תודה שביקרתם באתר Nature.com. אתם משתמשים בגרסת דפדפן עם תמיכה מוגבלת ב-CSS. לחוויית המשתמש הטובה ביותר, אנו ממליצים להשתמש בדפדפן מעודכן (או להשבית את מצב התאימות ב-Internet Explorer). בנוסף, כדי להבטיח תמיכה מתמשכת, אנו מציגים את האתר ללא סגנונות ו-JavaScript.
מציג קרוסלה של שלוש שקופיות בו זמנית. השתמשו בכפתורים הקודם והבא כדי לעבור בין שלוש שקופיות בו זמנית, או השתמשו בכפתורי המחוון בסוף כדי לעבור בין שלוש שקופיות בו זמנית.
אברונים עצביים בעלי הרכבה עצמית מייצגים פלטפורמה מבטיחה in vitro למידול התפתחות ומחלות אנושיות. עם זאת, לאורגנואידים חסרה הקישוריות הקיימת in vivo, דבר המגביל את ההתבגרות ומונע אינטגרציה עם מעגלים אחרים השולטים בהתנהגות. כאן אנו מראים שאורגנואידים קורטיקליים שמקורם בתאי גזע אנושיים המושתלים לקליפת המוח הסומטו-סנסורית של חולדות עירומות יילודות מפתחים סוגי תאים בוגרים המשתלבים במעגלים חושיים ומוטיבציוניים. MRI גילה גדילה של אורגנואידים לאחר השתלה במספר שורות תאי גזע ובעלי חיים, בעוד שניתוח ליבה יחידה גילה התקדמות של קורטיקוגנזה והופעת תוכנית שעתוק תלוית פעילות. ואכן, נוירונים קורטיקליים מושתלים מציגים תכונות מורפולוגיות, סינפטיות וממברנה פנימית מורכבות יותר מאשר עמיתיהם in vitro, מה שמאפשר זיהוי של פגמים עצביים בחולים עם תסמונת טימותי. מעקב אנטומי ותפקודי הראה שאברונים מושתלים מקבלים קלטים תלמוקורטיקליים וקורטיקוקורטיקליים, והקלטות in vivo של פעילות עצבית מצביעות על כך שקלטים אלה יכולים לייצר תגובות חושיות בתאים אנושיים. לבסוף, אורגנואידים קורטיקליים מרחיבים אקסונים ברחבי מוח החולדה, והפעלתם האופטוגנטית מובילה להתנהגות של חיפוש גמול. לפיכך, נוירונים מושתלים בקליפת המוח האנושית מתבגרים ומשתתפים במעגלים של המארח השולטים בהתנהגות. אנו מצפים שגישה זו תקל על זיהוי פנוטיפים ברמת הגדיל בתאים שמקורם במטופל שלא ניתן לזהותם באמצעים אחרים.
המוח האנושי המתפתח הוא תהליך התארגנות עצמית יוצא דופן שבו תאים מתרבים, מתמיינים, נודדים ומתחברים ליצירת מעגלים עצביים פונקציונליים אשר עוברים שיפור נוסף באמצעות חוויה חושית. בעיה מרכזית בהבנת התפתחות המוח האנושי, במיוחד בהקשר של מחלות, היא חוסר הגישה לרקמת מוח. אברונים מתארגנים עצמית, כולל אורגנואידים של קליפת המוח האנושית (hCO; הידוע גם ככדור קליפת המוח האנושי), יכולים לייצר 2,3,4,5,6. עם זאת, מספר מגבלות מגבילות את יישומם הרחב יותר להבנת התפתחותם ותפקודם של מעגלים עצביים. בפרט, לא ברור האם התבגרות hCO מוגבלת על ידי היעדר קלטים מיקרו-סביבתיים וחושיים מסוימים הקיימים in vivo. בנוסף, מכיוון ש-hCO אינם משולבים במעגלים שיכולים לייצר תוצאות התנהגותיות, התועלת שלהם במידול הפרעות נוירופסיכיאטריות מורכבות גנטית והתנהגותיות מוגבלת כיום.
השתלת hCO למוח חי שלם יכולה להתגבר על מגבלות אלו. מחקרים קודמים הראו כי נוירונים אנושיים המושתלים לקליפת המוח של המכרסם מסוגלים לשרוד, להקרין ולתקשר עם תאי מכרסם 7,8,9,10,11,12. עם זאת, ניסויים אלו מבוצעים בדרך כלל על בעלי חיים בוגרים, דבר שעשוי להגביל את האינטגרציה הסינפטית והאקסונלית. כאן, אנו מתארים פרדיגמת השתלה שבה השתלנו hCO תלת-ממדי שמקורו בתאי hiPS לקליפת המוח הסומטוסנסורית הראשונית (S1) של חולדות חסרות חיסון בשלב מוקדם של התפתחות פלסטית. נוירונים מושתלים של hCO (t-hCO) עוברים התבגרות משמעותית, מקבלים קלטים תלמוקורטיקליים וקורטיקלי-קורטיקליים המעוררים תגובות חושיות, ומרחיבים השלכות אקסונליות למוח החולדה כדי להניע התנהגות של חיפוש גמול. התבגרות ממושכת של t-hCO חשפה פגמים עצביים בחולים עם תסמונת טימותי (TS), הפרעה גנטית חמורה הנגרמת על ידי מוטציות בתעלת הסידן CaV1.2 מסוג L הרגישה למתח (המקודדת על ידי CACNA1C).
כדי לחקור נוירונים קורטיקליים אנושיים במעגלים in vivo, השתלנו באופן סטריאוטקטי hCO תלת-ממדי שלם לתוך S1 של חולדות אתימיות בשלב מוקדם לאחר הלידה (ימים 3-7 לאחר הלידה) (איור 1a ונתונים מורחבים של איור 1a-c). בשלב זה, ההשלכות האקסונליות התלמוקורטיקליות והקורטיקוליות טרם השלימו את עצבוב ה-S1 שלהן (הפניה 13). לכן, גישה זו נועדה למקסם את האינטגרציה של t-hCO תוך מזעור ההשפעה על מעגלים אנדוגניים. כדי להמחיש את מיקום ה-t-hCO בבעלי חיים חיים, ביצענו שחזורי מוח MRI משוקללים של T2 של חולדות 2-3 חודשים לאחר ההשתלה (איור 1b ונתונים מורחבים, איור 1d). t-hCO נצפו בקלות ומדידות נפח של t-hCO היו דומות לאלו שחושבו מפרוסות קבועות (איור 1d,e של נתונים מורחבים; P > 0.05). t-hCO נצפו בקלות ומדידות נפח של t-hCO היו דומות לאלו שחושבו מפרוסות קבועות (איור 1d,e של נתונים מורחבים; P > 0.05). t-hCO легко наблюдались, а объемные измерения t-hCO были аналогичны рассчитанным для фиксированных ресрезин, рис 1d, e; P> 0,05). נצפו בקלות t-hCO , ומדידות t-hCO נפחיות היו דומות לאלו שחושבו עבור מקטעים קבועים (נתונים מורחבים, איור 1ד, ה; P > 0.05).很容易观察到t-hCO，并且t-hCO的体积测量值与从固定切片计算的测量值相似（扩展数据图1d、e；P >。5）。5）很容易观察到t-hCO，并且t-hCO t-hCO легко наблюдался, а объемные измерения t-hCO были аналогичны рассчитанным для фиксированных срезов ( рис 1d, e; P> 0,05). ערך t-hCO נצפה בקלות, ומדידות t-hCO נפחיות היו דומות לאלו שחושבו עבור מקטעים קבועים (נתונים מורחבים, איור 1ד, ה; P > 0.05).קבענו את רמת t-hCO ב-81% מהחיות המושתלות כחודשיים לאחר ההשתלה (n = 72 חיות; hCO מ-10 שורות תאים hiPS; שורות תאים hiPS בטבלה המשלימה 1). מתוכן, 87% היו ממוקמות בקליפת המוח (איור 1c). על ידי ביצוע סריקות MRI סדרתיות בנקודות זמן מרובות באותה חולדה מושתלת, מצאנו עלייה פי תשעה בנפח t-hCO תוך 3 חודשים (איור 1d ונתונים מורחבים, איור 1f). לבעלי חיים מושתלים היה שיעור הישרדות גבוה (74%) 12 חודשים לאחר ההשתלה (נתונים מורחבים, איור 1g וטבלה משלימה 2), ולא נמצאו ליקויים מוטוריים או זיכרון גלויים, גליוזיס או אלקטרואנצפלוגרם (EEG). נתונים איור 1g וטבלה משלימה 2). 1h-m ו-3e).
א, תרשים סכמטי של תכנון הניסוי. hCO שמקורו בתאי hiPS הושתל לתוך תאי S1 של חולדות עירומות שזה עתה נולדו בימים 30-60 של התמיינות. ב, תמונות MRI קורונליות ואופקיות משוקללות T2 המציגות t-hCO ב-S1 חודשיים לאחר ההשתלה. סרגל קנה מידה, 2 מ"מ. ג, כימות שיעורי הצלחה בהשתלה המוצגים עבור כל שורת תאי hiPS (n = 108, מספרים בתוך העמודות מציינים את כמות t-hCO לכל שורת תאי hIPS) ומיקום קורטיקלי או תת-קורטיקלי (n = 88). ד, תמונת MRI של עורק כלילי (משמאל; סרגל קנה מידה, 3 מ"מ) ושחזור נפחי תלת-ממדי מתאים (סרגל קנה מידה, 3 מ"מ) המציג עלייה ב-t-hCO במשך 3 חודשים. ה, סקירת דפוסי t-hCO בקליפת המוח של חולדה. סרגל קנה מידה, 1 מ"מ. f, תמונות אימונוציטוכימיות מייצגות של t-hCO משמאל למעלה לימין (במהלך ההתמיינות): PPP1R17 (בן 4 חודשים), NeuN (בן 8 חודשים), SOX9 ו-GFAP (בן 8 חודשים), PDGFRα; (8 חודשים), MAP2 (8 חודשים) ו-IBA1 (8 חודשים). סרגל קנה מידה, 20 מיקרומטר. ביטוי משותף של HNA מצביע על תאים ממקור אנושי. g, snRNA-seq: הדמיית הפחתת מימדים מאוחדת של סעפת והקרנה (UMAP) של כל גרעיני t-hCO באיכות גבוהה לאחר אינטגרציה של Seurat (n=3 דגימות t-hCO, n=2 שורות תאים hiPS). אסטרוציטים, תאים מקו האסטרוציטים; cyc prog, תאי אב במחזור הדם; GluN DL, נוירונים גלוטמטרגיים עמוקים; GluN DL/SP, נוירונים גלוטמטרגיים עמוקים ותת-למלריים; GluN UL, נוירונים גלוטמטרגיים בשכבה העליונה; אוליגודנדרוציטים, אוליגודנדרוציטים; OPC, תאי אב אוליגודנדרוציטים; RELN, נוירונים של רילין. h, ניתוח העשרה במונחי אונטולוגיה של גנים (GO) של גנים בעלי עלייה משמעותית (P מותאם < 0.05, שינוי קיפול > 2, מתבטא בלפחות 10% מהגרעינים) בנוירונים גלוטמטרגיים של t-hCO בהשוואה לנוירונים גלוטמטרגיים של hCO. h, ניתוח העשרה במונחי אונטולוגיה של גנים (GO) של גנים בעלי עלייה משמעותית (P מותאם < 0.05, שינוי קיפול > 2, מתבטא בלפחות 10% מהגרעינים) בנוירונים גלוטמטרגיים של t-hCO בהשוואה לנוירונים גלוטמטרגיים של hCO. h, Анализ обогащения терминов Gene Ontology (GO) для генов со значительной активацией (скорректированный P <0,05, кратность и >зм2, ב- 10% ядер) ב- глутаматергических нейронах t-hCO ב- сравнению с глутаматергическими нейронах. h, ניתוח העשרה של מונחי אונטולוגיה של גנים (GO) עבור גנים עם הפעלה משמעותית (P מותאם <0.05, שינוי קיפול >2, ביטוי בלפחות 10% מגרעיני הגן) בנוירונים גלוטמטרגיים של t-hCO בהשוואה לנוירונים גלוטמטרגיים של hCO. h，与hCO 谷氨酸能神经元相比，t-hCO 谷氨酸能神经元中基因显着上调（谎整吃整0.05，倍数变化> 2，在至少10% 的细胞核中表达）的基因本体论(GO) 术识〈富 h ， 与 hco 谷氨酸 能 元 相比 ， t-hco 谷氨酸 能 神经 元 基因 显着 上谼 p <0 ０同.变化 变化> 2 ， 至少 10% 的 核中 表达） 基因 基因 基因 的 的 的 的 的 的 的 的 的的 的 的 的本体论(GO) 术语富集分析. h, гены значительно активизировались (скорректированный P <0,05, кратность изменения> 2, экспрессируется по 1% кратность изменения глутаматергических нейронах t-hCO по сравнению с глутаматергическими нейронами hCO Онтологический (GO) анализ. h, גנים היו מווסתים באופן משמעותי כלפי מעלה (P מותאם < 0.05, שינוי קיפול > 2, מתבטאים בלפחות 10% מהגרעינים) בנוירונים גלוטמטרגיים של t-hCO בהשוואה לנוירונים גלוטמטרגיים של hCO ניתוח אונטולוגי (GO) של מונח ההעשרה.הקו המקווקו מציין ערך aq של 0.05. i, הדמיית UMAP של סוגי תאי GluN ב-t-hCO באמצעות העברת תוויות ממערך נתונים של 22 snRNA-seq של קליפת המוח המוטורית של מבוגרים. CT - תאים קורטיקותלמיים, ET - תאים חוץ-מוחיים, IT - תאים טלנצפליים פנימיים, NP - הקרנה קרובה.
