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Selbstassemblierende neuronale Organellen stellen eine vielversprechende In-vitro-Plattform für die Modellierung menschlicher Entwicklung und Erkrankungen dar. Organoiden fehlt jedoch die in vivo vorhandene Konnektivität, was die Reifung einschränkt und die Integration mit anderen verhaltenssteuernden Schaltkreisen verhindert. Hier zeigen wir, dass aus menschlichen Stammzellen gewonnene kortikale Organoide, die in den somatosensorischen Kortex neugeborener Nacktmäusen transplantiert wurden, reife Zelltypen entwickeln, die sich in sensorische und motivationsbezogene Schaltkreise integrieren. MRT-Untersuchungen zeigten posttransplantiertes Organoidwachstum in mehreren Stammzelllinien und Tieren, während Einzelkernanalysen das Fortschreiten der Kortikogenese und die Entstehung eines aktivitätsabhängigen Transkriptionsprogramms zeigten. Tatsächlich weisen transplantierte kortikale Neuronen komplexere morphologische, synaptische und interne Membraneigenschaften auf als ihre In-vitro-Pendants, was die Erkennung neuronaler Defekte bei Patienten mit Timothy-Syndrom ermöglicht. Anatomische und funktionelle Analysen haben gezeigt, dass transplantierte Organellen thalamokortikale und kortikokortikale Inputs empfangen, und In-vivo-Aufzeichnungen der neuronalen Aktivität legen nahe, dass diese Inputs sensorische Reaktionen in menschlichen Zellen auslösen können. Schließlich erweitern kortikale Organoide Axone im gesamten Rattenhirn, und ihre optogenetische Aktivierung führt zu belohnungssuchendem Verhalten. Dadurch reifen transplantierte menschliche Kortexneuronen heran und nehmen an den verhaltenssteuernden Schaltkreisen des Wirts teil. Wir erwarten, dass dieser Ansatz die Erkennung von Strangphänotypen in patienteneigenen Zellen erleichtert, die mit anderen Mitteln nicht nachgewiesen werden können.
Die Entwicklung des menschlichen Gehirns ist ein bemerkenswerter selbstorganisierender Prozess, bei dem Zellen sich vermehren, differenzieren, migrieren und verbinden, um funktionale neuronale Schaltkreise zu bilden, die durch Sinneserfahrungen weiter verfeinert werden. Ein zentrales Problem beim Verständnis der menschlichen Gehirnentwicklung, insbesondere im Zusammenhang mit Krankheiten, ist der fehlende Zugang zum Hirngewebe. Selbstorganisierende Organellen, einschließlich menschlicher Cortex-Organoide (hCO; auch als menschliche Cortex-Sphäre bekannt), können 2,3,4,5,6 erzeugen. Mehrere Einschränkungen erschweren jedoch ihre breitere Anwendung zum Verständnis der Entwicklung und Funktionsweise neuronaler Schaltkreise. Insbesondere ist unklar, ob die hCO-Reifung durch das Fehlen bestimmter in vivo vorhandener mikroökologischer und sensorischer Inputs begrenzt ist. Da hCOs zudem nicht in Schaltkreise integriert sind, die Verhaltensergebnisse generieren können, ist ihr Nutzen bei der Modellierung genetisch komplexer und verhaltensbezogener neuropsychiatrischer Störungen derzeit begrenzt.
Die Transplantation von hCO in ein intaktes lebendes Gehirn kann diese Einschränkungen überwinden. Frühere Studien haben gezeigt, dass in den Kortex von Nagetieren transplantierte menschliche Neuronen überleben, projizieren und mit Nagetierzellen kommunizieren können7,8,9,10,11,12. Diese Experimente werden jedoch üblicherweise an erwachsenen Tieren durchgeführt, was die synaptische und axonale Integration einschränken kann. Hier beschreiben wir ein Transplantationsparadigma, bei dem wir aus hiPS-Zellen gewonnenes 3D-hCO in einem frühen Stadium der plastischen Entwicklung in den primären somatosensorischen Kortex (S1) immundefizienter Ratten transplantiert haben. Transplantierte hCO-Neuronen (t-hCO) reifen erheblich, empfangen thalamokortikale und kortikal-kortikale Inputs, die sensorische Reaktionen hervorrufen, und erweitern axonale Projektionen in das Rattenhirn, um Belohnungsverhalten auszulösen. Eine verlängerte Reifung von t-hCO hat neuronale Defekte bei Patienten mit Timothy-Syndrom (TS) offenbart, einer schweren genetischen Erkrankung, die durch Mutationen im spannungsempfindlichen L-Typ-CaV1.2-Calciumkanal (kodiert durch CACNA1C) verursacht wird.
Um menschliche kortikale Neuronen in Schaltkreisen in vivo zu untersuchen, transplantierten wir stereotaktisch intaktes 3D-hCO in S1 früh postnataler athymischer Ratten (3.–7. Tag postnatal) (Abb. 1a und erweiterte Daten in Abb. 1a–c). Zu diesem Zeitpunkt hatten die thalamokortikalen und kortikokortikalen Axonprojektionen ihre S1-Innervation noch nicht abgeschlossen (Ref. 13). Dieser Ansatz zielt daher darauf ab, die t-hCO-Integration zu maximieren und gleichzeitig die Auswirkungen auf endogene Schaltkreise zu minimieren. Um die Lage von t-hCO in lebenden Tieren zu visualisieren, führten wir 2–3 Monate nach der Transplantation T2-gewichtete MRT-Gehirnrekonstruktionen von Ratten durch (Abb. 1b und erweiterte Daten in Abb. 1d). t-hCO konnte leicht beobachtet werden und die Volumenmessungen von t-hCO ähnelten denen, die aus festen Scheiben berechnet wurden (Erweiterte Daten, Abb. 1d,e; P > 0,05). t-hCO konnte leicht beobachtet werden und die Volumenmessungen von t-hCO ähnelten denen, die aus festen Scheiben berechnet wurden (Erweiterte Daten, Abb. 1d,e; P > 0,05). t-hCO wurde kürzlich eingeführt, eine eindeutige Definition von t-hCO war eine analoge Analyse für physikalische Bereiche (reduzierte Daten, 1d, e; P> 0,05). t-hCO konnte leicht beobachtet werden und die volumetrischen t-hCO-Messungen ähnelten denen, die für feste Abschnitte berechnet wurden (erweiterte Daten, Abb. 1d, e; P > 0,05).很容易观察到t-hCO, 并且t-hCO的体积测量值与从固定切片计算的测量值相似（扩展数据图1d、e；P > 0.05）。很容易观察到t-hCO, 并且t-hCO t-hCO wurde kürzlich eingeführt, und als eindeutige Größe wurde t-hCO analog für physikalische Bereiche analysiert (verwendete Ergebnisse, 1d, e; P>). 0,05). t-hCO konnte leicht beobachtet werden und die volumetrischen t-hCO-Messungen ähnelten denen, die für feste Abschnitte berechnet wurden (erweiterte Daten, Abb. 1d, e; P > 0,05).Wir bestimmten t-hCO bei 81 % der transplantierten Tiere etwa 2 Monate nach der Transplantation (n = 72 Tiere; hCO aus 10 hiPS-Zelllinien; hiPS-Zelllinien in Ergänzungstabelle 1). Davon befanden sich 87 % in der Großhirnrinde (Abb. 1c). Durch die Durchführung serieller MRT-Scans zu mehreren Zeitpunkten bei derselben transplantierten Ratte stellten wir innerhalb von 3 Monaten eine neunfache Zunahme des t-hCO-Volumens fest (Abb. 1d und erweiterte Daten, Abb. 1f). Die transplantierten Tiere hatten 12 Monate nach der Transplantation eine hohe Überlebensrate (74 %) (erweiterte Daten, Abb. 1g und Ergänzungstabelle 2) und es wurden keine offensichtlichen motorischen oder Gedächtnisstörungen, Gliose oder Elektroenzephalogramm (EEG) festgestellt. Daten Abb. 1g und Ergänzungstabelle 2). 1h–m und 3e).
a, Schema des experimentellen Designs. Aus hiPS-Zellen gewonnenes hCO wurde an den Tagen 30-60 der Differenzierung in S1 neugeborener Nacktratten transplantiert. b, T2-gewichtete koronale und horizontale MRT-Bilder zeigen t-hCO in S1 2 Monate nach der Transplantation. Maßstab 2 mm. c, Quantifizierung der Transplantationserfolgsraten für jede hiPS-Zelllinie (n = 108, Zahlen innerhalb der Balken geben die Menge an t-hCO pro hIPS-Zelllinie an) und kortikale oder subkortikale Lage (n = 88). d, MRT-Bild einer Koronararterie (links; Maßstab 3 mm) und entsprechende volumetrische 3D-Rekonstruktion (Maßstab 3 mm), die einen Anstieg von t-hCO über 3 Monate zeigt. e, Überprüfung der t-hCO-Muster in der Großhirnrinde von Ratten. Maßstab 1 mm. f, Repräsentative immunzytochemische Bilder von t-hCO von oben links nach rechts (während der Differenzierung): PPP1R17 (4 Monate alt), NeuN (8 Monate alt), SOX9 und GFAP (8 Monate alt), PDGFRα; (8 Monate), MAP2 (8 Monate) und IBA1 (8 Monate). Maßstab 20 µm. Koexpression von HNA weist auf Zellen menschlichen Ursprungs hin. g, snRNA-seq: Unified Manifold and Projection (UMAP)-Dimensionsreduktionsbildgebung aller hochwertigen t-hCO-Kerne nach Seurat-Integration (n=3 t-hCO-Proben, n=2 hiPS-Zelllinien). Astrozyten, Zellen der Astrozytenlinie; cyc prog, zirkulierende Vorläuferzellen; GluN DL, tiefe glutamaterge Neuronen; GluN DL/SP, tiefe und sublamellare glutamaterge Neuronen; GluN UL, glutamaterge Neuronen der oberen Schicht; Oligodendrozyten, Oligodendrozyten; OPC, Oligodendrozyten-Vorläuferzellen; RELN, Reelin-Neuronen. h, Genontologie (GO)-Termanreicherungsanalyse von Genen, die in glutamatergen t-hCO-Neuronen im Vergleich zu glutamatergen hCO-Neuronen signifikant hochreguliert sind (angepasstes P < 0,05, Faltungsänderung > 2, exprimiert in mindestens 10 % der Kerne). h, Genontologie (GO)-Termanreicherungsanalyse von Genen, die in glutamatergen t-hCO-Neuronen im Vergleich zu glutamatergen hCO-Neuronen signifikant hochreguliert sind (angepasstes P < 0,05, Faltungsänderung > 2, exprimiert in mindestens 10 % der Kerne). h, Analyse der verwendeten Begriffe „Gene Ontology (GO)“ für die Gen-Ontologie (GO) mit automatischer Aktivierung (Reduzierung P <0,05, Mindestgröße > 2, maximale Genauigkeit). Nur 10 % ядер) in glutamatergisch-neironalem t-hCO aufgrund der Verdünnung mit glutamatergischem neurologischem hCO. h, Genontologie (GO)-Termanreicherungsanalyse für Gene mit signifikanter Aktivierung (angepasstes P <0,05, Faltungsänderung >2, Expression in mindestens 10 % der Kerne) in t-hCO-glutamatergen Neuronen im Vergleich zu hCO-glutamatergen Neuronen. h, 与hCO 谷氨酸能神经元相比, t-hCO 谷氨酸能神经元中基因显着上调（调整后P < 0.05，倍数变化> 2,在至少10% 的细胞核中表达）的基因本体论(GO) 术语富集分析。 h, 与 hco 谷氨酸 能 元 相比, t-hco 谷氨酸 能 神经 元 基因 显着 上调 （后 后 p <0,05, 变化变化> 2, 至少 10% 的 核中 表达） 基因 基因 基因 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的的 的本体论(GO) 术语富集分析. h, гены значительно активизировались (korrekter P <0,05, maximale Größe > 2, Druck auf 10 % pro Jahr) в glutamatergischisch Neues t-hCO im Vergleich zu glutamatergischen neuen hCO-Analysen (GO). h, Gene waren in t-hCO-glutamatergen Neuronen im Vergleich zu hCO-glutamatergen Neuronen signifikant hochreguliert (angepasstes P < 0,05, Faltungsänderung > 2, exprimiert in mindestens 10 % der Kerne). Ontologische (GO) Analyse des Anreicherungsterms.Die gepunktete Linie zeigt einen aq-Wert von 0,05 an. i, UMAP-Bildgebung von GluN-Zelltypen in t-hCO unter Verwendung von Label-Transfer aus einem Referenz-22-snRNA-seq-Datensatz des adulten motorischen Kortex. CT – kortikothalamische Zellen, ET – extrazerebrale Zellen, IT – innere Telencephalonzellen, NP – Nahprojektion.
Anschließend untersuchten wir die Zytoarchitektur und die allgemeine Zellzusammensetzung von t-hCO. Eine Antikörperfärbung von Ratten-Endothelzellen ergab eine Vaskularisierung mit t-hCO, während eine IBA1-Färbung das Vorhandensein von Ratten-Mikroglia im gesamten Transplantat zeigte (Abb. 1f und erweiterte Daten, Abb. 3c,d). Eine Immunfärbung ergab positive Zellen des humanen nukleären Antigens (HNA), die PPP1R17 (kortikale Vorläuferzellen), NeuN (Neuronen), SOX9 und GFAP (gliale Zellen) oder PDGFRα (Oligodendrozyten-Vorläuferzellen) koexprimierten (Abbildung 1f). Um die Zellzusammensetzung von t-hCO mit Einzelzellauflösung zu untersuchen, führten wir nach etwa 8 Monaten Differenzierung eine Single-Core-RNA-Sequenzierung (snRNA-seq) durch. Durch Massenfiltration und Entfernung von Rattenkernen wurden 21.500 hochwertige humane mononukleäre Karten erstellt (Abb. 1g und erweiterte Daten, Abb. 4a,b). Expressionsmuster typischer Zelltypmarker identifizierten Cluster wichtiger kortikaler Zellklassen, darunter tiefe und oberflächliche glutamaterge Neuronen, zirkulierende Vorläuferzellen, Oligodendrozyten und Astrozyten (Abb. 1g, erweiterte Daten, Abb. 4c und ergänzende Tabelle 3). Immunfärbungen für SATB2 und CTIP2 zeigten, dass t-hCO trotz des Vorhandenseins kortikaler Subtypen keine klare anatomische Schichtung aufwies (erweiterte Daten, Abb. 3a). stufenangepasste snRNA-Sequenzierung von hCO produzierte weitgehend ähnliche Zellklassen, mit wenigen Ausnahmen, einschließlich der Abwesenheit von Oligodendrozyten und der Anwesenheit von GABAergen Neuronen, was die zuvor berichteten günstigen In-vitro-Bedingungen für laterale Progenitorzellen widerspiegeln könnte15 (erweiterte Daten, Abb. 4f – i und ergänzende Tabelle 4). Die Analyse der differentiellen Genexpression ergab signifikante Unterschiede bei glutamatergen Neuronen zwischen t-hCO und hCO (ergänzende Tabelle 5), einschließlich der Aktivierung von Gensätzen, die mit der neuronalen Reifung verbunden sind, wie synaptische Signalgebung, dendritische Lokalisierung und spannungsgesteuerte Kanalaktivität (Abb. 1h und ergänzende Tabelle 5; Tabelle 6). Dementsprechend wiesen kortikale glutamaterge t-hCO-Neuronen eine beschleunigte transkriptionelle Reifung auf.
