Terima kasih telah mengunjungi Nature.com. Anda menggunakan versi browser dengan dukungan CSS terbatas. Untuk pengalaman terbaik, kami sarankan Anda menggunakan browser yang diperbarui (atau nonaktifkan Mode Kompatibilitas di Internet Explorer). Selain itu, untuk memastikan dukungan yang berkelanjutan, kami menampilkan situs tanpa gaya dan JavaScript.
Menampilkan rangkaian tiga slide sekaligus. Gunakan tombol Sebelumnya dan Berikutnya untuk berpindah melalui tiga slide sekaligus, atau gunakan tombol penggeser di bagian akhir untuk berpindah melalui tiga slide sekaligus.
Organel saraf yang merakit sendiri merupakan platform in vitro yang menjanjikan untuk memodelkan perkembangan dan penyakit manusia. Akan tetapi, organoid tidak memiliki konektivitas yang ada secara in vivo, yang membatasi pematangan dan mencegah integrasi dengan sirkuit lain yang mengendalikan perilaku. Di sini kami menunjukkan bahwa organoid kortikal yang berasal dari sel punca manusia yang ditransplantasikan ke korteks somatosensori tikus telanjang neonatal mengembangkan tipe sel dewasa yang terintegrasi ke dalam sirkuit yang berhubungan dengan sensorik dan motivasi. MRI mengungkapkan pertumbuhan organoid pascatransplantasi pada beberapa lini sel punca dan hewan, sementara analisis inti tunggal mengungkapkan perkembangan kortikogenesis dan munculnya program transkripsi yang bergantung pada aktivitas. Memang, neuron kortikal yang ditransplantasikan menunjukkan sifat morfologi, sinaptik, dan membran internal yang lebih kompleks daripada neuron in vitro, yang memungkinkan deteksi cacat neuronal pada pasien dengan sindrom Timothy. Penelusuran anatomi dan fungsional telah menunjukkan bahwa organel yang ditransplantasikan menerima masukan talamokortikal dan kortikokortikal, dan rekaman aktivitas saraf secara in vivo menunjukkan bahwa masukan ini dapat menghasilkan respons sensorik dalam sel manusia. Terakhir, organoid kortikal memperluas akson ke seluruh otak tikus, dan aktivasi optogenetiknya mengarah pada perilaku mencari imbalan. Dengan demikian, neuron korteks manusia yang ditransplantasikan menjadi matang dan berpartisipasi dalam sirkuit inang yang mengendalikan perilaku. Kami berharap pendekatan ini dapat memfasilitasi deteksi fenotipe tingkat untai pada sel yang berasal dari pasien yang tidak dapat dideteksi dengan cara lain.
Otak manusia yang sedang berkembang adalah proses pengorganisasian diri yang luar biasa di mana sel-sel berkembang biak, berdiferensiasi, bermigrasi, dan terhubung untuk membentuk sirkuit saraf fungsional yang selanjutnya disempurnakan melalui pengalaman sensorik. Masalah utama dalam memahami perkembangan otak manusia, terutama dalam konteks penyakit, adalah kurangnya akses ke jaringan otak. Organel yang mengatur diri sendiri, termasuk organoid korteks manusia (hCO; juga dikenal sebagai bola korteks manusia), dapat menghasilkan 2,3,4,5,6. Namun, beberapa keterbatasan membatasi penerapannya yang lebih luas untuk memahami perkembangan dan fungsi sirkuit saraf. Secara khusus, tidak jelas apakah pematangan hCO dibatasi oleh tidak adanya masukan mikrolingkungan dan sensorik tertentu yang ada secara in vivo. Selain itu, karena hCO tidak terintegrasi ke dalam sirkuit yang dapat menghasilkan hasil perilaku, utilitasnya dalam pemodelan gangguan neuropsikiatri yang kompleks secara genetik dan perilaku saat ini terbatas.
Transplantasi hCO ke dalam otak hidup yang utuh dapat mengatasi keterbatasan ini. Penelitian sebelumnya telah menunjukkan bahwa neuron manusia yang ditransplantasikan ke korteks hewan pengerat mampu bertahan hidup, memproyeksikan, dan berkomunikasi dengan sel hewan pengerat7,8,9,10,11,12. Namun, percobaan ini biasanya dilakukan pada hewan dewasa, yang dapat membatasi integrasi sinaptik dan akson. Di sini, kami menjelaskan paradigma transplantasi di mana kami mentransplantasikan hCO 3D yang berasal dari sel hiPS ke korteks somatosensori primer (S1) tikus imunodefisiensi pada tahap awal perkembangan plastik. Neuron hCO (t-hCO) yang ditransplantasikan mengalami pematangan substansial, menerima masukan talamokortikal dan kortikal-kortikal yang menimbulkan respons sensorik, dan memperluas proyeksi akson ke dalam otak tikus untuk mendorong perilaku mencari penghargaan. Pematangan t-hCO yang diperpanjang telah mengungkap cacat saraf pada pasien dengan sindrom Timothy (TS), kelainan genetik parah yang disebabkan oleh mutasi pada saluran kalsium tipe L CaV1.2 yang peka terhadap tegangan (dikodekan oleh CACNA1C).
Untuk mempelajari neuron kortikal manusia dalam sirkuit in vivo, kami mentransplantasikan hCO 3D utuh secara stereotaktik ke S1 tikus atimik pascanatal awal (hari ke-3-7 pascanatal) (Gbr. 1a dan data yang diperluas dari Gbr. 1a-c). Pada titik ini, proyeksi akson talamokortikal dan kortikokortikal belum menyelesaikan persarafan S1 mereka (ref. 13). Dengan demikian, pendekatan ini dirancang untuk memaksimalkan integrasi t-hCO sambil meminimalkan dampak pada sirkuit endogen. Untuk memvisualisasikan lokasi t-hCO pada hewan hidup, kami melakukan rekonstruksi otak MRI berbobot T2 pada tikus 2–3 bulan setelah transplantasi (Gbr. 1b dan data yang diperluas, Gbr. 1d). t-hCO mudah diamati dan pengukuran volume t-hCO serupa dengan yang dihitung dari irisan tetap (Data Tambahan Gambar 1d,e; P > 0,05). t-hCO mudah diamati dan pengukuran volume t-hCO serupa dengan yang dihitung dari irisan tetap (Data Tambahan Gambar 1d,e; P > 0,05). t-hCO tidak dapat digunakan, dan t-hCO juga dapat digunakan untuk keperluan lain срезов (расширенные данные, рис.1d, e; P> (nilai total 0,05). t-hCO mudah diamati, dan pengukuran t-hCO volumetrik serupa dengan yang dihitung untuk penampang tetap (data diperluas, Gambar 1d, e; P > 0,05).很容易观察到t-hCO,并且t-hCO的体积测量值与从固定切片计算的测量值相似（扩展数据图1d、e；P > 0.05）。很容易观察到t-hCO,并且t-hCO t-hCO tidak dapat digunakan, dan t-hCO dapat digunakan untuk keperluan lain срезов (расширенные данные, рис.1d, e; P> 0,05). t-hCO mudah diamati, dan pengukuran t-hCO volumetrik serupa dengan yang dihitung untuk penampang tetap (data yang diperluas, Gambar 1d, e; P > 0,05).Kami menentukan t-hCO pada 81% hewan yang ditransplantasi sekitar 2 bulan setelah transplantasi (n = 72 hewan; hCO dari 10 lini sel hiPS; lini sel hiPS dalam Tabel Tambahan 1). Dari jumlah tersebut, 87% terletak di korteks serebral (Gbr. 1c). Dengan melakukan pemindaian MRI serial pada beberapa titik waktu pada tikus yang ditransplantasi yang sama, kami menemukan peningkatan sembilan kali lipat dalam volume t-hCO dalam waktu 3 bulan (Gbr. 1d dan data yang diperluas, Gbr. 1f). Hewan yang ditransplantasi memiliki tingkat kelangsungan hidup yang tinggi (74%) pada 12 bulan pasca-transplantasi (data yang diperluas, Gbr. 1g dan Tabel Tambahan 2), dan tidak ditemukan gangguan motorik atau memori yang nyata, gliosis, atau elektroensefalogram (EEG). Data Gbr. 1g dan tabel tambahan 2). 1h–m dan 3e).
a, Skema rancangan eksperimen. hCO yang berasal dari sel hiPS ditransplantasikan ke S1 tikus telanjang yang baru lahir pada hari ke-30-60 diferensiasi. b, Gambar MRI koronal dan horizontal berbobot T2 yang menunjukkan t-hCO di S1 ​​2 bulan setelah transplantasi. Skala batang, 2 mm. c, Kuantifikasi tingkat keberhasilan pencangkokan yang ditunjukkan untuk setiap lini sel hiPS (n = 108, angka dalam batang menunjukkan jumlah t-hCO per lini sel hIPS) dan lokasi kortikal atau subkortikal (n = 88). d, Gambar MRI arteri koroner (kiri; skala batang, 3 mm) dan rekonstruksi volumetrik 3D yang sesuai (skala batang, 3 mm) yang menunjukkan peningkatan t-hCO selama 3 bulan. e, Tinjauan pola t-hCO di korteks serebral tikus. Skala batang, 1 mm. f, Gambar imunositokimia representatif t-hCO ditunjukkan dari kiri atas ke kanan (selama diferensiasi): PPP1R17 (umur 4 bulan), NeuN (umur 8 bulan), SOX9 dan GFAP (umur 8 bulan), PDGFRα; (8 bulan), MAP2 (8 bulan) dan IBA1 (8 bulan). Skala batang, 20 µm. Ko-ekspresi HNA menunjukkan sel-sel asal manusia. g, snRNA-seq: Pencitraan reduksi dimensionalitas manifold dan proyeksi terpadu (UMAP) dari semua inti t-hCO berkualitas tinggi setelah integrasi Seurat (n=3 sampel t-hCO, n=2 lini sel hiPS). Astrosit, sel-sel dari lini astrosit; cyc prog, progenitor yang bersirkulasi; GluN DL, neuron glutamatergik dalam; GluN DL/SP, neuron glutamatergik dalam dan sublamelar; GluN UL, neuron glutamatergik lapisan atas; oligodendrosit, oligodendrosit; OPC, sel progenitor oligodendrosit; RELN, neuron reelin. h, Analisis pengayaan istilah Gene Ontology (GO) dari gen yang mengalami peningkatan regulasi secara signifikan (P yang disesuaikan < 0,05, perubahan lipatan > 2, diekspresikan dalam setidaknya 10% nukleus) pada neuron glutamatergik t-hCO dibandingkan dengan neuron glutamatergik hCO. h, Analisis pengayaan istilah Gene Ontology (GO) dari gen yang mengalami peningkatan regulasi secara signifikan (P yang disesuaikan < 0,05, perubahan lipatan > 2, diekspresikan dalam setidaknya 10% nukleus) pada neuron glutamatergik t-hCO dibandingkan dengan neuron glutamatergik hCO. h, Анализ обогащения терминов Gene Ontology (GO) dan генов со значительной активацией (скорректированный P <0,05, кратность изменения > 2, экспрессия по крайней мере в 10% ядер) в глутаматергических нейронах t-hCO по сравнению с глутаматергическими tidak ada hCO. h, Analisis pengayaan istilah Gene Ontology (GO) untuk gen dengan aktivasi signifikan (P<0,05 yang disesuaikan, perubahan lipatan >2, ekspresi dalam setidaknya 10% inti) dalam neuron glutamatergik t-hCO dibandingkan dengan neuron glutamatergik hCO. h, 与 hCO 谷氨酸能神经元相比,t-hCO 谷氨酸能神经元中基因显着上调（调整后P < 0.05，倍数变化> 2, dengan 10% 的细胞核中表达）的基因本体论(GO) 术语富集分析。 h , 与 hco 谷氨酸 能 元 相比 , t-hco 谷氨酸 能 神经 元 基因 显着 上调 （后 后 p <0.05 , 变化变化> 2 , 至少 10% 的 核中 表达） 基因 基因 基因 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的的 的本体论(GO) 术语富集分析。 h, значительно aктивизировались (скорректированный P <0,05, кратность изменения> 2, экспрессируется lebih banyak uang dalam 10% lebih) dalam глутаматергических нейронах t-hCO melalui penggunaan hCO Онтологический (GO) analisis data yang diperlukan. h, gen-gen tersebut mengalami peningkatan regulasi secara signifikan (P yang disesuaikan < 0,05, perubahan lipat > 2, diekspresikan dalam setidaknya 10% nukleus) pada neuron glutamatergik t-hCO dibandingkan dengan neuron glutamatergik hCO Analisis ontologis (GO) dari istilah pengayaan.Garis putus-putus menunjukkan nilai aq sebesar 0,05. i, pencitraan UMAP jenis sel GluN dalam t-hCO menggunakan transfer label dari kumpulan data korteks motorik dewasa snRNA-seq referensi 22. CT — sel kortikotalamik, ET — sel ekstraserebral, IT — sel telensefalik internal, NP — proyeksi dekat.
