Misaotra anao nitsidika ny Nature.com. Mampiasa kinova mpitety tranonkala manana fanohanana CSS voafetra ianao. Mba hahazoana traikefa tsara indrindra, manoro hevitra anao izahay hampiasa navigateur nohavaozina (na esory ny Compatibility Mode amin'ny Internet Explorer). Ho fanampin'izany, mba hiantohana ny fanohanana mitohy, dia asehoy ny tranokala tsy misy fomba sy JavaScript.
Mampiseho carousel misy sary telo indray mandeha. Ampiasao ny bokotra teo aloha sy manaraka mba hivezivezena amin'ny slides telo amin'ny fotoana iray, na ampiasao ny bokotra slider amin'ny farany mba hivezivezena amin'ny slides telo isaky ny mandeha.
Ny organelles neural mitambatra ho an'ny tenany dia maneho sehatra in vitro mampanantena ho modely amin'ny fivoaran'ny olombelona sy ny aretina. Na izany aza, ny organoids dia tsy manana fifandraisana misy ao amin'ny vivo, izay mametra ny fahamatorana ary manakana ny fidirana amin'ny faritra hafa mifehy ny fitondran-tena. Asehontsika eto fa ny organoids cortical azo avy amin'ny selan'olombelona nafindra tao amin'ny cortex somatosensory amin'ny voalavo miboridana zaza vao teraka dia mamorona karazana sela matotra izay miditra ao amin'ny faritra mifandray amin'ny fahatsapana sy ny antony manosika. Ny MRI dia nanambara ny fitomboan'ny organoid post-transplant amin'ny tsipika sy ny biby maromaro, raha ny fanadihadiana tokana tokana kosa dia nanambara ny fivoaran'ny corticogenesis sy ny fiposahan'ny programa fandikana miankina amin'ny asa. Raha ny marina, ny neuron cortical nafindra dia mampiseho toetra morphologique, synaptic, ary membrane anatiny sarotra kokoa noho ny in vitro mitovy aminy, mamela ny fahitana ny tsy fahampian'ny neuronal amin'ny marary voan'ny aretin'i Timothy. Ny fanaraha-maso anatomika sy fiasa dia naneho fa ny organelles nafindra dia mahazo thalamocortical sy corticocortical inputs, ary ny firaketana an-tsoratra amin'ny hetsika neural ao amin'ny vivo dia manondro fa ireo fampidirana ireo dia afaka miteraka valin-kafatra amin'ny selan'olombelona. Farany, ny cortical organoids dia manitatra ny axon manerana ny atidohan'ny voalavo, ary ny fampahavitrihana optogenetic azy ireo dia mitarika amin'ny fitondran-tena mitady valisoa. Noho izany, ny neuron cortex olombelona nafindra dia matotra ary mandray anjara amin'ny fizaran'ny mpampiantrano izay mifehy ny fitondran-tena. Manantena izahay fa ity fomba ity dia hanamora ny fahitana ireo phenotypes amin'ny strand-level amin'ny sela azo avy amin'ny marary izay tsy hita amin'ny fomba hafa.
Ny atidohan'ny olombelona mivoatra dia dingana iray miavaka amin'ny fandrindrana ny tenany izay ahafahan'ny sela mitombo, manavaka, mifindra monina, ary mifandray amin'ny famoronana circuit neuronal miasa izay voadio kokoa amin'ny alalan'ny traikefa ara-tsaina. Ny olana lehibe amin'ny fahatakarana ny fivoaran'ny atidohan'olombelona, ​​​​indrindra amin'ny toe-javatra misy ny aretina, dia ny tsy fahampian'ny fidirana amin'ny sela atidoha. Ny organelles mandamina tena, anisan'izany ny organoids cortex olombelona (hCO ; fantatra amin'ny anarana hoe tontolon'ny cortex olombelona), dia afaka miteraka 2,3,4,5,6. Na izany aza, misy fetra maromaro mametra ny fampiharana azy ireo amin'ny fahatakarana ny fivoarana sy ny fiasan'ny circuit neural. Indrindra indrindra, tsy fantatra mazava raha voafetra ny fahamatoran'ny hCO amin'ny tsy fisian'ny microenvironmental sy sensory inputs misy ao amin'ny vivo. Ankoatr'izay, satria ny hCOs dia tsy tafiditra ao anatin'ny faritra izay afaka miteraka vokatra amin'ny fitondran-tena, ny fampiasana azy ireo amin'ny famolavolana ny aretin'ny neuropsychiatric ara-pananahana sy ny fitondran-tena dia voafetra amin'izao fotoana izao.
Ny famindrana ny hCO amin'ny ati-doha velona iray dia afaka mandresy ireo fetra ireo. Ny fandinihana teo aloha dia naneho fa ny neurons olombelona nafindra tao amin'ny cortex rodent dia afaka mivelona, ​​manao tetikasa ary mifandray amin'ny cellule rodent7,8,9,10,11,12. Na izany aza, ireo andrana ireo dia matetika atao amin'ny biby lehibe, izay mety hametra ny fampidirana synaptic sy axonal. Eto isika dia mamaritra paradigma transplantation izay nafindrantsika ny 3D hCO azo avy amin'ny sela hiPS ao amin'ny cortex somatosensory voalohany (S1) amin'ny voalavo immunodeficient amin'ny dingana voalohan'ny fivoaran'ny plastika. Ny neurônina hCO (t-hCO) nafindra dia mandalo fahamatorana lehibe, mahazo thalamocortical sy cortical-cortical inputs izay miteraka valiny ara-pihetseham-po, ary manitatra ny axonal projections ao amin'ny atidohan'ny rat mba hitondrana fitondran-tena mitady valisoa. Ny fahamatorana lava amin'ny t-hCO dia nanambara ny tsy fahampian'ny neuronal amin'ny mararin'ny aretin'i Timothy (TS), aretina ara-pananahana mahery vaika vokatry ny fiovan'ny karazana L-karazana kalsioma CaV1.2 (voahodidin'ny CACNA1C).
Mba handinihana ny neuron cortical olombelona amin'ny circuits in vivo, dia nafindrantsika tamin'ny fomba stereotactically ny 3D hCO ho ao amin'ny S1 amin'ny voalavo athymic postnatal tany am-boalohany (andro 3-7 postnatally) (sary 1a ary nanitatra ny angon-drakitra momba ny sary 1a-c). Amin'izao fotoana izao, ny projections axonal thalamocortical sy corticocortical dia mbola tsy nahavita ny innervation S1 (ref. 13). Noho izany, ity fomba ity dia natao hanamafisana ny fampidirana t-hCO ary hampihena ny fiantraikany amin'ny faritra endogenous. Mba hijerena ny toerana misy ny t-hCO amin'ny biby velona, ​​​​dia nanao famerenana ny atidohan'ny T2-mavesatra MRI amin'ny voalavo 2-3 volana taorian'ny famindrana (sary 1b sy angon-drakitra fanampiny, sary 1d). Ny t-hCO dia voamarika mora foana ary ny fandrefesana ny t-hCO dia mitovy amin'ny kajy avy amin'ny silaka raikitra (Data Extended Fig. 1d, e; P > 0.05). Ny t-hCO dia voamarika mora foana ary ny fandrefesana ny t-hCO dia mitovy amin'ny kajy avy amin'ny silaka raikitra (Data Extended Fig. 1d, e; P > 0.05). t-hCO легко наблюдались, а объемные измерения t-hCO были аналогичны рассчитанным для фиксированных срезов (расид, р. 1d, e; P> 0,05). Ny t-hCO dia voamarika mora foana, ary ny fandrefesana t-hCO volumetric dia mitovy amin'ny kajy ho an'ny fizarana raikitra (data nitarina, sary 1d, e; P> 0.05).很容易观察到t-hCO，并且t-hCO的体积测量值与从固定切片计算的测量值相似（扩展数据图1d、e；P > 0.05）.很容易观察到t-hCO，并且t-hCO t-hCO легко наблюдался, а объемные измерения t-hCO были аналогичны рассчитанным для фиксированных срезов (рассид, р. 1d, e; P> 0,05). T-hCO dia voamarika mora foana, ary ny fandrefesana t-hCO volumetric dia mitovy amin'ny kajy ho an'ny fizarana raikitra (data nitarina, sary 1d, e; P> 0.05).Nofaritanay ny t-hCO amin'ny 81% amin'ny biby nafindra manodidina ny 2 volana aorian'ny famindrana (n = biby 72; hCO avy amin'ny tsipika cellule 10 hiPS; tsipika cellule hiPS ao amin'ny tabilao fanampiny 1). Amin'ireo, ny 87% dia hita ao amin'ny cortex cerebral (sary 1c). Amin'ny fanaovana scans MRI serial amin'ny fotoana maromaro amin'ny voalavo iray nafindra, dia nahita fitomboana sivy heny amin'ny volume t-hCO izahay tao anatin'ny 3 volana (sary 1d sy angon-drakitra nanitatra, sary 1f). Ny biby nafindra dia nanana taham-pahavelomana ambony (74%) tamin'ny volana 12 taorian'ny transplantation (angona nitarina, sary 1g sy tabilao fanampiny 2), ary tsy hita ny motera mibaribary na fahatsiarovana, gliosis, na electroencephalogram (EEG). Data Fig. 1g sy latabatra fanampiny 2). 1h–m sy 3e).
a, Skema amin'ny famolavolana andrana. Ny hCO avy amin'ny sela hiPS dia nafindra tao amin'ny S1 amin'ny voalavo miboridana vao teraka tamin'ny andro 30-60 fanavahana. b, T2-mavesatra coronal sy horizontal sary MRI mampiseho t-hCO ao amin'ny S1 2 volana aorian'ny famindrana. Scale bar, 2 mm. c, Famaritana ny taham-pahombiazan'ny engraftment aseho ho an'ny tsipika cellule hiPS tsirairay (n = 108, ny isa ao anaty bara dia manondro ny habetsaky ny t-hCO isaky ny tsipika cellule hIPS) ary ny toerana misy ny cortical na subcortical (n = 88). d, sarin'ny MRI amin'ny lalan-drà (ankavia; bara mizana, 3 mm) ary ny fanamboarana volumetric 3D mifanaraka amin'izany (barony, 3 mm) mampiseho ny fitomboan'ny t-hCO mandritra ny 3 volana. e, Famerenana ny lamina t-hCO amin'ny cortex cerebral rat. Scale bar, 1 mm. f, Sarin'ny immunocytochemical solontenan'ny t-hCO aseho avy any ambony havia miankavanana (mandritra ny fanavahana): PPP1R17 (4 volana), NeuN (8 volana), SOX9 ary GFAP (8 volana), PDGFRα; (8 volana), MAP2 (8 volana) ary IBA1 (8 volana). Scale bar, 20 µm. Ny fanehoana ny HNA dia manondro sela avy amin'ny olombelona. g, snRNA-seq: Famaritana ny fampihenana ny refy mitambatra sy projection (UMAP) ny nuclei t-hCO avo lenta rehetra taorian'ny fampidirana Seurat (n = 3 t-hCO santionany, n = 2 hiPS cell line). Astrocytes, sela amin'ny tsipika astrocyte; cyc prog, razana mivezivezy; GluN DL, neuron glutamatergic lalina; GluN DL / SP, neuron glutamatergic lalina sy sublamellar; GluN UL, neurons glutamatergic sosona ambony; oligodendrocytes, oligodendrocytes; OPC, oligodendrocyte progenitor sela; RELN, reelin neurons. h, Gene Ontology (GO) famakafakana ny fampitomboana ny fototarazo dia nitombo be (nampifanarahana P <0.05, fiovan'ny vala> 2, aseho amin'ny farafaharatsiny 10% amin'ny nuclei) ao amin'ny neurons glutamatergic t-hCO raha oharina amin'ny neurons glutamatergic hCO. h, Gene Ontology (GO) famakafakana ny fampitomboana ny fototarazo dia nitombo be (nampifanarahana P <0.05, fiovan'ny vala> 2, aseho amin'ny farafaharatsiny 10% amin'ny nuclei) ao amin'ny neurons glutamatergic t-hCO raha oharina amin'ny neurons glutamatergic hCO. h, Анализ обогащения терминов Gene Ontology (GO) для генов со значительной активацией (скорректированный P <0,05, кратмоснеть ия экспрессия по крайней мере в 10% ядер) в глутаматергических нейронах t-hCO по сравнению с глутаматергических нейронах t-hCO по сравнению с глутаматергическиром . h, Gene Ontology (GO) famakafakana fanamafisam-peo ho an'ny fototarazo misy fampahavitrihana manan-danja (nampifanarahana P <0.05, fiovan'ny fold> 2, fanehoana amin'ny farafaharatsiny 10% nuclei) ao amin'ny neurons glutamatergic t-hCO raha oharina amin'ny neurons glutamatergic hCO. h，与hCO 谷氨酸能神经元相比，t-hCO 谷氨酸能神经元中基因显着上调（调整后P ， 十后P 5. 2，在至少10% 的细胞核中表达）的基因本体论(GO) 术语富集分析。 h ， 与 hco 谷氨酸 能 元 相比 ， t-hco 谷氨酸 能 神经 元 基因 显着 上调 （后 后 后 .变化> 2 ， 至少 10% 的 核中 表达） 基因 基因 基因 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 )术语富集分析。 h, гены значительно активизировались (скорректированный P <0,05, кратность изменения> 2, экспрессируется по крайне в 1% глутаматергических нейронах t-hCO по сравнению с глутаматергическими нейронами hCO Онтологический (GO) анаглиз теборми h, ny fototarazo dia nihena be (nampifanarahana P <0.05, fiovana mivalona> 2, aseho amin'ny farafaharatsiny 10% amin'ny nuclei) ao amin'ny neurons glutamatergic t-hCO raha ampitahaina amin'ny hCO glutamatergic neurons Ontological (GO) famakafakana ny teny fampivoarana.Ny tsipika misy teboka dia manondro ny sandan'ny aq amin'ny 0.05. i, sary UMAP amin'ny karazana sela GluN ao amin'ny t-hCO amin'ny alàlan'ny famindrana marika avy amin'ny reference 22 snRNA-seq motera cortex lehibe. CT - sela corticothalamic, ET - sela extracerebral, IT - sela telencephalic anatiny, NP - akaiky projection.
