Dėkojame, kad apsilankėte Nature.com. Naudojate naršyklės versiją su ribotu CSS palaikymu. Norėdami gauti geriausią patirtį, rekomenduojame naudoti atnaujintą naršyklę (arba išjungti suderinamumo režimą „Internet Explorer“). Be to, siekdami užtikrinti nuolatinį palaikymą, svetainę rodome be stilių ir „JavaScript“.
Rodo trijų skaidrių karuselę vienu metu. Naudokite mygtukus „Ankstesnis“ ir „Kitas“, kad vienu metu pereitumėte per tris skaidres, arba naudokite slankiklio mygtukus gale, kad vienu metu pereitumėte per tris skaidres.
Savaime besiformuojančios neuroninės organelės yra perspektyvi in ​​vitro platforma žmogaus vystymosi ir ligų modeliavimui. Tačiau organoidams trūksta in vivo egzistuojančio ryšio, o tai riboja brendimą ir neleidžia integruotis su kitomis elgimą kontroliuojančiomis grandinėmis. Šiame tyrime parodome, kad iš žmogaus kamieninių ląstelių gauti žievės organoidai, persodinti į naujagimių nuogų žiurkių somatosensorinę žievę, išsivysto brandžių ląstelių tipai, kurie integruojasi į jutimo ir motyvacijos grandines. MRT atskleidė organoidų augimą po transplantacijos keliose kamieninių ląstelių linijose ir gyvūnuose, o vieno branduolio analizė atskleidė kortikogenezės progresavimą ir aktyvumo priklausomos transkripcijos programos atsiradimą. Iš tiesų, persodinti žievės neuronai pasižymi sudėtingesnėmis morfologinėmis, sinapsinėmis ir vidinės membranos savybėmis nei jų in vitro atitikmenys, todėl galima aptikti neuronų defektus pacientams, sergantiems Timotijaus sindromu. Anatominis ir funkcinis sekimas parodė, kad persodintos organelės gauna talamokortikalinius ir kortikokortikalinius signalus, o neuronų aktyvumo įrašai in vivo rodo, kad šie signalai gali generuoti jutimo reakcijas žmogaus ląstelėse. Galiausiai, žievės organoidai ištiesia aksonus per visas žiurkių smegenis, o jų optogenetinė aktyvacija sukelia atlygio siekimo elgesį. Taigi, persodinti žmogaus žievės neuronai subręsta ir dalyvauja šeimininko neuronų grandinėse, kurios kontroliuoja elgesį. Tikimės, kad šis metodas palengvins grandinės lygio fenotipų aptikimą pacientų kilmės ląstelėse, kurių negalima aptikti kitais būdais.
Besivystančios žmogaus smegenys yra nepaprastas savaime organizuojamas procesas, kurio metu ląstelės dauginasi, diferencijuojasi, migruoja ir jungiasi, sudarydamos funkcines neuronų grandines, kurios toliau tobulinamos per jutiminę patirtį. Pagrindinė žmogaus smegenų vystymosi supratimo problema, ypač ligų kontekste, yra prieigos prie smegenų audinio stoka. Savaime organizuojamos organelės, įskaitant žmogaus žievės organoidus (hCO; dar žinomas kaip žmogaus žievės sfera), gali generuoti 2,3,4,5,6. Tačiau keli apribojimai riboja jų platesnį taikymą neuronų grandinių vystymuisi ir veikimui suprasti. Visų pirma, neaišku, ar hCO brendimą riboja tam tikrų mikroaplinkos ir sensorinių įvesties signalų nebuvimas in vivo. Be to, kadangi hCO nėra integruotos į grandines, galinčias generuoti elgesio rezultatus, jų naudingumas modeliuojant genetiškai sudėtingus ir elgesio neuropsichiatrinius sutrikimus šiuo metu yra ribotas.
HCO transplantacija į sveikas gyvas smegenis gali įveikti šiuos apribojimus. Ankstesni tyrimai parodė, kad į graužikų žievę persodinti žmogaus neuronai gali išgyventi, projektuoti signalus ir bendrauti su graužikų ląstelėmis7,8,9,10,11,12. Tačiau šie eksperimentai paprastai atliekami su suaugusiais gyvūnais, o tai gali riboti sinapsinę ir aksonų integraciją. Čia aprašome transplantacijos paradigmą, kurioje ankstyvoje plastinio vystymosi stadijoje į imunodeficito turinčių žiurkių pirminę somatosensorinę žievę (S1) persodinome iš hiPS ląstelių gautą 3D hCO. Persodinti hCO (t-hCO) neuronai gerokai subręsta, gauna talamokortikalinius ir kortikalinius-kortikalinius signalus, kurie sukelia sensorines reakcijas, ir plečia aksonų projekcijas į žiurkių smegenis, kad skatintų atlygio siekimo elgesį. Ilgalaikis t-hCO brendimas atskleidė neuronų defektus pacientams, sergantiems Timotijaus sindromu (TS) – sunkiu genetiniu sutrikimu, kurį sukelia įtampai jautraus L tipo CaV1.2 kalcio kanalo (koduojamo CACNA1C) mutacijos.
Norėdami in vivo tirti žmogaus žievės neuronus grandinėse, stereotaksiškai transplantavome nepažeistą 3D hCO3 į ankstyvųjų postnatalinių atiminių žiurkių S1 (3–7 dienomis po gimimo) (1a pav. ir išplėstiniai 1a–c pav. duomenys). Šiuo metu talamokortikalinės ir kortikokortikalinės aksonų projekcijos dar nėra baigusios inervuoti S1 (13 nuoroda). Taigi, šis metodas skirtas maksimaliai padidinti t-hCO3 integraciją, kartu sumažinant poveikį endogeninėms grandinėms. Norėdami vizualizuoti t-hCO3 vietą gyvuose gyvūnuose, atlikome T2 svertines MRT smegenų rekonstrukcijas žiurkėms praėjus 2–3 mėnesiams po transplantacijos (1b pav. ir išplėstiniai duomenys, 1d pav.). t-hCO buvo lengvai stebimi, o t-hCO tūrio matavimai buvo panašūs į tuos, kurie apskaičiuoti iš fiksuotų riekelių (išplėstiniai duomenys, 1d, e pav.; P > 0, 05). t-hCO buvo lengvai stebimi, o t-hCO tūrio matavimai buvo panašūs į tuos, kurie apskaičiuoti iš fiksuotų riekelių (išplėstiniai duomenys, 1d, e pav.; P > 0, 05). t-hCO легко наблюдались, а объемные измерения t-hCO были аналогичны рассчитанным для фиксировансрезох данные, рис 1d, P> 0,05). t-hCO buvo lengvai stebimi, o tūriniai t-hCO matavimai buvo panašūs į tuos, kurie apskaičiuoti fiksuotiems pjūviams (išplėstiniai duomenys, 1d, e pav.; P > 0, 05).很容易观察到t-hCO，并且t-hCO的体积测量值与从固定切片计算的测量值相似（扩展数据图、e；P > 0,05＀很容易观察到t-hCO，并且t-hCO t-hCO легко наблюдался, а объемные измерения t-hCO были аналогичны рассчитанным для фиксированшыревх данные, рис 1d, P> 0,05). t-hCO buvo lengvai stebimas, o tūriniai t-hCO matavimai buvo panašūs į tuos, kurie apskaičiuoti fiksuotiems pjūviams (išplėstiniai duomenys, 1d, e pav.; P > 0, 05).81 % persodintų gyvūnų t-hCO₂ nustatėme maždaug po 2 mėnesių po transplantacijos (n = 72 gyvūnai; hCO₂ iš 10 hiPS ląstelių linijų; hiPS ląstelių linijos pateiktos 1 papildomoje lentelėje). Iš jų 87 % buvo smegenų žievėje (1c pav.). Atlikdami serijinius MRT tyrimus keliais laiko momentais tai pačiai persodintai žiurkei, nustatėme devynis kartus padidėjusį t-hCO₂ tūrį per 3 mėnesius (1d pav. ir išplėstiniai duomenys, 1f pav.). Persodintų gyvūnų išgyvenamumas buvo didelis (74 %) praėjus 12 mėnesių po transplantacijos (išplėstiniai duomenys, 1g pav. ir 2 papildoma lentelė), o akivaizdžių motorikos ar atminties sutrikimų, gliozės ar elektroencefalogramos (EEG) nerasta. Duomenys pateikti 1g pav. ir 2 papildomoje lentelėje. 1h–m ir 3e).
a. Eksperimentinio plano schema. Iš hiPS ląstelių gautas hCO₂ buvo persodintas į naujagimių nuogų žiurkių S1 30–60 diferenciacijos dienomis. b. T2 svertiniai vainikiniai ir horizontalūs MRT vaizdai, rodantys t-hCO₂ S1 praėjus 2 mėnesiams po transplantacijos. Mastelio juosta, 2 mm. c. Kiekvienos hiPS ląstelių linijos (n = 108, skaičiai juostose rodo t-hCO₂ kiekį kiekvienoje hIPS ląstelių linijoje) ir žievės arba požievio vietos (n = 88) kiekybinis įsitvirtinimo sėkmės rodiklių įvertinimas. d. Vainikinės arterijos MRT vaizdas (kairėje; mastelio juosta, 3 mm) ir atitinkama 3D tūrinė rekonstrukcija (mastelio juosta, 3 mm), rodanti t-hCO₂ padidėjimą per 3 mėnesius. e. Žiurkių smegenų žievės t-hCO₂ modelių apžvalga. Mastelio juosta, 1 mm. f, Tipiniai t-hCO imunocitocheminiai vaizdai, pateikti iš viršaus į kairę į dešinę (diferenciacijos metu): PPP1R17 (4 mėnesių amžiaus), NeuN (8 mėnesių amžiaus), SOX9 ir GFAP (8 mėnesių amžiaus), PDGFRα; (8 mėnesių amžiaus), MAP2 (8 mėnesių amžiaus) ir IBA1 (8 mėnesių amžiaus). Mastelio juosta, 20 µm. HNA koekspresija rodo žmogaus kilmės ląsteles. g, snRNR seka: visų aukštos kokybės t-hCO branduolių vieningos daugialypės ir projekcijos (UMAP) matmenų mažinimo vaizdavimas po Seurat integracijos (n = 3 t-hCO mėginiai, n = 2 hiPS ląstelių linijos). Astrocitai, astrocitų linijos ląstelės; cyc prog, cirkuliuojantys pirmtakai; GluN DL, gilieji glutamaterginiai neuronai; GluN DL/SP, gilieji ir posluoksniniai glutamaterginiai neuronai; GluN UL, viršutinio sluoksnio glutamaterginiai neuronai; oligodendrocitai, oligodendrocitai; OPC, oligodendrocitų pirmtakinės ląstelės; RELN, reelino neuronai. h, genų ontologijos (GO) terminų praturtinimo analizė, atlikta su žymiai padidėjusia genų ekspresija (pakoreguota P 2, išreikšta mažiausiai 10% branduolių) t-hCO glutamaterginiuose neuronuose, palyginti su hCO glutamaterginiais neuronais. h, genų ontologijos (GO) terminų praturtinimo analizė, atlikta su žymiai padidėjusia genų ekspresija (pakoreguota P 2, išreikšta mažiausiai 10% branduolių) t-hCO glutamaterginiuose neuronuose, palyginti su hCO glutamaterginiais neuronais. h, Анализ обогащения терминов Genų ontologija (GO) для генов со значительной активацией (скорректированный P <0,05, книязминов, кратность экспрессия по крайней мере в 10% ядер) в глутаматергических нейронах t-hCO по сравнению с глутамачерских nejronami hCO. h, genų ontologijos (GO) terminų praturtinimo analizė genams, turintiems reikšmingą aktyvaciją (pakoreguotas P 2, ekspresija bent 10% branduolių) t-hCO glutamaterginiuose neuronuose, palyginti su hCO glutamaterginiais neuronais. h，与hCO 谷氨酸能神经元相比，t-hCO 谷氨酸能神经元中基因显着上调（调整0.05，倍数变化> 2，在至少10% 的细胞核中表达）的基因本体论(GO) 术语富雠 h ， 与 hco 谷氨酸 能 元 相比 ， t-hco 谷氨酸 能 神经 元 基因 显着 上谎 弐 5 p， 弎 弎变化 变化> 2 ， 至少 10% 的 核中 表达） 基因 基因 基因 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的的 的 的 的本体论(GO) 术语富集分析. h, гены значительно активизировались (скорректированный P <0,05, кратность изменения> 2, экспрессируется по крайне по крайне) глутаматергических нейронах t-hCO по сравнению с глутаматергическими нейронами hCO Онтологический () термина обогащения. h, t-hCO glutamaterginiuose neuronuose, palyginti su hCO glutamaterginiais neuronais, reikšmingai padidėjo genų ekspresija (pakoreguotas P 2, išreikštas bent 10% branduolių). Praturtėjimo termino ontologinė (GO) analizė.Punktyrinė linija žymi aq vertę, lygią 0,05. i, GluN ląstelių tipų UMAP vaizdinimas t-hCO3, naudojant žymės perkėlimą iš referencinio 22 snRNR-seq suaugusiųjų motorinės žievės duomenų rinkinio. KT – kortikotalaminės ląstelės, ET – ekstrasmegeninės ląstelės, IT – vidinės telencefalinės ląstelės, NP – artima projekcija.
Tada įvertinome t-hCO citoarchitektūrą ir bendrą ląstelių sudėtį. Žiurkių endotelio ląstelių dažymas antikūnais atskleidė t-hCO vaskuliarizaciją, o IBA1 dažymas atskleidė žiurkių mikroglijos buvimą visame transplantate (1f pav. ir išplėstiniai duomenys, 3c, d pav.). Imunodažymas atskleidė žmogaus branduolio antigeno (HNA) teigiamas ląsteles, kurios kartu ekspresuoja PPP1R17 (žievės pirmtakus), NeuN (neuronus), SOX9 ir GFAP (glijos kilmės ląsteles) arba PDGFRα (oligodendrocitų pirmtakus) (1f pav.). Norėdami ištirti t-hCO ląstelių sudėtį vienos ląstelės skiriamąja geba, atlikome vienos ląstelės RNR sekvenavimą (snRNR-seq) po maždaug 8 mėnesių diferenciacijos. Tūrinis filtravimas ir žiurkių branduolių pašalinimas davė 21 500 aukštos kokybės žmogaus mononuklearinių žemėlapių (1g pav. ir išplėstiniai duomenys, 4a, b pav.). Tipinių ląstelių tipų žymenų raiškos modeliai identifikavo pagrindinių žievės ląstelių klasių grupes, įskaitant giliuosius ir paviršinius glutamaterginius neuronus, cirkuliuojančius pirmtakus, oligodendrocitus ir astrocitų liniją (1g pav., išplėstiniai duomenys, 4c pav. ir 3 papildoma lentelė). Imunodažymas SATB2 ir CTIP2 parodė, kad nepaisant žievės potipių buvimo, t-hCO neparodė aiškios anatominės stratifikacijos (išplėstiniai duomenys, 3a pav.). Etapais suderinta snRNR-seq hCO išskyrė iš esmės panašias ląstelių klases, išskyrus keletą išimčių, įskaitant oligodendrocitų nebuvimą ir GABAerginių neuronų buvimą, o tai gali atspindėti anksčiau praneštas palankias in vitro sąlygas šoninėms pirmtakinėms ląstelėms15 (išplėstiniai duomenys, 4f–i pav. ir 4 papildoma lentelė). Diferencinės genų raiškos analizė atskleidė reikšmingus glutamaterginių neuronų skirtumus tarp t-hCO3 ir hCO3 (5 papildoma lentelė), įskaitant su neuronų brendimu susijusių genų rinkinių, tokių kaip sinapsinis signalizavimas, dendritų lokalizacija ir įtampos reguliuojamų kanalų aktyvumas, aktyvaciją (1h pav. ir 5 papildoma lentelė). Atitinkamai, žievės glutamaterginiai t-hCO3 neuronai pasižymėjo pagreitėjusiu transkripcijos brendimu.
