شكرًا لزيارتكم موقع Nature.com. أنتم تستخدمون إصدار متصفح يدعم CSS بشكل محدود. للحصول على أفضل تجربة، نوصي باستخدام متصفح مُحدّث (أو تعطيل وضع التوافق في إنترنت إكسبلورر). ولضمان استمرارية الدعم، نعرض الموقع بدون أنماط أو جافا سكريبت.
يعرض عرضًا دائريًا لثلاث شرائح دفعةً واحدة. استخدم زري "السابق" و"التالي" للتنقل بين ثلاث شرائح في آنٍ واحد، أو استخدم أزرار التمرير في النهاية للتنقل بين ثلاث شرائح في آنٍ واحد.
تُمثل العضيات العصبية ذاتية التجميع منصةً واعدةً في المختبر لنمذجة النمو البشري والأمراض. ومع ذلك، تفتقر العضيات إلى الاتصال الموجود في الجسم الحي، مما يحد من نضجها ويمنع تكاملها مع الدوائر الأخرى التي تتحكم في السلوك. نُظهر هنا أن العضيات القشرية المشتقة من الخلايا الجذعية البشرية، والمزروعة في القشرة الحسية الجسدية لفئران حديثة الولادة عارية، تُطور أنواعًا من الخلايا الناضجة التي تتكامل مع الدوائر الحسية والدافعة. كشف التصوير بالرنين المغناطيسي عن نمو العضيات بعد الزرع في العديد من سلالات الخلايا الجذعية والحيوانات، بينما كشف تحليل النواة الواحدة عن تطور تكوين القشرة وظهور برنامج نسخ يعتمد على النشاط. في الواقع، تُظهر الخلايا العصبية القشرية المزروعة خصائص مورفولوجية وتشابكية وغشائية داخلية أكثر تعقيدًا من نظيراتها في المختبر، مما يسمح باكتشاف العيوب العصبية لدى مرضى متلازمة تيموثي. أظهر التتبع التشريحي والوظيفي أن العضيات المزروعة تتلقى مُدخلات من المهاد القشري والقشري القشري، وتشير تسجيلات النشاط العصبي داخل الجسم الحي إلى أن هذه المُدخلات قادرة على توليد استجابات حسية في الخلايا البشرية. وأخيرًا، تُمدد العضيات القشرية محاورها العصبية في جميع أنحاء دماغ الجرذ، ويؤدي تنشيطها البصري الوراثي إلى سلوك باحث عن المكافأة. وهكذا، تنضج الخلايا العصبية القشرية البشرية المزروعة وتشارك في دوائر المضيف التي تتحكم في السلوك. ونتوقع أن يُسهّل هذا النهج الكشف عن الأنماط الظاهرية على مستوى الخيوط في الخلايا المشتقة من المريض والتي لا يُمكن الكشف عنها بوسائل أخرى.
يُعدّ نموّ الدماغ البشري عمليةً تنظيميةً ذاتيةً ملحوظةً، حيث تتكاثر الخلايا، وتتمايز، وتهاجر، وتتصل لتكوين دوائر عصبية وظيفية تُحسّن من خلال التجربة الحسية. ومن المشكلات الرئيسية في فهم نموّ الدماغ البشري، وخاصةً في سياق الأمراض، صعوبة الوصول إلى أنسجة الدماغ. تستطيع العضيات ذاتية التنظيم، بما في ذلك عضيات القشرة المخية البشرية (hCO3؛ والمعروفة أيضًا باسم كرة القشرة المخية البشرية)، توليد 2، 3، 4، 5، 6. ومع ذلك، تحد العديد من القيود من تطبيقها الأوسع لفهم نموّ ووظائف الدوائر العصبية. وعلى وجه الخصوص، من غير الواضح ما إذا كان نضج hCO3 محدودًا بغياب بعض المُدخلات البيئية الدقيقة والحسية الموجودة في الجسم الحي. بالإضافة إلى ذلك، نظرًا لعدم دمج hCO3 في الدوائر التي يُمكنها توليد نتائج سلوكية، فإن فائدتها في نمذجة الاضطرابات العصبية والنفسية المعقدة وراثيًا والسلوكية محدودة حاليًا.
يمكن لزرع hCO3 في دماغ حي سليم التغلب على هذه القيود. وقد أظهرت دراسات سابقة أن الخلايا العصبية البشرية المزروعة في قشرة القوارض قادرة على البقاء، والإسقاط، والتواصل مع خلايا القوارض7،8،9،10،11،12. ومع ذلك، تُجرى هذه التجارب عادةً على حيوانات بالغة، مما قد يحد من التكامل المشبكي والمحوري. في هذه الدراسة، نصف نموذج زرع زرعنا فيه hCO3 ثلاثي الأبعاد مشتقًا من خلايا hiPS في القشرة الحسية الجسدية الأولية (S1) لجرذان تعاني من نقص المناعة في مرحلة مبكرة من التطور اللدوني. تخضع الخلايا العصبية المزروعة hCO3 (t-hCO3) لنضج كبير، وتتلقى مدخلات قشرية-قشرية تثير استجابات حسية، وتمتد الإسقاطات المحورية إلى دماغ الجرذان لتحفيز سلوك البحث عن المكافأة. كشف النضج الممتد لـ t-hCO عن عيوب عصبية لدى المرضى المصابين بمتلازمة تيموثي (TS)، وهو اضطراب وراثي شديد ناجم عن طفرات في قناة الكالسيوم CaV1.2 من النوع L الحساسة للجهد (المشفرة بواسطة CACNA1C).
لدراسة الخلايا العصبية القشرية البشرية في الدوائر داخل الجسم الحي، قمنا بزرع 3D hCO سليمة مجسمًا في S1 لفئران مصابة بفقدان الغدة الصعترية في مرحلة مبكرة من الولادة (الأيام 3-7 بعد الولادة) (الشكل 1أ والبيانات الموسعة في الشكل 1أ-ج). في هذه المرحلة، لم تُكمل الإسقاطات المحورية القشرية المهادية والقشرية تكوينها العصبي في S1 (المرجع 13). لذا، صُممت هذه الطريقة لتعظيم تكامل t-hCO مع تقليل التأثير على الدوائر العصبية الداخلية. لتصوير موقع t-hCO في الحيوانات الحية، أجرينا عمليات إعادة بناء دماغية بالرنين المغناطيسي المرجح بـ T2 للفئران بعد شهرين إلى ثلاثة أشهر من الزرع (الشكل 1ب والبيانات الموسعة، الشكل 1د). تم ملاحظة t-hCO بسهولة وكانت قياسات حجم t-hCO مماثلة لتلك المحسوبة من الشرائح الثابتة (الشكل 1د، هـ؛ P > 0.05). تم ملاحظة t-hCO بسهولة وكانت قياسات حجم t-hCO مماثلة لتلك المحسوبة من الشرائح الثابتة (الشكل 1د، هـ؛ P > 0.05). t-hCO تمت مشاهدته بسهولة، وتم تقليصه بشكل كبير، وكان T-hCO مشابهًا للتركيبات الإصلاحية (البيانات الإضافية، ريس.1د، ه؛ ف> 0,05). تم ملاحظة t-hCO بسهولة، وكانت قياسات t-hCO الحجمية مماثلة لتلك المحسوبة للأقسام الثابتة (بيانات موسعة، الشكل 1د، هـ؛ P > 0.05).很容易观察到t-hCO، 并且t-hCO لا يوجد سبب محدد لذلك (يتراوح بين 1d،e；P > 0.05).很容易观察到t-hCO، 并且t-hCO تم اختبار t-hCO بسهولة، وهو عبارة عن تباين كبير، وكان t-hCO مشابهًا للمركبات الإصلاحية (بيانات متعددة، ريس.1د، ه؛ ف> 0,05). تم ملاحظة t-hCO بسهولة، وكانت قياسات t-hCO الحجمية مماثلة لتلك المحسوبة للأقسام الثابتة (بيانات موسعة، الشكل 1د، هـ؛ P > 0.05).حددنا تركيز t-hCO في 81% من الحيوانات المزروعة بعد شهرين تقريبًا من الزرع (عدد الحيوانات = 72 حيوانًا؛ تركيز hCO من 10 سلالات خلايا hiPS؛ سلالات خلايا hiPS في الجدول التكميلي 1). من بين هذه السلالات، وُجدت 87% منها في القشرة المخية (الشكل 1ج). بإجراء فحوصات تصوير بالرنين المغناطيسي متسلسلة في نقاط زمنية متعددة لنفس الفأر المزروع، وجدنا زيادة قدرها تسعة أضعاف في حجم t-hCO خلال 3 أشهر (الشكل 1د والبيانات الموسعة، الشكل 1و). كان معدل البقاء على قيد الحياة مرتفعًا لدى الحيوانات المزروعة (74%) بعد 12 شهرًا من الزرع (البيانات الموسعة، الشكل 1ز والجدول التكميلي 2)، ولم يُعثر على أي ضعف واضح في الحركة أو الذاكرة، أو داء الدبق، أو تخطيط كهربية الدماغ (EEG). البيانات (الشكل 1ز والجدول التكميلي 2). 1س-م و3هـ).
أ، مخطط للتصميم التجريبي. زُرعت خلايا hiPS المُشتقة من ثاني أكسيد الكربون الهيدروجيني (hCO3) في S1 لفئران حديثة الولادة عارية في الأيام 30-60 من التمايز. ب، صور رنين مغناطيسي إكليلي وأفقي مُرجحة بـ T2 تُظهر t-hCO3 في S1 بعد شهرين من الزرع. مقياس الرسم البياني: 2 مم. ج، تحديد كمي لمعدلات نجاح الزرع لكل سلالة من خلايا hiPS (ن = 108، تشير الأرقام داخل الأشرطة إلى كمية t-hCO3 لكل سلالة من خلايا hIPS) وموقعها القشري أو تحت القشري (ن = 88). د، صورة رنين مغناطيسي لشريان تاجي (يسار؛ مقياس الرسم البياني: 3 مم) مع إعادة بناء حجمية ثلاثية الأبعاد مُقابلة (مقياس الرسم البياني: 3 مم) تُظهر زيادة في t-hCO3 على مدار 3 أشهر. هـ، مراجعة لأنماط t-hCO3 في قشرة دماغ الفئران. مقياس الرسم البياني: 1 مم. و، صور مناعية كيميائية تمثيلية لـ t-hCO موضحة من أعلى اليسار إلى اليمين (أثناء التمايز): PPP1R17 (4 أشهر)، NeuN (8 أشهر)، SOX9 وGFAP (8 أشهر)، PDGFRα؛ (8 أشهر)، MAP2 (8 أشهر) وIBA1 (8 أشهر). مقياس الرسم البياني، 20 ميكرومتر. يشير التعبير المشترك عن HNA إلى خلايا من أصل بشري. ز، snRNA-seq: تصوير موحد متعدد الشعب والإسقاط (UMAP) لاختزال الأبعاد لجميع نوى t-hCO عالية الجودة بعد تكامل Seurat (ن = 3 عينات t-hCO، ن = 2 من سلالات خلايا hiPS). الخلايا النجمية، خلايا من سلالة الخلايا النجمية؛ cyc prog، الخلايا السلفية الدائرية؛ GluN DL، الخلايا العصبية العميقة الغلوتاماتية؛ GluN DL/SP، الخلايا العصبية العميقة وتحت الصفائحية الغلوتاماتية؛ GluN UL، الخلايا العصبية الغلوتاماتية في الطبقة العليا؛ الخلايا الدبقية القليلة التغصن، الخلايا الدبقية القليلة التغصن؛ OPC، الخلايا السلفية القليلة التغصن؛ RELN، الخلايا العصبية الريلين. ح، تحليل إثراء مصطلح علم الجينات (GO) للجينات التي تم تنظيمها بشكل كبير (P المعدل < 0.05، التغير في الطيات > 2، معبرًا عنه في 10% على الأقل من النوى) في الخلايا العصبية الغلوتاماتية t-hCO مقارنة بالخلايا العصبية الغلوتاماتية hCO. ح، تحليل إثراء مصطلح علم الجينات (GO) للجينات التي تم تنظيمها بشكل كبير (P المعدل < 0.05، التغير في الطيات > 2، معبرًا عنه في 10% على الأقل من النوى) في الخلايا العصبية الغلوتاماتية t-hCO مقارنة بالخلايا العصبية الغلوتاماتية hCO. ح، تحليل مصطلح الجينات علم الوجود الجيني (GO) للكائنات ذات النشاط البدائي (اختصار P <0,05، الاختلاف الدقيق > 2، تعبير عن جنون البحر بنسبة 10% أكثر) في الأعصاب العصبية الغلوتاماتية t-hCO في الإدراك غلوتاماتورغيسكيمي نييروناميز hCO. ح، تحليل إثراء مصطلح علم الجينات (GO) للجينات ذات التنشيط الكبير (P المعدل <0.05، التغير في الطيات >2، التعبير في 10% من النوى على الأقل) في الخلايا العصبية الغلوتاماتية t-hCO مقارنة بالخلايا العصبية الغلوتاماتية hCO. h، 与hCO 谷氨酸能神经元相比،t-hCO 谷氨酸能神经元中基因显着上调(P <0.05،倍数变化> 2، احصل على 10٪ من مكافآت التوفير (GO) من خلال استخدام GO. h , 与 hco 谷氨酸 能 元 相比 , t-hco 谷氨酸 能 神经 元 基因 显着 上调 （后 后 p <0.05 , 变化المبلغ> 2، احصل على 10% من المبلغ الإجمالي للدولار الأمريكي بنسبة 10% " 的本体论(GO) 术语富集分析. h, الجينات التنشيطية بشكل واضح (محددة P <0,05, التباين الدقيق> 2, يتم التعبير عنها على سطح البحر بنسبة 10% على الأقل) في الخلايا العصبية الجلوتاميتية t-hCO في حالة خلل في الأعصاب مع الخلايا العصبية الجلوتامية hCO الأنطولوجية (GO) تحليل مصطلح الإعانة. ح، تم رفع مستوى تنظيم الجينات بشكل ملحوظ (تم تعديل P < 0.05، تغيير الطي > 2، تم التعبير عنها في 10% على الأقل من النوى) في الخلايا العصبية الغلوتاماتية t-hCO مقارنة بالخلايا العصبية الغلوتاماتية hCO التحليل الوجودي (GO) لمصطلح الإثراء.يشير الخط المنقط إلى قيمة aq البالغة 0.05. i، تصوير UMAP لأنواع خلايا GluN في t-hCO باستخدام نقل الوسم من مجموعة بيانات مرجعية لقشرة المحرك لدى البالغين باستخدام تسلسل snRNA-seq 22. CT - خلايا قشرية مهادية، ET - خلايا خارج دماغية، IT - خلايا دماغية داخلية، NP - إسقاط قريب.
ثم قمنا بتقييم البنية الخلوية والتركيب الخلوي العام لـ t-hCO. كشف تلطيخ الأجسام المضادة لخلايا بطانة الأوعية الدموية لدى الجرذان عن تكوين الأوعية الدموية باستخدام t-hCO، بينما كشف تلطيخ IBA1 عن وجود خلايا دبقية صغيرة لدى الجرذان في جميع أنحاء الطُعم (الشكل 1و والبيانات المُوسّعة، الشكل 3ج، د). كشف التلطيخ المناعي عن خلايا إيجابية لمستضد نووي بشري (HNA) تُعبّر بشكل مُشترك عن PPP1R17 (الخلايا السلفية القشرية)، وNeuN (الخلايا العصبية)، وSOX9 وGFAP (الخلايا المُشتقة من الخلايا الدبقية)، أو PDGFRα (الخلايا السلفية قليلة التغصن) (الشكل 1و). لدراسة التركيب الخلوي لـ t-hCO بدقة خلية واحدة، أجرينا تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي النواة (snRNA-seq) بعد حوالي 8 أشهر من التمايز. أسفرت عملية الترشيح الشامل وإزالة نوى الفئران عن 21,500 خريطة عالية الجودة لأحاديات النواة البشرية (الشكل 1ز والبيانات الموسعة، الشكل 4أ، ب). حددت أنماط التعبير لعلامات نوع الخلية النموذجية مجموعات من فئات الخلايا القشرية الرئيسية، بما في ذلك الخلايا العصبية الغلوتاماتية العميقة والسطحية، والأسلاف الدائرية، والخلايا القليلة التغصن، وسلالة الخلايا النجمية (الشكل 1ز والبيانات الموسعة، الشكل 4ج، والجدول التكميلي 3). أظهر التلوين المناعي لجينات SATB2 وCTIP2 أنه على الرغم من وجود أنماط فرعية قشرية، إلا أن t-hCO لم يُظهر طبقية تشريحية واضحة (البيانات الموسعة، الشكل 3أ). أنتج تسلسل snRNA-seq hCO المطابق للمرحلة فئات خلوية متشابهة بشكل عام، مع بعض الاستثناءات، بما في ذلك غياب الخلايا قليلة التغصن ووجود الخلايا العصبية GABAergic، مما قد يعكس الظروف المواتية المُبلغ عنها سابقًا في المختبر للخلايا السلفية الجانبية15 (بيانات موسعة، الشكل 4f-i والجدول التكميلي 4). كشف تحليل التعبير الجيني التفاضلي عن اختلافات كبيرة في الخلايا العصبية الغلوتاماتية بين t-hCO وhCO (الجدول التكميلي 5)، بما في ذلك تنشيط مجموعات من الجينات المرتبطة بنضج الخلايا العصبية مثل الإشارات المشبكية، وتوطين الخلايا الشجيرية، ونشاط القنوات ذات البوابات الجهدية (الشكل 1h والجدول التكميلي 5). بناءً على ذلك، أظهرت الخلايا العصبية القشرية الغلوتاماتية t-hCO نضجًا نسخيًا متسارعًا.
