Asante kwa kutembelea Nature.com. Unatumia toleo la kivinjari lenye uwezo mdogo wa kutumia CSS. Kwa matumizi bora zaidi, tunapendekeza utumie kivinjari kilichosasishwa (au uzime Hali ya Upatanifu katika Internet Explorer). Kwa kuongeza, ili kuhakikisha usaidizi unaoendelea, tunaonyesha tovuti bila mitindo na JavaScript.
Huonyesha jukwa la slaidi tatu kwa wakati mmoja. Tumia vitufe vilivyotangulia na Vifuatavyo ili kupitia slaidi tatu kwa wakati mmoja, au tumia vitufe vya kutelezesha vilivyo mwishoni ili kupitia slaidi tatu kwa wakati mmoja.
Miundo ya neural organelles inayojikusanya inawakilisha jukwaa la kuahidi katika muundo wa maendeleo ya binadamu na magonjwa. Walakini, organoids hukosa muunganisho uliopo katika vivo, ambayo inazuia kukomaa na kuzuia kuunganishwa na mizunguko mingine inayodhibiti tabia. Hapa tunaonyesha kwamba oganoidi za gamba zinazotokana na seli ya shina za binadamu zilizopandikizwa kwenye gamba la somatosensory la panya uchi wachanga hutengeneza aina za seli za kukomaa ambazo huungana katika mizunguko inayohusiana na hisia na motisha. MRI ilifichua ukuaji wa oganoid baada ya kupandikiza katika mistari na wanyama kadhaa wa seli shina, huku uchanganuzi wa msingi mmoja ulionyesha kuendelea kwa kotikojenesisi na kuibuka kwa programu ya unukuzi inayotegemea shughuli. Kwa hakika, niuroni za gamba zilizopandikizwa huonyesha sifa changamano zaidi za kimofolojia, sinepsi, na utando wa ndani kuliko wenzao wa ndani, hivyo kuruhusu ugunduzi wa kasoro za niuroni kwa wagonjwa walio na ugonjwa wa Timothy. Ufuatiliaji wa anatomiki na utendakazi umeonyesha kuwa viungo vilivyopandikizwa hupokea pembejeo za thalamokokoti na gambakokoti, na rekodi za shughuli za neva zinapendekeza kwamba vifaa hivi vinaweza kutoa majibu ya hisi katika seli za binadamu. Hatimaye, organoidi za gamba huongeza axoni katika ubongo wote wa panya, na uanzishaji wao wa optogenetic husababisha tabia ya kutafuta malipo. Kwa hivyo, niuroni za gamba la binadamu zilizopandikizwa hukomaa na kushiriki katika saketi za mwenyeji zinazodhibiti tabia. Tunatarajia mbinu hii kuwezesha ugunduzi wa phenotypes za kiwango cha strand katika seli zinazotokana na mgonjwa ambazo haziwezi kutambuliwa kwa njia zingine.
Ubongo wa binadamu unaokua ni mchakato wa ajabu wa kujipanga ambapo seli huongezeka, kutofautisha, kuhama, na kuunganishwa ili kuunda mizunguko ya nyuroni inayofanya kazi ambayo huboreshwa zaidi kupitia uzoefu wa hisi. Shida kuu katika kuelewa ukuaji wa ubongo wa mwanadamu, haswa katika muktadha wa ugonjwa, ni ukosefu wa ufikiaji wa tishu za ubongo. Organelles zinazojipanga, ikiwa ni pamoja na organoids ya gamba la binadamu (hCO; pia inajulikana kama nyanja ya cortex ya binadamu), inaweza kuzalisha 2,3,4,5,6. Walakini, mapungufu kadhaa huzuia matumizi yao mapana kuelewa ukuzaji na utendakazi wa mizunguko ya neva. Hasa, haijulikani ikiwa kukomaa kwa hCO kunazuiwa kwa kutokuwepo kwa pembejeo fulani za mazingira na hisia zilizopo katika vivo. Kwa kuongezea, kwa sababu hCO hazijaunganishwa katika saketi zinazoweza kutoa matokeo ya kitabia, manufaa yao katika kuiga matatizo changamano ya kinasaba na tabia ya neuropsychiatric ni mdogo kwa sasa.
Kupandikiza hCO ndani ya ubongo ulio hai unaweza kushinda vikwazo hivi. Uchunguzi wa awali umeonyesha kwamba niuroni za binadamu zilizopandikizwa kwenye gamba la panya zinaweza kuishi, mradi, na kuwasiliana na seli za panya7,8,9,10,11,12. Walakini, majaribio haya kawaida hufanywa kwa wanyama wazima, ambayo inaweza kupunguza ujumuishaji wa sinepsi na axonal. Hapa, tunaelezea dhana ya kupandikiza ambapo tulipandikiza 3D hCO inayotokana na seli za hiPS hadi kwenye gamba la msingi la somatosensory cortex (S1) ya panya wasio na kinga katika hatua ya awali ya ukuzaji wa plastiki. Neuroni za hCO (t-hCO) zilizopandikizwa hukomaa kwa kiasi kikubwa, hupokea pembejeo za thalamokokoti na gamba-gamba ambazo huibua majibu ya hisia, na kupanua makadirio ya aksoni kwenye ubongo wa panya ili kuendesha tabia ya kutafuta thawabu. Upevushaji wa muda mrefu wa t-hCO umefunua kasoro za neuronal kwa wagonjwa walio na ugonjwa wa Timothy (TS), ugonjwa mbaya wa maumbile unaosababishwa na mabadiliko katika chaneli ya kalsiamu ya aina ya L-nyeti ya aina ya CaV1.2 ya CaV1.2 (iliyosimbwa na CACNA1C).
Kuchunguza niuroni za gamba la binadamu katika mizunguko katika vivo, tulipandikiza 3D hCO isiyobadilika kwa njia isiyobadilika hadi kwenye S1 ya panya wa mapema baada ya kuzaa (siku 3-7 baada ya kuzaa) (Mchoro 1a na data iliyopanuliwa ya Mtini. 1a-c). Katika hatua hii, makadirio ya thalamocortical na cortical axonal bado hayajakamilisha uhifadhi wao wa ndani wa S1 (rejelea 13). Kwa hivyo, mbinu hii imeundwa ili kuongeza ujumuishaji wa t-hCO huku ikipunguza athari kwenye saketi za asili. Ili kuibua eneo la t-hCO katika wanyama hai, tulifanya upyaji wa ubongo wa T2 wa MRI wa panya miezi 2-3 baada ya kupandikiza (Mchoro 1b na data iliyopanuliwa, Mchoro 1d). t-hCO ilizingatiwa kwa urahisi na vipimo vya kiasi cha t-hCO vilikuwa sawa na vilivyohesabiwa kutoka kwa vipande vilivyowekwa (Data Iliyopanuliwa Kielelezo 1d, e; P > 0.05). t-hCO ilizingatiwa kwa urahisi na vipimo vya kiasi cha t-hCO vilikuwa sawa na vilivyohesabiwa kutoka kwa vipande vilivyowekwa (Data Iliyopanuliwa Kielelezo 1d, e; P > 0.05). t-hCO легко наблюдались, а объемные измерения t-hCO были аналогичны рассчитанным для фиксированных срезов (расширенны, песни, друг, 1, 10; 0,05). t-hCO ilizingatiwa kwa urahisi, na vipimo vya volumetric t-hCO vilikuwa sawa na vilivyohesabiwa kwa sehemu zilizowekwa (data iliyopanuliwa, Mchoro 1d, e; P > 0.05).很容易观察到t-hCO，并且t-hCO 的体积测量值与从固定切片计算的测量值相似（扩似（扩似（扩似（扩（测量值相似（扩（扩很0.05).很容易观察到t-hCO，并且t-hCO t-hCO легко наблюдался, а объемные измерения t-hCO были аналогичны рассчитанным для фиксированных срезов (расширенны, песни ; 0,05). t-hCO ilionekana kwa urahisi, na vipimo vya volumetric t-hCO vilikuwa sawa na vilivyohesabiwa kwa sehemu zilizowekwa (data iliyopanuliwa, Mchoro 1d, e; P > 0.05).Tuliamua t-hCO katika 81% ya wanyama waliopandikizwa takriban miezi 2 baada ya kupandikiza (n = wanyama 72; hCO kutoka kwa mistari 10 ya seli ya hiPS; mistari ya seli ya hiPS katika Jedwali la Nyongeza la 1). Kati ya hizi, 87% walikuwa iko katika cortex ya ubongo (Mchoro 1c). Kwa kufanya uchunguzi wa MRI wa serial kwa pointi nyingi za muda katika panya sawa iliyopandikizwa, tulipata ongezeko la mara tisa la kiasi cha t-hCO ndani ya miezi 3 (Mchoro 1d na data iliyopanuliwa, Mchoro 1f). Wanyama waliopandikizwa walikuwa na kiwango cha juu cha kuishi (74%) katika miezi 12 baada ya kupandikizwa (data iliyopanuliwa, Mchoro 1g na Jedwali la Nyongeza 2), na hakuna uharibifu wa magari au kumbukumbu, gliosis, au electroencephalogram (EEG) ilipatikana. Takwimu Kielelezo 1g na jedwali la ziada 2). 1h–m na 3e).
a, Mchoro wa muundo wa majaribio. hCO inayotokana na seli za nyonga ilipandikizwa kwenye S1 ya panya waliozaliwa uchi siku ya 30-60 ya kutofautisha. b, picha za MRI zenye uzito wa T2 na mlalo zinazoonyesha t-hCO katika S1 miezi 2 baada ya kupandikizwa. Upau wa mizani, 2 mm. c, Ukadiriaji wa viwango vya mafanikio ya uandishi vilivyoonyeshwa kwa kila laini ya seli ya hiPS (n = 108, nambari ndani ya pau zinaonyesha kiasi cha t-hCO kwa kila mstari wa seli ya hIPS) na eneo la gamba au tambarare (n = 88). d, picha ya MRI ya ateri ya moyo (kushoto; upau wa mizani, 3 mm) na uundaji upya wa ujazo wa 3D (upau wa mizani, 3 mm) unaoonyesha ongezeko la t-hCO kwa zaidi ya miezi 3. e, Mapitio ya mifumo ya t-hCO katika gamba la ubongo la panya. Upau wa mizani, 1 mm. f, Mwakilishi wa picha za immunocytochemical za t-hCO zilizoonyeshwa kutoka juu kushoto kwenda kulia (wakati wa kutofautisha): PPP1R17 (umri wa miezi 4), NeuN (umri wa miezi 8), SOX9 na GFAP (umri wa miezi 8), PDGFRα; (miezi 8), MAP2 (miezi 8) na IBA1 (miezi 8). Upau wa kupima, 20 µm. Usemi mwenza wa HNA unaonyesha seli za asili ya mwanadamu. g. Astrocytes, seli za mstari wa astrocyte; cycl prog, progenitors mzunguko; GluN DL, neurons ya kina ya glutamatergic; GluN DL/SP, neurons ya kina na sublamellar glutamatergic; GluN UL, niuroni za glutamatergic za safu ya juu; oligodendrocytes, oligodendrocytes; OPC, seli za asili za oligodendrocyte; RELN, niuroni za reelin. h, Ontolojia ya Jeni (GO) uchambuzi wa uboreshaji wa muda wa jeni uliodhibitiwa kwa kiasi kikubwa (iliyorekebishwa P <0.05, mabadiliko ya mara > 2, iliyoonyeshwa kwa angalau 10% ya viini) katika niuroni za t-hCO za glutamatiki ikilinganishwa na niuroni za hCO glutamatergic. h, Ontolojia ya Jeni (GO) uchambuzi wa uboreshaji wa muda wa jeni uliodhibitiwa kwa kiasi kikubwa (iliyorekebishwa P <0.05, mabadiliko ya mara > 2, iliyoonyeshwa kwa angalau 10% ya viini) katika niuroni za t-hCO za glutamatiki ikilinganishwa na niuroni za hCO glutamatergic. h, Анализ обогащения терминов Jeni Ontology (GO) kwa для генов со значительной активацией (скорректированный P <0,05, кратность изменения 2ратность изменения > 2 katika 10% ядер) katika глутаматергических нейронах t-hCO по сравнению с глутаматергическими нейронами hCO. h, Uchanganuzi wa neno la Ontolojia ya Jeni (GO) kwa ajili ya jeni zilizo na uwezeshaji muhimu (iliyorekebishwa P<0.05, mabadiliko ya mara >2, kujieleza kwa angalau 10% ya viini) katika niuroni za t-hCO za glutamatiki ikilinganishwa na niuroni za hCO glutamatiki. h, 与hCO 谷氨酸能神经元相比，t-hCO 谷氨酸能神经元中基因显着上调（调整后P <0.05挕倍2，在至少10% 的细胞核中表达）的基因本体论(GO) 术语富集分析. h , 与 hco 谷氨酸 能 元 相比 , t-hco 谷氨酸 能 神经 元 基因 显着 上调 （后 嘎受 嘎 （后 嘎 （后 嘎 （后 嘎 （后 嘎 （后 嘎（ 后 嘎 （后 嘎） （后 嘎） （后 嘎（ ） 2 , 至少 10% 的 核中 表达） 基因 基因 的 的 的 的 的 的 的 的 核中 达） 基因 基因 h, гены значительно активизировались (скорректированный P <0,05, кратность изменения> 2, экспрессируется по крайней мере в 10% нейронах t-hCO по сравнению с глутаматергическими нейронами hCO Онтологический (GO) анализ термина обогащения. h, jeni zilidhibitiwa kwa kiasi kikubwa (iliyorekebishwa P <0.05, mabadiliko ya mkunjo > 2, iliyoonyeshwa kwa angalau 10% ya viini) katika niuroni za t-hCO glutamatergic ikilinganishwa na niuroni za hCO glutamatergic Ontological (GO) ya muda wa uboreshaji.Mstari wa nukta unaonyesha thamani ya aq ya 0.05. i, taswira ya UMAP ya aina za seli za GluN katika t-hCO kwa kutumia uhamisho wa lebo kutoka kwa hifadhidata ya kumbukumbu ya 22 snRNA-seq ya gamba la watu wazima. CT - seli za corticothalamic, ET - seli za extracerebral, IT - seli za telencephalic za ndani, NP - karibu na makadirio.