Norėdami išsiaiškinti, ar šie transkripcijos pokyčiai t-hCO buvo susiję su morfologiniais skirtumais tarp hCO in vitro ir t-hCO in vivo, po 7–8 mėnesių diferenciacijos ūminiuose pjūviuose rekonstravome stadijose suderintus biocitinu užpildytus hCO ir hCO. hCO neuronai (2a pav.). t-hCO neuronai buvo žymiai didesni, turėjo 1,5 karto didesnį somos skersmenį, dvigubai daugiau dendritų ir bendrą šešis kartus didesnį dendritų ilgį, palyginti su in vitro hCO (2b pav.). Be to, pastebėjome žymiai didesnį dendritinių spyglių tankį t-hCO neuronuose nei hCO neuronuose (2c pav.). Tai rodo, kad t-hCO neuronai patiria didelį dendritų pailgėjimą ir šakojimąsi, o tai kartu su nuolatine ląstelių proliferacija gali prisidėti prie intensyvaus t-hCO augimo po transplantacijos (1d pav. ir išplėstiniai duomenys 1f pav.). Tai paskatino mus ištirti elektrofiziologines savybes. Membranos talpa buvo aštuonis kartus didesnė (išplėsti duomenys, 8d pav.), ramybės būsenos membranos potencialas buvo labiau hiperpoliarizuotas (maždaug 20 mV), o srovės injekcija sukėlė didesnį maksimalų sužadinimo greitį t-hCO neuronuose nei hCO neuronuose. In vitro (2d, e pav.) tai atitinka didesnius ir sudėtingesnius t-hCO morfologinius požymius. Be to, savaiminių sužadinamųjų posinapsinių srovių (EPSC) dažnis buvo žymiai didesnis t-hCO neuronuose (2f pav.), o tai rodo, kad padidėjęs dendritinių spyglių tankis, pastebėtas t-hCO neuronuose, buvo susijęs su funkciniu jaudrumu. Nesubrendus hCO neuronų pobūdis in vitro buvo patvirtintas registruojant žymėtus glutamaterginius neuronus (išplėsti duomenys, 6a–c pav.).
a, biocitinu užpildytų hCO3 ir t-hCO3 neuronų 3D rekonstrukcija po 8 mėnesių diferenciacijos. b, Morfologinių požymių kiekybinis įvertinimas (n = 8 hCO neuronai, n = 6 t-hCO neuronai; **P = 0, 0084, *P = 0, 0179 ir ***P < 0, 0001). b, Morfologinių požymių kiekybinis įvertinimas (n = 8 hCO neuronai, n = 6 t-hCO neuronai; **P = 0, 0084, *P = 0, 0179 ir ***P < 0, 0001). б, количественная оценка морфологических признаков (n = 8 нейронов hCO, n = 6 нейронов t-hCO; ** P = 0,0084, 0 P = 0,0084, 0 P = 9,0 *** 0). b, morfologinių požymių kiekybinis įvertinimas ( n = 8 hCO neuronai, n = 6 t-hCO neuronai; ** P = 0, 0084, * P = 0, 0179 ir *** P <0, 0001). b，形态学特征的量化（n = 8 个hCO 神经元，n = 6 个t-hCO 神经元；**P = 0,0084，*P = 90 0,0001). b，形态学特征的量化（n = 8 个hCO 神经元，n = 6 个t-hCO 神经元；**P = 0,0084，*P = 90 0,0001). б, количественная оценка морфологических признаков (n = 8 нейронов hCO, n = 6 нейронов t-hCO; ** P = 0,0084, 0 P = 0,0084, 0 P = 9,0 *** 0). b, morfologinių požymių kiekybinis įvertinimas ( n = 8 hCO neuronai, n = 6 t-hCO neuronai; ** P = 0, 0084, * P = 0, 0179 ir *** P <0, 0001).c, hCO ir t-hCO dendritinių šakų 3D rekonstrukcija po 8 mėnesių diferenciacijos. Raudonos žvaigždutės žymi tariamus dendritinius spyglius. Dendritinių spyglių tankio kiekybinis įvertinimas (n = 8 hCO neuronai, n = 6 t-hCO neuronai; **P = 0,0092). d, ramybės membranos potencialo kiekybinis įvertinimas (n = 25 hCO neuronai, n = 16 t-hCO neuronų; ***P <0, 0001). d, ramybės membranos potencialo kiekybinis įvertinimas (n = 25 hCO neuronai, n = 16 t-hCO neuronų; ***P <0, 0001). d, количественная оценка мембранного потенциала покоя (n = 25 нейронов hCO, n = 16 нейронов t-hCO; *** P <0,0001). d, ramybės būsenos membranos potencialo kiekybinis įvertinimas (n = 25 hCO neuronai, n = 16 t-hCO neuronų; ***P <0, 0001). d，静息膜电位的量化（n = 25 hCO 神经元，n = 16 t-hCO 神经元；***P < 0,0001）. d，静息膜电位的量化（n = 25 hCO 神经元，n = 16 t-hCO 神经元；***P < 0,0001）. d, количественная оценка мембранного потенциала покоя (n = 25 нейронов hCO, n = 16 нейронов t-hCO; *** P <0,0001). d, ramybės būsenos membranos potencialo kiekybinis įvertinimas (n = 25 hCO neuronai, n = 16 t-hCO neuronų; ***P <0, 0001). e, pasikartojantis veikimo potencialo sužadinimas hCO3 ir t-hCO3, sukeltas didėjant srovės injekcijoms, ir maksimalaus sužadinimo dažnio kiekybinis įvertinimas (n = 25 hCO3 neuronai, n = 16 t-hCO3 neuronų; ***P < 0, 0001). e, pasikartojantis veikimo potencialo sužadinimas hCO3 ir t-hCO3, sukeltas didėjant srovės injekcijoms, ir maksimalaus sužadinimo dažnio kiekybinis įvertinimas (n = 25 hCO3 neuronai, n = 16 t-hCO3 neuronų; ***P < 0, 0001). e, повторное возбуждение потенциала действия в hCO ir t-hCO, вызванное увеличением тока, и количественная скорости возбуждения (n = 25 нейронов hCO, n = 16 нейронов t-hCO; *** P <0,0001). e, hCO ir t-hCO veikimo potencialo pakartotinis sužadinimas, sukeltas srovės padidėjimo ir maksimalaus sužadinimo greičio kiekybinio įvertinimo (n = 25 hCO neuronai, n = 16 t-hCO neuronų; *** P < 0, 0001). e，通过增加电流注入诱导的hCO 和t-hCO 重复动作电位放电，以及最大放电 最大放电 5个hCO 神经元，n = 16 个t-hCO 神经元；***P < 0,0001）. E ， 通过 增加 电流 注入 的 的 hco 和 t-hco 重复 电位 放电 ， 以及 最 大 的 最 大 的 2个 hco 神经 ， n = 16 个 t-hco 神经 ； *** p <0,0001） 。 e, повторяющееся возбуждение потенциала действия hCO и t-hCO, вызванное увеличением подачи тока, и ковциенчи тока максимальной скорости возбуждения (n = 25 нейронов hCO, n = 16 нейронов t-hCO; *** P <0,0001). e, pasikartojantis hCO ir t-hCO veikimo potencialų sužadinimas, sukeltas padidėjusios srovės tiekimo ir maksimalaus sužadinimo greičio kiekybinis įvertinimas (n = 25 hCO neuronai, n = 16 t-hCO neuronų; *** P < 0, 0001). f, spontaniškos EPSC (sEPSC) hCO ir t-hCO neuronuose po 8 diferenciacijos mėnesių ir sinapsinių įvykių dažnio kiekybinis įvertinimas (n = 25 hCO neuronai, n = 17 t-hCO neuronų; ***P <0, 0001). f, spontaninės EPSC (sEPSC) hCO ir t-hCO neuronuose po 8 diferenciacijos mėnesių ir sinapsinių įvykių dažnio kiekybinis įvertinimas (n = 25 hCO neuronai, n = 17 t-hCO neuronų; ***P < 0,0001). f, спонтанные EPSC (sEPSC) в нейронах hCO ir t-hCO через 8 месяцев дифференцировки и количественная оценка синаптических событий (n = 25 нейронов hCO, n = 17 нейронов t-hCO; *** P <0,0001) . f, spontaniški EPSC (sEPSC) hCO ir t-hCO neuronuose po 8 mėnesių diferenciacijos ir sinapsinių įvykių dažnio kiekybinio nustatymo ( n = 25 hCO neuronai, n = 17 t-hCO neuronų; *** P <0, 0001). p神经元，n = 17 t-hCO 神经元；***P < 0,0001） . p神率的量匼（n = 25 hCO 神率的量匼（n = 25hCO P < 0,0001） . f, спонтанные EPSC (sEPSC) в нейронах hCO ir t-hCO через 8 месяцев дифференцировки и количественная оценка синаптических событий (n = 25 нейронов hCO, n = 17 нейронов t-hCO; *** P <0,0001). f, spontaninės EPSC (sEPSC) hCO ir t-hCO neuronuose po 8 mėnesių diferenciacijos ir sinapsinių įvykių dažnio kiekybinio įvertinimo (n = 25 hCO neuronai, n = 17 t-hCO neuronų; *** P <0, 0001).1208-2 eilutėje esantys bf, hCO3 ir t-hCO3 buvo paimti iš tos pačios diferenciacijos partijos, kuri buvo palaikoma lygiagrečiai. g, Genų rinkinių praturtinimo analizė (vienpusis Fisher'o tikslusis testas), atlikta su reikšmingai padidėjusia raiška (pakoreguotas P < 0,05, kartų pokytis > 2, išreikštas bent 10 % branduolių) t-hCO glutamaterginiuose neuronuose, palyginti su hCO glutamaterginiais neuronais, turinčiais ankstyvojo atsako (ERG) ir vėlyvojo atsako (LRG) aktyvumo priklausomų genų rinkinius, nustatytus iš in vivo pelių tyrimo16, ir žmogui būdingų LRG iš in vitro neuronų17. g, Genų rinkinių praturtinimo analizė (vienpusis Fisher'o tikslusis testas), atlikta su reikšmingai padidėjusia raiška (pakoreguotas P < 0,05, kartų pokytis > 2, išreikštas bent 10 % branduolių) t-hCO glutamaterginiuose neuronuose, palyginti su hCO glutamaterginiais neuronais, turinčiais ankstyvojo atsako (ERG) ir vėlyvojo atsako (LRG) aktyvumo priklausomų genų rinkinius, nustatytus iš in vivo pelių tyrimo16, ir žmogui būdingų LRG iš in vitro neuronų17. g, анализ обогащения набора генов (односторонний точный критерий Фишера) генов со значительной

,0,0,5 кратность изменения > 2, экспрессия по меньшей мере в 10% ядер) в глутаматергических нейронах t-hCO по сравнению с глутаматергическими нейронами hCO наборы генов как раннего (ERG), так и позднего (LRG) генов, стовтикими, зав идентифицированных в исследовании на мышах in vivo16, и специфических для человека LRG из нейронов in vitro17. g, genų rinkinių praturtėjimo analizė (vienpusis Fisher'o tikslusis testas) genų, kuriems būdingas reikšmingas aktyvavimas (pakoreguotas P < 0,05, kartų pokytis > 2, ekspresija bent 10 % branduolių), t-hCO glutamaterginiuose neuronuose, palyginti su ankstyvųjų (ERG) ir vėlyvųjų (LRG) aktyvumo priklausomų genų hCO glutamaterginių neuronų rinkiniais, nustatytais in vivo pelėse16 ir žmonėms būdingais LRG iš neuronų in vitro17. g，t-hCO谷氨酸能神经元与hCO谷氨酸能神经元相比，t -hCO谷氨酸能神经元显着上调（调整后P<0,05，倍数变化>2，在至少10%的细胞核中表达）的基因集富集分析（单侧F isher精确检验）从体内小鼠研究中鉴定的早期反应(ERG)和晚期反应(LRG) 活性依赖性基因的基因组16 和体外神经元17 中的人类特LRG异 g ， t-hco 谷氨酸 神经 元 与 hco 谷氨酸 神经 元 相比 ， t-hco 谷氨酸 神经 尃 调<0.05 ， 倍数> 2 ， 至少 至少 10%的 细胞 核中 表达） 的 集富集 分析 䧈单体内 小鼠 研究 中 的 早期 反应 反应 反应 和 晚期 反应 反应 (lrg) 活性 基因 的 基 基因 的 基 因 的 基 反应 和 晚期 反应 反应 (lrg)神经元 17 中 中 17 中 17的人类特异性LRG. g, глутаматергические нейроны t-hCO были значительно активизированы по сравнению с глутаматергическимие глутаматергическим (скорректированный P<0,05, кратность изменения> 2, не менее 10% Анализ обогащения набора генов (одностороней) тчстеный раннего ответа (ERG) ir позднего гены, зависящие от активности ответа (LRG), идентифицированные in исниясле vivo16 ir нейронах in vitro17. LRG, специфичные для человека. g, t-hCO3 glutamaterginių neuronų ekspresija buvo reikšmingai padidėjusi, palyginti su hCO3 glutamaterginiais neuronais (koreguotas P < 0,05, kartų pokytis > 2, bent 10 %). Ankstyvojo atsako (ERG) ir vėlyvojo atsako genų praturtinimo analizė (vienpusis Fisher'io tikslus testas), atsako aktyvumo priklausomi genai (LRG), nustatyti in vivo pelėse16 ir in vitro neuronuose17. Žmogui būdingi LRG.Punktyrinė linija rodo Bonferroni pakoreguotą P reikšmę, lygią 0,05. h, GluN geno raiška (kiekvieno geno pseudopaketas ir mastelio keitimas) buvo reikšmingai padidinta LRG genų snRNR-seq replikose t-hCO glutamaterginiuose neuronuose. i, imunodažymas, rodantis SCG2 raišką t-hCO (viršutinė) ir hCO (apatinė) neuronuose. Baltos rodyklės rodo SCG2+ ląsteles. Skalės juosta, 25 µm. Duomenys išreikšti kaip vidurkis ± standartinis nuokrypis.