Avy eo dia nandinika ny cytoarchitecture sy ny fitambaran'ny sela amin'ny t-hCO izahay. Ny fametahana antibody amin'ny sela endothelial rat dia nanambara ny vascularization miaraka amin'ny t-hCO, raha ny IBA1 kosa dia nanambara ny fisian'ny microglia rat manerana ny graft (sary 1f sy ny angon-drakitra mivelatra, sary 3c, d). Ny immunostaining dia nanambara ny cellule positive antigène nokleary (HNA) olombelona miaraka amin'ny PPP1R17 (progenitors cortical), NeuN (neurons), SOX9 ary GFAP (sela avy amin'ny glial) na PDGFRα (oligodendrocyte progenitors) (sary 1f). Mba handinihana ny firafitry ny sela t-hCO amin'ny famahana ny sela tokana, dia nanao sequencing RNA tokana (snRNA-seq) izahay taorian'ny 8 volana teo ho eo ny fanavahana. Ny fanivanana be dia be sy ny fanesorana ny nuclei voalavo dia namokatra sarintany mononuclear olombelona 21.500 avo lenta (sary 1g sy angon-drakitra miitatra, sary 4a, b). Ny lamin'ny fanehoana ireo marika karazana sela mahazatra dia mamaritra ny clusters amin'ny kilasin'ny sela cortical lehibe, ao anatin'izany ny neuron glutamatergic lalina sy ambony, ny progenitors mivezivezy, ny oligodendrocytes, ary ny tsipika astrocyte (sary 1g, angon-drakitra mivelatra, sary 4c, ary tabilao fanampiny 3). Ny immunostaining ho an'ny SATB2 sy CTIP2 dia nampiseho fa na dia eo aza ny fisian'ny karazana kortika, ny t-hCO dia tsy nampiseho stratification anatomika mazava (data nitarina, sary 3a). Ny snRNA-seq hCO mifanentana amin'ny sehatra dia namokatra kilasy sela mitovitovy amin'izany, miaraka amin'ny tranga vitsivitsy, anisan'izany ny tsy fisian'ny oligodendrocytes sy ny fisian'ny neurons GABAergic, izay mety haneho ny fepetra voalaza etsy ambony ao amin'ny vitro ho an'ny cellule progenitor lateral15 (data nitarina, Fig. 4f - i sy Table fanampiny 4). Ny famakafakana ny fanehoan-kevitry ny fototarazo dia mampiseho fahasamihafana lehibe eo amin'ny neurons glutamatergic eo amin'ny t-hCO sy hCO (Tabilao fanampiny 5), ao anatin'izany ny fampahavitrihana ny fototarazo mifandraika amin'ny fahamatoran'ny neuronal toy ny famantarana synaptic, ny localization dendritika, ary ny hetsika fantsom-pifandraisana (sary 1h sy tabilao fanampiny 5). latabatra 6). Noho izany, ny cortical glutamatergic t-hCO neurons dia nampiseho fahamatorana transcriptional haingana.
Mba hanazavana raha misy ifandraisany amin'ny fahasamihafan'ny morphologie eo amin'ny hCO in vitro sy t-hCO in vivo ireo fiovan'ny transcriptional ao amin'ny t-hCO ireo, dia nanamboatra hCO sy hCO feno biocytin mifanentana amin'ny sehatra izahay taorian'ny fahasamihafan'ny 7-8 volana. hCO neurons (sary 2a). Ny neurons t-hCO dia lehibe kokoa, manana 1.5 heny amin'ny savaivony soma, avo roa heny ny dendrites, ary mitombo avo enina heny ny halavan'ny dendritika manontolo raha oharina amin'ny in vitro hCO (sary 2b). Ankoatr'izay, dia nahatsikaritra ny haavon'ny hazondamosin'ny dendritika ambony kokoa amin'ny neurons t-hCO izahay noho ny amin'ny neurons hCO (sary 2c). Izany dia manondro fa ny neurons t-hCO dia mandalo elongation dendritika be sy sampana, izay, miaraka amin'ny fitomboan'ny sela mitohy, dia mety hitondra anjara biriky amin'ny fitomboan'ny t-hCO aorian'ny famindrana (sary 1d sy Data Extended Fig. 1f). Izany dia nanosika anay hanadihady ny toetra electrophysiologique. Ny fahafahan'ny membrane dia avo valo heny (data nitarina, Fig. 8d), ny tanjaky ny membrane resting-state dia hyperpolarized kokoa (eo ho eo amin'ny 20 mV), ary ny tsindrona amin'izao fotoana izao dia nahatonga ny taham-pihetsiketsehana ambony indrindra amin'ny neurons t-hCO noho ny amin'ny neurons hCO. in vitro (sary 2d), e), izay mifanaraka amin'ny endri-javatra morphological lehibe kokoa sy sarotra kokoa amin'ny t-hCO. Ankoatr'izay, ny fatran'ny fisehoan-javatra mihetsiketsika postsynaptic (EPSC) dia avo kokoa amin'ny neurons t-hCO (sary 2f), izay manoro hevitra fa ny fitomboan'ny haavon'ny hazondamosina dendritika hita ao amin'ny neurons t-hCO dia mifandray amin'ny excitability. firaisana ara-nofo synapse. Nohamafisinay ny toetra tsy matotra amin'ny neurons hCO in vitro amin'ny alàlan'ny firaketana ny neurons glutamatergic misy soratra (data nitarina, sary 6a-c).
a, fanavaozana 3D ny hCO sy t-hCO neurons feno biocytin taorian'ny 8 volana fanavahana. b, Famaritana ny endri-javatra morphological (n = 8 hCO neurons, n = 6 t-hCO neurons; ** P = 0.0084, * P = 0.0179 ary *** P <0.0001). b, Famaritana ny endri-javatra morphological (n = 8 hCO neurons, n = 6 t-hCO neurons; ** P = 0.0084, * P = 0.0179 ary *** P <0.0001). б, количественная оценка морфологических признаков (n = 8 нейронов hCO, n = 6 нейронов t-hCO; ** P = 0,0084, * P = 0,001). b, famaritana ny endri-javatra morphological (n = 8 hCO neurons, n = 6 t-hCO neurons; ** P = 0.0084, * P = 0.0179, ary *** P <0.0001). b，形态学特征的量化（n = 8 个hCO 神经元，n = 6 个t-hCO 神经元；**P = 0.0084，*P = 0.0179 和 。 b，形态学特征的量化（n = 8 个hCO 神经元，n = 6 个t-hCO 神经元；**P = 0.0084，*P = 0.0179 和 。 б, количественная оценка морфологических признаков (n = 8 нейронов hCO, n = 6 нейронов t-hCO; ** P = 0,0084, * P = 0,001). b, famaritana ny endri-javatra morphological (n = 8 hCO neurons, n = 6 t-hCO neurons; ** P = 0.0084, * P = 0.0179, ary *** P <0.0001).c, fanamboarana 3D ny sampana dendritika hCO sy t-hCO taorian'ny fanavahana 8 volana. Ny asterisk mena dia manondro hazondamosina dendritika. Famaritana ny haavon'ny hazondamosina dendritika (n = 8 hCO neurons, n = 6 t-hCO neurons; ** P = 0.0092). d, Famaritana ny mety hisian'ny membrane (n = 25 hCO neurons, n = 16 t-hCO neurons; *** P <0.0001). d, Famaritana ny mety hisian'ny membrane (n = 25 hCO neurons, n = 16 t-hCO neurons; *** P <0.0001). d, количественная оценка мембранного потенциала покоя (n = 25 нейронов hCO, n = 16 нейронов t-hCO; *** P <0,0001). d, ny fampitomboana ny mety hisian'ny membrane (n = 25 hCO neurons, n = 16 t-hCO neurons; *** P <0.0001). d，静息膜电位的量化（n = 25 hCO 神经元，n = 16 t-hCO 神经元；***P < 0.0001）。 d，静息膜电位的量化（n = 25 hCO 神经元，n = 16 t-hCO 神经元；***P < 0.0001）。 d, количественная оценка мембранного потенциала покоя (n = 25 нейронов hCO, n = 16 нейронов t-hCO; *** P <0,0001). d, ny fampitomboana ny mety hisian'ny membrane (n = 25 hCO neurons, n = 16 t-hCO neurons; *** P <0.0001). e, Ny mety ho hetsika miverimberina ao amin'ny hCO sy t-hCO dia vokatry ny fampitomboana ny tsindrona amin'izao fotoana izao, ary ny fandrefesana ny tahan'ny tifitra ambony indrindra (n = 25 hCO neurons, n = 16 t-hCO neurons; *** P <0.0001). e, Ny mety ho hetsika miverimberina ao amin'ny hCO sy t-hCO dia vokatry ny fampitomboana ny tsindrona amin'izao fotoana izao, ary ny fandrefesana ny tahan'ny tifitra ambony indrindra (n = 25 hCO neurons, n = 16 t-hCO neurons; *** P <0.0001). e, повторное возбуждение потенциала действия в hCO и t-hCO, вызванное увеличением тока, и количественная оценка максистом возбуждения (n = 25 нейронов hCO, n = 16 нейронов t-hCO; *** P <0,0001). e, ny mety hisian'ny hetsika indray mandeha ao amin'ny hCO sy t-hCO vokatry ny fitomboana amin'izao fotoana izao sy ny habetsahan'ny tifitra ambony indrindra (n = 25 hCO neurons, n = 16 t-hCO neurons; *** P <0.0001). e，通过增加电流注入诱导的hCO 和t-hCO 重复动作电位放电，以及最大放电率的（n化）神经元，n = 16 个t-hCO 神经元；***P < 0.0001）。 E ， 通过 增加 电流 注入 的 的 hco 和 t-hco 重复 电位 放电 ， 以及 最 大 的 量化 （n （n2（n ， n = 16 个 t-hco 神经 ； *** p <0.0001） 。 e, повторяющееся возбуждение потенциала действия hCO sy t-hCO, вызванное увеличением подачи тока, и количественка маьцкном скорости возбуждения (n = 25 нейронов hCO, n = 16 нейронов t-hCO; *** P <0,0001). e, ny tifitra miverimberina amin'ny hCO sy t-hCO mety hitranga vokatry ny fitomboan'ny famatsiana amin'izao fotoana izao sy ny fampitomboana ny tahan'ny tifitra ambony indrindra (n = 25 hCO neurons, n = 16 t-hCO neurons; *** P <0.0001). f, Spontaneous EPSCs (sEPSCs) ao amin'ny hCO sy t-hCO neurons amin'ny 8 volana amin'ny fanavahana, ary ny famaritana ny fatran'ny hetsika synaptic (n = 25 hCO neurons, n = 17 t-hCO neurons; *** P <0.0001). f, Spontaneous EPSCs (sEPSCs) ao amin'ny hCO sy t-hCO neurons amin'ny 8 volana amin'ny fanavahana, ary ny famaritana ny fatran'ny hetsika synaptic (n = 25 hCO neurons, n = 17 t-hCO neurons; *** P <0.0001). f, спонтанные EPSC (sEPSC) amin'ny нейронах hCO sy t-hCO через 8 месяцев дифференцировки и количественная оценка частотыч синтич 5 нейронов hCO, n = 17 нейронов t-hCO; f, Spontaneous EPSCs (sEPSCs) ao amin'ny hCO sy t-hCO neurons amin'ny 8 volana amin'ny fanavahana sy ny famaritana ny tahan'ny hetsika synaptic (n = 25 hCO neurons, n = 17 t-hCO neurons; *** P <0.0001). f，分化8 个月时hCO 和t-hCO 神经元中的自发性EPSCs (sEPSCs)，以及突触事件频率的量化（n2（n CO = 烈率的量化（n 17 t-hCO 神经元；***P < 0.0001） . f，分化8 个月时hCO 和t-hCO 神经元中的自发性EPSCs (sEPSCs)，以及突触事件频率的量匼2（n CO = 2（n神率的量匼（n = 25 hCO 神率的量匼（n = 25hCO P < 0,0001） . f, спонтанные EPSC (sEPSC) amin'ny нейронах hCO sy t-hCO через 8 месяцев дифференцировки и количественная оценка частотыч синтич 5 нейронов hCO, n = 17 нейронов t-hCO; f, Spontaneous EPSCs (sEPSCs) ao amin'ny hCO sy t-hCO neurons amin'ny 8 volana amin'ny fanavahana sy ny famaritana ny tahan'ny hetsika synaptika (n = 25 hCO neurons, n = 17 t-hCO neurons; *** P <0.0001).Ho an'ny bf, hCO sy t-hCO ao amin'ny andalana 1208-2 dia nalaina avy amin'ny batch fanavakavahana mitovy amin'ny parallèle. g, Famakafakana fanamafisam-peo Gene (fitsapana marina nataon'i Fisher amin'ny lafiny iray) momba ny fototarazo (nampifanarahana P <0.05, fiovan'ny fony> 2, aseho amin'ny farafaharatsiny 10% amin'ny nuclei) ao amin'ny neurons t-hCO glutamatergic raha oharina amin'ny hCO glutamatergic hCO miaraka amin'ny andian-dahatsoratry ny générale-response (ERG) fantatra amin'ny fotoana voalohany (ERG-response) fandalinana totozy16 sy LRG manokana avy amin'ny neurons in vitro17. g, Famakafakana fanamafisam-peo Gene (fitsapana marina nataon'i Fisher amin'ny lafiny iray) momba ny fototarazo (nampifanarahana P <0.05, fiovan'ny fony> 2, aseho amin'ny farafaharatsiny 10% amin'ny nuclei) ao amin'ny neurons t-hCO glutamatergic raha oharina amin'ny hCO glutamatergic hCO miaraka amin'ny andian-dahatsoratry ny générale-response (ERG) fantatra amin'ny fotoana voalohany (ERG-response) fandalinana totozy16 sy LRG manokana avy amin'ny neurons in vitro17. g, анализ обогащения набора генов (односторонний точный критерий Фишера) генов со значительной активацией (скор0ректироть (скор0ректироть) изменения > 2, экспрессия по меньшей мере в 10% ядер) в глутаматергических нейронах t-hCO по сравнению стермича стермич hCO наборы генов как раннего (ERG), так и позднего (LRG) генов, зависящих от активности, идентифицированных в иванных в иснишл 6 и специфических для человека LRG из нейронов in vitro17. g, famakafakana ny fampitomboana ny fototarazo (fitsapana marina nataon'i Fisher tokana) ny fototarazo miaraka amin'ny fampahavitrihana manan-danja (nampifanarahana P <0.05, fiovan'ny fony> 2, fanehoana amin'ny farafaharatsiny 10% amin'ny nuclei) ao amin'ny neurons t-hCO glutamatergic raha oharina amin'ny hCO glutamatergic neurons seta amin'ny hetsika voalohany (ERG) sy ny tara (LRG) voafantina amin'ny hetsika miankinan'ny olombelona (LRG) LRG avy amin'ny neurons in vitro17. g，t-hCO谷氨酸能神经元与hCO谷氨酸能神经元相比，t -hCO谷氨酸能神经元显着上调（调整后P<0.05，倍数变化>2，在至少10%的细胞核中表达）的基因集富集分析（单侧F isher精确检验）从体内小鼠研究中鉴定的早期反应(ERG)和晚期反应(LRG) 活性依赖性基因的基因组16 和体外神经元17 中的人类特异性LRG。 g ， t-hco 谷氨酸 神经 元 与 hco 谷氨酸 神经 元 相比 ， t-hco 谷氨酸 神经 元 上调 0 . ， 倍数> 2 ， 至少 至少 10%的 细胞 核中 表达） 的 集富集 分析 （单侧 fisher 精确）研究 中 的 早期 反应 反应 反应 和 晚期 反应 反应 (lrg) 活性 基因 的 基因 璌 16神经元 17 中 中 17 中 17的人类特异性LRG。 g, глутаматергические нейроны t-hCO были значительно активизированы по сравнению с глутаматергическими нейскими (нейронами hCO) P<0,05, кратность изменения> 2, не менее 10% Анализ обогащения набора генов (односторонний точный тест Фишетра) позднего гены, зависящие от активности ответа (LRG), идентифицированные в исследованиях на мышах in vivo16 и in l для человека. g, t-hCO glutamatergic neurons dia nihena be raha oharina amin'ny hCO glutamatergic neurons (adjusted P<0.05, fold change> 2, fara fahakeliny 10% Early response (ERG) sy ny taratry ny famakafakana fampitomboana ny fototarazo (fitsapana marina nataon'i Fisher iray amin'ny rambony).Ny tsipika misy teboka dia manondro ny sandan'ny Bonferroni-nahitsy P amin'ny 0.05. h, GluN fanehoana ny fototarazo (pseudo-package sy scaling ny fototarazo tsirairay) dia nitombo be tamin'ny snRNA-seq dika mitovy amin'ny fototarazo LRG ao amin'ny t-hCO glutamatergic neurons. i, immunostaining mampiseho fanehoana SCG2 ao amin'ny neurons t-hCO (ambony) sy hCO (ambany). Ny zana-tsipìka fotsy dia manondro ny sela SCG2+. Scale bar, 25 µm. Ny angona dia aseho amin'ny hoe mean ± deviation standard.