לאחר מכן הערכנו את הציטוארכיטקטורה ואת ההרכב התאי הכולל של t-hCO. צביעת נוגדנים של תאי אנדותל של חולדות גילתה וסקולריזציה עם t-hCO, בעוד שצביעת IBA1 גילתה נוכחות של מיקרוגליה של חולדות ברחבי השתל (איור 1f ונתונים מורחבים, איור 3c,d). צביעה אימונולוגית גילתה תאים חיוביים לאנטיגן גרעיני אנושי (HNA) המבטאים יחד PPP1R17 (אבות קורטיקליים), NeuN (נוירונים), SOX9 ו-GFAP (תאים שמקורם בגליאל) או PDGFRα (אבות אוליגודנדרוציטים) (איור 1f). כדי לחקור את ההרכב התאי של t-hCO ברזולוציה של תא בודד, ביצענו ריצוף RNA ליבה יחידה (snRNA-seq) לאחר כ-8 חודשי התמיינות. סינון בכמות גדולה והסרה של גרעיני חולדה הניבו 21,500 מפות חד-גרעיניות אנושיות באיכות גבוהה (איור 1g ונתונים מורחבים, איור 4a,b). דפוסי ביטוי של סמני סוג תאים אופייניים זיהו אשכולות של מחלקות תאים קורטיקליים עיקריות, כולל נוירונים גלוטמטרגיים עמוקים ושטחיים, תאי אב במחזור הדם, אוליגודנדרוציטים ושושלת אסטרוציטים (איור 1g, נתונים מורחבים, איור 4c, וטבלה משלימה 3). צביעה אימונולוגית עבור SATB2 ו-CTIP2 הראתה שלמרות נוכחותם של תת-סוגים קורטיקליים, t-hCO לא הראה ריבוד אנטומי ברור (נתונים מורחבים, איור 3a). hCO מסוג snRNA-seq תואם בשלבים ייצר מחלקות תאים דומות באופן כללי, למעט כמה יוצאים מן הכלל, כולל היעדר אוליגודנדרוציטים ונוכחות נוירונים GABAergic, מה שעשוי לשקף את התנאים הנוחים במבחנה שדווחו בעבר עבור תאי אב רוחביים15 (נתונים מורחבים, איור 4f-i וטבלה משלימה 4). ניתוח ביטוי גנים דיפרנציאלי גילה הבדלים משמעותיים בנוירונים גלוטמטרגיים בין t-hCO ל-hCO (טבלה משלימה 5), כולל הפעלת קבוצות של גנים הקשורים להתבגרות נוירונים כגון איתות סינפטי, לוקליזציה דנדריטית ופעילות תעלה תלוית מתח (איור 1h וטבלה משלימה 5). טבלה 6). בהתאם, נוירונים גלוטמטרגיים קורטיקליים של t-hCO הציגו התבגרות תעתוק מואצת.
כדי להבהיר האם שינויים תעתוקיים אלה ב-t-hCO קשורים להבדלים מורפולוגיים בין hCO במבחנה (in vitro) לבין t-hCO ב-vivo (in vivo), שחזורנו hCO ו-hCO תואמים בשלבים בחתכים אקוטיים, לאחר 7-8 חודשי התמיינות. נוירוני hCO (איור 2א'). נוירוני t-hCO היו גדולים משמעותית, בקוטר הסומה פי 1.5, מספר הדנדריטים גדול פי שניים, ועלייה כוללת של פי שישה באורך הדנדריטי הכולל בהשוואה ל-hCO במבחנה (איור 2ב'). בנוסף, צפינו בצפיפות גבוהה משמעותית של קוצים דנדריטים בנוירוני t-hCO מאשר בנוירוני hCO (איור 2ג'). ממצא זה מצביע על כך שנוירוני t-hCO עוברים התארכות והסתעפות דנדריטיים נרחבים, אשר, בשילוב עם התפשטות תאים מתמשכת, עשויים לתרום לצמיחה אינטנסיבית של t-hCO לאחר השתלה (איור 1ד' ונתונים מורחבים איור 1ו'). ממצא זה הניע אותנו לחקור את התכונות האלקטרופיזיולוגיות. קיבול הממברנה היה גבוה פי שמונה (נתונים מורחבים, איור 8ד'), פוטנציאל הממברנה במצב מנוחה היה היפר-קוטבי יותר (כ-20 מיליוולט), והזרקת זרם גרמה לקצב עירור מקסימלי גבוה יותר בנוירוני t-hCO מאשר בנוירוני hCO. במבחנה (איור 2ד'), ה'), דבר התואם את המאפיינים המורפולוגיים הגדולים והמורכבים יותר של t-hCO. בנוסף, תדירות אירועי הזרם הפוסט-סינפטיים המעוררים הספונטניים (EPSC) הייתה גבוהה משמעותית בנוירוני t-hCO (איור 2ו'), דבר המצביע על כך שהצפיפות המוגברת של קוצים דנדריטים שנצפתה בנוירוני t-hCO הייתה קשורה לעירור תפקודי של סינפסה מינית. אישרנו את האופי הלא בוגר של נוירוני hCO במבחנה על ידי רישום נוירונים גלוטמטרגיים מסומנים (נתונים מורחבים, איור 6א'-ג').
א, שחזור תלת-ממדי של נוירונים hCO ו-t-hCO מלאים בביוציטין לאחר 8 חודשי התמיינות. ב, כימות של מאפיינים מורפולוגיים (n = 8 נוירונים של hCO, n = 6 נוירונים של t-hCO; **P = 0.0084, *P = 0.0179 ו-***P < 0.0001). ב, כימות של מאפיינים מורפולוגיים (n = 8 נוירונים של hCO, n = 6 נוירונים של t-hCO; **P = 0.0084, *P = 0.0179 ו-***P < 0.0001). б, количественная оценка морфологических признаков (n = 8 нейронов hCO, n = 6 нейронов t-hCO; ** P = 0,0084, * P = 9 0,01***). ב, כימות של מאפיינים מורפולוגיים (n=8 נוירונים של hCO, n=6 נוירונים של t-hCO; **P=0.0084, *P=0.0179, ו-***P<0.0001). b，形态学特征的量化（n = 8 个hCO 神经元，n = 6 个t-hCO 神经元；**P = 0.0084，和1***P = 0.0084,0*P9 0.0001）. b，形态学特征的量化（n = 8 个hCO 神经元，n = 6 个t-hCO 神经元；**P = 0.0084，和1***P = 0.0084,0*P9 0.0001）. б, количественная оценка морфологических признаков (n = 8 нейронов hCO, n = 6 нейронов t-hCO; ** P = 0,0084, * P = 9 0,01***). ב, כימות של מאפיינים מורפולוגיים (n=8 נוירונים של hCO, n=6 נוירונים של t-hCO; **P=0.0084, *P=0.0179, ו-***P<0.0001).ג, שחזור תלת-ממדי של ענפים דנדריטיים hCO ו-t-hCO לאחר 8 חודשי התמיינות. כוכביות אדומות מציינות קוצים דנדריטיים משוערים. כימות צפיפות עמוד השדרה הדנדריטי (n = 8 נוירונים של hCO, n = 6 נוירונים של t-hCO; **P = 0.0092). ד, כימות פוטנציאל הממברנה במנוחה (n = 25 נוירונים של hCO , n = 16 נוירונים של t-hCO ; ***P < 0.0001). ד, כימות פוטנציאל הממברנה במנוחה (n = 25 נוירונים של hCO , n = 16 נוירונים של t-hCO ; ***P < 0.0001). d, количественная оценка мембранного потенциала покоя (n = 25 нейронов hCO, n = 16 нейронов t-hCO; *** P <0,0001). ד, כימות פוטנציאל ממברנת מנוחה (n = 25 נוירונים של hCO , n = 16 נוירונים של t-hCO ; ***P < 0.0001). d，静息膜电位的量化（n = 25 hCO 神经元，n = 16 t-hCO 神经元；***P < 0.0001）. d，静息膜电位的量化（n = 25 hCO 神经元，n = 16 t-hCO 神经元；***P < 0.0001）. d, количественная оценка мембранного потенциала покоя (n = 25 нейронов hCO, n = 16 нейронов t-hCO; *** P <0,0001). ד, כימות פוטנציאל ממברנת מנוחה (n = 25 נוירונים של hCO , n = 16 נוירונים של t-hCO ; ***P < 0.0001). ה, ירי פוטנציאל פעולה חוזר ב-hCO ו-t-hCO המושרה על ידי הגדלת הזרקות זרם, וכימות קצב הירי המקסימלי (n = 25 נוירוני hCO, n = 16 נוירוני t-hCO; ***P < 0.0001). ה, ירי פוטנציאל פעולה חוזר ב-hCO ו-t-hCO המושרה על ידי הגדלת הזרקות זרם, וכימות קצב הירי המקסימלי (n = 25 נוירוני hCO, n = 16 נוירוני t-hCO; ***P < 0.0001). e, повторное возбуждение потенциала действия в hCO ו-t-hCO, вызванное увеличением тока, и количествия скорости возбуждения (n = 25 нейронов hCO, n = 16 нейронов t-hCO; *** P <0,0001). ה, ירי חוזר של פוטנציאל פעולה ב-hCO ו-t-hCO המושרה על ידי עלייה בזרם וכימות קצב הירי המקסימלי (n = 25 נוירוני hCO, n = 16 נוירוני t-hCO; *** P < 0.0001). e，通过增加电流注入诱导的hCO 和t-hCO 重复动作电位放电，以及最大放电缇n =2个hCO 神经元，n = 16 个t-hCO 神经元；***P < 0.0001）. E ， 通过 增加 电流 注入 的 的 hco 和 t-hco 重复 电位 放电 ， 以及 最 夼刏 n =2个 hco 神经 ， n = 16 个 t-hco 神经 ； *** p <0.0001） 。 ה. максимальной скорости возбуждения (n = 25 нейронов hCO, n = 16 нейронов t-hCO; *** P <0,0001). ה, ירי חוזר של פוטנציאלי פעולה של hCO ו-t-hCO המושרים על ידי אספקת זרם מוגברת וכימות קצב הירי המקסימלי (n = 25 נוירוני hCO, n = 16 נוירוני t-hCO; *** P < 0.0001). f, תאי EPSC ספונטניים (sEPSCs) בנוירוני hCO ו-t-hCO לאחר 8 חודשי התמיינות, וכימות תדירות האירועים הסינפטיים (n = 25 נוירוני hCO, n = 17 נוירוני t-hCO; ***P < 0.0001). ו, תאי EPSC ספונטניים (sEPSCs) בנוירוני hCO ו-t-hCO לאחר 8 חודשי התמיינות, וכימות תדירות האירועים הסינפטיים (n = 25 נוירוני hCO, n = 17 נוירוני t-hCO; ***P < 0.0001). f, спонтанные EPSC (sEPSC) в нейронах hCO и t-hCO через 8 месяцев дифференцировки и количественная оценкастичестича событий (n = 25 нейронов hCO, n = 17 нейронов t-hCO; *** P <0,0001) . f, תאי EPSC ספונטניים (sEPSCs) בנוירוני hCO ו-t-hCO לאחר 8 חודשי התמיינות וכימות קצב אירועים סינפטיים (n=25 נוירוני hCO, n=17 נוירוני t-hCO; ***P<0.0001). f，分化8 个月时hCO 和t-hCO 神经元中的自发性EPSCs (sEPSCs)，以及突触事件频率的5 CO神经元，n = 17 t-hCO 神经元；***P < 0.0001） . f，分化8 个月时hCO 和t-hCO 神经元中的自发性EPSCs (sEPSCs)，以及突触事件频率的5 CO神率的量匼（n = 25 hCO 神率的量匼（n = 25hCO P < 0.0001）. f, спонтанные EPSC (sEPSC) в нейронах hCO и t-hCO через 8 месяцев дифференцировки и количественная оценкастичестича событий (n = 25 нейронов hCO, n = 17 нейронов t-hCO; *** P <0,0001). f, תאי EPSC ספונטניים (sEPSCs) בנוירוני hCO ו-t-hCO לאחר 8 חודשי התמיינות וכימות קצב אירועים סינפטיים (n = 25 נוירוני hCO, n = 17 נוירוני t-hCO; *** P<0.0001).עבור bf, hCO3 ו-t-hCO3 בשורה 1208-2 נלקחו מאותה קבוצת בידול שהוחזקה במקביל. ז, ניתוח העשרת מערכי גנים (מבחן פישר המדויק חד-צדדי) של גנים בעלי עלייה משמעותית (P מותאם < 0.05, שינוי קיפול > 2, מתבטא בלפחות 10% מהגרעינים) בנוירונים גלוטמטרגיים של t-hCO בהשוואה לנוירונים גלוטמטרגיים של hCO עם מערכי גנים של גנים תלויי-פעילות של תגובה מוקדמת (ERG) וגנים תלויי-פעילות של תגובה מאוחרת (LRG) שזוהו ממחקר עכבר in vivo16 ו-LRGs ספציפיים לבני אדם מנוירונים in vitro17. ז, ניתוח העשרת מערכי גנים (מבחן פישר המדויק חד-צדדי) של גנים בעלי עלייה משמעותית (P מותאם < 0.05, שינוי קיפול > 2, מתבטא בלפחות 10% מהגרעינים) בנוירונים גלוטמטרגיים של t-hCO בהשוואה לנוירונים גלוטמטרגיים של hCO עם מערכי גנים של גנים תלויי-פעילות של תגובה מוקדמת (ERG) וגנים תלויי-פעילות של תגובה מאוחרת (LRG) שזוהו ממחקר עכבר in vivo16 ו-LRGs ספציפיים לבני אדם מנוירונים in vitro17. g, анализ обогащения набора генов (односторонний точный критерий Фишера) генов со значительной активацивацие (ский 0,5 кратность изменения > 2, экспрессия по меньшей мере в 10% ядер) в глутаматергических нейровнах t-hCO по сратность глутаматергическими нейронами hCO наборы генов как раннего (ERG), так и позднего (LRG) генов, зависящих от אקטיוונוסטי, идентифицированных в исследовании на мышах in vivo16, и специфических человека LRG из in vitro17. g, ניתוח העשרת מערכי גנים (מבחן פישר המדויק החד-זנבי) של גנים עם הפעלה משמעותית (P מותאם <0.05, שינוי קיפול >2, ביטוי בלפחות 10% מהגרעינים) בנוירונים גלוטמטרגיים של t-hCO בהשוואה לקבוצות נוירונים גלוטמטרגיים של hCO של גנים תלויי פעילות מוקדמים (ERG) ומאוחרים (LRG) שזוהו בעכברים in vivo16 ו-LRGs ספציפיים לבני אדם מנוירונים in vitro17. g，t-hCO谷氨酸能神经元与hCO谷氨酸能神经元相比，t -hCO谷氨酸能神经元显着上调（调整后P<0.05，倍数变化>2，在至少10%的细胞核中表达）的基因集富集分析（单侧F isher精确检验）从体内小鼠研究中鉴定的早期反应(ERG)和晚期反应(LRG) 活性依赖性基因的基因组16 和体外神经元17 中的人类特异 g ， t-hco 谷氨酸 神经 元 与 hco 谷氨酸 神经 元 相比 ， t-hco 谷氨酸 襞绸 兰 神绸 兰<0.05 ， 倍数> 2 ， 至少 至少 10%的 细胞 核中 表达） 的 集富集 分析ＲＧ单）体内 小鼠 研究 中 的 早期 反应 反应 反应 和 晚期 反应 反应 (lrg) 活性 基因 的 基因瞻 16神经元 17 中 中 17 中 17的人类特异性LRG. g, глутаматергические нейроны t-hCO были значительно активизированы по сравнению с глутаматергическими нейнейн P<0,05, кратность измения> 2, не менее 10% позднего гены, зависящие от активности ответа (LRG), идентифицированные в исследованиях на мышах in vivo16 ו нейронах in vitro17. LRG, специфичные для человека. g, נוירונים גלוטמטרגיים של t-hCO היו מוגברים באופן משמעותי בהשוואה לנוירונים גלוטמטרגיים של hCO (P מתוקן <0.05, שינוי קיפול >2, לפחות 10%. ניתוח העשרת גנים של תגובה מוקדמת (ERG) ותגובה מאוחרת (מבחן פישר המדויק חד-זנבי) גנים תלויי פעילות תגובה (LRGs) שזוהו בעכברים in vivo16 ובנוירונים in vitro.17 LRGs ספציפיים לבני אדם.הקו המקווקו מציין ערך P של 0.05, מתוקן לפי Bonferroni. h, ביטוי גן GluN (פסאודו-חבילה וקנה מידה של כל גן) היה מוגבר באופן משמעותי בהעתקי snRNA-seq של גנים LRG בנוירונים גלוטמטרגיים מסוג t-hCO. i, צביעה אימונומטרית המציגה ביטוי SCG2 בנוירונים מסוג t-hCO (עליון) ו-hCO (תחתון). חצים לבנים מצביעים על תאי SCG2+. סרגל קנה מידה, 25 מיקרומטר. הנתונים מבוטאים כממוצע ± סטיית תקן.