Remiantis padidėjusiu t-hCO aktyvumu, pastebėtu ex vivo pjūviuose, snRNR-seq atskleidė nuo aktyvumo priklausomą genų transkriptų padidėjimą t-hCO, palyginti su hCO in vitro. Glutamaterginiai t-hCO neuronai ekspresavo didesnį genų, reguliuojančių vėlyvojo atsako aktyvumą, kiekį (2g, h pav.), kuris buvo nustatytas ankstesniuose tyrimuose su pelių ir žmonių neuronais16,17. Pavyzdžiui, BDNF18, SCG2 ir OSTN, primatams būdingas aktyvumą reguliuojantis genas, parodė padidėjusią ekspresiją t-hCO neuronuose, palyginti su hCO neuronais (2g-i pav.). Taigi, transkripcijos, morfologinės ir funkcinės analizės duomenimis, t-hCO neuronai pasižymėjo geresnėmis brendimo savybėmis, palyginti su hCO neuronais.
Siekdami toliau įvertinti t-hCO brendimo ryšį su žmogaus smegenų vystymusi, atlikome vaisiaus ir suaugusiojo žievės ląstelių tipų19,20 ir suaugusiųjų21,22 transkriptominius palyginimus, taip pat išsamius duomenis apie žievės genų raišką23 vystymosi metu (išplėsti duomenys, 5 pav.). Remiantis ankstesniais darbais24, bendra hCO ir t-hCO transkriptomo brendimo būsena 7–8 diferenciacijos mėnesiais iš esmės atitinka in vivo vystymosi laiką ir labiausiai atitinka vėlyvąjį vaisiaus gyvenimą (išplėstiniai duomenys, 5a pav.). Pažymėtina, kad t-hCO pastebėjome padidėjusį transkriptomo brandumą, palyginti su atitinkamo amžiaus hCO, taip pat transkriptomo aktyvaciją, susijusią su sinaptogeneze, astrogeneze ir mielinizacija (išplėsti duomenys, 5b–d pav.). Ląstelių lygmenyje radome plonesnio žievės potipio t-hCO įrodymų, kai glutamaterginių neuronų grupės persidengia su suaugusiųjų L2/3, L5 ir L6 neuronų potipiais (1i pav.). Priešingai, glutamaterginių t-hCO neuronų ir vaisiaus žievės neuronų klasterių persidengimas nėštumo viduryje buvo labiau ribotas (išplėsti duomenys, 5e-j pav.). Norėdami nustatyti, ar t-hCO neuronai yra funkciškai panašūs į žmogaus postnatalinius neokortikalinius neuronus, atlikome žmogaus L2/3 piramidinių neuronų elektrofiziologinius įrašus ir anatomines rekonstrukcijas aštriuose žmogaus postnatalinės žievės pjūviuose (išplėsti duomenys, 7a pav.). L2/3 piramidinių neuronų elektrofiziologinės savybės buvo panašios į t-hCO piramidinių neuronų savybes (išplėsti duomenys, 7e pav.). Morfologiškai L2/3 neuronai iš postnatalinių žmogaus mėginių buvo panašesni į t-hCO nei į hCO, nors L2/3 ląstelės buvo ilgesnės, turėjo daugiau šakų ir didesnį stuburo tankį (3g pav. ir išplėstiniai duomenys, 7b-G pav.).
a, kontrolinių ir TS hiPS ląstelių linijų išgautos hCO₃ transplantacija į naujagimių žiurkes. b, biocitinu užpildytų t-hCO₃ neuronų 3D rekonstrukcija po 8 mėnesių diferenciacijos. c, vidutinio dendrito ilgio kiekybinis įvertinimas (n = 19 kontrolinių neuronų, n = 21 TS neuronas; **P = 0,0041). d, 3D rekonstruotos dendritinės šakos iš kontrolinės ir TS t-hCO 8 diferenciacijos mėnesių laikotarpiu ir dendritinių stuburo šakų tankio kiekybinis įvertinimas (n = 16 kontrolinių neuronų, n = 21 TS neuronas, ***P <0, 0001). d, 3D rekonstruotos dendritinės šakos iš kontrolinės ir TS t-hCO 8 diferenciacijos mėnesių laikotarpiu ir dendritinių stuburo šakų tankio kiekybinis įvertinimas (n = 16 kontrolinių neuronų, n = 21 TS neuronas, ***P <0, 0001). d, 3D-реконструкция дендритных ветвей из контроля и TS t-hCO через 8 месяцев дифференцировки и коленчеост плотности дендритных шипов (n = 16 контрольных нейронов, n = 21 TS нейронов, *** P <0,0001). d, dendritinių šakų 3D rekonstrukcija iš kontrolinės ir t-hCO TS po 8 diferenciacijos mėnesių ir dendritinio stuburo tankio kiekybinio nustatymo ( n = 16 kontrolinių neuronų, n = 21 TS neuronas, *** P <0, 0001). d，分化8 个月时对照和TS t-hCO 的3D 重建树突分支，以及树突棘密度的量n化16个对照神经元，n = 21 个TS 神经元，***P < 0,0001）. d ， 分化 8 个 时 对照 和 ts t-hco 的 3d 重建 分支 分支 以及 树突棘 密度 重 棘 密度神经 元 ， n = 21 个 ts 神经 ， *** p <0,0001 ）. d, 3D-реконструкция дендритных ветвей контроля и TS t-hCO через 8 месяцев дифференцировки и колинцияполостная колинче дендритных шипов (n = 16 контрольных нейронов, n = 21 TS нейронов, *** P <0,0001). d, kontrolinių dendritinių šakų ir TS t-hCO 3D rekonstrukcija po 8 diferenciacijos mėnesių ir dendritinių stuburo tankio kiekybinio nustatymo ( n = 16 kontrolinių neuronų, n = 21 TS neuronas, *** P <0, 0001).Raudonos žvaigždutės žymi galimas dendritines dygliuotus augalus. e, savaiminės EPSC kontroliniuose ir TS t-hCO neuronuose po 8 mėnesių diferenciacijos. f, kaupiamojo dažnio grafikas ir sinapsinių įvykių dažnio bei amplitudės kiekybinis įvertinimas (n = 32 kontroliniai neuronai, n = 26 TS neuronai; **P = 0,0076 ir P = 0,8102). g, Scholl analizė TS ir kontroliniams neuronams hCO ir t-hCO. Punktyrinės linijos rodo žmogaus L2/3 postnatalinius piramidinius neuronus palyginimui (n = 24 kontroliniai t-hCO neuronai, n = 21 TS t-hCO neuronas, n = 8 kontroliniai hCO neuronai ir n = 7 TS hCO neuronai). Duomenys išreikšti kaip vidurkis ± standartinis nuokrypis.
t-hCO gebėjimas aukštu lygiu atkartoti žmogaus žievės neuronų morfologinius ir funkcinius požymius paskatino mus ištirti, ar t-hCO galėtų būti naudojamas ligų fenotipams aptikti. Mes sutelkėme dėmesį į TS – sunkų neurologinės raidos sutrikimą, kurį sukelia CaV1.2 koduojančio geno, kuris inicijuoja nuo aktyvumo priklausomą genų transkripciją neuronuose, funkcijos padidėjimo mutacijos. Gavome hCO iš trijų TS pacientų, turinčių dažniausią pakaitą (p.G406R), ir trijų kontrolinių grupių (3a pav.). Po transplantacijos nustatėme, kad TS neuronų dendritų morfologija buvo pakitusi, palyginti su kontrolinėmis grupėmis (3b pav. ir išplėstiniai duomenys, 8a,b pav.), dvigubai padidėjo pirminių dendritų skaičius ir bendras vidutinio bei bendro dendritų ilgio sumažėjimas (3c pav. ir išplėstiniai duomenys, 8c pav.). Tai buvo susiję su padidėjusiu spyglių tankiu ir padidėjusiu spontaninių EPSC dažniu TS, palyginti su kontroliniais neuronais (3d–f pav. ir išplėstiniai duomenys, 8g pav.). Tolesnė analizė atskleidė nenormalių dendritų išsišakojimo modelius t-hCO TS, palyginti su kontrolinėmis grupėmis, bet ne in vitro TS hCO panašioje diferenciacijos stadijoje (3g pav.). Tai atitinka mūsų ankstesnes ataskaitas apie aktyvumo priklausomą dendritų susitraukimą TS ir pabrėžia šios transplantacijos platformos gebėjimą aptikti ligos fenotipus in vivo.
Tada klausėme, kiek t-hCO ląstelės yra funkciškai integruotos į žiurkės S1. Graužikų S1 gauna stiprius sinapsinius impulsus iš ipsilateralinio ventralinio bazinio ir užpakalinio talamo branduolių, taip pat iš ipsilateralinio motorinio ir antrinio somatosensorinių žievių bei kontralateralinio S1 (4a pav.). Norėdami atkurti inervacijos modelį, užkrėtėme hCO pasiutligės virusu-dG-GFP/AAV-G ir po 3 dienų persodinome hCO S1 žiurkei. 7–14 dienų po transplantacijos ipsilateralinio S1 ir ventralinių bazinių ganglijų neuronuose stebėjome tankią GFP raišką (4b, c pav.). Be to, talamo žymeklio netrino G1 antikūnų dažymas atskleidė talamo galūnių buvimą t-hCO (4d, e pav.). Norėdami įvertinti, ar šios aferentinės projekcijos gali sukelti sinapsinius atsakus t-hCO ląstelėse, atlikome viso ląstelių įrašus iš žmogaus ląstelių aštriuose talamokortikalinio sluoksnio pjūviuose. Žiurkės S1, vidinės kapsulės, baltosios medžiagos, skaidulų šalia t-hCO elektrinė stimuliacija arba opsiną ekspresuojančių talamo galūnių optogenetinė aktyvacija t-hCO sukėlė trumpo latentumo EPSC t-hCO neuronuose, veikiamuose AMPA receptorių antagonisto NBQX. (4f, g pav. ir išplėstiniai duomenys, 9a–g pav.). Šie duomenys rodo, kad t-hCO yra anatomiškai integruotas į žiurkės smegenis ir gali būti aktyvuojamas žiurkės šeimininko audinių.
a, Pasiutligės sekimo eksperimento schema. b, GFP ir žmogui būdinga STEM121 raiška tarp t-hCO ir žiurkės smegenų žievės (viršutinė panelė). Taip pat parodyta GFP raiška žiurkės ipsilateraliniame ventraliniame baziniame branduolyje (VB) (apačioje kairėje) ir ipsilateraliniame S1 (apačioje dešinėje). Mastelio juosta, 50 µm. Raudoni kvadratai žymi smegenų sritis, kuriose buvo padaryti vaizdai. c, ląstelių, ekspresuojančių GFP, kiekybinis įvertinimas (n = 4 žiurkės). d, e — Netrin G1+ talamo terminalai t-hCO. d rodo vainikinį pjūvį, kuriame yra t-hCO ir VB branduoliai. Mastelio juosta, 2 mm. e rodo Netrin G1 ir STEM121 raišką t-hCO (kairėje) ir VB (dešinėje) neuronuose. Mastelio juosta, 50 µm. Oranžinė punktyrinė linija žymi t-hCO ribą. f, g, t-hCO neuronų srovės kreivės po elektrinės stimuliacijos S1 žiurkėje (f) arba vidinėje kapsulėje (g), su (violetinė) arba be (juoda) NBQX (kairėje). EPSC amplitudės su ir be NBQX (n = 6 S1 neuronai, *P = 0,0119; ir n = 6 vidinės kapsulės neuronai, **P = 0,0022) (centre). t-hCO neuronų, rodančių EPSC, procentinė dalis reaguojant į elektrinę žiurkės S1 (f) arba vidinės kapsulės (g) stimuliaciją (dešinėje). aCSF, dirbtinis smegenų skystis. h, 2P vaizdavimo eksperimento schema (kairėje). GCaMP6 raiška t-hCO (viduryje). Mastelio juosta, 100 µm. GCaMP6 fluorescencijos laiko intervalas (dešinėje). i, savaiminio aktyvumo fluorescencijos Z balas. j, ūsų stimuliacijos schema. k, z balais įvertintos 2P fluorescencijos trajektorijos viename bandyme, sulygiuotos su ūsų nuokrypiu nuliniu laiko momentu (punktyrinė linija) pavyzdinėse ląstelėse. l, visų ląstelių populiacijos vidurkio z balų atsakai, sulygiuoti su ūsų nuokrypiu nuliniu laiko momentu (punktyrinė linija) (raudona) arba atsitiktinai sugeneruotomis laiko žymomis (pilka). m. Optinio žymėjimo eksperimento schema. n, Neapdorotos įtampos kreivės iš pavyzdinės t-hCO ląstelės mėlynojo lazerio stimuliacijos arba ūsų nukreipimo metu. Raudonos rodyklės rodo pirmuosius šviesos sukeltus šuolius (viršuje) arba ūsų nukreipimo sukeltus šuolius (apačioje). Pilkas šešėliavimas rodo ūsų nukreipimo periodus. o, Didžiausios šviesos bangos formos ir ūsų nukreipimo atsakai. p, vieno bandymo šuoliai, sulygiuoti su ūsų nuokrypiu pavyzdžio ląstelėse. 0 rodo ūsų nuokrypį (punktyrinė linija). q, visų šviesai jautrių ląstelių populiacijos vidurkio z balų suaktyvėjimo dažnis, sulygiuotas su ūsų nuokrypiu nuliniu laiko momentu (punktyrinė linija) (raudona) arba atsitiktinai sugeneruotomis laiko žymomis (pilka). r, Šviesai jautrių vienetų, kuriuos reikšmingai moduliuoja ūsų nuokrypis, dalis (n = 3 žiurkės) (kairėje). Didžiausia z balo latencija (n = 3 žiurkės; n = 5 (šviesiai žalia), n = 4 (tamsiai žalia) ir n = 4 (žydra) ūsų nuokrypio moduliacijos vienetai vienai žiurkei) (dešinėje). Duomenys išreikšti kaip vidurkis ± standartinis nuokrypis.
