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Les organites neuronaux auto-assemblés représentent une plateforme in vitro prometteuse pour la modélisation du développement et des maladies humaines. Cependant, les organoïdes manquent de la connectivité existante in vivo, ce qui limite leur maturation et empêche leur intégration avec d'autres circuits contrôlant le comportement. Nous montrons ici que des organites corticaux dérivés de cellules souches humaines transplantés dans le cortex somatosensoriel de rats nus nouveau-nés développent des types cellulaires matures qui s'intègrent aux circuits sensoriels et motivationnels. L'IRM a révélé une croissance organoïde post-transplantation dans plusieurs lignées de cellules souches et animaux, tandis que l'analyse monocœur a révélé une progression de la corticogenèse et l'émergence d'un programme de transcription dépendant de l'activité. En effet, les neurones corticaux transplantés présentent des propriétés morphologiques, synaptiques et membranaires internes plus complexes que leurs homologues in vitro, ce qui permet de détecter des anomalies neuronales chez les patients atteints du syndrome de Timothy. Le traçage anatomique et fonctionnel a montré que les organites transplantés reçoivent des entrées thalamocorticales et corticocorticales, et les enregistrements in vivo de l'activité neuronale suggèrent que ces entrées peuvent générer des réponses sensorielles dans les cellules humaines. Enfin, les organoïdes corticaux étendent leurs axones dans tout le cerveau du rat, et leur activation optogénétique induit un comportement de recherche de récompense. Ainsi, les neurones du cortex humain transplantés mûrissent et participent aux circuits de l'hôte qui contrôlent le comportement. Nous espérons que cette approche facilitera la détection de phénotypes au niveau des brins dans les cellules dérivées de patients, impossibles à détecter par d'autres moyens.
Le développement du cerveau humain est un remarquable processus d'auto-organisation au cours duquel les cellules prolifèrent, se différencient, migrent et se connectent pour former des circuits neuronaux fonctionnels qui s'affinent grâce à l'expérience sensorielle. Un problème majeur pour comprendre le développement du cerveau humain, notamment dans le contexte de la maladie, est le manque d'accès au tissu cérébral. Les organites auto-organisés, notamment les organoïdes du cortex humain (hCO ; également appelés sphères corticales humaines), peuvent générer des 2, 3, 4, 5, 6. Cependant, plusieurs limitations limitent leur application à la compréhension du développement et du fonctionnement des circuits neuronaux. En particulier, on ignore si la maturation des hCO est limitée par l'absence de certaines entrées microenvironnementales et sensorielles présentes in vivo. De plus, les hCO n'étant pas intégrés à des circuits capables de générer des résultats comportementaux, leur utilité pour la modélisation de troubles neuropsychiatriques génétiquement complexes et comportementaux est actuellement limitée.
La transplantation de hCO dans un cerveau vivant intact peut surmonter ces limitations. Des études antérieures ont montré que des neurones humains transplantés dans le cortex de rongeurs sont capables de survivre, de se projeter et de communiquer avec les cellules de rongeurs7,8,9,10,11,12. Cependant, ces expériences sont généralement réalisées sur des animaux adultes, ce qui peut limiter l'intégration synaptique et axonale. Nous décrivons ici un paradigme de transplantation dans lequel nous avons transplanté du hCO 3D dérivé de cellules hiPS dans le cortex somatosensoriel primaire (S1) de rats immunodéficients à un stade précoce de développement plastique. Les neurones hCO (t-hCO) transplantés subissent une maturation substantielle, reçoivent des entrées thalamocorticales et cortico-corticales qui déclenchent des réponses sensorielles, et étendent les projections axonales dans le cerveau du rat pour stimuler le comportement de recherche de récompense. La maturation prolongée du t-hCO a révélé des défauts neuronaux chez les patients atteints du syndrome de Timothy (TS), une maladie génétique grave causée par des mutations dans le canal calcique CaV1.2 de type L sensible à la tension (codé par CACNA1C).
Pour étudier les neurones corticaux humains dans les circuits in vivo, nous avons transplanté stéréotaxiquement du hCO 3D intact dans le S1 de rats athymiques postnatals précoces (jours 3 à 7 postnatals) (Fig. 1a et données étendues des Fig. 1a-c). À ce stade, les projections axonales thalamocorticales et corticocorticales n'ont pas encore terminé leur innervation du S1 (réf. 13). Ainsi, cette approche est conçue pour maximiser l'intégration du t-hCO tout en minimisant l'impact sur les circuits endogènes. Pour visualiser la localisation du t-hCO chez les animaux vivants, nous avons réalisé des reconstructions cérébrales IRM pondérées en T2 de rats 2 à 3 mois après la transplantation (Fig. 1b et données étendues, Fig. 1d). Les t-hCO ont été facilement observés et les mesures de volume de t-hCO étaient similaires à celles calculées à partir de tranches fixes (données étendues Fig. 1d, e ; P > 0,05). Les t-hCO ont été facilement observés et les mesures de volume de t-hCO étaient similaires à celles calculées à partir de tranches fixes (données étendues Fig. 1d, e ; P > 0,05). t-hCO est justement en mesure d'effectuer une mesure approfondie de t-hCO en utilisant des données analogiques pour les effets de fixation (risques de sécurité). 1d, e ; 0,05). Les t-hCO ont été facilement observés et les mesures volumétriques de t-hCO étaient similaires à celles calculées pour les sections fixes (données développées, Fig. 1d, e ; P > 0,05).很容易观察到t-hCO，并且t-hCO La valeur de référence est 1d、e；P > 0.05）.很容易观察到t-hCO，并且t-hCO t-hCO est justement arrivé, et l'étude approfondie de t-hCO a été effectuée de manière analogique pour les effets de fixation (risques. 1d,e;P>0,05). Le t-hCO a été facilement observé et les mesures volumétriques de t-hCO étaient similaires à celles calculées pour les sections fixes (données développées, Fig. 1d, e ; P > 0,05).Nous avons déterminé la t-hCO chez 81 % des animaux transplantés environ 2 mois après la transplantation (n = 72 animaux ; hCO provenant de 10 lignées cellulaires hiPS ; lignées cellulaires hiPS dans le tableau supplémentaire 1). Parmi ceux-ci, 87 % étaient situés dans le cortex cérébral (Fig. 1c). En effectuant des IRM en série à plusieurs moments dans le temps chez le même rat transplanté, nous avons constaté une augmentation de neuf fois du volume de t-hCO en 3 mois (Fig. 1d et données étendues, Fig. 1f). Les animaux transplantés avaient un taux de survie élevé (74 %) à 12 mois après la transplantation (données étendues, Fig. 1g et tableau supplémentaire 2), et aucun trouble moteur ou de mémoire manifeste, aucune gliose, ni aucun électroencéphalogramme (EEG) n'ont été observés. Données Fig. 1g et tableau supplémentaire 2). 1h–m et 3e).
a, Schéma du plan expérimental. Le hCO dérivé des cellules hiPS a été transplanté dans S1 de rats nudes nouveau-nés aux jours 30 à 60 de différenciation. b, Images IRM coronales et horizontales pondérées en T2 montrant le t-hCO dans S1 2 mois après la transplantation. Barre d'échelle, 2 mm. c, Quantification des taux de réussite de la greffe indiquée pour chaque lignée cellulaire hiPS (n = 108, les nombres dans les barres indiquent la quantité de t-hCO par lignée cellulaire hIPS) et l'emplacement cortical ou sous-cortical (n = 88). d, Image IRM d'une artère coronaire (à gauche ; barre d'échelle, 3 mm) et reconstruction volumétrique 3D correspondante (barre d'échelle, 3 mm) montrant une augmentation du t-hCO sur 3 mois. e, Examen des profils de t-hCO dans le cortex cérébral du rat. Barre d'échelle, 1 mm. f, Images immunocytochimiques représentatives de t-hCO présentées de haut en bas à gauche vers la droite (pendant la différenciation) : PPP1R17 (4 mois), NeuN (8 mois), SOX9 et GFAP (8 mois), PDGFRα ; (8 mois), MAP2 (8 mois) et IBA1 (8 mois). Barre d'échelle, 20 µm. La co-expression de HNA indique des cellules d'origine humaine. g, snRNA-seq : Imagerie de réduction de dimensionnalité UMAP (Unified manifold and projection) de tous les noyaux t-hCO de haute qualité après intégration de Seurat (n = 3 échantillons de t-hCO, n = 2 lignées cellulaires hiPS). Astrocytes, cellules de la lignée astrocytaire ; cyc prog, progéniteurs circulants ; GluN DL, neurones glutamatergiques profonds ; GluN DL/SP, neurones glutamatergiques profonds et sous-lamellaires ; GluN UL, neurones glutamatergiques de la couche supérieure ; oligodendrocytes, oligodendrocytes ; OPC, cellules progénitrices d'oligodendrocytes ; RELN, neurones à rééline. h, analyse d'enrichissement des termes de l'ontologie génétique (GO) des gènes significativement régulés à la hausse (P ajusté < 0,05, changement de facteur > 2, exprimé dans au moins 10 % des noyaux) dans les neurones glutamatergiques t-hCO par rapport aux neurones glutamatergiques hCO. h, analyse d'enrichissement des termes de l'ontologie génétique (GO) des gènes significativement régulés à la hausse (P ajusté < 0,05, changement de facteur > 2, exprimé dans au moins 10 % des noyaux) dans les neurones glutamatergiques t-hCO par rapport aux neurones glutamatergiques hCO. h, Analyse des termes de l'ontologie génétique (GO) pour les gènes avec une activité spécifique (correction P <0,05, taille de référence > 2, expression p крайней мере в 10% ядер) в глутаматергических нейронах t-hCO по сравнению с глутаматергическими нейронами hCO. h, analyse d'enrichissement des termes de l'ontologie génétique (GO) pour les gènes avec une activation significative (P ajusté < 0,05, changement de repli > 2, expression dans au moins 10 % des noyaux) dans les neurones glutamatergiques t-hCO par rapport aux neurones glutamatergiques hCO. h, hCO 2，在至少10% 的细胞核中表达）的基因本体论(GO) 术语富集分析。 h ， 与 hco 谷氨酸 能 元 相比 ， t-hco 谷氨酸 能 神经 元 基因 显着 上调 （后 后 p <0.05 ， 变化变化> 2 ， 至少 10% 的 核中 表达） 基因 基因 基因 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的的 的本体论(GO) 术语富集分析。 h, гены значительно активизировались (скорректированный P <0,05, кратность изменения> 2, экспрессируется по крайней мере в 10% ядер) в Les neurones glutamines t-hCO sont à l'écoute des neurones glutamines hCO. L'ontologie (GO) analyse les termes de l'obligation. h, les gènes ont été significativement régulés à la hausse (P ajusté < 0,05, changement de facteur > 2, exprimés dans au moins 10 % des noyaux) dans les neurones glutamatergiques t-hCO par rapport aux neurones glutamatergiques hCO Analyse ontologique (GO) du terme d'enrichissement.La ligne pointillée indique une valeur aq de 0,05. i, imagerie UMAP des types de cellules GluN dans t-hCO à l'aide du transfert de marqueur à partir d'un ensemble de données de référence 22 snRNA-seq du cortex moteur adulte. CT — cellules corticothalamiques, ET — cellules extracérébrales, IT — cellules télencéphaliques internes, NP — projection proche.
