Mèsi paske ou te vizite Nature.com. W ap itilize yon vèsyon navigatè ki gen sipò CSS limite. Pou pi bon eksperyans lan, nou rekòmande pou ou itilize yon navigatè ki ajou (oswa dezaktive Mòd Konpatibilite nan Internet Explorer). Anplis de sa, pou asire sipò kontinyèl, nou montre sit la san estil ak JavaScript.
Montre yon karousel twa diapozitiv alafwa. Sèvi ak bouton Presedan ak Pwochen yo pou deplase nan twa diapozitiv alafwa, oubyen sèvi ak bouton kurseur yo nan fen an pou deplase nan twa diapozitiv alafwa.
Òganèl newòn ki oto-asanble yo reprezante yon platfòm in vitro pwomèt pou modèl devlopman ak maladi imen. Sepandan, òganoid yo manke konektivite ki egziste in vivo, ki limite matirite epi anpeche entegrasyon ak lòt sikui ki kontwole konpòtman. La a, nou montre ke òganoid kortikal ki sòti nan selil souch imen ki transplante nan korteks somatosansoryèl rat toutouni ki fèk fèt yo devlope kalite selil matirite ki entegre nan sikui sansoryèl ak motivasyon. IRM te revele kwasans òganoid apre transplantasyon nan plizyè liy selil souch ak bèt, pandan ke analiz yon sèl nwayo te revele pwogresyon kortikojènèz ak aparisyon yon pwogram transkripsyon ki depann de aktivite. Anfèt, newòn kortikal transplante yo montre pwopriyete mòfolojik, sinaptik ak manbràn entèn ki pi konplèks pase tokay in vitro yo, sa ki pèmèt deteksyon domaj newòn nan pasyan ki gen sendwòm Timote. Trasaj anatomik ak fonksyonèl te montre ke òganèl transplante yo resevwa entrain talamokortikal ak kortikokortikal, epi anrejistreman in vivo nan aktivite newòn sijere ke entrain sa yo ka jenere repons sansoryèl nan selil imen. Finalman, òganoid kortikal yo pwolonje aksòn nan tout sèvo rat la, epi aktivasyon optojenetik yo mennen nan konpòtman rechèch rekonpans. Konsa, newòn kòtèks imen ki transplante yo matirite epi patisipe nan sikui lame a ki kontwole konpòtman. Nou espere apwòch sa a fasilite deteksyon fenotip nivo fil nan selil ki sòti nan pasyan ke yo pa ka detekte pa lòt mwayen.
Devlopman sèvo imen an se yon pwosesis remakab ki òganize tèt li kote selil yo miltipliye, diferansye, imigre, epi konekte pou fòme sikui newòn fonksyonèl ki amelyore plis atravè eksperyans sansoryèl. Yon pwoblèm kle nan konprann devlopman sèvo imen an, sitou nan kontèks maladi, se mank aksè a tisi nan sèvo. Òganèl ki òganize tèt yo, tankou òganoid korteks imen an (hCO; ke yo rele tou esfè korteks imen an), ka jenere 2,3,4,5,6. Sepandan, plizyè limitasyon limite aplikasyon yo pi laj pou konprann devlopman ak fonksyònman sikui newòn yo. An patikilye, li pa klè si matirasyon hCO a limite pa absans sèten entrain mikwoanviwònman ak sansoryèl ki prezan in vivo. Anplis de sa, paske hCO yo pa entegre nan sikui ki ka jenere rezilta konpòtman, itilite yo nan modèl maladi newopsikyatrik jenetikman konplèks ak konpòtmantal limite kounye a.
Transplantasyon hCO nan yon sèvo vivan ki entak ka simonte limitasyon sa yo. Etid anvan yo te montre ke newòn imen ki transplante nan korteks wonjè yo kapab siviv, pwojte, epi kominike avèk selil wonjè7,8,9,10,11,12. Sepandan, eksperyans sa yo anjeneral fèt sou bèt adilt, sa ki ka limite entegrasyon sinaptik ak aksonal. La a, nou dekri yon paradigme transplantasyon kote nou te transplante 3D hCO ki sòti nan selil hiPS nan korteks somatosansoryèl prensipal (S1) rat ki gen sistèm iminitè defisyans nan yon etap bonè nan devlopman plastik. Newòn hCO (t-hCO) ki transplante yo sibi yon matirite sibstansyèl, resevwa entrain talamokortikal ak kortikal-kortikal ki pwovoke repons sansoryèl, epi pwolonje pwojeksyon aksonal nan sèvo rat la pou kondwi konpòtman rechèch rekonpans. Matirite pwolonje t-hCO te revele domaj newòn nan pasyan ki gen sendwòm Timote (TS), yon maladi jenetik grav ki koze pa mitasyon nan kanal kalsyòm CaV1.2 tip L sansib a vòltaj (kode pa CACNA1C).
Pou nou etidye newòn kortikal imen nan sikui in vivo, nou te transplante estereyotaksikman 3D hCO entak nan S1 rat atimik byen bonè apre akouchman (jou 3-7 apre akouchman) (Fig. 1a ak done elaji nan Fig. 1a-c). Nan pwen sa a, pwojeksyon aksonal talamokortikal ak kortikokortikal yo poko fin ranpli inèvasyon S1 yo (ref. 13). Kidonk, apwòch sa a fèt pou maksimize entegrasyon t-hCO pandan y ap minimize enpak sou sikui andojèn yo. Pou nou vizyalize kote t-hCO nan bèt vivan, nou te fè rekonstriksyon sèvo MRI T2-weighted nan rat 2-3 mwa apre transplantasyon an (Fig. 1b ak done elaji, Fig. 1d). Yo te obsève t-hCO3 fasilman epi mezi volim t-hCO3 yo te sanble ak sa yo ki kalkile apati tranch fiks yo (Done Pwolonje Fig. 1d,e; P > 0.05). Yo te obsève t-hCO3 fasilman epi mezi volim t-hCO3 yo te sanble ak sa yo ki kalkile apati tranch fiks yo (Done Pwolonje Fig. 1d,e; P > 0.05). t-hCO легко наблюдались, а объемные измерения t-hCO были аналогичны рассчитанным длеро фиксным длерения (расширенные данные, рис. 1d, e; P> 0,05). Yo te fasil pou obsève t-hCO3, epi mezi volimik t-hCO3 yo te sanble ak sa yo te kalkile pou seksyon fiks yo (done elaji, Fig. 1d, e; P > 0.05).很容易观察到t-hCO，并且t-hCO的体积测量值与从固定切片计算的测量值相似（扩展数据图1d、e；P > 0.05）很容易观察到t-hCO，并且t-hCO t-hCO легко наблюдался, а объемные измерения t-hCO были аналогичны рассчитанным для фиксернызово фиксе (расширенные данные, рис. 1d, e; P> 0,05). Yo te obsève t-hCO3 fasilman, epi mezi volimik t-hCO3 yo te sanble ak sa yo te kalkile pou seksyon fiks yo (done elaji, Fig. 1d, e; P > 0.05).Nou te detèmine t-hCO nan 81% nan bèt ki te sibi transplantasyon yo apeprè 2 mwa apre transplantasyon an (n = 72 bèt; hCO ki soti nan 10 liy selil hiPS; liy selil hiPS nan Tablo Siplemantè 1). Nan sa yo, 87% te sitiye nan korteks serebral la (Fig. 1c). Lè nou te fè eskanè MRI seri nan plizyè moman nan menm rat ki te sibi transplantasyon an, nou te jwenn yon ogmantasyon nèf fwa nan volim t-hCO nan lespas 3 mwa (Fig. 1d ak done elaji, Fig. 1f). Bèt ki te sibi transplantasyon yo te gen yon gwo pousantaj siviv (74%) nan 12 mwa apre transplantasyon an (done elaji, Fig. 1g ak Tablo Siplemantè 2), epi pa gen okenn pwoblèm motè oswa memwa evidan, gliyoz, oswa elektwoansefalogram (EEG) ki te jwenn. Done Fig. 1g ak tablo siplemantè 2). 1h–m ak 3e).
a, Scheme konsepsyon eksperimantal la. Yo te transplante hCO ki sòti nan selil hiPS nan S1 rat toutouni ki fèk fèt nan jou 30-60 diferansyasyon an. b, Imaj MRI koronal ak orizontal pondere T2 ki montre t-hCO nan S1 2 mwa apre transplantasyon an. Ba echèl, 2 mm. c, Kantifikasyon to siksè grefaj yo montre pou chak liy selil hiPS (n = 108, chif ki nan ba yo endike kantite t-hCO pou chak liy selil hIPS) ak kote kortikal oswa soukortikal (n = 88). d, Imaj MRI yon atè kowonè (agoch; ba echèl, 3 mm) ak rekonstriksyon volimèt 3D ki koresponn lan (ba echèl, 3 mm) ki montre yon ogmantasyon nan t-hCO sou 3 mwa. e, Revizyon modèl t-hCO nan korteks serebral rat. Ba echèl, 1 mm. f, Imaj imunositochimik reprezantatif t-hCO yo montre soti anwo agòch rive dwat (pandan diferansyasyon): PPP1R17 (4 mwa), NeuN (8 mwa), SOX9 ak GFAP (8 mwa), PDGFRα; (8 mwa), MAP2 (8 mwa) ak IBA1 (8 mwa). Ba echèl, 20 µm. Ko-ekspresyon HNA endike selil ki soti nan moun. g, snRNA-seq: Imaj rediksyon dimansyonalite manifold ak pwojeksyon inifye (UMAP) nan tout nwayo t-hCO kalite siperyè apre entegrasyon Seurat (n=3 echantiyon t-hCO, n=2 liy selil hiPS). Astwosit, selil liy astrosit la; cyc prog, pwogéniteur sikile; GluN DL, newòn glutamaterjik pwofon; GluN DL/SP, newòn glutamaterjik pwofon ak sublamelè; GluN UL, newòn glutamaterjik kouch siperyè; oligodendrosit, oligodendrosit; OPC, selil pwogéniteur oligodendrosit; RELN, newòn reelin. h, analiz anrichisman tèm Ontoloji Jenetik (GO) nan jèn ki te siyifikativman ogmante (P ajiste < 0.05, chanjman pli > 2, eksprime nan omwen 10% nan nwayo yo) nan newòn glutamaterjik t-hCO konpare ak newòn glutamaterjik hCO. h, analiz anrichisman tèm Ontoloji Jenetik (GO) nan jèn ki te siyifikativman ogmante (P ajiste < 0.05, chanjman pli > 2, eksprime nan omwen 10% nan nwayo yo) nan newòn glutamaterjik t-hCO konpare ak newòn glutamaterjik hCO. h, Анализ обогащения терминов Gene Ontology (GO) для генов со значительной активацией (скоррективацией (скоррективацией) изменения > 2, экспрессия по крайней мере в 10% ядер) в глутаматергических нейронах t-hCO по снира глутаматергическими нейронами hCO. h, analiz anrichisman tèm Ontoloji Jenetik (GO) pou jèn ki gen aktivasyon siyifikatif (P ajiste <0.05, chanjman pliye >2, ekspresyon nan omwen 10% nwayo) nan newòn glutamaterjik t-hCO konpare ak newòn glutamaterjik hCO. h，与hCO 谷氨酸能神经元相比，t-hCO 谷氨酸能神经元中基因显着上调（谎P整0.05，倍数变化> 2，在至少10% 的细胞核中表达）的基因本体论(GO) 术语富核中表达）的基因本体论(GO) 术语富核中表达 h ， 与 hco 谷氨酸 能 元 相比 ， t-hco 谷氨酸 能 神经 元 基因 显着 上调 ０ 名， ， ， ， ， ，变化 变化> 2 ， 至少 10% 的 核中 表达） 基因 基因 基因 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的的 的 的 的本体论(GO) 术语富集分析。 h, гены значительно активизировались (скорректированный P <0,05, кратность изменения> 2, эсреспия крайней мере в 10% ядер) в глутаматергических нейронах t-hCO по сравнению с глутаматергичамнескию hCO Онтологический (GO) анализ термина обогащения. h, jèn yo te siyifikativman ogmante (P ajiste < 0.05, chanjman pli > 2, eksprime nan omwen 10% nan nwayo) nan newòn glutamaterjik t-hCO konpare ak newòn glutamaterjik hCO Analiz ontolojik (GO) nan tèm anrichisman an.Liy pwentiye a endike valè aq 0.05. i, imaj UMAP kalite selil GluN nan t-hCO lè l sèvi avèk transfè etikèt ki soti nan yon seri done korteks motè granmoun referans 22 snRNA-seq. CT — selil kortikotalamik, ET — selil ekstraserebral, IT — selil telensefalik entèn, NP — pwojeksyon tou pre.
Apre sa, nou te evalye sitoachitekti a ak konpozisyon selilè jeneral t-hCO a. Kolorasyon antikò selil andotelyal rat yo te revele vaskilarizasyon ak t-hCO, alòske kolorasyon IBA1 te revele prezans mikwogli rat nan tout grèf la (Fig. 1f ak done elaji, Fig. 3c,d). Iminokolorizasyon te revele selil pozitif pou antijèn nikleyè imen (HNA) ki ko-eksprime PPP1R17 (pwogéniteur kortikal), NeuN (newòn), SOX9 ak GFAP (selil ki sòti nan glial) oswa PDGFRα (pwogéniteur oligodendrosit) (Figi 1f). Pou etidye konpozisyon selilè t-hCO a nan rezolisyon yon sèl selil, nou te fè sekans ARN yon sèl nwayo (snRNA-seq) apre apeprè 8 mwa diferansyasyon. Filtraj an mas ak retire nwayo rat yo te bay 21,500 kat mononikleyè imen kalite siperyè (Fig. 1g ak done elaji, Fig. 4a,b). Modèl ekspresyon makè tipik kalite selil yo te idantifye gwoup prensipal klas selil kortikal yo, tankou newòn glutamaterjik pwofon ak sifasyal, pwogéniteur sikile, oligodendrosit, ak liy astrosit (Fig. 1g, done elaji, Fig. 4c, ak Tablo Siplemantè 3). Iminokolorizasyon pou SATB2 ak CTIP2 te montre ke malgre prezans soutip kortikal yo, t-hCO pa t montre yon stratifikasyon anatomik klè (done elaji, Fig. 3a). hCO snRNA-seq ki matche ak etap yo te pwodui klas selil ki sanble anpil, ak kèk eksepsyon, tankou absans oligodendrosit ak prezans newòn GABAerjik, ki ka reflete kondisyon favorab in vitro ki te rapòte deja pou selil pwogéniteur lateral yo15 (done elaji, Fig. 4f – i ak Tablo Siplemantè 4). Analiz ekspresyon jèn diferansyèl la te revele diferans enpòtan nan newòn glutamaterjik ant t-hCO ak hCO (Tablo Siplemantè 5), ki gen ladan aktivasyon gwoup jèn ki asosye ak matirasyon newòn tankou siyal sinaptik, lokalizasyon dendritik, ak aktivite kanal vòltaj-depandan (Figi 1h ak Tablo Siplemantè 5). tablo 6). Kidonk, newòn glutamaterjik t-hCO kortikal yo te montre yon matirasyon transkripsyon akselere.
