Tapadh leibh airson tadhal air Nature.com. Tha thu a’ cleachdadh dreach den bhrobhsair agad le taic CSS cuibhrichte. Airson an eòlas as fheàrr, tha sinn a’ moladh gun cleachd thu brabhsair ùraichte (no gun cuir thu dheth Modh Co-chòrdalachd ann an Internet Explorer). A bharrachd air an sin, gus dèanamh cinnteach à taic leantainneach, tha sinn a’ sealltainn an làraich gun stoidhlichean agus JavaScript.
A’ taisbeanadh carousel de thrì sleamhnagan aig an aon àm. Cleachd na putanan Roimhe agus Air adhart gus gluasad tro thrì sleamhnagan aig an aon àm, no cleachd na putanan sleamhnag aig a’ cheann thall gus gluasad tro thrì sleamhnagan aig an aon àm.
Tha organelles neoni fèin-chruinneachaidh a’ riochdachadh àrd-ùrlar gealltanach in vitro airson modaladh leasachadh is galair daonna. Ach, chan eil an ceangal a th’ aig organoids a tha ann in vivo, a chuireas bacadh air aibidh agus a chuireas casg air amalachadh le cuairtean eile a bhios a’ cumail smachd air giùlan. An seo tha sinn a’ sealltainn gu bheil organoids cortical a thig bho cheallan gas daonna a thèid a thar-chur a-steach do cortex somatosensory radain rùisgte ùr-bhreith a’ leasachadh seòrsachan cealla aibidh a bhios ag amalachadh ann an cuairtean mothachaidh agus brosnachaidh. Nochd MRI fàs organoid às dèidh tar-chur ann an grunn loidhnichean cealla gas agus bheathaichean, agus nochd mion-sgrùdadh aon-chridhe adhartas corticogenesis agus nochdadh prògram tar-sgrìobhaidh a tha an urra ri gnìomhachd. Gu dearbh, tha feartan morf-eòlach, synaptic agus membran a-staigh nas iom-fhillte aig neurons cortical a chaidh a thar-chur na an co-aoisean in vitro, a’ leigeil le lorg lochdan neuronal ann an euslaintich le sionndrom Timothy. Tha lorg anatomical agus gnìomhach air sealltainn gu bheil organelles a chaidh a thar-chur a’ faighinn cuir-a-steach thalamocortical agus corticocortical, agus tha clàran in vivo de ghnìomhachd neoni a’ moladh gum faod na cuir-a-steach sin freagairtean mothachaidh a ghineadh ann an ceallan daonna. Mu dheireadh, bidh organoids cortical a’ leudachadh axons air feadh eanchainn an radain, agus tha an gnìomhachd optogenetic aca a’ leantainn gu giùlan a tha a’ sireadh duaisean. Mar sin, bidh niùronan cortex daonna a chaidh a thar-chur a’ fàs nas aibidh agus a’ gabhail pàirt ann an cuairtean an aoigh a bhios a’ cumail smachd air giùlan. Tha sinn an dùil gun cuidich an dòigh-obrach seo le bhith a’ lorg phenotypes aig ìre snàthainn ann an ceallan a thig bhon euslainteach nach gabh a lorg le dòighean eile.
Tha eanchainn an duine a tha a’ leasachadh na phròiseas fèin-eagrachaidh iongantach anns am bi ceallan ag iomadachadh, ag eadar-dhealachadh, a’ gluasad, agus a’ ceangal gus cuairtean neuronal gnìomhach a chruthachadh a tha air an leasachadh nas motha tro eòlas mothachaidh. Is e prìomh dhuilgheadas ann a bhith a’ tuigsinn leasachadh eanchainn an duine, gu sònraichte ann an co-theacsa galair, dìth ruigsinneachd gu clò eanchainn. Faodaidh organelles fèin-eagrachaidh, a’ gabhail a-steach organoidean cortex daonna (hCO; ris an canar cuideachd cruinne cortex an duine), 2,3,4,5,6 a ghineadh. Ach, tha grunn chuingealachaidhean a’ cuingealachadh an cleachdadh nas fharsainge ann a bhith a’ tuigsinn leasachadh agus gnìomhachd chuairtean neuronal. Gu sònraichte, chan eil e soilleir a bheil aibidh hCO air a chuingealachadh le dìth cuir-a-steach meanbh-àrainneachdail agus mothachaidh sònraichte a tha an làthair in vivo. A bharrachd air an sin, leis nach eil hCOan air an amalachadh ann an chuairtean as urrainn toraidhean giùlain a ghineadh, tha an goireasachd ann a bhith a’ modaladh eas-òrdughan neuropsychiatric iom-fhillte gu ginteil agus giùlain cuingealaichte an-dràsta.
Faodaidh tar-chur hCO a-steach do eanchainn bheò slàn faighinn thairis air na cuingeadan sin. Tha sgrùdaidhean roimhe air sealltainn gu bheil neurons daonna a chaidh a thar-chur a-steach do cortex creimich comasach air mairsinn, pròiseactadh, agus conaltradh le ceallan creimich7,8,9,10,11,12. Ach, mar as trice bidh na deuchainnean seo air an dèanamh air beathaichean inbheach, a dh’ fhaodadh crìoch a chuir air amalachadh synaptic agus axonal. An seo, tha sinn a’ toirt cunntas air paradigm tar-chuir anns an do thar-chuir sinn hCO 3D a chaidh a thoirt bho cheallan hiPS a-steach don phrìomh cortex somatosensory (S1) de radain le dìonachd easbhaidheach aig ìre thràth de leasachadh plastaig. Bidh neurons hCO (t-hCO) a chaidh a thar-chur a’ dol tro aibidh mòr, a’ faighinn cuir-a-steach thalamocortical agus cortical-cortical a bhrosnaicheas freagairtean mothachaidh, agus a’ leudachadh ro-mheasaidhean axonal a-steach do eanchainn an radain gus giùlan a tha a’ sireadh duaisean a bhrosnachadh. Tha aibidh leudaichte t-hCO air easbhaidhean neuronal fhoillseachadh ann an euslaintich le sionndrom Timothy (TS), eas-òrdugh ginteil dona air adhbhrachadh le mùthaidhean anns an t-sianal calcium CaV1.2 seòrsa-L a tha mothachail air bholtadh (air a chòdachadh le CACNA1C).
Gus sgrùdadh a dhèanamh air neuronan cortical daonna ann an cuairtean in vivo, chuir sinn hCO3 3D slàn a-steach gu stereotactic a-steach do S1 radain athymic tràth iar-bhreith (làithean 3-7 às dèidh breith) (Figear 1a agus dàta leudaichte de Fhigear 1a-c). Aig an ìre seo, chan eil na ro-mheasaidhean axonal thalamocortical agus corticocortical air an innervation S1 aca a chrìochnachadh fhathast (iomradh 13). Mar sin, tha an dòigh-obrach seo air a dhealbhadh gus amalachadh t-hCO3 a mheudachadh agus aig an aon àm a’ lughdachadh buaidh air cuairtean endogenous. Gus suidheachadh t-hCO3 ann am beathaichean beò fhaicinn, rinn sinn ath-thogail eanchainn MRI le cuideam T2 de radain 2-3 mìosan às deidh tar-chur (Figear 1b agus dàta leudaichte, Figear 1d). Chaidh t-hCO fhaicinn gu furasta agus bha tomhais meud t-hCO coltach ris an fheadhainn a chaidh obrachadh a-mach bho shliseagan stèidhichte (Dàta Leudaichte Figear 1d,e; P > 0.05). Chaidh t-hCO fhaicinn gu furasta agus bha tomhais meud t-hCO coltach ris an fheadhainn a chaidh obrachadh a-mach bho shliseagan stèidhichte (Dàta Leudaichte Figear 1d,e; P > 0.05). t-hCO легко наблюдались, а объемные измерения t-hCO были аналогичны рассчитанным для фиксированныеѷ данные, рис 1d, e; Bha e furasta t-hCO fhaicinn, agus bha tomhais toirt-mheudach t-hCO coltach ris an fheadhainn a chaidh obrachadh a-mach airson earrannan stèidhichte (dàta leudaichte, Figear 1d, e; P > 0.05).很容易观察到t-hCO, 并 且t-hCO的体积测量值与从固定切片计算的测量值相似（扩展数据图1d、e；P > 。）很容易观察到t-hCO, 并 且t-hCO t-hCO легко наблюдался, а объемные измерения t-hCO были аналогичны рассчитанным для фиксированнрыыыыы данные, рис 1d, e; Bha e furasta t-hCO fhaicinn, agus bha tomhais toirt-mheudach t-hCO coltach ris an fheadhainn a chaidh obrachadh a-mach airson earrannan stèidhichte (dàta leudaichte, Figear 1d, e; P > 0.05).Mhìnich sinn t-hCO3 ann an 81% de bheathaichean a chaidh a thar-chur timcheall air 2 mhìos an dèidh tar-chur (n = 72 beathach; hCO3 bho 10 loidhnichean cealla hiPS; loidhnichean cealla hiPS ann an Clàr a bharrachd 1). Dhiubh sin, bha 87% suidhichte anns a’ chòrtex cerebral (Figear 1c). Le bhith a’ dèanamh sganaidhean MRI sreath aig iomadh àm san aon radain a chaidh a thar-chur, lorg sinn àrdachadh naoi-fhillte ann an tomhas-lìonaidh t-hCO3 taobh a-staigh 3 mìosan (Figear 1d agus dàta leudaichte, Figear 1f). Bha ìre mairsinn àrd (74%) aig beathaichean a chaidh a thar-chur 12 mìosan an dèidh tar-chur (dàta leudaichte, Figear 1g agus Clàr a bharrachd 2), agus cha deach ciorraman motair no cuimhne follaiseach, gliosis, no electroencephalogram (EEG) a lorg. Dàta Figear 1g agus clàr a bharrachd 2). 1h–m agus 3e).
a, Sgeama de dhealbhadh deuchainneach. Chaidh hCO a thàinig bho cheallan hiPS a thar-chur a-steach do S1 de radain rùisgte ùr-bhreith air làithean 30-60 de eadar-dhealachadh. b, Ìomhaighean MRI coronach is còmhnard le cuideam T2 a’ sealltainn t-hCO ann an S1 2 mhìos an dèidh tar-chur. Bàr sgèile, 2 mm. c, Meudachadh ìrean soirbheachais engraftment air an sealltainn airson gach loidhne cealla hiPS (n = 108, tha àireamhan taobh a-staigh bhàraichean a’ comharrachadh meud t-hCO gach loidhne cealla hIPS) agus àite cortical no subcortical (n = 88). d, Ìomhaigh MRI de artery coronaich (clì; bàr sgèile, 3 mm) agus ath-thogail toirteil 3D co-fhreagarrach (bàr sgèile, 3 mm) a’ sealltainn àrdachadh ann an t-hCO thairis air 3 mìosan. e, Ath-sgrùdadh air pàtrain t-hCO ann an cortex cerebral radain. Bàr sgèile, 1 mm. f, Dealbhan riochdachail imdhíon-chiotocheimiceach de t-hCO air an sealltainn bho mhullach clì gu deas (rè eadar-dhealachaidh): PPP1R17 (4 mìosan a dh'aois), NeuN (8 mìosan a dh'aois), SOX9 agus GFAP (8 mìosan a dh'aois), PDGFRα; (8 mìosan), MAP2 (8 mìosan) agus IBA1 (8 mìosan). Bàr-sgèile, 20 µm. Tha co-chur an cèill HNA a’ comharrachadh ceallan de thùs daonna. g, snRNA-seq: Dealbhan lughdachadh tomhasachd iomadachd is ro-mheasadh aonaichte (UMAP) de gach niuclasach t-hCO àrd-inbhe às deidh amalachadh Seurat (n=3 sampallan t-hCO, n=2 loidhnichean cealla hiPS). Astrocytes, ceallan na loidhne astrocyte; cyc prog, sinnsearan a’ cuairteachadh; GluN DL, neurons glutamatergic domhainn; GluN DL/SP, neurons glutamatergic domhainn agus fo-lamellar; GluN UL, neurons glutamatergic sreath àrd; oligodendrocytes, oligodendrocytes; OPC, ceallan sinnsear oligodendrocyte; RELN, neuronan reelin. h, Mion-sgrùdadh beairteachaidh teirm Gene Ontology (GO) air ginean air an àrdachadh gu mòr (P atharraichte < 0.05, atharrachadh fillte > 2, air a chur an cèill ann an co-dhiù 10% de niuclasan) ann an neurons glutamatergic t-hCO an taca ri neurons glutamatergic hCO. h, Mion-sgrùdadh beairteachaidh teirm Gene Ontology (GO) air ginean air an àrdachadh gu mòr (P atharraichte < 0.05, atharrachadh fillte > 2, air a chur an cèill ann an co-dhiù 10% de niuclasan) ann an neurons glutamatergic t-hCO an taca ri neurons glutamatergic hCO. h, Анализ обогащения терминов Gene Ontology (GO) для генов со значительной активацией (скорректированный P <0,05> 2, экспрессия по крайней мере в 10% ядер) в глутаматергических нейронах t-hCO по сравнению с глутамичих hCO. h, Mion-sgrùdadh beairteachaidh teirm Gene Ontology (GO) airson ginean le gnìomhachadh cudromach (P atharraichte <0.05, atharrachadh fillte >2, abairt ann an co-dhiù 10% niuclasan) ann an niùronan glutamatergic t-hCO an taca ri niùronan glutamatergic hCO. h, 与hCO 谷氨酸能 神经元相比, t-hCO 谷氨酸能神经元中基因显着上调（调整.匕台 嘏2, 在至少 10% 的细胞核中表达) 的基 因本 体论(GO) 术语富 集分析。 h, 与 hco 谷氨酸 能 元 相比, t-hco 谷氨酸 能 神经 元 基因 显着 上调 后 嘎 嘌 嘌 嘎 嘎嘎变化> 2 ， 至少 10% 的核中表达) 基因基因 基因 的 的 的 的 的的的的的的的的的的的的的的的的的的的的的的的的的的的的的的的的的的的的的的的的的的的的的的的的的的的的的的的的的的的的的的的的的的的的的的mu dheidhinn 的本体论(GO) 术语富集分析. h, гены значительно активизировались (скорректированный P <0,05, кратность изменения> 2, экспрессипо мере в 10% ядер) в глутаматергических нейронах t-hCO по сравнению с глутаматергическими нейронами hCO Оионию analiz termina obogasheniya. h, bha ginean air an àrdachadh gu mòr (P atharraichte < 0.05, atharrachadh fillte > 2, air a chur an cèill ann an co-dhiù 10% de niuclasan) ann an niùronan glutamatergic t-hCO an taca ri niùronan glutamatergic hCO Mion-sgrùdadh ontologach (GO) air an teirm beairteachaidh.Tha an loidhne dhotagach a’ comharrachadh luach aq de 0.05. i, ìomhaighean UMAP de sheòrsan cealla GluN ann an t-hCO a’ cleachdadh gluasad bileagan bho sheata dàta cortex motair inbheach 22 snRNA-seq iomraidh. CT — ceallan corticothalamic, ET — ceallan extracerebral, IT — ceallan telencephalic a-staigh, NP — faisg air ro-mheasadh.
