Σας ευχαριστούμε που επισκεφθήκατε το Nature.com. Χρησιμοποιείτε μια έκδοση προγράμματος περιήγησης με περιορισμένη υποστήριξη CSS. Για την καλύτερη δυνατή εμπειρία, συνιστούμε να χρησιμοποιήσετε ένα ενημερωμένο πρόγραμμα περιήγησης (ή να απενεργοποιήσετε τη Λειτουργία συμβατότητας στον Internet Explorer). Επιπλέον, για να διασφαλίσουμε τη συνεχή υποστήριξη, εμφανίζουμε τον ιστότοπο χωρίς στυλ και JavaScript.
Εμφανίζει ένα καρουζέλ τριών διαφανειών ταυτόχρονα. Χρησιμοποιήστε τα κουμπιά Προηγούμενο και Επόμενο για να μετακινηθείτε σε τρεις διαφάνειες κάθε φορά ή χρησιμοποιήστε τα κουμπιά ρυθμιστικού στο τέλος για να μετακινηθείτε σε τρεις διαφάνειες κάθε φορά.
Τα αυτοσυναρμολογούμενα νευρωνικά οργανίδια αντιπροσωπεύουν μια πολλά υποσχόμενη πλατφόρμα in vitro για τη μοντελοποίηση της ανθρώπινης ανάπτυξης και των ασθενειών. Ωστόσο, τα οργανοειδή δεν διαθέτουν τη συνδεσιμότητα που υπάρχει in vivo, γεγονός που περιορίζει την ωρίμανση και εμποδίζει την ενσωμάτωση με άλλα κυκλώματα που ελέγχουν τη συμπεριφορά. Εδώ δείχνουμε ότι τα φλοιώδη οργανοειδή που προέρχονται από ανθρώπινα βλαστοκύτταρα και μεταμοσχεύονται στον σωματοαισθητικό φλοιό νεογνών γυμνών αρουραίων αναπτύσσουν ώριμους κυτταρικούς τύπους που ενσωματώνονται σε αισθητηριακά και κυκλώματα που σχετίζονται με το κίνητρο. Η μαγνητική τομογραφία αποκάλυψε ανάπτυξη οργανοειδών μετά τη μεταμόσχευση σε διάφορες σειρές βλαστοκυττάρων και ζώα, ενώ η ανάλυση ενός πυρήνα αποκάλυψε εξέλιξη της κορτικογένεσης και την εμφάνιση ενός προγράμματος μεταγραφής που εξαρτάται από τη δραστηριότητα. Πράγματι, οι μεταμοσχευμένοι φλοιώδεις νευρώνες εμφανίζουν πιο σύνθετες μορφολογικές, συναπτικές και εσωτερικές μεμβρανικές ιδιότητες από τους αντίστοιχους in vitro, επιτρέποντας την ανίχνευση νευρωνικών ελαττωμάτων σε ασθενείς με σύνδρομο Timothy. Η ανατομική και λειτουργική ιχνηλάτηση έχει δείξει ότι τα μεταμοσχευμένα οργανίδια λαμβάνουν θαλαμοφλοιϊκά και φλοιοφλοιϊκά ερεθίσματα, και οι in vivo καταγραφές νευρωνικής δραστηριότητας υποδηλώνουν ότι αυτά τα ερεθίσματα μπορούν να δημιουργήσουν αισθητηριακές αποκρίσεις σε ανθρώπινα κύτταρα. Τέλος, τα φλοιώδη οργανοειδή επεκτείνουν άξονες σε όλο τον εγκέφαλο του αρουραίου, και η οπτογενετική τους ενεργοποίηση οδηγεί σε συμπεριφορά αναζήτησης ανταμοιβής. Έτσι, οι μεταμοσχευμένοι νευρώνες του ανθρώπινου φλοιού ωριμάζουν και συμμετέχουν στα κυκλώματα του ξενιστή που ελέγχουν τη συμπεριφορά. Αναμένουμε ότι αυτή η προσέγγιση θα διευκολύνει την ανίχνευση φαινοτύπων σε επίπεδο αλυσίδας σε κύτταρα που προέρχονται από ασθενείς, οι οποίοι δεν μπορούν να ανιχνευθούν με άλλα μέσα.
Η ανάπτυξη του ανθρώπινου εγκεφάλου αποτελεί μια αξιοσημείωτη αυτοοργανούμενη διαδικασία κατά την οποία τα κύτταρα πολλαπλασιάζονται, διαφοροποιούνται, μεταναστεύουν και συνδέονται για να σχηματίσουν λειτουργικά νευρωνικά κυκλώματα που βελτιώνονται περαιτέρω μέσω της αισθητηριακής εμπειρίας. Ένα βασικό πρόβλημα στην κατανόηση της ανάπτυξης του ανθρώπινου εγκεφάλου, ειδικά στο πλαίσιο ασθενειών, είναι η έλλειψη πρόσβασης στον εγκεφαλικό ιστό. Τα αυτοοργανούμενα οργανίδια, συμπεριλαμβανομένων των οργανοειδών του ανθρώπινου φλοιού (hCO, επίσης γνωστά ως σφαίρα του ανθρώπινου φλοιού), μπορούν να παράγουν 2,3,4,5,6. Ωστόσο, αρκετοί περιορισμοί περιορίζουν την ευρύτερη εφαρμογή τους στην κατανόηση της ανάπτυξης και της λειτουργίας των νευρωνικών κυκλωμάτων. Συγκεκριμένα, δεν είναι σαφές εάν η ωρίμανση του hCO περιορίζεται από την απουσία ορισμένων μικροπεριβαλλοντικών και αισθητηριακών εισροών που υπάρχουν in vivo. Επιπλέον, επειδή τα hCO δεν ενσωματώνονται σε κυκλώματα που μπορούν να δημιουργήσουν συμπεριφορικά αποτελέσματα, η χρησιμότητά τους στη μοντελοποίηση γενετικά πολύπλοκων και συμπεριφορικών νευροψυχιατρικών διαταραχών είναι προς το παρόν περιορισμένη.
Η μεταμόσχευση hCO3 σε έναν άθικτο ζωντανό εγκέφαλο μπορεί να ξεπεράσει αυτούς τους περιορισμούς. Προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει ότι οι ανθρώπινοι νευρώνες που μεταμοσχεύονται στον φλοιό τρωκτικών είναι σε θέση να επιβιώσουν, να προβάλλουν και να επικοινωνούν με κύτταρα τρωκτικών7,8,9,10,11,12. Ωστόσο, αυτά τα πειράματα συνήθως εκτελούνται σε ενήλικα ζώα, γεγονός που μπορεί να περιορίσει τη συναπτική και αξονική ολοκλήρωση. Εδώ, περιγράφουμε ένα παράδειγμα μεταμόσχευσης στο οποίο μεταμοσχεύσαμε τρισδιάστατη hCO3 που προέρχεται από κύτταρα hiPS στον πρωτογενή σωματοαισθητικό φλοιό (S1) ανοσοανεπάρκειων αρουραίων σε πρώιμο στάδιο πλαστικής ανάπτυξης. Οι μεταμοσχευμένοι νευρώνες hCO3 (t-hCO3) υφίστανται σημαντική ωρίμανση, λαμβάνουν θαλαμοφλοιϊκά και φλοιο-φλοιώδη ερεθίσματα που προκαλούν αισθητηριακές αποκρίσεις και επεκτείνουν αξονικές προβολές στον εγκέφαλο του αρουραίου για να οδηγήσουν σε συμπεριφορά αναζήτησης ανταμοιβής. Η παρατεταμένη ωρίμανση της t-hCO3 έχει αποκαλύψει νευρωνικά ελαττώματα σε ασθενείς με σύνδρομο Timothy (TS), μια σοβαρή γενετική διαταραχή που προκαλείται από μεταλλάξεις στο ευαίσθητο στην τάση κανάλι ασβεστίου L-τύπου CaV1.2 (που κωδικοποιείται από CACNA1C).
Για να μελετήσουμε τους ανθρώπινους φλοιώδεις νευρώνες σε κυκλώματα in vivo, μεταμοσχεύσαμε στερεοτακτικά άθικτο τρισδιάστατο hCO3 στο S1 πρώιμων μεταγεννητικών αθυμικών αρουραίων (ημέρες 3-7 μεταγεννητικά) (Εικ. 1α και εκτεταμένα δεδομένα του Σχήματος 1α-γ). Σε αυτό το σημείο, οι θαλαμοφλοιώδεις και φλοιοφλοιώδεις αξονικές προβολές δεν έχουν ακόμη ολοκληρώσει την εννεύρωση S1 (αναφ. 13). Έτσι, αυτή η προσέγγιση έχει σχεδιαστεί για να μεγιστοποιήσει την ενσωμάτωση της t-hCO3, ελαχιστοποιώντας παράλληλα τον αντίκτυπο στα ενδογενή κυκλώματα. Για να απεικονίσουμε τη θέση της t-hCO3 σε ζώντα ζώα, πραγματοποιήσαμε ανακατασκευές εγκεφάλου με μαγνητική τομογραφία Τ2 σε αρουραίους 2-3 μήνες μετά τη μεταμόσχευση (Εικ. 1β και εκτεταμένα δεδομένα, Εικ. 1δ). Τα t-hCO3 παρατηρήθηκαν εύκολα και οι μετρήσεις όγκου του t-hCO3 ήταν παρόμοιες με εκείνες που υπολογίστηκαν από σταθερές τομές (Εκτεταμένα Δεδομένα Σχήμα 1d, e; P > 0,05). Τα t-hCO3 παρατηρήθηκαν εύκολα και οι μετρήσεις όγκου του t-hCO3 ήταν παρόμοιες με εκείνες που υπολογίστηκαν από σταθερές τομές (Εκτεταμένα Δεδομένα Σχήμα 1d, e; P > 0,05). t-hCO легко наблюдались, а объемные измерения t-hCO были аналогичны рассчитанным для фиксированных резов (расширенные данные, рис. 1d, e; P> 0,05). Τα t-hCO3 παρατηρήθηκαν εύκολα και οι ογκομετρικές μετρήσεις t-hCO3 ήταν παρόμοιες με εκείνες που υπολογίστηκαν για σταθερές τομές (εκτεταμένα δεδομένα, Σχήμα 1d, e, P > 0,05).很容易观察到t-hCO，并且t-hCO的体积测量值与从固定切片计算的测量值相似（扩展数据图1d、e；P > 0,05）很容易观察到t-hCO，并且t-hCO t-hCO легко наблюдался, а объемные измерения t-hCO были аналогичны рассчитанным для фиксированных срезов (расширенные данные, рис. 1d, e; P> 0,05). Η t-hCO3 παρατηρήθηκε εύκολα και οι ογκομετρικές μετρήσεις t-hCO3 ήταν παρόμοιες με εκείνες που υπολογίστηκαν για σταθερές τομές (εκτεταμένα δεδομένα, Σχήμα 1d, e, P > 0,05).Προσδιορίσαμε την t-hCO3 στο 81% των μεταμοσχευμένων ζώων περίπου 2 μήνες μετά τη μεταμόσχευση (n = 72 ζώα· hCO3 από 10 κυτταρικές σειρές hiPS· κυτταρικές σειρές hiPS στον Συμπληρωματικό Πίνακα 1). Από αυτά, το 87% εντοπίστηκε στον εγκεφαλικό φλοιό (Εικόνα 1c). Πραγματοποιώντας διαδοχικές μαγνητικές τομογραφίες σε πολλαπλά χρονικά σημεία στον ίδιο μεταμοσχευμένο αρουραίο, διαπιστώσαμε εννέα φορές αύξηση στον όγκο της t-hCO3 εντός 3 μηνών (Εικόνα 1d και εκτεταμένα δεδομένα, Εικόνα 1f). Τα μεταμοσχευμένα ζώα είχαν υψηλό ποσοστό επιβίωσης (74%) 12 μήνες μετά τη μεταμόσχευση (εκτεταμένα δεδομένα, Εικόνα 1g και Συμπληρωματικός Πίνακας 2) και δεν βρέθηκαν εμφανείς κινητικές ή μνημονικές διαταραχές, γλοίωση ή ηλεκτροεγκεφαλογράφημα (EEG). Δεδομένα Εικόνα 1g και συμπληρωματικός πίνακας 2). 1h–m και 3e).
α, Σχηματική απεικόνιση του πειραματικού σχεδιασμού. Η hCO3 που προέρχεται από κύτταρα hiPS μεταμοσχεύθηκε σε S1 νεογέννητων γυμνών αρουραίων τις ημέρες 30-60 της διαφοροποίησης. β, Τ2-σταθμισμένες στεφανιαίες και οριζόντιες εικόνες MRI που δείχνουν t-hCO3 στην S1 2 μήνες μετά τη μεταμόσχευση. Γραμμή κλίμακας, 2 mm. γ, Ποσοτικοποίηση των ποσοστών επιτυχίας εμφύτευσης που εμφανίζονται για κάθε κυτταρική σειρά hiPS (n = 108, οι αριθμοί εντός των γραμμών υποδεικνύουν την ποσότητα t-hCO3 ανά κυτταρική σειρά hIPS) και φλοιώδη ή υποφλοιώδη θέση (n = 88). δ, Εικόνα MRI μιας στεφανιαίας αρτηρίας (αριστερά· γραμμή κλίμακας, 3 mm) και αντίστοιχη τρισδιάστατη ογκομετρική ανακατασκευή (γραμμή κλίμακας, 3 mm) που δείχνει αύξηση της t-hCO3 σε διάστημα 3 μηνών. ε, Ανασκόπηση των προτύπων t-hCO3 στον εγκεφαλικό φλοιό αρουραίου. Γραμμή κλίμακας, 1 mm. f, Αντιπροσωπευτικές ανοσοκυτταροχημικές εικόνες της t-hCO που φαίνονται από πάνω αριστερά προς τα δεξιά (κατά τη διαφοροποίηση): PPP1R17 (4 μηνών), NeuN (8 μηνών), SOX9 και GFAP (8 μηνών), PDGFRα; (8 μηνών), MAP2 (8 μηνών) και IBA1 (8 μηνών). Γραμμή κλίμακας, 20 µm. Η συνέκφραση του HNA υποδεικνύει κύτταρα ανθρώπινης προέλευσης. g, snRNA-seq: Απεικόνιση μείωσης διαστάσεων ενοποιημένης πολλαπλότητας και προβολής (UMAP) όλων των πυρήνων t-hCO υψηλής ποιότητας μετά την ενσωμάτωση Seurat (n=3 δείγματα t-hCO, n=2 κυτταρικές σειρές hiPS). Αστροκύτταρα, κύτταρα της σειράς αστροκυττάρων. cyc prog, κυκλοφορούντες πρόγονοι. GluN DL, βαθιοί γλουταμινεργικοί νευρώνες. GluN DL/SP, βαθιοί και υποστρωματικοί γλουταμινεργικοί νευρώνες. GluN UL, γλουταμινεργικοί νευρώνες ανώτερης στιβάδας. ολιγοδενδροκύτταρα, ολιγοδενδροκύτταρα. OPC, προγονικά κύτταρα ολιγοδενδροκυττάρων. RELN, νευρώνες reelin. h, Ανάλυση εμπλουτισμού όρων Οντολογίας Γονιδίων (GO) γονιδίων που αυξήθηκαν σημαντικά (προσαρμοσμένο P < 0,05, αλλαγή φορές > 2, εκφρασμένο σε τουλάχιστον 10% των πυρήνων) σε γλουταμινεργικούς νευρώνες t-hCO σε σύγκριση με γλουταμινεργικούς νευρώνες hCO. h, Ανάλυση εμπλουτισμού όρων Οντολογίας Γονιδίων (GO) γονιδίων που αυξήθηκαν σημαντικά (προσαρμοσμένο P < 0,05, αλλαγή φορές > 2, εκφρασμένο σε τουλάχιστον 10% των πυρήνων) σε γλουταμινεργικούς νευρώνες t-hCO σε σύγκριση με γλουταμινεργικούς νευρώνες hCO. h, Анализ обогащения терминов Γονιδιακή Οντολογία (GO) για γονίδια με σημαντική ενεργοποίηση (σκρεκτιροβαννый P <0,05, кратность изменения > 2, εκφράζουσα τιμή σε 10% δεν έχει γονίδιο) με glutamatergicheskimi neironami hCO. h, Ανάλυση εμπλουτισμού όρων Γονιδιακής Οντολογίας (GO) για γονίδια με σημαντική ενεργοποίηση (προσαρμοσμένο P <0,05, αλλαγή φορές >2, έκφραση σε τουλάχιστον 10% πυρήνες) σε γλουταμινεργικούς νευρώνες t-hCO σε σύγκριση με γλουταμινεργικούς νευρώνες hCO. h，与hCO 谷氨酸能神经元相比，t-hCO 谷氨酸能神经元中基因显着上调（调P 0,05，倍数变化> 2，在至少10% 的细胞核中表达）的基因本体论(GO) 术语富集术语富集 h ， 与 hco 谷氨酸 能 元 相比 ， t-hco 谷氨酸 能 神经 元 基因 显 上谎 （5 弈 p.变化 变化> 2 ， 至少 10% 的 核中 表达） 基因 基因 基因 的 的 的 的 的 的 的 的 的的 的 的 的本体论(GO) 术语富集分析。 h, γεννά σημαντικό ενεργητικό (scorrektirovannыy P <0,05, кратность изменения> 2, экспрессируется по крайней мере στο 10% ядер) σε glutamatergicheskih neyronah t-hCO με σραβευμένους CO. Онтологический (GO) анализ термина обогащения. h, τα γονίδια ήταν σημαντικά αυξημένα (προσαρμοσμένο P < 0,05, αλλαγή φορές > 2, εκφρασμένο σε τουλάχιστον 10% των πυρήνων) σε γλουταμινεργικούς νευρώνες t-hCO σε σύγκριση με τους γλουταμινεργικούς νευρώνες hCO. Οντολογική (GO) ανάλυση του όρου εμπλουτισμού.Η διακεκομμένη γραμμή υποδεικνύει τιμή aq 0,05. i, απεικόνιση UMAP των κυτταρικών τύπων GluN σε t-hCO χρησιμοποιώντας μεταφορά ετικέτας από ένα σύνολο δεδομένων κινητικού φλοιού ενηλίκων αναφοράς 22 snRNA-seq. CT — κορτικοθαλαμικά κύτταρα, ET — εξωεγκεφαλικά κύτταρα, IT — εσωτερικά τελεγκεφαλικά κύτταρα, NP — κοντινή προβολή.