Um zu klären, ob diese transkriptionellen Veränderungen in t-hCO mit morphologischen Unterschieden zwischen hCO in vitro und t-hCO in vivo zusammenhängen, rekonstruierten wir stadienangepasstes, mit Biocytin gefülltes hCO und hCO in akuten Schnitten nach 7–8 Monaten Differenzierung. hCO-Neuronen (Abb. 2a). t-hCO-Neuronen waren signifikant größer, hatten einen 1,5-fachen Somadurchmesser, doppelt so viele Dendriten und eine insgesamt sechsmal größere dendritische Gesamtlänge als in vitro-hCO (Abb. 2b). Darüber hinaus beobachteten wir eine signifikant höhere Dichte dendritischer Dornen in t-hCO-Neuronen als in hCO-Neuronen (Abb. 2c). Dies deutet darauf hin, dass t-hCO-Neuronen eine starke dendritische Verlängerung und Verzweigung durchlaufen, was in Kombination mit fortgesetzter Zellproliferation zum intensiven Wachstum von t-hCO nach der Transplantation beitragen könnte (Abb. 1d und Erweiterte Daten Abb. 1f). Dies veranlasste uns, die elektrophysiologischen Eigenschaften zu untersuchen. Die Membrankapazität war achtmal höher (erweiterte Daten, Abb. 8d), das Ruhemembranpotential war stärker hyperpolarisiert (ca. 20 mV) und die Strominjektion induzierte in t-hCO-Neuronen eine höhere maximale Erregungsrate als in hCO-Neuronen. in vitro (Abb. 2d), e), was mit den umfangreicheren und komplexeren morphologischen Merkmalen von t-hCO übereinstimmt. Außerdem war die Frequenz spontaner exzitatorischer postsynaptischer Stromereignisse (EPSC) in t-hCO-Neuronen signifikant höher (Abb. 2f), was darauf hindeutet, dass die in t-hCO-Neuronen beobachtete erhöhte Dichte dendritischer Dornen mit funktioneller Erregbarkeit verbunden war. sexuelle Synapse. Wir bestätigten den unreifen Charakter von hCO-Neuronen in vitro durch Aufzeichnung markierter glutamaterger Neuronen (erweiterte Daten, Abb. 6a-c).
a, 3D-Rekonstruktion von mit Biocytin gefüllten hCO- und t-hCO-Neuronen nach 8 Monaten Differenzierung. b, Quantifizierung morphologischer Merkmale (n = 8 hCO-Neuronen, n = 6 t-hCO-Neuronen; **P = 0,0084, *P = 0,0179 und ***P < 0,0001). b, Quantifizierung morphologischer Merkmale (n = 8 hCO-Neuronen, n = 6 t-hCO-Neuronen; **P = 0,0084, *P = 0,0179 und ***P < 0,0001). б, количественная оценка морфологических признаков (n = 8 neue hCO, n = 6 neue t-hCO; ** P = 0,0084, * P = 0,0179 und *** P <0,0001). b, Quantifizierung morphologischer Merkmale (n=8 hCO-Neuronen, n=6 t-hCO-Neuronen; **P=0,0084, *P=0,0179 und ***P<0,0001). b, 形态学特征的量化（n = 8 个hCO 神经元, n = 6 个t-hCO 神经元；**P = 0,0084,*P = 0,0179 和***P < 0,0001）。 b, 形态学特征的量化（n = 8 个hCO 神经元, n = 6 个t-hCO 神经元；**P = 0,0084,*P = 0,0179 和***P < 0,0001）。 б, количественная оценка морфологических признаков (n = 8 neue hCO, n = 6 neue t-hCO; ** P = 0,0084, * P = 0,0179 und *** P <0,0001). b, Quantifizierung morphologischer Merkmale (n=8 hCO-Neuronen, n=6 t-hCO-Neuronen; **P=0,0084, *P=0,0179 und ***P<0,0001).c, 3D-Rekonstruktion der hCO- und t-hCO-Dendritenäste nach 8 Monaten Differenzierung. Rote Sternchen kennzeichnen mutmaßliche dendritische Dornen. Quantifizierung der Dendritendorndichte (n = 8 hCO-Neuronen, n = 6 t-hCO-Neuronen; **P = 0,0092). d, Quantifizierung des Ruhemembranpotentials (n = 25 hCO-Neuronen, n = 16 t-hCO-Neuronen; ***P < 0,0001). d, Quantifizierung des Ruhemembranpotentials (n = 25 hCO-Neuronen, n = 16 t-hCO-Neuronen; ***P < 0,0001). d, 100 % Konzentration der Membran (n = 25 hCO, n = 16 t-hCO; *** P <0,0001). d, Quantifizierung des Ruhemembranpotentials (n = 25 hCO-Neuronen, n = 16 t-hCO-Neuronen; ***P < 0,0001). d,静息膜电位的量化（n = 25 hCO 神经元, n = 16 t-hCO 神经元；***P < 0,0001）。 d,静息膜电位的量化（n = 25 hCO 神经元, n = 16 t-hCO 神经元；***P < 0,0001）。 d, 100 % Konzentration der Membran (n = 25 hCO, n = 16 t-hCO; *** P <0,0001). d, Quantifizierung des Ruhemembranpotentials (n = 25 hCO-Neuronen, n = 16 t-hCO-Neuronen; ***P < 0,0001). e. Wiederholte Aktionspotentialauslösung in hCO und t-hCO, induziert durch zunehmende Strominjektionen, und Quantifizierung der maximalen Auslösungsrate (n = 25 hCO-Neuronen, n = 16 t-hCO-Neuronen; ***P < 0,0001). e. Wiederholte Aktionspotentialauslösung in hCO und t-hCO, induziert durch zunehmende Strominjektionen, und Quantifizierung der maximalen Auslösungsrate (n = 25 hCO-Neuronen, n = 16 t-hCO-Neuronen; ***P < 0,0001). e, zusätzliches Wirkungspotential für die Entwicklung von hCO und t-hCO, sehr hohe Konzentration und maximale Konzentration (n = 25). нейронов hCO, n = 16 нейронов t-hCO; *** P <0,0001). e, erneute Aktivierung von Aktionspotentialen in hCO und t-hCO, induziert durch Stromerhöhung und Quantifizierung der maximalen Aktivierungsrate (n = 25 hCO-Neuronen, n = 16 t-hCO-Neuronen; *** P < 0,0001). e, 通过增加电流注入诱导的hCO 和t-hCO 重复动作电位放电,以及最大放电率的量化（n = 25 个hCO神经元，n = 16 个t-hCO 神经元；***P < 0,0001）。 E;神经, n = 16 个 t-hco 神经 ； *** p <0,0001） 。 Das bedeutet, dass das Potenzial für die Bestimmung von hCO und t-hCO besteht, die Menge an Nährstoffen zu erhöhen und eine maximale Konzentration an Wasser zu gewährleisten (n = 25 Nanometer hCO, n = 16 Nanometer t-hCO; *** P <0,0001). e, wiederholtes Feuern von hCO- und t-hCO-Aktionspotentialen, induziert durch erhöhte Stromzufuhr und Quantifizierung der maximalen Feuerungsrate (n = 25 hCO-Neuronen, n = 16 t-hCO-Neuronen; *** P < 0,0001). f, Spontane EPSCs (sEPSCs) in hCO- und t-hCO-Neuronen nach 8 Monaten Differenzierung und Quantifizierung der Häufigkeit synaptischer Ereignisse (n = 25 hCO-Neuronen, n = 17 t-hCO-Neuronen; ***P < 0,0001). f. Spontane EPSCs (sEPSCs) in hCO- und t-hCO-Neuronen nach 8 Monaten Differenzierung und Quantifizierung der Häufigkeit synaptischer Ereignisse (n = 25 hCO-Neuronen, n = 17 t-hCO-Neuronen; ***P < 0,0001). f, sekundäres EPSC (sEPSC) in den neuen hCO- und t-hCO-Gebieten mit 8 Monaten Unterschieden und durchschnittlicher Konzentration an synaptischen Tests (n = 25 neue hCO, n = 17 нейронов t-hCO *** P <0,0001) . f, Spontane EPSCs (sEPSCs) in hCO- und t-hCO-Neuronen nach 8 Monaten Differenzierung und Quantifizierung der synaptischen Ereignisraten (n=25 hCO-Neuronen, n=17 t-hCO-Neuronen; ***P<0,0001). f, 分化8 个月时hCO 和t-hCO 神经元中的自发性EPSCs (sEPSCs), 以及突触事件频率的量化（n = 25 hCO神经元，n = 17 t-hCO 神经元；***P < 0,0001） . f, 分化8 个月时hCO 和t-hCO 神经元中的自发性EPSCs (sEPSCs), 以及突触事件频率的量匼（n = 25 hCO神率的量匼（n = 25 hCO 神率的量匼（n = 25hCO P < 0,0001） . f, sekundäres EPSC (sEPSC) in den neuen hCO- und t-hCO-Gebieten mit 8 Monaten Unterschieden und durchschnittlicher Konzentration an synaptischen Tests (n = 25 neue hCO, n = 17 нейронов t-hCO *** P <0,0001). f, Spontane EPSCs (sEPSCs) in hCO- und t-hCO-Neuronen nach 8 Monaten Differenzierung und Quantifizierung der synaptischen Ereignisraten (n = 25 hCO-Neuronen, n = 17 t-hCO-Neuronen; *** P < 0,0001).Für bf wurden hCO und t-hCO in Zeile 1208-2 aus derselben parallel geführten Differenzierungscharge entnommen. g. Gensatzanreicherungsanalyse (einseitiger exakter Test nach Fisher) von Genen, die in glutamatergen t-hCO-Neuronen signifikant hochreguliert sind (korrigiertes P < 0,05, Faltungsänderung > 2, exprimiert in mindestens 10 % der Kerne) im Vergleich zu glutamatergen hCO-Neuronen mit Gensätzen sowohl von aktivitätsabhängigen Genen für die frühe Reaktion (ERG) als auch für die späte Reaktion (LRG), die in einer In-vivo-Studie an Mäusen16 identifiziert wurden, und menschenspezifischen LRGs aus In-vitro-Neuronen17. g. Gensatzanreicherungsanalyse (einseitiger exakter Test nach Fisher) von Genen, die in glutamatergen t-hCO-Neuronen signifikant hochreguliert sind (korrigiertes P < 0,05, Faltungsänderung > 2, exprimiert in mindestens 10 % der Kerne) im Vergleich zu glutamatergen hCO-Neuronen mit Gensätzen sowohl von aktivitätsabhängigen Genen für die frühe Reaktion (ERG) als auch für die späte Reaktion (LRG), die in einer In-vivo-Studie an Mäusen16 identifiziert wurden, und menschenspezifischen LRGs aus In-vitro-Neuronen17. g, Analysieren der Analyse auf der Grundlage von Genen (übereinstimmendes, genaues Kriterium der Fischverarbeitung) Generieren mit einer hervorragenden Aktivierung (Skorrektur P <0,05, Höchstwert). Größe > 2, Ausstoß von nur 10 % pro Tag) in glutamatergischen t-hCO aufgrund der Verminderung von glutamatergienischen hCO-Ernährungstests (ERG), auch Genetisches (LRG) Gen, Nachweis von Aktivitaten, Identifizierung in der Folge von In-vivo-Mäusen16 und spezielle Tests für LRG-Leute aus Neuronen in vitro17. g, Analyse der Gensatzanreicherung (einseitiger exakter Test nach Fisher) von Genen mit signifikanter Aktivierung (korrigierter P < 0,05, Faltungsänderung > 2, Expression in mindestens 10 % der Kerne) in t-hCO-glutamatergen Neuronen im Vergleich zu hCO-glutamatergen Neuronensätzen sowohl früher (ERG) als auch später (LRG) aktivitätsabhängiger Gene, die in In-vivo-Mäusen16 und menschenspezifischen LRGs aus Neuronen in vitro17 identifiziert wurden. g,t-hCO谷氨酸能神经元与hCO谷氨酸能神经元相比,t -hCO谷氨酸能神经元显着上调（调整后P<0.05，倍数变化>2,在至少10%的细胞核中表达）的基因集富集分析（单侧F isher (ERG)和晚期反应(LRG) 活性依赖性基因的基因组16 和体外神经元17 中的人类特异性LRG. g, t-hco 谷氨酸 神经 元 与 hco 谷氨酸 神经 元 相比, t-hco 谷氨酸 神经 元 上调 （调整 后 p <0,05,倍数> 2, 至少 至少 10%的 细胞 核中 表达） 的 集富集 分析 (单侧 Fisher 精确） 体内 小鼠 研究 中 的 早期 反应 反应 反应 和 晚期 反应 反应 (lrg) 活性 基因 的 基因组 16 和神经元 神经元 17 中 中 17 中 17的人类特异性LRG. g, Glutamat-Neurone t-hCO wurde aufgrund der Zersetzung mit Glutamat-Neuronen hCO (Skorrektur P<0,05, Kratzfestigkeit) aktiviert Auflösung > 2, nicht mehr als 10 %. Analyse der Analyseergebnisse (übereinstimmender Fischtest) anhand der Ergebnisse (ERG) und nachfolgender Generationen, Anforderungen от активности ответа (LRG), Identifizieren von Blutproben in vivo16 und Neuronen in vitro17. LRG, speziell für Privatpersonen. g, t-hCO-glutamaterge Neuronen waren im Vergleich zu hCO-glutamatergen Neuronen signifikant hochreguliert (korrigiertes P < 0,05, Faltungsänderung > 2, mindestens 10 %. Frühreaktion (ERG) und späte Reaktionsgenanreicherungsanalyse (einseitiger exakter Test nach Fisher). Reaktionsaktivitätsabhängige Gene (LRGs) wurden in In-vivo-Mäusen16 und In-vitro-Neuronen17 identifiziert. Menschliche LRGs.Die gepunktete Linie zeigt einen Bonferroni-korrigierten P-Wert von 0,05. h, Die GluN-Genexpression (Pseudopaket und Skalierung jedes Gens) war in snRNA-seq-Replikaten von LRG-Genen in glutamatergen t-hCO-Neuronen signifikant hochreguliert. i, Immunfärbung zeigt SCG2-Expression in t-hCO- (oben) und hCO-Neuronen (unten). Weiße Pfeile zeigen auf SCG2+-Zellen. Maßstab: 25 µm. Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung angegeben.