An uairsin rinn sinn measadh air cytoarchitecture agus co-dhèanamh ceallach iomlan t-hCO. Nochd dathadh antibody cheallan endothelial radain vascularization le t-hCO, agus nochd dathadh IBA1 làthaireachd microglia radain air feadh a’ ghraft (Figear 1f agus dàta leudaichte, Figear 3c,d). Nochd immunostaining ceallan dearbhach antigen niùclasach daonna (HNA) a’ co-chur an cèill PPP1R17 (progenitors cortical), NeuN (neurons), SOX9 agus GFAP (ceallan a thig bho glial) no PDGFRα (progenitors oligodendrocyte) (Figear 1f). Gus sgrùdadh a dhèanamh air co-dhèanamh ceallach t-hCO aig rùn cealla singilte, rinn sinn sreath RNA aon-cridhe (snRNA-seq) às deidh timcheall air 8 mìosan de eadar-dhealachadh. Thug sìoladh mòr agus toirt air falbh niuclasan radain 21,500 mapaichean mononuclear daonna àrd-inbhe (Figear 1g agus dàta leudaichte, Figear 4a,b). Chomharraich pàtrain abairteachaidh chomharran seòrsa cealla àbhaisteach cruinneachaidhean de phrìomh chlasaichean cealla cortical, a’ gabhail a-steach neurons glutamatergic domhainn is uachdarach, sinnsearan cuairteachaidh, oligodendrocytes, agus loidhne astrocyte (Figear 1g, dàta leudaichte, Figear 4c, agus Clàr a bharrachd 3). Sheall immunostaining airson SATB2 agus CTIP2, a dh’ aindeoin làthaireachd fo-sheòrsan cortical, nach do sheall t-hCO sreathanachadh anatomical soilleir (dàta leudaichte, Figear 3a). Thug snRNA-seq hCO a bha co-ionnan ri ìre clasaichean cealla gu math coltach, le beagan eisgeachdan, a’ gabhail a-steach dìth oligodendrocytes agus làthaireachd neurons GABAergic, a dh’ fhaodadh a bhith a’ nochdadh nan suidheachaidhean in vitro fàbharach a chaidh aithris roimhe airson ceallan sinnsearan taobhach15 (dàta leudaichte, Figear 4f – i agus Clàr a bharrachd 4). Nochd mion-sgrùdadh eadar-dhealaichte air abairtean gine eadar-dhealachaidhean mòra ann an neuronan glutamatergic eadar t-hCO agus hCO (Clàr a bharrachd 5), a’ gabhail a-steach gnìomhachadh seataichean de ghinean co-cheangailte ri aibidh neuronal leithid comharran synaptic, suidheachadh dendritic, agus gnìomhachd seanail bholtaids-gheataichte (Figear 1h agus Clàr a bharrachd 5). clàr 6). A rèir sin, sheall neuronan t-hCO glutamatergic cortical aibidh tar-sgrìobhaidh nas luaithe.
Gus soilleireachadh an robh na h-atharrachaidhean tar-sgrìobhaidh seo ann an t-hCO3 co-cheangailte ri eadar-dhealachaidhean moirfeòlais eadar hCO3 in vitro agus t-hCO3 in vivo, rinn sinn ath-thogail air hCO3 agus hCO3 làn biocytin a bha co-ionnan ri ìre ann an earrannan géara an dèidh 7–8 mìosan de eadar-dhealachadh. neurons hCO3 (Figear 2a). Bha neurons t-hCO3 gu math nas motha, bha 1.5 uiread trast-thomhas an t-soma aca, dà uiread de dendrites, agus àrdachadh sia-fhillte iomlan ann am fad iomlan dendritic an taca ri hCO3 in vitro (Figear 2b). A bharrachd air an sin, chunnaic sinn dùmhlachd gu math nas àirde de spines dendritic ann an neurons t-hCO3 na ann an neurons hCO3 (Figear 2c). Tha seo a’ moladh gu bheil neurons t-hCO3 a’ faighinn leudachadh agus geugachadh dendritic farsaing, a dh’ fhaodadh, còmhla ri iomadachadh cealla leantainneach, cur ri fàs dian t-hCO3 às deidh tar-chur (Figear 1d agus Dàta Leudaichte Figear 1f). Thug seo oirnn sgrùdadh a dhèanamh air na feartan electrophysiological. Bha comas na membran ochd tursan nas àirde (dàta leudaichte, Figear 8d), bha comas na membran aig fois nas hyperpolaraichte (timcheall air 20 mV), agus dh’ adhbhraich stealladh gnàthach ìre brosnachaidh as àirde nas àirde ann an neurons t-hCO na ann an neurons hCO. in vitro (Figear 2d), e), a tha a rèir feartan morf-eòlach nas motha agus nas iom-fhillte t-hCO. A bharrachd air an sin, bha tricead thachartasan gnàthach postsynaptic brosnachail gun spionnadh (EPSC) gu math nas àirde ann an neurons t-hCO (Figear 2f), a’ moladh gu robh an dùmhlachd nas motha de spines dendritic a chithear ann an neurons t-hCO co-cheangailte ri so-ghluasadachd gnìomh. synapse gnèitheasach. Dhearbh sinn caractar neo-aibidh neurons hCO in vitro le bhith a’ clàradh neurons glutamatergic le bileagan (dàta leudaichte, Figear 6a-c).
a, ath-chruthachadh 3D de neuronan hCO agus t-hCO làn biocytin an dèidh 8 mìosan de eadar-dhealachadh. b, Meudachadh fheartan moirfeòlais (n = 8 niùronan hCO, n = 6 niùronan t-hCO; **P = 0.0084, *P = 0.0179 agus ***P < 0.0001). b, Meudachadh fheartan moirfeòlais (n = 8 niùronan hCO, n = 6 niùronan t-hCO; **P = 0.0084, *P = 0.0179 agus ***P < 0.0001). б, количественная оценка морфологических признаков (n = 8 нейронов hCO, n = 6 нейронов t-hCO; ** P = 0,0084, * P = 0,0084, * P = 0,004, * P = 0,004, * P = 7,004, * P = 7,004, * P = 9,000). b, tomhas fheartan moirfeòlais (n=8 niùronan hCO, n=6 niùronan t-hCO; **P=0.0084, *P=0.0179, agus ***P<0.0001). b，形态学特征的量化（n = 8 个hCO 神 经元， n = 6 个t-hCO 神 经 元；**P = 0.0084，*P = 0.01**0＀ <0.01**0＀ b，形态学特征的量化（n = 8 个hCO 神 经元， n = 6 个t-hCO 神 经 元；**P = 0.0084，*P = 0.01**0＀ <0.01**0＀ б, количественная оценка морфологических признаков (n = 8 нейронов hCO, n = 6 нейронов t-hCO; ** P = 0,0084, * P = 0,0084, * P = 0,004, * P = 0,004, * P = 7,004, * P = 7,004, * P = 9,000). b, tomhas fheartan moirfeòlais (n=8 niùronan hCO, n=6 niùronan t-hCO; **P=0.0084, *P=0.0179, agus ***P<0.0001).c, Ath-thogail 3D de gheugan dendritic hCO agus t-hCO an dèidh 8 mìosan de eadar-dhealachadh. Tha reultan dearga a’ comharrachadh droigheann dendritic a tha fo amharas. Tomhas dùmhlachd droma dendritic (n = 8 neurons hCO, n = 6 neurons t-hCO; **P = 0.0092). d, Meudachadh comas na membran fois (n = 25 niùronan hCO3, n = 16 niùronan t-hCO3; ***P < 0.0001). d, Meudachadh comas na membran fois (n = 25 niùronan hCO3, n = 16 niùronan t-hCO3; ***P < 0.0001). d, количественная оценка мембранного потенциала покоя (n = 25 нейронов hCO, n = 16 нейронов t-hCO; *** P <0,0001). d, tomhas comas membran fois (n = 25 niùronan hCO3, n = 16 niùronan t-hCO3; ***P < 0.0001). d, 静息膜电位的量化（n = 25 hCO 神经元， n = 16 t-hCO 神经元； ***P <0.0001） 。 d, 静息膜电位的量化（n = 25 hCO 神经元， n = 16 t-hCO 神经元； ***P <0.0001） 。 d, количественная оценка мембранного потенциала покоя (n = 25 нейронов hCO, n = 16 нейронов t-hCO; *** P <0,0001). d, tomhas comas membran fois (n = 25 niùronan hCO3, n = 16 niùronan t-hCO3; ***P < 0.0001). e, Losgadh comas gnìomh ath-aithriseach ann an hCO agus t-hCO air a bhrosnachadh le bhith ag àrdachadh stealladh gnàthach, agus tomhas an ìre losgaidh as àirde (n = 25 niùronan hCO, n = 16 niùronan t-hCO; ***P < 0.0001). e, Losgadh comas gnìomh ath-aithriseach ann an hCO agus t-hCO air a bhrosnachadh le bhith ag àrdachadh stealladh gnàthach, agus tomhas an ìre losgaidh as àirde (n = 25 niùronan hCO, n = 16 niùronan t-hCO; ***P < 0.0001). e, повторное возбуждение потенциала действия в hCO agus t-hCO, вызванное увеличением тока, agus количественкенаи ома скорости возбуждения (n = 25 нейронов hCO, n = 16 нейронов t-hCO; *** P <0,0001). e, ath-losgadh comas gnìomh ann an hCO agus t-hCO air adhbhrachadh le àrdachadh gnàthach agus tomhas an ìre losgaidh as àirde (n = 25 niùron hCO, n = 16 niùron t-hCO; *** P < 0.0001). e, 通过增加电流注入诱导的hCO 和t-hCO 重复动作电位放电, 以及最大放电率的5 =CO神经元， n = 16 个t-hCO 神经元； *** P < 0.0001）. E, 通过 增加 电流注入 的 的 hco 和 t-hco 重复 电位 放电 , 以及 最 大 的 里 和 和神 经 ， n = 16 个 t-hco 神 经 ； *** p <0.0001） 。 e, повторяющееся возбуждение потенциала действия hCO agus t-hCO, вызванное увеличением подачи тока, agus кеоца максимальной скорости возбуждения (n = 25 нейронов hCO, n = 16 нейронов t-hCO; *** P <0,0001). e, losgadh ath-aithriseach de chomasan gnìomh hCO agus t-hCO air adhbhrachadh le barrachd solar gnàthach agus tomhas na h-ìre losgaidh as àirde (n = 25 niùron hCO, n = 16 niùron t-hCO; *** P < 0.0001). f, EPSCan gun spionnadh (sEPSCan) ann an niùronan hCO agus t-hCO aig 8 mìosan de eadar-dhealachadh, agus tomhas tricead thachartasan synaptic (n = 25 niùronan hCO, n = 17 niùronan t-hCO; ***P < 0.0001). f, EPSCan gun spionnadh (sEPSCan) ann an niùronan hCO agus t-hCO aig 8 mìosan de eadar-dhealachadh, agus tomhas tricead thachartasan synaptic (n = 25 niùronan hCO, n = 17 niùronan t-hCO; ***P < 0.0001). f, спонтанные EPSC (sEPSC) в нейронах hCO и t-hCO через 8 месяцев диффференцировки и количественная оценкапаты чаты чаты чественная оценкаты событий (n = 25 нейронов hCO, n = 17 нейронов t-hCO; *** P <0,0001). f, EPSCan gun spionnadh (sEPSCan) ann an niùronan hCO agus t-hCO aig 8 mìosan de eadar-dhealachadh agus tomhas ìrean tachartais synaptic (n=25 niùronan hCO, n=17 niùronan t-hCO; ***P<0.0001). f，分化8 个月时hCO 和t-hCO 神经元中的自发性EPSCs (sEPSCs), 以及突触事件频率的里匌 = 2神经元， n = 17 t-hCO 神经元； *** P < 0.0001） . f, 分化8 个月时hCO 和t-hCO 神经元中的自发性EPSCs (sEPSCs), 以及突触事件频 率的釼 匼 匼 匼 叼神率的量匼（n = 25 hCO 神率的量匼（n = 25hCO P <0.0001） . f, спонтанные EPSC (sEPSC) в нейронах hCO и t-hCO через 8 месяцев диффференцировки и количественная оценкапаты чаты чаты чественная оценкаты событий (n = 25 нейронов hCO, n = 17 нейронов t-hCO; *** P <0,0001). f, EPSCan gun spionnadh (sEPSCan) ann an niùronan hCO agus t-hCO aig 8 mìosan de eadar-dhealachadh agus tomhas ìrean tachartais synaptic (n = 25 niùronan hCO, n = 17 niùronan t-hCO; *** P<0.0001).Airson bf, chaidh hCO3 agus t-hCO3 ann an loidhne 1208-2 a thoirt bhon aon bhaidse eadar-dhealachaidh a chaidh a chumail aig an aon àm. g, Mion-sgrùdadh beairteachaidh seata gine (deuchainn Fisher aon-taobhach) de ghinean air an àrdachadh gu mòr (P atharraichte < 0.05, atharrachadh fillte > 2, air a chur an cèill ann an co-dhiù 10% de niuclasan) ann an niùronan glutamatergic t-hCO an taca ri niùronan glutamatergic hCO le seataichean gine de ghinean an urra ri gnìomhachd freagairt tràth (ERG) agus freagairt fadalach (LRG) air an comharrachadh bho sgrùdadh luchaige in vivo16 agus LRGan sònraichte do dhaoine bho niùronan in vitro17. g, Mion-sgrùdadh beairteachaidh seata gine (deuchainn Fisher aon-taobhach) de ghinean air an àrdachadh gu mòr (P atharraichte < 0.05, atharrachadh fillte > 2, air a chur an cèill ann an co-dhiù 10% de niuclasan) ann an niùronan glutamatergic t-hCO an taca ri niùronan glutamatergic hCO le seataichean gine de ghinean an urra ri gnìomhachd freagairt tràth (ERG) agus freagairt fadalach (LRG) air an comharrachadh bho sgrùdadh luchaige in vivo16 agus LRGan sònraichte do dhaoine bho niùronan in vitro17. g, анализ обогащения набора генов (односторонний точный критерий Фишера) генов со значительной акительной акительной (скорректированный P <0,05, кратность изменения > 2, экспрессия по меньшей мере в 10% ядер) в глутамаронекина t-hCO по сравнению с глутаматергическими нейронами hCO наборы генов как раннего (ERG), так и позднего (LRG, Љощо, LRG) активности, идентифицированных в исследовании на мышах in vivo16, agus специфических для человека нроов 17. g, mion-sgrùdadh air beairteachadh seata ginean (deuchainn Fisher aon-earballach) de ghinean le gnìomhachadh cudromach (P atharraichte <0.05, atharrachadh fillte >2, abairt ann an co-dhiù 10% de niuclasan) ann an niùronan glutamatergic t-hCO an taca ri seataichean niùronan glutamatergic hCO de ghinean tràth (ERG) agus fadalach (LRG) an urra ri gnìomhachd a chaidh an comharrachadh ann an luchagan in vivo16 agus LRGan sònraichte do dhaoine bho niùronan in vitro17. g, t-hCO谷氨酸能神经元与hCO谷氨酸能神经元相比,t -hCO谷氨酸能神经元显着上调（调整后P<0.05, 倍数变化>2, 在至少 10% 的细胞核中表达) 的基因集富集分析（单侧F isher精确检验）从体内小鼠研究中鉴定的早期反应(ERG)和晚期反应(LRG) 活性 依赖性基因的基因组16 和体外神经元17 中的人类特倂 g, t-hco 谷氨酸 神经 元 与 hco 谷氨酸 神经元 相比, t-hco 谷氨酸 神经 元 上<0.0. ， 倍数> 2 ， 至少 至少 10% 的 细胞 核中 表达) 的 集富集 分析 , 单 侧 iasgair 粼Ｎ 粼）小鼠 研究 中 的 早期 反应 反应 反应 和 晚期 反应 反应 (lrg) 活性 基因 的 基因组 16 基因组 16神经元 17中中 17中 17的人类特异性LRG. g, глутаматергические нейроны t-hCO были значительно активизированы по сравнению с глутаматергемичи (скорректированный P<0,05, кратность изменения> 2, не менее 10% Анализ обогащения набора генов (одностора генов) Фишера) раннего ответа (ERG) agus позднего гены, зависящие от активности ответа (LRG), идентифицированили Geamannan ann an vivo16 agus neoni in vitro17. LRG, sпецифичные для человека. g, bha niùronan glutamatergic t-hCO air an àrdachadh gu mòr an taca ri niùronan glutamatergic hCO (P atharraichte <0.05, atharrachadh fillte >2, co-dhiù 10%) Mion-sgrùdadh beairteachaidh gine freagairt tràth (ERG) agus freagairt fadalach (deuchainn mionaideach Fisher aon-earballach) ginean an urra ri gnìomhachd freagairt (LRGn) air an comharrachadh ann an luchagan in vivo16 agus niùronan in vitro.17 LRGn sònraichte do dhaoine.Tha an loidhne dhotagach a’ comharrachadh luach P de 0.05, air a cheartachadh le Bonferroni. h, bha àrdachadh mòr ann an abairt gine GluN (pseudo-package agus sgèileadh gach gine) ann an leth-bhreacan snRNA-seq de ghinean LRG ann an neurons glutamatergic t-hCO. i, dìon-dhath a’ sealltainn abairt SCG2 ann an neurons t-hCO (àrd) agus hCO (ìosal). Tha saighdean geala a’ comharrachadh ceallan SCG2+. Bàr-sgèile, 25 µm. Tha dàta air a chur an cèill mar chuibheasach ± ​​claonadh àbhaisteach.