Kami kemudian menilai sitoarsitektur dan komposisi seluler keseluruhan dari t-hCO. Pewarnaan antibodi sel endotel tikus menunjukkan vaskularisasi dengan t-hCO, sementara pewarnaan IBA1 menunjukkan keberadaan mikroglia tikus di seluruh cangkokan (Gbr. 1f dan data yang diperluas, Gbr. 3c,d). Pewarnaan imun menunjukkan sel positif antigen nuklir manusia (HNA) yang mengekspresikan PPP1R17 (progenitor kortikal), NeuN (neuron), SOX9 dan GFAP (sel yang berasal dari glia) atau PDGFRα (progenitor oligodendrosit) (Gambar 1f). Untuk mempelajari komposisi seluler t-hCO pada resolusi sel tunggal, kami melakukan sekuensing RNA inti tunggal (snRNA-seq) setelah sekitar 8 bulan diferensiasi. Filtrasi massal dan penghilangan inti tikus menghasilkan 21.500 peta mononuklear manusia berkualitas tinggi (Gbr. 1g dan data yang diperluas, Gbr. 4a,b). Pola ekspresi penanda tipe sel yang khas mengidentifikasi kelompok kelas sel kortikal utama, termasuk neuron glutamatergik dalam dan superfisial, progenitor yang bersirkulasi, oligodendrosit, dan garis keturunan astrosit (Gbr. 1g, data yang diperluas, Gbr. 4c, dan Tabel Tambahan 3). Imunostaining untuk SATB2 dan CTIP2 menunjukkan bahwa meskipun terdapat subtipe kortikal, t-hCO tidak menunjukkan stratifikasi anatomi yang jelas (data yang diperluas, Gbr. 3a). snRNA-seq hCO yang disesuaikan dengan stadium menghasilkan kelas sel yang secara umum serupa, dengan beberapa pengecualian, termasuk tidak adanya oligodendrosit dan adanya neuron GABAergik, yang mungkin mencerminkan kondisi in vitro yang menguntungkan yang dilaporkan sebelumnya untuk sel progenitor lateral15 (data yang diperluas, Gbr. 4f – i dan Tabel Tambahan 4). Analisis ekspresi gen diferensial mengungkapkan perbedaan signifikan pada neuron glutamatergik antara t-hCO dan hCO (Tabel Tambahan 5), termasuk aktivasi set gen yang terkait dengan pematangan neuron seperti pensinyalan sinaptik, lokalisasi dendritik, dan aktivitas saluran berpagar tegangan (Gambar 1h dan Tabel Tambahan 5). tabel 6). Dengan demikian, neuron t-hCO glutamatergik kortikal menunjukkan pematangan transkripsi yang dipercepat.
Untuk menjelaskan apakah perubahan transkripsi dalam t-hCO ini terkait dengan perbedaan morfologi antara hCO in vitro dan t-hCO in vivo, kami merekonstruksi hCO dan hCO yang diisi biocytin yang disesuaikan dengan stadium pada potongan akut setelah 7–8 bulan diferensiasi. neuron hCO (Gbr. 2a). Neuron t-hCO secara signifikan lebih besar, memiliki diameter soma 1,5 kali lebih besar, dendrit dua kali lebih banyak, dan peningkatan keseluruhan enam kali lipat dalam panjang dendritik total dibandingkan dengan hCO in vitro (Gbr. 2b). Selain itu, kami mengamati kepadatan duri dendritik yang secara signifikan lebih tinggi pada neuron t-hCO daripada pada neuron hCO (Gbr. 2c). Hal ini menunjukkan bahwa neuron t-hCO mengalami pemanjangan dan percabangan dendritik yang luas, yang, dalam kombinasi dengan proliferasi sel yang berkelanjutan, dapat berkontribusi pada pertumbuhan intensif t-hCO setelah transplantasi (Gbr. 1d dan Data yang Diperluas Gbr. 1f). Hal ini mendorong kami untuk menyelidiki sifat elektrofisiologis. Kapasitansi membran delapan kali lebih tinggi (data yang diperluas, Gambar 8d), potensial membran keadaan istirahat lebih terhiperpolarisasi (sekitar 20 mV), dan injeksi arus menginduksi laju eksitasi maksimum yang lebih tinggi pada neuron t-hCO daripada pada neuron hCO. in vitro (Gambar 2d), e), yang konsisten dengan fitur morfologi t-hCO yang lebih besar dan lebih kompleks. Selain itu, frekuensi kejadian arus postsinaptik rangsang spontan (EPSC) secara signifikan lebih tinggi pada neuron t-hCO (Gambar 2f), menunjukkan bahwa peningkatan kepadatan duri dendritik yang diamati pada neuron t-hCO dikaitkan dengan rangsangan fungsional. sinaps seksual. Kami mengonfirmasi karakter neuron hCO yang belum matang secara in vitro dengan merekam neuron glutamatergik berlabel (data yang diperluas, Gambar 6a-c).
a, rekonstruksi 3D neuron hCO dan t-hCO yang terisi biocytin setelah 8 bulan diferensiasi. b, Kuantifikasi fitur morfologi (n = 8 neuron hCO, n = 6 neuron t-hCO; **P = 0,0084, *P = 0,0179 dan ***P < 0,0001). b, Kuantifikasi fitur morfologi (n = 8 neuron hCO, n = 6 neuron t-hCO; **P = 0,0084, *P = 0,0179 dan ***P < 0,0001). б, количественная оценка морфологических признаков (n = 8 нейронов hCO, n = 6 нейронов t-hCO; ** P = 0,0084, * P = 0,0179 *** P <0,0001). b, kuantifikasi fitur morfologi (n=8 neuron hCO, n=6 neuron t-hCO; **P=0,0084, *P=0,0179, dan ***P<0,0001). b,形态学特征的量化（n = 8 个hCO 神经元,n = 6 个t-hCO 神经元；**P = 0.0084，*P = 0.0179 和***P < 0.0001）。 b,形态学特征的量化（n = 8 个hCO 神经元,n = 6 个t-hCO 神经元；**P = 0.0084，*P = 0.0179 和***P < 0.0001）。 б, количественная оценка морфологических признаков (n = 8 нейронов hCO, n = 6 нейронов t-hCO; ** P = 0,0084, * P = 0,0179 *** P <0,0001). b, kuantifikasi fitur morfologi (n=8 neuron hCO, n=6 neuron t-hCO; **P=0,0084, *P=0,0179, dan ***P<0,0001).c, rekonstruksi 3D cabang dendritik hCO dan t-hCO setelah 8 bulan diferensiasi. Tanda bintang merah menunjukkan dugaan duri dendritik. Kuantifikasi kepadatan duri dendritik (n = 8 neuron hCO, n = 6 neuron t-hCO; **P = 0,0092). d, Kuantifikasi potensial membran istirahat (n = 25 neuron hCO, n = 16 neuron t-hCO; ***P < 0,0001). d, Kuantifikasi potensial membran istirahat (n = 25 neuron hCO, n = 16 neuron t-hCO; ***P < 0,0001). d, количественная оценка мембранного потенциала покоя (n = 25 нейронов hCO, n = 16 нейронов t-hCO; *** P <0,0001). d, kuantifikasi potensial membran istirahat (n = 25 neuron hCO, n = 16 neuron t-hCO; ***P < 0,0001). d, 静息膜电位的量化（n = 25 hCO 神经元,n = 16 t-hCO 神经元；***P < 0,0001）。 d, 静息膜电位的量化（n = 25 hCO 神经元,n = 16 t-hCO 神经元；***P < 0,0001）。 d, количественная оценка мембранного потенциала покоя (n = 25 нейронов hCO, n = 16 нейронов t-hCO; *** P <0,0001). d, kuantifikasi potensial membran istirahat (n = 25 neuron hCO, n = 16 neuron t-hCO; ***P < 0,0001). e, Potensial aksi berulang yang ditembakkan pada hCO dan t-hCO disebabkan oleh peningkatan suntikan arus, dan kuantifikasi laju penembakan maksimal (n = 25 neuron hCO, n = 16 neuron t-hCO; ***P < 0,0001). e, Potensial aksi berulang yang ditembakkan pada hCO dan t-hCO disebabkan oleh peningkatan suntikan arus, dan kuantifikasi laju penembakan maksimal (n = 25 neuron hCO, n = 16 neuron t-hCO; ***P < 0,0001). e, karena penggunaan hCO dan t-hCO, jumlah yang diperlukan, dan kolik оценка максимальной скорости возбуждения (n = 25 нейронов hCO, n = 16 нейронов t-hCO; *** P <0,0001). e, aksi potensial yang menyala kembali dalam hCO dan t-hCO diinduksi oleh peningkatan arus dan kuantifikasi laju nyala maksimum (n = 25 neuron hCO, n = 16 neuron t-hCO; *** P < 0,0001). e,通过增加电流注入诱导的hCO 和t-hCO 重复动作电位放电,以及最大放电率的量化（n = 25 个hCO神经元,n = 16 个t-hCO 神经元；***P < 0,0001）。 E , 通过 增加 电流 注入 的 的 hco 和 t-hco 重复 电位 放电 , 以及 最 大 的 量化 （（n = 25 个 hco神经 , n = 16 个 t-hco 神经 ； *** p <0.0001） 。 e, kemungkinan besar HCO dan t-hCO, jumlah yang diperlukan untuk itu, dan количественная оценка максимальной скорости возбуждения (n = 25 нейронов hCO, n = 16 нейронов t-hCO; *** P <0,0001). e, penembakan berulang potensial aksi hCO dan t-hCO yang disebabkan oleh peningkatan pasokan arus dan kuantifikasi laju penembakan maksimum (n = 25 neuron hCO, n = 16 neuron t-hCO; *** P < 0,0001). f, EPSC spontan (sEPSC) dalam neuron hCO dan t-hCO pada 8 bulan diferensiasi, dan kuantifikasi frekuensi kejadian sinaptik (n = 25 neuron hCO, n = 17 neuron t-hCO; ***P < 0,0001). f, EPSC spontan (sEPSC) dalam neuron hCO dan t-hCO pada 8 bulan diferensiasi, dan kuantifikasi frekuensi kejadian sinaptik (n = 25 neuron hCO, n = 17 neuron t-hCO; ***P < 0,0001). f, memasukkan EPSC (sEPSC) ke dalam hCO dan t-hCO yang tidak terhitung jumlahnya selama 8 bulan dan berturut-turut частоты синаптических событий (n = 25 tidak ada hCO, n = 17 tidak ada t-hCO; ***P<0,0001) . f, EPSC spontan (sEPSC) dalam neuron hCO dan t-hCO pada 8 bulan diferensiasi dan kuantifikasi laju kejadian sinaptik (n=25 neuron hCO, n=17 neuron t-hCO; ***P<0,0001). f, 分化8 个月时hCO 和t-hCO 神经元中的自发性EPSCs (sEPSCs),以及突触事件频率的量化（n = 25 hCO神经元,n = 17 t-hCO 神经元；***P < 0,0001） . f, 分化8 个月时hCO 和t-hCO 神经元中的自发性EPSCs (sEPSCs),以及突触事件频率的量匼（n = 25 hCO神率的量匼（n = 25 hCO 神率的量匼（n = 25hCO P < 0,0001） . f, memasukkan EPSC (sEPSC) ke dalam hCO dan t-hCO yang tidak terhitung jumlahnya selama 8 bulan dan berturut-turut частоты синаптических событий (n = 25 tidak ada hCO, n = 17 tidak ada t-hCO; ***P<0,0001). f, EPSC spontan (sEPSC) dalam neuron hCO dan t-hCO pada 8 bulan diferensiasi dan kuantifikasi tingkat kejadian sinaptik (n = 25 neuron hCO, n = 17 neuron t-hCO; *** P<0,0001).Untuk bf, hCO dan t-hCO pada baris 1208-2 diambil dari batch diferensiasi yang sama yang dipelihara secara paralel. g, Analisis pengayaan set gen (uji pasti Fisher satu sisi) dari gen yang meningkat secara signifikan (P yang disesuaikan < 0,05, perubahan lipat > 2, diekspresikan dalam setidaknya 10% nukleus) pada neuron glutamatergik t-hCO dibandingkan dengan neuron glutamatergik hCO dengan set gen dari kedua gen yang bergantung pada aktivitas respons awal (ERG) dan respons akhir (LRG) yang diidentifikasi dari studi tikus in vivo16 dan LRG spesifik manusia dari neuron in vitro17. g, Analisis pengayaan set gen (uji pasti Fisher satu sisi) dari gen yang meningkat secara signifikan (P yang disesuaikan < 0,05, perubahan lipat > 2, diekspresikan dalam setidaknya 10% nukleus) pada neuron glutamatergik t-hCO dibandingkan dengan neuron glutamatergik hCO dengan set gen dari kedua gen yang bergantung pada aktivitas respons awal (ERG) dan respons akhir (LRG) yang diidentifikasi dari studi tikus in vivo16 dan LRG spesifik manusia dari neuron in vitro17. g, анализ обогащения набора генов (односторонний точный критерий Фишера) генов со значительной aktivitas (скорректированный P <0,05, кратность изменения > 2, экспрессия по меньшей мере в 10% ядер) в глутаматергических нейронах t-hCO untuk melakukan pekerjaan dengan baik tidak ada hCO наборы генов как раннего (ERG), так и позднего (LRG) генов, зависящих от активности, penggunaan dalam ponsel in vivo16, dan LRG yang tidak digunakan secara in vitro17. g, analisis pengayaan set gen (uji pasti Fisher satu sisi) dari gen dengan aktivasi signifikan (P<0,05 yang disesuaikan, perubahan lipat >2, ekspresi dalam setidaknya 10% inti) dalam neuron glutamatergik t-hCO dibandingkan dengan set neuron glutamatergik hCO dari kedua gen yang bergantung pada aktivitas awal (ERG) dan akhir (LRG) yang diidentifikasi pada tikus in vivo16 dan LRG spesifik manusia dari neuron in vitro17. g,t-hCO谷氨酸能神经元与hCO谷氨酸能神经元相比,t -hCO谷氨酸能神经元显着上调（调整后P<0.05，倍数变化>2,在至少10%的细胞核中表达）的基因集富集分析（单侧F isher精确检验）从体内小鼠研究中鉴定的早期反应(ERG)和晚期反应(LRG) 活性依赖性基因的基因组16 和体外神经元17 中的人类特异性LRG。 g , t-hco 谷氨酸 神经 元 与 hco 谷氨酸 神经 元 相比 , t-hco 谷氨酸 神经 元 上调 （调整 后 p <0,05 , 倍数> 2 , 至少 至少 10%的 细胞 核中 表达） 的 集富集 分析 （单侧 fisher 精确）） 体内 小鼠 研究 中 的 早期 反应 反应 反应 和 晚期 反应 反应 (lrg) 活性 基因 的 基因组 16 和LRG。 g, tidak ada tindakan yang dapat dilakukan oleh t-hCO untuk melakukan tindakan yang diperlukan untuk melakukan pekerjaan yang diperlukan tidak ada hCO (скорректированный P<0,05, кратность изменения> 2, tidak ada 10% Анализ обогащения набора генов (односторонний точный тест Фишера) раннего ответа (ERG) dan позднего гены, от активности ответа (LRG), идентифицированные в исследованиях на мышах in vivo16 dan нейронах in vitro17. LRG, layanan yang diperlukan. g, neuron glutamatergik t-hCO mengalami peningkatan yang signifikan dibandingkan dengan neuron glutamatergik hCO (P<0,05 yang disesuaikan, perubahan lipat >2, sedikitnya 10% Analisis pengayaan gen respons dini (ERG) dan respons lambat (uji pasti Fisher satu sisi) gen yang bergantung pada aktivitas respons (LRG) diidentifikasi pada tikus in vivo16 dan neuron in vitro.17 LRG spesifik manusia.Garis putus-putus menunjukkan nilai P yang dikoreksi Bonferroni sebesar 0,05. h, ekspresi gen GluN (pseudo-package dan penskalaan setiap gen) meningkat secara signifikan dalam replika snRNA-seq gen LRG pada neuron glutamatergik t-hCO. i, imunopewarnaan menunjukkan ekspresi SCG2 pada neuron t-hCO (atas) dan hCO (bawah). Panah putih menunjuk ke sel SCG2+. Skala batang, 25 µm. Data dinyatakan sebagai rata-rata ± simpangan baku.