Tada paklausėme, ar t-hCO₂ gali būti aktyvuojamas sensoriniais dirgikliais in vivo. Į S1 žiurkes persodinome hCO₂, ekspresuojančią genetiškai užkoduotus kalcio indikatorius GCaMP6. Po 150 dienų atlikome pluošto fotometriją arba dviejų fotonų kalcio vaizdinimą (4h pav. ir išplėstiniai duomenys, 10a pav.). Nustatėme, kad t-hCO₂ ląstelės demonstravo sinchronizuotą ritminį aktyvumą (4i pav., išplėstiniai duomenys, 10b pav. ir 1 papildomas vaizdo įrašas). Norėdami apibūdinti didžiausią t-hCO₂ aktyvumą, atlikome ekstraceliulinius elektrofiziologinius įrašus anestezuotoms transplantuotoms žiurkėms (išplėstiniai duomenys, 10c–f pav.). Iš MRT vaizdų sugeneravome stereotaksines koordinates; taigi, šie užfiksuoti vienetai atspindi tariamus žmogaus neuronus, nors vien elektrofiziologija neleidžia nustatyti kilmės rūšies. Stereotaksinius aktyvumo pliūpsnius stebėjome (išplėstiniai duomenys, 10d pav.). Pliūpsniai truko apie 460 ms ir buvo atskirti maždaug 2 s tylos periodais (išplėstiniai duomenys, 10d, e pav.). Atskiri vienetai vidutiniškai iššovė apie tris šūvius per pliūpsnį, tai sudaro maždaug 73 % užregistruotų vienetų per pliūpsnį. Atskirų vienetų aktyvumas buvo labai koreliuojamas, ir šios koreliacijos buvo didesnės nei vienetų, identifikuotų nevakcinuotiems gyvūnams, užfiksuotų tomis pačiomis sąlygomis (išplėsti duomenys, 10f pav.). Norėdami toliau apibūdinti identifikuotų žmogaus kilmės neuronų impulsų atsakus, atlikome šviesos žymėjimo eksperimentus su anestezuotomis žiurkėmis, kurioms buvo persodintas hCO₂, ekspresuojantis šviesai jautrų katijonų kanalą rodopsiną 2 (hChR2), per kurį t-hCO neuronai trumpai (mažiau nei 10 ms) atpažįsta neuronus, reaguodami į mėlynos šviesos dirgiklius (4m–o pav.). t-hCO neuronai demonstravo savaiminio aktyvumo pliūpsnius dažniais, panašiais į tuos, kurie stebimi kalcio vaizdavime, taip pat elektrofiziologiniuose įrašuose, atliktuose t-hCO₂ be šviesos žymėjimo (išplėsti duomenys, 10c–g pav.). Atitinkamuose hCO₂ etapuose, užfiksuotuose in vitro, savaiminio aktyvumo nepastebėta. Norėdami įvertinti, ar t-hCO₃ gali būti aktyvuojamas sensorinių dirgiklių, trumpam nukreipėme žiurkės ūsus nuo t-hCO₃ (4j, m pav. ir išplėstiniai duomenys, 10h, k pav.). Remiantis ankstesniais tyrimais8,10, dalis t-hCO₃ ląstelių parodė padidėjusį aktyvumą reaguodama į ūsų nukreipimą, tačiau to nepastebėta, kai duomenys buvo lyginami su atsitiktiniais laiko žymomis (4k–q pav. ir išplėstiniai duomenys, 10h–q pav.). Iš tiesų, apie 54 % optoženklintų pavienių vienetų parodė žymiai padidėjusį susijaudinimo dažnį po ūsų stimuliacijos, kuris pasiekė piką maždaug po 650 ms (4r pav.). Apibendrinus šiuos duomenis, galima teigti, kad t-hCO₃ gauna tinkamus funkcinius signalus ir gali būti aktyvuojamas aplinkos dirgiklių.
Tada tyrėme, ar t-hCO gali aktyvuoti žiurkių neuronų grandines, kontroliuodamas elgesį. Pirmiausia tyrėme, ar t-hCO neuronų aksonai projektuojasi į aplinkinius žiurkės audinius. Užkrėtėme hCO lentivirusu, koduojančiu hChR2, sujungtu su EYFP (hChR2-EYFP). Po 110 dienų stebėjome EYFP raišką ipsilateraliniuose žievės regionuose, įskaitant klausos, motorinę ir somatosensorinę žieves, taip pat požieviniuose regionuose, įskaitant dryžuotąjį kūną, hipokampą ir talamą (5a pav.). Norėdami įvertinti, ar šios eferentinės projekcijos gali sukelti sinapsinius atsakus žiurkių ląstelėse, optiškai aktyvavome t-hCO ląsteles, ekspresuojančias hChR2-EYFP, registruodami žiurkių smegenų žievės ląsteles ryškiuose smegenų pjūviuose. T-hCO aksonų aktyvavimas mėlyna šviesa sukėlė trumpo latencijos EPSC žiurkių piramidinės žievės neuronuose, kuriuos blokavo NBQX (5b–g pav.). Be to, šiuos atsakus galėjo blokuoti tetrodotoksinas (TTX) ir atkurti 4-aminopiridinas (4-AP), o tai rodo, kad juos sukėlė monosinapsiniai ryšiai (5e pav.).
a, Aksonų sekimo schema (kairėje). t-hCO₃ EYFP raiška (dešinėje). Mastelio juosta, 100 µm. A1, klausos žievė, ACC, priekinė cingulinė žievė, d. dryžuotasis kūnas, nugarinis dryžuotasis kūnas, HPC, hipokampas; Diafragma, šoninė pertvara, mPFC, medialinė prefrontalinė žievė, piriforminė žievė, v. dryžuotasis kūnas, ventralinis dryžuotasis kūnas, VPM, ventropostomedialinis talamo branduolys, VTA, ventralinis tegmentinis regionas. Raudoni kvadratai žymi smegenų sritis, kuriose buvo daryti vaizdai. b, Stimuliacijos eksperimento schema. c, d, Mėlynos šviesos sukeltos fotosrovės (viršuje) ir įtampos (apačioje) atsako pavyzdžiai žmogaus (c) EYFP+ t-hCO₃ arba žiurkės (d) EYFP- ląstelėse. e, f, Žiurkių neuronų srovės kreivės po t-hCO aksonų stimuliacijos mėlyna šviesa TTX ir 4-AR (žalia), TTX (pilka) arba aCSF (juoda) (e), su (violetinė) arba be (juoda)) ) NBQX (e). g, mėlynos šviesos sukeltų atsakų latencija žiurkių ląstelėse (n = 16 ląstelių); horizontalios juostos rodo vidutinę latenciją (7,13 ms) (kairėje). Šviesos sukeltų EPSC amplitudė, užfiksuota su NBQX arba be jo (n = 7 ląstelės; ***P < 0, 0001) (viduryje). Šviesos sukeltų EPSC amplitudė, užfiksuota su NBQX arba be jo (n = 7 ląstelės; ***P < 0, 0001) (viduryje). Амплитуда вызванных светом EPSC, зарегистрированных с или без NBQX (n = 7 клеток; ***P <0,0001) (в центре). Šviesos sukeltų EPSC amplitudė, užregistruota su NBQX arba be jo (n = 7 ląstelės; ***P < 0, 0001) (centre).使用或不使用NBQX 记录的光诱发EPSC 的振幅（n = 7 个细胞；***P < 0,0001）（中）使用或不使用NBQX 记录的光诱发EPSC 的振幅（n = 7 个细胞；***P < 0,0001）（中） Амплитуда вызванных светом EPSC, зарегистрированных с или без NBQX (n = 7 клеток; ***P <0,0001) (в центре). Šviesos sukeltų EPSC amplitudė, užregistruota su NBQX arba be jo (n = 7 ląstelės; ***P < 0, 0001) (centre).Žiurkių ląstelių, rodančių į mėlyną šviesą reaguojančias EPSC, procentinė dalis (dešinėje). h, elgesio užduoties schema. d0, 0 diena. i. Pavyzdinių gyvūnų pasirodymas 1-ąją (kairėje) arba 15-ąją (dešinėje) mokymo dieną. Vidutinis laižymų skaičius, atliktas 1 dieną (kairėje) arba 15 dieną (dešinėje centre) (n = 150 mėlynos šviesos bandymų, n = 150 raudonos šviesos bandymų; ***P < 0,0001). Vidutinis laižymų skaičius, atliktas 1 dieną (kairėje) arba 15 dieną (dešinėje centre) (n = 150 mėlynos šviesos bandymų, n = 150 raudonos šviesos bandymų; ***P < 0,0001). Среднее количество облизываний, выполненных в день 1 (слева) или день 15 (в центре справа, в центре справа) = n = 150 испыта 150 испытаний с красным светом ***P <0,0001). Vidutinis laižymų skaičius, atliktas 1 dieną (kairėje) arba 15 dieną (dešinėje centre) (n = 150 mėlynos šviesos bandymų, n = 150 raudonos šviesos bandymų; ***P < 0,0001).第1 天（左）或第15 天（右中）执行的平均舔次数（n = 150 次蓝光试验150，n次红光试验；***P < 0,0001）.第1 天（左）或第15 天（右中）执行的平均舔次数（n = 150 次蓝光试验150，n次红光试验；***P < 0,001 Среднее количество облизываний, выполненных в день 1 (слева) или день 15 (в центре справа, в центре справа) = n = 150 испыта 150 испытаний с красным светом ***P <0,0001). Vidutinis laižymų skaičius, atliktas 1 dieną (kairėje) arba 15 dieną (dešinėje centre) (n = 150 mėlynos šviesos bandymų, n = 150 raudonos šviesos bandymų; ***P < 0,0001).Kaupiamieji raudonos ir mėlynos šviesos bandymų laižymų duomenys 1 dieną (centre kairėje) arba 15 dieną (dešinėje). NS – statistiškai nereikšmingas. j, k – Visų gyvūnų, kuriems 1 arba 15 dieną buvo persodintas t-hCO₃, ekspresuojantis hChR2-EYFP (j) arba kontrolinis fluoroforas (k), elgesio charakteristikos (hChR2-EYFP: n = 9 žiurkės, ** P = 0,0049; kontrolinė: n = 9, P = 0,1497). l, Pirmenybės balo evoliucija (n = 9 hChR2, n = 9 kontrolinė grupė; **P < 0,001, ***P < 0,0001). l, Pirmenybės balo evoliucija (n = 9 hChR2, n = 9 kontrolinė grupė; **P < 0,001, ***P < 0,0001). l, Эволюция показателя предпочтения (n = 9 hChR2, n = 9 контрольных; **P <0,001, ***P <0,0001). l, Pirmenybės balo evoliucija (n = 9 hChR2, n = 9 kontrolinės grupės; **P < 0,001, ***P < 0,0001). l，偏好评分的演变（n = 9 hChR2，n = 9 对照；**P < 0,001，***P < 0,0001）. l，偏好评分的演变（n = 9 hChR2，n = 9 对照；**P < 0,001，***P < 0,0001）. l, Эволюция показателей предпочтения (n = 9 hChR2, n = 9 контролей; **P <0,001, ***P <0,0001). l, Pirmenybės balų evoliucija (n = 9 hChR2, n = 9 kontrolinės grupės; **P < 0,001, ***P < 0,0001).m, FOS ekspresija reaguojant į t-hCO3 optogenetinį aktyvavimą S1. Rodomi FOS ekspresijos vaizdai (kairėje) ir kiekybinis įvertinimas (n = 3 kiekvienoje grupėje; *P <0, 05, **P <0, 01 ir ***P <0, 001) (dešinėje). Rodomi FOS ekspresijos vaizdai (kairėje) ir kiekybinis įvertinimas (n = 3 kiekvienoje grupėje; *P <0, 05, **P <0, 01 ir ***P <0, 001) (dešinėje). Показаны изображения экспрессии FOS (слева) ir количественного определения (n = 3 на группу; * P < 0,05, ** P < 0,05, ** P < 0,01 прасва1, 0,01 ). Rodomi FOS ekspresijos vaizdai (kairėje) ir kiekybinis įvertinimas (n = 3 kiekvienoje grupėje; *P <0, 05, **P <0, 01 ir ***P <0, 001) (dešinėje).显示了FOS 表达（左）和量化（每组n = 3；*P < 0,05、**P < 0,01 和***P。 0,001）徚叀）显示了FOS 表达（左）和量化（每组n = 3；*P < 0,05、**P < 0,01 和***P。 0,001）徚叀） Показаны изображения экспрессии FOS (слева) ir количественного определения (n = 3 на группу; * P < 0,05, ** P < 0,05, ** P < 0,01 прасва1, 0,01 ). Rodomi FOS ekspresijos vaizdai (kairėje) ir kiekybinis įvertinimas (n = 3 kiekvienoje grupėje; *P <0, 05, **P <0, 01 ir ***P <0, 001) (dešinėje).Mastelio juosta, 100 µm. Duomenys išreikšti kaip BLA, bazolateralinės tonzilės, MDT, dorsomedialinio talamo branduolio, PAG, periaqueductal pilkosios srities vidurkis ± standartinė paklaida.
Galiausiai paklausėme, ar t-hCO3 gali moduliuoti žiurkių elgesį. Norėdami tai patikrinti, į S1 persodinome hChR2-EYFP ekspresuojančią hCO3, o po 90 dienų į t-hCO3 implantavome optinius pluoštus šviesai tiekti. Tada žiurkes treniravome modifikuota operantinio sąlygojimo paradigma (5h pav.). Gyvūnus patalpinome į elgesio tyrimo kamerą ir atsitiktine tvarka taikėme 5 sekundžių mėlyno (473 nm) ir raudono (635 nm) lazerio stimuliatorius. Gyvūnai gaudavo vandens atlygį, jei laižydavo mėlynos šviesos stimuliacijos metu, bet nelaižydavo raudonos šviesos stimuliacijos metu. Pirmąją treniravimo dieną gyvūnų laižymasis nesiskyrė, kai jie buvo stimuliuojami mėlyna ar raudona šviesa. Tačiau 15 dieną gyvūnai, kuriems buvo persodintas hCO3, ekspresuojantis hChR2-EYFP, parodė aktyvesnį laižymąsi, kai buvo stimuliuojami mėlyna šviesa, palyginti su raudonos šviesos stimuliacija. Šie laižymosi elgesio pokyčiai nebuvo pastebėti kontroliniams gyvūnams, kuriems buvo persodintas hCO3, ekspresuojantis kontrolinį fluoroforą (mokymosi sėkmės rodiklis: hChR2 89 %, EYFP 0 %, 5i-1 pav. ir 2 papildomas vaizdo įrašas). Šie duomenys rodo, kad t-hCO ląstelės gali aktyvuoti žiurkių neuronus, kad paskatintų atlygio siekimo elgesį. Norėdami išsiaiškinti, kurios žiurkių t-hCO neuronų grandinės gali būti susijusios su šiais elgesio pokyčiais, optogenetiniu būdu aktyvavome t-hCO apmokytuose gyvūnuose ir po 90 minučių surinkome audinius. Imunohistochemija atskleidė aktyvumo priklausomo FOS baltymo ekspresiją keliose smegenų srityse, susijusiose su motyvuotu elgesiu, įskaitant medialinę prefrontalinę žievę, medialinę talamą ir periakveduklinę pilkąją medžiagą, kuri buvo ekspresuojama arba nestimuliuotų kontrolinių gyvūnų, arba gyvūnų. ryžiai. 5m). Apibendrinus, šie duomenys rodo, kad t-hCO gali moduliuoti žiurkių neuronų aktyvumą, kad paskatintų elgesį.
Neuroniniai organoidai yra perspektyvi sistema žmogaus vystymuisi ir ligoms tirti in vitro, tačiau juos riboja ryšių tarp in vivo egzistuojančių neuronų grandinių trūkumas. Sukūrėme naują platformą, kurioje persodinome hCO į imunodeficito turinčių ankstyvojo postnatalinio amžiaus žiurkių S1, kad tirtume žmogaus ląstelių vystymąsi ir funkciją in vivo. Parodėme, kad t-hCO vysto subrendusius ląstelių tipus, kurių in vitro nepastebėta28, ir kad t-hCO yra anatomiškai ir funkciškai integruotas į graužikų smegenis. t-hCO integracija į graužikų neuronų grandines leido mums nustatyti ryšį tarp žmogaus ląstelių aktyvumo ir tirto gyvūnų elgesio, parodant, kad t-hCO neuronai gali moduliuoti žiurkių neuronų aktyvumą, kad skatintų elgesio reakcijas.