Stèidhichte air an àrdachadh ann an gnìomhachd t-hCO a chaidh fhaicinn ann an sliseagan ex vivo, nochd snRNA-seq àrdachadh a rèir gnìomhachd ann an tar-sgrìobhaidhean gine ann an t-hCO an taca ri hCO in vitro. Bha ìrean nas àirde de ghinean a’ riaghladh gnìomhachd freagairt fadalach aig niùronan t-hCO glutamatergic (Figear 2g,h), a chaidh a lorg ann an sgrùdaidhean roimhe ann an niùronan luchaige is daonna16,17. Mar eisimpleir, sheall BDNF18, SCG2, agus OSTN, gine riaghlaidh gnìomhachd sònraichte do phrìomhaidean, barrachd abairt ann an niùronan t-hCO an taca ri niùronan hCO (Figear 2g-i). Mar sin, sheall niùronan t-hCO feartan aibidh nas fheàrr an taca ri niùronan hCO le mion-sgrùdaidhean tar-sgrìobhaidh, morf-eòlach, agus gnìomhach.
Gus tuilleadh measadh a dhèanamh air a’ cheangal eadar aibidh t-hCO agus leasachadh eanchainn daonna, rinn sinn coimeasan transcriptomic de sheòrsachan cealla cortical fetal agus inbheach19,20 agus inbheach21,22 a bharrachd air dàta farsaing air abairt gine cortical23 rè leasachadh (dàta leudaichte, Figear 5). le obair roimhe24, tha inbhe aibidh transcriptome hCO agus t-hCO cruinneil aig 7–8 mìosan de eadar-dhealachadh gu ìre mhòr a rèir ùine leasachaidh in vivo agus tha e co-ionann ri beatha fetal fadalach (Dàta Leudaichte Figear 5a). Gu sònraichte, chunnaic sinn aibidh transcriptome nas motha ann an t-hCO an taca ri hCO a rèir aois, a bharrachd air gnìomhachadh transcriptome co-cheangailte ri synaptogenesis, astrogenesis, agus myelination (dàta leudaichte, Figear 5b-d). Aig an ìre ceallach, fhuair sinn fianais air fo-sheòrsa cortex nas taine ann an t-hCO, le cruinneachaidhean de neurons glutamatergic a’ dol thairis air fo-sheòrsan neuron inbheach L2/3, L5, agus L6 (Figear 1i). An coimeas ri sin, bha for-tharraing cruinneachaidh eadar niùronan t-hCO glutamatergic agus niùronan cortical fetal nas cuingealaichte ann am meadhan an torrachais (dàta leudaichte, Figear 5e-j). Gus faighinn a-mach a bheil niùronan t-hCO coltach gu gnìomhach ri niùronan neocortical iar-bhreith daonna, rinn sinn clàraidhean electro-fhiseòlasach agus ath-thogail anatomical de niùronan pioramaideach L2/3 daonna ann an earrannan biorach den cortex iar-bhreith daonna (dàta leudaichte, Figear 7a). Bha feartan electro-fhiseòlasach niùronan pioramaideach L2/3 coltach ri feartan niùronan pioramaideach t-hCO (dàta leudaichte, Figear 7e). A thaobh morf-eòlas, bha niùronan L2/3 bho shampaill daonna iar-bhreith nas coltaiche ri t-hCO na ri hCO, ged a bha ceallan L2/3 nas fhaide, anns an robh barrachd mheuran san fharsaingeachd, agus bha dùmhlachd droma nas àirde aca (Figear 3g agus dàta leudaichte, Figear 7b-). G).
a, tar-chur hCO air a thoirt gu buil le loidhnichean cealla smachd agus TS hiPS a-steach do radain ùr-bhreith. b, ath-thogail 3D de neurons t-hCO làn biocytin an dèidh 8 mìosan de eadar-dhealachadh. c, tomhas fad cuibheasach dendritic (n = 19 neurons smachd, n = 21 neurons TS; **P = 0.0041). d, geugan dendritic ath-thogte ann an 3D bhon smachd agus TS t-hCO aig 8 mìosan de eadar-dhealachadh, agus tomhas dùmhlachd droma dendritic (n = 16 neuron smachd, n = 21 neuron TS, ***P < 0.0001). d, geugan dendritic ath-thogte ann an 3D bhon smachd agus TS t-hCO aig 8 mìosan de eadar-dhealachadh, agus tomhas dùmhlachd droma dendritic (n = 16 neuron smachd, n = 21 neuron TS, ***P < 0.0001). d, 3D-rekонструкция дендритных ветвей agus контроля agus TS t-hCO через 8 месяцев дифференцировки и колия плотности дендритных шипов (n = 16 контрольных нейронов, n = 21 TS нейронов, *** P <0,0001). d, ath-chruthachadh 3D de gheugan dendritic bhon TS smachd agus t-hCO aig 8 mìosan de eadar-dhealachadh agus tomhas dùmhlachd droma dendritic (n=16 neuron smachd, n=21 neuron TS, ***P<0.0001). d, 分化8 个月时对照和TS t-hCO 的3D 重建树突分支,以及树突棘密度的量化（n = 16个对 照神经元， n = 21 个TS 神 经元, *** P < 0.0001）。 d ， 分化 8个 时 对照 和 ts t-hco 的 3d 重建 分支 分支 以及 树突棘 密度量弌 = 1元 ， n = 21 个 ts 神 经 ， *** p <0.0001）. d, 3D-rеконструкция дендритных ветвей контроля agus TS t-hCO 8 месяцев дифференцировки и коленкиче через дендритных шипов (n = 16 контрольных нейронов, n = 21 TS нейронов, *** P <0,0001). d, ath-chruthachadh 3D de gheugan dendritic smachd agus TS t-hCO aig 8 mìosan de eadar-dhealachadh agus tomhas dùmhlachd droma dendritic (n=16 neuron smachd, n=21 neuron TS, ***P<0.0001).Tha rionnagan dearga a’ comharrachadh droigheann dendritic a tha fo amharas. e, EPSCn gun spionnadh ann an neuronan smachd agus TS t-hCO às deidh 8 mìosan de eadar-dhealachadh. f, plota tricead cruinnichte agus tomhas tricead agus meud thachartasan synaptic (n = 32 neuron smachd, n = 26 neuron TS; **P = 0.0076 agus P = 0.8102). g, Mion-sgrùdadh Scholl air neuronan TS agus smachd ann an hCO agus t-hCO. Tha loidhnichean briste a’ sealltainn neuronan pioramaideach iar-bhreith L2/3 daonna airson coimeas (n = 24 neuronan smachd t-hCO, n = 21 neuronan TS t-hCO, n = 8 neuronan smachd hCO, agus n = 7 neuronan TS hCO). Tha dàta air a chur an cèill mar a’ chuibheasachd ± claonadh àbhaisteach.
Thug comas t-hCO feartan morf-eòlach is gnìomhach niùronan cortex daonna ath-riochdachadh aig ìre àrd oirnn sgrùdadh a dhèanamh air an gabhadh t-hCO a chleachdadh gus fenotypes galair a lorg. Chuir sinn fòcas air TS, eas-òrdugh neuro-leasachaidh dona air adhbhrachadh le mùthaidhean buannachd-gnìomh anns a’ ghine a tha a’ còdachadh CaV1.2, a thòisicheas tar-sgrìobhadh gine a tha an urra ri gnìomhachd ann an niùronan. Fhuair sinn hCO bho thrì euslaintich TS a bha a’ giùlan an ionadachadh as cumanta (p.G406R) agus trì smachdan (Figear 3a). Às deidh tar-chur, fhuair sinn a-mach gun robh morf-eòlas dendritic air atharrachadh ann an niùronan TS an taca ri smachdan (Figear 3b agus dàta leudaichte, Figear 8a,b), le àrdachadh dà-fhillte ann an àireamh nan dendrites bun-sgoile agus àrdachadh iomlan ann an cuibheasachd agus lùghdachadh iomlan ann am fad dendritic (Figear 3c agus dàta leudaichte, Figear 8c). Bha seo co-cheangailte ri dùmhlachd nas motha de dh’fhìneagan agus tricead nas motha de EPSCn spontaneous ann an TS an taca ri niùronan smachd (Figear 3d–f agus dàta leudaichte, Figear 8g). Nochd tuilleadh mion-sgrùdaidh pàtrain de gheuganachadh dendritic neo-àbhaisteach ann an t-hCO TS an taca ri smachdan, ach chan ann an in vitro TS hCO aig ìre eadar-dhealachaidh coltach ris (Figear 3g). Tha seo a’ co-chòrdadh ris na h-aithisgean a bh’ againn roimhe mu chrìonadh dendritic an urra ri gnìomhachd ann an TS agus a’ soilleireachadh comas an àrd-ùrlar tar-chuir seo gus fenotypes galair a lorg in vivo.
An uairsin dh’fhaighnich sinn gu dè an ìre gu bheil ceallan t-hCO air an amalachadh gu gnìomhach ann an radan S1. Bidh S1 ann an creimich a’ faighinn cuir-a-steach synaptic làidir bho na niuclasan thalamic basal ventral agus posterior ipsilateral, a bharrachd air na cortices somatosensory motair agus àrd-sgoile ipsilateral, agus contralateral S1 (Figear 4a). Gus am pàtran innervation ath-nuadhachadh, rinn sinn galar air hCO le bhìoras confaidh-dG-GFP / AAV-G agus chuir sinn hCO a-steach do radan S1 3 latha às deidh sin. Chunnaic sinn abairt GFP dùmhail ann an neurons an S1 ipsilateral agus ganglia basal ventral 7–14 latha às deidh tar-chur (Figear 4b, c). A bharrachd air an sin, nochd dathadh antibody den chomharra thalamic netrin G1 làthaireachd chrìochnaidhean thalamic ann an t-hCO (Figear 4d, e). Gus measadh a dhèanamh an gabhadh na ro-mheasaidhean afferent seo freagairtean synaptic adhbhrachadh ann an ceallan t-hCO, rinn sinn clàraidhean cealla slàn bho cheallan daonna ann an earrannan biorach den t-sreath thalamocortical. Brosnachadh dealain air S1 radain, capsal a-staigh, stuth geal, snàithleanan faisg air t-hCO no gnìomhachadh optogenetic de chrìochnachaidhean talamach a tha a’ cur an cèill opsin ann an EPSCan geàrr-latency air an adhbhrachadh le t-hCO ann an neuronan t-hCO a tha fosgailte don antagonist gabhadair AMPA NBQX. (Figear 4f, g agus dàta leudaichte, Figear 9a–g). Tha an dàta seo a’ sealltainn gu bheil t-hCO air a thoirt a-steach gu anatomically ann an eanchainn radain agus gu bheil e comasach dha a bhith air a ghnìomhachadh le clò aoigheachd radain.
a, Diagram sgemataig de dheuchainn tracadh confaidh. b, GFP agus abairt STEM121 sònraichte do dhaoine eadar t-hCO agus cortex cerebral radain (pannal àrd). Tha abairt GFP ann an niùclas basal ventral ipsilateral (VB) radain (ìosal air an taobh chlì) agus ipsilateral S1 (ìosal air an làimh dheis) cuideachd air a shealltainn. Bàr-sgèile, 50 µm. Tha na ceàrnagan dearga a’ riochdachadh nan raointean den eanchainn far an deach na h-ìomhaighean a thogail. c, tomhas cheallan a’ cur an cèill GFP (n = 4 radain). d, e — Crìochnachaidhean thalamic Netrin G1+ ann an t-hCO. Tha d a’ sealltainn earrann coronal anns a bheil niùclas t-hCO agus VB. Bàr-sgèile, 2 mm. Tha e a’ sealltainn abairt Netrin G1 agus STEM121 ann an neuronan t-hCO (clì) agus VB (deas). Bàr-sgèile, 50 µm. Tha an loidhne dhotagach orains a’ comharrachadh crìoch t-hCO. f, g, Lorgan gnàthach de niùronan t-hCO an dèidh brosnachadh dealain ann an radan S1 (f) no capsal a-staigh (g), le (purpaidh) no às aonais (dubh) NBQX (clì). Meudan EPSC le agus às aonais NBQX (n = 6 niùronan S1, *P = 0.0119; agus n = 6 niùronan capsal a-staigh, **P = 0.0022) (meadhan). Ceudad de niùronan t-hCO a’ sealltainn EPSC mar fhreagairt do bhrosnachadh dealain radan S1 (f) no capsal a-staigh (g) (deas). aCSF, lionn cerebrospinal fuadain. h, diagram sgemataig den deuchainn ìomhaighean 2P (clì). Abairteachadh GCaMP6s ann an t-hCO (meadhan). Bàr sgèile, 100 µm. Ùine fluorescence de GCaMP6s (deas). i, Sgòr-Z de fluorescence gnìomhachd gun spionnadh. j, dealbh sgemataig de bhrosnachadh mustache. k, slighean-fluaraiseachd 2P le sgòr-z ann an aon deuchainn, air an co-thaobhadh ri gluasad feusag aig àm neoni (loidhne briste) ann an ceallan eisimpleir. l, freagairtean sgòr-z cuibheasach sluaigh de na ceallan uile air an co-thaobhadh ri gluasad feusag aig àm neoni (loidhne briste) (dearg) no stampaichean-ama air an gineadh air thuaiream (liath). m. Diagram sgemataigeach den deuchainn air comharrachadh optigeach. n, Lùban bholtaids amh bho chealla t-hCO eisimpleir rè brosnachadh laser gorm no gluasad feusag. Tha saighdean dearga a’ comharrachadh a’ chiad spìcean air adhbhrachadh le solas (gu h-àrd) no air adhbhrachadh le gluasad feusag (bonn). Tha sgàileadh liath a’ comharrachadh amannan de ghluasad feusag. o, Tonn-chruthan solais as àirde agus freagairtean gluasad feusag. p, spìcean oidhirp shingilte, air an co-thaobhadh ri gluasad nan feusag ann an ceallan an eisimpleir. Tha 0 a’ comharrachadh gluasad feusag (loidhne briste). q, ìre losgaidh sgòr-z cuibheasach sluaigh airson a h-uile cealla mothachail air solas, air an co-thaobhadh ri gluasad feusag aig àm neoni (loidhne briste) (dearg) no stampaichean-ama air an gineadh air thuaiream (liath). r, Co-roinn de dh'aonadan mothachail air solas air am modachadh gu mòr le claonadh feusag (n = 3 radain) (clì). An latency as àirde aig sgòr-z (n = 3 radain; n = 5 (uaine aotrom), n = 4 (uaine dorcha), agus n = 4 (goran) aonadan modachaidh gluasad feusag gach radain) (deas). Tha dàta air a chur an cèill mar chuibheasachd ± claonadh àbhaisteach
Dh’fhaighnich sinn an uairsin an gabhadh t-hCO a ghnìomhachadh le brosnachaidhean mothachaidh in vivo. Chuir sinn hCO a’ cur an cèill na comharran calcium a chaidh a chòdachadh gu ginteil GCaMP6 ann an radain S1. Às dèidh 150 latha, rinn sinn fotometry snàithleach no ìomhaighean calcium dà-photon (Figear 4h agus dàta leudaichte, Figear 10a). Fhuair sinn a-mach gu robh ceallan t-hCO a’ taisbeanadh gnìomhachd ruitheamach sioncronaichte (Figear 4i, Dàta Leudaichte, Figear 10b agus Bhidio a bharrachd 1). Gus gnìomhachd as àirde t-hCO a chomharrachadh, rinn sinn clàraidhean electro-fhiseòlasach taobh a-muigh na cealla ann an radain tar-chuir fo anesthetis (dàta leudaichte, Figear 10c-f). Tha sinn air co-chomharran stereotaxic a chruthachadh bho ìomhaighean MRI; mar sin, tha na h-aonadan clàraichte seo a’ riochdachadh neurons daonna a tha fo amharas, ged nach eil electro-fhiseòlas leis fhèin a’ leigeil le gnè tùsail a bhith air a dhearbhadh. Chunnaic sinn spreadhaidhean sioncronaichte de ghnìomhachd (dàta leudaichte, Figear 10d). Mhair na spreadhaidhean mu 460 ms agus bha amannan sàmhchair mu 2 diog eatorra (dàta leudaichte, Figear 10d, e). Loisg aonadan fa leth cuibheasachd de mu thrì cuairtean gach spreadhadh, agus tha sin timcheall air 73% de na h-aonadan clàraichte gach spreadhadh. Bha gnìomhachd nan aonadan fa leth gu math co-cheangailte, agus bha na co-dhàimhean sin nas àirde na gnìomhachd aonadan a chaidh an comharrachadh ann am beathaichean gun bhanachdach a chaidh a chlàradh fo na h-aon chumhachan (dàta leudaichte, Figear 10f). Gus tuilleadh chomharrachaidh a dhèanamh air freagairtean biorach neurons a chaidh an comharrachadh a thàinig bho dhaoine, rinn sinn deuchainnean tagaidh solais air radain fo anesthetis air an do thar-phlanntaich hCO3 a’ cur an cèill an t-sianal cation mothachail air solas rhodopsin 2 (hChR2), tro am bi neurons t-hCO3 ag aithneachadh latency goirid (nas lugha na 10 ms) mar fhreagairt do bhrosnachaidhean solais ghorm (Figear 4m–o). Sheall niùronan t-hCO spreadhaidhean de ghnìomhachd spontanach aig triceadan coltach ris an fheadhainn a chithear ann an ìomhaighean calcium, a bharrachd air clàraidhean electro-fhiseòlasach a chaidh a dhèanamh ann an t-hCO às aonais comharrachadh solais (dàta leudaichte, Figear 10c-g). Cha deach gnìomhachd spontanach sam bith fhaicinn anns na h-ìrean co-fhreagarrach de hCO a chaidh a chlàradh in vitro. Gus measadh a dhèanamh an gabhadh t-hCO a ghnìomhachadh le brosnachaidhean mothachaidh, thionndaidh sinn feusagan an radain air falbh bho t-hCO airson ùine ghoirid (Figear 4j,m agus dàta leudaichte, Figear 10h,k). A rèir sgrùdaidhean roimhe8,10, sheall fo-sheata de cheallan t-hCO barrachd gnìomhachd mar fhreagairt do thionndadh feusag, nach deach fhaicinn nuair a chaidh an dàta a choimeas ri stampaichean ùine air thuaiream (Figear 4k–q agus dàta leudaichte, Figear 10h–q). Gu dearbh, sheall timcheall air 54% de na h-aonadan singilte le bileagan opto-leubail ìre dùsgadh gu math nas àirde às deidh brosnachadh feusag, a’ ruighinn ìre as àirde aig timcheall air 650 ms (Figear 4r). Còmhla, tha an dàta seo a’ moladh gu bheil t-hCO a’ faighinn cuir-a-steach gnìomh iomchaidh agus gum faodar a ghnìomhachadh le brosnachaidhean àrainneachdail.