Kisha tukatathmini muundo wa cytoarchitecture na muundo wa jumla wa seli za t-hCO. Uchafuzi wa kingamwili wa seli za mwisho wa panya ulifunua upanuzi wa mishipa na t-hCO, wakati rangi ya IBA1 ilifichua uwepo wa microglia ya panya katika pandikizi (Mchoro 1f na data iliyopanuliwa, Mtini. 3c, d). Immunostaining ilifichua chembe chembe chanya za antijeni ya nyuklia ya binadamu (HNA) zinazoonyesha pamoja PPP1R17 (watangulizi wa gamba), NeuN (nyuroni), SOX9 na GFAP (seli zinazotokana na glial) au PDGFRα (watangulizi wa oligodendrocyte) (Mchoro 1f). Ili kusoma muundo wa seli za t-hCO katika azimio la seli moja, tulifanya upangaji wa RNA wa msingi mmoja (snRNA-seq) baada ya takriban miezi 8 ya utofautishaji. Uchujaji kwa wingi na uondoaji wa viini vya panya ulitoa ramani 21,500 za ubora wa juu za nyuklia za binadamu (Mchoro 1g na data iliyopanuliwa, Mtini. 4a,b). Miundo ya usemi ya vialamisho vya kawaida vya aina ya seli vilibainisha vishada vya tabaka kuu za gamba la gamba, ikijumuisha niuroni za kina na za juu juu za glutamatiki, vizazi vinavyozunguka, oligodendrositi na ukoo wa unajimu (Mchoro 1g, data iliyopanuliwa, Kielelezo 4c, na Jedwali la 3 la Nyongeza). Immunostaining kwa SATB2 na CTIP2 ilionyesha kuwa licha ya kuwepo kwa subtypes ya cortical, t-hCO haikuonyesha stratification wazi ya anatomical (data iliyopanuliwa, Mchoro 3a). snRNA-seq hCO iliyolingana na hatua ilizalisha madarasa ya seli sawa kwa upana, isipokuwa chache, ikiwa ni pamoja na kutokuwepo kwa oligodendrocytes na kuwepo kwa neurons ya GABAergic, ambayo inaweza kutafakari hali ya awali ya hali nzuri ya vitro kwa seli za progenitor lateral15 (data iliyopanuliwa, Mchoro 4f - i na Jedwali la Nyongeza 4). Uchanganuzi tofauti wa usemi wa jeni ulifunua tofauti kubwa katika niuroni za glutamatiki kati ya t-hCO na hCO (Jedwali la Ziada 5), ​​ikiwa ni pamoja na kuwezesha seti za jeni zinazohusiana na kukomaa kwa niuroni kama vile ishara za sinepsi, ujanibishaji wa dendritic, na shughuli za chaneli inayopitisha umeme (Mchoro 1h na Jedwali la Ziada la 5). meza 6). Ipasavyo, niuroni za cortical glutamatergic t-hCO zilionyesha upevukaji wa transcription ulioharakishwa.
Ili kufafanua ikiwa mabadiliko haya ya maandishi katika t-hCO yalihusiana na tofauti za kimofolojia kati ya hCO in vitro na t-hCO katika vivo, tulijenga upya hCO na hCO iliyojaa biocytin iliyolingana na hatua katika sehemu kali baada ya miezi 7-8 ya kutofautisha. hCO neurons (Mchoro 2a). Neuroni za t-hCO zilikuwa kubwa zaidi, zilikuwa na mara 1.5 ya kipenyo cha soma, mara mbili ya dendrites nyingi, na ongezeko la jumla la mara sita la urefu wa dendritic ikilinganishwa na in vitro hCO (Mchoro 2b). Kwa kuongezea, tuliona msongamano mkubwa zaidi wa miiba ya dendritic katika niuroni za t-hCO kuliko niuroni za hCO (Mchoro 2c). Hii inaonyesha kwamba t-hCO neurons kupitia elongation dendritic kina na matawi, ambayo, pamoja na kuendelea kuenea kwa seli, inaweza kuchangia ukuaji mkubwa wa t-hCO baada ya upandikizaji (Mchoro 1d na Data Extended Mtini. 1f). Hii ilitufanya kuchunguza sifa za electrophysiological. Uwezo wa utando ulikuwa mara nane zaidi (data iliyopanuliwa, Mtini. 8d), uwezo wa utando wa hali ya kupumzika ulikuwa wa hyperpolarized zaidi (takriban 20 mV), na sindano ya sasa ilisababisha kiwango cha juu cha msisimko katika niuroni za t-hCO kuliko katika niuroni za hCO. in vitro (Mchoro 2d), e), ambayo ni sawa na sifa kubwa na ngumu zaidi za kimaadili za t-hCO. Kwa kuongeza, mzunguko wa matukio ya sasa ya msisimko wa postynaptic (EPSC) ulikuwa wa juu zaidi katika neurons za t-hCO (Kielelezo 2f), ikionyesha kuwa kuongezeka kwa msongamano wa miiba ya dendritic iliyozingatiwa katika neurons ya t-hCO ilihusishwa na msisimko wa kazi. sinepsi ya ngono. Tulithibitisha ukomavu wa niuroni za hCO katika vitro kwa kurekodi niuroni za glutamatergic (data iliyopanuliwa, Mtini. 6a-c).
a, ujenzi wa 3D wa hCO iliyojaa biocytin na niuroni za t-hCO baada ya miezi 8 ya kutofautisha. b, Ukadiriaji wa vipengele vya kimofolojia (n = 8 hCO neurons, n = 6 t-hCO neurons; **P = 0.0084, *P = 0.0179 na ***P <0.0001). b, Ukadiriaji wa vipengele vya kimofolojia (n = 8 hCO neurons, n = 6 t-hCO neurons; **P = 0.0084, *P = 0.0179 na ***P <0.0001). б, количественная оценка морфологических признаков (n = 8 нейронов hCO, n = 6 нейронов t-hCO; ** P = 0,0084, * P = 0,0179 na *** P <0,00). b, ukadiriaji wa vipengele vya kimofolojia (n=8 hCO niuroni, n=6 niuroni za t-hCO; **P=0.0084, *P=0.0179, na ***P<0.0001). b，形态学特征的量化（n = 8 个hCO 神经元，n = 6 个t-hCO 神经元；**P = 0.0084,*P = 0.0179 和***0 <0.0179 和***0 1. b，形态学特征的量化（n = 8 个hCO 神经元，n = 6 个t-hCO 神经元；**P = 0.0084,*P = 0.0179 和***0 <0.0179 和***0 1. б, количественная оценка морфологических признаков (n = 8 нейронов hCO, n = 6 нейронов t-hCO; ** P = 0,0084, * P = 0,0179 na *** P <0,00). b, ukadiriaji wa vipengele vya kimofolojia (n=8 hCO niuroni, n=6 niuroni za t-hCO; **P=0.0084, *P=0.0179, na ***P<0.0001).c, ujenzi wa 3D wa matawi ya hCO na t-hCO dendritic baada ya miezi 8 ya kutofautisha. Nyota nyekundu zinaonyesha miiba ya dendritic. Ukadiriaji wa msongamano wa mgongo wa dendritic (n = 8 hCO neurons, n = 6 t-hCO niuroni; **P = 0.0092). d, Ukadiriaji wa uwezo wa utando wa kupumzika (n = 25 hCO neurons, n = 16 t-hCO neurons; ***P <0.0001). d, Ukadiriaji wa uwezo wa utando wa kupumzika (n = 25 hCO neurons, n = 16 t-hCO neurons; ***P <0.0001). d, количественная оценка мембранного потенциала покоя (n = 25 нейронов hCO, n = 16 нейронов t-hCO; *** P <0,0001). d, utando unaopumzika uwezo wa kukadiria (n = 25 hCO neurons, n = 16 t-hCO niuroni; ***P <0.0001). d，静息膜电位的量化（n = 25 hCO 神经元,n = 16 t-hCO 神经元；***P <0.0001）. d，静息膜电位的量化（n = 25 hCO 神经元,n = 16 t-hCO 神经元；***P <0.0001）. d, количественная оценка мембранного потенциала покоя (n = 25 нейронов hCO, n = 16 нейронов t-hCO; *** P <0,0001). d, utando unaopumzika uwezo wa kukadiria (n = 25 hCO neurons, n = 16 t-hCO niuroni; ***P <0.0001). e, Ufyatuaji wa uwezo wa kurudia hatua katika hCO na t-hCO unaosababishwa na kuongezeka kwa sindano za sasa, na kuhesabu kiwango cha juu cha kurusha (n = 25 hCO neurons, n = 16 t-hCO niuroni; ***P <0.0001). e, Ufyatuaji wa uwezo wa kurudia hatua katika hCO na t-hCO unaosababishwa na kuongezeka kwa sindano za sasa, na kuhesabu kiwango cha juu cha kurusha (n = 25 hCO neurons, n = 16 t-hCO niuroni; ***P <0.0001). e, повторное возбуждение потенциала действия katika hCO na t-hCO, вызванное увеличением тока, и количественная оценка максимальной скорости 255 n = 16 нейронов t-hCO *** P <0,0001). e, uwezekano wa hatua kurusha tena katika hCO na t-hCO unaosababishwa na ongezeko la sasa na hesabu ya kiwango cha juu cha kurusha (n = 25 hCO neurons, n = 16 t-hCO nyuroni; *** P <0.0001). e，通过增加电流注入诱导的hCO 和t-hCO 重复动作电位放电，以及最大放电率的量化（n CO6 = 25 神 = 25个t-hCO 神经元；***P <0.0001）. E , 通过 增加 电流 注入 的 hco 和 t-hco 重复 电位 放电 , 以及 最 大 的 量化 （ 5 神 = 2 （5 神 = 16 个 t-hco 神经 ; *** p <0.0001） . e, повторяющееся возбуждение потенциала действия hCO na t-hCO, вызванное увеличением подачи тока, и количественная оценка максимальний 2005 = нейронов hCO, n = 16 нейронов t-hCO *** P <0,0001). e, urushaji wa marudio wa uwezo wa hatua wa hCO na t-hCO unaosababishwa na kuongezeka kwa usambazaji wa sasa na ujazo wa kiwango cha juu cha kurusha (n = 25 hCO neurons, n = 16 t-hCO niuroni; *** P <0.0001). f, EPSC za Papo hapo (sEPSCs) katika hCO na t-hCO niuroni katika miezi 8 ya kutofautisha, na quantification ya mzunguko wa matukio ya sinepsi (n = 25 hCO neurons, n = 17 t-hCO neurons; ***P <0.0001). f, EPSC za papohapo (sEPSCs) katika hCO na t-hCO neurons katika miezi 8 ya kutofautisha, na quantification ya mzunguko wa matukio ya sinepsi (n = 25 hCO neurons, n = 17 t-hCO neurons; ***P <0.0001) . f, спонтанные EPSC (sEPSC) katika нейронах hCO na t-hCO через 8 месяцев дифференцировки na количественная оценка частоты синаптический соб, 25 = 2 17 нейронов t-hCO *** P <0,0001) . f, EPSC za Papohapo (sEPSCs) katika niuroni za hCO na t-hCO katika miezi 8 ya upambanuzi na ukadiriaji wa viwango vya matukio ya sinepsi (n=25 nyuroni za hCO, n=17 niuroni za t-hCO; ***P<0.0001). f,分化8 个月时hCO 和t-hCO 神经元中的自发性EPSCs (sEPSCs), 以及突触事件频率的量化（n = 25 hCO 7 神经 = 25 hCO 7 神神经元；***P <0.0001） . f，分化8 个月时hCO 和t-hCO 神经元中的自发性EPSCs (sEPSCs), 以及突触事件频率的量匼（n = 25 hCO 25 hCO 神n神率的量匼（n = 25hCO P <0.0001） . f, спонтанные EPSC (sEPSC) katika нейронах hCO na t-hCO через 8 месяцев дифференцировки na количественная оценка частоты синаптический соб, 25 = 2 17 нейронов t-hCO *** P <0,0001). f, EPSC za papohapo (sEPSCs) katika hCO na t-hCO niuroni katika miezi 8 ya utofautishaji na upimaji wa viwango vya matukio ya sinepsi (n = 25 hCO neurons, n = 17 t-hCO niuroni; *** P<0.0001).Kwa bf, hCO na t-hCO katika mstari wa 1208-2 zilichukuliwa kutoka kwa bechi moja ya upambanuzi iliyodumishwa kwa sambamba. g, Jeni iliweka uchanganuzi wa uboreshaji (mtihani kamili wa Fisher wa upande mmoja) wa jeni uliodhibitiwa kwa kiasi kikubwa (iliyorekebishwa P <0.05, mabadiliko ya mkunjo > 2, yaliyoonyeshwa kwa angalau 10% ya viini) katika niuroni za t-hCO glutamatergic ikilinganishwa na niuroni za hCO glutamatergic zilizo na seti za jeni za shughuli zote mbili za nyuma-ponseresponseresponseres (L) jeni zilizotambuliwa kutoka kwa utafiti wa panya katika vivo16 na LRG maalum za binadamu kutoka kwa niuroni za vitro17. g, Jeni iliweka uchanganuzi wa uboreshaji (mtihani kamili wa Fisher wa upande mmoja) wa jeni uliodhibitiwa kwa kiasi kikubwa (iliyorekebishwa P <0.05, mabadiliko ya mkunjo > 2, yaliyoonyeshwa kwa angalau 10% ya viini) katika niuroni za t-hCO glutamatergic ikilinganishwa na niuroni za hCO glutamatergic zilizo na seti za jeni za shughuli zote mbili za nyuma-ponseresponseresponseres (L) jeni zilizotambuliwa kutoka kwa utafiti wa panya katika vivo16 na LRG maalum za binadamu kutoka kwa niuroni za vitro17. g, анализ обогащения набора генов (односторонний точный критерий Фишера) генов со значительной активацией (скорректированнны5й, P) 2, экспрессия по меньшей мере katika 10% ядер) katika глутаматергических нейронах t-hCO kwa сравнению с глутаматергическими нейгронами hCO набор позднего (LRG) генов, зависящих от активности, идентифицированных katika исследовании kwenye мышах katika vivo16, na специфических для челозвей 17 и пецифических для челозвека 17 VORD LRG. g, uchanganuzi wa uboreshaji wa seti ya jeni (jaribio kamili la Fisher lenye mkia mmoja) wa jeni zilizo na uwezeshaji mkubwa (iliyorekebishwa P<0.05, mabadiliko ya mara >2, kujieleza katika angalau 10% ya viini) katika niuroni za t-hCO za glutamatergic ikilinganishwa na seti za hCO glutamatergic neurons za shughuli zote mbili za mapema (ERG genes) zilizoainishwa mapema (ERG) na kuchelewa. na LRGs maalum za binadamu kutoka kwa niuroni katika vitro17. g,t-hCO谷氨酸能神经元与hCO谷氨酸能神经元相比，t -hCO谷氨酸能神经元显着上调（调整后P<0.05，倍数变化>2，在至少10%的细胞核中表达）的基因集富集分析（单侧F isher精确检验）从体内小鼠研究中鉴定的早期反应(ERG)和晚期反应(LRG) 活性依赖性基因的基因组16 和体外神经元17 中的人类特异性LRG. g , t-hco 谷氨酸 神经 元 与 hco 谷氨酸 神经 元 相比 , t-hco 谷氨酸 神经 元 上调比 （0 调 .倍数> 2 , 至少 至少 10%的 细胞 核中 表达） 的集富集 分析 （单侧 mvuvi 精确 彠）中 的 早期 反应 反应 反应 和 晚期 反应 反应 (lrg) 活性 基因的 基因组 16 和 神经元 中7 中 中 元 中7 17的人类特异性LRG. g, глутаматергические нейроны t-hCO были значительно активизированы по сравнению с глутаматергическими нейронами hCO (скоррективизированы, P. 2, sio 10% Анализ обогащения набора генов (односторонний точный тест Фишера) раннего ответа (ERG) na позднего гены, завися идентифицированные в исследованиях мышах katika vivo16 na нейронах katika vitro17, специфичные для человека. g, niuroni za glutamatergic za t-hCO zilidhibitiwa kwa kiasi kikubwa ikilinganishwa na niuroni za hCO glutamatergic (zilizorekebishwa P<0.05, mabadiliko ya mara >2, angalau 10% ya majibu ya Mapema (ERG) na uchanganuzi wa uboreshaji wa jeni la mwitikio (mtihani kamili wa Fisher wenye mkia mmoja) jeni tegemezi za shughuli za majibu katika vitro 17 vya jeni (LRG6 katika neurons). LRGs.Mstari wa nukta unaonyesha thamani ya P iliyosahihishwa na Bonferroni ya 0.05. h, usemi wa jeni wa GluN (kifurushi bandia na upanuzi wa kila jeni) ulidhibitiwa kwa kiasi kikubwa katika nakala za snRNA-seq za jeni za LRG katika niuroni za t-hCO za glutamatergic. i, kinga inayoonyesha usemi wa SCG2 katika niuroni za t-hCO (juu) na hCO (chini). Mishale nyeupe inaelekeza kwenye seli za SCG2+. Upau wa mizani, 25 µm. Data huonyeshwa kama wastani ± mkengeuko wa kawaida.