Miorina amin'ny fitomboan'ny hetsika t-hCO hita ao amin'ny slices ex vivo, ny snRNA-seq dia nanambara ny fampivoarana ny transcript fototarazo amin'ny t-hCO raha oharina amin'ny hCO in vitro. Ny neurons glutamatergic t-hCO dia naneho ny haavon'ny fototarazo mifehy ny hetsika taratry ny valiny (sary 2g, h), izay hita tamin'ny fianarana teo aloha tamin'ny totozy sy ny neurons olombelona16,17. Ohatra, ny BDNF18, SCG2, ary ny OSTN, fototarazo mifehy ny hetsika manokana, dia nampiseho fitenenana nitombo tao amin'ny neurons t-hCO raha oharina amin'ny neurons hCO (sary 2g-i). Noho izany, ny neurons t-hCO dia nampiseho toetra matotra kokoa raha oharina amin'ny neurons hCO amin'ny alàlan'ny famakafakana transcriptional, morphological ary functional.
Mba hanombanana bebe kokoa ny fikambanan'ny fahamatoran'ny t-hCO amin'ny fivoaran'ny atidohan'olombelona, ​​​​dia nanao fampitahana transcriptomic amin'ny karazana sela cortical foetal sy olon-dehibe19,20 sy adult21,22 izahay ary koa ny angon-drakitra be dia be momba ny fanehoana ny fototarazo cortical23 nandritra ny fampandrosoana (data nitarina, sary 5). ). miaraka amin'ny asa teo aloha 24, ny hCO sy ny t-hCO transcriptome matoatoa eran-tany amin'ny 7-8 volana amin'ny fanavahana dia mifanaraka tanteraka amin'ny vanim-potoana fivoaran'ny vivo ary mitovy indrindra amin'ny fiainan'ny foetus tara (Data Extended Fig. 5a). Marihina fa nitombo ny fahamatoran'ny transcriptome ao amin'ny t-hCO raha oharina amin'ny hCO mifanaraka amin'ny taona, ary koa ny fampahavitrihana transcriptome mifandray amin'ny synaptogenesis, astrogenese, ary myelination (data miitatra, sary 5b-d). Ao amin'ny ambaratonga sela, dia nahita porofon'ny karazana cortex manify ao amin'ny t-hCO izahay, miaraka amin'ny vondron'ny neurons glutamatergic mifamatotra amin'ny olon-dehibe L2 / 3, L5, ary L6 neuron subtypes (sary 1i). Mifanohitra amin'izany kosa, ny fifandonan'ny cluster eo amin'ny neurons t-hCO glutamatergic sy ny neurons cortical foetal dia voafetra kokoa amin'ny fitondrana vohoka (angona miitatra, sary 5e-j). Mba hamaritana raha mitovy amin'ny neurons neocortical postnatal olombelona ny neurons t-hCO, dia nanao firaketana electrophysiologique sy fanavaozana anatomika ny neurons pyramidal L2 / 3 olombelona amin'ny fizarana maranitra amin'ny cortex postnatal olombelona (data nitarina, sary 7a). Ny toetran'ny electrophysiologique an'ny neurons pyramidal L2 / 3 dia mitovy amin'ny an'ny neurons pyramidal t-hCO (data nitarina, sary 7e). Amin'ny lafiny morphologique, ny neurons L2 / 3 avy amin'ny santionan'ny olombelona postnatal dia mitovy kokoa amin'ny t-hCO noho ny hCO, na dia lava kokoa aza ny sela L2 / 3, misy sampana bebe kokoa amin'ny ankapobeny, ary manana hakitroky ny hazondamosina ambony kokoa (sary 3g sy data miitatra, sary 7b-). G).
a, famindrana ny hCO novokarin'ny fanaraha-maso sy ny tsipika sela TS hiPS ho voalavo neonatal. b, fanamboarana 3D ny neurons t-hCO feno biocytin taorian'ny 8 volana fanavahana. c, famaritana ny halavan'ny dendritika (n = 19 mifehy ny neurons, n = 21 TS neurons; ** P = 0.0041). d, sampana dendritika 3D nohavaozina avy amin'ny fanaraha-maso sy TS t-hCO amin'ny 8 volana amin'ny fanavahana, ary ny famaritana ny haavon'ny hazondamosina dendritika (n = 16 control neurons, n = 21 TS neurons, *** P <0.0001). d, sampana dendritika 3D nohavaozina avy amin'ny fanaraha-maso sy TS t-hCO amin'ny 8 volana amin'ny fanavahana, ary ny famaritana ny haavon'ny hazondamosina dendritika (n = 16 control neurons, n = 21 TS neurons, *** P <0.0001). d, 3D-reconструкция дендритных ветвей из контроля и TS t-hCO через 8 месяцев дифференцировки и количественостонка дендритных шипов (n = 16 контрольных нейронов, n = 21 TS нейронов, *** P <0,0001). d, fanavaozana 3D ny sampana dendritika avy amin'ny fanaraha-maso sy ny t-hCO TS amin'ny 8 volana amin'ny fanavahana sy ny fampitomboana ny haavon'ny hazondamosina dendritika (n = 16 control neurons, n = 21 TS neurons, *** P <0.0001). d，分化8 个月时对照和TS t-hCO 的3D 重建树突分支，以及树突棘密度的量化（n = 16 个女21 个TS 神经元，***P < 0.0001）。 d ， 分化 8 个 时 对照 和 ts t-hco 的 3d 重建 分支 分支 以及 树突棘 密度 量化 ／化 ／元 ， n = 21 个 ts 神经 ， *** p <0.0001 ）。 d, 3D-reconструкция дендритных ветвей контроля и TS t-hCO через 8 месяцев дифференцировки и количественная отнхисти шипов (n = 16 контрольных нейронов, n = 21 TS нейронов, *** P <0,0001). d, fanavaozana 3D amin'ny sampana dendritika mifehy sy TS t-hCO amin'ny 8 volana amin'ny fanavahana sy ny fampitomboana ny haavon'ny hazondamosina dendritika (n = 16 control neurons, n = 21 TS neurons, *** P <0.0001).Ny asterisk mena dia manondro hazondamosina dendritika. e, EPSCs mandeha ho azy amin'ny fanaraha-maso sy TS t-hCO neurons taorian'ny 8 volana fanavahana. f, teti-pandrefesana mitambatra ary ny fatran'ny matetika sy ny amplitude amin'ny hetsika synaptic (n = 32 control neurons, n = 26 TS neurons; ** P = 0.0076 ary P = 0.8102). g, Famakafakana Scholl momba ny TS ary mifehy ny neurons amin'ny hCO sy t-hCO. Ny tsipika mipetaka dia mampiseho ny neurons pyramidal L2 / 3 postnatal olombelona ho fampitahana (n = 24 mifehy ny t-hCO neurons, n = 21 TS t-hCO neurons, n = 8 mifehy hCO neurons, ary n = 7 TS hCO neurons). Ny angon-drakitra dia aseho ho ny mean ± fivilian-dàlana
Ny fahafahan'ny t-hCO hamerenana ny endri-javatra morphologique sy miasa amin'ny neuron cortex olombelona amin'ny ambaratonga avo dia nanosika antsika hijery raha azo ampiasaina ny t-hCO hamantarana ireo karazana aretina. Nifantoka tamin'ny TS izahay, aretina mafy amin'ny neurodevelopmental vokatry ny fiovan'ny tombom-barotra amin'ny fototarazo CaV1.2, izay manomboka ny fandikana ny fototarazo miankina amin'ny asa ao amin'ny neurons. Nahazo hCO izahay avy amin'ny marary TS telo mitondra ny fanoloana mahazatra indrindra (p.G406R) ary fanaraha-maso telo (sary 3a). Taorian'ny famindrana dia hitanay fa niova ny morphologie dendritika ao amin'ny neurons TS raha oharina amin'ny fanaraha-maso (sary 3b sy ny angon-drakitra nanitatra, sary 8a, b), miaraka amin'ny fitomboana avo roa heny amin'ny isan'ny dendrites voalohany ary ny fitomboan'ny ankapobeny amin'ny ankapobeny sy ny fihenan'ny halavan'ny dendritika (sary 3c sy ​​ny angon-drakitra lava, sary 8c). Izany dia mifandray amin'ny fitomboan'ny hazondamosina sy ny fitomboan'ny EPSCs mandeha ho azy ao amin'ny TS raha oharina amin'ny fanaraha-maso ny neurons (sary 3d-f sy ny angon-drakitra miitatra, sary 8g). Ny famakafakana fanampiny dia mampiseho ny endriky ny sampana dendritika tsy ara-dalàna ao amin'ny t-hCO TS raha oharina amin'ny fanaraha-maso, fa tsy amin'ny in vitro TS hCO amin'ny dingana mitovy amin'ny fanavahana (sary 3g). Izany dia mifanaraka amin'ny tatitra nataonay teo aloha momba ny fihenan'ny dendritika miankina amin'ny asa ao amin'ny TS ary manasongadina ny fahafahan'ity sehatra famindrana ity hamantarana ireo karazana aretina ao amin'ny vivo.
Nanontany izahay avy eo hoe hatraiza ny sela t-hCO dia tafiditra ao anatin'ny rat S1. Ny S1 amin'ny biby mpikiky dia mahazo fidirana synaptic matanjaka avy amin'ny ipsilateral ventral basal sy posterior thalamic nuclei, ary koa ny motera ipsilateral sy ny cortices somatosensory faharoa, ary ny contralateral S1 (sary 4a). Mba hamerenana amin'ny laoniny ny lamina innervation dia voan'ny viriosy haromotana-dG-GFP/AAV-G ny hCO ary nafindra tao amin'ny voalavo S1 ny hCO 3 andro taty aoriana. Hitanay ny fitenenana GFP matevina amin'ny neurons amin'ny S1 ipsilateral sy ganglia basal ventral 7-14 andro aorian'ny famindrana (sary 4b, c). Ankoatr'izay, ny fandokoana antibody amin'ny marika thalamic netrin G1 dia nanambara ny fisian'ny fiafaran'ny thalamic amin'ny t-hCO (sary 4d, e). Mba hanombanana raha mety hamoaka valinteny synaptic ao amin'ny sela t-hCO ireo vinavina afferent ireo, dia nanao firaketana sela manontolo avy amin'ny selan'olombelona izahay tamin'ny fizarana maranitra amin'ny lay thalamocortical. Famporisihana elektrika amin'ny rat S1, kapsula anatiny, zavatra fotsy, fibre eo akaikin'ny t-hCO na fampahavitrihana optogenetika amin'ny fiafaran'ny thalamic opsin-expressing amin'ny t-hCO induced short-latency EPSCs ao amin'ny neurons t-hCO mipoitra amin'ny AMPA antagonist NBQX. (sary 4f, g ary angon-drakitra fanampiny, sary 9a-g). Ireo angon-drakitra ireo dia mampiseho fa ny t-hCO dia tafiditra ao anatin'ny ati-doha voalavo ary azo ampiasaina amin'ny tavy mpampiantrano rat.
a, Sarin-tsarin'ny andrana fanaraha-maso haromotana. b, GFP sy fanehoana STEM121 manokana momba ny olombelona eo anelanelan'ny t-hCO sy ny cortex cerebral rat (panneau ambony). Aseho ihany koa ny fanehoana GFP ao amin'ny rat ipsilateral ventral basal nucleus (VB) (ambany havia) ary ipsilateral S1 (ambany havanana). Scale bar, 50 µm. Ny efamira mena dia maneho ny faritra ao amin'ny atidoha izay nakana ny sary. c, fampitomboana ny sela maneho ny GFP (n = 4 voalavo). d, e - Netrin G1+ thalamic terminals amin'ny t-hCO. d mampiseho fizarana coronal misy nokleary t-hCO sy VB. Scale bar, 2 mm. e dia mampiseho ny fitenenana Netrin G1 sy STEM121 ao amin'ny neurons t-hCO (ankavia) sy VB (ankavanana). Scale bar, 50 µm. Ny tsipika mivolom-boasary dia manondro ny sisin-tany t-hCO. f, g, Ny soritr'aretin'ny t-hCO neurons amin'izao fotoana izao aorian'ny fanentanana elektrika ao amin'ny S1 rat (f) na kapsula anatiny (g), miaraka amin'ny (volomparasy) na tsy misy (mainty) NBQX (ankavia). EPSC amplitudes misy sy tsy misy NBQX (n = 6 S1 neurons, * P = 0.0119; ary n = 6 internal capsule neurons, ** P = 0.0022) (afovoany). Ny isan-jaton'ny neurons t-hCO mampiseho EPSC ho setrin'ny fanentanana elektrika amin'ny rat S1 (f) na kapsula anatiny (g) (ankavanana). aCSF, fluid cerebrospinal artificial. h, kisarisary schematic amin'ny fanandramana sary 2P (ankavia). Fanehoana ny GCaMP6s amin'ny t-hCO (afovoany). Scale bar, 100 µm. Ny fe-potoanan'ny fluorescence amin'ny GCaMP6s (ankavanana). i, Z - isa amin'ny fluorescence hetsika mandeha ho azy. j, fanoharana schematic momba ny fanentanana volombava. k, z-scored 2P fluorescence trajectories amin'ny fitsapana iray, mifanaraka amin'ny volombava fiviliana amin'ny fotoana aotra (tsipika tapaka) amin'ny ohatra sela. l, valin-kafatra z-salan'ny mponina amin'ny sela rehetra mifanandrify amin'ny fivilian'ny volombava amin'ny fotoana aotra (tsipika tsipika) (mena) na marika famantarana fotoana (voankazo). m. Diagram schematic amin'ny fanandramana amin'ny marika optika. n, Mivezivezy manta avy amin'ny sela t-hCO ohatra mandritra ny fanentanana laser manga na ny fivilian'ny volombava. Ny zana-tsipìka mena dia manondro ny tsipìka voalohany vokatry ny hazavana (ambony) na vokatry ny fivilian'ny volombava (ambany). Ny alokaloka volondavenona dia manondro vanim-potoanan'ny fivilian'ny volombava. o, ny onjam-pahazavana ambony indrindra sy ny valin'ny fivilian'ny volombava. p, spikes amin'ny andrana tokana, mifanaraka amin'ny fivilian'ny volombava ao amin'ny sela ohatra. 0 dia manondro ny fivilian'ny volombava (tsipika tapaka). q, tahan'ny tifitra z-sora amin'ny mponina ho an'ny sela rehetra mahatsikaritra, mifanandrify amin'ny fivilian'ny volombava amin'ny fotoana aotra (tsipika tsipika) (mena) na marika famantarana famantaranandro (volondavenona). r, Ny ampahany amin'ny singa photosensitive dia miovaova be amin'ny fivilian'ny volombava (n = 3 voalavo) (ankavia). Peak z-score latency (n = 3 voalavo; n = 5 (maitso maivana), n = 4 (maitso maizina), ary n = 4 (cyan) singam-panovàna fivilian-drivotra isaky ny voalavo) (ankavanana). Ny angona dia aseho amin'ny hoe mean ± deviation standard
Nanontany izahay avy eo raha azo ampiasaina amin'ny alàlan'ny stimuli sensory in vivo ny t-hCO. Nafindranay ny hCO maneho ny mari-pamantarana kalsioma voafantina GCaMP6 ho voalavo S1. Taorian'ny andro 150, dia nanao photometry fibre na sary roa-photon calcium izahay (sary 4h ary nanitatra ny angona, sary 10a). Hitanay fa ny sela t-hCO dia nampiseho hetsika rhythmic synchronized (sary 4i, Data Expanded, Figure 10b ary Video fanampiny 1). Mba hamaritana ny hetsika tampon'ny t-hCO, dia nanao firaketana electrophysiologique extracellular izahay tamin'ny voalavo transplanta anesthetized (data nitarina, sary 10c-f). Namorona fandrindrana stereotaxic avy amin'ny sary MRI izahay; Noho izany, ireo singa voarakitra ireo dia maneho ny neurons olombelona, ​​​​na dia ny electrophysiology irery aza dia tsy mamela karazana fiaviana iray hamaritana. Hitanay ny fipoahan'ny hetsika synchronized (data nitarina, sary 10d). Ny fipoahana dia naharitra 460 ms teo ho eo ary nosarahan'ny vanim-potoana fahanginana teo amin'ny 2 s (data nitarina, sary 10d, e). Manodidina ny 73% eo ho eo amin'ireo singa voarakitra isaky ny fipoahana ny vondrona tsirairay. Ny asan'ny vondrona tsirairay dia nifamatotra mafy, ary ireo fifandraisana ireo dia avo kokoa noho ny an'ny vondrona fantatra amin'ny biby tsy voatanisa voarakitra ao anatin'ny fepetra mitovy (data nitarina, sary 10f). Mba hamaritana bebe kokoa ny valin-kafatra avy amin'ny neurônina azo avy amin'ny olombelona, ​​​​dia nanao andrana fametahana maivana izahay tamin'ny voalavo anesthetized nafindra tamin'ny hCO maneho ny fantsom-pahazavana cation rhodopsin 2 (hChR2), izay ahafahan'ny t-hCO neurons fanekena fohy fohy (latsaky ny 10 ms) ho setrin'ny stimuli manga mazava (Fig.4im-og). Ny neurônina t-hCO dia naneho ny fipoahan'ny hetsika mandeha ho azy amin'ny fatrany mitovy amin'ny hita amin'ny sary kalsioma, ary koa ny firaketana electrophysiologique natao tamin'ny t-hCO raha tsy misy ny marika mazava (data nitarina, sary 10c-g). Tsy nisy hetsika tampoka hita tamin'ny dingana mifandraika amin'ny hCO voarakitra in vitro. Mba hanombanana raha azo ampiasaina amin'ny alàlan'ny stimuli sensory ny t-hCO, dia nesorinay vetivety ny volombava voalavo hiala amin'ny t-hCO (sary 4j, m ary angona miitatra, sary 10h, k). Araka ny fanadihadiana teo aloha8,10, ny ampahany amin'ny sela t-hCO dia nampiseho hetsika nitombo ho setrin'ny fivilian'ny volombava, izay tsy voamarika rehefa nampitahaina tamin'ny mari-pamantarana kisendrasendra ny angon-drakitra (sary 4k-q sy angon-drakitra miitatra, sary 10h-q). Raha ny marina, eo amin'ny 54% amin'ireo singa tokana misy marika opto dia nampiseho taham-pihetsiketsehana be dia be taorian'ny famporisihana ny volombava, nitombo teo amin'ny 650 ms (sary 4r). Raha atambatra, ireo angon-drakitra ireo dia manoro hevitra fa ny t-hCO dia mahazo fampidiran-dresaka mifanaraka amin'izany ary azo ampiasaina amin'ny fanentanana ara-tontolo iainana.