בהתבסס על הפעילות המוגברת של t-hCO שנצפתה בפרוסות ex vivo, snRNA-seq גילה עלייה תלוית פעילות של תעתיקי גנים ב-t-hCO בהשוואה ל-hCO במבחנה. נוירוני t-hCO גלוטמטרגיים ביטאו רמות גבוהות יותר של גנים המווסתים פעילות תגובה מאוחרת (איור 2g,h), אשר נמצאו במחקרים קודמים בנוירונים של עכברים ובני אדם 16,17. לדוגמה, BDNF18, SCG2 ו-OSTN, גן מווסת פעילות ספציפי לפרימטים, הראו ביטוי מוגבר בנוירוני t-hCO בהשוואה לנוירוני hCO (איור 2g-i). לפיכך, נוירוני t-hCO הציגו מאפייני התבגרות משופרים בהשוואה לנוירוני hCO על ידי ניתוחים תעתוקיים, מורפולוגיים ופונקציונליים.
כדי להעריך עוד יותר את הקשר בין התבגרות t-hCO לבין התפתחות המוח האנושי, ביצענו השוואות טרנסקריפטומיות של סוגי תאי קליפת המוח בעובר ובבוגר19,20 ובבוגר21,22, כמו גם נתונים נרחבים על ביטוי גנים קורטיקליים23 במהלך ההתפתחות (נתונים מורחבים, איור 5). עם עבודה קודמת24, מצב ההתבגרות הגלובלי של hCO ו-t-hCO לאחר 7-8 חודשים של התמיינות עולה בקנה אחד באופן כללי עם זמן ההתפתחות in vivo והוא שקול ביותר לחיי העובר המאוחרים (נתונים מורחבים איור 5a). ראוי לציין כי צפינו בבשלות טרנסקריפטום מוגברת ב-t-hCO בהשוואה ל-hCO תואם גיל, כמו גם הפעלת טרנסקריפטום הקשורה לסינפטוגנזה, אסטרוגנזה ומיאלינציה (נתונים מורחבים, איור 5b-d). ברמה התאית, מצאנו עדויות לתת-סוג קליפת מוח דקה יותר ב-t-hCO, עם אשכולות של נוירונים גלוטמטרגיים החופפים לתת-סוגי נוירונים L2/3, L5 ו-L6 בוגרים (איור 1i). לעומת זאת, חפיפת אשכולות בין נוירוני t-hCO גלוטמטרגיים לנוירונים קורטיקליים עובריים הייתה מוגבלת יותר באמצע ההריון (נתונים מורחבים, איור 5e-j). כדי לקבוע האם נוירוני t-hCO דומים מבחינה תפקודית לנוירונים ניאו-קורטיקליים אנושיים לאחר לידה, ביצענו הקלטות אלקטרופיזיולוגיות ושחזורים אנטומיים של נוירונים פירמידליים L2/3 אנושיים בחתכים חדים של קליפת המוח האנושית לאחר לידה (נתונים מורחבים, איור 7a). התכונות האלקטרופיזיולוגיות של נוירונים פירמידליים L2/3 היו דומות לאלה של נוירונים פירמידליים t-hCO (נתונים מורחבים, איור 7e). מבחינה מורפולוגית, נוירוני L2/3 מדגימות אנושיות לאחר לידה היו דומים יותר ל-t-hCO מאשר ל-hCO, למרות שתאי L2/3 היו ארוכים יותר, הכילו יותר ענפים בסך הכל, ובעלי צפיפות עמוד שדרה גבוהה יותר (איור 3g ונתונים מורחבים, איור 7b-). G).
א, השתלת hCO המיוצר על ידי שורות תאי בקרה ותאי TS hiPS לחולדות יילודות. ב, שחזור תלת-ממדי של נוירוני t-hCO מלאים בביוציטין לאחר 8 חודשי התמיינות. ג, כימות של אורך דנדריטי ממוצע (n = 19 נוירוני בקרה, n = 21 נוירוני TS; **P = 0.0041). ד, ענפים דנדריטים משוחזרים בתלת-ממד מקבוצת הביקורת ומקבוצת ה-TS t-hCO לאחר 8 חודשי התמיינות, וכימות צפיפות עמוד השדרה הדנדריטי (n = 16 נוירוני בקרה, n = 21 נוירוני TS, ***P < 0.0001). ד, ענפים דנדריטים משוחזרים בתלת-ממד מקבוצת הביקורת ומקבוצת ה-TS t-hCO לאחר 8 חודשי התמיינות, וכימות צפיפות עמוד השדרה הדנדריטי (n = 16 נוירוני בקרה, n = 21 נוירוני TS, ***P < 0.0001). d, 3D-rеконструкция дендритных ветвей из контроля ו-TS t-hCO через 8 месяцев диференцировки и количе дендритных шипов (n = 16 контрольных нейронов, n = 21 TS нейронов, *** P <0,0001). ד, שחזור תלת-ממדי של ענפים דנדריטים מקבוצת הביקורת ו-t-hCO TS לאחר 8 חודשי התמיינות וכימות צפיפות עמוד השדרה הדנדריטי (n=16 נוירוני בקרה, n=21 נוירוני TS, ***P<0.0001). d，分化8 个月时对照和TS t-hCO 的3D 重建树突分支，以及树突棘密度的量n 化1（个对照神经元，n = 21 个TS 神经元，***P < 0.0001）. d ， 分化 8 个 时 对照 和 ts t-hco 的 3d 重建 分支 分支 以及 树突棘 导度 1n神经 元 ， n = 21 个 ts 神经 ， *** p <0.0001 ）。 d, 3D-rеконструкция дендритных ветвей контроля ו-TS t-hCO через 8 месяцев диференцировки и коленколичеств дендритных шипов (n = 16 контрольных нейронов, n = 21 TS нейронов, *** P <0,0001). ד, שחזור תלת-ממדי של ענפי דנדריטים בקרה ו-TS t-hCO לאחר 8 חודשי התמיינות וכימות צפיפות עמוד השדרה הדנדריטי (n=16 נוירוני בקרה, n=21 נוירוני TS, ***P<0.0001).כוכביות אדומות מצביעות על קוצים דנדריטיים משוערים. ה, תאי EPSC ספונטניים בנוירוני בקרה ובנוירוני t-hCO מסוג TS לאחר 8 חודשי התמיינות. ו, עלילת תדירות מצטברת וכימות תדירות ומשרעת של אירועים סינפטיים (n=32 נוירוני בקרה, n=26 נוירוני TS; **P=0.0076 ו-P=0.8102). ז, ניתוח שול של נוירוני TS ובקרה ב-hCO ו-t-hCO. קווים מקווקווים מציגים נוירונים פירמידליים אנושיים L2/3 לאחר לידה להשוואה (n = 24 נוירוני t-hCO מסוג שליטה, n = 21 נוירוני t-hCO מסוג TS, n = 8 נוירוני hCO מסוג שליטה, ו-n = 7 נוירוני hCO מסוג TS). הנתונים מבוטאים כממוצע ± סטיית תקן.
היכולת של t-hCO לשכפל את התכונות המורפולוגיות והתפקודיות של נוירונים בקליפת המוח האנושית ברמה גבוהה הניעה אותנו לבחון האם ניתן להשתמש ב-t-hCO כדי לזהות פנוטיפים של מחלות. התמקדנו ב-TS, הפרעה נוירו-התפתחותית חמורה הנגרמת על ידי מוטציות gain-of-function בגן המקודד CaV1.2, אשר יוזמת שעתוק גנים תלוי-פעילות בנוירונים. השגנו hCO משלושה חולי TS הנושאים את ההחלפה הנפוצה ביותר (p.G406R) ומשלושה קבוצת ביקורת (איור 3a). לאחר ההשתלה, מצאנו שהמורפולוגיה הדנדריטית השתנתה בנוירונים של TS בהשוואה לקבוצת הביקורת (איור 3b ונתונים מורחבים, איור 8a,b), עם עלייה כפולה במספר הדנדריטים הראשוניים ועלייה כוללת בירידה הממוצעת והכללית באורך הדנדריטים (איור 3c ונתונים מורחבים, איור 8c). זה היה קשור לצפיפות מוגברת של קוצים ותדירות מוגברת של EPSCs ספונטניים ב-TS בהשוואה לנוירונים בקבוצת הביקורת (איור 3d-f ונתונים מורחבים, איור 8g). ניתוח נוסף גילה דפוסים של הסתעפות דנדריטית חריגה ב-t-hCO TS בהשוואה לקבוצת הביקורת, אך לא ב- in vitro TS hCO בשלב דומה של התמיינות (איור 3g). ממצא זה עולה בקנה אחד עם הדיווחים הקודמים שלנו על הצטמקות דנדריטית תלוית פעילות ב-TS ומדגיש את יכולתה של פלטפורמת השתלות זו לזהות פנוטיפים של מחלות in vivo.
לאחר מכן שאלנו באיזו מידה תאי t-hCO משולבים פונקציונלית לתוך S1 של חולדה. S1 במכרסמים מקבל קלטים סינפטיים חזקים מהגרעין התלמוסי הבסיסי והאחורי הגחוני איפסילטרלי, כמו גם מהקליפת המוח הסומטו-סנסורית המוטורית והמשנית איפסילטרלית, ומ-S1 הנגדי (איור 4א'). כדי לשחזר את דפוס העצבוב, הדבקנו את hCO בנגיף הכלבת-dG-GFP/AAV-G והשתלנו את hCO לתוך חולדה S1 3 ימים לאחר מכן. צפינו בביטוי צפוף של GFP בנוירונים של S1 איפסילטרלי וגרעיני הבסיס הגחוניים 7-14 ימים לאחר ההשתלה (איור 4ב', ג'). בנוסף, צביעת נוגדנים של סמן התלמוסי נטרין G1 חשפה את נוכחותם של קצוות תלמיים ב-t-hCO (איור 4ד', ה'). כדי להעריך האם בליטות אפרנטיות אלו יכולות לעורר תגובות סינפטיות בתאי t-hCO, ביצענו הקלטות של תאים שלמים מתאים אנושיים בחתכים חדים של השכבה התלמוקורטיקלית. גירוי חשמלי של S1 במוח החולדה, קפסולה פנימית, חומר לבן, סיבים ליד t-hCO או הפעלה אופטוגנטית של קצוות תלמיים המבטאים אופסין ב-t-hCO. תאי EPSC בעלי השהייה קצרה מושרים בנוירוני t-hCO שנחשפו לאנטגוניסט קולטן AMPA NBQX. (איור 4f, g ונתונים מורחבים, איור 9a-g). נתונים אלה מראים כי t-hCO משולב אנטומית במוח החולדה ויכול להיות מופעל על ידי רקמת מארח החולדה.
א, תרשים סכמטי של ניסוי מעקב אחר כלבת. ב, ביטוי GFP וביטוי STEM121 ספציפי לאדם בין t-hCO לקליפת המוח של חולדה (פאנל עליון). כמו כן מוצג ביטוי GFP בגרעין הבסיסי הגחוני (VB) איפסילטרלי של חולדה (שמאל למטה) וב-S1 איפסילטרלי (ימין למטה). סרגל קנה מידה, 50 מיקרומטר. הריבועים האדומים מייצגים את אזורי המוח שבהם צולמו התמונות. ג, כימות של תאים המבטאים GFP (n = 4 חולדות). ד, ה - טרמינלים תלמיים של Netrin G1+ ב-t-hCO. ד מציג חתך קורונלי המכיל גרעיני t-hCO ו-VB. סרגל קנה מידה, 2 מ"מ. ה מציג ביטוי Netrin G1 ו-STEM121 בנוירונים t-hCO (שמאל) ו-VB (ימין). סרגל קנה מידה, 50 מיקרומטר. הקו המקווקו הכתום מציין את גבול t-hCO. f, g, עקבות נוכחיים של נוירוני t-hCO לאחר גירוי חשמלי בחולדה S1 (f) או בקפסולה פנימית (g), עם NBQX (סגול) או בלי (שחור) (שמאל). אמפליטודות EPSC עם ובלי NBQX (n = 6 נוירוני S1, *P = 0.0119; ו-n = 6 נוירוני קפסולה פנימית, **P = 0.0022) (מרכז). אחוז נוירוני t-hCO המראים EPSC בתגובה לגירוי חשמלי של S1 בחולדה (f) או בקפסולה פנימית (g) (מימין). aCSF, נוזל מוחי שדרתי מלאכותי. h, תרשים סכמטי של ניסוי ההדמיה 2P (שמאל). ביטוי של GCaMP6s ב-t-hCO (אמצעי). סרגל קנה מידה, 100 מיקרומטר. זמן פלואורסצנציה של GCaMP6s (מימין). i, ציון Z של פלואורסצנציה של פעילות ספונטנית. j, איור סכמטי של גירוי שפם. k, מסלולי פלואורסצנציה 2P עם ציון z בניסוי אחד, מיושרים עם סטיית השפם בזמן אפס (קו מקווקו) בתאי הדוגמה. l, תגובות ציון z ממוצעות באוכלוסייה של כל התאים מיושרים עם סטיית השפם בזמן אפס (קו מקווקו) (אדום) או חותמות זמן שנוצרו באופן אקראי (אפור). m. תרשים סכמטי של הניסוי בסימון אופטי. n, עקומות מתח גולמיות מתא t-hCO לדוגמה במהלך גירוי לייזר כחול או סטיית שפם. חצים אדומים מצביעים על הקפיצות הראשונות שנגרמו על ידי אור (למעלה) או שנגרמו על ידי סטיית שפם (למטה). הצללה אפורה מציינת תקופות של סטיית שפם. o, צורות גל שיא של אור ותגובות סטיית שפם. p, קפיצות של ניסיון יחיד, מיושרות עם סטיית השפם בתאי הדוגמה. 0 מציין סטיית שפם (קו מקווקו). q, קצב ירי ציון z ממוצע באוכלוסייה עבור כל התאים הרגישים לאור, מיושר עם סטיית שפם בזמן אפס (קו מקווקו) (אדום) או חותמות זמן שנוצרו באופן אקראי (אפור). r, שיעור היחידות הרגישות לאור המווסתות באופן משמעותי על ידי סטיית שפם (n = 3 חולדות) (שמאל). שיא השהיית ציון z (n = 3 חולדות; n = 5 (ירוק בהיר), n = 4 (ירוק כהה) ו-n = 4 (ציאן) יחידות אפנון סטיית שפם לכל חולדה) (מימין). הנתונים מבוטאים כממוצע ± סטיית תקן.