لتوضيح ما إذا كانت هذه التغيرات النسخية في t-hCO مرتبطة بالاختلافات المورفولوجية بين hCO في المختبر وt-hCO في الجسم الحي، قمنا بإعادة بناء hCO وhCO المتطابقين في المرحلة، والمملوءين بالبيوسيتين، في مقاطع حادة بعد 7-8 أشهر من التمايز. كانت خلايا hCO أكبر بكثير، وقطر جسم الخلية أكبر بمرة ونصف، وعدد التغصنات ضعف عدد التغصنات، وزيادة إجمالية قدرها ستة أضعاف في الطول التغصني الكلي مقارنةً بـ hCO في المختبر (الشكل 2ب). بالإضافة إلى ذلك، لاحظنا كثافة أعلى بكثير للأشواك التغصنية في خلايا t-hCO مقارنةً بخلايا hCO (الشكل 2ج). يشير هذا إلى أن خلايا t-hCO تخضع لاستطالة وتفرع تغصنيّ واسع، مما قد يساهم، بالتزامن مع استمرار تكاثر الخلايا، في النمو المكثف لـ t-hCO بعد الزرع (الشكل 1د والبيانات الموسعة الشكل 1و). دفعنا هذا إلى دراسة الخصائص الكهربية الفيزيولوجية. كانت سعة الغشاء أعلى بثماني مرات (بيانات موسعة، الشكل 8د)، وكان جهد الغشاء في حالة الراحة أكثر فرط استقطاب (حوالي 20 ملي فولت)، وأدى حقن التيار إلى معدل إثارة قصوى أعلى في خلايا t-hCO مقارنةً بخلايا hCO. في المختبر (الشكل 2د)، هـ)، وهو ما يتوافق مع السمات المورفولوجية الأكبر والأكثر تعقيدًا لخلايا t-hCO. بالإضافة إلى ذلك، كان تواتر الأحداث الحالية ما بعد المشبكية الإثارة التلقائية (EPSC) أعلى بشكل ملحوظ في خلايا t-hCO (الشكل 2و)، مما يشير إلى أن زيادة كثافة الأشواك الشجيرية الملحوظة في خلايا t-hCO كانت مرتبطة بالإثارة الوظيفية. المشبك الجنسي. أكدنا عدم نضج خلايا hCO في المختبر من خلال تسجيل الخلايا العصبية الغلوتاماتية الموسومة (بيانات موسعة، الشكل 6أ-ج).
أ، إعادة بناء ثلاثية الأبعاد لخلايا عصبية hCO3 وt-hCO3 المملوءة بالبيوسيتين بعد 8 أشهر من التمايز. ب، تحديد كمية السمات المورفولوجية (ن = 8 خلايا عصبية من نوع hCO، ن = 6 خلايا عصبية من نوع t-hCO؛ **P = 0.0084، *P = 0.0179 و***P < 0.0001). ب، تحديد كمية السمات المورفولوجية (ن = 8 خلايا عصبية من نوع hCO، ن = 6 خلايا عصبية من نوع t-hCO؛ **P = 0.0084، *P = 0.0179 و***P < 0.0001). б, количественная оценка morphологический пизнаков (n = 8 нейронов hCO, n = 6 нейронов t-hCO; ** P = 0,0084, * P = 0,0179 и *** P <0,0001). ب، تحديد كمية السمات المورفولوجية (ن = 8 خلايا عصبية من نوع hCO، ن = 6 خلايا عصبية من نوع t-hCO؛ **P = 0.0084، *P = 0.0179، و***P <0.0001). ب، ن = 8 个hCO 神经元، n = 6 个t-hCO 神经元؛ ** P = 0.0084، * P = 0.0179 و*** P <0.0001). ب، ن = 8 个hCO 神经元، n = 6 个t-hCO 神经元؛ ** P = 0.0084، * P = 0.0179 و*** P <0.0001). б, количественная оценка morphологический пизнаков (n = 8 нейронов hCO, n = 6 нейронов t-hCO; ** P = 0,0084, * P = 0,0179 и *** P <0,0001). ب، تحديد كمية السمات المورفولوجية (ن = 8 خلايا عصبية من نوع hCO، ن = 6 خلايا عصبية من نوع t-hCO؛ **P = 0.0084، *P = 0.0179، و***P <0.0001).ج، إعادة بناء ثلاثية الأبعاد للفروع الشجيرية لـ hCO وt-hCO بعد 8 أشهر من التمايز. تشير النجوم الحمراء إلى أشواك شجيرية مُفترضة. تقدير كثافة الأشواك الشجيرية (عدد = 8 عصبونات hCO، عدد = 6 عصبونات t-hCO؛ **P = 0.0092). د، تحديد كمية جهد الغشاء الساكن (ن = 25 خلية عصبية من هيدروكسيد الصوديوم، ن = 16 خلية عصبية من هيدروكسيد الصوديوم؛ ***P < 0.0001). د، تحديد كمية جهد الغشاء الساكن (ن = 25 خلية عصبية من هيدروكسيد الصوديوم، ن = 16 خلية عصبية من هيدروكسيد الصوديوم؛ ***P < 0.0001). d, количественная оценка мембранного покоя (n = 25 нейронов hCO, n = 16 нейронов t-hCO; *** P <0,0001). د، تقدير جهد الغشاء الساكن (ن = 25 خلية عصبية من عصبونات hCO، ن = 16 خلية عصبية من عصبونات t-hCO؛ ***P < 0.0001). d، 电位的量化(n = 25 hCO 神经元، n = 16 t-hCO 神经元；***P <0.0001). d، 电位的量化(n = 25 hCO 神经元، n = 16 t-hCO 神经元；***P <0.0001). d, количественная оценка мембранного покоя (n = 25 нейронов hCO, n = 16 нейронов t-hCO; *** P <0,0001). د، تقدير جهد الغشاء الساكن (ن = 25 خلية عصبية من عصبونات hCO، ن = 16 خلية عصبية من عصبونات t-hCO؛ ***P < 0.0001). هـ، إطلاق إمكانات الفعل المتكررة في hCO وt-hCO الناجم عن زيادة حقن التيار، وتحديد معدل الإطلاق الأقصى (ن = 25 خلية عصبية من hCO، ن = 16 خلية عصبية من t-hCO؛ *** P < 0.0001). هـ، إطلاق إمكانات الفعل المتكررة في hCO وt-hCO الناجم عن زيادة حقن التيار، وتحديد معدل الإطلاق الأقصى (ن = 25 خلية عصبية من hCO، ن = 16 خلية عصبية من t-hCO؛ *** P < 0.0001). هـ، إمكانية الإمداد بالطاقة في hCO وT-hCO، واستنشاق الهواء المعزز، وزيادة الأوكسجين إلى أقصى حد возбудения (n = 25 нейронов hCO, n = 16 нейронов t-hCO; *** P <0,0001). هـ، إعادة إطلاق إمكانات الفعل في hCO وt-hCO الناجم عن زيادة التيار وتحديد معدل الإطلاق الأقصى (ن = 25 خلية عصبية من hCO، ن = 16 خلية عصبية من t-hCO؛ *** P < 0.0001). e، يحتوي على جزيئات من hCO وt-hCO في حالة وجود جزيئات دقيقة، وينتج عنه جزيئات من الكربون (n = 25 个hCO)神经元،n = 16 个t-hCO 神经元；***P <0.0001). E , 通过 增加 电流 注入 的 的 的 hco و t-hco 重复 电位 放电 , 以及 最 大 的 量化 （(n = 25 个 hco神经 , n = 16 个 t-hco 神经 ； *** p <0.0001) . هـ, زيادة الإمداد بالطاقة من خلال hCO وt-hCO, ضخ الهواء المتجدد, وتجميع الأوكسجين الحد الأقصى من المغذيات (n = 25 нейронов hCO, n = 16 нейронов t-hCO; *** P <0,0001). هـ، إطلاق متكرر لإمكانات عمل hCO3 وt-hCO3 الناجمة عن زيادة إمداد التيار وتحديد معدل الإطلاق الأقصى (ن = 25 خلية عصبية من hCO3، ن = 16 خلية عصبية من t-hCO3؛ *** P < 0.0001). و، الخلايا EPSCs العفوية (sEPSCs) في الخلايا العصبية hCO وt-hCO بعد 8 أشهر من التمايز، وتقدير تواتر الأحداث المشبكية (ن = 25 خلية عصبية hCO، ن = 17 خلية عصبية t-hCO؛ *** P < 0.0001). و، EPSCs العفوية (sEPSCs) في الخلايا العصبية hCO وt-hCO عند 8 أشهر من التمايز، وتقدير تواتر الأحداث المشبكية (ن = 25 خلية عصبية hCO، ن = 17 خلية عصبية t-hCO؛ *** P < 0.0001). f, EPSC التلقائي (sEPSC) في أعصاب hCO و T-hCO خلال 8 أشهر، وتختلف نقاط التركيز والكثافة في الخلايا العصبية (ن = 25) нейронов hCO, n = 17 нейронов t-hCO; *** P <0,0001) . و، الخلايا EPSCs العفوية (sEPSCs) في الخلايا العصبية hCO وt-hCO بعد 8 أشهر من التمايز وتحديد معدلات الأحداث المشبكية (ن = 25 خلية عصبية hCO، ن = 17 خلية عصبية t-hCO؛ *** P <0.0001). f،分化8 个月hCO وt-hCO 神经元中的自发EPSCs (sEPSCs)، 以及突触事件频率的量化،n = 25 hCO 经元،n = 17 طن-hCO 神经元；***P <0.0001). f، ما يعادل 8 ميكرولتر من hCO وt-hCO من جزيئات EPSCs (sEPSCs)، وثاني أكسيد الكربون من هيدروكسيد الصوديوم (n = 25 hCO)神率的量匼(n = 25 hCO 神率的量匼(n = 25hCO P <0.0001) . f, EPSC التلقائي (sEPSC) في أعصاب hCO و T-hCO خلال 8 أشهر، وتختلف نقاط التركيز والكثافة في الخلايا العصبية (ن = 25) нейронов hCO, n = 17 нейронов t-hCO; *** P <0,0001). و، الخلايا EPSCs العفوية (sEPSCs) في الخلايا العصبية hCO وt-hCO بعد 8 أشهر من التمايز وتحديد معدلات الأحداث المشبكية (ن = 25 خلية عصبية hCO، ن = 17 خلية عصبية t-hCO؛ *** P <0.0001).بالنسبة لـ bf، تم أخذ hCO وt-hCO في الخط 1208-2 من نفس دفعة التمايز المحفوظة بالتوازي. ز، تحليل إثراء مجموعة الجينات (اختبار فيشر الدقيق أحادي الجانب) للجينات التي تم تنظيمها بشكل كبير (P المعدل < 0.05، التغير في الطيات > 2، معبر عنه في 10% على الأقل من النوى) في الخلايا العصبية الغلوتاماتية t-hCO مقارنة بالخلايا العصبية الغلوتاماتية hCO مع مجموعات جينية من الجينات المعتمدة على النشاط لكل من الاستجابة المبكرة (ERG) والاستجابة المتأخرة (LRG) والتي تم تحديدها من دراسة أجريت على الفئران الحية16 والجينات الغلوتاماتية البشرية المحددة من الخلايا العصبية المختبرية17. ز، تحليل إثراء مجموعة الجينات (اختبار فيشر الدقيق أحادي الجانب) للجينات التي تم تنظيمها بشكل كبير (P المعدل < 0.05، التغير في الطيات > 2، معبر عنه في 10% على الأقل من النوى) في الخلايا العصبية الغلوتاماتية t-hCO مقارنة بالخلايا العصبية الغلوتاماتية hCO مع مجموعات جينية من الجينات المعتمدة على النشاط لكل من الاستجابة المبكرة (ERG) والاستجابة المتأخرة (LRG) والتي تم تحديدها من دراسة أجريت على الفئران الحية16 والجينات الغلوتاماتية البشرية المحددة من الخلايا العصبية المختبرية17. g، تحليل المكافأة للأشخاص (المعايير الدقيقة المحددة فيشرا) الجينات ذات التنشيط المميز (P <0,05, kratность изменения > 2, expressи по менией меre в 10% детеr) في glutamatergic neuironas t-hCO في التعامل مع أنواع معينة من الخلايا العصبية الغلوتاماتية hCO مثل الرانغو (ERG)، وكذلك العمق (LRG)، الموضحين بالنشاط، تم تحديد هويات الفطريات في الجسم الحي 16، وخصائص محددة لخلايا LRG من النييرونوف في المختبر 17. ز، تحليل إثراء مجموعة الجينات (اختبار فيشر الدقيق أحادي الذيل) للجينات ذات التنشيط الكبير (P المعدل <0.05، التغير في الطيات >2، التعبير في 10% على الأقل من النوى) في الخلايا العصبية الغلوتاماتية t-hCO مقارنة بمجموعات الخلايا العصبية الغلوتاماتية hCO من الجينات المعتمدة على النشاط المبكر (ERG) والمتأخر (LRG) التي تم تحديدها في الفئران الحية16 والخلايا العصبية الغلوتاماتية البشرية المحددة من الخلايا العصبية في المختبر17. g،t-hCO谷氨酸能神经元与hCO谷氨酸能神经元相比،t -hCO谷氨酸能神经元显着上调(调整后P<0.05،倍数变化> 2، نسبة 10٪ من نسبة الـ 10% من نسبة الـ 10٪ (النسبة F) إيشر (إيشر) تم تصميم مجموعة LRG (LRG) لتكون قادرة على الصمود في وجه 16 شخصًا و17 شخصًا من LRG. g , t-hco 谷氨酸 神经 元 与 hco 谷氨酸 神经 元 相比 , t-hco 谷氨酸 神经 元 上调 ( 后 p <0.05 , الخيار> 2، احصل على 10% من قيمة القرض في الصيدليات (فيشر 精确) في الصيد 小鼠 研究 中 的 早期 反应 反应 和 晚期 反应 反应 (lrg) 活性 基因 的 基因组 16 和تم تصميمه من 17 إلى 17 إلى 17 من 17 إلى 17 من LRG. g، تم تنشيط الخلايا العصبية الجلوتامية T-hCO بشكل طبيعي عن طريق الخلايا العصبية الجلوتامية hCO (الخلاصة) P<0,05, kratность изменения> 2, ليس أقل من 10% تحليل обогащения набора генов (اختبار دقيق للغاية) فيشيرا) فتح النطاق (ERG) والأجيال القادمة، التعرف على نشاط الفتح (LRG)، تحديد الهوية في أيقونات مختلفة في الجسم الحي 16 والأعصاب في المختبر 17 . LRG، خاص بالشعر. تم رفع تنظيم الخلايا العصبية الغلوتاماتية t-hCO بشكل ملحوظ مقارنة بالخلايا العصبية الغلوتاماتية hCO (P المعدل <0.05، التغير في الطيات >2، بنسبة 10% على الأقل) من خلال تحليل إثراء الجينات المعتمدة على نشاط الاستجابة (LRGs) للاستجابة المبكرة (ERG) والاستجابة المتأخرة (اختبار فيشر الدقيق أحادي الذيل) والتي تم تحديدها في الفئران الحية16 والخلايا العصبية في المختبر.17 LRGs الخاصة بالبشر.يشير الخط المنقط إلى قيمة P مصححة ببونفيروني قدرها 0.05. h، ارتفع التعبير الجيني لجين GluN (الحزمة الزائفة وقياس كل جين) بشكل ملحوظ في نسخ snRNA-seq لجينات LRG في الخلايا العصبية الغلوتاماتية t-hCO. i، يُظهر التلوين المناعي التعبير عن SCG2 في الخلايا العصبية t-hCO (العلوية) وhCO (السفلى). تشير الأسهم البيضاء إلى خلايا SCG2+. شريط المقياس، 25 ميكرومتر. البيانات مُعبَّر عنها كمتوسط ​​± انحراف معياري.