Pou nou te ka klarifye si chanjman transkripsyonèl sa yo nan t-hCO te gen rapò ak diferans mòfolojik ant hCO in vitro ak t-hCO in vivo, nou te rekonstwi hCO ak hCO ki ranpli ak biocytin ki koresponn ak etap yo nan seksyon egi apre 7-8 mwa diferansyasyon. Newòn hCO yo (Fig. 2a). Newòn t-hCO yo te siyifikativman pi gwo, yo te gen 1.5 fwa dyamèt soma a, de fwa plis dendrit, ak yon ogmantasyon sis fwa nan longè dendritik total konpare ak hCO in vitro (Fig. 2b). Anplis de sa, nou te obsève yon dansite pi gwo nan epin dendritik nan newòn t-hCO yo pase nan newòn hCO yo (Fig. 2c). Sa sijere ke newòn t-hCO yo sibi yon elongasyon ak branchman dendritik enpòtan, ki, an konbinezon ak pwoliferasyon selilè kontinyèl, ka kontribye nan kwasans entansif t-hCO apre transplantasyon (Fig. 1d ak Done Elaji Fig. 1f). Sa te pouse nou envestige pwopriyete elektwofizyolojik yo. Kapasitans manbràn nan te uit fwa pi wo (done elaji, Fig. 8d), potansyèl manbràn nan eta repo a te plis ipèpolarize (apeprè 20 mV), epi enjeksyon kouran an te pwovoke yon to eksitasyon maksimòm ki pi wo nan newòn t-hCO yo pase nan newòn hCO yo. in vitro (Fig. 2d), e), ki konsistan avèk karakteristik mòfolojik t-hCO ki pi gwo ak pi konplèks. Anplis de sa, frekans evènman kouran postsinaptik eksitatwa espontane (EPSC) te siyifikativman pi wo nan newòn t-hCO yo (Fig. 2f), sa ki sijere ke dansite ogmantasyon epin dendritik yo obsève nan newòn t-hCO yo te asosye avèk eksitabilite fonksyonèl. sinaps seksyèl. Nou te konfime karaktè imatur newòn hCO yo in vitro lè nou te anrejistre newòn glutamaterjik make yo (done elaji, Fig. 6a-c).
yon rekonstriksyon 3D newòn hCO ak t-hCO ki ranpli ak biocytin apre 8 mwa diferansyasyon. b, Kantifikasyon karakteristik mòfolojik yo (n = 8 newòn hCO, n = 6 newòn t-hCO; **P = 0.0084, *P = 0.0179 ak ***P < 0.0001). b, Kantifikasyon karakteristik mòfolojik yo (n = 8 newòn hCO, n = 6 newòn t-hCO; **P = 0.0084, *P = 0.0179 ak ***P < 0.0001). б, количественная оценка морфологических признаков (n = 8 нейронов hCO, n = 6 нейронка морфологических признаков) *** P <0,0001). b, kantifikasyon karakteristik mòfolojik yo (n=8 newòn hCO, n=6 newòn t-hCO; **P=0.0084, *P=0.0179, ak ***P<0.0001). b，形态学特征的量化（n = 8 个hCO 神经元，n = 6 个t-hCO 神经元；**P = 0.0084，*P = P = 0.01*** 90 0.0001). b，形态学特征的量化（n = 8 个hCO 神经元，n = 6 个t-hCO 神经元；**P = 0.0084，*P = P = 0.01*** 90 0.0001). б, количественная оценка морфологических признаков (n = 8 нейронов hCO, n = 6 нейронка морфологических признаков) *** P <0,0001). b, kantifikasyon karakteristik mòfolojik yo (n=8 newòn hCO, n=6 newòn t-hCO; **P=0.0084, *P=0.0179, ak ***P<0.0001).c, rekonstriksyon 3D branch dendritik hCO ak t-hCO apre 8 mwa diferansyasyon. Asterisk wouj yo endike epin dendritik swadizan yo. Kantifikasyon dansite epin dendritik (n = 8 newòn hCO, n = 6 newòn t-hCO; **P = 0.0092). d, Kantifikasyon potansyèl manbràn repo a (n = 25 newòn hCO, n = 16 newòn t-hCO; ***P < 0.0001). d, Kantifikasyon potansyèl manbràn repo a (n = 25 newòn hCO, n = 16 newòn t-hCO; ***P < 0.0001). d, количественная оценка мембранного потенциала покоя (n = 25 нейронов hCO, n = 16 нейронов t-hCO, 00*** P). d, kantifikasyon potansyèl manbràn repo (n = 25 newòn hCO, n = 16 newòn t-hCO; ***P < 0.0001). d，静息膜电位的量化（n = 25 hCO 神经元，n = 16 t-hCO 神经元；***P <0.0001）。 d，静息膜电位的量化（n = 25 hCO 神经元，n = 16 t-hCO 神经元；***P <0.0001）。 d, количественная оценка мембранного потенциала покоя (n = 25 нейронов hCO, n = 16 нейронов t-hCO, 00*** P). d, kantifikasyon potansyèl manbràn repo (n = 25 newòn hCO, n = 16 newòn t-hCO; ***P < 0.0001). e, Deklanchman potansyèl aksyon repetitif nan hCO3 ak t-hCO3 pwovoke pa ogmantasyon enjeksyon aktyèl, ak kantifikasyon to deklanchman maksimòm lan (n = 25 newòn hCO3, n = 16 newòn t-hCO3; ***P < 0.0001). e, Deklanchman potansyèl aksyon repetitif nan hCO3 ak t-hCO3 pwovoke pa ogmantasyon enjeksyon aktyèl, ak kantifikasyon to deklanchman maksimòm lan (n = 25 newòn hCO3, n = 16 newòn t-hCO3; ***P < 0.0001). e, повторное возбуждение потенциала действия в hCO и t-hCO, вызванное увеличением тока, и кнатолича максимальной скорости возбуждения (n = 25 нейронов hCO, n = 16 нейронов t-hCO; *** P <0,0001). e, potansyèl aksyon re-deklanche nan hCO3 ak t-hCO3 pwovoke pa ogmantasyon kouran ak kantifikasyon to maksimòm deklancheman (n = 25 newòn hCO3, n = 16 newòn t-hCO3; *** P < 0.0001). e，通过增加电流注入诱导的hCO 和t-hCO 重复动作电位放电，以及最大放电率率动作电位放电，以及最大放电大放电率率率动作电位放电个hCO 神经元，n = 16 个t-hCO 神经元；***P <0.0001）。 E ， 通过 增加 电流 注入 的 的 hco 和 t-hco 重复 电位 放电 ， 以及 最 大 及 大 及 （ （ 2 重 复个 hco 神经 ， n = 16 个 t-hco 神经 ； *** p <0.0001） 。 e, повторяющееся возбуждение потенциала действия hCO и t-hCO, вызванное увеличением подакач, и и подакач количественная оценка максимальной скорости возбуждения (n = 25 нейронов hCO, n = 16 нейронов hCO, n = 16 нейронов p-h0,00в ***0 e, repetisyon potansyèl aksyon hCO3 ak t-hCO3 pwovoke pa ogmantasyon ekipman pou kouran ak kantifikasyon to maksimòm dechaj (n = 25 newòn hCO3, n = 16 newòn t-hCO3; *** P < 0.0001). f, EPSC espontane (sEPSC) nan newòn hCO ak t-hCO nan 8 mwa diferansyasyon, ak kantifikasyon frekans evènman sinaptik yo (n = 25 newòn hCO, n = 17 newòn t-hCO; ***P < 0.0001). f, EPSC espontane (sEPSC) nan newòn hCO ak t-hCO nan 8 mwa diferansyasyon, ak kantifikasyon frekans evènman sinaptik yo (n = 25 newòn hCO, n = 17 newòn t-hCO; ***P < 0.0001). f, спонтанные EPSC (sEPSC) в нейронах hCO и t-hCO через 8 месяцев дифференцировки и количественая количествена количества синаптических событий (n = 25 нейронов hCO, n = 17 нейронов t-hCO; *** P <0,0001) . f, EPSC espontane (sEPSC) nan newòn hCO ak t-hCO nan 8 mwa diferansyasyon ak kantifikasyon to evènman sinaptik (n=25 newòn hCO, n=17 newòn t-hCO; ***P<0.0001). f，分化8 个月时hCO 和t-hCO 神经元中的自发性EPSCs (sEPSCs)，以及突触事件频率延频率元中的自发性EPSCs (sEPSCs)，以及突触事件频率延频率元中的自发性的5 hCO神经元，n = 17 t-hCO 神经元；***P <0.0001） . f，分化8 个月时hCO 和t-hCO 神经元中的自发性EPSCs (sEPSCs)，以及突触事件频率延频率元中的自发性EPSCs (sEPSCs)，以及突触事件频率延频率的5 hCO神率的量匼（n = 25 hCO 神率的量匼（n = 25hCO P <0.0001） . f, спонтанные EPSC (sEPSC) в нейронах hCO и t-hCO через 8 месяцев дифференцировки и количественая количествена количества синаптических событий (n = 25 нейронов hCO, n = 17 нейронов t-hCO; *** P <0,0001). f, EPSC espontane (sEPSC) nan newòn hCO ak t-hCO nan 8 mwa diferansyasyon ak kantifikasyon to evènman sinaptik (n = 25 newòn hCO, n = 17 newòn t-hCO; *** P<0.0001).Pou bf, hCO3 ak t-hCO3 nan liy 1208-2 yo te pran nan menm pakèt diferansyasyon an ki te kenbe an paralèl. g, Analiz anrichisman ansanm jèn (tès egzak Fisher yon sèl bò) nan jèn ki te siyifikativman ogmante (P ajiste < 0.05, chanjman pli > 2, eksprime nan omwen 10% nan nwayo yo) nan newòn glutamaterjik t-hCO konpare ak newòn glutamaterjik hCO ak ansanm jèn tou de jèn repons bonè (ERG) ak repons ta (LRG) ki depann de aktivite idantifye nan yon etid sourit in vivo16 ak LRG espesifik moun ki soti nan newòn in vitro17. g, Analiz anrichisman ansanm jèn (tès egzak Fisher yon sèl bò) nan jèn ki te siyifikativman ogmante (P ajiste < 0.05, chanjman pli > 2, eksprime nan omwen 10% nan nwayo yo) nan newòn glutamaterjik t-hCO konpare ak newòn glutamaterjik hCO ak ansanm jèn tou de jèn repons bonè (ERG) ak repons ta (LRG) ki depann de aktivite idantifye nan yon etid sourit in vivo16 ak LRG espesifik moun ki soti nan newòn in vitro17. g, анализ обогащения набора генов (односторонний точный критерий Фишера) генов со знатьчнитей (скорректированный P <0,05, кратность изменения > 2, экспрессия по меньшей мере в 10% ядетерь в гадетерь) нейронах t-hCO по сравнению с глутаматергическими нейронами hCO наборы генов как раннего (ERG), так и позднего (LRG) генов, зависящих от активности, идентифицированнысфицированнысх в ваннысх в возднего (LRG) мышах in vivo16, и специфических для человека LRG из нейронов in vitro17. g, analiz anrichisman ansanm jèn (tès egzak Fisher yon sèl ke) nan jèn ki gen aktivasyon siyifikatif (P<0.05 ajiste, chanjman pliye >2, ekspresyon nan omwen 10% nan nwayo) nan newòn glutamaterjik t-hCO konpare ak ansanm newòn glutamaterjik hCO ki gen jèn ki depann de aktivite bonè (ERG) ak ta (LRG) idantifye nan sourit in vivo16 ak LRG espesifik pou moun ki soti nan newòn in vitro17. g，t-hCO谷氨酸能神经元与hCO谷氨酸能神经元相比，t -hCO谷氨酸能神经元显着上调（调整后P<0.05，倍数变化>2，在至少10%的细胞核中表达）的基因集富集分析（单侧F isher精确检验）从体内小鼠研究中鉴定的早期反应(ERG)和晚期反应(LRG) 活性依赖性基因的基因组16 和体外神经元17 中的人类特异悀牧LRG。 g ， t-hco 谷氨酸 神经 元 与 hco 谷氨酸 神经 元 相比 ， t-hco 谷氨酸 神经 元 神经 元 临 元 比<0.05 ， 倍数> 2 ， 至少 至少 10%的 细胞 核中 表达） 的 集富集 分析 （分析 （分析 （分析 （单（单）体内 小鼠 研究 中 的 早期 反应 反应 反应 和 晚期 反应 反应 (lrg) 活性 基因 的 基因组 16 因组 反应 反应 (lrg) 活性 基因 的 基因组 16 因组 16 和 煞 神 17中 中 17 中 17的人类特异性LRG。 g, глутаматергические нейроны t-hCO были значительно активизированы по сравнению с глутамю с глутамч нейронами hCO (скорректированный P<0,05, кратность изменения> 2, не менее 10% Анализ обогаще ниогаь изменения> 2, не менее 10% (односторонний точный тест Фишера) раннего ответа (ERG) и позднего гены, зависящие от активности ответа (LRG), идентифицированные в исследованиях на мышах in vivo16 и нейронах in vitro17. LRG, специфичные для человека. g, newòn glutamaterjik t-hCO yo te siyifikativman ogmante konpare ak newòn glutamaterjik hCO yo (P ajiste <0.05, chanjman pli >2, omwen 10% Analiz anrichisman jèn repons bonè (ERG) ak repons ta (tès egzak Fisher yon sèl ke) jèn depandan aktivite repons (LRG) idantifye nan sourit in vivo16 ak newòn in vitro.17 LRG espesifik pou moun.Liy pwentiye a endike yon valè P korije pa Bonferroni ki egal a 0.05. h, ekspresyon jèn GluN (pseudo-pake ak gradyasyon chak jèn) te siyifikativman ogmante nan replik snRNA-seq jèn LRG nan newòn glutamaterjik t-hCO yo. i, imunokolorasyon ki montre ekspresyon SCG2 nan newòn t-hCO (anwo) ak hCO (anba). Flèch blan yo montre selil SCG2+ yo. Ba echèl, 25 µm. Done yo eksprime kòm mwayèn ± devyasyon estanda.