Basierend auf der erhöhten Aktivität von t-hCO, die in Ex-vivo-Schnitten beobachtet wurde, zeigte snRNA-Sequenzierung eine aktivitätsabhängige Hochregulierung der Gentranskripte in t-hCO im Vergleich zu hCO in vitro. Glutamaterge t-hCO-Neuronen exprimierten höhere Konzentrationen von Genen, die die späte Reaktionsaktivität regulieren (Abb. 2g,h), was in früheren Studien an Neuronen von Mäusen und Menschen festgestellt worden war16,17. Beispielsweise zeigten BDNF18, SCG2 und OSTN, ein primatenspezifisches aktivitätsregulierendes Gen, eine erhöhte Expression in t-hCO-Neuronen im Vergleich zu hCO-Neuronen (Abb. 2g-i). Somit wiesen t-hCO-Neuronen laut transkriptioneller, morphologischer und funktioneller Analysen verbesserte Reifungseigenschaften im Vergleich zu hCO-Neuronen auf.
Um den Zusammenhang zwischen der t-hCO-Reifung und der menschlichen Gehirnentwicklung weiter zu untersuchen, haben wir transkriptomische Vergleiche fetaler und adulter kortikaler Zelltypen19,20 und adulter21,22 durchgeführt und umfangreiche Daten zur kortikalen Genexpression23 während der Entwicklung erhoben (erweiterte Daten, Abb. 5). Wie aus früheren Arbeiten 24 hervorgeht, stimmt der globale Transkriptomreifungsstatus von hCO und t-hCO nach 7–8 Monaten der Differenzierung weitgehend mit der Entwicklungszeit in vivo überein und entspricht am ehesten dem späten fetalen Leben (Erweiterte Daten, Abb. 5a). Insbesondere haben wir eine erhöhte Transkriptomreife bei t-hCO im Vergleich zu altersentsprechendem hCO sowie eine Transkriptomaktivierung beobachtet, die mit Synaptogenese, Astrogenese und Myelinisierung assoziiert ist (erweiterte Daten, Abb. 5b-d). Auf zellulärer Ebene fanden wir Hinweise auf einen dünneren Kortex-Subtyp bei t-hCO, wobei sich Cluster glutamaterger Neuronen mit adulten Neuronen-Subtypen L2/3, L5 und L6 überlappen (Abbildung 1i). Im Gegensatz dazu war die Cluster-Überlappung zwischen glutamatergen t-hCO-Neuronen und fetalen Kortexneuronen in der Mitte der Schwangerschaft geringer (erweiterte Daten, Abbildung 5e-j). Um festzustellen, ob t-hCO-Neuronen funktionell den menschlichen postnatalen neokortikalen Neuronen ähneln, führten wir elektrophysiologische Aufzeichnungen und anatomische Rekonstruktionen menschlicher L2/3-Pyramidenneuronen in scharfen Schnitten des menschlichen postnatalen Kortex durch (erweiterte Daten, Abbildung 7a). Die elektrophysiologischen Eigenschaften der L2/3-Pyramidenneuronen waren denen der t-hCO-Pyramidenneuronen ähnlich (erweiterte Daten, Abbildung 7e). Morphologisch ähnelten L2/3-Neuronen aus postnatalen menschlichen Proben eher t-hCO als hCO, obwohl L2/3-Zellen länger waren, insgesamt mehr Verzweigungen enthielten und eine höhere Dorndichte aufwiesen (Abb. 3g und erweiterte Daten, Abb. 7b-). G).
a, Transplantation von hCO, das von Kontroll- und TS-hiPS-Zelllinien produziert wurde, in neugeborene Ratten. b, 3D-Rekonstruktion von mit Biocytin gefüllten t-hCO-Neuronen nach 8 Monaten Differenzierung. c, Quantifizierung der mittleren dendritischen Länge (n = 19 Kontrollneuronen, n = 21 TS-Neuronen; **P = 0,0041). d, 3D-rekonstruierte dendritische Äste von Kontroll- und TS-t-hCO nach 8 Monaten Differenzierung und Quantifizierung der dendritischen Dorndichte (n = 16 Kontrollneuronen, n = 21 TS-Neuronen, ***P < 0,0001). d, 3D-rekonstruierte dendritische Äste von Kontroll- und TS-t-hCO nach 8 Monaten Differenzierung und Quantifizierung der dendritischen Dorndichte (n = 16 Kontrollneuronen, n = 21 TS-Neuronen, ***P < 0,0001). d, 3D-Rekonstruktion von vertikalen Strukturen und TS t-hCO beträgt 8 Monate Differenz und eine Reihe von Berechnungspunkten (n = 16 Kontrollneuronen, n = 21 TS Neuronen, *** P <0,0001). d, 3D-Rekonstruktion dendritischer Äste von Kontroll- und t-hCO-TS nach 8 Monaten Differenzierung und Quantifizierung der dendritischen Dorndichte (n=16 Kontrollneuronen, n=21 TS-Neuronen, ***P<0,0001). d,分化8 个月时对照和TS t-hCO 的3D 重建树突分支,以及树突棘密度的量化（n = 16 Beispiel: n = 21 TS-Werte, ***P < 0,0001）. d, 分化 8 个 时 对照 和 ts t-hco 的 3d 重建 分支 分支 以及 树突棘 密度 量化 （n = 16 个 神经元, n = 21 个 ts 神经, *** p <0,0001 ）。 d, 3D-Rekonstruktion dreidimensionaler Kontrollsysteme und TS t-hCO umfassen 8 Monate Differenzen und eine Reihe von Analyseergebnissen (n = 16 Kontrollneuronen, n = 21 TS Neuronen, *** P <0,0001). d, 3D-Rekonstruktion der Kontroll-Dendritenzweige und des TS t-hCO nach 8 Monaten Differenzierung und Quantifizierung der Dendritendorndichte (n=16 Kontrollneuronen, n=21 TS-Neuronen, ***P<0,0001).Rote Sternchen kennzeichnen mutmaßliche dendritische Dornen. e, spontane EPSCs in Kontroll- und TS-t-hCO-Neuronen nach 8 Monaten Differenzierung. f, kumulatives Frequenzdiagramm und Quantifizierung von Frequenz und Amplitude synaptischer Ereignisse (n=32 Kontrollneuronen, n=26 TS-Neuronen; **P=0,0076 und P=0,8102). g, Scholl-Analyse von TS- und Kontrollneuronen in hCO und t-hCO. Gestrichelte Linien zeigen humane postnatale L2/3-Pyramidenneuronen zum Vergleich (n=24 Kontroll-t-hCO-Neuronen, n=21 TS-t-hCO-Neuronen, n=8 Kontroll-hCO-Neuronen und n=7 TS-hCO-Neuronen). Daten sind als Mittelwert ± Standardabweichung angegeben.
Die Fähigkeit von t-hCO, die morphologischen und funktionellen Merkmale menschlicher Kortexneuronen auf hohem Niveau zu replizieren, veranlasste uns zu der Untersuchung, ob t-hCO zum Erkennen von Krankheitsphänotypen verwendet werden könnte. Wir konzentrierten uns auf TS, eine schwere neurologische Entwicklungsstörung, die durch Gain-of-Function-Mutationen im Gen verursacht wird, das für CaV1.2 kodiert, das die aktivitätsabhängige Gentranskription in Neuronen einleitet. Wir gewannen hCO von drei TS-Patienten mit der häufigsten Substitution (p.G406R) und drei Kontrollpersonen (Abb. 3a). Nach der Transplantation stellten wir fest, dass die dendritische Morphologie in TS-Neuronen im Vergleich zu Kontrollpersonen verändert war (Abb. 3b und erweiterte Daten, Abb. 8a,b), mit einer Verdoppelung der Zahl primärer Dendriten und einer allgemeinen Zunahme der mittleren und allgemeinen Abnahme der dendritischen Länge (Abb. 3c und erweiterte Daten, Abb. 8c). Dies war mit einer erhöhten Dorndichte und einer erhöhten Frequenz spontaner EPSCs in TS im Vergleich zu Kontrollneuronen verbunden (Abb. 3d–f und erweiterte Daten, Abb. 8g). Weitere Analysen zeigten Muster abnormaler dendritischer Verzweigungen in t-hCO TS im Vergleich zu Kontrollen, jedoch nicht in In-vitro-TS-hCO in einem ähnlichen Differenzierungsstadium (Abb. 3g). Dies steht im Einklang mit unseren früheren Berichten über aktivitätsabhängige dendritische Schrumpfung in TS und unterstreicht die Fähigkeit dieser Transplantationsplattform, Krankheitsphänotypen in vivo zu erkennen.
Anschließend untersuchten wir, inwieweit t-hCO-Zellen funktionell in das S1 der Ratte integriert sind. Das S1 der Nagetiere erhält starke synaptische Inputs von den ipsilateralen ventralen basalen und posterioren Thalamuskernen sowie vom ipsilateralen motorischen und sekundären somatosensorischen Kortex und vom kontralateralen S1 (Abb. 4a). Um das Innervationsmuster wiederherzustellen, infizierten wir hCO mit Tollwutvirus-dG-GFP/AAV-G und transplantierten hCO drei Tage später in S1-Ratten. 7–14 Tage nach der Transplantation beobachteten wir eine dichte GFP-Expression in Neuronen des ipsilateralen S1 und der ventralen Basalganglien (Abb. 4b, c). Zusätzlich zeigte die Antikörperfärbung des Thalamusmarkers Netrin G1 das Vorhandensein von Thalamusendigungen in t-hCO (Abb. 4d, e). Um zu untersuchen, ob diese afferenten Projektionen synaptische Reaktionen in t-hCO-Zellen auslösen können, führten wir Ganzzellanalysen von menschlichen Zellen in scharfen Schnitten der thalamokortikalen Schicht durch. Elektrische Stimulation von S1, Capsula interna, weißer Substanz und Fasern in der Nähe von t-hCO bei Ratten oder optogenetische Aktivierung opsinexprimierender thalamischer Endungen in t-hCO induzierte kurzzeitige EPSCs in t-hCO-Neuronen, die dem AMPA-Rezeptorantagonisten NBQX ausgesetzt waren. (Abb. 4f, g und erweiterte Daten, Abb. 9a–g). Diese Daten zeigen, dass t-hCO anatomisch in das Rattenhirn integriert ist und durch Rattenwirtsgewebe aktiviert werden kann.
a, Schematische Darstellung eines Tollwut-Tracking-Experiments. b, GFP- und humanspezifischer STEM121-Ausdruck zwischen t-hCO und Großhirnrinde der Ratte (oberer Bereich). Ebenfalls gezeigt ist der GFP-Ausdruck im ipsilateralen ventralen Basalkern (VB) der Ratte (unten links) und im ipsilateralen S1 (unten rechts). Maßstab 50 µm. Die roten Quadrate stellen die Bereiche des Gehirns dar, in denen die Bilder aufgenommen wurden. c, Quantifizierung von Zellen, die GFP exprimieren (n = 4 Ratten). d, e – Netrin G1+ Thalamusendigungen in t-hCO. d zeigt einen Coronalschnitt mit t-hCO- und VB-Kernen. Maßstab 2 mm. e zeigt den Netrin G1- und STEM121-Ausdruck in t-hCO- (links) und VB-Neuronen (rechts). Maßstab 50 µm. Die orange gepunktete Linie kennzeichnet die t-hCO-Grenze. f, g, Stromverläufe von t-hCO-Neuronen nach elektrischer Stimulation bei S1-Ratte (f) oder innerer Kapsel (g), mit (lila) oder ohne (schwarz) NBQX (links). EPSC-Amplituden mit und ohne NBQX (n = 6 S1-Neuronen, *P = 0,0119; und n = 6 Neuronen der inneren Kapsel, **P = 0,0022) (Mitte). Prozentsatz der t-hCO-Neuronen mit EPSC als Reaktion auf elektrische Stimulation von S1 (f) oder innerer Kapsel (g) der Ratte (rechts). aCSF, künstliche Zerebrospinalflüssigkeit. h, schematische Darstellung des 2P-Bildgebungsexperiments (links). Expression von GCaMP6s in t-hCO (Mitte). Maßstab, 100 µm. Fluoreszenz-Zeitraffer von GCaMP6s (rechts). i, Z-Score der spontanen Aktivitätsfluoreszenz. j, schematische Darstellung der Schnurrbartstimulation. k. Z-bewertete 2P-Fluoreszenztrajektorien in einem Versuch, ausgerichtet auf die Schnurrhaarabweichung zum Zeitpunkt Null (gestrichelte Linie) in Beispielzellen. l. Populationsdurchschnittliche Z-Score-Reaktionen aller Zellen, ausgerichtet auf die Schnurrhaarabweichung zum Zeitpunkt Null (gestrichelte Linie) (rot) oder zufällig erstellte Zeitstempel (grau). m. Schematische Darstellung des Experiments zur optischen Markierung. n. Rohspannungskurven einer Beispiel-t-hCO-Zelle während blauer Laserstimulation oder Schnurrhaarabweichung. Rote Pfeile zeigen die ersten durch Licht (oben) oder durch Schnurrhaarabweichung (unten) verursachten Spitzen an. Graue Schattierung zeigt Perioden der Schnurrhaarabweichung an. o. Spitzenlichtwellenformen und Reaktionen der Schnurrhaarabweichung. p. Spitzen eines einzelnen Versuchs, ausgerichtet auf die Abweichung der Schnurrhaare in den Beispielzellen. 0 zeigt die Schnurrhaarabweichung an (gestrichelte Linie). q, populationsgemittelte Z-Score-Feuerrate für alle lichtempfindlichen Zellen, ausgerichtet an der Schnurrhaarabweichung zum Zeitpunkt Null (gestrichelte Linie) (rot) oder zufällig generierten Zeitstempeln (grau). r, Anteil der lichtempfindlichen Einheiten, die signifikant durch die Schnurrhaarabweichung moduliert wurden (n = 3 Ratten) (links). Maximale Z-Score-Latenz (n = 3 Ratten; n = 5 (hellgrün), n = 4 (dunkelgrün) und n = 4 (cyan) Schnurrhaarabweichungsmodulationseinheiten pro Ratte) (rechts). Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung ausgedrückt.