Français Nous avons ensuite évalué la cytoarchitecture et la composition cellulaire globale du t-hCO. La coloration des cellules endothéliales de rat par anticorps a révélé une vascularisation au t-hCO, tandis que la coloration IBA1 a révélé la présence de microglie de rat dans toute la greffe (Fig. 1f et données étendues, Fig. 3c, d). L'immunomarquage a révélé des cellules positives à l'antigène nucléaire humain (HNA) coexprimant PPP1R17 (progéniteurs corticaux), NeuN (neurones), SOX9 et GFAP (cellules dérivées des cellules gliales) ou PDGFRα (progéniteurs des oligodendrocytes) (Figure 1f). Pour étudier la composition cellulaire du t-hCO à la résolution d'une cellule unique, nous avons réalisé un séquençage d'ARN mononucléaire (snRNA-seq) après environ 8 mois de différenciation. La filtration en vrac et l'élimination des noyaux de rat ont produit 21 500 cartes mononucléaires humaines de haute qualité (Fig. 1g et données étendues, Fig. 4a, b). Français Les profils d'expression des marqueurs typiques du type cellulaire ont identifié des groupes de classes de cellules corticales majeures, y compris les neurones glutamatergiques profonds et superficiels, les progéniteurs circulants, les oligodendrocytes et la lignée des astrocytes (Fig. 1g, données étendues, Fig. 4c et tableau supplémentaire 3). L'immunomarquage pour SATB2 et CTIP2 a montré que malgré la présence de sous-types corticaux, le t-hCO ne présentait pas de stratification anatomique claire (données étendues, Fig. 3a). Le snRNA-seq hCO adapté au stade a produit des classes cellulaires globalement similaires, à quelques exceptions près, notamment l'absence d'oligodendrocytes et la présence de neurones GABAergiques, ce qui peut refléter les conditions in vitro favorables précédemment rapportées pour les cellules progénitrices latérales15 (données étendues, Fig. 4f – i et tableau supplémentaire 4). L'analyse de l'expression différentielle des gènes a révélé des différences significatives dans les neurones glutamatergiques entre t-hCO et hCO (tableau supplémentaire 5), y compris l'activation d'ensembles de gènes associés à la maturation neuronale tels que la signalisation synaptique, la localisation dendritique et l'activité des canaux voltage-dépendants (figure 1h et tableau supplémentaire 5). tableau 6). En conséquence, les neurones glutamatergiques corticaux t-hCO ont présenté une maturation transcriptionnelle accélérée.
Français Pour élucider si ces changements transcriptionnels dans le t-hCO étaient liés à des différences morphologiques entre le hCO in vitro et le t-hCO in vivo, nous avons reconstruit du hCO et du hCO remplis de biocytine de stade correspondant dans des sections aiguës après 7 à 8 mois de différenciation. neurones hCO (Fig. 2a). Les neurones t-hCO étaient significativement plus grands, avaient 1,5 fois le diamètre du soma, deux fois plus de dendrites et une augmentation globale de six fois de la longueur dendritique totale par rapport au hCO in vitro (Fig. 2b). De plus, nous avons observé une densité significativement plus élevée d'épines dendritiques dans les neurones t-hCO que dans les neurones hCO (Fig. 2c). Cela suggère que les neurones t-hCO subissent une élongation et une ramification dendritiques importantes, qui, en combinaison avec une prolifération cellulaire continue, peuvent contribuer à la croissance intensive du t-hCO après la transplantation (Fig. 1d et Données étendues Fig. 1f). Français Cela nous a incité à étudier les propriétés électrophysiologiques. La capacité membranaire était huit fois plus élevée (données développées, Fig. 8d), le potentiel de membrane à l'état de repos était plus hyperpolarisé (environ 20 mV) et l'injection de courant induisait un taux d'excitation maximal plus élevé dans les neurones t-hCO que dans les neurones hCO. in vitro (Fig. 2d), e), ce qui est cohérent avec les caractéristiques morphologiques plus grandes et plus complexes du t-hCO. De plus, la fréquence des événements de courant postsynaptiques excitateurs spontanés (EPSC) était significativement plus élevée dans les neurones t-hCO (Fig. 2f), suggérant que la densité accrue d'épines dendritiques observée dans les neurones t-hCO était associée à une excitabilité fonctionnelle. synapse sexuelle. Nous avons confirmé le caractère immature des neurones hCO in vitro en enregistrant des neurones glutamatergiques marqués (données développées, Fig. 6a-c).
a, reconstruction 3D des neurones hCO et t-hCO remplis de biocytine après 8 mois de différenciation. b, Quantification des caractéristiques morphologiques (n = 8 neurones hCO, n = 6 neurones t-hCO ; **P = 0,0084, *P = 0,0179 et ***P < 0,0001). b, Quantification des caractéristiques morphologiques (n = 8 neurones hCO, n = 6 neurones t-hCO ; **P = 0,0084, *P = 0,0179 et ***P < 0,0001). б, количественная оценка морфологических признаков (n = 8 нейронов hCO, n = 6 нейронов t-hCO ; ** P = 0,0084, * P = 0,0179 и *** P <0,0001). b, quantification des caractéristiques morphologiques (n = 8 neurones hCO, n = 6 neurones t-hCO ; **P = 0,0084, *P = 0,0179 et ***P < 0,0001). b，n = 8 个hCO 神经元，n = 6 个t-hCO 神经元；**P = 0,0084，*P = 0,0179 和***P < 0,0001）。 b，n = 8 个hCO 神经元，n = 6 个t-hCO 神经元；**P = 0,0084，*P = 0,0179 和***P < 0,0001）。 б, количественная оценка морфологических признаков (n = 8 нейронов hCO, n = 6 нейронов t-hCO ; ** P = 0,0084, * P = 0,0179 и *** P <0,0001). b, quantification des caractéristiques morphologiques (n = 8 neurones hCO, n = 6 neurones t-hCO ; **P = 0,0084, *P = 0,0179 et ***P < 0,0001).c, reconstruction 3D des branches dendritiques hCO et t-hCO après 8 mois de différenciation. Les astérisques rouges indiquent les épines dendritiques putatives. Quantification de la densité des épines dendritiques (n = 8 neurones hCO, n = 6 neurones t-hCO ; **P = 0,0092). d, Quantification du potentiel de membrane au repos (n = 25 neurones hCO, n = 16 neurones t-hCO ; ***P < 0,0001). d, Quantification du potentiel de membrane au repos (n = 25 neurones hCO, n = 16 neurones t-hCO ; ***P < 0,0001). d, количественная оценка мембранного потенциала покоя (n = 25 нейронов hCO, n = 16 нейронов t-hCO ; *** P <0,0001). d, quantification du potentiel de membrane au repos (n = 25 neurones hCO, n = 16 neurones t-hCO ; ***P < 0,0001). d，n = 25 hCO 神经元，n = 16 t-hCO 神经元；***P < 0,0001）。 d，n = 25 hCO 神经元，n = 16 t-hCO 神经元；***P < 0,0001）。 d, количественная оценка мембранного потенциала покоя (n = 25 нейронов hCO, n = 16 нейронов t-hCO ; *** P <0,0001). d, quantification du potentiel de membrane au repos (n = 25 neurones hCO, n = 16 neurones t-hCO ; ***P < 0,0001). e, Déclenchement du potentiel d'action répétitif dans hCO et t-hCO induit par des injections de courant croissantes, et quantification du taux de déclenchement maximal (n = 25 neurones hCO, n = 16 neurones t-hCO ; ***P < 0,0001). e, Déclenchement du potentiel d'action répétitif dans hCO et t-hCO induit par des injections de courant croissantes, et quantification du taux de déclenchement maximal (n = 25 neurones hCO, n = 16 neurones t-hCO ; ***P < 0,0001). e, повторное возбуждение потенциала действия в hCO и t-hCO, вызванное увеличением тока, и количественная оценка максимальной скорости возбуждения (n = 25 нейронов hCO, n = 16 нейронов t-hCO; *** P <0,0001). e, réactivation du potentiel d'action dans hCO et t-hCO induite par l'augmentation du courant et quantification du taux de déclenchement maximal (n = 25 neurones hCO, n = 16 neurones t-hCO ; *** P < 0,0001). e, hCO et t-hCO (n = 25 hCO)神经元，n = 16 个t-hCO 神经元；***P < 0,0001）。 E ， 通过 增加 电流 注入 的 的 hco 和 t-hco 重复 电位 放电 ， 以及 最 大 的 量化 （（n = 25 个 hco神经 ， n = 16 个 t-hco 神经 ； *** p <0,0001） 。 e, повторяющееся возбуждение потенциала действия hCO и t-hCO, вызванное увеличением подачи тока, и количественная оценка максимальной скорости возбуждения (n = 25 нейронов hCO, n = 16 нейронов t-hCO ; *** P <0,0001). e, déclenchement répétitif des potentiels d'action hCO et t-hCO induits par une augmentation de l'alimentation en courant et quantification du taux de déclenchement maximal (n = 25 neurones hCO, n = 16 neurones t-hCO ; *** P < 0,0001). f, EPSC spontanés (sEPSC) dans les neurones hCO et t-hCO à 8 mois de différenciation, et quantification de la fréquence des événements synaptiques (n = 25 neurones hCO, n = 17 neurones t-hCO ; ***P < 0,0001). f, EPSC spontanés (sEPSC) dans les neurones hCO et t-hCO à 8 mois de différenciation, et quantification de la fréquence des événements synaptiques (n = 25 neurones hCO, n = 17 neurones t-hCO ; ***P < 0,0001). f, спонтанные EPSC (sEPSC) dans нейронах hCO и t-hCO через 8 месяцев дифференцировки и количественная оценка частоты синаптических событий (n = 25 nééronovs hCO, n = 17 нейронов t-hCO; *** P <0,0001) . f, EPSC spontanés (sEPSC) dans les neurones hCO et t-hCO à 8 mois de différenciation et quantification des taux d'événements synaptiques (n = 25 neurones hCO, n = 17 neurones t-hCO ; ***P < 0,0001). f, environ 8 hCO et t-hCO et EPSC (sEPSC), n = 25 hCO神经元，n = 17 t-hCO 神经元；***P < 0,0001） . f, environ 8 hCO et t-hCO et des EPSC (sEPSC) (n = 25 hCO)神率的量匼（n = 25 hCO 神率的量匼（n = 25hCO P < 0,0001） . f, спонтанные EPSC (sEPSC) dans нейронах hCO и t-hCO через 8 месяцев дифференцировки и количественная оценка частоты синаптических событий (n = 25 nééronovs hCO, n = 17 нейронов t-hCO; *** P <0,0001). f, EPSC spontanés (sEPSC) dans les neurones hCO et t-hCO à 8 mois de différenciation et quantification des taux d'événements synaptiques (n = 25 neurones hCO, n = 17 neurones t-hCO ; *** P < 0,0001).Pour bf, hCO et t-hCO dans la ligne 1208-2 ont été prélevés dans le même lot de différenciation maintenu en parallèle. g, Analyse d'enrichissement de l'ensemble de gènes (test exact de Fisher unilatéral) des gènes significativement régulés à la hausse (P ajusté < 0,05, changement de facteur > 2, exprimés dans au moins 10 % des noyaux) dans les neurones glutamatergiques t-hCO par rapport aux neurones glutamatergiques hCO avec des ensembles de gènes dépendants de l'activité de réponse précoce (ERG) et de réponse tardive (LRG) identifiés à partir d'une étude in vivo sur la souris16 et des LRG spécifiques à l'homme provenant de neurones in vitro17. g, Analyse d'enrichissement de l'ensemble de gènes (test exact de Fisher unilatéral) des gènes significativement régulés à la hausse (P ajusté < 0,05, changement de facteur > 2, exprimés dans au moins 10 % des noyaux) dans les neurones glutamatergiques t-hCO par rapport aux neurones glutamatergiques hCO avec des ensembles de gènes dépendants de l'activité de réponse précoce (ERG) et de réponse tardive (LRG) identifiés à partir d'une étude in vivo sur la souris16 et des LRG spécifiques à l'homme provenant de neurones in vitro17. g, ANALIS обогащения набора генов (односторонний точный критерий Фишера) генов со значительной активацией (скорректированный P <0,05, кратность изменения > 2, экспрессия по меньшей мере в 10% ядер) в глутаматергических нейронах t-hCO по сравнению с глутаматергическими Les neurones hCO concernant les gènes tels que le dioxyde de carbone (ERG), ainsi que les gènes possédés (LRG), sont des informations sur les activités, identifiées dans les instructions sur мышах in vivo16, et les spécifications pour la biologie LRG et les neurones in vitro17. g, analyse de l'enrichissement de l'ensemble de gènes (test exact de Fisher unilatéral) des gènes avec une activation significative (P ajusté < 0,05, changement de repli > 2, expression dans au moins 10 % des noyaux) dans les neurones glutamatergiques t-hCO par rapport aux ensembles de neurones glutamatergiques hCO de gènes dépendants de l'activité précoce (ERG) et tardive (LRG) identifiés chez des souris in vivo16 et des LRG spécifiques à l'homme provenant de neurones in vitro17. g，t-hCO谷氨酸能神经元与hCO谷氨酸能神经元相比，t -hCO谷氨酸能神经元显着上调（调整后P<0.05，倍数变化>2，在至少10%的细胞核中表达）的基因集富集分析（单侧F isher和晚期反应(LRG) 活性依赖性基因的基因组16 et 17 中的人类特异性LRG。 g ， t-hco 谷氨酸 神经 元 与 hco 谷氨酸 神经 元 相比 ， t-hco 谷氨酸 神经 元 上调 （调整 后 p <0,05 ， 倍数> 2 ， 至少 至少 10%的 细胞 核中 表达） 的 集富集 分析 （单侧 fisher 精确）） 体内小鼠 研究 中 的 早期 反应 反应 反应 和 晚期 反应 反应 (lrg) 活性 基因 的 基因组 16 和 神经元Du 17 au 17 au 17 du 17 au 17, LRG。 g, les neurones glutamatergiques t-hCO sont spécifiquement activés pour le nettoyage des neurones glutamatergiques hCO (correxifs P<0,05, taille de la taille> 2, ne mesure pas 10% Analyse de la géographie (test de pêche) de la plage (ERG) et позднего Les gènes, qui sont responsables des résultats actifs (LRG), identifient les animaux in vivo16 et les humains in vitro17. LRG, spécifique pour la voiture. Les neurones glutamatergiques g, t-hCO ont été significativement régulés à la hausse par rapport aux neurones glutamatergiques hCO (P ajusté < 0,05, changement de repli > 2, au moins 10 % Analyse d'enrichissement des gènes de réponse précoce (ERG) et de réponse tardive (test exact de Fisher unilatéral) Gènes dépendants de l'activité de réponse (LRG) identifiés chez des souris in vivo16 et des neurones in vitro.17 LRG spécifiques à l'homme.Français La ligne pointillée indique une valeur de p corrigée de Bonferroni de 0,05. h, l'expression du gène GluN (pseudo-paquet et mise à l'échelle de chaque gène) a été significativement régulée à la hausse dans les répliques snRNA-seq des gènes LRG dans les neurones glutamatergiques t-hCO. i, immunocoloration montrant l'expression de SCG2 dans les neurones t-hCO (en haut) et hCO (en bas). Les flèches blanches pointent vers les cellules SCG2+. Barre d'échelle, 25 µm. Les données sont exprimées en moyenne ± écart type.
Français Sur la base de l'activité accrue de t-hCO observée dans des tranches ex vivo, le snRNA-seq a révélé une régulation positive dépendante de l'activité des transcrits génétiques dans t-hCO par rapport à hCO in vitro. Les neurones glutamatergiques t-hCO exprimaient des niveaux plus élevés de gènes régulant l'activité de réponse tardive (Fig. 2g,h), qui ont été trouvés dans des études précédentes sur des neurones de souris et humains16,17. Par exemple, BDNF18, SCG2 et OSTN, un gène régulateur d'activité spécifique aux primates, ont montré une expression accrue dans les neurones t-hCO par rapport aux neurones hCO (Fig. 2g-i). Ainsi, les neurones t-hCO ont montré des caractéristiques de maturation améliorées par rapport aux neurones hCO par des analyses transcriptionnelles, morphologiques et fonctionnelles.
Français Pour évaluer plus en détail l'association entre la maturation du t-hCO et le développement du cerveau humain, nous avons effectué des comparaisons transcriptomiques des types de cellules corticales fœtales et adultes19,20 et adultes21,22 ainsi que des données approfondies sur l'expression des gènes corticaux23 au cours du développement (données étendues, Fig. 5). ). avec des travaux antérieurs 24 , l'état de maturation du transcriptome global du hCO et du t-hCO à 7-8 mois de différenciation est globalement cohérent avec le temps de développement in vivo et est le plus équivalent à la fin de la vie fœtale (données étendues, Fig. 5a). Notamment, nous avons observé une maturité transcriptomique accrue dans le t-hCO par rapport au hCO du même âge, ainsi qu'une activation transcriptomique associée à la synaptogenèse, à l'astrogenèse et à la myélinisation (données étendues, Fig. 5b-d). Français Au niveau cellulaire, nous avons trouvé des preuves d'un sous-type de cortex plus fin dans le t-hCO, avec des amas de neurones glutamatergiques chevauchant les sous-types de neurones L2/3, L5 et L6 adultes (Figure 1i). En revanche, le chevauchement des amas entre les neurones glutamatergiques t-hCO et les neurones corticaux fœtaux était plus limité en milieu de grossesse (données étendues, Figure 5e-j). Afin de déterminer si les neurones t-hCO sont fonctionnellement similaires aux neurones néocorticaux postnatals humains, nous avons réalisé des enregistrements électrophysiologiques et des reconstructions anatomiques de neurones pyramidaux L2/3 humains dans des sections nettes du cortex postnatal humain (données étendues, Fig. 7a). Les propriétés électrophysiologiques des neurones pyramidaux L2/3 étaient similaires à celles des neurones pyramidaux t-hCO (données étendues, Fig. 7e). Morphologiquement, les neurones L2/3 provenant d'échantillons humains postnatals étaient plus similaires au t-hCO qu'au hCO, bien que les cellules L2/3 soient plus longues, contiennent globalement plus de branches et présentent une densité d'épines plus élevée (Fig. 3g et données étendues, Fig. 7b-). G).
a, transplantation de hCO produit par les lignées cellulaires hiPS témoins et TS chez des rats néonatals. b, reconstruction 3D de neurones t-hCO remplis de biocytine après 8 mois de différenciation. c, quantification de la longueur dendritique moyenne (n = 19 neurones témoins, n = 21 neurones TS ; **P = 0,0041). d, branches dendritiques reconstruites en 3D à partir du contrôle et du TS t-hCO à 8 mois de différenciation, et quantification de la densité des épines dendritiques (n = 16 neurones témoins, n = 21 neurones TS, ***P < 0,0001). d, branches dendritiques reconstruites en 3D à partir du contrôle et du TS t-hCO à 8 mois de différenciation, et quantification de la densité des épines dendritiques (n = 16 neurones témoins, n = 21 neurones TS, ***P < 0,0001). d, reconstitution 3D des dentiers en même temps que le contrôle et le TS t-hCO pendant 8 mois de différence et de collecte de dentiers. шипов (n = 16 контрольных нейронов, n = 21 TS нейронов, *** P <0,0001). d, reconstruction 3D des branches dendritiques à partir des neurones témoins et t-hCO TS à 8 mois de différenciation et quantification de la densité des épines dendritiques (n = 16 neurones témoins, n = 21 neurones TS, ***P < 0,0001). d，分化8 个月时对照和TS t-hCO 的3D 重建树突分支，以及树突棘密度的量化（n = 16个对照神经元，n = 21 个TS 神经元，***P < 0.0001）。 d ， 分化 8 个 时 对照 和 ts t-hco 的 3d 重建 分支 分支 以及 树突棘 密度 量化 （n = 16 个 神经元 ， n = 21 个 ts 神经 ， *** p <0,0001 ）。 d, 3D-reconstructivation de la voiture de contrôle et TS t-hCO avec 8 mois de différence et de collecte de données d'exploitation шипов (n = 16 контрольных нейронов, n = 21 TS нейронов, *** P <0,0001). d, reconstruction 3D des branches dendritiques de contrôle et du TS t-hCO à 8 mois de différenciation et quantification de la densité des épines dendritiques (n = 16 neurones de contrôle, n = 21 neurones TS, ***P < 0,0001).Les astérisques rouges indiquent les épines dendritiques putatives. e. Cellules épithéliales embryonnaires spontanées (EPSC) dans les neurones t-hCO témoins et TS après 8 mois de différenciation. f. Diagramme de fréquence cumulée et quantification de la fréquence et de l'amplitude des événements synaptiques (n = 32 neurones témoins, n = 26 neurones TS ; **P = 0,0076 et P = 0,8102). g. Analyse de Scholl des neurones TS et témoins dans hCO et t-hCO. Les lignes pointillées représentent les neurones pyramidaux postnataux humains L2/3 à titre de comparaison (n = 24 neurones t-hCO témoins, n = 21 neurones t-hCO TS, n = 8 neurones hCO témoins et n = 7 neurones hCO TS). Les données sont exprimées sous forme de moyenne ± écart type.