Baze sou ogmantasyon aktivite t-hCO ki obsève nan tranch ex vivo yo, snRNA-seq te revele yon ogmantasyon ki depann de aktivite nan transkripsyon jèn nan t-hCO konpare ak hCO in vitro. Newòn glutamaterjik t-hCO yo te eksprime pi gwo nivo jèn ki reglemante aktivite repons anreta (Fig. 2g,h), ki te jwenn nan etid anvan yo nan newòn sourit ak imen16,17. Pa egzanp, BDNF18, SCG2, ak OSTN, yon jèn ki reglemante aktivite espesifik nan primat, te montre yon ekspresyon ogmante nan newòn t-hCO konpare ak newòn hCO (Fig. 2g-i). Kidonk, newòn t-hCO yo te montre karakteristik matirite amelyore konpare ak newòn hCO pa analiz transkripsyonèl, mòfolojik, ak fonksyonèl.
Pou evalye pi lwen asosyasyon matirasyon t-hCO ak devlopman sèvo imen an, nou te fè konparezon transkriptomik kalite selil kortikal fetis ak adilt19,20 ak adilt21,22 ansanm ak done vaste sou ekspresyon jèn kortikal23 pandan devlopman (done elaji, Fig. 5). ). avèk travay anvan 24 , estati matirasyon transkriptòm hCO ak t-hCO mondyal la nan 7-8 mwa diferansyasyon an lajman konsistan avèk tan devlopman in vivo epi li pi ekivalan a fen lavi fetis la (Done Elaji Fig. 5a). Li enpòtan pou note ke nou te obsève yon ogmantasyon nan matirite transkriptòm nan t-hCO konpare ak hCO ki koresponn ak laj, ansanm ak aktivasyon transkriptòm ki asosye avèk sinaptojènèz, astrojènèz, ak myelinizasyon (done elaji, Fig. 5b-d). Nan nivo selilè a, nou te jwenn prèv yon soutip korteks ki pi mens nan t-hCO, ak gwoup newòn glutamaterjik ki sipèpoze ak soutip newòn adilt L2/3, L5, ak L6 (Figi 1i). Okontrè, sipèpoze gwoup ant newòn glutamaterjik t-hCO yo ak newòn kortikal fetis la te pi limite nan mitan gwosès la (done elaji, Figi 5e-j). Pou detèmine si newòn t-hCO yo fonksyonèlman sanble ak newòn neokortikal imen apre akouchman, nou te fè anrejistreman elektwofizyolojik ak rekonstriksyon anatomik newòn piramidal L2/3 imen nan seksyon byen file nan korteks imen apre akouchman an (done elaji, Fig. 7a). Pwopriyete elektwofizyolojik newòn piramidal L2/3 yo te sanble ak sa yo ki nan newòn piramidal t-hCO yo (done elaji, Fig. 7e). Mòfolojikman, newòn L2/3 ki soti nan echantiyon imen apre akouchman yo te pi sanble ak t-hCO pase ak hCO, byenke selil L2/3 yo te pi long, yo te gen plis branch an jeneral, epi yo te gen yon dansite kolòn vètebral ki pi wo (Fig. 3g ak done elaji, Fig. 7b-). G).
a, transplantasyon hCO ki pwodui pa liy selil kontwòl ak TS hiPS nan rat ki fèk fèt. b, rekonstriksyon 3D newòn t-hCO ki ranpli ak byositin apre 8 mwa diferansyasyon. c, kantifikasyon longè dendritik mwayèn (n = 19 newòn kontwòl, n = 21 newòn TS; **P = 0.0041). d, branch dendritik rekonstwi 3D soti nan kontwòl ak TS t-hCO nan 8 mwa diferansyasyon, ak kantifikasyon dansite epinyè dendritik (n = 16 newòn kontwòl, n = 21 newòn TS, ***P < 0.0001). d, branch dendritik rekonstwi 3D soti nan kontwòl ak TS t-hCO nan 8 mwa diferansyasyon, ak kantifikasyon dansite epinyè dendritik (n = 16 newòn kontwòl, n = 21 newòn TS, ***P < 0.0001). d, 3D-реконструкция дендритных ветвей из контроля и TS t-hCO через 8 месяцев диффференцев дифференцча всколинциро всколих оценка плотности дендритных шипов (n = 16 контрольных нейронов, n = 21 TS нейронов, *** P <0,0001). d, rekonstriksyon 3D branch dendritik yo soti nan kontwòl ak t-hCO TS nan 8 mwa diferansyasyon ak kantifikasyon dansite epinyè dendritik (n = 16 newòn kontwòl, n = 21 newòn TS, ***P < 0.0001). d，分化8 个月时对照和TS t-hCO 的3D 重建树突分支，以及树突棘密度的量化 = 1（n6个对照神经元，n = 21 个TS 神经元，***P <0.0001）。 d ， 分化 8 个 时 对照 和 ts t-hco 的 3d 重建 分支 分支 以及 树突棘 密度 密度 密度 重建   分支神经 元 ， n = 21 个 ts 神经 ， *** p <0.0001 ）。 d, 3D-реконструкция дендритных ветвей контроля и TS t-hCO через 8 месяцев дифференцирововей контроля инцировки нировез оценка плотности дендритных шипов (n = 16 контрольных нейронов, n = 21 TS нейронов, *** P <0,0001). d, rekonstriksyon 3D branch dendritik kontwòl yo ak TS t-hCO a 8 mwa diferansyasyon ak kantifikasyon dansite epinyè dendritik la (n=16 newòn kontwòl, n=21 newòn TS, ***P<0.0001).Asterisk wouj yo endike epin dendritik swadizan. e, EPSC espontane nan newòn kontwòl ak TS t-hCO apre 8 mwa diferansyasyon. f, graf frekans kimilatif ak kantifikasyon frekans ak anplitid evènman sinaptik yo (n=32 newòn kontwòl, n=26 newòn TS; **P=0.0076 ak P=0.8102). g, analiz Scholl sou newòn TS ak kontwòl nan hCO ak t-hCO. Liy tire yo montre newòn piramidal postnatal L2/3 imen pou konparezon (n = 24 newòn kontwòl t-hCO, n = 21 newòn TS t-hCO, n = 8 newòn kontwòl hCO, ak n = 7 newòn TS hCO). Done yo eksprime kòm mwayèn ± devyasyon estanda.
Kapasite t-hCO pou replike karakteristik mòfolojik ak fonksyonèl newòn kòtèks imen yo nan yon nivo segondè te pouse nou chèche konnen si t-hCO te kapab itilize pou detekte fenotip maladi yo. Nou te konsantre sou TS, yon maladi newodevlopman grav ki koze pa mitasyon gain-of-function nan jèn ki kode CaV1.2 la, ki inisye transkripsyon jèn ki depann de aktivite nan newòn yo. Nou te jwenn hCO nan men twa pasyan TS ki pote sibstitisyon ki pi komen an (p.G406R) ak twa temwen (Fig. 3a). Apre transplantasyon an, nou te jwenn ke mòfoloji dendritik la te chanje nan newòn TS yo konpare ak temwen yo (Fig. 3b ak done elaji, Fig. 8a,b), ak yon ogmantasyon de fwa nan kantite dendrit prensipal yo ak yon ogmantasyon jeneral nan diminisyon mwayèn ak jeneral nan longè dendritik (Fig. 3c ak done elaji, Fig. 8c). Sa te asosye avèk yon ogmantasyon nan dansite epin yo ak yon ogmantasyon nan frekans EPSC espontane nan TS konpare ak newòn temwen yo (Fig. 3d-f ak done elaji, Fig. 8g). Pli lwen analiz te revele modèl branchman dendritik anòmal nan t-hCO TS konpare ak kontwòl yo, men pa nan TS hCO in vitro nan yon etap diferansyasyon menm jan an (Fig. 3g). Sa a konsistan avèk rapò anvan nou yo sou kontraksyon dendritik depandan de aktivite nan TS epi li mete aksan sou kapasite platfòm transplantasyon sa a pou detekte fenotip maladi in vivo.
Apre sa, nou te mande nan ki pwen selil t-hCO yo entegre fonksyonèlman nan rat S1. Nan wonjè, S1 resevwa gwo enfliyans sinaptik ki soti nan nwayo bazal ventral ipsilateral ak talamik posterior yo, ansanm ak korteks motè ipsilateral ak somatosansoryèl segondè yo, ak S1 kontralateral la (Fig. 4a). Pou retabli modèl inèvasyon an, nou te enfekte hCO ak viris laraj-dG-GFP/AAV-G epi nou te transplante hCO nan rat S1 3 jou apre. Nou te obsève yon ekspresyon GFP dans nan newòn S1 ipsilateral yo ak gangliyon bazal ventral yo 7-14 jou apre transplantasyon an (Fig. 4b, c). Anplis de sa, koloran antikò makè talamik netrin G1 la te revele prezans tèminasyon talamik nan t-hCO (Fig. 4d, e). Pou evalye si pwojeksyon aferans sa yo te kapab pwovoke repons sinaptik nan selil t-hCO, nou te fè anrejistreman selil antye ki soti nan selil imen nan seksyon byen file nan kouch talamokortikal la. Stimilasyon elektrik S1 rat la, kapsil entèn lan, sibstans blan an, fib toupre t-hCO a oswa aktivasyon optojenetik tèminasyon talamik ki eksprime opsin nan EPSC kout latans pwovoke pa t-hCO nan newòn t-hCO ki ekspoze a antagonis reseptè AMPA NBQX la. (Fig. 4f, g ak done pwolonje, Fig. 9a-g). Done sa yo demontre ke t-hCO entegre anatomikman nan sèvo rat la epi li kapab aktive pa tisi lame rat la.
a, Dyagram eskematik yon eksperyans swiv raj. b, Ekspresyon GFP ak STEM121 espesifik pou moun ant t-hCO ak kòtèks serebral rat (panèl anwo). Yo montre tou ekspresyon GFP nan nwayo bazal ventral ipsilateral rat (VB) (anba agòch) ak S1 ipsilateral (anba adwat). Ba echèl, 50 µm. Kare wouj yo reprezante zòn nan sèvo a kote yo te pran imaj yo. c, kantifikasyon selil ki eksprime GFP (n = 4 rat). d, e — Tèminal talamik Netrin G1+ nan t-hCO. d montre yon seksyon koronal ki gen nwayo t-hCO ak VB. Ba echèl, 2 mm. e montre ekspresyon Netrin G1 ak STEM121 nan newòn t-hCO (agòch) ak VB (adwat). Ba echèl, 50 µm. Liy pwen zoranj lan endike fwontyè t-hCO a. f, g, Tras aktyèl newòn t-hCO yo apre estimilasyon elektrik nan rat S1 (f) oswa kapsil entèn (g), avèk (vyolèt) oswa san (nwa) NBQX (agoch). Anplitid EPSC avèk ak san NBQX (n = 6 newòn S1, *P = 0.0119; ak n = 6 newòn kapsil entèn, **P = 0.0022) (sant). Pousantaj newòn t-hCO ki montre EPSC an repons a estimilasyon elektrik nan rat S1 (f) oswa kapsil entèn (g) (adwat). aCSF, likid sefalorakinyèl atifisyèl. h, dyagram eskematik eksperyans imaj 2P a (agoch). Ekspresyon GCaMP6s nan t-hCO (mitan). Ba echèl, 100 µm. Interval tan fliyoresans GCaMP6s (adwat). i, Z-nòt fliyoresans aktivite espontane. j, ilistrasyon eskematik estimilasyon moustach. k, trajektwa fliyoresans 2P ki gen nòt z nan yon sèl esè, aliyen ak devyasyon moustach nan moman zewo (liy tire) nan selil egzanp yo. l, repons nòt z mwayèn popilasyon tout selil yo ki aliyen ak devyasyon moustach nan moman zewo (liy tire) (wouj) oswa timestamps ki pwodui owaza (gri). m. Dyagram eskematik eksperyans lan sou make optik. n, Koub vòltaj brit ki soti nan yon selil egzanp t-hCO pandan eksitasyon lazè ble oswa devyasyon moustach. Flèch wouj yo endike premye pik yo ki te koze pa limyè (anwo) oswa ki te koze pa devyasyon moustach (anba). Lonbraj gri endike peryòd devyasyon moustach. o, Fòm ond limyè pik ak repons devyasyon moustach. p, pik yon sèl tantativ, aliyen ak devyasyon moustach yo nan selil egzanp lan. 0 endike devyasyon moustach (liy tire). q, to ​​tire z mwayèn popilasyon pou tout selil fotosansib, aliyen ak devyasyon moustach nan moman zewo (liy tire) (wouj) oswa timestamps ki pwodui owaza (gri). r, Pwopòsyon inite fotosansib ki siyifikativman module pa devyasyon moustach (n = 3 rat) (agoch). Latans pik z-score (n = 3 rat; n = 5 (vèt klè), n = 4 (vèt fonse), ak n = 4 (syan) inite modilasyon devyasyon moustach pou chak rat) (adwat). Done yo eksprime kòm mwayèn ± devyasyon estanda.