Wir untersuchten dann, ob t-hCO in vivo durch sensorische Reize aktiviert werden kann. Wir transplantierten S1-Ratten hCO, das den genetisch kodierten Kalziumindikator GCaMP6 exprimierte. Nach 150 Tagen führten wir eine Faserphotometrie bzw. Zweiphotonen-Kalziumbildgebung durch (Abb. 4h und erweiterte Daten, Abb. 10a). Wir stellten fest, dass die t-hCO-Zellen eine synchronisierte rhythmische Aktivität zeigten (Abb. 4i, erweiterte Daten, Abb. 10b und Zusatzvideo 1). Zur Charakterisierung der Spitzenaktivität von t-hCO führten wir extrazelluläre elektrophysiologische Aufzeichnungen an anästhesierten Transplantatratten durch (erweiterte Daten, Abb. 10c-f). Wir haben stereotaktische Koordinaten aus MRT-Bildern generiert; diese aufgezeichneten Einheiten stellen somit mutmaßliche menschliche Neuronen dar, obwohl sich durch Elektrophysiologie allein keine Herkunftsspezies bestimmen lässt. Wir beobachteten synchronisierte Aktivitätsausbrüche (erweiterte Daten, Abb. 10d). Die Salven dauerten etwa 460 ms und waren durch Ruhephasen von etwa 2 s getrennt (erweiterte Daten, Abb. 10d, e). Einzelne Einheiten feuerten durchschnittlich etwa drei Schüsse pro Salve ab, was ungefähr 73 % der pro Salve registrierten Einheiten entspricht. Die Aktivitäten der einzelnen Einheiten korrelierten stark, und diese Korrelationen waren höher als die von Einheiten, die bei ungeimpften Tieren unter gleichen Bedingungen identifiziert wurden (erweiterte Daten, Abb. 10f). Um die Spike-Reaktionen der identifizierten Neuronen menschlichen Ursprungs weiter zu charakterisieren, führten wir Lichtmarkierungsexperimente an anästhesierten Ratten durch, denen hCO transplantiert wurde, das den lichtempfindlichen Kationenkanal Rhodopsin 2 (hChR2) exprimiert, wodurch t-hCO-Neuronen eine kurze Latenzzeit (weniger als 10 ms) als Reaktion auf blaue Lichtreize ermöglichen (Abb. 4m–o). t-hCO-Neuronen zeigten spontane Aktivitätsschübe mit ähnlichen Frequenzen wie sie in der Kalziumbildgebung sowie in elektrophysiologischen Aufzeichnungen in t-hCO ohne Lichtmarkierung beobachtet wurden (erweiterte Daten, Abb. 10c-g). In den entsprechenden in vitro aufgezeichneten hCO-Stadien wurde keine spontane Aktivität beobachtet. Um zu beurteilen, ob t-hCO durch sensorische Reize aktiviert werden kann, lenkten wir die Rattenschnurrhaare kurz von t-hCO weg (Abb. 4j,m und erweiterte Daten, Abb. 10h,k). Früheren Studien8,10 zufolge zeigte eine Untergruppe von t-hCO-Zellen eine erhöhte Aktivität als Reaktion auf die Schnurrhaarauslenkung, was beim Vergleich der Daten mit zufälligen Zeitstempeln nicht beobachtet wurde (Abb. 4k–q und erweiterte Daten, Abb. 10h–q). Tatsächlich zeigten etwa 54 % der optisch markierten Einzeleinheiten nach Schnurrhaarstimulation eine signifikant erhöhte Erregungsrate mit einem Maximum bei etwa 650 ms (Abb. 4r). Zusammengefasst lassen diese Daten darauf schließen, dass t-hCO entsprechende funktionelle Inputs erhält und durch Umweltreize aktiviert werden kann.
Anschließend untersuchten wir, ob t-hCO Schaltkreise in Ratten aktivieren kann, um das Verhalten zu steuern. Zunächst untersuchten wir, ob die Axone der t-hCO-Neuronen in das umliegende Gewebe der Ratte projizieren. Wir infizierten hCO mit einem Lentivirus, das für hChR2 fusioniert mit EYFP (hChR2-EYFP) kodiert. Nach 110 Tagen beobachteten wir die Expression von EYFP in ipsilateralen kortikalen Regionen, einschließlich des auditorischen, motorischen und somatosensorischen Kortex, sowie in subkortikalen Regionen, einschließlich des Striatums, Hippocampus und Thalamus (Abb. 5a). Um zu beurteilen, ob diese efferenten Projektionen synaptische Reaktionen in Rattenzellen hervorrufen können, aktivierten wir hChR2-EYFP exprimierende t-hCO-Zellen optisch, indem wir Zellen der Großhirnrinde von Ratten in scharfen Hirnschnitten aufzeichneten. Die Aktivierung von t-hCO-Axonen mit blauem Licht induzierte kurzzeitige EPSCs in Neuronen des Pyramidenkortex von Ratten, die durch NBQX blockiert wurden (Abb. 5b–g). Zusätzlich konnten diese Reaktionen durch Tetrodotoxin (TTX) blockiert und durch 4-Aminopyridin (4-AP) wiederhergestellt werden, was darauf hindeutet, dass sie durch monosynaptische Verbindungen verursacht wurden (Abb. 5e).
a, Schematische Darstellung der Axonverfolgung (links). t-hCO EYFP-Expression (rechts). Maßstab 100 µm. A1, auditorischer Kortex, ACC, anteriorer cingulärer Kortex, d. Striatum, dorsales Striatum, HPC, Hippocampus; Zwerchfell, laterales Septum, mPFC, medialer präfrontaler Kortex, Piri, piriformer Kortex, v. Striatum, ventrales Striatum, VPM, ventropostomedialer Kern des Thalamus, VTA, ventrale tegmentale Region. Die roten Quadrate stellen die Bereiche des Gehirns dar, in denen die Bilder aufgenommen wurden. b, Schematische Darstellung des Stimulationsexperiments. c, d, Beispiele für die Reaktion von durch blaues Licht induziertem Fotostrom (oben) und Spannung (unten) in menschlichen (c) EYFP+ t-hCO- oder Ratten- (d) EYFP--Zellen. e, f, Stromspuren von Rattenneuronen nach Blaulichtstimulation von t-hCO-Axonen mit TTX und 4-AR (grün), TTX (grau) oder aCSF (schwarz) (e), mit (violett) oder ohne (schwarz) ) ) NBQX (e). g, Latenz der durch Blaulicht induzierten Reaktionen in Rattenzellen (n = 16 Zellen); horizontale Balken zeigen die durchschnittliche Latenz (7,13 ms) an (links). Amplitude der durch Licht hervorgerufenen EPSCs, aufgezeichnet mit oder ohne NBQX (n = 7 Zellen; ***P < 0,0001) (Mitte). Amplitude der durch Licht hervorgerufenen EPSCs, aufgezeichnet mit oder ohne NBQX (n = 7 Zellen; ***P < 0,0001) (Mitte). Eine Vielzahl von EPSC-Lichtern, die mit oder ohne NBQX registriert sind (n = 7 Punkte; ***P <0,0001) (im Zentrum). Amplitude der lichtinduzierten EPSCs, aufgezeichnet mit oder ohne NBQX (n = 7 Zellen; ***P < 0,0001) (Mitte).使用或不使用NBQX 记录的光诱发EPSC 的振幅（n = 7 个细胞；***P < 0.0001）（中）.使用或不使用NBQX 记录的光诱发EPSC 的振幅（n = 7 个细胞；***P < 0.0001）（中）. Eine Vielzahl von EPSC-Lichtern, die mit oder ohne NBQX registriert sind (n = 7 Punkte; ***P <0,0001) (im Zentrum). Amplitude der lichtinduzierten EPSCs, aufgezeichnet mit oder ohne NBQX (n = 7 Zellen; ***P < 0,0001) (Mitte).Prozentsatz der Rattenzellen mit EPSCs, die auf blaues Licht reagieren (rechts). h, Schematische Darstellung einer Verhaltensaufgabe. d0, Tag 0. i. Leistung beispielhafter Tiere am 1. (links) bzw. 15. (rechts) Tag des Trainings. Die durchschnittliche Anzahl der Leckbewegungen am Tag 1 (links) oder Tag 15 (rechts in der Mitte) (n = 150 Versuche mit blauem Licht, n = 150 Versuche mit rotem Licht; ***P < 0,0001). Die durchschnittliche Anzahl der Leckbewegungen am Tag 1 (links) oder Tag 15 (rechts in der Mitte) (n = 150 Versuche mit blauem Licht, n = 150 Versuche mit rotem Licht; ***P < 0,0001). Mindestens 100.000 US-Dollar wurden am 1. Tag (später) oder 15. Tag (im Hauptquartier) veröffentlicht (n = 150 im Internet angezeigt, n = 150 im Monat angezeigt). Licht; ***P <0,0001). Durchschnittliche Anzahl der an Tag 1 (links) oder Tag 15 (Mitte rechts) durchgeführten Leckbewegungen (n = 150 Versuche mit blauem Licht, n = 150 Versuche mit rotem Licht; ***P < 0,0001).第1 天（左）或第15 天（右中）执行的平均舔次数（n = 150 次蓝光试验，n = 150次红光试验；***P < 0,0001）。第1 天（左）或第15 天（右中）执行的平均舔次数（n = 150 次蓝光试验，n = 150 ***P < 0,001 Mindestens 100.000 US-Dollar wurden am 1. Tag (später) oder 15. Tag (im Hauptquartier) veröffentlicht (n = 150 im Internet angezeigt, n = 150 im Monat angezeigt). Licht; ***P <0,0001). Durchschnittliche Anzahl der an Tag 1 (links) oder Tag 15 (Mitte rechts) durchgeführten Leckbewegungen (n = 150 Versuche mit blauem Licht, n = 150 Versuche mit rotem Licht; ***P < 0,0001).Kumulative Leckbewegungen bei Rot- und Blaulichtversuchen an Tag 1 (Mitte links) oder Tag 15 (rechts). NS, nicht signifikant. j,k, Verhaltensmerkmale aller Tiere, denen an Tag 1 oder 15 t-hCO transplantiert wurde, das hChR2-EYFP (j) oder Kontroll-Fluorophor (k) exprimiert (hChR2-EYFP: n = 9 Ratten, ** P = 0,0049; Kontrolle: n = 9, P = 0,1497). l, Entwicklung des Präferenzscores (n = 9 hChR2, n = 9 Kontrolle; **P < 0,001, ***P < 0,0001). l, Entwicklung des Präferenzscores (n = 9 hChR2, n = 9 Kontrolle; **P < 0,001, ***P < 0,0001). l, Эволюция показателя предпочтения (n = 9 hChR2, n = 9 Kontrollen; **P <0,001, ***P <0,0001). l, Entwicklung des Präferenzscores (n = 9 hChR2, n = 9 Kontrollen; **P < 0,001, ***P < 0,0001). l，偏好评分的演变（n = 9 hChR2，n = 9 对照；**P < 0,001,***P < 0,0001）。 l，偏好评分的演变（n = 9 hChR2，n = 9 对照；**P < 0,001,***P < 0,0001）。 l, Эволюция показателей предпочтения (n = 9 hChR2, n = 9 контролей; **P <0,001, ***P <0,0001). l, Entwicklung der Präferenzwerte (n = 9 hChR2, n = 9 Kontrollen; **P < 0,001, ***P < 0,0001).m, FOS-Expression als Reaktion auf die optogenetische Aktivierung von t-hCO in S1. Es werden Bilder des FOS-Ausdrucks (links) und der Quantifizierung (n = 3 pro Gruppe; *P < 0,05, **P < 0,01 und ***P < 0,001) (rechts) angezeigt. Es werden Bilder des FOS-Ausdrucks (links) und der Quantifizierung (n = 3 pro Gruppe; *P < 0,05, **P < 0,01 und ***P < 0,001) (rechts) angezeigt. Показаны изображения эксспрессии фос (слева) и количественного определения (n = 3 pro gruppe; * P <0,05, ** P <0,01 und *** P <0,001) (veröffentlicht). Bilder des FOS-Ausdrucks (links) und der Quantifizierung (n = 3 pro Gruppe; *P<0,05, **P<0,01 und ***P<0,001) werden angezeigt (rechts).显示了FOS 表达（左）和量化（每组n = 3；*P < 0.05、**P < 0.01 和***P < 0.001（右）的图像.显示了FOS 表达（左）和量化（每组n = 3；*P < 0.05、**P < 0.01 和***P < 0.001（右）的图像. Показаны изображения эксспрессии фос (слева) и количественного определения (n = 3 pro gruppe; * P <0,05, ** P <0,01 und *** P <0,001) (veröffentlicht). Bilder des FOS-Ausdrucks (links) und der Quantifizierung (n = 3 pro Gruppe; *P<0,05, **P<0,01 und ***P<0,001) werden angezeigt (rechts).Maßstab: 100 µm. Die Daten werden als Mittelwert ± Standardfehler von BLA, basolateraler Tonsille, MDT, dorsomedialem Thalamuskern, PAG und periaquäduktalem Grau ausgedrückt.
Schließlich untersuchten wir, ob t-hCO das Verhalten von Ratten modulieren kann. Um dies zu testen, transplantierten wir hChR2-EYFP-exprimierendes hCO in S1 und 90 Tage später implantierten wir optische Fasern zur Lichtabgabe in t-hCO. Dann trainierten wir die Ratten mit einem modifizierten Paradigma der operanten Konditionierung (Abb. 5h). Wir setzten die Tiere in eine Verhaltenstestkammer und applizierten zufällig 5 Sekunden lange blaue (473 nm) und rote (635 nm) Laserreize. Die Tiere erhielten eine Wasserbelohnung, wenn sie während der Stimulation mit blauem Licht leckten, leckten jedoch nicht während der Stimulation mit rotem Licht. Am ersten Trainingstag zeigten die Tiere keinen Unterschied beim Lecken, wenn sie mit blauem oder rotem Licht stimuliert wurden. Am 15. Tag zeigten die Tiere, denen hChR2-EYFP-exprimierendes hCO transplantiert worden war, jedoch am 15. Tag ein aktiveres Lecken, wenn sie mit blauem Licht stimuliert wurden, als mit rotem Licht. Diese Veränderungen im Leckverhalten wurden bei Kontrolltieren, denen hCO transplantiert wurde, das das Kontrollfluorophor exprimiert, nicht beobachtet (Lernerfolgsrate: hChR2 89 %, EYFP 0 %, Abbildung 5i-1 und ergänzendes Video 2). Diese Daten legen nahe, dass t-hCO-Zellen Rattenneuronen aktivieren können, um Belohnungssuchverhalten zu stimulieren. Um herauszufinden, welche neuronalen Schaltkreise von t-hCO bei Ratten an diesen Verhaltensänderungen beteiligt sein könnten, haben wir t-hCO bei trainierten Tieren optogenetisch aktiviert und 90 Minuten später Gewebe entnommen. Durch Immunhistochemie wurde die Expression des aktivitätsabhängigen FOS-Proteins in mehreren Hirnregionen nachgewiesen, die an motiviertem Verhalten beteiligt sind, darunter der mediale präfrontale Kortex, der mediale Thalamus und die periaquäduktale graue Substanz, die entweder bei unstimulierten Kontrolltieren oder bei Tieren exprimiert wurde. Reis. 5m). Zusammengenommen legen diese Daten nahe, dass t-hCO die neuronale Aktivität von Ratten modulieren kann, um Verhalten zu steuern.
Neuronale Organoide stellen ein vielversprechendes System für die Untersuchung der menschlichen Entwicklung und von Krankheiten in vitro dar, sind jedoch durch das Fehlen von Verbindungen zwischen in vivo vorhandenen Schaltkreisen eingeschränkt. Wir haben eine neuartige Plattform entwickelt, bei der wir hCO in S1 von immungeschwächten Ratten im frühen postnatalen Stadium transplantiert haben, um die Entwicklung und Funktion menschlicher Zellen in vivo zu untersuchen. Wir haben gezeigt, dass t-hCO reife Zelltypen entwickelt, die in vitro nicht beobachtet wurden28 und dass t-hCO anatomisch und funktionell in das Gehirn von Nagetieren integriert ist. Durch die Integration von t-hCO in neuronale Schaltkreise von Nagetieren konnten wir eine Verbindung zwischen menschlicher Zellaktivität und untersuchtem Tierverhalten herstellen und zeigen, dass t-hCO-Neuronen die neuronale Aktivität von Ratten modulieren können, um Verhaltensreaktionen auszulösen.