Kulingana na ongezeko la shughuli za t-hCO zinazozingatiwa katika vipande vya ex vivo, snRNA-seq ilifunua udhibiti unaotegemea shughuli wa nakala za jeni katika t-hCO ikilinganishwa na hCO in vitro. Neuroni za Glutamatergic t-hCO zilionyesha viwango vya juu vya jeni vinavyodhibiti shughuli za majibu ya marehemu (Kielelezo 2g, h), ambazo zilipatikana katika masomo ya awali katika nyuroni za panya na za binadamu16,17. Kwa mfano, BDNF18, SCG2, na OSTN, jeni inayodhibiti shughuli mahususi ya nyani, ilionyesha ongezeko la kujieleza katika nyuroni za t-hCO ikilinganishwa na niuroni za hCO (Mchoro 2g-i). Kwa hivyo, niuroni za t-hCO zilionyesha sifa za kukomaa zilizoimarishwa ikilinganishwa na niuroni za hCO kwa uchanganuzi wa maandishi, kimofolojia na utendakazi.
Ili kutathmini zaidi uhusiano wa kukomaa kwa t-hCO na ukuaji wa ubongo wa binadamu, tulifanya ulinganisho wa maandishi ya aina ya seli za gamba la fetasi na la watu wazima19,20 na watu wazima21,22 na pia data ya kina kuhusu usemi wa jeni la gamba23 wakati wa ukuzaji (data iliyopanuliwa, Mtini. 5). ) pamoja na kazi ya awali 24, hali ya ukomavu wa maandishi ya kimataifa ya hCO na t-hCO katika miezi 7-8 ya utofautishaji inaendana kwa upana na wakati wa ukuaji wa vivo na ni sawa na maisha ya marehemu ya fetasi (Data Iliyopanuliwa Kielelezo 5a). Hasa, tuliona kuongezeka kwa ukomavu wa maandishi katika t-hCO ikilinganishwa na hCO inayolingana na umri, pamoja na uanzishaji wa maandishi yanayohusiana na synaptogenesis, astrogenesis, na miyelination (data iliyopanuliwa, Mtini. 5b-d). Katika kiwango cha seli, tulipata ushahidi wa aina ndogo ya gamba nyembamba katika t-hCO, yenye makundi ya niuroni za glutamatergic zinazopishana na aina ndogo za L2/3, L5, na L6 za nyuro za L6 (Mchoro 1i). Kinyume chake, mwingiliano wa nguzo kati ya niuroni za glutamatergic t-hCO na niuroni za gamba la fetasi ulikuwa mdogo zaidi katikati ya ujauzito (data iliyopanuliwa, Mchoro 5e-j). Ili kubaini kama niuroni za t-hCO zinafanana kiutendaji na niuroni za neocortical baada ya kuzaa, tulirekodi rekodi za kielektroniki na uundaji upya wa anatomiki wa niuroni za piramidi za L2/3 katika sehemu zenye ncha kali za gamba la baada ya kuzaa (data iliyopanuliwa, Mtini. 7a). Sifa za kielekrofiziolojia za niuroni za piramidi za L2/3 zilikuwa sawa na zile za niuroni za piramidi za t-hCO (data iliyopanuliwa, Mtini. 7e). Kimfolojia, niuroni za L2/3 kutoka kwa sampuli za binadamu baada ya kuzaa zilifanana zaidi na t-hCO kuliko hCO, ingawa seli za L2/3 zilikuwa ndefu, zilikuwa na matawi mengi kwa ujumla, na zilikuwa na msongamano mkubwa wa mgongo (Mchoro 3g na data iliyopanuliwa, Mtini. 7b-). G).
a, kupandikiza hCO inayozalishwa na udhibiti na mistari ya seli ya TS hiPS kuwa panya wachanga. b, uundaji upya wa 3D wa niuroni za t-hCO zilizojaa biocytin baada ya miezi 8 ya kutofautisha. c, upimaji wa urefu wa wastani wa dendritic (n = 19 kudhibiti neurons, n = 21 TS neurons; **P = 0.0041). d, matawi ya dendritic yaliyoundwa upya kwa 3D kutoka kwa udhibiti na TS t-hCO katika miezi 8 ya kutofautisha, na quantification ya dendritic wiani wa mgongo (n = 16 kudhibiti neurons, n = 21 TS neurons, ***P <0.0001). d, matawi ya dendritic yaliyoundwa upya kwa 3D kutoka kwa udhibiti na TS t-hCO katika miezi 8 ya kutofautisha, na quantification ya dendritic wiani wa mgongo (n = 16 kudhibiti neurons, n = 21 TS neurons, ***P <0.0001). d, 3D-реконструкция дендритных ветвей из контроля na TS t-hCO через 8 месяцев дифференцировки и количественная оценка плондистин плотности 6 = контрольных нейронов, n = 21 TS нейронов, *** P <0,0001). d, ujenzi wa 3D wa matawi ya dendritic kutoka kwa udhibiti na t-hCO TS katika miezi 8 ya utofautishaji na upimaji wa wiani wa dendritic (n=16 neurons kudhibiti, n=21 TS neurons, ***P<0.0001). d，分化8 个月时对照和TS t-hCO的3D 重建树突分支，以及树突棘密度的量化（n = 16 內內內个TS 神经元,***P <0.0001). d , 分化 8 个 时 对照 和 ts t-hco 的 3d 重建 分支 分支 以及 树突棘 密度 量化 1 神 （n 1 = 1 = 6 21 个 ts 神经 , *** p <0.0001 . d, 3D-реконструкция дендритных ветвей контроля и TS t-hCO через 8 месяцев дифференцировки na количественная оценка плотностиный плотности 1 контрольных нейронов, n = 21 TS нейронов, *** P <0,0001). d, ujenzi wa 3D wa matawi ya kudhibiti dendritic na TS t-hCO katika miezi 8 ya utofautishaji na upimaji wa msongamano wa dendritic (n=16 niuroni za kudhibiti, n=21 niuroni za TS, ***P<0.0001).Nyota nyekundu zinaonyesha miiba ya dendritic. e, EPSC zinazodhibitiwa na TS t-hCO baada ya miezi 8 ya utofautishaji. f, njama ya masafa ya mkusanyiko na ukadiriaji wa marudio na ukubwa wa matukio ya sinepsi (n=32 niuroni za kudhibiti, n=26 niuroni za TS; **P=0.0076 na P=0.8102). g, Uchambuzi wa Scholl wa TS na neurons kudhibiti katika hCO na t-hCO. Mistari iliyokatika huonyesha niuroni za piramidi za baada ya kuzaa za L2/3 za binadamu kwa kulinganisha (n = 24 udhibiti wa t-hCO niuroni, n = 21 TS t-hCO niuroni, n = 8 kudhibiti niuroni hCO, na n = 7 TS hCO niuroni). Data huonyeshwa kama wastani wa ± mkengeuko wa kawaida
Uwezo wa t-hCO wa kunakili vipengele vya kimofolojia na utendaji kazi vya niuroni za gamba la binadamu katika kiwango cha juu ulituchochea kuchunguza ikiwa t-hCO inaweza kutumika kugundua phenotypes za ugonjwa. Tuliangazia TS, ugonjwa mbaya wa ukuaji wa neva unaosababishwa na mabadiliko ya faida ya kazi katika usimbaji wa jeni CaV1.2, ambayo huanzisha unukuzi wa jeni unaotegemea shughuli katika niuroni. Tulipata hCO kutoka kwa wagonjwa watatu wa TS wanaobeba uingizwaji wa kawaida (p.G406R) na udhibiti tatu (Mchoro 3a). Baada ya kupandikizwa, tuligundua kuwa morphology ya dendritic ilibadilishwa katika neurons za TS ikilinganishwa na udhibiti (Mchoro 3b na data iliyopanuliwa, Mchoro 8a, b), na ongezeko la mara mbili la idadi ya dendrites ya msingi na ongezeko la jumla la wastani na kupungua kwa jumla kwa urefu wa dendritic (Mchoro 3c na data iliyopanuliwa, Mchoro 8c). Hii ilihusishwa na kuongezeka kwa msongamano wa miiba na kuongezeka kwa mzunguko wa EPSC za hiari katika TS ikilinganishwa na neurons za udhibiti (Mchoro 3d-f na data iliyopanuliwa, Mtini. 8g). Uchambuzi zaidi ulifunua mifumo ya matawi ya dendritic isiyo ya kawaida katika t-hCO TS ikilinganishwa na udhibiti, lakini si katika vitro TS hCO katika hatua sawa ya upambanuzi (Mchoro 3g). Hii inalingana na ripoti zetu za awali za kupungua kwa dendritic kulingana na shughuli katika TS na kuangazia uwezo wa jukwaa hili la upandikizaji kutambua phenotypes za ugonjwa katika vivo.
Kisha tuliuliza ni kwa kiwango gani seli za t-hCO zimeunganishwa kiutendaji katika panya S1. S1 katika panya hupokea pembejeo kali za sinepsi kutoka kwa msingi wa ventral basal na nyuma ya thalamic nuclei, pamoja na motor ipsilateral na sekondari ya gamba la somatosensory, na contralateral S1 (Mchoro 4a). Ili kurejesha muundo wa uhifadhi, tuliambukiza hCO na virusi vya kichaa cha mbwa-dG-GFP/AAV-G na tukapandikiza hCO kwenye panya S1 siku 3 baadaye. Tuliona usemi mnene wa GFP katika niuroni za S1 ipsilateral na ventral basal ganglia siku 7-14 baada ya kupandikizwa (Mchoro 4b, c). Kwa kuongeza, upakaji wa kingamwili wa netrin ya thalamic ya netrin G1 ulifichua uwepo wa miisho ya thalamic katika t-hCO (Mchoro 4d, e). Ili kutathmini kama makadirio haya tofauti yanaweza kuleta majibu ya sinepsi katika seli za t-hCO, tulirekodi seli nzima kutoka kwa seli za binadamu katika sehemu zenye ncha kali za safu ya thalamokoti. Kichocheo cha umeme cha panya S1, kibonge cha ndani, chembe nyeupe, nyuzi karibu na t-hCO au uwezeshaji optogenetic wa miisho ya thalamic inayoonyesha opsin katika t-hCO iliyosababishwa na EPSC za muda mfupi za latency katika niuroni za t-hCO zilizofichuliwa kwa mpinzani wa kipokezi cha AMPA NBQX. (Mchoro 4f, g na data iliyopanuliwa, Mchoro 9a-g). Data hizi zinaonyesha kuwa t-hCO imeunganishwa kianatomiki kwenye ubongo wa panya na inaweza kuwashwa na tishu mwenyeji wa panya.
a, Mchoro wa kiratibu wa jaribio la kufuatilia kichaa cha mbwa. b, GFP na usemi mahususi wa STEM121 wa binadamu kati ya t-hCO na gamba la ubongo la panya (jopo la juu). Pia inavyoonyeshwa ni usemi wa GFP katika kiini cha msingi cha panya (VB) (chini kushoto) na ipsilateral S1 (chini kulia). Upau wa kupima, 50 µm. Miraba nyekundu inawakilisha maeneo ya ubongo ambapo picha zilichukuliwa. c, quantification ya seli zinazoonyesha GFP (n = panya 4). d, e - Netrin G1+ vituo vya thalamic katika t-hCO. d inaonyesha sehemu ya coronal iliyo na t-hCO na VB nuclei. Upau wa mizani, 2 mm. e inaonyesha Netrin G1 na STEM121 usemi katika t-hCO (kushoto) na VB (kulia) neurons. Upau wa kupima, 50 µm. Mstari wa rangi ya chungwa unaonyesha mpaka wa t-hCO. f, g, Athari za sasa za niuroni t-hCO baada ya msisimko wa umeme katika panya S1 (f) au kapsuli ya ndani (g), na (zambarau) au bila (nyeusi) NBQX (kushoto). Amplitudes za EPSC zenye na bila NBQX (n = 6 S1 neurons, *P = 0.0119; na n = 6 za ndani za neurons za capsule, **P = 0.0022) (katikati). Asilimia ya niuroni za t-hCO zinazoonyesha EPSC kutokana na msisimko wa umeme wa panya S1 (f) au kapsuli ya ndani (g) (kulia). aCSF, maji ya uti wa mgongo bandia. h, mchoro wa mpangilio wa jaribio la upigaji picha la 2P (kushoto). Usemi wa GCaMP6s katika t-hCO (katikati). Upau wa kupima, 100 µm. Kupungua kwa muda wa Fluorescence kwa GCaMP6s (kulia). i, Z-alama ya shughuli ya moja kwa moja ya fluorescence. j, kielelezo cha kimkakati cha kichocheo cha masharubu. k, z-zilizopata alama 2P njia za umeme katika jaribio moja, zikiwa zimepangwa na mkengeuko wa visharua kwa wakati sufuri (mstari uliokatika) katika visanduku vya mfano. l, majibu ya wastani ya idadi ya watu ya z-alama ya seli zote zilizopangiliwa na mkengeuko wa visharua kwa wakati sufuri (mstari uliopasuka) (nyekundu) au mihuri ya muda inayozalishwa bila mpangilio (kijivu). m. Mchoro wa kimpango wa jaribio la kuashiria macho. n, Mijiko ya voltage ghafi kutoka kwa mfano seli ya t-hCO wakati wa msisimko wa leza ya buluu au mgeuko wa viwiko. Mishale nyekundu inaonyesha spikes za kwanza zinazosababishwa na mwanga (juu) au zinazosababishwa na kupotosha kwa whisker (chini). Kivuli cha kijivu kinaonyesha vipindi vya kupotoka kwa whisker. o, Miundo ya kiwango cha juu cha mawimbi ya mwanga na majibu ya kukengeusha whisker. p, spikes ya jaribio moja, iliyokaa na kupotoka kwa whiskers katika seli za mfano. 0 inaonyesha kupotoka kwa whisker (mstari wa dashi). q, kiwango cha wastani cha z-alama za kurusha idadi ya watu kwa visanduku vyote vinavyoweza kuguswa na picha, vilivyopangiliwa na mkengeuko wa visharua kwa wakati sufuri (mstari uliopasuka) (nyekundu) au mihuri ya muda inayozalishwa bila mpangilio (kijivu). r, Uwiano wa vitengo vya kupiga picha vilivyorekebishwa kwa kiasi kikubwa na mkengeuko wa whisker (n = panya 3) (kushoto). Muda wa kusubiri wa alama z-kilele (n = panya 3; n = 5 (kijani hafifu), n = 4 (kijani kibichi), na n = 4 (cyan) vitengo vya urekebishaji wa visiki kwa kila panya) (kulia). Data huonyeshwa kama wastani ± mkengeuko wa kawaida
Kisha tuliuliza ikiwa t-hCO inaweza kuwashwa na vichocheo vya hisia katika vivo. Tulipandikiza hCO inayoonyesha viashirio vya kalsiamu vilivyosimbwa kwa vinasaba vya GCaMP6 hadi kwenye panya wa S1. Baada ya siku 150, tulifanya fotometry ya nyuzi au picha ya kalsiamu ya picha mbili (Mchoro 4h na data iliyopanuliwa, Mchoro 10a). Tuligundua kuwa seli za t-hCO zilionyesha shughuli ya midundo iliyosawazishwa (Mchoro 4i, Data Iliyopanuliwa, Kielelezo 10b na Video ya Ziada ya 1). Ili kubainisha shughuli za kilele cha t-hCO, tulifanya rekodi za kielektroniki za ziada katika panya za kupandikiza kwa ganzi (data iliyopanuliwa, Mtini. 10c-f). Tumeunda kuratibu za stereotaxic kutoka kwa picha za MRI; kwa hivyo, vitengo hivi vilivyorekodiwa vinawakilisha niuroni za binadamu, ingawa elektrofiziolojia pekee hairuhusu aina ya asili kubainishwa. Tuliona mipasuko iliyosawazishwa ya shughuli (data iliyopanuliwa, Mtini. 10d). Milipuko hiyo ilidumu kama 460 ms na ilitenganishwa na vipindi vya ukimya vya takriban 2 s (data iliyopanuliwa, Mchoro 10d, e). Vitengo vya mtu binafsi vilifuta wastani wa takriban raundi tatu kwa kila mlipuko, ambayo ni takriban 73% ya vitengo vilivyosajiliwa kwa kila mlipuko. Shughuli za vitengo vya mtu binafsi ziliunganishwa sana, na uwiano huu ulikuwa wa juu zaidi kuliko wale wa vitengo vilivyotambuliwa katika wanyama wasio na chanjo waliorekodi chini ya hali sawa (data iliyopanuliwa, Mchoro 10f). Ili kubainisha zaidi mwitikio wa mwinuko wa niuroni zilizotambuliwa zinazotokana na binadamu, tulifanya majaribio ya kuweka alama kwenye mwanga kwa panya waliolazwa kwa ganzi waliopandikizwa na hCO inayoonyesha njia nyeti nyepesi ya rhodopsin 2 (hChR2), ambayo niuroni za t-hCO utambuzi wa muda mfupi wa kuchelewesha (chini ya 10 ms-fimuli ya mstimuli ya bluu). Neuroni za t-hCO zilionyesha mlipuko wa shughuli za hiari katika masafa sawa na yale yaliyozingatiwa katika picha ya kalsiamu, pamoja na rekodi za electrophysiological zilizofanywa katika t-hCO bila kukosekana kwa alama ya mwanga (data iliyopanuliwa, Mtini. 10c-g). Hakuna shughuli ya hiari iliyozingatiwa katika hatua zinazolingana za hCO iliyorekodiwa katika vitro. Ili kutathmini kama t-hCO inaweza kuamilishwa na vichocheo vya hisia, tuliondoa kwa ufupi sharubu za panya kutoka kwa t-hCO (Mchoro 4j, m na data iliyopanuliwa, Mtini. 10h, k). Kwa mujibu wa masomo ya awali8,10, sehemu ndogo ya seli za t-hCO ilionyesha kuongezeka kwa shughuli katika kukabiliana na upungufu wa whisker, ambao haukuzingatiwa wakati data ililinganishwa na mihuri ya muda wa random (Mchoro 4k-q na data iliyopanuliwa, Mchoro 10h-q). Hakika, karibu 54% ya vitengo vya opto-labeled moja ilionyesha kiwango cha kuongezeka kwa kiasi kikubwa cha msisimko baada ya kusisimua whisker, kufikia kilele cha 650 ms (Mchoro 4r). Kwa pamoja, data hizi zinaonyesha kuwa t-hCO inapokea pembejeo za utendaji zinazofaa na inaweza kuanzishwa na vichocheo vya mazingira.