Στη συνέχεια αξιολογήσαμε την κυτοαρχιτεκτονική και τη συνολική κυτταρική σύνθεση του t-hCO. Η χρώση με αντισώματα ενδοθηλιακών κυττάρων αρουραίου αποκάλυψε αγγειοποίηση με t-hCO, ενώ η χρώση IBA1 αποκάλυψε την παρουσία μικρογλοίας αρουραίου σε όλο το μόσχευμα (Εικ. 1f και εκτεταμένα δεδομένα, Εικ. 3c,d). Η ανοσοχρώση αποκάλυψε κύτταρα θετικά για ανθρώπινο πυρηνικό αντιγόνο (HNA) που συνεκφράζουν PPP1R17 (φλοιώδη προγονικά κύτταρα), NeuN (νευρώνες), SOX9 και GFAP (κύτταρα που προέρχονται από νευρογλοία) ή PDGFRα (προγονικά κύτταρα ολιγοδενδροκυττάρων) (Εικ. 1f). Για να μελετήσουμε την κυτταρική σύνθεση του t-hCO σε ανάλυση ενός κυττάρου, πραγματοποιήσαμε αλληλούχιση RNA ενός πυρήνα (snRNA-seq) μετά από περίπου 8 μήνες διαφοροποίησης. Η μαζική διήθηση και η αφαίρεση πυρήνων αρουραίου απέδωσε 21.500 χάρτες ανθρώπινων μονοπύρηνων υψηλής ποιότητας (Εικ. 1g και εκτεταμένα δεδομένα, Εικ. 4a,b). Τα πρότυπα έκφρασης τυπικών δεικτών κυτταρικού τύπου αναγνώρισαν συστάδες κύριων κατηγοριών φλοιωδών κυττάρων, συμπεριλαμβανομένων των βαθιών και επιφανειακών γλουταμινεργικών νευρώνων, των κυκλοφορούντων προγονικών κυττάρων, των ολιγοδενδροκυττάρων και της γενεαλογίας αστροκυττάρων (Εικόνα 1g, εκτεταμένα δεδομένα, Εικόνα 4c και Συμπληρωματικός Πίνακας 3). Η ανοσοχρώση για SATB2 και CTIP2 έδειξε ότι παρά την παρουσία φλοιωδών υποτύπων, η t-hCO δεν έδειξε σαφή ανατομική στρωμάτωση (εκτεταμένα δεδομένα, Εικόνα 3a). Η hCO snRNA-seq που αντιστοιχούσε σε στάδιο παρήγαγε γενικά παρόμοιες κατηγορίες κυττάρων, με μερικές εξαιρέσεις, συμπεριλαμβανομένης της απουσίας ολιγοδενδροκυττάρων και της παρουσίας GABAεργικών νευρώνων, οι οποίες μπορεί να αντανακλούν τις προηγουμένως αναφερθείσες ευνοϊκές συνθήκες in vitro για τα πλευρικά προγονικά κύτταρα15 (εκτεταμένα δεδομένα, Εικόνα 4f - i και Συμπληρωματικός Πίνακας 4). Η ανάλυση διαφορικής γονιδιακής έκφρασης αποκάλυψε σημαντικές διαφορές στους γλουταμινεργικούς νευρώνες μεταξύ t-hCO3 και hCO3 (Συμπληρωματικός Πίνακας 5), συμπεριλαμβανομένης της ενεργοποίησης συνόλων γονιδίων που σχετίζονται με την νευρωνική ωρίμανση, όπως η συναπτική σηματοδότηση, ο δενδριτικός εντοπισμός και η δραστηριότητα του καναλιού που ελέγχεται από την τάση (Σχήμα 1h και Συμπληρωματικός Πίνακας 5). Πίνακας 6). Συνεπώς, οι φλοιώδεις γλουταμινεργικοί νευρώνες t-hCO3 παρουσίασαν επιταχυνόμενη μεταγραφική ωρίμανση.
Για να διευκρινιστεί εάν αυτές οι μεταγραφικές αλλαγές στην t-hCO σχετίζονταν με μορφολογικές διαφορές μεταξύ της hCO in vitro και της t-hCO in vivo, ανακατασκευάσαμε hCO και hCO γεμάτα με βιοκυτίνη σε οξείες τομές μετά από 7-8 μήνες διαφοροποίησης. Νευρώνες hCO (Εικ. 2α). Οι νευρώνες t-hCO ήταν σημαντικά μεγαλύτεροι, είχαν 1,5 φορές τη διάμετρο του σώματος, διπλάσιους δενδρίτες και συνολική εξαπλάσια αύξηση στο συνολικό μήκος των δενδριτικών κυττάρων σε σύγκριση με την hCO in vitro (Εικ. 2β). Επιπλέον, παρατηρήσαμε σημαντικά υψηλότερη πυκνότητα δενδριτικών ακανθών στους νευρώνες t-hCO από ό,τι στους νευρώνες hCO (Εικ. 2γ). Αυτό υποδηλώνει ότι οι νευρώνες t-hCO υφίστανται εκτεταμένη επιμήκυνση και διακλάδωση των δενδριτικών κυττάρων, η οποία, σε συνδυασμό με τον συνεχιζόμενο πολλαπλασιασμό των κυττάρων, μπορεί να συμβάλλει στην εντατική ανάπτυξη της t-hCO μετά τη μεταμόσχευση (Εικ. 1δ και Εκτεταμένα Δεδομένα Εικ. 1στ). Αυτό μας ώθησε να διερευνήσουμε τις ηλεκτροφυσιολογικές ιδιότητες. Η χωρητικότητα της μεμβράνης ήταν οκτώ φορές υψηλότερη (εκτεταμένα δεδομένα, Σχήμα 8δ), το δυναμικό μεμβράνης σε κατάσταση ηρεμίας ήταν περισσότερο υπερπολωμένο (περίπου 20 mV) και η έγχυση ρεύματος προκάλεσε υψηλότερο μέγιστο ρυθμό διέγερσης στους νευρώνες t-hCO3 από ό,τι στους νευρώνες hCO3. in vitro (Εικόνα 2δ), ε), γεγονός που συνάδει με τα μεγαλύτερα και πιο σύνθετα μορφολογικά χαρακτηριστικά της t-hCO3. Επιπλέον, η συχνότητα των αυθόρμητων διεγερτικών μετασυναπτικών ρευμάτων (EPSC) ήταν σημαντικά υψηλότερη στους νευρώνες t-hCO3 (Εικόνα 2στ), υποδηλώνοντας ότι η αυξημένη πυκνότητα των δενδριτικών ακανθών που παρατηρήθηκε στους νευρώνες t-hCO3 συσχετίστηκε με λειτουργική διεγερσιμότητα. Επιβεβαιώσαμε τον ανώριμο χαρακτήρα των νευρώνων hCO3 in vitro καταγράφοντας επισημασμένους γλουταμινεργικούς νευρώνες (εκτεταμένα δεδομένα, Σχήμα 6α-γ).
α, τρισδιάστατη ανακατασκευή νευρώνων hCO και t-hCO γεμισμένων με βιοκυτίνη μετά από 8 μήνες διαφοροποίησης. β, Ποσοτικοποίηση μορφολογικών χαρακτηριστικών (n = 8 νευρώνες hCO3, n = 6 νευρώνες t-hCO3· **P = 0,0084, *P = 0,0179 και ***P < 0,0001). β, Ποσοτικοποίηση μορφολογικών χαρακτηριστικών (n = 8 νευρώνες hCO3, n = 6 νευρώνες t-hCO3· **P = 0,0084, *P = 0,0179 και ***P < 0,0001). б, количественная оценка морфологических признаков (n = 8 νεογνά hCO, n = 6 νέοι t-hCO; ** P = 0,0084, * P = 0,0179 и *** P <0,0001). β, ποσοτικοποίηση μορφολογικών χαρακτηριστικών (n=8 νευρώνες hCO3, n=6 νευρώνες t-hCO3· **P=0,0084, *P=0,0179 και ***P<0,0001). b，形态学特征的量化（n = 8 个hCO 神经元，n = 6 个t-hCO 神经元；**P = 0.0084，1*P = 0.0084，1*P = 0,0001). b，形态学特征的量化（n = 8 个hCO 神经元，n = 6 个t-hCO 神经元；**P = 0.0084，1*P = 0.0084，1*P = 0,0001). б, количественная оценка морфологических признаков (n = 8 νεογνά hCO, n = 6 νέοι t-hCO; ** P = 0,0084, * P = 0,0179 и *** P <0,0001). β, ποσοτικοποίηση μορφολογικών χαρακτηριστικών (n=8 νευρώνες hCO3, n=6 νευρώνες t-hCO3· **P=0,0084, *P=0,0179 και ***P<0,0001).c, τρισδιάστατη ανακατασκευή των δενδριτικών κλάδων hCO και t-hCO μετά από 8 μήνες διαφοροποίησης. Οι κόκκινοι αστερίσκοι υποδεικνύουν πιθανές δενδριτικές άκανθες. Ποσοτικοποίηση πυκνότητας δενδριτικής άκανθας (n = 8 νευρώνες hCO, n = 6 νευρώνες t-hCO· **P = 0,0092). δ, Ποσοτικοποίηση του δυναμικού ηρεμίας της μεμβράνης (n = 25 νευρώνες hCO3, n = 16 νευρώνες t-hCO3· ***P < 0,0001). δ, Ποσοτικοποίηση του δυναμικού ηρεμίας της μεμβράνης (n = 25 νευρώνες hCO3, n = 16 νευρώνες t-hCO3· ***P < 0,0001). δ. δ, ποσοτικοποίηση δυναμικού μεμβράνης ηρεμίας (n = 25 νευρώνες hCO3, n = 16 νευρώνες t-hCO3· ***P < 0,0001). d，静息膜电位的量化（n = 25 hCO 神经元，n = 16 t-hCO 神经元；***P <0,0001）。 d，静息膜电位的量化（n = 25 hCO 神经元，n = 16 t-hCO 神经元；***P <0,0001）。 δ. δ, ποσοτικοποίηση δυναμικού μεμβράνης ηρεμίας (n = 25 νευρώνες hCO3, n = 16 νευρώνες t-hCO3· ***P < 0,0001). ε, Επαναλαμβανόμενη ενεργοποίηση δυναμικού δράσης σε hCO3 και t-hCO3 που προκαλείται από αυξανόμενες εγχύσεις ρεύματος και ποσοτικοποίηση του μέγιστου ρυθμού ενεργοποίησης (n = 25 νευρώνες hCO3, n = 16 νευρώνες t-hCO3· ***P < 0,0001). ε, Επαναλαμβανόμενη ενεργοποίηση δυναμικού δράσης σε hCO3 και t-hCO3 που προκαλείται από αυξανόμενες εγχύσεις ρεύματος και ποσοτικοποίηση του μέγιστου ρυθμού ενεργοποίησης (n = 25 νευρώνες hCO3, n = 16 νευρώνες t-hCO3· ***P < 0,0001). e, повторно е возбуждение потенциала действия во hCO και t-hCO, вызванное увеличением тока, и колιчественная оценка μέγιστα προσεχώς ανεβάζωνια (n = 25 νέο hCO, n = 16 νεϊρονοβ hCO, n = 16 νέρονοβ t-hCO). ε, επανενεργοποίηση δυναμικού δράσης σε hCO3 και t-hCO3 που προκαλείται από την αύξηση του ρεύματος και ποσοτικοποίηση του μέγιστου ρυθμού ενεργοποίησης (n = 25 νευρώνες hCO3, n = 16 νευρώνες t-hCO3; *** P < 0,0001). e，通过增加电流注入诱导的hCO 和t-hCO 重复动作电位放电，以及最大放电率个hCO 神经元，n = 16 个t-hCO 神经元；***P <0,0001）. E ， 通过 增加 电流 注入 的 的 hco 和 t-hco 重复 电位 放电 ， 以及 最 大 的 大个 hco 神经 ， n = 16 个 t-hco 神经 ； *** p <0,0001） . e, повторяющееся возбуждение потенциала действия hCO και t-hCO, вызванное увеличением подачи тока, и количественная оценка maximalьной скорости возбуждения (n = 25 néyronov hCO; n nCOhnov = 1 <0.0001). ε, επαναλαμβανόμενη πυροδότηση δυναμικών δράσης hCO3 και t-hCO3 που προκαλείται από αυξημένη παροχή ρεύματος και ποσοτικοποίηση του μέγιστου ρυθμού πυροδότησης (n = 25 νευρώνες hCO3, n = 16 νευρώνες t-hCO3; *** P < 0,0001). f, Αυθόρμητες EPSC (sEPSC) σε νευρώνες hCO και t-hCO σε 8 μήνες διαφοροποίησης και ποσοτικοποίηση της συχνότητας των συναπτικών συμβάντων (n = 25 νευρώνες hCO, n = 17 νευρώνες t-hCO; ***P < 0,0001). f, Αυθόρμητες EPSC (sEPSC) σε νευρώνες hCO και t-hCO σε 8 μήνες διαφοροποίησης και ποσοτικοποίηση της συχνότητας των συναπτικών συμβάντων (n = 25 νευρώνες hCO, n = 17 νευρώνες t-hCO; ***P < 0,0001). f, ενιαία EPSC (sEPSC) σε μη hCO και t-hCO μετά από 8 διαφορετικές διαφορές και συλλογικές παρατηρήσεις (n = 25 νέοι hCO, n = 17 PCO;0,00 t) f, Αυθόρμητες EPSC (sEPSC) σε νευρώνες hCO και t-hCO σε 8 μήνες διαφοροποίησης και ποσοτικοποίησης των ρυθμών συναπτικών συμβάντων (n=25 νευρώνες hCO, n=17 νευρώνες t-hCO; ***P<0,0001). f，分化8 个月时hCO 和t-hCO 神经元中的自发性EPSCs (sEPSCs)，以及突触事件频率经元中的自发性EPSCs，以及突触事件频率经元中的自发性EPSCs)，以及突触事件频率猖2hCO神经元，n = 17 t-hCO 神经元；***P <0,0001）. f，分化8 个月时hCO 和t-hCO 神经元中的自发性EPSCs (sEPSCs)，以及突触事件频率缏元中的自发性EPSCs)，以及突触事件频率缏元中的自发性EPSCs神率的量匼（n = 25 hCO 神率的量匼（n = 25hCO P <0,0001）. f, ενιαία EPSC (sEPSC) σε μη hCO και t-hCO μετά από 8 διαφορετικές διαφορές και συλλογικές παρατηρήσεις (n = 25 νέοι hCO, n = 17 PCO; 0,00 t). f, Αυθόρμητες EPSC (sEPSC) σε νευρώνες hCO και t-hCO σε 8 μήνες διαφοροποίησης και ποσοτικοποίησης των ρυθμών συναπτικών συμβάντων (n = 25 νευρώνες hCO, n = 17 νευρώνες t-hCO; *** P<0,0001).Για το bf, τα hCO3 και t-hCO3 στη γραμμή 1208-2 ελήφθησαν από την ίδια παρτίδα διαφοροποίησης που διατηρήθηκε παράλληλα. g, Ανάλυση εμπλουτισμού γονιδιακών συνόλων (μονόπλευρη ακριβής δοκιμή Fisher) γονιδίων που αυξήθηκαν σημαντικά (προσαρμοσμένο P < 0,05, αλλαγή φορές > 2, εκφρασμένο σε τουλάχιστον 10% των πυρήνων) σε γλουταμινεργικούς νευρώνες t-hCO σε σύγκριση με γλουταμινεργικούς νευρώνες hCO με γονιδιακά σύνολα γονιδίων που εξαρτώνται από τη δραστηριότητα τόσο της πρώιμης απόκρισης (ERG) όσο και της όψιμης απόκρισης (LRG) που εντοπίστηκαν από μια μελέτη ποντικών in vivo16 και ανθρώπινα LRG από νευρώνες in vitro17. g, Ανάλυση εμπλουτισμού γονιδιακών συνόλων (μονόπλευρη ακριβής δοκιμή Fisher) γονιδίων που αυξήθηκαν σημαντικά (προσαρμοσμένο P < 0,05, αλλαγή φορές > 2, εκφρασμένο σε τουλάχιστον 10% των πυρήνων) σε γλουταμινεργικούς νευρώνες t-hCO σε σύγκριση με γλουταμινεργικούς νευρώνες hCO με γονιδιακά σύνολα γονιδίων που εξαρτώνται από τη δραστηριότητα τόσο της πρώιμης απόκρισης (ERG) όσο και της όψιμης απόκρισης (LRG) που εντοπίστηκαν από μια μελέτη ποντικών in vivo16 και ανθρώπινα LRG από νευρώνες in vitro17. ζ, αναλύστε την αναλογία των γονιδίων (απόδοση точный κριтерий Фишера) γενώμενα με σημαντική δραστηριοποίηση (σκορεκτιροβαννый P <0,05, кратность изменения > 2, εκφραστική μέτρηση με μεν 110% μετρίως) neyronah t-hCO po sravneniyu with glutamatergicheskimi neironami hCO naborы genov cak rannego (ERG), tak and pozdnego (LRG) genov, forvisiah от δραστηριοτήτων, identificirovannыh в исследовании на мышах in vivo16, и specifiческих для человека LRG из нейронов in vitro17. g, ανάλυση εμπλουτισμού του γονιδιακού συνόλου (μονόπλευρη ακριβής δοκιμή Fisher) γονιδίων με σημαντική ενεργοποίηση (προσαρμοσμένο P <0, 05, αλλαγή φορές > 2, έκφραση σε τουλάχιστον 10% των πυρήνων) σε γλουταμινεργικούς νευρώνες t-hCO σε σύγκριση με σύνολα γλουταμινεργικών νευρώνων hCO τόσο πρώιμων (ERG) όσο και όψιμων (LRG) γονιδίων που εξαρτώνται από τη δραστηριότητα και ταυτοποιήθηκαν σε ποντίκια in vivo16 και σε ανθρώπινα LRG από νευρώνες in vitro17. g，t-hCO谷氨酸能神经元与hCO谷氨酸能神经元相比，t -hCO谷氨酸能神经元显着上调（调整后P<0,05，倍数变化>2，在至少10%的细胞核中表达）的基因集富集分析（单侧F isher精确检验）从体内小鼠研究中鉴定的早期反应(ERG)和晚期反应(LRG) 活性依赖性基因的基因组16 和体外神经元17 中暄人类牧LR g ， t-hco 谷氨酸 神经 元 与 hco 谷氨酸 神经 元 相比 ， t-hco 谷氨酸 神经 元 兰<0,05 ， 倍数> 2 ， 至少 至少 10% 的 细胞 核中 表达） 的 集富集 分析 （ ψαράς体内 小鼠 研究 中 的 早期 反应 反应 反应 和 晚期 反应 反应 (lrg) 活性 基因 的 基因组 16神经元 17 中 中 17 中 17的人类特异性LRG. g, glutamatergicheskie neyronы t-hCO были σημαντικό ενεργό ενεργό μετά από ασθένειες με glutamatergicheskie neyronami hCO (σκορεκτιροβαννый P<0,05, кратность изменения> 2, μηδενική 10% αναλογία т.е. специфичные для человека. g, οι γλουταμινεργικοί νευρώνες t-hCO3 ήταν σημαντικά αυξημένοι σε σύγκριση με τους γλουταμινεργικούς νευρώνες hCO3 (προσαρμοσμένο P <0,05, αλλαγή φορές >2, τουλάχιστον 10%). Ανάλυση εμπλουτισμού γονιδίων πρώιμης απόκρισης (ERG) και όψιμης απόκρισης (μονόπλευρη ακριβής δοκιμή Fisher) εξαρτώμενα από τη δραστηριότητα απόκρισης γονίδια (LRGs) που εντοπίστηκαν σε ποντίκια in vivo16 και νευρώνες in vitro17. Ανθρώπινα ειδικά LRGs.Η διακεκομμένη γραμμή υποδεικνύει μια τιμή P διορθωμένη κατά Bonferroni 0,05. h, η έκφραση του γονιδίου GluN (ψευδο-συσκευασία και κλιμάκωση κάθε γονιδίου) αυξήθηκε σημαντικά σε αντίγραφα snRNA-seq των γονιδίων LRG σε γλουταμινεργικούς νευρώνες t-hCO. i, ανοσοχρώση που δείχνει έκφραση SCG2 σε νευρώνες t-hCO (άνω) και hCO (κάτω). Τα λευκά βέλη δείχνουν τα κύτταρα SCG2+. Γραμμή κλίμακας, 25 µm. Τα δεδομένα εκφράζονται ως μέσος όρος ± τυπική απόκλιση.