Die von uns beschriebene Plattform bietet gegenüber früheren Studien zur Transplantation menschlicher Zellen in Nagetiergehirne mehrere Vorteile. Erstens transplantierten wir hCO in den sich entwickelnden Kortex frühpostnataler Ratten, was die anatomische und funktionelle Integration erleichtern könnte. Zweitens ermöglichte uns die t-hCO-MRT-Überwachung, die Position und das Wachstum des Transplantats an lebenden Tieren zu untersuchen. Dies ermöglichte uns die Durchführung von Langzeitstudien mit mehreren Tieren und die Überprüfung der Zuverlässigkeit mehrerer hiPS-Zelllinien. Schließlich transplantierten wir intakte Organoide anstelle isolierter Einzelzellsuspensionen, da diese für menschliche Zellen weniger schädlich sind und die Integration und Bildung menschlicher Kortexneuronen in Rattengehirnen fördern können.
Wir erkennen an, dass trotz der Fortschritte dieser Plattform zeitliche, räumliche und speziesübergreifende Einschränkungen die Ausbildung menschlicher neuronaler Schaltkreise mit hoher Wiedergabetreue verhindern, selbst nach einer Transplantation in einem frühen Entwicklungsstadium. Beispielsweise ist nicht klar, ob die in t-hCO beobachtete spontane Aktivität einen Entwicklungsphänotyp darstellt, der der während der kortikalen Entwicklung beobachteten rhythmischen Aktivität ähnelt, oder ob sie auf das Fehlen suppressiver Zelltypen in t-hCO zurückzuführen ist. Ebenso ist nicht klar, inwieweit das Fehlen einer Laminierung in t-hCO die Kettenkonnektivität beeinflusst30. Zukünftige Arbeiten werden sich auf die Integration anderer Zelltypen wie menschlicher Mikroglia, menschlicher Endothelzellen und unterschiedlicher Anteile GABAerger Interneuronen konzentrieren, wie in vitro anhand von Assembly 6 gezeigt, sowie auf das Verständnis, wie neuronale Integration und Verarbeitung in verändertem t-hCO auf transkriptioneller, synaptischer und Verhaltensebene in von Patienten gewonnenen Zellen erfolgen kann.
Insgesamt stellt diese In-vivo-Plattform eine leistungsstarke Ressource dar, die die Entwicklung des menschlichen Gehirns und die Krankheitsforschung in vitro ergänzen kann. Wir gehen davon aus, dass diese Plattform es uns ermöglichen wird, neuartige Phänotypen auf Strangebene in ansonsten schwer fassbaren Patientenzellen zu entdecken und neue therapeutische Strategien zu testen.
Wir erzeugten hCO2,5 aus HiPS-Zellen wie zuvor beschrieben. Um die hCO-Produktion aus hiPS-Zellen, die auf Feeder-Schichten kultiviert wurden, zu starten, wurden intakte hiPS-Zellkolonien mithilfe von Dispase (0,35 mg/ml) aus den Kulturschalen entfernt und in ultra-niedrige Kunststoffkulturschalen mit hiPS-Zellkulturmedium überführt. (Corning) ergänzt mit den beiden SMAD-Inhibitoren Dorsomorphin (5 μM; P5499, Sigma-Aldrich) und SB-431542 (10 μM; 1614, Tocris) sowie dem ROCK-Inhibitor Y-27632 (10 μM; S1049, Selleckchem). Während der ersten fünf Tage wurde das hiPS-Zellmedium täglich gewechselt und Dorsomorphin und SB-431542 hinzugefügt. Am sechsten Tag in Suspension wurden die neuronalen Sphäroide in ein neuronales Medium überführt, das Neurobasal-A (10888, Life Technologies), B-27-Supplement ohne Vitamin A (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies), Penicillin und Streptomycin (1:100, Life Technologies) enthielt und bis zum 24. Tag mit dem epidermalen Wachstumsfaktor (EGF; 20 ng ml−1; R&D Systems) und Fibroblasten-Wachstumsfaktor 2 (FGF2; 20 ng ml−1; R&D Systems) ergänzt wurde. Vom 25. bis zum 42. Tag wurde das Medium mit dem aus dem Gehirn stammenden neurotrophen Faktor (BDNF; 20 ng ml−1, Peprotech) und Neurotrophin 3 (NT3; 20 ng ml−1; Peprotech) ergänzt, wobei das Medium jeden zweiten Tag gewechselt wurde. Am sechsten Tag in Suspension wurden die neuronalen Sphäroide in ein neuronales Medium überführt, das Neurobasal-A (10888, Life Technologies), B-27-Supplement ohne Vitamin A (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies), Penicillin und Streptomycin (1:100, Life Technologies) enthielt und bis zum 24. Tag mit dem epidermalen Wachstumsfaktor (EGF; 20 ng ml−1; R&D Systems) und Fibroblasten-Wachstumsfaktor 2 (FGF2; 20 ng ml−1; R&D Systems) ergänzt wurde. Vom 25. bis zum 42. Tag wurde das Medium mit dem aus dem Gehirn stammenden neurotrophen Faktor (BDNF; 20 ng ml−1, Peprotech) und Neurotrophin 3 (NT3; 20 ng ml−1; Peprotech) ergänzt, wobei das Medium jeden zweiten Tag gewechselt wurde.Am sechsten Tag in Suspension wurden die neuronalen Sphäroide in ein neuronales Medium überführt, das Neurobasal-A (10888, Life Technologies), B-27-Ergänzung ohne Vitamin A (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies) und Penicillin enthielt.und Streptokokken (1:100, Life Technologies) und zusätzlicher epidermaler Faktor Rost (EGF; 20 ng/ml; R&D Systems) und Faktor fibroblastische 2 (FGF2; 20 ng/ml; R&D Systems) vor 24 Tagen. und Streptomycin (1:100, Life Technologies) und ergänzt mit epidermalem Wachstumsfaktor (EGF; 20 ng/ml; R&D Systems) und Fibroblasten-Wachstumsfaktor 2 (FGF2; 20 ng/ml; R&D Systems) bis zum 24. Tag.Von Tag 25 bis Tag 42 wurden dem Medium der aus dem Gehirn stammende neurotrophe Faktor (BDNF; 20 ng ml-1, Peprotech) und Neurotrophin 3 (NT3; 20 ng ml-1, Peprotech) hinzugefügt, wobei das Medium jeden zweiten Tag gewechselt wurde.在悬浮的第6 天, 将神经球体转移到含有neurobasal-A（10888，Life Technologies）、不含维生素A 的B-27补充剂（12587（Life Technologies）、GlutaMax（1:100（Life Technologies） Technologien）并辅以表皮生长因子（EGF；20 ng ml-1；F&E-Systeme） und 成纤维细胞生长因子2（FGF2；20 ng ml-1；R&D Systems）直至第24 天。在 悬浮 的 第 第 6 天 将 神经 球体 转移 含有 含有 neurobasal-a （10888, Life Technologies） 不 含 维生素 a 的 b-27补充剂 （12587, Life Technologies） Glutamax （1: 100, Life TechNOGIS青霉素 的 神经 培养 基 中 链霉素 （（1: 100, Life Technologies） 表皮 20 ng ml-1 (R&D Systems) Nach einer 6-tägigen Entlastung von Neurotransmittern wurde das Unternehmen in den Ruhestand geschickt (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies), пенициллин- Neurotransmitter (1:100, Life Technologies) mit zusätzlichem epidermalen Faktor 1 (EGF; 20 ng ML-1; R&D Systems) und Faktor 2 (FGF2; 20). ng мл-1) 1; Am 6. Tag wurden die Neurosphärensuspensionen auf ein Ergänzungsmittel umgestellt, das Neurobasal-A (10888, Life Technologies), B-27-Ergänzungsmittel ohne Vitamin A (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies), Penicillin-neutralisiertes Streptomycin (1:100, Life Technologies) enthielt, ergänzt mit epidermalem Wachstumsfaktor (EGF; 20 ng ml-1; R&D Systems) und Fibroblasten-Wachstumsfaktor 2 (FGF2; 20 ng ml-1) 1; R&D Systems) vor 24 Tagen. R&D Systems) bis zum 24. Tag.Von Tag 25 bis Tag 42 wurden dem Kulturmedium jeden zweiten Tag der aus dem Gehirn stammende neurotrophe Faktor (BDNF; 20 ng ml-1, Peprotech) und der neurotrophe Faktor 3 (NT3; 20 ng ml-1, Peprotech) zugesetzt. Das Medium wurde einmal gewechselt.Ab Tag 43 wurde hCO in unsupplementiertem Neurobasal-A-Medium (NM; 1088022, Thermo Fisher) mit Mediumwechsel alle 4–6 Tage gehalten. Um hCO aus hiPS-Zellen zu gewinnen, die unter feederlosen Bedingungen kultiviert wurden, wurden die hiPS-Zellen 7 Minuten lang bei 37 °C mit Accutase (AT-104, Innovate Cell Technologies) inkubiert, in Einzelzellen dissoziiert und auf AggreWell 800-Platten (34815, STEMCELL Technologies) mit einer Dichte von 3 × 106 Einzelzellen pro Well in Essential 8-Medium, ergänzt mit dem ROCK-Inhibitor Y-27632 (10 μM; S1049, Selleckchem), ausgesät. Nach 24 Stunden wurde das Medium in den Vertiefungen auf und ab in Medium pipettiert, das Essential 6-Medium (A1516401, Life Technologies) enthielt, ergänzt mit Dorsomorphin (2,5 μM; P5499, Sigma-Aldrich) und SB-431542 (10 μM; 1614, Tocrida). Von Tag 2 bis 6 wurde das Essential 6-Medium täglich durch Dorsomorphin und den Zusatz SB-431542 ersetzt. Ab dem sechsten Tag wurden die Neurosphärensuspensionen in das neurobasale Medium überführt und wie oben beschrieben aufbewahrt.
Alle Verfahren an den Tieren wurden gemäß den vom Stanford University Laboratory Animal Care Administrative Committee (APLAC) genehmigten Richtlinien zur Tierpflege durchgeführt. Trächtige, euthyme RNU-Ratten (rnu/+) wurden gekauft (Charles River Laboratories) oder untergebracht. Die Tiere wurden in einem 12-stündigen Hell-Dunkel-Rhythmus gehalten und erhielten Futter und Wasser ad libitum. Nackte (FOXN1–/–) Rattenjunge im Alter von drei bis sieben Tagen wurden vor der Keulung anhand des Wachstums unreifer Schnurrhaare identifiziert. Die Welpen (männlich und weiblich) wurden mit 2 – 3 % Isofluran betäubt und auf einen stereotaktischen Rahmen gelegt. Eine Trepanation des Schädels mit einem Durchmesser von ca. 2 – 3 mm oberhalb S1 wurde unter Wahrung der Integrität der Dura mater durchgeführt. Dann wurde eine 30-G-Nadel (ca. 0,3 mm) direkt außerhalb der Kraniotomie verwendet, um die Dura zu durchstechen. Anschließend wurde HCO auf einen dünnen Parafilm von 3 x 3 cm aufgetragen und überschüssiges Medium entfernt. Ziehen Sie mithilfe einer Hamilton-Spritze, die an einer 23 G, 45°-Nadel befestigt ist, vorsichtig hCO in das distalste Ende der Nadel auf. Installieren Sie dann die Spritze auf der Spritzenpumpe, die mit dem Stereotaxiegerät verbunden ist. Platzieren Sie dann die Nadelspitze über einem zuvor gemachten 0,3 mm großen Punktionsloch in der Dura (z = 0 mm) und verengen Sie die Spritze um 1 bis 2 mm (z = ungefähr –1,5 mm), bis sich die Nadel zwischen der Dura mater A befindet. Es bildet sich eine dichte Versiegelung. Heben Sie dann die Spritze zur Mitte der kortikalen Oberfläche bei z = –0,5 mm und injizieren Sie hCO mit einer Geschwindigkeit von 1 bis 2 µl pro Minute. Nach Abschluss der hCO-Injektion wird die Nadel mit einer Geschwindigkeit von 0,2 bis 0,5 mm pro Minute zurückgezogen, die Haut wird vernäht und das junge Tier wird sofort auf ein warmes Heizkissen gelegt, bis es sich vollständig erholt hat. Einige Tiere wurden bilateral transplantiert.
Alle Tierversuche wurden gemäß den von der Stanford University APLAC genehmigten Richtlinien zur Tierpflege durchgeführt. Ratten (älter als 60 Tage nach der Transplantation) wurden mit 5 % Isofluran anästhesiert und während der Bildgebung mit 1–3 % Isofluran betäubt. Zur Visualisierung wurde ein aktiv abgeschirmter 7-Tesla-Horizontal-Bohrlochscanner von Bruker (Bruker Corp.) mit einem Gradientenantrieb der International Electric Company (IECO), einem abgeschirmten Gradienteneinsatz mit einem Innendurchmesser von 120 mm (600 mT/m, 1000 T/m/s) unter Verwendung von AVANCE. III, Achtkanal-Mehrspulen-HF- und Mehrkernfunktionen sowie der zugehörigen Plattform Paravision 6.0.1 verwendet. Die Aufzeichnung erfolgte mit einer aktiv entkoppelten volumetrischen HF-Spule mit einem Innendurchmesser von 86 mm und einer vierkanaligen kryogekühlten HF-Spule nur zum Empfangen. Axiales 2D Turbo-RARE (Wiederholungszeit = 2500 ms, Echozeit = 33 ms, 2 Mittelwerte) mit 16 Schichtaufnahmen, Schichtdicke 0,6–0,8 mm, enthält 256 × 256 Proben. Die Signale wurden mit einer volumetrischen Quadratur-Transceiver-HF-Spule mit einem Innendurchmesser von 2 cm (Rapid MR International, LLC) empfangen. Abschließend verwenden Sie die integrierten Oberflächenschätzungsfunktionen von Imaris (BitPlane) für 3D-Rendering und Volumenanalyse. Eine erfolgreiche Transplantation wurde dann definiert, wenn sich in der transplantierten Hemisphäre Bereiche mit kontinuierlichem T2-gewichteten MRT-Signal bildeten. Eine Transplantatabstoßung wurde dann definiert, wenn ein Transplantat keine Bereiche mit kontinuierlichem T2-gewichteten MRT-Signal in der transplantierten Hemisphäre produzierte. Subkortikales t-hCO wurde von der nachfolgenden Analyse ausgeschlossen.