Berdasarkan peningkatan aktivitas t-hCO yang diamati pada irisan ex vivo, snRNA-seq mengungkapkan peningkatan regulasi transkrip gen yang bergantung pada aktivitas pada t-hCO dibandingkan dengan hCO secara in vitro. Neuron t-hCO glutamatergik mengekspresikan kadar gen yang lebih tinggi yang mengatur aktivitas respons lambat (Gbr. 2g,h), yang ditemukan dalam penelitian sebelumnya pada neuron tikus dan manusia16,17. Misalnya, BDNF18, SCG2, dan OSTN, gen pengatur aktivitas khusus primata, menunjukkan peningkatan ekspresi pada neuron t-hCO dibandingkan dengan neuron hCO (Gbr. 2g-i). Dengan demikian, neuron t-hCO menunjukkan karakteristik pematangan yang ditingkatkan dibandingkan dengan neuron hCO melalui analisis transkripsi, morfologi, dan fungsional.
Untuk mengevaluasi lebih lanjut hubungan pematangan t-hCO dengan perkembangan otak manusia, kami melakukan perbandingan transkriptomik jenis sel kortikal janin dan dewasa19,20 dan dewasa21,22 serta data ekstensif tentang ekspresi gen kortikal23 selama perkembangan (data yang diperluas, Gambar 5). ). dengan pekerjaan sebelumnya24, status pematangan transkriptom hCO dan t-hCO global pada diferensiasi 7-8 bulan secara luas konsisten dengan waktu perkembangan in vivo dan paling setara dengan kehidupan janin akhir (Data yang Diperluas Gambar 5a). Khususnya, kami mengamati peningkatan kematangan transkriptom pada t-hCO dibandingkan dengan hCO yang sesuai usia, serta aktivasi transkriptom yang terkait dengan sinaptogenesis, astrogenesis, dan mielinisasi (data yang diperluas, Gambar 5b-d). Pada tingkat sel, kami menemukan bukti subtipe korteks yang lebih tipis pada t-hCO, dengan gugus neuron glutamatergik yang tumpang tindih dengan subtipe neuron L2/3, L5, dan L6 dewasa (Gambar 1i). Sebaliknya, tumpang tindih gugus antara neuron t-hCO glutamatergik dan neuron kortikal janin lebih terbatas pada pertengahan kehamilan (data yang diperluas, Gambar 5e-j). Untuk menentukan apakah neuron t-hCO secara fungsional mirip dengan neuron neokortikal pascanatal manusia, kami melakukan perekaman elektrofisiologis dan rekonstruksi anatomi neuron piramidal L2/3 manusia pada irisan tajam korteks pascanatal manusia (data yang diperluas, Gambar 7a). Sifat elektrofisiologis neuron piramidal L2/3 mirip dengan neuron piramidal t-hCO (data yang diperluas, Gambar 7e). Secara morfologis, neuron L2/3 dari sampel manusia pascanatal lebih mirip dengan t-hCO daripada dengan hCO, meskipun sel L2/3 lebih panjang, mengandung lebih banyak cabang secara keseluruhan, dan memiliki kepadatan duri yang lebih tinggi (Gambar 3g dan data yang diperluas, Gambar 7b-).G).
a, transplantasi hCO yang diproduksi oleh garis sel kontrol dan TS hiPS ke tikus neonatus. b, rekonstruksi 3D neuron t-hCO yang terisi biocytin setelah 8 bulan diferensiasi. c, kuantifikasi panjang dendritik rata-rata (n = 19 neuron kontrol, n = 21 neuron TS; **P = 0,0041). d, cabang dendritik yang direkonstruksi 3D dari kontrol dan TS t-hCO pada 8 bulan diferensiasi, dan kuantifikasi kepadatan duri dendritik (n = 16 neuron kontrol, n = 21 neuron TS, ***P < 0,0001). d, cabang dendritik yang direkonstruksi 3D dari kontrol dan TS t-hCO pada 8 bulan diferensiasi, dan kuantifikasi kepadatan duri dendritik (n = 16 neuron kontrol, n = 21 neuron TS, ***P < 0,0001). d, konektor 3D dan TS t-hCO membutuhkan waktu 8 menit dan asuransi kesehatan tambahan шипов (n = 16 контрольных нейронов, n = 21 TS нейронов, *** P <0,0001). d, rekonstruksi 3D cabang dendritik dari kontrol dan t-hCO TS pada 8 bulan diferensiasi dan kuantifikasi kepadatan duri dendritik (n=16 neuron kontrol, n=21 neuron TS, ***P<0,0001). d,分化8 个月时对照和TS t-hCO 的3D 重建树突分支，以及树突棘密度的量化（n = 16个对照神经元,n = 21 个TS 神经元,***P < 0,0001）。 d , 分化 8 个 时 对照 和 ts t-hco 的 3d 重建 分支 分支 以及 树突棘 密度 量化 （n = 16 个神经 元 , n = 21 个 ts 神经 , *** p <0.0001 ）。 d, konektor 3D dan TS t-hCO membutuhkan waktu 8 menit dan asuransi kesehatan tambahan шипов (n = 16 контрольных нейронов, n = 21 TS нейронов, *** P <0,0001). d, rekonstruksi 3D cabang dendritik kontrol dan t-hCO TS pada 8 bulan diferensiasi dan kuantifikasi kepadatan duri dendritik (n=16 neuron kontrol, n=21 neuron TS, ***P<0,0001).Tanda bintang merah menunjukkan duri dendritik yang mungkin. e, EPSC spontan pada neuron t-hCO kontrol dan TS setelah 8 bulan diferensiasi. f, plot frekuensi kumulatif dan kuantifikasi frekuensi dan amplitudo kejadian sinaptik (n=32 neuron kontrol, n=26 neuron TS; **P=0,0076 dan P=0,8102). g, analisis Scholl pada neuron TS dan kontrol pada hCO dan t-hCO. Garis putus-putus menunjukkan neuron piramida pascanatal L2/3 manusia sebagai perbandingan (n = 24 neuron t-hCO kontrol, n = 21 neuron t-hCO TS, n = 8 neuron hCO kontrol, dan n = 7 neuron hCO TS). Data dinyatakan sebagai rata-rata ± simpangan baku
Kemampuan t-hCO untuk mereplikasi fitur morfologi dan fungsional neuron korteks manusia pada tingkat tinggi mendorong kami untuk mengeksplorasi apakah t-hCO dapat digunakan untuk mendeteksi fenotipe penyakit. Kami berfokus pada TS, gangguan perkembangan saraf parah yang disebabkan oleh mutasi perolehan fungsi pada gen yang mengkode CaV1.2, yang memulai transkripsi gen yang bergantung pada aktivitas pada neuron. Kami memperoleh hCO dari tiga pasien TS yang membawa substitusi paling umum (p.G406R) dan tiga kontrol (Gbr. 3a). Setelah transplantasi, kami menemukan bahwa morfologi dendritik diubah pada neuron TS dibandingkan dengan kontrol (Gbr. 3b dan data yang diperluas, Gbr. 8a,b), dengan peningkatan dua kali lipat dalam jumlah dendrit primer dan peningkatan keseluruhan dalam rata-rata dan penurunan keseluruhan dalam panjang dendritik (Gbr. 3c dan data yang diperluas, Gbr. 8c). Hal ini dikaitkan dengan peningkatan kepadatan duri dan peningkatan frekuensi EPSC spontan pada TS dibandingkan dengan neuron kontrol (Gbr. 3d–f dan data yang diperluas, Gbr. 8g). Analisis lebih lanjut mengungkapkan pola percabangan dendritik abnormal pada TS t-hCO dibandingkan dengan kontrol, tetapi tidak pada TS hCO in vitro pada tahap diferensiasi yang sama (Gbr. 3g). Hal ini konsisten dengan laporan kami sebelumnya tentang penyusutan dendritik yang bergantung pada aktivitas pada TS dan menyoroti kemampuan platform transplantasi ini untuk mendeteksi fenotipe penyakit secara in vivo.
Kami kemudian menanyakan sejauh mana sel t-hCO terintegrasi secara fungsional ke dalam S1 tikus. S1 pada hewan pengerat menerima masukan sinaptik yang kuat dari nukleus talamus basal ventral dan posterior ipsilateral, serta korteks motorik dan somatosensori sekunder ipsilateral, dan S1 kontralateral (Gbr. 4a). Untuk memulihkan pola persarafan, kami menginfeksi hCO dengan virus rabies-dG-GFP/AAV-G dan mentransplantasikan hCO ke dalam S1 tikus 3 hari kemudian. Kami mengamati ekspresi GFP yang padat pada neuron S1 ipsilateral dan ganglia basal ventral 7–14 hari setelah transplantasi (Gbr. 4b, c). Selain itu, pewarnaan antibodi penanda talamus netrin G1 mengungkapkan adanya ujung talamus pada t-hCO (Gbr. 4d, e). Untuk mengevaluasi apakah proyeksi aferen ini dapat menimbulkan respons sinaptik pada sel t-hCO, kami melakukan perekaman sel utuh dari sel manusia pada irisan tajam lapisan talamokortikal. Stimulasi listrik S1 tikus, kapsul internal, materi putih, serat dekat t-hCO atau aktivasi optogenetik ujung talamus yang mengekspresikan opsin pada t-hCO menginduksi EPSC latensi pendek pada neuron t-hCO yang terpapar antagonis reseptor AMPA NBQX. (Gbr. 4f, g dan data tambahan, Gbr. 9a–g). Data ini menunjukkan bahwa t-hCO terintegrasi secara anatomis ke dalam otak tikus dan dapat diaktifkan oleh jaringan inang tikus.
a, Diagram skematik eksperimen pelacakan rabies. b, Ekspresi GFP dan STEM121 spesifik manusia antara t-hCO dan korteks serebral tikus (panel atas). Juga ditunjukkan ekspresi GFP dalam nukleus basal ventral (VB) ipsilateral tikus (kiri bawah) dan S1 ipsilateral (kanan bawah). Skala batang, 50 µm. Kotak merah mewakili area otak tempat gambar diambil. c, kuantifikasi sel yang mengekspresikan GFP (n = 4 tikus). d, e — Terminal talamus Netrin G1+ dalam t-hCO. d menunjukkan irisan koronal yang berisi nukleus t-hCO dan VB. Skala batang, 2 mm. e menunjukkan ekspresi Netrin G1 dan STEM121 dalam neuron t-hCO (kiri) dan VB (kanan). Skala batang, 50 µm. Garis putus-putus oranye menunjukkan batas t-hCO. f, g, Jejak neuron t-hCO saat ini setelah stimulasi listrik pada tikus S1 (f) atau kapsula interna (g), dengan (ungu) atau tanpa (hitam) NBQX (kiri). Amplitudo EPSC dengan dan tanpa NBQX (n = 6 neuron S1, *P = 0,0119; dan n = 6 neuron kapsula interna, **P = 0,0022) (tengah). Persentase neuron t-hCO yang menunjukkan EPSC sebagai respons terhadap stimulasi listrik tikus S1 (f) atau kapsula interna (g) (kanan). aCSF, cairan serebrospinal buatan. h, diagram skema eksperimen pencitraan 2P (kiri). Ekspresi GCaMP6 dalam t-hCO (tengah). Skala batang, 100 µm. Selang waktu fluoresensi GCaMP6 (kanan). i, Skor-Z fluoresensi aktivitas spontan. j, ilustrasi skema stimulasi kumis. k, lintasan fluoresensi 2P yang diberi skor z dalam satu percobaan, diselaraskan dengan deviasi kumis pada waktu nol (garis putus-putus) dalam sel contoh. l, respons skor z rata-rata populasi dari semua sel yang diselaraskan dengan deviasi kumis pada waktu nol (garis putus-putus) (merah) atau cap waktu yang dibuat secara acak (abu-abu). m. Diagram skema percobaan pada penandaan optik. n, Kurva tegangan mentah dari sel t-hCO contoh selama stimulasi laser biru atau defleksi kumis. Panah merah menunjukkan lonjakan pertama yang disebabkan oleh cahaya (atas) atau disebabkan oleh defleksi kumis (bawah). Aransemen abu-abu menunjukkan periode defleksi kumis. o, Bentuk gelombang cahaya puncak dan respons defleksi kumis. p, lonjakan dari satu kali percobaan, diselaraskan dengan deviasi kumis dalam sel contoh. 0 menunjukkan deviasi kumis (garis putus-putus). q, laju penembakan z-score rata-rata populasi untuk semua sel fotosensitif, diselaraskan dengan deviasi kumis pada waktu nol (garis putus-putus) (merah) atau stempel waktu yang dibuat secara acak (abu-abu). r, Proporsi unit fotosensitif yang dimodulasi secara signifikan oleh deviasi kumis (n = 3 tikus) (kiri). Latensi z-score puncak (n = 3 tikus; n = 5 (hijau muda), n = 4 (hijau tua), dan n = 4 (sian) unit modulasi defleksi kumis per tikus) (kanan). Data dinyatakan sebagai rata-rata ± deviasi standar
Kami kemudian bertanya apakah t-hCO dapat diaktifkan oleh rangsangan sensorik in vivo. Kami mentransplantasikan hCO yang mengekspresikan indikator kalsium yang dikodekan secara genetik GCaMP6 ke tikus S1. Setelah 150 hari, kami melakukan fotometri serat atau pencitraan kalsium dua-foton (Gbr. 4h dan data yang diperluas, Gbr. 10a). Kami menemukan bahwa sel t-hCO menunjukkan aktivitas ritmis yang disinkronkan (Gambar 4i, Data yang Diperluas, Gambar 10b dan Video Tambahan 1). Untuk mengkarakterisasi aktivitas puncak t-hCO, kami melakukan perekaman elektrofisiologi ekstraseluler pada tikus transplantasi yang dibius (data yang diperluas, Gbr. 10c-f). Kami telah menghasilkan koordinat stereotaxic dari gambar MRI; dengan demikian, unit yang direkam ini mewakili neuron manusia putatif, meskipun elektrofisiologi saja tidak memungkinkan spesies asal untuk ditentukan. Kami mengamati ledakan aktivitas yang disinkronkan (data yang diperluas, Gbr. 10d). Semburan berlangsung sekitar 460 ms dan dipisahkan oleh periode hening sekitar 2 detik (data yang diperluas, Gambar 10d, e). Unit-unit individual melepaskan rata-rata sekitar tiga putaran per semburan, yang kira-kira 73% dari unit yang terdaftar per semburan. Aktivitas unit-unit individual sangat berkorelasi, dan korelasi ini lebih tinggi daripada unit-unit yang diidentifikasi pada hewan yang tidak divaksinasi yang tercatat dalam kondisi yang sama (data yang diperluas, Gambar 10f). Untuk lebih mengkarakterisasi respons lonjakan neuron yang berasal dari manusia yang diidentifikasi, kami melakukan eksperimen penandaan cahaya pada tikus yang dibius yang ditransplantasikan dengan hCO yang mengekspresikan saluran kation peka cahaya rhodopsin 2 (hChR2), yang melaluinya neuron t-hCO pengenalan latensi pendek (kurang dari 10 ms) sebagai respons terhadap rangsangan cahaya biru (Gambar 4m–o). Neuron t-hCO menunjukkan semburan aktivitas spontan pada frekuensi yang mirip dengan yang diamati dalam pencitraan kalsium, serta rekaman elektrofisiologis yang dilakukan dalam t-hCO tanpa adanya penanda cahaya (data yang diperluas, Gambar 10c-g). Tidak ada aktivitas spontan yang diamati pada tahap hCO yang sesuai yang direkam secara in vitro. Untuk menilai apakah t-hCO dapat diaktifkan oleh rangsangan sensorik, kami secara singkat membelokkan kumis tikus menjauh dari t-hCO (Gambar 4j,m dan data yang diperluas, Gambar 10h,k). Menurut penelitian sebelumnya8,10, sebagian kecil sel t-hCO menunjukkan peningkatan aktivitas sebagai respons terhadap defleksi kumis, yang tidak diamati ketika data dibandingkan dengan cap waktu acak (Gambar 4k–q dan data yang diperluas, Gambar 10h–q). Memang, sekitar 54% unit tunggal berlabel opto menunjukkan peningkatan laju gairah secara signifikan setelah stimulasi kumis, memuncak pada sekitar 650 ms (Gambar 4r). Secara keseluruhan, data ini menunjukkan bahwa t-hCO menerima masukan fungsional yang sesuai dan dapat diaktifkan oleh rangsangan lingkungan.