לאחר מכן שאלנו האם ניתן להפעיל t-hCO על ידי גירויים חושיים in vivo. השתלנו hCO המבטא את אינדיקטורי הסידן המקודדים גנטית GCaMP6 בחולדות S1. לאחר 150 ימים, ביצענו פוטומטריה של סיבים או הדמיית סידן דו-פוטונית (איור 4h ונתונים מורחבים, איור 10a). מצאנו שתאי t-hCO הציגו פעילות קצבית מסונכרנת (איור 4i, נתונים מורחבים, איור 10b וסרטון משלים 1). כדי לאפיין את שיא פעילות t-hCO, ביצענו הקלטות אלקטרופיזיולוגיות חוץ-תאיות בחולדות מושתלות מורדמות (נתונים מורחבים, איור 10c-f). יצרנו קואורדינטות סטריאוטקסיות מתמונות MRI; לפיכך, יחידות מוקלטות אלו מייצגות נוירונים אנושיים משוערים, אם כי אלקטרופיזיולוגיה לבדה אינה מאפשרת קביעת מין מוצא. צפינו בהתפרצויות פעילות מסונכרנות (נתונים מורחבים, איור 10d). ההתפרצויות נמשכו כ-460 מילישניות והופרדו על ידי פרקי שקט של כ-2 שניות (נתונים מורחבים, איור 10ד', ה'). יחידות בודדות ירו בממוצע כשלושה כדורים להתפרצות, שהם כ-73% מהיחידות שנרשמו להתפרצות. פעילויות היחידות הבודדות היו מתואמות מאוד, וקורלציות אלו היו גבוהות יותר מאלה של יחידות שזוהו בבעלי חיים לא מחוסנים שתועדו באותם תנאים (נתונים מורחבים, איור 10ו'). כדי לאפיין עוד יותר את תגובות הדופק של נוירונים שמקורם בבני אדם שזוהו, ביצענו ניסויי תיוג אור על חולדות מורדמות שהושתלו ב-hCO3 המבטא את ערוץ הקטיונים הרגיש לאור רודופסין 2 (hChR2), שדרכו נוירוני t-hCO3 זיהוי בעלי השהייה קצרה (פחות מ-10 מילישניות) בתגובה לגירויי אור כחול (איור 4מ'-ו'). נוירוני t-hCO הציגו התפרצויות של פעילות ספונטנית בתדרים דומים לאלה שנצפו בהדמיית סידן, כמו גם הקלטות אלקטרופיזיולוגיות שבוצעו ב-t-hCO בהיעדר סימון אור (נתונים מורחבים, איור 10c-g). לא נצפתה פעילות ספונטנית בשלבים המתאימים של hCO שנרשמו במבחנה. כדי להעריך האם t-hCO יכול להיות מופעל על ידי גירויים חושיים, הסטנו לזמן קצר את שפם החולדה הרחק מ-t-hCO (איור 4j,m ונתונים מורחבים, איור 10h,k). על פי מחקרים קודמים8,10, תת-קבוצה של תאי t-hCO הראתה פעילות מוגברת בתגובה להסטת שפם, דבר שלא נצפתה כאשר הנתונים הושוו לחותמות זמן אקראיות (איור 4k-q ונתונים מורחבים, איור 10h-q). ואכן, כ-54% מהיחידות הבודדות שסומנו אופטו-סימן הראו קצב עוררות מוגבר משמעותית לאחר גירוי שפם, שהגיע לשיא של כ-650 מילישניות (איור 4r). יחד, נתונים אלה מצביעים על כך ש-t-hCO מקבל קלטים פונקציונליים מתאימים וניתן להפעילו על ידי גירויים סביבתיים.
לאחר מכן חקרנו האם t-hCO יכול להפעיל מעגלים בחולדות כדי לשלוט בהתנהגות. תחילה חקרנו האם האקסונים של נוירוני t-hCO מקרינים לרקמות הסובבות את החולדה. הדבקנו את hCO בנגיף lentivirus המקודד ל-hChR2 המחובר ל-EYFP (hChR2-EYFP). לאחר 110 ימים, צפינו בביטוי EYFP באזורים קורטיקליים איפסילטרליים, כולל קליפת המוח השמיעתית, המוטורית והסומטו-סנסורית, כמו גם באזורים תת-קורטיקליים, כולל הסטריאטום, ההיפוקמפוס והתלמוס (איור 5a). כדי להעריך האם בליטות אפרנטיות אלו יכולות לעורר תגובות סינפטיות בתאי חולדה, הפעלנו אופטית תאי t-hCO המבטאים hChR2-EYFP על ידי רישום תאי קליפת המוח של חולדה בחתכים חדים של המוח. הפעלת אקסוני t-hCO עם אור כחול גרמה לתאי EPSC בעלי השהייה קצרה בנוירוני קליפת המוח הפירמידלית של חולדה, אשר נחסמו על ידי NBQX (איורים 5b-g). בנוסף, תגובות אלו יכולות להיחסם על ידי טטרודוטוקסין (TTX) ולשקם אותן על ידי 4-אמינופירידין (4-AP), דבר המצביע על כך שהן נגרמו על ידי קשרים מונוסינפטיים (איור 5e).
א, תרשים סכמטי של מעקב אקסונים (משמאל). ביטוי t-hCO EYFP (מימין). סרגל קנה מידה, 100 מיקרומטר. A1, קליפת המוח השמיעתית, ACC, קליפת המוח הסינגולרית הקדמית, סטריאטום ב', סטריאטום הגבי, HPC, היפוקמפוס; סרעפת, מחיצה צידית, mPFC, קליפת המוח הקדם-מצחית המדיאלית, פירי, קליפת המוח הפיריפורמית, סטריאטום גב', סטריאטום הגחוני, VPM, גרעין התלמוס החד-צדדי, VTA, אזור הטגמנטום הגחוני. הריבועים האדומים מייצגים את אזורי המוח שבהם צולמו התמונות. ב, תרשים סכמטי של ניסוי הגירוי. ג, ד, דוגמאות לתגובה של זרם פוטו-מושרה על ידי אור כחול (למעלה) ומתח (למטה) בתאי t-hCO אנושיים (ג) EYFP+ או EYFP- חולדה (ד). ה, ו, עקבות נוכחיים של נוירונים בחולדות לאחר גירוי אור כחול של אקסונים של t-hCO עם TTX ו-4-AR (ירוק), TTX (אפור) או aCSF (שחור) (ה), עם (סגול) או בלי (שחור)) ) NBQX (ה). ז, השהייה של תגובות המושרות על ידי אור כחול בתאי חולדה (n = 16 תאים); פסים אופקיים מצביעים על השהייה ממוצעת (7.13 אלפיות שנייה) (משמאל). אמפליטודה של תאי EPSC מעוררי אור שנרשמו עם או בלי NBQX (n = 7 תאים; ***P < 0.0001) (אמצע). אמפליטודה של תאי EPSC מעוררי אור שנרשמו עם או בלי NBQX (n = 7 תאים; ***P < 0.0001) (אמצע). Амплитуда вызванных светом EPSC, зарегистрированных с или без NBQX (n = 7 клеток; ***P <0,0001) (בחודש). משרעת של תאי EPSC המושרים על ידי אור שנרשמו עם או בלי NBQX (n = 7 תאים; ***P < 0.0001) (במרכז).使用或不使用NBQX 记录的光诱发EPSC 的振幅（n = 7 个细胞；***P < 0.0001）（中）。使用或不使用NBQX 记录的光诱发EPSC 的振幅（n = 7 个细胞；***P < 0.0001）（中）。 Амплитуда вызванных светом EPSC, зарегистрированных с или без NBQX (n = 7 клеток; ***P <0,0001) (בחודש). משרעת של תאי EPSC המושרים על ידי אור שנרשמו עם או בלי NBQX (n = 7 תאים; ***P < 0.0001) (במרכז).אחוז תאי חולדה המציגים תאי EPSC המגיבים לאור כחול (מימין). h, תרשים סכמטי של משימה התנהגותית. d0, יום 0. i. ביצועי חיות לדוגמה ביום 1 (שמאל) או יום 15 (מימין) של האימון. מספר הליקוקים הממוצע שבוצע ביום 1 (שמאל) או ביום 15 (ימין במרכז) (n = 150 ניסיונות באור כחול, n = 150 ניסיונות באור אדום; ***P < 0.0001). מספר הליקוקים הממוצע שבוצע ביום 1 (שמאל) או ביום 15 (ימין במרכז) (n = 150 ניסיונות באור כחול, n = 150 ניסיונות באור אדום; ***P < 0.0001). Среднее количество облизываний, выполненных в день 1 (слева) או день 15 (в центре справа) (n = 150 מחזורים, слева) n = 150 испытаний с красным светом ***P <0,0001). מספר ממוצע של ליקוקים שבוצעו ביום 1 (משמאל) או ביום 15 (מרכז ימין) (n = 150 ניסויים באור כחול, n = 150 ניסויים באור אדום; ***P < 0.0001).第1 天（左）或第15 天（右中）执行的平均舔次数（n = 150 次蓝光试验，n = 150次红光试验；***P < 0.0001）.第1 天（左）或第15 天（右中）执行的平均舔次数（n = 150 次蓝光试验，n = 150次红光试验；***P < 0.001 Среднее количество облизываний, выполненных в день 1 (слева) או день 15 (в центре справа) (n = 150 מחזורים, слева) n = 150 испытаний с красным светом ***P <0,0001). מספר ממוצע של ליקוקים שבוצעו ביום 1 (משמאל) או ביום 15 (מרכז ימין) (n = 150 ניסויים באור כחול, n = 150 ניסויים באור אדום; ***P < 0.0001).ליקוקים מצטברים עבור ניסויי אור אדום וכחול ביום 1 (מרכז משמאל) או יום 15 (מימין). NS, לא מובהק. j,k, מאפייני התנהגות של כל בעלי החיים שהושתלו עם t-hCO המבטא hChR2-EYFP (j) או פלואורופור בקרה (k) ביום 1 או 15 (hChR2-EYFP: n = 9 חולדות, ** P = 0.0049; בקרה: n = 9, P = 0.1497). l, התפתחות ציון ההעדפה (n = 9 hChR2, n = 9 בקבוצת הביקורת; **P < 0.001, ***P < 0.0001). l, התפתחות ציון ההעדפה (n = 9 hChR2, n = 9 בקבוצת הביקורת; **P < 0.001, ***P < 0.0001). l, Эволюция показателя предпочтения (n = 9 hChR2, n = 9 контрольных; **P <0,001, ***P <0,0001). l, התפתחות ציון ההעדפה (n = 9 hChR2, n = 9 בקרות; **P < 0.001, ***P < 0.0001). l，偏好评分的演变（n = 9 hChR2，n = 9 对照；**P < 0.001，***P < 0.0001）. l，偏好评分的演变（n = 9 hChR2，n = 9 对照；**P < 0.001，***P < 0.0001）. l, Эволюция показателей предпочтения (n = 9 hChR2, n = 9 контролей; **P <0,001, ***P <0,0001). l, התפתחות ציוני העדפה (n = 9 hChR2, n = 9 בקרות; **P < 0.001, ***P < 0.0001).m, ביטוי FOS בתגובה להפעלה אופטוגנטית של t-hCO ב-S1. מוצגות תמונות של ביטוי FOS (משמאל) וכימות (n = 3 לכל קבוצה; *P < 0.05, **P < 0.01 ו-***P < 0.001) (מימין). מוצגות תמונות של ביטוי FOS (משמאל) וכימות (n = 3 לכל קבוצה; *P < 0.05, **P < 0.01 ו-***P < 0.001) (מימין). Показаны изображения экспрессии FOS (слева) и количественного определения (n = 3 למשחק; * P <0,05, <01 ** P <0,0***) (справа). תמונות של ביטוי FOS (משמאל) וכימות (n = 3 לכל קבוצה; *P<0.05, **P<0.01, ו-***P<0.001) מוצגות (מימין).显示了FOS 表达（左）和量化（每组n = 3；*P < 0.05、**P < 0.01 和***P < 0.001）（像〳）显示了FOS 表达（左）和量化（每组n = 3；*P < 0.05、**P < 0.01 和***P < 0.001）（像〳） Показаны изображения экспрессии FOS (слева) и количественного определения (n = 3 למשחק; * P <0,05, <01 ** P <0,0***) (справа). תמונות של ביטוי FOS (משמאל) וכימות (n = 3 לכל קבוצה; *P<0.05, **P<0.01, ו-***P<0.001) מוצגות (מימין).סרגל קנה מידה, 100 מיקרומטר. הנתונים מבוטאים כממוצע ± סטיית תקן של BLA, שקד בסיסי, MDT, גרעין תלמי דורסומדיאלי, PAG, אפור פריאקדוקטלי.
לבסוף, שאלנו האם t-hCO יכול לווסת את התנהגות החולדות. כדי לבדוק זאת, השתלנו hCO המבטא hChR2-EYFP לתוך S1, ו-90 יום לאחר מכן, שתלנו סיבים אופטיים לתוך t-hCO לצורך העברת אור. לאחר מכן אימנו את החולדות באמצעות פרדיגמת התניה אופרנטית שונה (איור 5h). הנחנו את החיות בתא בדיקה התנהגותי והפעלנו באופן אקראי גירויי לייזר כחולים (473 ננומטר) ואדומים (635 ננומטר) למשך 5 שניות. החיות קיבלו גמול מים אם ליקקו במהלך גירוי אור כחול אך לא ליקקו במהלך גירוי אור אדום. ביום הראשון של האימון, החיות לא הראו הבדל בליקוק כאשר גורו באור כחול או אדום. עם זאת, ביום 15, חיות שהושתלו ב-hCO המבטא hChR2-EYFP הראו ליקוק פעיל יותר כאשר גורו באור כחול בהשוואה לגירוי אור אדום. שינויים אלה בהתנהגות הליקוק לא נצפו בחיות בקרה שהושתלו עם hCO המבטא את פלואורופור הבקרה (שיעור הצלחה בלמידה: hChR2 89%, EYFP 0%, איור 5i-1 וסרטון משלים 2). נתונים אלה מצביעים על כך שתאי t-hCO יכולים להפעיל נוירונים בחולדות כדי לעורר התנהגות חיפוש גמול. כדי לגלות אילו מעגלים עצביים של t-hCO בחולדות עשויים להיות מעורבים בשינויים התנהגותיים אלה, הפעלנו אופטוגנטית את t-hCO בבעלי חיים מאומנים ואספנו רקמות 90 דקות לאחר מכן. אימונוהיסטוכימיה חשפה ביטוי של חלבון FOS תלוי פעילות במספר אזורים במוח המעורבים בהתנהגות מונעת, כולל קליפת המוח הקדם-מצחית המדיאלית, התלמוס המדיאלי וחומר אפור פריאדוקטלי, אשר בא לידי ביטוי בחיות בקרה לא מגורה או בבעלי חיים. אורז. 5m). יחד, נתונים אלה מצביעים על כך שתאי t-hCO יכולים לווסת את פעילות העצבית של חולדות כדי להניע התנהגות.
