Nature.com ला भेट दिल्याबद्दल धन्यवाद. तुम्ही मर्यादित CSS सपोर्टसह ब्राउझर आवृत्ती वापरत आहात. सर्वोत्तम अनुभवासाठी, आम्ही शिफारस करतो की तुम्ही अपडेटेड ब्राउझर वापरा (किंवा इंटरनेट एक्सप्लोररमध्ये कंपॅटिबिलिटी मोड अक्षम करा). याव्यतिरिक्त, सतत सपोर्ट सुनिश्चित करण्यासाठी, आम्ही शैली आणि जावास्क्रिप्टशिवाय साइट दाखवतो.
एकाच वेळी तीन स्लाईड्सचा कॅरोसेल प्रदर्शित करते. एका वेळी तीन स्लाईड्समधून जाण्यासाठी मागील आणि पुढील बटणे वापरा किंवा एका वेळी तीन स्लाईड्समधून जाण्यासाठी शेवटी स्लाईडर बटणे वापरा.
मानवी विकास आणि रोगांचे मॉडेलिंग करण्यासाठी स्वयं-असेम्बलिंग न्यूरल ऑर्गेनेल्स एक आशादायक इन विट्रो प्लॅटफॉर्म आहेत. तथापि, ऑर्गेनॉइड्समध्ये व्हिव्होमध्ये अस्तित्वात असलेली कनेक्टिव्हिटी नसते, जी परिपक्वता मर्यादित करते आणि वर्तन नियंत्रित करणाऱ्या इतर सर्किट्सशी एकात्मता रोखते. येथे आपण दाखवतो की नवजात उंदरांच्या सोमाटोसेन्सरी कॉर्टेक्समध्ये प्रत्यारोपित केलेले मानवी स्टेम सेल-व्युत्पन्न कॉर्टिकल ऑर्गेनॉइड्स परिपक्व पेशी प्रकार विकसित करतात जे संवेदी आणि प्रेरणा-संबंधित सर्किट्समध्ये एकत्रित होतात. एमआरआयने अनेक स्टेम सेल लाईन्स आणि प्राण्यांमध्ये प्रत्यारोपणानंतरच्या ऑर्गेनॉइड वाढीचे प्रकटीकरण केले, तर सिंगल-कोर विश्लेषणाने कॉर्टिकोजेनेसिसची प्रगती आणि क्रियाकलाप-आश्रित ट्रान्सक्रिप्शन प्रोग्रामचा उदय उघड केला. खरंच, प्रत्यारोपित कॉर्टिकल न्यूरॉन्स त्यांच्या इन विट्रो समकक्षांपेक्षा अधिक जटिल मॉर्फोलॉजिकल, सिनॅप्टिक आणि अंतर्गत पडदा गुणधर्म प्रदर्शित करतात, ज्यामुळे टिमोथी सिंड्रोम असलेल्या रुग्णांमध्ये न्यूरोनल दोष शोधण्याची परवानगी मिळते. शारीरिक आणि कार्यात्मक ट्रेसिंगने दर्शविले आहे की प्रत्यारोपित ऑर्गेनेल्स थॅलेमोकॉर्टिकल आणि कॉर्टिकोकॉर्टिकल इनपुट प्राप्त करतात आणि न्यूरल अ‍ॅक्टिव्हिटीच्या इन विव्हॉ रेकॉर्डिंगवरून असे सूचित होते की हे इनपुट मानवी पेशींमध्ये संवेदी प्रतिसाद निर्माण करू शकतात. शेवटी, कॉर्टिकल ऑर्गेनॉइड्स उंदरांच्या मेंदूमध्ये अक्षांचा विस्तार करतात आणि त्यांच्या ऑप्टोजेनेटिक सक्रियतेमुळे बक्षीस शोधण्याची वर्तणूक होते. अशाप्रकारे, प्रत्यारोपित मानवी कॉर्टेक्स न्यूरॉन्स परिपक्व होतात आणि वर्तन नियंत्रित करणाऱ्या यजमानाच्या सर्किटमध्ये भाग घेतात. आम्हाला अपेक्षा आहे की या दृष्टिकोनामुळे रुग्ण-व्युत्पन्न पेशींमध्ये स्ट्रँड-लेव्हल फेनोटाइप शोधणे सोपे होईल जे इतर मार्गांनी शोधता येत नाहीत.
मानवी मेंदूचा विकास ही एक उल्लेखनीय स्वयं-संघटन प्रक्रिया आहे ज्यामध्ये पेशी वाढतात, वेगळे होतात, स्थलांतरित होतात आणि कार्यात्मक न्यूरोनल सर्किट तयार करण्यासाठी जोडतात जे संवेदी अनुभवाद्वारे अधिक परिष्कृत केले जातात. मानवी मेंदूच्या विकासाला समजून घेण्यात, विशेषतः रोगाच्या संदर्भात, एक महत्त्वाची समस्या म्हणजे मेंदूच्या ऊतींपर्यंत पोहोचण्याचा अभाव. मानवी कॉर्टेक्स ऑर्गेनॉइड्स (hCO; ज्याला मानवी कॉर्टेक्स गोलाकार देखील म्हणतात) सह स्वयं-संघटन करणारे ऑर्गेनेल्स 2,3,4,5,6 निर्माण करू शकतात. तथापि, अनेक मर्यादा न्यूरल सर्किट्सच्या विकास आणि कार्य समजून घेण्यासाठी त्यांच्या व्यापक अनुप्रयोगास मर्यादित करतात. विशेषतः, व्हिव्होमध्ये उपस्थित असलेल्या काही सूक्ष्म पर्यावरणीय आणि संवेदी इनपुटच्या अनुपस्थितीमुळे hCO परिपक्वता मर्यादित आहे की नाही हे स्पष्ट नाही. याव्यतिरिक्त, hCOs अशा सर्किट्समध्ये एकत्रित केलेले नसल्यामुळे जेनेटिकली कॉम्प्लेक्स आणि वर्तणुकीय न्यूरोसायकियाट्रिक विकारांचे मॉडेलिंग करण्यात त्यांची उपयुक्तता सध्या मर्यादित आहे.
hCO चे अखंड जिवंत मेंदूमध्ये प्रत्यारोपण केल्याने या मर्यादांवर मात करता येते. मागील अभ्यासातून असे दिसून आले आहे की उंदीर कॉर्टेक्समध्ये प्रत्यारोपित केलेले मानवी न्यूरॉन्स उंदीर पेशी जगण्यास, प्रक्षेपित करण्यास आणि त्यांच्याशी संवाद साधण्यास सक्षम असतात7,8,9,10,11,12. तथापि, हे प्रयोग सहसा प्रौढ प्राण्यांवर केले जातात, जे सिनॅप्टिक आणि अ‍ॅक्सोनल इंटिग्रेशन मर्यादित करू शकतात. येथे, आम्ही एका प्रत्यारोपणाच्या प्रतिमानाचे वर्णन करतो ज्यामध्ये आम्ही प्लास्टिक विकासाच्या सुरुवातीच्या टप्प्यावर इम्युनोडेफिशियन्सी उंदरांच्या प्राथमिक सोमाटोसेन्सरी कॉर्टेक्स (S1) मध्ये hiPS पेशींपासून मिळवलेले 3D hCO प्रत्यारोपण केले. प्रत्यारोपित hCO (t-hCO) न्यूरॉन्स लक्षणीय परिपक्वता अनुभवतात, थॅलेमोकॉर्टिकल आणि कॉर्टिकल-कॉर्टिकल इनपुट प्राप्त करतात जे संवेदी प्रतिसाद निर्माण करतात आणि बक्षीस शोधणारे वर्तन चालविण्यासाठी उंदराच्या मेंदूमध्ये अ‍ॅक्सोनल प्रोजेक्शन वाढवतात. t-hCO च्या विस्तारित परिपक्वतामुळे टिमोथी सिंड्रोम (TS) असलेल्या रुग्णांमध्ये न्यूरोनल दोष आढळले आहेत, जो व्होल्टेज-संवेदनशील L-प्रकार CaV1.2 कॅल्शियम चॅनेलमधील उत्परिवर्तनांमुळे होणारा एक गंभीर अनुवांशिक विकार आहे (CACNA1C द्वारे एन्कोड केलेला).
मानवी कॉर्टिकल न्यूरॉन्स इन विवो सर्किट्सचा अभ्यास करण्यासाठी, आम्ही स्टिरियोटॅक्टिकली अखंड 3D hCO चे प्रत्यारोपण प्रसुतिपूर्व अथिमिक उंदरांच्या S1 मध्ये केले (जन्मानंतर 3-7 दिवस) (आकृती 1a आणि आकृती 1a-c चा विस्तारित डेटा). या टप्प्यावर, थॅलेमोकॉर्टिकल आणि कॉर्टिकोकॉर्टिकल अॅक्सोनल प्रोजेक्शन्सनी अद्याप त्यांचे S1 इनर्वेशन पूर्ण केलेले नाही (संदर्भ 13). अशा प्रकारे, हा दृष्टिकोन अंतर्जात सर्किट्सवरील प्रभाव कमी करताना t-hCO एकत्रीकरण जास्तीत जास्त करण्यासाठी डिझाइन केला आहे. जिवंत प्राण्यांमध्ये t-hCO चे स्थान दृश्यमान करण्यासाठी, आम्ही प्रत्यारोपणानंतर 2-3 महिन्यांनी उंदरांचे T2-भारित MRI मेंदू पुनर्रचना केली (आकृती 1b आणि विस्तारित डेटा, आकृती 1d). t-hCO3 चे आकारमान सहजपणे पाहिले गेले आणि t-hCO3 चे आकारमान मापन स्थिर स्लाइसमधून मोजलेल्या आकारमानांसारखेच होते (विस्तारित डेटा आकृती 1d,e; P > 0.05). t-hCO3 चे आकारमान सहजपणे पाहिले गेले आणि t-hCO3 चे आकारमान मापन स्थिर स्लाइसमधून मोजलेल्या आकारमानांसारखेच होते (विस्तारित डेटा आकृती 1d,e; P > 0.05). t-hCO легко наблюдались, а объемные измерения t-hCO были аналогичны рассчитанным для фиксированных срезов (расшированных срезов, e. पी> ०,०५). t-hCO सहजपणे पाहिले गेले आणि आकारमानात्मक t-hCO मोजमाप निश्चित विभागांसाठी मोजलेल्या मोजमापांसारखेच होते (विस्तारित डेटा, आकृती 1d, e; P > 0.05).很容易观察到t-hCO，并且t-hCO的体积测量值与从固定切片计算的测量值相似（扩展数据图1d、e；P > 0.05）.很容易观察到t-hCO，并且t-hCO t-hCO легко наблюдался, а объемные измерения t-hCO были аналогичны рассчитанным для фиксированных срезов (расшированных срезов, e. पी> ०,०५). t-hCO सहजपणे पाहिले जाऊ शकले आणि आकारमानात्मक t-hCO मोजमाप निश्चित विभागांसाठी मोजलेल्या मोजमापांसारखेच होते (विस्तारित डेटा, आकृती 1d, e; P > 0.05).प्रत्यारोपणाच्या सुमारे २ महिन्यांनी आम्ही प्रत्यारोपित केलेल्या ८१% प्राण्यांमध्ये t-hCO3 निश्चित केले (n = ७२ प्राणी; १० hiPS पेशी रेषांमधून hCO3; पूरक तक्ता १ मध्ये hiPS पेशी रेष). यापैकी ८७% सेरेब्रल कॉर्टेक्समध्ये होते (आकृती १ क). एकाच प्रत्यारोपित उंदरामध्ये अनेक वेळेच्या ठिकाणी अनुक्रमिक MRI स्कॅन करून, आम्हाला ३ महिन्यांत t-hCO3 च्या प्रमाणात नऊ पट वाढ आढळली (आकृती १ द आणि विस्तारित डेटा, आकृती १ फ). प्रत्यारोपणानंतर १२ महिन्यांत प्रत्यारोपित केलेल्या प्राण्यांचा जगण्याचा दर (७४%) जास्त होता (विस्तारित डेटा, आकृती १ जी आणि पूरक तक्ता २), आणि कोणतेही उघड मोटर किंवा स्मृती दोष, ग्लिओसिस किंवा इलेक्ट्रोएन्सेफॅलोग्राम (EEG) आढळले नाहीत. डेटा आकृती १ जी आणि पूरक तक्ता २). १ तास-मी आणि ३ ई).
a, प्रायोगिक डिझाइनची योजनाबद्ध रचना. hiPS पेशींपासून मिळवलेले hCO हे भेदभावाच्या 30-60 व्या दिवशी नवजात नग्न उंदरांच्या S1 मध्ये प्रत्यारोपित केले गेले. b, T2-भारित कोरोनल आणि क्षैतिज MRI प्रतिमा प्रत्यारोपणानंतर 2 महिन्यांनी S1 मध्ये t-hCO दर्शवितात. स्केल बार, 2 मिमी. c, प्रत्येक hiPS सेल लाईनसाठी दर्शविलेल्या एन्ग्राफ्टमेंट यश दरांचे परिमाण (n = 108, बारमधील संख्या प्रति hIPS सेल लाईन t-hCO चे प्रमाण दर्शवितात) आणि कॉर्टिकल किंवा सबकॉर्टिकल स्थान (n = 88). d, कोरोनरी धमनीची MRI प्रतिमा (डावीकडे; स्केल बार, 3 मिमी) आणि संबंधित 3D व्हॉल्यूमेट्रिक पुनर्रचना (स्केल बार, 3 मिमी) 3 महिन्यांत t-hCO मध्ये वाढ दर्शविते. e, उंदराच्या सेरेब्रल कॉर्टेक्समध्ये t-hCO नमुन्यांचा आढावा. स्केल बार, 1 मिमी. f, वर डावीकडून उजवीकडे दर्शविलेल्या t-hCO च्या प्रतिनिधी इम्युनोसाइटोकेमिकल प्रतिमा (भेदभावादरम्यान): PPP1R17 (4 महिने जुने), NeuN (8 महिने जुने), SOX9 आणि GFAP (8 महिने जुने), PDGFRα; (8 महिने), MAP2 (8 महिने) आणि IBA1 (8 महिने). स्केल बार, 20 µm. HNA ची सह-अभिव्यक्ती मानवी उत्पत्तीच्या पेशी दर्शवते. g, snRNA-seq: Seurat एकात्मतेनंतर सर्व उच्च-गुणवत्तेच्या t-hCO केंद्रकांचे युनिफाइड मॅनिफोल्ड आणि प्रोजेक्शन (UMAP) डायमेंशनॅलिटी रिडक्शन इमेजिंग (n=3 t-hCO नमुने, n=2 hiPS सेल लाईन्स). अॅस्ट्रोसाइट्स, अॅस्ट्रोसाइट लाईनच्या पेशी; सायक प्रोग, फिरणारे प्रोजेनिटर; ग्लूएन डीएल, डीप ग्लूटामेटर्जिक न्यूरॉन्स; ग्लूएन डीएल/एसपी, डीप आणि सबलेमेलर ग्लूटामेटर्जिक न्यूरॉन्स; ग्लूएन यूएल, वरच्या थरातील ग्लूटामेटर्जिक न्यूरॉन्स; ऑलिगोडेंड्रोसाइट्स, ऑलिगोडेंड्रोसाइट्स; OPC, ऑलिगोडेंड्रोसाइट प्रोजेनिटर पेशी; RELN, रीलिन न्यूरॉन्स. h, hCO ग्लूटामॅटर्जिक न्यूरॉन्सच्या तुलनेत t-hCO ग्लूटामॅटर्जिक न्यूरॉन्समध्ये लक्षणीयरीत्या अपरेग्युलेटेड (समायोजित P < 0.05, फोल्ड चेंज > 2, न्यूक्लीच्या किमान 10% मध्ये व्यक्त केलेले) जीन ऑन्टोलॉजी (GO) टर्म एन्रिचमेंट विश्लेषण. h, hCO ग्लूटामॅटर्जिक न्यूरॉन्सच्या तुलनेत t-hCO ग्लूटामॅटर्जिक न्यूरॉन्समध्ये लक्षणीयरीत्या अपरेग्युलेटेड (समायोजित P < 0.05, फोल्ड चेंज > 2, न्यूक्लीच्या किमान 10% मध्ये व्यक्त केलेले) जीन ऑन्टोलॉजी (GO) टर्म एन्रिचमेंट विश्लेषण. h, Анализ обогащения терминов जीन ऑन्टोलॉजी (GO) для генов со значительной активацией (скорректированный P <0,05, кратность, эсяк2 изямре > по крайней мере в 10% ядер) в глутаматергических нейронах t-hCO по сравнению с глутаматергическими нейронами hCO. h, hCO ग्लूटामॅटर्जिक न्यूरॉन्सच्या तुलनेत t-hCO ग्लूटामॅटर्जिक न्यूरॉन्समध्ये लक्षणीय सक्रियता (समायोजित P<0.05, पट बदल >2, किमान 10% केंद्रकांमध्ये अभिव्यक्ती) असलेल्या जीन्ससाठी जीन ऑन्टोलॉजी (GO) टर्म एन्रिचमेंट विश्लेषण. h,与hCO 谷氨酸能神经元相比，t-hCO 谷氨酸能神神经元中基因显着上调（调整后P <0. 2,在至少10% 的细胞核中表达）的基因本体论(GO) 术语富集分析. h ， 与 hco 谷氨酸 能 元 相比 ， t-hco 谷氨酸 能 神经 元 基因 显着 上调 （后 变 变 后 05变化> 2，至少 10% 的 核中 表达） 基因 基因 的 的 核中 表达） 基因 的 的 的 的本体论(GO) 术语富集分析. h, гены значительно активизировались (скорректированный P <0,05, кратность изменения> 2, экспрессируется по крайнев %1мевяй) глутаматергических нейронах t-hCO по сравнению с глутаматергическими нейронами hCO Онтологический (GO) анализ термощанию. h, t-hCO ग्लूटामॅटर्जिक न्यूरॉन्समध्ये जीन्स लक्षणीयरीत्या वाढल्या (समायोजित P < 0.05, पट बदल > 2, कमीत कमी 10% केंद्रकांमध्ये व्यक्त) hCO ग्लूटामॅटर्जिक न्यूरॉन्सच्या तुलनेत समृद्धी संज्ञाचे ऑन्टोलॉजिकल (GO) विश्लेषण.ठिपकेदार रेषा ०.०५ चे aq मूल्य दर्शवते. i, संदर्भ २२ snRNA-seq प्रौढ मोटर कॉर्टेक्स डेटासेटमधून लेबल ट्रान्सफर वापरून t-hCO मध्ये GluN पेशी प्रकारांचे UMAP इमेजिंग. CT — कॉर्टिकोथॅलेमिक पेशी, ET — एक्स्ट्रासेरेब्रल पेशी, IT — अंतर्गत टेलेन्सेफॅलिक पेशी, NP — प्रक्षेपणाजवळ.