بناءً على زيادة نشاط t-hCO المُلاحَظ في شرائح خارج الجسم الحي، كشف تسلسل snRNA عن زيادة في تنظيم نُسخ الجينات في t-hCO مُرتبطة بالنشاط مُقارنةً بـ hCO في المختبر. أظهرت الخلايا العصبية t-hCO المُحفِّزة للغلوتامات مستويات أعلى من الجينات المُنظِّمة لنشاط الاستجابة المتأخرة (الشكل 2g، h)، والتي وُجِدت في دراسات سابقة على الخلايا العصبية للفئران والبشر16،17. على سبيل المثال، أظهر كلٌ من BDNF18 وSCG2 وOSTN، وهو جين مُنظِّم لنشاط الرئيسيات، زيادة في التعبير الجيني في الخلايا العصبية t-hCO مُقارنةً بخلايا hCO (الشكل 2g-i). وبالتالي، أظهرت الخلايا العصبية t-hCO خصائص نضج مُحسَّنة مُقارنةً بخلايا hCO من خلال التحليلات النسخية والمورفولوجية والوظيفية.
لتقييم ارتباط نضج t-hCO بتطور الدماغ البشري بشكل أعمق، أجرينا مقارنات نسخية لأنواع الخلايا القشرية الجنينية والبالغة19،20 والبالغة21،22، بالإضافة إلى بيانات موسعة حول التعبير الجيني القشري23 أثناء التطور (بيانات موسعة، الشكل 5). مع العمل السابق 24، فإن حالة نضج النسخ الكلي لـ hCO وt-hCO عند 7-8 أشهر من التمايز تتوافق بشكل عام مع وقت التطور داخل الجسم الحي، وتكافئ بشكل كبير مع أواخر عمر الجنين (بيانات موسعة، الشكل 5أ). والجدير بالذكر أننا لاحظنا زيادة في نضج النسخ في t-hCO مقارنةً بـ hCO المتطابقة في العمر، بالإضافة إلى تنشيط النسخ المرتبط بتكوين المشابك العصبية، والتكوين النجمي، والميالين (بيانات موسعة، الشكل 5ب-د). على المستوى الخلوي، وجدنا دليلاً على وجود نمط فرعي أرق من القشرة في t-hCO، مع تداخل مجموعات من الخلايا العصبية الغلوتاماتية مع الأنماط الفرعية للخلايا العصبية L2/3 وL5 وL6 لدى البالغين (الشكل 1i). في المقابل، كان التداخل العنقودي بين الخلايا العصبية t-hCO الغلوتاماتية والخلايا العصبية القشرية الجنينية أكثر محدودية في منتصف الحمل (بيانات موسعة، الشكل 5e-j). لتحديد ما إذا كانت الخلايا العصبية t-hCO متشابهة وظيفيًا مع الخلايا العصبية القشرية الحديثة البشرية بعد الولادة، أجرينا تسجيلات كهروفيزيولوجية وإعادة بناء تشريحية للخلايا العصبية الهرمية البشرية L2/3 في مقاطع حادة من قشرة ما بعد الولادة البشرية (بيانات موسعة، الشكل 7a). كانت الخصائص الكهروفيزيولوجية للخلايا العصبية الهرمية L2/3 مماثلة لتلك الخاصة بالخلايا العصبية الهرمية t-hCO (بيانات موسعة، الشكل 7e). من الناحية المورفولوجية، كانت الخلايا العصبية L2/3 من العينات البشرية بعد الولادة أكثر تشابهًا مع t-hCO من hCO، على الرغم من أن خلايا L2/3 كانت أطول، وتحتوي على فروع أكثر بشكل عام، وكانت كثافة العمود الفقري لديها أعلى (الشكل 3g والبيانات الموسعة، الشكل 7b-).
أ، زرع hCO3 المنتج بواسطة خطوط خلايا hiPS الضابطة وTS في الفئران حديثي الولادة. ب، إعادة بناء ثلاثية الأبعاد لخلايا عصبية t-hCO3 المملوءة بالبيوسيتين بعد 8 أشهر من التمايز. ج، تحديد متوسط ​​طول الشجيرات (ن = 19 خلية عصبية ضابطة، ن = 21 خلية عصبية TS؛ **P = 0.0041). د، فروع شجيرية أعيد بناؤها ثلاثية الأبعاد من الخلايا العصبية الضابطة وخلايا TS t-hCO عند 8 أشهر من التمايز، وتقدير كثافة العمود الشجيري (ن = 16 خلية عصبية ضابطة، ن = 21 خلية عصبية TS، *** P < 0.0001). د، فروع شجيرية أعيد بناؤها ثلاثية الأبعاد من الخلايا العصبية الضابطة وخلايا TS t-hCO عند 8 أشهر من التمايز، وتقدير كثافة العمود الشجيري (ن = 16 خلية عصبية ضابطة، ن = 21 خلية عصبية TS، *** P < 0.0001). د, إعادة بناء التشعبات ثلاثية الأبعاد من خلال التحكم في النباتات و TS t-hCO خلال 8 أشهر من التمايز وكثافة التربة التشعبية šипов (n = 16 контрольных нейронов, n = 21 TS нейронов, *** P <0,0001). د، إعادة بناء ثلاثية الأبعاد للفروع الشجرية من الخلايا العصبية الضابطة وخلايا TS-hCO3 بعد 8 أشهر من التمايز وتقدير كثافة العمود الشجري الشجري (ن = 16 خلية عصبية ضابطة، ن = 21 خلية عصبية TS، *** P <0.0001). د، و8 جزيئات من مادة TS t-hCO في 3D من الكربون، وثاني أكسيد الكربون في الغلاف الجوي (ن = 16 ميكرون، ن = 21 TS 神经元،***P <0.0001). d، 8 个 时 对 照 و ts t-hco 的 3d 重建 分支 以及 树突棘 密度 量化، n = 16 个 神经元 , n = 21 个 ts 神经 , *** p <0.0001 ). د, التحكم النباتي في إعادة بناء التشعبات ثلاثي الأبعاد و TS t-hCO خلال 8 أشهر من التفاضلات وتجميع قطع الأشجار التشعبية šипов (n = 16 контрольных нейронов, n = 21 TS нейронов, *** P <0,0001). د، إعادة بناء ثلاثية الأبعاد للفروع الشجرية المسيطرة وTS t-hCO في 8 أشهر من التمايز وتقدير كثافة العمود الشجري (ن = 16 خلية عصبية مسيطرة، ن = 21 خلية عصبية TS، *** P <0.0001).تشير النجوم الحمراء إلى أشواك شجيرية مُفترضة. هـ، الخلايا الجذعية المحفزة للخلايا الجذعية العفوية في الخلايا العصبية الضابطة وخلايا TS-hCO بعد 8 أشهر من التمايز. و، رسم بياني للتردد التراكمي وتقدير تردد وسعة الأحداث المشبكية (ن = 32 خلية عصبية ضابطة، ن = 26 خلية عصبية TS؛ **P = 0.0076 وP = 0.8102). ز، تحليل شول للخلايا العصبية TS وخلايا التحكم في خلايا hCO وt-hCO. تُظهر الخطوط المتقطعة الخلايا العصبية الهرمية البشرية L2/3 بعد الولادة للمقارنة (ن = 24 خلية عصبية t-hCO ضابطة، ن = 21 خلية عصبية t-hCO TS، ن = 8 خلايا عصبية hCO ضابطة، ن = 7 خلايا عصبية hCO TS). تُعبَّر البيانات كمتوسط ​​± الانحراف المعياري.
دفعتنا قدرة t-hCO على تكرار السمات المورفولوجية والوظيفية لخلايا عصبية قشرة الدماغ البشرية على مستوى عالٍ إلى استكشاف إمكانية استخدام t-hCO للكشف عن الأنماط الظاهرية للأمراض. ركزنا على متلازمة توريت، وهو اضطراب نمائي عصبي حاد ناتج عن طفرات اكتساب الوظيفة في الجين المشفر لـ CaV1.2، والذي يبدأ عملية نسخ الجينات المعتمدة على النشاط في الخلايا العصبية. حصلنا على hCO من ثلاثة مرضى مصابين بمتلازمة توريت يحملون الاستبدال الأكثر شيوعًا (p.G406R) وثلاثة من الضوابط (الشكل 3أ). بعد عملية الزرع، وجدنا أن مورفولوجيا الخلايا الشجيرية قد تغيرت في خلايا TS العصبية مقارنةً بالضوابط (الشكل 3ب والبيانات الموسعة، الشكل 8أ، ب)، مع زيادة مضاعفة في عدد التشعبات الأولية وزيادة إجمالية في متوسط ​​وانخفاض إجمالي في طول الخلايا الشجيرية (الشكل 3ج والبيانات الموسعة، الشكل 8ج). ارتبط هذا بزيادة كثافة الأشواك وزيادة تواتر الخلايا EPSCs العفوية في TS مقارنةً بالخلايا العصبية الضابطة (الشكل 3د-و والبيانات الموسعة، الشكل 8ز). كشف تحليل إضافي عن أنماط غير طبيعية للتفرع الشجيري في TS-hCO مقارنةً بالخلايا العصبية الضابطة، ولكن ليس في TS-hCO المختبري في مرحلة مماثلة من التمايز (الشكل 3ز). يتوافق هذا مع تقاريرنا السابقة عن انكماش الشجيري المعتمد على النشاط في TS، ويسلط الضوء على قدرة منصة الزرع هذه على اكتشاف الأنماط الظاهرية للمرض داخل الجسم الحي.
ثم سألنا عن مدى التكامل الوظيفي لخلايا t-hCO في S1 لدى الجرذان. تتلقى S1 لدى القوارض مدخلات مشبكية قوية من النوى القاعدية البطنية والخلفية المهادية من نفس الجانب، بالإضافة إلى القشرة الحركية والجسدية الحسية الثانوية من نفس الجانب، وS1 على الجانب المقابل (الشكل 4أ). لاستعادة نمط التعصيب، قمنا بإصابة hCO بفيروس داء الكلب-dG-GFP/AAV-G، ثم زرعنا hCO في الجرذ S1 بعد 3 أيام. لاحظنا تعبيرًا كثيفًا لـ GFP في الخلايا العصبية للـ S1 المماثل والعقد القاعدية البطنية بعد 7-14 يومًا من الزرع (الشكل 4ب، ج). بالإضافة إلى ذلك، كشف تلطيخ الأجسام المضادة للعلامة المهادية نيترين G1 عن وجود نهايات مهادية في t-hCO (الشكل 4د، هـ). لتقييم ما إذا كانت هذه الإسقاطات الواردة قادرة على إثارة استجابات مشبكية في خلايا t-hCO، أجرينا تسجيلات لخلايا كاملة من خلايا بشرية في مقاطع حادة من الطبقة القشرية المهادية. أدى التحفيز الكهربائي للمنطقة S1 لدى الجرذان، أو المحفظة الداخلية، أو المادة البيضاء، أو الألياف القريبة من t-hCO، أو التنشيط الضوئي الوراثي للنهايات المهادية المعبرة عن الأوبسين في t-hCO، إلى تحفيز الخلايا EPSCs قصيرة الكمون في عصبونات t-hCO المعرضة لمضاد مستقبلات AMPA، NBQX. (الشكل 4f، g، والبيانات الموسعة، الشكل 9a-g). تُظهر هذه البيانات أن t-hCO مُدمج تشريحيًا في دماغ الجرذان، ويمكن تنشيطه بواسطة أنسجة الجرذ المضيفة.
أ، رسم تخطيطي لتجربة تتبع داء الكلب. ب، التعبير عن البروتين الفلوري الأخضر (GFP) وبروتين STEM121 الخاص بالبشر بين t-hCO وقشرة دماغ الجرذان (اللوحة العلوية). كما يظهر التعبير عن البروتين الفلوري الأخضر (GFP) في النواة القاعدية البطنية (VB) المتماثلة للجرذان (أسفل اليسار) والنواة S1 المتماثلة (أسفل اليمين). مقياس الرسم: 50 ميكرومتر. تمثل المربعات الحمراء مناطق الدماغ التي التُقطت فيها الصور. ج، تحديد كمية الخلايا التي تُعبر عن البروتين الفلوري الأخضر (ن = 4 جرذان). د، هـ - النهايات المهادية لـ Netrin G1+ في t-hCO. د يُظهر مقطعًا إكليليًا يحتوي على نوى t-hCO وVB. مقياس الرسم: 2 مم. هـ يُظهر التعبير عن Netrin G1 وSTEM121 في الخلايا العصبية t-hCO (يسار) وVB (يمين). مقياس الرسم: 50 ميكرومتر. يشير الخط البرتقالي المنقط إلى حدود t-hCO. f، g، آثار حالية لخلايا t-hCO العصبية بعد التحفيز الكهربائي في جرذ S1 (f) أو الكبسولة الداخلية (g)، مع NBQX (بنفسجي) أو بدونه (أسود) (يسار). سعات EPSC مع NBQX وبدونه (n = 6 خلايا S1، *P = 0.0119؛ وn = 6 خلايا كبسولة داخلية، **P = 0.0022) (وسط). النسبة المئوية لخلايا t-hCO العصبية التي تُظهر EPSC استجابةً للتحفيز الكهربائي في جرذ S1 (f) أو الكبسولة الداخلية (g) (يمين). aCSF، سائل دماغي نخاعي اصطناعي. h، رسم تخطيطي لتجربة التصوير 2P (يسار). تعبير GCaMP6s في t-hCO (وسط). شريط المقياس، 100 ميكرومتر. فاصل زمني فلوري لـ GCaMP6s (يمين). i، الدرجة المعيارية لفلورة النشاط التلقائي. j، رسم تخطيطي لتحفيز الشارب. k، مسارات فلورية 2P ذات الدرجة المعيارية في تجربة واحدة، محاذية لانحراف الشعيرات عند الزمن صفر (خط متقطع) في خلايا المثال. l، استجابات الدرجة المعيارية المتوسطة لجميع الخلايا محاذية لانحراف الشعيرات عند الزمن صفر (خط متقطع) (أحمر) أو طوابع زمنية مُولّدة عشوائيًا (رمادي). m. رسم تخطيطي لتجربة وضع العلامات الضوئية. n، منحنيات الجهد الخام من خلية t-hCO مثال أثناء تحفيز الليزر الأزرق أو انحراف الشعيرات. تشير الأسهم الحمراء إلى أولى النبضات الناتجة عن الضوء (أعلى) أو الناتجة عن انحراف الشعيرات (أسفل). يشير التظليل الرمادي إلى فترات انحراف الشعيرات. o، أشكال موجة الضوء القصوى واستجابات انحراف الشعيرات. p، نبضات محاولة واحدة، محاذية لانحراف الشعيرات في خلايا المثال. يشير 0 إلى انحراف الشعيرات (خط متقطع). q، معدل إطلاق الدرجة المعيارية (Z) المُقاس على مستوى السكان لجميع الخلايا الحساسة للضوء، مُحاذيًا لانحراف الشعيرات عند الزمن صفر (خط متقطع) (أحمر) أو طوابع زمنية مُولّدة عشوائيًا (رمادي). r، نسبة الوحدات الحساسة للضوء المُعدّلة بشكل ملحوظ بانحراف الشعيرات (ن = 3 جرذان) (يسار). ذروة زمن استجابة الدرجة المعيارية (ن = 3 جرذان؛ ن = 5 (أخضر فاتح)، ن = 4 (أخضر داكن)، ون = 4 (سماوي) وحدات تعديل انحراف الشعيرات لكل جرذ) (يمين). تُعبّر البيانات عن المتوسط ​​± الانحراف المعياري.