אורגנואידים עצביים מייצגים מערכת מבטיחה לחקר התפתחות ומחלות אנושיות במבחנה, אך הם מוגבלים עקב היעדר קשרים בין מעגלים הקיימים in vivo. פיתחנו פלטפורמה חדשה שבה השתלנו hCO לתוך S1 של חולדות מוקדמות לאחר לידה בעלות מערכת חיסונית מדוכאת כדי לחקור את התפתחות ותפקוד תאים אנושיים in vivo. הראינו ש-t-hCO מפתח סוגי תאים בוגרים שלא נצפו במבחנה28 וכי-t-hCO משולב אנטומית ותפקודית במוח המכרסם. שילוב t-hCO במעגלים עצביים של מכרסמים אפשר לנו ליצור קשר בין פעילות תאית אנושית להתנהגות בעלי חיים שנחקרה, מה שמראה שנוירוני t-hCO יכולים לווסת את פעילות העצבית של חולדות כדי להניע תגובות התנהגותיות.
לפלטפורמה שאנו מתארים יש מספר יתרונות על פני מחקרים קודמים על השתלת תאים אנושיים במוחות מכרסמים. ראשית, השתלנו hCO לקליפת המוח המתפתחת של חולדות לאחר לידה מוקדמת, דבר שעשוי להקל על האינטגרציה האנטומית והתפקודית. שנית, ניטור MRI של t-hCO אפשר לנו לחקור את מיקום השתל וגדילתו בבעלי חיים חיים, מה שאפשר לנו לערוך מחקרים ארוכי טווח בבעלי חיים רבים ולקבוע את האמינות של מספר שורות תאים hiPS. לבסוף, השתלנו אורגנואידים שלמים, במקום תרחיפים מבודדים של תאים בודדים, שהם פחות הרסניים לתאים אנושיים ויכולים לקדם את האינטגרציה והיצירה של נוירונים בקליפת המוח האנושית במוחות חולדות.
אנו מכירים בכך שלמרות ההתקדמות בפלטפורמה זו, אילוצים זמניים, מרחביים וחוצי-מינים מונעים היווצרות של מעגלים עצביים אנושיים ברמת דיוק גבוהה, אפילו לאחר השתלה בשלב מוקדם של ההתפתחות. לדוגמה, לא ברור האם הפעילות הספונטנית שנצפתה ב-t-hCO מייצגת פנוטיפ התפתחותי הדומה לפעילות הקצבית שנצפתה במהלך התפתחות קורטיקלית, או שמא היא נובעת מהיעדר סוגי תאים מדכאים הקיימים ב-t-hCO. באופן דומה, לא ברור באיזו מידה היעדר הלמינציה ב-t-hCO משפיע על קישוריות השרשרת30. עבודה עתידית תתמקד בשילוב סוגי תאים אחרים כגון מיקרוגליה אנושית, תאי אנדותל אנושיים, ופרופורציות משתנות של נוירונים פנימיים גאבא-ארגיים כפי שמוצג באמצעות הרכבה 6 במבחנה, כמו גם בהבנת האופן שבו אינטגרציה ועיבוד עצבי יכולים להתרחש ברמות תעתוק, סינפטיות והתנהגותיות משתנות של t-hCO בתאים שהתקבלו מחולים.
בסך הכל, פלטפורמה זו של in vivo מייצגת משאב רב עוצמה שיכול להשלים התפתחות מוח אנושי ומחקר מחלות in vitro. אנו צופים שפלטפורמה זו תאפשר לנו לגלות פנוטיפים חדשים ברמת הגדיל בתאים שמקורם בחולים, אשר בדרך כלל חמקמקים, ולבחון אסטרטגיות טיפוליות חדשות.
ייצרנו hCO2.5 מתאי HiPS כפי שתואר קודם לכן. כדי להתחיל ייצור hCO מתאי hiPS שגודלו על שכבות הזנה, מושבות שלמות של תאי hiPS הוסרו מכלי תרבית באמצעות דיספאזה (0.35 מ"ג/מ"ל) והועברו לתרביות פלסטיק בעלות היצמדות נמוכה במיוחד המכילות מכלים עם מצע תרבית תאי hiPS (Corning) בתוספת של שני מעכבי SMAD: דורסומורפין (5 מיקרומולר; P5499, Sigma-Aldrich) ו-SB-431542 (10 מיקרומולר; 1614, Tocris) ומעכב ROCK Y-27632 (10 מיקרומולר; S1049, Selleckchem). במהלך 5 הימים הראשונים, מצע תאי ה-hiPS הוחלף מדי יום ודורסומורפין ו-SB-431542 נוספו. ביום השישי בתרחיף, הועברו ספרואידים עצביים למדיום עצבי המכיל נוירובזאל-A (10888, Life Technologies), תוסף B-27 ללא ויטמין A (12587, Life Technologies), גלוטמקס (1:100, Life Technologies), פניצילין וסטרפטומיצין (1:100, Life Technologies) ותוספות של גורם גדילה אפידרמלי (EGF; 20 ng ml−1; R&D Systems) וגורם גדילה פיברובלסטי 2 (FGF2; 20 ng ml−1; R&D Systems) עד יום 24. מיום 25 ועד יום 42, המדיום נוספה בגורם נוירוטרופי שמקורו במוח (BDNF; 20 ng ml−1, Peprotech) ונוירוטרופין 3 (NT3; 20 ng ml−1; Peprotech) עם החלפת מדיום כל יומיים. ביום השישי בתרחיף, הועברו ספרואידים עצביים למדיום עצבי המכיל נוירובזאל-A (10888, Life Technologies), תוסף B-27 ללא ויטמין A (12587, Life Technologies), גלוטמקס (1:100, Life Technologies), פניצילין וסטרפטומיצין (1:100, Life Technologies) ותוספות של גורם גדילה אפידרמלי (EGF; 20 ng ml−1; R&D Systems) וגורם גדילה פיברובלסטי 2 (FGF2; 20 ng ml−1; R&D Systems) עד יום 24. מיום 25 ועד יום 42, המדיום נוספה בגורם נוירוטרופי שמקורו במוח (BDNF; 20 ng ml−1, Peprotech) ונוירוטרופין 3 (NT3; 20 ng ml−1; Peprotech) עם החלפת מדיום כל יומיים.ביום השישי בתרחיף, הספרואידים העצביים הועברו למצע עצבי המכיל Neurobasal-A (10888, Life Technologies), תוסף B-27 ללא ויטמין A (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies), פניצילין.и стрептомицин (1:100, Life Technologies) и дополнены эпидермальным фактором роста (EGF; 20 нг/мл; R&D Systems) и фактолнены эпидермальным фактором роста (EGF; 20 нг/мл; R&D Systems) и фактобстаром робста20GF; нг/мл; R&D Systems) עד 24-го дня. וסטרפטומיצין (1:100, Life Technologies) ותוספות של גורם גדילה אפידרמלי (EGF; 20 ng/ml; R&D Systems) וגורם גדילה פיברובלסטי 2 (FGF2; 20 ng/ml; R&D Systems) עד יום 24.מימים 25 עד 42, נוספו למדיום גורם נוירוטרופי שמקורו במוח (BDNF; 20 ng ml-1, Peprotech) ונוירוטרופין 3 (NT3; 20 ng ml-1, Peprotech), תוך החלפת המדיום כל יומיים.在悬浮的第6 天，将神经球体转移到含有neurobasal-A（10888，Life Technologies）、不含维生焠B-27生焠补充剂（12587，Life Technologies）、GlutaMax（1:100，Life Technologies）、青霉素的神经培养基中和铼，1瓼，1链霉: טכנולוגיות）并辅以表皮生长因子（EGF；20 ng ml-1；R&D Systems）和成纤维细胞生长因子2（FGF2；20 ng ml-1；R&D Systems）直至第24 天。在 悬浮 的 第 第 6 天 将 神经 球体 转移 含有 含有 neurobasal-a （10888 ， Life Technologies０ 焫 縍b-27 补充剂 （12587 ， טכנולוגיות חיים טכנולוגיות） 表皮 生长 因子 （（（20 ng ml-1 ； r&d Systems） 成 纤维 细胞 生长 2 （fgf2 ； 20 ng ml- 1；穛笛2 Systems）因子 На 6-й день суспензии нейросферы были переведены на добавку, содержащую нейробазал-А (10888, Life Technologies), добава-27, добававку А (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies), пенициллин- нейтрализованный стрептомицин (1:100, Life Technologies) с добавлением фальпицин (EGF; 20 нг мл-1; R&D Systems) и фактора роста фибробластов 2 (FGF2; 20 нг מל-1) 1; ביום 6, תרחיפי הנוירוספרה הוחלפו לתוסף המכיל נוירובזאל-A (10888, Life Technologies), תוסף B-27 ללא ויטמין A (12587, Life Technologies), גלוטמקס (1:100, Life Technologies), סטרפטומיצין מנוטרל פניצילין (1:100, Life Technologies) בתוספת גורם גדילה אפידרמלי (EGF; 20 ננוגרם מ"ל-1; R&D Systems) וגורם גדילה פיברובלסטי 2 (FGF2; 20 ננוגרם מ"ל-1); מערכות מחקר ופיתוח) עד 24-го дня. מערכות מו"פ) עד יום 24.מימים 25 עד 42, נוספו למדיום התרבית גורם נוירוטרופי שמקורו במוח (BDNF; 20 ng ml-1, Peprotech) וגורם נוירוטרופי 3 (NT3; 20 ng ml-1, Peprotech) כל יומיים. החלפת המדיום פעם אחת.החל מיום 43, hCO נשמר במדיום נוירובזאלי-A ללא תוספת (NM; 1088022, Thermo Fisher) עם החלפת מדיום כל 4-6 ימים. כדי להשיג hCO מתאי hiPS שגודלו בתנאים ללא הזנה, תאי hiPS הודגרו עם Accutase (AT-104, Innovate Cell Technologies) ב-37°C למשך 7 דקות, פורקו לתאים בודדים, וצופו על פלטות AggreWell 800 (34815, STEMCELL Technologies) בצפיפות של 3 × 106 תאים בודדים לבאר במדיום Essential 8 בתוספת מעכב ROCK Y-27632 (10 מיקרומולר; S1049, Selleckchem). לאחר 24 שעות, המדיום שבבארות הוזרקו באמצעות פיפטה מעלה ומטה לתוך מדיום המכיל מדיום Essential 6 (A1516401, Life Technologies) בתוספת דורסומורפין (2.5 מיקרומולר; P5499, Sigma-Aldrich) ו-SB-431542 (10 מיקרומולר; 1614, Tocrada). מיום 2 עד 6, מדיום Essential 6 הוחלף מדי יום בדורסומורפין ובתוספת SB-431542. מהיום השישי, תרחיפי הנוירוספרה הועברו למדיום הנוירו-בזאלי ונשמרו כמתואר לעיל.
כל הליכי החיות בוצעו בהתאם להנחיות הטיפול בבעלי חיים שאושרו על ידי הוועדה המנהלית לטיפול בבעלי חיים במעבדה של אוניברסיטת סטנפורד (APLAC). חולדות RNU (rnu/+) בהריון נרכשו (מעבדות צ'ארלס ריבר) או שוכנו. בעלי החיים הוחזקו במחזור אור-חושך של 12 שעות עם מזון ומים לפי רצונם. גורי חולדות עירומים (FOXN1–/–) בגילאי שלושה עד שבעה ימים זוהו על ידי גדילת שפם לא בוגר לפני ההשמדה. גורים (זכרים ונקבות) הורדמו עם 2-3% איזופלוראן והונחו על מסגרת סטריאוטקסית. בוצעה טרפנציה של הגולגולת בקוטר של כ-2-3 מ"מ מעל S1 תוך שמירה על שלמות הדורה מאטר. לאחר מכן השתמשו במחט 30-G (כ-0.3 מ"מ) ממש מחוץ לקרניוטומיה כדי לנקב את הדורה. לאחר מכן מרחו HCO3 על פרפילם דק בגודל 3×3 ס"מ והסירו עודפי מצע. בעזרת מזרק המילטון המחובר למחט 23 G, זווית 45°, שאבו בעדינות hCO3 לקצה הדיסטלי ביותר של המחט. לאחר מכן, התקינו את המזרק על משאבת המזרק המחוברת למכשיר הסטריאוטקסי. לאחר מכן, הניחו את קצה המחט מעל חור ניקוב ברוחב 0.3 מ"מ שנוצר מראש בדורה (z = 0 מ"מ) וצרו את המזרק ב-1-2 מ"מ (z = כ-1.5 מ"מ) עד שהמחט נמצאת בין הדורה מאטר A. נוצר אטם צפוף. לאחר מכן, הרימו את המזרק למרכז פני השטח הקורטיקליים ב-z = -0.5 מ"מ והזריקו hCO3 בקצב של 1-2 מיקרוליטר לדקה. לאחר השלמת הזרקת ה-hCO3, המחט נמשכת בקצב של 0.2-0.5 מ"מ לדקה, העור נתפר, והגור מונח מיד על כרית חימום חמה עד להחלמה מלאה. חלק מהחיות הושתלו דו-צדדית.
כל הניסויים בבעלי חיים בוצעו בהתאם להנחיות הטיפול בבעלי חיים שאושרו על ידי APLAC באוניברסיטת סטנפורד. חולדות (מעל 60 יום לאחר ההשתלה) עברו הרדמה של 5% איזופלוראן והורדמו עם 1-3% איזופלוראן במהלך ההדמיה. לצורך הדמיה, נעשה שימוש בסורק קידוח אופקי מוגן באופן אקטיבי של 7 טסלה של Bruker (Bruker Corp.) עם הנעת גרדיאנט של חברת החשמל הבינלאומית (IECO), תוספות גרדיאנט מוגנות בקוטר פנימי של 120 מ"מ (600 mT/m, 1000 T/m/s) באמצעות AVANCE. III, יכולות RF רב-סלילים בעלות שמונה ערוצים ויכולות מרובות ליבות, ופלטפורמת Paravision 6.0.1 הנלווית. ההקלטה בוצעה באמצעות סליל RF נפחי מנותק באופן אקטיבי בקוטר פנימי של 86 מ"מ וסליל RF מקורר קריוגן בעל ארבעה ערוצים לקליטה בלבד. טכנולוגיית Axial 2D Turbo-RARE (זמן חזרה = 2500 אלפיות שנייה, זמן הד = 33 אלפיות שנייה, 2 ממוצעים) עם 16 לכידות פרוסות, עובי פרוסה 0.6-0.8 מ"מ, המכילה 256 × 256 דגימות. האותות התקבלו באמצעות סליל RF נפחי בעל משדר-מקלט ריבועי בקוטר פנימי של 2 ס"מ (Rapid MR International, LLC). לבסוף, השתמשו בפונקציות הערכת פני השטח המובנות של Imaris (BitPlane) לצורך רינדור תלת-ממדי וניתוח נפח. השתלה מוצלחת הוגדרה כהשתלה שבה נוצרו אזורים של אות MRI רציף משוקלל T2 בהמיספרה המושתלת. דחיית שתל הוגדרה כשתל שלא יצר אזורים של אות MRI רציף משוקלל T2 בהמיספרה המושתלת. t-hCO תת-קורטיקלי לא נכלל בניתוח שלאחר מכן.