त्यानंतर आम्ही सायटोआर्किटेक्चर आणि t-hCO च्या एकूण सेल्युलर रचनेचे मूल्यांकन केले. उंदराच्या एंडोथेलियल पेशींच्या अँटीबॉडी स्टेनिंगमुळे t-hCO सह रक्तवहिन्यासंबंधीचा शोध लागला, तर IBA1 स्टेनिंगमुळे संपूर्ण ग्राफ्टमध्ये उंदराच्या मायक्रोग्लियाची उपस्थिती दिसून आली (आकृती 1f आणि विस्तारित डेटा, आकृती 3c,d). इम्युनोस्टेनिंगमुळे मानवी न्यूक्लियर अँटीजेन (HNA) पॉझिटिव्ह पेशी PPP1R17 (कॉर्टिकल प्रोजेनिटर), NeuN (न्यूरॉन्स), SOX9 आणि GFAP (ग्लियल-व्युत्पन्न पेशी) किंवा PDGFRα (ऑलिगोडेंड्रोसाइट प्रोजेनिटर) सह-अभिव्यक्त झाल्याचे दिसून आले (आकृती 1f). एकल पेशी रिझोल्यूशनवर t-hCO च्या सेल्युलर रचनेचा अभ्यास करण्यासाठी, आम्ही सुमारे 8 महिन्यांच्या भिन्नतेनंतर सिंगल-कोर RNA सिक्वेन्सिंग (snRNA-seq) केले. उंदराच्या केंद्रकांचे मोठ्या प्रमाणात गाळणे आणि काढून टाकल्याने 21,500 उच्च-गुणवत्तेचे मानवी मोनोन्यूक्लियर नकाशे मिळाले (आकृती 1g आणि विस्तारित डेटा, आकृती 4a,b). सामान्य पेशी-प्रकार मार्करच्या अभिव्यक्ती नमुन्यांमध्ये खोल आणि वरवरच्या ग्लूटामेटर्जिक न्यूरॉन्स, परिसंचरण करणारे पूर्वज, ऑलिगोडेंड्रोसाइट्स आणि अॅस्ट्रोसाइट वंश (आकृती 1g, विस्तारित डेटा, आकृती 4c, आणि पूरक तक्ता 3) यासह प्रमुख कॉर्टिकल पेशी वर्गांचे क्लस्टर ओळखले गेले. SATB2 आणि CTIP2 साठी इम्युनोस्टेनिंगमध्ये असे दिसून आले की कॉर्टिकल उपप्रकारांची उपस्थिती असूनही, t-hCO ने स्पष्ट शारीरिक स्तरीकरण दर्शविले नाही (विस्तारित डेटा, आकृती 3a). स्टेज-मॅच केलेल्या snRNA-seq hCO ने काही अपवादांसह, ऑलिगोडेंड्रोसाइट्सची अनुपस्थिती आणि GABAergic न्यूरॉन्सची उपस्थिती यासह, मोठ्या प्रमाणात समान पेशी वर्ग तयार केले, जे पार्श्व पूर्वज पेशींसाठी पूर्वी नोंदवलेल्या अनुकूल इन विट्रो परिस्थिती प्रतिबिंबित करू शकतात15 (विस्तारित डेटा, आकृती 4f – i आणि पूरक तक्ता 4). विभेदक जनुक अभिव्यक्ती विश्लेषणाने t-hCO आणि hCO मधील ग्लूटामेटर्जिक न्यूरॉन्समध्ये लक्षणीय फरक दिसून आला (पूरक तक्ता 5), ज्यामध्ये सिनॅप्टिक सिग्नलिंग, डेंड्रिटिक लोकलायझेशन आणि व्होल्टेज-गेटेड चॅनेल क्रियाकलाप (आकृती 1h आणि पूरक तक्ता 5) सारख्या न्यूरोनल परिपक्वताशी संबंधित जनुकांच्या संचांचे सक्रियकरण समाविष्ट आहे. तक्ता 6). त्यानुसार, कॉर्टिकल ग्लूटामेटर्जिक t-hCO न्यूरॉन्सने प्रवेगक ट्रान्सक्रिप्शनल परिपक्वता प्रदर्शित केली.
t-hCO मधील हे ट्रान्सक्रिप्शनल बदल hCO इन विट्रो आणि t-hCO इन विव्हो मधील मॉर्फोलॉजिकल फरकांशी संबंधित आहेत का हे स्पष्ट करण्यासाठी, आम्ही 7-8 महिन्यांच्या भिन्नतेनंतर तीव्र विभागांमध्ये स्टेज-मॅच केलेले बायोसायटिन-भरलेले hCO आणि hCO पुनर्बांधणी केली. hCO न्यूरॉन्स (आकृती 2a). t-hCO न्यूरॉन्स लक्षणीयरीत्या मोठे होते, सोमा व्यासाच्या 1.5 पट, डेंड्राइट्सच्या दुप्पट आणि इन विट्रो hCO च्या तुलनेत एकूण डेंड्राइटिक लांबीमध्ये एकूण सहा पट वाढ होती (आकृती 2b). याव्यतिरिक्त, आम्ही hCO न्यूरॉन्सपेक्षा t-hCO न्यूरॉन्समध्ये डेंड्राइटिक स्पाइनची घनता लक्षणीयरीत्या जास्त पाहिली (आकृती 2c). हे सूचित करते की t-hCO न्यूरॉन्समध्ये व्यापक डेंड्राइटिक लांबी आणि शाखा असतात, जे सतत पेशींच्या प्रसारासह, प्रत्यारोपणानंतर t-hCO च्या गहन वाढीस हातभार लावू शकतात (आकृती 1d आणि विस्तारित डेटा आकृती 1f). यामुळे आम्हाला इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल गुणधर्मांची तपासणी करण्यास प्रवृत्त केले. मेम्ब्रेन कॅपेसिटन्स आठ पट जास्त होता (विस्तारित डेटा, आकृती 8d), रेस्टिंग-स्टेट मेम्ब्रेन पोटेंशियल अधिक हायपरपोलराइज्ड (अंदाजे 20 mV), आणि करंट इंजेक्शनमुळे hCO न्यूरॉन्सपेक्षा t-hCO न्यूरॉन्समध्ये जास्त कमाल उत्तेजना दर निर्माण झाला. इन विट्रो (आकृती 2d), e), जे t-hCO च्या मोठ्या आणि अधिक जटिल मॉर्फोलॉजिकल वैशिष्ट्यांशी सुसंगत आहे. याव्यतिरिक्त, t-hCO न्यूरॉन्समध्ये उत्स्फूर्त उत्तेजक पोस्टसिनॅप्टिक करंट इव्हेंट्स (EPSC) ची वारंवारता लक्षणीयरीत्या जास्त होती (आकृती 2f), असे सूचित करते की t-hCO न्यूरॉन्समध्ये आढळलेल्या डेंड्रिटिक स्पाइनची वाढलेली घनता कार्यात्मक उत्तेजनाशी संबंधित होती. लैंगिक सिनॅप्स. आम्ही लेबल केलेले ग्लूटामेटर्जिक न्यूरॉन्स (विस्तारित डेटा, आकृती 6a-c) रेकॉर्ड करून इन विट्रोमध्ये hCO न्यूरॉन्सच्या अपरिपक्व स्वरूपाची पुष्टी केली.
a, ८ महिन्यांच्या भेदभावानंतर बायोसायटिनने भरलेल्या hCO आणि t-hCO न्यूरॉन्सची ३D पुनर्बांधणी. b, आकारिकीय वैशिष्ट्यांचे परिमाण (n = 8 hCO न्यूरॉन्स, n = 6 t-hCO न्यूरॉन्स; **P = 0.0084, *P = 0.0179 आणि ***P < 0.0001). b, आकारिकीय वैशिष्ट्यांचे परिमाण (n = 8 hCO न्यूरॉन्स, n = 6 t-hCO न्यूरॉन्स; **P = 0.0084, *P = 0.0179 आणि ***P < 0.0001). б, количественная оценка морфологических признаков (n = 8 нейронов hCO, n = 6 нейронов t-hCO; ** P = 0,0084, * P = 0,0179, * P = 0,0179, *** 0179). b, आकारिकीय वैशिष्ट्यांचे परिमाण (n=8 hCO न्यूरॉन्स, n=6 t-hCO न्यूरॉन्स; **P=0.0084, *P=0.0179, आणि ***P<0.0001). b，形态学特征的量化（n = 8 个hCO 神经元，n = 6 个t-hCO 神经元；**P = 0.0084，*P = 0.0179,*P = 0.0179 和*00179 b，形态学特征的量化（n = 8 个hCO 神经元，n = 6 个t-hCO 神经元；**P = 0.0084，*P = 0.0179,*P = 0.0179 和*00179 б, количественная оценка морфологических признаков (n = 8 нейронов hCO, n = 6 нейронов t-hCO; ** P = 0,0084, * P = 0,0179, * P = 0,0179, *** 0179). b, आकारिकीय वैशिष्ट्यांचे परिमाण (n=8 hCO न्यूरॉन्स, n=6 t-hCO न्यूरॉन्स; **P=0.0084, *P=0.0179, आणि ***P<0.0001).c, 8 महिन्यांच्या भिन्नतेनंतर hCO आणि t-hCO डेंड्रिटिक शाखांचे 3D पुनर्बांधणी. लाल तारका चिन्ह कथित डेंड्रिटिक मणक्यांचे संकेत देतात. डेंड्रिटिक मणक्याचे घनता प्रमाणीकरण (n = 8 hCO न्यूरॉन्स, n = 6 t-hCO न्यूरॉन्स; **P = 0.0092). d, विश्रांतीच्या पडद्याच्या संभाव्यतेचे परिमाण (n = 25 hCO3 न्यूरॉन्स, n = 16 t-hCO3 न्यूरॉन्स; ***P < 0.0001). d, विश्रांतीच्या पडद्याच्या संभाव्यतेचे परिमाण (n = 25 hCO3 न्यूरॉन्स, n = 16 t-hCO3 न्यूरॉन्स; ***P < 0.0001). d, количественная оценка мембранного потенциала покоя (n = 25 нейронов hCO, n = 16 нейронов t-hCO; *** P <0,0001). d, विश्रांती झिल्ली संभाव्य परिमाण (n = 25 hCO3 न्यूरॉन्स, n = 16 t-hCO3 न्यूरॉन्स; ***P < 0.0001). d，静息膜电位的量化（n = 25 hCO 神经元，n = 16 t-hCO 神经元；***P < 0.0001）. d，静息膜电位的量化（n = 25 hCO 神经元，n = 16 t-hCO 神经元；***P < 0.0001）. d, количественная оценка мембранного потенциала покоя (n = 25 нейронов hCO, n = 16 нейронов t-hCO; *** P <0,0001). d, विश्रांती झिल्ली संभाव्य परिमाण (n = 25 hCO3 न्यूरॉन्स, n = 16 t-hCO3 न्यूरॉन्स; ***P < 0.0001). e, वाढत्या करंट इंजेक्शन्समुळे hCO आणि t-hCO मध्ये पुनरावृत्ती होणारे क्रिया क्षमता फायरिंग आणि जास्तीत जास्त फायरिंग रेटचे परिमाण (n = 25 hCO न्यूरॉन्स, n = 16 t-hCO न्यूरॉन्स; ***P < 0.0001). e, वाढत्या करंट इंजेक्शन्समुळे hCO आणि t-hCO मध्ये पुनरावृत्ती होणारे क्रिया क्षमता फायरिंग आणि जास्तीत जास्त फायरिंग रेटचे परिमाण (n = 25 hCO न्यूरॉन्स, n = 16 t-hCO न्यूरॉन्स; ***P < 0.0001). e, повторное возбуждение потенциала действия в hCO и t-hCO, вызванное увеличением тока, и количественная оценка максиала максиала действия возбуждения (n = 25 нейронов hCO, n = 16 нейронов t-hCO; *** P <0,0001). e, कमाल फायरिंग रेटच्या वर्तमान वाढीमुळे आणि परिमाणानुसार hCO आणि t-hCO मध्ये क्रिया क्षमता पुन्हा-फायरिंग (n = 25 hCO न्यूरॉन्स, n = 16 t-hCO न्यूरॉन्स; *** P < 0.0001). e，通过增加电流注入诱导的hCO 和t-hCO 重复动作电位放电，以及最大放电率的釀大放电率釀大放电率的釀大放电率的鏪导神经元，n = 16 个t-hCO 神经元；*P <0.0001）. E ， 通过 增加 电流 注入 的 的 hco 和 t-hco 重复 电位 放电 ， 以及 最 大 的 量 丞 n 5 hco ， n = 16 个 t-hco 神经 ； *** p <0.0001） . e, повторяющееся возбуждение потенциала действия hCO и t-hCO, вызванное увеличением подачи тока, и количественкайциальная количественкаиная. скорости возбуждения (n = 25 нейронов hCO, n = 16 нейронов t-hCO; *** P <0,0001). e, वाढीव विद्युत प्रवाह पुरवठा आणि कमाल अग्निदराचे परिमाण (n = 25 hCO न्यूरॉन्स, n = 16 t-hCO न्यूरॉन्स; *** P < 0.0001) यामुळे प्रेरित hCO आणि t-hCO क्रिया क्षमतांचे पुनरावृत्ती होणारे प्रहार. f, 8 महिन्यांच्या भेदभावावर hCO आणि t-hCO न्यूरॉन्समध्ये उत्स्फूर्त EPSCs (sEPSCs), आणि सिनॅप्टिक घटनांच्या वारंवारतेचे प्रमाणीकरण (n = 25 hCO न्यूरॉन्स, n = 17 t-hCO न्यूरॉन्स; ***P < 0.0001). f, 8 महिन्यांच्या भेदभावावर hCO आणि t-hCO न्यूरॉन्समध्ये उत्स्फूर्त EPSCs (sEPSCs), आणि सिनॅप्टिक घटनांच्या वारंवारतेचे प्रमाणीकरण (n = 25 hCO न्यूरॉन्स, n = 17 t-hCO न्यूरॉन्स; ***P < 0.0001). f, спонтанные EPSC (sEPSC) в нейронах hCO и t-hCO через 8 месяцев дифференцировки и количественная оценка = частоты (сипыхинах) нейронов hCO, n = 17 нейронов t-hCO *** P <0,0001) . f, सिनॅप्टिक इव्हेंट रेटच्या भेदभाव आणि परिमाणीकरणाच्या 8 महिन्यांच्या कालावधीत hCO आणि t-hCO न्यूरॉन्समध्ये उत्स्फूर्त EPSCs (sEPSCs) (n=25 hCO न्यूरॉन्स, n=17 t-hCO न्यूरॉन्स; ***P<0.0001). f，分化8 个月时hCO 和t-hCO 神经元中的自发性EPSCs (sEPSCs)，以及突触事件频率的量化（烞烞件频率的量化（n 17 टी-एचसीओ 神经元；**P <0.0001） . f，分化8 个月时hCO 和t-hCO 神经元中的自发性EPSCs (sEPSCs)，以及突触事件频率的量匼（n神率的量匼（n = 25 hCO 神率的量匼（n = 25hCO P < 0.0001） . f, спонтанные EPSC (sEPSC) в нейронах hCO и t-hCO через 8 месяцев дифференцировки и количественная оценка = частоты (сипыхинах) нейронов hCO, n = 17 нейронов t-hCO; *** पी <0,0001). f, सिनॅप्टिक इव्हेंट रेटच्या भेदभाव आणि परिमाणीकरणाच्या 8 महिन्यांच्या कालावधीत hCO आणि t-hCO न्यूरॉन्समध्ये उत्स्फूर्त EPSCs (sEPSCs) (n = 25 hCO न्यूरॉन्स, n = 17 t-hCO न्यूरॉन्स; *** P<0.0001).bf साठी, १२०८-२ ओळीतील hCO आणि t-hCO हे समांतर राखलेल्या समान भिन्नता बॅचमधून घेतले गेले. g, t-hCO ग्लूटामॅटर्जिक न्यूरॉन्समध्ये लक्षणीयरीत्या अपरेग्युलेटेड जनुकांचे जीन सेट एन्रिचमेंट विश्लेषण (एकतर्फी फिशरची अचूक चाचणी) (समायोजित P < 0.05, फोल्ड चेंज > 2, न्यूक्लीच्या किमान 10% मध्ये व्यक्त केलेले) hCO ग्लूटामॅटर्जिक न्यूरॉन्सच्या तुलनेत, इन व्हिव्हो माऊस स्टडी16 आणि इन विट्रो न्यूरॉन्स17 मधील मानवी-विशिष्ट LRGs मधून ओळखल्या जाणाऱ्या सुरुवातीच्या-प्रतिसाद (ERG) आणि उशीरा-प्रतिसाद (LRG) क्रियाकलाप-अवलंबित जनुकांच्या जीन सेटसह. g, t-hCO ग्लूटामॅटर्जिक न्यूरॉन्समध्ये लक्षणीयरीत्या अपरेग्युलेटेड जनुकांचे जीन सेट एन्रिचमेंट विश्लेषण (एकतर्फी फिशरची अचूक चाचणी) (समायोजित P < 0.05, फोल्ड चेंज > 2, न्यूक्लीच्या किमान 10% मध्ये व्यक्त केलेले) hCO ग्लूटामॅटर्जिक न्यूरॉन्सच्या तुलनेत, इन व्हिव्हो माऊस स्टडी16 आणि इन विट्रो न्यूरॉन्स17 मधील मानवी-विशिष्ट LRGs मधून ओळखल्या जाणाऱ्या सुरुवातीच्या-प्रतिसाद (ERG) आणि उशीरा-प्रतिसाद (LRG) क्रियाकलाप-अवलंबित जनुकांच्या जीन सेटसह. g, анализ обогащения набора генов (односторонний точный критерий Фишера) генов со значительной активацией (скорректировань, скорректировань 5 изменения > 2, экспрессия по меньшей мере в 10% ядер) в глутаматергических нейронах t-hCO по сравнеминию с глутаматергических hCO наборы генов как раннего (ERG), так и позднего (LRG) генов, зависящих от активности, идентифицированных в исследовании на мыследовании на мыследовании на мыспишичех, मध्ये для человека LRG из нейронов in vitro17. g, इन विवो माईस16 मध्ये ओळखल्या जाणाऱ्या सुरुवातीच्या (ERG) आणि उशीरा (LRG) क्रियाकलाप-आश्रित जनुकांच्या hCO ग्लूटामेटर्जिक न्यूरॉन्स संचांच्या तुलनेत t-hCO ग्लूटामेटर्जिक न्यूरॉन्समध्ये लक्षणीय सक्रियता (समायोजित P<0.05, फोल्ड बदल >2, किमान 10% न्यूक्लीयमध्ये अभिव्यक्ती) असलेल्या जनुकांच्या जीन सेट समृद्धीचे विश्लेषण आणि इन विट्रो17 मधील न्यूरॉन्समधील मानवी-विशिष्ट LRG. g,t-hCO谷氨酸能神经元与hCO谷氨酸能神经元相比,t -hCO谷氨酸能神经元显着上调（调整后P<0.05,倍数变化>2,在至少10%的细胞核中表达）的基因集富集分析（单侧F isher精确检验）从体内小鼠研究中鉴定的早期反应(ERG)和晚期反应(LRG) 活性依赖性基因的基因组16 和体外神经元17 中的人类特异。LG.L.G. g ， t-hco 谷氨酸 神经 元 与 hco 谷氨酸 神经 元 相比 ， t-hco 谷氨酸 神经 元 谨酸 神经 元 谨酸 神经 元 调 式 有0 元 式倍数> 2, 至少 至少 10%的 细胞 核中 表达） 的 集富集 分析 （单侧 फिशर研究 中 的 早期 反应 反应 反应 和 晚期 反应 反应 (lrg) 活性 基因 的 基因组 16 和烞煥17 中 中 17 中 17 人类特异性LRG. g, глутаматергические нейроны t-hCO были значительно активизированы с глутаматергическими P<0,05, кратность изменения> 2, не менее 10% Анализ обогащения набора генов (односторонний точный тест Фишера) ранотегера) позднего гены, зависящие от активности ответа (LRG), идентифицированные в исследованиях на мышах in vivo16 आणि нейронах in vitro17. LRG, специфичные для человека. g, t-hCO ग्लूटामॅटर्जिक न्यूरॉन्स hCO ग्लूटामॅटर्जिक न्यूरॉन्सच्या तुलनेत लक्षणीयरीत्या अपरेग्युलेटेड होते (समायोजित P<0.05, फोल्ड चेंज >2, किमान 10% प्रारंभिक प्रतिसाद (ERG) आणि उशीरा प्रतिसाद जनुक समृद्धी विश्लेषण (एक-पुच्छ फिशरची अचूक चाचणी) प्रतिसाद क्रियाकलाप अवलंबून जनुके (LRGs) इन विवो माईस16 आणि इन विट्रो न्यूरॉन्समध्ये ओळखले गेले.17 मानवी विशिष्ट LRGs.ठिपकेदार रेषा 0.05.h चे बोनफेरोनी-करेक्ट केलेले P मूल्य दर्शवते, t-hCO ग्लूटामेटर्जिक न्यूरॉन्समधील LRG जनुकांच्या snRNA-seq प्रतिकृतींमध्ये GluN जनुक अभिव्यक्ती (प्रत्येक जनुकाचे स्यूडो-पॅकेज आणि स्केलिंग) लक्षणीयरीत्या अपरेग्युलेटेड होती. i, t-hCO (वरच्या) आणि hCO (खालच्या) न्यूरॉन्समध्ये SCG2 अभिव्यक्ती दर्शविणारे इम्युनोस्टेनिंग. पांढरे बाण SCG2+ पेशींकडे निर्देश करतात. स्केल बार, 25 µm. डेटा सरासरी ± मानक विचलन म्हणून व्यक्त केला जातो.