Apre sa, nou te mande si t-hCO te kapab aktive pa stimuli sansoryèl in vivo. Nou te transplante hCO ki eksprime endikatè kalsyòm jenetikman kode GCaMP6 nan rat S1. Apre 150 jou, nou te fè fotometri fib oswa imaj kalsyòm de foton (Fig. 4h ak done elaji, Fig. 10a). Nou te jwenn ke selil t-hCO yo te montre aktivite ritmik senkronize (Figi 4i, Done elaji, Figi 10b ak Videyo Siplemantè 1). Pou karakterize aktivite pik t-hCO a, nou te fè anrejistreman elektwofizyolojik ekstraselilè nan rat transplantasyon anestezye (done elaji, Fig. 10c-f). Nou te pwodui kowòdone estereyotaksik apati imaj IRM; kidonk, inite anrejistre sa yo reprezante swadizan newòn imen, byenke elektwofizyoloji poukont li pa pèmèt detèmine yon espès orijin. Nou te obsève eksplozyon aktivite senkronize (done elaji, Fig. 10d). Rafal yo te dire anviwon 460 ms epi yo te separe pa peryòd silans anviwon 2 s (done elaji, Fig. 10d, e). Chak inite te tire an mwayèn anviwon twa bal pa rafal, ki se apeprè 73% nan inite ki anrejistre pa rafal. Aktivite inite endividyèl yo te trè korele, epi korelasyon sa yo te pi wo pase sa yo ki nan inite idantifye nan bèt ki pa pran vaksen ki anrejistre nan menm kondisyon yo (done elaji, Fig. 10f). Pou nou karakterize pi byen repons pik newòn ki sòti nan moun idantifye yo, nou te fè eksperyans make limyè sou rat anestezye ki te grefe ak hCO ki eksprime kanal kasyon sansib a limyè rodopsin 2 (hChR2), kote newòn t-hCO yo pase pou rekonèt yon ti latans (mwens pase 10 ms) an repons a stimuli limyè ble (Fig. 4m–o). Newòn t-hCO yo te montre aktivite espontane rapid nan frekans menm jan ak sa yo obsève nan imaj kalsyòm, osi byen ke anrejistreman elektwofizyolojik ki fèt nan t-hCO san mak limyè (done elaji, Fig. 10c-g). Pa gen okenn aktivite espontane ki te obsève nan etap korespondan hCO ki anrejistre in vitro. Pou evalye si t-hCO te kapab aktive pa stimuli sansoryèl, nou te devye moustach rat yo yon ti tan lwen t-hCO (Fig. 4j,m ak done elaji, Fig. 10h,k). Dapre etid anvan yo8,10, yon sou-gwoup selil t-hCO te montre yon ogmantasyon nan aktivite an repons a devyasyon moustach, ki pa te obsève lè done yo te konpare ak dat ak lè o aza (Fig. 4k-q ak done elaji, Fig. 10h-q). Anfèt, anviwon 54% nan inite endividyèl ki make ak opto yo te montre yon to eksitasyon ki ogmante anpil apre estimilasyon moustach, ki te rive nan pik nan anviwon 650 ms (Fig. 4r). Lè nou pran done sa yo ansanm, yo sijere ke t-hCO resevwa entrain fonksyonèl apwopriye epi li ka aktive pa stimuli anviwònman an.
Apre sa, nou te envestige si t-hCO te kapab aktive sikui nan rat pou kontwole konpòtman. Nou te premye envestige si akson newòn t-hCO yo pwojte nan tisi ki antoure rat la. Nou te enfekte hCO ak yon lentivirus ki kode hChR2 ki fizyone ak EYFP (hChR2-EYFP). Apre 110 jou, nou te obsève ekspresyon EYFP nan rejyon kortikal ipsilateral yo, ki gen ladan kortikal oditoryèl, motè ak somatosansoryèl yo, ansanm ak nan rejyon soukortikal yo, ki gen ladan striatòm, ipokanp ak talamus (Fig. 5a). Pou evalye si pwojeksyon eferan sa yo te kapab pwovoke repons sinaptik nan selil rat yo, nou te aktive optikman selil t-hCO ki eksprime hChR2-EYFP lè nou te anrejistre selil korteks serebral rat nan seksyon byen file nan sèvo a. Aktivasyon akson t-hCO ak limyè ble te pwovoke EPSC kout latans nan newòn korteks piramidal rat yo, ki te bloke pa NBQX (Fig. 5b-g). Anplis de sa, repons sa yo te kapab bloke pa tetrodotoksin (TTX) epi retabli pa 4-aminopiridin (4-AP), sa ki sijere ke yo te koze pa koneksyon monosinaptik (Fig. 5e).
a, Dyagram eskematik swivi akson (agoch). Ekspresyon t-hCO EYFP (adwat). Ba echèl, 100 µm. A1, korteks oditif, ACC, korteks singilè anterior, d. striatum, striatum dorsal, HPC, ipokanp; Dyafram, septòm lateral, mPFC, korteks prefrontal medyal, piri, korteks pirifòm, v. striatum, striatum ventral, VPM, nwayo ventropostomedial talamus la, VTA, rejyon tegmental ventral. Kare wouj yo reprezante zòn nan sèvo a kote imaj yo te pran. b, Dyagram eskematik eksperyans estimilasyon an. c, d, Egzanp repons fotokouran pwovoke pa limyè ble (anwo) ak vòltaj (anba) nan selil imen (c) EYFP+ t-hCO oswa rat (d) EYFP-. e, f, Tras aktyèl newòn rat apre estimilasyon limyè ble nan akson t-hCO avèk TTX ak 4-AR (vèt), TTX (gri) oswa aCSF (nwa) (e), avèk (vyolèt) oswa san (nwa)) ) NBQX (e). g, latans repons pwovoke pa limyè ble nan selil rat (n = 16 selil); ba orizontal yo endike latans mwayèn (7.13 ms) (agoch). Anplitid EPSC ki pwovoke pa limyè yo anrejistre avèk oswa san NBQX (n = 7 selil; ***P < 0.0001) (mitan). Anplitid EPSC ki pwovoke pa limyè yo anrejistre avèk oswa san NBQX (n = 7 selil; ***P < 0.0001) (mitan). Амплитуда вызванных светом EPSC, зарегистрированных с или без NBQX (n = 7 клеток; ***P <0,0001) (в трецен). Anplitid EPSC pwovoke pa limyè ki anrejistre avèk oswa san NBQX (n = 7 selil; ***P < 0.0001) (sant).使用或不使用NBQX 记录的光诱发EPSC 的振幅（n = 7 个细胞；***P < 0.0001）（中）。使用或不使用NBQX 记录的光诱发EPSC 的振幅（n = 7 个细胞；***P < 0.0001）（中）。 Амплитуда вызванных светом EPSC, зарегистрированных с или без NBQX (n = 7 клеток; ***P <0,0001) (в трецен). Anplitid EPSC pwovoke pa limyè ki anrejistre avèk oswa san NBQX (n = 7 selil; ***P < 0.0001) (sant).Pousantaj selil rat ki montre EPSC ki reyaji a limyè ble (adwat). h, Dyagram eskematik yon travay konpòtmantal. d0, jou 0. i. Pèfòmans bèt egzanplè nan jou 1 (agoch) oswa jou 15 (adwat) nan antrènman an. Mwayèn kantite niche ki te fèt nan premye jou a (agoch) oswa nan 15yèm jou a (adwat nan mitan) (n = 150 esè ak limyè ble, n = 150 esè ak limyè wouj; ***P < 0.0001). Mwayèn kantite niche ki te fèt nan premye jou a (agoch) oswa nan 15yèm jou a (adwat nan mitan) (n = 150 esè ak limyè ble, n = 150 esè ak limyè wouj; ***P < 0.0001). Среднее количество облизываний, выполненных в день 1 (слева) или день 15 (в центре сполненных в день 15 (в центре спра 150) синим светом, n = 150 испытаний с красным светом ***P <0,0001). Mwayèn kantite fwa yo te niche yon moun nan premye jou a (agoch) oubyen nan 15yèm jou a (sant adwat) (n = 150 esè ak limyè ble, n = 150 esè ak limyè wouj; ***P < 0.0001).第1 天（左）或第15 天（右中）执行的平均舔次数（n = 150 次蓝光试验（n = 150次红光试验；***P <0.0001）。第1 天（左）或第15 天（右中）执行的平均舔次数（n = 150 次蓝光试验（n = 150次红光试验；***P < 0.001 Среднее количество облизываний, выполненных в день 1 (слева) или день 15 (в центре сполненных в день 15 (в центре спра 150) синим светом, n = 150 испытаний с красным светом ***P <0,0001). Mwayèn kantite fwa yo te niche yon moun nan premye jou a (agoch) oubyen nan 15yèm jou a (sant adwat) (n = 150 esè ak limyè ble, n = 150 esè ak limyè wouj; ***P < 0.0001).Kou kimilatif pou esè limyè wouj ak ble nan jou 1 (sant agòch) oswa jou 15 (adwat). NS, pa siyifikatif. j,k, Karakteristik konpòtman tout bèt yo te transplante ak t-hCO ki eksprime hChR2-EYFP (j) oswa fluorofò kontwòl (k) nan jou 1 oswa 15 (hChR2-EYFP: n = 9 rat, ** P = 0.0049; kontwòl: n = 9, P = 0.1497). l, Evolisyon nòt preferans lan (n = 9 hChR2, n = 9 kontwòl; **P < 0.001, ***P < 0.0001). l, Evolisyon nòt preferans lan (n = 9 hChR2, n = 9 kontwòl; **P < 0.001, ***P < 0.0001). l, Эволюция показателя предпочтения (n = 9 hChR2, n = 9 контрольных; **P <0,001, ***P <0,0001). l, Evolisyon nòt preferans lan (n = 9 hChR2, n = 9 kontwòl; **P < 0.001, ***P < 0.0001). l，偏好评分的演变（n = 9 hChR2，n = 9 对照；**P <0.001，***P <0.0001）。 l，偏好评分的演变（n = 9 hChR2，n = 9 对照；**P <0.001，***P <0.0001）。 l, Эволюция показателей предпочтения (n = 9 hChR2, n = 9 контролей; **P <0,001, ***P <0,0001). l, Evolisyon nòt preferans yo (n = 9 hChR2, n = 9 kontwòl; **P < 0.001, ***P < 0.0001).m, ekspresyon FOS an repons a aktivasyon optojenetik t-hCO nan S1. Imaj ekspresyon FOS (agoch), ak kantifikasyon (n = 3 pa gwoup; *P < 0.05, **P < 0.01 ak ***P < 0.001) (adwat) yo montre. Imaj ekspresyon FOS (agoch), ak kantifikasyon (n = 3 pa gwoup; *P < 0.05, **P < 0.01 ak ***P < 0.001) (adwat) yo montre. Показаны изображения экспрессии FOS (слева) и количественного определения (n = 3 на группу;, * P *** <0,0 5, ** P <0,0 ; <0,001) (справа). Imaj ekspresyon FOS yo (agoch) ak kantifikasyon (n = 3 pa gwoup; *P<0.05, **P<0.01, ak ***P<0.001) yo montre (adwat).显示了FOS 表达（左）和量化（每组n = 3；*P < 0.05、**P < 0.01 和***P < 0.001））叄右）显示了FOS 表达（左）和量化（每组n = 3；*P < 0.05、**P < 0.01 和***P < 0.001））叄右） Показаны изображения экспрессии FOS (слева) и количественного определения (n = 3 на группу;, * P *** <0,0 5, ** P <0,0 ; <0,001) (справа). Imaj ekspresyon FOS yo (agoch) ak kantifikasyon (n = 3 pa gwoup; *P<0.05, **P<0.01, ak ***P<0.001) yo montre (adwat).Ba echèl, 100 µm. Done yo eksprime kòm mwayèn ± erè estanda nan BLA, amigdal bazolateral, MDT, nwayo talamik dorsomedial, PAG, gri periakediktal.
Finalman, nou te mande si t-hCO te kapab modifye konpòtman rat yo. Pou teste sa, nou te transplante hCO ki eksprime hChR2-EYFP nan S1, epi 90 jou apre, nou te enplante fib optik nan t-hCO pou delivre limyè. Apre sa, nou te antrene rat yo ak yon paradigme kondisyònman operan modifye (Fig. 5h). Nou te mete bèt yo nan yon chanm tès konpòtman epi nou te aplike owaza estimilis lazè ble (473 nm) ak wouj (635 nm) pandan 5 segonn. Bèt yo te resevwa yon rekonpans dlo si yo te niche pandan estimilis limyè ble men yo pa t niche pandan estimilis limyè wouj. Nan premye jou fòmasyon an, bèt yo pa t montre okenn diferans nan niche lè yo te estimile ak limyè ble oswa wouj. Sepandan, nan jou 15 la, bèt ki te transplante ak hCO ki eksprime hChR2-EYFP te montre yon niche pi aktif lè yo te estimile ak limyè ble konpare ak estimilis limyè wouj. Chanjman sa yo nan konpòtman niche pa te obsève nan bèt kontwòl yo te transplante ak hCO ki eksprime fluorofò kontwòl la (pousantaj siksè aprantisaj: hChR2 89%, EYFP 0%, Figi 5i-1 ak Videyo Siplemantè 2). Done sa yo sijere ke selil t-hCO yo ka aktive newòn rat pou ankouraje konpòtman rechèch rekonpans. Pou chèche konnen ki sikwi newòn t-hCO rat ki ta ka enplike nan chanjman konpòtman sa yo, nou te aktive t-hCO optojenetikman nan bèt ki antrene epi nou te rekòlte tisi 90 minit apre. Iminoistochimik te revele ekspresyon pwoteyin FOS ki depann de aktivite a nan plizyè rejyon nan sèvo ki enplike nan konpòtman motive, tankou korteks prefrontal medyal la, talamus medyal la, ak matyè gri periakediktal la, ki te eksprime swa nan bèt kontwòl ki pa te stimule oswa nan bèt yo. diri. 5m). Lè nou mete tout ansanm, done sa yo sijere ke t-hCO ka module aktivite newòn rat pou kondwi konpòtman.
Organoid newronal yo reprezante yon sistèm pwomèt pou etidye devlopman ak maladi imen in vitro, men yo limite pa mank koneksyon ant sikui ki egziste in vivo. Nou te devlope yon nouvo platfòm kote nou te transplante hCO nan S1 nan rat ki gen sistèm iminitè febli nan kòmansman peryòd apre akouchman an pou etidye devlopman ak fonksyon selil imen in vivo. Nou te montre ke t-hCO devlope kalite selil matirite yo pa obsève in vitro28 epi ke t-hCO entegre anatomikman ak fonksyonèlman nan sèvo wonjè a. Entegrasyon t-hCO nan sikui newronal wonjè yo te pèmèt nou etabli yon lyen ant aktivite selilè imen ak konpòtman bèt yo te etidye, sa ki montre ke newòn t-hCO yo ka module aktivite newronal rat pou kondwi repons konpòtmantal yo.