La capacité du t-hCO à reproduire à un niveau élevé les caractéristiques morphologiques et fonctionnelles des neurones du cortex humain nous a incités à explorer si le t-hCO pouvait être utilisé pour détecter les phénotypes de la maladie. Nous nous sommes concentrés sur le syndrome de Turner, un trouble neurodéveloppemental grave causé par des mutations gain de fonction dans le gène codant pour CaV1.2, qui initie la transcription génique dépendante de l'activité dans les neurones. Nous avons obtenu du hCO chez trois patients atteints de syndrome de Turner porteurs de la substitution la plus courante (p.G406R) et trois témoins (Fig. 3a). Après transplantation, nous avons constaté une morphologie dendritique altérée dans les neurones atteints de syndrome de Turner par rapport aux témoins (Fig. 3b et données étendues, Fig. 8a,b), avec un doublement du nombre de dendrites primaires et une augmentation globale de la longueur moyenne et une diminution globale de la longueur dendritique (Fig. 3c et données étendues, Fig. 8c). Français Ceci était associé à une densité accrue d'épines et à une fréquence accrue d'EPSC spontanées dans les TS par rapport aux neurones témoins (Fig. 3d–f et données étendues, Fig. 8g). Une analyse plus approfondie a révélé des schémas de ramification dendritique anormale dans les TS t-hCO par rapport aux témoins, mais pas dans les TS hCO in vitro à un stade de différenciation similaire (Fig. 3g). Ceci est cohérent avec nos rapports précédents sur le rétrécissement dendritique dépendant de l'activité dans les TS et souligne la capacité de cette plateforme de transplantation à détecter les phénotypes de la maladie in vivo.
Français Nous avons ensuite cherché à savoir dans quelle mesure les cellules t-hCO sont fonctionnellement intégrées dans le S1 du rat. Le S1 chez les rongeurs reçoit de fortes entrées synaptiques des noyaux basaux ventraux et thalamiques postérieurs ipsilatéraux, ainsi que des cortex moteurs et somatosensoriels secondaires ipsilatéraux et du S1 controlatéral (Fig. 4a). Pour restaurer le schéma d'innervation, nous avons infecté le hCO avec le virus de la rage-dG-GFP/AAV-G et transplanté le hCO chez le rat S1 3 jours plus tard. Nous avons observé une expression dense de GFP dans les neurones du S1 ipsilatéral et des noyaux gris centraux ventraux 7 à 14 jours après la transplantation (Fig. 4b, c). De plus, la coloration par anticorps du marqueur thalamique nétrine G1 a révélé la présence de terminaisons thalamiques dans le t-hCO (Fig. 4d, e). Pour évaluer si ces projections afférentes pouvaient induire des réponses synaptiques dans les cellules t-hCO, nous avons réalisé des enregistrements de cellules entières à partir de cellules humaines dans des sections nettes de la couche thalamocorticale. La stimulation électrique de S1, de la capsule interne, de la substance blanche et des fibres proches de t-hCO chez le rat, ou l'activation optogénétique des terminaisons thalamiques exprimant l'opsine dans t-hCO, a induit des EPSC à courte latence dans les neurones t-hCO exposés à l'antagoniste du récepteur AMPA NBQX. (Fig. 4f, g et données étendues, Fig. 9a–g). Ces données démontrent que t-hCO est anatomiquement intégré dans le cerveau du rat et peut être activé par les tissus de l'hôte.
a, Schéma d'une expérience de suivi de la rage. b, Expression de la GFP et de STEM121 spécifique à l'homme entre le t-hCO et le cortex cérébral du rat (panneau supérieur). L'expression de la GFP est également représentée dans le noyau basal ventral (VB) ipsilatéral du rat (en bas à gauche) et le S1 ipsilatéral (en bas à droite). Barre d'échelle, 50 µm. Les carrés rouges représentent les zones du cerveau où les images ont été prises. c, Quantification des cellules exprimant la GFP (n = 4 rats). d, e — Terminaux thalamiques de la nétrine G1+ dans le t-hCO. d montre une coupe coronale contenant les noyaux t-hCO et VB. Barre d'échelle, 2 mm. e montre l'expression de la nétrine G1 et de STEM121 dans les neurones t-hCO (à gauche) et VB (à droite). Barre d'échelle, 50 µm. La ligne pointillée orange indique la limite du t-hCO. f, g, Traces actuelles des neurones t-hCO après stimulation électrique chez le rat S1 (f) ou la capsule interne (g), avec (violet) ou sans (noir) NBQX (gauche). Amplitudes EPSC avec et sans NBQX (n = 6 neurones S1, *P = 0,0119 ; et n = 6 neurones de la capsule interne, **P = 0,0022) (centre). Pourcentage de neurones t-hCO présentant des EPSC en réponse à une stimulation électrique du rat S1 (f) ou de la capsule interne (g) (droite). LCRa, liquide céphalorachidien artificiel. h, schéma de l'expérience d'imagerie 2P (gauche). Expression des GCaMP6 dans le t-hCO (milieu). Barre d'échelle, 100 µm. Laps de temps de fluorescence des GCaMP6 (droite). i, Z-score de la fluorescence d'activité spontanée. j, illustration schématique de la stimulation de la moustache. k, trajectoires de fluorescence 2P avec score z dans un essai, alignées avec la déviation des moustaches au temps zéro (ligne pointillée) dans les cellules de l'exemple. l, réponses du score z moyen de la population de toutes les cellules alignées avec la déviation des moustaches au temps zéro (ligne pointillée) (rouge) ou horodatages générés aléatoirement (gris). m. Schéma de l'expérience sur le marquage optique. n, Courbes de tension brutes d'un exemple de cellule t-hCO pendant une stimulation laser bleu ou une déviation des moustaches. Les flèches rouges indiquent les premiers pics causés par la lumière (en haut) ou causés par la déviation des moustaches (en bas). L'ombrage gris indique les périodes de déviation des moustaches. o, Formes d'onde lumineuses maximales et réponses de déviation des moustaches. p, pics d'une seule tentative, alignés avec la déviation des moustaches dans les cellules de l'exemple. 0 indique une déviation des moustaches (ligne pointillée). q : Taux de déclenchement du score z moyen de la population pour toutes les cellules photosensibles, aligné sur la déviation des moustaches à l'instant zéro (ligne pointillée) (rouge) ou sur des horodatages générés aléatoirement (gris). r : Proportion d'unités photosensibles significativement modulées par la déviation des moustaches (n = 3 rats) (à gauche). Latence maximale du score z (n = 3 rats ; n = 5 (vert clair), n = 4 (vert foncé) et n = 4 (cyan) unités de modulation de la déviation des moustaches par rat) (à droite). Les données sont exprimées en moyenne ± écart type.
Nous avons ensuite cherché à savoir si la t-hCO pouvait être activée par des stimuli sensoriels in vivo. Nous avons transplanté de l'hCO exprimant les indicateurs calciques génétiquement codés GCaMP6 chez des rats S1. Après 150 jours, nous avons réalisé une photométrie par fibre optique ou une imagerie calcique à deux photons (Fig. 4h et données étendues, Fig. 10a). Nous avons constaté que les cellules t-hCO présentaient une activité rythmique synchronisée (Figure 4i, Données étendues, Figure 10b et Vidéo supplémentaire 1). Pour caractériser le pic d'activité de la t-hCO, nous avons réalisé des enregistrements électrophysiologiques extracellulaires chez des rats transplantés anesthésiés (données étendues, Fig. 10c-f). Nous avons généré des coordonnées stéréotaxiques à partir d'images IRM ; ainsi, ces unités enregistrées représentent des neurones humains putatifs, bien que l'électrophysiologie seule ne permette pas de déterminer l'espèce d'origine. Nous avons observé des pics d'activité synchronisés (données étendues, Fig. 10d). Français Les salves ont duré environ 460 ms et ont été séparées par des périodes de silence d'environ 2 s (données développées, Fig. 10d, e). Les unités individuelles ont tiré en moyenne environ trois coups par salves, ce qui représente environ 73 % des unités enregistrées par salves. Les activités des unités individuelles étaient fortement corrélées, et ces corrélations étaient supérieures à celles des unités identifiées chez les animaux non vaccinés enregistrées dans les mêmes conditions (données développées, Fig. 10f). Pour caractériser davantage les réponses de pointe des neurones d'origine humaine identifiés, nous avons réalisé des expériences de marquage lumineux sur des rats anesthésiés transplantés avec du hCO exprimant le canal cationique photosensible rhodopsine 2 (hChR2), par lequel les neurones t-hCO raccourcissent la latence de reconnaissance (moins de 10 ms) en réponse à des stimuli de lumière bleue (Fig. 4m–o). Français Les neurones t-hCO ont montré des bouffées d'activité spontanée à des fréquences similaires à celles observées en imagerie calcique, ainsi que lors d'enregistrements électrophysiologiques réalisés dans le t-hCO en l'absence de marquage lumineux (données étendues, Fig. 10c-g). Aucune activité spontanée n'a été observée dans les stades correspondants de hCO enregistrés in vitro. Pour évaluer si le t-hCO pouvait être activé par des stimuli sensoriels, nous avons brièvement dévié les moustaches du rat loin du t-hCO (Fig. 4j, m et données étendues, Fig. 10h, k). Selon des études antérieures8,10, un sous-ensemble de cellules t-hCO a montré une activité accrue en réponse à la déviation des moustaches, ce qui n'a pas été observé lorsque les données ont été comparées à des horodatages aléatoires (Fig. 4k-q et données étendues, Fig. 10h-q). En effet, environ 54 % des unités individuelles opto-marquées ont montré une augmentation significative du taux d'éveil après stimulation des moustaches, atteignant un pic à environ 650 ms (Fig. 4r). Prises ensemble, ces données suggèrent que le t-hCO reçoit des entrées fonctionnelles appropriées et peut être activé par des stimuli environnementaux.