ثم سألنا عما إذا كان من الممكن تنشيط t-hCO بواسطة محفزات حسية داخل الجسم الحي. زرعنا hCO معبرًا عن مؤشرات الكالسيوم المشفرة وراثيًا GCaMP6 في فئران S1. بعد 150 يومًا، أجرينا قياس الضوء بالألياف أو تصوير الكالسيوم ثنائي الفوتون (الشكل 4ح والبيانات الموسعة، الشكل 10أ). وجدنا أن خلايا t-hCO أظهرت نشاطًا إيقاعيًا متزامنًا (الشكل 4ط، البيانات الموسعة، الشكل 10ب والفيديو التكميلي 1). لتوصيف ذروة نشاط t-hCO، أجرينا تسجيلات كهربائية فيزيولوجية خارج الخلية في فئران مزروعة مخدرة (البيانات الموسعة، الشكل 10ج-و). لقد أنشأنا إحداثيات مجسمة من صور الرنين المغناطيسي؛ وبالتالي، تمثل هذه الوحدات المسجلة خلايا عصبية بشرية مفترضة، على الرغم من أن الفيزيولوجيا الكهربائية وحدها لا تسمح بتحديد نوع المنشأ. لاحظنا اندفاعات متزامنة من النشاط (البيانات الموسعة، الشكل 10د). استمرت النبضات حوالي 460 مللي ثانية، وفصلت بينها فترات صمت بلغت حوالي ثانيتين (بيانات موسعة، الشكل 10د، هـ). أطلقت الوحدات الفردية ما معدله حوالي ثلاث طلقات لكل نبضة، وهو ما يمثل حوالي 73% من الوحدات المسجلة لكل نبضة. كانت أنشطة الوحدات الفردية مترابطة بشكل كبير، وكانت هذه الارتباطات أعلى من تلك الخاصة بالوحدات المحددة في الحيوانات غير الملقحة والمسجلة في نفس الظروف (بيانات موسعة، الشكل 10و). ولتحديد خصائص استجابات النبضات العصبية المحددة المشتقة من الإنسان بشكل أكبر، أجرينا تجارب وسم ضوئي على فئران مخدرة مزروعة بـ hCO معبرة عن قناة الكاتيون الحساسة للضوء رودوبسين 2 (hChR2)، والتي من خلالها تتعرف خلايا t-hCO على الخلايا العصبية في فترة زمنية قصيرة (أقل من 10 مللي ثانية) استجابةً لمحفزات الضوء الأزرق (الشكل 4م-و). أظهرت عصبونات t-hCO اندفاعات من النشاط التلقائي بترددات مشابهة لتلك التي لوحظت في تصوير الكالسيوم، بالإضافة إلى التسجيلات الكهربية الفيزيولوجية التي أُجريت في t-hCO في غياب علامات الضوء (بيانات موسعة، الشكل 10ج-ز). لم يُلاحظ أي نشاط تلقائي في المراحل المقابلة من hCO المسجلة في المختبر. لتقييم إمكانية تنشيط t-hCO بالمحفزات الحسية، قمنا بإبعاد شوارب الفئران لفترة وجيزة عن t-hCO (الشكل 4ج، م والبيانات الموسعة، الشكل 10ح، ك). وفقًا لدراسات سابقة8،10، أظهرت مجموعة فرعية من خلايا t-hCO زيادة في النشاط استجابةً لانحراف الشوارب، وهو ما لم يُلاحظ عند مقارنة البيانات بعلامات زمنية عشوائية (الشكل 4ك-ق والبيانات الموسعة، الشكل 10ح-ق). في الواقع، أظهر حوالي 54% من الوحدات المفردة المُعَلَّمة بصريًا زيادةً ملحوظةً في معدل الإثارة بعد تحفيز الشعيرات، وبلغت ذروتها عند حوالي 650 مللي ثانية (الشكل 4ر). وتشير هذه البيانات مجتمعةً إلى أن t-hCO يستقبل مُدخلات وظيفية مناسبة، ويمكن تنشيطه بواسطة مُحفزات بيئية.
ثم بحثنا فيما إذا كان t-hCO قادراً على تنشيط الدوائر العصبية في الفئران للتحكم في سلوكها. بحثنا أولاً فيما إذا كانت محاور عصبونات t-hCO تمتد إلى الأنسجة المحيطة بالجرذ. قمنا بإصابة hCO بفيروس عدسي يُشفّر hChR2 مُدمجاً مع EYFP (hChR2-EYFP). بعد 110 أيام، لاحظنا تعبير EYFP في المناطق القشرية المتماثلة، بما في ذلك القشرة السمعية والحركية والحسية الجسدية، وكذلك في المناطق تحت القشرية، بما في ذلك المخطط والحُصين والمهاد (الشكل 5أ). لتقييم ما إذا كانت هذه الإسقاطات الصادرة قادرة على إثارة استجابات مشبكية في خلايا الجرذان، قمنا بتنشيط خلايا t-hCO المُعبّرة عن hChR2-EYFP بصرياً عن طريق تسجيل خلايا قشرة دماغ الجرذان في مقاطع دماغية حادة. أدى تنشيط محاور t-hCO2 بالضوء الأزرق إلى تحفيز خلايا EPSCs قصيرة الكمون في عصبونات قشرة الفئران الهرمية، والتي حُجبت بواسطة NBQX (الأشكال 5ب-ز). بالإضافة إلى ذلك، يُمكن حجب هذه الاستجابات بواسطة التترودوتوكسين (TTX) واستعادتها بواسطة 4-أمينوبيريدين (4-AP)، مما يشير إلى أنها ناجمة عن اتصالات أحادية المشبك (الشكل 5هـ).
أ، رسم تخطيطي لتتبع المحور العصبي (يسار). تعبير t-hCO EYFP (يمين). شريط المقياس، 100 ميكرومتر. A1، القشرة السمعية، ACC، القشرة الحزامية الأمامية، د. المخطط، المخطط الظهري، HPC، الحصين؛ الحجاب الحاجز، الحاجز الجانبي، mPFC، القشرة الجبهية الأمامية الإنسية، الكمثرية، القشرة الكمثرية، v. المخطط، المخطط البطني، VPM، النواة البطنية الإنسية للمهاد، VTA، المنطقة التغميطية البطنية. تمثل المربعات الحمراء مناطق الدماغ التي التُقطت فيها الصور. ب، رسم تخطيطي لتجربة التحفيز. ج، د، أمثلة على استجابة التيار الضوئي المُستحث بالضوء الأزرق (أعلى) والجهد (أسفل) في خلايا t-hCO EYFP+ البشرية أو خلايا EYFP- لدى الجرذان (ج) هـ، و، آثار حالية لخلايا عصبية للفئران بعد تحفيز الضوء الأزرق لمحاور t-hCO باستخدام TTX و4-AR (أخضر)، أو TTX (رمادي) أو aCSF (أسود) (هـ)، مع (بنفسجي) أو بدون (أسود) ) ) NBQX (هـ). ز، زمن الاستجابة للاستجابات الناجمة عن الضوء الأزرق في خلايا الفئران (ن = 16 خلية)؛ تشير الأشرطة الأفقية إلى متوسط ​​زمن الاستجابة (7.13 مللي ثانية) (يسار). سعة EPSCs المستحثة بالضوء المسجلة مع أو بدون NBQX (n = 7 خلايا؛ ***P < 0.0001) (الوسط). سعة EPSCs المستحثة بالضوء المسجلة مع أو بدون NBQX (n = 7 خلايا؛ ***P < 0.0001) (الوسط). سعة إمداد الطاقة EPSC، مسجلة أو بدون NBQX (n = 7 cletok؛ ***P <0,0001) (في المركز). سعة EPSCs المستحثة بالضوء المسجلة مع أو بدون NBQX (n = 7 خلايا؛ ***P < 0.0001) (الوسط).تم اختبار NBQX بواسطة EPSC (n = 7 个细胞；***P <0.0001)(中).تم اختبار NBQX بواسطة EPSC (n = 7 个细胞；***P <0.0001)(中). سعة إمداد الطاقة EPSC، مسجلة أو بدون NBQX (n = 7 cletok؛ ***P <0,0001) (في المركز). سعة EPSCs المستحثة بالضوء المسجلة مع أو بدون NBQX (n = 7 خلايا؛ ***P < 0.0001) (الوسط).النسبة المئوية لخلايا الفئران التي تُظهر خلايا EPSCs التي تستجيب للضوء الأزرق (يمين). h، رسم تخطيطي لمهمة سلوكية. d0، اليوم 0. i. أداء الحيوانات النموذجية في اليوم الأول (يسار) أو اليوم الخامس عشر (يمين) من التدريب. متوسط ​​عدد اللعقات التي تم إجراؤها في اليوم الأول (يسار) أو اليوم الخامس عشر (يمين الوسط) (ن = 150 تجربة ضوء أزرق، ن = 150 تجربة ضوء أحمر؛ ***P < 0.0001). متوسط ​​عدد اللعقات التي تم إجراؤها في اليوم الأول (يسار) أو اليوم الخامس عشر (يمين الوسط) (ن = 150 تجربة ضوء أزرق، ن = 150 تجربة ضوء أحمر؛ ***P < 0.0001). تم رصد عدد من النقاط في اليوم الأول (الجانب) أو اليوم 15 (في الوسط مباشرة) (n = 150 مستنزفًا مع الضوء نفسه ، n = 150 испытаний с красным светом; ***P <0,0001). متوسط ​​عدد اللعقات التي تم إجراؤها في اليوم الأول (يسار) أو اليوم الخامس عشر (وسط اليمين) (ن = 150 تجربة ضوء أزرق، ن = 150 تجربة ضوء أحمر؛ ***P < 0.0001).< 0.0001).第1 天(左) أو 15 天(右中) 的平均舔次数(n = 150 次蓝光试验،n = 150 次红光试验；***P <0.001 تم رصد عدد من النقاط في اليوم الأول (الجانب) أو اليوم 15 (في الوسط مباشرة) (n = 150 مستنزفًا مع الضوء نفسه ، n = 150 испытаний с красным светом; ***P <0,0001). متوسط ​​عدد اللعقات التي تم إجراؤها في اليوم الأول (يسار) أو اليوم الخامس عشر (وسط اليمين) (ن = 150 تجربة ضوء أزرق، ن = 150 تجربة ضوء أحمر؛ ***P < 0.0001).اللحسات التراكمية لتجارب الضوء الأحمر والأزرق في اليوم الأول (الوسط الأيسر) أو اليوم الخامس عشر (اليمين). NS، غير مهم. j، k، الخصائص السلوكية لجميع الحيوانات المزروعة باستخدام t-hCO المعبرة عن hChR2-EYFP (j) أو الفلوروفور الضابط (k) في اليوم الأول أو الخامس عشر (hChR2-EYFP: n = 9 جرذان، ** P = 0.0049؛ الضابط: n = 9، P = 0.1497). ل، تطور درجة التفضيل (ن = 9 hChR2، ن = 9 ضابط؛ **P < 0.001، ***P < 0.0001). ل، تطور درجة التفضيل (ن = 9 hChR2، ن = 9 ضابط؛ **P < 0.001، ***P < 0.0001). l, Эволюция показателя педпочтения (n = 9 hChR2, n = 9 контрольных; **P <0,001, ***P <0,0001). ل، تطور درجة التفضيل (ن = 9 hChR2، ن = 9 ضوابط؛ **P < 0.001، ***P < 0.0001). l،偏好评分的演变(n = 9 hChR2،n = 9 对照；**P <0.001،***P <0.0001). l،偏好评分的演变(n = 9 hChR2،n = 9 对照；**P <0.001،***P <0.0001). l، Эволюция показателей педпочтения (n = 9 hChR2، n = 9 контролей؛ ** P <0,001، *** P <0,0001). ل، تطور درجات التفضيل (ن = 9 hChR2، ن = 9 ضوابط؛ **P < 0.001، ***P < 0.0001).م، تعبير FOS استجابةً للتنشيط البصري لـ t-hCO في S1. تظهر صور تعبير FOS (يسار) والقياس الكمي (ن = 3 لكل مجموعة؛ *P < 0.05، **P < 0.01 و***P < 0.001) (يمين). تظهر صور تعبير FOS (يسار) والقياس الكمي (ن = 3 لكل مجموعة؛ *P < 0.05، **P < 0.01 و***P < 0.001) (يمين). عرض الصور التعبيرية FOS (سليفا) والخيارات الشاملة (n = 3 في المجموعة؛ * P <0,05، ** P <0,01 و *** P <0,001) (صحيح). تظهر صور تعبير FOS (يسار) والقياس الكمي (ن = 3 لكل مجموعة؛ *P<0.05، **P<0.01، و***P<0.001) (يمين).استخدم FOS (左) و 量化 (每 组 = 3 ； * P < 0.05 、 ** P < 0.01 و *** P < 0.001) (右) 的 图像.استخدم FOS (左) و 量化 (每 组 = 3 ； * P < 0.05 、 ** P < 0.01 و *** P < 0.001) (右) 的 图像. عرض الصور التعبيرية FOS (سليفا) والخيارات الشاملة (n = 3 في المجموعة؛ * P <0,05، ** P <0,01 و *** P <0,001) (صحيح). تظهر صور تعبير FOS (يسار) والقياس الكمي (ن = 3 لكل مجموعة؛ *P<0.05، **P<0.01، و***P<0.001) (يمين).شريط المقياس، ١٠٠ ميكرومتر. البيانات مُعبَّر عنها كمتوسط ​​± خطأ معياري لـ BLA، اللوزة القاعدية الجانبية، MDT، النواة المهادية الظهرية الإنسية، PAG، والرمادية المحيطة بالقناة.
أخيرًا، سألنا عما إذا كان t-hCO يمكنه تعديل سلوك الفئران. لاختبار ذلك، زرعنا hCO المعبر عن hChR2-EYFP في S1، وبعد 90 يومًا، زرعنا أليافًا بصرية في t-hCO لتوصيل الضوء. ثم دربنا الفئران باستخدام نموذج تكييف إجرائي معدل (الشكل 5ح). وضعنا الحيوانات في حجرة اختبار سلوكية وطبقنا بشكل عشوائي محفزات ليزر أزرق (473 نانومتر) وأحمر (635 نانومتر) لمدة 5 ثوانٍ. تلقت الحيوانات مكافأة مائية إذا لعقت أثناء تحفيز الضوء الأزرق ولكنها لم تلعق أثناء تحفيز الضوء الأحمر. في اليوم الأول من التدريب، لم تُظهر الحيوانات أي فرق في اللعق عند تحفيزها بالضوء الأزرق أو الأحمر. ومع ذلك، في اليوم الخامس عشر، أظهرت الحيوانات المزروعة بـ hCO المعبر عن hChR2-EYFP لعقًا أكثر نشاطًا عند تحفيزها بالضوء الأزرق مقارنةً بتحفيز الضوء الأحمر. لم تُلاحظ هذه التغيرات في سلوك اللعق لدى الحيوانات الضابطة المزروعة بـ hCO2 المُعبِّرة عن الفلوروفور الضابط (معدل نجاح التعلم: hChR2 89%، EYFP 0%، الشكل 5i-1 والفيديو التكميلي 2). تشير هذه البيانات إلى أن خلايا t-hCO2 يُمكنها تنشيط الخلايا العصبية للجرذان لتحفيز سلوك البحث عن المكافأة. لمعرفة الدوائر العصبية لـ t-hCO2 لدى الجرذان التي قد تكون مُشاركة في هذه التغيرات السلوكية، قمنا بتنشيط t-hCO2 ضوئيًا في الحيوانات المُدرَّبة والأنسجة المُحصودة بعد 90 دقيقة. كشفت الكيمياء المناعية عن تعبير بروتين FOS المُعتمد على النشاط في العديد من مناطق الدماغ المُشاركة في السلوك المُحفَّز، بما في ذلك القشرة الجبهية الأمامية الإنسية، والمهاد الإنسي، والمادة الرمادية المُحيطة بالقناة، والذي عُبِّر عنه إما في الحيوانات الضابطة غير المُحفَّزة أو في الحيوانات الأخرى. 5 أمتار). وبالنظر إلى هذه البيانات مجتمعةً، تُشير إلى أن t-hCO2 يُمكنه تعديل نشاط الخلايا العصبية للجرذان لتوجيه السلوك.
تُمثل العضيات العصبية نظامًا واعدًا لدراسة النمو البشري والأمراض في المختبر، إلا أنها محدودة بسبب نقص الروابط بين الدوائر العصبية الموجودة في الجسم الحي. لقد طورنا منصة جديدة زرعنا فيها hCO في S1 لفئران ضعيفة المناعة في مرحلة ما بعد الولادة المبكرة لدراسة نمو الخلايا البشرية ووظائفها في الجسم الحي. وقد أظهرنا أن t-hCO يُطور أنواعًا من الخلايا الناضجة لم تُلاحظ في المختبر28، وأن t-hCO مُدمج تشريحيًا ووظيفيًا في دماغ القوارض. وقد سمح لنا دمج t-hCO في الدوائر العصبية للقوارض بإقامة صلة بين النشاط الخلوي البشري وسلوك الحيوانات المدروس، مُبينين أن الخلايا العصبية t-hCO قادرة على تعديل النشاط العصبي للفئران لتوجيه الاستجابات السلوكية.