Mūsų aprašyta platforma turi keletą pranašumų, palyginti su ankstesniais žmogaus ląstelių transplantacijos į graužikų smegenis tyrimais. Pirma, persodinome hCO3 į besivystančią ankstyvojo postnatalinio žiurkių smegenų žievę, o tai gali palengvinti anatominę ir funkcinę integraciją. Antra, t-hCO3 MRT stebėjimas leido mums ištirti transplantato padėtį ir augimą gyvuose gyvūnuose, todėl galėjome atlikti ilgalaikius tyrimus su keliais gyvūnais ir nustatyti kelių hiPS ląstelių linijų patikimumą. Galiausiai, persodinome nepažeistus organoidus, o ne izoliuotas pavienių ląstelių suspensijas, kurios yra mažiau žalingos žmogaus ląstelėms ir gali skatinti žmogaus žievės neuronų integraciją ir generaciją žiurkių smegenyse.
Pripažįstame, kad nepaisant šios platformos pažangos, laiko, erdvės ir tarprūšiniai apribojimai neleidžia formuotis žmogaus neuroninėms grandinėms su didele preciziškumu, net ir po transplantacijos ankstyvoje vystymosi stadijoje. Pavyzdžiui, neaišku, ar savaiminis aktyvumas, stebimas t-hCO, atspindi vystymosi fenotipą, panašų į ritminį aktyvumą, stebimą žievės vystymosi metu, ar tai lemia slopinamųjų ląstelių tipų nebuvimas t-hCO. Taip pat neaišku, kiek laminacijos nebuvimas t-hCO veikia grandinės jungiamumą30. Būsimas darbas bus sutelktas į kitų ląstelių tipų, tokių kaip žmogaus mikroglija, žmogaus endotelio ląstelės ir įvairios GABAerginių interneuronų proporcijos, integravimą, kaip parodyta naudojant 6 surinkimą in vitro, taip pat į supratimą, kaip neuronų integracija ir apdorojimas gali vykti pakitusiuose t-hCO transkripcijos, sinapsės ir elgesio lygiuose ląstelėse, gautose iš pacientų.
Apskritai ši in vivo platforma yra galingas išteklius, galintis papildyti in vitro žmogaus smegenų vystymosi ir ligų tyrimus. Tikimės, kad ši platforma leis mums atrasti naujus grandinės lygio fenotipus kitaip sunkiai aptinkamose iš pacientų gautose ląstelėse ir išbandyti naujas terapines strategijas.
Iš HiPS ląstelių hCO2.5 gavome, kaip aprašyta anksčiau. Norint pradėti hCO2 gamybą iš hiPS ląstelių, kultivuojamų ant maitinamųjų sluoksnių, nepažeistos hiPS ląstelių kolonijos buvo pašalintos iš kultūros lėkštelių naudojant dispazę (0,35 mg/ml) ir perkeltos į itin mažai prisitvirtinusias plastikines kultūras turinčias lėkšteles su hiPS ląstelių kultūros terpe („Corning“), papildyta dviem SMAD inhibitoriais: dorsomorfinu (5 μM; P5499, „Sigma-Aldrich“) ir SB-431542 (10 μM; 1614, „Tocris“) bei ROCK inhibitoriumi Y-27632 (10 μM; S1049, „Selleckchem“). Per pirmąsias 5 dienas hiPS ląstelių terpė buvo keičiama kasdien ir pridedama dorsomorfino bei SB-431542. Šeštąją suspensijos dieną neuroniniai sferoidai buvo perkelti į neuroninę terpę, kurioje buvo neurobazalinio-A (10888, „Life Technologies“), vitamino B-27 papildas be vitamino A (12587, „Life Technologies“), „GlutaMax“ (1:100, „Life Technologies“), penicilino ir streptomicino (1:100, „Life Technologies“), ir papildyta epidermio augimo faktoriumi (EGF; 20 ng ml−1; „R&D Systems“) ir fibroblastų augimo faktoriumi 2 (FGF2; 20 ng ml−1; „R&D Systems“) iki 24 dienos. Nuo 25 iki 42 dienos terpė buvo papildyta smegenų kilmės neurotrofiniu faktoriumi (BDNF; 20 ng ml−1, „Peprotech“) ir neurotrofinu 3 (NT3; 20 ng ml−1; „Peprotech“), terpę keičiant kas antrą dieną. Šeštąją suspensijos dieną neuroniniai sferoidai buvo perkelti į neuroninę terpę, kurioje buvo neurobazalinio-A (10888, „Life Technologies“), vitamino B-27 papildas be vitamino A (12587, „Life Technologies“), „GlutaMax“ (1:100, „Life Technologies“), penicilino ir streptomicino (1:100, „Life Technologies“), ir papildyta epidermio augimo faktoriumi (EGF; 20 ng ml−1; „R&D Systems“) ir fibroblastų augimo faktoriumi 2 (FGF2; 20 ng ml−1; „R&D Systems“) iki 24 dienos. Nuo 25 iki 42 dienos terpė buvo papildyta smegenų kilmės neurotrofiniu faktoriumi (BDNF; 20 ng ml−1, „Peprotech“) ir neurotrofinu 3 (NT3; 20 ng ml−1; „Peprotech“), terpę keičiant kas antrą dieną.Šeštąją suspensijos dieną nerviniai sferoidai buvo perkelti į nervinę terpę, kurioje buvo Neurobasal-A (10888, „Life Technologies“), B-27 papildas be vitamino A (12587, „Life Technologies“), GlutaMax (1:100, „Life Technologies“) ir penicilinas.и стрептомицин (1:100, Life Technologies) ir дополнены эпидермальным фактором роста (EGF; 20 нг/мл; R&D Systems) ir фактомифром ро22. 20 нг/мл; R&D sistemos) iki 24 го дня. ir streptomicino (1:100, „Life Technologies“) ir papildytos epidermio augimo faktoriumi (EGF; 20 ng/ml; „R&D Systems“) ir fibroblastų augimo faktoriumi 2 (FGF2; 20 ng/ml; „R&D Systems“) iki 24 dienos.Nuo 25 iki 42 dienos į terpę buvo įlašinamas iš smegenų išskiriamas neurotrofinis faktorius (BDNF; 20 ng ml-1, „Peprotech“) ir neurotrofinas 3 (NT3; 20 ng ml-1, „Peprotech“), terpę keičiant kas antrą dieną.6补充剂 (12587), Life Technologies), GlutaMax (1:100), Life Technologies) Technologijos）并辅以表皮生长因子（EGF；20 ng ml-1；R&D Systems）和成纤维细胞生长因子2（2（FGF2R&ml；D Sistemos）直至第24 天.在 悬浮 的 第 第 6 天 将 神经 球体 转移 含有 含有 neurobasal-a （10888 绌 納 嚍 嚫 丟 丟b-27 补充剂 （12587 ， Life Technologies） Glutamax （1: 100 ， Life TechNOGIS青霉素 的 神经 培养 基 中 培养 基 中 1） 01:0 ， Gyvenimo technologijos） 表皮 生长 因子 （（(20 ng ml-1； R & D sistemos） 成 纤维 细胞 生长 2 （fgf2 ； 20 ng ml-1；R&D Sistemos）直至第24天. На 6-й день суспензии нейросферы были переведены на добавку, содержащую нейробазал-А (10888, Life добавакиes2) без витамина А (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies), пенициллин- нейтрализованный стрептомицин (1:100, Life Technologies) эпидермального фактора роста (EGF; 20 нг мл-1; R&D sistemos) ir фактора роста фибробластов 2 (FGF2; 20 нг мл-1) 1; 6 dieną neurosferų suspensijos buvo pakeistos papildais, kurių sudėtyje yra neurobazalinio-A (10888, „Life Technologies“), vitamino B-27 papildų be vitamino A (12587, „Life Technologies“), „GlutaMax“ (1:100, „Life Technologies“), penicilinu neutralizuoto streptomicino (1:100, „Life Technologies“), papildyto epidermio augimo faktoriumi (EGF; 20 ng ml-1; „R&D Systems“) ir fibroblastų augimo faktoriumi 2 (FGF2; 20 ng ml-1) 1; R&D sistemos) iki 24-osios dienos. R&D Systems) iki 24 dienos.Nuo 25 iki 42 dienos į kultūros terpę kas antrą dieną buvo dedama iš smegenų išskiriamo neurotrofinio faktoriaus (BDNF; 20 ng ml-1, „Peprotech“) ir neurotrofinio faktoriaus 3 (NT3; 20 ng ml-1, „Peprotech“). Terpė buvo keičiama vieną kartą.Nuo 43 dienos hCO₂ buvo palaikomas nepapildytoje neurobazalinėje A terpėje (NM; 1088022, „Thermo Fisher“), terpę keičiant kas 4–6 dienas. Norint gauti hCO₂ iš hiPS ląstelių, kultivuojamų be maitinimo sąlygų, hiPS ląstelės buvo inkubuojamos su Accutase (AT-104, „Innovate Cell Technologies“) 37 °C temperatūroje 7 minutes, atskirtos į atskiras ląsteles ir išskleistos ant „AggreWell 800“ plokštelių (34815, „STEMCELL Technologies“), kurių tankis buvo 3 × 106 atskirų ląstelių šulinėlyje, „Essential 8“ terpėje, papildytoje ROCK inhibitoriumi Y-27632 (10 μM; S1049, „Selleckchem“). Po 24 valandų terpės iš šulinių buvo pipete perkeliamos į terpę, kurioje buvo „Essential 6“ terpė (A1516401, „Life Technologies“), papildyta dorsomorfinu (2,5 μM; P5499, „Sigma-Aldrich“) ir SB-431542 (10 μM; 1614). , Tocrida). Nuo 2 iki 6 dienos „Essential 6“ terpė buvo kasdien keičiama dorsomorfinu ir SB-431542 papildymu. Nuo šeštos dienos neurosferų suspensijos buvo perkeliamos į neurobazinę terpę ir laikomos, kaip aprašyta aukščiau.
Visos gyvūnų procedūros buvo atliekamos laikantis Stanfordo universiteto laboratorinių gyvūnų priežiūros administracinio komiteto (APLAC) patvirtintų gyvūnų priežiūros gairių. Nėščios eutiminės RNU (rnu/+) žiurkės buvo įsigytos („Charles River Laboratories“) arba laikomos. Gyvūnai buvo laikomi 12 valandų šviesos ir tamsos cikle, gaunant maisto ir vandens neribotai. Nuogi (FOXN1–/–) žiurkių jaunikliai nuo trijų iki septynių dienų buvo identifikuojami pagal nesubrendusių ūsų augimą prieš išbrokavimą. Šuniukai (patinai ir patelės) buvo anestezuojami 2–3 % izoflurano tirpalu ir paguldomi ant stereotaksinio rėmo. Buvo atlikta kaukolės trepanacija, kurios skersmuo būtų maždaug 2–3 mm virš S1, išsaugant kietojo smegenų dangalo vientisumą. Tada 30 G adata (maždaug 0,3 mm) pradurta tiesiai už kraniotomijos ribų. Tada užtepkite HCO3 ant plonos 3 × 3 cm paraplėvelės ir pašalinkite terpės perteklių. Prie 23 G, 45° adatos pritvirtintu Hamiltono švirkštu švelniai įtraukite HCO3 į tolimiausią adatos galą. Tada uždėkite švirkštą ant švirkšto pompos, prijungtos prie stereotaksinio prietaiso. Tada uždėkite adatos galiuką ant anksčiau padarytos 0,3 mm pločio skylutės kietajame smegenų dangale (z = 0 mm) ir susiaurinkite švirkštą 1–2 mm (z = maždaug –1,5 mm), kol adata atsidurs tarp kietojo smegenų dangalo A. Susidarys tankus sandariklis. Tada pakelkite švirkštą į žievės paviršiaus centrą ties z = -0,5 mm ir suleiskite HCO3 1–2 µl per minutę greičiu. Baigus HCO3 injekciją, adata ištraukiama 0,2–0,5 mm per minutę greičiu, oda susiuvama ir šuniukas nedelsiant paguldomas ant šilto šildymo kilimėlio, kol visiškai pasveiks. Kai kuriems gyvūnams buvo persodinta į abipusę ertmę.
Visos gyvūnų procedūros buvo atliekamos laikantis Stanfordo universiteto APLAC patvirtintų gyvūnų priežiūros gairių. Žiurkėms (praėjus daugiau nei 60 dienų po transplantacijos) buvo taikoma 5 % izoflurano anestezija ir vaizdavimo metu jos buvo anestezuojamos 1–3 % izoflurano tirpalu. Vizualizacijai buvo naudojamas 7 teslų aktyviai ekranuotas horizontalus gręžinio skeneris „Bruker“ („Bruker Corp.“) su „International Electric Company“ (IECO) gradiento pavara, ekranuotu gradiento įdėklu, kurio vidinis skersmuo 120 mm (600 mT/m, 1000 T/m/s), naudojant AVANCE. III, aštuonių kanalų daugiaričių radijo dažnių ir daugiabranduoles galimybes bei pridedamą „Paravision 6.0.1“ platformą. Įrašymas buvo atliekamas naudojant aktyviai atjungtą tūrinę radijo dažnių ritę, kurios vidinis skersmuo 86 mm, ir keturių kanalų kriogeniniu būdu aušinamą radijo dažnių ritę, skirtą tik priėmimui. Ašinis 2D Turbo-RARE (pasikartojimo laikas = 2500 ms, aidėjimo laikas = 33 ms, 2 vidurkiai) su 16 pjūvių fiksavimais, pjūvio storis 0,6–0,8 mm, kuriame yra 256 × 256 mėginiai. Signalai buvo priimami naudojant kvadratūrinę siųstuvo-imtuvo tūrinę RF ritę, kurios vidinis skersmuo 2 cm („Rapid MR International, LLC“). Galiausiai, 3D vaizdavimui ir tūrio analizei naudoti integruotas „Imaris“ („BitPlane“) paviršiaus įvertinimo funkcijas. Sėkminga transplantacija apibrėžta kaip tokia, kai persodintame pusrutulyje susidarė ištisinio T2 svertinio MRT signalo sritys. Transplantato atmetimas apibrėžtas kaip transplantatas, kuris persodintame pusrutulyje nesukūrė ištisinio T2 svertinio MRT signalo sričių. Subkortikalinis t-hCO buvo pašalintas iš tolesnės analizės.