एक्स व्हिव्हो स्लाइसमध्ये आढळलेल्या t-hCO च्या वाढीव क्रियाकलापांवर आधारित, snRNA-seq ने hCO च्या तुलनेत t-hCO मध्ये जीन ट्रान्सक्रिप्ट्सचे क्रियाकलाप-आधारित अपरेग्युलेशन उघड केले. ग्लूटामेटर्जिक t-hCO न्यूरॉन्सने उशिरा प्रतिसाद क्रियाकलाप नियंत्रित करणाऱ्या जीन्सची उच्च पातळी व्यक्त केली (आकृती 2g,h), जी उंदीर आणि मानवी न्यूरॉन्समधील मागील अभ्यासात आढळली होती16,17. उदाहरणार्थ, BDNF18, SCG2, आणि OSTN, एक प्राइमेट-विशिष्ट क्रियाकलाप-नियमन करणारे जीन, hCO न्यूरॉन्सच्या तुलनेत t-hCO न्यूरॉन्समध्ये वाढलेली अभिव्यक्ती दर्शविली (आकृती 2g-i). अशाप्रकारे, ट्रान्सक्रिप्शनल, मॉर्फोलॉजिकल आणि फंक्शनल विश्लेषणाद्वारे t-hCO न्यूरॉन्सने hCO न्यूरॉन्सच्या तुलनेत वाढलेली परिपक्वता वैशिष्ट्ये प्रदर्शित केली.
मानवी मेंदूच्या विकासाशी t-hCO परिपक्वतेचा संबंध अधिक मूल्यांकन करण्यासाठी, आम्ही गर्भ आणि प्रौढ कॉर्टिकल पेशी प्रकारांची ट्रान्सक्रिप्टोमिक तुलना केली19,20 आणि प्रौढ21,22 तसेच विकासादरम्यान कॉर्टिकल जीन अभिव्यक्ती23 वरील विस्तृत डेटा (विस्तारित डेटा, आकृती 5). मागील काम 24 सह, 7-8 महिन्यांच्या भिन्नतेवर जागतिक hCO आणि t-hCO ट्रान्सक्रिप्टोम परिपक्वता स्थिती इन व्हिव्हो विकास वेळेशी मोठ्या प्रमाणात सुसंगत आहे आणि गर्भाच्या आयुष्याच्या उत्तरार्धात (विस्तारित डेटा आकृती 5a) समतुल्य आहे. उल्लेखनीय म्हणजे, आम्ही वय-जुळणाऱ्या hCO च्या तुलनेत t-hCO मध्ये वाढलेली ट्रान्सक्रिप्टोम परिपक्वता तसेच सायनाप्टोजेनेसिस, अॅस्ट्रोजेनेसिस आणि मायलिनेशनशी संबंधित ट्रान्सक्रिप्टोम सक्रियता पाहिली (विस्तारित डेटा, आकृती 5b-d). सेल्युलर स्तरावर, आम्हाला t-hCO मध्ये पातळ कॉर्टेक्स उपप्रकाराचे पुरावे आढळले, ज्यामध्ये ग्लूटामेटर्जिक न्यूरॉन्सचे क्लस्टर्स प्रौढ L2/3, L5 आणि L6 न्यूरॉन उपप्रकारांसह ओव्हरलॅप होत आहेत (आकृती 1i). याउलट, गर्भधारणेच्या मध्यात ग्लूटामेटर्जिक t-hCO न्यूरॉन्स आणि गर्भाच्या कॉर्टिकल न्यूरॉन्समधील क्लस्टर ओव्हरलॅप अधिक मर्यादित होते (विस्तारित डेटा, आकृती 5e-j). t-hCO न्यूरॉन्स मानवी प्रसवोत्तर निओकॉर्टिकल न्यूरॉन्ससारखे कार्यात्मकदृष्ट्या समान आहेत की नाही हे निर्धारित करण्यासाठी, आम्ही मानवी प्रसवोत्तर कॉर्टेक्सच्या तीक्ष्ण भागांमध्ये मानवी L2/3 पिरॅमिडल न्यूरॉन्सचे इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल रेकॉर्डिंग आणि शारीरिक पुनर्रचना केली (विस्तारित डेटा, आकृती 7a). L2/3 पिरॅमिडल न्यूरॉन्सचे इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल गुणधर्म t-hCO पिरॅमिडल न्यूरॉन्ससारखेच होते (विस्तारित डेटा, आकृती 7e). आकारशास्त्रीयदृष्ट्या, प्रसवोत्तर मानवी नमुन्यांमधील L2/3 न्यूरॉन्स hCO पेक्षा t-hCO सारखेच होते, जरी L2/3 पेशी लांब होत्या, एकूणच अधिक शाखा होत्या आणि त्यांच्या मणक्याची घनता जास्त होती (आकृती 3g आणि विस्तारित डेटा, आकृती 7b-). G).
a, नियंत्रण आणि TS hiPS पेशी रेषांनी उत्पादित केलेल्या hCO3 चे नवजात उंदरांमध्ये प्रत्यारोपण. b, 8 महिन्यांच्या भिन्नतेनंतर बायोसाइटिनने भरलेल्या t-hCO3 न्यूरॉन्सचे 3D पुनर्रचना. c, सरासरी डेंड्रिटिक लांबीचे परिमाण (n = 19 नियंत्रण न्यूरॉन्स, n = 21 TS न्यूरॉन्स; **P = 0.0041). d, 8 महिन्यांच्या भिन्नतेवर नियंत्रण आणि TS t-hCO3 मधून 3D-पुनर्निर्मित डेंड्रिटिक शाखा, आणि डेंड्रिटिक स्पाइन डेन्सिटीचे प्रमाणीकरण (n = 16 कंट्रोल न्यूरॉन्स, n = 21 TS न्यूरॉन्स, ***P < 0.0001). d, 8 महिन्यांच्या भिन्नतेवर नियंत्रण आणि TS t-hCO3 मधून 3D-पुनर्निर्मित डेंड्रिटिक शाखा, आणि डेंड्रिटिक स्पाइन डेन्सिटीचे प्रमाणीकरण (n = 16 कंट्रोल न्यूरॉन्स, n = 21 TS न्यूरॉन्स, ***P < 0.0001). d, 3D-реконструкция дендритных ветвей из контроля и TS t-hCO через 8 месяцев дифференцировки и количественная оцедритных оцедритных шипов (n = 16 контрольных нейронов, n = 21 TS нейронов, *** P <0,0001). d, ८ महिन्यांच्या भिन्नता आणि डेंड्रिटिक स्पाइन डेन्सिटी क्वांटिफिकेशनवर नियंत्रण आणि t-hCO TS पासून डेंड्रिटिक शाखांचे ३D पुनर्बांधणी (n=१६ कंट्रोल न्यूरॉन्स, n=२१ TS न्यूरॉन्स, ***P<०.०००१). d，分化8 个月时对照和TS t-hCO 的3D 重建树突分支，以及树突棘密度的量化（n = 16 个煥煥的量化（n 21 个TS 神经元,***P <0.0001）. d ， 分化 8 个 时 对照 和 ts t-hco 的 3d 重建 分支 分支 以及 树突棘 密度 量化 61元 ， n = 21 个 ts 神经 ， *** p <0.0001 ）. d, 3D-реконструкция дендритных ветвей контроля и TS t-hCO через 8 месяцев дифференцировки и количественная оцентвей контроля шипов (n = 16 контрольных нейронов, n = 21 TS нейронов, *** P <0,0001). d, ८ महिन्यांच्या भिन्नता आणि डेंड्रिटिक स्पाइन डेन्सिटी क्वांटिफिकेशनवर कंट्रोल डेंड्रिटिक ब्रँच आणि TS t-hCO3 चे ३D पुनर्बांधणी (n=१६ कंट्रोल न्यूरॉन्स, n=२१ TS न्यूरॉन्स, ***P<०.०००१).लाल तारे हे कल्पित डेंड्रिटिक स्पाइन दर्शवतात. e, नियंत्रणात असलेले उत्स्फूर्त EPSC आणि 8 महिन्यांच्या भिन्नतेनंतर TS t-hCO न्यूरॉन्स. f, संचयी वारंवारता प्लॉट आणि सिनॅप्टिक घटनांच्या वारंवारता आणि मोठेपणाचे प्रमाणीकरण (n=32 नियंत्रण न्यूरॉन्स, n=26 TS न्यूरॉन्स; **P=0.0076 आणि P=0.8102). g, hCO आणि t-hCO मधील TS आणि नियंत्रण न्यूरॉन्सचे स्कॉल विश्लेषण. तुटक रेषा तुलनेसाठी मानवी L2/3 प्रसवोत्तर पिरामिडल न्यूरॉन्स दर्शवतात (n = 24 नियंत्रण t-hCO न्यूरॉन्स, n = 21 TS t-hCO न्यूरॉन्स, n = 8 नियंत्रण hCO न्यूरॉन्स आणि n = 7 TS hCO न्यूरॉन्स). डेटा सरासरी ± मानक विचलन म्हणून व्यक्त केला जातो.
उच्च पातळीवर मानवी कॉर्टेक्स न्यूरॉन्सच्या आकारिकीय आणि कार्यात्मक वैशिष्ट्यांची प्रतिकृती तयार करण्याची t-hCO ची क्षमता आम्हाला रोगाच्या फेनोटाइप शोधण्यासाठी t-hCO चा वापर करता येईल का याचा शोध घेण्यास प्रवृत्त करते. आम्ही TS वर लक्ष केंद्रित केले, जो CaV1.2 एन्कोडिंग जनुकातील कार्यक्षमतेच्या उत्परिवर्तनांमुळे होणारा एक गंभीर न्यूरोडेव्हलपमेंटल डिसऑर्डर आहे, जो न्यूरॉन्समध्ये क्रियाकलाप-अवलंबित जीन ट्रान्सक्रिप्शन सुरू करतो. आम्ही सर्वात सामान्य प्रतिस्थापन (p.G406R) आणि तीन नियंत्रणे (आकृती 3a) असलेल्या तीन TS रुग्णांकडून hCO मिळवला. प्रत्यारोपणानंतर, आम्हाला आढळले की नियंत्रणांच्या तुलनेत TS न्यूरॉन्समध्ये डेंड्रिटिक आकारविज्ञान बदलले गेले (आकृती 3b आणि विस्तारित डेटा, आकृती 8a,b), प्राथमिक डेंड्रिट्सच्या संख्येत दुप्पट वाढ आणि सरासरीमध्ये एकूण वाढ आणि डेंड्रिटिक लांबीमध्ये एकूण घट (आकृती 3c आणि विस्तारित डेटा, आकृती 8c). हे कंट्रोल न्यूरॉन्सच्या तुलनेत TS मध्ये मणक्यांच्या वाढत्या घनतेशी आणि उत्स्फूर्त EPSCs च्या वाढीव वारंवारतेशी संबंधित होते (आकृती 3d–f आणि विस्तारित डेटा, आकृती 8g). पुढील विश्लेषणातून नियंत्रणांच्या तुलनेत t-hCO TS मध्ये असामान्य डेंड्रिटिक ब्रांचिंगचे नमुने आढळले, परंतु विभक्ततेच्या समान टप्प्यावर इन विट्रो TS hCO मध्ये नाही (आकृती 3g). हे TS मध्ये क्रियाकलाप-आधारित डेंड्रिटिक संकोचनाच्या आमच्या मागील अहवालांशी सुसंगत आहे आणि या प्रत्यारोपण प्लॅटफॉर्मची विवोमध्ये रोग फेनोटाइप शोधण्याची क्षमता अधोरेखित करते.
त्यानंतर आम्ही विचारले की उंदीर S1 मध्ये t-hCO पेशी किती प्रमाणात कार्यात्मकपणे एकत्रित होतात. उंदीरांमधील S1 ला ipsilateral ventral basal आणि posterior thalamic nuclei, तसेच ipsilateral motor आणि secondary somatosensory cortices आणि contralateral S1 कडून मजबूत synaptic इनपुट मिळतात (आकृती 4a). innervation pattern पुनर्संचयित करण्यासाठी, आम्ही hCO ला रेबीज व्हायरस-dG-GFP/AAV-G ने संक्रमित केले आणि 3 दिवसांनी S1 उंदरामध्ये hCO चे प्रत्यारोपण केले. प्रत्यारोपणानंतर 7-14 दिवसांनी ipsilateral S1 आणि ventral basal ganglia च्या न्यूरॉन्समध्ये आम्ही दाट GFP अभिव्यक्ती पाहिली (आकृती 4b, c). याव्यतिरिक्त, थॅलेमिक मार्कर नेट्रिन G1 च्या अँटीबॉडी स्टेनिंगने t-hCO मध्ये थॅलेमिक एंडिंगची उपस्थिती उघड केली (आकृती 4d, e). हे afferent projections t-hCO पेशींमध्ये synaptic प्रतिसाद निर्माण करू शकतात का याचे मूल्यांकन करण्यासाठी, आम्ही थॅलेमोकॉर्टिकल लेयरच्या तीक्ष्ण भागांमध्ये मानवी पेशींमधून संपूर्ण पेशी रेकॉर्डिंग केले. उंदराच्या S1 चे विद्युत उत्तेजन, अंतर्गत कॅप्सूल, पांढरे पदार्थ, t-hCO जवळील तंतू किंवा t-hCO मध्ये ऑप्सिन-अभिव्यक्त करणाऱ्या थॅलेमिक एंडिंग्जचे ऑप्टोजेनेटिक सक्रियकरण यामुळे AMPA रिसेप्टर अँटागोनिस्ट NBQX च्या संपर्कात आलेल्या t-hCO न्यूरॉन्समध्ये शॉर्ट-लेटन्सी EPSCs प्रेरित होतात. (आकृती 4f, g आणि विस्तारित डेटा, आकृती 9a-g). हे डेटा दर्शविते की t-hCO हे उंदराच्या मेंदूमध्ये शारीरिकदृष्ट्या एकत्रित केले जाते आणि उंदराच्या यजमान ऊतीद्वारे सक्रिय केले जाऊ शकते.
a, रेबीज ट्रॅकिंग प्रयोगाचा योजनाबद्ध आकृती. b, GFP आणि t-hCO आणि उंदराच्या सेरेब्रल कॉर्टेक्स (वरच्या पॅनेल) मधील मानव-विशिष्ट STEM121 अभिव्यक्ती. उंदराच्या ipsilateral ventral basal nucleus (VB) (खाली डावीकडे) आणि ipsilateral S1 (खाली उजवीकडे) मधील GFP अभिव्यक्ती देखील दर्शविली आहे. स्केल बार, 50 µm. लाल चौरस मेंदूच्या त्या क्षेत्रांचे प्रतिनिधित्व करतात जिथे प्रतिमा घेतल्या गेल्या. c, GFP व्यक्त करणाऱ्या पेशींचे प्रमाणीकरण (n = 4 उंदीर). d, e — t-hCO मध्ये नेट्रिन G1+ थॅलेमिक टर्मिनल्स. d मध्ये t-hCO आणि VB केंद्रक असलेला कोरोनल विभाग दर्शविला आहे. स्केल बार, 2 मिमी. e मध्ये t-hCO (डावीकडे) आणि VB (उजवीकडे) न्यूरॉन्समध्ये नेट्रिन G1 आणि STEM121 अभिव्यक्ती दर्शविली आहे. स्केल बार, 50 µm. नारिंगी ठिपके असलेली रेषा t-hCO सीमा दर्शवते. f, g, S1 उंदीर (f) किंवा अंतर्गत कॅप्सूल (g), (जांभळा) किंवा त्याशिवाय (काळा) NBQX (डावीकडे) मध्ये विद्युत उत्तेजनानंतर t-hCO न्यूरॉन्सचे वर्तमान ट्रेस. NBQX (n = 6 S1 न्यूरॉन्स, *P = 0.0119; आणि n = 6 अंतर्गत कॅप्सूल न्यूरॉन्स, **P = 0.0022) (मध्यभागी) सह आणि त्याशिवाय EPSC मोठेपणा. उंदीर S1 (f) किंवा अंतर्गत कॅप्सूल (g) (उजवीकडे) च्या विद्युत उत्तेजनाच्या प्रतिसादात EPSC दर्शविणारे t-hCO न्यूरॉन्सची टक्केवारी. aCSF, कृत्रिम सेरेब्रोस्पाइनल फ्लुइड. h, 2P इमेजिंग प्रयोगाचा योजनाबद्ध आकृती (डावीकडे). t-hCO मध्ये GCaMP6s ची अभिव्यक्ती (मध्यभागी). स्केल बार, 100 µm. GCaMP6s (उजवीकडे) चा प्रतिदीप्ति वेळ समाप्त. i, उत्स्फूर्त क्रियाकलाप प्रतिदीप्तिचा Z-स्कोअर. j, मिशा उत्तेजनाचे योजनाबद्ध चित्रण. k, एका चाचणीत z-स्कोअर केलेले 2P फ्लूरोसेन्स ट्रॅजेक्टोरीज, उदाहरणार्थ पेशींमध्ये शून्य वेळेवर व्हिस्कर विचलनासह संरेखित. l, शून्य वेळेवर व्हिस्कर विचलनासह संरेखित सर्व पेशींचे लोकसंख्या-सरासरी z-स्कोअर प्रतिसाद (डॅश केलेली रेषा) (लाल) किंवा यादृच्छिकपणे व्युत्पन्न केलेले टाइमस्टॅम्प (राखाडी). m. ऑप्टिकल मार्किंगवरील प्रयोगाचे योजनाबद्ध आकृती. n, निळ्या लेसर उत्तेजना किंवा व्हिस्कर विचलन दरम्यान t-hCO सेलच्या उदाहरणावरून रॉ व्होल्टेज वक्र. लाल बाण प्रकाशामुळे (वर) किंवा व्हिस्कर विचलनामुळे (तळाशी) उद्भवणारे पहिले स्पाइक दर्शवितात. राखाडी शेडिंग व्हिस्कर विचलनाचा कालावधी दर्शविते. o, पीक लाइट वेव्हफॉर्म आणि व्हिस्कर विचलन प्रतिसाद. p, एका प्रयत्नाचे स्पाइक, उदाहरणाच्या पेशींमध्ये व्हिस्करच्या विचलनासह संरेखित. 0 व्हिस्कर विचलन (डॅश केलेली रेषा) दर्शविते. q, सर्व प्रकाशसंवेदनशील पेशींसाठी लोकसंख्या-सरासरी z-स्कोअर फायरिंग रेट, शून्य वेळेवर व्हिस्कर विचलनासह संरेखित (राखाडी) किंवा यादृच्छिकपणे व्युत्पन्न केलेले टाइमस्टॅम्प (राखाडी). r, व्हिस्कर विचलनाद्वारे लक्षणीयरीत्या मॉड्युलेट केलेल्या प्रकाशसंवेदनशील युनिट्सचे प्रमाण (n = 3 उंदीर) (डावीकडे). पीक z-स्कोअर लेटन्सी (n = 3 उंदीर; n = 5 (हलका हिरवा), n = 4 (गडद हिरवा), आणि n = 4 (निळसर) व्हिस्कर विचलन मॉड्युलेशन युनिट्स प्रति उंदीर) (उजवीकडे). डेटा सरासरी ± मानक विचलन म्हणून व्यक्त केला जातो.