Kisha tukachunguza ikiwa t-hCO inaweza kuwezesha mizunguko katika panya ili kudhibiti tabia. Tulichunguza kwanza ikiwa akzoni za niuroni za t-hCO zinaingia kwenye tishu zinazozunguka za panya. Tuliambukiza hCO kwa usimbaji wa lentivirus hChR2 iliyounganishwa kwa EYFP (hChR2-EYFP). Baada ya siku 110, tuliona mwonekano wa EYFP katika maeneo ya gamba la pembeni, ikiwa ni pamoja na sehemu za sikio, motor, na somatosensory, na pia katika maeneo ya chini ya gamba, ikiwa ni pamoja na striatum, hippocampus na thelamasi (Mchoro 5a). Ili kutathmini kama makadirio haya yanayoweza kuleta majibu ya sinepsi katika seli za panya, tuliwasha seli za t-hCO zinazoonyesha hChR2-EYFP kwa kurekodi seli za gamba la ubongo katika sehemu zenye ncha kali za ubongo. Uamilisho wa akzoni za t-hCO zilizo na mwanga wa buluu zilizotokana na EPSC za muda mfupi wa kusubiri katika niuroni za gamba la piramidi, ambazo zilizuiliwa na NBQX (Mtini. 5b–g). Kwa kuongeza, majibu haya yanaweza kuzuiwa na tetrodotoxin (TTX) na kurejeshwa na 4-aminopyridine (4-AP), na kupendekeza kuwa yalisababishwa na uhusiano wa monosynaptic (Mchoro 5e).
a, Mchoro wa mpangilio wa ufuatiliaji wa axon (kushoto). usemi wa t-hCO EYFP (kulia). Upau wa kupima, 100 µm. A1, gamba la kusikia, ACC, gamba la mbele la singulate, d. striatum, dorsal striatum, HPC, hippocampus; Diaphragm, lateral septamu, mPFC, gamba la mbele la mbele la kati, piri, piriform cortex, v. striatum, ventral striatum, VPM, nucleus ya ventropostomedial ya thelamasi, VTA, eneo la ventral tegmental. Miraba nyekundu inawakilisha maeneo ya ubongo ambapo picha zilichukuliwa. b, Mchoro wa kimkakati wa jaribio la kusisimua. c, d, Mifano ya majibu ya picha ya bluu inayotokana na mwanga (juu) na voltage (chini) kwa binadamu (c) EYFP+ t-hCO au panya (d) seli za EYFP-. e, f, Athari za sasa za niuroni za panya baada ya msisimko wa mwanga wa samawati wa akzoni za t-hCO na TTX na 4-AR (kijani), TTX (kijivu) au aCSF (nyeusi) (e), yenye (violet) au bila (nyeusi) ) ) NBQX (e). g, latency ya majibu yanayotokana na mwanga wa bluu katika seli za panya (n = seli 16); pau mlalo zinaonyesha muda wa wastani wa kusubiri (7.13 ms) (kushoto). Ukuzaji wa EPSC zilizoamshwa na mwanga zilizorekodiwa na au bila NBQX (n = seli 7; ***P <0.0001) (katikati). Ukuzaji wa EPSC zilizoamshwa na mwanga zilizorekodiwa na au bila NBQX (n = seli 7; ***P <0.0001) (katikati). Амплитуда вызванных светом EPSC, зарегистрированных с или без NBQX (n = 7 клеток; ***P <0,0001) (в центре). Ukuzaji wa EPSC zinazotokana na mwanga zilizorekodiwa na au bila NBQX (n = seli 7; ***P <0.0001) (katikati).使用或不使用NBQX 记录的光诱发EPSC 的振幅（n = 7 个细胞；***P <0.0001）（中）.使用或不使用NBQX 记录的光诱发EPSC 的振幅（n = 7 个细胞；***P <0.0001）（中）. Амплитуда вызванных светом EPSC, зарегистрированных с или без NBQX (n = 7 клеток; ***P <0,0001) (в центре). Ukuzaji wa EPSC zinazotokana na mwanga zilizorekodiwa na au bila NBQX (n = seli 7; ***P <0.0001) (katikati).Asilimia ya seli za panya zinazoonyesha EPSC zinazojibu mwanga wa buluu (kulia). h, Mchoro wa mpangilio wa kazi ya kitabia. d0, siku 0. i. Utendaji wa wanyama wa mfano siku ya 1 (kushoto) au siku ya 15 (kulia) ya mafunzo. Idadi ya wastani ya midomo iliyofanywa siku ya 1 (kushoto) au siku ya 15 (katikati ya kulia) (n = majaribio 150 ya mwanga wa bluu, n = majaribio 150 ya mwanga mwekundu; ***P <0.0001). Idadi ya wastani ya midomo iliyofanywa siku ya 1 (kushoto) au siku ya 15 (katikati ya kulia) (n = majaribio 150 ya mwanga wa bluu, n = majaribio 150 ya mwanga mwekundu; ***P <0.0001). Среднее количество облизываний, выполненных kwenye день 1 (слева) na день 15 (n = 150 испытаний с синим светой, n = 150 светом, n = 150 светом; ***P <0,0001). Idadi ya wastani ya midomo iliyofanywa siku ya 1 (kushoto) au siku ya 15 (katikati kulia) (n = majaribio 150 ya mwanga wa bluu, n = majaribio 150 ya mwanga mwekundu; ***P <0.0001).第1 天（左）或第15 天（右中）执行的平均舔次数（n = 150 次蓝光试验，n = 150 试验，n = 150 0.0001).第1 天（左）或第15 天（右中）执行的平均舔次数（n = 150 次蓝光试验，n = 试验，n = 试验，n = 试验，n = 试验，n = 150 试验，n = 150 Среднее количество облизываний, выполненных kwenye день 1 (слева) na день 15 (n = 150 испытаний с синим светой, n = 150 светом, n = 150 светом; ***P <0,0001). Idadi ya wastani ya midomo iliyofanywa siku ya 1 (kushoto) au siku ya 15 (katikati kulia) (n = majaribio 150 ya mwanga wa bluu, n = majaribio 150 ya mwanga mwekundu; ***P <0.0001).Kulamba kwa wingi kwa majaribio ya mwanga mwekundu na buluu siku ya 1 (katikati kushoto) au siku ya 15 (kulia). NS, sio muhimu. j,k, Tabia za tabia za wanyama wote waliopandikizwa na t-hCO inayoonyesha hChR2-EYFP (j) au kudhibiti fluorophore (k) siku ya 1 au 15 (hChR2-EYFP: n = panya 9, ** P = 0.0049; udhibiti: n = 9, P9 = 0). l, Mageuzi ya alama ya upendeleo (n = 9 hChR2, n = 9 kudhibiti; **P <0.001, ***P <0.0001). l, Mageuzi ya alama ya upendeleo (n = 9 hChR2, n = 9 kudhibiti; **P <0.001, ***P <0.0001). l, Эволюция показателя предпочтения (n = 9 hChR2, n = 9 контрольных; **P <0,001, ***P <0,0001). l, Mageuzi ya alama ya upendeleo (n = 9 hChR2, n = vidhibiti 9; **P <0.001, ***P <0.0001). l，偏好评分的演变（n = 9 hChR2，n = 9 对照；**P <0.001,***P <0.0001). l，偏好评分的演变（n = 9 hChR2，n = 9 对照；**P <0.001,***P <0.0001). l, Эволюция показателей предпочтения (n = 9 hChR2, n = 9 контролей; **P <0,001, ***P <0,0001). l, Mageuzi ya alama za upendeleo (n = 9 hChR2, n = vidhibiti 9; **P <0.001, ***P <0.0001).m, usemi wa FOS katika kukabiliana na uanzishaji wa optogenetic ya t-hCO katika S1. Picha za usemi wa FOS (kushoto), na ujazo (n = 3 kwa kila kikundi; *P <0.05, **P <0.01 na ***P <0.001) (kulia) zinaonyeshwa. Picha za usemi wa FOS (kushoto), na ujazo (n = 3 kwa kila kikundi; *P <0.05, **P <0.01 na ***P <0.001) (kulia) zinaonyeshwa. Показаны изображения экспрессии FOS (слева) и количественного определения (n = 3 на группу; * P <0,05, ** P <0,01 na *** P <0,001) (справа). Picha za usemi wa FOS (kushoto) na ukadiriaji (n = 3 kwa kila kikundi; *P<0.05, **P<0.01, na ***P<0.001) zinaonyeshwa (kulia).显示了FOS 表达（左）和量化（每组n = 3;*P <0.05,**P <0.01 和***P <0.001）（右）的图像。显示了FOS 表达（左）和量化（每组n = 3;*P <0.05,**P <0.01 和***P <0.001）（右）的图像。 Показаны изображения экспрессии FOS (слева) и количественного определения (n = 3 на группу; * P <0,05, ** P <0,01 na *** P <0,001) (справа). Picha za usemi wa FOS (kushoto) na ukadiriaji (n = 3 kwa kila kikundi; *P<0.05, **P<0.01, na ***P<0.001) zinaonyeshwa (kulia).Upau wa kupima, 100 µm. Data inaonyeshwa kama wastani ± makosa ya kawaida ya BLA, tonsili ya msingi, MDT, kiini cha thalamic ya dorsomedial, PAG, kijivu cha periaqueductal.
Hatimaye, tuliuliza ikiwa t-hCO inaweza kurekebisha tabia ya panya. Ili kujaribu hili, tulipandikiza hChR2-EYFP-inaonyesha hCO hadi S1, na siku 90 baadaye, tuliweka nyuzi za macho kwenye t-hCO kwa ajili ya utoaji wa mwanga. Kisha tuliwafundisha panya na dhana ya hali ya uendeshaji iliyobadilishwa (Mchoro 5h). Tuliwaweka wanyama katika chumba cha majaribio ya tabia na tukaweka nasibu sekunde 5 za bluu (473 nm) na nyekundu (635 nm) vichocheo vya leza. Wanyama walipokea thawabu ya maji ikiwa walilamba wakati wa msisimko wa mwanga wa bluu lakini hawakulamba wakati wa msisimko wa taa nyekundu. Katika siku ya kwanza ya mafunzo, wanyama hawakuonyesha tofauti katika kulamba wakati wa kuchochewa na mwanga wa bluu au nyekundu. Hata hivyo, siku ya 15, wanyama waliopandikizwa na hCO inayoonyesha hChR2-EYFP walionyesha kulamba kwa nguvu zaidi walipochochewa na mwanga wa buluu ikilinganishwa na msisimko wa taa nyekundu. Mabadiliko haya ya tabia ya kulamba hayakuzingatiwa katika udhibiti wa wanyama waliopandikizwa na hCO inayoonyesha udhibiti wa fluorophore (kiwango cha mafanikio ya kujifunza: hChR2 89%, EYFP 0%, Kielelezo 5i-1 na Video ya Ziada 2). Data hizi zinaonyesha kuwa seli za t-hCO zinaweza kuwezesha neurons za panya ili kuchochea tabia ya kutafuta zawadi. Ili kujua ni sakiti zipi za neural za panya t-hCO zinaweza kuhusika katika mabadiliko haya ya kitabia, tuliwasha t-hCO kiotomatiki katika wanyama waliofunzwa na tishu zilizovunwa dakika 90 baadaye. Immunohistokemia ilifichua usemi wa protini ya FOS inayotegemea shughuli katika maeneo kadhaa ya ubongo inayohusika na tabia ya kuhamasishwa, ikiwa ni pamoja na gamba la mbele la mbele la kati, thelamasi ya kati, na suala la kijivu la periaqueductal, ambalo lilionyeshwa ama katika wanyama wasio na udhibiti au kwa wanyama. mchele. 5m). Kwa pamoja, data hizi zinapendekeza kuwa t-hCO inaweza kurekebisha shughuli za nyuroni za panya ili kuendesha tabia.