Avy eo dia nanadihady izahay raha afaka manetsika ny faritra amin'ny voalavo ny t-hCO mba hifehezana ny fitondran-tena. Nanadihady voalohany izahay raha toa ny axons ny t-hCO neurons dia miditra amin'ny tavy manodidina ny voalavo. Nahitana ny hCO tamin'ny lentivirus coding hChR2 mitambatra amin'ny EYFP (hChR2-EYFP) izahay. Taorian'ny andro 110, dia nandinika ny fanehoana EYFP tany amin'ny faritra cortical ipsilateral izahay, anisan'izany ny cortices auditory, motor, ary somatosensory, ary koa amin'ny faritra subcortical, anisan'izany ny striatum, hippocampus, ary thalamus (sary 5a). Mba hanombanana raha mety hiteraka valin-kafatra synaptic ao amin'ny sela voalavo ireo vinavina efferent ireo, dia navitrika ny sela t-hCO izay maneho hChR2-EYFP amin'ny alàlan'ny firaketana ny sela cortex cerebral rat ao amin'ny fizarana atidoha maranitra. Ny fampandehanana ny axon t-hCO miaraka amin'ny hazavana manga dia miteraka EPSCs fohy fohy ao amin'ny neurons cortex pyramidal rat, izay nosakanan'ny NBQX (sary 5b-g). Ankoatr'izay, ireo valinteny ireo dia mety ho voasakana amin'ny tetrodotoxin (TTX) ary haverina amin'ny laoniny amin'ny 4-aminopyridine (4-AP), izay milaza fa vokatry ny fifandraisana monosynaptic (sary 5e) no nahatonga azy ireo.
a, Diagrama skéma amin'ny fanaraha-maso axon (ankavia). t-hCO EYFP expression (ankavanana). Scale bar, 100 µm. A1, cortex auditory, ACC, cortex cingulate aloha, d. striatum, dorsal striatum, HPC, hippocampus; Diaphragm, lateral septum, mPFC, medial prefrontal cortex, piri, piriform cortex, v. striatum, ventral striatum, VPM, ventropostomedial nucleus ny thalamus, VTA, faritra tegmental ventral. Ny efamira mena dia maneho ny faritra ao amin'ny atidoha izay nakana ny sary. b, Diagram schematic amin'ny fanandramana fanentanana. c, d, Ohatra amin'ny valin'ny photocurrent manga (ambony) sy malefaka (ambany) amin'ny olombelona (c) EYFP + t-hCO na rat (d) sela EYFP-. e, f, Ny soritr'aretin'ny neurons amin'izao fotoana izao aorian'ny fanentanana manga amin'ny t-hCO axons miaraka amin'ny TTX sy 4-AR (maitso), TTX (voalohany) na aCSF (mainty) (e), miaraka amin'ny (violet) na tsy misy (mainty) ) NBQX (e). g, faharetan'ny valinteny ateraky ny hazavana manga ao amin'ny sela voalavo (n = 16 sela); Ny bara mitsivalana dia manondro ny fahatarana antonony (7,13 ms) (ankavia). Ny amplitude amin'ny EPSC voarakitra na tsy misy NBQX (n = 7 sela; *** P <0.0001) (afovoany). Ny amplitude amin'ny EPSC voarakitra na tsy misy NBQX (n = 7 sela; *** P <0.0001) (afovoany). Амплитуда вызванных светом EPSC, зарегистрированных с или без NBQX (n = 7 клеток; ***P <0,0001) (amin'ny центре). Ny amplitude amin'ny EPSC voarakitra an-tsoratra miaraka na tsy misy NBQX (n = sela 7; *** P <0.0001) (afovoany).使用或不使用NBQX 记录的光诱发EPSC 的振幅（n = 7 个细胞；***P < 0.0001）（中）。使用或不使用NBQX 记录的光诱发EPSC 的振幅（n = 7 个细胞；***P < 0.0001）（中）。 Амплитуда вызванных светом EPSC, зарегистрированных с или без NBQX (n = 7 клеток; ***P <0,0001) (amin'ny центре). Ny amplitude amin'ny EPSC voarakitra an-tsoratra miaraka na tsy misy NBQX (n = sela 7; *** P <0.0001) (afovoany).Ny isan-jaton'ny sela voalavo mampiseho EPSC mamaly ny hazavana manga (ankavanana). h, Diagram skématika momba ny asa fitondran-tena. d0, andro 0. i. Fampisehoana biby fakan-tahaka amin'ny andro 1 (ankavia) na andro 15 (ankavanana) fanofanana. Ny isan'ny licks natao tamin'ny andro 1 (ankavia) na andro 15 (afovoany havanana) (n = 150 fitsapana jiro manga, n = 150 fitsapana jiro mena; *** P <0.0001). Ny isan'ny licks natao tamin'ny andro 1 (ankavia) na andro 15 (afovoany havanana) (n = 150 fitsapana jiro manga, n = 150 fitsapana jiro mena; *** P <0.0001). Среднее количество облизываний, выполненных в день 1 (слева) или день 15 (в центре справа) (n = 150 испытаний с = ситоним с = с 5 испытаний с красным светом; ***P <0,0001). Ny isan'ny licks natao tamin'ny andro 1 (ankavia) na andro 15 (afovoany havanana) (n = 150 fitsapana jiro manga, n = 150 fitsapana jiro mena; *** P <0.0001).第1 天（左）或第15 天（右中）执行的平均舔次数（n = 150 次蓝光试验，n = 150次红光试验；***P < 0.0001）。第1 天（左）或第15 天（右中）执行的平均舔次数（n = 150 次蓝光试验，n = 150次红光试验；***P < 0.001 Среднее количество облизываний, выполненных в день 1 (слева) или день 15 (в центре справа) (n = 150 испытаний с = ситоним с = с 5 испытаний с красным светом; ***P <0,0001). Ny isan'ny licks natao tamin'ny andro 1 (ankavia) na andro 15 (afovoany havanana) (n = 150 fitsapana jiro manga, n = 150 fitsapana jiro mena; *** P <0.0001).Lelaka mitambatra ho an'ny fitsapana hazavana mena sy manga amin'ny andro 1 (afovoany ankavia) na andro 15 (ankavanana). NS, tsy manan-danja. j, k, Ny toetran'ny biby rehetra nafindra tamin'ny t-hCO maneho hChR2-EYFP (j) na ny fluorophore (k) amin'ny andro 1 na 15 (hChR2-EYFP: n = 9 rats, ** P = 0.0049; fanaraha-maso: n = 9, P = 0.1497). l, Evolisiona ny isa tiany (n = 9 hChR2, n = 9 fanaraha-maso; ** P <0.001, *** P <0.0001). l, Evolisiona ny isa tiany (n = 9 hChR2, n = 9 fanaraha-maso; ** P <0.001, *** P <0.0001). l, Эволюция показателя предпочтения (n = 9 hChR2, n = 9 контрольных; **P <0,001, ***P <0,0001). l, Evolisiona ny isa tiany (n = 9 hChR2, n = 9 fanaraha-maso; ** P <0.001, *** P <0.0001). l，偏好评分的演变（n = 9 hChR2，n = 9 对照；**P < 0.001，***P < 0.0001）. l，偏好评分的演变（n = 9 hChR2，n = 9 对照；**P < 0.001，***P < 0.0001）. l, Эволюция показателей предпочтения (n = 9 hChR2, n = 9 контролей; **P <0,001, ***P <0,0001). l, Evolisiona ny isa tiany (n = 9 hChR2, n = 9 fanaraha-maso; ** P <0.001, *** P <0.0001).m, fanehoana FOS ho setrin'ny fampahavitrihana optogenetic ny t-hCO ao amin'ny S1. Sarin'ny fanehoana FOS (ankavia), ary ny fatiantoka (n = 3 isaky ny vondrona; * P <0.05, ** P <0.01 ary *** P <0.001) (ankavanana). Sarin'ny fanehoana FOS (ankavia), ary ny fatiantoka (n = 3 isaky ny vondrona; * P <0.05, ** P <0.01 ary *** P <0.001) (ankavanana). Показаны изображения экспрессии FOS (слева) и количественного определения (n = 3 на группу; * P <0,05, ** P <0,01,00 *** P <0,01,00 *** P). Sarin'ny fanehoana FOS (ankavia) sy ny famaritana (n = 3 isaky ny vondrona; * P <0.05, ** P <0.01, ary *** P <0.001) dia aseho (ankavanana).显示了FOS 表达（左）和量化（每组n = 3；*P < 0.05、**P < 0.01 和***P < 0.001）（叾））叾）显示了FOS 表达（左）和量化（每组n = 3；*P < 0.05、**P < 0.01 和***P < 0.001）（叾））叾） Показаны изображения экспрессии FOS (слева) и количественного определения (n = 3 на группу; * P <0,05, ** P <0,01,00 *** P <0,01,00 *** P). Sarin'ny fanehoana FOS (ankavia) sy ny famaritana (n = 3 isaky ny vondrona; * P <0.05, ** P <0.01, ary *** P <0.001) dia aseho (ankavanana).Scale bar, 100 µm. Ny angon-drakitra dia aseho ho mean ± fahadisoana mahazatra amin'ny BLA, basolateral tonsil, MDT, dorsomedial thalamic nucleus, PAG, periaqueductal grey.
Farany, nanontany izahay raha afaka manova ny fitondran-tenan'ny voalavo ny t-hCO. Mba hitsapana izany dia nafindranay ny hChR2-EYFP-expressing hCO ho ao amin'ny S1, ary 90 andro taty aoriana, dia nametraka fibre optika tao amin'ny t-hCO izahay ho an'ny fandefasana maivana. Avy eo dia nampiofanay ireo voalavo tamin'ny paradigma opérant conditioner novaina (sary 5h). Nametraka ny biby tao amin'ny efitrano fitsapana fitondran-tena izahay ary nampiharina tamin'ny laser 5 segondra manga (473 nm) sy mena (635 nm). Nahazo valisoa rano ny biby raha nilelaka nandritra ny famporisihana hazavana manga fa tsy nilelaka nandritra ny famporisihana jiro mena. Tamin'ny andro voalohany amin'ny fiofanana dia tsy nisy fahasamihafana teo amin'ny filelaka ny biby rehefa notarihina tamin'ny hazavana manga na mena. Na izany aza, tamin'ny andro 15, ny biby nafindra tamin'ny hCO maneho hChR2-EYFP dia nampiseho filalaovana mavitrika kokoa rehefa namporisika tamin'ny hazavana manga raha oharina amin'ny fanentanana hazavana mena. Ireo fiovana amin'ny fitondran-tena milelaka ireo dia tsy voamarika tamin'ny biby fanaraha-maso nafindra tamin'ny hCO maneho ny fluorophore fanaraha-maso (fahombiazan'ny fianarana: hChR2 89%, EYFP 0%, Figure 5i-1 ary Video fanampiny 2). Ireo angon-drakitra ireo dia manoro hevitra fa ny sela t-hCO dia afaka manetsika ny neurons rat mba hamporisihana ny fitondran-tena mitady valisoa. Mba hahafantarana hoe iza amin'ireo raty t-hCO neural circuits no mety ho tafiditra amin'ireo fiovan'ny fitondran-tena ireo, dia navitrika t-hCO tamin'ny biby voaofana izahay ary nijinja tao anatin'ny 90 minitra taty aoriana. Ny immunohistochemistry dia nanambara ny fanehoana ny proteinina FOS miankina amin'ny asa any amin'ny faritra maromaro ao amin'ny atidoha tafiditra amin'ny fitondran-tena mandrisika, ao anatin'izany ny cortex medial prefrontal, medial thalamus, ary ny periaqueductal grey matter, izay naseho na tamin'ny biby tsy voafehy na tamin'ny biby. vary. 5m). Raha atambatra, ireo angon-drakitra ireo dia manoro hevitra fa ny t-hCO dia afaka manova ny hetsika neuronal rat mba hitondrana fitondran-tena.