An uairsin rinn sinn sgrùdadh an gabhadh le t-hCO cuairtean a ghnìomhachadh ann an radain gus smachd a chumail air giùlan. An toiseach rinn sinn sgrùdadh an robh axons neurons t-hCO a’ dol a-steach do na figheagan mun cuairt air an radain. Rinn sinn galar air hCO le lentivirus a’ còdachadh hChR2 ceangailte ri EYFP (hChR2-EYFP). Às dèidh 110 latha, chunnaic sinn abairt EYFP ann an roinnean cortical ipsilateral, a’ gabhail a-steach na cortices claisneachd, motair, agus somatosensory, a bharrachd air ann an roinnean fo-cortical, a’ gabhail a-steach an striatum, hippocampus, agus thalamus (Figear 5a). Gus measadh a dhèanamh an gabhadh na ro-mheasaidhean efferent seo freagairtean synaptic adhbhrachadh ann an ceallan radain, ghnìomhaich sinn gu optigeach ceallan t-hCO a’ cur an cèill hChR2-EYFP le bhith a’ clàradh cheallan cortex cerebral radain ann an earrannan biorach den eanchainn. Gnìomhachadh axons t-hCO le EPSCan goirid-latency air an adhbhrachadh le solas gorm ann an neurons cortex pioramaideach radain, a chaidh a bhacadh le NBQX (Figearan 5b–g). A bharrachd air sin, dh’ fhaodadh na freagairtean sin a bhith air am bacadh le tetrodotoxin (TTX) agus air an ath-nuadhachadh le 4-aminopyridine (4-AP), a’ moladh gun robh iad air adhbhrachadh le ceanglaichean monosynaptic (Figear 5e).
a, Diagram sgemataigeach de leantainn axon (clì). abairt t-hCO3 EYFP (deas). Bàr-sgèile, 100 µm. A1, cortex claisneachd, ACC, cortex cingulate anterior, d. striatum, striatum dorsal, HPC, hippocampus; Diaphragm, septum lateral, mPFC, cortex prefrontal medial, piri, cortex piriform, v. striatum, striatum ventral, VPM, niùclas ventropostomedial an thalamus, VTA, roinn tegmental ventral. Tha na ceàrnagan dearga a’ riochdachadh nan raointean den eanchainn far an deach na h-ìomhaighean a thogail. b, Diagram sgemataigeach den deuchainn brosnachaidh. c, d, Eisimpleirean de fhreagairt photocurrent air adhbhrachadh le solas gorm (gu h-àrd) agus bholtaids (gu h-ìosal) ann an ceallan EYFP+ t-hCO3 daonna (c) no radain (d) EYFP-. e, f, Lorgan gnàthach de niùronan radain an dèidh brosnachadh solas gorm de axons t-hCO le TTX agus 4-AR (uaine), TTX (liath) no aCSF (dubh) (e), le (violet) no às aonais (dubh)) ) NBQX (e). g, dàil fhreagairtean air an adhbhrachadh le solas gorm ann an ceallan radain (n = 16 ceallan); tha bàraichean còmhnard a’ comharrachadh dàil chuibheasach (7.13 ms) (clì). Meud nan EPSCan air an adhbhrachadh le solas a chaidh a chlàradh le no às aonais NBQX (n = 7 ceallan; ***P < 0.0001) (meadhan). Meud nan EPSCan air an adhbhrachadh le solas a chaidh a chlàradh le no às aonais NBQX (n = 7 ceallan; ***P < 0.0001) (meadhan). Амплитуда вызванных светом EPSC, зарегистрированных с или без NBQX (n = 7 клеток; ***P <0,0001) (ев цент). Meudachd EPSCan air an adhbhrachadh le solas a chaidh a chlàradh le no às aonais NBQX (n = 7 ceallan; ***P < 0.0001) (meadhan).使用或不使用NBQX 记录的光诱发EPSC 的振幅（n = 7个细胞；**P <0.0001）（中）使用或不使用NBQX 记录的光诱发EPSC 的振幅（n = 7个细胞；**P <0.0001）（中） Амплитуда вызванных светом EPSC, зарегистрированных с или без NBQX (n = 7 клеток; ***P <0,0001) (ев цент). Meudachd EPSCan air an adhbhrachadh le solas a chaidh a chlàradh le no às aonais NBQX (n = 7 ceallan; ***P < 0.0001) (meadhan).Ceudad de cheallan radain a’ sealltainn EPSCan a fhreagras ri solas gorm (deas). h, Diagram sgemataigeach de ghnìomh giùlain. d0, latha 0. i. Coileanadh bheathaichean eisimpleireach air latha 1 (clì) no latha 15 (deas) de thrèanadh. An àireamh chuibheasach de lìcean a chaidh a dhèanamh air latha 1 (clì) no latha 15 (meadhan deas) (n = 150 deuchainnean solais ghorm, n = 150 deuchainnean solais dhearg; ***P < 0.0001). An àireamh chuibheasach de lìcean a chaidh a dhèanamh air latha 1 (clì) no latha 15 (meadhan deas) (n = 150 deuchainnean solais ghorm, n = 150 deuchainnean solais dhearg; ***P < 0.0001). Среднее количество облизываний, выполненных в день 1 (слева) или день 15 (v центре справа) (n = 15 синисиха) светом, n = 150 испытаний с красным светом ***P <0,0001). Àireamh chuibheasach de lìcean a chaidh a dhèanamh air latha 1 (clì) no latha 15 (meadhan deas) (n = 150 deuchainnean solais ghorm, n = 150 deuchainnean solais dhearg; ***P < 0.0001).第1 天（左）或第15 天（右中）执行的平均舔次数（n = 150 次蓝光试验， n = 150次红光试验；**P <0.0001）.第1 天（左）或第15 天（右中）执行的平均舔次数（n = 150 次蓝光试验， n = 150次红光试验；**P < 0.001 Среднее количество облизываний, выполненных в день 1 (слева) или день 15 (v центре справа) (n = 15 синисиха) светом, n = 150 испытаний с красным светом ***P <0,0001). Àireamh chuibheasach de lìcean a chaidh a dhèanamh air latha 1 (clì) no latha 15 (meadhan deas) (n = 150 deuchainnean solais ghorm, n = 150 deuchainnean solais dhearg; ***P < 0.0001).Lìcean cruinnichte airson deuchainnean solais dhearg is ghorm air latha 1 (meadhan clì) no latha 15 (deas). NS, gun a bhith cudromach. j,k, Feartan giùlain nan uile bheathaichean air an tar-chur le t-hCO a’ cur an cèill hChR2-EYFP (j) no fluorophore smachd (k) air latha 1 no 15 (hChR2-EYFP: n = 9 radain, ** P = 0.0049; smachd: n = 9, P = 0.1497). l, Mean-fhàs sgòr roghainn (n = 9 hChR2, n = 9 smachd; **P < 0.001, ***P < 0.0001). l, Mean-fhàs sgòr roghainn (n = 9 hChR2, n = 9 smachd; **P < 0.001, ***P < 0.0001). l, Эволюция показателя предпочтения (n = 9 hChR2, n = 9 контрольных; **P <0,001, ***P <0,0001). l, Mean-fhàs sgòr roghainn (n = 9 hChR2, n = 9 smachdan; **P < 0.001, ***P < 0.0001). l，偏好评分的演变（n = 9 hChR2， n = 9 对 照；**P <0.001，**P <0.0001）。 l，偏好评分的演变（n = 9 hChR2， n = 9 对 照；**P <0.001，**P <0.0001）。 l, Эволюция показателей предпочтения (n = 9 hChR2, n = 9 контролей; **P <0,001, ***P <0,0001). l, Mean-fhàs sgòran roghainn (n = 9 hChR2, n = 9 smachdan; **P < 0.001, ***P < 0.0001).m, abairt FOS mar fhreagairt do ghnìomhachadh optogenetach t-hCO ann an S1. Tha ìomhaighean de abairt FOS (clì), agus tomhas (n = 3 gach buidheann; *P < 0.05, **P < 0.01 agus ***P < 0.001) (deas) air an sealltainn. Tha ìomhaighean de abairt FOS (clì), agus tomhas (n = 3 gach buidheann; *P < 0.05, **P < 0.01 agus ***P < 0.001) (deas) air an sealltainn. Показаны изображения экспрессии FOS (слева) agus количественного определения (n = 3 ag ràdh; * P <0,0,0) < 0,0,0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0. (còmhla). Tha ìomhaighean de abairt FOS (clì) agus tomhas (n = 3 gach buidheann; *P<0.05, **P<0.01, agus ***P<0.001) air an sealltainn (deas).显 示 了FOS 表达（左）和量化 (每组n = 3；*P <0.05、**P <0.01 和**P <0.001））右倁）显 示 了FOS 表达（左）和量化 (每组n = 3；*P <0.05、**P <0.01 和**P <0.001））右倁） Показаны изображения экспрессии FOS (слева) agus количественного определения (n = 3 ag ràdh; * P <0,0,0) < 0,0,0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0. (còmhla). Tha ìomhaighean de abairt FOS (clì) agus tomhas (n = 3 gach buidheann; *P<0.05, **P<0.01, agus ***P<0.001) air an sealltainn (deas).Bàr-sgèile, 100 µm. Tha dàta air a chur an cèill mar chuibheasachd ± mearachd àbhaisteach de BLA, tonsil basolateral, MDT, niùclas thalamic dorsomedial, PAG, liath periaqueductal.
Mu dheireadh, dh’fhaighnich sinn an gabhadh le t-hCO giùlan radain atharrachadh. Gus seo a dhearbhadh, chuir sinn hCO a’ cur an cèill hChR2-EYFP ann an S1, agus 90 latha às deidh sin, chuir sinn snàithleanan optaigeach ann an t-hCO airson lìbhrigeadh solais. An uairsin thrèan sinn na radain le paradigm suidheachaidh obrachaidh atharraichte (Figear 5h). Chuir sinn na beathaichean ann an seòmar deuchainn giùlain agus chuir sinn brosnachaidhean laser gorm (473 nm) agus dearg (635 nm) 5 diogan air thuaiream. Fhuair beathaichean duais uisge ma bha iad a’ reamhrachadh rè brosnachadh solais ghorm ach mura do reamhrachadh rè brosnachadh solais dhearg. Air a’ chiad latha den trèanadh, cha do sheall na beathaichean eadar-dhealachadh sam bith ann an reamhrachadh nuair a chaidh an brosnachadh le solas gorm no dearg. Ach, air latha 15, sheall beathaichean air an deach tar-chur le hCO a’ cur an cèill hChR2-EYFP reamhrachadh nas gnìomhaiche nuair a chaidh an brosnachadh le solas gorm an taca ri brosnachadh solais dhearg. Cha deach na h-atharrachaidhean seo ann an giùlan reamhar fhaicinn ann am beathaichean smachd air an deach hCO a thar-chur a’ cur an cèill am fluorophore smachd (ìre soirbheachais ionnsachaidh: hChR2 89%, EYFP 0%, Figear 5i-1 agus Bhidio a bharrachd 2). Tha an dàta seo a’ moladh gum faod ceallan t-hCO neurons radain a ghnìomhachadh gus giùlan a tha a’ sireadh dhuaisean a bhrosnachadh. Gus faighinn a-mach dè na cuairtean neural t-hCO radain a dh’ fhaodadh a bhith an sàs anns na h-atharrachaidhean giùlain seo, chuir sinn t-hCO an gnìomh gu optogenetach ann am beathaichean air an trèanadh agus bhuain sinn clò 90 mionaid às deidh sin. Nochd immunohistochemistry abairt a’ phròtain FOS a tha an urra ri gnìomhachd ann an grunn roinnean eanchainn a tha an sàs ann an giùlan brosnachail, a’ gabhail a-steach an cortex prefrontal medial, thalamus medial, agus cùis liath periaqueductal, a chaidh a chur an cèill an dàrna cuid ann am beathaichean smachd gun bhrosnachadh no ann am beathaichean. rus. 5m). Còmhla, tha an dàta seo a’ moladh gum faod t-hCO gnìomhachd neuronal radain atharrachadh gus giùlan a stiùireadh.
Tha organoidean neoni a’ riochdachadh siostam gealltanach airson leasachadh is galairean daonna a sgrùdadh in vitro, ach tha iad air an cuingealachadh leis an dìth cheanglaichean eadar na cuairtean a tha ann in vivo. Tha sinn air àrd-ùrlar ùr a leasachadh anns an do thar-phland sinn hCO a-steach do S1 radain tràth iar-bhreith le siostam dìon lag gus leasachadh is gnìomhachd cheallan daonna a sgrùdadh in vivo. Tha sinn air sealltainn gu bheil t-hCO a’ leasachadh seòrsachan cealla aibidh nach fhaicear in vitro28 agus gu bheil t-hCO air a thoirt a-steach gu anatomically agus gu gnìomhach ann an eanchainn creimich. Leig amalachadh t-hCO ann an cuairtean neoni creimich leinn ceangal a stèidheachadh eadar gnìomhachd cealla daonna agus giùlan bheathaichean a chaidh a sgrùdadh, a’ sealltainn gum faod neuronan t-hCO gnìomhachd neuronal radain atharrachadh gus freagairtean giùlain a bhrosnachadh.
Tha grunn bhuannachdan aig an àrd-ùrlar a tha sinn a’ toirt cunntas air thairis air rannsachadh a rinneadh roimhe air tar-chur cheallan daonna gu eanchainn chreimich. An toiseach, chuir sinn hCO3 a-steach don cortex a bha a’ leasachadh ann an radain tràth às dèidh breith, agus dh’ fhaodadh seo amalachadh anatomical agus gnìomhach a dhèanamh nas fhasa. San dàrna àite, leig sgrùdadh MRI t-hCO3 leinn suidheachadh agus fàs graft a sgrùdadh ann am beathaichean beò, a’ leigeil leinn sgrùdaidhean fad-ùine air iomadh beathach a dhèanamh agus earbsachd grunn loidhnichean cealla hiPS a stèidheachadh. Mu dheireadh, chuir sinn organoidean slàn a-steach, seach crochaidhean cealla singilte iomallach, a tha nas lugha millteach do cheallan daonna agus a dh’ fhaodadh amalachadh agus gineadh neuronan cortex daonna ann an eanchainn radain adhartachadh.