تتميز المنصة التي نصفها بمزايا عديدة مقارنةً بالأبحاث السابقة حول زراعة الخلايا البشرية في أدمغة القوارض. أولًا، زرعنا hCO في القشرة المخية النامية لفئران في مرحلة ما بعد الولادة المبكرة، مما قد يُسهّل التكامل التشريحي والوظيفي. ثانيًا، أتاحت لنا مراقبة t-hCO بالرنين المغناطيسي دراسة موضع الطعم ونموه في الحيوانات الحية، مما سمح لنا بإجراء دراسات طويلة الأمد على حيوانات متعددة، وتحديد موثوقية العديد من سلالات خلايا hiPS. وأخيرًا، زرعنا عضيات سليمة، بدلًا من معلقات الخلايا المفردة المعزولة، وهي أقل ضررًا على الخلايا البشرية، ويمكنها تعزيز تكامل وتوليد الخلايا العصبية القشرية البشرية في أدمغة الفئران.
نُقرّ بأنه على الرغم من التقدم المُحرز في هذه المنصة، فإن القيود الزمنية والمكانية، وتداخل الأنواع، تمنع تكوين دوائر عصبية بشرية بدقة عالية، حتى بعد الزرع في مرحلة مبكرة من النمو. على سبيل المثال، ليس من الواضح ما إذا كان النشاط التلقائي المُلاحظ في t-hCO يُمثل نمطًا ظاهريًا نمائيًا مُشابهًا للنشاط الإيقاعي المُلاحظ أثناء نمو القشرة المخية، أم أنه ناتج عن غياب أنواع الخلايا الكابتة الموجودة في t-hCO. وبالمثل، ليس من الواضح إلى أي مدى يؤثر غياب التصفيح في t-hCO على اتصال السلسلة30. ستُركّز الأبحاث المستقبلية على دمج أنواع خلايا أخرى، مثل الخلايا الدبقية الصغيرة البشرية، والخلايا البطانية البشرية، ونسب مُتفاوتة من الخلايا العصبية البينية GABAergic، كما هو مُوضّح باستخدام التجميع 6 في المختبر، بالإضافة إلى فهم كيفية حدوث التكامل العصبي والمعالجة في المستويات النسخية والتشابكية والسلوكية المُعدّلة لـ t-hCO في الخلايا المُستقاة من المرضى.
بشكل عام، تُمثل هذه المنصة الحيوية موردًا قويًا يُكمّل أبحاث نمو الدماغ البشري والأمراض المُجراة في المختبر. ونتوقع أن تُمكّننا هذه المنصة من اكتشاف أنماط ظاهرية جديدة على مستوى الخيوط في خلايا مشتقة من المرضى، والتي كانت صعبة المنال لولا ذلك، واختبار استراتيجيات علاجية جديدة.
تم توليد hCO2.5 من خلايا HiPS كما هو موضح سابقًا. لبدء إنتاج hCO2 من خلايا hiPS المزروعة على طبقات التغذية، أُزيلت مستعمرات خلايا hiPS السليمة من أطباق الزراعة باستخدام إنزيم ديسبيز (0.35 ملغ/مل) ونُقلت إلى مزارع بلاستيكية منخفضة الالتصاق للغاية تحتوي على أطباق تحتوي على وسط زراعة خلايا hiPS. (Corning) مُضافًا إليه مثبطان SMAD: دورسومورفين (5 ميكرومولار؛ P5499، سيجما-ألدريتش) وSB-431542 (10 ميكرومولار؛ 1614، توكريس) ومثبط ROCK Y-27632 (10 ميكرومولار؛ S1049، Selleckchem). خلال الأيام الخمسة الأولى، تم تغيير وسط خلايا hiPS يوميًا، وأُضيف إليه دورسومورفين وSB-431542. في اليوم السادس من التعليق، تم نقل الكرات العصبية إلى وسط عصبي يحتوي على neurobasal-A (10888، Life Technologies)، ومكمل B-27 بدون فيتامين A (12587، Life Technologies)، وGlutaMax (1:100، Life Technologies)، والبنسلين والستربتوميسين (1:100، Life Technologies) وتم استكماله بعامل نمو البشرة (EGF؛ 20 نانوغرام/مل؛ R&D Systems) وعامل نمو الخلايا الليفية 2 (FGF2؛ 20 نانوغرام/مل؛ R&D Systems) حتى اليوم 24. ومن اليوم 25 إلى اليوم 42، تم استكمال الوسط بعامل التغذية العصبية المشتق من الدماغ (BDNF؛ 20 نانوغرام/مل، Peprotech) والنيوروتروفين 3 (NT3؛ 20 نانوغرام/مل؛ Peprotech) مع تغيير الوسط كل يومين. في اليوم السادس من التعليق، تم نقل الكرات العصبية إلى وسط عصبي يحتوي على neurobasal-A (10888، Life Technologies)، ومكمل B-27 بدون فيتامين A (12587، Life Technologies)، وGlutaMax (1:100، Life Technologies)، والبنسلين والستربتوميسين (1:100، Life Technologies) وتم استكماله بعامل نمو البشرة (EGF؛ 20 نانوغرام/مل؛ R&D Systems) وعامل نمو الخلايا الليفية 2 (FGF2؛ 20 نانوغرام/مل؛ R&D Systems) حتى اليوم 24. ومن اليوم 25 إلى اليوم 42، تم استكمال الوسط بعامل التغذية العصبية المشتق من الدماغ (BDNF؛ 20 نانوغرام/مل، Peprotech) والنيوروتروفين 3 (NT3؛ 20 نانوغرام/مل؛ Peprotech) مع تغيير الوسط كل يومين.في اليوم السادس من التعليق، تم نقل الكرات العصبية إلى وسط عصبي يحتوي على Neurobasal-A (10888، Life Technologies)، مكمل B-27 بدون فيتامين A (12587، Life Technologies)، GlutaMax (1:100، Life Technologies)، البنسلين.والستربتوميسين (1:100، تقنيات الحياة) وعامل إضافي للبشرة (EGF؛ 20 نانوغرام/مل؛ أنظمة البحث والتطوير) وعامل الأرومة الليفية 2 (FGF2; 20) ng/ml; أنظمة البحث والتطوير) حتى 24 يومًا. والستربتوميسين (1:100، تقنيات الحياة) ومكمل بعامل نمو البشرة (EGF؛ 20 نانوجرام/مل؛ أنظمة R&D) وعامل نمو الخلايا الليفية 2 (FGF2؛ 20 نانوجرام/مل؛ أنظمة R&D) حتى اليوم 24.من اليوم 25 إلى اليوم 42، تمت إضافة عامل التغذية العصبية المشتق من الدماغ (BDNF؛ 20 نانوجرام مل-1، Peprotech) والنيوروتروفين 3 (NT3؛ 20 نانوجرام مل-1، Peprotech) إلى الوسط، مع تغيير الوسط كل يومين.6 在悬浮的第، 经球体转移到含有neurobasal-A(10888،تقنيات الحياة)،不含维生素A 的B-27 补充剂(12587،Life) التكنولوجيات)، غلوتاماكس (1:100، تقنيات الحياة)، 青霉素的神经培养基中和链霉素(1:100، الحياة) التقنيات)并辅以表皮生长因子(EGF；20 نانوغرام مل-1；أنظمة البحث والتطوير) وأنظمة البحث والتطوير(FGF2；20 نانوغرام مل-1；أنظمة البحث والتطوير)24天.تم تصميمه بواسطة 6 天 将 神 经 球体 含有 含有 neurobasal-a (10888، Life Technologies) 不 含 维生素 a 的 b-27 تصنيف (12587، تقنيات الحياة) غلوتاماكس (1: 100، Life TechNOGIS، تكنولوجيا الحياة) 生长 因子 （((20 ng ml-1 ； r & d Systems) أو 纤维 细胞 生长 2 (fgf2 ； 20 ng ml- 1； R&D Systems) 直至第24天. تم تعليق كبسولات أعصاب لمدة 6 أيام على مادة مغذية، بما في ذلك مادة نيتروجين-A (10888، Life Technologies)، وفيتامين V-27 بدون فيتامين A. (12587، تقنيات الحياة)، غلوتاماكس (1:100، تقنيات الحياة)، البنسلين- الستربتوميسين المحايد (1:100، تقنيات الحياة) مع إضافة عامل البشرة الأساسي (EGF؛ 20 نانوغرام مل-1؛ أنظمة البحث والتطوير) وعامل الخلايا الليفية 2 (FGF2؛ 20 نانوغرام مل-1) 1؛ في اليوم السادس، تم تحويل معلقات الكرة العصبية إلى مكمل يحتوي على neurobasal-A (10888، Life Technologies)، ومكمل B-27 بدون فيتامين A (12587، Life Technologies)، وGlutaMax (1:100، Life Technologies)، وستربتوميسين محايد للبنسلين (1:100، Life Technologies) مضاف إليه عامل نمو البشرة (EGF؛ 20 نانوجرام مل-1؛ R&D Systems) وعامل نمو الخلايا الليفية 2 (FGF2؛ 20 نانوجرام مل-1) 1؛ أنظمة البحث والتطوير) حتى 24 يومًا. أنظمة البحث والتطوير) حتى اليوم 24.من اليوم الخامس والعشرين إلى الثاني والأربعين، أُضيف عامل التغذية العصبية المشتق من الدماغ (BDNF؛ 20 نانوغرام/مل، بيبروتيك) وعامل التغذية العصبية 3 (NT3؛ 20 نانوغرام/مل، بيبروتيك) إلى وسط الزراعة كل يومين. يُغيّر الوسط مرة واحدة.ابتداءً من اليوم الثالث والأربعين، تم الحفاظ على تركيز ثاني أكسيد الكربون في وسط neurobasal-A غير المعزز (NM؛ 1088022، Thermo Fisher) مع تغيير الوسط كل 4-6 أيام. للحصول على تركيز ثاني أكسيد الكربون من خلايا hiPS المزروعة في ظروف خالية من التغذية، حُضنت خلايا hiPS مع Accutase (AT-104، Innovate Cell Technologies) عند درجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة 7 دقائق، ثم فُصلت إلى خلايا مفردة، ووُضعت على أطباق AggreWell 800 (34815، STEMCELL Technologies) بكثافة 3 × 106 خلية مفردة لكل بئر في وسط Essential 8 المعزز بمثبط ROCK Y-27632 (10 ميكرومولار؛ S1049، Selleckchem). بعد ٢٤ ساعة، تم ضخ الوسائط الموجودة في الآبار صعودًا وهبوطًا في وسائط تحتوي على وسائط Essential 6 (A1516401، Life Technologies) مضافًا إليها دورسومورفين (2.5 ميكرومول؛ P5499، Sigma-Aldrich) وSB-431542 (10 ميكرومول؛ 1614). (Tocrida). من اليوم الثاني إلى اليوم السادس، تم استبدال وسط Essential 6 يوميًا بدورسومورفين ومكمل SB-431542. بدءًا من اليوم السادس، تم نقل معلقات الكرة العصبية إلى وسط Neurobasal وصيانتها كما هو موضح أعلاه.
تم إجراء جميع إجراءات الحيوانات وفقًا لإرشادات رعاية الحيوانات المعتمدة من قبل لجنة إدارة رعاية حيوانات المختبر بجامعة ستانفورد (APLAC). تم شراء فئران RNU (rnu/+) الحوامل السليمة النمو (مختبرات تشارلز ريفر) أو إيواؤها. تم الاحتفاظ بالحيوانات على دورة ضوء وظلام مدتها 12 ساعة مع الطعام والماء حسب الرغبة. تم التعرف على صغار الفئران العارية (FOXN1–/–) التي تتراوح أعمارها بين ثلاثة وسبعة أيام من خلال نمو الشوارب غير الناضجة قبل الذبح. تم تخدير الجراء (الذكور والإناث) بمادة إيزوفلوران 2-3٪ ووضعها على إطار مجسم. تم إجراء ثقب الجمجمة بقطر يبلغ حوالي 2-3 مم فوق S1 مع الحفاظ على سلامة الأم الجافية. ثم استخدم إبرة 30-G (حوالي 0.3 مم) خارج فتحة الجمجمة مباشرة لثقب الجافية. ثم ضع HCO على بارافيلم رقيق 3 × 3 سم وأزل الوسط الزائد. باستخدام محقنة هاميلتون متصلة بإبرة 23 G و 45 درجة، اسحب hCO برفق في الطرف الأبعد للإبرة. ثم قم بتركيب المحقنة على مضخة المحقنة المتصلة بجهاز التجسيم التجسيمي. ثم ضع طرف الإبرة فوق ثقب ثقب تم صنعه مسبقًا بعرض 0.3 مم في الجافية (z = 0 مم) وضيّق المحقنة بمقدار 1-2 مم (z = -1.5 مم تقريبًا) حتى تصبح الإبرة بين الجافية A. يتم تكوين ختم كثيف. ثم ارفع المحقنة إلى مركز السطح القشري عند z = -0.5 مم واحقن hCO بمعدل 1-2 ميكرولتر في الدقيقة. بعد الانتهاء من حقن hCO، يتم سحب الإبرة بمعدل 0.2-0.5 مم في الدقيقة، ويتم خياطة الجلد، ويوضع الجرو على الفور على وسادة تدفئة دافئة حتى يتعافى تمامًا. تم زرع بعض الحيوانات بشكل ثنائي.
أُجريت جميع الإجراءات على الحيوانات وفقًا لإرشادات رعاية الحيوانات المعتمدة من جامعة ستانفورد (APLAC). حُثّت الفئران (بعد أكثر من 60 يومًا من الزرع) على تخدير 5% من الأيزوفلوران، وخُدِّرت بمادة أيزوفلوران بنسبة 1-3% أثناء التصوير. للتصوير، استُخدم ماسح ضوئي أفقي للآبار بقوة 7 تسلا من شركة بروكر (Bruker Corp.) محميّ بنشاط، ومزوّد بمحرك تدرج من شركة الكهرباء الدولية (IECO)، ومُدخل تدرج محميّ بقطر داخلي 120 مم (600 ميكرو تسلا/متر، 1000 ميكرو تسلا/متر/ثانية) باستخدام نظام AVANCE. III، وثماني قنوات متعددة الملفات، وإمكانات تردد لاسلكي متعددة الأنوية، ومنصة Paravision 6.0.1 المصاحبة. أُجري التسجيل باستخدام ملف تردد لاسلكي حجمي منفصل بنشاط بقطر داخلي 86 مم، وملف تردد لاسلكي مُبرّد بالتبريد رباعي القنوات للاستقبال فقط. تقنية Axial 2D Turbo-RARE (زمن التكرار = 2500 مللي ثانية، زمن الصدى = 33 مللي ثانية، متوسطان) مع 16 شريحة، سُمك الشريحة 0.6-0.8 مم، وتحتوي على 256 × 256 عينة. استُقبلت الإشارات باستخدام ملف تردد لاسلكي حجمي لجهاز إرسال واستقبال رباعي بقطر داخلي 2 سم (Rapid MR International, LLC). وأخيرًا، استُخدمت دوال تقدير السطح المدمجة في Imaris (BitPlane) للرسم ثلاثي الأبعاد وتحليل الحجم. عُرفت عملية الزرع الناجحة بأنها تلك التي تتشكل فيها مناطق من إشارة الرنين المغناطيسي المستمرة المرجحة بـ T2 في نصف الكرة المزروع. عُرف رفض الطعم بأنه طعم لا ينتج مناطق من إشارة الرنين المغناطيسي المستمرة المرجحة بـ T2 في نصف الكرة المزروع. استُبعدت t-hCO تحت القشرية من التحليل اللاحق.