Um GCaMP6s in hCO für die Zwei-Photonen-Calcium-Bildgebung stabil zu exprimieren, wurden hiPS-Zellen mit pLV[Exp]-EF1a::GcaMP6s-WPRE-Puro infiziert, gefolgt von einer Antibiotikaselektion. Kurz gesagt wurden die Zellen mit EDTA dissoziiert und in 1 ml Essential 8-Medium mit einer Dichte von ca. 300.000 Zellen in Gegenwart von Polybren (5 μg/ml) und 15 μl Virus suspendiert. Die Zellen wurden anschließend 60 Minuten in Suspension inkubiert und mit einer Dichte von 50.000 Zellen pro Well ausgesät. Nach der Konfluenz wurden die Zellen 5–10 Tage lang oder bis zum Auftreten stabiler Kolonien mit 5–10 μg ml-1 Puromycin behandelt. Die akute hCO-Infektion wurde wie zuvor beschrieben mit einigen Modifikationen durchgeführt. Kurz gesagt: Übertragen Sie am 30.–45. Tag hCO in 1,5 ml Eppendorf-Mikrozentrifugenröhrchen mit 100 µl Nervenmedium. Dann werden ungefähr 90 µl Medium entfernt, 3–6 µl Lentivirus mit hohem Titer (von 0,5 x 108 bis 1,2 x 109) werden in das Röhrchen gegeben und das hCO wird für 30 Minuten in den Inkubator überführt. Geben Sie dann 90–100 µl Medium in jedes Röhrchen und stellen Sie die Röhrchen über Nacht zurück in den Inkubator. Übertragen Sie am nächsten Tag hCO in frisches Nervenmedium in Platten mit geringer Anhaftung. Nach 7 Tagen wurde hCO zur Visualisierung und Bewertung der Infektionsqualität in 24-Well-Glasbodenplatten überführt. pLV[Exp]-SYN1::EYFP-WPRE und pLV[Exp]-SYN1::hChR2-EYFP-WPRE wurden mit VectorBuilder generiert. Lentiviren werden in den meisten Experimenten verwendet, da sie in das Wirtsgenom integriert sind und so die Expression von Reportergenen in infizierten Zelllinien ermöglichen. Zur Tollwut-Nachuntersuchung wurde hCO an Tag 30–45 mit Rabies-ΔG-eGFP und AAV-DJ-EF1a-CVS-G-WPRE-pGHpA (Plasmid Nr. 67528, Addgene) koinfiziert, drei Tage lang gründlich gewaschen und in Ratten in S1 transplantiert, wo sie 7–14 Tage in vivo gehalten wurden.
Für die Immunzytochemie wurden die Tiere anästhesiert und transkardial mit PBS und anschließend 4 % Paraformaldehyd (PFA in PBS; Electron Microscopy Sciences) perfundiert. Die Gehirne wurden 2 Stunden lang oder über Nacht bei 4 °C in 4 % PFA fixiert, 48–72 Stunden lang in 30 % Saccharose in PBS kryokonserviert und in 1:1, 30 % Saccharose:OCT (Tissue-Tek OCT Compound 4583, Sakura Finetek) eingebettet und mithilfe eines Kryostaten (Leica) wurden Coronalschnitte bei 30 µm angefertigt. Für die Immunhistochemie dicker Schnitte wurden die Tiere mit PBS perfundiert, das Gehirn wurde mithilfe eines Vibratoms (Leica) präpariert und Coronalschnitte bei 300–400 µm angefertigt und die Schnitte 30 Minuten lang mit 4 % PFA fixiert. Anschließend wurden Kryoschnitte oder dicke Schnitte mit PBS gewaschen, 1 Stunde bei Raumtemperatur blockiert (10 % normales Eselserum (NDS) und 0,3 % Triton X-100, verdünnt in PBS) und mit einer Blockierungslösung bei 4 °C blockiert. – Inkubation Kryoschnitte wurden über Nacht und dicke Schnitte 5 Tage lang inkubiert. Verwendete Primärantikörper waren: Anti-NeuN (Maus, 1:500; ab104224, abcam), Anti-CTIP2 (Ratte, 1:300; ab18465, abcam), Anti-GFAP (Kaninchen, 1:1.000; Z0334, Dako), Anti-GFP (Huhn, 1:1.000; GTX13970, GeneTex), Anti-HNA (Maus, 1:200; ab191181, abcam), Anti-NeuN (Kaninchen, 1:500; ABN78, Millipore), Anti-PDGFRA (Kaninchen, 1:200; sc-338, Santa Cruz), Anti-PPP1R17 (Kaninchen, 1:200; HPA047819, Atlas Antibodies), Anti-RECA-1 (Maus, 1:50; ab9774, abcam), Anti-SCG2 (Kaninchen, 1:100; 20357-1-AP, Proteintech), Anti-SOX9 (Ziege, 1:500; AF3075, R&D Systems), Netrin G1a (Ziege, 1:100; AF1166, R&D Systems), Anti-STEM121 (Maus, 1:200; Y40410, Takara Bio), Anti-SATB2 (Maus, 1:50; ab51502, abcam), Anti-GAD65/67 (Kaninchen, 1:400; ABN904, Millipore) und Anti-IBA1 (Ziege, 1:100; ab5076, abcam). Verwendete Primärantikörper waren: Anti-NeuN (Maus, 1:500; ab104224, abcam), Anti-CTIP2 (Ratte, 1:300; ab18465, abcam), Anti-GFAP (Kaninchen, 1:1.000; Z0334, Dako), Anti-GFP (Huhn, 1:1.000; GTX13970, GeneTex), Anti-HNA (Maus, 1:200; ab191181, abcam), Anti-NeuN (Kaninchen, 1:500; ABN78, Millipore), Anti-PDGFRA (Kaninchen, 1:200; sc-338, Santa Cruz), Anti-PPP1R17 (Kaninchen, 1:200; HPA047819, Atlas Antibodies), Anti-RECA-1 (Maus, 1:50; ab9774, abcam), Anti-SCG2 (Kaninchen, 1:100; 20357-1-AP, Proteintech), Anti-SOX9 (Ziege, 1:500; AF3075, R&D Systems), Netrin G1a (Ziege, 1:100; AF1166, R&D Systems), Anti-STEM121 (Maus, 1:200; Y40410, Takara Bio), Anti-SATB2 (Maus, 1:50; ab51502, abcam), Anti-GAD65/67 (Kaninchen, 1:400; ABN904, Millipore) und Anti-IBA1 (Ziege, 1:100; ab5076, abcam). Es wurden nachfolgend folgende Anti-Antikörper verwendet: Anti-NeuN (männlich, 1:500; ab104224, abcam), Anti-CTIP2 (kreativ, 1:300; ab18465, abcam), Anti-GFAP (Körner, 1:1000; Z0334, Dako), Anti-GFP (Körner, 1:1000; GTX13970, GeneTex), Anti-HNA (Mischung, 1:200; ab191181, abcam), Anti-NeuN (Mischung, 1:500; ABN78, Millipore), Anti-PDGFRA (Mischung, 1:200; sc-338, Santa Cruz), Anti-PPP1R17 (Antikörper, 1:200; HPA047819, Atlas Antibodies), Anti-RECA-1 (Antikörper, 1:50; ab9774, abcam), Anti-SCG2 (Körper, 1:100; 20357-1-AP, Proteintech), Anti-SOX9 (Körper, 1:500; AF3075, R&D Systems), Netrin G1a (Körper, 1:100; AF1166, R&D Systems), Anti-STEM121 (männlich, 1:200; Y40410, Takara Bio), anti-SATB2 (mehr, 1:50; ab51502, abcam), anti-GAD65/67 (rot, 1:400; ABN904, Millipore) und Anti-IBA1 (Koza, 1:100; AB5076, AB). Die verwendeten Primärantikörper waren: Anti-NeuN (Maus, 1:500; ab104224, abcam), Anti-CTIP2 (Ratte, 1:300; ab18465, abcam), Anti-GFAP (Kaninchen, 1:1000; Z0334, Dako), Anti-GFP (Huhn, 1:1000; GTX13970, GeneTex), Anti-HNA (Maus, 1:200; ab191181, abcam), Anti-NeuN (Kaninchen, 1:500; ABN78, Millipore), Anti-PDGFRA (Kaninchen, 1:200; sc-338, Santa Cruz), Anti-PPP1R17 (Kaninchen, 1:200; HPA047819, Atlas Antibodies), Anti-RECA-1 (Maus, 1:50; ab9774, abcam), Anti-SCG2 (Kaninchen, 1:100; 20357-1-AP, Proteintech), Anti-SOX9 (Ziege, 1:500; AF3075, R&D Systems), Netrin G1a (Ziege, 1:100; AF1166, R&D Systems), Anti-STEM121 (Maus, 1:200; Y40410, Takara Bio), Anti-SATB2 (Maus, 1:50; ab51502, abcam), Anti-GAD65/67 (Kaninchen, 1:400; ABN904, Millipore) und Anti-IBA1 (Ziege, 1:100; ab5076, abkam).Gewünschte Leistung: NeuN (Wert: 1:500, ab104224, Abcam) und CTIP2 (Wert: 1:3). 00；ab18465，abcam），抗GFAP（兔，1:1.000；Z0334，Dako），抗-GF P（鸡, 1:1,000；GTX13970, GeneTex）, 抗HNA（小鼠, 1:200；ab191181, abcam）, 抗NeuN（兔, 1:500；ABN78, Millipore）, 抗PDGFRA（兔, 1:200；sc-338,Santa Cruz）,抗PPP1R17（兔,1:200；HPA047819,Atlas抗体）, 抗RECA-1（小鼠, 1:50；ab9774, abcam）, 抗SCG2（兔） , 1:100；20357-1-AP，Proteintech），抗SOX9（山羊，1:500；AF3075，R&D Systems），Netrin G1a（山羊, 1:100；AF1166, R&D Systems）,抗STEM121（小鼠, 1:200;使用的一抗是:NeuN（小鼠，1:500；ab104224，abcam）und CTIP2（大鼠，1 :300；ab18465，abcam），抗GFAP（兔，1:1,000；Z0334，Dako），抗-GFP（鸡，1:1.000；GTX13970，GeneTex）,抗HNA（小鼠，1:200；ab191181，abcam）,抗NeuN（兔，1:500；ABN78，Millipore％弔，抗1: 200, sc-338, Santa Cruz, PPP1R17, 1:200, HPA047819, Atlas, RECA-1, 1:50, ab9774, abcam, SCG2 100;Y40410, Takara Bio), Anti-SATB2 (Maus, 1:50; ab51502, abcam), Anti-GAD65/67 (Kaninchen, 1:400; ABN904, Millipore) und Anti-IBA1 (Ziege, 1:100; ab5076, abcam).Die verwendeten primären Antikörper waren: Anti-NeuN (Maus, 1:500; ab104224, abcam), Anti-CTIP2 (Ratte, 1:300; ab18465, abcam), Anti-GFAP (Kaninchen, 1:1000; Z0334, Dako). , Anti-GFP (Huhn, 1:1000; GTX13970, GeneTex), Anti-HNA (Maus, 1:200; ab191181, abcam), Anti-NeuN (Kaninchen, 1:500; ABN78, Millipore), Anti-PDGFRA (Kaninchen, 1:200; sc-338, Santa Cruz), Anti-PPP1R17 (Kaninchen, 1:200; HPA047819, Atlas-Antikörper), Anti-RECA-1 (Maus, 1:50; ab9774, abcam), Anti-SCG2 (Kaninchen), 1:100;20357-1-AP, Proteintech), Anti-SOX9 (ca. 1:500; AF3075, R&D Systems), Netrin G1a (ca. 1:100; AF1166, R&D Systems), Anti-STEM121 (ca. 1:200; Y40410, Takara Bio), Anti-SATB2 (stark, 1:50; ab51502, abcam), Anti-GAD65/67 (stark, 1:400; ABN904, Millipore) und Anti-IBA1 (gleich, 1:100; ab5076, abkam). 20357-1-AP, Proteintech), Anti-SOX9 (Ziege, 1:500; AF3075, R&D Systems), Netrin G1a (Ziege, 1:100; AF1166, R&D Systems), Anti-STEM121 (Maus, 1:200; Y40410, Takara Bio), Anti-SATB2 (Maus, 1:50; ab51502, abcam), Anti-GAD65/67 (Kaninchen, 1:400; ABN904, Millipore) und Anti-IBA1 (Ziege, 1:100; ab5076, abkam).Die Schnitte wurden dann mit PBS gewaschen und mit einem Sekundärantikörper 1 Stunde bei Raumtemperatur (Gefrierschnitte) oder über Nacht bei 4 °C (dicke Schnitte) inkubiert. Es wurde der Sekundärantikörper Alexa Fluor (Life Technologies), 1:1000 in Blockierungslösung verdünnt, verwendet. Nach dem Waschen mit PBS wurden die Zellkerne mit einem Hoechst 33258 (Life Technologies) visualisiert. Schließlich wurden die Objektträger mithilfe eines Aquamount (Polysciences) auf ein Mikroskop mit Deckgläsern (Fisher Scientific) gelegt und das Bild auf einem Keyence-Fluoreszenzmikroskop (BZ-X-Analysator) oder einem konfokalen Mikroskop Leica TCS SP8 (Las-X) analysiert. Die Bilder wurden mit dem Programm ImageJ (Fiji) verarbeitet. Um den Anteil menschlicher Neuronen in t-hCO und der Rattenrinde zu quantifizieren, wurden 387,5 μm breite rechteckige Bilder in der Mitte von t-hCO, am oder nahe dem Rand der Rattenrinde aufgenommen. Die Transplantatränder wurden anhand von Veränderungen der Gewebetransparenz, HNA+-Zellenkernen und/oder des Vorhandenseins von Gewebeautofluoreszenz bestimmt. In jedem Bild wurde die Gesamtzahl der NeuN+- und HNA+-Zellen durch die Gesamtzahl der NeuN+-Zellen im gleichen Bereich geteilt. Um sicherzustellen, dass nur Zellen mit Kernen in der Bildebene gezählt werden, werden nur Hoechst+-Zellen in die Berechnung einbezogen. Zur Reduzierung des statistischen Fehlers wurden zwei Bilder mit einem Abstand von mindestens 1 mm gemittelt.
Eine Woche vor der Probenentnahme wurden hCO-Transplantate (ca. 8 Monate Differenzierung) in einen dunklen Raum gebracht und die Schnurrhaare gestutzt, um sensorische Stimulation zu minimieren. Die Zellkernisolierung erfolgte wie zuvor beschrieben, mit einigen Modifikationen. Kurz gesagt: t-hCO und hCO wurden mittels detergensmechanischer Zelllyse und einem 2-ml-Glasgewebezerkleinerer (D8938, Sigma-Aldrich/KIMBLE) zerstört. Die Rohzellkerne wurden anschließend mit einem 40-µm-Filter abfiltriert und 10 Minuten bei 4 °C (320 g) zentrifugiert, bevor ein Saccharose-Dichtegradient durchgeführt wurde. Nach dem Zentrifugieren (320 g für 20 min bei 4 °C) wurden die Proben in 0,04 % BSA/PBS unter Zugabe von 0,2 Einheiten µl-1 RNase-Inhibitor (40 u µl-1, AM2682, Ambion) resuspendiert und durch einen 40-µm-Fluidfilter geleitet. Die dissoziierten Zellkerne wurden anschließend in PBS mit 0,02 % BSA resuspendiert und auf einen Chromium Single Cell 3′-Chip geladen (geschätzte Ausbeute: 8.000 Zellen pro Spur). snRNA-seq-Bibliotheken wurden mit dem Chromium Single cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics) vorbereitet. snRNA-seq-Bibliotheken wurden mit dem Chromium Single cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics) vorbereitet. Die snRNA-seq-Bibliothek wurde mit Chromium Single Cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics) heruntergeladen. Die snRNA-seq-Bibliotheken wurden mit Chromium Single Cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics) vorbereitet. snRNA-seq ist ein Chromium Single Cell 3′ GEM-Bibliotheks- und Gel-Bead-Kit v3 (10x Genomics). snRNA-seq ist ein Chromium Single Cell 3′ GEM-Bibliotheks- und Gel-Bead-Kit v3 (10x Genomics). Die snRNA-seq-Bibliothek wurde mit Chromium Single Cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics) verwendet. Die snRNA-seq-Bibliothek wurde mit Chromium Single Cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics) erstellt.Bibliotheken aus verschiedenen Proben wurden von Admera Health auf NovaSeq S4 (Illumina) gepoolt und sequenziert.