Με βάση την αυξημένη δραστικότητα του t-hCO που παρατηρήθηκε σε τομές ex vivo, η snRNA-seq αποκάλυψε μια εξαρτώμενη από τη δραστικότητα ανοδική ρύθμιση των γονιδιακών μεταγράφων στο t-hCO σε σύγκριση με το hCO in vitro. Οι γλουταμινεργικοί νευρώνες t-hCO εξέφρασαν υψηλότερα επίπεδα γονιδίων που ρυθμίζουν την όψιμη δραστηριότητα απόκρισης (Εικ. 2g,h), τα οποία βρέθηκαν σε προηγούμενες μελέτες σε νευρώνες ποντικού και ανθρώπου16,17. Για παράδειγμα, τα BDNF18, SCG2 και OSTN, ένα γονίδιο που ρυθμίζει τη δραστικότητα ειδικό για πρωτεύοντα, έδειξαν αυξημένη έκφραση σε νευρώνες t-hCO σε σύγκριση με νευρώνες hCO (Εικ. 2g-i). Έτσι, οι νευρώνες t-hCO εμφάνισαν βελτιωμένα χαρακτηριστικά ωρίμανσης σε σύγκριση με νευρώνες hCO μέσω μεταγραφικών, μορφολογικών και λειτουργικών αναλύσεων.
Για να αξιολογήσουμε περαιτέρω τη συσχέτιση της ωρίμανσης της t-hCO με την ανάπτυξη του ανθρώπινου εγκεφάλου, πραγματοποιήσαμε μεταγραφικές συγκρίσεις εμβρυϊκών και ενήλικων κυτταρικών τύπων φλοιού19,20 και ενηλίκων21,22 καθώς και εκτεταμένα δεδομένα σχετικά με την έκφραση γονιδίων του φλοιού23 κατά την ανάπτυξη (εκτεταμένα δεδομένα, Σχήμα 5). ). Με προηγούμενη εργασία24, η συνολική κατάσταση ωρίμανσης του hCO και του μεταγραφώματος t-hCO στους 7-8 μήνες διαφοροποίησης είναι γενικά συμβατή με τον χρόνο ανάπτυξης in vivo και είναι περισσότερο ισοδύναμη με την ύστερη εμβρυϊκή ζωή (Εκτεταμένα Δεδομένα Σχήμα 5α). Αξιοσημείωτα, παρατηρήσαμε αυξημένη ωριμότητα μεταγραφώματος στην t-hCO σε σύγκριση με την hCO αντίστοιχης ηλικίας, καθώς και ενεργοποίηση μεταγραφώματος που σχετίζεται με τη συναπτογένεση, την αστρογένεση και τη μυελίνωση (εκτεταμένα δεδομένα, Σχήμα 5b-d). Σε κυτταρικό επίπεδο, βρήκαμε ενδείξεις ενός λεπτότερου υποτύπου φλοιού στην t-hCO, με συστάδες γλουταμινεργικών νευρώνων που επικαλύπτονται με υποτύπους νευρώνων L2/3, L5 και L6 ενηλίκων (Σχήμα 1i). Αντίθετα, η επικάλυψη συστάδων μεταξύ των γλουταμινεργικών νευρώνων t-hCO και των εμβρυϊκών φλοιωδών νευρώνων ήταν πιο περιορισμένη στα μέσα της εγκυμοσύνης (αναπτυγμένα δεδομένα, Σχήμα 5e-j). Για να προσδιορίσουμε εάν οι νευρώνες t-hCO είναι λειτουργικά παρόμοιοι με τους ανθρώπινους μεταγεννητικούς νεοφλοιώδεις νευρώνες, πραγματοποιήσαμε ηλεκτροφυσιολογικές καταγραφές και ανατομικές ανακατασκευές ανθρώπινων πυραμιδικών νευρώνων L2/3 σε αιχμηρές τομές του ανθρώπινου μεταγεννητικού φλοιού (αναπτυγμένα δεδομένα, Σχήμα 7α). Οι ηλεκτροφυσιολογικές ιδιότητες των πυραμιδικών νευρώνων L2/3 ήταν παρόμοιες με εκείνες των πυραμιδικών νευρώνων t-hCO (αναπτυγμένα δεδομένα, Σχήμα 7ε). Μορφολογικά, οι νευρώνες L2/3 από μεταγεννητικά ανθρώπινα δείγματα ήταν περισσότερο παρόμοιοι με την t-hCO παρά με την hCO, αν και τα κύτταρα L2/3 ήταν μακρύτερα, περιείχαν συνολικά περισσότερους κλάδους και είχαν υψηλότερη πυκνότητα σπονδυλικής στήλης (Σχήμα 3g και αναπτυγμένα δεδομένα, Σχήμα 7b-). G).
α, μεταμόσχευση hCO3 που παράγεται από κυτταρικές σειρές ελέγχου και TS hiPS σε νεογνικούς αρουραίους. β, τρισδιάστατη ανακατασκευή νευρώνων t-hCO3 γεμισμένων με βιοκυτίνη μετά από 8 μήνες διαφοροποίησης. γ, ποσοτικοποίηση του μέσου μήκους των δενδριτών (n = 19 νευρώνες ελέγχου, n = 21 νευρώνες TS· **P = 0,0041). δ, τρισδιάστατα ανακατασκευασμένα δενδριτικά κλαδιά από τον έλεγχο και το TS t-hCO3 στους 8 μήνες διαφοροποίησης και ποσοτικοποίηση της πυκνότητας της δενδριτικής σπονδυλικής στήλης (n = 16 νευρώνες ελέγχου, n = 21 νευρώνες TS, ***P < 0,0001). δ, τρισδιάστατα ανακατασκευασμένα δενδριτικά κλαδιά από τον έλεγχο και το TS t-hCO3 στους 8 μήνες διαφοροποίησης και ποσοτικοποίηση της πυκνότητας της δενδριτικής σπονδυλικής στήλης (n = 16 νευρώνες ελέγχου, n = 21 νευρώνες TS, ***P < 0,0001). d, 3D-reconstructciя дендритных ветвей из контроля и TS t-hCO через 8 месяцев дифференцировки и количественная оценка плотности дендритных шипов (n = 16 έλεγχοι δεν ελέγχουν, n = 0, n = 20, n = 20, n = 20, n = 20, n = 20, n = 20, 21). δ, τρισδιάστατη ανακατασκευή δενδριτικών κλάδων από τον έλεγχο και την t-hCO3 TS σε 8 μήνες διαφοροποίησης και ποσοτικοποίησης πυκνότητας δενδριτικής σπονδυλικής στήλης (n=16 νευρώνες ελέγχου, n=21 νευρώνες TS, ***P<0,0001). d，分化8 个月时对照和TS t-hCO 的3D 重建树突分支，以及树突棘密度的量化 = 16，个对照神经元，n = 21 个TS 神经元，***P <0,0001）. d ， 分化 8 个 时 对照 和 ts t-hco 的 3d 重建 分支 分支 以及 树突挘 密度 重建神经 元 ， n = 21 ts 神经 ， *** p <0,0001 ）. d, 3D-reconstructciя дендритных ветвей контроля и TS t-hCO через 8 месяцев дифференцировки и количественная оценка плотности дендритных шипов (n = 16 ελέγχους νεϊρόνο, n = 20,0TS). δ, τρισδιάστατη ανακατασκευή των δενδριτικών κλάδων ελέγχου και της t-hCO3 του TS σε 8 μήνες διαφοροποίησης και ποσοτικοποίησης της πυκνότητας της δενδριτικής σπονδυλικής στήλης (n=16 νευρώνες ελέγχου, n=21 νευρώνες TS, ***P<0,0001).Οι κόκκινοι αστερίσκοι υποδεικνύουν πιθανές δενδριτικές ακανθώδεις στήλες. ε, αυθόρμητες EPSC σε νευρώνες ελέγχου και TS t-hCO νευρώνες μετά από 8 μήνες διαφοροποίησης. στ, διάγραμμα αθροιστικής συχνότητας και ποσοτικοποίηση της συχνότητας και του πλάτους των συναπτικών συμβάντων (n=32 νευρώνες ελέγχου, n=26 νευρώνες TS· **P=0,0076 και P=0,8102). ζ, ανάλυση Scholl των νευρώνων TS και ελέγχου σε hCO και t-hCO. Οι διακεκομμένες γραμμές δείχνουν ανθρώπινους πυραμιδικούς νευρώνες L2/3 μετά τη γέννηση για σύγκριση (n = 24 νευρώνες ελέγχου t-hCO, n = 21 νευρώνες TS t-hCO, n = 8 νευρώνες ελέγχου hCO και n = 7 νευρώνες TS hCO). Τα δεδομένα εκφράζονται ως η μέση τιμή ± τυπική απόκλιση.
Η ικανότητα της t-hCO3 να αναπαράγει τα μορφολογικά και λειτουργικά χαρακτηριστικά των νευρώνων του ανθρώπινου φλοιού σε υψηλό επίπεδο μας ώθησε να διερευνήσουμε εάν η t-hCO3 θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί για την ανίχνευση φαινοτύπων ασθενειών. Εστιάσαμε στο TS, μια σοβαρή νευροαναπτυξιακή διαταραχή που προκαλείται από μεταλλάξεις gain-of-function στο γονίδιο που κωδικοποιεί το CaV1.2, το οποίο ξεκινά την μεταγραφή γονιδίων που εξαρτάται από τη δραστηριότητα στους νευρώνες. Λάβαμε hCO3 από τρεις ασθενείς με TS που έφεραν την πιο κοινή υποκατάσταση (p.G406R) και τρεις μάρτυρες (Εικόνα 3α). Μετά τη μεταμόσχευση, διαπιστώσαμε ότι η δενδριτική μορφολογία μεταβλήθηκε στους νευρώνες TS σε σύγκριση με τους μάρτυρες (Εικόνα 3b και εκτεταμένα δεδομένα, Εικόνα 8a,b), με διπλάσια αύξηση στον αριθμό των πρωτογενών δενδριτών και συνολική αύξηση στη μέση και συνολική μείωση του μήκους των δενδριτών (Εικόνα 3c και εκτεταμένα δεδομένα, Εικόνα 8c). Αυτό συσχετίστηκε με αυξημένη πυκνότητα ακίδων και αυξημένη συχνότητα αυθόρμητων EPSC σε TS σε σύγκριση με τους νευρώνες ελέγχου (Εικόνα 3d-f και εκτεταμένα δεδομένα, Εικόνα 8g). Περαιτέρω ανάλυση αποκάλυψε πρότυπα ανώμαλης διακλάδωσης των δενδριτικών κυττάρων σε t-hCO3 TS σε σύγκριση με τους μάρτυρες, αλλά όχι σε in vitro hCO3 TS σε παρόμοιο στάδιο διαφοροποίησης (Εικ. 3g). Αυτό συμφωνεί με τις προηγούμενες αναφορές μας για συρρίκνωση των δενδριτικών κυττάρων που εξαρτάται από τη δραστηριότητα σε TS και υπογραμμίζει την ικανότητα αυτής της πλατφόρμας μεταμόσχευσης να ανιχνεύει φαινοτύπους ασθενειών in vivo.
Στη συνέχεια, ρωτήσαμε σε ποιο βαθμό τα κύτταρα t-hCO είναι λειτουργικά ενσωματωμένα στο S1 του αρουραίου. Το S1 στα τρωκτικά λαμβάνει ισχυρά συναπτικά ερεθίσματα από τους ομόπλευρους κοιλιακούς βασικούς και οπίσθιους θαλαμικούς πυρήνες, καθώς και από τους ομόπλευρους κινητικούς και δευτερογενείς σωματοαισθητικούς φλοιούς, και το ετερόπλευρο S1 (Εικ. 4α). Για να αποκαταστήσουμε το πρότυπο νεύρωσης, μολύναμε το hCO με τον ιό της λύσσας-dG-GFP/AAV-G και μεταμοσχεύσαμε το hCO σε αρουραίο S1 3 ημέρες αργότερα. Παρατηρήσαμε πυκνή έκφραση GFP σε νευρώνες του ομόπλευρου S1 και των κοιλιακών βασικών γαγγλίων 7-14 ημέρες μετά τη μεταμόσχευση (Εικ. 4b, c). Επιπλέον, η χρώση με αντισώματα του θαλαμικού δείκτη netrin G1 αποκάλυψε την παρουσία θαλαμικών απολήξεων στο t-hCO (Εικ. 4d, e). Για να αξιολογήσουμε εάν αυτές οι προσαγωγές προβολές θα μπορούσαν να προκαλέσουν συναπτικές αποκρίσεις σε κύτταρα t-hCO, πραγματοποιήσαμε καταγραφές ολόκληρων κυττάρων από ανθρώπινα κύτταρα σε αιχμηρές τομές του θαλαμοφλοιώδους στρώματος. Ηλεκτρική διέγερση του S1 αρουραίου, της εσωτερικής κάψας, της λευκής ουσίας, των ινών κοντά στην t-hCO ή οπτογενετική ενεργοποίηση των θαλαμικών απολήξεων που εκφράζουν οψίνη σε EPSC βραχείας λανθάνουσας κατάστασης που προκαλούνται από t-hCO σε νευρώνες t-hCO που εκτέθηκαν στον ανταγωνιστή του υποδοχέα AMPA NBQX. (Εικ. 4f, g και εκτεταμένα δεδομένα, Εικ. 9a–g). Αυτά τα δεδομένα καταδεικνύουν ότι η t-hCO είναι ανατομικά ενσωματωμένη στον εγκέφαλο του αρουραίου και είναι ικανή να ενεργοποιηθεί από τον ιστό ξενιστή του αρουραίου.
α, Σχηματικό διάγραμμα ενός πειράματος παρακολούθησης λύσσας. β, GFP και έκφραση STEM121 ειδική για τον άνθρωπο μεταξύ t-hCO και εγκεφαλικού φλοιού αρουραίου (άνω πλαίσιο). Επίσης, φαίνεται η έκφραση GFP στον ομόπλευρο κοιλιακό βασικό πυρήνα (VB) του αρουραίου (κάτω αριστερά) και στον ομόπλευρο S1 (κάτω δεξιά). Γραμμή κλίμακας, 50 µm. Τα κόκκινα τετράγωνα αντιπροσωπεύουν τις περιοχές του εγκεφάλου όπου ελήφθησαν οι εικόνες. γ, ποσοτικοποίηση κυττάρων που εκφράζουν GFP (n = 4 αρουραίοι). δ, ε — Netrin G1+ θαλαμικά τερματικά σε t-hCO. δ δείχνει μια στεφανιαία τομή που περιέχει πυρήνες t-hCO και VB. Γραμμή κλίμακας, 2 mm. ε δείχνει την έκφραση Netrin G1 και STEM121 σε νευρώνες t-hCO (αριστερά) και VB (δεξιά). Γραμμή κλίμακας, 50 µm. Η πορτοκαλί διακεκομμένη γραμμή υποδεικνύει το όριο t-hCO. f, g, Τρέχοντα ίχνη νευρώνων t-hCO μετά από ηλεκτρική διέγερση σε αρουραίο S1 (f) ή εσωτερική κάψουλα (g), με (μωβ) ή χωρίς (μαύρο) NBQX (αριστερά). Πλάτη EPSC με και χωρίς NBQX (n = 6 νευρώνες S1, *P = 0,0119; και n = 6 νευρώνες εσωτερικής κάψουλας, **P = 0,0022) (κέντρο). Ποσοστό νευρώνων t-hCO που εμφανίζουν EPSC σε απόκριση σε ηλεκτρική διέγερση αρουραίου S1 (f) ή εσωτερικής κάψουλας (g) (δεξιά). aCSF, τεχνητό εγκεφαλονωτιαίο υγρό. h, σχηματικό διάγραμμα του πειράματος απεικόνισης 2P (αριστερά). Έκφραση GCaMP6s σε t-hCO (μέση). Γραμμή κλίμακας, 100 µm. Χρονική παρέλευση φθορισμού των GCaMP6s (δεξιά). i, Z-βαθμολογία αυθόρμητου φθορισμού δραστηριότητας. j, σχηματική απεικόνιση διέγερσης μουστακιού. k, τροχιές φθορισμού 2P με z-βαθμολόγηση σε μία δοκιμή, ευθυγραμμισμένες με την απόκλιση των μουστακιών στο χρόνο μηδέν (διακεκομμένη γραμμή) σε κύτταρα-παραδείγματα. l, αποκρίσεις z-βαθμολογίας κατά μέσο όρο πληθυσμού όλων των κυττάρων ευθυγραμμισμένες με την απόκλιση των μουστακιών στο χρόνο μηδέν (διακεκομμένη γραμμή) (κόκκινη) ή τυχαία δημιουργημένες χρονικές σημάνσεις (γκρι). m. Σχηματικό διάγραμμα του πειράματος σε οπτική σήμανση. n, Καμπύλες ακατέργαστης τάσης από ένα παράδειγμα κυττάρου t-hCO3 κατά τη διάρκεια διέγερσης με μπλε λέιζερ ή εκτροπής των μουστακιών. Τα κόκκινα βέλη υποδεικνύουν τις πρώτες αιχμές που προκαλούνται από το φως (πάνω) ή που προκαλούνται από την εκτροπή των μουστακιών (κάτω). Η γκρι σκίαση υποδεικνύει περιόδους εκτροπής των μουστακιών. o, Μέγιστες κυματομορφές φωτός και αποκρίσεις εκτροπής των μουστακιών. p, αιχμές μιας μόνο προσπάθειας, ευθυγραμμισμένες με την απόκλιση των μουστακιών στα κύτταρα του παραδείγματος. Το 0 υποδεικνύει την απόκλιση των μουστακιών (διακεκομμένη γραμμή). q, μέσος όρος ρυθμού πυροδότησης z-βαθμολογίας πληθυσμού για όλα τα φωτοευαίσθητα κύτταρα, ευθυγραμμισμένα με την απόκλιση των μουστακιών στο χρόνο μηδέν (διακεκομμένη γραμμή) (κόκκινη) ή τυχαία δημιουργημένες χρονικές σημάνσεις (γκρι). r, Ποσοστό φωτοευαίσθητων μονάδων που διαμορφώνονται σημαντικά από την απόκλιση των μουστακιών (n = 3 αρουραίοι) (αριστερά). Μέγιστη καθυστέρηση z-score (n = 3 αρουραίοι· n = 5 (ανοιχτό πράσινο), n = 4 (σκούρο πράσινο) και n = 4 (κυανό) μονάδες διαμόρφωσης εκτροπής μουστακιών ανά αρουραίο) (δεξιά). Τα δεδομένα εκφράζονται ως μέσος όρος ± τυπική απόκλιση
Στη συνέχεια, ρωτήσαμε αν η t-hCO3 θα μπορούσε να ενεργοποιηθεί από αισθητηριακά ερεθίσματα in vivo. Μεταμοσχεύσαμε hCO3 που εκφράζει τους γενετικά κωδικοποιημένους δείκτες ασβεστίου GCaMP6 σε αρουραίους S1. Μετά από 150 ημέρες, πραγματοποιήσαμε φωτομετρία ινών ή απεικόνιση ασβεστίου δύο φωτονίων (Εικ. 4h και εκτεταμένα δεδομένα, Εικ. 10a). Διαπιστώσαμε ότι τα κύτταρα t-hCO3 εμφάνισαν συγχρονισμένη ρυθμική δραστηριότητα (Εικ. 4i, Εκτεταμένα Δεδομένα, Εικ. 10b και Συμπληρωματικό Βίντεο 1). Για να χαρακτηρίσουμε τη μέγιστη δραστηριότητα t-hCO3, πραγματοποιήσαμε εξωκυτταρικές ηλεκτροφυσιολογικές καταγραφές σε αναισθητοποιημένους αρουραίους που είχαν υποβληθεί σε μεταμόσχευση (εκτεταμένα δεδομένα, Εικ. 10c-f). Δημιουργήσαμε στερεοταξικές συντεταγμένες από εικόνες μαγνητικής τομογραφίας. Έτσι, αυτές οι καταγεγραμμένες μονάδες αντιπροσωπεύουν πιθανούς ανθρώπινους νευρώνες, αν και η ηλεκτροφυσιολογία από μόνη της δεν επιτρέπει τον προσδιορισμό ενός είδους προέλευσης. Παρατηρήσαμε συγχρονισμένες εκρήξεις δραστηριότητας (εκτεταμένα δεδομένα, Εικ. 10d). Οι εκρήξεις διήρκεσαν περίπου 460 ms και διαχωρίστηκαν από περιόδους σιωπής περίπου 2 s (εκτεταμένα δεδομένα, Εικ. 10d, e). Μεμονωμένες μονάδες πυροδότησαν κατά μέσο όρο περίπου τρεις βολές ανά ριπή, που αντιστοιχεί περίπου στο 73% των καταγεγραμμένων μονάδων ανά ριπή. Οι δραστηριότητες των μεμονωμένων μονάδων ήταν σε μεγάλο βαθμό συσχετισμένες και αυτές οι συσχετίσεις ήταν υψηλότερες από εκείνες των μονάδων που εντοπίστηκαν σε μη εμβολιασμένα ζώα που καταγράφηκαν υπό τις ίδιες συνθήκες (εκτεταμένα δεδομένα, Εικ. 10f). Για να χαρακτηρίσουμε περαιτέρω τις αιχμές απόκρισης των ταυτοποιημένων νευρώνων που προέρχονται από ανθρώπους, πραγματοποιήσαμε πειράματα σήμανσης φωτός σε αναισθητοποιημένους αρουραίους που είχαν μεταμοσχευθεί με hCO3 που εκφράζουν το φωτοευαίσθητο κανάλι κατιόντων ροδοψίνη 2 (hChR2), μέσω του οποίου οι νευρώνες t-hCO3 αναγνωρίζουν βραχυπρόθεσμα (λιγότερο από 10 ms) σε απόκριση σε ερεθίσματα μπλε φωτός (Εικ. 4m–o). Οι νευρώνες t-hCO εμφάνισαν εκρήξεις αυθόρμητης δραστηριότητας σε συχνότητες παρόμοιες με αυτές που παρατηρήθηκαν στην απεικόνιση ασβεστίου, καθώς και σε ηλεκτροφυσιολογικές καταγραφές που πραγματοποιήθηκαν σε t-hCO απουσία φωτεινής σήμανσης (διευρυμένα δεδομένα, Εικ. 10c-g). Δεν παρατηρήθηκε αυθόρμητη δραστηριότητα στα αντίστοιχα στάδια της hCO που καταγράφηκαν in vitro. Για να αξιολογήσουμε εάν η t-hCO θα μπορούσε να ενεργοποιηθεί από αισθητηριακά ερεθίσματα, εκτρέψαμε για λίγο τα μουστάκια του αρουραίου μακριά από την t-hCO (Εικ. 4j,m και διευρυμένα δεδομένα, Εικ. 10h,k). Σύμφωνα με προηγούμενες μελέτες8,10, ένα υποσύνολο κυττάρων t-hCO έδειξε αυξημένη δραστηριότητα σε απόκριση στην εκτροπή των μουστάκια, η οποία δεν παρατηρήθηκε όταν τα δεδομένα συγκρίθηκαν με τυχαίες χρονικές σφραγίδες (Εικ. 4k–q και διευρυμένα δεδομένα, Εικ. 10h–q). Πράγματι, περίπου το 54% των οπτικά επισημασμένων μεμονωμένων μονάδων έδειξαν σημαντικά αυξημένο ρυθμό διέγερσης μετά από διέγερση με μουστάκια, φτάνοντας στο μέγιστο περίπου στα 650 ms (Εικ. 4r). Συνολικά, αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι η t-hCO3 λαμβάνει κατάλληλα λειτουργικά ερεθίσματα και μπορεί να ενεργοποιηθεί από περιβαλλοντικά ερεθίσματα.