Platfòm nou dekri a gen plizyè avantaj parapò ak rechèch anvan yo sou transplantasyon selil imen nan sèvo wonjè. Premyèman, nou te transplante hCO3 nan korteks rat ki an devlopman nan kòmansman peryòd apre akouchman an, sa ki ka fasilite entegrasyon anatomik ak fonksyonèl. Dezyèmman, siveyans IRM t-hCO3 a te pèmèt nou etidye pozisyon grèf ak kwasans nan bèt vivan, sa ki pèmèt nou fè etid alontèm sou plizyè bèt epi etabli fyab plizyè liy selil hiPS. Finalman, nou te transplante organoyid entak, olye de sispansyon selil endividyèl izole, ki mwens destriktif pou selil imen yo epi ki ka ankouraje entegrasyon ak jenerasyon newòn korteks imen nan sèvo rat.
Nou rekonèt ke malgre pwogrè nan platfòm sa a, kontrent tanporèl, espasyal, ak kwa-espès yo anpeche fòmasyon sikui newronal imen ak gwo fidelite, menm apre transplantasyon nan yon etap bonè nan devlopman. Pa egzanp, li pa klè si aktivite espontane obsève nan t-hCO a reprezante yon fenotip devlopman menm jan ak aktivite ritmik obsève pandan devlopman kortikal la, oswa si li akòz absans kalite selil sipresif ki prezan nan t-hCO. Menm jan an tou, li pa klè nan ki pwen absans laminasyon nan t-hCO a afekte koneksyon chèn lan30. Travay nan lavni an pral konsantre sou entegrasyon lòt kalite selil tankou mikwogli imen, selil andotelyal imen, ak pwopòsyon varyab entèneuron GABAergic jan yo montre lè l sèvi avèk asanblaj 6 in vitro, osi byen ke konprann kijan entegrasyon ak pwosesis newronal ka rive nan nivo transkripsyonèl, sinaptik ak konpòtmantal t-hCO ki modifye nan selil yo jwenn nan men pasyan yo.
An jeneral, platfòm in vivo sa a reprezante yon resous pwisan ki ka konplete devlopman sèvo imen in vitro ak rechèch sou maladi. Nou prevwa ke platfòm sa a pral pèmèt nou dekouvri nouvo fenotip nan nivo fil nan selil ki sòti nan pasyan yo ki otreman difisil pou jwenn epi teste nouvo estrateji terapetik.
Nou te pwodui hCO2.5 apati selil HiPS jan nou te dekri deja. Pou nou te kòmanse pwodiksyon hCO apati selil hiPS ki te kiltive sou kouch nourisè yo, nou te retire koloni selil hiPS entak yo nan asyèt kilti yo lè l sèvi avèk dispaz (0.35 mg/mL) epi nou te transfere yo nan kilti plastik ki gen yon atachman ultra ba ki genyen asyèt ki gen mwayen kilti selil hiPS. (Corning) yo te complétée ak de inibitè SMAD dorsomorfin (5 μM; P5499, Sigma-Aldrich) ak SB-431542 (10 μM; 1614, Tocris) ak inibitè ROCK Y-27632 (10 μM; S1049, Selleckchem). Pandan 5 premye jou yo, mwayen selil hiPS la te chanje chak jou epi nou te ajoute dorsomorfin ak SB-431542. Nan sizyèm jou sispansyon an, yo te transfere esferoyid neworal yo nan yon mwayen neworal ki genyen nerobazal-A (10888, Life Technologies), sipleman B-27 san vitamin A (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies), penisilin ak streptomisin (1:100, Life Technologies) epi yo te ajoute faktè kwasans epidèm (EGF; 20 ng ml−1; R&D Systems) ak faktè kwasans fibwoblas 2 (FGF2; 20 ng ml−1; R&D Systems) jiska 24yèm jou a. Soti nan 25yèm jou a rive nan 42yèm jou a, yo te ajoute faktè newotwofik ki sòti nan sèvo (BDNF; 20 ng ml−1, Peprotech) ak newrotwofin 3 (NT3; 20 ng ml−1; Peprotech) epi yo te chanje mwayen an chak de jou. Nan sizyèm jou sispansyon an, yo te transfere esferoyid neworal yo nan yon mwayen neworal ki genyen nerobazal-A (10888, Life Technologies), sipleman B-27 san vitamin A (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies), penisilin ak streptomisin (1:100, Life Technologies) epi yo te ajoute faktè kwasans epidèm (EGF; 20 ng ml−1; R&D Systems) ak faktè kwasans fibwoblas 2 (FGF2; 20 ng ml−1; R&D Systems) jiska 24yèm jou a. Soti nan 25yèm jou a rive nan 42yèm jou a, yo te ajoute faktè newotwofik ki sòti nan sèvo (BDNF; 20 ng ml−1, Peprotech) ak newrotwofin 3 (NT3; 20 ng ml−1; Peprotech) epi yo te chanje mwayen an chak de jou.Nan sizyèm jou sispansyon an, yo te transfere esferoyid neworal yo nan yon medyòm neworal ki gen Neurobasal-A (10888, Life Technologies), sipleman B-27 san vitamin A (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies), penisilin.и стрептомицин (1:100, Life Technologies) ak дополнены эпидермальным фактором роста (EGF; 20 нг/мл; R&D Systems) ak фактором роста фибробластов 2 (FGF2; 20 нг/мл; R&D Systems) до 24-го дня. ak streptomisin (1:100, Life Technologies) epi yo te complété ak faktè kwasans epidèm (EGF; 20 ng/ml; R&D Systems) ak faktè kwasans fibroblas 2 (FGF2; 20 ng/ml; R&D Systems) jiska jou 24 la.Soti nan jou 25 rive nan jou 42, yo te ajoute faktè newotwofik ki sòti nan sèvo a (BDNF; 20 ng ml-1, Peprotech) ak newotwofin 3 (NT3; 20 ng ml-1, Peprotech) nan medyòm nan, chanje medyòm nan chak de jou.在悬浮的第6 天，将神经球体转移到含有neurobasal-A（10888，Life Technologies）、不含维生素-A27补充剂（12587，Life Technologies）、GlutaMax（1:100，Life Technologies）、青霉素的神经培养基中和链霉（1:1000 Teknoloji）并辅以表皮生长因子（EGF；20 ng ml-1；R&D Systems）和成纤维细胞生长因子2（FGF2；20 ng ml-1；R&D Systems）直至第24 天。在 悬浮 的 第 第 6 天 将 神经 球体 转移 含有 含有 neurobasal-a （10888 ， Life Technologies， 的 縠 球体 含有b-27 补充剂 （12587 ， Life Technologies） Glutamax （1: 100 ， Life TechNOGIS青霉素 的 神经 培养 基 中 铠 （ （ 链 （ 10 （ （ 10 ， Teknoloji） 表皮 生长 因子 （（（20 ng ml-1 ； R&D Systems） 成 纤维 细胞 生长 2 （fgf2 ； 20 ng ml- 1；R&D Systems）直至穬㬀24凤 На 6-й день суспензии нейросферы были переведены на добавку, содержащую нейробаферы были переведены на добавку, содержащую нейробащую нейробаферы (10л-забаза 88, На бавку) В-27 без витамина А (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies), пенициллин- нейтрализованный стрептомицин, (1:) Life Technologies 1000 добавлением эпидермального фактора роста (EGF; 20 нг мл-1; R&D Systems) и фактора роста фибробластов 2 (FGF2; 20 нг мл-1) 1; Nan 6yèm jou a, yo te chanje sispansyon neurosfè yo pou yo te pran yon sipleman ki gen neurobasal-A (10888, Life Technologies), sipleman B-27 san vitamin A (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies), streptomisin netralize ak penisilin (1:100, Life Technologies) complété ak faktè kwasans epidèm (EGF; 20 ng ml-1; R&D Systems) ak faktè kwasans fibwoblas 2 (FGF2; 20 ng ml-1) 1; R&D Systems) до 24-го дня. Sistèm R&D) jiska jou 24.Soti nan jou 25 rive nan jou 42, yo te ajoute faktè newotwofik ki sòti nan sèvo a (BDNF; 20 ng ml-1, Peprotech) ak faktè newotwofik 3 (NT3; 20 ng ml-1, Peprotech) nan medyòm kilti a chak de jou. Chanje medyòm nan yon fwa.Apati 43yèm jou a, yo te kenbe hCO a nan yon medyòm neurobazal-A san sipleman (NM; 1088022, Thermo Fisher) avèk chanjman medyòm chak 4-6 jou. Pou jwenn hCO a nan selil hiPS ki te kiltive nan kondisyon san feeder, yo te enkube selil hiPS yo avèk Accutase (AT-104, Innovate Cell Technologies) a 37°C pandan 7 minit, yo te disosye yo an selil endividyèl, epi yo te mete yo sou plak AggreWell 800 (34815, STEMCELL Technologies) nan yon dansite 3 × 106 selil endividyèl pa pi nan medyòm Essential 8 siplemante ak inibitè ROCK Y-27632 (10 μM; S1049, Selleckchem). Apre 24 èdtan, yo te pipete medya ki nan pi yo monte desann nan medya ki gen medya Essential 6 (A1516401, Life Technologies) complétée ak dorsomorfin (2.5 μM; P5499, Sigma-Aldrich) ak SB-431542 (10 μM; 1614). , Tocrida). Soti nan jou 2 rive nan 6, yo te ranplase medya Essential 6 la chak jou ak dorsomorfin ak sipleman SB-431542. Apati sizyèm jou a, yo te transfere sispansyon newosfè yo nan medya newobazal la epi yo te kenbe yo jan sa dekri pi wo a.
Tout pwosedi pou bèt yo te fèt an akò avèk direktiv swen bèt yo ke Komite Administratif Swen Animal Laboratwa Inivèsite Stanford (APLAC) te apwouve. Yo te achte oswa mete rat RNU eutimik ansent (rnu/+) yo (Charles River Laboratories). Yo te kenbe bèt yo sou yon sik limyè-fènwa 12 èdtan ak manje ak dlo ad libitum. Yo te idantifye ti rat toutouni (FOXN1–/–) ki te gen ant twa ak sèt jou yo pa kwasans moustach ki pa devlope anvan yo te touye yo. Yo te anestezi ti chen yo (mal ak femèl) ak 2-3% izofluran epi yo te mete yo sou yon ankadreman estereyotaksik. Yo te fè yon trepanasyon zo bwa tèt la ak yon dyamèt apeprè 2-3 mm pi wo pase S1 pandan y ap kenbe entegrite dura mater la. Apre sa, sèvi ak yon zegwi 30-G (apeprè 0.3 mm) jis deyò kranyotomi a pou pèse dura a. Apre sa, aplike HCO3 sou yon parafilm mens 3×3 cm epi retire medyòm anplis la. Sèvi ak yon sereng Hamilton tache ak yon zegwi 23 G, 45°, rale hCO3 dousman nan bout ki pi distal zegwi a. Apre sa, enstale sereng lan sou ponp sereng ki konekte ak aparèy stereotaksik la. Apre sa, mete pwent zegwi a sou yon twou 0.3 mm lajè ki te fèt deja nan dura mater la (z = 0 mm) epi retresi sereng lan 1-2 mm (z = apeprè –1.5 mm) jiskaske zegwi a ant dura mater A. Yon sele dans fòme. Lè sa a, leve sereng lan nan sant sifas kortikal la nan z = -0.5 mm epi enjekte hCO3 nan yon vitès 1-2 µl pa minit. Apre yo fin enjekte hCO3 a, yo retire zegwi a nan yon vitès 0.2-0.5 mm pa minit, yo suture po a, epi yo mete ti chen an imedyatman sou yon kousen chofaj cho jiskaske li refè nèt. Gen kèk bèt yo te transplante bilateralman.
Tout pwosedi bèt yo te fèt an akò ak direktiv swen bèt Inivèsite Stanford apwouve pa APLAC. Rat yo (plis pase 60 jou apre transplantasyon) te sibi endiksyon ak anestezi 5% izofluran epi yo te anestezye ak 1-3% izofluran pandan imajri a. Pou vizyalizasyon, yo te itilize yon eskanè twou orizontal 7 Tesla aktivman pwoteje Bruker (Bruker Corp.) ak yon kondwi gradyan International Electric Company (IECO), yon insert gradyan pwoteje ak yon dyamèt entèn 120 mm (600 mT/m, 1000 T/m/s) lè l sèvi avèk AVANCE. III, kapasite RF milti-bobin uit kanal ak milti-nwayo, ak platfòm Paravision 6.0.1 ki akonpaye l la. Anrejistreman an te fèt lè l sèvi avèk yon bobin RF volumetrik aktivman dekouple ak yon dyamèt entèn 86 mm ak yon bobin RF kat kanal kriyo-refwadi pou resevwa sèlman. Axial 2D Turbo-RARE (tan repetisyon = 2500 ms, tan eko = 33 ms, 2 mwayèn) ak 16 kaptire tranch, epesè tranch 0.6–0.8 mm, ki gen 256 × 256 echantiyon. Siyal yo te resevwa lè l sèvi avèk yon bobin RF volumetrik transceiver kwadrature ak yon dyamèt entèn 2 cm (Rapid MR International, LLC). Finalman, sèvi ak fonksyon estimasyon sifas Imaris (BitPlane) entegre pou rann 3D ak analiz volim. Yon transplantasyon reyisi te defini kòm youn kote zòn siyal MRI kontinyèl T2-pondere te fòme nan emisfè transplante a. Rejè grèf te defini kòm yon grèf ki pa t pwodui zòn siyal MRI kontinyèl T2-pondere nan emisfè transplante a. t-hCO subkortikal te eskli nan analiz ki vin apre yo.
