinaptiċi u mġieba f'ċelluli miksuba minn pazjenti.
B'mod ġenerali, din il-pjattaforma in vivo tirrappreżenta riżorsa qawwija li tista' tikkumplimenta l-iżvilupp tal-moħħ tal-bniedem in vitro u r-riċerka dwar il-mard. Nantiċipaw li din il-pjattaforma se tippermettilna niskopru fenotipi ġodda fil-livell tal-istrand f'ċelloli derivati mill-pazjent li altrimenti jkunu diffiċli biex jiġu identifikati u nittestjaw strateġiji terapewtiċi ġodda.
Aħna ġġenerajna hCO2.5 minn ċelloli HiPS kif deskritt qabel. Biex nibdew il-produzzjoni ta' hCO minn ċelloli hiPS ikkultivati fuq saffi alimentatriċi, kolonji intatti ta' ċelloli hiPS tneħħew mill-platti tal-kultura bl-użu ta' dispase (0.35 mg/mL) u ttrasferixxew għal kulturi tal-plastik b'adeżjoni ultra-baxxa li fihom platti b'mezz tal-kultura taċ-ċelloli hiPS. (Corning) supplimentat b'żewġ inibituri SMAD dorsomorphine (5 μM; P5499, Sigma-Aldrich) u SB-431542 (10 μM; 1614, Tocris) u inibitur ROCK Y-27632 (10 μM; S1049, Selleckchem). Matul l-ewwel 5 ijiem, il-mezz taċ-ċelloli hiPS inbidel kuljum u ġew miżjuda dorsomorphine u SB-431542. Fis-sitt jum f'sospensjoni, l-isferojdi newrali ġew trasferiti għal mezz newrali li kien fih newrobasal-A (10888, Life Technologies), suppliment B-27 mingħajr vitamina A (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies), peniċillina u streptomycin (1:100, Life Technologies) u supplimentati bil-fattur tat-tkabbir epidermali (EGF; 20 ng ml−1; R&D Systems) u l-fattur tat-tkabbir tal-fibroblasti 2 (FGF2; 20 ng ml−1; R&D Systems) sal-jum 24. Mill-jum 25 sal-jum 42, il-mezz ġie supplimentat bil-fattur newrotrofiku derivat mill-moħħ (BDNF; 20 ng ml−1, Peprotech) u newrotrofina 3 (NT3; 20 ng ml−1; Peprotech) b'bidliet fil-mezz kull jumejn. Fis-sitt jum f'sospensjoni, l-isferojdi newrali ġew trasferiti għal mezz newrali li kien fih newrobasal-A (10888, Life Technologies), suppliment B-27 mingħajr vitamina A (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies), peniċillina u streptomycin (1:100, Life Technologies) u supplimentati bil-fattur tat-tkabbir epidermali (EGF; 20 ng ml−1; R&D Systems) u l-fattur tat-tkabbir tal-fibroblasti 2 (FGF2; 20 ng ml−1; R&D Systems) sal-jum 24. Mill-jum 25 sal-jum 42, il-mezz ġie supplimentat bil-fattur newrotrofiku derivat mill-moħħ (BDNF; 20 ng ml−1, Peprotech) u newrotrofina 3 (NT3; 20 ng ml−1; Peprotech) b'bidliet fil-mezz kull jumejn.Fis-sitt jum f'sospensjoni, l-isferojdi newrali ġew trasferiti għal mezz newrali li kien fih Neurobasal-A (10888, Life Technologies), suppliment B-27 mingħajr vitamina A (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies), peniċillina.и стрептомицин (1:100, Teknoloġiji tal-Ħajja) u дополнены эпидермальным фактором роста (EGF; 20 нг/мл; Sistemi R&D) и фактором роста фибробластов 2 (FGF2; 20 нг/мл; Sistemi R&D) до 24-го дня. u streptomycin (1:100, Life Technologies) u supplimentat b'fattur tat-tkabbir epidermali (EGF; 20 ng/ml; R&D Systems) u fattur tat-tkabbir tal-fibroblasti 2 (FGF2; 20 ng/ml; R&D Systems) sal-jum 24.Mill-25 sal-42 jum, il-fattur newrotrofiku derivat mill-moħħ (BDNF; 20 ng ml-1, Peprotech) u n-newrotrofina 3 (NT3; 20 ng ml-1, Peprotech) ġew miżjuda mal-mezz, billi l-mezz inbidel kull jumejn.在悬浮的第6 天，将神经球体转移到含有neurobasal-A（10888，Life Technologies）、不含维生素-27生素-A补充剂（12587，Teknoloġiji tal-Ħajja）、GlutaMax（1:100，Teknoloġiji tal-Ħajja）、青霉素的神经培养基中和链霉（1:1000，Life:1000 Teknoloġiji）并辅以表皮生长因子（EGF；20 ng ml-1；R&D Sistemi）和成纤维细胞生长因子2（FGF2；20 ng ml-1；Sistemi R&D）直至第24 天。在 悬浮 的 第 第 6 天 将 神经 球体 转移 含有 含有 neurobasal-a （10888 ， Life Technologies， 的 縠 球体 含有b-27 补充剂 （12587 ， Teknoloġiji tal-Ħajja） Glutamax （1: 100 ， Life TechNOGIS青霉素 的 神经 培养 基 中 铠 （ （ （ （ （ ， （ （ ， （ ， （ ， ， Teknoloġiji） 表皮 生长 因子 （（（20 ng ml-1 ； Sistemi R&D） 成 纤维 细胞 生长 2 （fgf2 ； 20 ng ml- 1；Sistemi R&D）直至穀24嬀 На 6-й день суспензии нейросферы были переведены на добавку, содержащую нейробаферы были переведены на добавку, содержащую нейробаферы (10л-888) В-27 без витамина А (12587, Teknoloġiji tal-Ħajja), GlutaMax (1:100, Teknoloġiji tal-Ħajja), пенициллин- нейтрализованный стрептомицин, (1) Teknoloġiji tal-Ħajja добавлением эпидермального фактора роста (EGF; 20 нг мл-1; Sistemi R&D) и фактора роста фибробластов 2 (FGF2; 20 нг мл-1) 1; Fis-sitt jum, is-sospensjonijiet tan-newrosferi nbidlu għal suppliment li fih newrobasal-A (10888, Life Technologies), suppliment B-27 mingħajr vitamina A (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies), streptomycin newtralizzata bil-peniċillina (1:100, Life Technologies) supplimentata b'fattur tat-tkabbir epidermali (EGF; 20 ng ml-1; R&D Systems) u fattur tat-tkabbir tal-fibroblasti 2 (FGF2; 20 ng ml-1) 1; Sistemi R&D) до 24-го дня. Sistemi ta' R&Ż) sal-jum 24.Mill-25 sal-42 jum, il-fattur newrotrofiku derivat mill-moħħ (BDNF; 20 ng ml-1, Peprotech) u l-fattur newrotrofiku 3 (NT3; 20 ng ml-1, Peprotech) ġew miżjuda mal-mezz tal-kultura kull jumejn. Il-mezz għandu jinbidel darba.Mill-jum 43 'il quddiem, l-hCO inżamm f'mezz newrobasali-A mhux supplimentat (NM; 1088022, Thermo Fisher) b'bidla tal-mezz kull 4–6 ijiem. Biex jinkiseb hCO minn ċelloli hiPS ikkultivati taħt kundizzjonijiet mingħajr feeder, iċ-ċelloli hiPS ġew inkubati b'Accutase (AT-104, Innovate Cell Technologies) f'temperatura ta' 37°C għal 7 minuti, dissoċjati f'ċelloli singoli, u mqiegħda fuq pjanċi AggreWell 800 (34815, STEMCELL Technologies) b'densità ta' 3 × 106 ċelloli singoli għal kull bir f'mezz Essential 8 supplimentat bl-inibitur ROCK Y-27632 (10 μM; S1049, Selleckchem). Wara 24 siegħa, il-midja fil-bjar ġiet pipettata 'l fuq u 'l isfel f'midja li fiha l-midja Essential 6 (A1516401, Life Technologies) supplimentata b'dorsomorphine (2.5 μM; P5499, Sigma-Aldrich) u SB-431542 (10 μM; 1614). , Tocrida). Mit-tieni sas-sitt jum, il-midja Essential 6 ġiet sostitwita kuljum b'dorsomorphine u suppliment SB-431542. Mis-sitt jum, is-sospensjonijiet tan-newrosferi ġew trasferiti għall-midja newrobasali u miżmuma kif deskritt hawn fuq.