للتعبير المستقر عن GCaMP6s في hCO3 لتصوير الكالسيوم ثنائي الفوتون، حُوِّلت خلايا hiPS إلى pLV[Exp]-EF1a::GcaMP6s-WPRE-Puro، ثم اختيرت المضادات الحيوية. باختصار، فُصلت الخلايا باستخدام EDTA، وعُلِّقت في 1 مل من وسط Essential 8 بكثافة تقارب 300,000 خلية، بوجود بوليبرين (5 ميكروغرام/مل) و15 ميكرولتر من الفيروس. ثم حُضِّنت الخلايا في المُعلَّق لمدة 60 دقيقة، ووُزِّعت بكثافة 50,000 خلية لكل بئر. بعد التقاء الخلايا، عولجت ببيورومايسين بتركيز 5-10 ميكروغرام/مل-1 لمدة 5-10 أيام أو حتى ظهور مستعمرات مستقرة. أُجريت عدوى hCO3 الحادة كما هو موضح سابقًا5 مع بعض التعديلات. باختصار، انقل في اليوم 30-45 ساعة من ثاني أكسيد الكربون إلى أنابيب طرد مركزي إيبندورف ميكروية سعة 1.5 مل تحتوي على 100 ميكرولتر من وسط عصبي. بعد ذلك، يُزال حوالي 90 ميكرولتر من الوسط، ويُضاف 3-6 ميكرولتر من الفيروسة العصوية عالية التركيز (من 0.5 × 108 إلى 1.2 × 109) إلى الأنبوب، ثم يُنقل ثاني أكسيد الكربون إلى الحاضنة لمدة 30 دقيقة. بعد ذلك، يُضاف 90-100 ميكرولتر من الوسط إلى كل أنبوب، وتُعاد الأنابيب إلى الحاضنة طوال الليل. في اليوم التالي، يُنقل ثاني أكسيد الكربون إلى وسط عصبي جديد في صفائح منخفضة الالتصاق. بعد 7 أيام، يُنقل ثاني أكسيد الكربون إلى صفائح زجاجية ذات 24 بئرًا لتصوير العدوى وتقييم جودتها. تم إنشاء pLV[Exp]-SYN1::EYFP-WPRE وpLV[Exp]-SYN1::hChR2-EYFP-WPRE بواسطة VectorBuilder. يُستخدم الفيروس العكوس في معظم التجارب لاندماجه في جينوم العائل، مما يسمح بالتعبير الجيني المُبلّغ عنه في سلالات الخلايا المصابة. لمتابعة داء الكلب، تم تطعيم خلايا hCO2 في الفترة من 30 إلى 45 يومًا بجينات rabies-ΔG-eGFP وAAV-DJ-EF1a-CVS-G-WPRE-pGHpA (البلازميد رقم 67528، Addgene)، ثم غسلها جيدًا لمدة 3 أيام، ثم زُرعت في الفئران في S1، وحُفظت في الجسم الحي لمدة 7-14 يومًا.
لإجراء مناعة خلوية كيميائية، خُدِّرت الحيوانات ورُويت عبر القلب بمادة فوسفات الصوديوم (PBS)، ثم أُضيف إليها بارافورمالدهيد بنسبة 4% (PFA في PBS؛ Electron Microscopy Sciences). ثُبِّتت الأدمغة في محلول فوسفات الصوديوم بنسبة 4% لمدة ساعتين أو طوال الليل عند درجة حرارة 4 درجات مئوية، ثم حُفظت بالتبريد في محلول 30% سكروز في محلول فوسفات الصوديوم لمدة 48-72 ساعة، وغُرست في محلول فوسفات الصوديوم بنسبة 1:1، 30% سكروز: OCT (مركب Tissue-Tek OCT 4583، Sakura Finetek)، وأُجريت مقاطع إكليلية عند 30 ميكرومتر باستخدام جهاز تبريد (Leica). لإجراء مناعة نسيجية كيميائية للمقاطع السميكة، رُويت الحيوانات بمادة فوسفات الصوديوم (PBS)، ثم شُرِّح الدماغ وقُطِّع إكليليًا عند 300-400 ميكرومتر باستخدام جهاز اهتزازي (Leica)، ثُبِّتت المقاطع بمادة فوسفات الصوديوم بنسبة 4% لمدة 30 دقيقة. ثم غسلت المقاطع المبردة أو المقاطع السميكة بـ PBS، وحُجبت لمدة ساعة في درجة حرارة الغرفة (10% مصل حمار طبيعي (NDS) و0.3% Triton X-100 مخفف في PBS) وحُجبت بمحلول حجب عند 4 درجات مئوية. - الحضانة تم حضن المقاطع المبردة طوال الليل وتم حضن المقاطع السميكة لمدة 5 أيام. كانت الأجسام المضادة الأولية المستخدمة هي: مضاد NeuN (الفأر، 1:500؛ ab104224، abcam) مضاد CTIP2 (الجرذ، 1:300؛ ab18465، abcam) مضاد GFAP (الأرنب، 1:1000؛ Z0334، Dako) مضاد GFP (الدجاج، 1:1000؛ GTX13970، GeneTex) مضاد HNA (الفأر، 1:200؛ ab191181، abcam) مضاد NeuN (الأرنب، 1:500؛ ABN78، Millipore) مضاد PDGFRA (الأرنب، 1:200؛ sc-338، Santa Cruz) مضاد PPP1R17 (الأرنب، 1:200؛ HPA047819، Atlas Antibodies) مضاد RECA-1 (الفأر، 1:50؛ ab9774، abcam)، ومضاد SCG2 (أرنب، 1:100؛ 20357-1-AP، Proteintech)، ومضاد SOX9 (ماعز، 1:500؛ AF3075، R&D Systems)، ومضاد Netrin G1a (ماعز، 1:100؛ AF1166، R&D Systems)، ومضاد STEM121 (فأر، 1:200؛ Y40410، Takara Bio)، ومضاد SATB2 (فأر، 1:50؛ ab51502، abcam)، ومضاد GAD65/67 (أرنب، 1:400؛ ABN904، Millipore) ومضاد IBA1 (ماعز، 1:100؛ ab5076، abcam). كانت الأجسام المضادة الأولية المستخدمة هي: مضاد NeuN (الفأر، 1:500؛ ab104224، abcam) مضاد CTIP2 (الجرذ، 1:300؛ ab18465، abcam)، مضاد GFAP (الأرنب، 1:1000؛ Z0334، Dako)، مضاد -GFP (الدجاج، 1:1000؛ GTX13970، GeneTex)، مضاد HNA (الفأر، 1:200؛ ab191181، abcam)، مضاد NeuN (الأرنب، 1:500؛ ABN78، Millipore)، مضاد PDGFRA (الأرنب، 1:200؛ sc-338، Santa Cruz)، مضاد PPP1R17 (الأرنب، 1:200؛ HPA047819، Atlas Antibodies)، مضاد RECA-1 (الفأر، 1:50؛ ab9774، abcam)، مضاد لـ SCG2 (أرنب، 1:100؛ 20357-1-AP، Proteintech)، مضاد لـ SOX9 (ماعز، 1:500؛ AF3075، R&D Systems)، Netrin G1a (ماعز، 1:100؛ AF1166، R&D Systems)، مضاد لـ STEM121 (فأر، 1:200؛ Y40410، Takara Bio)، مضاد لـ SATB2 (فأر، 1:50؛ ab51502، abcam)، مضاد لـ GAD65/67 (أرنب، 1:400؛ ABN904، Millipore) ومضاد لـ IBA1 (ماعز، 1:100؛ ab5076، abcam). تم استخدام المضاد الأول التالي: Anti-NeuN (الخرسانة، 1:500؛ ab104224، abcam)، anti-CTIP2 (كريسين، 1:300؛ ab18465، abcam)، مضاد GFAP (الطول، 1:1000؛ Z0334، داكو)، مضاد -GFP (كوريثا، 1:1000؛ GTX13970، GeneTex)، مضاد HNA (الموج، 1:200؛ ab191181، abcam)، مضاد-NeuN (كروليك، 1:500؛ ABN78، ميليبور)، مضاد-PDGFRA (كروليك، 1:200؛ sc-338، سانتا كروز)، مضاد-PPP1R17 (كروليك، 1:200؛ HPA047819، أطلس الأجسام المضادة)، مضاد-RECA-1 (مم، 1:50؛ ab9774، abcam)، مضاد-SCG2 (متعرج، 1:100؛ 20357-1-AP، بروتينتك)، مضاد-SOX9 (كوزي، 1:500؛ AF3075، أنظمة البحث والتطوير)، نيترين G1a (كوزي، 1:100؛ AF1166، أنظمة البحث والتطوير)، مضاد-STEM121 (مم، 1:200؛ Y40410، تاكارا بيو)، مضاد-SATB2 (مم، 1:50؛ ab51502، abcam)، مضاد-GAD65/67 (كروليك، 1:400؛ ABN904، ميليبور) ومضاد IBA1 (كوسا, 1 :100; AB5076, بمعنى آخر). كانت الأجسام المضادة الأساسية المستخدمة هي: مضاد NeuN (الفأر، 1:500؛ ab104224، abcam)، مضاد CTIP2 (الجرذ، 1:300؛ ab18465، abcam)، مضاد GFAP (الأرنب، 1:1000؛ Z0334، Dako)، مضاد GFP (الدجاج، 1:1000؛ GTX13970، GeneTex)، مضاد HNA (الفأر، 1:200؛ ab191181، abcam)، مضاد NeuN (الأرنب، 1:500؛ ABN78، Millipore)، مضاد PDGFRA (الأرنب، 1:200؛ sc-338، Santa Cruz)، مضاد PPP1R17 (الأرنب، 1:200؛ HPA047819، Atlas Antibodies)، مضاد RECA-1 (الفأر، 1:50؛ ab9774، abcam)، ومضاد SCG2 (أرنب، 1:100؛ 20357-1-AP، Proteintech)، ومضاد SOX9 (ماعز، 1:500؛ AF3075، R&D Systems)، وnetrin G1a (ماعز، 1:100؛ AF1166، R&D Systems)، ومضاد STEM121 (فأر، 1:200؛ Y40410، Takara Bio)، ومضاد SATB2 (فأر، 1:50؛ ab51502، abcam)، ومضاد GAD65/67 (أرنب، 1:400؛ ABN904، Millipore) ومضاد IBA1 (ماعز، 1:100؛ ab5076، abkam).الإستخدام الأمثل: نيوN (التصوير، 1:500، ab104224، abcam) أو CTIP2 (التصوير، 1:3) 00；ab18465,abcam),抗GFAP(兔,1:1,000；Z0334,Dako),抗-GF P (1: 1000، GTX13970، GeneTex)، HNA (小鼠، 1:200، ab191181، abcam)، NeuN (1:500، ABN78، Millipore)، PDGFRA (兔)، 1:200، SC-338، سانتا كروز، PPP1R17 (兔، 1:200، HPA047819، Atlas 体)، RECA-1 (小鼠، 1:50، ab9774، abcam)، SCG2 (兔)، 1:100؛ 20357-1-AP، بروتين تك)، SOX9 (山羊، 1:500؛ AF3075، أنظمة البحث والتطوير)، نترين G1a (山羊، 1:100؛ AF1166، أنظمة البحث والتطوير)، STEM121 (小鼠، 1:200)؛أفضل ما في الأمر: نيوN (التصوير، 1:500، ab104224، abcam) أو CTIP2 (التصوير، 1) :300；ab18465,abcam),抗GFAP(兔,1:1,000；Z0334,Dako),抗-GFP (1: 1,000، GTX13970، GeneTex)، HNA (1:200، ab191181، abcam)، نيوN (1:500، ABN78، ميليبور، 1: 200؛ sc-338، سانتا كروز)، PPP1R17 (兔، 1:200؛ HPA047819، Atlas 体)،، RECA-1 (小鼠، 1:50، ab9774، abcam)،، SCG2 100；20357-1-AP، بروتينتك)، SOX9 (山羊، 1:500، AF3075، أنظمة البحث والتطوير)، Netrin G1a (山羊، 1:100، AF1166، أنظمة البحث والتطوير) 1:20، ؛Y40410، Takara Bio)، مضاد لـ SATB2 (فأر، 1:50؛ ab51502، abcam)، مضاد لـ GAD65/67 (أرنب، 1:400؛ ABN904، Millipore) ومضاد لـ IBA1 (ماعز، 1:100؛ ab5076، abcam).كانت الأجسام المضادة الأولية المستخدمة هي: مضاد NeuN (الفأر، 1:500؛ ab104224، abcam)، مضاد CTIP2 (الجرذ، 1:300؛ ab18465، abcam)، مضاد GFAP (الأرنب، 1:1000؛ Z0334، Dako). ، مضاد لـ GFP (دجاجة، 1:1000؛ GTX13970، GeneTex)، مضاد لـ HNA (فأر، 1:200؛ ab191181، abcam)، مضاد لـ NeuN (أرنب، 1:500؛ ABN78، Millipore)، مضاد لـ PDGFRA (أرنب، 1:200؛ sc-338، سانتا كروز)، مضاد لـ PPP1R17 (أرنب، 1:200؛ HPA047819، جسم مضاد Atlas)، مضاد لـ RECA-1 (فأر، 1:50؛ ab9774، abcam)، مضاد لـ SCG2 (أرنب)، 1:100؛20357-1-AP، بروتينتك)، مضاد SOX9 (كوز، 1:500؛ AF3075، أنظمة البحث والتطوير)، نترين G1a (كوز، 1:100؛ AF1166، أنظمة البحث والتطوير)، مضاد -STEM121 (مم، 1:200؛ Y40410، تاكارا) Bio)، مضاد SATB2 (الجهاز، 1:50؛ ab51502، abcam)، مضاد GAD65/67 (كروليك، 1:400؛ ABN904، ميليبور) ومضاد IBA1 (كوسا، 1:100؛ AB5076، إلخ). (20357-1-AP، Proteintech)، ومضاد SOX9 (الماعز، 1:500؛ AF3075، R&D Systems)، ومضاد Netrin G1a (الماعز، 1:100؛ AF1166، R&D Systems)، ومضاد STEM121 (الفأر، 1:200؛ Y40410، Takara Bio)، ومضاد SATB2 (الفأر، 1:50؛ ab51502، abcam)، ومضاد GAD65/67 (الأرنب، 1:400؛ ABN904، Millipore)، ومضاد IBA1 (الماعز، 1:100؛ ab5076، abkam).تم غسل المقاطع بعد ذلك باستخدام PBS وحضنها مع جسم مضاد ثانوي لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة (مقاطع مجمدة) أو طوال الليل عند 4 درجات مئوية (مقاطع سميكة). تم استخدام الجسم المضاد الثانوي Alexa Fluor (Life Technologies) المخفف بنسبة 1: 1000 في محلول حجب. بعد الغسل باستخدام PBS، تم تصور النوى باستخدام Hoechst 33258 (Life Technologies). أخيرًا، تم وضع الشرائح على مجهر مع غطاء زجاجي (Fisher Scientific) باستخدام Aquamount (Polysciences) وتحليلها على مجهر فلورسنت Keyence (محلل BZ-X) أو مجهر Leica TCS SP8 متحد البؤر (Las-X) على الصورة. تمت معالجة الصور باستخدام برنامج ImageJ (فيجي). لتحديد نسبة الخلايا العصبية البشرية في t-hCO وقشرة الفئران، تم التقاط صور مستطيلة بعرض 387.5 ميكرومتر في مركز t-hCO، عند حافة قشرة الفئران أو بالقرب منها. تم تحديد هوامش الطعم بتقييم التغيرات في شفافية الأنسجة، ونوى HNA+، و/أو وجود تألق ذاتي للأنسجة. في كل صورة، قُسِّم العدد الإجمالي لخلايا NeuN+ وHNA+ على العدد الإجمالي لخلايا NeuN+ في نفس المنطقة. لضمان احتساب الخلايا التي تحتوي على نوى فقط في مستوى الصورة، أُدرجت الخلايا التي تحتوي أيضًا على Hoechst+ فقط في الحساب. تم حساب متوسط ​​صورتين يفصل بينهما 1 مم على الأقل لتقليل الخطأ الإحصائي.