Tha sinn ag aideachadh, a dh’aindeoin adhartasan san àrd-ùrlar seo, gu bheil cuingealachaidhean ùine, fànais agus thar-ghnèithean a’ cur casg air cruthachadh chuairtean neòil daonna le dìlseachd àrd, eadhon às deidh tar-chur aig ìre thràth de leasachadh. Mar eisimpleir, chan eil e soilleir a bheil an gnìomhachd spontaneous a chithear ann an t-hCO a’ riochdachadh phenotype leasachaidh coltach ris a’ ghnìomhachd ruitheamach a chithear rè leasachadh cortical, no a bheil e mar thoradh air dìth sheòrsaichean cealla casgach a tha an làthair ann an t-hCO. San aon dòigh, chan eil e soilleir gu dè an ìre gu bheil dìth lamination ann an t-hCO a’ toirt buaidh air ceangal slabhraidh30. Bidh obair san àm ri teachd ag amas air seòrsachan cealla eile a thoirt còmhla leithid microglia daonna, ceallan endothelial daonna, agus diofar chuibhreannan de interneurons GABAergic mar a chithear a’ cleachdadh assembly 6 in vitro, a bharrachd air a bhith a’ tuigsinn mar a dh’ fhaodas amalachadh agus giullachd neòil tachairt ann an t-hCO atharraichte. ìrean tar-sgrìobhaidh, synaptic agus giùlain ann an ceallan a fhuaireadh bho euslaintich.
Gu h-iomlan, tha an àrd-ùrlar in vivo seo a’ riochdachadh goireas cumhachdach a dh’ fhaodas leasachadh eanchainn daonna in vitro agus rannsachadh ghalaran a neartachadh. Tha sinn an dùil gun leig an t-àrd-ùrlar seo leinn fenotypes ùra aig ìre snàthainn a lorg ann an ceallan a thig bho euslaintich a bhiodh duilich a lorg air dhòigh eile agus ro-innleachdan leigheasach ùra fheuchainn.
Chruthaich sinn hCO2.5 bho cheallan HiPS mar a chaidh a mhìneachadh roimhe. Gus cinneasachadh hCO a thòiseachadh bho cheallan hiPS a chaidh a chultarachadh air sreathan beathachaidh, chaidh coloinidhean slàn de cheallan hiPS a thoirt a-mach à soithichean cultar a’ cleachdadh dispase (0.35 mg/mL) agus an gluasad gu cultaran plastaig le ceangal glè ìosal anns an robh soithichean le meadhan cultar cealla hiPS. (Corning) air an cur ri dà bhacadh SMAD dorsomorphine (5 μM; P5499, Sigma-Aldrich) agus SB-431542 (10 μM; 1614, Tocris) agus bacadair ROCK Y-27632 (10 μM; S1049, Selleckchem). Rè a’ chiad 5 latha, chaidh meadhan cealla hiPS atharrachadh gach latha agus chaidh dorsomorphine agus SB-431542 a chur ris. Air an t-siathamh latha ann an crochadh, chaidh na spheroids neoni a ghluasad gu meadhan neoni anns an robh neurobasal-A (10888, Life Technologies), stuth-leasachaidh B-27 às aonais bhiotamain A (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies), penicillin agus streptomycin (1:100, Life Technologies) agus air an cur ris leis an fhactar fàis epidermal (EGF; 20 ng ml−1; R&D Systems) agus factar fàis fibroblast 2 (FGF2; 20 ng ml−1; R&D Systems) gus an 24mh latha. Bho latha 25 gu latha 42, chaidh am meadhan a chur ris le factar neurotrophic a thàinig bhon eanchainn (BDNF; 20 ng ml−1, Peprotech) agus neurotrophin 3 (NT3; 20 ng ml−1; Peprotech) le atharrachaidhean meadhan a h-uile dàrna latha. Air an t-siathamh latha ann an crochadh, chaidh na spheroids neoni a ghluasad gu meadhan neoni anns an robh neurobasal-A (10888, Life Technologies), stuth-leasachaidh B-27 às aonais bhiotamain A (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies), penicillin agus streptomycin (1:100, Life Technologies) agus air an cur ris leis an fhactar fàis epidermal (EGF; 20 ng ml−1; R&D Systems) agus factar fàis fibroblast 2 (FGF2; 20 ng ml−1; R&D Systems) gus an 24mh latha. Bho latha 25 gu latha 42, chaidh am meadhan a chur ris le factar neurotrophic a thàinig bhon eanchainn (BDNF; 20 ng ml−1, Peprotech) agus neurotrophin 3 (NT3; 20 ng ml−1; Peprotech) le atharrachaidhean meadhan a h-uile dàrna latha.Air an t-siathamh latha san crochadh, chaidh na spèroidan neoni a ghluasad gu meadhan neoni anns an robh Neurobasal-A (10888, Life Technologies), stuth-leasachaidh B-27 gun bhiotamain A (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies), penicillin.и стрептомицин (1:100, Teicneòlasan Beatha) agus дополнены эпидермальным фактором роста (EGF; 20 нг/мл; R&D Systems) agus факторомифлам2 20 нг/мл; R&D Systems) до 24-го дня. agus streptomycin (1:100, Life Technologies) agus air a chur ris le factar fàis epidermal (EGF; 20 ng/ml; R&D Systems) agus factar fàis fibroblast 2 (FGF2; 20 ng/ml; R&D Systems) gus an 24mh latha.Bho làithean 25 gu 42, chaidh factar neurotrophic a thàinig bhon eanchainn (BDNF; 20 ng ml-1, Peprotech) agus neurotrophin 3 (NT3; 20 ng ml-1, Peprotech) a chur ris a’ mheadhan, ag atharrachadh a’ mheadhain a h-uile dàrna latha.在悬 浮 的第6 天，将神经球体转移 到含有neurobasal-A（10888, Life Technologies）、不含 维 生素A 的B-2补 充 剂 (12587, Life Technologies), GlutaMax (1: 100), Life Technologies）, 青霉素的神经培养基中和链霉素0, Beatha 1: Teicneòlasan）并辅以表皮 生长因子（EGF；20 ng ml-1 Siostaman）和成纤维细胞生长因子2（FGF2；20 ng ml-1；R&D Systems）直至第24 天。在 悬浮 的 第 第 6 天 将 神经 球体 转移 含有含有 neurobasal-a (10888), Life Technologies） 不 素 焔 含 有 含有 含有含有 neurobasal-a (10888), Life Technologies ） 不 素 素 焖补 充 剂 (12587 ， Teicneòlasan Beatha) Glutamax (1: 100), Life TechNOGIS 青霉素 的 神经 培 养 基 中 链霉素 1: 100 , Life TechNOGIS 青霉素 的 神经 培养 基中 链霉素 1: 0ＨＨ） a-mach 因子 (（（20 ng ml-1 ； r&d Systems） 成 纤维 细胞 生长 2 fgf2 ； 20 ng ml- 1；R&D SystemsＤ 盬嬀 盬 盬 ・ Airson 6-й день суспензии нейросферы были переведены na добавку, содержащую нейробазал-А (10888, Life-Technology), agus Lifetech. без витамина А (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies), пенициллин- нейтрализованный стрептомицин (1:100, Life Technologies) слендома эпидермального фактора роста (EGF; 20 нг мл-1; R&D Systems) agus фактора роста фибробластов 2 (FGF2; 20 нг ml-1) 1; Air latha 6, chaidh crochaidhean neurosphere atharrachadh gu stuth-leasachaidh anns an robh neurobasal-A (10888, Life Technologies), stuth-leasachaidh B-27 às aonais bhiotamain A (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies), streptomycin air a neodachadh le penicillin (1:100, Life Technologies) le factar fàis epidermal (EGF; 20 ng ml-1; R&D Systems) agus factar fàis fibroblast 2 (FGF2; 20 ng ml-1) 1 a bharrachd; R&D Systems) airson 24-gu-latha. Siostaman R&D) gus an 24mh latha.Bho làithean 25 gu 42, chaidh factar neurotrophic a thàinig bhon eanchainn (BDNF; 20 ng ml-1, Peprotech) agus factar neurotrophic 3 (NT3; 20 ng ml-1, Peprotech) a chur ris a’ mheadhan cultarach a h-uile dàrna latha. Atharraich am meadhan aon uair.Bho latha 43, chaidh hCO a chumail ann am meadhan neurobasal-A gun stuth-cuideachaidh (NM; 1088022, Thermo Fisher) le atharrachadh meadhan gach 4–6 latha. Gus hCO fhaighinn bho cheallan hiPS a chaidh a chultarachadh fo chumhachan gun bhiadhadh, chaidh ceallan hiPS a ghoir le Accutase (AT-104, Innovate Cell Technologies) aig 37°C airson 7 mionaidean, an sgaradh ann an ceallan singilte, agus an cur air pleitean AggreWell 800 (34815, STEMCELL Technologies) aig dùmhlachd de 3 × 106 cealla singilte gach tobar ann am meadhan Essential 8 le inhibitor ROCK Y-27632 (10 μM; S1049, Selleckchem) air a chur ris. Às dèidh 24 uairean, chaidh na meadhanan anns na tobraichean a phìobaireachd suas is sìos a-steach do mheadhanan anns an robh meadhanan Essential 6 (A1516401, Life Technologies) le dorsomorphine (2.5 μM; P5499, Sigma-Aldrich) agus SB-431542 (10 μM; 1614) air an cur ris. , Tocrida). Bho làithean 2 gu 6, chaidh meadhan Essential 6 a chur an àite dorsomorphine agus an stuth-cuideachaidh SB-431542 gach latha. Bho an t-siathamh latha, chaidh na crochaidhean neurosphere a ghluasad chun mheadhan neurobasal agus an cumail suas mar a chaidh a mhìneachadh gu h-àrd.
Chaidh a h-uile modh-obrach ainmhidhean a dhèanamh a rèir nan stiùiridhean cùram bheathaichean a chaidh aontachadh le Comataidh Rianachd Cùram Ainmhidhean Obair-lann Oilthigh Stanford (APLAC). Chaidh radain euthymic RNU (rnu/+) a bha trom a cheannach (Charles River Laboratories) no an cur ann an taigh. Chaidh na beathaichean a chumail air cearcall solais-dorchadas 12-uair le biadh is uisge ad libitum. Chaidh cuileanan radain rùisgte (FOXN1–/–) eadar trì is seachd latha a dh'aois a chomharrachadh le fàs feusagan neo-aibidh mus deach an cur às. Chaidh cuileanan (fireann is boireann) a thoirt a-steach do anesthetis le 2-3% isoflurane agus an cur air frèam stereotaxic. Chaidh trepanation a dhèanamh air a’ chlaigeann le trast-thomhas de mu 2-3 mm os cionn S1 fhad ‘s a bha ionracas an dura mater air a chumail suas. An uairsin cleachd snàthad 30-G (mu 0.3 mm) dìreach taobh a-muigh a’ chraniotomy gus an dura a tholladh. An uairsin cuir HCO3 air parafilm tana 3 × 3 cm agus thoir air falbh cus meadhan. A’ cleachdadh steallaire Hamilton ceangailte ri snàthad 23 G, 45°, tarraing hCO gu socair a-steach don cheann as fhaide air falbh den t-snàthad. An uairsin cuir an steallaire air pumpa an steallaire a tha ceangailte ris an inneal stereotaxic. An uairsin cuir bàrr na snàthaid thairis air toll puncture 0.3 mm de leud a chaidh a dhèanamh roimhe anns an dura (z = 0 mm) agus caolaich an steallaire 1–2 mm (z = timcheall air –1.5 mm) gus am bi an t-snàthad eadar an dura mater A. tha ròn dùmhail air a chruthachadh. An uairsin tog an steallaire gu meadhan uachdar a’ chortaig aig z = -0.5 mm agus stealladh hCO aig ìre 1-2 µl gach mionaid. Às deidh crìoch a chur air an stealladh hCO, thèid an t-snàthad a tharraing air ais aig ìre 0.2-0.5 mm gach mionaid, thèid an craiceann a fhuaigheal, agus thèid an cuilean a chuir sa bhad air pada teasachaidh blàth gus an tèid e seachad gu tur. Chaidh cuid de bheathaichean a thar-phlandadh gu dà-thaobhach.
Chaidh a h-uile modh-obrach ainmhidhean a dhèanamh a rèir stiùiridhean cùram ainmhidhean ceadaichte le APLAC Oilthigh Stanford. Chaidh radain (nas motha na 60 latha às deidh tar-chur) a bhrosnachadh le anesthesia 5% isoflurane agus anesthesia le 1-3% isoflurane rè na h-ìomhaighean. Airson lèirsinn, chaidh sganair toll-toll còmhnard le dìon gnìomhach 7 Tesla Bruker (Bruker Corp.) le draibhear caisead Companaidh Dealain Eadar-nàiseanta (IECO), cuir a-steach caisead le dìon le trast-thomhas a-staigh de 120 mm (600 mT/m, 1000 T/m/s) a chleachdadh a’ cleachdadh AVANCE. III, comasan RF ioma-choilich ochd-sianal agus ioma-cridhe, agus an àrd-ùrlar Paravision 6.0.1 a tha na chois. Chaidh clàradh a dhèanamh a’ cleachdadh coil RF toirteil neo-cheangailte gu gnìomhach le trast-thomhas a-staigh de 86 mm agus coil RF ceithir-sianal le fuarachadh crio airson faighinn a-mhàin. Turbo-RARE 2D aiseach (ùine ath-aithris = 2500 ms, ùine mac-talla = 33 ms, 2 chuibheasachd) le 16 glacadh slisne, tiugh slisne 0.6–0.8 mm, anns a bheil 256 × 256 sampall. Chaidh na comharran fhaighinn le bhith a’ cleachdadh coil RF toirt-mheudach transceiver ceàrnagach le trast-thomhas a-staigh de 2 cm (Rapid MR International, LLC). Mu dheireadh, cleachd na gnìomhan tuairmse uachdar Imaris (BitPlane) a tha air an togail a-steach airson tairgse 3D agus mion-sgrùdadh toirte. Chaidh tar-chur soirbheachail a mhìneachadh mar fhear anns an deach raointean de chomharra MRI leantainneach le cuideam T2 a chruthachadh anns an leth-chruinne tar-chuirte. Chaidh diùltadh graft a mhìneachadh mar ghraft nach do rinn raointean de chomharra MRI leantainneach le cuideam T2 anns an leth-chruinne tar-chuirte. Chaidh t-hCO fo-chortical a dhùnadh a-mach às an anailis às dèidh sin.
Gus GCaMP6s a chur an cèill gu seasmhach ann an hCO3 airson ìomhaighean calcium dà-photon, chaidh ceallan hiPS a ghalarachadh le pLV[Exp]-EF1a::GcaMP6s-WPRE-Puro agus an uairsin chaidh antibiotics a thaghadh. Goirid, chaidh ceallan a sgaradh le EDTA agus an crochadh ann an 1 ml de mheadhan Essential 8 aig dùmhlachd de mu 300,000 cealla an làthair polybrene (5 μg/ml) agus 15 μl de bhìoras. An uairsin chaidh na ceallan a ghoir ann am crochadh airson 60 mionaid agus an cur aig dùmhlachd de 50,000 cealla gach tobar. Às deidh co-chruinneachadh, chaidh ceallan a làimhseachadh le 5-10 μg ml-1 puromycin airson 5-10 latha no gus an do nochd coloinidhean seasmhach. Chaidh galar hCO3 géar a dhèanamh mar a chaidh a mhìneachadh roimhe5 le beagan atharrachaidhean. Goirid, gluais latha 30-45 hCO3 gu tiùban microcentrifuge Eppendorf 1.5 ml anns a bheil 100 µl de mheadhan nearbhach. An uairsin thèid timcheall air 90 µl den mheadhan a thoirt air falbh, thèid 3-6 µl de lentivirus àrd-titear (bho 0.5 x 108 gu 1.2 x 109) a chur ris an tiùb, agus thèid an hCO3 a ghluasad chun an goireadair airson 30 mionaid. An uairsin cuir 90–100 µl de mheadhan ri gach tiùb agus till na tiùban chun an goireadair thar oidhche. An ath latha, gluais hCO3 gu meadhan neoni ùr ann am pleitean ceangail ìosal. Às deidh 7 latha, chaidh hCO3 a ghluasad gu pleitean bonn glainne 24-tobar airson lèirsinn agus measadh càileachd gabhaltachd. Chaidh pLV[Exp]-SYN1::EYFP-WPRE agus pLV[Exp]-SYN1::hChR2-EYFP-WPRE a chruthachadh le VectorBuilder. Tha lentivirus air a chleachdadh anns a’ mhòr-chuid de dheuchainnean leis gu bheil e air a thoirt a-steach do ghineam an aoigh, a’ leigeil le abairt gine aithris ann an loidhnichean cealla gabhaltach. Airson sgrùdadh leanmhainn air confaidh, chaidh hCO a cho-ghalair le confaidh-ΔG-eGFP agus AAV-DJ-EF1a-CVS-G-WPRE-pGHpA (plasmid #67528, Addgene) air latha 30-45, a nighe gu mionaideach airson 3 latha, agus a thar-phlandadh a-steach do radain ann an S1 agus a chumail in vivo airson 7-14 latha.