Neural organoids inawakilisha mfumo wa kuahidi wa kusoma maendeleo ya binadamu na ugonjwa katika vitro, lakini ni mdogo na ukosefu wa miunganisho kati ya mizunguko iliyopo katika vivo. Tumeunda jukwaa jipya ambalo tulipandikiza hCO hadi S1 ​​ya panya wa mapema baada ya kuzaa ambao hawana kinga ili kusoma ukuaji na utendaji wa seli za binadamu katika vivo. Tumeonyesha kuwa t-hCO hukuza aina za seli zilizokomaa ambazo hazizingatiwi katika vitro28 na kwamba t-hCO imeunganishwa kimaanatomia na kiutendaji katika ubongo wa panya. Ujumuishaji wa t-hCO katika mizunguko ya neural ya panya ulituruhusu kuanzisha kiunganishi kati ya shughuli za seli za binadamu na tabia ya wanyama iliyochunguzwa, ikionyesha kwamba niuroni za t-hCO zinaweza kurekebisha shughuli za niuroni za panya ili kuendesha majibu ya tabia.
Jukwaa tunaloelezea lina manufaa kadhaa juu ya utafiti wa awali wa kupandikiza seli za binadamu hadi kwenye ubongo wa panya. Kwanza, tulipandikiza hCO kwenye gamba linalokua la panya wa mapema baada ya kuzaa, ambayo inaweza kuwezesha ujumuishaji wa anatomiki na utendaji. Pili, ufuatiliaji wa t-hCO MRI ulituruhusu kujifunza nafasi ya graft na ukuaji wa wanyama hai, kuruhusu sisi kufanya masomo ya muda mrefu ya wanyama mbalimbali na kuanzisha uaminifu wa mistari kadhaa ya seli za hiPS. Hatimaye, tulipandikiza oganoidi zisizobadilika, badala ya kusimamishwa kwa seli moja, ambazo hazina uharibifu kidogo kwa seli za binadamu na zinaweza kukuza ujumuishaji na uzalishaji wa niuroni za gamba la binadamu katika ubongo wa panya.
Tunakubali kwamba licha ya maendeleo katika jukwaa hili, vikwazo vya muda, anga na spishi mbalimbali huzuia uundaji wa mizunguko ya neva ya binadamu kwa uaminifu wa juu, hata baada ya kupandikiza katika hatua ya awali ya maendeleo. Kwa mfano, haijulikani ikiwa shughuli ya hiari inayozingatiwa katika t-hCO inawakilisha phenotipu ya ukuzaji sawa na shughuli ya mdundo inayozingatiwa wakati wa ukuzaji wa gamba, au ikiwa ni kwa sababu ya kutokuwepo kwa aina za seli za kukandamiza zilizopo katika t-hCO. Vile vile, haijulikani ni kwa kiasi gani ukosefu wa lamination katika t-hCO huathiri uunganisho wa mnyororo30. Kazi ya siku zijazo italenga kuunganisha aina zingine za seli kama vile mikroglia ya binadamu, seli za mwisho za binadamu, na idadi tofauti ya miingiliano ya GABAergic kama inavyoonyeshwa kwa kutumia assembly 6 in vitro, na pia kuelewa jinsi ujumuishaji wa neva na usindikaji unaweza kutokea katika t-hCO iliyobadilishwa. viwango vya transcription, sinepsi na tabia katika seli zilizopatikana kutoka kwa wagonjwa.
Kwa ujumla, jukwaa hili la vivo linawakilisha rasilimali yenye nguvu inayoweza kukamilisha maendeleo ya ubongo wa binadamu na utafiti wa magonjwa. Tunatarajia kuwa jukwaa hili litaturuhusu kugundua aina mpya za kiwango cha strand-level katika seli ambazo ni ngumu kupata zinazotokana na mgonjwa na kujaribu mikakati mipya ya matibabu.
Tulitengeneza hCO2.5 kutoka kwa seli za HiPS kama ilivyoelezwa hapo awali. Ili kuanzisha uzalishaji wa hCO kutoka kwa seli za hiPS zilizopandwa kwenye tabaka za malisho, safu nzima za seli za hiPS zilitolewa kutoka kwa sahani za kitamaduni kwa kutumia dispase (0.35 mg/mL) na kuhamishiwa kwenye tamaduni za plastiki zenye viambatisho vya chini sana vilivyo na sahani zilizo na chombo cha utamaduni cha hiPS. (Corning) iliyoongezewa na vizuizi viwili vya SMAD dorsomorphine (5 μM; P5499, Sigma-Aldrich) na SB-431542 (10 μM; 1614, Tocris) na kizuizi cha ROCK Y-27632 (10 μM; S1049, Selleckchem). Katika siku 5 za kwanza, kati ya seli ya hiPS ilibadilishwa kila siku na dorsomorphine na SB-431542 ziliongezwa. Katika siku ya sita ya kusimamishwa, spheroids za neural zilihamishiwa kwenye neural medium iliyo na neurobasal-A (10888, Life Technologies), B-27 ya ziada bila vitamini A (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies), penicillin na streptomy00cin, epichnologies ya ukuaji wa Epichnologies (1:1) na Life Technologies (1:1) kipengele (EGF; 20 ng ml−1; Mifumo ya R&D) na kipengele cha 2 cha ukuaji wa fibroblast (FGF2; 20 ng ml-1; Mifumo ya R&D) hadi siku ya 24. Kuanzia siku ya 25 hadi siku ya 42, cha kati kiliongezewa na kipengele cha neurotrophic kinachotokana na ubongo (BDNF; 20 , trophin 3; 3 trophin; 20 trophin; 3 trophin) 20 ng ml-1; Peprotech) na mabadiliko ya wastani kila siku nyingine. Katika siku ya sita ya kusimamishwa, spheroids za neural zilihamishiwa kwenye neural medium iliyo na neurobasal-A (10888, Life Technologies), B-27 ya ziada bila vitamini A (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies), penicillin na streptomy00cin, epichnologies ya ukuaji wa Epichnologies (1:1) na Life Technologies (1:1) kipengele (EGF; 20 ng ml−1; Mifumo ya R&D) na kipengele cha 2 cha ukuaji wa fibroblast (FGF2; 20 ng ml-1; Mifumo ya R&D) hadi siku ya 24. Kuanzia siku ya 25 hadi siku ya 42, cha kati kiliongezewa na kipengele cha neurotrophic kinachotokana na ubongo (BDNF; 20 , trophin 3; 3 trophin; 20 trophin; 3 trophin) 20 ng ml-1; Peprotech) na mabadiliko ya wastani kila siku nyingine.Katika siku ya sita ya kusimamishwa, spheroids za neural zilihamishiwa kwenye kati ya neural iliyo na Neurobasal-A (10888, Life Technologies), B-27 ya ziada bila vitamini A (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies), penicillin.и стрептомицин (1:100, Life Technologies) и дополнены эпидермальным фактором роста (EGF; 20 нг/мл; Mifumo ya R&D) и фактором роста фибл20Fласто фибл20Fласто; Mifumo ya R&D) до 24-го дня. na streptomycin (1:100, Life Technologies) na kuongezewa kipengele cha ukuaji wa epidermal (EGF; 20 ng/ml; R&D Systems) na kipengele cha 2 cha ukuaji wa fibroblast (FGF2; 20 ng/ml; Mifumo ya R&D) hadi siku ya 24.Kuanzia siku ya 25 hadi 42, sababu ya neurotrophic inayotokana na ubongo (BDNF; 20 ng ml-1, Peprotech) na neurotrophin 3 (NT3; 20 ng ml-1, Peprotech) iliongezwa kwa kati, kubadilisha kati kila siku nyingine.在悬浮的第6 天，将神经球体转移到含有neurobasal-A（10888，Maisha Technologies）、不含维生素A 的B-27 补充充儿25 Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies) ml-1;R&D Systems）和成纤维细胞生长因子2（FGF2;20 ng ml-1;R&D Systems）直至第24 天.在 悬浮 的第 第 6 天 将 神经 球体 转移 含有 含有 neurobasal-a (10888 , Life Technologies) 不 含 维移 含有 含有 neurobasal-a (10888 , Life Technologies) (12587 , Life Technologies) Glutamax (1: 100 , Life TechNOGIS青霉素 的 神经 培养 基 中 链霉素 （（1: 100 素 （（1: 100 经） 经 ，生长 因子 ((((20 ng ml-1 ; r & d Systems) 成 纤维 细胞 生长 2 （fgf2; 20 ng ml- 1;R&D Systems）笴2). На 6-й день суспензии нейросферы были переведены на добавку, содержащую нейробазал-А (10888, Life Technologies), добавку 2бавку 8, 7 Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies), пенициллин- нейтрализованный сстрептомицин (1:100, Life Technologies) с добавлением эпидермальго факторангей факторай (1FORMANCE); Mifumo ya R&D) na фактора роста фибробластов 2 (FGF2; 20 нг мл-1) 1; Siku ya 6, usitishaji wa mfumo wa neva ulibadilishwa hadi kiongeza chenye neurobasal-A (10888, Life Technologies), B-27 ziada bila vitamini A (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies), penicillin-neutralized streptomycin (1:100) nyongeza ya ukuaji wa maisha na Technologies ya 1:100 (EGF; 20 ng ml-1; Mifumo ya R&D) na kipengele cha ukuaji wa fibroblast 2 (FGF2; 20 ng ml-1) 1; Mifumo ya R&D) до 24-го дня. Mifumo ya R&D) hadi siku ya 24.Kuanzia siku ya 25 hadi 42, kipengele cha neurotrophic kinachotokana na ubongo (BDNF; 20 ng ml-1, Peprotech) na kipengele cha 3 cha neurotrophic (NT3; 20 ng ml-1, Peprotech) kiliongezwa kwa njia ya utamaduni kila siku nyingine. Mabadiliko ya wastani mara moja.Kuanzia siku ya 43, hCO ilidumishwa katika mfumo wa neurobasal-A ambao haujaongezwa (NM; 1088022, Thermo Fisher) na mabadiliko ya wastani kila baada ya siku 4-6. Ili kupata hCO kutoka kwa seli za hiPS zilizokuzwa chini ya hali zisizo na malisho, seli za hiPS ziliwekwa ndani kwa Accutase (AT-104, Innovate Cell Technologies) kwa 37°C kwa dakika 7, zikiwa zimetenganishwa kuwa seli moja, na kubandikwa kwenye sahani za AggreWell 800 (34815, STEMCELL katika seli 6 za kisima 6 kwa kila seli 6 kwa kila seli 6 za Technologies 1) Essential 8 kati ikiongezewa na ROCK inhibitor Y-27632 (10 μM; S1049, Selleckchem). Baada ya saa 24, vyombo vya habari katika visima vilipigwa bomba juu na chini kwenye vyombo vya habari vyenye Essential 6 media (A1516401, Life Technologies) iliyoongezewa dorsomorphine (2.5 μM; P5499, Sigma-Aldrich) na SB-431542 (10 μM; 1614). , Tocrida). Kuanzia siku 2 hadi 6, Essential 6 medium ilibadilishwa kila siku na dorsomorphine na nyongeza ya SB-431542. Kuanzia siku ya sita, kusimamishwa kwa neurosphere kulihamishiwa kwa kati ya neurobasal na kudumishwa kama ilivyoelezwa hapo juu.
Taratibu zote za wanyama zilifanywa kwa mujibu wa miongozo ya utunzaji wa wanyama iliyoidhinishwa na Kamati ya Utawala ya Utunzaji wa Wanyama ya Chuo Kikuu cha Stanford (APLAC). Panya wajawazito wa RNU (rnu/+) walinunuliwa (Charles River Laboratories) au kuwekwa makazi. Wanyama walihifadhiwa kwenye mzunguko wa giza-mwanga wa saa 12 na chakula na maji libitum. Watoto wachanga wa panya walio uchi (FOXN1–/–) wenye umri wa siku tatu hadi saba walitambuliwa na ukuaji wa ndevu ambazo hazijakomaa kabla ya kukatwa. Watoto wa mbwa (wa kiume na wa kike) walipigwa ganzi kwa 2-3% ya isoflurane na kuwekwa kwenye fremu ya stereotaxic. Mtetemo wa fuvu la kichwa chenye kipenyo cha takriban mm 2-3 juu ya S1 ulifanyika wakati wa kudumisha uadilifu wa dura mater. Kisha tumia sindano ya 30-G (takriban 0.3 mm) nje kidogo ya craniotomy ili kutoboa dura. Kisha weka HCO kwa parafilm nyembamba ya 3 × 3 cm na uondoe kati ya ziada. Kwa kutumia sindano ya Hamilton iliyounganishwa kwenye sindano ya 23 G, 45°, chora kwa upole hCO kwenye ncha ya mbali zaidi ya sindano. Kisha sakinisha sindano kwenye pampu ya sindano iliyounganishwa na kifaa cha stereotaxic. Kisha weka ncha ya sindano juu ya shimo la kuchomwa lenye upana wa 0.3 mm lililofanywa hapo awali kwenye dura (z = 0 mm) na nyembamba ya sindano 1-2 mm (z = takriban -1.5 mm) hadi sindano iko kati ya dura mater A. muhuri mnene huundwa. Kisha inua sindano hadi katikati ya uso wa gamba kwa z = -0.5 mm na ingiza hCO kwa kiwango cha 1-2 µl kwa dakika. Baada ya kukamilika kwa sindano ya hCO, sindano hutolewa kwa kiwango cha 0.2-0.5 mm kwa dakika, ngozi hupigwa, na puppy huwekwa mara moja kwenye pedi ya joto ya joto hadi kupona kabisa. Wanyama wengine walipandikizwa kwa pande mbili.
Taratibu zote za wanyama zilifanywa kwa mujibu wa miongozo ya utunzaji wa wanyama iliyoidhinishwa na Chuo Kikuu cha Stanford APLAC. Panya (zaidi ya siku 60 baada ya kupandikizwa) walichochewa na 5% ya anesthesia ya isoflurane na walilala na 1-3% ya isoflurane wakati wa kupiga picha. Kwa taswira, skana 7 ya Tesla iliyolindwa kikamilifu ya kisima cha kisima cha Bruker (Bruker Corp.) na kiendeshi cha gradient cha Kampuni ya Kimataifa ya Umeme (IECO), kipenyo cha ndani cha 120 mm (600 mT/m, 1000 T/m/s) kilitumika kwa kutumia AVANCE. III, chaneli nane za RF nyingi za coil na uwezo wa msingi-nyingi, na jukwaa linaloandamana la Paravision 6.0.1. Rekodi ilifanywa kwa kutumia koili ya RF ya ujazo iliyotenganishwa kikamilifu na kipenyo cha ndani cha 86 mm na koili ya RF yenye idhaa nne iliyopozwa kwa kupokewa pekee. Axial 2D Turbo-RARE (muda wa kurudia = 2500 ms, wakati wa echo = 33 ms, wastani wa 2) na vipande 16 vya kukamata, unene wa vipande 0.6-0.8 mm, vyenye sampuli 256 × 256. Ishara zilipokelewa kwa kutumia coil ya RF ya quadrature transceiver volumetric na kipenyo cha ndani cha 2 cm (Rapid MR International, LLC). Hatimaye, tumia kazi za kukadiria uso za Imaris (BitPlane) zilizojengewa ndani kwa uwasilishaji wa 3D na uchanganuzi wa sauti. Upandikizaji uliofaulu ulifafanuliwa kama ule ambapo maeneo ya ishara ya MRI yenye uzito wa T2 yaliundwa katika nusutufe iliyopandikizwa. Kukataliwa kwa vipandikizi kulifafanuliwa kuwa kipandikizi ambacho hakikutoa maeneo ya ishara ya MRI yenye uzito wa T2 katika nusutufe iliyopandikizwa. Subcortical t-hCO haikujumuishwa kwenye uchanganuzi uliofuata.