Kami kemudian menyelidiki apakah t-hCO dapat mengaktifkan sirkuit pada tikus untuk mengendalikan perilaku. Pertama-tama kami menyelidiki apakah akson neuron t-hCO memproyeksikan ke jaringan sekitar tikus. Kami menginfeksi hCO dengan lentivirus yang mengkode hChR2 yang menyatu dengan EYFP (hChR2-EYFP). Setelah 110 hari, kami mengamati ekspresi EYFP di daerah kortikal ipsilateral, termasuk korteks pendengaran, motorik, dan somatosensori, serta di daerah subkortikal, termasuk striatum, hipokampus, dan talamus (Gbr. 5a). Untuk menilai apakah proyeksi eferen ini dapat menimbulkan respons sinaptik pada sel tikus, kami mengaktifkan secara optik sel t-hCO yang mengekspresikan hChR2-EYFP dengan merekam sel korteks serebral tikus di irisan otak yang tajam. Aktivasi akson t-hCO dengan cahaya biru menginduksi EPSC latensi pendek pada neuron korteks piramidal tikus, yang diblokir oleh NBQX (Gbr. 5b–g). Selain itu, respons ini dapat diblokir oleh tetrodotoxin (TTX) dan dipulihkan oleh 4-aminopiridina (4-AP), yang menunjukkan bahwa respons ini disebabkan oleh koneksi monosinaptik (Gbr. 5e).
a, Diagram skema pelacakan akson (kiri). Ekspresi t-hCO EYFP (kanan). Skala batang, 100 µm. A1, korteks pendengaran, ACC, korteks cingulate anterior, d. striatum, striatum dorsal, HPC, hipokampus; Diafragma, septum lateral, mPFC, korteks prefrontal medial, piri, korteks piriform, v. striatum, striatum ventral, VPM, nukleus ventropostomedial thalamus, VTA, daerah tegmental ventral. Kotak merah mewakili area otak tempat gambar diambil. b, Diagram skema eksperimen stimulasi. c, d, Contoh respons arus foto yang diinduksi cahaya biru (atas) dan tegangan (bawah) pada sel EYFP+ manusia (c) atau sel EYFP- tikus (d). e, f, Jejak terkini neuron tikus setelah stimulasi cahaya biru pada akson t-hCO dengan TTX dan 4-AR (hijau), TTX (abu-abu) atau aCSF (hitam) (e), dengan (ungu) atau tanpa (hitam) ) ) NBQX (e). g, latensi respons yang diinduksi oleh cahaya biru dalam sel tikus (n = 16 sel); garis horizontal menunjukkan latensi rata-rata (7,13 ms) (kiri). Amplitudo EPSC yang ditimbulkan cahaya yang direkam dengan atau tanpa NBQX (n = 7 sel; ***P < 0,0001) (tengah). Amplitudo EPSC yang ditimbulkan cahaya yang direkam dengan atau tanpa NBQX (n = 7 sel; ***P < 0,0001) (tengah). Амплитуда вызванных светом EPSC, зарегистрированных с atau без NBQX (n = 7 клеток; ***P <0,0001) (в центре). Amplitudo EPSC yang diinduksi cahaya yang direkam dengan atau tanpa NBQX (n = 7 sel; ***P < 0,0001) (tengah).使用或不使用NBQX 记录的光诱发EPSC 的振幅（n = 7 个细胞；***P < 0.0001）（中）。使用或不使用NBQX 记录的光诱发EPSC 的振幅（n = 7 个细胞；***P < 0.0001）（中）。 Амплитуда вызванных светом EPSC, зарегистрированных с atau без NBQX (n = 7 клеток; ***P <0,0001) (в центре). Amplitudo EPSC yang diinduksi cahaya yang direkam dengan atau tanpa NBQX (n = 7 sel; ***P < 0,0001) (tengah).Persentase sel tikus yang menunjukkan EPSC yang merespons cahaya biru (kanan). h, Diagram skematis tugas perilaku. d0, hari ke-0. i. Kinerja hewan contoh pada hari ke-1 (kiri) atau hari ke-15 (kanan) pelatihan. Jumlah rata-rata jilatan yang dilakukan pada hari ke-1 (kiri) atau hari ke-15 (tengah kanan) (n = 150 uji coba cahaya biru, n = 150 uji coba cahaya merah; ***P < 0,0001). Jumlah rata-rata jilatan yang dilakukan pada hari ke-1 (kiri) atau hari ke-15 (tengah kanan) (n = 150 uji coba cahaya biru, n = 150 uji coba cahaya merah; ***P < 0,0001). Среднее количество облизываний, выполненных в день 1 (слева) atau 15 (в центре справа) (n = 150 испытаний с синим светом, n = 150 испытаний с красным светом; ***P <0,0001). Jumlah rata-rata jilatan yang dilakukan pada hari ke-1 (kiri) atau hari ke-15 (tengah kanan) (n = 150 uji coba cahaya biru, n = 150 uji coba cahaya merah; ***P < 0,0001).第1 天（左）或第15 天（右中）执行的平均舔次数（n = 150 次蓝光试验,n = 150次红光试验；***P < 0,0001）。第1 天（左）或第15 天（右中）执行的平均舔次数（n = 150 次蓝光试验,n = 150次红光试验；***P < 0,001 Среднее количество облизываний, выполненных в день 1 (слева) atau 15 (в центре справа) (n = 150 испытаний с синим светом, n = 150 испытаний с красным светом; ***P <0,0001). Jumlah rata-rata jilatan yang dilakukan pada hari ke-1 (kiri) atau hari ke-15 (tengah kanan) (n = 150 uji coba cahaya biru, n = 150 uji coba cahaya merah; ***P < 0,0001).Jumlah jilatan kumulatif untuk uji coba cahaya merah dan biru pada hari ke-1 (tengah kiri) atau hari ke-15 (kanan). NS, tidak signifikan. j,k, Karakteristik perilaku semua hewan yang ditransplantasikan dengan hChR2-EYFP yang mengekspresikan t-hCO (j) atau fluorofor kontrol (k) pada hari ke-1 atau ke-15 (hChR2-EYFP: n = 9 tikus, ** P = 0,0049; kontrol: n = 9, P = 0,1497). l, Evolusi skor preferensi (n = 9 hChR2, n = 9 kontrol; **P < 0,001, ***P < 0,0001). l, Evolusi skor preferensi (n = 9 hChR2, n = 9 kontrol; **P < 0,001, ***P < 0,0001). l, Эволюция показателя предпочтения (n = 9 hChR2, n = 9 konto; **P <0,001, ***P <0,0001). l, Evolusi skor preferensi (n = 9 hChR2, n = 9 kontrol; **P < 0,001, ***P < 0,0001). l, 偏好评分的演变（n = 9 hChR2,n = 9 对照；**P < 0,001,***P < 0,0001）。 l, 偏好评分的演变（n = 9 hChR2,n = 9 对照；**P < 0,001,***P < 0,0001）。 l, Эволюция показателей предпочтения (n = 9 hChR2, n = 9 kontoлей; **P <0,001, ***P <0,0001). l, Evolusi skor preferensi (n = 9 hChR2, n = 9 kontrol; **P < 0,001, ***P < 0,0001).m, ekspresi FOS sebagai respons terhadap aktivasi optogenetik t-hCO di S1. Gambar ekspresi FOS (kiri), dan kuantifikasi (n = 3 per kelompok; *P < 0,05, **P < 0,01 dan ***P < 0,001) (kanan) ditampilkan. Gambar ekspresi FOS (kiri), dan kuantifikasi (n = 3 per kelompok; *P < 0,05, **P < 0,01 dan ***P < 0,001) (kanan) ditampilkan. Persyaratan FOS (слева) dan kapasitas определения (n = 3 на группу; * P <0,05, ** P <0,01 и *** P <0,001) (справа). Gambar ekspresi FOS (kiri) dan kuantifikasi (n = 3 per kelompok; *P<0,05, **P<0,01, dan ***P<0,001) ditampilkan (kanan).显示了FOS 表达（左）和量化（每组n = 3；*P < 0.05、**P < 0.01 和***P < 0.001）（右）的图像。显示了FOS 表达（左）和量化（每组n = 3；*P < 0.05、**P < 0.01 和***P < 0.001）（右）的图像。 Persyaratan FOS (слева) dan kapasitas определения (n = 3 на группу; * P <0,05, ** P <0,01 и *** P <0,001) (справа). Gambar ekspresi FOS (kiri) dan kuantifikasi (n = 3 per kelompok; *P<0,05, **P<0,01, dan ***P<0,001) ditampilkan (kanan).Skala batang, 100 µm. Data dinyatakan sebagai rata-rata ± kesalahan standar BLA, tonsil basolateral, MDT, nukleus talamus dorsomedial, PAG, abu-abu periaqueductal.
Akhirnya, kami bertanya apakah t-hCO dapat memodulasi perilaku tikus. Untuk mengujinya, kami mentransplantasikan hCO yang mengekspresikan hChR2-EYFP ke dalam S1, dan 90 hari kemudian, kami menanamkan serat optik ke dalam t-hCO untuk pengiriman cahaya. Kami kemudian melatih tikus dengan paradigma pengkondisian operan yang dimodifikasi (Gbr. 5h). Kami menempatkan hewan dalam ruang uji perilaku dan secara acak menerapkan rangsangan laser biru (473 nm) dan merah (635 nm) selama 5 detik. Hewan menerima hadiah air jika mereka menjilat selama rangsangan cahaya biru tetapi tidak menjilat selama rangsangan cahaya merah. Pada hari pertama pelatihan, hewan tidak menunjukkan perbedaan dalam menjilati ketika dirangsang dengan cahaya biru atau merah. Namun, pada hari ke-15, hewan yang ditransplantasikan dengan hChR2-EYFP yang mengekspresikan hCO menunjukkan menjilati lebih aktif ketika dirangsang dengan cahaya biru dibandingkan dengan rangsangan cahaya merah. Perubahan dalam perilaku menjilati ini tidak diamati pada hewan kontrol yang ditransplantasi dengan hCO yang mengekspresikan fluorofor kontrol (tingkat keberhasilan pembelajaran: hChR2 89%, EYFP 0%, Gambar 5i-1 dan Video Tambahan 2). Data ini menunjukkan bahwa sel t-hCO dapat mengaktifkan neuron tikus untuk merangsang perilaku mencari hadiah. Untuk mengetahui sirkuit saraf t-hCO tikus mana yang mungkin terlibat dalam perubahan perilaku ini, kami mengaktifkan t-hCO secara optogenetik pada hewan yang terlatih dan memanen jaringan 90 menit kemudian. Imunohistokimia mengungkapkan ekspresi protein FOS yang bergantung pada aktivitas di beberapa daerah otak yang terlibat dalam perilaku yang termotivasi, termasuk korteks prefrontal medial, talamus medial, dan materi abu-abu periaqueductal, yang diekspresikan baik pada hewan kontrol yang tidak terstimulasi atau pada hewan. beras. 5m). Secara keseluruhan, data ini menunjukkan bahwa t-hCO dapat memodulasi aktivitas saraf tikus untuk mendorong perilaku.