כדי לבטא ביציבות GCaMP6s ב-hCO3 עבור דימות סידן דו-פוטוני, תאי hiPS הודבקו ב-pLV[Exp]-EF1a::GcaMP6s-WPRE-Puro ולאחר מכן נבחרו אנטיביוטיקה. בקצרה, התאים הופרדו עם EDTA והושעו ב-1 מ"ל של מדיום Essential 8 בצפיפות של כ-300,000 תאים בנוכחות פוליברן (5 מיקרוגרם/מ"ל) ו-15 מיקרוליטר של וירוס. לאחר מכן, התאים הודגרו בתרחיף למשך 60 דקות ונזרעו בצפיפות של 50,000 תאים לבאר. לאחר קומפלקס, התאים טופלו ב-5-10 מיקרוגרם מ"ל-1 פורומיצין למשך 5-10 ימים או עד להופעת מושבות יציבות. זיהום hCO3 חריף בוצע כפי שתואר קודם לכן5 עם כמה שינויים. בקצרה, העבירו hCO3 ביום 30-45 לתוך צינורות מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מ"ל אפנדורף המכילים 100 מיקרוליטר של מדיום עצב. לאחר מכן, מוסרים כ-90 מיקרוליטר מהמדיום, מוסיפים למבחנה 3-6 מיקרוליטר של lentivirus בעל טיטר גבוה (מ-0.5 x 108 עד 1.2 x 109), ו-hCO3 מועבר לאינקובטור למשך 30 דקות. לאחר מכן, מוסיפים 90-100 מיקרוליטר של מדיום לכל מבחנה ומחזירים את המבחנים לאינקובטור למשך הלילה. למחרת, מעבירים את hCO3 למדיום עצב טרי בצלחות בעלות חיבור נמוך. לאחר 7 ימים, hCO3 הועבר לצלחות זכוכית בעלות תחתית של 24 בארות לצורך ויזואליזציה והערכת איכות ההדבקה. pLV[Exp]-SYN1::EYFP-WPRE ו-pLV[Exp]-SYN1::hChR2-EYFP-WPRE נוצרו על ידי VectorBuilder. lentivirus משמש ברוב הניסויים מכיוון שהוא משולב בגנום המארח, ומאפשר ביטוי גן מדווח בקווי תאים נגועים. למעקב אחר כלבת, קבוצת hCO ביום 30-45 נדבקה במשותף עם rabies-ΔG-eGFP ו-AAV-DJ-EF1a-CVS-G-WPRE-pGHpA (פלסמיד #67528, Addgene), נשטפה היטב במשך 3 ימים, והושתלה בחולדות ב-S1 ונשמרה in vivo למשך 7-14 ימים.
לצורך אימונוציטוכימיה, בעלי החיים עברו הרדמה וזורפו את המוח באופן טרנסקרדיאלי עם PBS ולאחר מכן 4% פאראפורמלדהיד (PFA ב-PBS; Electron Microscopy Sciences). המוחות קובעו ב-4% PFA למשך שעתיים או למשך הלילה ב-4°C, הוקפאו ב-30% סוכרוז ב-PBS למשך 48-72 שעות, והוטמעו ב-OCT 30% סוכרוז ביחס של 1:1 (Tissue-Tek OCT Compound 4583, Sakura Finetek) וחתכים קורונליים בוצעו בעובי של 30 מיקרומטר באמצעות קריוסטט (Leica). לצורך אימונוהיסטוכימיה של חתכים עבים, בעלי החיים עברו זיור עם PBS, והמוח נותח וחותך קורונלי בעובי של 300-400 מיקרומטר באמצעות ויברטום (Leica) והחתכים קובעו עם 4% PFA למשך 30 דקות. לאחר מכן נשטפו חתכים קריוגניים או חתכים עבים עם PBS, נחסמו למשך שעה בטמפרטורת החדר (10% סרום חמורים רגיל (NDS) ו-0.3% Triton X-100 מדולל ב-PBS) ונחסמו בתמיסת חסימה ב-4°C. – דגירה חתכים קריוגניים הודגרו למשך הלילה והחתכים העבים הודגרו במשך 5 ימים. הנוגדנים העיקריים ששימשו היו: אנטי-NeuN (עכבר, 1:500; ab104224, abcam), אנטי-CTIP2 (חולדה, 1:300; ab18465, abcam), אנטי-GFAP (ארנבת, 1:1,000; Z0334, Dako), אנטי-GFP (עוף, 1:1,000; GTX13970, GeneTex), אנטי-HNA (עכבר, 1:200; ab191181, abcam), אנטי-NeuN (ארנבת, 1:500; ABN78, Millipore), אנטי-PDGFRA (ארנבת, 1:200; sc-338, סנטה קרוז), אנטי-PPP1R17 (ארנבת, 1:200; HPA047819, נוגדני אטלס), אנטי-RECA-1 (עכבר, 1:50; ab9774, abcam), אנטי-SCG2 (ארנבת, 1:100; 20357-1-AP, Proteintech), אנטי-SOX9 (עז, 1:500; AF3075, R&D Systems), נטרין G1a (עז, 1:100; AF1166, R&D Systems), אנטי-STEM121 (עכבר, 1:200; Y40410, Takara Bio), אנטי-SATB2 (עכבר, 1:50; ab51502, abcam), אנטי-GAD65/67 (ארנבת, 1:400; ABN904, Millipore) ואנטי-IBA1 (עז, 1:100; ab5076, abcam). הנוגדנים העיקריים ששימשו היו: אנטי-NeuN (עכבר, 1:500; ab104224, abcam), אנטי-CTIP2 (חולדה, 1:300; ab18465, abcam), אנטי-GFAP (ארנבת, 1:1,000; Z0334, Dako), אנטי-GFP (עוף, 1:1,000; GTX13970, GeneTex), אנטי-HNA (עכבר, 1:200; ab191181, abcam), אנטי-NeuN (ארנבת, 1:500; ABN78, Millipore), אנטי-PDGFRA (ארנבת, 1:200; sc-338, סנטה קרוז), אנטי-PPP1R17 (ארנבת, 1:200; HPA047819, נוגדני אטלס), אנטי-RECA-1 (עכבר, 1:50; ab9774, abcam), אנטי-SCG2 (ארנבת, 1:100; 20357-1-AP, Proteintech), אנטי-SOX9 (עז, 1:500; AF3075, R&D Systems), נטרין G1a (עז, 1:100; AF1166, R&D Systems), אנטי-STEM121 (עכבר, 1:200; Y40410, Takara Bio), אנטי-SATB2 (עכבר, 1:50; ab51502, abcam), אנטי-GAD65/67 (ארנבת, 1:400; ABN904, Millipore) ואנטי-IBA1 (עז, 1:100; ab5076, abcam). Использовались следующие первичные антитела: анти-NeuN (мышиные, 1:500; ab104224, abcam), анти-CTIP2 (крысины5,abcam,abcam,abcam,abcam,abcam),abcam анти-GFAP (кроличьи, 1:1000; Z0334, Dako), анти- -GFP (курица, 1:1000; GTX13970, GeneTex), анти-HNA (мышь, 1:200; ab19118), (мышь, 1:200; ab19118), (ротикан, ab19118), ( 1:500; ABN78, Millipore), анти-PDGFRA (кролик, 1:200; sc-338, Санта-Круз), анти-PPP1R17 (кролик, 1:200; HPA047819, Atlas Antibodies), анти-RECA-1 (мышь, 1:50; ab9774, abcam), анти-SCG2, анти-SCG2, анти-SCG2, 20357-1-AP, Proteintech), анти-SOX9 (козий, 1:500; AF3075, R&D Systems), нетрин G1a (козий, 1:100; AF1166, R&D Systems), анти-STEM121 (мыный, мыный, 120ши; Y40410, Takara Bio), анти-SATB2 (мышь, 1:50; ab51502, abcam), анти-GAD65/67 (кролик, 1:400; ABN904, Millipore) ו анти-IBA1 (коза, 1:100; аб5076, абкам). הנוגדנים העיקריים ששימשו היו: אנטי-NeuN (עכבר, 1:500; ab104224, abcam), אנטי-CTIP2 (חולדה, 1:300; ab18465, abcam), אנטי-GFAP (ארנבת, 1:1000; Z0334, Dako), אנטי-GFP (עוף, 1:1000; GTX13970, GeneTex), אנטי-HNA (עכבר, 1:200; ab191181, abcam), אנטי-NeuN (ארנבת, 1:500; ABN78, Millipore), אנטי-PDGFRA (ארנבת, 1:200; sc-338, סנטה קרוז), אנטי-PPP1R17 (ארנבת, 1:200; HPA047819, נוגדני אטלס), אנטי-RECA-1 (עכבר, 1:50; ab9774, abcam), אנטי-SCG2 (ארנבת, 1:100; 20357-1-AP, Proteintech), אנטי-SOX9 (עז, 1:500; AF3075, R&D Systems), נטרין G1a (עז, 1:100; AF1166, R&D Systems), אנטי-STEM121 (עכבר, 1:200; Y40410, Takara Bio), אנטי-SATB2 (עכבר, 1:50; ab51502, abcam), אנטי-GAD65/67 (ארנבת, 1:400; ABN904, Millipore) ואנטי-IBA1 (עז, 1:100; ab5076, abkam).使用的一抗是：抗NeuN（小鼠，1:500；ab104224，abcam）抗CTIP2（大鼠，1:3 00；ab18465，abcam），抗GFAP（兔，1:1,000；Z0334，Dako），抗-GF P（鸡，1:1,000；GTX13970，GeneTex），抗HNA（小鼠，1:200；ab1911 81，abcam），抗NeuN（兔，1:500；ABN78，Millipore），抗PDGFRA（兔， 1:200；sc-338，Santa Cruz），抗PPP1R17（兔，1:200；HPA047819，Atlas抗体），抗RECA-1（小鼠，1:50；ab9774，abcam），抗SCG2（兔） , מספר Systems），抗STEM121（小鼠, 1:200;使用的一抗是：抗NeuN（小鼠，1:500；ab104224，abcam）抗CTIP2（大鼠，1 :300；ab18465，abcam），抗GFAP（兔，1:1,000；Z0334，Dako），抗-GFP（鸡，1:1,000；GTX13970，GeneTex），抗HNA（小鼠，1:200；ab 191181，abcam），抗NeuN（兔，1:500；ABN78，Millipore％弔，抗1: 200；sc-338，Santa Cruz），抗PPP1R17（兔，1:200；HPA047819，Atlas抗体），抗RECA-1（小鼠，1:50；ab9774，abcam），抗SCG2 מספר מערכות）頏1:20,;Y40410, Takara Bio), אנטי-SATB2 (עכבר, 1:50; ab51502, abcam), אנטי-GAD65/67 (ארנבת, 1:400; ABN904, Millipore) ואנטי-IBA1 (עז, 1:100; ab5076, abcam).הנוגדנים העיקריים ששימשו היו: אנטי-NeuN (עכבר, 1:500; ab104224, abcam), אנטי-CTIP2 (חולדה, 1:300; ab18465, abcam), אנטי-GFAP (ארנבת, 1:1000; Z0334, Dako). , אנטי-GFP (עוף, 1:1000; GTX13970, GeneTex), אנטי-HNA (עכבר, 1:200; ab191181, abcam), אנטי-NeuN (ארנבת, 1:500; ABN78, Millipore), אנטי-PDGFRA (ארנבת, 1:200; sc-338, סנטה קרוז), אנטי-PPP1R17 (ארנבת, 1:200; HPA047819, נוגדן אטלס), אנטי-RECA-1 (עכבר, 1:50; ab9774, abcam), אנטי-SCG2 (ארנבת), 1:100;20357-1-AP, Proteintech), анти-SOX9 (коза, 1:500; AF3075, R&D Systems), Нетрин G1a (коза, 1:100; AF1166, R&D Systems) Bio), анти-SATB2 (мышь, 1:50; ab51502, abcam), анти-GAD65/67 (кролик, 1:400; ABN904, Millipore) ו анти-IBA1 (коза, 1:1076; абаба76, аба50ка). 20357-1-AP, Proteintech), אנטי-SOX9 (עז, 1:500; AF3075, R&D Systems), נטרין G1a (עז, 1:100; AF1166, R&D Systems), אנטי-STEM121 (עכבר, 1:200; Y40410, Takara Bio), אנטי-SATB2 (עכבר, 1:50; ab51502, abcam), אנטי-GAD65/67 (ארנבת, 1:400; ABN904, Millipore), ואנטי-IBA1 (עז, 1:100; ab5076, abkam).לאחר מכן נשטפו החתכים עם PBS והודגרו עם נוגדן משני למשך שעה בטמפרטורת החדר (חתכים קפואים) או למשך הלילה ב-4 מעלות צלזיוס (חתכים עבים). נעשה שימוש בנוגדן משני של Alexa Fluor (Life Technologies) מדולל 1:1000 בתמיסת חסימה. לאחר השטיפה עם PBS, הגרעינים נצפו באמצעות Hoechst 33258 (Life Technologies). לבסוף, השקופיות הונחו על מיקרוסקופ עם כיסויי זכוכית (Fisher Scientific) באמצעות Aquamount (Polysciences) ונותחו במיקרוסקופ פלואורסצנטי Keyence (BZ-X analyzer) או במיקרוסקופ קונפוקלי Leica TCS SP8 (Las-X) על התמונה. התמונות עובדו באמצעות תוכנת ImageJ (Fiji). כדי לכמת את שיעור הנוירונים האנושיים ב-t-hCO3 ובקליפת המוח של החולדה, צולמו תמונות מלבניות ברוחב 387.5 מיקרומטר במרכז ה-t-hCO3, בקצה קליפת המוח של החולדה או בסמוך לה. שולי השתל נקבעו על ידי הערכת שינויים בשקיפות הרקמה, גרעיני HNA+ ו/או נוכחות אוטופלואורסצנציה של הרקמה. בכל תמונה, המספר הכולל של תאי NeuN+ ו-HNA+ חולק במספר הכולל של תאי NeuN+ באותו אזור. כדי להבטיח שרק תאים עם גרעינים במישור התמונה ייספרו, רק תאים שהם גם Hoechst+ נכללים בחישוב. ממוצע של שתי תמונות המופרדות על ידי לפחות 1 מ"מ בוצע כדי להפחית את השגיאה הסטטיסטית.