त्यानंतर आम्ही विचारले की t-hCO हे संवेदी उत्तेजनांद्वारे सक्रिय केले जाऊ शकते का? आम्ही S1 उंदरांमध्ये अनुवांशिकरित्या एन्कोड केलेले कॅल्शियम निर्देशक GCaMP6 व्यक्त करणारे hCO प्रत्यारोपित केले. 150 दिवसांनंतर, आम्ही फायबर फोटोमेट्री किंवा टू-फोटॉन कॅल्शियम इमेजिंग केले (आकृती 4h आणि विस्तारित डेटा, आकृती 10a). आम्हाला आढळले की t-hCO पेशींनी समक्रमित लयबद्ध क्रियाकलाप प्रदर्शित केला (आकृती 4i, विस्तारित डेटा, आकृती 10b आणि पूरक व्हिडिओ 1). पीक t-hCO क्रियाकलापाचे वैशिष्ट्यीकृत करण्यासाठी, आम्ही भूल देणाऱ्या प्रत्यारोपण उंदरांमध्ये बाह्य पेशीय इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल रेकॉर्डिंग केले (विस्तारित डेटा, आकृती 10c-f). आम्ही MRI प्रतिमांमधून स्टिरिओटॅक्सिक निर्देशांक तयार केले आहेत; अशा प्रकारे, हे रेकॉर्ड केलेले युनिट्स पुटेटिव्ह मानवी न्यूरॉन्सचे प्रतिनिधित्व करतात, जरी केवळ इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी उत्पत्तीची प्रजाती निश्चित करण्यास परवानगी देत ​​नाही. आम्ही क्रियाकलापांचे समक्रमित स्फोट पाहिले (विस्तारित डेटा, आकृती 10d). हे स्फोट सुमारे ४६० मिलीसेकंद चालले आणि सुमारे २ सेकंदांच्या शांततेच्या कालावधीने वेगळे केले गेले (विस्तारित डेटा, आकृती १०d, e). वैयक्तिक युनिट्सनी प्रति स्फोट सरासरी तीन राउंड फायर केले, जे प्रति स्फोट नोंदणीकृत युनिट्सच्या अंदाजे ७३% आहे. वैयक्तिक युनिट्सच्या क्रियाकलापांमध्ये अत्यंत सहसंबंध होते आणि हे सहसंबंध समान परिस्थितीत नोंदवलेल्या लसीकरण न केलेल्या प्राण्यांमध्ये ओळखल्या जाणाऱ्या युनिट्सपेक्षा जास्त होते (विस्तारित डेटा, आकृती १०f). ओळखल्या जाणाऱ्या मानवी-व्युत्पन्न न्यूरॉन्सच्या स्पाइक प्रतिसादांचे अधिक वैशिष्ट्यीकरण करण्यासाठी, आम्ही प्रकाश-संवेदनशील केशन चॅनेल रोडोपसिन २ (hChR2) व्यक्त करणाऱ्या hCO सह प्रत्यारोपित केलेल्या भूल देणाऱ्या उंदरांवर प्रकाश-टॅगिंग प्रयोग केले, ज्याद्वारे t-hCO न्यूरॉन्स निळ्या प्रकाशाच्या उत्तेजनांना प्रतिसाद म्हणून शॉर्ट-लेटन्सी ओळख (१० मिलीसेकंद पेक्षा कमी) (आकृती ४m–o). t-hCO न्यूरॉन्समध्ये कॅल्शियम इमेजिंगमध्ये आढळलेल्या फ्रिक्वेन्सीजप्रमाणेच उत्स्फूर्त क्रियाकलापांचे स्फोट दिसून आले, तसेच प्रकाश चिन्हांकन नसताना t-hCO मध्ये केलेल्या इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल रेकॉर्डिंग्ज देखील दिसून आल्या (विस्तारित डेटा, आकृती 10c-g). इन विट्रोमध्ये नोंदवलेल्या hCO च्या संबंधित टप्प्यांमध्ये कोणतीही उत्स्फूर्त क्रियाकलाप दिसून आला नाही. संवेदी उत्तेजनांद्वारे t-hCO सक्रिय केले जाऊ शकते का याचे मूल्यांकन करण्यासाठी, आम्ही उंदरांच्या मिशा थोडक्यात t-hCO पासून दूर वळवल्या (आकृती 4j,m आणि विस्तारित डेटा, आकृती 10h,k). मागील अभ्यासांनुसार 8,10, t-hCO पेशींच्या उपसमूहाने मिशा विक्षेपणाच्या प्रतिसादात वाढलेली क्रियाकलाप दर्शविली, जी डेटाची तुलना यादृच्छिक टाइम स्टॅम्पशी केली तेव्हा दिसून आली नाही (आकृती 4k–q आणि विस्तारित डेटा, आकृती 10h–q). खरंच, ऑप्टो-लेबल केलेल्या सिंगल युनिट्सपैकी सुमारे 54% ने मिशा उत्तेजित झाल्यानंतर लक्षणीयरीत्या वाढलेला उत्तेजना दर दर्शविला, जो सुमारे 650 ms (आकृती 4r) वर पोहोचला. एकत्रितपणे, हे डेटा सूचित करतात की t-hCO योग्य कार्यात्मक इनपुट प्राप्त करते आणि पर्यावरणीय उत्तेजनांद्वारे सक्रिय केले जाऊ शकते.
त्यानंतर आम्ही तपास केला की t-hCO उंदरांमध्ये वर्तन नियंत्रित करण्यासाठी सर्किट सक्रिय करू शकते का. आम्ही प्रथम तपासले की t-hCO न्यूरॉन्सचे अक्ष उंदराच्या आसपासच्या ऊतींमध्ये प्रक्षेपित होतात का. आम्ही hCO ला EYFP (hChR2-EYFP) मध्ये फ्यूज केलेल्या hChR2 एन्कोडिंग लेन्टीव्हायरसने संक्रमित केले. 110 दिवसांनंतर, आम्ही श्रवण, मोटर आणि सोमाटोसेन्सरी कॉर्टिसेससह आयप्सिलेटरल कॉर्टिकल क्षेत्रांमध्ये तसेच स्ट्रायटम, हिप्पोकॅम्पस आणि थॅलेमससह सबकॉर्टिकल क्षेत्रांमध्ये EYFP अभिव्यक्ती पाहिली (आकृती 5a). हे अपवर्तन प्रक्षेपण उंदरांच्या पेशींमध्ये सिनॅप्टिक प्रतिसाद निर्माण करू शकतात का याचे मूल्यांकन करण्यासाठी, आम्ही तीक्ष्ण मेंदूच्या विभागांमध्ये उंदरांच्या सेरेब्रल कॉर्टेक्स पेशी रेकॉर्ड करून hChR2-EYFP व्यक्त करणाऱ्या t-hCO पेशींना ऑप्टिकली सक्रिय केले. NBQX द्वारे अवरोधित केलेल्या उंदरांच्या पिरॅमिडल कॉर्टेक्स न्यूरॉन्समध्ये निळ्या प्रकाशाने प्रेरित शॉर्ट-लेटन्सी EPSCs सह t-hCO अक्षांचे सक्रियकरण (आकृती 5b-g). याव्यतिरिक्त, या प्रतिक्रिया टेट्रोडोटॉक्सिन (TTX) द्वारे अवरोधित केल्या जाऊ शकतात आणि 4-एमिनोपायरीडिन (4-AP) द्वारे पुनर्संचयित केल्या जाऊ शकतात, जे सूचित करते की ते मोनोसिनॅप्टिक कनेक्शनमुळे झाले आहेत (आकृती 5e).
a, अ‍ॅक्सॉन ट्रॅकिंगचा स्कीमॅटिक आकृती (डावीकडे). t-hCO EYFP अभिव्यक्ती (उजवीकडे). स्केल बार, १०० µm. A1, श्रवण कॉर्टेक्स, ACC, अँटीरियर सिंग्युलेट कॉर्टेक्स, d. स्ट्रायटम, डोर्सल स्ट्रायटम, HPC, हिप्पोकॅम्पस; डायाफ्राम, लॅटरल सेप्टम, mPFC, मेडियल प्रीफ्रंटल कॉर्टेक्स, पिरी, पिरिफॉर्म कॉर्टेक्स, v. स्ट्रायटम, व्हेंट्रल स्ट्रायटम, VPM, थॅलेमसचा व्हेंट्रोपोस्टोमेडियल न्यूक्लियस, VTA, व्हेंट्रल टेगमेंटल प्रदेश. लाल चौरस मेंदूच्या त्या भागांचे प्रतिनिधित्व करतात जिथे प्रतिमा घेतल्या गेल्या होत्या. b, उत्तेजना प्रयोगाचा स्कीमॅटिक आकृती. c, d, मानवांमध्ये निळ्या प्रकाश-प्रेरित फोटोकरंट (वर) आणि व्होल्टेज (तळाशी) च्या प्रतिसादाची उदाहरणे (c) EYFP+ t-hCO किंवा उंदीर (d) EYFP- पेशी. e, f, TTX आणि 4-AR (हिरवा), TTX (राखाडी) किंवा aCSF (काळा) (e), (जांभळा) किंवा त्याशिवाय (काळा) ) सह t-hCO अक्षांच्या निळ्या प्रकाश उत्तेजनानंतर उंदराच्या न्यूरॉन्सचे वर्तमान ट्रेस NBQX (e). g, उंदराच्या पेशींमध्ये निळ्या प्रकाशामुळे प्रेरित प्रतिसादांची विलंबता (n = 16 पेशी); क्षैतिज पट्ट्या सरासरी विलंबता (7.13 ms) (डावीकडे) दर्शवतात. NBQX सह किंवा त्याशिवाय रेकॉर्ड केलेल्या प्रकाश-प्रवर्तित EPSC चे मोठेपणा (n = 7 पेशी; ***P < 0.0001) (मध्यम). NBQX सह किंवा त्याशिवाय रेकॉर्ड केलेल्या प्रकाश-प्रवर्तित EPSC चे मोठेपणा (n = 7 पेशी; ***P < 0.0001) (मध्यम). Амплитуда вызванных светом EPSC, зарегистрированных с или без NBQX (n = 7 клеток; ***P <0,0001) (в центре). NBQX सह किंवा त्याशिवाय रेकॉर्ड केलेल्या प्रकाश-प्रेरित EPSC चे मोठेपणा (n = 7 पेशी; ***P < 0.0001) (मध्यभागी).使用或不使用NBQX 记录的光诱发EPSC 的振幅（n = 7 个细胞；***P < 0.0001）（中）.使用或不使用NBQX 记录的光诱发EPSC 的振幅（n = 7 个细胞；***P < 0.0001）（中）. Амплитуда вызванных светом EPSC, зарегистрированных с или без NBQX (n = 7 клеток; ***P <0,0001) (в центре). NBQX सह किंवा त्याशिवाय रेकॉर्ड केलेल्या प्रकाश-प्रेरित EPSC चे मोठेपणा (n = 7 पेशी; ***P < 0.0001) (मध्यभागी).निळ्या प्रकाशाला प्रतिसाद देणाऱ्या EPSC दर्शविणाऱ्या उंदराच्या पेशींची टक्केवारी (उजवीकडे). h, वर्तणुकीच्या कार्याचे योजनाबद्ध आकृती. d0, दिवस 0. i. प्रशिक्षणाच्या पहिल्या दिवशी (डावीकडे) किंवा १५ व्या दिवशी (उजवीकडे) अनुकरणीय प्राण्यांची कामगिरी. दिवस १ (डावीकडे) किंवा दिवस १५ (उजवीकडे मध्यभागी) केलेल्या चाट्यांची सरासरी संख्या (n = १५० निळ्या प्रकाशाच्या चाचण्या, n = १५० लाल प्रकाशाच्या चाचण्या; ***P < ०.०००१). दिवस १ (डावीकडे) किंवा दिवस १५ (उजवीकडे मध्यभागी) केलेल्या चाट्यांची सरासरी संख्या (n = १५० निळ्या प्रकाशाच्या चाचण्या, n = १५० लाल प्रकाशाच्या चाचण्या; ***P < ०.०००१). Среднее количество облизываний, выполненных в день 1 (слева) или день 15 (в центре справа) (n = 150 испытаний с = свимений) испытаний с красным светом ***P <0,0001). दिवस १ (डावीकडे) किंवा दिवस १५ (मध्यभागी उजवीकडे) रोजी केलेल्या चाट्यांची सरासरी संख्या (n = १५० निळ्या प्रकाशाच्या चाचण्या, n = १५० लाल प्रकाशाच्या चाचण्या; ***P < ०.०००१).第1 天（左）或第15 天（右中）执行的平均舔次数（n = 150 次蓝光试验，n = 150次红光试验；**P <0.0001）.第1 天（左）或第15 天（右中）执行的平均舔次数（n = 150 次蓝光试验，n = 150次红光试验；**P < ०.००१ Среднее количество облизываний, выполненных в день 1 (слева) или день 15 (в центре справа) (n = 150 испытаний с = свимений) испытаний с красным светом ***P <0,0001). दिवस १ (डावीकडे) किंवा दिवस १५ (मध्यभागी उजवीकडे) रोजी केलेल्या चाट्यांची सरासरी संख्या (n = १५० निळ्या प्रकाशाच्या चाचण्या, n = १५० लाल प्रकाशाच्या चाचण्या; ***P < ०.०००१).दिवस १ (मध्यभागी डावीकडे) किंवा दिवस १५ (उजवीकडे) वर लाल आणि निळ्या प्रकाशाच्या चाचण्यांसाठी संचयी चाटणे. NS, लक्षणीय नाही. j,k, दिवस १ किंवा १५ वर hChR2-EYFP (j) व्यक्त करणाऱ्या t-hCO किंवा नियंत्रण फ्लोरोफोर (k) सह प्रत्यारोपित केलेल्या सर्व प्राण्यांची वर्तणुकीय वैशिष्ट्ये (hChR2-EYFP: n = ९ उंदीर, ** P = ०.००४९; नियंत्रण: n = ९, P = ०.१४९७). l, पसंती गुणांची उत्क्रांती (n = 9 hChR2, n = 9 नियंत्रण; **P < 0.001, ***P < 0.0001). l, पसंती गुणांची उत्क्रांती (n = 9 hChR2, n = 9 नियंत्रण; **P < 0.001, ***P < 0.0001). l, Эволюция показателя предпочтения (n = 9 hChR2, n = 9 контрольных; **P <0,001, ***P <0,0001). l, पसंती गुणांची उत्क्रांती (n = 9 hChR2, n = 9 नियंत्रणे; **P < 0.001, ***P < 0.0001). l，偏好评分的演变（n = 9 hChR2，n = 9 对照；**P < 0.001，***P < 0.0001）. l，偏好评分的演变（n = 9 hChR2，n = 9 对照；**P < 0.001，***P < 0.0001）. l, Эволюция показателей предпочтения (n = 9 hChR2, n = 9 контролей; **P <0,001, ***P <0,0001). l, पसंती गुणांची उत्क्रांती (n = 9 hChR2, n = 9 नियंत्रणे; **P < 0.001, ***P < 0.0001).m, S1 मध्ये t-hCO च्या ऑप्टोजेनेटिक सक्रियतेच्या प्रतिसादात FOS अभिव्यक्ती. FOS अभिव्यक्ती (डावीकडे) आणि परिमाणीकरण (n = 3 प्रति गट; *P < 0.05, **P < 0.01 आणि ***P < 0.001) (उजवीकडे) च्या प्रतिमा दर्शविल्या आहेत. FOS अभिव्यक्ती (डावीकडे) आणि परिमाणीकरण (n = 3 प्रति गट; *P < 0.05, **P < 0.01 आणि ***P < 0.001) (उजवीकडे) च्या प्रतिमा दर्शविल्या आहेत. Показаны изображения экспрессии FOS (слева) и количественного определения (n = 3 на группу; * P <0,05, ** P <0,01 и *** P <0,01) (0,01). FOS अभिव्यक्ती (डावीकडे) आणि परिमाणीकरणाच्या प्रतिमा (n = 3 प्रति गट; *P<0.05, **P<0.01, आणि ***P<0.001) दर्शविल्या आहेत (उजवीकडे).显示了FOS 表达（左）和量化（每组n = 3；*P < 0.05、**P < 0.01 和***P < 0.001）（叾叾ﾼ显示了FOS 表达（左）和量化（每组n = 3；*P < 0.05、**P < 0.01 和***P < 0.001）（叾叾ﾼ Показаны изображения экспрессии FOS (слева) и количественного определения (n = 3 на группу; * P <0,05, ** P <0,01 и *** P <0,01) (0,01). FOS अभिव्यक्ती (डावीकडे) आणि परिमाणीकरणाच्या प्रतिमा (n = 3 प्रति गट; *P<0.05, **P<0.01, आणि ***P<0.001) दर्शविल्या आहेत (उजवीकडे).स्केल बार, १०० µm. डेटा सरासरी ± BLA, बेसोलॅटरल टॉन्सिल, MDT, डोर्सोमेडियल थॅलेमिक न्यूक्लियस, PAG, पेरियाक्वेडक्टल ग्रे ची मानक त्रुटी म्हणून व्यक्त केला जातो.
शेवटी, आम्ही विचारले की t-hCO उंदरांच्या वर्तनात बदल करू शकते का. हे तपासण्यासाठी, आम्ही hChR2-EYFP-अभिव्यक्त करणाऱ्या hCO चे S1 मध्ये प्रत्यारोपण केले आणि 90 दिवसांनंतर, आम्ही प्रकाश वितरणासाठी t-hCO मध्ये ऑप्टिकल फायबरचे रोपण केले. त्यानंतर आम्ही उंदरांना सुधारित ऑपरेटंट कंडिशनिंग पॅराडाइम (आकृती 5h) सह प्रशिक्षित केले. आम्ही प्राण्यांना वर्तणुकीय चाचणी कक्षात ठेवले आणि यादृच्छिकपणे 5 सेकंद निळा (473 nm) आणि लाल (635 nm) लेसर उत्तेजना लागू केल्या. जर प्राण्यांनी निळ्या प्रकाशाच्या उत्तेजनादरम्यान चाटले परंतु लाल प्रकाशाच्या उत्तेजनादरम्यान चाटले नाही तर त्यांना पाण्याचे बक्षीस मिळाले. प्रशिक्षणाच्या पहिल्या दिवशी, प्राण्यांना निळ्या किंवा लाल प्रकाशाने उत्तेजित केल्यावर चाटण्यात कोणताही फरक दिसला नाही. तथापि, 15 व्या दिवशी, hChR2-EYFP व्यक्त करणाऱ्या hCO ने प्रत्यारोपित केलेल्या प्राण्यांनी लाल प्रकाशाच्या उत्तेजनाच्या तुलनेत निळ्या प्रकाशाने उत्तेजित केल्यावर अधिक सक्रिय चाट दाखवली. चाटण्याच्या वर्तनातील हे बदल नियंत्रण फ्लोरोफोर व्यक्त करणाऱ्या hCO सह प्रत्यारोपित केलेल्या नियंत्रित प्राण्यांमध्ये आढळले नाहीत (शिकण्याचा यश दर: hChR2 89%, EYFP 0%, आकृती 5i-1 आणि पूरक व्हिडिओ 2). हे डेटा सूचित करतात की t-hCO पेशी उंदरांच्या न्यूरॉन्सना बक्षीस शोधण्याच्या वर्तनाला उत्तेजन देण्यासाठी सक्रिय करू शकतात. या वर्तनात्मक बदलांमध्ये कोणते उंदराचे t-hCO न्यूरल सर्किट सहभागी असू शकतात हे शोधण्यासाठी, आम्ही 90 मिनिटांनंतर प्रशिक्षित प्राण्यांमध्ये आणि कापणी केलेल्या ऊतींमध्ये ऑप्टोजेनेटिकली t-hCO सक्रिय केले. इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्रीने प्रेरित वर्तनात गुंतलेल्या अनेक मेंदूच्या क्षेत्रांमध्ये क्रियाकलाप-आधारित FOS प्रथिनाची अभिव्यक्ती उघड केली, ज्यामध्ये मध्यवर्ती प्रीफ्रंटल कॉर्टेक्स, मध्यवर्ती थॅलेमस आणि पेरियाक्वेडक्टल ग्रे मॅटरचा समावेश आहे, जो एकतर उत्तेजित नियंत्रण प्राण्यांमध्ये किंवा प्राण्यांमध्ये व्यक्त केला गेला होता. तांदूळ. 5m). एकत्रितपणे, हे डेटा सूचित करतात की t-hCO वर्तन चालविण्यासाठी उंदरांच्या न्यूरोनल क्रियाकलापांचे नियमन करू शकते.
मानवी विकास आणि रोगांचा अभ्यास करण्यासाठी इन विट्रोमध्ये न्यूरल ऑर्गेनॉइड्स एक आशादायक प्रणाली दर्शवतात, परंतु इन विव्हॉमध्ये अस्तित्वात असलेल्या सर्किट्समधील कनेक्शनच्या अभावामुळे ते मर्यादित आहेत. आम्ही एक नवीन प्लॅटफॉर्म विकसित केला आहे ज्यामध्ये आम्ही मानवी पेशी विकास आणि इन विव्हॉमध्ये कार्याचा अभ्यास करण्यासाठी इम्युनोकॉम्प्रोमाइज्ड अर्ली पोस्टनेटल उंदरांच्या S1 मध्ये hCO चे प्रत्यारोपण केले आहे. आम्ही दाखवून दिले आहे की t-hCO इन विट्रोमध्ये न पाहिलेले परिपक्व पेशी प्रकार विकसित करते आणि t-hCO उंदीर मेंदूमध्ये शारीरिक आणि कार्यात्मकपणे एकत्रित केले जाते. उंदीर न्यूरल सर्किट्समध्ये t-hCO चे एकत्रीकरण केल्याने आम्हाला मानवी पेशी क्रियाकलाप आणि अभ्यासलेल्या प्राण्यांच्या वर्तनात दुवा स्थापित करण्याची परवानगी मिळाली, हे दर्शविते की t-hCO न्यूरॉन्स वर्तनात्मक प्रतिक्रिया चालविण्यासाठी उंदीर न्यूरोनल क्रियाकलाप नियंत्रित करू शकतात.