Nous avons ensuite étudié si le t-hCO pouvait activer des circuits chez le rat pour contrôler le comportement. Nous avons d'abord cherché à savoir si les axones des neurones t-hCO se projetaient dans les tissus environnants du rat. Nous avons infecté le hCO avec un lentivirus codant pour le hChR2 fusionné à l'EYFP (hChR2-EYFP). Après 110 jours, nous avons observé l'expression de l'EYFP dans les régions corticales homolatérales, notamment les cortex auditif, moteur et somatosensoriel, ainsi que dans les régions sous-corticales, notamment le striatum, l'hippocampe et le thalamus (Fig. 5a). Afin d'évaluer si ces projections efférentes pouvaient induire des réponses synaptiques dans les cellules de rat, nous avons activé optiquement des cellules t-hCO exprimant le hChR2-EYFP en enregistrant des cellules du cortex cérébral de rat dans des coupes cérébrales nettes. L'activation des axones t-hCO par la lumière bleue a induit des cellules souches embryonnaires de rat à courte latence (EPSC) dans les neurones du cortex pyramidal, lesquelles ont été bloquées par NBQX (Fig. 5b–g). De plus, ces réponses pourraient être bloquées par la tétrodotoxine (TTX) et restaurées par la 4-aminopyridine (4-AP), suggérant qu'elles étaient causées par des connexions monosynaptiques (Fig. 5e).
a, Schéma du suivi des axones (à gauche). Expression de t-hCO EYFP (à droite). Barre d'échelle, 100 µm. A1, cortex auditif, ACC, cortex cingulaire antérieur, d. striatum, striatum dorsal, HPC, hippocampe ; diaphragme, septum latéral, mPFC, cortex préfrontal médian, piri, cortex piriforme, v. striatum, striatum ventral, VPM, noyau ventropostomédial du thalamus, VTA, région tegmentale ventrale. Les carrés rouges représentent les zones du cerveau où les images ont été prises. b, Schéma de l'expérience de stimulation. c, d, Exemples de réponse du photocourant induit par la lumière bleue (en haut) et du voltage (en bas) dans les cellules t-hCO humaines (c) EYFP+ ou les cellules EYFP- de rat (d). e, f, Traces actuelles des neurones de rat après stimulation par la lumière bleue des axones t-hCO avec TTX et 4-AR (vert), TTX (gris) ou aCSF (noir) (e), avec (violet) ou sans (noir) ) ) NBQX (e). g, latence des réponses induites par la lumière bleue dans les cellules de rat (n = 16 cellules) ; les barres horizontales indiquent la latence moyenne (7,13 ms) (à gauche). Amplitude des EPSC évoqués par la lumière enregistrés avec ou sans NBQX (n = 7 cellules ; ***P < 0,0001) (milieu). Amplitude des EPSC évoqués par la lumière enregistrés avec ou sans NBQX (n = 7 cellules ; ***P < 0,0001) (milieu). Une grande partie de votre EPSC est enregistrée avec ou sans NBQX (n = 7 clés ; ***P <0,0001) (au centre). Amplitude des EPSC induites par la lumière enregistrées avec ou sans NBQX (n = 7 cellules ; ***P < 0,0001) (centre).La valeur NBQX correspond à celle d'EPSC (n = 7 个细胞；***P < 0,0001) (中)。La valeur NBQX correspond à celle d'EPSC (n = 7 个细胞；***P < 0,0001) (中)。 Une grande partie de votre EPSC est enregistrée avec ou sans NBQX (n = 7 clés ; ***P <0,0001) (au centre). Amplitude des EPSC induites par la lumière enregistrées avec ou sans NBQX (n = 7 cellules ; ***P < 0,0001) (centre).Pourcentage de cellules de rat présentant des EPSC qui répondent à la lumière bleue (à droite). h, Schéma d'une tâche comportementale. d0, jour 0. i. Performance d'animaux exemplaires le jour 1 (à gauche) ou le jour 15 (à droite) de la formation. Nombre moyen de coups de langue effectués le jour 1 (à gauche) ou le jour 15 (au centre à droite) (n = 150 essais de lumière bleue, n = 150 essais de lumière rouge ; ***P < 0,0001). Nombre moyen de coups de langue effectués le jour 1 (à gauche) ou le jour 15 (au centre à droite) (n = 150 essais de lumière bleue, n = 150 essais de lumière rouge ; ***P < 0,0001). Un total de 150 employés ont été achetés le 1er jour ou le 15e jour (au centre de la ville) (n = 150 achats avec votre argent, n = 150 achats c красным светом; ***P <0,0001). Nombre moyen de coups de langue effectués le jour 1 (à gauche) ou le jour 15 (au centre à droite) (n = 150 essais de lumière bleue, n = 150 essais de lumière rouge ; ***P < 0,0001).第1 天（左）或第15 天（右中）执行的平均舔次数（n = 150 次蓝光试验，n = 150次红光试验；***P < 0,0001）。第1 天（左）或第15 天（右中）执行的平均舔次数（n = 150 次蓝光试验，n = 150次红光试验；***P < 0,001 Un total de 150 employés ont été achetés le 1er jour ou le 15e jour (au centre de la ville) (n = 150 achats avec votre argent, n = 150 achats c красным светом; ***P <0,0001). Nombre moyen de coups de langue effectués le jour 1 (à gauche) ou le jour 15 (au centre à droite) (n = 150 essais de lumière bleue, n = 150 essais de lumière rouge ; ***P < 0,0001).Léchages cumulés pour les essais de lumière rouge et bleue au jour 1 (centre gauche) ou au jour 15 (droite). NS, non significatif. j,k, Caractéristiques comportementales de tous les animaux transplantés avec t-hCO exprimant hChR2-EYFP (j) ou fluorophore témoin (k) au jour 1 ou 15 (hChR2-EYFP : n = 9 rats, ** P = 0,0049 ; témoin : n = 9, P = 0,1497). l, Évolution du score de préférence (n = 9 hChR2, n = 9 contrôle ; **P < 0,001, ***P < 0,0001). l, Évolution du score de préférence (n = 9 hChR2, n = 9 contrôle ; **P < 0,001, ***P < 0,0001). l, Эволюция показателя предпочтения (n = 9 hChR2, n = 9 контрольных; **P <0,001, ***P <0,0001). l, Évolution du score de préférence (n = 9 hChR2, n = 9 témoins ; **P < 0,001, ***P < 0,0001). l，好评分的演变（n = 9 hChR2，n = 9 对照；**P < 0,001，***P < 0,0001）。 l，好评分的演变（n = 9 hChR2，n = 9 对照；**P < 0,001，***P < 0,0001）。 l, Эволюция показателей предпочтения (n = 9 hChR2, n = 9 контролей; **P <0,001, ***P <0,0001). l, Évolution des scores de préférence (n = 9 hChR2, n = 9 témoins ; **P < 0,001, ***P < 0,0001).m, expression de FOS en réponse à l'activation optogénétique de t-hCO dans S1. Des images de l'expression de FOS (à gauche) et de la quantification (n = 3 par groupe ; *P < 0,05, **P < 0,01 et ***P < 0,001) (à droite) sont présentées. Des images de l'expression de FOS (à gauche) et de la quantification (n = 3 par groupe ; *P < 0,05, **P < 0,01 et ***P < 0,001) (à droite) sont présentées. Показаны изображения экспрессии FOS (слева) и количественного определения (n = 3 на группу; * P <0,05, ** P <0,01 и *** P <0,001) (справа). Des images de l'expression de FOS (à gauche) et de la quantification (n = 3 par groupe ; *P<0,05, **P<0,01 et ***P<0,001) sont présentées (à droite).La valeur FOS est inférieure à 0,05 et **P < 0,01 à ***P < 0,001（右）.La valeur FOS est inférieure à 0,05 et **P < 0,01 à ***P < 0,001（右）. Показаны изображения экспрессии FOS (слева) и количественного определения (n = 3 на группу; * P <0,05, ** P <0,01 и *** P <0,001) (справа). Des images de l'expression de FOS (à gauche) et de la quantification (n = 3 par groupe ; *P<0,05, **P<0,01 et ***P<0,001) sont présentées (à droite).Barre d'échelle, 100 µm. Les données sont exprimées en moyenne ± erreur standard de BLA, amygdale basolatérale, MDT, noyau thalamique dorsomédian, PAG, substance grise périaqueducale.
Enfin, nous avons cherché à savoir si le t-hCO pouvait moduler le comportement du rat. Pour tester cette hypothèse, nous avons transplanté du hCO exprimant hChR2-EYFP dans S1, puis, 90 jours plus tard, nous avons implanté des fibres optiques dans le t-hCO pour l'administration de lumière. Nous avons ensuite entraîné les rats avec un paradigme de conditionnement opérant modifié (Fig. 5h). Nous avons placé les animaux dans une chambre de test comportemental et appliqué aléatoirement des stimuli laser bleu (473 nm) et rouge (635 nm) pendant 5 secondes. Les animaux recevaient une récompense en eau s'ils léchaient pendant la stimulation par la lumière bleue, mais ne léchaient pas pendant la stimulation par la lumière rouge. Le premier jour d'entraînement, les animaux n'ont montré aucune différence de léchage selon qu'ils étaient stimulés par la lumière bleue ou rouge. Cependant, au jour 15, les animaux transplantés avec du hCO exprimant hChR2-EYFP ont montré un léchage plus actif lorsqu'ils étaient stimulés par la lumière bleue que par la lumière rouge. Français Ces changements dans le comportement de léchage n'ont pas été observés chez les animaux témoins transplantés avec hCO exprimant le fluorophore témoin (taux de réussite d'apprentissage : hChR2 89 %, EYFP 0 %, Figure 5i-1 et vidéo supplémentaire 2). Ces données suggèrent que les cellules t-hCO peuvent activer les neurones du rat pour stimuler le comportement de recherche de récompense. Pour découvrir quels circuits neuronaux t-hCO du rat pourraient être impliqués dans ces changements comportementaux, nous avons activé optogénétiquement le t-hCO chez des animaux entraînés et prélevé des tissus 90 minutes plus tard. L'immunohistochimie a révélé l'expression de la protéine FOS dépendante de l'activité dans plusieurs régions du cerveau impliquées dans le comportement motivé, y compris le cortex préfrontal médian, le thalamus médian et la matière grise périaqueducale, qui était exprimée soit chez les animaux témoins non stimulés, soit chez les animaux. riz. 5m). Prises ensemble, ces données suggèrent que le t-hCO peut moduler l'activité neuronale du rat pour stimuler le comportement.
Les organoïdes neuronaux représentent un système prometteur pour l'étude du développement et des maladies humaines in vitro, mais ils sont limités par le manque de connexions entre les circuits existants in vivo. Nous avons développé une nouvelle plateforme dans laquelle nous avons transplanté du hCO dans S1 de rats postnatals immunodéprimés afin d'étudier le développement et la fonction des cellules humaines in vivo. Nous avons montré que le t-hCO développe des types de cellules matures non observés in vitro28 et que le t-hCO est anatomiquement et fonctionnellement intégré dans le cerveau des rongeurs. L'intégration du t-hCO dans les circuits neuronaux des rongeurs nous a permis d'établir un lien entre l'activité cellulaire humaine et le comportement animal étudié, montrant que les neurones t-hCO peuvent moduler l'activité neuronale du rat pour piloter les réponses comportementales.
La plateforme que nous décrivons présente plusieurs avantages par rapport aux recherches antérieures sur la transplantation de cellules humaines dans le cerveau de rongeurs. Premièrement, nous avons transplanté du hCO dans le cortex en développement de rats en début de vie, ce qui pourrait faciliter l'intégration anatomique et fonctionnelle. Deuxièmement, le suivi par IRM t-hCO nous a permis d'étudier la position et la croissance du greffon chez des animaux vivants, ce qui nous a permis de mener des études multi-animaux à long terme et d'établir la fiabilité de plusieurs lignées cellulaires hiPS. Enfin, nous avons transplanté des organoïdes intacts, plutôt que des suspensions de cellules individuelles isolées, qui sont moins destructrices pour les cellules humaines et peuvent favoriser l'intégration et la génération de neurones du cortex humain dans le cerveau de rat.