قبل أسبوع من جمع العينات، وُضعت حيوانات زراعة hCO3 (بعد حوالي 8 أشهر من التمايز) في غرفة مظلمة مع قصّ شواربها لتقليل التحفيز الحسي. عُزلت الأنوية كما هو موضح سابقًا، مع بعض التعديلات. باختصار، تم تدمير t-hCO3 وhCO3 باستخدام تحلل الخلايا الميكانيكي بالمنظف وآلة طحن أنسجة زجاجية سعة 2 مل (D8938، Sigma-Aldrich/KIMBLE). بعد ذلك، رُشِّحت الأنوية الخام باستخدام مرشح 40 ميكرومتر، وطُردت مركزيًا بسرعة 320 غ لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية قبل إجراء تدرج كثافة السكروز. بعد مرحلة الطرد المركزي (320 غ لمدة 20 دقيقة عند 4 درجات مئوية)، أُعيد تعليق العينات في محلول فوسفات الصوديوم/فوسفات الصوديوم (BSA/PBS) بتركيز 0.04% مع إضافة 0.2 وحدة من مثبط ريبونوكلياز ميكرولتر-1 (40 وحدة ميكرولتر-1، AM2682، Ambion)، ومُررت عبر مرشح تدفق 40 ميكرومتر. ثم أُعيد تعليق النوى المنفصلة في محلول فوسفات الصوديوم (PBS) بتركيز 0.02% من محلول فوسفات الصوديوم، وحُملت على شريحة كروميوم أحادية الخلية 3′ (يُقدر استرداد 8000 خلية لكل مسار). تم إعداد مكتبات snRNA-seq باستخدام Chromium Single cell 3' GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics). تم إعداد مكتبات snRNA-seq باستخدام Chromium Single cell 3' GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics). تم إنشاء مكتبة snRNA-seq من خلال Chromium Single cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics). تم إعداد مكتبات snRNA-seq باستخدام Chromium Single cell 3' GEM، Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics). snRNA-seq تم تطويره بواسطة Chromium Single cell 3 'GEM، Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics) 制备的. snRNA-seq تم تطويره بواسطة Chromium Single cell 3 'GEM، Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics) 制备的. تم إنشاء مكتبة snRNA-seq باستخدام خلية الكروم المفردة 3 'GEM، Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics). تم إعداد مكتبة snRNA-seq باستخدام Chromium Single Cell 3′ GEM، Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics).تم تجميع المكتبات من عينات مختلفة وتسلسلها بواسطة Admera Health على NovaSeq S4 (Illumina).
تم تحديد مستويات التعبير الجيني لكل رمز شريطي نووي مفترض باستخدام برنامج التحليل 10x Genomics CellRanger (الإصدار 6.1.2). وتحديدًا، تمت مطابقة القراءات مع مجموعة من الجينومات المرجعية البشرية (GRCh38، Ensemble، الإصدار 98) والجرذية (Rnor_6.0، Ensemble، الإصدار 100)، المُنشأة باستخدام الأمر mkref، وباستخدام دالة count مع الأمر –include-introns=TRUE لتحديد قراءات التضمين المُطابقة لمناطق الإنترون. بالنسبة لعينات t-hCO، تم تحديد النوى البشرية بناءً على الشرط المُتحفظ بأن 95% على الأقل من جميع القراءات المُطابقة تُطابق الجينوم البشري. أُجريت جميع التحليلات اللاحقة على مُخرجات مصفوفة رموز شريطية مُفلترة من CellRanger باستخدام حزمة R (الإصدار 4.1.2) وSeurat (الإصدار 4.1.1)32.
لضمان تضمين النوى عالية الجودة فقط في التحليل اللاحق، طُبقت عملية ترشيح تكرارية لكل عينة. أولًا، تم تحديد وإزالة النوى منخفضة الجودة التي تحتوي على أقل من 1000 جين فريد، وتمثل أكثر من 20% من إجمالي الميتوكوندريا. بعد ذلك، تم تطبيع مصفوفة عدد الجينات الخام عن طريق الانحدار الثنائي السلبي المنظم باستخدام دالة sctransform(vst.flavor=”v2″)، والتي حددت أيضًا أكثر 3000 جين متغير باستخدام المعلمات الافتراضية. تم إجراء تقليل الأبعاد على الجينات المتغيرة العليا باستخدام تحليل المكونات الرئيسية (PCA) مع المعلمات الافتراضية باستخدام بُعد مجموعة بيانات 30 (تم اختيار الأبعاد = 30 بناءً على الفحص البصري لمواقع الركبة واستخدامها لجميع العينات وتحليلات المجموعة). ثم أجرينا عدة جولات من التجميع التكراري (الدقة = 1) لتصنيف الجينات بناءً على عدد الجينات المنخفض بشكل غير طبيعي (المتوسط ​​أقل من النسبة المئوية العاشرة)، وعدد جينات الميتوكوندريا المرتفع بشكل غير طبيعي (المتوسط ​​أعلى من النسبة المئوية 95) لتحديد وإزالة الخلايا المفترضة ذات الجودة المنخفضة. مجموعات و/أو نسبة عالية من التوائم المشتبه بها التي تم تحديدها باستخدام حزمة DoubletFinder33 (متوسط ​​درجة DoubletFinder أعلى من النسبة المئوية 95). تم دمج عينات t-hCO (n=3) وعينات hCO (n=3) بشكل منفصل باستخدام دالة IntegrateData مع المعلمات المذكورة أعلاه. ثم أُجريت جولة أخرى من التصفية النوعية لمجموعة البيانات المتكاملة كما هو موضح أعلاه.
بعد إزالة النوى منخفضة الجودة، جُمعت مجموعة البيانات المتكاملة (بدقة 0.5) وأُدمجت لأغراض تصور UMAP34. حُددت جينات الواسمات لكل مجموعة باستخدام دالة FindMarkers، مع معلمات افتراضية محسوبة من بيانات التعبير الجيني المُوَحَّدة. نُحدِّد ونُصنِّف فئات الخلايا الرئيسية من خلال الجمع بين مجموعات بيانات مرجعية للقشرة الجنينية والبالغة، مع التعبير الجيني الواسم 19، 20، 21، 35، والشرح التوضيحي. على وجه الخصوص، تم تحديد السلائف الدائرية من خلال التعبير عن MKI67 وTOP2A. حُدِّدت مجموعات السلف من خلال غياب النسخ الانقسامية، والتداخل العالي مع مجموعات السلف الدبقية متعددة القدرات الموصوفة في قشرة الجنين في الطور الاستوائي المتأخر، والتعبير عن EGFR وOLIG1. نستخدم مصطلح الخلايا النجمية للإشارة إلى عدة مراحل من تمايز الخلايا النجمية، من الخلايا الدبقية الشعاعية المتأخرة إلى نضوج الخلايا النجمية. تُعبّر عناقيد الخلايا النجمية عن مستويات عالية من SLC1A3 وAQP4، وقد ثبت ارتباطها بأنواع فرعية من الخلايا الدبقية الشعاعية الجنينية و/أو الخلايا النجمية البالغة. تُعبّر الخلايا الظهارية الأولية (OPCs) عن PDGFRA وSOX10، بينما تُعبّر الخلايا قليلة التغصن عن علامات التغميد (MOG وMYRF). تمّ تحديد الخلايا العصبية الغلوتاماتية من خلال وجود نُسخ عصبية (SYT1 وSNAP25)، وغياب علامات GABAergic (GAD2)، والتعبير عن NEUROD6، وSLC17A7، وBCL11B، أو SATB2. قُسّمت الخلايا العصبية الغلوتاماتية إلى فئات فرعية عليا (تعبير عن SATB2 وفقدان BCL11B) وعميقة (تعبير عن BCL11B). تُعبّر الخلايا العصبية الصفائحية الفرعية المفترضة (SP) عن علامات SP18 المعروفة مثل ST18 وSORCS1، بالإضافة إلى علامات GluN العميقة. تم التعرف على الخلايا الشبيهة بالضفيرة المشيمية من خلال التعبير عن TTR، كما تم التعرف على الخلايا الشبيهة بالسحايا من خلال التعبير عن الجينات المرتبطة بالخلايا الليفية ورسم خريطة للخلايا الحنونية/الوعائية لمجموعة البيانات المرجعية.
أُجري تحليل تفاضلي للتعبير الجيني بين الفئتين الفرعيتين t-hCO وhCO باستخدام طريقة شبه دفعية مُطورة حديثًا، مُعاد إنتاجها في عينات مُنفذة باستخدام حزمة Libra R (الإصدار 1.0.0). وبشكل أكثر تحديدًا، أُجريت اختبارات احتمالية سجل edgeR (الإصدار 3.36.0، الحزمة R) للمجموعات عن طريق جمع عدد الجينات في الخلايا لفئة خلوية مُعينة لكل تكرار للعينة. ولتصور خريطة الحرارة، تُحسب القيم المُوحدة لكل مليون (CPM) باستخدام edgeR (دالة cpm()) وتُقاس (للوصول إلى المتوسط ​​= 0، والانحراف المعياري = 1). أُجري تحليل إثراء علم الجينات (GO) لجينات t-hCO GluN المُنظمة بشكل كبير (قيمة P المُصححة لبنياميني-هوشبيرج أقل من 0.05، مُعبر عنها في 10% على الأقل من خلايا t-hCO GluN، وزيادة مضاعفة في التغير لا تقل عن ضعفين). تم إجراء ذلك باستخدام حزمة ToppGene Suite (https://toppgene.cchmc.org/)37. نستخدم تطبيق ToppFun مع المعلمات الافتراضية، ونُبلغ عن قيم P المصححة بـ Benjamini-Hochberg، المحسوبة من اختبارات هندسية فائقة مُعلّقة بـ GO.
لمطابقة مجموعات snRNA-seq الخاصة بنا مع مجموعات الخلايا المُعلَّقة من دراسات مرجعية لـ snRNA-seq أحادية الخلية الأولية أو snRNA-seq للبالغين19،20،21،22، طبقنا نهج تكامل مجموعات البيانات المزدوجة. استخدمنا سير عمل التطبيع SCTransform (الإصدار 2) في Seurat لدمج ومقارنة تداخلات المجموعات بين مجموعات البيانات (باستخدام نفس المعلمات المذكورة أعلاه). قُسِّمت مجموعات البيانات الفردية عشوائيًا إلى مجموعات فرعية تصل إلى 500 خلية أو نواة لكل مجموعة أصلية لتحقيق كفاءة حسابية. وباستخدام نهج مماثل لما وُصف سابقًا، عُرِّف تداخل المجموعات بأنه نسبة الخلايا أو النوى في كل مجموعة مُجمَّعة التي تداخلت مع تسمية المجموعة المرجعية. ولتصنيف GluNs بشكل أفضل، استخدمنا سير عمل TransferData من Seurat لبيانات مجموعة GluN الفرعية لتعيين تسميات مجموعات البيانات المرجعية لخلايا GluN الخاصة بنا.
لتقييم حالة نضج النسخ الكلي لعينات t-hCO وhCO، قارنّا عيناتنا شبه الكلية مع BrainSpan/psychENCODE23، التي تتكون من تسلسل RNA كبير يغطي نمو الدماغ البشري. أجرينا تحليل المكونات الرئيسية (PCA) على مصفوفة تعبير جيني مُعدّلة النمط مُدمجة من عينات قشرية بعد 10 أسابيع من الحمل، وفي وقت لاحق، في 5567 جينًا (مع بياناتنا) تم تحديدها سابقًا على أنها نشطة في عينات BrainSpan القشرية (مُعرّفة بأنها أكبر من 50% في التباين النمائي المُفسّر حسب العمر باستخدام نموذج مكعب)38. بالإضافة إلى ذلك، اشتققنا جينات مرتبطة بتوقيعات النسخ الرئيسية للنمو العصبي باستخدام تحليل المصفوفة غير السلبي كما هو موضح سابقًا. أوزان العينات المحسوبة باستخدام إجراء تحليل المصفوفة غير السلبي مُبيّنة في الشكل 5ب مع بيانات مُوسّعة لكل من التوقيعات الخمس التي وصفها تشو وآخرون.38. مرة أخرى، استُخلصت العلامات النسخية المعتمدة على النشاط من دراسات منشورة سابقًا. على وجه الخصوص، ازدادت مستويات ERG وLRG بشكل ملحوظ في الخلايا العصبية الغلوتاماتية التي تم تحديدها من خلال جمع snRNA-seq للقشرة البصرية للفأر بعد التحفيز البصري من الجدول التكميلي 3، هرفاتين وآخرون.16. تم الحصول على LRGs المخصبة لدى البشر من مزارع أدمغة أجنة بشرية مُنشَّطة بكلوريد البوتاسيوم، وجُمعت بعد 6 ساعات من التحفيز، وارتفعت مستويات الجينات المُرشَّحة بشكل ملحوظ لدى البشر، ولكن ليس لدى القوارض (الجدول التكميلي 4). أُجري تحليل إثراء مجموعات الجينات باستخدام هذه المجموعات باستخدام اختبار فيشر الدقيق أحادي الاتجاه.
خدّر الفئران بمادة الأيزوفلوران، ثم أزل الأدمغة، وضعها في محلول سكروز بارد (حوالي 4 درجات مئوية) مؤكسج (95% أكسجين و5% ثاني أكسيد الكربون) للأجزاء التي تحتوي على: 234 ملي مولار سكروز، 11 ملي مولار جلوكوز، 26 ملي مولار NaHCO3، 2.5 ملي مولار كلوريد البوتاسيوم، 1.25 ملي مولار NaH2PO4، 10 ملي مولار كبريتات المغنيسيوم، و0.5 ملي مولار كلوريد الكالسيوم (حوالي 310 ميلي أوسمول). صُنعت أجزاء تاجية من دماغ الفئران (300-400 ميكرومتر) تحتوي على t-hCO3 باستخدام جهاز لايكا VT1200 الاهتزازي كما هو موضح سابقًا. نُقلت المقاطع بعد ذلك إلى حجرة تقطيع مع أكسجة مستمرة بدرجة حرارة الغرفة، تحتوي على سائل نخاعي محفز (aCSF) مُحضر من: 10 ملي مولار جلوكوز، 26 ملي مولار NaHCO3، 2.5 ملي مولار كلوريد البوتاسيوم، 1.25 ملي مولار NaHPO4، 1 ملي مولار كبريتات المغنيسيوم، 2 ملي مولار كلوريد الكالسيوم، و126 ملي مولار كلوريد الصوديوم (298 ملي مولار أسمول). قبل التسجيل بـ 45 دقيقة على الأقل. سُجلت المقاطع في حجرة مغمورة، حيث تم ترطيبها باستمرار بسائل نخاعي محفز (قارورة تحتوي على 95% أكسجين و5% ثاني أكسيد الكربون). سُجلت جميع البيانات بدرجة حرارة الغرفة. تم إنهاء عصبونات t-hCO باستخدام ماصة زجاجية من البورسليكات مملوءة بمحلول يحتوي على 127 ملي مولار من جلوكونات البوتاسيوم، و8 ملي مولار من كلوريد الصوديوم، و4 ملي مولار من ATP المغنيسيوم، و0.3 ملي مولار من GTP الصوديوم، و10 ملي مولار من HEPES، و0.6 ملي مولار من EGTA، بدرجة حموضة 7.2، ومحلول داخلي مُعدّل بهيدروكسيد البوتاسيوم (290 ملي مولار). وللاستعادة، أُضيف البيوسيتين (0.2%) إلى محلول التسجيل.
تم الحصول على البيانات باستخدام مُضخِّم MultiClamp 700B (من شركة Molecular Devices) ومُحوّل رقمي Digidata 1550B (من شركة Molecular Devices)، مع ترشيح الترددات المنخفضة بتردد 2 كيلوهرتز، ورقمنة الترددات بتردد 20 كيلوهرتز، وتحليلها باستخدام Clampfit (من شركة Molecular Devices)، وOrigin (من شركة OriginPro). 2021b، OriginLab، ودوال MATLAB مُخصصة (من شركة Mathworks). حُسب جهد الوصلة باستخدام JPCalc، وعُدِّلت المُدخلات إلى القيمة المحسوبة -14 مللي فولت. تتكون العملية الرابعة من سلسلة من خطوات التيار بترددات تتراوح بين 10 و25 بيكو أمبير، من -250 إلى 750 بيكو أمبير.
تم تحفيز المهاد والمادة البيضاء والخلايا الواردة S1 كهربائيًا في شرائح المهاد القشري أثناء تسجيل رقعة المشبك لخلايا عصبية hCO، كما هو موضح سابقًا. باختصار، وُضع الدماغ على طاولة طباعة ثلاثية الأبعاد مائلة بزاوية 10 درجات، وقُطعت مقدمة الدماغ بزاوية 35 درجة. ثم أُلصق الدماغ بالسطح المقطوع وقُطع، مع الحفاظ على المحاور العصبية البارزة في المهاد القشري. رُكبت أقطاب تنغستن ثنائية القطب (0.5 MΩ) على معالج دقيق ثانٍ، ووُضعت بشكل استراتيجي لتحفيز أربع مناطق في كل خلية (الكبسولة الداخلية، المادة البيضاء، S1، وhCO). سُجِّلت الاستجابات المشبكية بعد تحفيز طوري بقوة 300 ميكرو أمبير بتردد 0.03-0.1 هرتز.