Die Genexpressionsniveaus für jeden mutmaßlichen Kernbarcode wurden mit dem Analysesoftwarepaket 10x Genomics CellRanger (Version 6.1.2) quantifiziert. Die Reads wurden mit einer Kombination aus menschlichen (GRCh38, Ensemble, Version 98) und Ratten-Referenzgenomen (Rnor_6.0, Ensemble, Version 100) abgeglichen, die mit dem Befehl mkref erstellt wurden. Die Berechnung erfolgte mit dem Befehl –include-introns=TRUE, um die den Intron-Regionen zugeordneten Reads in die Quantifizierung einzubeziehen. Für t-hCO-Proben wurden menschliche Kerne anhand der konservativen Anforderung identifiziert, dass mindestens 95 % aller zugeordneten Reads dem menschlichen Genom entsprechen. Alle nachfolgenden Analysen wurden an einem gefilterten Barcode-Array durchgeführt, das von CellRanger mit dem Paket R (Version 4.1.2) Seurat (Version 4.1.1)32 ausgegeben wurde.
Um sicherzustellen, dass nur qualitativ hochwertige Zellkerne in die nachfolgende Analyse einbezogen werden, wurde für jede Probe ein iterativer Filterprozess implementiert. Zunächst werden minderwertige Zellkerne mit weniger als 1000 gefundenen einzigartigen Genen und mehr als 20 % der gesamten Mitochondrien identifiziert und entfernt. Anschließend wurde die Rohgenanzahlmatrix mittels regularisierter negativer Binomialregression mit der Funktion sctransform(vst.flavor=”v2″) normalisiert. Diese Funktion identifizierte auch die 3000 variabelsten Gene unter Verwendung von Standardparametern. Die Dimensionsreduktion der am stärksten variablen Gene erfolgte mittels Hauptkomponentenanalyse (PCA) mit Standardparametern und einer Datensatzdimension von 30 (dims = 30 wurde basierend auf einer visuellen Inspektion der Kniestellen gewählt und für alle Proben und Ensembleanalysen verwendet). Anschließend führten wir mehrere Runden iteratives Clustering (Auflösung = 1) durch, um Gene basierend auf einer ungewöhnlich niedrigen Genanzahl (Median unter dem 10. Perzentil) und einer ungewöhnlich hohen mitochondrialen Genanzahl (Median über dem 95. Perzentil) zu klassifizieren und mutmaßliche Zellen von geringer Qualität zu identifizieren und zu entfernen. Cluster und/oder ein hoher Anteil mutmaßlicher Zwillinge wurden mit dem Paket DoubletFinder33 identifiziert (mittlerer DoubletFinder-Score über dem 95. Perzentil). t-hCO-Proben (n=3) und hCO-Proben (n=3) wurden separat mit der Funktion IntegrateData mit den oben genannten Parametern integriert. Anschließend wurde eine weitere Runde qualitativer Filterung des integrierten Datensatzes wie oben beschrieben durchgeführt.
Nach dem Entfernen der Kernel niedriger Qualität wurde der integrierte Datensatz gruppiert (Auflösung = 0,5) und für UMAP34-Visualisierungszwecke eingebettet. Markergene für jeden Cluster wurden mithilfe der FindMarkers-Funktion mit Standardparametern bestimmt, die aus normalisierten Genexpressionsdaten berechnet wurden. Wir identifizieren und klassifizieren wichtige Zellklassen, indem wir fetale und adulte kortikale Referenzdatensätze mit der Expression von Markergenen 19,20,21,35 und Annotationen kombinieren. Insbesondere wurden zirkulierende Vorläufer durch die Expression von MKI67 und TOP2A identifiziert. Progenitorcluster wurden durch das Fehlen mitotischer Transkripte, eine hohe Überlappung mit multipotenten glialen Progenitorclustern, die im fetalen Kortex der späten Metaphase beschrieben wurden, sowie die Expression von EGFR und OLIG1 definiert. Wir verwenden den Begriff Astrozyten, um mehrere Stadien der Astrozytendifferenzierung zu umfassen, von der späten radialen Glia bis zur Reifung von Astrozyten. Astrozytencluster exprimieren hohe Konzentrationen von SLC1A3 und AQP4 und wurden nachweislich mit Subtypen fetaler radialer Glia und/oder adulten Astrozyten in Verbindung gebracht. OPCs exprimieren PDGFRA und SOX10, während Oligodendrozyten Myelinisierungsmarker (MOG und MYRF) exprimieren. Glutamaterge Neuronen wurden anhand des Vorhandenseins neuronaler Transkripte (SYT1 und SNAP25), des Fehlens GABAerger Marker (GAD2) und der Expression von NEUROD6, SLC17A7, BCL11B oder SATB2 identifiziert. GluN-Neuronen wurden weiter in obere (SATB2-Expression und Verlust von BCL11B) und tiefe (BCL11B-Expression) Unterklassen unterteilt. Putative Subplate (SP)-Neuronen exprimieren neben tiefen GluN-Markern auch bekannte SP18-Marker wie ST18 und SORCS1. Choroid-Plexus-ähnliche Zellen wurden durch TTR-Expression identifiziert und meningeale Zellen exprimierten Fibroblasten-assoziierte Gene und kartierten Pia-/Gefäßzellen des Referenzdatensatzes.
Die differenzielle Analyse der Genexpression zwischen t-hCO- und hCO-Unterklassen wurde mithilfe einer neu entwickelten Pseudo-Batch-Methode durchgeführt, die in Proben reproduziert wurde, die mit dem Libra R-Paket (Version 1.0.0) implementiert wurden. Insbesondere wurden edgeR-Log-Likelihood-Tests (Version 3.36.0, Paket R) für Gruppen durchgeführt, indem die Zahl der Gene in Zellen für eine gegebene Zellklasse für jede Probenreplikation summiert wurde. Zur Heatmap-Visualisierung werden normalisierte Werte pro Million (CPM) mithilfe von edgeR (Funktion cpm()) berechnet und skaliert (um Mittelwert = 0, Standardabweichung = 1 zu erreichen). Eine Genontologie(GO)-Anreicherungsanalyse von signifikant hochregulierten t-hCO-GluN-Genen wurde durchgeführt (Benjamini-Hochberg-korrigierter P-Wert von weniger als 0,05, exprimiert in mindestens 10 % der t-hCO-GluN-Zellen und eine mindestens zweifache Veränderungssteigerung). durchgeführt mit ToppGene Suite (https://toppgene.cchmc.org/)37. Wir verwenden die ToppFun-App mit Standardparametern und berichten über Benjamini-Hochberg-korrigierte P-Werte, die aus GO-annotierten hypergeometrischen Tests berechnet wurden.
Um unsere snRNA-Seq-Cluster mit annotierten Zellclustern aus Referenzstudien zu primärer Einzelzell-RNA-Seq oder adulter snRNA-Seq19,20,21,22 abzugleichen, haben wir einen Ansatz zur gepaarten Datensatzintegration angewendet. Wir haben den Normalisierungsworkflow SCTransform (v2) in Seurat verwendet, um Clusterüberlappungen zwischen Datensätzen zu integrieren und zu vergleichen (unter Verwendung derselben Parameter wie oben). Einzelne Datensätze wurden zur Recheneffizienz zufällig in bis zu 500 Zellen oder Kerne pro Originalcluster unterteilt. Unter Verwendung eines ähnlichen Ansatzes wie zuvor beschrieben wurde die Clusterüberlappung als der Anteil der Zellen oder Kerne in jedem gepoolten Cluster definiert, der sich mit der Bezeichnung des Referenzclusters überlappte. Um GluNs weiter zu klassifizieren, haben wir Seurats TransferData-Workflow für GluN-Teilmengendaten verwendet, um unseren GluN-Zellen Referenzdatensatzbezeichnungen zuzuweisen.
Um den Reifestatus des globalen Transkriptoms von t-hCO- und hCO-Proben zu beurteilen, verglichen wir unsere Pseudo-Bulk-Proben mit BrainSpan/psychENCODE23, einer umfangreichen RNA-Sequenz, die die menschliche Gehirnentwicklung abdeckt. Wir führten eine PCA an einer kombinierten musternormalisierten Genexpressionsmatrix aus kortikalen Proben 10 Wochen nach der Empfängnis und später durch, und zwar an 5567 Genen (zusammen mit unseren Daten), die zuvor in kortikalen BrainSpan-Proben als aktiv identifiziert worden waren (definiert als > 50 % altersbedingte Entwicklungsvarianz unter Verwendung eines kubischen Modells)38. Zusätzlich leiteten wir mithilfe der zuvor beschriebenen nicht-negativen Matrixfaktorisierung Gene ab, die mit wichtigen Transkriptomsignaturen der neurologischen Entwicklung assoziiert sind. Die mithilfe des nicht-negativen Matrixfaktorisierungsverfahrens berechneten Probengewichte sind in Abb. 5b mit erweiterten Daten für jede der fünf von Zhu et al.38 beschriebenen Signaturen dargestellt. Auch hier wurden aktivitätsabhängige Transkriptionsmarker aus zuvor veröffentlichten Studien abgeleitet. Insbesondere waren ERG und LRG in glutamatergen Neuronen, die durch die snRNA-Sequenzierung des visuellen Kortex der Maus identifiziert wurden, nach visueller Stimulation signifikant hochreguliert (siehe Ergänzungstabelle 3, Hrvatin et al. 16). Humanangereicherte LRGs wurden aus KCl-aktivierten menschlichen fetalen Gehirnkulturen gewonnen und sechs Stunden nach der Stimulation geerntet. Die gefilterten Gene waren beim Menschen, jedoch nicht bei Nagetieren, signifikant hochreguliert (Ergänzungstabelle 4). Die Analyse der Gensatzanreicherung anhand dieser Gensätze erfolgte mit dem einfaktoriellen exakten Fisher-Test.
Ratten werden mit Isofluran anästhesiert, die Gehirne entnommen und in eine kalte (ca. 4 °C), sauerstoffreiche (95 % O2 und 5 % CO2) Saccharoselösung gelegt, um Schnitte zu erhalten. Die Lösung enthält: 234 mM Saccharose, 11 mM Glucose, 26 mM NaHCO3, 2,5 mM KCl, 1,25 mM NaH2PO4, 10 mM MgSO4 und 0,5 mM CaCl2 (ca. 310 mOsm). Koronale Schnitte (300–400 µm) von Rattenhirnen mit t-hCO wurden wie zuvor beschrieben mit einem Leica VT1200 Vibratom hergestellt39. Die Schnitte wurden anschließend mindestens 45 Minuten vor der Aufzeichnung in eine Schneidekammer mit kontinuierlicher Sauerstoffzufuhr bei Raumtemperatur überführt. Die Kammer enthielt aCSF, hergestellt aus: 10 mM Glucose, 26 mM NaHCO₃, 2,5 mM KCl, 1,25 mM NaHPO₄, 1 mM MgSO₄, 2 mM CaCl₂ und 126 mM NaCl (298 mOsm). Die Schnitte wurden in einer Tauchkammer aufgezeichnet, wo sie kontinuierlich mit aCSF (95 % O₂ und 5 % CO₂-Fläschchen) perfundiert wurden. Alle Daten wurden bei Raumtemperatur aufgezeichnet. t-hCO-Neuronen wurden mit einer Borosilikatglaspipette terminiert, die mit einer Lösung aus 127 mM Kaliumgluconat, 8 mM NaCl, 4 mM Magnesium-ATP, 0,3 mM Natrium-GTP, 10 mM HEPES und 0,6 mM EGTA (pH 7,2) gefüllt war. Die interne Lösung wurde mit KOH (290 mOsm) eingestellt. Zur Wiederherstellung wurde der Aufzeichnungslösung Biocytin (0,2 %) zugesetzt.
Die Daten wurden mit einem MultiClamp 700B-Verstärker (Molecular Devices) und einem Digidata 1550B-Digitalisierer (Molecular Devices) erfasst, bei 2 kHz tiefpassgefiltert, bei 20 kHz digitalisiert und mit Clampfit (Molecular Devices), Origin (OriginPro 2021b, OriginLab) und benutzerdefinierten MATLAB-Funktionen (Mathworks) analysiert. Das Verbindungspotenzial wurde mit JPCalc berechnet und die Einträge auf den berechneten Wert von -14 mV angepasst. Operation IV besteht aus einer Reihe von Stromschritten in 10–25-pA-Schritten von -250 bis 750 pA.
Thalamus, weiße Substanz und S1-Afferenzen wurden während der Patch-Clamp-Aufzeichnung von hCO-Neuronen in thalamokortikalen Scheiben elektrisch stimuliert, wie zuvor beschrieben. Kurz gesagt, wurde das Gehirn auf einen um 10° geneigten 3D-Drucktisch gelegt und die Vorderseite des Gehirns in einem Winkel von 35° geschnitten. Das Gehirn wurde dann auf die Schnittfläche geklebt und seziert, wobei die hervorstehenden thalamokortikalen Axone erhalten blieben. Bipolare Wolframelektroden (0,5 MΩ) wurden auf einem zweiten Mikromanipulator montiert und strategisch positioniert, um vier Regionen pro Zelle zu stimulieren (innere Kapsel, weiße Substanz, S1 und hCO). Zeichnen Sie die synaptischen Reaktionen nach phasischer Stimulation mit 300 µA bei 0,03–0,1 Hz auf.
hChR2-exprimierende hCO-Neuronen wurden bei 480 nm aktiviert und von einer LED (Prizmatix) erzeugte Lichtimpulse wurden durch ein 40-fach-Objektiv (0,9 NA; Olympus) angewendet, um die hChR2-Expression in der Nähe der Zellen aufzuzeichnen. Der Durchmesser des beleuchteten Felds beträgt ca. 0,5 mm und die Gesamtleistung beträgt 10–20 mW. Die Impulsbreite wurde auf 10 ms eingestellt, was dem während des Verhaltenslernexperiments gegebenen Impuls entspricht. Es wurden verschiedene Stimulationsfrequenzen von 1 bis 20 Hz verwendet, aber nur der erste Impuls der Serie wurde zur Quantifizierung verwendet. Die Intervalle zwischen den Zügen sind normalerweise länger als 30 s, um die Wirkung auf synaptische hemmende oder fördernde Bahnen zu minimieren. Um zu testen, ob die hChR2-Reaktion monosynaptisch war, gaben wir TTX (1 μM) in das Bad, bis die EPSC-Reaktion verschwand, und fügten dann 4-Aminopyridin (4-AP; 100 μM) hinzu. Normalerweise erfolgt innerhalb weniger Minuten eine Reaktion, wobei zwischen der Aktivierung der LED und der Erzeugung von EPSC eine etwas längere Verzögerung besteht. NBQX (10 μM) wurde verwendet, um zu testen, ob die Reaktion durch AMPA-Rezeptoren gesteuert wird.