Il-proċeduri kollha fuq l-annimali twettqu skont il-linji gwida għall-kura tal-annimali approvati mill-Kumitat Amministrattiv tal-Kura tal-Annimali tal-Laboratorju tal-Università ta' Stanford (APLAC). Firien ewtimiċi RNU (rnu/+) tqal inxtraw (Charles River Laboratories) jew tpoġġew f'akkomodazzjoni. L-annimali nżammu fuq ċiklu ta' dawl-dlam ta' 12-il siegħa b'ikel u ilma ad libitum. Ġriewi tal-firien nudi (FOXN1–/–) ta' bejn tlieta u sebat ijiem ġew identifikati mit-tkabbir ta' mustaċċi immaturi qabel il-qatla. Il-ġriewi (irġiel u nisa) ġew anestetizzati b'2-3% isoflurane u mqiegħda fuq qafas stereotassiku. Twettqet trepanazzjoni tal-kranju b'dijametru ta' madwar 2-3 mm 'il fuq minn S1 filwaqt li nżammet l-integrità tad-dura mater. Imbagħad uża labra ta' 30-G (madwar 0.3 mm) eżatt barra l-kranjotomija biex tittaqqab id-dura. Imbagħad applika HCO3 fuq parafilm irqiq ta' 3×3 ċm u neħħi l-mezz żejjed. Bl-użu ta' siringa Hamilton imwaħħla ma' labra ta' 23 G, 45°, iġbed bil-mod l-hCO3 fl-aktar tarf distali tal-labra. Imbagħad installa s-siringa fuq il-pompa tas-siringa konnessa mal-apparat stereotassiku. Imbagħad poġġi l-ponta tal-labra fuq toqba ta' titqib wiesgħa 0.3 mm li tkun saret qabel fid-dura mater (z = 0 mm) u dejjaq is-siringa b'1–2 mm (z = madwar –1.5 mm) sakemm il-labra tkun bejn id-dura mater A. tifforma siġill dens. Imbagħad erfa' s-siringa saċ-ċentru tal-wiċċ kortikali f'z = -0.5 mm u injetta l-hCO3 b'rata ta' 1-2 µl kull minuta. Wara t-tlestija tal-injezzjoni tal-hCO3, il-labra tinġibed lura b'rata ta' 0.2-0.5 mm kull minuta, il-ġilda tiġi suturata, u l-ġeru jitqiegħed immedjatament fuq kuxxinett sħun sakemm jirkupra kompletament. Xi annimali ġew trapjantati bilateralment.
Il-proċeduri kollha fuq l-annimali twettqu skont il-linji gwida għall-kura tal-annimali approvati mill-APLAC tal-Università ta' Stanford. Il-firien (aktar minn 60 jum wara t-trapjant) ġew indotti b'anestesija ta' 5% isoflurane u anestetizzati b'1-3% isoflurane waqt l-immaġini. Għall-viżwalizzazzjoni, intuża skaner orizzontali ta' borehole protett b'mod attiv ta' 7 Tesla Bruker (Bruker Corp.) b'sewqan tal-gradjent tal-International Electric Company (IECO), inserzjoni tal-gradjent protetta b'dijametru intern ta' 120 mm (600 mT/m, 1000 T/m/s) bl-użu ta' AVANCE. III, RF multi-coil bi tmien kanali u kapaċitajiet multi-core, u l-pjattaforma Paravision 6.0.1 li takkumpanjaha. Ir-reġistrazzjoni twettqet bl-użu ta' coil RF volumetriku deakkoppjat b'mod attiv b'dijametru intern ta' 86 mm u coil RF imkessaħ bil-krijoġenu b'erba' kanali għar-riċeviment biss. Turbo-RARE 2D assjali (ħin ta' ripetizzjoni = 2500 ms, ħin ta' eku = 33 ms, 2 medji) b'16-il qabda ta' porzjonijiet, ħxuna ta' porzjonijiet 0.6–0.8 mm, li fihom 256 × 256 kampjun. Is-sinjali ġew riċevuti bl-użu ta' coil RF volumetriku ta' transceiver kwadratura b'dijametru intern ta' 2 ċm (Rapid MR International, LLC). Fl-aħħarnett, uża l-funzjonijiet integrati ta' stima tal-wiċċ Imaris (BitPlane) għar-rendering 3D u l-analiżi tal-volum. Trapjant ta' suċċess ġie definit bħala wieħed li fih ġew iffurmati żoni ta' sinjal MRI kontinwu ponderat bit-T2 fl-emisfera trapjantata. Ir-rifjut tat-tilqima ġie definit bħala tilqima li ma pproduċietx żoni ta' sinjal MRI kontinwu ponderat bit-T2 fl-emisfera trapjantata. t-hCO subkortikali ġie eskluż mill-analiżi sussegwenti.
Biex jiġu espressi b'mod stabbli l-GCaMP6s fl-hCO għal immaġini tal-kalċju b'żewġ fotoni, iċ-ċelloli hiPS ġew infettati b'pLV[Exp]-EF1a::GcaMP6s-WPRE-Puro segwit minn għażla ta' antibijotiċi. Fil-qosor, iċ-ċelloli ġew dissoċjati b'EDTA u sospiżi f'1 ml ta' mezz Essential 8 b'densità ta' madwar 300,000 ċellula fil-preżenza ta' polybrene (5 μg/ml) u 15 μl ta' virus. Iċ-ċelloli mbagħad ġew inkubati f'sospensjoni għal 60 minuta u miżrugħa b'densità ta' 50,000 ċellula għal kull bir. Wara l-konfluwenza, iċ-ċelloli ġew ittrattati b'5-10 μg ml-1 puromycin għal 5-10 ijiem jew sakemm dehru kolonji stabbli. L-infezzjoni akuta bl-hCO twettqet kif deskritt qabel5 b'xi modifiki. Fil-qosor, ittrasferixxi l-hCO fil-jum 30-45 f'tubi ta' mikroċentrifuga Eppendorf ta' 1.5 ml li fihom 100 µl ta' mezz tan-nervituri. Imbagħad jitneħħew madwar 90 µl tal-mezz, jiżdiedu mat-tubu 3-6 µl ta' lentivirus b'titru għoli (minn 0.5 x 108 sa 1.2 x 109), u l-hCO jiġi trasferit għall-inkubatur għal 30 minuta. Imbagħad żid 90–100 µl ta' mezz ma' kull tubu u erġa' poġġi t-tubi fl-inkubatur matul il-lejl. L-għada, ittrasferixxi l-hCO għal mezz tan-nervituri frisk fi pjanċi b'twaħħil baxx. Wara 7 ijiem, l-hCO ġie trasferit għal pjanċi b'qiegħ tal-ħġieġ ta' 24-bir għall-viżwalizzazzjoni u l-evalwazzjoni tal-kwalità tal-infezzjoni. pLV[Exp]-SYN1::EYFP-WPRE u pLV[Exp]-SYN1::hChR2-EYFP-WPRE ġew iġġenerati minn VectorBuilder. Il-lentivirus jintuża fil-biċċa l-kbira tal-esperimenti għaliex huwa integrat fil-ġenoma ospitanti, li jippermetti l-espressjoni tal-ġene reporter f'linji ta' ċelluli infettati. Għal segwitu tar-rabbja, jum 30-45, l-hCO ġie ko-infettat b'rabbja-ΔG-eGFP u AAV-DJ-EF1a-CVS-G-WPRE-pGHpA (plasmid #67528, Addgene), maħsul sewwa għal 3 ijiem, u trapjantat fil-firien f'S1 u miżmum in vivo għal 7-14-il jum.