Ili kueleza kwa uthabiti GCaMP6s katika hCO kwa picha ya kalsiamu ya fotoni mbili, seli za hiPS ziliambukizwa na pLV[Exp]-EF1a::GcaMP6s-WPRE-Puro ikifuatiwa na uteuzi wa antibiotics. Kwa ufupi, seli zilitenganishwa na EDTA na kusimamishwa katika 1 ml ya Essential 8 kati kwa msongamano wa takriban seli 300,000 mbele ya polybrene (5 μg/ml) na 15 μl ya virusi. Kisha seli ziliwekwa katika kusimamishwa kwa dakika 60 na mbegu kwa msongamano wa seli 50,000 kwa kila kisima. Baada ya muunganiko, seli zilitibiwa na puromycin 5-10 μg ml-1 kwa siku 5-10 au hadi makoloni thabiti yaonekane. Maambukizi ya papo hapo ya hCO yalifanyika kama ilivyoelezwa hapo awali5 na marekebisho kadhaa. Kwa ufupi, hamishia siku 30-45 hCO hadi 1.5 ml Eppendorf microcentrifuge zilizopo zenye 100 µl za kati ya neva. Kisha takriban 90 µl ya kati huondolewa, 3-6 µl ya lentivirus ya kiwango cha juu (kutoka 0.5 x 108 hadi 1.2 x 109) huongezwa kwenye bomba, na hCO huhamishiwa kwenye incubator kwa dakika 30. Kisha ongeza 90-100 µl za kati kwa kila bomba na urudishe mirija kwenye incubator usiku kucha. Siku inayofuata, hamishia hCO hadi kwenye kiungo kipya cha neva katika vibao vya chini vya viambatisho. Baada ya siku 7, hCO ilihamishiwa kwenye sahani za chini za kioo zenye visima 24 kwa taswira na tathmini ya ubora wa maambukizi. pLV[Exp]-SYN1::EYFP-WPRE na pLV[Exp]-SYN1::hChR2-EYFP-WPRE zilitolewa na VectorBuilder. Lentivirus hutumiwa katika majaribio mengi kwa sababu imeunganishwa kwenye jenomu mwenyeji, ikiruhusu usemi wa jeni la mwandishi katika mistari ya seli iliyoambukizwa. Kwa ufuatiliaji wa kichaa cha mbwa, siku ya 30-45 hCO iliambukizwa pamoja na kichaa cha mbwa-ΔG-eGFP na AAV-DJ-EF1a-CVS-G-WPRE-pGHpA (plasmid #67528, Addgene), ilioshwa vizuri kwa siku 3, na kupandikizwa kwenye panya katika S1 na kudumishwa kwa siku 7-1.
Kwa immunocytokemia, wanyama walipigwa ganzi na kutiwa moyo na PBS ikifuatiwa na 4% paraformaldehyde (PFA katika PBS; Sayansi ya Microscopy ya Electron). Akili ziliwekwa katika 4% PFA kwa saa 2 au usiku kucha kwa 4°C, zimehifadhiwa katika 30% sucrose katika PBS kwa saa 48-72, na kupachikwa katika 1:1, 30% sucrose: OCT (Tissue-Tek OCT Compound 4583 , Sakura Finetes0sehemu ya 3 ilitengenezwa kwa ccoronat3) (Leica). Kwa immunohistokemia ya sehemu nene, wanyama walitiwa manukato kwa PBS, na ubongo uligawanywa na kugawanywa kwa moyo kwa 300-400 µm kwa kutumia vibratome (Leica) na sehemu hizo ziliwekwa kwa 4% PFA kwa dakika 30. Kisha sehemu zilizokauka au sehemu nene zilioshwa na PBS, zikazuiwa kwa saa 1 kwa joto la kawaida (10% ya seramu ya punda ya kawaida (NDS) na 0.3% Triton X-100 iliyopunguzwa katika PBS) na kuzuiwa na suluhisho la kuzuia saa 4 ° C. - Incubation Cryosections iliangaziwa usiku mmoja na sehemu nene ziliangaziwa kwa siku 5. Kingamwili msingi zilizotumika zilikuwa: anti-NeuN (panya, 1:500; ab104224, abcam) anti-CTIP2 (panya, 1:300; ab18465, abcam), anti-GFAP (sungura, 1:1,000; Z0334, Dako), anti-GFP0, GTX7, GTX 3, 1, 3 ya kuku, 1, 1,000 ya GFAP; GeneTex), anti-HNA (panya, 1:200; ab191181, abcam), anti-NeuN (sungura, 1:500; ABN78, Millipore), anti-PDGFRA (sungura, 1:200; sc-338, Santa Cruz), anti-PPP20:7; HPA047819, Antibodies za Atlas), anti-RECA-1 (panya, 1:50; ab9774, abcam), anti-SCG2 (sungura, 1:100; 20357-1-AP, Proteintech), anti-SOX9 (mbuzi, 1:500; Netgorins Systema, AF&30D1 1:100; AF1166, Mifumo ya R&D), anti-STEM121 (panya, 1:200; Y40410, Takara Bio), anti-SATB2 (panya, 1:50; ab51502, abcam), anti-GAD65/67 (sungura, 1:400, anti-ABIN90; (mbuzi, 1:100; ab5076, abcam). Kingamwili msingi zilizotumika zilikuwa: anti-NeuN (panya, 1:500; ab104224, abcam) anti-CTIP2 (panya, 1:300; ab18465, abcam), anti-GFAP (sungura, 1:1,000; Z0334, Dako), anti-GFP0, GTX7, 3, 1, 3 ya kuku, 1, 3 GFP; GeneTex), anti-HNA (panya, 1:200; ab191181, abcam), anti-NeuN (sungura, 1:500; ABN78, Millipore), anti-PDGFRA (sungura, 1:200; sc-338, Santa Cruz), anti-PPP20:7; HPA047819, Antibodies za Atlas), anti-RECA-1 (panya, 1:50; ab9774, abcam), anti-SCG2 (sungura , 1:100; 20357-1-AP, Proteintech), anti-SOX9 (mbuzi, 1:500; Neta1 Systems), Rat1, AFgo, 30D 1:100; AF1166, Mifumo ya R&D), anti-STEM121 (panya , 1:200; Y40410, Takara Bio), anti-SATB2 (panya, 1:50; ab51502, abcam), anti-GAD65/67 (sungura, 1:400, anti-ABIN00) (mbuzi, 1:100; ab5076, abcam). Использовались следующие первичные антитела: анти-NeuN (мышиные, 1:500; ab104224, abcam), анти-CTIP2 (крысиные, 1:506); анти-GFAP (кроличьи, 1:1000; Z0334, Dako), анти- -GFP (курица, 1:1000; GTX13970, GeneTex), анти-HNA (мышь, 1:200; ab1911181, ab1911181, ab1911181, 1:500; ABN78, Millipore), анти-PDGFRA (кролик, 1:200; sc-338, Санта-Круз), анти-PPP1R17 (кролик, 1:200; HPA047819, Atlas, Atlas, Antibodies) 1:50; ab9774, abcam), анти-SCG2 (кролик , 1:100; 20357-1-AP, Proteintech), анти-SOX9 (козий, 1:500; AF3075, R&D Systems), нетризн0, 6 G10 Mifumo ya R&D), анти-STEM121 (мышиный , 1:200; Y40410, Takara Bio), анти-SATB2 (мышь, 1:50; ab51502, abcam), анти-GAD65/67 (кролик0, AB9, AB9, 1:4) анти-IBA1 (коза, 1 :100; аб5076, абкам). Kingamwili za msingi zilizotumika zilikuwa: anti-NeuN (panya, 1:500; ab104224, abcam), anti-CTIP2 (panya, 1:300; ab18465, abcam), anti-GFAP (sungura, 1:1000; Z0334, Dako), anti-GFP0 Gene; anti-HNA (panya, 1:200; ab191181, abcam), anti-NeuN (sungura, 1:500; ABN78, Millipore), anti-PDGFRA ( sungura, 1:200; sc-338, Santa Cruz), anti-PPP1R17, 8 HPA, 17 HPA, 17 HPAb4; Kingamwili), anti-RECA-1 (panya, 1:50; ab9774, abcam), anti- SCG2 (sungura, 1:100; 20357-1-AP, Proteintech), anti-SOX9 (mbuzi, 1:500; AF3075, R&D Systems1), netria:100 G1, netrin 10; Mifumo ya R&D), anti- STEM121 (panya, 1:200; Y40410, Takara Bio), anti-SATB2 (panya, 1:50; ab51502, abcam), anti-GAD65/67 (sungura, 1:400; ABN904, Millipore, 0, 1: 1) na anti-GAD67 ab5076, abkam).使用的一抗是：抗NeuN（小鼠，1:500；ab104224，abcam）抗CTIP2（大鼠，1:3 00;ab18465，abcam），抗GFAP（兔，1:1,000;Z0334，Dako），抗-GF P（鸡，1:1,000;GTX13970，GeneTex），抗HNA（小鼠，1:200；ab191181,abcam），抗NeuN（兔，1:500;ABN78）Millipore） ABN78， 1:200;sc-338，Santa Cruz），抗PPP1R17（兔，1:200;HPA047819，Atlas 抗体），抗RECA-1（小鼠，1:50;ab9774ab9774ab9774ab 1 1:200;使用的一抗是：抗NeuN（小鼠，1:500；ab104224，abcam）抗CTIP2（大鼠，1 :300;ab18465，abcam），抗GFAP（兔，1:1,000;Z0334，Dako），抗-GFP（鸡，1:1,000;GTX13970，GeneTex），抗HNA（小鼠，1:200；ab191181,abcam），抗NeuN（兔，1:500;ABN78＊Millipo％ 200；sc-338，Santa Cruz) 100;20357-1-AP，Proteintech），抗SOX9（山羊，1:500;AF3075，R&D Systems），Netrin G1a（山羊，1:100;AF1166,R&D Systems1:20,Y40410, Takara Bio), anti-SATB2 (panya, 1:50; ab51502, abcam), anti-GAD65/67 (sungura, 1:400; ABN904, Millipore) na anti-IBA1 (mbuzi, 1:100; ab5076, abcam).Kingamwili za msingi zilizotumika zilikuwa: anti-NeuN (panya, 1:500; ab104224, abcam), anti-CTIP2 (panya, 1:300; ab18465, abcam), anti-GFAP (sungura, 1:1000; Z0334, Dako) . , anti-GFP (kuku, 1:1000; GTX13970, GeneTex), anti-HNA (panya, 1:200; ab191181, abcam), anti-NeuN (sungura, 1:500; ABN78, Millipore), anti-PDGFRA (sungura-308, 108; anti-PPP1R17 (sungura, 1:200; HPA047819, antibody ya Atlas), anti-RECA-1 (panya, 1:50; ab9774, abcam), anti- SCG2 (sungura), 1:100;20357-1-AP, Proteintech), анти-SOX9 (коза, 1:500; AF3075, Mifumo ya R&D), Нетрин G1a (коза, 1:100; AF1166, Mifumo ya R&D), анти -STEM121 (Y4:0raш0; анти-SATB2 (мышь, 1:50; ab51502, abcam), анти-GAD65/67 (кролик, 1:400; ABN904, Millipore) и анти-IBA1 (коза, 1:100; аб5076, аб5076,). 20357-1-AP, Proteintech), anti-SOX9 (mbuzi, 1:500; AF3075, Mifumo ya R&D), Netrin G1a (mbuzi, 1:100; AF1166, Mifumo ya R&D), anti-STEM121 (panya, 1:200; kinza-SATA2), Y404 1:50; ab51502, abcam), anti-GAD65/67 (sungura, 1:400; ABN904, Millipore), na anti-IBA1 (mbuzi, 1:100; ab5076, abkam).Kisha sehemu zilioshwa na PBS na kuingizwa kwa kingamwili ya pili kwa saa 1 kwenye joto la kawaida (sehemu zilizogandishwa) au usiku kucha kwa 4°C (sehemu nene). Kingamwili ya upili ya Alexa Fluor (Teknolojia za Maisha) iliyopunguzwa 1:1000 katika suluhisho la kuzuia ilitumika. Baada ya kuosha na PBS, viini vilionyeshwa kwa Hoechst 33258 (Life Technologies). Hatimaye, slaidi ziliwekwa kwenye darubini yenye vifuniko (Fisher Scientific) kwa kutumia Aquamount (Polysciences) na kuchambuliwa kwenye darubini ya Keyence fluorescent (BZ-X analyzer) au darubini ya Leica TCS SP8 confocal (Las-X) kwenye picha. Picha zilichakatwa kwa kutumia programu ya ImageJ (Fiji). Ili kutathmini uwiano wa niuroni za binadamu katika t-hCO na gamba la panya, picha za mstatili 387.5 μm pana zilichukuliwa katikati ya t-hCO, kwenye au karibu na ukingo wa gamba la panya. Mipaka ya pandikizi iliamuliwa kwa kutathmini mabadiliko katika uwazi wa tishu, viini vya HNA+, na/au uwepo wa otofluorescence ya tishu. Katika kila picha, jumla ya idadi ya seli za NeuN+ na HNA+ ziligawanywa kwa jumla ya seli za NeuN+ katika eneo moja. Ili kuhakikisha kuwa ni seli zilizo na viini kwenye ndege ya picha pekee ndizo zinazohesabiwa, ni seli ambazo pia ni Hoechst+ ndizo zinazojumuishwa kwenye hesabu. Picha mbili zilizotenganishwa kwa angalau mm 1 zilikadiriwa ili kupunguza hitilafu ya takwimu.
Wiki moja kabla ya kukusanya sampuli, weka wanyama wa kupandikiza hCO (takriban miezi 8 ya kutofautisha) katika chumba chenye giza na sharubu zilizokatwa ili kupunguza msisimko wa hisi. Kutengwa kwa viini kulifanyika kama ilivyoelezwa hapo awali, na marekebisho kadhaa. Kwa ufupi, t-hCO na hCO ziliharibiwa kwa kutumia sabuni-mechanical lysis na 2 ml kioo grinder tishu (D8938, Sigma-Aldrich/KIMBLE). Viini ghafi basi vilichujwa kwa kutumia kichujio cha 40 µm na kuwekwa katikati kwa 320 g kwa dakika 10 kwa 4 °C kabla ya kufanya upinde rangi wa sucrose. Baada ya hatua ya kuanisha (320 g kwa dakika 20 kwa 4°C), sampuli zilirejeshwa katika 0.04% BSA/PBS kwa kuongezwa vitengo 0.2 vya µl-1 RNase inhibitor (40 u µl-1, AM2682, Ambion) na kupita kwa mtiririko wa 40 µm. Viini vilivyotenganishwa vilisimamishwa tena katika PBS iliyo na 0.02% BSA na kupakiwa kwenye chip ya Chromium Single Cell 3′ (kadirio la kurejesha seli 8,000 kwa kila mstari). Maktaba za snRNA-seq zilitayarishwa kwa Chromium Single cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics). Maktaba za snRNA-seq zilitayarishwa kwa Chromium Single cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics). Библиотеки snRNA-seq были приготовлены с помощью Chromium Single cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics). Maktaba za snRNA-seq zilitayarishwa kwa kutumia Chromium Single cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics). snRNA-seq 文库是使用Chromium Single cell 3′ GEM、Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics) 制备的. snRNA-seq 文库是使用Chromium Single cell 3′ GEM、Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics) 制备的. Библиотеку snRNA-seq готовили с использованием Chromium Single Cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics). Maktaba ya snRNA-seq ilitayarishwa kwa kutumia Chromium Single Cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics).Maktaba kutoka kwa sampuli tofauti ziliunganishwa na kupangwa na Admera Health kwenye NovaSeq S4 (Illumina).