Pou eksprime GCaMP6s yo yon fason ki estab nan hCO pou imaj kalsyòm de foton, selil hiPS yo te enfekte ak pLV[Exp]-EF1a::GcaMP6s-WPRE-Puro epi apre sa yo te chwazi antibyotik. An brèf, selil yo te disosye ak EDTA epi yo te sispann yo nan 1 ml medyòm Essential 8 nan yon dansite apeprè 300,000 selil an prezans polibrèn (5 μg/ml) ak 15 μl viris. Apre sa, selil yo te enkube an sispansyon pandan 60 minit epi yo te simen yo nan yon dansite 50,000 selil pa pi. Apre konflyans lan, selil yo te trete ak 5-10 μg ml-1 puromisin pandan 5-10 jou oswa jiskaske koloni ki estab parèt. Enfeksyon egi hCO te fèt jan sa te dekri deja5 ak kèk modifikasyon. An brèf, transfere jou 30-45 hCO nan tib mikwosantrifij Eppendorf 1.5 ml ki gen 100 µl medyòm nè. Apre sa, yo retire apeprè 90 µl nan medyòm nan, yo ajoute 3-6 µl lentivirus ki gen gwo tit (soti nan 0.5 x 108 rive nan 1.2 x 109) nan tib la, epi yo transfere hCO a nan enkibatè a pandan 30 minit. Apre sa, ajoute 90-100 µl medyòm nan chak tib epi retounen tib yo nan enkibatè a pandan tout lannwit lan. Nan denmen, transfere hCO a nan medyòm nè fre a nan plak ki gen ti atachman. Apre 7 jou, yo te transfere hCO a nan plak ki gen 24 pi an vè pou vizyalizasyon ak evalyasyon kalite enfeksyon an. pLV[Exp]-SYN1::EYFP-WPRE ak pLV[Exp]-SYN1::hChR2-EYFP-WPRE te pwodui pa VectorBuilder. Yo itilize lentivirus nan pifò eksperyans paske li entegre nan jenòm lame a, sa ki pèmèt ekspresyon jèn rapòtè nan liy selil enfekte yo. Pou swivi pou laraj, jou 30-45 la te ko-enfekte hCO avèk laraj-ΔG-eGFP ak AAV-DJ-EF1a-CVS-G-WPRE-pGHpA (plasmid #67528, Addgene), lave byen pandan 3 jou, epi transplante nan rat nan S1 epi kenbe in vivo pandan 7-14 jou.
Pou imunositochimik, yo te anestezi bèt yo epi yo te fè yo pèfizyon transkadyak ak PBS epi apre sa yo te resevwa 4% paraformaldeyid (PFA nan PBS; Electron Microscopy Sciences). Yo te fikse sèvo yo nan 4% PFA pandan 2 èdtan oubyen pandan tout lannwit nan 4°C, yo te kriyoprezève yo nan 30% sikwoz nan PBS pandan 48-72 èdtan, epi yo te mete yo nan 1:1, 30% sikwoz: OCT (Tissue-Tek OCT Compound 4583, Sakura Finetek) epi yo te fè seksyon koronal a 30 µm lè l sèvi avèk yon kriyostat (Leica). Pou imunoistochimik seksyon epè yo, yo te fè pèfizyon bèt yo ak PBS, epi yo te disseke sèvo a epi seksyone koronalman a 300-400 µm lè l sèvi avèk yon vibratom (Leica) epi yo te fikse seksyon yo ak 4% PFA pandan 30 minit. Apre sa, yo te lave kriyoseksyon yo oswa seksyon epè yo ak PBS, yo te bloke yo pandan 1 èdtan nan tanperati chanm (10% seròm bourik nòmal (NDS) ak 0.3% Triton X-100 dilye nan PBS) epi yo te bloke yo ak solisyon blokaj a 4°C. – Enkibasyon Yo te enkube kriyoseksyon yo pandan lannwit lan epi yo te enkube seksyon epè yo pandan 5 jou. Antikò prensipal yo te itilize yo se te: anti-NeuN (sourit, 1:500; ab104224, abcam) anti-CTIP2 (rat, 1:300; ab18465, abcam), anti-GFAP (lapen, 1:1,000; Z0334, Dako), anti-GFP (poul, 1:1,000; GTX13970, GeneTex), anti-HNA (sourit, 1:200; ab191181, abcam), anti-NeuN (lapen, 1:500; ABN78, Millipore), anti-PDGFRA (lapen, 1:200; sc-338, Santa Cruz), anti-PPP1R17 (lapen, 1:200; HPA047819, Atlas Antibodies), anti-RECA-1 (sourit, 1:50; ab9774, abcam), anti-SCG2 (lapen, 1:100; 20357-1-AP, Proteintech), anti-SOX9 (kabrit, 1:500; AF3075, R&D Systems), Netrin G1a (kabrit, 1:100; AF1166, R&D Systems), anti-STEM121 (sourit, 1:200; Y40410, Takara Bio), anti-SATB2 (sourit, 1:50; ab51502, abcam), anti-GAD65/67 (lapen, 1:400; ABN904, Millipore) ak anti-IBA1 (kabrit, 1:100; ab5076, abcam). Antikò prensipal yo te itilize yo se te: anti-NeuN (sourit, 1:500; ab104224, abcam) anti-CTIP2 (rat, 1:300; ab18465, abcam), anti-GFAP (lapen, 1:1,000; Z0334, Dako), anti-GFP (poul, 1:1,000; GTX13970, GeneTex), anti-HNA (sourit, 1:200; ab191181, abcam), anti-NeuN (lapen, 1:500; ABN78, Millipore), anti-PDGFRA (lapen, 1:200; sc-338, Santa Cruz), anti-PPP1R17 (lapen, 1:200; HPA047819, Atlas Antibodies), anti-RECA-1 (sourit, 1:50; ab9774, abcam), anti-SCG2 (lapen, 1:100; 20357-1-AP, Proteintech), anti-SOX9 (kabrit, 1:500; AF3075, R&D Systems), Netrin G1a (kabrit, 1:100; AF1166, R&D Systems), anti-STEM121 (sourit, 1:200; Y40410, Takara Bio), anti-SATB2 (sourit, 1:50; ab51502, abcam), anti-GAD65/67 (lapen, 1:400; ABN904, Millipore) ak anti-IBA1 (kabrit, 1:100; ab5076, abcam). Использовались следующие первичные антитела: анти-NeuN (мышиные, 1:500; ab104224, abcam), анти-CTIP:3000; ab18465, abcam), анти-GFAP (кроличьи, 1:1000; Z0334, Dako), анти- -GFP (курица, 1:1000; GTX13970, GeneTex), анти-HNA (,81:2000, мы1:1:1000) abcam), анти-NeuN (кролик, 1:500; ABN78, Millipore), анти-PDGFRA (кролик, 1:200; sc-338, Санта-Круз), анти-PPP1R17 (кролик, 1:200; HPA047819, Atlas Antibodies), анти-RECA-1 (мыш40, ab97:5ь, ab977819, 1:200); анти-SCG2 (кролик , 1:100; 20357-1-AP, Proteintech), анти-SOX9 (козий, 1:500; AF3075, R&D Systems), нетрин G1a (козин 1160, 6, AF1160, ; анти-STEM121 (мышиный, 1:200; Y40410, Takara Bio), анти-SATB2 (мышь, 1:50; ab51502, abcam), анти-GAD65/67 (кролик, 1:400; ABN904, Millipore) ak анти-IBA1 (коза, 1:100; абббка, аббка, 1:100). Antikò prensipal yo te itilize yo se te: anti-NeuN (sourit, 1:500; ab104224, abcam), anti-CTIP2 (rat, 1:300; ab18465, abcam), anti-GFAP (lapen, 1:1000; Z0334, Dako), anti-GFP (poul, 1:1000; GTX13970, GeneTex), anti-HNA (sourit, 1:200; ab191181, abcam), anti-NeuN (lapen, 1:500; ABN78, Millipore), anti-PDGFRA (lapen, 1:200; sc-338, Santa Cruz), anti-PPP1R17 (lapen, 1:200; HPA047819, Atlas Antibodies), anti-RECA-1 (sourit, 1:50; ab9774, abcam), anti-SCG2 (lapen, 1:100; 20357-1-AP, Proteintech), anti-SOX9 (kabrit, 1:500; AF3075, R&D Systems), netrin G1a (kabrit, 1:100; AF1166, R&D Systems), anti-STEM121 (sourit, 1:200; Y40410, Takara Bio), anti-SATB2 (sourit, 1:50; ab51502, abcam), anti-GAD65/67 (lapen, 1:400; ABN904, Millipore) ak anti-IBA1 (kabrit, 1:100; ab5076, abkam).使用的一抗是：抗NeuN（小鼠，1:500；ab104224，abcam）抗CTIP2（大鼠，1:3 00；ab18465，abcam），抗GFAP（兔，1:1,000；Z0334，Dako），抗-GF P（鸡，1:1,000；GTX13970，GeneTex），抗HNA（小鼠，1:200；ab1911 81，abcam），抗NeuN（兔，1:500；ABN78，Millipore），抗PDGFRA（兔， 1:200；sc-338，Santa Cruz），抗PPP1R17（兔，1:200；HPA047819，Atlas抗体），抗RECA-1（小鼠，1:50；ab9774，abcam），抗SCG2（兔） , 1:100；20357-1-AP，Proteintech），抗SOX9（山羊，1:500；AF3075，R&D Systems），Netrin G1a（山羊（山羊，1:10D66；AF3075，R&D Systems） Systems），抗STEM121（小鼠, 1:200;使用的一抗是：抗NeuN（小鼠，1:500；ab104224，abcam）抗CTIP2（大鼠，1 :300；ab18465，abcam），抗GFAP（兔，1:1,000；Z0334，Dako），抗-GFP（鸡，1:1,000；GTX13970，GeneTex），抗HNA（小鼠，1:200；ab 191181，abcam），抗NeuN（兔，1:500；ABN78，Millipore％弔，抗1: 200；sc-338，Santa Cruz），抗PPP1R17（兔，1:200；HPA047819，Atlas抗体），抗RECA-1（小鼠，1:50；ab9774，abcam），抗SCG2 100；20357-1-AP，Proteintech），抗SOX9（山羊，1:500；AF3075，R&D Systems），Netrin G1a（山羊（山羊；1:1006；AF306； Systems）頏1:20, ;Y40410, Takara Bio), anti-SATB2 (sourit, 1:50; ab51502, abcam), anti-GAD65/67 (lapen, 1:400; ABN904, Millipore) ak anti-IBA1 (kabrit, 1:100; ab5076, abcam).Antikò prensipal yo te itilize yo se te: anti-NeuN (sourit, 1:500; ab104224, abcam), anti-CTIP2 (rat, 1:300; ab18465, abcam), anti-GFAP (lapen, 1:1000; Z0334, Dako). , anti-GFP (poul, 1:1000; GTX13970, GeneTex), anti-HNA (sourit, 1:200; ab191181, abcam), anti-NeuN (lapen, 1:500; ABN78, Millipore), anti-PDGFRA (lapen, 1:200; sc-338, Santa Cruz), anti-PPP1R17 (lapen, 1:200; HPA047819, Atlas antikò), anti-RECA-1 (sourit, 1:50; ab9774, abcam), anti-SCG2 (lapen), 1:100;20357-1-AP, Proteintech), анти-SOX9 (коза, 1:500; AF3075, R&D Systems), Нетрин G1a (коза, 1:100; AF1166, R&D Systems), анти (коза, 1:500; AF3075, мы12ь, мы121и -STEM,; Y40410, Takara Bio), анти-SATB2 (мышь, 1:50; ab51502, abcam), анти-GAD65/67 (кролик, 1:400; ABN904, Millipore) ak анти-IBA1, ка6,за1 (; 1:010, кролик, 1:400). абкам). 20357-1-AP, Proteintech), anti-SOX9 (kabrit, 1:500; AF3075, R&D Systems), Netrin G1a (kabrit, 1:100; AF1166, R&D Systems), anti-STEM121 (sourit, 1:200; Y40410, Takara Bio), anti-SATB2 (sourit, 1:50; ab51502, abcam), anti-GAD65/67 (lapen, 1:400; ABN904, Millipore), ak anti-IBA1 (kabrit, 1:100; ab5076, abkam).Apre sa, yo te lave seksyon yo ak PBS epi yo te enkube yo ak antikò segondè pandan 1 èdtan nan tanperati chanm (seksyon konjele) oswa pandan tout lannwit nan 4°C (seksyon epè). Yo te itilize antikò segondè Alexa Fluor (Life Technologies) dilye 1:1000 nan solisyon blokaj. Apre yo te fin lave yo ak PBS, yo te vizyalize nwayo yo ak yon Hoechst 33258 (Life Technologies). Finalman, yo te mete lam yo sou yon mikwoskòp ak kouvèti (Fisher Scientific) lè l sèvi avèk yon Aquamount (Polysciences) epi yo te analize yo sou yon mikwoskòp fliyoresan Keyence (analizè BZ-X) oswa yon mikwoskòp konfokal Leica TCS SP8 (Las-X) sou imaj la. Yo te trete imaj yo lè l sèvi avèk pwogram ImageJ (Fiji). Pou mezire pwopòsyon newòn imen yo nan t-hCO ak nan korteks rat la, yo te pran imaj rektangilè 387.5 μm lajè nan sant t-hCO a, nan oswa toupre kwen korteks rat la. Yo te detèmine maj grèf yo lè yo te evalye chanjman nan transparans tisi yo, nwayo HNA+ yo, ak/oswa prezans otofluoresans tisi yo. Nan chak imaj, yo te divize kantite total selil NeuN+ ak HNA+ yo pa kantite total selil NeuN+ ki nan menm zòn nan. Pou asire ke se sèlman selil ki gen nwayo nan plan imaj la yo konte, se sèlman selil ki se Hoechst+ yo enkli nan kalkil la. Yo te pran mwayèn de imaj ki separe pa omwen 1 mm pou diminye erè estatistik la.
Yon semèn anvan koleksyon echantiyon an, mete bèt ki te resevwa transplantasyon hCO3 yo (apeprè 8 mwa diferansyasyon) nan yon chanm nwa ak moustach koupe pou minimize eksitasyon sansoryèl. Izolasyon nwayo yo te fèt jan sa te dekri deja, avèk kèk modifikasyon. An brèf, t-hCO3 ak hCO3 yo te detwi lè l sèvi avèk liziz selilè mekanik ak detèjan ak yon moulen tisi an vè 2 ml (D8938, Sigma-Aldrich/KIMBLE). Apre sa, nwayo brit yo te filtre lè l sèvi avèk yon filtè 40 µm epi santrifije yo a 320 g pandan 10 minit a 4 °C anvan yo te fè yon gradyan dansite sikwoz. Apre etap santrifijasyon an (320 g pandan 20 min a 4°C), echantiyon yo te resispann nan 0.04% BSA/PBS avèk adisyon 0.2 inite inibitè RNase µl-1 (40 u µl-1, AM2682, Ambion) epi yo te pase yo nan yon filtè koule 40 µm. Apre sa, yo te resispann nwayo disosye yo nan PBS ki gen 0.02% BSA epi yo te chaje yo sou yon chip Chromium Single Cell 3′ (yo estime rekiperasyon an se 8,000 selil pa liy). Yo te prepare bibliyotèk snRNA-seq yo avèk Chromium Single cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics). Yo te prepare bibliyotèk snRNA-seq yo avèk Chromium Single cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics). Библиотеки snRNA-seq были приготовлены с помощью Chromium Single selil 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics). Yo te prepare bibliyotèk snRNA-seq yo lè l sèvi avèk Chromium Single cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics). snRNA-seq 文库是使用Chromium Single selil 3′ GEM、Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics) 制备的。 snRNA-seq 文库是使用Chromium Single selil 3′ GEM、Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics) 制备的。 Библиотеку snRNA-seq готовили с использованием Chromium Single Cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics). Yo te prepare bibliyotèk snRNA-seq la lè l sèvi avèk Chromium Single Cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics).Admera Health te rasanble epi sekansye bibliyotèk ki soti nan diferan echantiyon sou NovaSeq S4 (Illumina).