שבוע לפני איסוף הדגימות, יש להניח את בעלי החיים המושתלים hCO3 (כ-8 חודשי התמיינות) בחדר חשוך עם שפם גזום כדי למזער גירוי חושי. בידוד הגרעינים בוצע כמתואר קודם לכן, עם כמה שינויים. בקצרה, t-hCO3 ו-hCO3 הושמדו באמצעות ליזיס תאים דטרגנטי-מכני ומטחנת רקמות זכוכית בנפח 2 מ"ל (D8938, Sigma-Aldrich/KIMBLE). לאחר מכן סוננו הגרעינים הגולמיים באמצעות פילטר 40 מיקרומטר ועברו צנטריפוגה ב-320 גרם למשך 10 דקות ב-4 מעלות צלזיוס לפני ביצוע גרדיאנט צפיפות סוכרוז. לאחר שלב הצנטריפוגה (320 גרם למשך 20 דקות ב-4 מעלות צלזיוס), הדגימות הושעו מחדש ב-0.04% BSA/PBS עם תוספת של 0.2 יחידות של מעכב RNase µl-1 (40 u µl-1, AM2682, Ambion) והועברו דרך פילטר זרימה 40 מיקרומטר. הגרעינים המנותקים הושעו מחדש ב-PBS המכיל 0.02% BSA והועמסו על שבב Chromium Single Cell 3′ (התאוששות משוערת של 8,000 תאים לכל נתיב). ספריות snRNA-seq הוכנו באמצעות ערכת Chromium Single cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics). ספריות snRNA-seq הוכנו באמצעות ערכת Chromium Single cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics). Библиотеки snRNA-seq были приготовлены с помощью Chromium Single cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics). ספריות snRNA-seq הוכנו באמצעות Chromium Single cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics). snRNA-seq 文库是使用Chromium Single cell 3′ GEM、Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics) 制备的。 snRNA-seq 文库是使用Chromium Single cell 3′ GEM、Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics) 制备的。 Библиотеку snRNA-seq готовили с использованием Chromium Single Cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics). ספריית snRNA-seq הוכנה באמצעות Chromium Single Cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics).ספריות מדגימות שונות אוגדו ורוצפו על ידי Admera Health על גבי NovaSeq S4 (Illumina).
רמות ביטוי גנים עבור כל ברקוד גרעיני משוער נמדדו כימות באמצעות חבילת תוכנת הניתוח 10x Genomics CellRanger (גרסה 6.1.2). באופן ספציפי, הקריאות הותאמו לשילוב של גנומים אנושיים (GRCh38, Ensemble, גרסה 98) וחולדות (Rnor_6.0, Ensemble, גרסה 100) שנוצרו באמצעות הפקודה mkref ובאמצעות הפקודה count עם הפקודה –include-introns=TRUE כדי לכמת את הקריאות הממופות לאזורי אינטרונים. עבור דגימות t-hCO3, גרעינים אנושיים זוהו על סמך הדרישה השמרנית שלפחות 95% מכלל הקריאות הממופות יתאימו לגנום האנושי. כל הניתוחים הבאים בוצעו על מערך ברקודים מסונן שהוצא מ-CellRanger באמצעות חבילת R (גרסה 4.1.2) Seurat (גרסה 4.1.1)32.
כדי להבטיח שרק גרעינים באיכות גבוהה ייכללו בניתוח שלאחר מכן, יושם תהליך סינון איטרטיבי עבור כל דגימה. ראשית, מזוהים ומוסרים גרעינים באיכות נמוכה עם פחות מ-1000 גנים ייחודיים שנמצאו ויותר מ-20% מכלל המיטוכונדריה. לאחר מכן, מטריצת מספר הגנים הגולמית נורמלה על ידי רגרסיה בינומית שלילית מוסדרת באמצעות הפונקציה sctransform(vst.flavor=”v2″), אשר זיהתה גם את 3000 הגנים המשתנים ביותר באמצעות פרמטרים ברירת מחדל. הפחתת מימדים בוצעה על הגנים בעלי המשתנה העליון באמצעות ניתוח רכיבים ראשיים (PCA) עם פרמטרים ברירת מחדל תוך שימוש בממד מערך נתונים של 30 (dims = 30 נבחר על סמך בדיקה ויזואלית של אתרי הברך ושימש עבור כל הדגימות וניתוחי האנסמבל). לאחר מכן ביצענו מספר סבבים של אשכולות איטרטיביים (רזולוציה = 1) כדי לסווג גנים על סמך ספירת גנים נמוכה באופן חריג (חציון מתחת לאחוזון ה-10), ספירת גנים מיטוכונדריה גבוהה באופן חריג (חציון מעל האחוזון ה-95) כדי לזהות ולהסיר תאים משוערים באיכות נמוכה. אשכולות ו/או שיעור גבוה של תאומים חשודים שזוהו באמצעות חבילת DoubletFinder33 (ציון DoubletFinder ממוצע מעל האחוזון ה-95). דגימות t-hCO (n=3) ודגימות hCO (n=3) שולבו בנפרד באמצעות הפונקציה IntegrateData עם הפרמטרים הנ"ל. לאחר מכן סבב נוסף של סינון איכותני של מערך הנתונים המשולב בוצע כמתואר לעיל.
לאחר הסרת הגרעינים באיכות ירודה, מערך הנתונים המשולב קובץ (רזולוציה = 0.5) והוטמע למטרות ויזואליזציה של UMAP34. גני סמן עבור כל אשכול נקבעו באמצעות פונקציית FindMarkers עם פרמטרים ברירת מחדל שחושבו מנתוני ביטוי גנים מנורמלים. אנו מזהים ומסווגים מחלקות תאים עיקריות על ידי שילוב מערכי נתונים של קליפת המוח העוברית והבוגרת עם ביטוי גני סמן [19,20,21,35] והערות. בפרט, תאי קדם במחזור הדם זוהו על ידי ביטוי של MKI67 ו-TOP2A. אשכולות אב הוגדרו על ידי היעדר תמלילים מיטוטיים, חפיפה גבוהה עם אשכולות אב גליאליים רב-פוטנציאליים שתוארו בקליפת המוח העוברית במטאפאזה מאוחרת, וביטוי EGFR ו-OLIG1. אנו משתמשים במונח אסטרוציט כדי לכלול מספר מצבים של התמיינות אסטרוציטים, מגליה רדיאלית מאוחרת ועד להבשלה של אסטרוציטים. אשכולות אסטרוציטים מבטאים רמות גבוהות של SLC1A3 ו-AQP4 והוכחו כי הם מתאימים לתת-סוגים של גליה רדיאלית עוברית ו/או אסטרוציטים בוגרים. תאי OPC מבטאים PDGFRA ו-SOX10 בעוד שאוליגודנדרוציטים מבטאים סמני מיאלינציה (MOG ו-MYRF). נוירונים גלוטמטרגיים זוהו על ידי נוכחות של תמלילים עצביים (SYT1 ו-SNAP25), היעדר סמנים GABAergic (GAD2), והביטוי של NEUROD6, SLC17A7, BCL11B, או SATB2. נוירונים של GluN חולקו עוד לתת-מחלקות עליונות (ביטוי SATB2 ואובדן BCL11B) ועמוקות (ביטוי BCL11B). נוירונים משוערים של תת-לוחית (SP) מבטאים סמני SP18 ידועים כגון ST18 ו-SORCS1 בנוסף לסמני GluN עמוקים. תאים דמויי מקלעת כורואיד זוהו על ידי ביטוי TTR, ותאים דמויי קרומי המוח ביטאו גנים הקשורים לפיברובלסטים ומיפו תאים פיאליים/וסקולריים של מערך נתוני הייחוס.
ניתוח דיפרנציאלי של ביטוי גנים בין תת-מחלקות t-hCO ו-hCO בוצע באמצעות שיטת פסאודו-אצווה חדשה שפותחה והוחזרה בדגימות המיושמות באמצעות חבילת Libra R (גרסה 1.0.0). באופן ספציפי, בוצעו מבחני סבירות לוגריתמית של edgeR (גרסה 3.36.0, חבילה R) עבור קבוצות על ידי סיכום מספר הגנים בתאים עבור מחלקת תאים נתונה עבור כל שכפול דגימה. לצורך ויזואליזציה של מפת חום, חושבו ערכים מנורמלים למיליון (CPM) באמצעות edgeR (פונקציית cpm()) וגודלם (להשגת ממוצע = 0, סטיית תקן = 1). בוצע ניתוח העשרה של אונטולוגיה גנטית (GO) של גנים של t-hCO GluN מווסתים באופן משמעותי (ערך P מתוקן על ידי בנג'מיני-הוכברג של פחות מ-0.05 המתבטא בלפחות 10% מתאי t-hCO GluN ועלייה בשינוי של לפחות פי 2) באמצעות ToppGene Suite (https://toppgene.cchmc.org/)37. אנו משתמשים באפליקציית ToppFun עם פרמטרים ברירת מחדל ומדווחים על ערכי P שתוקנו על ידי בנג'מיני-הוכברג ומחושבים מבדיקות היפרגיאומטריות עם הערות GO.
כדי להתאים את אשכולות ה-snRNA-seq שלנו לאשכולות תאים מבוארים ממחקרי ייחוס של RNA-seq של תא בודד ראשוני או snRNA-seq של מבוגרים19,20,21,22, יישמנו גישת שילוב מערכי נתונים מזווגים. השתמשנו בזרימת עבודה של נירמול SCTransform (v2) ב-Seurat כדי לשלב ולהשוות חפיפות אשכולות בין מערכי נתונים (תוך שימוש באותם פרמטרים כנ"ל). מערכי נתונים בודדים חולקו באופן אקראי לתת-קבוצה של עד 500 תאים או ליבות לכל אשכול מקורי לצורך יעילות חישובית. באמצעות גישה דומה לזו שתוארה קודם לכן, חפיפת אשכולות הוגדרה כחלק מהתאים או הגרעינים בכל אשכול מאוחד שחפפו לתווית של אשכול הייחוס. כדי לסווג עוד יותר GluNs, השתמשנו בזרימת העבודה TransferData של Seurat עבור נתוני תת-קבוצה של GluN כדי להקצות תוויות של מערך נתונים ייחוס לתאי GluN שלנו.
כדי להעריך את מצב ההתבגרות של הטרנסקריפטום הגלובלי של דגימות t-hCO ו-hCO, השווינו את הדגימות הפסאודו-בולק שלנו עם BrainSpan/psychENCODE23, המורכב מרצף RNA גדול המשתרע על פני התפתחות המוח האנושי. ביצענו PCA על מטריצת ביטוי גנים מנורמלת-תבנית משולבת מדגימות קורטיקליות 10 שבועות לאחר ההתעברות ומאוחר יותר, ב-5567 גנים (יחד עם הנתונים שלנו) שזוהו בעבר כפעילים בדגימות קורטיקליות של BrainSpan (שהוגדרו כגדולות מ-50% בשונות התפתחותית מוסברת על ידי גיל באמצעות מודל קובי)38. בנוסף, גזרנו גנים הקשורים לחתימות טרנסקריפטום עיקריות של נוירולוגיות התפתחותיות באמצעות פירוק לגורמים לא-שליליים של מטריצה ​​כפי שתואר קודם לכן. משקלי הדגימה שחושבו באמצעות הליך פירוק לגורמים לא-שליליים של מטריצה ​​מוצגים באיורים 5b עם נתונים מורחבים עבור כל אחת מחמש החתימות שתוארו על ידי Zhu et al.38. שוב, סמני תעתוק תלויי פעילות נגזרו ממחקרים שפורסמו בעבר. בפרט, ERG ו-LRG היו בעלי עלייה משמעותית בנוירונים גלוטמטרגיים שזוהו על ידי אוסף snRNA-seq של קליפת המוח הראייתית של העכבר לאחר גירוי חזותי מטבלה משלימה 3 Hrvatin et al.16. LRGs מועשרים בבני אדם התקבלו מתרביות מוח עוברי אנושי המופעלות על ידי KCl ונאספו 6 שעות לאחר הגירוי, והגנים המסוננים היו בעלי עלייה משמעותית בבני אדם אך לא במכרסמים (טבלה משלימה 4). ניתוח העשרת מערכי גנים באמצעות מערכי גנים אלה בוצע באמצעות מבחן פישר מדויק חד-כיווני.
יש להרדים חולדות בעזרת איזופלוראן, להוציא את המוחות ולהניח אותן בתמיסת סוכרוז קרה (כ-4°C) מחומצנת (95% O2 ו-5% CO2) עבור חתכים המכילים: 234 mM סוכרוז, 11 mM גלוקוז, 26 mM NaHCO3, 2.5 mM KCl, 1.25 mM NaH2PO4, 10 mM MgSO4 ו-0.5 mM CaCl2 (כ-310 mOsm). חתכים קורונליים של מוח חולדה (300-400 מיקרומטר) המכילים t-hCO נוצרו באמצעות ויברטום Leica VT1200 כמתואר קודם לכן. לאחר מכן, החתכים הועברו לתא חיתוך עם חמצון רציף בטמפרטורת החדר, המכיל aCSF שהוכן מ: 10 mM גלוקוז, 26 mM NaHCO3, 2.5 mM KCl, 1.25 mM NaHPO4, 1 mM MgSO4, 2 mM CaCl2 ו-126 mM NaCl (298 mOsm), לפחות 45 דקות לפני הרישום. החתכים תועדו בתא שקוע שם הם זכו לזרימה רציפה של aCSF (בקבוקון 95% O2 ו-5% CO2). כל הנתונים תועדו בטמפרטורת החדר. נוירוני t-hCO נסגרו באמצעות פיפטה מזכוכית בורוסיליקט מלאה בתמיסה המכילה 127 mM אשלגן גלוקונאט, 8 mM NaCl, 4 mM מגנזיום ATP, 0.3 mM נתרן GTP, 10 mM HEPES ו-0.6 mM EGTA, pH 7.2, תמיסה פנימית מותאמת עם KOH (290 mOsm). על מנת לשחזר, ביוציטין (0.2%) נוסף לתמיסת ההקלטה.
הנתונים נאספו באמצעות מגבר MultiClamp 700B (Molecular Devices) ודיגיטייזר Digidata 1550B (Molecular Devices), עברו סינון מעביר נמוכים בתדר 2 קילוהרץ, עברו דיגיטציה ב-20 קילוהרץ ונותחו באמצעות Clampfit (Molecular Devices), Origin (OriginPro, 2021b, OriginLab) ופונקציות MATLAB מותאמות אישית (Mathworks). פוטנציאל הצומת חושב באמצעות JPCalc והערכים הותאמו לערך המחושב של -14 mV. פעולה IV מורכבת מסדרה של שלבי זרם בצעדים של 10-25 pA, מ-250- עד 750 pA.
התלמוס, החומר הלבן והאפרנטים S1 עברו גירוי חשמלי בפרוסות תלמוקורטיקליות במהלך רישום patch-clamp של נוירוני hCO, כפי שתואר קודם לכן. בקצרה, המוח הונח על שולחן הדפסה תלת-ממדי המוטה בזווית של 10°, וחזית המוח נחתכה בזווית של 35°. לאחר מכן המוח הודבק למשטח החתוך וחולק, תוך שמירה על האקסונים הבולטים התלמוקורטיקליים. אלקטרודות טונגסטן דו-קוטביות (0.5 MΩ) הורכבו על מיקרומניפולטור שני וממוקמות אסטרטגית כדי לעורר ארבעה אזורים בכל תא (קפסולה פנימית, חומר לבן, S1 ו-hCO). תעדו תגובות סינפטיות לאחר גירוי פאזי של 300 מיקרו-אמפר בתדר של 0.03-0.1 הרץ.