Français Nous reconnaissons que malgré les progrès de cette plateforme, les contraintes temporelles, spatiales et inter-espèces empêchent la formation de circuits neuronaux humains avec une grande fidélité, même après une transplantation à un stade précoce de développement. Par exemple, il n'est pas clair si l'activité spontanée observée dans le t-hCO représente un phénotype développemental similaire à l'activité rythmique observée pendant le développement cortical, ou si elle est due à l'absence de types cellulaires suppressifs présents dans le t-hCO. De même, on ne sait pas dans quelle mesure l'absence de lamination dans le t-hCO affecte la connectivité de la chaîne30. Les travaux futurs se concentreront sur l'intégration d'autres types de cellules tels que la microglie humaine, les cellules endothéliales humaines et diverses proportions d'interneurones GABAergiques comme démontré par l'assemblage 6 in vitro, ainsi que sur la compréhension de la façon dont l'intégration et le traitement neuronaux peuvent se produire dans le t-hCO altéré. niveaux transcriptionnels, synaptiques et comportementaux dans les cellules obtenues chez les patients.
Globalement, cette plateforme in vivo représente une ressource puissante, susceptible de compléter la recherche in vitro sur le développement du cerveau humain et les maladies. Nous espérons qu'elle nous permettra de découvrir de nouveaux phénotypes au niveau des brins dans des cellules issues de patients, jusqu'alors difficiles à identifier, et de tester de nouvelles stratégies thérapeutiques.
Nous avons généré du hCO2,5 à partir de cellules HiPS comme décrit précédemment. Pour initier la production de hCO à partir de cellules hiPS cultivées sur des couches nourricières, des colonies intactes de cellules hiPS ont été prélevées des boîtes de culture à l'aide de dispase (0,35 mg/mL) et transférées dans des cultures en plastique à très faible adhérence contenant des boîtes contenant du milieu de culture cellulaire hiPS (Corning) supplémenté par deux inhibiteurs de SMAD, la dorsomorphine (5 μM ; P5499, Sigma-Aldrich) et le SB-431542 (10 μM ; 1614, Tocris) et l'inhibiteur de ROCK Y-27632 (10 μM ; S1049, Selleckchem). Pendant les 5 premiers jours, le milieu cellulaire hiPS a été changé quotidiennement et de la dorsomorphine et du SB-431542 ont été ajoutés. Français Le sixième jour en suspension, les sphéroïdes neuronaux ont été transférés dans un milieu neuronal contenant du neurobasal-A (10888, Life Technologies), un supplément B-27 sans vitamine A (12587, Life Technologies), du GlutaMax (1:100, Life Technologies), de la pénicilline et de la streptomycine (1:100, Life Technologies) et supplémenté avec le facteur de croissance épidermique (EGF ; 20 ng ml−1 ; R&D Systems) et le facteur de croissance des fibroblastes 2 (FGF2 ; 20 ng ml−1 ; R&D Systems) jusqu'au jour 24. Du jour 25 au jour 42, le milieu a été supplémenté avec du facteur neurotrophique dérivé du cerveau (BDNF ; 20 ng ml−1, Peprotech) et de la neurotrophine 3 (NT3 ; 20 ng ml−1 ; Peprotech) avec des changements de milieu tous les deux jours. Français Le sixième jour en suspension, les sphéroïdes neuronaux ont été transférés dans un milieu neuronal contenant du neurobasal-A (10888, Life Technologies), un supplément B-27 sans vitamine A (12587, Life Technologies), du GlutaMax (1:100, Life Technologies), de la pénicilline et de la streptomycine (1:100, Life Technologies) et supplémenté avec le facteur de croissance épidermique (EGF ; 20 ng ml−1 ; R&D Systems) et le facteur de croissance des fibroblastes 2 (FGF2 ; 20 ng ml−1 ; R&D Systems) jusqu'au jour 24. Du jour 25 au jour 42, le milieu a été supplémenté avec du facteur neurotrophique dérivé du cerveau (BDNF ; 20 ng ml−1, Peprotech) et de la neurotrophine 3 (NT3 ; 20 ng ml−1 ; Peprotech) avec des changements de milieu tous les deux jours.Au sixième jour de suspension, les sphéroïdes neuronaux ont été transférés dans un milieu neuronal contenant du Neurobasal-A (10888, Life Technologies), un supplément B-27 sans vitamine A (12587, Life Technologies), du GlutaMax (1:100, Life Technologies), de la pénicilline.et la streptomycine (1:100, Life Technologies) et le facteur épidermique double (EGF; 20 ng/ml; R&D Systems) et le facteur fibroblastique 2 (FGF2; 20 нг/мл; R&D Systems) pour 24-го дня. et de la streptomycine (1:100, Life Technologies) et complétée par le facteur de croissance épidermique (EGF ; 20 ng/ml ; R&D Systems) et le facteur de croissance des fibroblastes 2 (FGF2 ; 20 ng/ml ; R&D Systems) jusqu'au jour 24.Du 25e au 42e jour, le facteur neurotrophique dérivé du cerveau (BDNF ; 20 ng ml-1, Peprotech) et la neurotrophine 3 (NT3 ; 20 ng ml-1, Peprotech) ont été ajoutés au milieu, en changeant le milieu tous les deux jours.在悬浮的第6 天, 不含维生素A 的B-27 补充剂（12587，Life Technologies）、GlutaMax（1:100，Life Technologies）、青霉素的神经培养基中和链霉素（1:100，Life Technologies）并辅以表皮生长因子（EGF；20 ng ml-1；R&D Systems）和成纤维细胞生长因子2（FGF2；20 ng ml-1；R&D Systems）直至第24 heures.不 含 维生素 a 的 b-27补充剂 （12587 ， Life Technologies） Glutamax （1: 100 ， Life TechNOGIS青霉素 的 神经 培养 基 中 链霉素 （（1: 100 ， Life Technologies） 表皮 生长 因子 （（（20 ng ml-1 ； r & d Systems） et 纤维 细胞 生长 2 （fgf2 ； 20 ng ml- 1；R&D Systems）直至第24天。 Pendant 6 jours, la suspension des neurones a été effectuée dans le cadre d'un projet, avec un supplément de В-27 sans vitamine А (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies), Péninsilline- streptomycine neutralisante (1:100, Life Technologies) avec une dose de facteur épidermique (EGF ; 20 ng ml-1 ; R&D Systems) et une dose de facteur фибробластов 2 (FGF2; 20 нг ml-1) 1; Le jour 6, les suspensions de neurosphères ont été remplacées par un supplément contenant du neurobasal-A (10888, Life Technologies), un supplément B-27 sans vitamine A (12587, Life Technologies), du GlutaMax (1:100, Life Technologies), de la streptomycine neutralisée à la pénicilline (1:100, Life Technologies) supplémentée en facteur de croissance épidermique (EGF ; 20 ng ml-1 ; R&D Systems) et en facteur de croissance des fibroblastes 2 (FGF2 ; 20 ng ml-1) 1 ; Systèmes R&D) pendant 24 heures. Systèmes R&D) jusqu'au jour 24.Du 25e au 42e jour, du facteur neurotrophique dérivé du cerveau (BDNF ; 20 ng ml-1, Peprotech) et du facteur neurotrophique 3 (NT3 ; 20 ng ml-1, Peprotech) ont été ajoutés au milieu de culture tous les deux jours. Le milieu a été changé une fois.Français À partir du jour 43, le hCO a été maintenu dans un milieu neurobasal-A non supplémenté (NM ; 1088022, Thermo Fisher) avec un changement de milieu tous les 4 à 6 jours. Pour obtenir du hCO à partir de cellules hiPS cultivées dans des conditions sans nourrisseur, les cellules hiPS ont été incubées avec de l'Accutase (AT-104, Innovate Cell Technologies) à 37 °C pendant 7 minutes, dissociées en cellules individuelles et étalées sur des plaques AggreWell 800 (34815, STEMCELL Technologies) à une densité de 3 × 106 cellules individuelles par puits dans un milieu Essential 8 supplémenté avec l'inhibiteur ROCK Y-27632 (10 μM ; S1049, Selleckchem). Après 24 heures, le milieu des puits a été pipeté de haut en bas dans un milieu contenant du milieu Essential 6 (A1516401, Life Technologies) supplémenté en dorsomorphine (2,5 μM ; P5499, Sigma-Aldrich) et SB-431542 (10 μM ; 1614, Tocrida). Du jour 2 au jour 6, le milieu Essential 6 a été remplacé quotidiennement par de la dorsomorphine et un supplément en SB-431542. À partir du sixième jour, les suspensions de neurosphères ont été transférées dans le milieu neurobasal et maintenues comme décrit ci-dessus.
Toutes les procédures animales ont été réalisées conformément aux directives de soins aux animaux approuvées par le Comité administratif de soins aux animaux de laboratoire de l'Université de Stanford (APLAC). Des rates euthymiques RNU (rnu/+) gestantes ont été achetées (Charles River Laboratories) ou hébergées. Les animaux ont été maintenus sous un cycle lumière-obscurité de 12 heures avec nourriture et eau à volonté. Les ratons nus (FOXN1–/–) âgés de trois à sept jours ont été identifiés par la croissance de leurs moustaches immatures avant leur abattage. Les chiots (mâles et femelles) ont été anesthésiés à l'isoflurane à 2-3 % et placés sur un cadre stéréotaxique. Une trépanation du crâne d'un diamètre d'environ 2-3 mm au-dessus de S1 a été réalisée tout en préservant l'intégrité de la dure-mère. Ensuite, une aiguille de 30 G (environ 0,3 mm) a été utilisée juste à l'extérieur de la craniotomie pour percer la dure-mère. Ensuite, du HCO a été appliqué sur un fin parafilm de 3 × 3 cm et l'excédent de milieu a été retiré. À l'aide d'une seringue Hamilton fixée à une aiguille de calibre 23 G à 45°, aspirez délicatement l'hCO2 par l'extrémité distale de l'aiguille. Installez ensuite la seringue sur le pousse-seringue relié à l'appareil stéréotaxique. Placez ensuite la pointe de l'aiguille sur un trou de ponction de 0,3 mm de large préalablement pratiqué dans la dure-mère (z = 0 mm) et rétrécissez la seringue de 1 à 2 mm (z = environ -1,5 mm) jusqu'à ce que l'aiguille se trouve entre la dure-mère A et forme une étanchéité parfaite. Relevez ensuite la seringue jusqu'au centre de la surface corticale à z = -0,5 mm et injectez l'hCO2 à un débit de 1 à 2 µl par minute. Une fois l'injection d'hCO2 terminée, l'aiguille est rétractée à un débit de 0,2 à 0,5 mm par minute, la peau est suturée et le chiot est immédiatement placé sur une compresse chauffante chaude jusqu'à sa guérison complète. Certains animaux ont bénéficié d'une transplantation bilatérale.