Airson immunocytochemistry, chaidh beathaichean a thoirt fo anesthetis agus chaidh PBS a thoirt a-steach don chraiceann le uisge agus an uair sin 4% paraformaldehyde (PFA ann am PBS; Electron Microscopy Sciences). Chaidh eanchainn a shuidheachadh ann an 4% PFA airson 2 uair a thìde no thar oidhche aig 4°C, air an reothadh ann an 30% siùcros ann am PBS airson 48-72 uair a thìde, agus air an cur a-steach ann an 1:1, 30% siùcros: OCT (Tissue-Tek OCT Compound 4583, Sakura Finetek) agus chaidh earrannan coronal a dhèanamh aig 30 µm a’ cleachdadh criostat (Leica). Airson immunohistochemistry de earrannan tiugh, chaidh beathaichean a thoirt a-steach do uisge le PBS, agus chaidh an eanchainn a sgaradh agus a ghearradh gu coronal aig 300–400 µm a’ cleachdadh vibratome (Leica) agus chaidh na h-earrannan a shuidheachadh le 4% PFA airson 30 mionaid. An uairsin chaidh crio-earrannan no earrannan tiugh a nighe le PBS, am bacadh airson 1 uair a thìde aig teòthachd an t-seòmair (10% serum asail àbhaisteach (NDS) agus 0.3% Triton X-100 air a lagachadh ann am PBS) agus am bacadh le fuasgladh bacadh aig 4°C. – Goradh Chaidh crio-earrannan a ghoir thar oidhche agus chaidh earrannan tiugh a ghoir airson 5 latha. B’ iad na prìomh antibodies a chaidh a chleachdadh: anti-NeuN (luchag, 1:500; ab104224, abcam) anti-CTIP2 (radain, 1:300; ab18465, abcam), anti-GFAP (coineanach, 1:1,000; Z0334, Dako), anti-GFP (cearc, 1:1,000; GTX13970, GeneTex), anti-HNA (luchag, 1:200; ab191181, abcam), anti-NeuN (coineanach, 1:500; ABN78, Millipore), anti-PDGFRA (coineanach, 1:200; sc-338, Santa Cruz), anti-PPP1R17 (coineanach, 1:200; HPA047819, Atlas Antibodies), anti-RECA-1 (luchag, 1:50; ab9774, abcam), an-aghaidh SCG2 (coineanach, 1:100; 20357-1-AP, Proteintech), an-aghaidh SOX9 (gobhar, 1:500; AF3075, R&D Systems), Netrin G1a (gobhar, 1:100; AF1166, R&D Systems), an-aghaidh STEM121 (luchag, 1:200; Y40410, Takara Bio), an-aghaidh SATB2 (luchag, 1:50; ab51502, abcam), an-aghaidh GAD65/67 (coineanach, 1:400; ABN904, Millipore) agus an-aghaidh IBA1 (gobhar, 1:100; ab5076, abcam). B’ iad na prìomh antibodies a chaidh a chleachdadh: anti-NeuN (luchag, 1:500; ab104224, abcam) anti-CTIP2 (radan, 1:300; ab18465, abcam), anti-GFAP (coineanach, 1:1,000; Z0334, Dako), anti-GFP (cearc, 1:1,000; GTX13970, GeneTex), anti-HNA (luchag, 1:200; ab191181, abcam), anti-NeuN (coineanach, 1:500; ABN78, Millipore), anti-PDGFRA (coineanach, 1:200; sc-338, Santa Cruz), anti-PPP1R17 (coineanach, 1:200; HPA047819, Atlas Antibodies), anti-RECA-1 (luchag, 1:50; ab9774, abcam), an-aghaidh SCG2 (coineanach, 1:100; 20357-1-AP, Proteintech), an-aghaidh SOX9 (gobhar, 1:500; AF3075, R&D Systems), Netrin G1a (gobhar, 1:100; AF1166, R&D Systems), an-aghaidh STEM121 (luchag, 1:200; Y40410, Takara Bio), an-aghaidh SATB2 (luchag, 1:50; ab51502, abcam), an-aghaidh GAD65/67 (coineanach, 1:400; ABN904, Millipore) agus an-aghaidh IBA1 (gobhar, 1:100; ab5076, abcam). Использовались следующие первичные антитела: анти-NeuN (мышиные, 1:500; ab104224, abcam), анти-CTIP2 (3: 0: 0; ab18465, abcam), анти-GFAP (кроличьи, 1: 1000; Z0334, Dako), анти- -GFP (курица, 1: 1000; GTX13970, GeneTex), анти-HNA (мы1, 2: анти-HNA (мы1: 1: 1: abcam), анти-NeuN (кролик, 1:500; ABN78, Millipore), анти-PDGFRA (кролик, 1:200; sc-338, Санта-Круз), анти-PPP1R17 (кролик, 1:200; HPA047819, Atlas Antibodies), анти-RECA-1 (мышь, 1:50; ab9774, abcam), анти-RECA-1 (мышь, 1:50; ab9774, abcam), анти-RECA-1 (мышь, 1:50; ab9774, abcam), анти-RECA-1 (мышь, 1:50; ab9774, abcam), анти-RECA-1 (мышь, 1:50; ab9774, abcam), анти-RECA-1 20357-1-AP, Proteintech), анти-SOX9 (козий, 1: 500; AF3075, R&D Systems), нетрин G1a (козий, 1:100; AF1166, R&D Systems), ант1и-STE 1:200; Y40410, Takara Bio), анти-SATB2 (мышь, 1:50; ab51502, abcam), анти-GAD65/67 (кролик, 1:400; ABN904, Millipore) agus анти-IBA1 (коза, 1:100; аб5076, абкам). B’ iad na prìomh antibodies a chaidh a chleachdadh: anti-NeuN (luchag, 1:500; ab104224, abcam), anti-CTIP2 (radan, 1:300; ab18465, abcam), anti-GFAP (coineanach, 1:1000; Z0334, Dako), anti-GFP (cearc, 1:1000; GTX13970, GeneTex), anti-HNA (luchag, 1:200; ab191181, abcam), anti-NeuN (coineanach, 1:500; ABN78, Millipore), anti-PDGFRA (coineanach, 1:200; sc-338, Santa Cruz), anti-PPP1R17 (coineanach, 1:200; HPA047819, Atlas Antibodies), anti-RECA-1 (luchag, 1:50; ab9774, abcam), an-aghaidh SCG2 (coineanach, 1:100; 20357-1-AP, Proteintech), an-aghaidh SOX9 (gobhar, 1:500; AF3075, R&D Systems), netrin G1a (gobhar, 1:100; AF1166, R&D Systems), an-aghaidh STEM121 (luchag, 1:200; Y40410, Takara Bio), an-aghaidh SATB2 (luchag, 1:50; ab51502, abcam), an-aghaidh GAD65/67 (coineanach, 1:400; ABN904, Millipore) agus an-aghaidh IBA1 (gobhar, 1:100; ab5076, abkam).使用的一抗是:抗NeuN（小鼠,1:500；ab104224, abcam）抗CTIP2（大鼠, 1:3 00；ab18465,abcam）,抗GFAP（兔, 1:1,000；Z0334, Dako）,抗-GF P（鸡, 1:1,000；GTX13970,GeneTex）, 抗HNA（小鼠, 1:200；ab191181,abcam）,抗NeuN（兔,1:500；ABN78,GIPore） 1:200；sc-338,Santa Cruz）, 抗PPP1R17（兔,1:200；HPA047819,Atlas抗体）, 抗RECA-1（小鼠, 1:50； ab9774, abcam）, 抗SCG2（兔）, 1: 100 ； 20357-1-AP, Proteintech）, 抗SOX9（山 羊, 1:500 ； AF3075, R&D Systems）, Netrin G1a（山羊, 1:100；AF1166, R&D Siostaman）, STEM121（小鼠, 1:200;使用的一抗是:抗NeuN（小鼠, 1:500； ab104224,abcam）抗CTIP2（大鼠,1 :300；ab18465, abcam）,抗GFAP（兔, 1:1,000；Z0334, Dako）,抗-GFP (鸡, 1:1,000) GTX 13970, GeneTex）, 抗HNA（小 鼠, 1:200； ab191181, abcam）, 抗NeuN（兔, 1:500, 1:500, 1ABN78 200 ；sc-338, Santa Cruz）, 抗 PPP1R17（兔, 1:200；HPA047819, Atlas 抗体）, 抗RECA-1 (小 鼠, 1:50 ； ab9774, CG2) 100 ； 20357-1-AP, Proteintech）, 抗SOX9（山 羊, 1:500 ； AF3075, R&D Systems）, Netrin G1a（山 羊, 1:100；AF1166,R&D／;Y40410, Takara Bio), an-aghaidh SATB2 (luchag, 1:50; ab51502, abcam), an-aghaidh GAD65/67 (coineanach, 1:400; ABN904, Millipore) agus an-aghaidh IBA1 (gobhar, 1:100; ab5076, abcam).B’ iad na prìomh antibodies a chaidh a chleachdadh: anti-NeuN (luchag, 1:500; ab104224, abcam), anti-CTIP2 (radan, 1:300; ab18465, abcam), anti-GFAP (coineanach, 1:1000; Z0334, Dako). , an-aghaidh GFP (cearc, 1:1000; GTX13970, GeneTex), an-aghaidh HNA (luchag, 1:200; ab191181, abcam), an-aghaidh NeuN (coineanach, 1:500; ABN78, Millipore), an-aghaidh PDGFRA (coineanach, 1:200; sc-338, Santa Cruz), an-aghaidh PPP1R17 (coineanach, 1:200; HPA047819, antibody Atlas), an-aghaidh RECA-1 (luchag, 1:50; ab9774, abcam), an-aghaidh SCG2 (coineanach), 1:100;20357-1-AP, Proteintech), анти-SOX9 (коза, 1: 500; AF3075, R&D Systems), Нетрин G1a (коза, 1:100; AF1166, R&D Systems), анти -мSTEM1: 2: Y40410, Takara Bio), анти-SATB2 (мышь, 1:50; ab51502, abcam), анти-GAD65/67 (кролик, 1:400; ABN904, Millipore) agus анти-IBA1 (к1оза0; абкам). 20357-1-AP, Proteintech), an-aghaidh SOX9 (gobhar, 1:500; AF3075, R&D Systems), Netrin G1a (gobhar, 1:100; AF1166, R&D Systems), an-aghaidh STEM121 (luchag, 1:200; Y40410, Takara Bio), an-aghaidh SATB2 (luchag, 1:50; ab51502, abcam), an-aghaidh GAD65/67 (coineanach, 1:400; ABN904, Millipore), agus an-aghaidh IBA1 (gobhar, 1:100; ab5076, abkam).Chaidh na h-earrannan an uair sin a nighe le PBS agus an goir le antibody àrd-sgoile airson 1 uair aig teòthachd an t-seòmair (earrannan reòta) no thar oidhche aig 4°C (earrannan tiugh). Chaidh antibody àrd-sgoile Alexa Fluor (Life Technologies) caolaichte 1:1000 ann am fuasgladh bacadh a chleachdadh. Às dèidh an nighe le PBS, chaidh na niuclasan a dhèanamh follaiseach le Hoechst 33258 (Life Technologies). Mu dheireadh, chaidh na sleamhnagan a chur air miocroscop le còmhdach-sleamhnagan (Fisher Scientific) a’ cleachdadh Aquamount (Polysciences) agus an sgrùdadh air miocroscop fluorescent Keyence (anailisiche BZ-X) no miocroscop confocal Leica TCS SP8 (Las-X) air an ìomhaigh. Chaidh na h-ìomhaighean a phròiseasadh a’ cleachdadh prògram ImageJ (Fiji). Gus co-roinn niùronan daonna ann an t-hCO agus cortex an radain a thomhas, chaidh ìomhaighean ceart-cheàrnach 387.5 μm de leud a thogail aig meadhan an t-hCO, aig no faisg air oir cortex an radain. Chaidh oirean graft a dhearbhadh le bhith a’ measadh atharrachaidhean ann am follaiseachd clò, niuclasan HNA+, agus/no làthaireachd fèin-fluorescence clò. Anns gach ìomhaigh, chaidh an àireamh iomlan de cheallan NeuN+ agus HNA+ a roinn leis an àireamh iomlan de cheallan NeuN+ san aon raon. Gus dèanamh cinnteach nach tèid ach ceallan le niuclasan ann am plèana na h-ìomhaigh a chunntadh, chan eil ach ceallan a tha cuideachd nan Hoechst+ air an gabhail a-steach san àireamhachadh. Chaidh dà ìomhaigh air an sgaradh le co-dhiù 1 mm a chuibheasachadh gus an mearachd staitistigeil a lùghdachadh.
Seachdain mus tèid an sampall a chruinneachadh, cuir beathaichean tar-chuir hCO3 (timcheall air 8 mìosan de dh’ eadar-dhealachadh) ann an seòmar dorcha le feusagan air an gearradh gus brosnachadh mothachaidh a lughdachadh. Chaidh dealachadh nan niuclasan a dhèanamh mar a chaidh a mhìneachadh roimhe, le beagan atharrachaidhean. Gu h-aithghearr, chaidh t-hCO3 agus hCO3 a sgrios le bhith a’ cleachdadh lysis cealla inneal-glanaidh-meacanaigeach agus inneal-bleith clò glainne 2 ml (D8938, Sigma-Aldrich/KIMBLE). Chaidh na niuclasan amh an uairsin a shìoladh dheth le bhith a’ cleachdadh criathrag 40 µm agus gan cur ann an ceudrifugation aig 320 g airson 10 mionaidean aig 4 °C mus deach caisead dùmhlachd siùcros a dhèanamh. Às deidh a’ cheum ceudrifugation (320 g airson 20 mionaid aig 4 ° C), chaidh na sampallan ath-fhulang ann an 0.04% BSA/PBS le bhith a’ cur 0.2 aonad de µl-1 inhibitor RNase (40 u µl-1, AM2682, Ambion) ris agus gan cur tro chriathrag sruthadh 40 µm. Chaidh na niuclasan sgarte an uair sin ath-fhrochaid ann am PBS anns an robh 0.02% BSA agus an luchdachadh air sliseag Chromium Single Cell 3′ (meas air faighinn air ais 8,000 cealla gach làn). Chaidh leabharlannan snRNA-seq ullachadh leis an Chromium Single cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics). Chaidh leabharlannan snRNA-seq ullachadh leis an Chromium Single cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics). Библиотеки snRNA-seq были приготовлены с помощью Chromium Singilte cealla 3′ GEM, Leabharlann & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics). Chaidh na leabharlannan snRNA-seq ullachadh le bhith a’ cleachdadh Chromium Single cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics). snRNA-seq 文库是使用Chromium Singilte cealla 3′ GEM, Leabharlann & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics) 制备 的。 snRNA-seq 文库是使用Chromium Singilte cealla 3′ GEM, Leabharlann & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics) 制备 的。 Библиотеку snRNA-seq готовили с использованием Chromium Single Cell 3′ GEM, Leabharlann & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics). Chaidh an leabharlann snRNA-seq ullachadh le bhith a’ cleachdadh Chromium Single Cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics).Chaidh leabharlannan bho dhiofar shamhlaichean a chruinneachadh agus a sheicheamh le Admera Health air NovaSeq S4 (Illumina).