Għall-immunoċitokimika, l-annimali ġew anestetizzati u perfużi transkardjalment b'PBS segwit minn 4% paraformaldehyde (PFA f'PBS; Electron Microscopy Sciences). L-imħuħ ġew iffissati f'4% PFA għal sagħtejn jew matul il-lejl f'4°C, krijopreservati f'30% sukrożju f'PBS għal 48-72 siegħa, u inkorporati f'1:1, 30% sukrożju: OCT (Tissue-Tek OCT Compound 4583, Sakura Finetek) u saru sezzjonijiet koronali f'30 µm bl-użu ta' kriostat (Leica). Għall-immunoistokimika ta' sezzjonijiet ħoxnin, l-annimali ġew perfużi b'PBS, u l-moħħ ġie dissezzjonat u sezzjonat koronalment f'300–400 µm bl-użu ta' vibratome (Leica) u s-sezzjonijiet ġew iffissati b'4% PFA għal 30 minuta. Imbagħad il-krijosezzjonijiet jew is-sezzjonijiet ħoxnin inħaslu bil-PBS, imblukkati għal siegħa f'temperatura tal-kamra (10% serum normali tal-ħmir (NDS) u 0.3% Triton X-100 dilwit fil-PBS) u imblukkati b'soluzzjoni ta' imblukkar f'4°C. – Inkubazzjoni Il-krijosezzjonijiet ġew inkubati matul il-lejl u s-sezzjonijiet ħoxnin ġew inkubati għal 5 ijiem. L-antikorpi primarji użati kienu: anti-NeuN (ġurdien, 1:500; ab104224, abcam) anti-CTIP2 (firien, 1:300; ab18465, abcam), anti-GFAP (fenek, 1:1,000; Z0334, Dako), anti-GFP (tiġieġ, 1:1,000; GTX13970, GeneTex), anti-HNA (ġurdien, 1:200; ab191181, abcam), anti-NeuN (fenek, 1:500; ABN78, Millipore), anti-PDGFRA (fenek, 1:200; sc-338, Santa Cruz), anti-PPP1R17 (fenek, 1:200; HPA047819, Atlas Antibodies), anti-RECA-1 (ġurdien, 1:50; ab9774, abcam), anti-SCG2 (fenek, 1:100; 20357-1-AP, Proteintech), anti-SOX9 (mogħża, 1:500; AF3075, R&D Systems), Netrin G1a (mogħża, 1:100; AF1166, R&D Systems), anti-STEM121 (ġurdien, 1:200; Y40410, Takara Bio), anti-SATB2 (ġurdien, 1:50; ab51502, abcam), anti-GAD65/67 (fenek, 1:400; ABN904, Millipore) u anti-IBA1 (mogħża, 1:100; ab5076, abcam). L-antikorpi primarji użati kienu: anti-NeuN (ġurdien, 1:500; ab104224, abcam) anti-CTIP2 (firien, 1:300; ab18465, abcam), anti-GFAP (fenek, 1:1,000; Z0334, Dako), anti-GFP (tiġieġ, 1:1,000; GTX13970, GeneTex), anti-HNA (ġurdien, 1:200; ab191181, abcam), anti-NeuN (fenek, 1:500; ABN78, Millipore), anti-PDGFRA (fenek, 1:200; sc-338, Santa Cruz), anti-PPP1R17 (fenek, 1:200; HPA047819, Atlas Antibodies), anti-RECA-1 (ġurdien, 1:50; ab9774, abcam), anti-SCG2 (fenek, 1:100; 20357-1-AP, Proteintech), anti-SOX9 (mogħża, 1:500; AF3075, R&D Systems), Netrin G1a (mogħża, 1:100; AF1166, R&D Systems), anti-STEM121 (ġurdien, 1:200; Y40410, Takara Bio), anti-SATB2 (ġurdien, 1:50; ab51502, abcam), anti-GAD65/67 (fenek, 1:400; ABN904, Millipore) u anti-IBA1 (mogħża, 1:100; ab5076, abcam). Использовались следующие первичные антитела: анти-NeuN (мышиные, 1:500; ab104224, abcam), анти-CTIP:3иные (мышиные, 1:500); ab18465, abcam), анти-GFAP (кроличьи, 1:1000; Z0334, Dako), анти- -GFP (курица, 1:1000; GTX13970, GeneTex), анти-HNA (,мы1:1:1000; abcam), анти-NeuN (кролик, 1:500; ABN78, Millipore), анти-PDGFRA (кролик, 1:200; sc-338, Санта-Круз), анти-PPP1R17 (кролик, 1:200; HPA047819, Atlas Antibodies), анти-RECA-1 (мыш40, ab97:5ь, ab97:5ь; анти-SCG2 (кролик , 1:100; 20357-1-AP, Proteintech), анти-SOX9 (козий, 1:500; AF3075, Sistemi R&D), нетрин G1a (козин, 6:11060), R&D Systems,; анти-STEM121 (мышиный , 1:200; Y40410, Takara Bio), анти-SATB2 (мышь, 1:50; ab51502, abcam), анти-GAD65/67 (кролик, 1:400; ABN904, Millipore) и анти-IBA1 (коза, 1:100; абб5076, мака). L-antikorpi primarji użati kienu: anti-NeuN (ġurdien, 1:500; ab104224, abcam), anti-CTIP2 (firien, 1:300; ab18465, abcam), anti-GFAP (fenek, 1:1000; Z0334, Dako), anti-GFP (tiġieġ, 1:1000; GTX13970, GeneTex), anti-HNA (ġurdien, 1:200; ab191181, abcam), anti-NeuN (fenek, 1:500; ABN78, Millipore), anti-PDGFRA (fenek, 1:200; sc-338, Santa Cruz), anti-PPP1R17 (fenek, 1:200; HPA047819, Atlas Antibodies), anti-RECA-1 (ġurdien, 1:50; ab9774, abcam), anti-SCG2 (fenek, 1:100; 20357-1-AP, Proteintech), anti-SOX9 (mogħża, 1:500; AF3075, R&D Systems), netrin G1a (mogħża, 1:100; AF1166, R&D Systems), anti-STEM121 (ġurdien, 1:200; Y40410, Takara Bio), anti-SATB2 (ġurdien, 1:50; ab51502, abcam), anti-GAD65/67 (fenek, 1:400; ABN904, Millipore) u anti-IBA1 (mogħża, 1:100; ab5076, abkam).使用的一抗是：抗NeuN（小鼠，1:500；ab104224，abcam）抗CTIP2（大鼠，1:3 00；ab18465，abcam），抗GFAP（兔，1:1,000；Z0334，Dako），抗-GF P（鸡，1:1,000；GTX13970，GeneTex），抗HNA（小鼠，1:200；ab1911 81，abcam），抗NeuN（兔，1:500；ABN78，Millipore），抗PDGFRA（兔， 1:200；sc-338，Santa Cruz），抗PPP1R17（兔，1:200；HPA047819，Atlas抗体），抗RECA-1（小鼠，1:50；ab9774，abcam），抗SCG2（兔）, 1:100；20357-1-AP，Proteintech），抗SOX9（山羊，1:500；AF3075，R&D Systems），Netrin G1a（山羊（山羊，1:106；AF106； Sistemi），抗STEM121（小鼠, 1:200;使用的一抗是：抗NeuN（小鼠，1:500；ab104224，abcam）抗CTIP2（大鼠，1 :300；ab18465，abcam），抗GFAP（兔，1:1,000；Z0334，Dako），抗-GFP（鸡，1:1,000；GTX13970，GeneTex），抗HNA（小鼠，1:200；ab 191181，abcam），抗NeuN（兔，1:500；ABN78，Millipore％弔，抗1: 200；sc-338，Santa Cruz），抗PPP1R17（兔，1:200；HPA047819，Atlas抗体），抗RECA-1（小鼠，1:50；ab9774，abcam），抗SCG2 100；20357-1-AP，Proteintech），抗SOX9（山羊，1:500；AF3075，R&D Systems），Netrin G1a（山羊（山羊；1:1006；AF306； Sistemi）頏1:20, ;Y40410, Takara Bio), anti-SATB2 (ġurdien, 1:50; ab51502, abcam), anti-GAD65/67 (fenek, 1:400; ABN904, Millipore) u anti-IBA1 (mogħża, 1:100; ab5076, abcam).L-antikorpi primarji użati kienu: anti-NeuN (ġurdien, 1:500; ab104224, abcam), anti-CTIP2 (firien, 1:300; ab18465, abcam), anti-GFAP (fenek, 1:1000; Z0334, Dako). , anti-GFP (tiġieġ, 1:1000; GTX13970, GeneTex), anti-HNA (ġurdien, 1:200; ab191181, abcam), anti-NeuN (fenek, 1:500; ABN78, Millipore), anti-PDGFRA (fenek, 1:200; sc-338, Santa Cruz), anti-PPP1R17 (fenek, 1:200; HPA047819, antikorp Atlas), anti-RECA-1 (ġurdien, 1:50; ab9774, abcam), anti-SCG2 (fenek), 1:100;20357-1-AP, Proteintech), анти-SOX9 (коза, 1:500; AF3075, Sistemi R&D), Нетрин G1a (коза, 1:100; AF1166, Sistemi R&D), анти (коза, 1:500; AF3075, мы12ь -STEM,; Y40410, Takara Bio), анти-SATB2 (мышь, 1:50; ab51502, abcam), анти-GAD65/67 (кролик, 1:400; ABN904, Millipore) и анти-IBA1, ка7,за1 (; 1:10) абкам). 