Norint stabiliai ekspresuoti GCaMP6s hCO terpėje dviejų fotonų kalcio vaizdinimui, hiPS ląstelės buvo užkrėstos pLV[Exp]-EF1a::GcaMP6s-WPRE-Puro, po to buvo parinkti antibiotikai. Trumpai tariant, ląstelės buvo disocijuotos su EDTA ir suspenduotos 1 ml Essential 8 terpės, kurios tankis buvo maždaug 300 000 ląstelių, esant polibrenui (5 μg/ml) ir 15 μl viruso. Tada ląstelės buvo inkubuojamos suspensijoje 60 minučių ir pasėtos 50 000 ląstelių viename šulinėlyje tankiu. Po susiliejimo ląstelės buvo apdorojamos 5–10 μg ml-1 puromicino 5–10 dienų arba kol atsirado stabilios kolonijos. Ūminė hCO infekcija buvo atlikta, kaip aprašyta anksčiau5, su tam tikrais pakeitimais. Trumpai tariant, 30–45 dieną hCO perkelkite į 1,5 ml Eppendorf mikrocentrifugos mėgintuvėlius, kuriuose yra 100 µl nervų terpės. Tada pašalinama maždaug 90 µl terpės, į mėgintuvėlį įpilama 3–6 µl didelio titro lentiviruso (nuo 0,5 x 108 iki 1,2 x 109) ir hCO3 30 minučių perkeliamas į inkubatorių. Tada į kiekvieną mėgintuvėlį įpilama 90–100 µl terpės ir mėgintuvėliai per naktį grąžinami į inkubatorių. Kitą dieną hCO3 perkeliamas į šviežią nervų terpę, esančią mažo prisijungimo plokštelėse. Po 7 dienų hCO3 buvo perkeltas į 24 šulinėlių stiklinio dugno plokšteles, kad būtų galima vizualizuoti ir įvertinti infekcijos kokybę. pLV[Exp]-SYN1::EYFP-WPRE ir pLV[Exp]-SYN1::hChR2-EYFP-WPRE buvo sukurti naudojant „VectorBuilder“. Lentivirusas naudojamas daugumoje eksperimentų, nes jis yra integruotas į šeimininko genomą, todėl užkrėstose ląstelių linijose galima reikšti reporterinį geną. Pasiutligės stebėjimui 30–45 dieną hCO buvo koinfekuota pasiutligės-ΔG-eGFP ir AAV-DJ-EF1a-CVS-G-WPRE-pGHpA (plazmidė #67528, Addgene), kruopščiai plaunama 3 dienas ir persodinta žiurkėms S1 fazėje bei palaikoma in vivo 7–14 dienų.
Imunohistochemijai gyvūnai buvo anestezuoti ir transkardialiai perfuzuoti PBS, o po to 4 % paraformaldehidu (PFA PBS; „Electron Microscopy Sciences“). Smegenys buvo fiksuotos 4 % PFA 2 valandas arba per naktį 4 °C temperatūroje, kriokonservuotos 30 % sacharozės PBS tirpale 48–72 valandas ir įmerktos į 1:1 30 % sacharozės:OCT tirpalą („Tissue-Tek OCT Compound 4583“, „Sakura Finetek“), o vainikiniai pjūviai buvo padaryti 30 µm storio, naudojant kriostatą („Leica“). Storųjų pjūvių imunohistochemijai gyvūnai buvo perfuzuoti PBS, smegenys buvo išpreparuotos ir atliktas vainikinis 300–400 µm storio pjūvis, naudojant vibratomą („Leica“), o pjūviai buvo fiksuoti 4 % PFA 30 minučių. Tada kriosekcijos arba storosios sekcijos buvo plaunamos PBS tirpalu, blokuojamos 1 valandai kambario temperatūroje (10 % normalaus asilo serumo (NDS) ir 0,3 % Triton X-100, praskiesto PBS tirpalu) ir blokuojamos blokuojančiu tirpalu 4 °C temperatūroje. – Inkubacija Kriosekcijos buvo inkubuojamos per naktį, o storosios sekcijos – 5 dienas. Naudoti pirminiai antikūnai buvo šie: anti-NeuN (pelė, 1:500; ab104224, abcam), anti-CTIP2 (žiurkė, 1:300; ab18465, abcam), anti-GFAP (triušis, 1:1000; Z0334, Dako), anti-GFP (vištiena, 1:1000; GTX13970, GeneTex), anti-HNA (pelė, 1:200; ab191181, abcam), anti-NeuN (triušis, 1:500; ABN78, Millipore), anti-PDGFRA (triušis, 1:200; sc-338, Santa Cruz), anti-PPP1R17 (triušis, 1:200; HPA047819, Atlas antikūnai), anti-RECA-1 (pelė, 1:50; ab9774, abcam), anti-SCG2 (triušis, 1:100; 20357-1-AP, Proteintech), anti-SOX9 (ožka, 1:500; AF3075, R&D Systems), Netrin G1a (ožka, 1:100; AF1166, R&D Systems), anti-STEM121 (pelė, 1:200; Y40410, Takara Bio), anti-SATB2 (pelė, 1:50; ab51502, abcam), anti-GAD65/67 (triušis, 1:400; ABN904, Millipore) ir anti-IBA1 (ožka, 1:100; ab5076, abcam). Naudoti pirminiai antikūnai buvo šie: anti-NeuN (pelė, 1:500; ab104224, abcam), anti-CTIP2 (žiurkė, 1:300; ab18465, abcam), anti-GFAP (triušis, 1:1000; Z0334, Dako), anti-N-GFP (vištiena, 1:1000; GTX13970, GeneTex), anti-HNA (pelė, 1:200; ab191181, abcam), anti-NeuN (triušis, 1:500; ABN78, Millipore), anti-PDGFRA (triušis, 1:200; sc-338, Santa Cruz), anti-PPP1R17 (triušis, 1:200; HPA047819, Atlas antikūnai), anti-RECA-1 (pelė, 1:50; ab9774, abcam), anti-SCG2 (triušis, 1:100; 20357-1-AP, „Proteintech“), anti-SOX9 (ožka, 1:500; AF3075, „R&D Systems“), Netrin G1a (ožka, 1:100; AF1166, „R&D Systems“), anti-STEM121 (pelė, 1:200; Y40410, „Takara Bio“), anti-SATB2 (pelė, 1:50; ab51502, abcam), anti-GAD65/67 (triušis, 1:400; ABN904, „Millipore“) ir anti-IBA1 (ožka, 1:100; ab5076, abcam). Использовались следующие первичные антитела: анти-NeuN (мышиные, 1:500; ab104224, abcam), анти-CTIP2 (30;ке, CTIP2: 00; ab18465, abcam), анти-GFAP (кроличьи, 1:1000; Z0334, Dako), анти- -GFP (курица, 1:1000; GTX13970, GeneTex), анти-HNA (мы1,2910,8; abcam), анти-NeuN (кролик, 1:500; ABN78, Millipore), анти-PDGFRA (кролик, 1:200; sc-338, Санта-Круз), анти-PPP1R17 (кролик, 1:200; HPA047819, atlaso antikūnai), 1:5, 1,1, ab9774, abcam), анти-SCG2 (кролик , 1:100; 20357-1-AP, Proteintech), анти-SOX9 (козий, 1:500; AF3075, R&D Systems), нетрин G1a,;,1: AF101a,; Sistemos), анти-STEM121 (мышиный , 1:200; Y40410, Takara Bio), анти-SATB2 (мышь, 1:50; ab51502, abcam), анти-GAD65/67 (кролик, 1:400; ABBAнт904, иBAipore)-I (коза, 1:100; аб5076, абкам). Naudoti pagrindiniai antikūnai buvo šie: anti-NeuN (pelė, 1:500; ab104224, abcam), anti-CTIP2 (žiurkė, 1:300; ab18465, abcam), anti-GFAP (triušis, 1:1000; Z0334, Dako), anti-GFP (vištiena, 1:1000; GTX13970, GeneTex), anti-HNA (pelė, 1:200; ab191181, abcam), anti-NeuN (triušis, 1:500; ABN78, Millipore), anti-PDGFRA (triušis, 1:200; sc-338, Santa Cruz), anti-PPP1R17 (triušis, 1:200; HPA047819, Atlas antikūnai), anti-RECA-1 (pelė, 1:50; ab9774, abcam), anti-SCG2 (triušis, 1:100; 20357-1-AP, „Proteintech“), anti-SOX9 (ožka, 1:500; AF3075, „R&D Systems“), netrin G1a (ožka, 1:100; AF1166, „R&D Systems“), anti-STEM121 (pelė, 1:200; Y40410, „Takara Bio“), anti-SATB2 (pelė, 1:50; ab51502, „abcam“), anti-GAD65/67 (triušis, 1:400; ABN904, „Millipore“) ir anti-IBA1 (ožka, 1:100; ab5076, „abkam“).使用的一抗是：抗NeuN（小鼠，1:500；ab104224，abcam）抗CTIP2（大鼠，1:3 00；ab18465，abcam），抗GFAP（兔，1:1,000；Z0334，Dako），抗-GF P（鸡，1:1000；GTX13970，GeneTex），抗HNA（小鼠，1:200；ab1911 81，abcam），抗NeuN（兔，1:500；ABN78，Millipore），抗PDGFRA（兔， 1:200；sc-338，Santa Cruz），抗PPP1R17（兔，1:200；HPA047819，Atlas抗体），抗RECA-1（小鼠，1:50；ab9774，abcam），抗SCG2（兔） , 1:100；20357-1-AP，Proteintech），抗SOX9（山羊，1:500；AF3075，R&D Systems），Netrin G1a（山羊，1:100；AF1166，R&D Systems），抗STEM121（小鼠, 1:200;使用的一抗是：抗NeuN（小鼠，1:500；ab104224，abcam）抗CTIP2（大鼠，1 :300；ab18465，abcam），抗GFAP（兔，1:1,000；Z0334，Dako），抗-GFP（鸡，1:1000；GTX13970，GeneTex），抗HNA（小鼠，1:200；ab 191181，abcam），抗NeuN（兔，1:500；ABN78，Millipore％弔，抗1: 200；sc-338，Santa Cruz），抗PPP1R17（兔，1:200；HPA047819，Atlas抗体），抗RECA-1（小鼠，1:50；ab9774，abcam），抗SCG2 100；20357-1-AP，Proteintech），抗SOX9（山羊，1:500；AF3075，R&D Systems），Netrin G1a（山羊，1:100，山羊，1:100， Sistemos）頏1:20, ;Y40410, „Takara Bio“), anti-SATB2 (pelė, 1:50; ab51502, „abcam“), anti-GAD65/67 (triušis, 1:400; ABN904, „Millipore“) ir anti-IBA1 (ožka, 1:100; ab5076, „abcam“).Pagrindiniai naudoti antikūnai buvo šie: anti-NeuN (pelė, 1:500; ab104224, abcam), anti-CTIP2 (žiurkė, 1:300; ab18465, abcam), anti-GFAP (triušis, 1:1000; Z0334, Dako). , anti-GFP (vištiena, 1:1000; GTX13970, „GeneTex“), anti-HNA (pelė, 1:200; ab191181, „abcam“), anti-NeuN (triušis, 1:500; ABN78, „Millipore“), anti-PDGFRA (triušis, 1:200; sc-338, „Santa Cruz“), anti-PPP1R17 (triušis, 1:200; HPA047819, „Atlas“ antikūnas), anti-RECA-1 (pelė, 1:50; ab9774, „abcam“), anti-SCG2 (triušis), 1:100;20357-1-AP, Proteintech), анти-SOX9 (коза, 1:500; AF3075, R&D sistemos), Нетрин G1a (коза, 1:100; AF1166, R&D sistemos), анти -STEM120,,1:401, (1:40) Takara Bio), анти-SATB2 (мышь, 1:50; ab51502, abcam), анти-GAD65/67 (кролик, 1:400; ABN904, Millipore) ir анти-IBA1 (коза, 1, баб00ка; 1,1500; 20357-1-AP, „Proteintech“), anti-SOX9 (ožka, 1:500; AF3075, „R&D Systems“), Netrin G1a (ožka, 1:100; AF1166, „R&D Systems“), anti-STEM121 (pelė, 1:200; Y40410, „Takara Bio“), anti-SATB2 (pelė, 1:50; ab51502, „abcam“), anti-GAD65/67 (triušis, 1:400; ABN904, „Millipore“) ir anti-IBA1 (ožka, 1:100; ab5076, „abkam“).Pjūviai buvo plaunami PBS ir inkubuojami su antriniu antikūnu 1 valandą kambario temperatūroje (užšaldyti pjūviai) arba per naktį 4 °C temperatūroje (stori pjūviai). Buvo naudojamas „Alexa Fluor“ antrinis antikūnas („Life Technologies“), praskiestas 1:1000 blokuojančiame tirpale. Po plovimo PBS, branduoliai buvo vizualizuojami naudojant „Hoechst 33258“ („Life Technologies“). Galiausiai, stikleliai buvo dedami ant mikroskopo su dengiančiais stikleliais („Fisher Scientific“) naudojant „Aquamount“ („Polysciences“) ir analizuojami „Keyence“ fluorescenciniu mikroskopu (BZ-X analizatorius) arba „Leica TCS SP8“ konfokaliniu mikroskopu („Las-X“) pagal vaizdą. Vaizdai buvo apdoroti naudojant „ImageJ“ programą (Fidžis). Norint kiekybiškai įvertinti žmogaus neuronų dalį t-hCO ir žiurkės žievėje, buvo padaryti 387,5 μm pločio stačiakampiai vaizdai t-hCO centre, žiurkės žievės krašte arba šalia jo. Transplantato kraštai buvo nustatyti įvertinant audinių skaidrumo pokyčius, HNA+ branduolius ir (arba) audinių autofluorescencijos buvimą. Kiekviename vaizde bendras NeuN+ ir HNA+ ląstelių skaičius buvo padalytas iš bendro NeuN+ ląstelių skaičiaus toje pačioje srityje. Siekiant užtikrinti, kad būtų skaičiuojamos tik ląstelės, kurių branduoliai yra vaizdo plokštumoje, į skaičiavimą įtraukiamos tik tos ląstelės, kurios taip pat yra Hoechst+. Dviejų vaizdų, atskirtų bent 1 mm atstumu, vidurkis buvo apskaičiuotas siekiant sumažinti statistinę paklaidą.
Savaitę prieš mėginių surinkimą hCO₂ transplantacijos gyvūnus (maždaug 8 mėnesių diferenciacijos) patalpinkite į tamsią patalpą, apkirpdami ūsus, kad sumažintumėte sensorinę stimuliaciją. Branduolių išskyrimas buvo atliktas, kaip aprašyta anksčiau, su tam tikrais pakeitimais. Trumpai tariant, t-hCO₂ ir hCO₂ buvo sunaikinti naudojant detergentinę-mechaninę ląstelių lizę ir 2 ml stiklinių audinių malūnėlį (D8938, „Sigma-Aldrich“/KIMBLE). Neapdoroti branduoliai buvo nufiltruoti naudojant 40 µm filtrą ir centrifuguoti 320 g greičiu 10 minučių 4 °C temperatūroje, prieš atliekant sacharozės tankio gradientą. Po centrifugavimo etapo (320 g 20 min. 4 °C temperatūroje) mėginiai buvo resuspenduoti 0,04% BSA/PBS tirpale, pridedant 0,2 vieneto µl-1 RNazės inhibitoriaus (40 u µl-1, AM2682, „Ambion“), ir perleisti per 40 µm srauto filtrą. Disocijuoti branduoliai buvo resuspenduoti PBS, kuriame yra 0, 02% BSA, ir įkelti į „Chromium Single Cell 3′“ lustą (apytikslis 8000 ląstelių atkūrimas kiekvienoje juostoje). snRNR-seq bibliotekos buvo paruoštos naudojant „Chromium Single cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3“ (10x Genomics). snRNR-seq bibliotekos buvo paruoštos naudojant „Chromium Single cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3“ (10x Genomics). Библиотеки snRNA-seq были приготовлены с помощью Chromium Single cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics). snRNR-seq bibliotekos buvo paruoštos naudojant „Chromium Single cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3“ (10x Genomics). snRNA-seq 文库是使用Chromium Single cell 3′ GEM、Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics) 制备的。 snRNA-seq 文库是使用Chromium Single cell 3′ GEM、Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics) 制备的。 Библиотеку snRNA-seq готовили с использованием Chromium Single Cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics). snRNA-seq biblioteka buvo parengta naudojant Chromium Single Cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics).Skirtingų mėginių bibliotekos buvo sujungtos ir sekvenuotos naudojant „Admera Health“ naudojant „NovaSeq S4“ („Illumina“).