Viwango vya usemi wa jeni kwa kila msimbo pau wa nyuklia vilidhibitiwa kwa kutumia kifurushi cha uchanganuzi cha programu ya 10x Genomics CellRanger (toleo la 6.1.2). Hasa, usomaji ulilinganishwa dhidi ya mchanganyiko wa binadamu (GRCh38, Ensemble, toleo la 98) na panya (Rnor_6.0, Ensemble, toleo la 100) jenomu za marejeleo zilizoundwa kwa amri ya mkref na kutumia hesabu kwa amri ya -include-introns=TRUE hadi upimaji ni pamoja na usomaji uliopangwa kwa maeneo ya utangulizi. Kwa sampuli za t-hCO, viini vya binadamu vilitambuliwa kulingana na hitaji la kihafidhina kwamba angalau 95% ya usomaji wote wa ramani unalingana na jenomu ya binadamu. Uchambuzi wote uliofuata ulifanywa kwenye safu ya safu ya msimbopau iliyochujwa kutoka kwa CellRanger kwa kutumia kifurushi cha R (toleo la 4.1.2) Seurat (toleo la 4.1.1)32.
Ili kuhakikisha kwamba ni viini vya ubora wa juu pekee vinajumuishwa katika uchanganuzi unaofuata, mchakato wa kuchuja mara kwa mara ulitekelezwa kwa kila sampuli. Kwanza, viini vya ubora wa chini na chini ya jeni 1000 za kipekee zilizopatikana na zaidi ya 20% ya jumla ya mitochondria hutambuliwa na kuondolewa. Baadaye, matriki ya nambari mbichi ya jeni ilirekebishwa kwa urejeleaji hasi wa binomial mara kwa mara kwa kutumia kitendakazi cha sctransform(vst.flavor=”v2″), ambacho pia kilitambua jeni 3000 zinazobadilika zaidi kwa kutumia vigezo chaguo-msingi. Upunguzaji wa vipimo ulifanyika kwa jeni za juu zaidi kwa kutumia Uchanganuzi wa Kipengele kikuu (PCA dimension ya 3 ya seti ya data ya msingi = dimension ya data 3) 30 ilichaguliwa kulingana na ukaguzi wa kuona wa maeneo ya goti na kutumika kwa sampuli zote na uchanganuzi wa kuunganisha (azimio = 1) ili kuainisha jeni kwa kuzingatia hesabu ya chini ya jeni (wastani chini ya asilimia 10), juu ya kawaida ya mitochondrial juu ya hesabu ya chini ya 9 ya hesabu ya jeni na/au idadi kubwa ya mapacha wanaoshukiwa kutambuliwa kwa kutumia kifurushi cha DoubletFinder33 (inamaanisha alama ya DoubletFinder juu ya sampuli za t-hCO (n=3) na hCO (n=3) ziliunganishwa kando kwa kutumia kipengele cha kukokotoa cha IntegrateData na vigezo vilivyo hapo juu.
Baada ya kuondoa kokwa za ubora wa chini, mkusanyiko wa data uliounganishwa uliwekwa katika makundi (azimio = 0.5) na kupachikwa kwa madhumuni ya taswira ya UMAP34. Jeni za kiala kwa kila kundi zilibainishwa kwa kutumia chaguo za kukokotoa za FindMarkers na vigezo chaguomsingi vilivyokokotwa kutoka kwa data ya kawaida ya usemi wa jeni. Tunatambua na kuainisha aina kuu za seli kwa kuchanganya hifadhidata za marejeleo ya gamba la fetasi na la watu wazima na usemi wa jeni wa kialamisha 19,20,21,35 na ufafanuzi. Hasa, watangulizi wa mzunguko walitambuliwa na usemi wa MKI67 na TOP2A. Vikundi vya vizazi vilifafanuliwa kwa kukosekana kwa nakala za mitotiki, mwingiliano wa juu na nguzo zenye nguvu nyingi za glial progenitor zilizoelezewa katika gamba la fetasi la metaphase, na usemi wa EGFR na OLIG1. Tunatumia neno astrositi kujumuisha majimbo kadhaa ya upambanuzi wa astrositi, kutoka kwa nuru ya marehemu hadi kukomaa kwa astrositi. Vikundi vya astrocyte vinaonyesha viwango vya juu vya SLC1A3 na AQP4 na vimeonyeshwa ramani na aina ndogo za glia ya fetasi na/au astrositi za watu wazima. OPC zinaonyesha PDGFRA na SOX10 huku oligodendrocyte zinaonyesha alama za miyelination (MOG na MYRF). Neuroni za glutamatergic zilitambuliwa kwa kuwepo kwa nakala za nyuro (SYT1 na SNAP25), kutokuwepo kwa alama za GABAergic (GAD2), na usemi wa NEUROD6, SLC17A7, BCL11B, au SATB2. Neuroni za GluN ziligawanywa zaidi katika sehemu ndogo za juu (usemi wa SATB2 na upotevu wa BCL11B) na kina (BCL11B). Neuroni za sahani ndogo (SP) huonyesha vialamisho vinavyojulikana vya SP18 kama vile ST18 na SORCS1 pamoja na vialama vya kina vya GluN. Seli zinazofanana na mishipa ya fahamu ya choroid zilitambuliwa kwa mwonekano wa TTR, na seli zinazofanana na uti zilionyesha jeni zinazohusiana na fibroblasti na seli zilizopangwa kwenye ramani za pial/vascular za seti ya data ya marejeleo.
Uchanganuzi tofauti wa usemi wa jeni kati ya t-hCO na hCO ulifanywa kwa kutumia mbinu mpya iliyobuniwa ya bechi bandia iliyotolewa tena katika sampuli zilizotekelezwa kwa kutumia kifurushi cha Libra R (toleo la 1.0.0). Hasa, majaribio ya uwezekano wa kumbukumbu ya edgeR (toleo la 3.36.0, kifurushi R) yalifanywa kwa vikundi kwa kujumlisha idadi ya jeni katika seli kwa darasa fulani la seli kwa kila sampuli ya urudufishaji. Kwa taswira ya ramani ya joto, thamani zilizosawazishwa kwa kila milioni (CPM) hukokotwa kwa kutumia kitendakazi cha edgeR (cpm()) na kuongezwa (ili kufikia wastani = 0, mkengeuko wa kawaida = 1). Uchambuzi wa uboreshaji wa Gene Ontology (GO) wa jeni za t-hCO GluN zilizodhibitiwa kwa kiasi kikubwa ulifanyika (Benjamini-Hochberg alirekebisha thamani ya P ya chini ya 0.05 iliyoonyeshwa katika angalau 10% ya seli za t-hCO GluN na ongezeko la mabadiliko ya angalau mara 2). inatekelezwa kwa kutumia ToppGene Suite (https://toppgene.cchmc.org/)37. Tunatumia programu ya ToppFun iliyo na vigezo chaguo-msingi na kuripoti thamani za P zilizosahihishwa za Benjamini-Hochberg zilizokokotwa kutoka kwa majaribio ya hypergeometric yenye maelezo ya GO.
Ili kulinganisha vikundi vyetu vya snRNA-seq na vikundi vya seli vilivyofafanuliwa kutoka kwa masomo ya marejeleo ya seli moja msingi ya RNA-seq au snRNA-seq19,20,21,22 ya watu wazima, tulitumia mbinu ya ujumuishaji ya seti ya data iliyooanishwa. Tulitumia mtiririko wa kuhalalisha wa SCTransform (v2) katika Seurat kujumuisha na kulinganisha mwingiliano wa nguzo kati ya seti za data (kwa kutumia vigezo sawa na hapo juu). Seti za data za kibinafsi ziliwekwa chini kwa nasibu hadi seli au core 500 kwa kila kundi asili kwa ufanisi wa kukokotoa. Kwa kutumia mbinu sawa na ilivyoelezwa hapo awali, mwingiliano wa nguzo ulifafanuliwa kama uwiano wa seli au viini katika kila kikundi kilichounganishwa ambacho kilipishana na lebo ya nguzo ya marejeleo. Ili kuainisha zaidi GluN, tulitumia mtiririko wa kazi wa TransferData wa Seurat kwa data ya kitengo kidogo cha GluN kugawa lebo za seti ya kumbukumbu kwa seli zetu za GluN.
Ili kutathmini hali ya kukomaa ya nakala ya kimataifa ya sampuli za t-hCO na hCO, tulilinganisha sampuli zetu za wingi bandia na BrainSpan/psychENCODE23, ambayo inajumuisha mfuatano mkubwa wa RNA unaohusisha ukuaji wa ubongo wa binadamu. Tulitekeleza PCA kwenye muundo uliounganishwa wa usemi wa jeni uliorekebishwa kutoka kwa sampuli za gamba wiki 10 baada ya mimba kutungwa na baadaye, katika jeni 5567 (pamoja na data yetu) ambazo hapo awali zilitambuliwa kuwa amilifu katika sampuli za gamba la BrainSpan (zilizofafanuliwa kuwa kubwa zaidi ya 50% katika tofauti ya ukuaji inayoelezewa na umri kwa kutumia modeli ya ujazo)38. Kwa kuongezea, tulipata jeni zinazohusiana na saini kuu za nakala za ukuzaji wa neva kwa kutumia ujanibishaji wa matriki usio hasi kama ilivyoelezewa hapo awali. Uzani wa sampuli unaokokotolewa kwa kutumia utaratibu wa uwekaji sababu wa matriki usio hasi umepangwa kwenye Mtini. 5b na data iliyopanuliwa kwa kila moja ya sahihi tano zilizoelezwa na Zhu et al.38. Tena, alama za uandishi zinazotegemea shughuli zilitokana na tafiti zilizochapishwa hapo awali. Hasa, ERG na LRG zilidhibitiwa kwa kiasi kikubwa katika niuroni za glutamatergic zilizotambuliwa na mkusanyiko wa gamba la kuona la panya snRNA-seq baada ya msisimko wa kuona kutoka kwa Jedwali la Nyongeza 3 Hrvatin et al.16. LRGs zilizoboreshwa na binadamu zilipatikana kutoka kwa tamaduni za ubongo wa fetasi zilizowezeshwa na KCl na kuvunwa saa 6 baada ya kusisimua, na jeni zilizochujwa zilidhibitiwa kwa kiasi kikubwa kwa binadamu lakini si kwa panya (Jedwali la Ziada 4). Uchanganuzi wa uboreshaji wa seti ya jeni kwa kutumia seti hizi za jeni ulifanywa kwa kutumia jaribio kamili la njia moja la Fisher.
Nunua panya kwa kutumia isoflurane, ondoa ubongo na uweke mahali baridi (takriban 4°C) iliyo na oksijeni (95% O2 na 5% CO2) mmumunyo wa sucrose kwa sehemu zenye: 234 mM sucrose, 11 mM glucose, 26 mM NaHCO3, 2.5 mM KCl, 1.25 m. NaH2PO4, 10 mm MgSO4 na 0.5 mM CaCl2 (takriban 310 mOsm). Sehemu za ubongo wa panya (300–400 µm) zenye t-hCO zilitengenezwa kwa kutumia mtetemo wa Leica VT1200 kama ilivyoelezwa39 hapo awali. Kisha sehemu zilihamishiwa kwenye chumba cha kugawanya chenye hewa ya joto ya kawaida ya chumba iliyo na aCSF iliyotayarishwa kutoka: glukosi ya 10 mM, 26 mm NaHCO3, 2.5 mM KCl, 1.25 mM NaHPO4, 1 mM MgSO4, 2 mM CaCl2 na 126 mM NaCl mOsm29 (29). angalau dakika 45 kabla ya kurekodi. Sehemu zilirekodiwa katika chumba cha kuzamishwa ambapo ziliwekwa mara kwa mara kwa aCSF (95% O2 na 5% CO2 bakuli). Data zote zilirekodiwa kwa joto la kawaida. Neuroni za t-hCO zilikomeshwa kwa bomba la glasi ya borosilicate iliyojazwa na myeyusho ulio na gluconate ya potasiamu ya 127 mM, 8 mM NaCl, 4 mM magnesiamu ATP, 0.3 mM sodiamu GTP, 10 mm HEPES, na 0.6 mm EGTA, pH 7.2, myeyusho wa ndani uliorekebishwa kwa KOO m290 mH). Ili kurejesha, biocytin (0.2%) iliongezwa kwenye suluhisho la kurekodi.
Data ilipatikana kwa kutumia amplifier ya MultiClamp 700B (Vifaa vya Molekuli) na dijitali ya Digidata 1550B (Vifaa vya Molekuli), pasi ya chini iliyochujwa kwa kHz 2, kuunganishwa dijiti kwa 20 kHz, na kuchambuliwa kwa kutumia Clampfit (Vifaa vya Molekuli), Origin (OriginPro). 2021b, OriginLab). na vitendaji maalum vya MATLAB (Hisabati). Uwezo wa makutano ulikokotolewa kwa kutumia JPCalc na maingizo yakarekebishwa hadi thamani iliyokokotolewa ya -14 mV. Operesheni IV ina mfululizo wa hatua za sasa katika hatua 10-25 pA, kutoka -250 hadi 750 pA.
Thalamus, mada nyeupe, na viambajengo vya S1 vilichochewa kwa umeme katika vipande vya thalamokoti wakati wa kurekodi viraka vya niuroni za hCO, kama ilivyoelezwa hapo awali. Kwa ufupi, ubongo uliwekwa kwenye jedwali la uchapishaji la 3D lililoinama kwa pembe ya 10°, na sehemu ya mbele ya ubongo ilikatwa kwa pembe ya 35°. Kisha ubongo uliunganishwa kwenye uso uliokatwa na kugawanywa, kuhifadhi akzoni zinazochomoza za thalamocortical. Electrodes ya tungsten ya bipolar (0.5 MΩ) ziliwekwa kwenye kidhibiti maikrofoni cha pili na kuwekwa kimkakati ili kuchochea kanda nne kwa kila seli (kibonge cha ndani, chembe nyeupe, S1 na hCO). Rekodi majibu ya sinepsi baada ya msisimko wa 300 µA kwa 0.03–0.1 Hz.