20357-1-AP, Proteintech), anti-SOX9 (mogħża, 1:500; AF3075, R&D Systems), Netrin G1a (mogħża, 1:100; AF1166, R&D Systems), anti-STEM121 (ġurdien, 1:200; Y40410, Takara Bio), anti-SATB2 (ġurdien, 1:50; ab51502, abcam), anti-GAD65/67 (fenek, 1:400; ABN904, Millipore), u anti-IBA1 (mogħża, 1:100; ab5076, abkam).Imbagħad is-sezzjonijiet inħaslu bil-PBS u ġew inkubati b'antikorp sekondarju għal siegħa f'temperatura tal-kamra (sezzjonijiet iffriżati) jew matul il-lejl f'4°C (sezzjonijiet ħoxnin). Intuża antikorp sekondarju Alexa Fluor (Life Technologies) dilwit 1:1000 f'soluzzjoni ta' imblukkar. Wara l-ħasil bil-PBS, in-nuklei ġew viżwalizzati b'Hoechst 33258 (Life Technologies). Fl-aħħar, is-slajds tqiegħdu fuq mikroskopju b'coverslips (Fisher Scientific) bl-użu ta' Aquamount (Polysciences) u ġew analizzati fuq mikroskopju fluworexxenti Keyence (analizzatur BZ-X) jew mikroskopju konfokali Leica TCS SP8 (Las-X) fuq l-immaġni. L-immaġnijiet ġew ipproċessati bl-użu tal-programm ImageJ (Fiji). Biex jiġi kwantifikat il-proporzjon ta' newroni umani fit-t-hCO u l-kortiċi tal-firien, ittieħdu immaġnijiet rettangolari wesgħin 387.5 μm fiċ-ċentru tat-t-hCO, fit-tarf jew qrib it-tarf tal-kortiċi tal-firien. Il-marġini tat-tilqim ġew determinati billi ġew evalwati l-bidliet fit-trasparenza tat-tessut, in-nuklei HNA+, u/jew il-preżenza ta' awtofluworexxenza tat-tessut. F'kull immaġni, in-numru totali ta' ċelluli NeuN+ u HNA+ ġie diviż bin-numru totali ta' ċelluli NeuN+ fl-istess żona. Biex jiġi żgurat li jingħaddu biss iċ-ċelluli bin-nuklei fil-pjan tal-immaġni, fil-kalkolu jiġu inklużi biss iċ-ċelluli li huma wkoll Hoechst+. Żewġ immaġini separati b'mill-inqas 1 mm ġew medjati biex jitnaqqas l-iżball statistiku.
Ġimgħa qabel il-ġbir tal-kampjun, poġġi l-annimali tat-trapjant tal-hCO (madwar 8 xhur ta' differenzjazzjoni) f'kamra mudlama bil-mustaċċi mirquma biex timminimizza l-istimulazzjoni sensorja. L-iżolament tan-nuklei sar kif deskritt qabel, b'xi modifiki. Fil-qosor, t-hCO u hCO inqerdu bl-użu ta' lisi taċ-ċelluli mekkanika-deterġent u grinder tat-tessut tal-ħġieġ ta' 2 ml (D8938, Sigma-Aldrich/KIMBLE). In-nuklei mhux raffinati mbagħad ġew iffiltrati bl-użu ta' filtru ta' 40 µm u ċċentrifugati fi 320 g għal 10 minuti f'4 °C qabel ma twettaq gradjent ta' densità tas-sukrożju. Wara l-pass taċ-ċentrifugazzjoni (320 g għal 20 minuta f'4°C), il-kampjuni ġew sospiżi mill-ġdid f'0.04% BSA/PBS biż-żieda ta' 0.2 unitajiet ta' inibitur RNase µl-1 (40 u µl-1, AM2682, Ambion) u għaddew minn filtru tal-fluss ta' 40 µm. In-nuklei dissoċjati mbagħad ġew sospiżi mill-ġdid f'PBS li kien fih 0.02% BSA u mgħobbija fuq ċippa Chromium Single Cell 3′ (irkupru stmat ta' 8,000 ċellula għal kull korsija). Il-libreriji snRNA-seq ġew ippreparati bil-Chromium Single cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics). Il-libreriji snRNA-seq ġew ippreparati bil-Chromium Single cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics). Библиотеки snRNA-seq были приготовлены с помощью Chromium Single cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics). Il-libreriji snRNA-seq ġew ippreparati bl-użu ta' Chromium Single cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics). snRNA-seq 文库是使用Chromium Single cell 3′ GEM、Librery & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics) 制备的。 snRNA-seq 文库是使用Chromium Single cell 3′ GEM、Librery & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics) 制备的。 Библиотеку snRNA-seq готовили с использованием Chromium Single Cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics). Il-librerija snRNA-seq ġiet ippreparata bl-użu ta' Chromium Single Cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics).Libreriji minn kampjuni differenti ġew miġbura u sekwenzati minn Admera Health fuq NovaSeq S4 (Illumina).
Il-livelli ta' espressjoni tal-ġeni għal kull barcode nukleari putattiv ġew kwantifikati bl-użu tal-pakkett tas-softwer tal-analiżi 10x Genomics CellRanger (verżjoni 6.1.2). Speċifikament, il-qari tqabbel ma' taħlita ta' ġenomi ta' referenza umani (GRCh38, Ensemble, verżjoni 98) u tal-firien (Rnor_6.0, Ensemble, verżjoni 100) maħluqa bil-kmand mkref u bl-użu ta' count bil-kmand –include-introns=TRUE għall-kwantifikazzjoni li jinkludi qari mmappjat għal reġjuni tal-intron. Għal kampjuni t-hCO, in-nuklei umani ġew identifikati abbażi tar-rekwiżit konservattiv li mill-inqas 95% tal-qari mmappjat kollu jaqbel mal-ġenoma umana. L-analiżijiet sussegwenti kollha twettqu fuq matriċi ta' barcode ffiltrata output miċ-CellRanger bl-użu tal-pakkett R (verżjoni 4.1.2) Seurat (verżjoni 4.1.1)32.