تم تنشيط الخلايا العصبية hCO المعبرة عن hChR2 عند 480 نانومتر وتم تطبيق نبضات ضوئية تم إنشاؤها بواسطة LED (Prizmatix) من خلال هدف × 40 (0.9 NA؛ Olympus) لتسجيل تعبير hChR2 بالقرب من الخلايا. يبلغ قطر المجال المضاء حوالي 0.5 مم والطاقة الكلية 10-20 مللي واط. تم ضبط عرض النبضة على 10 مللي ثانية، وهو ما يتوافق مع النبضة المعطاة أثناء تجربة التعلم السلوكي. تم استخدام ترددات تحفيز مختلفة، من 1 إلى 20 هرتز، ولكن تم استخدام النبضة الأولى فقط من السلسلة للقياس الكمي. عادةً ما تكون الفواصل الزمنية بين القطارات أطول من 30 ثانية لتقليل التأثير على مسارات التثبيط أو التسهيل المشبكية. لاختبار ما إذا كانت استجابة hChR2 أحادية المشبك، قمنا بتطبيق TTX (1 ميكرومول) على الحمام حتى اختفى تفاعل EPSC، ثم قمنا بتطبيق 4-أمينوبيريدين (4-AP؛ 100 ميكرومول). عادةً، يتم إرجاع الاستجابة خلال بضع دقائق، مع وجود تأخير أطول قليلاً بين إطلاق LED وتوليد EPSC. تم استخدام NBQX (10 ميكرومتر) لاختبار ما إذا كانت الاستجابة مدفوعة بمستقبلات AMPA.
تم إنشاء مقاطع hCO حادة كما هو موضح سابقًا. باختصار، غُرست مقاطع hCO في أجاروز بتركيز 4%، ونُقلت إلى خلايا تحتوي على 126 ملي مولار من كلوريد الصوديوم، و2.5 ملي مولار من كلوريد البوتاسيوم، و1.25 ملي مولار من هيدروكسيد الصوديوم، و1 ملي مولار من كبريتات المغنيسيوم، و2 ملي مولار من كلوريد الكالسيوم، و26 ملي مولار من NaHCO3، و10 ملي مولار من الجلوكوز d-(+)-. قُطعت المقاطع عند 200-300 ميكرومتر في درجة حرارة الغرفة باستخدام هزاز Leica VT1200، وخُزنت في سائل خزفي جزيئي (ASF) في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك، أُجري تسجيل رقعة من الخلايا الكاملة على مقاطع hCO تحت مجهر SliceScope المباشر (Scientifica). رُويت المقاطع بسائل نخاعي جذعي نشط (aCSF) (95% O2 و5% CO2)، وسُجلت إشارات الخلايا في درجة حرارة الغرفة. تم تطبيق خلايا عصبية hCO3 باستخدام ماصة زجاجية من البورسليكات مملوءة بمحلول يحتوي على 127 ملي مولار من جلوكونات البوتاسيوم، و8 ملي مولار من كلوريد الصوديوم، و4 ملي مولار من ATP المغنيسيوم، و0.3 ملي مولار من GTP الصوديوم، و10 ملي مولار من HEPES، و0.6 ملي مولار من EGTA، بدرجة حموضة داخلية 7.2، مع تعديلها باستخدام هيدروكسيد البوتاسيوم (الاسمولية 290). لأغراض الاستخلاص، أضف 0.2% من بيوسيتين إلى المحلول الداخلي.
تم الحصول على البيانات بواسطة Clampex (Clampex 11.1، Molecular Devices) باستخدام مُضخّم MultiClamp 700B (Molecular Devices) ومُحوّل رقمي Digidata 1550B (Molecular Devices)، مُرشّحة بترددات منخفضة عند 2 كيلوهرتز، ومُرقمنة عند 20 كيلوهرتز، وحُللت باستخدام Clampfit (الإصدار 10.6) للتحليل، ودوال MATLAB المُخصصة (MATLAB 2019b، Mathworks). حُسب جهد الوصلة باستخدام JPCalc، وعُدّلت المُدخلات إلى جهد الوصلة المُحتسب -14 مللي فولت. تتكون العملية الرابعة من سلسلة من خطوات التيار، تتراوح بين 5 و10 بيكو أمبير، من -50 إلى 250 بيكو أمبير.
لإعادة بناء الخلايا العصبية المضغوطة، أُضيف 0.2% بيوسيتين (سيجما-ألدريتش) إلى المحلول الداخلي. حُضّرت الخلايا لمدة 15 دقيقة على الأقل بعد التقطيع. ثم سُحبت الماصة ببطء لمدة دقيقة إلى دقيقتين حتى يُغلق الغشاء المُسجَّل تمامًا. بعد إجراء فحص فسيولوجيا المقطع، ثُبّتت المقاطع طوال الليل عند 4 درجات مئوية في محلول PFA 4%، وغُسلت بمحلول PBS X3، وخُفّفت بنسبة 1:1000 باستخدام DyLight 549 أو DyLight 405 المُقترن بالستربتافيدين (Vector Labs). وُضعت علامات على الخلايا المملوءة بالبيوسيتين (2%؛ سيجما-ألدريتش) أثناء تسجيل المشبك الرقعي في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعتين. ثُبّتت المقاطع بعد ذلك على شرائح مجهرية باستخدام جهاز Aquamount (من شركة Thermo Scientific)، وصوّرت في اليوم التالي باستخدام مجهر Leica TCS SP8 متحد البؤر باستخدام عدسة غمر زيتية بفتحة عددية ×40، 1.3، وتكبير ×0.9-1.0، xy. بلغ معدل أخذ العينات حوالي 7 بكسل لكل ميكرون. تم الحصول على مجموعات Z بفواصل زمنية قدرها 1 ميكرومتر بشكل تسلسلي، وأُجريت فسيفساء مجموعات Z والخياطة التلقائية القائمة على Leica لتغطية الشجرة الشجيرية بالكامل لكل خلية عصبية. بعد ذلك، تم تتبع الخلايا العصبية بشكل شبه يدوي باستخدام واجهة neuTube 40، وتم إنشاء ملفات SWC. ثم حُمّلت الملفات إلى البرنامج المساعد SimpleNeuriteTracer41 Fiji (ImageJ، الإصدار 2.1.0؛ المعاهد الوطنية للصحة).
تم الحصول على أنسجة قشرية بشرية بموافقة مستنيرة وفقًا لبروتوكول معتمد من مجلس المراجعة المؤسسية بجامعة ستانفورد. تم الحصول على عيّنتين من أنسجة بشرية بعد الولادة (3 و18 عامًا) عن طريق استئصال القشرة الجبهية (التلفيف الجبهي الأوسط) كجزء من جراحة الصرع المقاوم للعلاج. بعد الاستئصال، تُجمع الأنسجة في سائل NMDG-aCSF بارد يحتوي على: 92 ملي مولار من NMDG، 2.5 ملي مولار من كلوريد البوتاسيوم، 1.25 ملي مولار من NaH2PO4، 30 ملي مولار من NaHCO3، 20 ملي مولار من HEPES، 25 ملي مولار من الجلوكوز، 2 ملي مولار من الثيويوريا، 5 ملي مولار من أسكوربات الصوديوم، 3 ملي مولار من بيروفات الصوديوم، 0.5 ملي مولار من كلوريد الكالسيوم · 4H2O، و10 ملي مولار من كبريتات المغنيسيوم · 7H2O. عايرت إلى درجة حموضة 7.3-7.4 بحمض الهيدروكلوريك المركز. تم تسليم الأنسجة إلى المختبر خلال 30 دقيقة وتم أخذ مقاطع إكليلية وفقًا للإجراء الموضح أعلاه.
أُجريت جميع عمليات الحيوانات وفقًا لإرشادات رعاية الحيوانات المعتمدة من جامعة ستانفورد (APLAC). حُثّت الفئران (بعد أكثر من 140 يومًا من الزرع) على تخدير 5% من الأيزوفلوران، وخُدِّرت باستخدام 1-3% من الأيزوفلوران أثناء العملية. وُضعت الحيوانات في إطار تجسيمي (Kopf) وحُقنت تحت الجلد بدواء بوبرينورفين ممتد المفعول. فُضحت الجمجمة، ونُظِّفت، وأُدخلت 3-5 براغي عظمية. لاستهداف t-hCO، أنشأنا إحداثيات تجسيمية من صور الرنين المغناطيسي. حُفر ثقب في الموقع المطلوب، ورُفعت الألياف (قطرها 400 ميكرومتر، NA 0.48، دوريك) بمقدار 100 ميكرومتر تحت سطح hCO، ثُبِّتت على الجمجمة باستخدام أسمنت أسنان قابل للتصلب بالأشعة فوق البنفسجية (Relyx).
تم إجراء تسجيلات ضوئية للألياف كما هو موضح سابقًا42. لتسجيل النشاط التلقائي، وُضعت الفئران في قفص نظيف وكابل توصيل ألياف بصرية (دوريك) بقطر 400 ميكرومتر متصل بنظام اكتساب بيانات ضوئية للألياف البصرية متصل بكابل الألياف البصرية المزروع. خلال تسجيل النشاط الحركي لمدة 10 دقائق، كانت الحيوانات حرة لاستكشاف القفص. لتسجيل النشاط المُستحث، تم تخدير الفئران (بعد أكثر من 140 يومًا من الزرع) باستخدام 5٪ إيزوفلوران للتحريض و1-3٪ إيزوفلوران للصيانة. ضع الحيوان في إطار مجسم (كوبف) وقُصِّصت الشعيرات على الجانب الآخر من t-hCO إلى حوالي 2 سم ومُررت عبر شبكة متصلة بمحرك كهربائي ضغطي (PI). تم توصيل كابل توصيل ألياف بصرية (دوريك) بقطر 400 ميكرومتر بالألياف المزروعة وتوصيله بنظام اكتساب البيانات. بعد ذلك، تم انحراف الشعيرات على الجانب الآخر من t-hCO 50 مرة (2 مم عند 20 هرتز، ثانيتان لكل عرض) في أوقات عشوائية بواسطة محرك كهرضغطي على مدار فترة تسجيل مدتها 20 دقيقة. استخدم حزمة دعم أردوينو MATLAB للتحكم في زمن الانحراف باستخدام شيفرة MATLAB مخصصة. تتم مزامنة الأحداث مع برنامج جمع البيانات باستخدام نبضات منطق ترانزستور-ترانزستور (TTL).
تم تحريض الفئران (بعد أكثر من 140 يومًا من عملية الزرع) باستخدام تخدير 5٪ إيزوفلوران وتخديرها باستخدام 1-3٪ إيزوفلوران أثناء الجراحة. تم وضع الحيوانات في إطار مجسم (Kopf) وحقن بوبرينورفين SR وديكساميثازون تحت الجلد. تم كشف الجمجمة وتنظيفها وإدخال 3-5 مسامير عظمية. لاستهداف t-hCO، قمنا بإنشاء إحداثيات مجسمة من صور الرنين المغناطيسي. تم إجراء حج قحف دائري (قطره حوالي 1 سم) باستخدام مثقاب عالي السرعة مباشرة فوق hCO المزروع. بمجرد أن يصبح العظم رقيقًا قدر الإمكان، ولكن قبل الحفر عبر العظم بالكامل، استخدم ملقطًا لإزالة القرص الحوضي السليم المتبقي للكشف عن t-hCO الأساسي. تم ملء حج القحف بمحلول ملحي معقم، وتم تثبيت غطاء ودبوس رأس خاص على الجمجمة باستخدام أسمنت أسنان معالج بالأشعة فوق البنفسجية (Relyx).
أُجري التصوير ثنائي الفوتون باستخدام مجهر بروكر متعدد الفوتون مع عدسة نيكون LWD (×16، 0.8 NA). أُجري تصوير GCaMP6 عند طول موجي 920 نانومتر مع تكبير أحادي المستوى z بمقدار 1.4x ومتوسط ​​8x بمعدل 7.5 إطار في الثانية. حُثّت الفئران على تخدير 5% إيزوفلوران، وصُممت باستخدام 1-3% إيزوفلوران. وُضعت الفئران في جهاز رأس مُصمم خصيصًا لها، ووُضعت تحت العدسة. تم الحصول على تسجيل خلفي للنشاط الحركي لمدة 3 دقائق. على مدار 20 دقيقة من التسجيل، تم توصيل 50 نفخة (طول كل منها 100 مللي ثانية) بشكل عشوائي إلى لوحة الشعيرات المقابلة لـ t-hCO باستخدام جهاز picospricer. استخدم حزمة دعم Arduino MATLAB للتحكم في وقت النبضة باستخدام كود MATLAB مُخصص. زَمّن الأحداث مع برنامج جمع البيانات (PrairieView 5.5) باستخدام نبضات TTL. للتحليل، تم تصحيح الصور لحركة المحور الصبغي (xy) باستخدام التصحيح الأفيني في برنامج MoCo الذي أُطلق في فيجي. استُخلصت آثار الفلورسنت من الخلايا الفردية باستخدام CNMF-E43. استُخلصت الفلورسنت لكل منطقة ذات أهمية، وحوِّلت إلى منحنيات dF/F، ثم إلى درجات Z.
تم تحريض الفئران (بعد أكثر من 140 يومًا من عملية الزرع) باستخدام تخدير إيزوفلوران بنسبة 5٪ وتخديرها باستخدام إيزوفلوران بنسبة 1-3٪ أثناء الجراحة. تم وضع الحيوانات في إطار مجسم (Kopf) وحقن بوبرينورفين SR وديكساميثازون تحت الجلد. تم قطع الشعيرات الموجودة على الجانب الآخر من t-hCO إلى حوالي 2 سم وتم تمريرها من خلال شبكة متصلة بمحرك كهربائي ضغطي. تم الكشف عن الجمجمة وتنظيفها. تم تثبيت برغي أرضي من الفولاذ المقاوم للصدأ على الجمجمة. لاستهداف t-hCO، قمنا بإنشاء إحداثيات مجسمة من صور الرنين المغناطيسي. قم بإجراء فتح حج القحف الدائري (قطره حوالي 1 سم) باستخدام مثقاب عالي السرعة فوق t-hCO مباشرة. بمجرد أن يصبح العظم رقيقًا قدر الإمكان، ولكن قبل الحفر عبر العظم بالكامل، استخدم ملقطًا لإزالة القرص الحوضي السليم المتبقي للكشف عن t-hCO الأساسي. تم تسجيل الخلايا الفردية باستخدام مجسات سيليكون عالية الكثافة ذات 32 أو 64 قناة (Cambridge Neurotech) مؤرضة بمسامير أرضية ومضخمة مسبقًا باستخدام مكبرات صوت RHD (Intan). استخدم المعالج لخفض الأقطاب الكهربائية إلى الموقع المستهدف من خلال حج القحف، المملوء بمحلول ملحي معقم. تم إجراء جمع البيانات بتردد 30 كيلو هرتز باستخدام نظام جمع البيانات Open Ephys. استمر التسجيل فقط عندما اكتشفنا نشاطًا عفويًا إيقاعيًا مرتبطًا للغاية في أكثر من 10 قنوات، مما يشير إلى أن الأقطاب الكهربائية كانت موجودة في الطعم (بناءً على بيانات تصوير الكالسيوم ثنائي الفوتون). تم الحصول على تسجيل خلفية لمدة 10 دقائق للنشاط الحركي. ثم تم انحراف الشعيرات الموجودة على الجانب الآخر من t-hCO 50 مرة (2 مم عند 20 هرتز، 2 ثانية لكل عرض) في أوقات عشوائية بواسطة محرك كهربائي ضغطي على مدى فترة تسجيل مدتها 20 دقيقة. باستخدام حزمة دعم MATLAB لأردوينو (MATLAB 2019b)، يمكنك التحكم في زمن الانحراف باستخدام شيفرة MATLAB مخصصة. استخدم نبضات TTL لمزامنة الأحداث مع برنامج جمع البيانات.
لإجراء تجارب وضع العلامات الضوئية، وُصل سلك توصيل ضوئي بطول 200 ميكرومتر (دوريك) موصولاً بليزر بطول 473 نانومتر (أوميكرون) بألياف ضوئية بطول 200 ميكرومتر موضوعة فوق فتحة الجمجمة. قبل ذلك مباشرةً، اضبط طاقة وصلة التوصيل على 20 ميلي واط. استخدم المُحرك لإنزال الأقطاب الكهربائية إلى الموقع المستهدف عبر فتحة الجمجمة، المملوءة بمحلول ملحي معقم. في بداية التسجيل، أُطلقت عشر نبضات ضوئية بطول 473 نانومتر (تردد 2 هرتز، مدة النبضة 10 مللي ثانية). عُرفت الخلايا الحساسة للضوء بأنها الخلايا التي أظهرت استجابة شوكية في غضون 10 مللي ثانية من الضوء في 70% أو أكثر من التجارب.