Kiekvieno numatomo branduolio brūkšninio kodo genų raiškos lygiai buvo kiekybiškai įvertinti naudojant „10x Genomics CellRanger“ analizės programinės įrangos paketą (6.1.2 versija). Tiksliau, rodmenys buvo palyginti su žmogaus (GRCh38, „Ensemble“, 98 versija) ir žiurkės (Rnor_6.0, „Ensemble“, 100 versija) etaloninių genomų deriniu, sukurtu naudojant komandą „mkref“ ir „count“ su komanda „–include-introns=TRUE“, kad būtų galima kiekybiškai įvertinti įtraukimo rodmenis, susietus su intronų sritimis. t-hCO mėginiams žmogaus branduoliai buvo identifikuoti remiantis konservatyviu reikalavimu, kad bent 95 % visų susietų rodmenų atitiktų žmogaus genomą. Visos tolesnės analizės buvo atliktos su filtruotu brūkšninių kodų matricos išvestimi iš „CellRanger“ naudojant R paketą (4.1.2 versija) Seurat (4.1.1 versija)32.
Siekiant užtikrinti, kad į vėlesnę analizę būtų įtraukti tik aukštos kokybės branduoliai, kiekvienam mėginiui buvo įdiegtas iteracinis filtravimo procesas. Pirmiausia identifikuojami ir pašalinami žemos kokybės branduoliai, kuriuose randama mažiau nei 1000 unikalių genų ir daugiau nei 20 % visų mitochondrijų. Vėliau neapdorota genų skaičiaus matrica buvo normalizuota reguliarizuota neigiama binominė regresija naudojant sctransform(vst.flavor=”v2”) funkciją, kuri taip pat identifikavo 3000 kintamiausių genų, naudodama numatytuosius parametrus. Dimensijų mažinimas buvo atliktas viršutinių kintamųjų genų atveju naudojant pagrindinių komponentų analizę (PCA) su numatytaisiais parametrais, naudojant 30 duomenų rinkinio dimensiją (dims = 30 buvo pasirinktas remiantis vizualine kelio vietų apžiūra ir naudojamas visiems mėginiams ir ansamblio analizei). Tada atlikome kelis iteracinio klasterizavimo etapus (skiriamoji geba = 1), kad klasifikuotume genus pagal neįprastai mažą genų skaičių (mediana žemiau 10 procentilio), neįprastai didelį mitochondrijų genų skaičių (mediana virš 95 procentilio), kad nustatytume ir pašalintume galimas žemos kokybės ląsteles. Klasteriai ir (arba) didelė įtariamų dvynių dalis, identifikuoti naudojant „DoubletFinder33“ paketą (vidutinis „DoubletFinder“ balas virš 95 procentilio). t-hCO mėginiai (n = 3) ir hCO mėginiai (n = 3) buvo integruoti atskirai naudojant „IntegrateData“ funkciją su aukščiau nurodytais parametrais. Tada Kitas integruoto duomenų rinkinio kokybinio filtravimo etapas buvo atliktas, kaip aprašyta aukščiau.
Pašalinus žemos kokybės branduolius, integruotas duomenų rinkinys buvo sugrupuotas (skiriamoji geba = 0,5) ir įterptas UMAP34 vizualizacijos tikslais. Kiekvieno klasterio žymenų genai buvo nustatyti naudojant „FindMarkers“ funkciją su numatytaisiais parametrais, apskaičiuotais iš normalizuotų genų raiškos duomenų. Pagrindines ląstelių klases identifikuojame ir klasifikuojame derindami vaisiaus ir suaugusiojo žievės etaloninius duomenų rinkinius su žymenų genų raiška 19, 20, 21, 35 ir anotacijomis. Visų pirma, cirkuliuojantys pirmtakai buvo identifikuoti pagal MKI67 ir TOP2A raišką. Progenitoriniai klasteriai buvo apibrėžti pagal mitozinių transkriptų nebuvimą, didelį persidengimą su daugiapotentėmis glijos pirmtakų klasteriais, aprašytais vėlyvosios metafazės vaisiaus žievėje, ir EGFR bei OLIG1 raišką. Terminą „astrocitas“ vartojame apibrėždami kelias astrocitų diferenciacijos būsenas – nuo ​​vėlyvosios radialinės glijos iki astrocitų brendimo. Astrocitų klasteriai išreiškia aukštą SLC1A3 ir AQP4 kiekį ir, kaip įrodyta, atitinka vaisiaus radialinės glijos ir (arba) suaugusiojo astrocitų potipius. OPC ekspresuoja PDGFRA ir SOX10, o oligodendrocitai ekspresuoja mielinizacijos žymenis (MOG ir MYRF). Glutamaterginiai neuronai buvo identifikuoti pagal neuronų transkriptų (SYT1 ir SNAP25) buvimą, GABAerginių žymenų (GAD2) nebuvimą ir NEUROD6, SLC17A7, BCL11B arba SATB2 ekspresiją. GluN neuronai buvo toliau suskirstyti į viršutinius (SATB2 ekspresija ir BCL11B praradimas) ir gilius (BCL11B ekspresija) poklasius. Tariami poplokštelės (SP) neuronai, be gilių GluN žymenų, ekspresuoja žinomus SP18 žymenis, tokius kaip ST18 ir SORCS1. Gyslainės rezginio tipo ląstelės buvo identifikuotos pagal TTR ekspresiją, o meningealinio tipo ląstelės ekspresavo su fibroblastais susijusius genus ir nustatė pial/kraujagyslių ląsteles referenciniame duomenų rinkinyje.
Diferencinė genų raiškos analizė tarp t-hCO3 ir hCO3 poklasių buvo atlikta naudojant naujai sukurtą pseudo-partijos metodą, atkurtą mėginiuose, įdiegtuose naudojant „Libra R“ paketą (1.0.0 versija). Tiksliau, grupėms buvo atlikti edgeR log-tikimybės testai (3.36.0 versija, R paketas), sumuojant genų skaičių ląstelėse kiekvienai mėginio replikacijai tam tikrai ląstelių klasei. Šilumos žemėlapio vizualizavimui normalizuotos milijoninės (CPM) vertės apskaičiuojamos naudojant edgeR (cpm() funkciją) ir skaluojamos (kad vidurkis būtų 0, standartinis nuokrypis = 1). Atlikta reikšmingai padidėjusios t-hCO3 GluN genų raiškos genų ontologijos (GO) praturtinimo analizė (Benjamini-Hochbergo pataisyta P vertė mažesnė nei 0,05, išreikšta bent 10 % t-hCO3 GluN ląstelių, o pokytis padidėjo bent 2 kartus), naudojant „ToppGene Suite“ (https://toppgene.cchmc.org/)37. Naudojame „ToppFun“ programėlę su numatytaisiais parametrais ir pateikiame Benjamini-Hochbergo pakoreguotas P reikšmes, apskaičiuotas iš GO anotuotųjų hipergeometrinių testų.
Norėdami suderinti savo snRNR sekos nustatymo klasterius su anotuotomis ląstelių grupėmis iš pirminių vienos ląstelės RNR sekos nustatymo arba suaugusiųjų snRNR sekos nustatymo etaloninių tyrimų19,20,21,22, taikėme porinių duomenų rinkinių integravimo metodą. Norėdami integruoti ir palyginti klasterių persidengimus tarp duomenų rinkinių (naudodami tuos pačius parametrus kaip ir aukščiau), naudojome „Seurat“ normalizavimo darbo eigą „SCTransform“ (v2). Siekiant skaičiavimo efektyvumo, individualūs duomenų rinkiniai buvo atsitiktinai suskirstyti į poaibius iki 500 ląstelių arba branduolių kiekviename pradiniame klasteryje. Naudojant panašų metodą, kaip aprašyta anksčiau, klasterių persidengimas buvo apibrėžtas kaip ląstelių arba branduolių, kurie persidengė su etaloninio klasterio žyme, dalis kiekviename sujungtame klasteryje. Norėdami toliau klasifikuoti GluN, naudojome „Seurat“ „TransferData“ darbo eigą GluN poaibių duomenims, kad priskirtume etaloninių duomenų rinkinių žymes mūsų GluN ląstelėms.
Norėdami įvertinti t-hCO₃ ir hCO₃ mėginių globalios transkriptomo brandos būseną, palyginome savo pseudo-bulk mėginius su BrainSpan/psychENCODE23, kurį sudaro didelė RNR seka, apimanti žmogaus smegenų vystymąsi. Atlikome PCA su kombinuota pagal modelį normalizuota genų raiškos matrica iš žievės mėginių praėjus 10 savaičių po apvaisinimo ir vėliau 5567 genuose (kartu su mūsų duomenimis), kurie anksčiau buvo identifikuoti kaip aktyvūs BrainSpan žievės mėginiuose (apibrėžiami kaip daugiau nei 50 % vystymosi dispersijos, paaiškinamos amžiumi, naudojant kubinį modelį)38. Be to, naudodami anksčiau aprašytą neneigiamą matricos faktorizaciją, nustatėme genus, susijusius su pagrindiniais neurovystymosi transkriptomo parašais. Imties svoriai, apskaičiuoti naudojant neneigiamos matricos faktorizacijos procedūrą, pavaizduoti 5b paveiksluose su išplėstiniais duomenimis apie kiekvieną iš penkių parašų, aprašytų Zhu ir kt.38. Vėlgi, nuo aktyvumo priklausomi transkripcijos žymenys buvo gauti iš anksčiau paskelbtų tyrimų. Visų pirma, ERG ir LRG reikšmingai padidėjo glutamaterginiuose neuronuose, identifikuotuose pelių regos žievės snRNR-seq rinkinyje po regos stimuliacijos iš 3 papildomos lentelės (Hrvatin ir kt.16). Žmogaus praturtinti LRG buvo gauti iš KCl aktyvuotų žmogaus vaisiaus smegenų kultūrų ir surinkti praėjus 6 valandoms po stimuliacijos, o filtruotų genų reikšmingai padidėjo žmonių, bet ne graužikų, organizmuose (4 papildoma lentelė). Genų rinkinių praturtinimo naudojant šiuos genų rinkinius analizė atlikta naudojant vienfaktorinį Fisher'o tikslų testą.
Žiurkėms anestezuoti izofluranu, išimti smegenis ir įdėti į šaltą (maždaug 4 °C) deguonimi prisotintą (95 % O2 ir 5 % CO2) sacharozės tirpalą, kad gautųsi pjūviai, kurių sudėtyje yra: 234 mM sacharozės, 11 mM gliukozės, 26 mM NaHCO3, 2,5 mM KCl, 1,25 mM NaH2PO4, 10 mM MgSO4 ir 0,5 mM CaCl2 (apie 310 mOsm). Žiurkių smegenų vainikiniai pjūviai (300–400 µm) su t-hCO3 buvo pagaminti naudojant „Leica VT1200“ vibratomą, kaip aprašyta anksčiau39. Tada pjūviai buvo perkelti į pjūvių kamerą su nuolatiniu kambario temperatūros deguonimi prisotinimu, kuriame buvo aCSF, paruoštas iš: 10 mM gliukozės, 26 mM NaHCO3, 2,5 mM KCl, 1,25 mM NaHPO4, 1 mM MgSO4, 2 mM CaCl2 ir 126 mM NaCl (298 mOsm). bent 45 minutes prieš registravimą. Pjūviai buvo registruojami panardintoje kameroje, kurioje jie buvo nuolat perfuzuojami aCSF (95 % O2 ir 5 % CO2 buteliukas). Visi duomenys buvo registruojami kambario temperatūroje. t-hCO neuronai buvo nutraukiami borosilikatinio stiklo pipete, pripildyta tirpalo, kuriame yra 127 mM kalio gliukonato, 8 mM NaCl, 4 mM magnio ATP, 0,3 mM natrio GTP, 10 mM HEPES ir 0,6 mM EGTA, pH 7,2, vidinis tirpalas, sureguliuotas KOH (290 mOsm). Norint atgauti, į registravimo tirpalą buvo įpilta biocitino (0,2 %).
Duomenys buvo gauti naudojant „MultiClamp 700B“ stiprintuvą („Molecular Devices“) ir „Digidata 1550B“ skaitmenintuvą („Molecular Devices“), žemo dažnio filtrą esant 2 kHz dažniui, skaitmeninami 20 kHz dažniu ir analizuojami naudojant „Clampfit“ („Molecular Devices“), „Origin“ („OriginPro“ (2021b, „OriginLab“) ir pasirinktines MATLAB funkcijas („Mathworks“). Jungties potencialas buvo apskaičiuotas naudojant „JPCalc“, o įrašai buvo pakoreguoti pagal apskaičiuotą -14 mV vertę. IV operacija susideda iš srovės žingsnių serijos 10–25 pA žingsniais, nuo -250 iki 750 pA.
Kaip aprašyta anksčiau, atliekant hCO neuronų registravimą lopo spaustuku, talamokortikaliniuose pjūviuose buvo elektriškai stimuliuojami talamas, baltoji medžiaga ir S1 aferentai. Trumpai tariant, smegenys buvo padėtos ant 10° kampu pakreipto 3D spausdinimo stalo, o priekinė smegenų dalis buvo perpjauta 35° kampu. Tada smegenys buvo priklijuotos prie perpjauto paviršiaus ir perpjautos, išsaugant išsikišusias talamokortikalines aksonus. Bipoliniai volframo elektrodai (0,5 MΩ) buvo sumontuoti ant antrojo mikromanipuliatoriaus ir strategiškai išdėstyti taip, kad stimuliuotų keturis kiekvienos ląstelės regionus (vidinę kapsulę, baltąją medžiagą, S1 ir hCO). Sinapsinių atsakų registravimas po 300 µA fazinės stimuliacijos 0,03–0,1 Hz dažniu.
hChR2 ekspresuojantys hCO neuronai buvo aktyvuoti esant 480 nm bangos ilgiui, o LED (Prizmatix) generuojami šviesos impulsai buvo taikomi per ×40 objektyvą (0,9 NA; „Olympus“), siekiant užregistruoti hChR2 ekspresiją šalia ląstelių. Apšviesto lauko skersmuo yra maždaug 0,5 mm, o bendra galia – 10–20 mW. Impulso plotis buvo nustatytas ties 10 ms, kuris atitinka impulsą, duotą elgesio mokymosi eksperimento metu. Buvo naudojami įvairūs stimuliavimo dažniai – nuo ​​1 iki 20 Hz, tačiau kiekybiniam įvertinimui buvo naudojamas tik pirmasis serijos impulsas. Intervalai tarp impulsų serijų paprastai būna ilgesni nei 30 s, siekiant sumažinti poveikį sinapsiniams slopinantiems arba palengvinantiems keliams. Norėdami patikrinti, ar hChR2 atsakas buvo monosinapsinis, į vonią taikėme TTX (1 μM), kol išnyko EPSC reakcija, o tada taikėme 4-aminopiridiną (4-AP; 100 μM). Paprastai atsakas grįžta per kelias minutes, o tarp LED įjungimo ir EPSC generavimo yra šiek tiek ilgesnis uždelsimas. NBQX (10 μM) buvo naudojamas norint patikrinti, ar atsaką lemia AMPA receptoriai.