Biex jiġi żgurat li n-nuklei ta’ kwalità għolja biss jiġu inklużi fl-analiżi sussegwenti, ġie implimentat proċess ta’ filtrazzjoni iterattiv għal kull kampjun. L-ewwel, in-nuklei ta’ kwalità baxxa b’inqas minn 1000 ġene uniku misjuba u aktar minn 20% tal-mitokondrija totali jiġu identifikati u mneħħija. Sussegwentement, il-matriċi tan-numru tal-ġeni mhux ipproċessati ġiet normalizzata permezz ta' rigressjoni binomjali negattiva regolarizzata bl-użu tal-funzjoni sctransform(vst.flavor="v2″), li identifikat ukoll it-3000 ġene l-aktar varjabbli bl-użu ta' parametri awtomatiċi. It-tnaqqis tad-dimensjoni sar fuq il-ġeni varjabbli ta' fuq bl-użu tal-Analiżi tal-Komponenti Prinċipali (PCA) b'parametri awtomatiċi bl-użu ta' dimensjoni tas-sett tad-dejta ta' 30 (dims = 30 intgħażel abbażi ta' spezzjoni viżwali tas-siti tal-irkoppa u ntuża għall-kampjuni kollha u l-analiżijiet tal-ensemble). Imbagħad wettaqna diversi rawnds ta' raggruppament iterattiv (riżoluzzjoni = 1) biex nikklassifikaw il-ġeni bbażati fuq għadd ta' ġeni anormalment baxx (medjan taħt l-10 perċentil), għadd ta' ġeni mitokondrijali anormalment għoli (medjan 'il fuq mill-95 perċentil) biex nidentifikaw u nneħħu ċelloli putattivi ta' kwalità baxxa. raggruppamenti u/jew proporzjon għoli ta' tewmin suspettati identifikati bl-użu tal-pakkett DoubletFinder33 (punteġġ medju ta' DoubletFinder 'il fuq mill-95 perċentil). Kampjuni t-hCO (n=3) u kampjuni hCO (n=3) ġew integrati separatament bl-użu tal-funzjoni IntegrateData bil-parametri ta' hawn fuq. Imbagħad Twettqet rawnd ieħor ta' filtrazzjoni kwalitattiva tas-sett tad-dejta integrat kif deskritt hawn fuq.
Wara li tneħħew il-kernels ta' kwalità baxxa, id-dataset integrat ġie miġbur fi gruppi (riżoluzzjoni = 0.5) u inkorporat għal skopijiet ta' viżwalizzazzjoni UMAP34. Il-ġeni markaturi għal kull raggruppament ġew determinati bl-użu tal-funzjoni FindMarkers b'parametri default ikkalkulati minn dejta normalizzata tal-espressjoni tal-ġeni. Aħna nidentifikaw u nikklassifikaw il-klassijiet ewlenin taċ-ċelloli billi ngħaqqdu settijiet ta' dejta ta' referenza kortikali tal-fetu u tal-adulti mal-espressjoni tal-ġeni markaturi 19,20,21,35 u l-annotazzjoni. B'mod partikolari, il-prekursuri li jiċċirkolaw ġew identifikati bl-espressjoni ta' MKI67 u TOP2A. Ir-raggruppamenti proġenituri ġew definiti min-nuqqas ta' traskrizzjonijiet mitotiċi, sovrappożizzjoni għolja ma' raggruppamenti proġenituri gliali multipotenti deskritti fil-kortiċi fetali tal-metafażi tard, u espressjoni ta' EGFR u OLIG1. Aħna nużaw it-terminu astroċita biex niġbru diversi stati ta' differenzjazzjoni tal-astroċiti, minn glija radjali tard sal-maturazzjoni tal-astroċiti. Ir-raggruppamenti tal-astroċiti jesprimu livelli għoljin ta' SLC1A3 u AQP4 u ntwera li jimmappaw ma' sottotipi ta' glija radjali tal-fetu u/jew astroċiti adulti. L-OPCs jesprimu PDGFRA u SOX10 filwaqt li l-oligodendroċiti jesprimu markaturi tal-mijelinazzjoni (MOG u MYRF). In-newroni glutamaterġiċi ġew identifikati bil-preżenza ta' traskrizzjonijiet newronali (SYT1 u SNAP25), l-assenza ta' markaturi GABAerġiċi (GAD2), u l-espressjoni ta' NEUROD6, SLC17A7, BCL11B, jew SATB2. In-newroni GluN ġew maqsuma aktar f'sottoklassijiet ta' fuq (espressjoni SATB2 u telf ta' BCL11B) u profondi (espressjoni BCL11B). In-newroni putattivi tas-sottopjanċa (SP) jesprimu markaturi SP18 magħrufa bħal ST18 u SORCS1 flimkien ma' markaturi GluN profondi. Ċelloli simili għall-plexus tal-korojde ġew identifikati bl-espressjoni TTR, u ċelloli simili għall-meninġi esprimew ġeni assoċjati mal-fibroblasti u mmappjaw ċelloli piali/vaskulari tas-sett tad-dejta ta' referenza.
Analiżi differenzjali tal-espressjoni tal-ġeni bejn is-sottoklassijiet t-hCO u hCO twettqet bl-użu ta' metodu pseudo-batch żviluppat ġdid riprodott f'kampjuni implimentati bl-użu tal-pakkett Libra R (verżjoni 1.0.0). Speċifikament, it-testijiet tal-log-likelihood edgeR (verżjoni 3.36.0, pakkett R) twettqu għal gruppi billi ġie miġbur in-numru ta' ġeni fiċ-ċelloli għal klassi ta' ċelloli partikolari għal kull replikazzjoni tal-kampjun. Għall-viżwalizzazzjoni tal-mappa tas-sħana, il-valuri normalizzati għal kull miljun (CPM) huma kkalkulati bl-użu ta' edgeR (funzjoni cpm()) u skalati (biex jinkiseb medja = 0, devjazzjoni standard = 1). Twettqet analiżi tal-arrikkiment tal-Ontoloġija tal-Ġeni (GO) tal-ġeni t-hCO GluN regolati b'mod sinifikanti (valur P ikkoreġut minn Benjamini-Hochberg ta' inqas minn 0.05 espress f'mill-inqas 10% taċ-ċelloli t-hCO GluN u żieda fil-bidla ta' mill-inqas darbtejn). imwettqa bl-użu ta' ToppGene Suite (https://toppgene.cchmc.org/)37. Aħna nużaw l-app ToppFun b'parametri awtomatiċi u nirrappurtaw valuri-P ikkoreġuti minn Benjamini-Hochberg ikkalkulati minn testijiet iperġeometriċi annotati minn GO.
Biex inqabblu l-clusters snRNA-seq tagħna ma' clusters ta' ċelluli annotati minn studji ta' referenza ta' RNA-seq primarju ta' ċellula waħda jew snRNA-seq adult19,20,21,22, applikajna approċċ ta' integrazzjoni ta' datasets imqabbla. Użajna l-fluss tax-xogħol ta' normalizzazzjoni SCTransform (v2) f'Seurat biex nintegraw u nqabblu s-sovrappożizzjonijiet tal-clusters bejn id-datasets (bl-użu tal-istess parametri bħal hawn fuq). Datasets individwali ġew imqassma b'mod każwali f'sottosettijiet sa 500 ċellula jew qalba għal kull cluster oriġinali għall-effiċjenza komputazzjonali. Bl-użu ta' approċċ simili għal dak deskritt qabel, is-sovrappożizzjoni tal-clusters ġiet definita bħala l-proporzjon ta' ċelluli jew nuklei f'kull cluster miġbur li kienu jikkoinċidu mat-tikketta tal-cluster ta' referenza. Biex nikklassifikaw aktar il-GluNs, użajna l-fluss tax-xogħol TransferData ta' Seurat għad-dejta tas-sottosett GluN biex nassenjaw tikketti tad-dataset ta' referenza liċ-ċelluli GluN tagħna.