Ny organoids neural dia maneho rafitra mampanantena amin'ny fandalinana ny fivoaran'ny olombelona sy ny aretina amin'ny vitro, saingy voafetra ny tsy fisian'ny fifandraisana misy eo amin'ny faritra misy ao amin'ny vivo. Namolavola sehatra vaovao izay nafindranay ny hCO ho amin'ny S1 amin'ny voalavo taorian'ny nahaterahan'ny immunocompromised mba handalinana ny fivoaran'ny sela olombelona sy ny fiasan'ny vivo. Nasehonay fa ny t-hCO dia mampivelatra karazana sela matotra tsy voamarika ao amin'ny vitro28 ary ny t-hCO dia tafiditra ao anatin'ny ati-doha mpikiky. Ny fampidirana ny t-hCO amin'ny faritra neural rodent dia namela antsika hametraka fifandraisana misy eo amin'ny asan'ny sela olombelona sy ny fandalinana ny fitondran-tenan'ny biby, izay mampiseho fa ny neuron t-hCO dia afaka manova ny asan'ny neuronal rat mba hitondrana valiny amin'ny fitondran-tena.
Ny sehatra nofaritanay dia manana tombony maro raha oharina amin'ny fikarohana teo aloha momba ny famindrana ny selan'olombelona ho lasa atidoha mpikiky. Voalohany, nafindranay ny hCO ho ao amin'ny cortex mivoatra amin'ny voalavo postnatal aloha, izay mety hanamora ny fampidirana anatomika sy fiasa. Faharoa, ny fanaraha-maso ny t-hCO MRI dia namela antsika handalina ny toeran'ny grefy sy ny fitomboan'ny biby velona, ​​​​izay mamela antsika hanao fandalinana biby maro mandritra ny fotoana maharitra ary hametraka ny fahamendrehana amin'ny tsipika sela hiPS maromaro. Farany, nafindranay ny organoids tsy misy dikany, fa tsy ny fampiatoana sela tokana tokana, izay tsy dia manimba ny selan'olombelona ary afaka mampiroborobo ny fampidirana sy ny famoronana neuron cortex olombelona ao amin'ny atidoha voalavo.
Ekentsika fa na dia eo aza ny fandrosoana amin'ity sehatra ity, ny faneriterena ara-nofo, ara-nofo, ary ireo karazam-biby samihafa dia manakana ny fiforonan'ny rafitry ny neural olombelona manana fahatokiana avo, na dia aorian'ny famindrana amin'ny dingana voalohan'ny fivoarana aza. Ohatra, tsy fantatra mazava raha ny hetsika mihetsiketsika hita ao amin'ny t-hCO dia maneho phenotype amin'ny fampandrosoana mitovy amin'ny hetsika rhythmic hita nandritra ny fivoaran'ny cortical, na noho ny tsy fisian'ny karazana sela manakana ao amin'ny t-hCO. Toy izany koa, tsy fantatra mazava hoe hatraiza ny tsy fisian'ny lamination ao amin'ny t-hCO dia misy fiantraikany amin'ny fifandraisana rojo30. Ny asa ho avy dia hifantoka amin'ny fampidirana ireo karazana sela hafa toy ny microglia olombelona, ​​ny sela endothelial olombelona, ​​ary ny ampahany isan-karazany amin'ny interneuron GABAergic araka ny aseho amin'ny fampiasana ny fivoriambe 6 in vitro, ary koa ny fahatakarana ny fomba mety hitrangan'ny fampidirana sy ny fanodinana neural amin'ny t-hCO. transcriptional, synaptic ary fitondran-tena ao amin'ny sela azo avy amin'ny marary.
Amin'ny ankapobeny, ity sehatra in vivo ity dia maneho loharano mahery izay afaka mameno ny fivoaran'ny atidoha sy ny fikarohana aretina amin'ny vitro. Manantena izahay fa ity sehatra ity dia ahafahantsika mahita phenotypes amin'ny ambaratonga vaovao amin'ny sela tsy azo ihodivirana amin'ny marary ary manandrana paikady fitsaboana vaovao.
Namorona hCO2.5 avy amin'ny sela HiPS araka ny voalaza teo aloha izahay. Mba hanombohana ny famokarana hCO avy amin'ny sela hiPS novolavolaina tamin'ny sosona feeder, dia nesorina tamin'ny lovia kolontsaina ny kolontsain'ny sela hiPS tamin'ny alàlan'ny dispase (0.35 mg / mL) ary nafindra tany amin'ny kolontsaina plastika mipetaka ambany indrindra misy lovia miaraka amin'ny medium culture cell hiPS. (Corning) dia nampiana roa SMAD inhibitors dorsomorphine (5 μM; P5499, Sigma-Aldrich) ary SB-431542 (10 μM; 1614, Tocris) ary ROCK inhibitor Y-27632 (10 μM; S1049, Selleckchem). Nandritra ny andro 5 voalohany dia niova isan'andro ny medium cellule hiPS ary nampiana ny dorsomorphine sy SB-431542. Ny andro fahenina amin'ny fampiatoana, dia nafindra tany amin'ny media neural misy neurobasal-A (10888, Life Technologies) ny spheroid neural, fanampin'ny B-27 tsy misy vitamin A (12587, Life Technologies), GlutaMax (1: 100, Life Technologies), penicillin ary streptomycin (1: 100, Life Technologies); R & D Systems) sy fibroblast growth factor 2 (FGF2; 20 ng ml-1; R & D Systems) hatramin'ny andro 24. Avy amin'ny andro 25 ka hatramin'ny andro 42, ny medium dia nampiana neurotrophic azo avy amin'ny atidoha (BDNF; 20 ng ml−1, Peprotech) ary ny neurotrophin 3 (NT3; 20 ng ml hafa) isan'andro. Ny andro fahenina amin'ny fampiatoana, dia nafindra tany amin'ny media neural misy neurobasal-A (10888, Life Technologies) ny spheroid neural, fanampin'ny B-27 tsy misy vitamin A (12587, Life Technologies), GlutaMax (1: 100, Life Technologies), penicillin ary streptomycin (1: 100, Life Technologies); R & D Systems) sy fibroblast growth factor 2 (FGF2; 20 ng ml-1; R & D Systems) hatramin'ny andro 24. Avy amin'ny andro 25 ka hatramin'ny andro 42, ny medium dia nampiana neurotrophic azo avy amin'ny atidoha (BDNF; 20 ng ml−1, Peprotech) ary ny neurotrophin 3 (NT3; 20 ng ml hafa) isan'andro.Ny andro fahenina amin'ny fampiatoana, dia nafindra tany amin'ny media neural misy Neurobasal-A (10888, Life Technologies), B-27 supplement tsy misy vitamina A (12587, Life Technologies), GlutaMax (1: 100, Life Technologies), glutaMax (1: 100, Life Technologies), penicillin ny spheroid neural.и стрептомицин (1:100, Life Technologies) и дополнены эпидермальным фактором роста (EGF; 20 нг/мл; R&D Systems) ary фактором роста фиброб; R&D Systems) hatramin'ny 24-gо дня. ary streptomycin (1: 100, Life Technologies) ary ampiana amin'ny fitomboan'ny epidermis (EGF; 20 ng / ml; R&D Systems) sy ny fitomboan'ny fibroblast 2 (FGF2; 20 ng / ml; R&D Systems) hatramin'ny andro 24.Avy amin'ny andro 25 ka hatramin'ny 42, dia nampidirina tao amin'ny medium ny atidoha (BDNF; 20 ng ml-1, Peprotech) sy ny neurotrophin 3 (NT3; 20 ng ml-1, Peprotech), izay manova ny media isan'andro.在悬浮的第6 天，将神经球体转移到含有neurobasal-A（10888，Life Technologies）、不含维生素A 的B-27补充剂（12587，Life Technologies）、GlutaMax（1:100，Life Technologies）、青霉素的神经培养基中和链霉素（1:10（1:10 Technologies）并辅以表皮生长因子（EGF；20 ng ml-1；R&D Systems）和成纤维细胞生长因子2（FGF ngR-1；；20 Systems）直至第24 天。在 悬浮 的 第 第 6 天 将 神经 球体 转移 含有 含有 neurobasal-a （10888 ， Life Technologies） 不 含 索2补充剂 （12587 ， Life Technologies） Glutamax （1: 100 ， Life TechNOGIS青霉素 的 神经 培养 基 中 链霉素 （1（素 （1（素 （1（1: 1生长 因子 （（（20 ng ml-1 ； r & d Systems） 成 纤维 细胞 生长 2 （fgf2 ； 20 ng ml- 1; R&D SystemsＳ礴华Ｓ. На 6-й день суспензии нейросферы были переведены на добавку, содержащую нейробазал-А (10888, Life Technologies), доб-Вав7 А (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies), пенициллин- нейтрализованный стрептомицин (1:100, Life Technologies) с добавлением эпидермальакото (GF2; нг мл-1; Tamin'ny andro 6, ny fampiatoana ny neurosphere dia navadika ho fanampin-tsakafo misy neurobasal-A (10888, Life Technologies), B-27 supplement tsy misy vitamin A (12587, Life Technologies), GlutaMax (1: 100, Life Technologies), penicillin-neutralized streptomycin (1: 100, Life Technologies) manampy amin'ny fitomboan'ny epidermal ; R0; fibroblast growth factor 2 (FGF2; 20 ng ml-1) 1; R&D Systems) hatramin'ny 24-gо дня. R&D Systems) hatramin'ny andro 24.Avy amin'ny andro 25 ka hatramin'ny 42, ny singa neurotrophic avy amin'ny atidoha (BDNF; 20 ng ml-1, Peprotech) sy ny neurotrophic factor 3 (NT3; 20 ng ml-1, Peprotech) dia nampidirina tao amin'ny media kolontsaina isan'andro. Fiovana antonony indray mandeha.Nanomboka tamin'ny andro 43, ny hCO dia notazonina tao amin'ny neurobasal-A medium (NM; 1088022, Thermo Fisher) miaraka amin'ny fiovana antonony isaky ny 4-6 andro. Mba hahazoana hCO avy amin'ny sela hiPS kolontsaina amin'ny toe-javatra tsy misy sakafo, ny cellule hiPS dia natsipy tamin'ny Accutase (AT-104, Innovate Cell Technologies) tamin'ny 37 ° C nandritra ny 7 minitra, nisaraka tamin'ny sela tokana, ary nopetahana tamin'ny takelaka AggreWell 800 (34815, STEMCELL Technologies) amin'ny haavon'ny sela 3 × 106 amin'ny sela 3 × E86. Y-27632 (10 μM; S1049, Selleckchem). Taorian'ny 24 ora, ny haino aman-jery tao amin'ny fantsakana dia nopetahana niakatra sy midina tao amin'ny haino aman-jery misy media Essential 6 (A1516401, Life Technologies) nampiana dorsomorphine (2.5 μM; P5499, Sigma-Aldrich) ary SB-431542 (10 μM; 1614). , Tocrida). Avy amin'ny andro 2 ka hatramin'ny 6, ny medium Essential 6 dia nosoloina isan'andro amin'ny dorsomorphine ary manampy SB-431542. Hatramin'ny andro fahenina, ny fampiatoana ny neurosphere dia nafindra tany amin'ny media neurobasal ary notazonina araka ny voalaza etsy ambony.
Ny fomba fikarakarana biby rehetra dia natao araka ny torolàlana momba ny fikarakarana biby nankatoavin'ny Stanford University Laboratory Animal Care Administrative Committee (APLAC). Novidina (Charles River Laboratories) ny voalavo euthymic RNU (rnu/+) bevohoka. Notazonina nandritra ny adiny 12 ny tsingerina maizimaizina miaraka amin'ny sakafo sy rano ad libitum. Ny zana-boalavo miboridana (FOXN1–/–) telo ka hatramin'ny fito andro dia fantatra tamin'ny fitomboan'ny volombava tsy matotra talohan'ny famonoana. Ny puppies (lahy sy vavy) dia notsaboina tamin'ny 2-3% isoflurane ary napetraka teo amin'ny rafitra stereotaxic. Ny trepanation ny karandoha miaraka amin'ny savaivony eo ho eo amin'ny 2-3 mm eo ambonin'ny S1 dia natao raha mitazona ny fahamendrehan'ny dura mater. Avy eo dia ampiasao fanjaitra 30-G (eo amin'ny 0,3 mm eo ho eo) eo ivelan'ny craniotomy mba hanindrona ny dura. Apetaho amin'ny parafilm manify 3×3 sm avy eo ny HCO ary esory ny fitaovana be loatra. Amin'ny alalan'ny fampiasana syringe Hamilton mipetaka amin'ny fanjaitra 23 G, 45°, alaivo moramora ny hCO amin'ny faran'ny fanjaitra indrindra. Avy eo dia apetraho eo amin'ny paompy syringe mifandray amin'ny fitaovana stereotaxic ny syringe. Avy eo dia apetraho eo amin'ny lavaka fandrobana 0,3 mm ny sakany efa vita teo aloha ny tendron'ny fanjaitra (z = 0 mm) ary tery ny syringe 1-2 mm (z = -1,5 mm eo ho eo) mandra-pahatongan'ny fanjaitra eo anelanelan'ny dura mater A. misy tombo-kase matevina miforona. Avy eo, atsangano ny syringe ho eo afovoan'ny cortical surface amin'ny z = -0,5 mm ary tsindrona hCO amin'ny tahan'ny 1-2 µl isa-minitra. Rehefa vita ny tsindrona hCO, ny fanjaitra dia averina amin'ny tahan'ny 0.2-0.5 mm isa-minitra, ny hoditra dia manjaitra, ary ny puppy dia apetraka eo amin'ny pad fanafanana mafana mandra-pahasitrana tanteraka. Ny biby sasany dia nafindra amin'ny lafiny roa.
Ny fomba fikarakarana biby rehetra dia natao araka ny torolàlana momba ny fikarakarana biby nankatoavin'ny Stanford University APLAC. Ny voalavo (mihoatra ny 60 andro aorian'ny famindrana) dia nampidirina tamin'ny fanenjehana isoflurane 5% ary nalaina tamin'ny isoflurane 1-3% nandritra ny fakana sary. Ho an'ny sary, ny 7 Tesla mpikirakira borehole mitsivalana niaro mavitrika Bruker (Bruker Corp.) miaraka amin'ny gradient drive International Electric Company (IECO), insert gradient voaaro miaraka amin'ny savaivony anatiny 120 mm (600 mT / m, 1000 T / m / s) dia nampiasaina tamin'ny fampiasana AVANCE. III, valo-channel multi-coil RF sy fahaiza-manao multi-core, ary ny sehatra Paravision 6.0.1 miaraka aminy. Ny fandraketana dia natao tamin'ny alàlan'ny coil RF volumetric efa nopotehina mavitrika miaraka amin'ny savaivony anatiny 86 mm ary coil RF cryo-cooled efatra ho an'ny fandraisana ihany. Axial 2D Turbo-RARE (fotoana famerimberenana = 2500 ms, fotoana echo = 33 ms, salan'isa 2) miaraka amin'ny fisamborana 16 slices, hatevin'ny silaka 0.6-0.8 mm, misy santionany 256 × 256. Ny famantarana dia noraisina tamin'ny fampiasana coil RF volumetric transceiver quadrature misy savaivony anatiny 2 cm (Rapid MR International, LLC). Farany, ampiasao ny fiasa tombanana ambonin'ny Imaris (BitPlane) naorina ho an'ny famandrihana 3D sy famakafakana boky. Ny transplant iray mahomby dia nofaritana ho toy ny iray izay niforona ny faritra misy ny mari-pamantarana MRI misy lanjany T2 ao amin'ny hemisphere nafindra. Ny fandavana ny graft dia nofaritana ho toy ny grefy izay tsy namokatra faritra misy mari-pamantarana MRI misy lanjany T2 ao amin'ny hemisphere nafindra. Ny t-hCO subcortical dia nesorina tamin'ny fanadihadiana manaraka.