Organoid saraf merupakan sistem yang menjanjikan untuk mempelajari perkembangan dan penyakit manusia secara in vitro, tetapi organoid ini dibatasi oleh kurangnya hubungan antara sirkuit yang ada secara in vivo. Kami telah mengembangkan platform baru di mana kami mentransplantasikan hCO ke S1 tikus postnatal dini yang mengalami gangguan kekebalan untuk mempelajari perkembangan dan fungsi sel manusia secara in vivo. Kami telah menunjukkan bahwa t-hCO mengembangkan jenis sel dewasa yang tidak diamati secara in vitro28 dan bahwa t-hCO terintegrasi secara anatomis dan fungsional ke dalam otak hewan pengerat. Integrasi t-hCO ke dalam sirkuit saraf hewan pengerat memungkinkan kami untuk membangun hubungan antara aktivitas seluler manusia dan perilaku hewan yang dipelajari, yang menunjukkan bahwa neuron t-hCO dapat memodulasi aktivitas saraf tikus untuk mendorong respons perilaku.
Platform yang kami jelaskan memiliki beberapa keunggulan dibandingkan penelitian sebelumnya tentang transplantasi sel manusia ke otak hewan pengerat. Pertama, kami mentransplantasikan hCO ke korteks yang sedang berkembang pada tikus pascanatal awal, yang dapat memfasilitasi integrasi anatomi dan fungsional. Kedua, pemantauan MRI t-hCO memungkinkan kami untuk mempelajari posisi dan pertumbuhan cangkok pada hewan hidup, yang memungkinkan kami untuk melakukan studi multi-hewan jangka panjang dan menetapkan keandalan beberapa lini sel hiPS. Terakhir, kami mentransplantasikan organoid utuh, daripada suspensi sel tunggal yang terisolasi, yang kurang merusak sel manusia dan dapat meningkatkan integrasi dan pembentukan neuron korteks manusia di otak tikus.
Kami mengakui bahwa meskipun ada kemajuan dalam platform ini, kendala temporal, spasial, dan lintas spesies mencegah pembentukan sirkuit saraf manusia dengan kesetiaan tinggi, bahkan setelah transplantasi pada tahap awal perkembangan. Misalnya, tidak jelas apakah aktivitas spontan yang diamati dalam t-hCO mewakili fenotipe perkembangan yang mirip dengan aktivitas ritmik yang diamati selama perkembangan kortikal, atau apakah itu karena tidak adanya jenis sel penekan yang ada dalam t-hCO. Demikian pula, tidak jelas sejauh mana tidak adanya laminasi dalam t-hCO memengaruhi konektivitas rantai30. Pekerjaan di masa depan akan fokus pada pengintegrasian jenis sel lain seperti mikroglia manusia, sel endotel manusia, dan berbagai proporsi interneuron GABAergik seperti yang ditunjukkan menggunakan perakitan 6 secara in vitro, serta memahami bagaimana integrasi dan pemrosesan saraf dapat terjadi pada t-hCO yang diubah, tingkat transkripsi, sinaptik, dan perilaku dalam sel yang diperoleh dari pasien.
Secara keseluruhan, platform in vivo ini merupakan sumber daya yang kuat yang dapat melengkapi pengembangan otak manusia dan penelitian penyakit secara in vitro. Kami mengantisipasi bahwa platform ini akan memungkinkan kami menemukan fenotipe tingkat untai baru dalam sel yang berasal dari pasien yang sulit dipahami dan menguji strategi terapi baru.
Kami menghasilkan hCO2,5 dari sel HiPS seperti yang dijelaskan sebelumnya. Untuk memulai produksi hCO dari sel hiPS yang dikultur pada lapisan pengumpan, koloni utuh sel hiPS dikeluarkan dari cawan kultur menggunakan dispase (0,35 mg/mL) dan dipindahkan ke kultur plastik dengan perlekatan sangat rendah yang berisi cawan dengan medium kultur sel hiPS. (Corning) yang dilengkapi dengan dua penghambat SMAD dorsomorfin (5 μM; P5499, Sigma-Aldrich) dan SB-431542 (10 μM; 1614, Tocris) dan penghambat ROCK Y-27632 (10 μM; S1049, Selleckchem). Selama 5 hari pertama, medium sel hiPS diganti setiap hari dan dorsomorfin dan SB-431542 ditambahkan. Pada hari keenam dalam suspensi, spheroid neural dipindahkan ke medium neural yang mengandung neurobasal-A (10888, Life Technologies), suplemen B-27 tanpa vitamin A (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies), penisilin dan streptomisin (1:100, Life Technologies) dan ditambah dengan faktor pertumbuhan epidermal (EGF; 20 ng ml−1; R&D Systems) dan faktor pertumbuhan fibroblast 2 (FGF2; 20 ng ml−1; R&D Systems) hingga hari ke-24. Dari hari ke-25 hingga hari ke-42, medium ditambah dengan faktor neurotropik yang berasal dari otak (BDNF; 20 ng ml−1, Peprotech) dan neurotrofin 3 (NT3; 20 ng ml−1; Peprotech) dengan penggantian medium setiap dua hari. Pada hari keenam dalam suspensi, spheroid neural dipindahkan ke medium neural yang mengandung neurobasal-A (10888, Life Technologies), suplemen B-27 tanpa vitamin A (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies), penisilin dan streptomisin (1:100, Life Technologies) dan ditambah dengan faktor pertumbuhan epidermal (EGF; 20 ng ml−1; R&D Systems) dan faktor pertumbuhan fibroblast 2 (FGF2; 20 ng ml−1; R&D Systems) hingga hari ke-24. Dari hari ke-25 hingga hari ke-42, medium ditambah dengan faktor neurotropik yang berasal dari otak (BDNF; 20 ng ml−1, Peprotech) dan neurotrofin 3 (NT3; 20 ng ml−1; Peprotech) dengan penggantian medium setiap dua hari.Pada hari keenam dalam suspensi, spheroid saraf dipindahkan ke media saraf yang mengandung Neurobasal-A (10888, Life Technologies), suplemen B-27 tanpa vitamin A (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies), penisilin.dan стрептомицин (1:100, Life Technologies) dan эпидермальным фактором роста (EGF; 20 нг/мл; R&D Systems) dan фактором роста фибробластов 2 (FGF2; 20 orang/tahun; Sistem R&D) hingga 24 hari. dan streptomisin (1:100, Life Technologies) dan dilengkapi dengan faktor pertumbuhan epidermal (EGF; 20 ng/ml; R&D Systems) dan faktor pertumbuhan fibroblast 2 (FGF2; 20 ng/ml; R&D Systems) hingga hari ke-24.Dari hari ke-25 hingga ke-42, faktor neurotropik yang berasal dari otak (BDNF; 20 ng ml-1, Peprotech) dan neurotrofin 3 (NT3; 20 ng ml-1, Peprotech) ditambahkan ke media, mengganti media setiap dua hari.在悬浮的第6 天,将神经球体转移到含有neurobasal-A（10888,Life Technologies）、不含维生素A 的B-27 补充剂（12587,Life Teknologi）、GlutaMax（1:100，Teknologi Kehidupan）、青霉素的神经培养基中和链霉素（1:100，Kehidupan Teknologi）并辅以表皮生长因子（EGF；20 ng ml-1；Sistem R&D）和成纤维细胞生长因子2（FGF2；20 ng ml-1；R&D Sistem）直至第24 jam。在 悬浮 的 第 第 6 天 将 神经 球体 转移 含有 含有 neurobasal-a （10888 , Life Technologies） 不 含 维生素 a 的 b-27补充剂 （12587 , Life Technologies） Glutamax （1:100 , Life TechNOGIS青霉素 的 神经 培养 基 中 链霉素 （（1:100 , Life Technologies） 表皮 生长 因子 （（（20 ng ml-1 ； Sistem Litbang） 成 纤维 细胞 生长 2 （fgf2 ； 20 ng ml- 1；Sistem Litbang）直至第24天。 Pada 6-й день суспензии нейросферы были переведены на добавку, содержащую нейробазал-А (10888, Life Technologies), добавку В-27 без витамина А (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies), пенициллин- нейтрализованный стрептомицин (1:100, Life Technologies) с добавлением эпидермального фактора роста (EGF; 20 нг мл-1; Sistem Litbang) dan lainnya фибробластов 2 (FGF2; 20 ml-1) 1; Pada hari ke-6, suspensi neurosphere dialihkan ke suplemen yang mengandung neurobasal-A (10888, Life Technologies), suplemen B-27 tanpa vitamin A (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies), streptomisin yang dinetralkan dengan penisilin (1:100, Life Technologies) yang disuplemen dengan faktor pertumbuhan epidermal (EGF; 20 ng ml-1; R&D Systems) dan faktor pertumbuhan fibroblast 2 (FGF2; 20 ng ml-1) 1; Sistem R&D) selama 24 jam. Sistem R&D) hingga hari ke-24.Dari hari ke-25 hingga ke-42, faktor neurotropik yang berasal dari otak (BDNF; 20 ng ml-1, Peprotech) dan faktor neurotropik 3 (NT3; 20 ng ml-1, Peprotech) ditambahkan ke media kultur setiap dua hari. Media diganti satu kali.Dimulai dari hari ke-43, hCO dipertahankan dalam medium neurobasal-A tanpa suplemen (NM; 1088022, Thermo Fisher) dengan penggantian medium setiap 4–6 hari. Untuk memperoleh hCO dari sel hiPS yang dikultur dalam kondisi tanpa pengumpan, sel hiPS diinkubasi dengan Accutase (AT-104, Innovate Cell Technologies) pada suhu 37°C selama 7 menit, dipisahkan menjadi sel tunggal, dan ditanam pada pelat AggreWell 800 (34815, STEMCELL Technologies) pada kepadatan 3 × 106 sel tunggal per sumur dalam medium Essential 8 yang dilengkapi dengan inhibitor ROCK Y-27632 (10 μM; S1049, Selleckchem). Setelah 24 jam, media dalam sumur dipipet naik turun ke dalam media yang mengandung media Essential 6 (A1516401, Life Technologies) yang dilengkapi dengan dorsomorfin (2,5 μM; P5499, Sigma-Aldrich) dan SB-431542 (10 μM; 1614). , Tocrida). Dari hari ke-2 hingga ke-6, media Essential 6 diganti setiap hari dengan dorsomorfin dan suplemen SB-431542. Dari hari keenam, suspensi neurosphere dipindahkan ke media neurobasal dan dipertahankan seperti dijelaskan di atas.
Semua prosedur hewan dilakukan sesuai dengan pedoman perawatan hewan yang disetujui oleh Komite Administratif Perawatan Hewan Laboratorium Universitas Stanford (APLAC). Tikus RNU (rnu/+) eutimik yang hamil dibeli (Charles River Laboratories) atau dikandangkan. Hewan dipelihara dalam siklus terang-gelap 12 jam dengan makanan dan air sepuasnya. Anak tikus telanjang (FOXN1–/–) berusia tiga hingga tujuh hari diidentifikasi dengan tumbuhnya kumis yang belum dewasa sebelum pemusnahan. Anak tikus (jantan dan betina) dibius dengan isoflurana 2-3% dan ditempatkan pada kerangka stereotaxic. Trepanasi tengkorak dengan diameter sekitar 2-3 mm di atas S1 dilakukan sambil menjaga integritas dura mater. Kemudian gunakan jarum 30-G (sekitar 0,3 mm) tepat di luar kraniotomi untuk menusuk dura. Kemudian oleskan HCO ke parafilm tipis berukuran 3x3 cm dan singkirkan media yang berlebih. Bahasa Indonesia: Dengan menggunakan spuit Hamilton yang dipasang pada jarum 23 G, 45°, tarik perlahan hCO ke ujung paling distal jarum. Kemudian pasang spuit pada pompa spuit yang terhubung ke perangkat stereotaxic. Kemudian letakkan ujung jarum di atas lubang tusukan selebar 0,3 mm yang dibuat sebelumnya di dura (z = 0 mm) dan persempit spuit 1–2 mm (z = sekitar –1,5 mm) hingga jarum berada di antara dura mater A. segel yang rapat terbentuk. Kemudian naikkan spuit ke tengah permukaan kortikal pada z = -0,5 mm dan suntikkan hCO pada kecepatan 1-2 µl per menit. Setelah selesai menyuntikkan hCO, jarum ditarik kembali pada kecepatan 0,2-0,5 mm per menit, kulit dijahit, dan anak anjing segera diletakkan di atas bantal pemanas yang hangat hingga pemulihan total. Beberapa hewan ditransplantasikan secara bilateral.
Semua prosedur hewan dilakukan sesuai dengan pedoman perawatan hewan yang disetujui APLAC Universitas Stanford. Tikus (lebih dari 60 hari setelah transplantasi) diinduksi dengan anestesi isoflurana 5% dan dibius dengan isoflurana 1-3% selama pencitraan. Untuk visualisasi, pemindai lubang bor horizontal berpelindung aktif 7 Tesla Bruker (Bruker Corp.) dengan penggerak gradien International Electric Company (IECO), sisipan gradien berpelindung dengan diameter internal 120 mm (600 mT/m, 1000 T/m/s) digunakan menggunakan AVANCE. III, kapabilitas RF multi-kumparan delapan saluran dan multi-inti, dan platform Paravision 6.0.1 yang menyertainya. Perekaman dilakukan menggunakan kumparan RF volumetrik yang dipisahkan secara aktif dengan diameter internal 86 mm dan kumparan RF berpendingin krio empat saluran untuk penerimaan saja. Axial 2D Turbo-RARE (waktu pengulangan = 2500 ms, waktu gema = 33 ms, 2 rata-rata) dengan 16 tangkapan irisan, ketebalan irisan 0,6–0,8 mm, berisi 256 × 256 sampel. Sinyal diterima menggunakan kumparan RF volumetrik transceiver kuadratur dengan diameter internal 2 cm (Rapid MR International, LLC). Terakhir, gunakan fungsi estimasi permukaan Imaris (BitPlane) bawaan untuk rendering 3D dan analisis volume. Transplantasi yang berhasil didefinisikan sebagai transplantasi yang menghasilkan area sinyal MRI berbobot T2 kontinu di hemisfer yang ditransplantasi. Penolakan cangkok didefinisikan sebagai cangkok yang tidak menghasilkan area sinyal MRI berbobot T2 kontinu di hemisfer yang ditransplantasi. T-hCO subkortikal dikeluarkan dari analisis selanjutnya.