आम्ही ज्या प्लॅटफॉर्मचे वर्णन करतो त्याचे उंदीरांच्या मेंदूमध्ये मानवी पेशींचे प्रत्यारोपण करण्याच्या मागील संशोधनापेक्षा अनेक फायदे आहेत. प्रथम, आम्ही जन्मपूर्व उंदरांच्या विकसनशील कॉर्टेक्समध्ये hCO3 चे प्रत्यारोपण केले, जे शारीरिक आणि कार्यात्मक एकात्मता सुलभ करू शकते. दुसरे, t-hCO3 एमआरआय मॉनिटरिंगमुळे आम्हाला जिवंत प्राण्यांमध्ये ग्राफ्ट स्थिती आणि वाढीचा अभ्यास करण्याची परवानगी मिळाली, ज्यामुळे आम्हाला दीर्घकालीन बहु-प्राणी अभ्यास करता आला आणि अनेक hiPS पेशी रेषांची विश्वासार्हता स्थापित करता आली. शेवटी, आम्ही वेगळ्या सिंगल सेल सस्पेंशनऐवजी अखंड ऑर्गेनॉइड्सचे प्रत्यारोपण केले, जे मानवी पेशींसाठी कमी विध्वंसक आहेत आणि उंदरांच्या मेंदूमध्ये मानवी कॉर्टेक्स न्यूरॉन्सचे एकात्मता आणि निर्मितीला प्रोत्साहन देऊ शकतात.
आम्ही हे मान्य करतो की या प्लॅटफॉर्ममध्ये प्रगती असूनही, ऐहिक, अवकाशीय आणि क्रॉस-प्रजातींच्या अडचणी मानवी न्यूरल सर्किट्सची निर्मिती उच्च निष्ठेसह रोखतात, अगदी विकासाच्या सुरुवातीच्या टप्प्यावर प्रत्यारोपणानंतरही. उदाहरणार्थ, t-hCO मध्ये आढळणारी उत्स्फूर्त क्रियाकलाप कॉर्टिकल विकासादरम्यान आढळणाऱ्या लयबद्ध क्रियाकलापांसारखीच विकासात्मक फेनोटाइप दर्शवते की ती t-hCO मध्ये उपस्थित असलेल्या दमनशील पेशी प्रकारांच्या अनुपस्थितीमुळे आहे हे स्पष्ट नाही. त्याचप्रमाणे, t-hCO मध्ये लॅमिनेशनची अनुपस्थिती साखळी कनेक्टिव्हिटीवर किती प्रमाणात परिणाम करते हे स्पष्ट नाही. भविष्यातील कार्य मानवी मायक्रोग्लिया, मानवी एंडोथेलियल पेशी आणि GABAergic इंटरन्यूरॉन्सचे वेगवेगळे प्रमाण यासारख्या इतर पेशी प्रकारांना एकत्रित करण्यावर लक्ष केंद्रित करेल, जसे की असेंब्ली 6 इन विट्रो वापरून दर्शविले आहे, तसेच बदललेल्या t-hCO मध्ये न्यूरल इंटिग्रेशन आणि प्रक्रिया कशी होऊ शकते हे समजून घेण्यावर लक्ष केंद्रित करेल. रुग्णांकडून मिळवलेल्या पेशींमध्ये ट्रान्सक्रिप्शनल, सिनॅप्टिक आणि वर्तनात्मक पातळी.
एकंदरीत, हे इन व्हिव्हो प्लॅटफॉर्म एक शक्तिशाली संसाधन आहे जे इन विट्रो मानवी मेंदू विकास आणि रोग संशोधनाला पूरक ठरू शकते. आम्हाला अपेक्षा आहे की हे प्लॅटफॉर्म आम्हाला अन्यथा अस्पष्ट रुग्ण-व्युत्पन्न पेशींमध्ये नवीन स्ट्रँड-लेव्हल फेनोटाइप शोधण्यास आणि नवीन उपचारात्मक धोरणांची चाचणी घेण्यास अनुमती देईल.
आम्ही आधी वर्णन केल्याप्रमाणे HiPS पेशींमधून hCO2.5 निर्माण केले. फीडर लेयर्सवर कल्चर केलेल्या hiPS पेशींमधून hCO उत्पादन सुरू करण्यासाठी, डिस्पेस (0.35 mg/mL) वापरून कल्चर डिशमधून hiPS पेशींच्या अखंड वसाहती काढून टाकल्या गेल्या आणि hiPS सेल कल्चर माध्यम असलेल्या डिश असलेल्या अल्ट्रा-लो अटॅचमेंट प्लास्टिक कल्चरमध्ये हस्तांतरित केल्या गेल्या. (कॉर्निंग) ला दोन SMAD इनहिबिटर डोर्सोमॉर्फिन (5 μM; P5499, सिग्मा-अल्ड्रिच) आणि SB-431542 (10 μM; 1614, टोक्रिस) आणि ROCK इनहिबिटर Y-27632 (10 μM; S1049, सेलेकेकेम) ने पूरक केले. पहिल्या 5 दिवसांत, hiPS सेल माध्यम दररोज बदलले जात असे आणि डोर्सोमॉर्फिन आणि SB-431542 जोडले जात असे. सहाव्या दिवशी, न्यूरल स्फेरॉइड्सना न्यूरोबेसल-ए (१०८८८, लाईफ टेक्नॉलॉजीज), व्हिटॅमिन ए नसलेले बी-२७ सप्लिमेंट (१२५८७, लाईफ टेक्नॉलॉजीज), ग्लुटामॅक्स (१:१००, लाईफ टेक्नॉलॉजीज), पेनिसिलिन आणि स्ट्रेप्टोमायसिन (१:१००, लाईफ टेक्नॉलॉजीज) असलेल्या न्यूरल माध्यमात स्थानांतरित केले गेले आणि २४ व्या दिवसापर्यंत एपिडर्मल ग्रोथ फॅक्टर (EGF; २० एनजी एमएल−१; आर अँड डी सिस्टम्स) आणि फायब्रोब्लास्ट ग्रोथ फॅक्टर २ (FGF2; २० एनजी एमएल−१; आर अँड डी सिस्टम्स) ने पूरक केले गेले. २५ व्या दिवसापासून ४२ व्या दिवसापर्यंत, माध्यमाला मेंदूतून मिळवलेले न्यूरोट्रॉफिक फॅक्टर (BDNF; २० एनजी एमएल−१, पेप्रोटेक) आणि न्यूरोट्रॉफिन ३ (NT3; २० एनजी एमएल−१; पेप्रोटेक) ने पूरक केले गेले आणि दर दुसऱ्या दिवशी मध्यम बदल केले गेले. सहाव्या दिवशी, न्यूरल स्फेरॉइड्सना न्यूरोबेसल-ए (१०८८८, लाईफ टेक्नॉलॉजीज), व्हिटॅमिन ए नसलेले बी-२७ सप्लिमेंट (१२५८७, लाईफ टेक्नॉलॉजीज), ग्लुटामॅक्स (१:१००, लाईफ टेक्नॉलॉजीज), पेनिसिलिन आणि स्ट्रेप्टोमायसिन (१:१००, लाईफ टेक्नॉलॉजीज) असलेल्या न्यूरल माध्यमात स्थानांतरित केले गेले आणि २४ व्या दिवसापर्यंत एपिडर्मल ग्रोथ फॅक्टर (EGF; २० एनजी एमएल−१; आर अँड डी सिस्टम्स) आणि फायब्रोब्लास्ट ग्रोथ फॅक्टर २ (FGF2; २० एनजी एमएल−१; आर अँड डी सिस्टम्स) ने पूरक केले गेले. २५ व्या दिवसापासून ४२ व्या दिवसापर्यंत, माध्यमाला मेंदूतून मिळवलेले न्यूरोट्रॉफिक फॅक्टर (BDNF; २० एनजी एमएल−१, पेप्रोटेक) आणि न्यूरोट्रॉफिन ३ (NT3; २० एनजी एमएल−१; पेप्रोटेक) ने पूरक केले गेले आणि दर दुसऱ्या दिवशी मध्यम बदल केले गेले.सहाव्या दिवशी, न्यूरल स्फेरॉइड्सना न्यूरोबॅसल-ए (१०८८८, लाईफ टेक्नॉलॉजीज), व्हिटॅमिन ए नसलेले बी-२७ सप्लिमेंट (१२५८७, लाईफ टेक्नॉलॉजीज), ग्लुटामॅक्स (१:१००, लाईफ टेक्नॉलॉजीज), पेनिसिलिन असलेल्या न्यूरल माध्यमात स्थानांतरित करण्यात आले.и стрептомицин (1:100, लाइफ टेक्नॉलॉजीज) и дополнены эпидермальным фактором роста (EGF; 20 ng/мл; R&D Systems) и фактором роста; ng/ml; R&D सिस्टम्स) 24-го дня. आणि स्ट्रेप्टोमायसिन (१:१००, लाईफ टेक्नॉलॉजीज) आणि २४ व्या दिवसापर्यंत एपिडर्मल ग्रोथ फॅक्टर (EGF; २० एनजी/मिली; आर अँड डी सिस्टम्स) आणि फायब्रोब्लास्ट ग्रोथ फॅक्टर २ (FGF2; २० एनजी/मिली; आर अँड डी सिस्टम्स) सह पूरक.२५ ते ४२ दिवसांपर्यंत, मेंदूतून मिळणारे न्यूरोट्रॉफिक फॅक्टर (BDNF; २० एनजी एमएल-१, पेप्रोटेक) आणि न्यूरोट्रॉफिन ३ (NT3; २० एनजी एमएल-१, पेप्रोटेक) माध्यमात जोडले गेले, दर दुसऱ्या दिवशी माध्यम बदलले गेले.在悬浮的第6 天，将神经球体转移到含有neurobasal-A（10888，Life Technologies）、不含维生素A B2-7补充剂（12587，Life Technologies）、GlutaMax（1:100，Life Technologies）、青霉素的神经培养基的神经培养基中和龍龙01 तंत्रज्ञान）并辅以表皮生长因子（EGF；20 ng ml-1；R&D सिस्टम्स）和成纤维细胞生长因子2（FGF2；20 ng ml-1；R&D Systems）直至第24 天.在 悬浮 的 第 6 天 将 神经 球体 转移 含有 含有 neurobasal-a 的 含有 的 第 第 6 天 将 神经补充剂 （12587, Life Technologies） Glutamax （1: 100, Life TechNOGIS 青霉素 的 神经 培养 基 中 链霉素 ， लाइफ 1: 100 तंत्रज्ञान） 表皮 生长 因子 （（（20 ng ml-1 ； r & d Systems） 成 纤维 细胞 生长 2 （fgf2 ； 20 ng ml- 1；R&D Systems）笩謇層24. 6-й день суспензии нейросферы были переведены на добавку, содержащую нейробазал-А (10888, लाइफ टेक्नॉलॉजीज), добавку добавку витамина А (१२५८७, लाइफ टेक्नॉलॉजीज), ग्लुटामॅक्स (१:१००, लाइफ टेक्नॉलॉजीज), пенициллин- нейтрализованный стрептомицин (1:100, लाइफ टेक्नॉलॉजीज) फॅक्टोरा रोस्टा (EGF; 20 ng ml-1; R&D Systems) и фактора роста фибробластов 2 (FGF2; 20 нг мл-1) 1; सहाव्या दिवशी, न्यूरोस्फीअर सस्पेंशनला न्यूरोबेसल-ए (१०८८८, लाईफ टेक्नॉलॉजीज), व्हिटॅमिन ए नसलेले बी-२७ सप्लिमेंट (१२५८७, लाईफ टेक्नॉलॉजीज), ग्लुटामॅक्स (१:१००, लाईफ टेक्नॉलॉजीज), पेनिसिलिन-न्यूट्रलाइज्ड स्ट्रेप्टोमायसिन (१:१००, लाईफ टेक्नॉलॉजीज) असलेल्या सप्लिमेंटमध्ये बदलण्यात आले ज्यामध्ये एपिडर्मल ग्रोथ फॅक्टर (EGF; २० एनजी एमएल-१; आर अँड डी सिस्टम्स) आणि फायब्रोब्लास्ट ग्रोथ फॅक्टर २ (FGF2; २० एनजी एमएल-१) १ समाविष्ट होते; R&D प्रणाली) 24-го дня. (आर अँड डी सिस्टीम्स) २४ व्या दिवसापर्यंत.२५ ते ४२ दिवसांपर्यंत, मेंदूतून मिळवलेले न्यूरोट्रॉफिक फॅक्टर (BDNF; २० एनजी एमएल-१, पेप्रोटेक) आणि न्यूरोट्रॉफिक फॅक्टर ३ (NT3; २० एनजी एमएल-१, पेप्रोटेक) हे दर दुसऱ्या दिवशी कल्चर माध्यमात जोडले गेले. मध्यम एकदा बदलले गेले.४३ व्या दिवसापासून, hCO3 ला पूरक नसलेल्या न्यूरोबेसल-ए माध्यमात (NM; १०८८०२२, थर्मो फिशर) दर ४-६ दिवसांनी मध्यम बदलासह राखण्यात आले. फीडरलेस परिस्थितीत कल्चर केलेल्या hiPS पेशींमधून hCO3 मिळविण्यासाठी, hiPS पेशींना Accutase (AT-१०४, इनोव्हेट सेल टेक्नॉलॉजीज) सह ३७°C वर ७ मिनिटांसाठी इनक्युबेट केले गेले, एकल पेशींमध्ये विलग केले गेले आणि ROCK इनहिबिटर Y-२७६३२ (१० μM; S१०४९, सेलेकेकेम) सह पूरक असलेल्या Essential 8 माध्यमात प्रति विहिरी ३ × १०६ एकल पेशींच्या घनतेवर AggreWell 800 प्लेट्स (३४८१५, STEMCELL टेक्नॉलॉजीज) वर प्लेट केले गेले. २४ तासांनंतर, विहिरींमधील माध्यमांना डोर्सोमॉर्फिन (२.५ μM; P5499, सिग्मा-अल्ड्रिच) आणि SB-431542 (१० μM; १६१४) सह पूरक असलेल्या इसेन्शियल ६ माध्यम (A1516401, लाईफ टेक्नॉलॉजीज) असलेल्या माध्यमात वर आणि खाली पाईपेट केले गेले. , टोक्रिडा). दिवस २ ते ६ पर्यंत, इसेन्शियल ६ माध्यम दररोज डोर्सोमॉर्फिन आणि सप्लिमेंट SB-431542 ने बदलले गेले. सहाव्या दिवसापासून, न्यूरोस्फीअर सस्पेंशन न्यूरोबेसल माध्यमात हस्तांतरित केले गेले आणि वर वर्णन केल्याप्रमाणे राखले गेले.
सर्व प्राण्यांच्या प्रक्रिया स्टॅनफोर्ड युनिव्हर्सिटी लॅबोरेटरी अ‍ॅनिमल केअर अ‍ॅडमिनिस्ट्रेटिव्ह कमिटी (APLAC) ने मंजूर केलेल्या प्राण्यांच्या काळजी मार्गदर्शक तत्त्वांनुसार केल्या गेल्या. गर्भवती युथिमिक RNU (rnu/+) उंदरांना (चार्ल्स रिव्हर लॅबोरेटरीज) खरेदी करण्यात आले किंवा ठेवण्यात आले. प्राण्यांना १२ तासांच्या प्रकाश-अंधाराच्या चक्रावर अन्न आणि पाणी देऊन ठेवण्यात आले. तीन ते सात दिवस वयोगटातील नग्न (FOXN1–/–) उंदरांच्या पिल्लांना मारण्यापूर्वी अपरिपक्व मिशांच्या वाढीमुळे ओळखले गेले. पिल्लांना (नर आणि मादी) २-३% आयसोफ्लुरेनने भूल देण्यात आली आणि स्टिरिओटॅक्सिक फ्रेमवर ठेवण्यात आले. ड्युरा मेटरची अखंडता राखत S1 वरील अंदाजे २-३ मिमी व्यासाच्या कवटीचे ट्रेपेनेशन करण्यात आले. नंतर ड्युरा छिद्र करण्यासाठी क्रॅनियोटॉमीच्या बाहेर ३०-G सुई (अंदाजे ०.३ मिमी) वापरा. ​​नंतर पातळ ३×३ सेमी पॅराफिल्मवर HCO लावा आणि जास्तीचे माध्यम काढून टाका. २३ G, ४५° सुईला जोडलेल्या हॅमिल्टन सिरिंजचा वापर करून, सुईच्या सर्वात दूरच्या टोकावर hCO हळूवारपणे ओढा. नंतर स्टिरिओटॅक्सिक उपकरणाशी जोडलेल्या सिरिंज पंपवर सिरिंज बसवा. नंतर सुईची टीप ड्युरामध्ये पूर्वी बनवलेल्या ०.३ मिमी रुंद पंचर होलवर ठेवा (z = ० मिमी) आणि सिरिंज १-२ मिमी (z = अंदाजे –१.५ मिमी) अरुंद करा जोपर्यंत सुई ड्युरा मेटर A च्या दरम्यान येत नाही. एक दाट सील तयार होतो. नंतर सिरिंज कॉर्टिकल पृष्ठभागाच्या मध्यभागी z = -०.५ मिमी या वेगाने वाढवा आणि १-२ µl प्रति मिनिट या दराने hCO इंजेक्ट करा. hCO इंजेक्शन पूर्ण झाल्यानंतर, सुई ०.२-०.५ मिमी प्रति मिनिट या दराने मागे घेतली जाते, त्वचा शिवली जाते आणि पिल्ला पूर्णपणे बरा होईपर्यंत लगेच उबदार हीटिंग पॅडवर ठेवला जातो. काही प्राण्यांचे द्विपक्षीय प्रत्यारोपण करण्यात आले.
सर्व प्राण्यांच्या प्रक्रिया स्टॅनफोर्ड विद्यापीठाच्या APLAC-मंजूर प्राण्यांच्या काळजी मार्गदर्शक तत्त्वांनुसार करण्यात आल्या. उंदरांना (प्रत्यारोपणानंतर 60 दिवसांपेक्षा जास्त) 5% आयसोफ्लुरेन भूल देऊन प्रेरित करण्यात आले आणि इमेजिंग दरम्यान 1-3% आयसोफ्लुरेनने भूल देण्यात आली. व्हिज्युअलायझेशनसाठी, इंटरनॅशनल इलेक्ट्रिक कंपनी (IECO) ग्रेडियंट ड्राइव्हसह 7 टेस्ला सक्रियपणे संरक्षित क्षैतिज बोअरहोल स्कॅनर ब्रुकर (ब्रुकर कॉर्प.), 120 मिमी (600 mT/m, 1000 T/m/s) अंतर्गत व्यासासह एक संरक्षित ग्रेडियंट इन्सर्ट AVANCE वापरून वापरण्यात आला. III, आठ-चॅनेल मल्टी-कॉइल RF आणि मल्टी-कोर क्षमता आणि सोबत असलेले पॅराव्हिजन 6.0.1 प्लॅटफॉर्म. 86 मिमीच्या अंतर्गत व्यासासह सक्रियपणे डीकपल्ड व्हॉल्यूमेट्रिक RF कॉइल आणि फक्त रिसीव्हसाठी चार-चॅनेल क्रायो-कूल्ड RF कॉइल वापरून रेकॉर्डिंग केले गेले. अक्षीय 2D टर्बो-RARE (पुनरावृत्ती वेळ = 2500 ms, प्रतिध्वनी वेळ = 33 ms, 2 सरासरी) 16 स्लाइस कॅप्चरसह, स्लाइस जाडी 0.6–0.8 मिमी, ज्यामध्ये 256 × 256 नमुने आहेत. 2 सेमी अंतर्गत व्यास असलेल्या क्वाड्रॅचर ट्रान्सीव्हर व्हॉल्यूमेट्रिक RF कॉइल वापरून सिग्नल प्राप्त झाले (रॅपिड एमआर इंटरनॅशनल, एलएलसी). शेवटी, 3D रेंडरिंग आणि व्हॉल्यूम विश्लेषणासाठी बिल्ट-इन इमारिस (बिटप्लेन) पृष्ठभाग अंदाज फंक्शन्स वापरा. ​​यशस्वी प्रत्यारोपणाची व्याख्या अशी करण्यात आली ज्यामध्ये प्रत्यारोपित गोलार्धात सतत T2-भारित MRI सिग्नलचे क्षेत्र तयार झाले. ग्राफ्ट रिजेक्शनची व्याख्या अशी करण्यात आली जी प्रत्यारोपित गोलार्धात सतत T2-भारित MRI सिग्नलचे क्षेत्र तयार करत नाही. सबकॉर्टिकल t-hCO3 नंतरच्या विश्लेषणातून वगळण्यात आले.