Yo te mezire nivo ekspresyon jèn pou chak kòd bar nikleyè swadizan lè l sèvi avèk pake lojisyèl analiz 10x Genomics CellRanger (vèsyon 6.1.2). Espesyalman, yo te konpare lekti yo ak yon konbinezon jenòm referans imen (GRCh38, Ensemble, vèsyon 98) ak rat (Rnor_6.0, Ensemble, vèsyon 100) ki te kreye avèk kòmandman mkref la epi lè l sèvi avèk konte avèk kòmandman –include-introns=TRUE pou kantifikasyon an enkli lekti ki mape nan rejyon intron yo. Pou echantiyon t-hCO3 yo, yo te idantifye nwayo imen yo baze sou egzijans konsèvatif ke omwen 95% nan tout lekti ki mape yo koresponn ak jenòm imen an. Tout analiz ki vin apre yo te fèt sou yon pwodiksyon etalaj kòd bar filtre ki soti nan CellRanger la lè l sèvi avèk pake R (vèsyon 4.1.2) Seurat (vèsyon 4.1.1)32.
Pou asire ke se sèlman nwayo ki gen bon kalite ki enkli nan analiz ki vin apre a, yo te aplike yon pwosesis filtraj iteratif pou chak echantiyon. Premyèman, yo idantifye epi retire nwayo ki pa gen bon kalite ki gen mwens pase 1000 jèn inik yo te jwenn ak plis pase 20% nan total mitokondri yo. Apre sa, matris nimewo jèn brit la te nòmalize pa regresyon binomyal negatif regilarize lè l sèvi avèk fonksyon sctransform(vst.flavor="v2") la, ki te idantifye tou 3000 jèn ki pi varyab yo lè l sèvi avèk paramèt default yo. Rediksyon dimansyon an te fèt sou jèn varyab siperyè yo lè l sèvi avèk Analiz Konpozan Prensipal (PCA) ak paramèt default lè l sèvi avèk yon dimansyon ansanm done 30 (dims = 30 te chwazi ki baze sou enspeksyon vizyèl sit jenou yo epi li te itilize pou tout echantiyon yo ak analiz ansanbl yo). Apre sa, nou te fè plizyè seri gwoupman iteratif (rezolisyon = 1) pou klase jèn yo ki baze sou kantite jèn ki anòmalman ba (medyàn anba 10yèm persentil), kantite jèn mitokondriyal ki anòmalman wo (medyàn pi wo pase 95yèm persentil) pou idantifye epi retire selil swadizan ki gen bon jan kalite ki ba. Gwoupman ak/oswa yon gwo pwopòsyon marasa sispèk idantifye lè l sèvi avèk pake DoubletFinder33 la (nòt mwayèn DoubletFinder pi wo pase 95yèm persentil la). Echantiyon t-hCO (n=3) ak echantiyon hCO (n=3) yo te entegre separeman lè l sèvi avèk fonksyon IntegrateData a ak paramèt ki anwo yo. Apre sa Yo te fè yon lòt seri filtraj kalitatif sou ansanm done entegre a jan sa dekri pi wo a.
Apre yo te fin retire nwayo ki pa bon kalite yo, yo te gwoupe ansanm done entegre yo (rezolisyon = 0.5) epi entegre yo pou rezon vizyalizasyon UMAP34. Yo te detèmine jèn makè pou chak gwoup lè l sèvi avèk fonksyon FindMarkers ak paramèt default ki kalkile apati done ekspresyon jèn nòmalize yo. Nou idantifye epi klase klas selil prensipal yo lè nou konbine ansanm done referans kortikal fetis la ak adilt ak ekspresyon jèn makè 19,20,21,35 ak anotasyon. An patikilye, yo te idantifye prekisè sikile yo pa ekspresyon MKI67 ak TOP2A. Yo te defini gwoup pwogéniteur yo pa absans transkripsyon mitotik, gwo sipèpoze ak gwoup pwogéniteur glial miltipotans ki dekri nan korteks fetis la nan metafaz ta, ak ekspresyon EGFR ak OLIG1. Nou itilize tèm astrosit la pou anglobe plizyè eta diferansyasyon astrosit, soti nan gliyal radial an reta rive nan matirite astrosit yo. Gwoup astrosit yo eksprime nivo SLC1A3 ak AQP4 ki wo epi yo te montre yo korelasyon ak soutip gliyal radial fetis la ak/oswa astrosit adilt. OPC yo eksprime PDGFRA ak SOX10 pandan ke oligodendrosit yo eksprime makè myelinasyon (MOG ak MYRF). Newòn glutamaterjik yo te idantifye pa prezans transkripsyon newonal (SYT1 ak SNAP25), absans makè GABAerjik (GAD2), ak ekspresyon NEUROD6, SLC17A7, BCL11B, oswa SATB2. Newòn GluN yo te divize pi lwen an souklas siperyè (ekspresyon SATB2 ak pèt BCL11B) ak pwofon (ekspresyon BCL11B). Newòn souplak (SP) swadizan yo eksprime makè SP18 li te ye tankou ST18 ak SORCS1 anplis makè GluN pwofon yo. Selil ki sanble ak plexus koroyid yo te idantifye pa ekspresyon TTR, epi selil ki sanble ak menenj yo te eksprime jèn ki asosye ak fibroblas epi yo te kat selil pial/vaskilè nan seri done referans lan.
Yo te fè analiz diferansyèl ekspresyon jèn ant souklas t-hCO ak hCO yo lè l sèvi avèk yon metòd pseudo-batch ki fèk devlope ki repwodui nan echantiyon yo aplike lè l sèvi avèk pake Libra R (vèsyon 1.0.0). Espesyalman, yo te fè tès edgeR log-likelihood (vèsyon 3.36.0, pake R) pou gwoup yo lè yo te adisyone kantite jèn ki nan selil yo pou yon klas selil bay pou chak replikasyon echantiyon. Pou vizyalizasyon kat chalè a, yo te kalkile valè nòmalize pa milyon (CPM) lè l sèvi avèk edgeR (fonksyon cpm()) epi yo te mete yo a yon pwopòsyon (pou reyalize mwayèn = 0, devyasyon estanda = 1). Yo te fè analiz anrichisman Gene Ontology (GO) sou jèn t-hCO GluN ki te siyifikativman ogmante (valè P korije Benjamini-Hochberg mwens pase 0.05 ki eksprime nan omwen 10% nan selil t-hCO GluN yo ak yon ogmantasyon nan chanjman omwen 2 fwa). Yo te fè sa lè l sèvi avèk ToppGene Suite (https://toppgene.cchmc.org/)37. Nou itilize aplikasyon ToppFun lan ak paramèt default epi nou rapòte valè P korije pa Benjamini-Hochberg ki kalkile apati tès ipèjeometrik anote pa GO.
Pou nou te kapab matche gwoup snRNA-seq nou yo ak gwoup selil anote ki soti nan etid referans sou RNA-seq prensipal yon sèl selil oswa snRNA-seq adilt19,20,21,22, nou te aplike yon apwòch entegrasyon ansanm done pè. Nou te itilize workflow normalizasyon SCTransform (v2) nan Seurat pou entegre ak konpare sipèpoze gwoup ant ansanm done yo (lè l sèvi avèk menm paramèt yo pi wo a). Ansanm done endividyèl yo te sou-ansanm owaza jiska 500 selil oswa nwayo pou chak gwoup orijinal pou efikasite enfòmatik. Lè l sèvi avèk yon apwòch menm jan ak sa ki te dekri anvan an, sipèpoze gwoup yo te defini kòm pwopòsyon selil oswa nwayo nan chak gwoup gwoupe ki te sipèpoze ak etikèt gwoup referans lan. Pou nou te kapab klase GluN yo pi byen, nou te itilize workflow TransferData Seurat la pou done sou-ansanm GluN pou nou te kapab bay etikèt ansanm done referans nan selil GluN nou yo.
Pou evalye eta matirite transkriptòm global echantiyon t-hCO ak hCO yo, nou te konpare echantiyon pseudo-bulk nou yo ak BrainSpan/psychENCODE23, ki konsiste de yon gwo sekans ARN ki kouvri devlopman sèvo imen an. Nou te fè PCA sou yon matris ekspresyon jèn konbine ki nòmalize pa modèl ki soti nan echantiyon kortikal 10 semèn apre konsepsyon ak pita, nan 5567 jèn (ansanm ak done nou yo) ki te deja idantifye kòm aktif nan echantiyon kortikal BrainSpan (defini kòm pi gran pase 50% nan varyans devlopman ki eksplike pa laj lè l sèvi avèk yon modèl kib)38. Anplis de sa, nou te derive jèn ki asosye ak siyati transkriptòm prensipal newodevlopman lè l sèvi avèk faktorizasyon matris ki pa negatif jan sa te dekri deja. Pwa echantiyon yo kalkile lè l sèvi avèk pwosedi faktorizasyon matris ki pa negatif la trase nan Figi 5b ak done elaji pou chak nan senk siyati yo dekri pa Zhu et al.38. Yon fwa ankò, makè transkripsyon ki depann de aktivite yo te sòti nan etid ki te pibliye deja. An patikilye, ERG ak LRG te siyifikativman ogmante nan newòn glutamaterjik yo idantifye pa koleksyon snRNA-seq korteks vizyèl sourit la apre estimilasyon vizyèl ki soti nan Tablo Siplemantè 3 Hrvatin et al.16. LRG anrichi ak moun yo te jwenn nan kilti sèvo fetis imen aktive ak KCl epi yo te rekòlte 6 èdtan apre estimilasyon an, epi jèn filtre yo te siyifikativman ogmante nan moun men pa nan wonjè (Tablo Siplemantè 4). Analiz anrichisman ansanm jèn lè l sèvi avèk ansanm jèn sa yo te fèt lè l sèvi avèk yon tès egzak Fisher yon sèl chemen.
Anestezye rat yo ak izofluran, retire sèvo yo epi mete yo nan yon solisyon sikwoz frèt (apeprè 4°C) oksijene (95% O2 ak 5% CO2) pou seksyon ki genyen: 234 mM sikwoz, 11 mM glikoz, 26 mM NaHCO3, 2.5 mM KCl, 1.25 mM. NaH2PO4, 10 mM MgSO4 ak 0.5 mM CaCl2 (apeprè 310 mOsm). Seksyon koronal sèvo rat (300–400 µm) ki genyen t-hCO yo te fèt lè l sèvi avèk yon vibratòm Leica VT1200 jan sa te dekri deja39. Apre sa, yo te transfere seksyon yo nan yon chanm seksyonaj ak oksijenasyon kontinyèl nan tanperati chanm ki gen ladan aCSF prepare ak: 10 mM glikoz, 26 mM NaHCO3, 2.5 mM KCl, 1.25 mM NaHPO4, 1 mM MgSO4, 2 mM CaCl2 ak 126 mM NaCl (298 mOsm). omwen 45 minit anvan anrejistreman an. Yo te anrejistre seksyon yo nan yon chanm benyen kote yo te kontinyèlman pèfize ak aCSF (95% O2 ak 5% CO2 flakon). Yo te anrejistre tout done yo nan tanperati chanm. Yo te mete fen nan newòn t-hCO yo ak yon pipèt an vè borosilikat ki te ranpli ak yon solisyon ki gen 127 mM glukonat potasyòm, 8 mM NaCl, 4 mM ATP mayezyòm, 0.3 mM GTP sodyòm, 10 mM HEPES, ak 0.6 mM EGTA, pH 7.2, solisyon entèn ajiste ak KOH (290 mOsm). Pou rekipere, yo te ajoute biocytin (0.2%) nan solisyon anrejistreman an.
Yo te pran done yo avèk yon anplifikatè MultiClamp 700B (Molecular Devices) ak yon dijitalizè Digidata 1550B (Molecular Devices), yo te filtre done yo avèk yon filtre pas ba a 2 kHz, yo te dijitalize yo a 20 kHz, epi yo te analize yo avèk Clampfit (Molecular Devices), Origin (OriginPro). 2021b, OriginLab). ak fonksyon MATLAB pèsonalize (Mathworks). Yo te kalkile potansyèl jonksyon an avèk JPCalc epi yo te ajiste antre yo nan valè kalkile a ki se -14 mV. Operasyon IV la konsiste de yon seri etap aktyèl nan etap 10-25 pA, soti nan -250 a 750 pA.
Talamus la, sibstans blan an, ak aferan S1 yo te estimile elektrikman nan tranch talamokortikal yo pandan anrejistreman patch-clamp newòn hCO yo, jan sa dekri deja. An brèf, yo te mete sèvo a sou yon tab enprime 3D ki te panche nan yon ang 10°, epi yo te koupe devan sèvo a nan yon ang 35°. Apre sa, yo te kole sèvo a sou sifas koupe a epi yo te koupe l an seksyon, pou prezève akson talamokortikal ki te soti deyò yo. Yo te monte elektwòd tengstèn bipolè (0.5 MΩ) sou yon dezyèm mikwomanipilatè epi yo te pozisyone yo estratejikman pou estimile kat rejyon pa selil (kapsil enteryè, sibstans blan, S1 ak hCO). Anrejistre repons sinaptik yo apre yon estimilasyon fazik 300 µA nan 0.03–0.1 Hz.