Στη συνέχεια, διερευνήσαμε εάν η t-hCO θα μπορούσε να ενεργοποιήσει κυκλώματα σε αρουραίους για τον έλεγχο της συμπεριφοράς. Αρχικά, διερευνήσαμε εάν οι άξονες των νευρώνων t-hCO προβάλλονται στους περιβάλλοντες ιστούς του αρουραίου. Μολύναμε την hCO με έναν φακοϊό που κωδικοποιεί hChR2 συγχωνευμένο με EYFP (hChR2-EYFP). Μετά από 110 ημέρες, παρατηρήσαμε έκφραση EYFP σε ομόπλευρες φλοιώδεις περιοχές, συμπεριλαμβανομένων των ακουστικών, κινητικών και σωματοαισθητικών φλοιών, καθώς και σε υποφλοιώδεις περιοχές, συμπεριλαμβανομένου του ραβδωτού σώματος, του ιππόκαμπου και του θαλάμου (Εικ. 5α). Για να αξιολογήσουμε εάν αυτές οι απαγωγές προβολές θα μπορούσαν να προκαλέσουν συναπτικές αποκρίσεις σε κύτταρα αρουραίου, ενεργοποιήσαμε οπτικά κύτταρα t-hCO που εκφράζουν hChR2-EYFP καταγράφοντας κύτταρα εγκεφαλικού φλοιού αρουραίου σε αιχμηρές τομές εγκεφάλου. Η ενεργοποίηση των αξόνων t-hCO με μπλε φως προκάλεσε EPSC βραχείας λανθάνουσας κατάστασης σε νευρώνες πυραμιδικού φλοιού αρουραίου, οι οποίοι μπλοκαρίστηκαν από NBQX (Εικ. 5b–g). Επιπλέον, αυτές οι αποκρίσεις θα μπορούσαν να μπλοκαριστούν από την τετροδοτοξίνη (TTX) και να αποκατασταθούν από την 4-αμινοπυριδίνη (4-AP), γεγονός που υποδηλώνει ότι προκλήθηκαν από μονοσυναπτικές συνδέσεις (Εικ. 5ε).
α, Σχηματικό διάγραμμα της ιχνηλάτησης του νευράξονα (αριστερά). Έκφραση t-hCO EYFP (δεξιά). Γραμμή κλίμακας, 100 µm. A1, ακουστικός φλοιός, ACC, πρόσθιος φλοιός του προσαγωγίου, δ. ραβδωτό σώμα, ραχιαίο ραβδωτό σώμα, HPC, ιππόκαμπος. Διάφραγμα, πλάγιο διάφραγμα, mPFC, έσω προμετωπιαίος φλοιός, απιοειδής φλοιός, απιοειδής φλοιός, v. ραβδωτό σώμα, κοιλιακό ραβδωτό σώμα, VPM, κοιλιο-οπισθομεσαίος πυρήνας του θαλάμου, VTA, κοιλιακή καλυπτρική περιοχή. Τα κόκκινα τετράγωνα αντιπροσωπεύουν τις περιοχές του εγκεφάλου όπου ελήφθησαν οι εικόνες. β, Σχηματικό διάγραμμα του πειράματος διέγερσης. γ, δ, Παραδείγματα της απόκρισης του φωτορεύματος που προκαλείται από μπλε φως (πάνω) και της τάσης (κάτω) σε ανθρώπινα (γ) κύτταρα EYFP+ t-hCO ή αρουραίου (δ) κύτταρα EYFP-. e, f, Τρέχοντα ίχνη νευρώνων αρουραίου μετά από διέγερση με μπλε φως των αξόνων t-hCO με TTX και 4-AR (πράσινο), TTX (γκρι) ή aCSF (μαύρο) (ε), με (βιολετί) ή χωρίς (μαύρο) ) ) NBQX (ε). g, καθυστέρηση των αποκρίσεων που προκαλούνται από μπλε φως σε κύτταρα αρουραίου (n = 16 κύτταρα). οι οριζόντιες γραμμές υποδεικνύουν μέση καθυστέρηση (7,13 ms) (αριστερά). Πλάτος των προκαλούμενων από το φως EPSC που καταγράφηκαν με ή χωρίς NBQX (n = 7 κύτταρα; ***P < 0,0001) (μεσαία). Πλάτος των προκαλούμενων από το φως EPSC που καταγράφηκαν με ή χωρίς NBQX (n = 7 κύτταρα; ***P < 0,0001) (μεσαία). Amplituda вызванных светом EPSC, εγγεγραμμένος με ή χωρίς NBQX (n = 7 kletok; ***P <0,0001) (в центре). Πλάτος των EPSC που προκαλούνται από το φως καταγράφηκαν με ή χωρίς NBQX (n = 7 κύτταρα; ***P < 0,0001) (κέντρο).使用或不使用NBQX 记录的光诱发EPSC 的振幅（n = 7 个细胞；***P <0,0001）（中）使用或不使用NBQX 记录的光诱发EPSC 的振幅（n = 7 个细胞；***P <0,0001）（中） Amplituda вызванных светом EPSC, εγγεγραμμένος με ή χωρίς NBQX (n = 7 kletok; ***P <0,0001) (в центре). Πλάτος των EPSC που προκαλούνται από το φως καταγράφηκαν με ή χωρίς NBQX (n = 7 κύτταρα; ***P < 0,0001) (κέντρο).Ποσοστό κυττάρων αρουραίου που εμφανίζουν EPSC που ανταποκρίνονται στο μπλε φως (δεξιά). h, Σχηματικό διάγραμμα μιας συμπεριφορικής δοκιμασίας. d0, ημέρα 0. i. Απόδοση παραδειγματικών ζώων την ημέρα 1 (αριστερά) ή την ημέρα 15 (δεξιά) της εκπαίδευσης. Ο μέσος αριθμός γλειψιμάτων που πραγματοποιήθηκαν την ημέρα 1 (αριστερά) ή την ημέρα 15 (δεξιά στο κέντρο) (n = 150 δοκιμές με μπλε φως, n = 150 δοκιμές με κόκκινο φως· ***P < 0,0001). Ο μέσος αριθμός γλειψιμάτων που πραγματοποιήθηκαν την ημέρα 1 (αριστερά) ή την ημέρα 15 (δεξιά στο κέντρο) (n = 150 δοκιμές με μπλε φως, n = 150 δοκιμές με κόκκινο φως· ***P < 0,0001). Среднее количество облизываний, выполненных в день 1 (слева) или день 15 (в центре справа) (n = 150 испытаний со симним светом, n = 150 испытаний со красным светом; ***P <0,000). Μέσος αριθμός γλειψίματος που πραγματοποιήθηκαν την 1η ημέρα (αριστερά) ή την 15η ημέρα (κέντρο δεξιά) (n = 150 δοκιμές με μπλε φως, n = 150 δοκιμές με κόκκινο φως· ***P < 0,0001).第1 天（左）或第15 天（右中）执行的平均舔次数（n = 150 次蓝光试验，n =次红光试验；***P <0,0001）.第1 天（左）或第15 天（右中）执行的平均舔次数（n = 150 次蓝光试验，n =次红光试验；***P <0,001 Среднее количество облизываний, выполненных в день 1 (слева) или день 15 (в центре справа) (n = 150 испытаний со симним светом, n = 150 испытаний со красным светом; ***P <0,000). Μέσος αριθμός γλειψίματος που πραγματοποιήθηκαν την 1η ημέρα (αριστερά) ή την 15η ημέρα (κέντρο δεξιά) (n = 150 δοκιμές με μπλε φως, n = 150 δοκιμές με κόκκινο φως· ***P < 0,0001).Αθροιστικά γλείψιμα για δοκιμές κόκκινου και μπλε φωτός την 1η ημέρα (κέντρο αριστερά) ή την 15η ημέρα (δεξιά). NS, μη σημαντικά. j,k, Χαρακτηριστικά συμπεριφοράς όλων των ζώων που μεταμοσχεύθηκαν με t-hCO που εκφράζουν hChR2-EYFP (j) ή φθοροφόρο ελέγχου (k) την 1η ή 15η ημέρα (hChR2-EYFP: n = 9 αρουραίοι, ** P = 0,0049· έλεγχος: n = 9, P = 0,1497). l, Εξέλιξη της βαθμολογίας προτίμησης (n = 9 hChR2, n = 9 ομάδα ελέγχου; **P < 0,001, ***P < 0,0001). l, Εξέλιξη της βαθμολογίας προτίμησης (n = 9 hChR2, n = 9 ομάδα ελέγχου; **P < 0,001, ***P < 0,0001). l, Эволюция показателя предпочтения (n = 9 hChR2, n = 9 έλεγχοι; **P <0,001, ***P <0,0001). l, Εξέλιξη της βαθμολογίας προτίμησης (n = 9 hChR2, n = 9 έλεγχοι· **P < 0,001, ***P < 0,0001). l，偏好评分的演变（n = 9 hChR2，n = 9 对照；**P <0,001，***P <0,0001）。 l，偏好评分的演变（n = 9 hChR2，n = 9 对照；**P <0,001，***P <0,0001）。 l, Эволюция показателей предпочтения (n = 9 hChR2, n = 9 έλεγχος; **P <0,001, ***P <0,0001). l, Εξέλιξη των βαθμολογιών προτίμησης (n = 9 hChR2, n = 9 έλεγχοι; **P < 0,001, ***P < 0,0001).m, έκφραση FOS σε απόκριση στην οπτογενετική ενεργοποίηση της t-hCO3 στο S1. Εμφανίζονται εικόνες έκφρασης FOS (αριστερά) και ποσοτικοποίηση (n = 3 ανά ομάδα· *P < 0,05, **P < 0,01 και ***P < 0,001) (δεξιά). Εμφανίζονται εικόνες έκφρασης FOS (αριστερά) και ποσοτικοποίηση (n = 3 ανά ομάδα· *P < 0,05, **P < 0,01 και ***P < 0,001) (δεξιά). Показаны изображения экспрессии FOS (слева) и coliчественного προσδιορισμοί (n = 3 στην ομάδα; * P <0,05, ** P <0,01 и *** P <0,001) (σправα). Εμφανίζονται εικόνες έκφρασης FOS (αριστερά) και ποσοτικοποίησης (n = 3 ανά ομάδα, *P <0,05, **P <0,01 και ***P <0,001) (δεξιά).显示了FOS 表达（左）和量化（每组n = 3；*P <0,05、**P <0,01 和***P <0,001）（右显示了FOS 表达（左）和量化（每组n = 3；*P <0,05、**P <0,01 和***P <0,001）（右 Показаны изображения экспрессии FOS (слева) и coliчественного προσδιορισμοί (n = 3 στην ομάδα; * P <0,05, ** P <0,01 и *** P <0,001) (σправα). Εμφανίζονται εικόνες έκφρασης FOS (αριστερά) και ποσοτικοποίησης (n = 3 ανά ομάδα, *P <0,05, **P <0,01 και ***P <0,001) (δεξιά).Γραμμή κλίμακας, 100 µm. Τα δεδομένα εκφράζονται ως μέσος όρος ± τυπικό σφάλμα BLA, βασοπλευρικής αμυγδαλής, MDT, ραχιομεσου θαλαμικού πυρήνα, PAG, περιυδραγωγικού γκρι.
Τέλος, ρωτήσαμε αν το t-hCO3 θα μπορούσε να τροποποιήσει τη συμπεριφορά των αρουραίων. Για να το ελέγξουμε αυτό, μεταμοσχεύσαμε hCO3 που εκφράζει hChR2-EYFP στο S1 και 90 ημέρες αργότερα, εμφυτεύσαμε οπτικές ίνες στο t-hCO3 για χορήγηση φωτός. Στη συνέχεια, εκπαιδεύσαμε τους αρουραίους με ένα τροποποιημένο παράδειγμα προετοιμασίας χειριστή (Εικ. 5h). Τοποθετήσαμε τα ζώα σε έναν θάλαμο δοκιμής συμπεριφοράς και εφαρμόσαμε τυχαία ερεθίσματα λέιζερ με μπλε (473 nm) και κόκκινο (635 nm) διάρκειας 5 δευτερολέπτων. Τα ζώα έλαβαν μια ανταμοιβή νερού εάν έγλειφαν κατά τη διάρκεια της διέγερσης με μπλε φως αλλά δεν έγλειφαν κατά τη διάρκεια της διέγερσης με κόκκινο φως. Την πρώτη ημέρα της εκπαίδευσης, τα ζώα δεν εμφάνισαν διαφορά στο γλείψιμο όταν διεγείρονταν με μπλε ή κόκκινο φως. Ωστόσο, την 15η ημέρα, τα ζώα που μεταμοσχεύθηκαν με hCO3 που εκφράζουν hChR2-EYFP εμφάνισαν πιο ενεργό γλείψιμο όταν διεγείρονταν με μπλε φως σε σύγκριση με τη διέγερση με κόκκινο φως. Αυτές οι αλλαγές στη συμπεριφορά γλείψιμου δεν παρατηρήθηκαν σε ζώα ελέγχου στα οποία είχε μεταμοσχευθεί hCO3 που εκφράζει το φθοροφόρο ελέγχου (ποσοστό επιτυχίας μάθησης: hChR2 89%, EYFP 0%, Σχήμα 5i-1 και Συμπληρωματικό Βίντεο 2). Αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι τα κύτταρα t-hCO3 μπορούν να ενεργοποιήσουν νευρώνες αρουραίου για να διεγείρουν συμπεριφορά αναζήτησης ανταμοιβής. Για να ανακαλύψουμε ποια νευρωνικά κυκλώματα t-hCO3 αρουραίου μπορεί να εμπλέκονται σε αυτές τις αλλαγές συμπεριφοράς, ενεργοποιήσαμε οπτογενετικά την t-hCO3 σε εκπαιδευμένα ζώα και συλλέξαμε ιστούς 90 λεπτά αργότερα. Η ανοσοϊστοχημεία αποκάλυψε την έκφραση της πρωτεΐνης FOS που εξαρτάται από τη δραστηριότητα σε διάφορες περιοχές του εγκεφάλου που εμπλέκονται στην παρακινημένη συμπεριφορά, συμπεριλαμβανομένου του μέσου προμετωπιαίου φλοιού, του μέσου θαλάμου και της περιυδραγωγικής φαιάς ουσίας, η οποία εκφράστηκε είτε σε μη διεγερμένα ζώα ελέγχου είτε σε ζώα. ρύζι. 5m). Συνολικά, αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι η t-hCO3 μπορεί να τροποποιήσει τη νευρωνική δραστηριότητα του αρουραίου για να οδηγήσει τη συμπεριφορά.