Scharfe hCO-Schnitte wurden wie zuvor beschrieben erstellt. Kurz gesagt wurden hCO-Schnitte in 4 % Agarose eingebettet und in Zellen mit 126 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM NaH2PO4, 1 mM MgSO4, 2 mM CaCl2, 26 mM NaHCO3 und 10 mM d-(+)-Glucose übertragen. Die Schnitte wurden bei Raumtemperatur mit einem Leica VT1200-Vibrator in 200–300 µm dicke Stücke geschnitten und bei Raumtemperatur in ASF gelagert. Anschließend wurde eine Patch-Camp-Aufzeichnung ganzer Zellen an hCO-Schnitten unter einem direkten SliceScope-Mikroskop (Scientifica) durchgeführt. Die Schnitte wurden mit aCSF (95 % O2 und 5 % CO2) perfundiert und die Zellsignale bei Raumtemperatur aufgezeichnet. Die hCO-Neuronen wurden mit einer Borosilikatglaspipette appliziert. Die Pipette enthielt eine Lösung aus 127 mM Kaliumgluconat, 8 mM NaCl, 4 mM Magnesium-ATP, 0,3 mM Natrium-GTP, 10 mM HEPES und 0,6 mM EGTA. Der interne pH-Wert betrug 7,2 und wurde mit KOH (Osmolarität 290) eingestellt. Zur Wiederherstellung wurde der internen Lösung 0,2 % Biocytin zugesetzt.
Die Daten wurden mit Clampex (Clampex 11.1, Molecular Devices) unter Verwendung eines MultiClamp 700B-Verstärkers (Molecular Devices) und eines Digidata 1550B-Digitalisierers (Molecular Devices) erfasst, bei 2 kHz tiefpassgefiltert, bei 20 kHz digitalisiert und mit Clampfit (Version 10.6) für die Analyse (Molecular Devices) und benutzerdefinierten MATLAB-Funktionen (MATLAB 2019b, Mathworks) analysiert. Das Verbindungspotenzial wurde mit JPCalc berechnet und die Einträge an das berechnete Verbindungspotenzial von -14 mV angepasst. Operation IV besteht aus einer Reihe von Stromschritten in 5–10-pA-Schritten von -50 bis 250 pA.
Zur morphologischen Rekonstruktion eingeklemmter Neuronen wurde der internen Lösung 0,2 % Biocytin (Sigma-Aldrich) zugesetzt. Die Zellen werden nach dem Hacken mindestens 15 Minuten lang vorbereitet. Anschließend wird die Pipette 1–2 Minuten lang langsam eingezogen, bis die registrierte Membran vollständig versiegelt ist. Nach der Schnittphysiologie wurden die Schnitte über Nacht bei 4 °C in 4 % PFA fixiert, mit PBS X3 gewaschen und 1:1000 mit Streptavidin-konjugiertem DyLight 549 oder DyLight 405 (Vector Labs) verdünnt. Mit Biocytin (2 %; Sigma-Aldrich) gefüllte Zellen wurden während der Patch-Clamp-Messung 2 Stunden lang bei Raumtemperatur markiert. Die Schnitte wurden dann mit einem Aquamount (Thermo Scientific) auf Objektträger montiert und am nächsten Tag auf einem konfokalen Mikroskop Leica TCS SP8 mit einem Ölimmersionsobjektiv mit einer numerischen Apertur von ×40 1,3, Vergrößerung ×0,9–1,0, xy visualisiert. Die Abtastrate beträgt ca. 7 Pixel pro Mikron. Z-Stapel in 1-µm-Intervallen wurden seriell aufgenommen und Z-Stapel-Mosaike und Leica-basiertes Auto-Stitching wurden durchgeführt, um den gesamten Dendritenbaum jedes Neurons abzudecken. Die Neuronen wurden dann halbmanuell mit der neuTube 40-Schnittstelle verfolgt und SWC-Dateien generiert. Die Dateien wurden dann in das SimpleNeuriteTracer41 Fiji-Plugin (ImageJ, Version 2.1.0; NIH) hochgeladen.
Menschliches Kortexgewebe wurde mit Einverständniserklärung gemäß einem vom Institutional Review Board der Stanford University genehmigten Protokoll gewonnen. Zwei Proben menschlichen postpartalen Gewebes (3 und 18 Jahre alt) wurden durch Resektion des Frontalkortex (mittlerer Frontalgyrus) im Rahmen einer Operation wegen therapieresistenter Epilepsie gewonnen. Nach der Resektion wird das Gewebe in eiskalter NMDG-aCSF entnommen, die Folgendes enthält: 92 mM NMDG, 2,5 mM KCl, 1,25 mM NaH2PO4, 30 mM NaHCO3, 20 mM HEPES, 25 mM Glucose, 2 mM Thioharnstoff, 5 mM Natriumascorbat, 3 mM Natriumpyruvat, 0,5 mM CaCl2 4H2O und 10 mM MgSO4 7H2O. Mit konzentrierter Salzsäure auf pH 7,3–7,4 titrieren. Die Gewebe wurden innerhalb von 30 Minuten an das Labor geliefert und Koronalschnitte wurden gemäß dem oben beschriebenen Verfahren entnommen.
Alle Tierversuche wurden gemäß den von der Stanford University APLAC anerkannten Tierpflegerichtlinien durchgeführt. Ratten (älter als 140 Tage nach der Transplantation) wurden mit 5% Isofluran induziert und intraoperativ mit 1–3% Isofluran anästhesiert. Die Tiere wurden in einen stereotaktischen Rahmen (Kopf) gesetzt und Buprenorphin mit verzögerter Wirkstofffreisetzung (SR) subkutan injiziert. Der Schädel wurde freigelegt, gereinigt und 3–5 Knochenschrauben eingesetzt. Zur gezielten Behandlung von t-hCO wurden stereotaktische Koordinaten aus MRT-Bildern generiert. An der gewünschten Stelle wurde ein Bohrloch gebohrt und Fasern (400 µm Durchmesser, NA 0,48, Doric) 100 µm unter die hCO-Oberfläche abgesenkt und mit UV-härtendem Zahnzement (Relyx) am Schädel befestigt.
Faserphotometrische Aufzeichnungen wurden wie zuvor beschrieben durchgeführt42. Zur Aufzeichnung der spontanen Aktivität wurden die Ratten in einen sauberen Käfig gesetzt und ein 400 µm dickes Glasfaser-Patchkabel (Doric), das an ein faseroptisches photometrisches Datenerfassungssystem angeschlossen war, mit dem implantierten Glasfaserkabel verbunden. Während der 10-minütigen Aufzeichnung der motorischen Aktivität konnten die Tiere den Käfig frei erkunden. Zur Aufzeichnung der evozierten Aktivität wurden die Ratten (mehr als 140 Tage nach der Transplantation) zur Induktion mit 5 % Isofluran und zur Aufrechterhaltung mit 1–3 % Isofluran anästhesiert. Das Tier wurde in einen stereotaktischen Rahmen (Kopf) gesetzt und die Schnurrhaare auf der gegenüberliegenden Seite des t-hCO wurden auf etwa 2 cm gekürzt und durch ein Netz geführt, das mit einem piezoelektrischen Aktuator (PI) verbunden war. Ein 400 µm dickes Glasfaser-Patchkabel (Doric) wurde an die implantierte Faser angeschlossen und mit dem Datenerfassungssystem verbunden. Die Whisker auf der gegenüberliegenden Seite von t-hCO wurden anschließend über einen Aufzeichnungszeitraum von 20 Minuten 50-mal (2 mm bei 20 Hz, 2 s pro Präsentation) zu zufälligen Zeitpunkten durch einen piezoelektrischen Antrieb ausgelenkt. Verwenden Sie das Arduino MATLAB Support Package, um die Auslenkungszeit mit benutzerdefiniertem MATLAB-Code zu steuern. Ereignisse werden über Transistor-Transistor-Logik (TTL)-Impulse mit der Datenerfassungssoftware synchronisiert.
Bei Ratten (mehr als 140 Tage nach der Transplantation) wurde eine Narkose mit 5 % Isofluran eingeleitet und intraoperativ mit 1–3 % Isofluran betäubt. Die Tiere wurden in einen stereotaktischen Rahmen (Kopf) gesetzt und Buprenorphin SR und Dexamethason wurden subkutan injiziert. Der Schädel wird freigelegt, gereinigt und 3–5 Knochenschrauben eingesetzt. Um t-hCO anzuvisieren, haben wir aus MRT-Bildern stereotaktische Koordinaten generiert. Eine zirkuläre Kraniotomie (ungefähr 1 cm Durchmesser) wurde mit einem Hochgeschwindigkeitsbohrer direkt über dem transplantierten hCO durchgeführt. Sobald der Knochen so dünn wie möglich ist, aber bevor durch den gesamten Knochen gebohrt wird, wird die verbleibende intakte Beckenscheibe mit einer Pinzette entfernt, um das darunter liegende t-hCO freizulegen. Die Kraniotomie wurde mit steriler Kochsalzlösung gefüllt und ein Deckglas und ein spezieller Kopfstift wurden mit UV-gehärtetem Zahnzement (Relyx) am Schädel befestigt.
Die Zwei-Photonen-Bildgebung erfolgte mit einem Bruker-Multiphotonenmikroskop mit einem Nikon-LWD-Objektiv (×16, 0,8 NA). Die GCaMP6-Bildgebung erfolgte bei 920 nm mit 1,4-facher einfacher z-Ebenen-Vergrößerung und 8-facher durchschnittlicher Geschwindigkeit von 7,5 fps. Die Ratten wurden mit 5 % Isofluran anästhesiert und mit 1–3 % Isofluran aufrechterhalten. Die Ratten wurden in eine speziell angefertigte Kopfhalterung gesetzt und unter die Linse positioniert. Es wurde eine 3-minütige Hintergrundaufzeichnung der motorischen Aktivität durchgeführt. Im Verlauf der 20-minütigen Aufzeichnung wurden 50 Stöße (jede Präsentation 100 ms lang) zufällig an das Schnurrhaarpolster gegenüber von t-hCO mithilfe eines Picospricers abgegeben. Verwenden Sie das Arduino MATLAB Support Package, um die Burst-Zeit mit benutzerdefiniertem MATLAB-Code zu steuern. Synchronisieren Sie Ereignisse mithilfe von TTL-Impulsen mit Datenerfassungssoftware (PrairieView 5.5). Zur Analyse wurden die Bilder im Rahmen des in Fidschi eingeführten MoCo-Programms mittels affiner Korrektur hinsichtlich der xy-Bewegung korrigiert. Extraktion von Fluoreszenzspuren aus einzelnen Zellen mittels CNMF-E43. Die Fluoreszenz wurde für jeden Bereich von Interesse extrahiert, in dF/F-Kurven umgewandelt und anschließend in z-Scores konvertiert.
Bei Ratten (mehr als 140 Tage nach der Transplantation) wurde eine Narkose mit 5 % Isofluran eingeleitet und intraoperativ mit 1–3 % Isofluran betäubt. Die Tiere wurden in einen stereotaktischen Rahmen (Kopf) gesetzt und Buprenorphin SR und Dexamethason wurden subkutan injiziert. Die Schnurrhaare auf der dem t-hCO gegenüberliegenden Seite wurden auf etwa 2 cm gekürzt und durch ein Netz geführt, das mit einem piezoelektrischen Aktuator verbunden war. Der Schädel wird freigelegt und gereinigt. Eine Erdungsschraube aus Edelstahl wird am Schädel befestigt. Um das t-hCO anzuvisieren, haben wir aus MRT-Bildern stereotaktische Koordinaten generiert. Führen Sie direkt über dem t-hCO eine zirkuläre Kraniotomie (ungefähr 1 cm Durchmesser) mit einem Hochgeschwindigkeitsbohrer durch. Sobald der Knochen so dünn wie möglich ist, aber bevor Sie durch den gesamten Knochen bohren, entfernen Sie mit einer Pinzette die verbleibende intakte Beckenscheibe, um das darunter liegende t-hCO freizulegen. Einzelne Zellen wurden mit 32-Kanal- oder 64-Kanal-Siliziumsonden hoher Dichte (Cambridge Neurotech) aufgezeichnet, die an Erdungsschrauben geerdet und mit RHD-Verstärkern (Intan) vorverstärkt wurden. Verwenden Sie den Manipulator, um die Elektroden durch die mit steriler Kochsalzlösung gefüllte Kraniotomie zur Zielstelle abzusenken. Die Datenerfassung wurde mit einer Frequenz von 30 kHz unter Verwendung des Datenerfassungssystems Open Ephys durchgeführt. Die Aufzeichnung wurde nur fortgesetzt, als wir in mehr als 10 Kanälen eine hochkorrelierte rhythmische spontane Aktivität feststellten, was darauf hindeutet, dass sich die Elektroden im Transplantat befanden (basierend auf Daten der Zwei-Photonen-Kalziumbildgebung). Es wurde eine 10-minütige Hintergrundaufzeichnung der motorischen Aktivität durchgeführt. Die Schnurrhaare auf der gegenüberliegenden Seite von t-hCO wurden dann über einen Aufzeichnungszeitraum von 20 Minuten 50-mal (2 mm bei 20 Hz, 2 s pro Präsentation) zu zufälligen Zeiten durch einen piezoelektrischen Antrieb ausgelenkt. Steuern Sie die Ablenkzeit mit dem MATLAB Support Package für Arduino (MATLAB 2019b) mit benutzerdefiniertem MATLAB-Code. Verwenden Sie TTL-Impulse, um Ereignisse mit der Datenerfassungssoftware zu synchronisieren.
Für optische Markierungsexperimente wurde ein 200-µm-Patchkabel (Doric), das an einen 473-nm-Laser (Omicron) angeschlossen war, mit einer 200-µm-Glasfaser über der Kraniotomie verbunden. Unmittelbar zuvor wurde die Jumperleistung auf 20 mW eingestellt. Die Elektroden wurden mit dem Manipulator durch die mit steriler Kochsalzlösung gefüllte Kraniotomie zur Zielstelle abgesenkt. Zu Beginn der Aufzeichnung wurden zehn 473-nm-Lichtimpulse (Frequenz 2 Hz, Impulsdauer 10 ms) ausgesendet. Als lichtempfindliche Zellen wurden Zellen definiert, die in mindestens 70 % der Versuche innerhalb von 10 ms Lichteinwirkung eine Spike-Reaktion zeigten.