Untuk mengekspresikan GCaMP6s secara stabil dalam hCO untuk pencitraan kalsium dua-foton, sel hiPS diinfeksi dengan pLV[Exp]-EF1a::GcaMP6s-WPRE-Puro diikuti dengan pemilihan antibiotik. Secara singkat, sel dipisahkan dengan EDTA dan disuspensikan dalam 1 ml medium Essential 8 pada kepadatan sekitar 300.000 sel dengan adanya polibrena (5 μg/ml) dan 15 μl virus. Sel-sel tersebut kemudian diinkubasi dalam suspensi selama 60 menit dan disemai pada kepadatan 50.000 sel per sumur. Setelah konfluensi, sel-sel diobati dengan 5-10 μg ml-1 puromisin selama 5-10 hari atau sampai koloni yang stabil muncul. Infeksi hCO akut dilakukan seperti yang dijelaskan sebelumnya5 dengan beberapa modifikasi. Singkatnya, pindahkan hCO hari ke-30-45 ke dalam tabung mikrosentrifus Eppendorf 1,5 ml yang berisi 100 µl medium saraf. Kemudian sekitar 90 µl medium dikeluarkan, 3-6 µl lentivirus titer tinggi (dari 0,5 x 108 hingga 1,2 x 109) ditambahkan ke tabung, dan hCO dipindahkan ke inkubator selama 30 menit. Kemudian tambahkan 90–100 µl medium ke setiap tabung dan kembalikan tabung ke inkubator semalaman. Keesokan harinya, pindahkan hCO ke medium saraf baru di pelat perlekatan rendah. Setelah 7 hari, hCO dipindahkan ke pelat dasar kaca 24-sumur untuk visualisasi dan evaluasi kualitas infeksi. pLV[Exp]-SYN1::EYFP-WPRE dan pLV[Exp]-SYN1::hChR2-EYFP-WPRE dibuat oleh VectorBuilder. Lentivirus digunakan dalam sebagian besar percobaan karena virus ini terintegrasi ke dalam genom inang, yang memungkinkan ekspresi gen pelapor dalam lini sel yang terinfeksi. Untuk tindak lanjut rabies, hCO hari ke-30-45 diinfeksi bersama dengan rabies-ΔG-eGFP dan AAV-DJ-EF1a-CVS-G-WPRE-pGHpA (plasmid #67528, Addgene), dicuci bersih selama 3 hari, dan ditransplantasikan ke tikus dalam S1 dan dipelihara secara in vivo selama 7-14 hari.
Untuk imunositokimia, hewan dibius dan diperfusi transkardial dengan PBS diikuti oleh 4% paraformaldehida (PFA dalam PBS; Electron Microscopy Sciences). Otak difiksasi dalam 4% PFA selama 2 jam atau semalam pada suhu 4°C, dikriopreservasi dalam 30% sukrosa dalam PBS selama 48-72 jam, dan ditanamkan dalam 1:1, 30% sukrosa: OCT (Tissue-Tek OCT Compound 4583, Sakura Finetek) dan irisan koronal dibuat pada 30 µm menggunakan kriostat (Leica). Untuk imunohistokimia irisan tebal, hewan diperfusi dengan PBS, dan otak dibedah dan dipotong secara koronal pada 300–400 µm menggunakan vibratom (Leica) dan irisan tersebut difiksasi dengan 4% PFA selama 30 menit. Kemudian kriosiseksi atau irisan tebal dicuci dengan PBS, diblokir selama 1 jam pada suhu ruangan (10% serum keledai normal (NDS) dan 0,3% Triton X-100 diencerkan dalam PBS) dan diblokir dengan larutan pemblokiran pada suhu 4 °C. – Inkubasi Krioseksi diinkubasi semalaman dan irisan tebal diinkubasi selama 5 hari. Antibodi primer yang digunakan adalah: anti-NeuN (tikus, 1:500; ab104224, abcam) anti-CTIP2 (tikus, 1:300; ab18465, abcam), anti-GFAP (kelinci, 1:1.000; Z0334, Dako), anti-GFP (ayam, 1:1.000; GTX13970, GeneTex), anti-HNA (tikus, 1:200; ab191181, abcam), anti-NeuN (kelinci, 1:500; ABN78, Millipore), anti-PDGFRA (kelinci, 1:200; sc-338, Santa Cruz), anti-PPP1R17 (kelinci, 1:200; HPA047819, Atlas Antibodies), anti-RECA-1 (tikus, 1:50; ab9774, abcam), anti-SCG2 (kelinci, 1:100; 20357-1-AP, Proteintech), anti-SOX9 (kambing, 1:500; AF3075, R&D Systems), Netrin G1a (kambing, 1:100; AF1166, R&D Systems), anti-STEM121 (tikus, 1:200; Y40410, Takara Bio), anti-SATB2 (tikus, 1:50; ab51502, abcam), anti-GAD65/67 (kelinci, 1:400; ABN904, Millipore) dan anti-IBA1 (kambing, 1:100; ab5076, abcam). Antibodi primer yang digunakan adalah: anti-NeuN (tikus, 1:500; ab104224, abcam) anti-CTIP2 (tikus, 1:300; ab18465, abcam), anti-GFAP (kelinci, 1:1.000; Z0334, Dako), anti-GFP (ayam, 1:1.000; GTX13970, GeneTex), anti-HNA (tikus, 1:200; ab191181, abcam), anti-NeuN (kelinci, 1:500; ABN78, Millipore), anti-PDGFRA (kelinci, 1:200; sc-338, Santa Cruz), anti-PPP1R17 (kelinci, 1:200; HPA047819, Atlas Antibodies), anti-RECA-1 (tikus, 1:50; ab9774, abcam), anti-SCG2 (kelinci, 1:100; 20357-1-AP, Proteintech), anti-SOX9 (kambing, 1:500; AF3075, R&D Systems), Netrin G1a (kambing, 1:100; AF1166, R&D Systems), anti-STEM121 (tikus, 1:200; Y40410, Takara Bio), anti-SATB2 (tikus, 1:50; ab51502, abcam), anti-GAD65/67 (kelinci, 1:400; ABN904, Millipore) dan anti-IBA1 (kambing, 1 :100; ab5076, abcam). анти-NeuN (мышиные, 1:500; ab104224, abcam), анти-CTIP2 (крысиные, 1:300; ab18465, abcam), dan-GFAP (кроличьи, 1:1000; Z0334, Dako), dan- -GFP (курица, 1:1000; GTX13970, GeneTex), анти-HNA (мышь, 1:200; ab191181, abcam), анти-NeuN (кролик, 1:500; ABN78, Millipore), анти-PDGFRA (кролик, 1:200; sc-338, Санта-Круз), анти-PPP1R17 (кролик, 1:200; HPA047819, Atlas Antibodi), анти-RECA-1 (мышь, 1:50; ab9774, abcam), анти-SCG2 (кролик , 1:100; 20357-1-AP, Proteintech), анти-SOX9 (козий, 1:500; AF3075, R&D Systems), нетрин G1a (козий, 1:100; AF1166, Sistem R&D), анти-STEM121 (мышиный , 1:200; Y40410, Takara Bio), анти-SATB2 (мышь, 1:50; ab51502, abcam), анти-GAD65/67 (кролик, 1:400; ABN904, Millipore) dan анти-IBA1 (коза, 1 :100; аб5076, абкам). Antibodi primer yang digunakan adalah: anti-NeuN (tikus, 1:500; ab104224, abcam), anti-CTIP2 (tikus, 1:300; ab18465, abcam), anti-GFAP (kelinci, 1:1000; Z0334, Dako), anti-GFP (ayam, 1:1000; GTX13970, GeneTex), anti-HNA (tikus, 1:200; ab191181, abcam), anti-NeuN (kelinci, 1:500; ABN78, Millipore), anti-PDGFRA (kelinci, 1:200; sc-338, Santa Cruz), anti-PPP1R17 (kelinci, 1:200; HPA047819, Atlas Antibodies), anti-RECA-1 (tikus, 1:50; ab9774, abcam), anti-SCG2 (kelinci, 1:100; 20357-1-AP, Proteintech), anti-SOX9 (kambing, 1:500; AF3075, R&D Systems), netrin G1a (kambing, 1:100; AF1166, R&D Systems), anti-STEM121 (tikus, 1:200; Y40410, Takara Bio), anti-SATB2 (tikus, 1:50; ab51502, abcam), anti-GAD65/67 (kelinci, 1:400; ABN904, Millipore) dan anti-IBA1 (kambing, 1:100; ab5076, abkam).使用的一抗是：抗NeuN（小鼠,1:500；ab104224,abcam）抗CTIP2（大鼠,1:3 00；ab18465,abcam）,抗GFAP（兔,1:1,000；Z0334,Dako）,抗-GF P（鸡，1:1,000；GTX13970，GeneTex），抗HNA（小鼠，1:200；ab191181，abcam），抗NeuN（兔,1:500；ABN78，Millipore），抗PDGFRA（兔， 1:200；sc-338，Santa Cruz），抗PPP1R17（兔，1:200；HPA047819，Atlas , RECA-1 , 1:50 , ab9774 , abcam , SCG2 , 1:100；20357-1-AP，Proteintech），抗SOX9（山羊，1:500；AF3075，Sistem Litbang），Netrin G1a（山羊，1:100；AF1166，Sistem Litbang），抗STEM121（小鼠, 1:200;使用的一抗是：抗NeuN（小鼠,1:500；ab104224,abcam）抗CTIP2（大鼠,1 :300；ab18465,abcam）,抗GFAP（兔,1:1,000；Z0334,Dako）,抗-GFP（鸡，1:1,000；GTX13970，GeneTex），抗HNA（小鼠，1:200；ab191181，abcam），抗NeuN（兔,1:500；ABN78，Millipore％弔，抗1: 200；sc-338，Santa Cruz），抗PPP1R17（兔，1:200；HPA047819，Atlas 抗体），抗RECA-1（小鼠，1:50；ab9774，abcam），抗SCG2 100；20357-1-AP，Proteintech），抗SOX9（山羊，1:500；AF3075，Sistem Litbang），Netrin G1a（山羊，1:100；AF1166，Sistem Litbang）頏1:20, Bahasa Indonesia:Y40410, Takara Bio), anti-SATB2 (tikus, 1:50; ab51502, abcam), anti-GAD65/67 (kelinci, 1:400; ABN904, Millipore) dan anti-IBA1 (kambing, 1:100; ab5076, abcam)。Antibodi primer yang digunakan adalah: anti-NeuN (tikus, 1:500; ab104224, abcam), anti-CTIP2 (tikus, 1:300; ab18465, abcam), anti-GFAP (kelinci, 1:1000; Z0334, Dako). , anti-GFP (ayam, 1:1000; GTX13970, GeneTex), anti-HNA (tikus, 1:200; ab191181, abcam), anti-NeuN (kelinci, 1:500; ABN78, Millipore), anti-PDGFRA (kelinci, 1:200; sc-338, Santa Cruz), anti-PPP1R17 (kelinci, 1:200; HPA047819, antibodi Atlas), anti-RECA-1 (tikus, 1:50; ab9774, abcam), anti-SCG2 (kelinci), 1:100;20357-1-AP, Proteintech), анти-SOX9 (коза, 1:500; AF3075, Sistem R&D), Нетрин G1a (коза, 1:100; AF1166, Sistem R&D), dan -STEM121 (мышь, 1:200; Y40410, Takara Bio), анти-SATB2 (мышь, 1:50; ab51502, abcam), анти-GAD65/67 (кролик, 1:400; ABN904, Millipore) dan анти-IBA1 (коза, 1:100; аб5076, абкам). 20357-1-AP, Proteintech), anti-SOX9 (kambing, 1:500; AF3075, R&D Systems), Netrin G1a (kambing, 1:100; AF1166, R&D Systems), anti-STEM121 (tikus, 1:200; Y40410, Takara Bio), anti-SATB2 (tikus, 1:50; ab51502, abcam), anti-GAD65/67 (kelinci, 1:400; ABN904, Millipore), dan anti-IBA1 (kambing, 1:100; ab5076, abkam).Potongan-potongan tersebut kemudian dicuci dengan PBS dan diinkubasi dengan antibodi sekunder selama 1 jam pada suhu ruangan (potongan beku) atau semalaman pada suhu 4°C (potongan tebal). Antibodi sekunder Alexa Fluor (Life Technologies) yang diencerkan 1:1000 dalam larutan pemblokiran digunakan. Setelah dicuci dengan PBS, nukleus divisualisasikan dengan Hoechst 33258 (Life Technologies). Akhirnya, slide diletakkan pada mikroskop dengan penutup kaca (Fisher Scientific) menggunakan Aquamount (Polysciences) dan dianalisis pada mikroskop fluoresensi Keyence (penganalisis BZ-X) atau mikroskop confocal Leica TCS SP8 (Las-X) pada gambar. Gambar-gambar tersebut diproses menggunakan program ImageJ (Fiji). Untuk mengukur proporsi neuron manusia dalam t-hCO dan korteks tikus, gambar persegi panjang selebar 387,5 μm diambil di bagian tengah t-hCO, di atau dekat tepi korteks tikus. Batas cangkok ditentukan dengan menilai perubahan transparansi jaringan, inti HNA+, dan/atau keberadaan autofluoresensi jaringan. Pada setiap gambar, jumlah total sel NeuN+ dan HNA+ dibagi dengan jumlah total sel NeuN+ di area yang sama. Untuk memastikan bahwa hanya sel dengan inti pada bidang gambar yang dihitung, hanya sel yang juga Hoechst+ yang disertakan dalam perhitungan. Dua gambar yang dipisahkan oleh setidaknya 1 mm dirata-ratakan untuk mengurangi kesalahan statistik.