Biex nivvalutaw l-istatus ta' maturazzjoni tat-traskrittoma globali tal-kampjuni ta' t-hCO u hCO, qabbilna l-kampjuni pseudo-bulk tagħna ma' BrainSpan/psychENCODE23, li jikkonsisti f'sekwenza kbira ta' RNA li tkopri l-iżvilupp tal-moħħ tal-bniedem. Wettaqna PCA fuq matriċi ta' espressjoni tal-ġeni normalizzata b'mudell ikkombinat minn kampjuni kortikali 10 ġimgħat wara l-konċepiment u aktar tard, f'5567 ġene (flimkien mad-dejta tagħna) li qabel kienu identifikati bħala attivi f'kampjuni kortikali ta' BrainSpan (definiti bħala akbar minn 50% fil-varjanza tal-iżvilupp spjegata mill-età bl-użu ta' mudell kubu)38. Barra minn hekk, idderivajna ġeni assoċjati ma' firem ewlenin tat-traskrittoma tal-iżvilupp newroloġiku bl-użu ta' fattorizzazzjoni tal-matriċi mhux negattiva kif deskritt qabel. Il-piżijiet tal-kampjuni kkalkulati bl-użu tal-proċedura tal-fattorizzazzjoni tal-matriċi mhux negattiva huma pplottjati fil-Figuri 5b b'dejta estiża għal kull waħda mill-ħames firem deskritti minn Zhu et al.38. Għal darb'oħra, markaturi traskrizzjonali dipendenti fuq l-attività ġew derivati minn studji ppubblikati qabel. B'mod partikolari, l-ERG u l-LRG kienu regolati 'l fuq b'mod sinifikanti fin-newroni glutamaterġiċi identifikati mill-ġbir ta' snRNA-seq tal-kortiċi viżwali tal-ġrieden wara stimulazzjoni viżwali mit-Tabella Supplimentari 3 Hrvatin et al.16. LRGs arrikkiti mill-bniedem inkisbu minn kulturi tal-moħħ tal-fetu uman attivati bil-KCl u nġabru 6 sigħat wara l-istimulazzjoni, u l-ġeni ffiltrati kienu regolati 'l fuq b'mod sinifikanti fil-bnedmin iżda mhux fil-ġrieden (Tabella Supplimentari 4). L-analiżi tal-arrikkiment tas-sett tal-ġeni bl-użu ta' dawn is-settijiet tal-ġeni twettqet bl-użu ta' test eżatt ta' Fisher f'direzzjoni waħda.
Anestetizza l-firien bl-isoflurane, neħħi l-imħuħ u poġġihom f'soluzzjoni kiesħa (madwar 4°C) ossiġenata (95% O2 u 5% CO2) tas-sukrożju għal sezzjonijiet li fihom: 234 mM sukrożju, 11 mM glukożju, 26 mM NaHCO3, 2.5 mM KCl, 1.25 mM. NaH2PO4, 10 mM MgSO4 u 0.5 mM CaCl2 (madwar 310 mOsm). Sezzjonijiet koronali tal-moħħ tal-firien (300–400 µm) li fihom t-hCO saru bl-użu ta' vibratome Leica VT1200 kif deskritt qabel39. Imbagħad is-sezzjonijiet ġew trasferiti għal kamra tas-sezzjoni b'ossiġenazzjoni kontinwa f'temperatura tal-kamra li fiha aCSF ippreparat minn: 10 mM glukożju, 26 mM NaHCO3, 2.5 mM KCl, 1.25 mM NaHPO4, 1 mM MgSO4, 2 mM CaCl2 u 126 mM NaCl (298 mOsm). mill-inqas 45 minuta qabel ir-reġistrazzjoni. Is-sezzjonijiet ġew irreġistrati f'kamra mgħaddsa fejn ġew perfużi kontinwament b'aCSF (kunjett ta' 95% O2 u 5% CO2). Id-dejta kollha ġiet irreġistrata f'temperatura tal-kamra. In-newroni t-hCO ġew terminati b'pipetta tal-ħġieġ borosilikat mimlija b'soluzzjoni li fiha 127 mM glukonat tal-potassju, 8 mM NaCl, 4 mM manjesju ATP, 0.3 mM sodju GTP, 10 mM HEPES, u 0.6 mM EGTA, pH 7.2, soluzzjoni interna aġġustata b'KOH (290 mOsm). Sabiex tirkupra, ġiet miżjuda bijoċitina (0.2%) mas-soluzzjoni tar-reġistrazzjoni.
Id-dejta nkisbet bl-użu ta' amplifikatur MultiClamp 700B (Molecular Devices) u diġitalizzatur Digidata 1550B (Molecular Devices), iffiltrata low-pass f'2 kHz, diġitalizzata f'20 kHz, u analizzata bl-użu ta' Clampfit (Molecular Devices), Origin (OriginPro). 2021b, OriginLab). u funzjonijiet MATLAB tad-dwana (Mathworks). Il-potenzjal tal-junction ġie kkalkulat bl-użu ta' JPCalc u d-dħulijiet ġew aġġustati għall-valur ikkalkulat ta' -14 mV. L-Operazzjoni IV tikkonsisti f'serje ta' passi ta' kurrent fi passi ta' 10-25 pA, minn -250 sa 750 pA.
It-talamu, il-materja bajda, u l-afferenti S1 ġew stimulati bl-elettriku fi flieli talamokortikali waqt ir-reġistrazzjoni bil-garża tan-newroni hCO, kif deskritt qabel. Fil-qosor, il-moħħ tqiegħed fuq mejda tal-istampar 3D inklinata f'angolu ta' 10°, u l-parti ta' quddiem tal-moħħ inqatgħet f'angolu ta' 35°. Il-moħħ imbagħad twaħħel mal-wiċċ maqtugħ u ġie sezzjonat, filwaqt li ppreserva l-assoni talamokortikali li jisporġu 'l barra. Elettrodi bipolari tat-tungstenu (0.5 MΩ) ġew immuntati fuq it-tieni mikromanipulatur u pożizzjonati strateġikament biex jistimulaw erba' reġjuni għal kull ċellula (kapsula ta' ġewwa, materja bajda, S1 u hCO). Irreġistra r-risponsi sinaptiċi wara stimulazzjoni fażika ta' 300 µA f'0.03–0.1 Hz.
In-newroni hCO li jesprimu hChR2 ġew attivati f'480 nm u l-impulsi tad-dawl iġġenerati minn LED (Prizmatix) ġew applikati permezz ta' oġġettiv ×40 (0.9 NA; Olympus) biex jirreġistraw l-espressjoni ta' hChR2 ħdejn iċ-ċelloli. Id-dijametru tal-kamp illuminat huwa ta' madwar 0.5 mm u l-qawwa totali hija ta' 10-20 mW. Il-wisa' tal-impuls ġiet issettjata għal 10 ms, li tikkorrispondi għall-impuls mogħti waqt l-esperiment tat-tagħlim komportamentali. Intużaw diversi frekwenzi ta' stimulazzjoni, minn 1 sa 20 Hz, iżda l-ewwel impuls tas-serje biss intuża għall-kwantifikazzjoni. L-intervalli bejn il-ferroviji ġeneralment ikunu itwal minn 30 s biex jimminimizzaw l-effett fuq mogħdijiet inibitorji jew ta' faċilitazzjoni sinaptiċi. Biex nittestjaw jekk ir-rispons tal-hChR2 kienx monosinaptiku, applikajna TTX (1 μM) fil-banju sakemm ir-reazzjoni tal-EPSC sparixxiet, u mbagħad applikajna 4-aminopyridine (4-AP; 100 μM). Tipikament, rispons jiġi rritornat fi żmien ftit minuti, b'dewmien kemmxejn itwal bejn it-tqabbid tal-LED u l-ġenerazzjoni tal-EPSC. NBQX (10 μM) intuża biex jiġi ttestjat jekk ir-rispons huwiex immexxi mir-riċetturi tal-AMPA.