Τα νευρωνικά οργανοειδή αντιπροσωπεύουν ένα πολλά υποσχόμενο σύστημα για τη μελέτη της ανθρώπινης ανάπτυξης και των ασθενειών in vitro, αλλά περιορίζονται από την έλλειψη συνδέσεων μεταξύ κυκλωμάτων που υπάρχουν in vivo. Έχουμε αναπτύξει μια νέα πλατφόρμα στην οποία μεταμοσχεύσαμε hCO3 σε S1 ανοσοκατεσταλμένων αρουραίων πρώιμης μεταγεννητικής περιόδου για να μελετήσουμε την ανάπτυξη και τη λειτουργία των ανθρώπινων κυττάρων in vivo. Έχουμε δείξει ότι η t-hCO3 αναπτύσσει ώριμους κυτταρικούς τύπους που δεν παρατηρήθηκαν in vitro28 και ότι η t-hCO3 είναι ανατομικά και λειτουργικά ενσωματωμένη στον εγκέφαλο των τρωκτικών. Η ενσωμάτωση της t-hCO3 σε νευρωνικά κυκλώματα τρωκτικών μας επέτρεψε να δημιουργήσουμε μια σύνδεση μεταξύ της ανθρώπινης κυτταρικής δραστηριότητας και της μελετημένης συμπεριφοράς των ζώων, δείχνοντας ότι οι νευρώνες t-hCO3 μπορούν να τροποποιήσουν τη νευρωνική δραστηριότητα των αρουραίων για να οδηγήσουν σε συμπεριφορικές αντιδράσεις.
Η πλατφόρμα που περιγράφουμε έχει αρκετά πλεονεκτήματα σε σχέση με προηγούμενες έρευνες σχετικά με τη μεταμόσχευση ανθρώπινων κυττάρων σε εγκεφάλους τρωκτικών. Πρώτον, μεταμοσχεύσαμε hCO3 στον αναπτυσσόμενο φλοιό πρώιμων μεταγεννητικών αρουραίων, κάτι που μπορεί να διευκολύνει την ανατομική και λειτουργική ενσωμάτωση. Δεύτερον, η παρακολούθηση με μαγνητική τομογραφία t-hCO3 μας επέτρεψε να μελετήσουμε τη θέση και την ανάπτυξη του μοσχεύματος σε ζώντα ζώα, επιτρέποντάς μας να διεξάγουμε μακροπρόθεσμες μελέτες σε πολλά ζώα και να διαπιστώσουμε την αξιοπιστία αρκετών κυτταρικών σειρών hiPS. Τέλος, μεταμοσχεύσαμε άθικτα οργανοειδή, αντί για μεμονωμένα εναιωρήματα μεμονωμένων κυττάρων, τα οποία είναι λιγότερο καταστροφικά για τα ανθρώπινα κύτταρα και μπορούν να προωθήσουν την ενσωμάτωση και τη δημιουργία νευρώνων του ανθρώπινου φλοιού σε εγκεφάλους αρουραίων.
Αναγνωρίζουμε ότι παρά τις εξελίξεις σε αυτήν την πλατφόρμα, οι χρονικοί, χωρικοί και διασταυρούμενοι περιορισμοί εμποδίζουν τον σχηματισμό ανθρώπινων νευρωνικών κυκλωμάτων με υψηλή πιστότητα, ακόμη και μετά από μεταμόσχευση σε πρώιμο στάδιο ανάπτυξης. Για παράδειγμα, δεν είναι σαφές εάν η αυθόρμητη δραστηριότητα που παρατηρείται στην t-hCO αντιπροσωπεύει έναν αναπτυξιακό φαινότυπο παρόμοιο με τη ρυθμική δραστηριότητα που παρατηρείται κατά την ανάπτυξη του φλοιού ή εάν οφείλεται στην απουσία κατασταλτικών κυτταρικών τύπων που υπάρχουν στην t-hCO. Ομοίως, δεν είναι σαφές σε ποιο βαθμό η απουσία ελασματοποίησης στην t-hCO επηρεάζει τη συνδεσιμότητα της αλυσίδας30. Η μελλοντική εργασία θα επικεντρωθεί στην ενσωμάτωση άλλων κυτταρικών τύπων, όπως η ανθρώπινη μικρογλοία, τα ανθρώπινα ενδοθηλιακά κύτταρα και οι ποικίλες αναλογίες GABAεργικών ενδιάμεσων νευρώνων, όπως φαίνεται χρησιμοποιώντας τη συναρμολόγηση 6 in vitro, καθώς και στην κατανόηση του πώς η νευρωνική ενσωμάτωση και επεξεργασία μπορεί να συμβεί σε τροποποιημένα μεταγραφικά, συναπτικά και συμπεριφορικά επίπεδα t-hCO σε κύτταρα που λαμβάνονται από ασθενείς.
Συνολικά, αυτή η πλατφόρμα in vivo αντιπροσωπεύει έναν ισχυρό πόρο που μπορεί να συμπληρώσει την in vitro ανάπτυξη του ανθρώπινου εγκεφάλου και την έρευνα για ασθένειες. Αναμένουμε ότι αυτή η πλατφόρμα θα μας επιτρέψει να ανακαλύψουμε νέους φαινοτύπους σε επίπεδο αλυσίδας σε κύτταρα που προέρχονται από ασθενείς και να δοκιμάσουμε νέες θεραπευτικές στρατηγικές.
Δημιουργήσαμε hCO2.5 από κύτταρα HiPS όπως περιγράφηκε προηγουμένως. Για να ξεκινήσει η παραγωγή hCO2 από κύτταρα hiPS που καλλιεργήθηκαν σε τροφοδοτικά στρώματα, άθικτες αποικίες κυττάρων hiPS αφαιρέθηκαν από τρυβλία καλλιέργειας χρησιμοποιώντας dispase (0,35 mg/mL) και μεταφέρθηκαν σε πλαστικές καλλιέργειες εξαιρετικά χαμηλής προσκόλλησης που περιείχαν τρυβλία με μέσο καλλιέργειας κυττάρων hiPS. (Corning) συμπληρωμένο με δύο αναστολείς SMAD, δορσομορφίνη (5 μM· P5499, Sigma-Aldrich) και SB-431542 (10 μM· 1614, Tocris) και αναστολέα ROCK Y-27632 (10 μM· S1049, Selleckchem). Κατά τη διάρκεια των πρώτων 5 ημερών, το μέσο κυττάρων hiPS άλλαζε καθημερινά και προστίθεντο δορσομορφίνη και SB-431542. Την έκτη ημέρα σε εναιώρημα, τα νευρικά σφαιροειδή μεταφέρθηκαν σε νευρικό μέσο που περιείχε νευροβασική-Α (10888, Life Technologies), συμπλήρωμα Β-27 χωρίς βιταμίνη Α (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies), πενικιλίνη και στρεπτομυκίνη (1:100, Life Technologies) και συμπληρώθηκε με τον επιδερμικό αυξητικό παράγοντα (EGF· 20 ng ml−1· R&D Systems) και τον αυξητικό παράγοντα ινοβλαστών 2 (FGF2· 20 ng ml−1· R&D Systems) μέχρι την 24η ημέρα. Από την 25η έως την 42η ημέρα, το μέσο συμπληρώθηκε με νευροτροφικό παράγοντα που προέρχεται από τον εγκέφαλο (BDNF· 20 ng ml−1, Peprotech) και νευροτροφίνη 3 (NT3· 20 ng ml−1· Peprotech) με αλλαγές μέσου κάθε δεύτερη μέρα. Την έκτη ημέρα σε εναιώρημα, τα νευρικά σφαιροειδή μεταφέρθηκαν σε νευρικό μέσο που περιείχε νευροβασική-Α (10888, Life Technologies), συμπλήρωμα Β-27 χωρίς βιταμίνη Α (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies), πενικιλίνη και στρεπτομυκίνη (1:100, Life Technologies) και συμπληρώθηκε με τον επιδερμικό αυξητικό παράγοντα (EGF· 20 ng ml−1· R&D Systems) και τον αυξητικό παράγοντα ινοβλαστών 2 (FGF2· 20 ng ml−1· R&D Systems) μέχρι την 24η ημέρα. Από την 25η έως την 42η ημέρα, το μέσο συμπληρώθηκε με νευροτροφικό παράγοντα που προέρχεται από τον εγκέφαλο (BDNF· 20 ng ml−1, Peprotech) και νευροτροφίνη 3 (NT3· 20 ng ml−1· Peprotech) με αλλαγές μέσου κάθε δεύτερη μέρα.Την έκτη ημέρα σε εναιώρηση, τα νευρικά σφαιροειδή μεταφέρθηκαν σε ένα νευρικό μέσο που περιείχε Neurobasal-A (10888, Life Technologies), συμπλήρωμα Β-27 χωρίς βιταμίνη Α (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies) και πενικιλίνη.и streptomicin (1:100, Life Technologies) και дополнителен эпидермальным фактором роза (EGF; 20 ng/ml; R&D Systems) и фактором роста фибробластов 2 (FGF2; 20 ng/ml; R&D Systems) έως 24-. και στρεπτομυκίνη (1:100, Life Technologies) και συμπληρώθηκε με επιδερμικό αυξητικό παράγοντα (EGF· 20 ng/ml· R&D Systems) και ινοβλαστικό αυξητικό παράγοντα 2 (FGF2· 20 ng/ml· R&D Systems) μέχρι την 24η ημέρα.Από την 25η έως την 42η ημέρα, προστέθηκαν στο μέσο νευροτροφικός παράγοντας που προέρχεται από τον εγκέφαλο (BDNF· 20 ng ml-1, Peprotech) και νευροτροφίνη 3 (NT3· 20 ng ml-1, Peprotech), αλλάζοντας το μέσο κάθε δεύτερη μέρα.在悬浮的第6 天，将神经球体转移到含有neurobasal-A（10888，Life Technologies）、不含维A2生生补充剂 (12587，Life Technologies）、GlutaMax（1:100，Life Technologies）、青霉素的神经培养基中和10Life Τεχνολογίες）并辅以表皮生长因子（EGF；20 ng ml-1；R&D Systems）和成纤维细胞生长因子2（FGF2；20 ng ml-1；R&D Systems）直至第24 天。在 悬浮 的 第 第 6 天 将 神经 球体 转移 含有 含有 neurobasal-a （10888 ， 画 画 TechnologiesＫ 体b-27 补充剂 （12587 ， Life Technologies） Glutamax (1: 100 ， Life TechNOGIS青霉素 的 神经 培养 基 中 10 ， Τεχνολογίες Ζωής） 表皮 生长 Συστήματα Ε&Α Στο 6-й день суспензии нейросферы были переведены на добавку, содержащую нейробазал-А (10888, Life Technologies), добавку В-27 без витамин А (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies), пеници стрептомицин (1:100, Life Technologies) со добавлением эпидермального фактора роста (EGF; 20 ng ml-1; Συστήματα Ε&Α) и фактора роста фибробластов 2 (FGF2; 20 ng ml-1) 1; Την ημέρα 6, τα εναιωρήματα νευροσφαιρών άλλαξαν σε ένα συμπλήρωμα που περιείχε νευροβασική-Α (10888, Life Technologies), συμπλήρωμα Β-27 χωρίς βιταμίνη Α (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies), στρεπτομυκίνη εξουδετερωμένη με πενικιλίνη (1:100, Life Technologies) συμπληρωμένη με επιδερμικό αυξητικό παράγοντα (EGF· 20 ng ml-1· R&D Systems) και αυξητικό παράγοντα ινοβλαστών 2 (FGF2· 20 ng ml-1)· Συστήματα Ε&Α) έως 24 ημέρες. Συστήματα Έρευνας και Ανάπτυξης) μέχρι την 24η ημέρα.Από την 25η έως την 42η ημέρα, προστέθηκαν στο μέσο καλλιέργειας νευροτροφικός παράγοντας που προέρχεται από τον εγκέφαλο (BDNF· 20 ng ml-1, Peprotech) και νευροτροφικός παράγοντας 3 (NT3· 20 ng ml-1, Peprotech) κάθε δεύτερη μέρα. Αλλαγή μέσου μία φορά.Ξεκινώντας από την 43η ημέρα, το hCO3 διατηρήθηκε σε μη συμπληρωμένο μέσο νευροβασικής-Α (NM; 1088022, Thermo Fisher) με αλλαγή μέσου κάθε 4-6 ημέρες. Για να ληφθεί hCO3 από κύτταρα hiPS που καλλιεργήθηκαν υπό συνθήκες χωρίς τροφοδότη, τα κύτταρα hiPS επωάστηκαν με Accutase (AT-104, Innovate Cell Technologies) στους 37°C για 7 λεπτά, διαχωρίστηκαν σε μεμονωμένα κύτταρα και τοποθετήθηκαν σε πλάκες AggreWell 800 (34815, STEMCELL Technologies) σε πυκνότητα 3 × 106 μεμονωμένα κύτταρα ανά φρεάτιο σε μέσο Essential 8 συμπληρωμένο με τον αναστολέα ROCK Y-27632 (10 μM; S1049, Selleckchem). Μετά από 24 ώρες, τα μέσα στα φρεάτια μεταφέρθηκαν με πιπέτα σε μέσα που περιείχαν μέσο Essential 6 (A1516401, Life Technologies) συμπληρωμένο με δορσομορφίνη (2,5 μM· P5499, Sigma-Aldrich) και SB-431542 (10 μM· 1614). , Tocrida). Από τις ημέρες 2 έως 6, το μέσο Essential 6 αντικαθίστατο καθημερινά με δορσομορφίνη και συμπλήρωμα SB-431542. Από την έκτη ημέρα, τα εναιωρήματα νευροσφαιρών μεταφέρθηκαν στο νευροβασικό μέσο και διατηρήθηκαν όπως περιγράφεται παραπάνω.
Όλες οι διαδικασίες που αφορούσαν τα ζώα πραγματοποιήθηκαν σύμφωνα με τις οδηγίες φροντίδας των ζώων που έχουν εγκριθεί από την Επιτροπή Διαχείρισης Φροντίδας Ζώων του Εργαστηρίου του Πανεπιστημίου Στάνφορντ (APLAC). Αγοράστηκαν ή στεγάστηκαν έγκυοι ευθυμικοί αρουραίοι RNU (rnu/+). Τα ζώα διατηρήθηκαν σε 12ωρο κύκλο φωτός-σκότους με τροφή και νερό ad libitum. Γυμνά κουτάβια αρουραίων (FOXN1–/–) ηλικίας τριών έως επτά ημερών αναγνωρίστηκαν από την ανάπτυξη ανώριμων μουστακιών πριν από την θανάτωση. Τα κουτάβια (αρσενικά και θηλυκά) αναισθητοποιήθηκαν με 2-3% ισοφλουράνιο και τοποθετήθηκαν σε στερεοταξικό πλαίσιο. Πραγματοποιήθηκε τρυπανισμός του κρανίου με διάμετρο περίπου 2-3 ​​mm πάνω από την S1, διατηρώντας παράλληλα την ακεραιότητα της σκληράς μήνιγγας. Στη συνέχεια, χρησιμοποιήστε μια βελόνα 30-G (περίπου 0,3 mm) ακριβώς έξω από την κρανιοτομή για να τρυπήσετε τη σκληρά μήνιγγα. Στη συνέχεια, εφαρμόστε HCO3 σε ένα λεπτό παραφίλμ 3×3 cm και αφαιρέστε την περίσσεια μέσου. Χρησιμοποιώντας μια σύριγγα Hamilton προσαρτημένη σε μια βελόνα 23 G, 45°, τραβήξτε απαλά hCO3 στο πιο περιφερικό άκρο της βελόνας. Στη συνέχεια, τοποθετήστε τη σύριγγα στην αντλία σύριγγας που είναι συνδεδεμένη με τη στερεοταξική συσκευή. Στη συνέχεια, τοποθετήστε την άκρη της βελόνας πάνω από μια προηγουμένως κατασκευασμένη οπή διάτρησης πλάτους 0,3 mm στη σκληρά μήνιγγα (z = 0 mm) και στενέψτε τη σύριγγα κατά 1-2 mm (z = περίπου –1,5 mm) μέχρι η βελόνα να βρεθεί ανάμεσα στη σκληρά μήνιγγα Α. Δημιουργείται μια πυκνή σφράγιση. Στη συνέχεια, σηκώστε τη σύριγγα στο κέντρο της φλοιώδους επιφάνειας στα z = -0,5 mm και εγχύστε hCO3 με ρυθμό 1-2 µl ανά λεπτό. Μετά την ολοκλήρωση της ένεσης hCO3, η βελόνα ανασύρεται με ρυθμό 0,2-0,5 mm ανά λεπτό, το δέρμα ράβεται και το κουτάβι τοποθετείται αμέσως σε ένα ζεστό θερμαντικό επίθεμα μέχρι την πλήρη ανάρρωση. Σε ορισμένα ζώα έγινε μεταμόσχευση αμφοτερόπλευρα.
Όλες οι διαδικασίες σε ζώα πραγματοποιήθηκαν σύμφωνα με τις εγκεκριμένες από την APLAC οδηγίες φροντίδας ζώων του Πανεπιστημίου Stanford. Οι αρουραίοι (μεγαλύτερες από 60 ημέρες μετά τη μεταμόσχευση) υποβλήθηκαν σε πρόκληση αναισθησίας με 5% ισοφλουράνιο και αναισθητοποιήθηκαν με 1-3% ισοφλουράνιο κατά τη διάρκεια της απεικόνισης. Για την απεικόνιση, χρησιμοποιήθηκε ένας ενεργά θωρακισμένος οριζόντιος σαρωτής γεωτρήσεων Bruker (Bruker Corp.) 7 Tesla με μονάδα κλίσης της International Electric Company (IECO), ένα θωρακισμένο ένθετο κλίσης με εσωτερική διάμετρο 120 mm (600 mT/m, 1000 T/m/s) χρησιμοποιώντας το AVANCE.III, δυνατότητες οκτακάναλης πολλαπλής σπείρας RF και πολλαπλών πυρήνων, και την συνοδευτική πλατφόρμα Paravision 6.0.1. Η καταγραφή πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας ένα ενεργά αποσυνδεδεμένο ογκομετρικό πηνίο RF με εσωτερική διάμετρο 86 mm και ένα τετρακάναλο κρυοψυγμένο πηνίο RF μόνο για λήψη. Αξονική 2D Turbo-RARE (χρόνος επανάληψης = 2500 ms, χρόνος ηχούς = 33 ms, 2 μέσοι όροι) με 16 λήψεις τομών, πάχος τομής 0,6–0,8 mm, που περιείχε 256 × 256 δείγματα. Τα σήματα ελήφθησαν χρησιμοποιώντας ένα ογκομετρικό πηνίο RF πομποδέκτη τετραγωνισμού με εσωτερική διάμετρο 2 cm (Rapid MR International, LLC). Τέλος, χρησιμοποιήστε τις ενσωματωμένες συναρτήσεις εκτίμησης επιφάνειας Imaris (BitPlane) για τρισδιάστατη απεικόνιση και ανάλυση όγκου. Μια επιτυχημένη μεταμόσχευση ορίστηκε ως αυτή στην οποία σχηματίστηκαν περιοχές συνεχούς σήματος MRI με στάθμιση Τ2 στο μεταμοσχευμένο ημισφαίριο. Η απόρριψη μοσχεύματος ορίστηκε ως ένα μόσχευμα που δεν παρήγαγε περιοχές συνεχούς σήματος MRI με στάθμιση Τ2 στο μεταμοσχευμένο ημισφαίριο. Η υποφλοιώδης t-hCO3 εξαιρέθηκε από την επακόλουθη ανάλυση.