Ryškūs hCO3 pjūviai buvo sukurti, kaip aprašyta anksčiau. Trumpai tariant, hCO3 pjūviai buvo įterpti į 4 % agarozę ir perkelti į ląsteles, turinčias 126 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM NaH2PO4, 1 mM MgSO4, 2 mM CaCl2, 26 mM NaHCO3 ir 10 mM d-(+)-gliukozės. Pjūviai buvo supjaustyti 200–300 µm storio kambario temperatūroje naudojant „Leica VT1200“ vibratorių ir laikomi ASF kambario temperatūroje. Tada hCO3 pjūviuose buvo atliktas ištisų ląstelių stebėjimas naudojant tiesioginį „SliceScope“ mikroskopą („Scientifica“). Pjūviai buvo perfuzuoti aCSF (95 % O2 ir 5 % CO2), o ląstelių signalai buvo registruojami kambario temperatūroje. hCO neuronai buvo užtepti naudojant borosilikatinio stiklo pipetę, pripildytą tirpalu, kuriame yra 127 mM kalio gliukonato, 8 mM NaCl, 4 mM magnio ATP, 0,3 mM natrio GTP, 10 mM HEPES ir 0,6 mM EGTA, vidinis pH 7, 2, sureguliuotas KOH (osmoliariškumas 290). Atgavimo tikslais į vidinį tirpalą įpilkite 0,2 % biocitino.
Duomenys buvo surinkti naudojant „Clampex“ („Clampex 11.1“, „Molecular Devices“) programinę įrangą, naudojant „MultiClamp 700B“ stiprintuvą („Molecular Devices“) ir „Digidata 1550B“ skaitmenintuvą („Molecular Devices“), žemo dažnio filtravimas atliktas 2 kHz dažniu, skaitmeninimas atliktas 20 kHz dažniu ir analizuojami naudojant „Clampfit“ (10.6 versija) analizei (molekuliniams įrenginiams) ir pritaikytas MATLAB funkcijas („MATLAB 2019b“, „Mathworks“). Jungties potencialas buvo apskaičiuotas naudojant JPCalc, o įrašai pakoreguoti pagal apskaičiuotą -14 mV jungties potencialą. IV operacija susideda iš srovės žingsnių serijos 5–10 pA žingsniais nuo -50 iki 250 pA.
Morfologinei suspaustų neuronų rekonstrukcijai į vidinį tirpalą buvo įpilta 0,2 % biocitino („Sigma-Aldrich“). Ląstelės po įpjovimo ruošiamos mažiausiai 15 minučių. Tada pipetė lėtai traukiama 1–2 minutes, kol užregistruota membrana visiškai užsandarinama. Po pjūvių fiziologijos procedūros pjūviai buvo fiksuoti per naktį 4 °C temperatūroje 4 % PFA tirpale, plaunami PBS X3 ir praskiesti santykiu 1:1000 streptavidinu konjuguotu DyLight 549 arba DyLight 405 („Vector Labs“). Ląstelės, užpildytos biocitinu (2 %; „Sigma-Aldrich“), buvo žymimos lopo spaustuko registravimo metu kambario temperatūroje 2 valandas. Tada pjūviai buvo pritvirtinti ant mikroskopo stiklelių naudojant „Aquamount“ („Thermo Scientific“) ir kitą dieną vizualizuoti „Leica TCS SP8“ konfokaliniu mikroskopu, naudojant aliejaus imersijos objektyvą su skaitine apertūra ×40 1,3, didinimu ×0,9–1,0, xy. Mėginių ėmimo dažnis yra maždaug 7 pikseliai mikronui. Z formos kaupikai buvo gauti nuosekliai 1 µm intervalais, o z formos kaupo mozaikos ir „Leica“ pagrindu sukurtas automatinis susiuvimas buvo atlikti siekiant padengti visą kiekvieno neurono dendritinį medį. Neuronai buvo sekami pusiau rankiniu būdu naudojant „neuTube 40“ sąsają ir sugeneruoti SWC failai. Tada failai buvo įkelti į „SimpleNeuriteTracer41 Fiji“ papildinį („ImageJ“, 2.1.0 versija; NIH).
Žmogaus žievės audinys buvo gautas gavus informuotą sutikimą pagal Stanfordo universiteto Institucinės peržiūros tarybos patvirtintą protokolą. Du žmogaus pogimdyminio audinio mėginiai (3 ir 18 metų amžiaus) buvo gauti atliekant priekinės žievės (vidurinio kaktos vingio) rezekciją kaip refrakterinės epilepsijos operacijos dalį. Po rezekcijos audiniai buvo imami lediniame NMDG-aCSF tirpale, kuriame buvo: 92 mM NMDG, 2,5 mM KCl, 1,25 mM NaH2PO4, 30 mM NaHCO3, 20 mM HEPES, 25 mM gliukozės, 2 mM tiourėjos, 5 mM natrio askorbato, 3 mM natrio piruvato, 0,5 mM CaCl2 4H2O ir 10 mM MgSO4 7H2O. Titruojama iki pH 7,3–7,4 koncentruota druskos rūgštimi. Audiniai buvo pristatyti į laboratoriją per 30 minučių, o vainikiniai pjūviai buvo paimti pagal aukščiau aprašytą procedūrą.
Visos gyvūnų procedūros buvo atliekamos laikantis Stanfordo universiteto APLAC patvirtintų gyvūnų priežiūros gairių. Žiurkėms (praėjus daugiau nei 140 dienų po transplantacijos) buvo taikoma 5 % izoflurano anestezija ir jos operacijos metu buvo anestezuojamos 1–3 % izoflurano tirpalu. Gyvūnai buvo patalpinti į stereotaksinį rėmą (Kopf) ir po oda buvo sušvirkštas pailginto atpalaidavimo buprenorfinas (SR). Kaukolė buvo atidengta, nuvalyta ir įstatyti 3–5 kauliniai varžtai. Norėdami pasiekti t-hCO2, iš MRT vaizdų sugeneravome stereotaksines koordinates. Domėjimosi vietoje buvo išgręžta skylė, o pluoštai (400 µm skersmens, NA 0,48, dorinis) buvo nuleisti 100 µm žemiau hCO2 paviršiaus ir pritvirtinti prie kaukolės UV spinduliuose kietėjančiu dantų cementu (Relyx).
Šviesolaidinio fotometrinio aktyvumo įrašymas buvo atliktas, kaip aprašyta anksčiau42. Spontaniniam aktyvumui užregistruoti žiurkės buvo patalpintos į švarų narvelį, o prie implantuoto šviesolaidinio kabelio buvo prijungtas 400 µm skersmens šviesolaidinis jungiamasis kabelis („Doric“), prijungtas prie šviesolaidinės fotometrinės duomenų rinkimo sistemos. 10 minučių trukmės motorinio aktyvumo registravimo metu gyvūnai galėjo laisvai tyrinėti narvelį. Sukeltam aktyvumui užregistruoti žiurkės (praėjus daugiau nei 140 dienų po transplantacijos) buvo anestezuojamos 5 % izoflurano tirpalu indukcijai ir 1–3 % izoflurano tirpalu palaikymui. Gyvūnas įdedamas į stereotaksinį rėmą („Kopf“), o ūsai priešingoje t-hCO3 pusėje nukerpami iki maždaug 2 cm ir perkišami per tinklelį, prijungtą prie pjezoelektrinio pavaros (PI). 400 µm šviesolaidinis jungiamasis kabelis („Doric“) buvo prijungtas prie implantuoto šviesolaidinio kabelio ir prie duomenų rinkimo sistemos. Ūsai, esantys priešingoje t-hCO3 pusėje, buvo nukreipti 50 kartų (2 mm esant 20 Hz dažniui, 2 s per pateikimą) atsitiktiniu laiku pjezoelektrine pavara per 20 minučių įrašymo laikotarpį. Norėdami valdyti nukreipimo laiką su pasirinktiniu MATLAB kodu, naudokite „Arduino MATLAB“ palaikymo paketą. Įvykiai sinchronizuojami su duomenų rinkimo programine įranga naudojant tranzistorių-tranzistorių logiką (TTL).
Žiurkėms (praėjus daugiau nei 140 dienų po transplantacijos) buvo taikoma 5 % izoflurano anestezija ir jos operacijos metu buvo anestezuojamos 1–3 % izoflurano tirpalu. Gyvūnai buvo patalpinti į stereotaksinį rėmą (Kopf), o po oda buvo sušvirkšta buprenorfino SR ir deksametazono. Kaukolė buvo atidengta, nuvalyta ir įsriegiami 3–5 kaulo varžtai. Norėdami pasiekti t-hCO2, stereotaksinės koordinatės buvo sugeneruotos iš MRT vaizdų. Didelio greičio grąžtu tiesiai virš persodinto hCO2 buvo atlikta žiedinė kraniotomija (maždaug 1 cm skersmens). Kai kaulas tapo kuo plonesnis, bet prieš pergręžiant visą kaulą, žnyplėmis buvo pašalintas likęs nepažeistas dubens diskas, kad būtų atidengtas po juo esantis t-hCO2. Kraniotomija buvo užpildyta steriliu fiziologiniu tirpalu, o prie kaukolės UV spinduliuose kietinamu dantų cementu (Relyx) buvo pritvirtintas dengiamasis stikliukas ir specialus galvos kaištis.
Dviejų fotonų vaizdinimas buvo atliktas naudojant „Bruker“ daugiafotonį mikroskopą su „Nikon LWD“ (×16, 0,8 NA) objektyvu. GCaMP6 vaizdinimas buvo atliktas esant 920 nm bangos ilgiui, 1,4 karto vienos z plokštumos didinimu ir 8 kartus vidutiniškai 7,5 kadrų per sekundę greičiu. Žiurkėms buvo sukelta 5 % izoflurano anestezija ir palaikoma 1–3 % izoflurano. Žiurkės buvo patalpintos į specialiai pagamintą galvos tvirtinimo elementą ir padėtos po lęšiu. Buvo gautas 3 minučių trukmės foninis motorinio aktyvumo įrašymas. Per 20 minučių įrašymo metu 50 įpūtimų (kiekvieno pateikimo trukmė – 100 ms) buvo atsitiktinai nukreipti į priešingą t-hCO3 ūsų pagalvėlę, naudojant pikospricerį. Naudokite „Arduino MATLAB“ palaikymo paketą, kad valdytumėte impulsų trukmę su specialiai pritaikytu MATLAB kodu. Sinchronizuokite įvykius su duomenų rinkimo programine įranga („PrairieView 5.5“) naudodami TTL impulsus. Analizei vaizdai buvo pakoreguoti pagal xy judėjimą naudojant afinę korekciją Fidžyje paleistoje „MoCo“ programoje. Fluorescencinių pėdsakų išskyrimas iš atskirų ląstelių naudojant CNMF-E43. Kiekvienos dominančios srities fluorescencija buvo išskirta, konvertuota į dF/F kreives, o tada konvertuota į z balus.
Žiurkėms (praėjus daugiau nei 140 dienų po transplantacijos) buvo taikoma 5 % izoflurano anestezija ir jos operacijos metu buvo anestezuojamos 1–3 % izoflurano tirpalu. Gyvūnai buvo patalpinti į stereotaksinį rėmą (Kopf) ir po oda buvo sušvirkštas buprenorfinas SR bei deksametazonas. Priešingoje t-hCO pusėje esantys ūsai buvo nukirpti iki maždaug 2 cm ilgio ir perverti per tinklelį, prijungtą prie pjezoelektrinio pavaros. Kaukolė buvo atidengta ir nuvalyta. Prie kaukolės pritvirtintas nerūdijančio plieno įžeminimo varžtas. Norėdami nustatyti t-hCO, stereotaksinės koordinatės buvo sugeneruotos iš MRT vaizdų. Atlikite žiedinę kraniotomiją (maždaug 1 cm skersmens) didelio greičio grąžtu tiesiai virš t-hCO. Kai kaulas taps kuo plonesnis, bet prieš pergręždami visą kaulą, žnyplėmis pašalinkite likusį nepažeistą dubens diską, kad atidengtumėte po juo esantį t-hCO. Individualios ląstelės buvo registruojamos naudojant 32 arba 64 kanalų didelio tankio silicio zondus („Cambridge Neurotech“), įžemintus prie įžeminimo varžtų ir iš anksto sustiprintus RHD stiprintuvais („Intan“). Manipuliatoriumi elektrodai buvo nuleisti į tikslinę vietą per kraniotomiją, kuri užpildyta steriliu fiziologiniu tirpalu. Duomenų rinkimas buvo atliktas 30 kHz dažniu, naudojant „Open Ephys“ duomenų rinkimo sistemą. Įrašymas buvo tęsiamas tik tada, kai aptikome labai koreliuojamą ritminį savaiminį aktyvumą daugiau nei 10 kanalų, o tai rodo, kad elektrodai buvo transplantate (remiantis dviejų fotonų kalcio vaizdavimo duomenimis). Buvo gautas 10 minučių foninis motorinio aktyvumo įrašas. Tada ūsai, esantys priešingoje t-hCO3 pusėje, buvo nukreipti 50 kartų (2 mm esant 20 Hz dažniui, 2 s per pateikimą) atsitiktiniu laiku pjezoelektrine pavara per 20 minučių įrašymo laikotarpį. Naudojant MATLAB palaikymo paketą „Arduino“ (MATLAB 2019b), nukreipimo laiką valdykite su pasirinktiniu MATLAB kodu. Naudokite TTL impulsus, kad sinchronizuotumėte įvykius su duomenų rinkimo programine įranga.
Optinio žymėjimo eksperimentams 200 µm optinis jungiamasis laidas („Doric“), prijungtas prie 473 nm lazerio („Omicron“), buvo prijungtas prie 200 µm optinio pluošto, uždėto virš kraniotomijos. Prieš pat tai trumpiklio galia buvo sureguliuota iki 20 mW. Manipuliatoriumi elektrodus nuleisti į taikinio vietą per kraniotomiją, kuri pripildyta steriliu fiziologiniu tirpalu. Įrašymo pradžioje buvo išsiųsti dešimt 473 nm šviesos impulsų (dažnis 2 Hz, impulso trukmė 10 ms). Šviesai jautrios ląstelės apibrėžtos kaip ląstelės, kurios 70 % ar daugiau bandymų parodė smailės atsaką per 10 ms nuo šviesos.