Toutes les procédures animales ont été réalisées conformément aux directives de soins aux animaux approuvées par l'APLAC de l'Université de Stanford. Les rats (plus de 60 jours après la transplantation) ont été induits avec une anesthésie à 5 % d'isoflurane et anesthésiés avec 1 à 3 % d'isoflurane pendant l'imagerie. Pour la visualisation, un scanner de forage horizontal à blindage actif de 7 Tesla Bruker (Bruker Corp.) avec un entraînement de gradient d'International Electric Company (IECO), un insert de gradient blindé d'un diamètre interne de 120 mm (600 mT/m, 1 000 T/m/s) a été utilisé avec AVANCE. III, des capacités RF multi-bobines et multi-cœurs à huit canaux, et la plateforme Paravision 6.0.1 associée. L'enregistrement a été réalisé à l'aide d'une bobine RF volumétrique à découplage actif d'un diamètre interne de 86 mm et d'une bobine RF cryo-refroidie à quatre canaux pour la réception uniquement. Turbo-RARE axial 2D (temps de répétition = 2500 ms, temps d'écho = 33 ms, 2 moyennes) avec 16 captures de coupes, épaisseur de coupe 0,6–0,8 mm, contenant 256 × 256 échantillons. Les signaux ont été reçus à l'aide d'une bobine RF volumétrique d'émetteur-récepteur en quadrature d'un diamètre interne de 2 cm (Rapid MR International, LLC). Enfin, utilisez les fonctions intégrées d'estimation de surface d'Imaris (BitPlane) pour le rendu 3D et l'analyse volumique. Une greffe réussie a été définie comme une greffe dans laquelle des zones de signal IRM continu pondéré en T2 se sont formées dans l'hémisphère transplanté. Un rejet de greffe a été défini comme une greffe qui n'a pas produit de zones de signal IRM continu pondéré en T2 dans l'hémisphère transplanté. La t-hCO sous-corticale a été exclue de l'analyse ultérieure.
Pour exprimer de manière stable les GCaMP6 dans l'hCO pour l'imagerie calcique à deux photons, les cellules hiPS ont été infectées par pLV[Exp]-EF1a::GcaMP6s-WPRE-Puro, puis des antibiotiques ont été sélectionnés. Brièvement, les cellules ont été dissociées par EDTA et suspendues dans 1 ml de milieu Essential 8 à une densité d'environ 300 000 cellules en présence de polybrène (5 μg/ml) et de 15 μl de virus. Les cellules ont ensuite été incubées en suspension pendant 60 minutes et ensemencées à une densité de 50 000 cellules par puits. Après confluence, les cellules ont été traitées avec 5 à 10 μg ml-1 de puromycine pendant 5 à 10 jours ou jusqu'à l'apparition de colonies stables. L'infection aiguë par l'hCO a été réalisée comme décrit précédemment5 avec quelques modifications. Brièvement, transférer l'hCO du jour 30 à 45 dans des tubes à microcentrifugation Eppendorf de 1,5 ml contenant 100 µl de milieu nerveux. Ensuite, environ 90 µl de milieu sont prélevés, 3 à 6 µl de lentivirus à titre élevé (de 0,5 x 108 à 1,2 x 109) sont ajoutés au tube, et le hCO est transféré à l'incubateur pendant 30 minutes. Ensuite, 90 à 100 µl de milieu sont ajoutés à chaque tube et les tubes sont remis à l'incubateur pendant la nuit. Le lendemain, le hCO est transféré dans du milieu nerveux frais dans des plaques à faible adhérence. Après 7 jours, le hCO a été transféré dans des plaques à fond de verre à 24 puits pour la visualisation et l'évaluation de la qualité de l'infection. pLV[Exp]-SYN1::EYFP-WPRE et pLV[Exp]-SYN1::hChR2-EYFP-WPRE ont été générés par VectorBuilder. Le lentivirus est utilisé dans la plupart des expériences car il est intégré au génome de l'hôte, ce qui permet l'expression du gène rapporteur dans les lignées cellulaires infectées. Pour le suivi de la rage, les jours 30 à 45, le hCO a été co-infecté avec rage-ΔG-eGFP et AAV-DJ-EF1a-CVS-G-WPRE-pGHpA (plasmide n° 67528, Addgene), lavé soigneusement pendant 3 jours, puis transplanté chez des rats en S1 et maintenu in vivo pendant 7 à 14 jours.
Français Pour l'immunocytochimie, les animaux ont été anesthésiés et perfusés par voie transcardiaque avec du PBS suivi de paraformaldéhyde à 4 % (PFA dans du PBS ; Electron Microscopy Sciences). Les cerveaux ont été fixés dans du PFA à 4 % pendant 2 heures ou toute la nuit à 4 °C, cryoconservés dans du saccharose à 30 % dans du PBS pendant 48 à 72 heures, et inclus dans de l'OCT à 30 % de saccharose 1:1 (Tissue-Tek OCT Compound 4583, Sakura Finetek) et des coupes coronales ont été réalisées à 30 µm à l'aide d'un cryostat (Leica). Pour l'immunohistochimie des coupes épaisses, les animaux ont été perfusés avec du PBS, et le cerveau a été disséqué et sectionné coronairement à 300-400 µm à l'aide d'un vibratome (Leica) et les coupes ont été fixées avec du PFA à 4 % pendant 30 minutes. Ensuite, les cryosections ou sections épaisses ont été lavées avec du PBS, bloquées pendant 1 heure à température ambiante (10 % de sérum d'âne normal (NDS) et 0,3 % de Triton X-100 dilué dans du PBS) et bloquées avec une solution de blocage à 4°C. – Incubation Les cryosections ont été incubées pendant la nuit et les sections épaisses ont été incubées pendant 5 jours. Les principaux anticorps utilisés étaient : anti-NeuN (souris, 1:500 ; ab104224, abcam) anti-CTIP2 (rat, 1:300 ; ab18465, abcam), anti-GFAP (lapin, 1:1 000 ; Z0334, Dako), anti-GFP (poulet, 1:1 000 ; GTX13970, GeneTex), anti-HNA (souris, 1:200 ; ab191181, abcam), anti-NeuN (lapin, 1:500 ; ABN78, Millipore), anti-PDGFRA (lapin, 1:200 ; sc-338, Santa Cruz), anti-PPP1R17 (lapin, 1:200 ; HPA047819, Atlas Antibodies), anti-RECA-1 (souris, 1:50 ; ab9774, abcam), anti-SCG2 (lapin, 1:100 ; 20357-1-AP, Proteintech), anti-SOX9 (chèvre, 1:500 ; AF3075, R&D Systems), Netrin G1a (chèvre, 1:100 ; AF1166, R&D Systems), anti-STEM121 (souris, 1:200 ; Y40410, Takara Bio), anti-SATB2 (souris, 1:50 ; ab51502, abcam), anti-GAD65/67 (lapin, 1:400 ; ABN904, Millipore) et anti-IBA1 (chèvre, 1:100 ; ab5076, abcam). Les principaux anticorps utilisés étaient : anti-NeuN (souris, 1:500 ; ab104224, abcam) anti-CTIP2 (rat, 1:300 ; ab18465, abcam), anti-GFAP (lapin, 1:1 000 ; Z0334, Dako), anti-GFP (poulet, 1:1 000 ; GTX13970, GeneTex), anti-HNA (souris, 1:200 ; ab191181, abcam), anti-NeuN (lapin, 1:500 ; ABN78, Millipore), anti-PDGFRA (lapin, 1:200 ; sc-338, Santa Cruz), anti-PPP1R17 (lapin, 1:200 ; HPA047819, Atlas Antibodies), anti-RECA-1 (souris, 1:50 ; ab9774, abcam), anti-SCG2 (lapin, 1:100 ; 20357-1-AP, Proteintech), anti-SOX9 (chèvre, 1:500 ; AF3075, R&D Systems), Netrin G1a (chèvre, 1:100 ; AF1166, R&D Systems), anti-STEM121 (souris, 1:200 ; Y40410, Takara Bio), anti-SATB2 (souris, 1:50 ; ab51502, abcam), anti-GAD65/67 (lapin, 1:400 ; ABN904, Millipore) et anti-IBA1 (chèvre, 1:100 ; ab5076, abcam). Utilisez les anti-poussière suivants : anti-NeuN (échelle, 1:500; ab104224, abcam), anti-CTIP2 (échelle, 1:300; ab18465, abcam), anti-GFAP (croix, 1:1000 ; Z0334, Dako), anti- -GFP (курица, 1:1000; GTX13970, GeneTex), anti-HNA (мышь, 1:200; ab191181, abcam), anti-NeuN (кролик, 1:500; ABN78, Millipore), anti-PDGFRA (кролик, 1:200; sc-338, Santa-Круз), anti-PPP1R17 (crolyque, 1:200 ; HPA047819, Atlas Antibodies), anti-RECA-1 (mышь, 1:50 ; ab9774, abcam), anti-SCG2 (crolyk, 1:100 ; 20357-1-AP, Proteintech), anti-SOX9 (coziй, 1 :500 ; AF3075, R&D Systems), нетрин G1a (coziй, 1 :100 ; AF1166, R&D Systems), anti-STEM121 (mышиный, 1:200 ; Y40410, Takara Bio), anti-SATB2 (mышь, 1:50 ; ab51502, abcam), anti-GAD65/67 (crolyque, 1:400 ; ABN904, Millipore) et anti-IBA1 (coza, 1 :100 ; ab5076, abcam). Les principaux anticorps utilisés étaient : anti-NeuN (souris, 1:500 ; ab104224, abcam), anti-CTIP2 (rat, 1:300 ; ab18465, abcam), anti-GFAP (lapin, 1:1000 ; Z0334, Dako), anti-GFP (poulet, 1:1000 ; GTX13970, GeneTex), anti-HNA (souris, 1:200 ; ab191181, abcam), anti-NeuN (lapin, 1:500 ; ABN78, Millipore), anti-PDGFRA (lapin, 1:200 ; sc-338, Santa Cruz), anti-PPP1R17 (lapin, 1:200 ; HPA047819, Atlas Antibodies), anti-RECA-1 (souris, 1:50 ; ab9774, abcam), anti-SCG2 (lapin, 1:100 ; 20357-1-AP, Proteintech), anti-SOX9 (chèvre, 1:500 ; AF3075, R&D Systems), nétrine G1a (chèvre, 1:100 ; AF1166, R&D Systems), anti-STEM121 (souris, 1:200 ; Y40410, Takara Bio), anti-SATB2 (souris, 1:50 ; ab51502, abcam), anti-GAD65/67 (lapin, 1:400 ; ABN904, Millipore) et anti-IBA1 (chèvre, 1:100 ; ab5076, abkam).Nom du produit : NeuN (小鼠), 1:500 ; ab104224, abcam) et CTIP2 (大鼠), 1:3 00；ab18465，abcam），抗GFAP（兔，1:1 000；Z0334，Dako），抗-GF P（鸡，1:1 000；GTX13970，GeneTex），抗HNA（小鼠，1:200；ab191181，abcam），抗NeuN（兔，1:500；ABN78，Millipore），抗PDGFRA（兔， 1:200；sc-338，Santa Cruz），抗PPP1R17（兔，1:200；HPA047819，Atlas , 1:100；20357-1-AP，Proteintech），抗SOX9（山羊，1:500；AF3075，Systèmes R&D），Netrin G1a (山羊, 1:100) AF1166, R&D Systems, et STEM121 (小鼠, 1:200) ;Nom du produit : NeuN (小鼠), 1: 500 ; ab104224, abcam) et CTIP2 (大鼠), 1 :300；ab18465，abcam），pour GFAP（兔，1:1 000；Z0334，Dako），pour -GFP（鸡，1:1 000；GTX13970，GeneTex），抗HNA（小鼠，1:200；ab191181，abcam），抗NeuN（兔，1:500；ABN78，Millipore％弔，抗1 : 200；sc-338，Santa Cruz），抗PPP1R17（兔，1:200；HPA047819，Atlas 抗体），抗RECA-1（小鼠，1:50；ab9774，abcam），抗SCG2 100；20357-1-AP，Proteintech），抗SOX9（山羊，1:500；AF3075，R&D Systems），Netrin G1a（山羊，1:100；AF1166，R&D Systèmes)頏1:20, ;Y40410, Takara Bio), anti-SATB2 (souris, 1:50 ; ab51502, abcam), anti-GAD65/67 (lapin, 1:400 ; ABN904, Millipore) et anti-IBA1 (chèvre, 1:100 ; ab5076, abcam)。