Neuroni za hCO zinazoonyesha hChR2 ziliwashwa kwa nm 480 na mipigo ya mwanga inayotokana na LED (Prizmatix) ilitumiwa kupitia lengo la × 40 (0.9 NA; Olympus) kurekodi usemi wa hChR2 karibu na seli. Kipenyo cha uwanja ulioangaziwa ni takriban 0.5 mm na jumla ya nguvu ni 10-20 mW. Upana wa mapigo uliwekwa kuwa 10 ms, ambayo inalingana na mpigo uliotolewa wakati wa jaribio la kujifunza tabia. Masafa mbalimbali ya kusisimua yalitumiwa, kutoka 1 hadi 20 Hz, lakini tu mapigo ya kwanza ya mfululizo yalitumiwa kwa quantification. Vipindi kati ya treni kwa kawaida huwa zaidi ya sekunde 30 ili kupunguza athari kwenye vizuizi vya sinepsi au njia kuwezesha. Ili kupima ikiwa jibu la hChR2 lilikuwa monosynaptic, tuliweka TTX (1 μM) kwenye umwagaji hadi mmenyuko wa EPSC upotee, na kisha tukatumia 4-aminopyridine (4-AP; 100 μM). Kwa kawaida, jibu hurejeshwa ndani ya dakika chache, kwa kuchelewa kidogo kati ya kurusha kwa LED na kuzalisha EPSC. NBQX (10 μM) ilitumika kupima kama majibu yanaendeshwa na vipokezi vya AMPA.
Sehemu za hCO kali ziliundwa kama ilivyoelezwa hapo awali. Kwa ufupi, sehemu za hCO zilipachikwa katika 4% ya agarose na kuhamishiwa kwenye seli zilizo na 126 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM NaH2PO4, 1 mM MgSO4, 2 mM CaCl2, 26 mM NaHCO3 na 10 mM -glucose d-3 katika sehemu ya 0 (0) ilikatwa kwa 0 (sehemu 2) kwa 0+ µm kwenye halijoto ya kawaida kwa kutumia vibrator ya Leica VT1200 na kuhifadhiwa katika ASF kwenye halijoto ya kawaida. Kisha, kurekodi kwa kila seli kulifanywa kwenye sehemu za hCO chini ya darubini ya moja kwa moja ya SliceScope (Scientifica). Sehemu zilichanganywa na aCSF (95% O2 na 5% CO2) na ishara za seli zilirekodiwa kwa joto la kawaida. Neuroni za hCO ziliwekwa kwa kutumia pipette ya glasi ya borosilicate iliyojaa suluhu iliyo na gluconate ya potasiamu ya 127 mM, 8 mM NaCl, 4 mM magnesiamu ATP, 0.3 mM sodiamu GTP, 10 mM HEPES, na 0.6 mM EGTA, pH ya ndani 7, 2, iliyorekebishwa kwa KOH20 mo. Kwa madhumuni ya kurejesha, ongeza 0.2% ya Biocytin kwenye suluhisho la ndani.
Data ilipatikana na Clampex (Clampex 11.1, Vifaa vya Molecular) kwa kutumia amplifier ya MultiClamp 700B (Vifaa vya Molecular) na Digidata 1550B digitizer (Vifaa vya Molekuli), pasi ya chini iliyochujwa kwa 2 kHz, tarakimu kwa 20 kHz, na 10 kuchanganua toleo la Clamp6. vifaa) na kazi maalum za MATLAB (MATLAB 2019b, Hisabati). Uwezo wa makutano ulikokotolewa kwa kutumia JPCalc na maingizo yakarekebishwa kwa uwezo uliokokotolewa wa makutano wa -14 mV. Operesheni IV inajumuisha mfululizo wa hatua za sasa katika hatua za 5-10 pA kutoka -50 hadi 250 pA.
Kwa uundaji upya wa kimofolojia wa niuroni zilizobanwa, 0.2% ya biocytin (Sigma-Aldrich) iliongezwa kwenye suluhisho la ndani. Seli hizo hutunzwa kwa angalau dakika 15 baada ya kudukuliwa. Kisha bomba hutolewa polepole kwa dakika 1-2 hadi membrane iliyosajiliwa imefungwa kabisa. Kufuatia utaratibu wa fiziolojia ya sehemu, sehemu zilirekebishwa usiku kucha kwa 4° C. katika 4% PFA, zikanawa kwa PBS X3, na diluted 1:1000 na streptavidin-conjugated DyLight 549 au DyLight 405 (Vector Labs). Seli zilizojazwa na biocytin (2%; Sigma-Aldrich) ziliwekwa lebo wakati wa kurekodi kwa kibano kwenye joto la kawaida kwa saa 2. Kisha sehemu hizo ziliwekwa kwenye slaidi za hadubini kwa kutumia Aquamount (Thermo Scientific) na kuonyeshwa siku iliyofuata kwenye darubini ya Leica TCS SP8 iliyounganishwa kwa kutumia lengo la kuzamisha mafuta lenye kipenyo cha nambari ×40 1.3, ukuzaji × 0.9–1.0, xy. Kiwango cha sampuli ni takriban saizi 7 kwa kila mikroni. Rafu za Z katika vipindi vya 1 µm zilipatikana kwa mfululizo, na mosaiki za z-stack na kushona kiotomatiki kwa msingi wa Leica zilitekelezwa ili kufunika mti mzima wa dendritic wa kila neuroni. Neuroni zilifuatiliwa nusu kwa mikono kwa kutumia kiolesura cha neuTube 40 na faili za SWC zilitolewa. Kisha faili zilipakiwa kwenye programu-jalizi ya SimpleNeuriteTracer41 Fiji (ImageJ, toleo la 2.1.0; NIH).
Tishu ya gamba la binadamu ilipatikana kwa idhini iliyoarifiwa kulingana na itifaki iliyoidhinishwa na Bodi ya Ukaguzi ya Kitaasisi ya Chuo Kikuu cha Stanford. Sampuli mbili za tishu za binadamu baada ya kuzaa (umri wa miaka 3 na 18) zilipatikana kwa kukatwa kwa gamba la mbele (gyrus ya mbele ya kati) kama sehemu ya upasuaji wa kifafa cha kifafa. Baada ya kukatwa upya, vuna tishu kwenye barafu-NMDG-aCSF iliyo na: 92 mM NMDG, 2.5 mM KCl, 1.25 mM NaH2PO4, 30 mM NaHCO3, 20 mM HEPES, 25 mM glucose, 2 mM thiourea, 5 mM MM KCl ya sodiamu, pyruvate 0 sodium ascorbate 0 mpyruvate 0, pyruvate 0 sodium ascorbate. 4H2O na 10 mm MgSO4 7H2O. Titrate hadi pH 7.3-7.4 na asidi hidrokloriki iliyokolea. Tishu zilipelekwa kwenye maabara ndani ya dakika 30 na sehemu za coronal zilichukuliwa kulingana na utaratibu ulioelezwa hapo juu.
Taratibu zote za wanyama zilifanywa kwa mujibu wa miongozo ya utunzaji wa wanyama iliyoidhinishwa na Chuo Kikuu cha Stanford APLAC. Panya (zaidi ya siku 140 baada ya kupandikizwa) walichochewa na 5% ya anesthesia ya isoflurane na walilala na 1-3% ya isoflurane ndani ya upasuaji. Wanyama waliwekwa kwenye fremu ya stereotaxic (Kopf) na buprenorphine ya kutolewa endelevu (SR) ilidungwa chini ya ngozi. Fuvu ni wazi, kusafishwa na screws 3-5 mfupa ni kuingizwa. Ili kulenga t-hCO, tulizalisha viwianishi vya stereotaxic kutoka kwa picha za MRI. Shimo la burr lilitobolewa kwenye tovuti ya kuvutia na nyuzi (kipenyo cha µm 400, NA 0.48, Doric) zilishushwa 100 µm chini ya uso wa hCO na kuwekwa kwenye fuvu kwa simenti ya meno inayoweza kutibika na UV (Relyx).
Rekodi za fotometric za nyuzi zilifanywa kama ilivyoelezwa hapo awali42. Ili kurekodi shughuli za moja kwa moja, panya waliwekwa kwenye ngome safi na kebo ya kipenyo cha 400 µm ya fiber optic (Doric) iliyounganishwa kwenye mfumo wa kupata data ya fibre optic photometric iliunganishwa kwenye kebo ya fiber optic iliyopandikizwa. Wakati wa kurekodi kwa dakika 10 ya shughuli za magari, wanyama walikuwa huru kuchunguza ngome. Ili kurekodi shughuli iliyoibuliwa, panya (zaidi ya siku 140 baada ya kupandikizwa) walilazimishwa na 5% ya isoflurane ya kuingizwa na 1-3% ya isoflurane kwa matengenezo. Weka mnyama katika sura ya stereotactic (Kopf) na whiskers upande wa kinyume wa t-hCO hupunguzwa hadi karibu 2 cm na kupitishwa kupitia mesh iliyounganishwa na actuator ya piezoelectric (PI). Kebo ya 400 µm fiber optic (Doric) iliunganishwa kwenye nyuzi iliyopandikizwa na kuunganishwa kwenye mfumo wa kupata data. Visharua vilivyo upande wa pili wa t-hCO viligeuzwa mara 50 (2 mm kwa 20 Hz, 2 s kwa kila wasilisho) kwa nyakati zisizo na mpangilio na kiendeshi cha piezoelectric kwa muda wa dakika 20 wa kurekodi. Tumia Kifurushi cha Usaidizi cha Arduino MATLAB ili kudhibiti wakati wa ukengeushaji kwa kutumia msimbo maalum wa MATLAB. Matukio husawazishwa na programu ya kupata data kwa kutumia mipigo ya mantiki ya transistor-transistor (TTL).
Panya (zaidi ya siku 140 baada ya kupandikizwa) walichochewa na 5% ya anesthesia ya isoflurane na walilala na 1-3% ya isoflurane ndani ya upasuaji. Wanyama waliwekwa kwenye fremu ya stereotaxic (Kopf) na buprenorphine SR na deksamethasone zilidungwa chini ya ngozi. Fuvu ni wazi, kusafishwa na screws 3-5 mfupa ni kuingizwa. Ili kulenga t-hCO, tulizalisha viwianishi vya stereotaxic kutoka kwa picha za MRI. Craniotomy ya mviringo (takriban 1 cm ya kipenyo) ilifanywa kwa kuchimba kwa kasi ya juu moja kwa moja juu ya hCO iliyopandikizwa. Mara mfupa unapokuwa mwembamba iwezekanavyo, lakini kabla ya kuchimba mfupa mzima, tumia forceps kuondoa diski ya pelvisi iliyosalia ili kufichua t-hCO ya msingi. Craniotomy ilijazwa na salini isiyoweza kuzaa, na kifuniko na pini maalum ya kichwa iliunganishwa kwenye fuvu na saruji ya meno ya UV (Relyx).
Upigaji picha wa fotoni mbili ulifanywa kwa kutumia darubini ya Bruker multiphoton yenye lengo la Nikon LWD (×16, 0.8 NA). Upigaji picha wa GCaMP6 ulifanywa kwa nm 920 kwa ukuzaji wa z-ndege moja wa 1.4x na wastani wa 8x wa ramprogrammen 7.5. Panya walichochewa na anesthesia ya 5% ya isoflurane na kudumishwa na 1-3% ya isoflurane. Panya waliwekwa kwenye kifaa maalum cha kichwa na kuwekwa chini ya lenzi. Rekodi ya chinichini ya dakika 3 ya shughuli za gari ilipatikana. Kwa muda wa dakika 20 za kurekodi, pumzi 50 (kila wasilisho lenye urefu wa ms 100) ziliwasilishwa kwa nasibu kwenye pedi ya whisker iliyo mkabala na t-hCO kwa kutumia picospricer. Tumia Kifurushi cha Usaidizi cha Arduino MATLAB ili kudhibiti muda wa kupasuka kwa msimbo maalum wa MATLAB. Sawazisha matukio na programu ya kupata data (PrairieView 5.5) kwa kutumia mipigo ya TTL. Kwa uchanganuzi, picha zilisahihishwa kwa xy motion kwa kutumia urekebishaji wa uhusiano katika mpango wa MoCo uliozinduliwa nchini Fiji. Uchimbaji wa athari za fluorescent kutoka kwa seli za kibinafsi kwa kutumia CNMF-E43. Fluorescence ilitolewa kwa kila eneo linalokuvutia, ikabadilishwa kuwa mikondo ya dF/F, na kisha kubadilishwa hadi alama z.
Panya (zaidi ya siku 140 baada ya kupandikizwa) walichochewa na 5% ya anesthesia ya isoflurane na walilala na 1-3% ya isoflurane ndani ya upasuaji. Wanyama waliwekwa kwenye fremu ya stereotaxic (Kopf) na buprenorphine SR na deksamethasone zilidungwa chini ya ngozi. Masharubu ya upande wa pili wa t-hCO yalikatwa hadi karibu 2 cm na kuunganishwa kupitia mesh iliyounganishwa na actuator ya piezoelectric. Fuvu limefunuliwa na kusafishwa. Screw ya ardhi ya chuma cha pua imeunganishwa kwenye fuvu. Ili kulenga t-hCO, tulizalisha viwianishi vya stereotaxic kutoka kwa picha za MRI. Fanya craniotomy ya mviringo (takriban 1 cm ya kipenyo) na kuchimba kwa kasi ya juu juu ya t-hCO. Mara mfupa unapokuwa mwembamba iwezekanavyo, lakini kabla ya kuchimba mfupa mzima, tumia forceps kuondoa diski ya pelvisi iliyosalia ili kufichua t-hCO ya msingi. Visanduku vya mtu binafsi vilirekodiwa kwa kutumia chaneli 32 au chaneli 64 za uchunguzi wa silikoni zenye msongamano wa juu (Cambridge Neurotech) zilizowekwa chini kwenye skrubu na kuimarishwa awali kwa vikuza vya RHD (Intan). Tumia kidanganyifu kupunguza elektrodi kwenye tovuti inayolengwa kupitia craniotomy, ambayo imejaa salini isiyoweza kuzaa. Ukusanyaji wa data ulifanywa kwa mzunguko wa kHz 30 kwa kutumia mfumo wa kupata data wa Open Ephys. Rekodi iliendelea tu tulipogundua shughuli za hiari zilizounganishwa sana katika zaidi ya chaneli 10, na kupendekeza kuwa elektrodi zilipatikana kwenye pandikizi (kulingana na data ya kupiga picha ya kalsiamu ya fotoni mbili). Rekodi ya mandharinyuma ya dakika 10 ya shughuli za magari ilipatikana. Visharua vilivyo upande wa pili wa t-hCO viligeuzwa mara 50 (2 mm kwa 20 Hz, 2 s kwa kila wasilisho) kwa nyakati zisizo na mpangilio na kiendeshi cha piezoelectric kwa muda wa dakika 20 wa kurekodi. Kwa kutumia Kifurushi cha Usaidizi cha MATLAB cha Arduino (MATLAB 2019b), dhibiti wakati wa ukengeushaji kwa kutumia msimbo maalum wa MATLAB. Tumia midundo ya TTL kusawazisha matukio na programu ya kupata data.
Kwa majaribio ya kuashiria macho, kamba ya kiraka ya 200 µm (Doric) iliyounganishwa kwenye leza ya nm 473 (Omicron) iliunganishwa kwenye nyuzinyuzi ya macho ya 200 µm iliyowekwa juu ya fupanyonga. Mara moja kabla ya hii, rekebisha nguvu ya jumper hadi 20 mW. Tumia kidanganyifu kupunguza elektrodi kwenye tovuti inayolengwa kupitia craniotomy, ambayo imejaa salini isiyoweza kuzaa. Mwanzoni mwa kurekodi, mipigo kumi ya mwanga 473 nm (frequency 2 Hz, muda wa pigo 10 ms) ilitolewa. Seli za picha zilifafanuliwa kuwa seli ambazo zilionyesha mwitikio mwingi ndani ya ms 10 ya mwanga katika 70% au zaidi ya majaribio.