נוירונים של hCO המבטאים hChR2 הופעלו ב-480 ננומטר ופעימות אור שנוצרו על ידי נורת LED (Prizmatix) הופעלו דרך עדשה ×40 (0.9 NA; Olympus) כדי לתעד את ביטוי hChR2 ליד התאים. קוטר השדה המואר הוא כ-0.5 מ"מ וההספק הכולל הוא 10-20 mW. רוחב הפעימה נקבע ל-10 מילישניות, התואם את הפעימה שניתן במהלך ניסוי הלמידה ההתנהגותית. נעשה שימוש בתדרי גירוי שונים, מ-1 עד 20 הרץ, אך רק הפעימה הראשונה בסדרה שימשה לכימות. המרווחים בין סדרות הם בדרך כלל ארוכים מ-30 שניות כדי למזער את ההשפעה על מסלולים מעכבים או מקלים סינפטיים. כדי לבדוק אם תגובת hChR2 הייתה מונוסינפטית, יישמנו TTX (1 מיקרומולר) לאמבט עד שתגובת ה-EPSC נעלמה, ולאחר מכן יישמנו 4-אמינופירידין (4-AP; 100 מיקרומולר). בדרך כלל, תגובה מוחזרת תוך מספר דקות, עם עיכוב מעט ארוך יותר בין הפעלת ה-LED ליצירת EPSC. NBQX (10 מיקרומולר) שימש לבדיקת האם התגובה מונעת על ידי קולטני AMPA.
חתכים חדים של hCO נוצרו כמתואר קודם לכן. בקצרה, חתכים של hCO הוטבעו באגרוז 4% והועברו לתאים המכילים 126 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM NaH2PO4, 1 mM MgSO4, 2 mM CaCl2, 26 mM NaHCO3 ו-10 mM d-(+)-גלוקוז. החתכים נחתכו ב-200-300 מיקרומטר בטמפרטורת החדר באמצעות ויברטור Leica VT1200 ואוחסנו ב-ASF בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, בוצע רישום patch-camp של תאים שלמים על חתכים של hCO תחת מיקרוסקופ SliceScope ישיר (Scientifica). החתכים עברו זילוח עם aCSF (95% O2 ו-5% CO2) ואותות התאים נרשמו בטמפרטורת החדר. נוירונים של hCO3 יושמו באמצעות פיפטה מזכוכית בורוסיליקט מלאה בתמיסה המכילה 127 mM אשלגן גלוקונאט, 8 mM NaCl, 4 mM מגנזיום ATP, 0.3 mM נתרן GTP, 10 mM HEPES ו-0.6 mM EGTA, pH פנימי 7, 2, מותאם עם KOH (אוסמולריות 290). למטרות שחזור, הוסיפו 0.2% ביוציטין לתמיסה הפנימית.
הנתונים נאספו על ידי Clampex (Clampex 11.1, Molecular Devices) באמצעות מגבר MultiClamp 700B (Molecular Devices) ודיגיטייזר Digidata 1550B (Molecular Devices), עברו סינון מעביר נמוכים בתדר 2 קילוהרץ, עברו דיגיטציה ב-20 קילוהרץ ונותחו באמצעות Clampfit (גרסה 10.6) לניתוח (התקנים מולקולריים) ופונקציות MATLAB מותאמות אישית (MATLAB 2019b, Mathworks). פוטנציאל הצומת חושב באמצעות JPCalc והערכים הותאמו לפוטנציאל הצומת המחושב של -14 mV. פעולה IV מורכבת מסדרה של שלבי זרם בצעדים של 5-10 pA מ-50- עד 250 pA.
לצורך שחזור מורפולוגי של נוירונים נצבטים, נוספו 0.2% ביוציטין (Sigma-Aldrich) לתמיסה הפנימית. התאים הוכנו למשך 15 דקות לפחות לאחר הפריצה. לאחר מכן, הפיפטה נמשכת פנימה באיטיות למשך 1-2 דקות עד שהממברנה הרשומה אטומה לחלוטין. בהתאם להליך הפיזיולוגיה של החתכים, החתכים קובעו למשך הלילה ב-4°C ב-4% PFA, נשטפו עם PBS X3, ודוללו ביחס של 1:1000 עם DyLight 549 או DyLight 405 מצומדים לסטרפטבידין (Vector Labs). תאים מלאים בביוציטין (2%; Sigma-Aldrich) סומנו במהלך הקלטת patch clamp בטמפרטורת החדר למשך שעתיים. לאחר מכן, החתכים הורכבו על שקופיות מיקרוסקופ באמצעות Aquamount (Thermo Scientific) והוצגו למחרת במיקרוסקופ קונפוקלי Leica TCS SP8 באמצעות מטרת טבילה בשמן עם צמצם נומרי ×40 1.3, הגדלה ×0.9–1.0, xy. קצב הדגימה הוא כ-7 פיקסלים למיקרון. קבוצות Z במרווחים של 1 מיקרומטר הושגו באופן סדרתי, ובוצעו פסיפסים של קבוצות z ותפירה אוטומטית מבוססת Leica כדי לכסות את כל עץ הדנדריטים של כל נוירון. לאחר מכן נוירונים עקבו באופן חצי ידני באמצעות ממשק neuTube 40 ונוצרו קבצי SWC. לאחר מכן הקבצים הועלו לתוסף SimpleNeuriteTracer41 Fiji (ImageJ, גרסה 2.1.0; NIH).
רקמת קליפת המוח האנושית נאספה בהסכמה מדעת בהתאם לפרוטוקול שאושר על ידי מועצת הביקורת המוסדית של אוניברסיטת סטנפורד. שתי דגימות של רקמה אנושית לאחר לידה (בנות 3 ו-18) נאספו על ידי כריתה של קליפת המוח הקדמית (גירוס קדמי אמצעי) כחלק מניתוח לאפילפסיה עמידה. לאחר הכריתה, נאספו רקמות ב-NMDG-aCSF קר כקרח המכיל: 92 mM NMDG, 2.5 mM KCl, 1.25 mM NaH2PO4, 30 mM NaHCO3, 20 mM HEPES, 25 mM גלוקוז, 2 mM תיאוריאה, 5 mM נתרן אסקורבט, 3 mM נתרן פירובט, 0.5 mM CaCl2 4H2O ו-10 mM MgSO4 7H2O. טיטרציה ל-pH 7.3-7.4 עם חומצה הידרוכלורית מרוכזת. הרקמות סופקו למעבדה תוך 30 דקות וחתכים קורונליים נלקחו בהתאם להליך שתואר לעיל.
כל הניתוחים בבעלי חיים בוצעו בהתאם להנחיות הטיפול בבעלי חיים שאושרו על ידי APLAC באוניברסיטת סטנפורד. חולדות (מעל 140 יום לאחר ההשתלה) עברו הרדמה של 5% איזופלוראן והורדמו עם 1-3% איזופלוראן במהלך הניתוח. בעלי החיים הוכנסו למסגרת סטריאוטקסית (Kopf) ובופרנורפין בשחרור מושהה (SR) הוזרק תת עורי. הגולגולת נחשפה, נוקתה והוכנסו 3-5 ברגים לעצם. כדי לכוון את t-hCO3, יצרנו קואורדינטות סטריאוטקסיות מתמונות MRI. נקדח חור קדח באתר המעניין וסיבים (קוטר 400 מיקרומטר, NA 0.48, Doric) הורדו 100 מיקרומטר מתחת לפני השטח של hCO3 וחוברו לגולגולת בעזרת צמנט דנטלי הניתן לריפוי UV (Relyx).
רישום פוטומטריה של סיבים בוצע כמתואר קודם לכן42. כדי לתעד פעילות ספונטנית, חולדות הוכנסו לכלוב נקי וכבל תיקון סיב אופטי (Doric) בקוטר 400 מיקרומטר המחובר למערכת איסוף נתונים פוטומטרית של סיב אופטי חובר לכבל הסיב האופטי המושתל. במהלך רישום הפעילות המוטורית בן 10 הדקות, החיות היו חופשיות לחקור את הכלוב. כדי לתעד את הפעילות המעוררת, חולדות (יותר מ-140 יום לאחר ההשתלה) הורדמו עם 5% איזופלוראן לאינדוקציה ו-1-3% איזופלוראן לתחזוקה. הניחו את החיה במסגרת סטריאוטקטית (Kopf) והשפם בצד הנגדי של t-hCO נחתך לכ-2 ס"מ ומועבר דרך רשת המחוברת למפעיל פיזואלקטרי (PI). כבל תיקון סיב אופטי (Doric) בקוטר 400 מיקרומטר חובר לסיב המושתל וחובר למערכת איסוף הנתונים. השפם בצד הנגדי של t-hCO הוסטו לאחר מכן 50 פעמים (2 מ"מ ב-20 הרץ, 2 שניות לכל מצגת) בזמנים אקראיים על ידי מנוע פיזואלקטרי במשך תקופת הקלטה של ​​20 דקות. השתמש בחבילת התמיכה של Arduino MATLAB כדי לשלוט בזמן ההסטה באמצעות קוד MATLAB מותאם אישית. האירועים מסונכרנים לתוכנת רכישת הנתונים באמצעות פולסים של טרנזיסטור-טרנזיסטור לוגיקה (TTL).
חולדות (מעל 140 יום לאחר ההשתלה) עברו השראת הרדמה של 5% איזופלוראן והורדמו עם 1-3% איזופלוראן במהלך הניתוח. החיות הונחו במסגרת סטריאוטקסית (Kopf) ובופרנורפין SR ודקסמתזון הוזרקו תת עורית. הגולגולת נחשפה, נוקתה והוכנסו 3-5 ברגי עצם. כדי לכוון את t-hCO3, יצרנו קואורדינטות סטריאוטקסיות מתמונות MRI. ניתוח גולגולת מעגלי (בקוטר של כ-1 ס"מ) בוצע בעזרת מקדחה במהירות גבוהה ישירות מעל ה-hCO3 המושתל. לאחר שהעצם דקה ככל האפשר, אך לפני קידוח דרך כל העצם, השתמשו במלקחיים כדי להסיר את דיסק האגן השלם שנותר כדי לחשוף את ה-t-hCO3 שמתחתיו. ניתוח הגולגולת מולאה במי מלח סטרילית, ומכסה וסיכת ראש מיוחדת חוברו לגולגולת בעזרת צמנט דנטלי מועשר בקרינת UV (Relyx).
הדמיית שני פוטונים בוצעה באמצעות מיקרוסקופ רב-פוטוני Bruker עם עדשת Nikon LWD (×16, 0.8 NA). הדמיית GCaMP6 בוצעה ב-920 ננומטר עם הגדלה יחידה של x1.4 במישור z וממוצע של x8 של 7.5 פריימים לשנייה. החולדות עברו אינדוקציה עם הרדמה של 5% איזופלוראן ונשמרו עם 1-3% איזופלוראן. החולדות הושמו במתקן ראש בהתאמה אישית והוצבו מתחת לעדשה. התקבל תיעוד רקע של 3 דקות של פעילות מוטורית. במהלך 20 דקות של הקלטה, 50 שאיפות (כל מצגת באורך 100 מילישניות) נמסרו באופן אקראי למשטח הזיף שממול ל-t-hCO באמצעות picospricer. השתמש בחבילת התמיכה של Arduino MATLAB כדי לשלוט בזמן ההתפרצות עם קוד MATLAB מותאם אישית. סנכרן אירועים עם תוכנת רכישת נתונים (PrairieView 5.5) באמצעות פולסי TTL. לצורך ניתוח, התמונות תוקנו לתנועת xy באמצעות תיקון אפיני בתוכנית MoCo שהושקה בפיג'י. מיצוי עקבות פלואורסצנטיות מתאים בודדים באמצעות CNMF-E43. פלואורסצנציה חולצה עבור כל אזור מעניין, הומרה לעקומות dF/F, ולאחר מכן הומרה לציוני z.
חולדות (מעל 140 יום לאחר ההשתלה) עברו השראה בהרדמה של 5% איזופלוראן והורדמו ב-1-3% איזופלוראן במהלך הניתוח. החיות הונחו במסגרת סטריאוטקסית (Kopf) ובופרנורפין SR ודקסמתזון הוזרקו תת עורית. השפם בצד הנגדי של t-hCO נחתך לכ-2 ס"מ והושחל דרך רשת המחוברת למפעיל פיזואלקטרי. הגולגולת נחשפה ונוקה. בורג הארקה מפלדת אל-חלד מחובר לגולגולת. כדי לכוון את t-hCO, יצרנו קואורדינטות סטריאוטקסיות מתמונות MRI. בצעו ניתוח גולגולת מעגלי (בקוטר של כ-1 ס"מ) בעזרת מקדחה במהירות גבוהה ממש מעל t-hCO. לאחר שהעצם דקה ככל האפשר, אך לפני קידוח דרך כל העצם, השתמשו במלקחיים כדי להסיר את דיסק האגן השלם שנותר כדי לחשוף את t-hCO שמתחתיו. תאים בודדים תועדו באמצעות גלאי סיליקון בצפיפות גבוהה בעלי 32 או 64 ערוצים (Cambridge Neurotech) המחוברים לברגי הארקה ומוגברים מראש באמצעות מגברי RHD (Intan). השתמשו במניפולטור כדי להוריד את האלקטרודות לאתר המטרה דרך ניתוח הקרניוטומיה, הממולא בתמיסת מלח סטרילית. איסוף הנתונים בוצע בתדר של 30 קילוהרץ באמצעות מערכת איסוף הנתונים Open Ephys. ההקלטה נמשכה רק כאשר זיהינו פעילות ספונטנית קצבית מתואמת מאוד ביותר מ-10 ערוצים, דבר המצביע על כך שהאלקטרודות היו ממוקמות בשתל (בהתבסס על נתוני הדמיה של סידן בשני פוטונים). התקבל הקלטה ברקע של 10 דקות של פעילות מוטורית. לאחר מכן, השפם בצד הנגדי של t-hCO הוסטו 50 פעמים (2 מ"מ ב-20 הרץ, 2 שניות לכל הצגה) בזמנים אקראיים על ידי מנוע פיאזואלקטרי במשך תקופת הקלטה של ​​20 דקות. באמצעות חבילת התמיכה של MATLAB עבור Arduino (MATLAB 2019b), שלטו בזמן ההסטה באמצעות קוד MATLAB מותאם אישית. השתמש בפולסי TTL כדי לסנכרן אירועים עם תוכנת רכישת נתונים.
עבור ניסויי סימון אופטי, כבל תיקון אופטי 200 מיקרומטר (דוריק) המחובר ללייזר 473 ננומטר (אומיקרון) חובר לסיב אופטי 200 מיקרומטר שהונח מעל ניתוח הקרניוטומיה. מיד לפני כן, כוונן את עוצמת המגשר ל-20 מיליוואט. השתמש במניפולטור כדי להוריד את האלקטרודות לאתר המטרה דרך ניתוח הקרניוטומיה, המלא בתמיסת מלח סטרילית. בתחילת ההקלטה, נפלטו עשרה פולסים של אור 473 ננומטר (תדר 2 הרץ, משך פולס 10 מילישניות). תאים רגישים לאור הוגדרו כתאים שהציגו תגובת דוקרנות תוך 10 מילישניות של אור ב-70% או יותר מהניסויים.