दोन-फोटॉन कॅल्शियम इमेजिंगसाठी hCO मध्ये GCaMP6s स्थिरपणे व्यक्त करण्यासाठी, hiPS पेशींना pLV[Exp]-EF1a::GcaMP6s-WPRE-Puro ने संक्रमित केले गेले आणि त्यानंतर प्रतिजैविकांची निवड केली गेली. थोडक्यात, पेशींना EDTA सह वेगळे केले गेले आणि पॉलीब्रिन (5 μg/ml) आणि 15 μl विषाणूच्या उपस्थितीत अंदाजे 300,000 पेशींच्या घनतेवर 1 मिली Essential 8 माध्यमात निलंबित केले गेले. त्यानंतर पेशींना 60 मिनिटांसाठी सस्पेंशनमध्ये उबवले गेले आणि प्रत्येक विहिरीमध्ये 50,000 पेशींच्या घनतेवर बीज दिले गेले. संगमानंतर, पेशींवर 5-10 दिवसांसाठी किंवा स्थिर वसाहती दिसेपर्यंत 5-10 μg ml-1 प्युरोमायसिनने उपचार केले गेले. काही सुधारणांसह पूर्वी वर्णन केल्याप्रमाणे तीव्र hCO संसर्ग करण्यात आला. थोडक्यात, दिवस 30-45 hCO 100 μl मज्जातंतू माध्यम असलेल्या 1.5 मिली एपेनडॉर्फ मायक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबमध्ये स्थानांतरित करा. नंतर अंदाजे ९० µl माध्यम काढून टाकले जाते, ३-६ µl उच्च टायटर लेंटीव्हायरस (०.५ x १०८ ते १.२ x १०९ पर्यंत) ट्यूबमध्ये जोडला जातो आणि hCO ३० मिनिटांसाठी इनक्यूबेटरमध्ये हस्तांतरित केला जातो. नंतर प्रत्येक ट्यूबमध्ये ९०-१०० µl माध्यम घाला आणि नळ्या रात्रभर इनक्यूबेटरमध्ये परत करा. दुसऱ्या दिवशी, कमी जोडणीच्या प्लेट्समध्ये ताज्या मज्जातंतू माध्यमात hCO स्थानांतरित करा. ७ दिवसांनंतर, संसर्गाच्या गुणवत्तेचे दृश्यमानीकरण आणि मूल्यांकन करण्यासाठी hCO २४-वेल ग्लास बॉटम प्लेट्समध्ये स्थानांतरित करण्यात आले. pLV[Exp]-SYN1::EYFP-WPRE आणि pLV[Exp]-SYN1::hChR2-EYFP-WPRE हे व्हेक्टरबिल्डरने तयार केले होते. लेंटीव्हायरस बहुतेक प्रयोगांमध्ये वापरला जातो कारण तो होस्ट जीनोममध्ये एकत्रित केला जातो, ज्यामुळे संक्रमित पेशी ओळींमध्ये रिपोर्टर जीन अभिव्यक्ती होऊ शकते. रेबीज फॉलो-अपसाठी, दिवस ३०-४५ hCO ला रेबीज-ΔG-eGFP आणि AAV-DJ-EF1a-CVS-G-WPRE-pGHpA (प्लाझमिड #६७५२८, अ‍ॅडजीन) सह सह-संक्रमित केले गेले, ३ दिवस पूर्णपणे धुतले गेले आणि S1 मधील उंदरांमध्ये प्रत्यारोपित केले गेले आणि ७-१४ दिवसांसाठी व्हिव्होमध्ये ठेवले गेले.
इम्युनोसाइटोकेमिस्ट्रीसाठी, प्राण्यांना भूल देण्यात आली आणि ट्रान्सकार्डियली पीबीएसने परफ्यूज केले गेले आणि त्यानंतर ४% पॅराफॉर्मल्डिहाइड (पीबीएसमध्ये पीएफए; इलेक्ट्रॉन मायक्रोस्कोपी सायन्सेस) देण्यात आले. मेंदू ४% पीएफएमध्ये २ तासांसाठी किंवा रात्रभर ४°C वर स्थिर करण्यात आले, पीबीएसमध्ये ३०% सुक्रोजमध्ये ४८-७२ तासांसाठी क्रायोप्रिझर्व करण्यात आले आणि १:१, ३०% सुक्रोजमध्ये एम्बेड करण्यात आले: ओसीटी (टिश्यू-टेक ओसीटी कंपाउंड ४५८३, साकुरा फिनेटेक) आणि कोरोनल सेक्शन ३० µm वर क्रायोस्टॅट (लाइका) वापरून बनवण्यात आले. जाड सेक्शनच्या इम्युनोहिस्टोकेमिस्ट्रीसाठी, प्राण्यांना पीबीएसने परफ्यूज करण्यात आले आणि मेंदूचे विच्छेदन करून व्हायब्रेटोम (लाइका) वापरून ३००-४०० µm वर कोरोनल सेक्शन करण्यात आले आणि सेक्शन ३० मिनिटांसाठी ४% पीएफएने फिक्स करण्यात आले. नंतर क्रायोसेक्शन किंवा जाड भाग पीबीएसने धुतले गेले, खोलीच्या तपमानावर १ तासासाठी ब्लॉक केले गेले (१०% सामान्य गाढव सीरम (एनडीएस) आणि ०.३% ट्रायटन एक्स-१०० पीबीएसमध्ये पातळ केले गेले) आणि ४° सेल्सिअस तापमानावर ब्लॉकिंग सोल्यूशनने ब्लॉक केले गेले. – इनक्युबेशन क्रायोसेक्शन रात्रभर इनक्युबेट केले गेले आणि जाड भाग ५ दिवस इनक्युबेट केले गेले. वापरलेले प्राथमिक अँटीबॉडीज होते: अँटी-न्यूएन (उंदीर, १:५००; ab104224, abcam) अँटी-CTIP2 (उंदीर, १:३००; ab18465, abcam), अँटी-GFAP (ससा, १:१,०००; Z0334, डाको), अँटी-GFP (चिकन, १:१,०००; GTX13970, GeneTex), अँटी-HNA (उंदीर, १:२००; ab191181, abcam), अँटी-न्यूएन (ससा, १:५००; ABN78, मिलिपोर), अँटी-PDGFRA (ससा, १:२००; sc-338, सांताक्रूझ), अँटी-PPP1R17 (ससा, १:२००; HPA047819, अ‍ॅटलस अँटीबॉडीज), अँटी-RECA-1 (उंदीर, १:५०; ab9774, abcam), अँटी-SCG2 (ससा, १:१००; २०३५७-१-एपी, प्रोटीनटेक), अँटी-SOX9 (शेळी, १:५००; AF3075, आर अँड डी सिस्टम्स), नेट्रिन G1a (शेळी, १:१००; AF1166, आर अँड डी सिस्टम्स), अँटी-STEM121 (उंदीर, १:२००; Y40410, टाकारा बायो), अँटी-SATB2 (उंदीर, १:५०; ab51502, abcam), अँटी-GAD65/67 (ससा, १:४००; ABN904, मिलिपोर) आणि अँटी-IBA1 (शेळी, १:१००; ab5076, abcam). वापरलेले प्राथमिक अँटीबॉडीज होते: अँटी-न्यूएन (उंदीर, १:५००; ab104224, abcam) अँटी-CTIP2 (उंदीर, १:३००; ab18465, abcam), अँटी-GFAP (ससा, १:१,०००; Z0334, डाको), अँटी-GFP (चिकन, १:१,०००; GTX13970, GeneTex), अँटी-HNA (उंदीर, १:२००; ab191181, abcam), अँटी-न्यूएन (ससा, १:५००; ABN78, मिलिपोर), अँटी-PDGFRA (ससा, १:२००; sc-338, सांताक्रूझ), अँटी-PPP1R17 (ससा, १:२००; HPA047819, अ‍ॅटलस अँटीबॉडीज), अँटी-RECA-1 (उंदीर, १:५०; ab9774, abcam), अँटी-SCG2 (ससा, १:१००; २०३५७-१-एपी, प्रोटीनटेक), अँटी-SOX9 (शेळी, १:५००; AF3075, आर अँड डी सिस्टम्स), नेट्रिन G1a (शेळी, १:१००; AF1166, आर अँड डी सिस्टम्स), अँटी-STEM121 (उंदीर, १:२००; Y40410, टाकारा बायो), अँटी-SATB2 (उंदीर, १:५०; ab51502, abcam), अँटी-GAD65/67 (ससा, १:४००; ABN904, मिलिपोर) आणि अँटी-IBA1 (शेळी, १:१००; ab5076, abcam). Использовались следующие первичные антитела: анти-NeuN (мышиные, 1:500; ab104224, abcam), анти-CTIP2 (крысиные, abcam), 136, abcam ANTI-GFAP (кроличьи, 1:1000; Z0334, Dako), анти- -GFP (курица, 1:1000; GTX13970, GeneTex), анти-HNA (мышь, 1:200; ab19-cameu), ab19198 (кролик, 1:500; ABN78, मिलीपूर), अँटी-पीडीजीएफआरए (क्रॉलिक, 1:200; sc-338, सांता-क्रूझ), अँटी-पीपीपी1आर17 (क्रॉलिक, 1:200; एचपीए047819, ॲटलस अँटीबॉडीज), अँटी-आरईसीए-1 (एम:19, 74, एबी), ANTI-SCG2 (кролик , 1:100; 20357-1-AP, Proteintech), анти-SOX9 (козий, 1:500; AF3075, R&D Systems), нетрин G1a (козий, 1:100, R166; सिस्टम), ANTI-STEM121 (мышиный , 1:200; Y40410, Takara Bio), анти-SATB2 (мышь, 1:50; ab51502, abcam), анти-GAD65/67 (кролик, 1:400; ABN904, मिलीपूर) आणि анти-IBA1 (коза, 1 :100; абкама7). वापरलेले प्राथमिक अँटीबॉडीज होते: अँटी-न्यूएन (उंदीर, १:५००; ab104224, abcam), अँटी-CTIP2 (उंदीर, १:३००; ab18465, abcam), अँटी-GFAP (ससा, १:१०००; Z0334, डाको), अँटी-GFP (चिकन, १:१०००; GTX13970, GeneTex), अँटी-HNA (उंदीर, १:२००; ab191181, abcam), अँटी-न्यूएन (ससा, १:५००; ABN78, मिलिपोर), अँटी-PDGFRA (ससा, १:२००; sc-३३८, सांताक्रूझ), अँटी-PPP1R17 (ससा, १:२००; HPA047819, अ‍ॅटलस अँटीबॉडीज), अँटी-RECA-1 (उंदीर, १:५०; ab9774, abcam), अँटी-SCG2 (ससा, १:१००; २०३५७-१-एपी, प्रोटीनटेक), अँटी-SOX9 (शेळी, १:५००; AF3075, R&D सिस्टम्स), नेट्रिन G1a (शेळी, १:१००; AF1166, R&D सिस्टम्स), अँटी-STEM121 (उंदीर, १:२००; Y40410, टाकारा बायो), अँटी-SATB2 (उंदीर, १:५०; ab51502, abcam), अँटी-GAD65/67 (ससा, १:४००; ABN904, मिलिपोर) आणि अँटी-IBA1 (बकरी, १:१००; ab5076, abkam).使用的一抗是：抗NeuN（小鼠, 1:500；ab104224, abcam）抗CTIP2（大鼠,1:3 00；ab18465，abcam），抗GFAP（兔,1:1,000；Z0334,डाको）,抗-GF P（鸡, 1:1,000；GTX13970, GeneTex）,抗HNA（小鼠, 1:200；ab1911 81, abcam）,抗NeuN（兔,1:500；ABN78,Millipor）,抗PDGFRA（兔, 1:200；sc-338，Santa Cruz），抗PPP1R17（兔,1:200；HPA047819, ऍटलस抗体）,抗RECA-1（小鼠,1:50；ab9774,abcam）,抗SCG2（兔） , 1:100；20357-1-AP，Proteintech），抗SOX9（山羊，1:500；AF3075,R&D Systems），Netrin G1a（山羊，1:100；AF1166，R&D सिस्टम），抗STEM121（小鼠, 1:200;使用的一抗是：抗NeuN（小鼠，1:500；ab104224，abcam）抗CTIP2（大鼠，1 :300；ab18465，abcam），抗GFAP（兔,1:1,000；Z0334,डाको）,抗-GFP（鸡，1:1,000；GTX13970，GeneTex）,抗HNA（小鼠，1:200；ab 191181, abcam）,抗NeuN（兔,1:500；ABN78,Millipor％弔,抗1: 200;sc-338, सांता Cruz), 抗PPP1R17（兔，1:200；HPA047819, Atlas 抗体）,抗RECA-1（小鼠,1:50；ab9774, abcam）,抗SCG2 100；20357-1-AP，प्रोटीनटेक），抗SOX9（山羊，1:500；AF3075,R&D Systems），Netrin G1a（山羊，1:100；AF1166;R&D0,R&0;Y40410, टाकारा बायो), अँटी-SATB2 (उंदीर, 1:50; ab51502, abcam), अँटी-GAD65/67 (ससा, 1:400; ABN904, मिलिपूर) आणि अँटी-IBA1 (बकरी, 1:100; ab5076, abcam).वापरलेले प्राथमिक अँटीबॉडीज होते: अँटी-न्यूएन (उंदीर, १:५००; ab104224, abcam), अँटी-CTIP2 (उंदीर, १:३००; ab18465, abcam), अँटी-GFAP (ससा, १:१०००; Z0334, डाको). , अँटी-GFP (चिकन, १:१०००; GTX१३९७०, GeneTex), अँटी-HNA (उंदीर, १:२००; ab191181, abcam), अँटी-NeuN (ससा, १:५००; ABN७८, मिलिपोर), अँटी-PDGFRA (ससा, १:२००; sc-३३८, सांताक्रूझ), अँटी-PPP1R17 (ससा, १:२००; HPA047819, अॅटलस अँटीबॉडी), अँटी-RECA-1 (उंदीर, १:५०; ab9774, abcam), अँटी-SCG2 (ससा), १:१००;20357-1-AP, Proteintech), ANTI-SOX9 (koza, 1:500; AF3075, R&D Systems), NETRIN G1a (коза, 1:100; AF1166, R&D Systems), анти -STEM121;,40121; टाकारा बायो), анти-SATB2 (мышь, 1:50; ab51502, abcam), анти-GAD65/67 (кролик, 1:400; ABN904, मिलीपोर) आणि анти-IBA1 (коза, 1:бамака, бама6); २०३५७-१-एपी, प्रोटीनटेक), अँटी-एसओएक्स९ (शेळी, १:५००; एएफ३०७५, आर अँड डी सिस्टम्स), नेट्रिन जी१ए (शेळी, १:१००; एएफ११६६, आर अँड डी सिस्टम्स), अँटी-एसटीईएम१२१ (उंदीर, १:२००; वाई४०४१०, टाकारा बायो), अँटी-एसएटीबी२ (उंदीर, १:५०; एबी५१५०२, अ‍ॅबकॅम), अँटी-जीएडी६५/६७ (ससा, १:४००; एबीएन९०४, मिलिपोर), आणि अँटी-आयबीए१ (शेळी, १:१००; एबी५०७६, अ‍ॅबकॅम).त्यानंतर विभागांना PBS ने धुतले गेले आणि खोलीच्या तपमानावर (गोठवलेले विभाग) किंवा रात्रभर 4°C (जाड विभाग) वर दुय्यम प्रतिपिंडाने 1 तासासाठी उष्मायन केले गेले. अलेक्सा फ्लोर दुय्यम प्रतिपिंड (लाइफ टेक्नॉलॉजीज) 1:1000 मध्ये पातळ केलेले ब्लॉकिंग द्रावण वापरले गेले. PBS ने धुतल्यानंतर, केंद्रकांना Hoechst 33258 (लाइफ टेक्नॉलॉजीज) ने दृश्यमान केले गेले. शेवटी, स्लाईड्स एका मायक्रोस्कोपवर ठेवण्यात आल्या ज्यावर कव्हरस्लिप्स (फिशर सायंटिफिक) एक्वामाउंट (पॉलिसायन्सेस) वापरून वापरण्यात आले आणि प्रतिमेवर कीन्स फ्लोरोसेंट सूक्ष्मदर्शक (BZ-X विश्लेषक) किंवा लाइका TCS SP8 कॉन्फोकल सूक्ष्मदर्शक (Las-X) वर विश्लेषण केले गेले. प्रतिमांवर इमेजजे प्रोग्राम (फिजी) वापरून प्रक्रिया करण्यात आली. t-hCO2 आणि उंदराच्या कॉर्टेक्समध्ये मानवी न्यूरॉन्सचे प्रमाण मोजण्यासाठी, t-hCO2 च्या मध्यभागी, उंदराच्या कॉर्टेक्सच्या काठावर किंवा जवळ 387.5 μm रुंद आयताकृती प्रतिमा घेण्यात आल्या. ऊतींच्या पारदर्शकतेतील बदल, HNA+ केंद्रके आणि/किंवा ऊतींच्या ऑटोफ्लोरेसेन्सची उपस्थिती यांचे मूल्यांकन करून ग्राफ्ट मार्जिन निश्चित केले गेले. प्रत्येक प्रतिमेमध्ये, NeuN+ आणि HNA+ पेशींची एकूण संख्या त्याच क्षेत्रातील NeuN+ पेशींच्या एकूण संख्येने भागली गेली. प्रतिमेच्या समतलात केंद्रके असलेल्या पेशी मोजल्या जातील याची खात्री करण्यासाठी, फक्त Hoechst+ असलेल्या पेशींचाच गणनामध्ये समावेश केला जातो. सांख्यिकीय त्रुटी कमी करण्यासाठी किमान 1 मिमीने विभक्त केलेल्या दोन प्रतिमांची सरासरी काढली गेली.
नमुना संकलनाच्या एक आठवडा आधी, hCO प्रत्यारोपण केलेल्या प्राण्यांना (अंदाजे 8 महिने वेगळे) एका अंधाऱ्या खोलीत ठेवा ज्यामध्ये संवेदी उत्तेजना कमी करण्यासाठी मिश्या कापल्या जातील. आधी वर्णन केल्याप्रमाणे काही बदलांसह केंद्रकांचे पृथक्करण केले गेले. थोडक्यात, t-hCO आणि hCO डिटर्जंट-मेकॅनिकल सेल लिसिस आणि 2 मिली ग्लास टिश्यू ग्राइंडर (D8938, सिग्मा-अल्ड्रिच/किंबले) वापरून नष्ट केले गेले. नंतर कच्च्या केंद्रकांना 40 µm फिल्टर वापरून फिल्टर केले गेले आणि सुक्रोज घनता ग्रेडियंट करण्यापूर्वी 4 °C वर 10 मिनिटांसाठी 320 ग्रॅम सेंट्रीफ्यूज केले गेले. सेंट्रीफ्यूगेशन स्टेप नंतर (4°C वर 20 मिनिटांसाठी 320 ग्रॅम), नमुने 0.2 युनिट्स µl-1 RNase इनहिबिटर (40 u µl-1, AM2682, Ambion) जोडून 0.04% BSA/PBS मध्ये पुन्हा निलंबित केले गेले आणि 40 µm फ्लो फिल्टरमधून गेले. नंतर विलग झालेल्या केंद्रकांना ०.०२% BSA असलेल्या PBS मध्ये पुन्हा सस्पेंड केले गेले आणि क्रोमियम सिंगल सेल ३′ चिपवर लोड केले गेले (प्रति लेन ८,००० पेशींची अंदाजे पुनर्प्राप्ती). snRNA-seq लायब्ररी क्रोमियम सिंगल सेल 3′ GEM, लायब्ररी आणि जेल बीड किट v3 (10x जीनोमिक्स) वापरून तयार करण्यात आल्या. snRNA-seq लायब्ररी क्रोमियम सिंगल सेल 3′ GEM, लायब्ररी आणि जेल बीड किट v3 (10x जीनोमिक्स) वापरून तयार करण्यात आल्या. Библиотеки snRNA-seq были приготовлены с помощью क्रोमियम सिंगल सेल 3′ GEM, लायब्ररी आणि जेल बीड किट v3 (10x जीनोमिक्स). snRNA-seq लायब्ररी क्रोमियम सिंगल सेल 3′ GEM, लायब्ररी आणि जेल बीड किट v3 (10x जीनोमिक्स) वापरून तयार करण्यात आल्या. snRNA-seq 文库是使用Chromium सिंगल सेल 3′ GEM、Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics) 制备的. snRNA-seq 文库是使用Chromium सिंगल सेल 3′ GEM、Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics) 制备的. Библиотеку snRNA-seq готовили с использованием क्रोमियम सिंगल सेल 3′ GEM, लायब्ररी आणि जेल बीड किट v3 (10x जीनोमिक्स). snRNA-seq लायब्ररी क्रोमियम सिंगल सेल 3′ GEM, लायब्ररी आणि जेल बीड किट v3 (10x जीनोमिक्स) वापरून तयार करण्यात आली.नोव्हासेक एस४ (इल्युमिना) वर अ‍ॅडमेरा हेल्थने वेगवेगळ्या नमुन्यांमधील ग्रंथालये एकत्रित केली आणि अनुक्रमित केली.