Mba hanehoana tsara ny GCaMP6s amin'ny hCO ho an'ny sary kalsioma roa-fotona, ny sela hiPS dia voan'ny pLV [Exp] -EF1a :: GcaMP6s-WPRE-Puro arahin'ny fifantenana antibiotika. Raha fohifohy, ny sela dia nisaraka tamin'ny EDTA ary naato tamin'ny 1 ml ny Essential 8 medium amin'ny hakitroky ny sela 300,000 eo ho eo eo anatrehan'ny polybrene (5 μg / ml) sy 15 μl ny viriosy. Avy eo dia natsofoka tamin'ny fampiatoana nandritra ny 60 minitra ireo sela ary nafafy tamin'ny hakitroky ny sela 50.000 isaky ny lavadrano. Taorian'ny fifandonana, ny sela dia notsaboina tamin'ny 5-10 μg ml-1 puromycin nandritra ny 5-10 andro na mandra-pisehoan'ny zanatany stable. Ny fihanaky ny hCO acute dia natao araka ny voalaza teo aloha 5 miaraka amin'ny fanovana sasany. Fohy ny andro 30-45 hCO 1,5 ml Eppendorf microcentrifuge fantsona misy 100 µl ny nerve medium. Avy eo dia esorina eo amin'ny 90 µl ny medium, 3-6 µl of high titer lentivirus (avy amin'ny 0.5 x 108 ka hatramin'ny 1.2 x 109) dia ampiana ao anaty fantsona, ary ny hCO dia nafindra tao amin'ny incubator mandritra ny 30 minitra. Avy eo dia ampio 90-100 µl medium ny fantsona tsirairay ary avereno ao amin'ny incubator mandritra ny alina ny fantsona. Ny ampitson'iny, afindrao ny hCO amin'ny media nerveuse vaovao amin'ny takelaka ambany. Rehefa afaka 7 andro, ny hCO dia nafindra tao amin'ny takelaka fitaratra 24-lavaka ambany ho an'ny fijerena sy fanombanana ny kalitaon'ny aretina. pLV[Exp]-SYN1::EYFP-WPRE sy pLV[Exp]-SYN1::hChR2-EYFP-WPRE dia novokarin'ny VectorBuilder. Ny lentivirus dia ampiasaina amin'ny ankamaroan'ny andrana satria tafiditra ao anatin'ny génome mpampiantrano izy io, mamela ny fanehoana ny fototarazo mpanao gazety amin'ny tsipika sela voan'ny aretina. Ho an'ny fanaraha-maso ny haromotana, ny andro 30-45 hCO dia voan'ny rabies-ΔG-eGFP sy AAV-DJ-EF1a-CVS-G-WPRE-pGHpA (plasmid #67528, Addgene), nosasana tsara nandritra ny 3 andro, ary nafindra tany amin'ny voalavo ao amin'ny S1 ary voatazona ao anatin'ny 7-1 andro.
Ho an'ny immunocytochemistry, ny biby dia nesorina sy nopotehina tamin'ny PBS ary narahin'ny 4% paraformaldehyde (PFA ao amin'ny PBS; Electron Microscopy Sciences). Ny ati-doha dia napetraka ao amin'ny 4% PFA mandritra ny 2 ora na mandritra ny alina amin'ny 4 ° C, cryopreserved amin'ny 30% sucrose ao amin'ny PBS mandritra ny 48-72 ora, ary tafiditra ao amin'ny 1: 1, 30% sucrose: OCT (Tissue-Tek OCT Compound 4583 , Sakura Finetek) ary natao tamin'ny fizarana coronal30sstat. Ho an'ny immunohistochemistry amin'ny fizarana matevina, ny biby dia nopotehina tamin'ny PBS, ary ny atidoha dia nesorina sy nizarazara tamin'ny coronally tamin'ny 300-400 µm tamin'ny fampiasana vibratome (Leica) ary ny fizarana dia napetraka tamin'ny 4% PFA nandritra ny 30 minitra. Avy eo ny cryosections na ny fizarana matevina dia nosasana tamin'ny PBS, nosakanana nandritra ny adiny 1 tamin'ny mari-pana amin'ny efitrano (10% serum ampondra mahazatra (NDS) ary 0,3% Triton X-100 voadio amin'ny PBS) ary nosakanana tamin'ny vahaolana fanakanana tamin'ny 4 ° C. - Incubation Cryosections dia natsipy nandritra ny alina ary ny faritra matevina dia natsipy nandritra ny 5 andro. Ny antibody voalohany nampiasaina dia: anti-NeuN (mouse, 1: 500; ab104224, abcam) anti-CTIP2 (rat, 1: 300; ab18465, abcam), anti-GFAP (bitro, 1: 1,000; Z0334, Dako), anti-GFP: 1, Tex, 1000, GTX, 1000, 18465 anti-HNA (mouse, 1:200; ab191181, abcam), anti-NeuN (bitro, 1:500; ABN78, Millipore), manohitra ny PDGFRA (bitro, 1:200; sc-338, Santa Cruz), anti-PPP1R17 (bitro, HPA0, Atlasbo1, 1:2008; anti-RECA-1 (mouse, 1:50; ab9774, abcam), anti-SCG2 (bitro, 1:100; 20357-1-AP, Proteintech), anti-SOX9 (osy, 1:500; AF3075, R&D Systems), Netrin G1A: 100; anti-STEM121 (mouse, 1:200; Y40410, Takara Bio), anti-SATB2 (mouse, 1:50; ab51502, abcam), anti-GAD65/67 (bitro, 1:400; ABN904, Millipore) ary anti-IBA1 (osy, ab57; ab57). Ny antibody voalohany nampiasaina dia: anti-NeuN (mouse, 1: 500; ab104224, abcam) anti-CTIP2 (rat, 1: 300; ab18465, abcam), anti-GFAP (bitro, 1: 1,000; Z0334, Dako), anti -GFP: 1, Tex, Gene, GTX 1000; anti-HNA (mouse, 1:200; ab191181, abcam), anti-NeuN (bitro, 1:500; ABN78, Millipore), manohitra ny PDGFRA (bitro, 1:200; sc-338, Santa Cruz), anti-PPP1R17 (bitro, HPA0, Atlasbo1, 1:2008; anti-RECA-1 (mouse, 1:50; ab9774, abcam), anti-SCG2 (bitro , 1:100; 20357-1-AP, Proteintech), anti-SOX9 (osy, 1:500; AF3075, R&D Systems), Netrin AF: 10,6; anti-STEM121 (mouse , 1:200; Y40410, Takara Bio), anti-SATB2 (mouse, 1:50; ab51502, abcam), anti-GAD65/67 (bitro, 1:400; ABN904, Millipore) ary anti-IBA1 :107; a107; a107; Использовались следующие первичные антитела: анти-NeuN (мышиные, 1:500; ab104224, abcam), анти-CTIP2 (крысиные, 5:1b, 6; анти-GFAP (кроличьи, 1:1000; Z0334, Dako), анти- -GFP (курица, 1:1000; GTX13970, GeneTex), анти-HNA (мышь, 1:200; ab191. 1:500; ABN78, Millipore), анти-PDGFRA (кролик, 1:200; sc-338, Санта-Круз), анти-PPP1R17 (кролик, 1:200; HPA047819, Atlas1; Antibodies 5; ab9774, abcam), анти-SCG2 (кролик , 1:100; 20357-1-AP, Proteintech), анти-SOX9 (козий, 1:500; AF3075, R&D Systems), нетрин G1a, нетрин G1a (козий, 1:500; AF3075, R&D Systems), нетрин G1a, &6; анти-STEM121 (мышиный , 1:200; Y40410, Takara Bio), анти-SATB2 (мышь, 1:50; ab51502, abcam), анти-GAD65/67 (кролик, 1:4040, 1:4040; Millipore; (коза, 1 :100; аб5076, абкам). Ny antibody voalohany nampiasaina dia: anti-NeuN (mouse, 1:500; ab104224, abcam), anti-CTIP2 (rat, 1:300; ab18465, abcam), anti-GFAP (bitro, 1:1000; Z0334, Dako), anti-GFP1009; anti-HNA (totozy, 1:200; ab191181, abcam), anti-NeuN (bitro, 1:500; ABN78, Millipore), anti-PDGFRA ( bitro, 1:200; sc-338, Santa Cruz), anti-PPP1R17 (bitro, HPA, 2478; HPA, 2478; HPA, 2478; anti-RECA-1 (mouse, 1:50; ab9774, abcam), anti- SCG2 (bitro, 1:100; 20357-1-AP, Proteintech), anti-SOX9 (osy, 1:500; AF3075, R&D Systems), netrin G1A: 100; R&D: 106; STEM121 (mouse, 1:200; Y40410, Takara Bio), anti-SATB2 (mouse, 1:50; ab51502, abcam), anti-GAD65/67 (bitro, 1:400; ABN904, Millipore) ary anti-IBA1 (osy, ab:10).使用的一抗是：抗NeuN（小鼠，1:500；ab104224，abcam）抗CTIP2（大鼠，1:3 00；ab18465，abcam），抗GFAP（兔，1:1,000；Z0334，Dako），抗-GF P（鸡，1:1,000；GTX13970，GeneTex），抗HNA（小鼠，1:200；ab1911 81，abcam），抗NeuN（兔，1:500；ABN78，Millipore），抗PDGFRA（兔， 1:200；sc-338，Santa Cruz），抗PPP1R17（兔，1:200；HPA047819，Atlas抗体），抗RECA-1（小鼠，1:50；ab9774，abcam），抗SCG2（兔） , 1:100；20357-1-AP，Proteintech），抗SOX9（山羊，1:500；AF3075，R&D Systems），Netrin G1a（山羊，1:100；AF1166，R&D Systems），抗STEM121（小鼠, 1:200;使用的一抗是：抗NeuN（小鼠，1:500；ab104224，abcam）抗CTIP2（大鼠，1 :300；ab18465，abcam），抗GFAP（兔，1:1,000；Z0334，Dako），抗-GFP（鸡，1:1,000；GTX13970，GeneTex），抗HNA（小鼠，1:200；ab191181，abcam），抗NeuN（兔，1:500；小鼠，1:200；ab191181，abcam），抗NeuN（兔，1:500；公re，77 200；sc-338，Santa Cruz），抗PPP1R17（兔，1:200；HPA047819，Atlas 抗体），抗RECA-1（小鼠，1:50；ab9774，ab9774，2 100；20357-1-AP，Proteintech），抗SOX9（山羊，1:500；AF3075，R&D Systems），Netrin G1a（山羊，1:100；AF1166，R&D1:Y40410, Takara Bio), anti-SATB2 (mouse, 1:50; ab51502, abcam), anti-GAD65/67 (bitro, 1:400; ABN904, Millipore) ary anti-IBA1 (osy, 1:100; ab5076, abcam).Ny antibody voalohany nampiasaina dia: anti-NeuN (mouse, 1: 500; ab104224, abcam), anti-CTIP2 (rat, 1: 300; ab18465, abcam), anti-GFAP (bitro, 1: 1000; Z0334, Dako). , anti-GFP (akoho, 1:1000; GTX13970, GeneTex), anti-HNA (mouse, 1:200; ab191181, abcam), anti-NeuN (bitro, 1:500; ABN78, Millipore), anti-PDGFRA ( bitro, 1:2308, Santa Cruz, 1:2308) (bitro, 1:200; HPA047819, antibody Atlas), anti-RECA-1 (mouse, 1:50; ab9774, abcam), anti- SCG2 (bitro), 1:100;20357-1-AP, Proteintech), анти-SOX9 (коза, 1:500; AF3075, R&D Systems), Нетрин G1a (коза, 1:100; AF1166, R&D Systems), анти -STEM121; анти-SATB2 (мышь, 1:50; ab51502, abcam), анти-GAD65/67 (кролик, 1:400; ABN904, Millipore) ary анти-IBA1 (коза, 1:100; аб5076, аб5076). 20357-1-AP, Proteintech), anti-SOX9 (osy, 1: 500; AF3075, R&D Systems), Netrin G1a (osy, 1:100; AF1166, R&D Systems), anti-STEM121 (mouse, 1:200; Tabakara Bio, 1:200; Y4044; ab51502, abcam), anti-GAD65/67 (bitro, 1:400; ABN904, Millipore), ary anti-IBA1 (osy, 1:100; ab5076, abkam).Ny fizarana dia nosasana tamin'ny PBS ary natsipy tamin'ny antibody faharoa mandritra ny adiny 1 amin'ny mari-pana amin'ny efitrano (fizarana mangatsiaka) na mandritra ny alina amin'ny 4 ° C (fizarana matevina). Alexa Fluor faharoa antibody (Life Technologies) nalevina 1:1000 tamin'ny vahaolana fanakanana no nampiasaina. Taorian'ny nanasany tamin'ny PBS, ny nuclei dia naseho tamin'ny Hoechst 33258 (Life Technologies). Farany, napetraka teo amin'ny mikraoskaopy misy coverlips (Fisher Scientific) ny slides amin'ny fampiasana Aquamount (Polysciences) ary nodinihina tamin'ny microscope fluorescent Keyence (BZ-X analyzer) na microscope confocal Leica TCS SP8 (Las-X) eo amin'ny sary. Ny sary dia nokarakaraina tamin'ny alàlan'ny programa ImageJ (Fiji). Mba hamaritana ny ampahany amin'ny neurons olombelona ao amin'ny t-hCO sy ny cortex voalavo, dia 387.5 μm ny sarin'ny mahitsizoro lehibe dia nalaina teo afovoan'ny t-hCO, na teo akaikin'ny sisin'ny cortex rat. Ny sisin'ny graft dia nofaritana tamin'ny fanombanana ny fiovan'ny mangarahara amin'ny sela, ny nuclei HNA +, ary / na ny fisian'ny autofluorescence tissue. Ao amin'ny sary tsirairay, ny totalin'ny sela NeuN+ sy HNA+ dia nozaraina tamin'ny fitambaran'ny sela NeuN+ ao amin'ny faritra iray ihany. Mba hahazoana antoka fa ny sela misy nokleary ao amin'ny fiaramanidina sary ihany no isaina, ny sela izay Hoechst+ ihany koa no tafiditra ao amin'ny kajy. Sary roa nosarahan'ny 1 mm fara-fahakeliny no natao salan'isa mba hampihenana ny fahadisoana ara-statistika.
Herinandro alohan'ny fanangonana santionany dia apetraho ao anaty efitrano maizina misy volombava voatetika ny biby fiompiana hCO (eo ho eo amin'ny 8 volana eo ho eo) ao anaty efitrano maizimaizina mba hampihenana ny fientanam-po. Ny fitokanana ny nuclei dia natao araka ny voalaza teo aloha, miaraka amin'ny fanovana sasany. Raha fohifohy, ny t-hCO sy ny hCO dia nopotehina tamin'ny alàlan'ny lysis cellule deterjen-mekanika sy ny 2 ml fitaratra fitaratra (D8938, Sigma-Aldrich / KIMBLE). Avy eo dia nosivanina tamin'ny alalan'ny sivana 40 µm ny nokleary crude ary notsivana tamin'ny 320 g nandritra ny 10 minitra tamin'ny 4 ° C alohan'ny hanaovana ny gradient sucrose. Taorian'ny dingana centrifugation (320 g ho an'ny 20 min amin'ny 4 ° C), ny santionany dia naverina tamin'ny 0.04% BSA / PBS miaraka amin'ny fanampiana 0.2 units µl-1 RNase inhibitor (40 u µl-1, AM2682, Ambion) ary nandalo tamin'ny sivana 40 µm. Avy eo dia naverina naverina tao amin'ny PBS misy 0.02% BSA ny nuclei disociated ary nampidirina tao amin'ny chip Chromium Single Cell 3′ (tombanana ho fanarenana ny sela 8,000 isaky ny lalana). Ny tranomboky snRNA-seq dia nomanina niaraka tamin'ny Chromium Single cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics). Ny tranomboky snRNA-seq dia nomanina niaraka tamin'ny Chromium Single cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics). Библиотеки snRNA-seq были приготовлены с помощью Chromium sela tokana 3′ GEM, Tranomboky & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics). Ny tranomboky snRNA-seq dia nomanina tamin'ny alàlan'ny Chromium Single cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics). snRNA-seq 文库是使用Chromium Single cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics) 制备的。 snRNA-seq 文库是使用Chromium Single cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics) 制备的。 Библиотеку snRNA-seq готовили с использованием Chromium Single Cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics). Ny tranomboky snRNA-seq dia nomanina tamin'ny alàlan'ny Chromium Single Cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics).Ny trano famakiam-boky avy amin'ny santionany samihafa dia navondrona sy nokarakarain'ny Admera Health tao amin'ny NovaSeq S4 (Illumina).