Chaidh ìrean abairteachd gine airson gach còd-barra niùclasach ris an robh dùil a thomhas le bhith a’ cleachdadh pasgan bathar-bog mion-sgrùdaidh 10x Genomics CellRanger (dreach 6.1.2). Gu sònraichte, chaidh na leughaidhean a mhaidseadh an aghaidh measgachadh de ghinean fiosrachaidh daonna (GRCh38, Ensemble, dreach 98) agus radain (Rnor_6.0, Ensemble, dreach 100) a chaidh a chruthachadh leis an àithne mkref agus a’ cleachdadh cunntadh leis an àithne –include-introns=TRUE gus leughaidhean a chaidh a mhapadh gu roinnean intron a thomhas. Airson sampallan t-hCO3, chaidh niùclasan daonna a chomharrachadh stèidhichte air an riatanas glèidhidh gum biodh co-dhiù 95% de na leughaidhean mapaichte uile a’ freagairt ris a’ ghineam daonna. Chaidh a h-uile mion-sgrùdadh às dèidh sin a dhèanamh air sreath còd-barra sìolaichte a chaidh a thoirt a-mach às an CellRanger a’ cleachdadh pasgan R (dreach 4.1.2) Seurat (dreach 4.1.1)32.
Gus dèanamh cinnteach nach tèid ach niuclasan àrd-inbhe a ghabhail a-steach san anailis às dèidh sin, chaidh pròiseas sìolaidh ath-aithriseach a chur an gnìomh airson gach sampall. An toiseach, thèid niuclasan ìosal-inbhe le nas lugha na 1000 gine sònraichte air an lorg agus barrachd air 20% de na mitochondria gu lèir a chomharrachadh agus a thoirt air falbh. Às dèidh sin, chaidh maitrís àireamh nan ginean amh a dhèanamh àbhaisteach le ath-tharraing binomial àicheil cunbhalach a’ cleachdadh an gnìomh sctransform(vst.flavor=”v2″), a chomharraich cuideachd na 3000 ginean as caochlaideach a’ cleachdadh paramadairean bunaiteach. Chaidh lughdachadh tomhas a dhèanamh air na ginean caochlaideach as àirde a’ cleachdadh Mion-sgrùdadh Prìomh Cho-phàirtean (PCA) le paramadairean bunaiteach a’ cleachdadh tomhas seata dàta de 30 (chaidh dims = 30 a thaghadh stèidhichte air sgrùdadh lèirsinneach air làraichean glùine agus a chleachdadh airson a h-uile sampall agus mion-sgrùdadh co-chruinneachaidh). An uairsin rinn sinn grunn chuairtean de chruinneachadh ath-aithriseach (rùn = 1) gus ginean a sheòrsachadh stèidhichte air cunntadh ginean anabarrach ìosal (meadhan fo 10mh ceudad), cunntadh ginean mitochondrial anabarrach àrd (meadhan os cionn 95mh ceudad) gus ceallan a tha fo amharas de chàileachd ìosal a chomharrachadh agus a thoirt air falbh. cruinneachaidhean agus/no cuibhreann àrd de chàraid amharasach air an comharrachadh a’ cleachdadh am pasgan DoubletFinder33 (sgòr DoubletFinder cuibheasach os cionn an 95mh ceudad). Chaidh sampallan t-hCO (n=3) agus sampallan hCO (n=3) a thoirt a-steach air leth a’ cleachdadh an gnìomh IntegrateData leis na paramadairean gu h-àrd. An uairsin Chaidh cuairt eile de shìoladh càileachdail den t-seata dàta amalaichte a dhèanamh mar a chaidh a mhìneachadh gu h-àrd.
Às dèidh na h-eithnichean ìosal-inbhe a thoirt air falbh, chaidh an seata dàta amalaichte a chur ann am buidhnean (rùn = 0.5) agus a leabachadh a-steach airson adhbharan lèirsinn UMAP34. Chaidh ginean comharrachaidh airson gach cruinneachadh a dhearbhadh a’ cleachdadh an gnìomh FindMarkers le paramadairean bunaiteach air an tomhas bho dhàta abairt gine àbhaisteach. Bidh sinn a’ comharrachadh agus a’ seòrsachadh prìomh chlasaichean cealla le bhith a’ cothlamadh seataichean dàta iomraidh cortical fetal agus inbheach le abairt gine comharrachaidh 19,20,21,35 agus anotachadh. Gu sònraichte, chaidh ro-ruithearan a’ cuairteachadh a chomharrachadh le abairt MKI67 agus TOP2A. Chaidh cruinneachaidhean progenitor a mhìneachadh le dìth tar-sgrìobhaidhean mitotic, for-tharraing àrd le cruinneachaidhean progenitor glial ioma-chumhachdach a chaidh a mhìneachadh ann an cortex fetal metaphase fadalach, agus abairt EGFR agus OLIG1. Bidh sinn a’ cleachdadh an teirm astrocyte gus grunn staidean de eadar-dhealachadh astrocyte a ghabhail a-steach, bho glia radial fadalach gu aibidh astrocytes. Bidh cruinneachaidhean astrocyte a’ cur an cèill ìrean àrda de SLC1A3 agus AQP4 agus chaidh sealltainn gu bheil iad a’ mapadh le fo-sheòrsan de glia radial fetal agus / no astrocytes inbheach. Bidh OPCan a’ cur an cèill PDGFRA agus SOX10 agus bidh oligodendrocytes a’ cur an cèill comharran myelination (MOG agus MYRF). Chaidh neurons glutamatergic a chomharrachadh le làthaireachd tar-sgrìobhaidhean neuronal (SYT1 agus SNAP25), dìth chomharran GABAergic (GAD2), agus cur an cèill NEUROD6, SLC17A7, BCL11B, no SATB2. Chaidh neurons GluN a roinn tuilleadh ann am fo-chlasaichean àrd (cur an cèill SATB2 agus call BCL11B) agus domhainn (cur an cèill BCL11B). Bidh neurons fo-phlàta a tha coltach (SP) a’ cur an cèill comharran SP18 aithnichte leithid ST18 agus SORCS1 a bharrachd air comharran GluN domhainn. Chaidh ceallan coltach ri plexus choroid a chomharrachadh le cur an cèill TTR, agus chuir ceallan coltach ri meningeal ginean co-cheangailte ri fibroblast an cèill agus mhapadh iad ceallan pial / vascular den t-seata dàta iomraidh.
Chaidh mion-sgrùdadh eadar-dhealaichte air abairt gine eadar fo-chlasaichean t-hCO agus hCO a dhèanamh le bhith a’ cleachdadh dòigh pseudo-batch a chaidh a leasachadh às ùr air ath-riochdachadh ann an sampallan a chaidh a chur an gnìomh a’ cleachdadh pasgan Libra R (dreach 1.0.0). Gu sònraichte, chaidh deuchainnean coltachd log edgeR (dreach 3.36.0, pasgan R) a dhèanamh airson buidhnean le bhith a’ cur ri chèile an àireamh de ghinean ann an ceallan airson clas cealla sònraichte airson gach ath-riochdachadh sampall. Airson lèirsinn mapa teas, tha luachan àbhaisteach gach millean (CPM) air an obrachadh a-mach a’ cleachdadh edgeR (gnìomh cpm()) agus air an sgèileadh (gus cuibheasachd = 0, claonadh àbhaisteach = 1 a choileanadh). Chaidh mion-sgrùdadh beairteachaidh Ontology Gene (GO) air ginean GluN t-hCO a chaidh a mheudachadh gu mòr a dhèanamh (luach P ceartaichte Benjamini-Hochberg nas lugha na 0.05 air a chur an cèill ann an co-dhiù 10% de cheallan GluN t-hCO agus àrdachadh fillte ann an atharrachadh co-dhiù 2 uair). air a dhèanamh a’ cleachdadh ToppGene Suite (https://toppgene.cchmc.org/)37. Bidh sinn a’ cleachdadh an aplacaid ToppFun le paramadairean bunaiteach agus ag aithris luachan-P air an ceartachadh le Benjamini-Hochberg air an obrachadh a-mach bho dheuchainnean hipear-geoimeatrach le notaichean GO.
Gus na cruinneachaidhean snRNA-seq againn a mhaidseadh ri cruinneachaidhean cealla le notaichean bho sgrùdaidhean iomraidh de RNA-seq cealla singilte bun-sgoile no snRNA-seq inbheach19,20,21,22, chuir sinn dòigh-obrach amalachaidh seata dàta càraideach an sàs. Chleachd sinn sruth-obrach àbhaisteachaidh SCTransform (v2) ann an Seurat gus tar-lùbadh cruinneachaidh eadar seataichean dàta a thoirt còmhla agus a choimeas (a’ cleachdadh nan aon pharaimeatairean ris an fhear gu h-àrd). Chaidh fo-sheataichean dàta fa leth a chuir ann an fo-roinnean air thuaiream suas gu 500 cealla no cridheachan gach cruinneachadh tùsail airson èifeachdas coimpiutaireachd. A’ cleachdadh dòigh-obrach coltach ris an fhear a chaidh a mhìneachadh roimhe, chaidh tar-lùbadh cruinneachaidh a mhìneachadh mar an co-roinn de cheallan no niuclasan anns gach cruinneachadh cruinnichte a bha a’ tar-lùbadh le leubail a’ chruinneachaidh iomraidh. Gus GluNan a sheòrsachadh tuilleadh, chleachd sinn sruth-obrach TransferData Seurat airson dàta fo-sheata GluN gus leubail seata dàta iomraidh a shònrachadh do na ceallan GluN againn.
Gus measadh a dhèanamh air inbhe aibidh an transcriptome cruinneil de shampaill t-hCO agus hCO, rinn sinn coimeas eadar na sampallan pseudo-bulk againn agus BrainSpan/psychENCODE23, a tha air a dhèanamh suas de shreath RNA mòr a’ dol thairis air leasachadh eanchainn daonna. Rinn sinn PCA air maitrís abairt gine co-mheasgaichte le pàtran àbhaisteach bho shampaill cortical 10 seachdainean às deidh a’ bhreith agus nas fhaide air adhart, ann an 5567 ginean (còmhla ris an dàta againn) a chaidh a chomharrachadh roimhe mar ghnìomhach ann an sampallan cortical BrainSpan (air am mìneachadh mar nas motha na 50% ann an caochlaideachd leasachaidh air a mhìneachadh le aois a’ cleachdadh modail ciùbach)38. A bharrachd air an sin, fhuair sinn ginean co-cheangailte ri prìomh shoidhnichean transcriptome de leasachadh neuro a’ cleachdadh factaraidh maitrís neo-àicheil mar a chaidh a mhìneachadh roimhe. Tha na cuideaman sampall a chaidh obrachadh a-mach a’ cleachdadh modh-obrach factaraidh maitrís neo-àicheil air an sealltainn ann am Figearan 5b le dàta leudaichte airson gach aon de na còig soidhnichean a mhìnich Zhu et al.38. A-rithist, chaidh comharran tar-sgrìobhaidh an urra ri gnìomhachd a thoirt bho sgrùdaidhean a chaidh fhoillseachadh roimhe. Gu sònraichte, bha ERG agus LRG air an àrdachadh gu mòr ann an neurons glutamatergic a chaidh an comharrachadh leis a’ chruinneachadh snRNA-seq cortex lèirsinneach luchaige às deidh brosnachadh lèirsinneach bho Chlàr-taice 3 Hrvatin et al.16. Fhuaireadh LRGan beairteach le daoine bho chultaran eanchainn fetal daonna air an gnìomhachadh le KCl agus chaidh an buain 6 uairean a thìde às deidh brosnachadh, agus bha na ginean sìolaichte air an àrdachadh gu mòr ann an daoine ach chan ann an creimich (Clàr-taice 4). Chaidh mion-sgrùdadh air beairteachadh seata gine a’ cleachdadh nan seataichean gine seo a dhèanamh a’ cleachdadh deuchainn mionaideach aon-shligheach Fisher.
Cuir isoflurane air na radain, thoir air falbh na h-eanchainn agus cuir iad ann am fuasgladh siùcros fuar (timcheall air 4°C) ocsaideanaichte (95% O2 agus 5% CO2) airson earrannan anns a bheil: 234 mM siùcros, 11 mM glùcois, 26 mM NaHCO3, 2.5 mM KCl, 1.25 mM NaH2PO4, 10 mM MgSO4 agus 0.5 mM CaCl2 (timcheall air 310 mOsm). Chaidh earrannan coronal eanchainn radain (300–400 µm) anns a bheil t-hCO a dhèanamh a’ cleachdadh crith-chriathrag Leica VT1200 mar a chaidh a mhìneachadh roimhe39. Chaidh na h-earrannan an uair sin a ghluasad gu seòmar earrannan le ocsaideanachadh leantainneach aig teòthachd an t-seòmair anns an robh aCSF air ullachadh bho: 10 mM glùcois, 26 mM NaHCO3, 2.5 mM KCl, 1.25 mM NaHPO4, 1 mM MgSO4, 2 mM CaCl2 agus 126 mM NaCl (298 mOsm). co-dhiù 45 mionaid mus deach an clàradh. Chaidh na h-earrannan a chlàradh ann an seòmar bog far an deach an sruthadh gu leantainneach le aCSF (fioal 95% O2 agus 5% CO2). Chaidh a h-uile dàta a chlàradh aig teòthachd an t-seòmair. Chaidh niùronan t-hCO a chrìochnachadh le pipette glainne borosilicate air a lìonadh le fuasgladh anns an robh 127 mM gluconate potasium, 8 mM NaCl, 4 mM magnesium ATP, 0.3 mM sodium GTP, 10 mM HEPES, agus 0.6 mM EGTA, pH 7.2, fuasgladh a-staigh air atharrachadh le KOH (290 mOsm). Gus faighinn air ais, chaidh biocytin (0.2%) a chur ris an fhuasgladh clàraidh.
Chaidh dàta fhaighinn le bhith a’ cleachdadh amplifier MultiClamp 700B (Molecular Devices) agus digiteadair Digidata 1550B (Molecular Devices), air a shìoladh le pas ìosal aig 2 kHz, air a dhidseatachadh aig 20 kHz, agus air a sgrùdadh le bhith a’ cleachdadh Clampfit (Molecular Devices), Origin (OriginPro). 2021b, OriginLab). agus gnìomhan MATLAB gnàthaichte (Mathworks). Chaidh comas an snaim obrachadh a-mach le bhith a’ cleachdadh JPCalc agus chaidh na h-inntrigidhean atharrachadh chun luach obraichte de -14 mV. Tha Obrachadh IV a’ toirt a-steach sreath de cheumannan gnàthach ann an ceumannan 10-25 pA, bho -250 gu 750 pA.
Chaidh an talamus, stuth geal, agus afferents S1 a bhrosnachadh gu dealain ann an sliseagan thalamocortical rè clàradh patch-clamp de neurons hCO, mar a chaidh a mhìneachadh roimhe. Goirid, chaidh an eanchainn a chuir air bòrd clò-bhualaidh 3D air a chlaonadh aig ceàrn 10°, agus chaidh aghaidh na h-eanchainn a ghearradh aig ceàrn 35°. An uairsin chaidh an eanchainn a ghleusadh ris an uachdar gearraidh agus a roinn ann an earrannan, a’ gleidheadh ​​​​​​na h-axons thalamocortical a bha a’ steigeadh a-mach. Chaidh electrodan tungsten dà-phòlach (0.5 MΩ) a chuir air dàrna micromanipulator agus an suidheachadh gu ro-innleachdail gus ceithir roinnean gach cealla a bhrosnachadh (capsal a-staigh, stuth geal, S1 agus hCO). Clàraich freagairtean synaptic às deidh brosnachadh ìreil 300 µA aig 0.03–0.1 Hz.