Sezzjonijiet preċiżi tal-hCO3 inħolqu kif deskritt qabel. Fil-qosor, is-sezzjonijiet tal-hCO3 ġew inkorporati f'4% agarose u trasferiti għal ċelloli li fihom 126 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM NaH2PO4, 1 mM MgSO4, 2 mM CaCl2, 26 mM NaHCO3 u 10 mM d-(+)-glucose. Is-sezzjonijiet inqatgħu f'200–300 µm f'temperatura tal-kamra bl-użu ta' vibratur Leica VT1200 u nħażnu f'ASF f'temperatura tal-kamra. Imbagħad, ir-reġistrazzjoni patch-camp taċ-ċelloli sħaħ twettqet fuq sezzjonijiet tal-hCO3 taħt mikroskopju dirett SliceScope (Scientifica). Is-sezzjonijiet ġew perfużi b'aCSF (95% O2 u 5% CO2) u s-sinjali taċ-ċelloli ġew irreġistrati f'temperatura tal-kamra. In-newroni tal-hCO3 ġew applikati bl-użu ta' pipetta tal-ħġieġ borosilikat mimlija b'soluzzjoni li fiha 127 mM glukonat tal-potassju, 8 mM NaCl, 4 mM manjesju ATP, 0.3 mM sodju GTP, 10 mM HEPES, u 0.6 mM EGTA, pH intern 7, 2, aġġustat bil-KOH (osmolarità 290). Għal skopijiet ta' rkupru, żid 0.2% Bijoċitina mas-soluzzjoni interna.
Id-dejta nkisbet minn Clampex (Clampex 11.1, Molecular Devices) bl-użu ta' amplifikatur MultiClamp 700B (Molecular Devices) u diġitalizzatur Digidata 1550B (Molecular Devices), ġiet iffiltrata b'pass baxx f'2 kHz, diġitalizzata f'20 kHz, u analizzata bl-użu ta' Clampfit (verżjoni 10.6) għall-analiżi, apparati molekulari) u funzjonijiet MATLAB personalizzati (MATLAB 2019b, Mathworks). Il-potenzjal tal-junction ġie kkalkulat bl-użu ta' JPCalc u d-dħul ġie aġġustat għall-potenzjal tal-junction ikkalkulat ta' -14 mV. L-Operazzjoni IV tikkonsisti f'serje ta' passi ta' kurrent fi passi ta' 5-10 pA minn -50 sa 250 pA.
Għar-rikostruzzjoni morfoloġika tan-newroni maqbudin, 0.2% bijoċitina (Sigma-Aldrich) ġiet miżjuda mas-soluzzjoni interna. Iċ-ċelloli jiġu ppreparati għal mill-inqas 15-il minuta wara l-qtugħ. Il-pipetta mbagħad tinġibed bil-mod għal 1–2 minuti sakemm il-membrana rreġistrata tkun issiġillata kompletament. Wara l-proċedura tal-fiżjoloġija tas-sezzjoni, is-sezzjonijiet ġew iffissati matul il-lejl f'4°C f'4% PFA, maħsula b'PBS X3, u dilwiti 1:1000 b'DyLight 549 jew DyLight 405 (Vector Labs) konjugati ma' streptavidin. Iċ-ċelloli mimlija bil-bijoċitina (2%; Sigma-Aldrich) ġew ittikkettati waqt ir-reġistrazzjoni tal-garża clamp f'temperatura tal-kamra għal sagħtejn. Is-sezzjonijiet imbagħad ġew immuntati fuq slajds tal-mikroskopija bl-użu ta' Aquamount (Thermo Scientific) u viżwalizzati l-għada fuq mikroskopju konfokali Leica TCS SP8 bl-użu ta' oġġettiv ta' immersjoni fiż-żejt b'apertura numerika ×40 1.3, ingrandiment ×0.9–1.0, xy. Ir-rata ta' teħid ta' kampjuni hija ta' madwar 7 pixels kull mikron. Z-stacks f'intervalli ta' 1 µm inkisbu serjalment, u z-stack mosaics u Leica-based auto-stitching twettqu biex ikopru s-siġra dendritika kollha ta' kull newron. In-newroni mbagħad ġew traċċati semi-manwalment bl-użu tal-interface neuTube 40 u ġew iġġenerati fajls SWC. Il-fajls imbagħad ġew imtella' fuq il-plugin SimpleNeuriteTracer41 Fiji (ImageJ, verżjoni 2.1.0; NIH).
It-tessut kortikali uman inkiseb b'kunsens infurmat skont protokoll approvat mill-Bord ta' Reviżjoni Istituzzjonali tal-Università ta' Stanford. Żewġ kampjuni ta' tessut uman wara t-twelid (ta' 3 u 18-il sena) inkisbu permezz ta' resezzjoni tal-kortiċi frontali (ġirus frontali tan-nofs) bħala parti minn kirurġija għal epilessija refrattorja. Wara r-resezzjoni, ħsad it-tessut f'NMDG-aCSF kiesaħ silġ li fih: 92 mM NMDG, 2.5 mM KCl, 1.25 mM NaH2PO4, 30 mM NaHCO3, 20 mM HEPES, 25 mM glukożju, 2 mM tiourea, 5 mM sodium askorbate, 3 mM sodium pyruvate, 0.5 mM CaCl2 4H2O u 10 mM MgSO4 7H2O. Ittitra għal pH 7.3-7.4 b'aċidu idrokloriku kkonċentrat. It-tessuti twasslu fil-laboratorju fi żmien 30 minuta u ttieħdu sezzjonijiet koronali skont il-proċedura deskritta hawn fuq.
Il-proċeduri kollha fuq l-annimali twettqu skont il-linji gwida dwar il-kura tal-annimali approvati mill-APLAC tal-Università ta' Stanford. Il-firien (aktar minn 140 jum wara t-trapjant) ġew indotti b'anestesija ta' 5% isoflurane u anestetizzati b'1-3% isoflurane intraoperattivament. L-annimali tqiegħdu f'qafas stereotassiku (Kopf) u buprenorfina b'rilaxx sostnut (SR) ġiet injettata taħt il-ġilda. Il-kranju ġie espost, imnaddaf u 3-5 viti tal-għadam ġew imdaħħla. Biex nimmiraw lejn it-t-hCO, ġġenerajna koordinati stereotassiċi minn immaġini tal-MRI. Tħaffret toqba fis-sit ta' interess u l-fibri (dijametru ta' 400 µm, NA 0.48, Doric) tbaxxew 100 µm taħt il-wiċċ tal-hCO u twaħħlu mal-kranju b'siment dentali li jitfejjaq bl-UV (Relyx).