Ny haavon'ny fanehoana ny fototarazo ho an'ny kaody nokleary nokleary tsirairay dia nofaritana tamin'ny fampiasana ny fonosana rindrambaiko fanadihadiana 10x Genomics CellRanger (version 6.1.2). Amin'ny ankapobeny, ny vakiteny dia nifanaraka tamin'ny fitambaran'ny olombelona (GRCh38, Ensemble, version 98) sy rat (Rnor_6.0, Ensemble, version 100) noforonina miaraka amin'ny baiko mkref ary mampiasa isa miaraka amin'ny baiko -include-introns=TRUE amin'ny fanisana dia ahitana ny famakiana sarintany amin'ny faritra intron. Ho an'ny santionan'ny t-hCO, ny nokleary olombelona dia fantatra noho ny fepetra takian'ny mpandala ny nentin-drazana fa farafaharatsiny 95% amin'ny famakiana sarintany rehetra dia mifanandrify amin'ny fototarazo olombelona. Ny famakafakana manaraka rehetra dia natao tamin'ny famoahana barcode array voasivana avy amin'ny CellRanger amin'ny fampiasana ny fonosana R (version 4.1.2) Seurat (version 4.1.1)32.
Mba hahazoana antoka fa ny nokleary avo lenta ihany no tafiditra ao amin'ny famakafakana manaraka, dia nisy dingana fanivanana iterative ho an'ny santionany tsirairay. Voalohany, ny nokleary ambany kalitao miaraka amin'ny fototarazo tsy manam-paharoa 1000 hita ary mihoatra ny 20% amin'ny mitochondria manontolo no fantatra sy nesorina. Taorian'izay, ny matriks ny nomeraon'ny fototarazo manta dia natao ara-dalàna tamin'ny alàlan'ny regression binomial négatif mahazatra amin'ny fampiasana ny sctransform(vst.flavor = "v2″), izay nanondro ihany koa ny fototarazo miovaova 3000 indrindra amin'ny alàlan'ny parameter default. Ny fanaraha-maso ny tranokalan'ny lohalika ary ampiasaina amin'ny santionany rehetra sy ny famakafakana an'ny tarika). (midika ny isa DoubletFinder eo ambonin'ny 95 isan-jato) ny santionany t-hCO (n=3) sy ny santionany hCO (n=3) dia nampidirina misaraka amin'ny fampiasana ny IntegrateData miaraka amin'ireo masontsivana etsy ambony.
Rehefa avy nesorina ireo voany ambany kalitao dia navondrona (famaha = 0.5) ny angon-drakitra nampidirina ary nampidirina ho an'ny tanjona fijerena UMAP34. Ny fototarazon'ny marika ho an'ny kluster tsirairay dia nofaritana tamin'ny fampiasana ny asa FindMarkers miaraka amin'ny mari-pamantarana default kajy avy amin'ny angon-drakitra fanehoana fototarazo mahazatra. Mamantatra sy manasokajy ny kilasin'ny sela lehibe izahay amin'ny fampifangaroana ny angon-drakitra momba ny cortical cortical foetal sy olon-dehibe miaraka amin'ny fanehoana fototarazo marika 19,20,21,35 sy ny fanamarihana. Indrindra indrindra, ireo mpialoha lalana mivezivezy dia fantatra amin'ny alàlan'ny fanehoana MKI67 sy TOP2A. Ny clusters progenitor dia nofaritana tamin'ny tsy fisian'ny transcript mitotic, mifanipaka avo miaraka amin'ny cluster progenitor glial multipotent voalaza ao amin'ny cortex fetal metaphase farany, ary ny fanehoana EGFR sy OLIG1. Ampiasainay ny teny hoe astrocyte mba hamaritana ny toetry ny fahasamihafan'ny astrocyte, manomboka amin'ny glia radial tara ka hatramin'ny fahamatoran'ny astrocytes. Ny clusters astrocyte dia maneho ny haavon'ny SLC1A3 sy AQP4 avo lenta ary aseho amin'ny sarintany miaraka amin'ny karazana glia radial foetal sy / na astrocytes olon-dehibe. Ny OPCs dia maneho ny PDGFRA sy SOX10 raha ny oligodendrocytes dia maneho ny marika myelination (MOG sy MYRF). Ny neuron glutamatergic dia fantatra amin'ny fisian'ny transcript neuronal (SYT1 sy SNAP25), ny tsy fisian'ny marika GABAergic (GAD2), ary ny fanehoana ny NEUROD6, SLC17A7, BCL11B, na SATB2. Ny neurons GluN dia nozaraina ho ambony (SATB2 expression sy fahaverezan'ny BCL11B) ary lalina (BCL11B expression). Ny neurons Putative subplate (SP) dia maneho marika SP18 fantatra toy ny ST18 sy SORCS1 ankoatry ny marika GluN lalina. Ny sela toy ny choroid plexus dia fantatra tamin'ny fanehoana TTR, ary ny sela meningeal dia naneho ny fototarazo mifandraika amin'ny fibroblast ary ny sela pial / vascular an'ny tahirin-kevitra momba ny angona.
Ny famakafakana tsy mitovy amin'ny fanehoana fototarazo eo anelanelan'ny t-hCO sy ny hCO subclasses dia natao tamin'ny fampiasana fomba fiasa pseudo-batch vao novolavolaina tamin'ny santionany nampiharina tamin'ny alàlan'ny fonosana Libra R (version 1.0.0). Amin'ny ankapobeny, ny fitsapana mety ho an'ny log-edgeR (version 3.36.0, fonosana R) dia natao ho an'ny vondrona amin'ny famintinana ny isan'ny fototarazo ao amin'ny sela ho an'ny kilasin'ny sela iray ho an'ny replication santionany tsirairay. Ho an'ny fijerena sarintany mafana, ny sandan'ny normalized per million (CPM) dia kajy amin'ny fampiasana edgeR (cpm() function) ary ampitomboina (mba hahatratrarana ny mean = 0, standard deviation = 1). Ny famakafakana fampitomboana ny Gene Ontology (GO) momba ny fototarazo t-hCO GluN dia natao (Benjamini-Hochberg dia nanitsy ny sanda P latsaky ny 0.05 izay voalaza ao amin'ny 10% farafahakeliny amin'ny sela t-hCO GluN ary ny fitomboan'ny fiovan'ny fiovan'ny in-2 farafahakeliny). natao tamin'ny fampiasana ToppGene Suite (https://toppgene.cchmc.org/)37. Mampiasa ny fampiharana ToppFun izahay miaraka amin'ny mari-pamantarana mahazatra ary mitatitra ny sanda P-nahitsy an'i Benjamini-Hochberg izay kajy avy amin'ny fitsapana hypergeometric GO-annotated.
Mba hifanaraka amin'ny clusters snRNA-seq miaraka amin'ny clusters cellule misy annotated avy amin'ny fanadihadiana momba ny RNA-seq tokana tokana na olon-dehibe snRNA-seq19,20,21,22, dia nampiharina ny fomba fampidirana ny datasets. Nampiasa ny fizotran'ny normalization SCTransform (v2) tao Seurat izahay mba hampidirana sy hampitahana ny fifandimbiasan'ny kluster eo amin'ny angon-drakitra (mampiasa ny mari-pamantarana mitovy amin'ny etsy ambony). Ny angon-drakitra tsirairay dia nosoloina an-kisendrasendra hatramin'ny sela 500 na cores isaky ny cluster voalohany ho an'ny fahombiazan'ny kajy. Amin'ny fampiasana fomba fiasa mitovy amin'ny voalaza teo aloha, ny fifandimbiasan'ny kluster dia nofaritana ho ny isan'ny sela na ny nuclei ao amin'ny cluster tsirairay mitambatra izay mifanindry amin'ny mari-pamantarana ny cluster reference. Mba hanasokajiana bebe kokoa ny GluNs, dia nampiasa Seurat's TransferData workflow ho an'ny angon-drakitra subset GluN mba hanendry etikety references amin'ny sela GluN.
Mba hanombanana ny toetry ny fahamatorana amin'ny transcriptome eran-tany amin'ny santionany t-hCO sy hCO, dia nampitahainay ny santionany pseudo-bulk miaraka amin'ny BrainSpan / psychENCODE23, izay misy ny filaharan'ny RNA lehibe amin'ny fivoaran'ny atidohan'olombelona. Nanao PCA izahay tamin'ny matrice fanehoana générique mitambatra avy amin'ny santionany cortical 10 herinandro taorian'ny fiterahana ary taty aoriana, tao amin'ny fototarazo 5567 (miaraka amin'ny angon-drakitray) izay fantatra teo aloha fa mavitrika ao amin'ny santionany cortical BrainSpan (nofaritana ho lehibe kokoa noho ny 50% amin'ny fiovan'ny fivoarana nohazavaina amin'ny taona mampiasa modely cubic)38. Ho fanampin'izany, dia nahazo fototarazo mifandray amin'ny sonia transcriptome lehibe momba ny neurodevelopment izahay amin'ny fampiasana faktiora matrix tsy negative araka ny voalaza teo aloha. Ny lanjan'ny santionany kajy amin'ny fampiasana ny fomba faktiora matrix tsy negative dia aseho amin'ny sary. 5b miaraka amin'ny angon-drakitra miitatra ho an'ny tsirairay amin'ireo sonia dimy nofaritan'i Zhu et al.38. Averina indray, ny marika transcriptional miankina amin'ny asa dia avy amin'ny fanadihadiana navoaka teo aloha. Indrindra indrindra, ny ERG sy ny LRG dia nitombo be dia be tao amin'ny neurons glutamatergic fantatra amin'ny alàlan'ny fanangonana cortex visual snRNA-seq taorian'ny fanentanana hita maso avy amin'ny tabilao fanampiny 3 Hrvatin et al.16. Ny LRG manankarena olombelona dia azo avy amin'ny kolontsain'ny atidohan'ny foetus KCl ary nanangona ora 6 taorian'ny fanentanana, ary ny fototarazo voasivana dia nitombo be tamin'ny olombelona fa tsy tamin'ny biby mpikiky (Tabilao fanampiny 4). Ny famakafakana ny fampitomboana ny fitambaran'ny fototarazo amin'ny fampiasana ireo andiana fototarazo ireo dia natao tamin'ny alàlan'ny fitsapana tokana nataon'i Fisher.
Anesthesie voalavo miaraka amin'ny isoflurane, esory ny atidoha ary apetraho amin'ny mangatsiaka (4°C eo ho eo) oksizenina (95% O2 sy 5% CO2) vahaolana sucrose ho an'ny fizarana misy: 234 mM sucrose, 11 mM glucose, 26 mM NaHCO3, 2.5 mM KCl, 1.25 mM. NaH2PO4, 10 mM MgSO4 ary 0,5 mM CaCl2 (manodidina ny 310 mOsm). Ny fizarana coronal ati-doha (300-400 µm) misy t-hCO dia natao tamin'ny fampiasana vibratome Leica VT1200 araka ny voalaza teo aloha39. Ny fizarana dia nafindra tany amin'ny efitrano fizarana miaraka amin'ny oxygenation mari-pana ao amin'ny efitrano misy aCSF voaomana avy amin'ny: glucose 10 mM, 26 mM NaHCO3, 2.5 mM KCl, 1.25 mM NaHPO4, 1 mM MgSO4, 2 mM CaCl2 ary 126 mM NaCl (298 mO). fara fahakeliny 45 minitra alohan'ny fandraisam-peo. Ny fizarana dia voarakitra ao amin'ny efitrano asitrika izay tsy mitsaha-mitombo amin'ny aCSF (95% O2 sy 5% CO2 vial). Ny angon-drakitra rehetra dia voarakitra amin'ny mari-pana amin'ny efitrano. Ny neurons t-hCO dia tapaka tamin'ny pipette fitaratra borosilicate feno vahaolana misy 127 mM potassium gluconate, 8 mM NaCl, 4 mM magnesium ATP, 0.3 mM sodium GTP, 10 mM HEPES, ary 0.6 mM EGTA, pH 7.2, vahaolana anatiny adjusted amin'ny KOH290 m290. Mba hamerenana indray dia nampiana biocytin (0.2%) ny vahaolana firaketana.
Ny angona dia azo tamin'ny alalan'ny MultiClamp 700B amplifier (Molecular Devices) sy Digidata 1550B digitizer (Molecular Devices), ambany-pass voasivana amin'ny 2 kHz, nomerika amin'ny 20 kHz, ary nodinihina tamin'ny fampiasana Clampfit (Molecular Devices), Origin (OriginPro). 2021b, OriginLab). ary ny fiasa MATLAB mahazatra (Mathworks). Nokajiana tamin'ny alalan'ny JPCalc ny tanjaky ny fihaonan-dalana ary novaina tamin'ny sandan'ny kajy -14 mV ny fidirana. Operation IV dia ahitana andiana dingana amin'izao fotoana izao amin'ny dingana 10-25 pA, manomboka amin'ny -250 ka hatramin'ny 750 pA.
Ny thalamus, ny fotsy, ary ny S1 afferents dia namporisika elektrika tamin'ny silaka thalamocortical nandritra ny firaketana patch-clamp ny neurons hCO, araka ny voalaza teo aloha. Fohy, napetraka teo amin'ny latabatra fanontam-pirinty 3D mitongilana amin'ny zoro 10 ° ny atidoha, ary tapaka amin'ny zoro 35 ° ny anoloan'ny atidoha. Nopetahana teo amin'ilay faritra voatapaka ny ati-doha ary nozaraina, nitahiry ireo axons mipoitra ny thalamocortical. Ny electrodes tungstène bipolar (0.5 MΩ) dia napetraka amin'ny micromanipulator faharoa ary napetraka amin'ny toerana stratejika hanentanana faritra efatra isaky ny sela (kapsola anatiny, zavatra fotsy, S1 ary hCO). Raketo ny valin'ny synaptic taorian'ny fanentanana phasic 300 μA amin'ny 0.03-0.1 Hz.
Ny hChR2-milaza ny hCO neurons dia navitrika tao amin'ny 480 nm ary ny pulses maivana novokarin'ny LED (Prizmatix) dia nampiharina tamin'ny tanjona × 40 (0.9 NA; Olympus) mba handrakitra ny fitenenana hChR2 akaikin'ny sela. Manodidina ny 0,5 mm eo ho eo ny savaivony eny an-tsaha mazava ary 10-20 mW ny totaliny. Ny sakan'ny pulse dia napetraka ho 10 ms, izay mifanaraka amin'ny pulse nomena nandritra ny fanandramana fianarana fitondran-tena. Fampidirana isan-karazany no nampiasaina, avy amin'ny 1 ka hatramin'ny 20 Hz, fa ny pulse voalohany amin'ny andian-dahatsoratra ihany no nampiasaina mba hamaritana. Ny elanelam-potoana eo anelanelan'ny lamasinina dia matetika mihoatra ny 30 s mba hampihenana ny fiantraikan'ny fisakanana synaptic na lalana manamora. Mba hitsapana raha monosynaptic ny valin'ny hChR2, dia nampihatra TTX (1 μM) tamin'ny fandroana izahay mandra-panjavona ny fihetsiky ny EPSC, ary avy eo dia nampihatra 4-aminopyridine (4-AP; 100 μM). Amin'ny ankapobeny, misy valiny averina ao anatin'ny minitra vitsy, miaraka amin'ny fahatarana kely kokoa eo anelanelan'ny tifitra LED sy ny famokarana EPSC. Ny NBQX (10 μM) dia nampiasaina hitsapana raha entin'ny mpandray AMPA ny valiny.