Για τη σταθερή έκφραση των GCaMP6s σε hCO3 για απεικόνιση ασβεστίου δύο φωτονίων, τα κύτταρα hiPS μολύνθηκαν με pLV[Exp]-EF1a::GcaMP6s-WPRE-Puro και ακολούθησε επιλογή αντιβιοτικών. Εν συντομία, τα κύτταρα διαχωρίστηκαν με EDTA και αιωρήθηκαν σε 1 ml μέσου Essential 8 σε πυκνότητα περίπου 300.000 κυττάρων παρουσία πολυβρενίου (5 μg/ml) και 15 μl ιού. Τα κύτταρα στη συνέχεια επωάστηκαν σε εναιώρημα για 60 λεπτά και εμβολιάστηκαν σε πυκνότητα 50.000 κυττάρων ανά φρεάτιο. Μετά τη συρροή, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε αγωγή με 5-10 μg ml-1 πουρομυκίνη για 5-10 ημέρες ή μέχρι να εμφανιστούν σταθερές αποικίες. Η οξεία μόλυνση με hCO πραγματοποιήθηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως5 με ορισμένες τροποποιήσεις. Εν συντομία, μεταφέρθηκαν την ημέρα 30-45 hCO3 σε μικροσωλήνες φυγοκέντρησης Eppendorf των 1,5 ml που περιείχαν 100 μl νευρικού μέσου. Στη συνέχεια, αφαιρούνται περίπου 90 µl του μέσου, προστίθενται 3-6 µl φακοϊού υψηλού τίτλου (από 0,5 x 108 έως 1,2 x 109) στον σωλήνα και το hCO3 μεταφέρεται στον επωαστήρα για 30 λεπτά. Στη συνέχεια, προσθέστε 90-100 µl μέσου σε κάθε σωλήνα και επιστρέψτε τους σωλήνες στον επωαστήρα όλη τη νύχτα. Την επόμενη ημέρα, μεταφέρετε το hCO3 σε φρέσκο ​​νευρικό μέσο σε πλάκες χαμηλής προσκόλλησης. Μετά από 7 ημέρες, το hCO3 μεταφέρθηκε σε πλάκες γυάλινου πυθμένα 24 φρεατίων για οπτικοποίηση και αξιολόγηση της ποιότητας της μόλυνσης. Τα pLV[Exp]-SYN1::EYFP-WPRE και pLV[Exp]-SYN1::hChR2-EYFP-WPRE δημιουργήθηκαν από το VectorBuilder. Ο φακοϊός χρησιμοποιείται στα περισσότερα πειράματα επειδή ενσωματώνεται στο γονιδίωμα του ξενιστή, επιτρέποντας την έκφραση του γονιδίου αναφοράς σε μολυσμένες κυτταρικές σειρές. Για την παρακολούθηση της λύσσας, την ημέρα 30-45, το hCO συν-μολύνθηκε με rabies-ΔG-eGFP και AAV-DJ-EF1a-CVS-G-WPRE-pGHpA (πλασμίδιο #67528, Addgene), πλύθηκε σχολαστικά για 3 ημέρες και μεταμοσχεύθηκε σε αρουραίους σε S1 και διατηρήθηκε in vivo για 7-14 ημέρες.
Για ανοσοκυτταροχημεία, τα ζώα αναισθητοποιήθηκαν και εγχύθηκαν διακαρδιακά με PBS ακολουθούμενο από 4% παραφορμαλδεΰδη (PFA σε PBS· Electron Microscopy Sciences). Οι εγκέφαλοι σταθεροποιήθηκαν σε 4% PFA για 2 ώρες ή όλη τη νύχτα στους 4°C, κρυοσυντηρήθηκαν σε 30% σακχαρόζη σε PBS για 48-72 ώρες και ενσωματώθηκαν σε 1:1, 30% σακχαρόζη: OCT (Tissue-Tek OCT Compound 4583, Sakura Finetek) και έγιναν στεφανιαίες τομές στα 30 µm χρησιμοποιώντας κρυοστάτη (Leica). Για ανοσοϊστοχημεία παχιών τομών, τα ζώα εγχύθηκαν με PBS και ο εγκέφαλος ανατομήθηκε και τεμαχίστηκε στεφανιαίως στα 300-400 µm χρησιμοποιώντας δονητικό τομέα (Leica) και οι τομές σταθεροποιήθηκαν με 4% PFA για 30 λεπτά. Στη συνέχεια, οι κρυοτομές ή οι παχιές τομές πλύθηκαν με PBS, μπλοκαρίστηκαν για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου (10% φυσιολογικός ορός γαϊδουριού (NDS) και 0,3% Triton X-100 αραιωμένο σε PBS) και μπλοκαρίστηκαν με διάλυμα μπλοκαρίσματος στους 4°C. – Επώαση Οι κρυοτομές επωάστηκαν όλη τη νύχτα και οι παχιές τομές επωάστηκαν για 5 ημέρες. Τα πρωτογενή αντισώματα που χρησιμοποιήθηκαν ήταν: αντι-NeuN (ποντικός, 1:500; ab104224, abcam) αντι-CTIP2 (αρουραίος, 1:300; ab18465, abcam), αντι-GFAP (κουνέλι, 1:1.000; Z0334, Dako), αντι-GFP (κοτόπουλο, 1:1.000; GTX13970, GeneTex), αντι-HNA (ποντικός, 1:200; ab191181, abcam), αντι-NeuN (κουνέλι, 1:500; ABN78, Millipore), αντι-PDGFRA (κουνέλι, 1:200; sc-338, Santa Cruz), αντι-PPP1R17 (κουνέλι, 1:200; HPA047819, Atlas Antibodies), αντι-RECA-1 (ποντίκι, 1:50; ab9774, abcam), αντι-SCG2 (κουνέλι, 1:100; 20357-1-AP, Proteintech), αντι-SOX9 (αίγα, 1:500; AF3075, R&D Systems), Netrin G1a (αίγα, 1:100; AF1166, R&D Systems), αντι-STEM121 (ποντικός, 1:200; Y40410, Takara Bio), αντι-SATB2 (ποντικός, 1:50; ab51502, abcam), αντι-GAD65/67 (κουνέλι, 1:400; ABN904, Millipore) και αντι-IBA1 (αίγα, 1:100; ab5076, abcam). Τα πρωτογενή αντισώματα που χρησιμοποιήθηκαν ήταν: αντι-NeuN (ποντικός, 1:500; ab104224, abcam) αντι-CTIP2 (αρουραίος, 1:300; ab18465, abcam), αντι-GFAP (κουνέλι, 1:1.000; Z0334, Dako), αντι-GFP (κοτόπουλο, 1:1.000; GTX13970, GeneTex), αντι-HNA (ποντικός, 1:200; ab191181, abcam), αντι-NeuN (κουνέλι, 1:500; ABN78, Millipore), αντι-PDGFRA (κουνέλι, 1:200; sc-338, Santa Cruz), αντι-PPP1R17 (κουνέλι, 1:200; HPA047819, Atlas Antibodies), αντι-RECA-1 (ποντίκι, 1:50; ab9774, abcam), αντι-SCG2 (κουνέλι 1:100; 20357-1-AP, Proteintech), αντι-SOX9 (αίγα, 1:500; AF3075, R&D Systems), Netrin G1a (αίγα, 1:100; AF1166, R&D Systems), αντι-STEM121 (ποντικός 1:200; Y40410, Takara Bio), αντι-SATB2 (ποντικός 1:50; ab51502, abcam), αντι-GAD65/67 (κουνέλι, 1:400; ABN904, Millipore) και αντι-IBA1 (αίγα, 1:100; ab5076, abcam). Использовались следующие первичные антитела: anti-NeuN (мышиные, 1:500; ab104224, abcam), anti-CTIP2 (крысиные, 1:300; ab18465, abcam), anti-GFAP (1:030, 1:030), -GFP (курица, 1:1000; GTX13970, GeneTex), анти-HNA (мышь, 1:200; ab191181, abcam), анти-NeuN (кролик, 1:500; ABN78, Millipore), anti-PDGFRA (кролик3, 1:1: anti-PPP1R17 (кролик, 1:200; HPA047819, Atlas Antibodies), anti-RECA-1 (мышь, 1:50; ab9774, abcam), anti-SCG2 (кролик , 1:100; 20357-1-tech), SO-AP, 1:500; AF3075, R&D Systems), нетрин G1a (козий, 1:100; AF1166, R&D Systems), анти-STEM121 (мышиный , 1:200; Y40410, Takara Bio), анти-SATB2,1:5; αντι-GAD65/67 (κρολίκ, 1:400; ABN904, Millipore) και αντι-IBA1 (κοζα, 1:100; ab5076, αβκαμ). Τα κύρια αντισώματα που χρησιμοποιήθηκαν ήταν: αντι-NeuN (ποντικός, 1:500; ab104224, abcam), αντι-CTIP2 (αρουραίος, 1:300; ab18465, abcam), αντι-GFAP (κουνέλι, 1:1000; Z0334, Dako), αντι-GFP (κοτόπουλο, 1:1000; GTX13970, GeneTex), αντι-HNA (ποντικός, 1:200; ab191181, abcam), αντι-NeuN (κουνέλι, 1:500; ABN78, Millipore), αντι-PDGFRA (κουνέλι, 1:200; sc-338, Santa Cruz), αντι-PPP1R17 (κουνέλι, 1:200; HPA047819, Atlas Antibodies), αντι-RECA-1 (ποντίκι, 1:50; ab9774, abcam), αντι-SCG2 (κουνέλι, 1:100; 20357-1-AP, Proteintech), αντι-SOX9 (αίγα, 1:500; AF3075, R&D Systems), νετρίνη G1a (αίγα, 1:100; AF1166, R&D Systems), αντι-STEM121 (ποντικός, 1:200; Y40410, Takara Bio), αντι-SATB2 (ποντικός, 1:50; ab51502, abcam), αντι-GAD65/67 (κουνέλι, 1:400; ABN904, Millipore) και αντι-IBA1 (αίγα, 1:100; ab5076, abkam).使用的一抗是：抗NeuN（小鼠，1:500；ab104224，abcam）抗CTIP2（大鼠，1:3 00；ab18465，abcam），抗GFAP（兔，1:1.000；Z0334，Dako），抗-GF P（鸡，1:1.000；GTX13970，GeneTex），抗HNA（小鼠，1:200；ab1911 81,abcam)，抗NeuN（兔，1:500；ABN78，Millipor），抗PDGFRA（兔， 1:200；sc-338，Santa Cruz），抗PPP1R17（兔，1:200；HPA047819，Άτλας抗体），抗RECA-1（小鼠，1:50；ab9774，abcam），抗SCG2（兔）, 1:100；20357-1-AP，Proteintech），抗SOX9（山羊，1:500；AF3075，R&D Systems），Netrin G1a（山羊（山羊（山羊（山羊，60（山羊，1:AF10 Systems，抗STEM121（小鼠, 1:200;使用的一抗是：抗NeuN（小鼠，1:500；ab104224，abcam）抗CTIP2（大鼠，1 :300；ab18465,abcam），抗GFAP（兔，1:1.000；Z0334，Dako），抗-GFP（鸡，1:1.000；GTX13970，GeneTex），抗HNA（小鼠，1:200；ab 191181, abcam）, 抗NeuN（兔, 1:500, ABN78, Millipore, 弔, 抗1: 200；sc-338，Santa Cruz），抗PPP1R17（兔，1:200；HPA047819，Άτλας抗体），抗RECA-1（小鼠，1:50；ab9774，abcam），抗SCG2 100；20357-1-AP，Proteintech），抗SOX9（山羊，1:500；AF3075，R&D Systems），Netrin G1a（山羊（山羊，1:1100（山羊，1:100（山羊， Systems）頏1:20, ;Y40410, Takara Bio), αντι-SATB2 (ποντίκι, 1:50; ab51502, abcam), αντι-GAD65/67 (κουνέλι, 1:400; ABN904, Millipore) και αντι-IBA1 (αίγα, 1:100; ab5076, abcam).Τα κύρια αντισώματα που χρησιμοποιήθηκαν ήταν: αντι-NeuN (ποντικός, 1:500; ab104224, abcam), αντι-CTIP2 (αρουραίος, 1:300; ab18465, abcam), αντι-GFAP (κουνέλι, 1:1000; Z0334, Dako). , αντι-GFP (κοτόπουλο, 1:1000; GTX13970, GeneTex), αντι-HNA (ποντίκι, 1:200; ab191181, abcam), αντι-NeuN (κουνέλι, 1:500; ABN78, Millipore), αντι-PDGFRA (κουνέλι, 1:200; sc-338, Santa Cruz), αντι-PPP1R17 (κουνέλι, 1:200; HPA047819, αντίσωμα Atlas), αντι-RECA-1 (ποντίκι, 1:50; ab9774, abcam), αντι-SCG2 (κουνέλι), 1:100;20357-1-AP, Proteintech), anti-SOX9 (коза, 1:500; AF3075, R&D Systems), Нетрин G1a (коза, 1:100; AF1166, R&D Systems), αντι -STEM121 (мышь, 1:2010,Takara, 1:2010,YATAR); (мышь, 1:50; ab51502, abcam), anti-GAD65/67 (κρόλικ, 1:400; ABN904, Millipore) και anti-IBA1 (κoза, 1:100; ab5076, ABKAM). 20357-1-AP, Proteintech), αντι-SOX9 (αίγα, 1:500; AF3075, R&D Systems), Netrin G1a (αίγα, 1:100; AF1166, R&D Systems), αντι-STEM121 (ποντικός, 1:200; Y40410, Takara Bio), αντι-SATB2 (ποντικός, 1:50; ab51502, abcam), αντι-GAD65/67 (κουνέλι, 1:400; ABN904, Millipore) και αντι-IBA1 (αίγα, 1:100; ab5076, abkam).Οι τομές στη συνέχεια πλύθηκαν με PBS και επωάστηκαν με δευτερογενές αντίσωμα για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου (κατεψυγμένες τομές) ή όλη τη νύχτα στους 4°C (παχιές τομές). Χρησιμοποιήθηκε δευτερογενές αντίσωμα Alexa Fluor (Life Technologies) αραιωμένο 1:1000 σε διάλυμα αποκλεισμού. Μετά το πλύσιμο με PBS, οι πυρήνες απεικονίστηκαν με Hoechst 33258 (Life Technologies). Τέλος, οι αντικειμενοφόρες πλάκες τοποθετήθηκαν σε μικροσκόπιο με καλυπτρίδες (Fisher Scientific) χρησιμοποιώντας Aquamount (Polysciences) και αναλύθηκαν σε φθορίζον μικροσκόπιο Keyence (αναλυτής BZ-X) ή σε ομοεστιακό μικροσκόπιο Leica TCS SP8 (Las-X) στην εικόνα. Οι εικόνες υποβλήθηκαν σε επεξεργασία χρησιμοποιώντας το πρόγραμμα ImageJ (Fiji). Για την ποσοτικοποίηση της αναλογίας των ανθρώπινων νευρώνων στην t-hCO και στον φλοιό του αρουραίου, ελήφθησαν ορθογώνιες εικόνες πλάτους 387,5 μm στο κέντρο της t-hCO, στην άκρη ή κοντά στην άκρη του φλοιού του αρουραίου. Τα όρια του μοσχεύματος προσδιορίστηκαν αξιολογώντας τις αλλαγές στη διαφάνεια των ιστών, τους πυρήνες HNA+ ή/και την παρουσία αυτοφθορισμού ιστών. Σε κάθε εικόνα, ο συνολικός αριθμός των κυττάρων NeuN+ και HNA+ διαιρέθηκε με τον συνολικό αριθμό των κυττάρων NeuN+ στην ίδια περιοχή. Για να διασφαλιστεί ότι καταμετρώνται μόνο τα κύτταρα με πυρήνες στο επίπεδο της εικόνας, στον υπολογισμό περιλαμβάνονται μόνο τα κύτταρα που είναι επίσης Hoechst+. Υπολογίστηκε ο μέσος όρος δύο εικόνων που απέχουν μεταξύ τους τουλάχιστον 1 mm για τη μείωση του στατιστικού σφάλματος.
Μία εβδομάδα πριν από τη συλλογή του δείγματος, τοποθετήστε τα ζώα μεταμόσχευσης hCO3 (περίπου 8 μήνες διαφοροποίησης) σε σκοτεινό δωμάτιο με κομμένα τα μουστάκια για την ελαχιστοποίηση της αισθητηριακής διέγερσης. Η απομόνωση των πυρήνων πραγματοποιήθηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως, με ορισμένες τροποποιήσεις. Εν συντομία, η t-hCO3 και η hCO3 καταστράφηκαν χρησιμοποιώντας μηχανική λύση κυττάρων με απορρυπαντικό και έναν μύλο γυάλινων ιστών 2 ml (D8938, Sigma-Aldrich/KIMBLE). Οι ακατέργαστοι πυρήνες στη συνέχεια διηθήθηκαν χρησιμοποιώντας φίλτρο 40 µm και φυγοκεντρήθηκαν στα 320 g για 10 λεπτά στους 4 °C πριν από την εκτέλεση βαθμίδωσης πυκνότητας σακχαρόζης. Μετά το βήμα φυγοκέντρησης (320 g για 20 λεπτά στους 4 °C), τα δείγματα επαναιωρήθηκαν σε 0,04% BSA/PBS με την προσθήκη 0,2 μονάδων αναστολέα µl-1 RNase (40 u µl-1, AM2682, Ambion) και διήλθαν από φίλτρο ροής 40 µm. Οι διαχωρισμένοι πυρήνες στη συνέχεια επαναιωρήθηκαν σε PBS που περιείχε 0,02% BSA και φορτώθηκαν σε ένα τσιπ Chromium Single Cell 3' (εκτιμώμενη ανάκτηση 8.000 κυττάρων ανά λωρίδα). Οι βιβλιοθήκες snRNA-seq παρασκευάστηκαν με το Chromium Single cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics). Οι βιβλιοθήκες snRNA-seq παρασκευάστηκαν με το Chromium Single cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics). Biblioteki snRNA-seq были приготовлены со помош Chromium Single cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics). Οι βιβλιοθήκες snRNA-seq παρασκευάστηκαν χρησιμοποιώντας Chromium Single cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics). snRNA-seq 文库是使用Chromium Single cell 3′ GEM、Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics) 制备的。 snRNA-seq 文库是使用Chromium Single cell 3′ GEM、Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics) 制备的。 Biblioteku snRNA-seq προετοιμάστηκε με χρήση Chromium Single Cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics). Η βιβλιοθήκη snRNA-seq παρασκευάστηκε χρησιμοποιώντας το Chromium Single Cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics).Βιβλιοθήκες από διαφορετικά δείγματα συγκεντρώθηκαν και αλληλουχήθηκαν από την Admera Health σε NovaSeq S4 (Illumina).