Seminggu sebelum pengambilan sampel, tempatkan hewan transplantasi hCO (sekitar 8 bulan diferensiasi) di ruangan gelap dengan kumis dipangkas untuk meminimalkan rangsangan sensorik. Isolasi nukleus dilakukan seperti yang dijelaskan sebelumnya, dengan beberapa modifikasi. Secara singkat, t-hCO dan hCO dihancurkan menggunakan lisis sel mekanis-deterjen dan penggiling jaringan kaca 2 ml (D8938, Sigma-Aldrich/KIMBLE). Nukleus kasar kemudian disaring menggunakan filter 40 µm dan disentrifugasi pada 320 g selama 10 menit pada suhu 4 °C sebelum melakukan gradien densitas sukrosa. Setelah langkah sentrifugasi (320 g selama 20 menit pada suhu 4°C), sampel disuspensikan kembali dalam 0,04% BSA/PBS dengan penambahan 0,2 unit inhibitor RNase µl-1 (40 u µl-1, AM2682, Ambion) dan dilewatkan melalui filter aliran 40 µm. Inti yang terdisosiasi kemudian disuspensikan kembali dalam PBS yang mengandung 0,02% BSA dan dimuat ke dalam chip Chromium Single Cell 3′ (perkiraan pemulihan 8.000 sel per jalur). Pustaka snRNA-seq disiapkan dengan Chromium Single cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics). Pustaka snRNA-seq disiapkan dengan Chromium Single cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics). Aplikasi snRNA-seq digunakan oleh Chromium Single cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics). Pustaka snRNA-seq disiapkan menggunakan Chromium Single cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics). snRNA-seq 文库是使用Chromium Single cell 3′ GEM、Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics) 制备的。 snRNA-seq 文库是使用Chromium Single cell 3′ GEM、Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics) 制备的。 Unduh snRNA-seq dengan menggunakan Chromium Single Cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics). Pustaka snRNA-seq disiapkan menggunakan Chromium Single Cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics).Pustaka dari sampel yang berbeda dikumpulkan dan diurutkan oleh Admera Health pada NovaSeq S4 (Illumina).
Tingkat ekspresi gen untuk setiap kode batang nuklir yang diduga diukur menggunakan paket perangkat lunak analisis 10x Genomics CellRanger (versi 6.1.2). Secara khusus, pembacaan tersebut dicocokkan dengan kombinasi genom referensi manusia (GRCh38, Ensemble, versi 98) dan tikus (Rnor_6.0, Ensemble, versi 100) yang dibuat dengan perintah mkref dan menggunakan count dengan perintah –include-introns=TRUE untuk mengukur pembacaan yang dipetakan ke daerah intron. Untuk sampel t-hCO, inti manusia diidentifikasi berdasarkan persyaratan konservatif bahwa setidaknya 95% dari semua pembacaan yang dipetakan cocok dengan genom manusia. Semua analisis selanjutnya dilakukan pada array kode batang yang difilter yang dikeluarkan dari CellRanger menggunakan paket R (versi 4.1.2) Seurat (versi 4.1.1)32.
Untuk memastikan bahwa hanya inti berkualitas tinggi yang disertakan dalam analisis selanjutnya, proses penyaringan berulang diterapkan untuk setiap sampel. Pertama, inti berkualitas rendah dengan kurang dari 1000 gen unik yang ditemukan dan lebih dari 20% dari total mitokondria diidentifikasi dan dihilangkan. Selanjutnya, matriks nomor gen mentah dinormalisasi dengan regresi binomial negatif yang diregulasi menggunakan fungsi sctransform(vst.flavor=”v2″), yang juga mengidentifikasi 3000 gen yang paling bervariasi menggunakan parameter default. Reduksi dimensi dilakukan pada gen variabel atas menggunakan Principal Component Analysis (PCA) dengan parameter default menggunakan dimensi set data 30 (dims = 30 dipilih berdasarkan inspeksi visual pada lokasi lutut dan digunakan untuk semua sampel dan analisis ensemble). Kami kemudian melakukan beberapa putaran pengelompokan iteratif (resolusi = 1) untuk mengklasifikasikan gen berdasarkan jumlah gen yang sangat rendah (median di bawah persentil ke-10), jumlah gen mitokondria yang sangat tinggi (median di atas persentil ke-95) untuk mengidentifikasi dan menghilangkan sel-sel yang diduga berkualitas rendah. klaster dan/atau proporsi tinggi kembar yang diduga diidentifikasi menggunakan paket DoubletFinder33 (skor DoubletFinder rata-rata di atas persentil ke-95). Sampel t-hCO (n=3) dan sampel hCO (n=3) diintegrasikan secara terpisah menggunakan fungsi IntegrateData dengan parameter di atas. Kemudian, putaran penyaringan kualitatif lain dari kumpulan data terintegrasi dilakukan seperti dijelaskan di atas.
Setelah membuang kernel berkualitas rendah, set data terintegrasi dikelompokkan (resolusi = 0,5) dan disematkan untuk tujuan visualisasi UMAP34. Gen penanda untuk setiap klaster ditentukan menggunakan fungsi FindMarkers dengan parameter default yang dihitung dari data ekspresi gen yang dinormalisasi. Kami mengidentifikasi dan mengklasifikasikan kelas sel utama dengan menggabungkan set data referensi kortikal janin dan dewasa dengan ekspresi gen penanda 19,20,21,35 dan anotasi. Secara khusus, prekursor yang bersirkulasi diidentifikasi oleh ekspresi MKI67 dan TOP2A. Klaster progenitor didefinisikan oleh tidak adanya transkrip mitosis, tumpang tindih tinggi dengan klaster progenitor glia multipotensi yang dijelaskan dalam korteks janin metafase akhir, dan ekspresi EGFR dan OLIG1. Kami menggunakan istilah astrosit untuk mencakup beberapa keadaan diferensiasi astrosit, dari glia radial akhir hingga pematangan astrosit. Gugusan astrosit mengekspresikan kadar tinggi SLC1A3 dan AQP4 dan telah terbukti memetakan dengan subtipe glia radial janin dan/atau astrosit dewasa. OPC mengekspresikan PDGFRA dan SOX10 sementara oligodendrosit mengekspresikan penanda mielinisasi (MOG dan MYRF). Neuron glutamatergik diidentifikasi dengan adanya transkrip neuronal (SYT1 dan SNAP25), tidak adanya penanda GABAergik (GAD2), dan ekspresi NEUROD6, SLC17A7, BCL11B, atau SATB2. Neuron GluN selanjutnya dibagi menjadi subkelas atas (ekspresi SATB2 dan hilangnya BCL11B) dan dalam (ekspresi BCL11B). Neuron subplate (SP) putatif mengekspresikan penanda SP18 yang diketahui seperti ST18 dan SORCS1 selain penanda GluN dalam. Sel-sel mirip pleksus koroid diidentifikasi melalui ekspresi TTR, dan sel-sel mirip meningeal mengekspresikan gen-gen yang berkaitan dengan fibroblas dan memetakan sel-sel pial/vaskular dari kumpulan data referensi.
Analisis diferensial ekspresi gen antara subkelas t-hCO dan hCO dilakukan menggunakan metode pseudo-batch yang baru dikembangkan yang direproduksi dalam sampel yang diimplementasikan menggunakan paket Libra R (versi 1.0.0). Secara khusus, uji log-likelihood edgeR (versi 3.36.0, paket R) dilakukan untuk kelompok dengan menjumlahkan jumlah gen dalam sel untuk kelas sel tertentu untuk setiap replikasi sampel. Untuk visualisasi peta panas, nilai-nilai yang dinormalisasi per juta (CPM) dihitung menggunakan edgeR (fungsi cpm()) dan diskalakan (untuk mencapai mean = 0, simpangan baku = 1). Analisis pengayaan Gene Ontology (GO) dari gen-gen GluN t-hCO yang meningkat secara signifikan dilakukan (nilai P yang dikoreksi Benjamini-Hochberg kurang dari 0,05 yang diekspresikan dalam setidaknya 10% sel GluN t-hCO dan peningkatan lipat dalam perubahan setidaknya 2 kali lipat). dilakukan menggunakan ToppGene Suite (https://toppgene.cchmc.org/)37. Kami menggunakan aplikasi ToppFun dengan parameter default dan melaporkan nilai-P yang dikoreksi Benjamini-Hochberg yang dihitung dari uji hipergeometrik beranotasi GO.
Untuk mencocokkan klaster snRNA-seq kami dengan klaster sel beranotasi dari studi referensi RNA-seq sel tunggal primer atau snRNA-seq dewasa19,20,21,22, kami menerapkan pendekatan integrasi himpunan data berpasangan. Kami menggunakan alur kerja normalisasi SCTransform (v2) di Seurat untuk mengintegrasikan dan membandingkan tumpang tindih klaster antara himpunan data (menggunakan parameter yang sama seperti di atas). Himpunan data individual dibagi secara acak hingga 500 sel atau inti per klaster asli untuk efisiensi komputasi. Dengan menggunakan pendekatan serupa seperti yang dijelaskan sebelumnya, tumpang tindih klaster didefinisikan sebagai proporsi sel atau inti di setiap klaster gabungan yang tumpang tindih dengan label klaster referensi. Untuk mengklasifikasikan GluN lebih lanjut, kami menggunakan alur kerja TransferData Seurat untuk data subhimpunan GluN guna menetapkan label himpunan data referensi ke sel GluN kami.
Untuk menilai status pematangan transkriptom global sampel t-hCO dan hCO, kami membandingkan sampel pseudo-massal kami dengan BrainSpan/psychENCODE23, yang terdiri dari sekuens RNA besar yang mencakup perkembangan otak manusia. Kami melakukan PCA pada matriks ekspresi gen gabungan yang dinormalisasi pola dari sampel kortikal 10 minggu setelah pembuahan dan setelahnya, pada 5567 gen (bersama dengan data kami) yang sebelumnya diidentifikasi sebagai aktif dalam sampel kortikal BrainSpan (didefinisikan sebagai lebih dari 50% dalam varians perkembangan yang dijelaskan oleh usia menggunakan model kubik)38. Selain itu, kami memperoleh gen yang terkait dengan tanda tangan transkriptom utama dari perkembangan saraf menggunakan faktorisasi matriks non-negatif seperti yang dijelaskan sebelumnya. Bobot sampel yang dihitung menggunakan prosedur faktorisasi matriks non-negatif diplot dalam Gambar 5b dengan data yang diperluas untuk masing-masing dari lima tanda tangan yang dijelaskan oleh Zhu et al.38. Sekali lagi, penanda transkripsi yang bergantung pada aktivitas diperoleh dari penelitian yang diterbitkan sebelumnya. Secara khusus, ERG dan LRG mengalami peningkatan regulasi yang signifikan pada neuron glutamatergik yang diidentifikasi oleh koleksi snRNA-seq korteks visual tikus setelah stimulasi visual dari Tabel Tambahan 3 Hrvatin et al.16. LRG yang diperkaya manusia diperoleh dari kultur otak janin manusia yang diaktivasi KCl dan dipanen 6 jam pasca-stimulasi, dan gen yang difilter mengalami peningkatan regulasi yang signifikan pada manusia tetapi tidak pada hewan pengerat (Tabel Tambahan 4). Analisis pengayaan set gen menggunakan set gen ini dilakukan menggunakan uji eksak Fisher satu arah.
Anestesi tikus dengan isoflurana, keluarkan otak dan tempatkan dalam larutan sukrosa dingin (sekitar 4°C) yang mengandung oksigen (95% O2 dan 5% CO2) untuk irisan yang mengandung: 234 mM sukrosa, 11 mM glukosa, 26 mM NaHCO3, 2,5 mM KCl, 1,25 mM NaH2PO4, 10 mM MgSO4 dan 0,5 mM CaCl2 (sekitar 310 mOsm). Irisan koronal otak tikus (300–400 µm) yang mengandung t-hCO dibuat menggunakan vibratom Leica VT1200 seperti yang dijelaskan sebelumnya39. Potongan-potongan tersebut kemudian dipindahkan ke ruang pemotongan dengan oksigenasi suhu ruangan berkelanjutan yang berisi aCSF yang dibuat dari: glukosa 10 mM, NaHCO3 26 mM, KCl 2,5 mM, NaHPO4 1,25 mM, MgSO4 1 mM, CaCl2 2 mM, dan NaCl 126 mM (298 mOsm). setidaknya 45 menit sebelum perekaman. Potongan-potongan tersebut direkam dalam ruang yang terendam di mana potongan-potongan tersebut terus-menerus diperfusi dengan aCSF (vial O2 95% dan CO2 5%). Semua data direkam pada suhu ruangan. Neuron t-hCO diakhiri dengan pipet kaca borosilikat yang diisi dengan larutan yang mengandung 127 mM kalium glukonat, 8 mM NaCl, 4 mM magnesium ATP, 0,3 mM natrium GTP, 10 mM HEPES, dan 0,6 mM EGTA, pH 7,2, larutan internal disesuaikan dengan KOH (290 mOsm). Untuk pemulihan, biocytin (0,2%) ditambahkan ke larutan perekaman.
Data diperoleh menggunakan amplifier MultiClamp 700B (Molecular Devices) dan digitizer Digidata 1550B (Molecular Devices), disaring dengan low-pass pada 2 kHz, didigitalkan pada 20 kHz, dan dianalisis menggunakan Clampfit (Molecular Devices), Origin (OriginPro). 2021b, OriginLab). dan fungsi MATLAB khusus (Mathworks). Potensial sambungan dihitung menggunakan JPCalc dan entri disesuaikan dengan nilai terhitung -14 mV. Operasi IV terdiri dari serangkaian langkah arus dalam langkah 10-25 pA, dari -250 hingga 750 pA.
Thalamus, materi putih, dan aferen S1 dirangsang secara elektrik dalam irisan talamokortikal selama perekaman patch-clamp neuron hCO, seperti yang dijelaskan sebelumnya. Secara singkat, otak diletakkan di atas meja cetak 3D yang dimiringkan pada sudut 10°, dan bagian depan otak dipotong pada sudut 35°. Otak kemudian direkatkan ke permukaan yang dipotong dan dipotong, dengan mempertahankan akson talamokortikal yang menonjol. Elektroda tungsten bipolar (0,5 MΩ) dipasang pada mikromanipulator kedua dan diposisikan secara strategis untuk menstimulasi empat wilayah per sel (kapsul bagian dalam, materi putih, S1, dan hCO). Rekam respons sinaptik setelah stimulasi fasik 300 µA pada 0,03–0,1 Hz.