Ny fizarana hCO maranitra dia noforonina araka ny voalaza teo aloha. Raha fohifohy, ny fizarana hCO dia napetraka tao amin'ny agarose 4% ary nafindra tany amin'ny sela misy 126 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM NaH2PO4, 1 mM MgSO4, 2 mM CaCl2, 26 mM NaHCO3 ary 10 mM d-(+) -glucose ao amin'ny Fizarana 2-0-glucose. µm amin'ny mari-pana amin'ny efitrano mampiasa vibrator Leica VT1200 ary voatahiry ao amin'ny ASF amin'ny mari-pana. Avy eo, natao tamin'ny fizarana hCO eo ambanin'ny mikraoskaopy SliceScope mivantana (Scientifica) ny firaketana an-tsoratra ny sela manontolo. Ny fizarana dia nopotehina tamin'ny aCSF (95% O2 sy 5% CO2) ary ny mari-pamantarana sela dia voarakitra amin'ny mari-pana. Ny neurons hCO dia nampiharina tamin'ny fampiasana pipette fitaratra borosilicate feno vahaolana misy 127 mM potassium gluconate, 8 mM NaCl, 4 mM magnesium ATP, 0.3 mM sodium GTP, 10 mM HEPES, ary 0.6 mM EGTA, anatiny pH 7, 2, namboarina miaraka amin'ny KOH (osmolarity). Ho an'ny tanjona fanarenana, ampio 0,2% Biocytin ny vahaolana anatiny.
Clampex (Clampex 11.1, Molecular Devices) no nahazoan'ny angon-drakitra tamin'ny alàlan'ny fanamafisam-peo MultiClamp 700B (Molecular Devices) ary ny Digidata 1550B digitizer (Molecular Devices), ambany-pass voasivana amin'ny 2 kHz, nomerika amin'ny 20 kHz, ary nodinihina amin'ny fampiasana fitaovana Clampfit (version 10 MAT). (MATLAB 2019b, Mathworks). Ny tanjaky ny fifandraisana dia nokajiana tamin'ny JPCalc ary ny fidirana dia novaina tamin'ny tanjaky ny fifandraisana -14 mV. Ny Operation IV dia misy andiana dingana amin'izao fotoana izao amin'ny dingana 5-10 pA manomboka amin'ny -50 ka hatramin'ny 250 pA.
Ho an'ny fananganana morphologique ny neurons voapoizina, 0.2% biocytin (Sigma-Aldrich) dia nampiana ny vahaolana anatiny. Ny sela dia voaomana mandritra ny 15 minitra farafahakeliny aorian'ny hacking. Atsofohy tsikelikely mandritra ny 1-2 minitra ny pipette mandra-pifehezana tanteraka ny membrane voasoratra. Taorian'ny fizotry ny fizika fizarana, ny fizarana dia napetraka mandritra ny alina amin'ny 4 ° C. ao amin'ny 4% PFA, nosasana tamin'ny PBS X3, ary natsofoka 1: 1000 miaraka amin'ny DyLight 549 na DyLight 405 (Vector Labs) streptavidin-conjugated. Ny sela feno biocytin (2%; Sigma-Aldrich) dia nofaritana nandritra ny fandraketana fametahana fametahana amin'ny mari-pana mandritra ny 2 ora. Avy eo dia napetaka tamin'ny slide microscopie ireo fizarana ireo tamin'ny alàlan'ny Aquamount (Thermo Scientific) ary naseho ny ampitson'iny tamin'ny microscope confocal Leica TCS SP8 tamin'ny fampiasana tanjona asitrika menaka miaraka amin'ny aperture numeric × 40 1.3, magnification × 0.9-1.0, xy. Ny tahan'ny sampling dia manodidina ny 7 pixel isaky ny micron. Ny Z-stacks amin'ny elanelana 1 µm dia azo serial, ary ny mosaika z-stack sy ny auto-stitching mifototra amin'ny Leica dia natao mba handrakofana ny hazo dendritika manontolo amin'ny neuron tsirairay. Ny neurons dia narahina semi-manual tamin'ny fampiasana ny interface neuTube 40 ary ny rakitra SWC dia novokarina. Nalefa tao amin'ny plugin SimpleNeuriteTracer41 Fiji ireo rakitra avy eo (ImageJ, version 2.1.0; NIH).
Ny vatan'ny cortical olombelona dia azo tamin'ny alàlan'ny fanekena araka ny protocola nankatoavin'ny Institutional Review Board of Stanford University. Santionany roa amin'ny vatan'olombelona aorian'ny fiterahana (3 sy 18 taona) dia azo tamin'ny fanesorana ny cortex frontal (gyrus frontal afovoany) ho ampahany amin'ny fandidiana ny epilepsy refractory. Aorian'ny fandidiana dia alaivo ny tavy amin'ny NMDG-aCSF mangatsiaka misy: 92 mM NMDG, 2.5 mM KCl, 1.25 mM NaH2PO4, 30 mM NaHCO3, 20 mM HEPES, 25 mM glucose, 2 mM thiourea as3 mM, sodium as3 mMru 0,5 mM CaCl2 4H2O sy 10 mM MgSO4 7H2O. Titrate amin'ny pH 7.3-7.4 miaraka amin'ny asidra hydrochloric. Naterina tao amin'ny laboratoara tao anatin'ny 30 minitra ny tavy ary nalaina ny fizarana coronal araka ny fomba voalaza etsy ambony.
Ny fomba fikarakarana biby rehetra dia natao araka ny torolàlana momba ny fikarakarana biby nankatoavin'ny Stanford University APLAC. Ny voalavo (mihoatra ny 140 andro aorian'ny famindrana) dia nampidirina tamin'ny fanenjehana isoflurane 5% ary nalaina tamin'ny 1-3% isoflurane intraoperatively. Ny biby dia napetraka tao amin'ny rafitra stereotaxic (Kopf) ary ny buprenorphine famotsorana maharitra (SR) dia natsindrona subcutaneously. Apetaho ny karandoha, diovina ary ampidirina ny visy taolana 3-5. Mba hikendry ny t-hCO, dia namorona koordinate stereotaxic avy amin'ny sary MRI izahay. Nisy lavaka bory iray nalaina teo amin'ny toerana mahaliana ary ny fibre (400 µm savaivony, NA 0.48, Doric) dia nampidinina 100 µm ambanin'ny hCO ary napetaka tamin'ny karandoha tamin'ny simenitra nify UV (Relyx).
Ny firaketana fibre photometric dia natao araka ny voalaza teo aloha42. Mba hanoratana ny hetsika ho azy, dia napetraka tao anaty tranom-borona madio ny voalavo ary ny tariby fibre optic patch (Doric) 400 µm savaivony mifandray amin'ny rafitra fakana angon-drakitra fibre optique photometric dia nampifandraisina tamin'ny tariby fibre optic nambolena. Nandritra ny firaketana an-tsoratra nandritra ny 10 minitra ny fihetsiketsehan'ny môtô dia nalalaka nijery ny tranom-borona ireo biby. Ho an'ny firaketana an-tsoratra ny hetsika navoaka, ny voalavo (mihoatra ny 140 andro taorian'ny famindrana) dia nodiovina tamin'ny 5% isoflurane ho an'ny induction ary 1-3% isoflurane ho an'ny fikojakojana. Apetraho ao anaty rafitra stereotactic (Kopf) ny biby ary ny volombava eo amin'ny lafiny mifanohitra amin'ny t-hCO dia tetehina amin'ny 2 sm eo ho eo ary mandalo amin'ny harato mifandray amin'ny piezoelectric actuator (PI). Ny tariby fibre optic patch 400 µm (Doric) dia nifandray tamin'ny fibre nambolena ary nifandray tamin'ny rafitra fanangonana data. Ny volombava eo amin'ny ilany mifanohitra amin'ny t-hCO dia navadika in-50 (2 mm amin'ny 20 Hz, 2 s isaky ny fampisehoana) amin'ny fotoana kisendrasendra amin'ny alàlan'ny fiara piezoelectric mandritra ny fe-potoana 20 minitra. Ampiasao ny Arduino MATLAB Support Package mba hifehezana ny fotoana fiviliana amin'ny kaody MATLAB mahazatra. Ny zava-mitranga dia ampifandraisina amin'ny rindrambaiko fanangonana angon-drakitra amin'ny alàlan'ny pulses transistor-transistor logic (TTL).
Ny voalavo (mihoatra ny 140 andro aorian'ny famindrana) dia nampidirina tamin'ny fanenjehana isoflurane 5% ary nalaina tamin'ny 1-3% isoflurane intraoperatively. Ny biby dia napetraka tao amin'ny rafitra stereotaxic (Kopf) ary ny buprenorphine SR sy ny dexamethasone dia natsindrona subcutaneously. Apetaho ny karandoha, diovina ary ampidirina ny visy taolana 3-5. Mba hikendry ny t-hCO, dia namorona koordinate stereotaxic avy amin'ny sary MRI izahay. Ny craniotomy boribory (eo amin'ny 1 cm eo ho eo amin'ny savaivony) dia natao tamin'ny fandavahana haingam-pandeha mivantana teo ambonin'ny hCO nafindra. Raha vantany vao manify araka izay azo atao ny taolana, fa alohan'ny handavaka ny taolana manontolo, dia ampiasao forceps hanesorana ny kapila pelvic sisa tavela mba hampisehoana ny t-hCO. Nofenoina saline sterile ilay craniotomy, ary nasiana coupe sy tsipika manokana tamin'ny lohany tamin'ny simenitra nify UV (Relyx).
Ny sary an-tsary roa dia natao tamin'ny fampiasana mikraoskaopy Bruker multiphoton miaraka amin'ny tanjona Nikon LWD (× 16, 0.8 NA). Ny sary GCaMP6 dia natao tamin'ny 920 nm miaraka amin'ny 1.4x single z-plane magnification ary 8x eo ho eo amin'ny 7.5 fps. Ny voalavo dia nampidirina tamin'ny fanenjehana isoflurane 5% ary notazonina tamin'ny isoflurane 1-3%. Ny voalavo dia napetraka tao amin'ny lohan-doha natao manokana ary napetraka teo ambanin'ny family. Naharitra 3 minitra ny firaketana an-tsoratra momba ny hetsika maotera. Nandritra ny 20 minitra fandraketana, 50 puffs (ny famelabelarana tsirairay dia 100 ms ny halavany) dia naterina kisendrasendra tao amin'ny pad whisker mifanohitra amin'ny t-hCO amin'ny fampiasana picospricer. Ampiasao ny Arduino MATLAB Support Package mba hifehezana ny fotoana vaky amin'ny kaody MATLAB mahazatra. Ampifanaraho amin'ny rindrambaiko fakana data (PrairieView 5.5) amin'ny alàlan'ny pulses TTL. Ho famakafakana, nahitsy ho an'ny xy motion ireo sary tamin'ny fampiasana fanitsiana affine tao amin'ny programa MoCo natomboka tao Fiji. Ny fitrandrahana ny dian'ny fluorescent avy amin'ny sela tsirairay mampiasa CNMF-E43. Ny fluorescence dia nalaina ho an'ny faritra tsirairay mahaliana, niova ho dF / F curve, ary avy eo navadika ho z-scores.
Ny voalavo (mihoatra ny 140 andro aorian'ny famindrana) dia nampidirina tamin'ny fanenjehana isoflurane 5% ary nalaina tamin'ny 1-3% isoflurane intraoperatively. Ny biby dia napetraka tao amin'ny rafitra stereotaxic (Kopf) ary ny buprenorphine SR sy ny dexamethasone dia natsindrona subcutaneously. Ny volombava teo amin'ny lafiny mifanohitra amin'ny t-hCO dia notapatapahina teo amin'ny 2 sm teo ho eo ary napetaka tamin'ny alàlan'ny harato mifandray amin'ny actuator piezoelectric. Aseho sy diovina ny karandoha. Visy vy tsy misy vy mipetaka amin'ny karandohany. Mba hikendry ny t-hCO, dia namorona koordinate stereotaxic avy amin'ny sary MRI izahay. Manaova craniotomy boribory (eo amin'ny 1 sm eo ho eo amin'ny savaivony) miaraka amin'ny fandavahana haingana eo ambonin'ny t-hCO. Raha vantany vao manify araka izay azo atao ny taolana, fa alohan'ny handavaka ny taolana manontolo, dia ampiasao forceps hanesorana ny kapila pelvic sisa tavela mba hampisehoana ny t-hCO. Ny sela tsirairay dia voarakitra amin'ny fampiasana 32-channel na 64-channel high-density silisiôma probes (Cambridge Neurotech) miorina amin'ny visy ary efa nohamafisina tamin'ny RHD amplifier (Intan). Ampiasao ny manipulator hampidina ny electrodes amin'ny toerana lasibatra amin'ny alàlan'ny craniotomy, izay feno sira sterile. Ny fanangonana angon-drakitra dia natao tamin'ny fatran'ny 30 kHz tamin'ny fampiasana ny rafitra fanangonana data Open Ephys. Ny firaketana an-tsoratra dia nitohy ihany rehefa hitanay fa misy ifandraisany amin'ny rhythmic hetsika mandeha ho azy ao amin'ny fantsona 10 mahery, izay nanoro hevitra fa ny electrodes dia hita ao amin'ny grefy (mifototra amin'ny angon-drakitra kalsioma roa-photon). Naharitra 10 minitra ny firaketana an-tsoratra momba ny fiasan'ny motera. Ny volombava eo amin'ny ilany mifanohitra amin'ny t-hCO dia navadika in-50 (2 mm amin'ny 20 Hz, 2 s isaky ny fampisehoana) amin'ny fotoana kisendrasendra amin'ny alàlan'ny fiara piezoelectric mandritra ny fe-potoana 20 minitra. Mampiasa ny MATLAB Support Package ho an'ny Arduino (MATLAB 2019b), mifehy ny fotoana fiviliana amin'ny kaody MATLAB mahazatra. Mampiasà pulses TTL mba hampifanaraka ny hetsika amin'ny rindrambaiko fanangonana angona.
Ho an'ny fanandramana marika optique, ny tady patch optika 200 µm (Doric) mifandray amin'ny laser 473 nm (Omicron) dia mifandray amin'ny fibre optika 200 µm napetraka eo ambonin'ny craniotomy. Avy hatrany alohan'izany, ampifanaraho amin'ny 20 mW ny herin'ny jumper. Ampiasao ny manipulator hampidina ny electrodes amin'ny toerana lasibatra amin'ny alàlan'ny craniotomy, izay feno sira sterile. Tany am-piandohan'ny fandraketana dia navoaka ny pulso folo amin'ny hazavana 473 nm (frequency 2 Hz, faharetan'ny pulse 10 ms). Ny sela photosensitive dia nofaritana ho sela izay naneho valiny spike tao anatin'ny hazavana 10 ms amin'ny 70% na mihoatra ny fitsapana.