Τα επίπεδα γονιδιακής έκφρασης για κάθε πιθανό πυρηνικό γραμμωτό κώδικα ποσοτικοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας το πακέτο λογισμικού ανάλυσης 10x Genomics CellRanger (έκδοση 6.1.2). Συγκεκριμένα, οι αναγνώσεις αντιστοιχίστηκαν με έναν συνδυασμό γονιδιωμάτων αναφοράς ανθρώπου (GRCh38, Ensemble, έκδοση 98) και αρουραίου (Rnor_6.0, Ensemble, έκδοση 100) που δημιουργήθηκαν με την εντολή mkref και χρησιμοποιώντας την εντολή count με την εντολή –include-introns=TRUE για την ποσοτικοποίηση των αναγνώσεων που αντιστοιχίστηκαν σε περιοχές ιντρονίων. Για τα δείγματα t-hCO3, οι ανθρώπινοι πυρήνες ταυτοποιήθηκαν με βάση την συντηρητική απαίτηση ότι τουλάχιστον το 95% όλων των αντιστοιχισμένων αναγνώσεων ταιριάζουν με το ανθρώπινο γονιδίωμα. Όλες οι επακόλουθες αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν σε μια φιλτραρισμένη συστοιχία γραμμωτού κώδικα που εξήχθη από το CellRanger χρησιμοποιώντας το πακέτο R (έκδοση 4.1.2) Seurat (έκδοση 4.1.1)32.
Για να διασφαλιστεί ότι στην επακόλουθη ανάλυση περιλαμβάνονται μόνο πυρήνες υψηλής ποιότητας, εφαρμόστηκε μια επαναληπτική διαδικασία φιλτραρίσματος για κάθε δείγμα. Αρχικά, εντοπίζονται και αφαιρούνται πυρήνες χαμηλής ποιότητας με λιγότερα από 1000 μοναδικά γονίδια και περισσότερο από 20% του συνόλου των μιτοχονδρίων. Στη συνέχεια, ο ακατέργαστος πίνακας αριθμού γονιδίων ομαλοποιήθηκε με κανονικοποιημένη αρνητική διωνυμική παλινδρόμηση χρησιμοποιώντας τη συνάρτηση sctransform(vst.flavor=”v2″), η οποία επίσης αναγνώρισε τα 3000 πιο μεταβλητά γονίδια χρησιμοποιώντας προεπιλεγμένες παραμέτρους. Η μείωση των διαστάσεων πραγματοποιήθηκε στα ανώτερα μεταβλητά γονίδια χρησιμοποιώντας την Ανάλυση Κύριων Συνιστωσών (PCA) με προεπιλεγμένες παραμέτρους χρησιμοποιώντας μια διάσταση συνόλου δεδομένων 30 (το dims = 30 επιλέχθηκε με βάση την οπτική επιθεώρηση των θέσεων του γόνατος και χρησιμοποιήθηκε για όλα τα δείγματα και τις αναλύσεις συνόλων). Στη συνέχεια, πραγματοποιήσαμε αρκετούς γύρους επαναληπτικής ομαδοποίησης (ανάλυση = 1) για να ταξινομήσουμε γονίδια με βάση τον ασυνήθιστα χαμηλό αριθμό γονιδίων (διάμεσος κάτω από το 10ο εκατοστημόριο), τον ασυνήθιστα υψηλό αριθμό μιτοχονδριακών γονιδίων (διάμεσος πάνω από το 95ο εκατοστημόριο) για να εντοπίσουμε και να αφαιρέσουμε πιθανά κύτταρα χαμηλής ποιότητας. Συστάδες ή/και υψηλό ποσοστό ύποπτων διδύμων που αναγνωρίστηκαν χρησιμοποιώντας το πακέτο DoubletFinder33 (μέση βαθμολογία DoubletFinder πάνω από το 95ο εκατοστημόριο). Τα δείγματα t-hCO3 (n=3) και τα δείγματα hCO3 (n=3) ενσωματώθηκαν ξεχωριστά χρησιμοποιώντας τη συνάρτηση IntegrateData με τα παραπάνω. παραμέτρους. Στη συνέχεια, πραγματοποιήθηκε ένας ακόμη γύρος ποιοτικού φιλτραρίσματος του ολοκληρωμένου συνόλου δεδομένων όπως περιγράφεται παραπάνω.
Μετά την αφαίρεση των πυρήνων χαμηλής ποιότητας, το ενσωματωμένο σύνολο δεδομένων ομαδοποιήθηκε (ανάλυση = 0,5) και ενσωματώθηκε για σκοπούς οπτικοποίησης UMAP34. Τα γονίδια-δείκτες για κάθε συστάδα προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας τη συνάρτηση FindMarkers με προεπιλεγμένες παραμέτρους που υπολογίστηκαν από κανονικοποιημένα δεδομένα γονιδιακής έκφρασης. Προσδιορίζουμε και ταξινομούμε τις κύριες κατηγορίες κυττάρων συνδυάζοντας σύνολα δεδομένων αναφοράς εμβρυϊκού και ενήλικου φλοιού με την έκφραση γονιδίων-δεικτών 19,20,21,35 και σχολιασμό. Συγκεκριμένα, οι κυκλοφορούντες πρόδρομοι ταυτοποιήθηκαν από την έκφραση των MKI67 και TOP2A. Οι προγονικές συστάδες ορίστηκαν από την απουσία μιτωτικών μεταγράφων, την υψηλή επικάλυψη με πολυδύναμες νευρογλοιακές προγονικές συστάδες που περιγράφονται στον εμβρυϊκό φλοιό ύστερης μετάφασης και την έκφραση EGFR και OLIG1. Χρησιμοποιούμε τον όρο αστροκύτταρο για να συμπεριλάβουμε διάφορες καταστάσεις διαφοροποίησης αστροκυττάρων, από την ύστερη ακτινική γλοία έως την ωρίμανση των αστροκυττάρων. Οι συστάδες αστροκυττάρων εκφράζουν υψηλά επίπεδα SLC1A3 και AQP4 και έχουν αποδειχθεί ότι χαρτογραφούνται με υποτύπους εμβρυϊκής ακτινικής γλοίας ή/και ενήλικων αστροκυττάρων. Τα OPC εκφράζουν PDGFRA και SOX10, ενώ τα ολιγοδενδροκύτταρα εκφράζουν δείκτες μυελίνωσης (MOG και MYRF). Οι γλουταμινεργικοί νευρώνες ταυτοποιήθηκαν από την παρουσία νευρωνικών μεταγραφών (SYT1 και SNAP25), την απουσία GABAεργικών δεικτών (GAD2) και την έκφραση των NEUROD6, SLC17A7, BCL11B ή SATB2. Οι νευρώνες GluN διαιρέθηκαν περαιτέρω σε ανώτερες (έκφραση SATB2 και απώλεια BCL11B) και βαθιές (έκφραση BCL11B) υποκατηγορίες. Οι πιθανοί νευρώνες υποπλάκας (SP) εκφράζουν γνωστούς δείκτες SP18 όπως ST18 και SORCS1, εκτός από τους βαθείς δείκτες GluN. Τα κύτταρα που μοιάζουν με χοριοειδές πλέγμα ταυτοποιήθηκαν με έκφραση TTR, και τα μηνιγγικά κύτταρα εξέφρασαν γονίδια που σχετίζονται με ινοβλάστες και χαρτογράφησαν χολοκυστικά/αγγειακά κύτταρα του συνόλου δεδομένων αναφοράς.
Η διαφορική ανάλυση της γονιδιακής έκφρασης μεταξύ των t-hCO και των υποκατηγοριών hCO πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας μια πρόσφατα ανεπτυγμένη μέθοδο ψευδο-παρτίδας που αναπαράγεται σε δείγματα που υλοποιείται χρησιμοποιώντας το πακέτο Libra R (έκδοση 1.0.0). Συγκεκριμένα, πραγματοποιήθηκαν δοκιμές λογαριθμικής πιθανοφάνειας edgeR (έκδοση 3.36.0, πακέτο R) για ομάδες αθροίζοντας τον αριθμό των γονιδίων στα κύτταρα για μια δεδομένη κατηγορία κυττάρων για κάθε αντιγραφή δείγματος. Για την οπτικοποίηση του θερμικού χάρτη, οι κανονικοποιημένες τιμές ανά εκατομμύριο (CPM) υπολογίζονται χρησιμοποιώντας το edgeR (συνάρτηση cpm()) και κλιμακώνονται (για να επιτευχθεί μέσος όρος = 0, τυπική απόκλιση = 1). Πραγματοποιήθηκε ανάλυση εμπλουτισμού με Οντολογία Γονιδίων (GO) σημαντικά αυξημένων γονιδίων t-hCO GluN (τιμή P διορθωμένη από Benjamini-Hochberg μικρότερη από 0,05 που εκφράζεται σε τουλάχιστον 10% των κυττάρων t-hCO GluN και αύξηση της μεταβολής τουλάχιστον 2 φορές). Πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας το ToppGene Suite (https://toppgene.cchmc.org/)37. Χρησιμοποιούμε την εφαρμογή ToppFun με προεπιλεγμένες παραμέτρους και αναφέρουμε τιμές P διορθωμένες κατά Benjamini-Hochberg, οι οποίες υπολογίζονται από υπεργεωμετρικές δοκιμές με σχολιασμό GO.
Για να αντιστοιχίσουμε τα συμπλέγματα snRNA-seq μας με σχολιασμένες συστάδες κυττάρων από μελέτες αναφοράς πρωτογενούς μονοκυτταρικού RNA-seq ή ενήλικου snRNA-seq19,20,21,22, εφαρμόσαμε μια προσέγγιση ολοκλήρωσης ζευγαρωμένων συνόλων δεδομένων. Χρησιμοποιήσαμε τη ροή εργασίας κανονικοποίησης SCTransform (v2) στο Seurat για να ενσωματώσουμε και να συγκρίνουμε επικαλύψεις συμπλεγμάτων μεταξύ συνόλων δεδομένων (χρησιμοποιώντας τις ίδιες παραμέτρους όπως παραπάνω). Τα μεμονωμένα σύνολα δεδομένων υποδιαιρέθηκαν τυχαία έως και 500 κύτταρα ή πυρήνες ανά αρχική συστάδα για υπολογιστική αποτελεσματικότητα. Χρησιμοποιώντας μια παρόμοια προσέγγιση όπως περιγράφηκε προηγουμένως, η επικάλυψη συμπλέγματος ορίστηκε ως η αναλογία κυττάρων ή πυρήνων σε κάθε συγκεντρωμένη συστάδα που επικαλύπτονταν με την ετικέτα της συστάδας αναφοράς. Για να ταξινομήσουμε περαιτέρω τα GluN, χρησιμοποιήσαμε τη ροή εργασίας TransferData του Seurat για δεδομένα υποσυνόλου GluN για να αντιστοιχίσουμε ετικέτες συνόλου δεδομένων αναφοράς στα κύτταρα GluN μας.
Για να αξιολογήσουμε την κατάσταση ωρίμανσης του καθολικού μεταγραφώματος των δειγμάτων t-hCO και hCO, συγκρίναμε τα ψευδο-μαζικά μας δείγματα με το BrainSpan/psychENCODE23, το οποίο αποτελείται από μια μεγάλη αλληλουχία RNA που καλύπτει την ανάπτυξη του ανθρώπινου εγκεφάλου. Πραγματοποιήσαμε PCA σε έναν συνδυασμένο πίνακα γονιδιακής έκφρασης με κανονικοποιημένο πρότυπο από φλοιώδη δείγματα 10 εβδομάδες μετά τη σύλληψη και αργότερα, σε 5567 γονίδια (μαζί με τα δεδομένα μας) που είχαν προηγουμένως αναγνωριστεί ως ενεργά σε φλοιώδη δείγματα BrainSpan (οριζόμενη ως μεγαλύτερη από 50% στην αναπτυξιακή διακύμανση που εξηγείται από την ηλικία χρησιμοποιώντας ένα κυβικό μοντέλο)38. Επιπλέον, προέκυψαν γονίδια που σχετίζονται με κύριες μεταγραφικές υπογραφές νευροανάπτυξης χρησιμοποιώντας μη αρνητική παραγοντοποίηση μήτρας όπως περιγράφηκε προηγουμένως. Τα βάρη των δειγμάτων που υπολογίστηκαν χρησιμοποιώντας τη διαδικασία μη αρνητικής παραγοντοποίησης μήτρας απεικονίζονται στα Σχήματα 5b με εκτεταμένα δεδομένα για καθεμία από τις πέντε υπογραφές που περιγράφονται από τους Zhu et al.38. Και πάλι, οι μεταγραφικοί δείκτες που εξαρτώνται από τη δραστηριότητα προέκυψαν από προηγουμένως δημοσιευμένες μελέτες. Συγκεκριμένα, τα ERG και LRG αυξήθηκαν σημαντικά σε γλουταμινεργικούς νευρώνες που ταυτοποιήθηκαν από τη συλλογή snRNA-seq οπτικού φλοιού ποντικού μετά από οπτική διέγερση από τον Συμπληρωματικό Πίνακα 3 Hrvatin et al.16. Εμπλουτισμένα σε ανθρώπους LRG ελήφθησαν από καλλιέργειες ανθρώπινου εμβρυϊκού εγκεφάλου ενεργοποιημένες με KCl και συλλέχθηκαν 6 ώρες μετά τη διέγερση, και τα φιλτραρισμένα γονίδια αυξήθηκαν σημαντικά σε ανθρώπους αλλά όχι σε τρωκτικά (Συμπληρωματικός Πίνακας 4). Η ανάλυση του εμπλουτισμού του γονιδιακού συνόλου χρησιμοποιώντας αυτά τα γονιδιακά σύνολα πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας μια μονόδρομη ακριβή δοκιμή Fisher.
Αναισθητοποιήστε τους αρουραίους με ισοφλουράνιο, αφαιρέστε τους εγκεφάλους και τοποθετήστε τους σε κρύο (περίπου 4°C) οξυγονωμένο (95% O2 και 5% CO2) διάλυμα σακχαρόζης για τομές που περιέχουν: 234 mM σακχαρόζη, 11 mM γλυκόζη, 26 mM NaHCO3, 2,5 mM KCl, 1,25 mM NaH2PO4, 10 mM MgSO4 και 0,5 mM CaCl2 (περίπου 310 mOsm). Οι στεφανιαίες τομές εγκεφάλου αρουραίου (300–400 µm) που περιείχαν t-hCO3 έγιναν χρησιμοποιώντας έναν δονητή Leica VT1200 όπως περιγράφηκε προηγουμένως39. Οι τομές μεταφέρθηκαν στη συνέχεια σε θάλαμο τομής με συνεχή οξυγόνωση σε θερμοκρασία δωματίου που περιείχε aCSF παρασκευασμένο από: 10 mM γλυκόζη, 26 mM NaHCO3, 2,5 mM KCl, 1,25 mM NaHPO4, 1 mM MgSO4, 2 mM CaCl2 και 126 mM NaCl (298 mOsm). τουλάχιστον 45 λεπτά πριν από την καταγραφή. Οι τομές καταγράφηκαν σε βυθισμένο θάλαμο όπου αιματώνονταν συνεχώς με aCSF (φιαλίδιο 95% O2 και 5% CO2). Όλα τα δεδομένα καταγράφηκαν σε θερμοκρασία δωματίου. Οι νευρώνες t-hCO3 τερματίστηκαν με πιπέτα από βοριοπυριτικό γυαλί γεμισμένη με διάλυμα που περιείχε 127 mM γλυκονικό κάλιο, 8 mM NaCl, 4 mM μαγνήσιο ATP, 0,3 mM GTP νατρίου, 10 mM HEPES και 0,6 mM EGTA, pH 7,2, εσωτερικό διάλυμα ρυθμισμένο με KOH (290 mOsm). Για την ανάκτηση, προστέθηκε βιοκυτίνη (0,2%) στο διάλυμα καταγραφής.
Τα δεδομένα αποκτήθηκαν χρησιμοποιώντας έναν ενισχυτή MultiClamp 700B (Molecular Devices) και έναν ψηφιοποιητή Digidata 1550B (Molecular Devices), φιλτραρίστηκαν χαμηλοπερατά στα 2 kHz, ψηφιοποιήθηκαν στα 20 kHz και αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας Clampfit (Molecular Devices), Origin (OriginPro, 2021b, OriginLab) και προσαρμοσμένες συναρτήσεις MATLAB (Mathworks). Το δυναμικό σύνδεσης υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας το JPCalc και οι καταχωρήσεις προσαρμόστηκαν στην υπολογιζόμενη τιμή των -14 mV. Η λειτουργία IV αποτελείται από μια σειρά βημάτων ρεύματος σε βήματα των 10-25 pA, από -250 έως 750 pA.
Ο θάλαμος, η λευκή ουσία και οι προσαγωγοί αγωγοί S1 διεγέρθηκαν ηλεκτρικά σε φέτες θαλαμοφλοιώδους ιστού κατά τη διάρκεια της καταγραφής νευρώνων hCO3 με σφιγκτήρα, όπως περιγράφηκε προηγουμένως. Εν συντομία, ο εγκέφαλος τοποθετήθηκε σε ένα τραπέζι τρισδιάστατης εκτύπωσης με κλίση 10° και το μπροστινό μέρος του εγκεφάλου κόπηκε υπό γωνία 35°. Στη συνέχεια, ο εγκέφαλος κολλήθηκε στην επιφάνεια κοπής και τμήθηκε, διατηρώντας τους προεξέχοντες νευράξονες του θαλαμοφλοιώδους ιστού. Διπολικά ηλεκτρόδια βολφραμίου (0,5 MΩ) τοποθετήθηκαν σε έναν δεύτερο μικροχειριστή και τοποθετήθηκαν στρατηγικά για να διεγείρουν τέσσερις περιοχές ανά κύτταρο (εσωτερική κάψουλα, λευκή ουσία, S1 και hCO3). Καταγράψτε τις συναπτικές αποκρίσεις μετά από φασική διέγερση 300 µA στα 0,03–0,1 Hz.
Νευρώνες hCO3 που εκφράζουν hChR2 ενεργοποιήθηκαν στα 480 nm και παλμοί φωτός που δημιουργήθηκαν από ένα LED (Prizmatix) εφαρμόστηκαν μέσω ενός αντικειμενικού φακού ×40 (0,9 NA· Olympus) για να καταγραφεί η έκφραση hChR2 κοντά στα κύτταρα. Η διάμετρος του φωτιζόμενου πεδίου είναι περίπου 0,5 mm και η συνολική ισχύς είναι 10-20 mW. Το πλάτος παλμού ορίστηκε στα 10 ms, το οποίο αντιστοιχεί στον παλμό που δόθηκε κατά τη διάρκεια του πειράματος συμπεριφορικής μάθησης. Χρησιμοποιήθηκαν διάφορες συχνότητες διέγερσης, από 1 έως 20 Hz, αλλά μόνο ο πρώτος παλμός της σειράς χρησιμοποιήθηκε για ποσοτικοποίηση. Τα διαστήματα μεταξύ των συνεχόμενων κύκλων είναι συνήθως μεγαλύτερα από 30 s για να ελαχιστοποιηθεί η επίδραση στις συναπτικές ανασταλτικές ή διευκολυντικές οδούς. Για να ελέγξουμε εάν η απόκριση hChR2 ήταν μονοσυναπτική, εφαρμόσαμε TTX (1 μM) στο λουτρό μέχρι να εξαφανιστεί η αντίδραση EPSC και στη συνέχεια εφαρμόσαμε 4-αμινοπυριδίνη (4-AP· 100 μM). Συνήθως, μια απόκριση επιστρέφεται μέσα σε λίγα λεπτά, με μια ελαφρώς μεγαλύτερη καθυστέρηση μεταξύ της πυροδότησης του LED και της παραγωγής EPSC. Χρησιμοποιήθηκε NBQX (10 μM) για να ελεγχθεί εάν η απόκριση καθοδηγείται από υποδοχείς AMPA.