प्रत्येक अनुमानित न्यूक्लियर बारकोडसाठी जीन अभिव्यक्ती पातळी 10x जीनोमिक्स सेलरेंजर विश्लेषण सॉफ्टवेअर पॅकेज (आवृत्ती 6.1.2) वापरून मोजली गेली. विशेषतः, वाचन मानवी (GRCh38, एन्सेम्बल, आवृत्ती 98) आणि उंदीर (Rnor_6.0, एन्सेम्बल, आवृत्ती 100) संदर्भ जीनोमच्या संयोजनाशी जुळले गेले जे mkref कमांडसह तयार केले गेले होते आणि –include-introns=TRUE कमांडसह काउंट वापरून इंट्रॉन प्रदेशांमध्ये मॅप केलेले वाचन समाविष्ट केले गेले. t-hCO नमुन्यांसाठी, सर्व मॅप केलेल्या वाचनांपैकी किमान 95% मानवी जीनोमशी जुळतील या रूढीवादी आवश्यकतांवर आधारित मानवी केंद्रके ओळखली गेली. त्यानंतरचे सर्व विश्लेषण R पॅकेज (आवृत्ती 4.1.2) Seurat (आवृत्ती 4.1.1)32 वापरून सेलरेंजरमधून फिल्टर केलेल्या बारकोड अॅरे आउटपुटवर केले गेले.
त्यानंतरच्या विश्लेषणात फक्त उच्च दर्जाचे केंद्रके समाविष्ट आहेत याची खात्री करण्यासाठी, प्रत्येक नमुन्यासाठी पुनरावृत्ती फिल्टरिंग प्रक्रिया लागू करण्यात आली. प्रथम, १००० पेक्षा कमी अद्वितीय जीन्स आढळून आलेले आणि एकूण मायटोकॉन्ड्रियाच्या २०% पेक्षा जास्त असलेले कमी दर्जाचे केंद्रके ओळखले जातात आणि काढून टाकले जातात. त्यानंतर, sctransform(vst.flavor=”v2″) फंक्शन वापरून नियमित नकारात्मक द्विपदी प्रतिगमन करून कच्चा जीन क्रमांक मॅट्रिक्स सामान्यीकृत करण्यात आला, ज्याने डीफॉल्ट पॅरामीटर्स वापरून 3000 सर्वात चल जीन्स देखील ओळखले. प्रिन्सिपल कंपोनंट अॅनालिसिस (PCA) वापरून वरच्या चल जीन्सवर डायमेंशन रिडक्शन करण्यात आले ज्यामध्ये 30 चा डेटा सेट डायमेंशन वापरुन डिफॉल्ट पॅरामीटर्स वापरण्यात आले (डिम्स = 30 गुडघ्याच्या साइट्सच्या व्हिज्युअल तपासणीवर आधारित निवडले गेले आणि सर्व नमुने आणि एन्सेम्बल विश्लेषणासाठी वापरले गेले). त्यानंतर आम्ही असामान्यपणे कमी जीन काउंट (10 व्या पर्सेंटाइलच्या खाली मध्यक), असामान्यपणे उच्च माइटोकॉन्ड्रियल जीन काउंट (95 व्या पर्सेंटाइलच्या वर मध्यक) वर आधारित जीन्सचे वर्गीकरण करण्यासाठी पुनरावृत्ती क्लस्टरिंग (रिझोल्यूशन = 1) च्या अनेक फेऱ्या केल्या जेणेकरून कमी गुणवत्तेच्या पुटेटिव्ह पेशी ओळखता येतील आणि काढून टाकता येतील. DoubletFinder33 पॅकेज वापरून ओळखल्या जाणाऱ्या संशयित जुळ्यांचे क्लस्टर आणि/किंवा उच्च प्रमाण (95 व्या पर्सेंटाइलच्या वर सरासरी DoubletFinder स्कोअर). t-hCO नमुने (n=3) आणि hCO नमुने (n=3) स्वतंत्रपणे एकत्रित केले गेले. वरील पॅरामीटर्ससह इंटिग्रेटडेटा फंक्शन. नंतर वर वर्णन केल्याप्रमाणे इंटिग्रेटेड डेटा सेटच्या गुणात्मक फिल्टरिंगची दुसरी फेरी करण्यात आली.
कमी दर्जाचे कर्नल काढून टाकल्यानंतर, एकात्मिक डेटासेट गटबद्ध केले गेले (रिझोल्यूशन = 0.5) आणि UMAP34 व्हिज्युअलायझेशन उद्देशांसाठी एम्बेड केले गेले. सामान्यीकृत जीन अभिव्यक्ती डेटामधून गणना केलेल्या डीफॉल्ट पॅरामीटर्ससह FindMarkers फंक्शन वापरून प्रत्येक क्लस्टरसाठी मार्कर जीन्स निश्चित केले गेले. आम्ही मार्कर जीन अभिव्यक्ती 19,20,21,35 आणि भाष्यांसह गर्भ आणि प्रौढ कॉर्टिकल संदर्भ डेटासेट एकत्रित करून प्रमुख पेशी वर्ग ओळखतो आणि वर्गीकृत करतो. विशेषतः, MKI67 आणि TOP2A च्या अभिव्यक्तीद्वारे परिसंचरणित पूर्वसूचक ओळखले गेले. प्रोजेनिटर क्लस्टर्सची व्याख्या मायटोटिक ट्रान्सक्रिप्ट्सच्या अनुपस्थिती, लेट मेटाफेस फेटल कॉर्टेक्समध्ये वर्णन केलेल्या मल्टीपोटेंट ग्लियल प्रोजेनिटर क्लस्टर्ससह उच्च ओव्हरलॅप आणि EGFR आणि OLIG1 अभिव्यक्तीद्वारे केली गेली. आम्ही लेट रेडियल ग्लियापासून अॅस्ट्रोसाइट्सच्या परिपक्वतेपर्यंत अॅस्ट्रोसाइट भिन्नतेच्या अनेक अवस्था समाविष्ट करण्यासाठी अॅस्ट्रोसाइट हा शब्द वापरतो. अॅस्ट्रोसाइट क्लस्टर्स SLC1A3 आणि AQP4 चे उच्च स्तर व्यक्त करतात आणि गर्भाच्या रेडियल ग्लिया आणि/किंवा प्रौढ अॅस्ट्रोसाइट्सच्या उपप्रकारांसह मॅप करताना दर्शविले गेले आहेत. OPCs PDGFRA आणि SOX10 व्यक्त करतात तर ऑलिगोडेंड्रोसाइट्स मायलिनेशन मार्कर (MOG आणि MYRF) व्यक्त करतात. ग्लूटामेटर्जिक न्यूरॉन्स न्यूरोनल ट्रान्सक्रिप्ट्स (SYT1 आणि SNAP25), GABAergic मार्कर (GAD2) ची अनुपस्थिती आणि NEUROD6, SLC17A7, BCL11B, किंवा SATB2 च्या अभिव्यक्तीद्वारे ओळखले गेले. GluN न्यूरॉन्सला वरच्या (SATB2 अभिव्यक्ती आणि BCL11B चे नुकसान) आणि खोल (BCL11B अभिव्यक्ती) उपवर्गांमध्ये विभागले गेले. पुटेटिव्ह सबप्लेट (SP) न्यूरॉन्स खोल GluN मार्कर व्यतिरिक्त ST18 आणि SORCS1 सारखे ज्ञात SP18 मार्कर व्यक्त करतात. कोरोइड प्लेक्सससारख्या पेशी TTR अभिव्यक्तीद्वारे ओळखल्या गेल्या आणि मेनिन्जियलसारख्या पेशींनी फायब्रोब्लास्ट-संबंधित जीन्स आणि संदर्भ डेटा सेटच्या मॅप केलेल्या पियल/व्हस्क्युलर पेशी व्यक्त केल्या.
लिब्रा आर पॅकेज (आवृत्ती १.०.०) वापरून अंमलात आणलेल्या नमुन्यांमध्ये पुनरुत्पादित केलेल्या नवीन विकसित स्यूडो-बॅच पद्धतीचा वापर करून t-hCO आणि hCO उपवर्गांमधील जनुक अभिव्यक्तीचे विभेदक विश्लेषण केले गेले. विशेषतः, प्रत्येक नमुना प्रतिकृतीसाठी दिलेल्या पेशी वर्गासाठी पेशींमधील जनुकांची संख्या एकत्रित करून गटांसाठी edgeR लॉग-संभाव्यता चाचण्या (आवृत्ती ३.३६.०, पॅकेज R) केल्या गेल्या. हीटमॅप व्हिज्युअलायझेशनसाठी, edgeR (cpm() फंक्शन) वापरून सामान्यीकृत प्रति दशलक्ष (CPM) मूल्ये मोजली जातात आणि स्केल केली जातात (सरासरी = ०, मानक विचलन = १ साध्य करण्यासाठी). लक्षणीयरीत्या अपरेग्युलेटेड t-hCO GluN जनुकांचे जीन ऑन्टोलॉजी (GO) समृद्धी विश्लेषण केले गेले (बेंजामिनी-होचबर्गने t-hCO GluN पेशींच्या किमान १०% मध्ये व्यक्त केलेले ०.०५ पेक्षा कमी P मूल्य आणि बदलात किमान २ पट वाढ). ToppGene Suite (https://toppgene.cchmc.org/)37 वापरून केले गेले. आम्ही डिफॉल्ट पॅरामीटर्ससह टॉपफन अॅप वापरतो आणि GO-अ‍ॅनोटेटेड हायपरजिओमेट्रिक चाचण्यांमधून गणना केलेल्या बेंजामिनी-हॉचबर्ग-करेक्टेड पी-व्हॅल्यूजचा अहवाल देतो.
प्राथमिक सिंगल-सेल RNA-seq किंवा प्रौढ snRNA-seq19,20,21,22 च्या संदर्भ अभ्यासातून आमच्या snRNA-seq क्लस्टर्सना एनोटेटेड सेल क्लस्टर्सशी जुळवण्यासाठी, आम्ही एक पेअर डेटासेट इंटिग्रेशन दृष्टिकोन लागू केला. डेटासेटमधील क्लस्टर ओव्हरलॅप्स एकत्रित करण्यासाठी आणि त्यांची तुलना करण्यासाठी आम्ही Seurat मध्ये SCTransform (v2) नॉर्मलायझेशन वर्कफ्लो वापरला (वरील प्रमाणेच पॅरामीटर्स वापरून). संगणकीय कार्यक्षमतेसाठी वैयक्तिक डेटासेट प्रत्येक मूळ क्लस्टरमध्ये 500 सेल्स किंवा कोर पर्यंत यादृच्छिकपणे सबसेट्स केले गेले. पूर्वी वर्णन केल्याप्रमाणे समान दृष्टिकोन वापरून, क्लस्टर ओव्हरलॅपला संदर्भ क्लस्टरच्या लेबलसह ओव्हरलॅप केलेल्या प्रत्येक पूल्ड क्लस्टरमधील पेशी किंवा केंद्रकांचे प्रमाण म्हणून परिभाषित केले गेले. GluN चे अधिक वर्गीकरण करण्यासाठी, आम्ही आमच्या GluN पेशींना संदर्भ डेटासेट लेबल्स नियुक्त करण्यासाठी GluN सबसेट डेटासाठी Seurat चा TransferData वर्कफ्लो वापरला.
t-hCO आणि hCO नमुन्यांच्या जागतिक ट्रान्सक्रिप्टोमच्या परिपक्वता स्थितीचे मूल्यांकन करण्यासाठी, आम्ही आमच्या स्यूडो-बल्क नमुन्यांची तुलना BrainSpan/psychENCODE23 शी केली, ज्यामध्ये मानवी मेंदूच्या विकासाचा एक मोठा RNA क्रम असतो. आम्ही गर्भधारणेच्या 10 आठवड्यांनंतर आणि नंतर, 5567 जनुकांमध्ये (आमच्या डेटासह) कॉर्टिकल नमुन्यांमधून एकत्रित पॅटर्न-सामान्यीकृत जीन अभिव्यक्ती मॅट्रिक्सवर PCA केले जे पूर्वी BrainSpan कॉर्टिकल नमुन्यांमध्ये सक्रिय म्हणून ओळखले गेले होते (क्यूबिक मॉडेल वापरून वयानुसार स्पष्ट केलेल्या विकासात्मक भिन्नतेमध्ये 50% पेक्षा जास्त म्हणून परिभाषित)38. याव्यतिरिक्त, आम्ही पूर्वी वर्णन केल्याप्रमाणे नॉन-नेगेटिव्ह मॅट्रिक्स फॅक्टराइजेशन वापरून न्यूरोडेव्हलपमेंटच्या प्रमुख ट्रान्सक्रिप्टोम स्वाक्षरींशी संबंधित जीन्स मिळवले. नॉन-नेगेटिव्ह मॅट्रिक्स फॅक्टराइजेशन प्रक्रियेचा वापर करून गणना केलेले नमुना वजन झू एट अल.38 द्वारे वर्णन केलेल्या पाच स्वाक्षरींपैकी प्रत्येकासाठी विस्तारित डेटासह आकृती 5b मध्ये प्लॉट केले आहे. पुन्हा, क्रियाकलाप अवलंबून ट्रान्सक्रिप्शनल मार्कर पूर्वी प्रकाशित अभ्यासांमधून घेतले गेले होते. विशेषतः, पूरक तक्ता 3 Hrvatin et al.16 मधून दृश्य उत्तेजनानंतर माऊस व्हिज्युअल कॉर्टेक्स snRNA-seq संग्रहाद्वारे ओळखल्या जाणाऱ्या ग्लूटामेटर्जिक न्यूरॉन्समध्ये ERG आणि LRG लक्षणीयरीत्या वाढले. मानवी-समृद्ध LRGs KCl-सक्रिय मानवी गर्भाच्या मेंदूच्या संस्कृतींमधून मिळवले गेले आणि उत्तेजनानंतर 6 तासांनी कापले गेले आणि फिल्टर केलेले जीन्स मानवांमध्ये लक्षणीयरीत्या वाढले परंतु उंदीरांमध्ये नाही (पूरक तक्ता 4). या जीन सेटचा वापर करून जीन सेट समृद्धीचे विश्लेषण एक-मार्गी फिशरच्या अचूक चाचणीचा वापर करून केले गेले.
उंदरांना आयसोफ्लुरेनने भूल द्या, मेंदू काढून टाका आणि थंड (सुमारे 4°C) ऑक्सिजनयुक्त (95% O2 आणि 5% CO2) सुक्रोज द्रावणात ठेवा ज्यामध्ये 234 mM सुक्रोज, 11 mM ग्लुकोज, 26 mM NaHCO3, 2.5 mM KCl, 1.25 mM. NaH2PO4, 10 mM MgSO4 आणि 0.5 mM CaCl2 (सुमारे 310 mOsm) समाविष्ट आहेत. t-hCO3 असलेले उंदरांच्या मेंदूचे कोरोनल सेक्शन (300-400 µm) पूर्वी वर्णन केल्याप्रमाणे Leica VT1200 व्हायब्रेटोम वापरून बनवले गेले होते39. त्यानंतर विभागांना सतत खोलीच्या तापमानात ऑक्सिजनेशन असलेल्या सेक्शनिंग चेंबरमध्ये स्थानांतरित केले गेले ज्यामध्ये aCSF तयार केले गेले: १० mM ग्लुकोज, २६ mM NaHCO३, २.५ mM KCl, १.२५ mM NaHPO४, १ mM MgSO४, २ mM CaCl2 आणि १२६ mM NaCl (२९८ mOsm). रेकॉर्डिंगच्या किमान ४५ मिनिटे आधी. विभाग एका बुडलेल्या चेंबरमध्ये रेकॉर्ड केले गेले जिथे त्यांना सतत aCSF (९५% O2 आणि ५% CO2 व्हाईल) सह परफ्यूज केले गेले. सर्व डेटा खोलीच्या तपमानावर रेकॉर्ड केला गेला. t-hCO न्यूरॉन्स १२७ mM पोटॅशियम ग्लुकोनेट, ८ mM NaCl, ४ mM मॅग्नेशियम ATP, ०.३ mM सोडियम GTP, १० mM HEPES आणि ०.६ mM EGTA, pH ७.२, KOH (२९० mOsm) सह समायोजित केलेल्या द्रावणाने भरलेल्या बोरोसिलिकेट ग्लास पिपेटने संपवले गेले. पुनर्प्राप्तीसाठी, रेकॉर्डिंग सोल्युशनमध्ये बायोसायटिन (0.2%) जोडले गेले.
मल्टीक्लॅम्प ७००बी अॅम्प्लिफायर (मॉलिक्युलर डिव्हाइसेस) आणि डिजिडेटा १५५०बी डिजिटायझर (मॉलिक्युलर डिव्हाइसेस) वापरून डेटा मिळवण्यात आला, २ किलोहर्ट्झवर लो-पास फिल्टर केला गेला, २० किलोहर्ट्झवर डिजिटायझेशन केले गेले आणि क्लॅम्पफिट (मॉलिक्युलर डिव्हाइसेस), ओरिजिन (ओरिजिनप्रो). २०२१बी, ओरिजिनलॅब). आणि कस्टम MATLAB फंक्शन्स (मॅथवर्क्स) वापरून विश्लेषण केले गेले. JPCalc वापरून जंक्शन पोटेंशियलची गणना केली गेली आणि नोंदी -१४ mV च्या गणना केलेल्या मूल्याशी समायोजित केल्या गेल्या. ऑपरेशन IV मध्ये -२५० ते ७५० पीए पर्यंत १०-२५ पीए चरणांमध्ये चालू चरणांची मालिका असते.
आधी वर्णन केल्याप्रमाणे, hCO न्यूरॉन्सच्या पॅच-क्लॅम्प रेकॉर्डिंग दरम्यान थॅलेमस, पांढरा पदार्थ आणि S1 अ‍ॅफरंट्सना थॅलेमस कॉर्टिकल स्लाइसमध्ये विद्युतरित्या उत्तेजित केले गेले. थोडक्यात, मेंदूला 10° कोनात झुकलेल्या 3D प्रिंटिंग टेबलवर ठेवण्यात आले आणि मेंदूचा पुढचा भाग 35° कोनात कापण्यात आला. त्यानंतर मेंदूला कट केलेल्या पृष्ठभागावर चिकटवले गेले आणि विभागण्यात आले, ज्यामुळे थॅलेमोकॉर्टिकल बाहेर पडणारे अक्ष जतन केले गेले. बायपोलर टंगस्टन इलेक्ट्रोड (0.5 MΩ) दुसऱ्या मायक्रोमॅनिप्युलेटरवर बसवले गेले आणि प्रति पेशी चार क्षेत्रे (आतील कॅप्सूल, पांढरा पदार्थ, S1 आणि hCO) उत्तेजित करण्यासाठी धोरणात्मकरित्या स्थित केले गेले. 0.03–0.1 Hz वर 300 µA फॅसिक उत्तेजनानंतर सिनॅप्टिक प्रतिसाद रेकॉर्ड करा.
hChR2-अभिव्यक्त करणारे hCO न्यूरॉन्स 480 nm वर सक्रिय केले गेले आणि पेशींजवळ hChR2 अभिव्यक्ती रेकॉर्ड करण्यासाठी LED (Prizmatix) द्वारे निर्माण होणारे प्रकाश स्पंदन ×40 ऑब्जेक्टिव्ह (0.9 NA; ऑलिंपस) द्वारे लागू केले गेले. प्रकाशित क्षेत्राचा व्यास अंदाजे 0.5 मिमी आहे आणि एकूण शक्ती 10-20 mW आहे. नाडीची रुंदी 10 ms वर सेट केली गेली होती, जी वर्तणुकीय शिक्षण प्रयोगादरम्यान दिलेल्या नाडीशी जुळते. 1 ते 20 Hz पर्यंत विविध उत्तेजना फ्रिक्वेन्सी वापरल्या गेल्या, परंतु परिमाण निश्चित करण्यासाठी मालिकेतील फक्त पहिली नाडी वापरली गेली. सिनॅप्टिक इनहिबिटरी किंवा सुविधाजनक मार्गांवर परिणाम कमी करण्यासाठी ट्रेनमधील अंतर सहसा 30 सेकंदांपेक्षा जास्त असते. hChR2 प्रतिसाद मोनोसिनॅप्टिक होता की नाही हे तपासण्यासाठी, आम्ही EPSC प्रतिक्रिया गायब होईपर्यंत बाथमध्ये TTX (1 μM) लागू केले आणि नंतर 4-अमिनोपायरीडिन (4-AP; 100 μM) लागू केले. सामान्यतः, काही मिनिटांत प्रतिसाद मिळतो, ज्यामध्ये LED फायरिंग आणि EPSC जनरेशनमध्ये थोडा जास्त विलंब होतो. प्रतिसाद AMPA रिसेप्टर्सद्वारे चालवला जातो की नाही हे तपासण्यासाठी NBQX (10 μM) वापरण्यात आला.