Neuron hCO yang mengekspresikan hChR2 diaktifkan pada 480 nm dan pulsa cahaya yang dihasilkan oleh LED (Prizmatix) diaplikasikan melalui objektif ×40 (0,9 NA; Olympus) untuk merekam ekspresi hChR2 di dekat sel. Diameter medan iluminasi sekitar 0,5 mm dan daya totalnya 10-20 mW. Lebar pulsa ditetapkan menjadi 10 ms, yang sesuai dengan pulsa yang diberikan selama percobaan pembelajaran perilaku. Berbagai frekuensi stimulasi digunakan, dari 1 hingga 20 Hz, tetapi hanya pulsa pertama dari rangkaian yang digunakan untuk kuantifikasi. Interval antara rangkaian biasanya lebih panjang dari 30 detik untuk meminimalkan efek pada jalur penghambat atau pemfasilitasan sinaptik. Untuk menguji apakah respons hChR2 bersifat monosinaptik, kami menerapkan TTX (1 μM) ke dalam rendaman hingga reaksi EPSC menghilang, dan kemudian menerapkan 4-aminopiridina (4-AP; 100 μM). Biasanya, respons diberikan dalam beberapa menit, dengan penundaan yang sedikit lebih lama antara penyalaan LED dan pembentukan EPSC. NBQX (10 μM) digunakan untuk menguji apakah respons tersebut didorong oleh reseptor AMPA.
Potongan hCO tajam dibuat seperti yang dijelaskan sebelumnya. Secara singkat, potongan hCO dibenamkan dalam agarosa 4% dan dipindahkan ke sel yang mengandung 126 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM NaH2PO4, 1 mM MgSO4, 2 mM CaCl2, 26 mM NaHCO3, dan 10 mM d-(+) -glukosa. Potongan dipotong pada 200–300 µm pada suhu ruangan menggunakan vibrator Leica VT1200 dan disimpan dalam ASF pada suhu ruangan. Kemudian, perekaman patch-camp dari seluruh sel dilakukan pada potongan hCO di bawah mikroskop SliceScope langsung (Scientifica). Potongan diperfusi dengan aCSF (95% O2 dan 5% CO2) dan sinyal sel direkam pada suhu ruangan. Neuron hCO diaplikasikan menggunakan pipet kaca borosilikat yang diisi dengan larutan yang mengandung 127 mM kalium glukonat, 8 mM NaCl, 4 mM magnesium ATP, 0,3 mM natrium GTP, 10 mM HEPES, dan 0,6 mM EGTA, pH internal 7, 2, disesuaikan dengan KOH (osmolalitas 290). Untuk tujuan pemulihan, tambahkan 0,2% Biocytin ke dalam larutan internal.
Data diperoleh oleh Clampex (Clampex 11.1, Molecular Devices) menggunakan amplifier MultiClamp 700B (Molecular Devices) dan digitizer Digidata 1550B (Molecular Devices), disaring dengan low-pass pada 2 kHz, didigitalkan pada 20 kHz, dan dianalisis menggunakan Clampfit (versi 10.6) untuk analisis, molecular devices) dan fungsi MATLAB kustom (MATLAB 2019b, Mathworks). Potensial sambungan dihitung menggunakan JPCalc dan entri disesuaikan dengan potensi sambungan terhitung sebesar -14 mV. Operasi IV terdiri dari serangkaian langkah arus dalam langkah 5-10 pA dari -50 hingga 250 pA.
Untuk rekonstruksi morfologi neuron yang terjepit, 0,2% biocytin (Sigma-Aldrich) ditambahkan ke larutan internal. Sel-sel disiapkan setidaknya selama 15 menit setelah dipotong. Pipet kemudian ditarik perlahan selama 1–2 menit hingga membran yang direkam tertutup rapat. Setelah prosedur fisiologi bagian, bagian-bagian tersebut difiksasi semalaman pada suhu 4° C. dalam 4% PFA, dicuci dengan PBS X3, dan diencerkan 1:1000 dengan DyLight 549 atau DyLight 405 yang terkonjugasi streptavidin (Vector Labs). Sel-sel yang diisi dengan biocytin (2%; Sigma-Aldrich) diberi label selama perekaman patch clamp pada suhu ruangan selama 2 jam. Potongan-potongan tersebut kemudian dipasang pada slide mikroskopi menggunakan Aquamount (Thermo Scientific) dan divisualisasikan keesokan harinya pada mikroskop confocal Leica TCS SP8 menggunakan lensa objektif imersi minyak dengan aperture numerik ×40 1,3, perbesaran ×0,9–1,0, xy. Laju pengambilan sampel sekitar 7 piksel per mikron. Tumpukan-z pada interval 1 µm diperoleh secara serial, dan mosaik tumpukan-z dan penjahitan otomatis berbasis Leica dilakukan untuk menutupi seluruh pohon dendritik setiap neuron. Neuron kemudian dilacak secara semi-manual menggunakan antarmuka neuTube 40 dan file SWC dibuat. File-file tersebut kemudian diunggah ke plugin SimpleNeuriteTracer41 Fiji (ImageJ, versi 2.1.0; NIH).
Jaringan korteks manusia diperoleh dengan persetujuan yang diinformasikan sesuai dengan protokol yang disetujui oleh Institutional Review Board dari Universitas Stanford. Dua sampel jaringan pascapersalinan manusia (usia 3 dan 18 tahun) diperoleh melalui reseksi korteks frontal (girus frontal tengah) sebagai bagian dari pembedahan untuk epilepsi refrakter. Setelah reseksi, panen jaringan dalam NMDG-aCSF dingin yang mengandung: 92 mM NMDG, 2,5 mM KCl, 1,25 mM NaH2PO4, 30 mM NaHCO3, 20 mM HEPES, 25 mM glukosa, 2 mM tiourea, 5 mM natrium askorbat, 3 mM natrium piruvat, 0,5 mM CaCl2 4H2O dan 10 mM MgSO4 7H2O. Titrasi hingga pH 7,3-7,4 dengan asam klorida pekat. Jaringan dikirim ke laboratorium dalam waktu 30 menit dan bagian koronal diambil sesuai dengan prosedur yang dijelaskan di atas.
Semua prosedur pada hewan dilakukan sesuai dengan pedoman perawatan hewan yang disetujui APLAC Universitas Stanford. Tikus (lebih dari 140 hari pascatransplantasi) diinduksi dengan anestesi isoflurana 5% dan dibius dengan isoflurana 1-3% selama operasi. Hewan ditempatkan dalam rangka stereotaxic (Kopf) dan buprenorfin lepas lambat (SR) disuntikkan secara subkutan. Tengkorak diekspos, dibersihkan, dan 3-5 sekrup tulang dimasukkan. Untuk menargetkan t-hCO, kami menghasilkan koordinat stereotaxic dari gambar MRI. Lubang burr dibor di lokasi yang diinginkan dan serat (diameter 400 µm, NA 0,48, Doric) diturunkan 100 µm di bawah permukaan hCO dan diamankan ke tengkorak dengan semen gigi yang dapat diawetkan dengan UV (Relyx).
Perekaman fotometrik serat dilakukan seperti yang dijelaskan sebelumnya42. Untuk merekam aktivitas spontan, tikus ditempatkan di kandang yang bersih dan kabel serat optik berdiameter 400 µm (Doric) yang terhubung ke sistem akuisisi data fotometrik serat optik dihubungkan ke kabel serat optik yang ditanamkan. Selama perekaman aktivitas motorik selama 10 menit, hewan-hewan bebas menjelajahi kandang. Untuk merekam aktivitas yang ditimbulkan, tikus (lebih dari 140 hari setelah transplantasi) dibius dengan isoflurana 5% untuk induksi dan isoflurana 1-3% untuk pemeliharaan. Tempatkan hewan dalam bingkai stereotaktik (Kopf) dan kumis di sisi berlawanan dari t-hCO dipangkas hingga sekitar 2 cm dan dilewatkan melalui jaring yang terhubung ke aktuator piezoelektrik (PI). Kabel serat optik berdiameter 400 µm (Doric) dihubungkan ke serat yang ditanamkan dan dihubungkan ke sistem akuisisi data. Kumis pada sisi berlawanan dari t-hCO kemudian dibelokkan 50 kali (2 mm pada 20 Hz, 2 detik per penyajian) pada waktu acak oleh penggerak piezoelektrik selama periode perekaman 20 menit. Gunakan Arduino MATLAB Support Package untuk mengendalikan waktu defleksi dengan kode MATLAB khusus. Peristiwa disinkronkan ke perangkat lunak akuisisi data menggunakan pulsa logika transistor-transistor (TTL).
Tikus (lebih dari 140 hari pascatransplantasi) diinduksi dengan anestesi isoflurana 5% dan dibius dengan isoflurana 1-3% selama operasi. Hewan ditempatkan dalam bingkai stereotaxic (Kopf) dan buprenorphine SR dan deksametason disuntikkan secara subkutan. Tengkorak diekspos, dibersihkan, dan 3-5 sekrup tulang dimasukkan. Untuk menargetkan t-hCO, kami menghasilkan koordinat stereotaxic dari gambar MRI. Kraniotomi melingkar (berdiameter sekitar 1 cm) dilakukan dengan bor kecepatan tinggi langsung di atas hCO yang ditransplantasikan. Setelah tulang setipis mungkin, tetapi sebelum mengebor seluruh tulang, gunakan forsep untuk mengangkat sisa diskus pelvis yang utuh untuk memperlihatkan t-hCO yang mendasarinya. Kraniotomi diisi dengan salin steril, dan penutup kaca dan pin kepala khusus dipasang ke tengkorak dengan semen gigi yang diawetkan dengan UV (Relyx).
Pencitraan dua-foton dilakukan menggunakan mikroskop multifoton Bruker dengan lensa objektif Nikon LWD (×16, 0,8 NA). Pencitraan GCaMP6 dilakukan pada 920 nm dengan perbesaran bidang z tunggal 1,4x dan rata-rata 8x sebesar 7,5 fps. Tikus diinduksi dengan anestesi isoflurana 5% dan dipertahankan dengan isoflurana 1-3%. Tikus ditempatkan pada alat bantu kepala yang dibuat khusus dan diposisikan di bawah lensa. Rekaman latar belakang aktivitas motorik selama 3 menit diperoleh. Selama perekaman selama 20 menit, 50 semprotan (setiap presentasi berdurasi 100 ms) diberikan secara acak ke bantalan kumis di seberang t-hCO menggunakan picospricer. Gunakan Arduino MATLAB Support Package untuk mengontrol waktu burst dengan kode MATLAB khusus. Sinkronkan kejadian dengan perangkat lunak akuisisi data (PrairieView 5.5) menggunakan pulsa TTL. Untuk analisis, gambar dikoreksi untuk gerakan xy menggunakan koreksi afin dalam program MoCo yang diluncurkan di Fiji. Ekstraksi jejak fluoresensi dari sel individual menggunakan CNMF-E43. Fluoresensi diekstraksi untuk setiap wilayah yang diminati, diubah menjadi kurva dF/F, lalu diubah menjadi skor-z.
Tikus (lebih dari 140 hari pascatransplantasi) diinduksi dengan anestesi isoflurana 5% dan dibius dengan isoflurana 1-3% selama operasi. Hewan ditempatkan dalam rangka stereotaxic (Kopf) dan buprenorphine SR dan deksametason disuntikkan secara subkutan. Kumis pada sisi berlawanan dari t-hCO dipotong sekitar 2 cm dan dimasukkan melalui jaring yang terhubung ke aktuator piezoelektrik. Tengkorak diekspos dan dibersihkan. Sekrup tanah baja tahan karat dipasang ke tengkorak. Untuk menargetkan t-hCO, kami menghasilkan koordinat stereotaxic dari gambar MRI. Lakukan kraniotomi melingkar (berdiameter sekitar 1 cm) dengan bor kecepatan tinggi tepat di atas t-hCO. Setelah tulang setipis mungkin, tetapi sebelum mengebor seluruh tulang, gunakan forsep untuk mengangkat sisa diskus pelvis utuh untuk memperlihatkan t-hCO yang mendasarinya. Sel-sel individual direkam menggunakan probe silikon kepadatan tinggi 32-saluran atau 64-saluran (Cambridge Neurotech) yang diardekan ke sekrup arde dan diperkuat terlebih dahulu dengan amplifier RHD (Intan). Gunakan manipulator untuk menurunkan elektroda ke lokasi target melalui kraniotomi, yang diisi dengan salin steril. Pengumpulan data dilakukan pada frekuensi 30 kHz menggunakan sistem akuisisi data Open Ephys. Perekaman dilanjutkan hanya ketika kami mendeteksi aktivitas spontan ritmis yang sangat berkorelasi di lebih dari 10 saluran, yang menunjukkan bahwa elektroda terletak di cangkokan (berdasarkan data pencitraan kalsium dua-foton). Rekaman latar belakang aktivitas motorik selama 10 menit diperoleh. Kumis di sisi berlawanan dari t-hCO kemudian dibelokkan 50 kali (2 mm pada 20 Hz, 2 detik per presentasi) pada waktu acak oleh penggerak piezoelektrik selama periode perekaman 20 menit. Menggunakan MATLAB Support Package for Arduino (MATLAB 2019b), kendalikan waktu defleksi dengan kode MATLAB khusus. Gunakan pulsa TTL untuk menyinkronkan kejadian dengan perangkat lunak akuisisi data.
Untuk percobaan penandaan optik, kabel patch optik 200 µm (Doric) yang dihubungkan ke laser 473 nm (Omicron) dihubungkan ke serat optik 200 µm yang ditempatkan di atas kraniotomi. Segera sebelum ini, sesuaikan daya jumper ke 20 mW. Gunakan manipulator untuk menurunkan elektroda ke lokasi target melalui kraniotomi, yang diisi dengan larutan garam steril. Pada awal perekaman, sepuluh pulsa cahaya 473 nm (frekuensi 2 Hz, durasi pulsa 10 ms) dipancarkan. Sel fotosensitif didefinisikan sebagai sel yang menunjukkan respons lonjakan dalam 10 ms cahaya dalam 70% atau lebih percobaan.