Newòn hCO ki eksprime hChR2 yo te aktive a 480 nm epi yo te aplike pulsasyon limyè ki te pwodui pa yon LED (Prizmatix) atravè yon objektif ×40 (0.9 NA; Olympus) pou anrejistre ekspresyon hChR2 toupre selil yo. Dyamèt chan ki eklere a se apeprè 0.5 mm epi puisans total la se 10-20 mW. Yo te fikse lajè pulsasyon an sou 10 ms, ki koresponn ak pulsasyon yo te bay pandan eksperyans aprantisaj konpòtman an. Yo te itilize plizyè frekans estimilasyon, soti nan 1 a 20 Hz, men se sèlman premye pulsasyon seri a ki te itilize pou kantifikasyon. Entèval ki genyen ant tren yo anjeneral pi long pase 30 s pou minimize efè a sou chemen inibitwa oswa fasilitasyon sinaptik yo. Pou teste si repons hChR2 a te monosinaptik, nou te aplike TTX (1 μM) nan beny lan jiskaske reyaksyon EPSC a te disparèt, epi answit nou te aplike 4-aminopiridin (4-AP; 100 μM). Tipikman, yon repons retounen nan kèk minit, ak yon reta yon ti kras pi long ant deklanchman LED ak jenerasyon EPSC. Yo te itilize NBQX (10 μM) pou teste si reseptè AMPA yo te kondwi repons lan.
Yo te kreye seksyon hCO byen file jan yo te dekri deja. An brèf, yo te mete seksyon hCO yo nan 4% agaroz epi yo te transfere yo nan selil ki genyen 126 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM NaH2PO4, 1 mM MgSO4, 2 mM CaCl2, 26 mM NaHCO3 ak 10 mM d-(+) -glikoz. Yo te koupe seksyon yo a 200–300 µm nan tanperati chanm lè l sèvi avèk yon vibratè Leica VT1200 epi yo te estoke yo nan ASF nan tanperati chanm. Apre sa, yo te fè anrejistreman patch-camp selil antye yo sou seksyon hCO anba yon mikwoskòp dirèk SliceScope (Scientifica). Yo te pèfize seksyon yo ak aCSF (95% O2 ak 5% CO2) epi yo te anrejistre siyal selil yo nan tanperati chanm. Yo te aplike newòn hCO yo lè l sèvi avèk yon pipèt an vè borosilikat ki te ranpli ak yon solisyon ki gen 127 mM glukonat potasyòm, 8 mM NaCl, 4 mM ATP mayezyòm, 0.3 mM GTP sodyòm, 10 mM HEPES, ak 0.6 mM EGTA, pH entèn 7, 2, ajiste ak KOH (osmolarite 290). Pou rezon rekiperasyon, ajoute 0.2% Biocytin nan solisyon entèn lan.
Done yo te jwenn pa Clampex (Clampex 11.1, Molecular Devices) lè l sèvi avèk yon anplifikatè MultiClamp 700B (Molecular Devices) ak yon dijitalizè Digidata 1550B (Molecular Devices), filtre low-pass a 2 kHz, dijitalize a 20 kHz, epi analize lè l sèvi avèk Clampfit (vèsyon 10.6) pou analiz, aparèy molekilè) ak fonksyon MATLAB koutim (MATLAB 2019b, Mathworks). Potansyèl jonksyon an te kalkile lè l sèvi avèk JPCalc epi antre yo te ajiste a potansyèl jonksyon kalkile a -14 mV. Operasyon IV konsiste de yon seri etap aktyèl nan etap 5-10 pA soti nan -50 a 250 pA.
Pou rekonstriksyon mòfolojik newòn ki pense yo, yo te ajoute 0.2% biocytin (Sigma-Aldrich) nan solisyon entèn lan. Selil yo te prepare pou omwen 15 minit apre yo te fin koupe yo. Apre sa, yo rale pipèt la dousman pandan 1-2 minit jiskaske manbràn anrejistre a sele nèt. Apre pwosedi fizyoloji seksyon an, yo te fiks seksyon yo pandan lannwit nan 4°C nan 4% PFA, yo te lave yo ak PBS X3, epi yo te dilye yo 1:1000 ak DyLight 549 oswa DyLight 405 konjige ak streptavidin (Vector Labs). Selil ki te ranpli ak biocytin (2%; Sigma-Aldrich) yo te make pandan anrejistreman patch clamp nan tanperati chanm pandan 2 èdtan. Apre sa, yo te monte seksyon yo sou lam mikwoskopi lè l sèvi avèk yon Aquamount (Thermo Scientific) epi yo te vizyalize yo nan jou ki te vin apre a sou yon mikwoskòp konfokal Leica TCS SP8 lè l sèvi avèk yon objektif imèsyon lwil ak yon ouvèti nimerik ×40 1.3, agrandisman ×0.9–1.0, xy. To echantiyonaj la se apeprè 7 piksèl pa mikron. Yo te jwenn Z-stacks an seri nan entèval 1 µm, epi yo te fè mozayik z-stack ak oto-koud ki baze sou Leica pou kouvri tout pyebwa dendritik chak newòn. Apre sa, yo te swiv newòn yo semi-manyèlman lè l sèvi avèk koòdone neuTube 40 la epi yo te pwodui fichye SWC yo. Apre sa, yo te telechaje fichye yo nan plugin SimpleNeuriteTracer41 Fiji a (ImageJ, vèsyon 2.1.0; NIH).
Yo te jwenn tisi kortikal imen an avèk konsantman enfòme dapre yon pwotokòl ki te apwouve pa Komisyon Revizyon Enstitisyonèl Inivèsite Stanford la. Yo te jwenn de echantiyon tisi imen apre akouchman (3 ak 18 an) pa rezekasyon korteks frontal la (girus frontal mitan an) kòm yon pati nan yon operasyon pou epilepsi refraktè. Apre rezekasyon an, yo te rekòlte tisi a nan NMDG-aCSF frèt tankou glas ki genyen: 92 mM NMDG, 2.5 mM KCl, 1.25 mM NaH2PO4, 30 mM NaHCO3, 20 mM HEPES, 25 mM glikoz, 2 mM tioure, 5 mM askorbat sodyòm, 3 mM piruvat sodyòm, 0.5 mM CaCl2 4H2O ak 10 mM MgSO4 7H2O. Titre a pH 7.3-7.4 ak asid idroklorik konsantre. Yo te delivre tisi yo nan laboratwa a nan lespas 30 minit epi yo te pran seksyon koronal yo dapre pwosedi ki dekri pi wo a.
Tout pwosedi sou bèt yo te fèt an akò ak direktiv swen bèt ke Inivèsite Stanford APLAC te apwouve. Rat yo (plis pase 140 jou apre transplantasyon) te sibi endiksyon ak anestezi 5% izofluran epi yo te anestezye yo ak 1-3% izofluran pandan operasyon an. Yo te mete bèt yo nan yon kad estereyotaksik (Kopf) epi yo te enjekte buprenorfin lage pwolonje (SR) anba po. Yo ekspoze krann lan, netwaye li epi yo mete 3-5 vis pou zo. Pou vize t-hCO3 a, nou te pwodui kowòdone estereyotaksik apati imaj MRI yo. Yo te fè yon twou nan sit enterè a epi yo te bese fib yo (400 µm dyamèt, NA 0.48, Doric) 100 µm anba sifas hCO3 a epi yo te fikse yo nan krann lan ak siman dantè ki ka geri ak UV (Relyx).
Anrejistreman fotometrik fib yo te fèt jan yo te dekri deja42. Pou anrejistre aktivite espontane a, yo te mete rat yo nan yon kaj pwòp epi yo te konekte yon kab plak fib optik 400 µm dyamèt (Doric) konekte ak yon sistèm akizisyon done fotometrik fib optik ak kab fib optik ki te enplante a. Pandan anrejistreman 10 minit aktivite motè a, bèt yo te lib pou eksplore kaj la. Pou anrejistre aktivite ki te pwovoke a, yo te anestezye rat yo (plis pase 140 jou apre transplantasyon an) ak 5% izofluran pou endiksyon ak 1-3% izofluran pou antretyen. Mete bèt la nan yon ankadreman estereyotaksik (Kopf) epi yo koupe moustach yo sou lòt bò t-hCO a a anviwon 2 cm epi yo pase yo nan yon may ki konekte ak yon aktuatè pyezoelektrik (PI). Yo te konekte yon kab plak fib optik 400 µm (Doric) ak fib ki te enplante a epi ak sistèm akizisyon done a. Moustach yo ki sou lòt bò t-hCO3 a te devye 50 fwa (2 mm a 20 Hz, 2 s pa prezantasyon) nan moman o aza pa yon motè pyezoelektrik sou yon peryòd anrejistreman 20 minit. Sèvi ak Pake Sipò Arduino MATLAB la pou kontwole tan devyasyon an ak kòd MATLAB pèsonalize. Evènman yo senkronize ak lojisyèl akizisyon done a lè l sèvi avèk pulsasyon lojik tranzistò-tranzistò (TTL).
Rat yo (plis pase 140 jou apre transplantasyon an) te sibi endiksyon anestezi 5% izofluran epi yo te anestezi yo ak 1-3% izofluran pandan operasyon an. Yo te mete bèt yo nan yon kad estereyotaksik (Kopf) epi yo te enjekte buprenorfin SR ak deksametazòn anba po. Yo te ekspoze zo bwa tèt la, netwaye li epi yo te mete 3-5 vis pou zo. Pou vize t-hCO a, nou te pwodui kowòdone estereyotaksik apati imaj IRM yo. Yo te fè yon kranyotomi sikilè (apeprè 1 cm an dyamèt) avèk yon egzèsis gwo vitès dirèkteman sou hCO ki te transplante a. Yon fwa zo a vin osi mens ke posib, men anvan yo perfore tout zo a, yo te itilize yon pensèt pou retire rès disk basen an pou revele t-hCO ki anba a. Yo te ranpli kranyotomi a ak saline esteril, epi yo te tache yon kouvèti lamèl ak yon zegwi tèt espesyal ak zo bwa tèt la avèk siman dantè ki geri ak UV (Relyx).
Yo te fè imaj de foton yo lè l sèvi avèk yon mikwoskòp miltifoton Bruker ak yon objektif Nikon LWD (×16, 0.8 NA). Yo te fè imaj GCaMP6 a 920 nm ak yon agrandisman 1.4x nan yon sèl plan z ak yon mwayèn 8x 7.5 fps. Yo te entwodui rat yo ak yon anestezi 5% izofluran epi yo te kenbe yo ak 1-3% izofluran. Yo te mete rat yo nan yon aparèy pou tèt ki te fèt espesyalman epi yo te pozisyone yo anba lantiy la. Yo te jwenn yon anrejistreman aktivite motè pandan 3 minit. Pandan 20 minit anrejistreman, yo te delivre 50 boufle (chak prezantasyon 100 ms longè) owaza nan kousinen moustach ki anfas t-hCO3 la lè l sèvi avèk yon picospricer. Sèvi ak Pake Sipò Arduino MATLAB la pou kontwole tan rafale a ak kòd MATLAB pèsonalize. Senkronize evènman yo ak lojisyèl akizisyon done (PrairieView 5.5) lè l sèvi avèk pulsasyon TTL. Pou analiz, yo te korije imaj yo pou mouvman xy lè l sèvi avèk koreksyon afin nan pwogram MoCo ki te lanse nan Fiji. Ekstraksyon tras fliyoresan nan selil endividyèl yo lè l sèvi avèk CNMF-E43. Yo te ekstrè fliyoresans pou chak rejyon enterè, konvèti an koub dF/F, epi answit konvèti an z-score.
Rat yo (plis pase 140 jou apre transplantasyon an) te sibi endiksyon ak anestezi 5% izofluran epi yo te anestezye yo ak 1-3% izofluran pandan operasyon an. Yo te mete bèt yo nan yon ankadreman estereyotaksik (Kopf) epi yo te enjekte buprenorfin SR ak deksametazòn anba po. Yo te koupe moustach yo ki sou lòt bò t-hCO a a anviwon 2 cm epi yo te pase yo nan yon may ki konekte ak yon aktuatè pyezoelektrik. Yo ekspoze epi netwaye zo bwa tèt la. Yo tache yon vis tè an asye pur ak zo bwa tèt la. Pou vize t-hCO a, nou te pwodui kowòdone estereyotaksik apati imaj IRM yo. Fè yon kranyotomi sikilè (apeprè 1 cm an dyamèt) ak yon egzèsis gwo vitès jis anlè t-hCO a. Yon fwa zo a vin osi mens ke posib, men anvan ou perfore tout zo a, sèvi ak yon pens pou retire disk basen ki entak ki rete a pou revele t-hCO ki anba a. Yo te anrejistre chak selil endividyèl lè l sèvi avèk sond silikon wo dansite 32 kanal oswa 64 kanal (Cambridge Neurotech) konekte ak vis ki konekte ak tè epi pre-anplifye ak anplifikatè RHD (Intan). Sèvi ak manipilatè a pou bese elektwòd yo nan sit sib la atravè kranyotomi a, ki ranpli ak saline esteril. Yo te kolekte done nan yon frekans 30 kHz lè l sèvi avèk sistèm akizisyon done Open Ephys la. Anrejistreman an te kontinye sèlman lè nou te detekte aktivite espontane ritmik ki trè korele nan plis pase 10 kanal, sa ki sijere ke elektwòd yo te sitiye nan grèf la (dapre done imaj kalsyòm de foton). Yo te jwenn yon anrejistreman aktivite motè pandan 10 minit. Lè sa a, yo te devye moustach yo sou lòt bò t-hCO3 a 50 fwa (2 mm a 20 Hz, 2 s pa prezantasyon) nan moman o aza pa yon kondwi pyezoelektrik sou yon peryòd anrejistreman 20 minit. Lè l sèvi avèk Pake Sipò MATLAB pou Arduino (MATLAB 2019b), kontwole tan devyasyon an ak kòd MATLAB pèsonalize. Sèvi ak pulsasyon TTL pou senkronize evènman yo ak lojisyèl akizisyon done.
Pou eksperyans make optik yo, yo te konekte yon kòd koneksyon optik 200 µm (Doric) konekte ak yon lazè 473 nm (Omicron) ak yon fib optik 200 µm ki te plase sou kranyotomi a. Touswit anvan sa, ajiste puisans jumper la a 20 mW. Sèvi ak manipilatè a pou bese elektwòd yo nan sit sib la atravè kranyotomi a, ki plen ak saline esteril. Nan kòmansman anrejistreman an, yo te emèt dis pulsasyon limyè 473 nm (frekans 2 Hz, dire pulsasyon 10 ms). Selil fotosansib yo te defini kòm selil ki te montre yon repons pik nan lespas 10 ms limyè nan 70% oswa plis nan esè yo.