Chaidh niùronan hCO a bha a’ cur an cèill hChR2 a ghnìomhachadh aig 480 nm agus chaidh cuislean solais a chaidh a chruthachadh le LED (Prizmatix) a chuir an sàs tro amas ×40 (0.9 NA; Olympus) gus clàradh a dhèanamh air an abairt hChR2 faisg air na ceallan. Tha trast-thomhas an achaidh shoilleir timcheall air 0.5 mm agus tha an cumhachd iomlan 10-20 mW. Chaidh leud na cuisle a shuidheachadh gu 10 ms, a tha a’ freagairt ris a’ chuisle a chaidh a thoirt seachad rè an deuchainn ionnsachaidh giùlain. Chaidh diofar triceadan brosnachaidh a chleachdadh, bho 1 gu 20 Hz, ach cha deach ach a’ chiad chuisle den t-sreath a chleachdadh airson tomhas. Mar as trice bidh na h-eadar-amaichean eadar trèanaichean nas fhaide na 30 s gus a’ bhuaidh air slighean bacaidh no comasachaidh synaptic a lughdachadh. Gus deuchainn a dhèanamh an robh am freagairt hChR2 monosynaptic, chuir sinn TTX (1 μM) ris an amar gus an do dh’ fhalbh an ath-bhualadh EPSC, agus an uairsin chuir sinn 4-aminopyridine (4-AP; 100 μM) an sàs. Mar as trice, thèid freagairt a thilleadh taobh a-staigh beagan mhionaidean, le dàil beagan nas fhaide eadar losgadh LED agus gineadh EPSC. Chaidh NBQX (10 μM) a chleachdadh gus deuchainn a dhèanamh an e gabhadairean AMPA a tha a’ stiùireadh na freagairt.
Chaidh earrannan biorach de hCO a chruthachadh mar a chaidh a mhìneachadh roimhe. Gu h-aithghearr, chaidh earrannan de hCO a leabachadh ann an 4% agarose agus an gluasad gu ceallan anns an robh 126 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM NaH2PO4, 1 mM MgSO4, 2 mM CaCl2, 26 mM NaHCO3 agus 10 mM d-(+) -glucose ann an earrannan. Chaidh na h-earrannan a ghearradh aig 200–300 µm aig teòthachd an t-seòmair a’ cleachdadh crith-tharraing Leica VT1200 agus an stòradh ann an ASF aig teòthachd an t-seòmair. An uairsin, chaidh clàradh patch-camp de cheallan slàn a dhèanamh air earrannan de hCO fo mhiocroscop dìreach SliceScope (Scientifica). Chaidh aCSF (95% O2 agus 5% CO2) a phasgadh tro na h-earrannan agus chaidh comharran cealla a chlàradh aig teòthachd an t-seòmair. Chaidh niùronan hCO a chur an sàs le bhith a’ cleachdadh pìobaid glainne borosilicate air a lìonadh le fuasgladh anns an robh 127 mM gluconat potasium, 8 mM NaCl, 4 mM magnesium ATP, 0.3 mM GTP sodium, 10 mM HEPES, agus 0.6 mM EGTA, pH a-staigh 7, 2, air atharrachadh le KOH (osmolarity 290). Airson adhbharan ath-bheothachaidh, cuir 0.2% Biocytin ris an fhuasgladh a-staigh.
Chaidh dàta fhaighinn le Clampex (Clampex 11.1, Molecular Devices) a’ cleachdadh amplifier MultiClamp 700B (Molecular Devices) agus digiteadair Digidata 1550B (Molecular Devices), air a shìoladh le pas ìosal aig 2 kHz, air a dhidseatachadh aig 20 kHz, agus air a sgrùdadh a’ cleachdadh Clampfit (dreach 10.6) airson mion-sgrùdadh, innealan moileciuil) agus gnìomhan MATLAB gnàthaichte (MATLAB 2019b, Mathworks). Chaidh comas a’ cheangail obrachadh a-mach a’ cleachdadh JPCalc agus chaidh na h-inntrigidhean atharrachadh a rèir comas a’ cheangail obraichte de -14 mV. Tha Obrachadh IV a’ toirt a-steach sreath de cheumannan gnàthach ann an ceumannan 5-10 pA bho -50 gu 250 pA.
Airson ath-thogail morf-eòlach de neurons prìnichte, chaidh 0.2% biocytin (Sigma-Aldrich) a chur ris an fhuasgladh a-staigh. Tha na ceallan air an ullachadh airson co-dhiù 15 mionaidean an dèidh an gearradh. Tha am pipette an uairsin air a tharraing a-steach gu slaodach airson 1–2 mionaid gus am bi am membran clàraichte air a dhùnadh gu tur. Às dèidh modh-obrach fiseòlas earrannan, chaidh earrannan a shuidheachadh thar oidhche aig 4° C. ann an 4% PFA, air an nighe le PBS X3, agus air an caolachadh 1:1000 le DyLight 549 no DyLight 405 (Vector Labs) ceangailte ri streptavidin. Chaidh ceallan air an lìonadh le biocytin (2%; Sigma-Aldrich) a chomharrachadh rè clàradh clamp paiste aig teòthachd an t-seòmair airson 2 uair a thìde. Chaidh na h-earrannan an uairsin a chuir air sleamhnagan microscopy a’ cleachdadh Aquamount (Thermo Scientific) agus air an taisbeanadh an ath latha air microscop confocal Leica TCS SP8 a’ cleachdadh amas bogadh ola le fosgladh àireamhach ×40 1.3, meudachadh ×0.9–1.0, xy. Tha an ìre samplachaidh timcheall air 7 piogsail gach micron. Chaidh cruachan-Z fhaighinn ann an sreath aig eadar-amaichean 1 µm, agus chaidh moasaig cruach-z agus fuaigheal fèin-ghluasadach stèidhichte air Leica a dhèanamh gus craobh dendritic gu lèir gach neuron a chòmhdach. Chaidh neurons an uairsin a leantainn leth-làimhe a’ cleachdadh eadar-aghaidh neuTube 40 agus chaidh faidhlichean SWC a chruthachadh. Chaidh na faidhlichean an uairsin a luchdachadh suas chun plugan SimpleNeuriteTracer41 Fiji (ImageJ, dreach 2.1.0; NIH).
Chaidh clò cortical daonna fhaighinn le cead fiosraichte a rèir pròtacal a chaidh aontachadh le Bòrd Ath-sgrùdaidh Institiùideach Oilthigh Stanford. Chaidh dà shampall de chlò iar-bhreith daonna (3 agus 18 bliadhna a dh'aois) fhaighinn le bhith a’ toirt air falbh a’ cortex aghaidh (gyrus aghaidh meadhanach) mar phàirt de lannsaireachd airson tinneas tuiteamach teasfhulangach. Às dèidh an toirt air falbh, buain clò ann an NMDG-aCSF reòthte anns a bheil: 92 mM NMDG, 2.5 mM KCl, 1.25 mM NaH2PO4, 30 mM NaHCO3, 20 mM HEPES, 25 mM glùcois, 2 mM thiourea, 5 mM sodium ascorbate, 3 mM sodium pyruvate, 0.5 mM CaCl2 4H2O agus 10 mM MgSO4 7H2O. Tiotrate gu pH 7.3-7.4 le searbhag hydrochloride dùmhail. Chaidh na clòthan a lìbhrigeadh don obair-lann taobh a-staigh 30 mionaid agus chaidh earrannan coronal a ghabhail a rèir a’ mhodh-obrach a chaidh a mhìneachadh gu h-àrd.
Chaidh a h-uile modh-obrach ainmhidhean a dhèanamh a rèir stiùiridhean cùram ainmhidhean ceadaichte le APLAC Oilthigh Stanford. Chaidh radain (barrachd air 140 latha às dèidh tar-chur) a bhrosnachadh le anesthesia 5% isoflurane agus anesthesia le 1-3% isoflurane rè na h-obrachaidh. Chaidh beathaichean a chur ann am frèam stereotaxic (Kopf) agus chaidh buprenorphine leigeil ma sgaoil leantainneach (SR) a stealladh fon chraiceann. Tha a’ chlaigeann air a nochdadh, air a ghlanadh agus tha 3-5 sgriothan cnàimh air an cur a-steach. Gus t-hCO a thargaideadh, chruthaich sinn co-chomharran stereotaxic bho ìomhaighean MRI. Chaidh toll burr a dhrileadh aig an làrach ùidh agus chaidh snàithleanan (trast-thomhas 400 µm, NA 0.48, Doric) a leigeil sìos 100 µm fo uachdar hCO agus air an daingneachadh ris a’ chlaigeann le saimeant fiaclaireachd a ghabhas leigheas le UV (Relyx).
Chaidh clàraidhean fotomeatrach snàithleach a dhèanamh mar a chaidh a mhìneachadh roimhe42. Gus gnìomhachd gun spionnadh a chlàradh, chaidh radain a chur ann an cèidse glan agus chaidh càball paiste snàithleach optaigeach 400 µm ann an trast-thomhas (Doric) ceangailte ri siostam togail dàta fotomeatrach snàithleach optaigeach a cheangal ris a’ chàball snàithleach optaigeach a chaidh a chur a-steach. Rè clàradh 10-mionaidean de ghnìomhachd motair, bha na beathaichean saor airson an cèidse a sgrùdadh. Gus an gnìomhachd a chaidh a bhrosnachadh a chlàradh, chaidh radain (barrachd air 140 latha às deidh tar-chur) a thoirt a-steach do dh’anaesthetic le 5% isoflurane airson inntrigeadh agus 1-3% isoflurane airson cumail suas. Cuir am beathach ann am frèam stereotactic (Kopf) agus tha na feusagan air taobh eile an t-hCO air an gearradh gu timcheall air 2 cm agus air an cur tro mhogal ceangailte ri actuator piezoelectric (PI). Chaidh càball paiste snàithleach optaigeach 400 µm (Doric) a cheangal ris an t-snàithleach a chaidh a chur a-steach agus a cheangal ris an t-siostam togail dàta. Chaidh na ciaragan air taobh eile t-hCO an uair sin a thionndadh 50 uair (2 mm aig 20 Hz, 2 s gach taisbeanadh) aig amannan air thuaiream le draibhear piezoelectric thairis air ùine clàraidh 20 mionaid. Cleachd Pasgan Taic Arduino MATLAB gus smachd a chumail air ùine tionndaidh le còd MATLAB gnàthaichte. Tha tachartasan air an sioncronachadh ris a’ bhathar-bog togail dàta a’ cleachdadh cuislean loidsig transistor-transistor (TTL).
Chaidh radain (barrachd air 140 latha às dèidh tar-chur) a bhrosnachadh le anesthesia 5% isoflurane agus anesthesia le 1-3% isoflurane rè na h-obrachaidh. Chaidh beathaichean a chur ann am frèam stereotaxic (Kopf) agus chaidh buprenorphine SR agus dexamethasone a stealladh a-steach don chraiceann. Tha a’ chlaigeann air a nochdadh, air a ghlanadh agus tha 3-5 sgriothan cnàimh air an cur a-steach. Gus t-hCO a thar-chur, chruthaich sinn co-chomharran stereotaxic bho ìomhaighean MRI. Chaidh craniotomy cruinn (timcheall air 1 cm ann an trast-thomhas) a dhèanamh le drile àrd-astar dìreach thairis air an hCO a chaidh a thar-chur. Cho luath ‘s a bhios an cnàimh cho tana ‘s a ghabhas, ach mus tèid drileadh tron ​​chnàimh gu lèir, cleachd forceps gus an diosc pelvic slàn a tha air fhàgail a thoirt air falbh gus an t-hCO a tha fon uachdar fhoillseachadh. Chaidh an craniotomy a lìonadh le saline sterile, agus chaidh còmhdach-slip agus prìne cinn sònraichte a cheangal ris a’ chlaigeann le saimeant fiaclaireachd air a leigheas le UV (Relyx).
Rinneadh ìomhaighean dà-photon le bhith a’ cleachdadh miocroscop ioma-photon Bruker le amas Nikon LWD (×16, 0.8 NA). Rinneadh ìomhaighean GCaMP6 aig 920 nm le meudachadh plèana-z singilte 1.4x agus cuibheasachd 8x de 7.5 fps. Chaidh radain a bhrosnachadh le anesthesia isoflurane 5% agus an cumail suas le 1-3% isoflurane. Chaidh na radain a chur ann an inneal-cinn gnàthaichte agus an suidheachadh fon lionsa. Fhuaireadh clàradh cùl-fhiosrachaidh 3-mionaidean de ghnìomhachd motair. Thar cùrsa 20 mionaid de chlàradh, chaidh 50 puff (gach taisbeanadh 100 ms a dh'fhaid) a lìbhrigeadh air thuaiream chun a’ phloc feusag mu choinneimh t-hCO a’ cleachdadh picospricer. Cleachd am Pasgan Taic Arduino MATLAB gus smachd a chumail air ùine spreadhaidh le còd MATLAB gnàthaichte. Sioncronaich tachartasan le bathar-bog togail dàta (PrairieView 5.5) a’ cleachdadh cuislean TTL. Airson mion-sgrùdadh, chaidh na h-ìomhaighean a cheartachadh airson gluasad xy a’ cleachdadh ceartachadh affine anns a’ phrògram MoCo a chaidh a chuir air bhog ann am Fiji. Tarraing lorgan fluorescent bho cheallan fa leth a’ cleachdadh CNMF-E43. Chaidh fluorescence a thoirt a-mach airson gach roinn de dh’ùidh, air a thionndadh gu lùban dF/F, agus an uairsin air a thionndadh gu sgòran-z.
Chaidh radain (barrachd air 140 latha às dèidh tar-chur) a bhrosnachadh le anesthesia 5% isoflurane agus anesthesia le 1-3% isoflurane rè na h-obrachaidh. Chaidh beathaichean a chur ann am frèam stereotaxic (Kopf) agus chaidh buprenorphine SR agus dexamethasone a stealladh fon chraiceann. Chaidh na feusagan air taobh eile an t-hCO a ghearradh gu mu 2 cm agus an snàthadh tro mhogal ceangailte ri actuator piezoelectric. Tha an claigeann air a nochdadh agus air a ghlanadh. Tha sgriubha talmhainn stàilinn gun smal ceangailte ris a’ chlaigeann. Gus t-hCO a thargaideadh, chruthaich sinn co-chomharran stereotaxic bho ìomhaighean MRI. Dèan craniotomy cruinn (mu 1 cm ann an trast-thomhas) le drile àrd-astar dìreach os cionn an t-hCO. Cho luath ‘s a bhios an cnàimh cho tana ‘s a ghabhas, ach mus drileadh tron ​​chnàimh gu lèir, cleachd forceps gus an diosc pelvic slàn a tha air fhàgail a thoirt air falbh gus an t-hCO fon talamh fhoillseachadh. Chaidh ceallan fa leth a chlàradh le bhith a’ cleachdadh proban silicon àrd-dùmhlachd 32-sianal no 64-sianal (Cambridge Neurotech) ceangailte ri sgriothan talmhainn agus air an ro-mheudachadh le amplifiers RHD (Intan). Cleachd an inneal-làimhseachaidh gus na electrodan a leigeil sìos chun làraich targaid tron ​​​​chraniotomy, a tha air a lìonadh le saline sterile. Chaidh cruinneachadh dàta a dhèanamh aig tricead 30 kHz a’ cleachdadh siostam togail dàta Open Ephys. Cha do lean an clàradh ach nuair a lorg sinn gnìomhachd fèin-ghluasadach ruitheamach co-cheangailte gu math ann am barrachd air 10 seanalan, a’ moladh gu robh na electrodan suidhichte anns a’ ghraft (stèidhichte air dàta ìomhaighean calcium dà-photon). Fhuaireadh clàradh cùl-fhiosrachaidh 10-mionaid de ghnìomhachd motair. Chaidh na feusagan air taobh eile t-hCO an uairsin a thionndadh 50 uair (2 mm aig 20 Hz, 2 s gach taisbeanadh) aig amannan air thuaiream le draibhear piezoelectric thairis air ùine clàraidh 20 mionaid. A’ cleachdadh Pasgan Taic MATLAB airson Arduino (MATLAB 2019b), smachd a chumail air ùine tionndaidh le còd MATLAB gnàthaichte. Cleachd cuislean TTL gus tachartasan a shioncronachadh le bathar-bog togail dàta.
Airson deuchainnean comharrachaidh optaigeach, chaidh corda paiste optaigeach 200 µm (Doric) ceangailte ri laser 473 nm (Omicron) a cheangal ri snàithleach optaigeach 200 µm a chaidh a chur thairis air a’ chraniotomy. Dìreach ron seo, atharraich cumhachd an leumadair gu 20 mW. Cleachd an inneal-làimhseachaidh gus na electrodan a leigeil sìos chun làraich targaid tron ​​chraniotomy, a tha air a lìonadh le saline sterile. Aig toiseach a’ chlàraidh, chaidh deich cuislean solais 473 nm (tricead 2 Hz, fad cuisle 10 ms) a leigeil a-mach. Chaidh ceallan mothachail air solas a mhìneachadh mar cheallan a sheall freagairt biorach taobh a-staigh 10 ms de sholas ann an 70% no barrachd de na deuchainnean.