Δημιουργήθηκαν αιχμηρές τομές hCO όπως περιγράφηκε προηγουμένως. Εν συντομία, οι τομές hCO ενσωματώθηκαν σε 4% αγαρόζη και μεταφέρθηκαν σε κύτταρα που περιείχαν 126 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM NaH2PO4, 1 mM MgSO4, 2 mM CaCl2, 26 mM NaHCO3 και 10 mM d-(+)-γλυκόζη σε τεμάχια. Οι τομές κόπηκαν στα 200-300 µm σε θερμοκρασία δωματίου χρησιμοποιώντας έναν δονητή Leica VT1200 και αποθηκεύτηκαν σε ASF σε θερμοκρασία δωματίου. Στη συνέχεια, πραγματοποιήθηκε καταγραφή patch-camp ολόκληρων κυττάρων σε τομές hCO υπό άμεσο μικροσκόπιο SliceScope (Scientifica). Οι τομές εγχύθηκαν με aCSF (95% O2 και 5% CO2) και τα κυτταρικά σήματα καταγράφηκαν σε θερμοκρασία δωματίου. Οι νευρώνες hCO3 εφαρμόστηκαν χρησιμοποιώντας μια πιπέτα από βοριοπυριτικό γυαλί γεμισμένη με ένα διάλυμα που περιείχε 127 mM γλυκονικό κάλιο, 8 mM NaCl, 4 mM μαγνήσιο ATP, 0,3 mM GTP νατρίου, 10 mM HEPES και 0,6 mM EGTA, εσωτερικό pH 7, 2, ρυθμισμένο με KOH (ωσμωτικότητα 290). Για σκοπούς ανάκτησης, προσθέστε 0,2% βιοκυτίνη στο εσωτερικό διάλυμα.
Τα δεδομένα αποκτήθηκαν από την Clampex (Clampex 11.1, Molecular Devices) χρησιμοποιώντας έναν ενισχυτή MultiClamp 700B (Molecular Devices) και έναν ψηφιοποιητή Digidata 1550B (Molecular Devices), φιλτραρίστηκαν χαμηλών συχνοτήτων στα 2 kHz, ψηφιοποιήθηκαν στα 20 kHz και αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το Clampfit (έκδοση 10.6) για ανάλυση, μοριακές συσκευές) και προσαρμοσμένες συναρτήσεις MATLAB (MATLAB 2019b, Mathworks). Το δυναμικό σύνδεσης υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας το JPCalc και οι καταχωρήσεις προσαρμόστηκαν στο υπολογισμένο δυναμικό σύνδεσης των -14 mV. Η λειτουργία IV αποτελείται από μια σειρά βημάτων ρεύματος σε βήματα των 5-10 pA από -50 έως 250 pA.
Για τη μορφολογική ανακατασκευή των νευρώνων που έχουν υποστεί τσιμπή, προστέθηκε στο εσωτερικό διάλυμα 0,2% βιοκυτίνη (Sigma-Aldrich). Τα κύτταρα προετοιμάζονται για τουλάχιστον 15 λεπτά μετά την θραύση. Στη συνέχεια, η πιπέτα αναρροφάται αργά για 1-2 λεπτά μέχρι να σφραγιστεί πλήρως η καταγεγραμμένη μεμβράνη. Ακολουθώντας τη διαδικασία φυσιολογίας τομών, οι τομές σταθεροποιήθηκαν όλη τη νύχτα στους 4°C σε 4% PFA, πλύθηκαν με PBS X3 και αραιώθηκαν 1:1000 με DyLight 549 ή DyLight 405 συζευγμένο με στρεπταβιδίνη (Vector Labs). Τα κύτταρα που γεμίστηκαν με βιοκυτίνη (2%, Sigma-Aldrich) επισημάνθηκαν κατά την καταγραφή με σφιγκτήρα σε θερμοκρασία δωματίου για 2 ώρες. Οι τομές στη συνέχεια τοποθετήθηκαν σε αντικειμενοφόρες πλάκες μικροσκοπίας χρησιμοποιώντας Aquamount (Thermo Scientific) και απεικονίστηκαν την επόμενη ημέρα σε ομοεστιακό μικροσκόπιο Leica TCS SP8 χρησιμοποιώντας αντικειμενικό φακό εμβάπτισης σε λάδι με αριθμητικό άνοιγμα ×40 1,3, μεγέθυνση ×0,9-1,0, xy. Ο ρυθμός δειγματοληψίας είναι περίπου 7 pixel ανά μικρόν. Οι στοίβες Z σε διαστήματα 1 µm ελήφθησαν σειριακά και πραγματοποιήθηκαν μωσαϊκά στοίβας z και αυτόματη συρραφή με βάση τη Leica για να καλυφθεί ολόκληρο το δενδριτικό δέντρο κάθε νευρώνα. Οι νευρώνες στη συνέχεια παρακολουθήθηκαν ημι-χειροκίνητα χρησιμοποιώντας τη διεπαφή neuTube 40 και δημιουργήθηκαν αρχεία SWC. Τα αρχεία στη συνέχεια μεταφορτώθηκαν στο πρόσθετο SimpleNeuriteTracer41 Fiji (ImageJ, έκδοση 2.1.0; NIH).
Ανθρώπινος φλοιώδης ιστός ελήφθη με ενημερωμένη συγκατάθεση σύμφωνα με πρωτόκολλο που εγκρίθηκε από το Συμβούλιο Θεσμικής Αναθεώρησης του Πανεπιστημίου Στάνφορντ. Δύο δείγματα ανθρώπινου ιστού μετά τον τοκετό (ηλικίας 3 και 18 ετών) ελήφθησαν με εκτομή του μετωπιαίου φλοιού (μέση μετωπιαία έλικα) ως μέρος χειρουργικής επέμβασης για ανθεκτική επιληψία. Μετά την εκτομή, συλλέχθηκε ιστός σε παγωμένο NMDG-aCSF που περιείχε: 92 mM NMDG, 2,5 mM KCl, 1,25 mM NaH2PO4, 30 mM NaHCO3, 20 mM HEPES, 25 mM γλυκόζη, 2 mM θειουρία, 5 mM ασκορβικό νάτριο, 3 mM πυροσταφυλικό νάτριο, 0,5 mM CaCl2·4H2O και 10 mM MgSO4·7H2O. Τιτλοδοτήθηκε σε pH 7,3-7,4 με πυκνό υδροχλωρικό οξύ. Οι ιστοί παραδόθηκαν στο εργαστήριο εντός 30 λεπτών και ελήφθησαν στεφανιαίες τομές σύμφωνα με τη διαδικασία που περιγράφεται παραπάνω.
Όλες οι διαδικασίες σε ζώα πραγματοποιήθηκαν σύμφωνα με τις εγκεκριμένες από την APLAC οδηγίες φροντίδας ζώων του Πανεπιστημίου Stanford. Οι αρουραίοι (μεγαλύτερες από 140 ημέρες μετά τη μεταμόσχευση) υποβλήθηκαν σε πρόκληση με αναισθησία 5% ισοφλουρανίου και αναισθητοποιήθηκαν με 1-3% ισοφλουράνιο διεγχειρητικά. Τα ζώα τοποθετήθηκαν σε στερεοταξικό πλαίσιο (Kopf) και χορηγήθηκε υποδόρια ένεση βουπρενορφίνης (SR) παρατεταμένης αποδέσμευσης. Το κρανίο εκτίθεται, καθαρίζεται και εισάγονται 3-5 οστικές βίδες. Για να στοχεύσουμε την t-hCO3, δημιουργήσαμε στερεοταξικές συντεταγμένες από εικόνες μαγνητικής τομογραφίας. Ανοίχτηκε μια οπή φρέζας στο σημείο ενδιαφέροντος και ίνες (διαμέτρου 400 µm, NA 0,48, δωρική) κατεβήκαν 100 µm κάτω από την επιφάνεια της hCO3 και στερεώθηκαν στο κρανίο με οδοντιατρικό τσιμέντο που σκληρύνεται με υπεριώδη ακτινοβολία (Relyx).
Οι φωτομετρικές καταγραφές ινών πραγματοποιήθηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως42. Για την καταγραφή της αυθόρμητης δραστηριότητας, οι αρουραίοι τοποθετήθηκαν σε ένα καθαρό κλουβί και ένα καλώδιο οπτικής ίνας διαμέτρου 400 µm (Doric) συνδεδεμένο με ένα σύστημα λήψης φωτομετρικών δεδομένων οπτικών ινών συνδέθηκε με το εμφυτευμένο καλώδιο οπτικών ινών. Κατά τη διάρκεια της 10λεπτης καταγραφής της κινητικής δραστηριότητας, τα ζώα ήταν ελεύθερα να εξερευνήσουν το κλουβί. Για την καταγραφή της προκληθείσας δραστηριότητας, οι αρουραίοι (περισσότερες από 140 ημέρες μετά τη μεταμόσχευση) αναισθητοποιήθηκαν με 5% ισοφλουράνιο για επαγωγή και 1-3% ισοφλουράνιο για συντήρηση. Τοποθετήστε το ζώο σε ένα στερεοτακτικό πλαίσιο (Kopf) και τα μουστάκια στην αντίθετη πλευρά του t-hCO3 κόβονται σε περίπου 2 cm και περνούν μέσα από ένα πλέγμα συνδεδεμένο με έναν πιεζοηλεκτρικό ενεργοποιητή (PI). Ένα καλώδιο οπτικής ίνας 400 µm (Doric) συνδέθηκε με την εμφυτευμένη ίνα και στο σύστημα λήψης δεδομένων. Τα μουστάκια στην αντίθετη πλευρά του t-hCO3 εκτράπηκαν στη συνέχεια 50 φορές (2 mm στα 20 Hz, 2 s ανά παρουσίαση) σε τυχαίους χρόνους από μια πιεζοηλεκτρική μονάδα σε μια περίοδο καταγραφής 20 λεπτών. Χρησιμοποιήστε το Πακέτο Υποστήριξης Arduino MATLAB για να ελέγξετε τον χρόνο εκτροπής με προσαρμοσμένο κώδικα MATLAB. Τα συμβάντα συγχρονίζονται με το λογισμικό συλλογής δεδομένων χρησιμοποιώντας παλμούς λογικής τρανζίστορ-τρανζίστορ (TTL).
Οι αρουραίοι (περισσότερο από 140 ημέρες μετά τη μεταμόσχευση) υποβλήθηκαν σε πρόκληση με αναισθησία 5% ισοφλουρανίου και αναισθητοποιήθηκαν με 1-3% ισοφλουράνιο διεγχειρητικά. Τα ζώα τοποθετήθηκαν σε στερεοταξικό πλαίσιο (Kopf) και εγχύθηκαν υποδορίως βουπρενορφίνη SR και δεξαμεθαζόνη. Το κρανίο εκτίθεται, καθαρίζεται και εισάγονται 3-5 οστικές βίδες. Για τη στόχευση της t-hCO3, δημιουργήσαμε στερεοταξικές συντεταγμένες από εικόνες μαγνητικής τομογραφίας. Πραγματοποιήθηκε κυκλική κρανιοτομή (διαμέτρου περίπου 1 cm) με τρυπάνι υψηλής ταχύτητας απευθείας πάνω από το μεταμοσχευμένο hCO3. Μόλις το οστό γίνει όσο το δυνατόν πιο λεπτό, αλλά πριν τρυπήσουμε ολόκληρο το οστό, χρησιμοποιήστε λαβίδα για να αφαιρέσετε τον εναπομείναντα άθικτο πυελικό δίσκο για να αποκαλυφθεί η υποκείμενη t-hCO3. Η κρανιοτομή γεμίστηκε με αποστειρωμένο φυσιολογικό ορό και μια καλυπτρίδα και μια ειδική καρφίτσα κεφαλής προσαρτήθηκαν στο κρανίο με οδοντιατρικό τσιμέντο σκληρυμένο με υπεριώδη ακτινοβολία (Relyx).
Η απεικόνιση δύο φωτονίων πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας ένα πολυφωτονικό μικροσκόπιο Bruker με αντικειμενικό φακό Nikon LWD (×16, 0,8 NA). Η απεικόνιση GCaMP6 πραγματοποιήθηκε στα 920 nm με μεγέθυνση 1,4x ενός επιπέδου z και μέσο όρο 8x 7,5 fps. Οι αρουραίοι υποβλήθηκαν σε επαγωγή με αναισθησία 5% ισοφλουράνιο και διατηρήθηκαν με 1-3% ισοφλουράνιο. Οι αρουραίοι τοποθετήθηκαν σε ένα ειδικά κατασκευασμένο εξάρτημα κεφαλής και τοποθετήθηκαν κάτω από τον φακό. Λήφθηκε μια καταγραφή κινητικής δραστηριότητας στο παρασκήνιο 3 λεπτών. Κατά τη διάρκεια 20 λεπτών καταγραφής, 50 εισπνοές (κάθε παρουσίαση διάρκειας 100 ms) χορηγήθηκαν τυχαία στο μαξιλαράκι μουστάκι απέναντι από το t-hCO3 χρησιμοποιώντας ένα picospricer. Χρησιμοποιήστε το πακέτο υποστήριξης Arduino MATLAB για να ελέγξετε τον χρόνο ριπής με προσαρμοσμένο κώδικα MATLAB. Συγχρονίστε συμβάντα με λογισμικό συλλογής δεδομένων (PrairieView 5.5) χρησιμοποιώντας παλμούς TTL. Για ανάλυση, οι εικόνες διορθώθηκαν για κίνηση xy χρησιμοποιώντας διόρθωση affine στο πρόγραμμα MoCo που ξεκίνησε στα Φίτζι. Εκχύλιση ιχνών φθορισμού από μεμονωμένα κύτταρα χρησιμοποιώντας CNMF-E43. Ο φθορισμός εκχυλίστηκε για κάθε περιοχή ενδιαφέροντος, μετατράπηκε σε καμπύλες dF/F και στη συνέχεια μετατράπηκε σε z-scores.
Οι αρουραίοι (περισσότερο από 140 ημέρες μετά τη μεταμόσχευση) υποβλήθηκαν σε πρόκληση τοκετού με αναισθησία 5% ισοφλουρανίου και αναισθητοποιήθηκαν με 1-3% ισοφλουράνιο διεγχειρητικά. Τα ζώα τοποθετήθηκαν σε στερεοταξικό πλαίσιο (Kopf) και εγχύθηκαν υποδορίως βουπρενορφίνη SR και δεξαμεθαζόνη. Τα μουστάκια στην αντίθετη πλευρά του t-hCO3 κόπηκαν σε περίπου 2 cm και περάστηκαν μέσα από ένα πλέγμα συνδεδεμένο με έναν πιεζοηλεκτρικό ενεργοποιητή. Το κρανίο εκτίθεται και καθαρίζεται. Μια ανοξείδωτη βίδα γείωσης προσαρτάται στο κρανίο. Για να στοχεύσουμε το t-hCO3, δημιουργήσαμε στερεοταξικές συντεταγμένες από εικόνες μαγνητικής τομογραφίας. Πραγματοποιήστε μια κυκλική κρανιοτομή (διαμέτρου περίπου 1 cm) με ένα τρυπάνι υψηλής ταχύτητας ακριβώς πάνω από το t-hCO3. Μόλις το οστό γίνει όσο το δυνατόν πιο λεπτό, αλλά πριν τρυπήσετε ολόκληρο το οστό, χρησιμοποιήστε λαβίδα για να αφαιρέσετε τον εναπομείναντα άθικτο πυελικό δίσκο για να αποκαλύψετε την υποκείμενη t-hCO3. Τα μεμονωμένα κύτταρα καταγράφηκαν χρησιμοποιώντας ανιχνευτές πυριτίου υψηλής πυκνότητας 32 ή 64 καναλιών (Cambridge Neurotech) γειωμένους σε βίδες γείωσης και προενισχυμένους με ενισχυτές RHD (Intan). Χρησιμοποιήστε τον χειριστή για να χαμηλώσετε τα ηλεκτρόδια στο σημείο-στόχο μέσω της κρανιοτομής, η οποία είναι γεμάτη με αποστειρωμένο φυσιολογικό ορό. Η συλλογή δεδομένων πραγματοποιήθηκε σε συχνότητα 30 kHz χρησιμοποιώντας το σύστημα συλλογής δεδομένων Open Ephys. Η καταγραφή συνεχίστηκε μόνο όταν ανιχνεύσαμε υψηλά συσχετισμένη ρυθμική αυθόρμητη δραστηριότητα σε περισσότερα από 10 κανάλια, γεγονός που υποδηλώνει ότι τα ηλεκτρόδια βρίσκονταν στο μόσχευμα (με βάση δεδομένα απεικόνισης ασβεστίου δύο φωτονίων). Λήφθηκε μια καταγραφή κινητικής δραστηριότητας σε φόντο 10 λεπτών. Τα μουστάκια στην αντίθετη πλευρά του t-hCO3 εκτράπηκαν στη συνέχεια 50 φορές (2 mm στα 20 Hz, 2 s ανά παρουσίαση) σε τυχαίους χρόνους από μια πιεζοηλεκτρική μονάδα σε μια περίοδο καταγραφής 20 λεπτών. Χρησιμοποιώντας το Πακέτο Υποστήριξης MATLAB για Arduino (MATLAB 2019b), ελέγξτε τον χρόνο εκτροπής με προσαρμοσμένο κώδικα MATLAB. Χρησιμοποιήστε παλμούς TTL για να συγχρονίσετε συμβάντα με λογισμικό συλλογής δεδομένων.
Για πειράματα οπτικής σήμανσης, ένα οπτικό καλώδιο διασύνδεσης 200 µm (Doric) συνδεδεμένο με ένα λέιζερ 473 nm (Omicron) συνδέθηκε με μια οπτική ίνα 200 µm τοποθετημένη πάνω από την κρανιοτομή. Αμέσως πριν από αυτό, ρυθμίστε την ισχύ του βραχυκυκλωτήρα στα 20 mW. Χρησιμοποιήστε τον χειριστή για να χαμηλώσετε τα ηλεκτρόδια στο σημείο-στόχο μέσω της κρανιοτομής, η οποία είναι γεμάτη με αποστειρωμένο φυσιολογικό ορό. Στην αρχή της καταγραφής, εκπέμφθηκαν δέκα παλμοί φωτός 473 nm (συχνότητα 2 Hz, διάρκεια παλμού 10 ms). Τα φωτοευαίσθητα κύτταρα ορίστηκαν ως τα κύτταρα που εμφάνισαν απόκριση αιχμής εντός 10 ms φωτός σε 70% ή περισσότερο των δοκιμών.