पूर्वी वर्णन केल्याप्रमाणे तीव्र hCO विभाग तयार केले गेले. थोडक्यात, hCO विभाग 4% अ‍ॅगारोजमध्ये एम्बेड केले गेले आणि 126 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM NaH2PO4, 1 mM MgSO4, 2 mM CaCl2, 26 mM NaHCO3 आणि 10 mM d-(+) -ग्लुकोज असलेल्या पेशींमध्ये हस्तांतरित केले गेले. विभागांना खोलीच्या तपमानावर 200-300 µm वर Leica VT1200 व्हायब्रेटर वापरून कापले गेले आणि खोलीच्या तपमानावर ASF मध्ये साठवले गेले. त्यानंतर, संपूर्ण पेशींचे पॅच-कॅम्प रेकॉर्डिंग hCO विभागांवर थेट स्लाईसस्कोप सूक्ष्मदर्शकाखाली (सायंटिफिका) केले गेले. विभागांना aCSF (95% O2 आणि 5% CO2) सह परफ्यूज केले गेले आणि खोलीच्या तपमानावर सेल सिग्नल रेकॉर्ड केले गेले. १२७ मिमी पोटॅशियम ग्लुकोनेट, ८ मिमी NaCl, ४ मिमी मॅग्नेशियम ATP, ०.३ मिमी सोडियम GTP, १० मिमी HEPES आणि ०.६ मिमी EGTA, अंतर्गत pH ७, २, KOH (ऑस्मोलॅरिटी २९०) सह समायोजित केलेल्या द्रावणाने भरलेल्या बोरोसिलिकेट ग्लास पिपेटचा वापर करून hCO न्यूरॉन्स लागू केले गेले. पुनर्प्राप्तीसाठी, अंतर्गत द्रावणात ०.२% बायोसायटिन घाला.
क्लॅम्पेक्स (क्लॅम्पेक्स ११.१, मॉलिक्युलर डिव्हाइसेस) द्वारे मल्टीक्लॅम्प ७००बी अॅम्प्लिफायर (मॉलिक्युलर डिव्हाइसेस) आणि डिजिडेटा १५५०बी डिजिटायझर (मॉलिक्युलर डिव्हाइसेस) वापरून डेटा मिळवला गेला, २ किलोहर्ट्झवर लो-पास फिल्टर केला गेला, २० किलोहर्ट्झवर डिजिटायझेशन केले गेले आणि विश्लेषणासाठी क्लॅम्पफिट (आवृत्ती १०.६) वापरून विश्लेषण केले गेले, मॉलिक्युलर डिव्हाइसेस) आणि कस्टम MATLAB फंक्शन्स (MATLAB २०१९b, मॅथवर्क्स). JPCalc वापरून जंक्शन पोटेंशिअलची गणना केली गेली आणि नोंदी -१४ mV च्या गणना केलेल्या जंक्शन पोटेंशिअलमध्ये समायोजित केल्या गेल्या. ऑपरेशन IV मध्ये -५० ते २५० pA पर्यंत ५-१० pA चरणांमध्ये चालू चरणांची मालिका असते.
पिंच केलेल्या न्यूरॉन्सच्या मॉर्फोलॉजिकल पुनर्बांधणीसाठी, अंतर्गत द्रावणात 0.2% बायोसायटिन (सिग्मा-अल्ड्रिच) जोडले गेले. हॅकिंगनंतर पेशींना किमान 15 मिनिटे प्राइम केले जाते. नोंदणीकृत पडदा पूर्णपणे सील होईपर्यंत पिपेट नंतर 1-2 मिनिटांसाठी हळूहळू ओढले जाते. सेक्शन फिजियोलॉजी प्रक्रियेनंतर, सेक्शन रात्रभर 4% PFA मध्ये 4° C वर निश्चित केले गेले, PBS X3 ने धुतले गेले आणि स्ट्रेप्टाव्हिडिन-कंजुगेटेड डायलाईट 549 किंवा डायलाईट 405 (व्हेक्टर लॅब्स) सह 1:1000 पातळ केले गेले. बायोसायटिन (2%; सिग्मा-अल्ड्रिच) ने भरलेल्या पेशींना खोलीच्या तपमानावर पॅच क्लॅम्प रेकॉर्डिंग दरम्यान 2 तास लेबल केले गेले. त्यानंतर हे सेक्शन अॅक्वामाउंट (थर्मो सायंटिफिक) वापरून मायक्रोस्कोपी स्लाईड्सवर बसवले गेले आणि दुसऱ्या दिवशी लाइका TCS SP8 कॉन्फोकल मायक्रोस्कोपवर संख्यात्मक छिद्र ×40 1.3, मॅग्निफिकेशन ×0.9–1.0, xy सह ऑइल इमर्सन ऑब्जेक्टिव्ह वापरून व्हिज्युअलायझ केले गेले. सॅम्पलिंग रेट अंदाजे ७ पिक्सेल प्रति मायक्रॉन आहे. १ µm अंतराने झेड-स्टॅक अनुक्रमे मिळवले गेले आणि प्रत्येक न्यूरॉनच्या संपूर्ण डेंड्रिटिक ट्रीला कव्हर करण्यासाठी झेड-स्टॅक मोज़ेक आणि लाइका-आधारित ऑटो-स्टिचिंग केले गेले. त्यानंतर न्यूट्यूब ४० इंटरफेस वापरून न्यूरॉन्स अर्ध-मॅन्युअली ट्रॅक केले गेले आणि SWC फाइल्स तयार केल्या गेल्या. त्यानंतर फाइल्स SimpleNeuriteTracer41 फिजी प्लगइनवर अपलोड केल्या गेल्या (इमेजजे, आवृत्ती २.१.०; NIH).
स्टॅनफोर्ड विद्यापीठाच्या संस्थात्मक पुनरावलोकन मंडळाने मंजूर केलेल्या प्रोटोकॉलनुसार माहितीपूर्ण संमतीने मानवी कॉर्टिकल ऊती प्राप्त केल्या गेल्या. रिफ्रॅक्टरी एपिलेप्सीसाठी शस्त्रक्रियेचा भाग म्हणून फ्रंटल कॉर्टेक्स (मध्यम फ्रंटल गायरस) च्या रीसेक्शनद्वारे मानवी प्रसूतीनंतरच्या ऊतींचे (३ आणि १८ वर्षे) दोन नमुने प्राप्त केले गेले. रीसेक्शननंतर, बर्फाळ NMDG-aCSF मध्ये ऊतींची कापणी करा ज्यामध्ये समाविष्ट आहे: ९२ mM NMDG, २.५ mM KCl, १.२५ mM NaH2PO4, ३० mM NaHCO3, २० mM HEPES, २५ mM ग्लुकोज, २ mM थायोरिया, ५ mM सोडियम एस्कॉर्बेट, ३ mM ​​सोडियम पायरुवेट, ०.५ mM CaCl2 4H2O आणि १० mM MgSO4 7H2O. एकाग्र हायड्रोक्लोरिक आम्लासह pH ७.३-७.४ पर्यंत टायट्रेट करा. ऊती ३० मिनिटांत प्रयोगशाळेत पोहोचवण्यात आल्या आणि वर वर्णन केलेल्या प्रक्रियेनुसार कोरोनल सेक्शन घेण्यात आले.
सर्व प्राण्यांच्या प्रक्रिया स्टॅनफोर्ड विद्यापीठाच्या APLAC-मंजूर प्राण्यांच्या काळजी मार्गदर्शक तत्त्वांनुसार करण्यात आल्या. उंदरांना (प्रत्यारोपणानंतर १४० दिवसांपेक्षा जास्त) ५% आयसोफ्लुरेन भूल देण्यात आली आणि शस्त्रक्रियेदरम्यान १-३% आयसोफ्लुरेन भूल देण्यात आली. प्राण्यांना स्टीरिओटॅक्सिक फ्रेम (Kopf) मध्ये ठेवण्यात आले आणि त्वचेखाली सतत सोडण्यात येणारे ब्युप्रेनॉर्फिन (SR) इंजेक्शन देण्यात आले. कवटी उघडी केली जाते, स्वच्छ केली जाते आणि ३-५ हाडांचे स्क्रू घातले जातात. t-hCO3 लक्ष्य करण्यासाठी, आम्ही MRI प्रतिमांमधून स्टीरिओटॅक्सिक निर्देशांक तयार केले. आवडीच्या ठिकाणी एक बुर होल ड्रिल करण्यात आला आणि तंतू (४०० µm व्यास, NA ०.४८, डोरिक) hCO3 पृष्ठभागापासून १०० µm खाली आणले गेले आणि UV-क्युरेबल डेंटल सिमेंट (Relyx) ने कवटीला सुरक्षित केले.
पूर्वी वर्णन केल्याप्रमाणे फायबर फोटोमेट्रिक रेकॉर्डिंग करण्यात आले42. उत्स्फूर्त क्रियाकलाप रेकॉर्ड करण्यासाठी, उंदरांना एका स्वच्छ पिंजऱ्यात ठेवण्यात आले आणि फायबर ऑप्टिक फोटोमेट्रिक डेटा अधिग्रहण प्रणालीशी जोडलेली 400 µm व्यासाची फायबर ऑप्टिक पॅच केबल (डोरिक) प्रत्यारोपित फायबर ऑप्टिक केबलशी जोडण्यात आली. मोटर क्रियाकलापांच्या 10-मिनिटांच्या रेकॉर्डिंग दरम्यान, प्राणी पिंजऱ्याचा शोध घेण्यास मोकळे होते. उत्तेजित क्रियाकलाप रेकॉर्ड करण्यासाठी, उंदरांना (प्रत्यारोपणानंतर 140 दिवसांपेक्षा जास्त) इंडक्शनसाठी 5% आयसोफ्लुरेन आणि देखभालीसाठी 1-3% आयसोफ्लुरेनसह भूल देण्यात आली. प्राण्याला स्टिरिओटॅक्टिक फ्रेम (Kopf) मध्ये ठेवा आणि t-hCO च्या विरुद्ध बाजूला असलेल्या मिश्या सुमारे 2 सेमी पर्यंत कापल्या जातात आणि पायझोइलेक्ट्रिक अ‍ॅक्च्युएटर (PI) ला जोडलेल्या जाळीतून जातात. 400 µm फायबर ऑप्टिक पॅच केबल (डोरिक) प्रत्यारोपित फायबरशी जोडण्यात आली आणि डेटा अधिग्रहण प्रणालीशी जोडण्यात आली. त्यानंतर t-hCO च्या विरुद्ध बाजूच्या कल्ले २० मिनिटांच्या रेकॉर्डिंग कालावधीत पायझोइलेक्ट्रिक ड्राइव्हद्वारे यादृच्छिक वेळी ५० वेळा (२० हर्ट्झवर २ मिमी, प्रति सादरीकरण २ सेकंद) विचलित केले गेले. कस्टम MATLAB कोडसह विचलन वेळ नियंत्रित करण्यासाठी Arduino MATLAB सपोर्ट पॅकेज वापरा. ​​ट्रान्झिस्टर-ट्रान्झिस्टर लॉजिक (TTL) पल्स वापरून इव्हेंट्स डेटा अधिग्रहण सॉफ्टवेअरशी समक्रमित केले जातात.
उंदरांना (प्रत्यारोपणानंतर १४० दिवसांपेक्षा जास्त) ५% आयसोफ्लुरेन भूल देऊन आणि शस्त्रक्रियेदरम्यान १-३% आयसोफ्लुरेन भूल देऊन भूल देण्यात आली. प्राण्यांना स्टीरिओटॅक्सिक फ्रेम (कोप्फ) मध्ये ठेवण्यात आले आणि बुप्रेनॉर्फिन एसआर आणि डेक्सामेथासोन त्वचेखाली इंजेक्शन देण्यात आले. कवटी उघडी केली जाते, स्वच्छ केली जाते आणि ३-५ हाडांचे स्क्रू घातले जातात. टी-एचसीओ लक्ष्य करण्यासाठी, आम्ही एमआरआय प्रतिमांमधून स्टीरिओटॅक्सिक निर्देशांक तयार केले. प्रत्यारोपित एचसीओ वर थेट हाय स्पीड ड्रिलसह एक वर्तुळाकार क्रॅनियोटॉमी (अंदाजे १ सेमी व्यासाचा) करण्यात आला. हाड शक्य तितके पातळ झाल्यावर, परंतु संपूर्ण हाडातून ड्रिल करण्यापूर्वी, अंतर्निहित टी-एचसीओ उघड करण्यासाठी उर्वरित अखंड पेल्विक डिस्क काढण्यासाठी संदंश वापरा. ​​क्रॅनियोटॉमी निर्जंतुकीकरण सलाईनने भरण्यात आली आणि यूव्ही-क्युअर डेंटल सिमेंट (रेलिक्स) सह कवटीला एक कव्हरस्लिप आणि एक विशेष हेड पिन जोडण्यात आला.
Nikon LWD (×16, 0.8 NA) ऑब्जेक्टिव्हसह ब्रुकर मल्टीफोटॉन मायक्रोस्कोप वापरून टू-फोटॉन इमेजिंग करण्यात आले. GCaMP6 इमेजिंग 920 nm वर 1.4x सिंगल z-प्लेन मॅग्निफिकेशन आणि 8x सरासरी 7.5 fps सह करण्यात आले. उंदरांना 5% आयसोफ्लुरेन भूल देऊन प्रेरित करण्यात आले आणि 1-3% आयसोफ्लुरेनसह राखण्यात आले. उंदरांना कस्टम मेड हेड फिक्स्चरमध्ये ठेवण्यात आले आणि लेन्सखाली ठेवण्यात आले. मोटर अ‍ॅक्टिव्हिटीचे 3-मिनिटांचे पार्श्वभूमी रेकॉर्डिंग मिळवण्यात आले. रेकॉर्डिंगच्या 20 मिनिटांच्या कालावधीत, 50 पफ (प्रत्येक प्रेझेंटेशन 100 ms लांब) पिकोस्प्रिसर वापरून t-hCO विरुद्ध असलेल्या व्हिस्कर पॅडवर यादृच्छिकपणे वितरित केले गेले. कस्टम MATLAB कोडसह बर्स्ट टाइम नियंत्रित करण्यासाठी Arduino MATLAB सपोर्ट पॅकेज वापरा. ​​TTL पल्स वापरून डेटा अ‍ॅक्विझिशन सॉफ्टवेअर (PrairieView 5.5) सह इव्हेंट्स सिंक्रोनाइझ करा. विश्लेषणासाठी, फिजीमध्ये सुरू झालेल्या MoCo प्रोग्राममध्ये अ‍ॅफाइन करेक्शन वापरून xy मोशनसाठी प्रतिमा दुरुस्त करण्यात आल्या. CNMF-E43 वापरून वैयक्तिक पेशींमधून फ्लोरोसेंट ट्रेस काढणे. प्रत्येक आवडीच्या क्षेत्रासाठी फ्लोरोसेन्स काढला गेला, dF/F वक्रांमध्ये रूपांतरित केला गेला आणि नंतर z-स्कोअरमध्ये रूपांतरित केला गेला.
उंदरांना (प्रत्यारोपणानंतर १४० दिवसांपेक्षा जास्त) ५% आयसोफ्लुरेन भूल देण्यात आली आणि शस्त्रक्रियेदरम्यान १-३% आयसोफ्लुरेन भूल देण्यात आली. प्राण्यांना स्टीरिओटॅक्सिक फ्रेम (कोप्फ) मध्ये ठेवण्यात आले आणि बुप्रेनॉर्फिन एसआर आणि डेक्सामेथासोन त्वचेखाली इंजेक्शन देण्यात आले. टी-एचसीओच्या विरुद्ध बाजूस असलेल्या मिश्या सुमारे २ सेमी पर्यंत कापल्या गेल्या आणि पायझोइलेक्ट्रिक अ‍ॅक्ट्युएटरला जोडलेल्या जाळीने थ्रेड केल्या गेल्या. कवटी उघडी करून स्वच्छ केली जाते. कवटीला स्टेनलेस स्टीलचा ग्राउंड स्क्रू जोडला जातो. टी-एचसीओ लक्ष्य करण्यासाठी, आम्ही एमआरआय प्रतिमांमधून स्टीरिओटॅक्सिक निर्देशांक तयार केले. टी-एचसीओच्या अगदी वर हाय स्पीड ड्रिलसह वर्तुळाकार क्रॅनियोटॉमी (अंदाजे १ सेमी व्यासाचा) करा. हाड शक्य तितके पातळ झाल्यावर, परंतु संपूर्ण हाडातून ड्रिल करण्यापूर्वी, अंतर्निहित टी-एचसीओ उघडण्यासाठी उर्वरित अखंड पेल्विक डिस्क काढण्यासाठी संदंश वापरा. ३२-चॅनेल किंवा ६४-चॅनेल हाय-डेन्सिटी सिलिकॉन प्रोब (केंब्रिज न्यूरोटेक) वापरून वैयक्तिक पेशी रेकॉर्ड केल्या गेल्या ज्या ग्राउंड स्क्रूवर ग्राउंड केल्या गेल्या आणि RHD अॅम्प्लिफायर्स (इंटान) सह प्री-एम्प्लीफाय केल्या गेल्या. क्रॅनियोटॉमीद्वारे इलेक्ट्रोड्स लक्ष्य साइटवर कमी करण्यासाठी मॅनिपुलेटर वापरा, जे निर्जंतुकीकरण सलाईनने भरलेले आहे. ओपन इफिस डेटा अधिग्रहण प्रणाली वापरून ३० kHz च्या वारंवारतेवर डेटा संकलन केले गेले. रेकॉर्डिंग तेव्हाच चालू राहिले जेव्हा आम्हाला १० पेक्षा जास्त चॅनेलमध्ये अत्यंत सहसंबंधित लयबद्ध उत्स्फूर्त क्रियाकलाप आढळला, ज्यामुळे असे सूचित होते की इलेक्ट्रोड्स ग्राफ्टमध्ये स्थित आहेत (दोन-फोटॉन कॅल्शियम इमेजिंग डेटावर आधारित). मोटर क्रियाकलापांचे १०-मिनिटांचे पार्श्वभूमी रेकॉर्डिंग प्राप्त झाले. त्यानंतर t-hCO च्या विरुद्ध बाजूच्या व्हिस्कर्सना २० मिनिटांच्या रेकॉर्डिंग कालावधीत पायझोइलेक्ट्रिक ड्राइव्हद्वारे यादृच्छिक वेळी ५० वेळा (२० हर्ट्झवर २ मिमी, प्रति प्रेझेंटेशन २ सेकंद) विचलित केले गेले. Arduino साठी MATLAB सपोर्ट पॅकेज (MATLAB २०१९b) वापरून, कस्टम MATLAB कोडसह विक्षेपण वेळ नियंत्रित करा. डेटा अधिग्रहण सॉफ्टवेअरसह कार्यक्रमांचे सिंक्रोनाइझेशन करण्यासाठी TTL पल्स वापरा.
ऑप्टिकल मार्किंग प्रयोगांसाठी, ४७३ एनएम लेसर (ओमिक्रॉन) ला जोडलेला २०० µm ऑप्टिकल पॅच कॉर्ड (डोरिक) क्रॅनियोटॉमीवर ठेवलेल्या २०० µm ऑप्टिकल फायबरला जोडला गेला. याच्या लगेच आधी, जंपर पॉवर २० मेगावॅट पर्यंत समायोजित करा. क्रॅनियोटॉमीद्वारे, जे निर्जंतुकीकरण सलाईनने भरलेले असते, इलेक्ट्रोड लक्ष्य साइटवर कमी करण्यासाठी मॅनिपुलेटर वापरा. ​​रेकॉर्डिंगच्या सुरुवातीला, ४७३ एनएम (फ्रिक्वेन्सी २ हर्ट्झ, पल्स कालावधी १० एमएस) प्रकाशाच्या दहा स्पंदने उत्सर्जित झाली. प्रकाशसंवेदनशील पेशींना अशा पेशी म्हणून परिभाषित केले गेले ज्यांनी ७०% किंवा त्याहून अधिक चाचण्यांमध्ये १० एमएस प्रकाशाच्या आत स्पाइक प्रतिसाद दर्शविला.