Ir-reġistrazzjonijiet fotometriċi tal-fibra twettqu kif deskritt qabel42. Biex tiġi rreġistrata l-attività spontanja, il-firien tqiegħdu f'gaġġa nadifa u kejbil tal-garża tal-fibra ottika b'dijametru ta' 400 µm (Doric) imqabbad ma' sistema ta' akkwist ta' dejta fotometrika tal-fibra ottika ġie konness mal-kejbil tal-fibra ottika impjantat. Matul ir-reġistrazzjoni ta' 10 minuti tal-attività tal-mutur, l-annimali kienu liberi li jesploraw il-gaġġa. Biex tiġi rreġistrata l-attività evokata, il-firien (aktar minn 140 jum wara t-trapjant) ġew anestetizzati b'5% isoflurane għall-induzzjoni u 1-3% isoflurane għall-manutenzjoni. Poġġi l-annimal f'qafas stereotattiku (Kopf) u l-mustaċċi fuq in-naħa opposta tat-t-hCO3 jitqassmu għal madwar 2 ċm u jiġu mgħoddija minn malja konnessa ma' attwatur pjeżoelettriku (PI). Kejbil tal-garża tal-fibra ottika ta' 400 µm (Doric) ġie konness mal-fibra impjantata u konness mas-sistema ta' akkwist tad-dejta. Il-mustaċċi fuq in-naħa opposta tat-t-hCO2 imbagħad ġew deflessi 50 darba (2 mm f'20 Hz, 2 s għal kull preżentazzjoni) f'ħinijiet każwali minn sewqan pjeżoelettriku fuq perjodu ta' reġistrazzjoni ta' 20 minuta. Uża l-Pakkett ta' Appoġġ Arduino MATLAB biex tikkontrolla l-ħin tad-deflessjoni b'kodiċi MATLAB apposta. L-avvenimenti huma sinkronizzati mas-softwer tal-akkwist tad-dejta bl-użu ta' impulsi tal-loġika transistor-transistor (TTL).
Il-firien (aktar minn 140 jum wara t-trapjant) ġew indotti b'anestesija ta' 5% isoflurane u anestetizzati b'1-3% isoflurane intraoperattivament. L-annimali tqiegħdu f'qafas stereotassiku (Kopf) u buprenorphine SR u dexamethasone ġew injettati taħt il-ġilda. Il-kranju ġie espost, imnaddaf u 3-5 viti tal-għadam ġew imdaħħla. Biex nimmiraw it-t-hCO, ġġenerajna koordinati stereotassiċi minn immaġini MRI. Twettqet kranjotomija ċirkolari (madwar 1 ċm fid-dijametru) bi trapan b'veloċità għolja direttament fuq l-hCO trapjantat. Ladarba l-għadam ikun irqiq kemm jista' jkun, iżda qabel ma tittaqqab fl-għadam kollu, uża forceps biex tneħħi d-diska pelvika intatta li jkun fadal biex tikxef it-t-hCO sottostanti. Il-kranjotomija mtliet b'salina sterili, u coverslip u labra speċjali tar-ras ġew imwaħħla mal-kranju b'siment dentali vulkanizzat bl-UV (Relyx).
L-immaġini b'żewġ fotoni twettqet bl-użu ta' mikroskopju multifoton Bruker b'objettiv Nikon LWD (×16, 0.8 NA). L-immaġini GCaMP6 twettqet f'920 nm b'ingrandiment ta' 1.4x fuq pjan z wieħed u medja ta' 8x ta' 7.5 fps. Il-firien ġew indotti b'anestesija ta' 5% isoflurane u miżmuma b'1-3% isoflurane. Il-firien tqiegħdu f'apparat tar-ras magħmul apposta u pożizzjonati taħt il-lenti. Inkisbet reġistrazzjoni fl-isfond ta' 3 minuti tal-attività tal-mutur. Matul 20 minuta ta' reġistrazzjoni, 50 puff (kull preżentazzjoni twila 100 ms) ingħataw b'mod każwali lill-whisker pad oppost għat-t-hCO2 bl-użu ta' picospricer. Uża l-Arduino MATLAB Support Package biex tikkontrolla l-ħin tal-fqigħ b'kodiċi MATLAB apposta. Sinkronizza l-avvenimenti mas-softwer tal-akkwist tad-dejta (PrairieView 5.5) bl-użu ta' impulsi TTL. Għall-analiżi, l-immaġini ġew ikkoreġuti għall-moviment xy bl-użu ta' korrezzjoni affine fil-programm MoCo mniedi fil-Fiġi. Estrazzjoni ta' traċċi fluworexxenti minn ċelloli individwali bl-użu ta' CNMF-E43. Il-fluworexxenza ġiet estratta għal kull reġjun ta' interess, konvertita għal kurvi dF/F, u mbagħad konvertita għal punteġġi z.
Il-firien (aktar minn 140 jum wara t-trapjant) ġew indotti b'anestesija ta' 5% isoflurane u anestetizzati b'1-3% isoflurane intraoperattivament. L-annimali tqiegħdu f'qafas stereotassiku (Kopf) u buprenorphine SR u dexamethasone ġew injettati taħt il-ġilda. Il-mustaċċi fuq in-naħa opposta tat-t-hCO nqatgħu għal madwar 2 ċm u għaddew minn ġo malja konnessa ma' attwatur pjeżoelettriku. Il-kranju jiġi espost u mnaddaf. Vit tal-ert tal-istainless steel huwa mwaħħal mal-kranju. Biex nimmiraw it-t-hCO, ġġenerajna koordinati stereotassiċi minn immaġini MRI. Wettaq kranjotomija ċirkolari (madwar 1 ċm fid-dijametru) bi trapan b'veloċità għolja eżatt 'il fuq mit-t-hCO. Ladarba l-għadam ikun irqiq kemm jista' jkun, iżda qabel ma tħaffer mill-għadam kollu, uża forceps biex tneħħi d-diska pelvika intatta li jkun fadal biex tikxef it-t-hCO sottostanti. Iċ-ċelloli individwali ġew irreġistrati bl-użu ta' sondi tas-silikon ta' densità għolja ta' 32 kanal jew 64 kanal (Cambridge Neurotech) imqabbda ma' viti tal-art u pre-amplifikati b'amplifikaturi RHD (Intan). Uża l-manipulatur biex tbaxxi l-elettrodi għas-sit fil-mira permezz tal-kranjotomija, li hija mimlija b'salina sterili. Il-ġbir tad-dejta sar bi frekwenza ta' 30 kHz bl-użu tas-sistema ta' akkwist tad-dejta Open Ephys. Ir-reġistrazzjoni kompliet biss meta skoprejna attività spontanja ritmika korrelata ħafna f'aktar minn 10 kanali, li tissuġġerixxi li l-elettrodi kienu jinsabu fit-tilqima (ibbażata fuq dejta ta' immaġini tal-kalċju b'żewġ fotoni). Inkisbet reġistrazzjoni fl-isfond ta' 10 minuti tal-attività tal-mutur. Il-mustaċċi fuq in-naħa opposta tat-t-hCO3 imbagħad ġew deflessi 50 darba (2 mm f'20 Hz, 2 s għal kull preżentazzjoni) f'ħinijiet każwali minn sewqan pjeżoelettriku fuq perjodu ta' reġistrazzjoni ta' 20 minuta. Bl-użu tal-MATLAB Support Package għal Arduino (MATLAB 2019b), ikkontrolla l-ħin tad-deflessjoni b'kodiċi MATLAB apposta. Uża impulsi TTL biex tissinkronizza l-avvenimenti mas-softwer tal-akkwist tad-dejta.
Għal esperimenti ta' mmarkar ottiku, korda tal-garża ottika ta' 200 µm (Doric) imqabbda ma' laser ta' 473 nm (Omicron) ġiet imqabbda ma' fibra ottika ta' 200 µm imqiegħda fuq il-kranjotomija. Immedjatament qabel dan, aġġusta l-qawwa tal-jumper għal 20 mW. Uża l-manipulatur biex tbaxxi l-elettrodi għas-sit fil-mira permezz tal-kranjotomija, li hija mimlija b'salina sterili. Fil-bidu tar-reġistrazzjoni, inħarġu għaxar impulsi ta' dawl ta' 473 nm (frekwenza ta' 2 Hz, tul tal-impuls ta' 10 ms). Iċ-ċelloli fotosensittivi ġew definiti bħala ċelloli li wrew rispons ta' spike fi żmien 10 ms ta' dawl f'70% jew aktar tal-provi.
Ħin tal-posta: 19 ta' Novembru 2022