Les principaux anticorps utilisés étaient : anti-NeuN (souris, 1:500 ; ab104224, abcam), anti-CTIP2 (rat, 1:300 ; ab18465, abcam), anti-GFAP (lapin, 1:1000 ; Z0334, Dako). , anti-GFP (poulet, 1:1000 ; GTX13970, GeneTex), anti-HNA (souris, 1:200 ; ab191181, abcam), anti-NeuN (lapin, 1:500 ; ABN78, Millipore), anti-PDGFRA (lapin, 1:200 ; sc-338, Santa Cruz), anti-PPP1R17 (lapin, 1:200 ; HPA047819, anticorps Atlas), anti-RECA-1 (souris, 1:50 ; ab9774, abcam), anti-SCG2 (lapin), 1:100 ;20357-1-AP, Proteintech), anti-SOX9 (comme, 1:500 ; AF3075, R&D Systems), Нетрин G1a (comme, 1:100 ; AF1166, R&D Systems), anti-STEM121 (dans, 1:200 ; Y40410, Takara Bio), anti-SATB2 (мышь, 1:50; ab51502, abcam), anti-GAD65/67 (crolyk, 1:400; ABN904, Millipore) et анти-IBA1 (коза, 1:100; аб5076, абкам). 20357-1-AP, Proteintech), anti-SOX9 (chèvre, 1:500; AF3075, R&D Systems), Netrin G1a (chèvre, 1:100; AF1166, R&D Systems), anti-STEM121 (souris, 1:200; Y40410, Takara Bio), anti-SATB2 (souris, 1:50; ab51502, abcam), anti-GAD65/67 (lapin, 1:400; ABN904, Millipore) et anti-IBA1 (chèvre, 1:100; ab5076, abkam).Français Les coupes ont ensuite été lavées avec du PBS et incubées avec un anticorps secondaire pendant 1 heure à température ambiante (coupes congelées) ou toute la nuit à 4 °C (coupes épaisses). L'anticorps secondaire Alexa Fluor (Life Technologies) dilué à 1:1000 dans une solution de blocage a été utilisé. Après lavage avec du PBS, les noyaux ont été visualisés avec un Hoechst 33258 (Life Technologies). Enfin, les lames ont été placées sur un microscope avec des lamelles (Fisher Scientific) à l'aide d'un Aquamount (Polysciences) et analysées sur un microscope à fluorescence Keyence (analyseur BZ-X) ou un microscope confocal Leica TCS SP8 (Las-X) sur l'image. Les images ont été traitées à l'aide du programme ImageJ (Fiji). Pour quantifier la proportion de neurones humains dans le t-hCO et le cortex du rat, des images rectangulaires de 387,5 μm de large ont été prises au centre du t-hCO, au bord ou près du bord du cortex du rat. Les marges du greffon ont été déterminées en évaluant les variations de transparence des tissus, les noyaux HNA+ et/ou la présence d'autofluorescence tissulaire. Sur chaque image, le nombre total de cellules NeuN+ et HNA+ a été divisé par le nombre total de cellules NeuN+ dans la même zone. Afin de garantir que seules les cellules avec noyau dans le plan image soient comptabilisées, seules les cellules également Hoechst+ ont été incluses dans le calcul. La moyenne de deux images séparées d'au moins 1 mm a été calculée afin de réduire l'erreur statistique.
Une semaine avant le prélèvement de l'échantillon, les animaux transplantés hCO (environ 8 mois de différenciation) ont été placés dans une chambre noire, les moustaches coupées afin de minimiser la stimulation sensorielle. L'isolement des noyaux a été réalisé comme décrit précédemment, avec quelques modifications. En bref, le t-hCO et le hCO ont été détruits par lyse cellulaire mécanique au détergent et dans un broyeur à tissu en verre de 2 ml (D8938, Sigma-Aldrich/KIMBLE). Les noyaux bruts ont ensuite été filtrés à l'aide d'un filtre de 40 µm et centrifugés à 320 g pendant 10 minutes à 4 °C avant d'effectuer un gradient de densité de saccharose. Après l'étape de centrifugation (320 g pendant 20 min à 4 °C), les échantillons ont été remis en suspension dans 0,04 % de BSA/PBS avec ajout de 0,2 unité d'inhibiteur de RNase µl-1 (40 u µl-1, AM2682, Ambion) et filtrés à travers un filtre à flux de 40 µm. Les noyaux dissociés ont ensuite été remis en suspension dans du PBS contenant 0,02 % de BSA et chargés sur une puce Chromium Single Cell 3' (récupération estimée à 8 000 cellules par voie). Les bibliothèques snRNA-seq ont été préparées avec le kit Chromium Single cell 3' GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics). Les bibliothèques snRNA-seq ont été préparées avec le kit Chromium Single cell 3' GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics). Les bibliothèques snRNA-seq sont utilisées avec Chromium Single cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics). Les bibliothèques snRNA-seq ont été préparées à l'aide de Chromium Single cell 3' GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics). snRNA-seq 文库是使用Chromium Single cell 3′ GEM、Bibliothèque et kit de perles de gel v3 (10x génomique) 制备的。 snRNA-seq 文库是使用Chromium Single cell 3′ GEM、Bibliothèque et kit de perles de gel v3 (10x génomique) 制备的。 La bibliothèque snRNA-seq utilise Chromium Single Cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics). La bibliothèque snRNA-seq a été préparée à l'aide du kit Chromium Single Cell 3' GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics).Les bibliothèques de différents échantillons ont été regroupées et séquencées par Admera Health sur NovaSeq S4 (Illumina).
Les niveaux d'expression génétique de chaque code-barres nucléaire présumé ont été quantifiés à l'aide du logiciel d'analyse 10x Genomics CellRanger (version 6.1.2). Plus précisément, les lectures ont été comparées à une combinaison de génomes de référence humains (GRCh38, Ensemble, version 98) et de rats (Rnor_6.0, Ensemble, version 100) créés avec la commande mkref et utilisant count avec la commande –include-introns=TRUE pour quantifier les lectures cartographiées dans les régions introniques. Pour les échantillons de t-hCO, les noyaux humains ont été identifiés sur la base de l'exigence prudente qu'au moins 95 % de toutes les lectures cartographiées correspondent au génome humain. Toutes les analyses ultérieures ont été effectuées sur un tableau de codes-barres filtré provenant du CellRanger à l'aide du package R (version 4.1.2) et de Seurat (version 4.1.1)32.
Afin de garantir que seuls les noyaux de haute qualité soient inclus dans l'analyse ultérieure, un processus de filtrage itératif a été mis en œuvre pour chaque échantillon. Dans un premier temps, les noyaux de faible qualité, contenant moins de 1 000 gènes uniques et plus de 20 % du total des mitochondries, sont identifiés et éliminés. Par la suite, la matrice brute du nombre de gènes a été normalisée par régression binomiale négative régularisée à l'aide de la fonction sctransform(vst.flavor=”v2″), qui a également identifié les 3 000 gènes les plus variables à l'aide de paramètres par défaut. La réduction dimensionnelle a été réalisée sur les gènes variables supérieurs à l'aide d'une analyse en composantes principales (ACP) avec des paramètres par défaut, en utilisant une dimension d'ensemble de données de 30 (la valeur dims = 30 a été choisie sur la base d'une inspection visuelle des sites du genou et utilisée pour tous les échantillons et les analyses d'ensemble). Nous avons ensuite effectué plusieurs cycles de clustering itératif (résolution = 1) pour classer les gènes en fonction d'un nombre anormalement bas de gènes (médiane inférieure au 10e percentile), d'un nombre anormalement élevé de gènes mitochondriaux (médiane supérieure au 95e percentile) afin d'identifier et de supprimer les cellules putatives de faible qualité. Des clusters et/ou une forte proportion de jumeaux suspects ont été identifiés à l'aide du package DoubletFinder33 (score DoubletFinder moyen supérieur au 95e percentile). Échantillons de t-hCO (n = 3) et d'hCO (n=3) ont été intégrés séparément à l'aide de la fonction IntegrateData avec les paramètres ci-dessus. Un autre filtrage qualitatif de l'ensemble de données intégrées a ensuite été effectué, comme décrit ci-dessus.
Après avoir supprimé les noyaux de faible qualité, l'ensemble de données intégré a été groupé (résolution = 0,5) et intégré à des fins de visualisation UMAP34. Les gènes marqueurs de chaque cluster ont été déterminés à l'aide de la fonction FindMarkers, les paramètres par défaut étant calculés à partir de données d'expression génique normalisées. Nous identifions et classons les principales classes cellulaires en combinant des ensembles de données de référence corticales fœtales et adultes avec l'expression des gènes marqueurs 19, 20, 21, 35 et l'annotation. En particulier, les précurseurs circulants ont été identifiés par l'expression de MKI67 et TOP2A. Les clusters de progéniteurs ont été définis par l'absence de transcrits mitotiques, un chevauchement élevé avec les clusters de progéniteurs gliaux multipotents décrits dans le cortex fœtal en métaphase tardive, et l'expression d'EGFR et d'OLIG1. Nous utilisons le terme astrocyte pour englober plusieurs stades de différenciation des astrocytes, de la glie radiale tardive à la maturation des astrocytes. Les amas d'astrocytes expriment des niveaux élevés de SLC1A3 et d'AQP4 et se sont avérés correspondre à des sous-types de glie radiale fœtale et/ou d'astrocytes adultes. Les OPC expriment PDGFRA et SOX10, tandis que les oligodendrocytes expriment des marqueurs de myélinisation (MOG et MYRF). Les neurones glutamatergiques ont été identifiés par la présence de transcrits neuronaux (SYT1 et SNAP25), l'absence de marqueurs GABAergiques (GAD2) et l'expression de NEUROD6, SLC17A7, BCL11B ou SATB2. Les neurones GluN ont été subdivisés en sous-classes supérieures (expression de SATB2 et perte de BCL11B) et profondes (expression de BCL11B). Les neurones putatifs de la sous-plaque (SP) expriment des marqueurs SP18 connus tels que ST18 et SORCS1, en plus des marqueurs GluN profonds. Les cellules de type plexus choroïde ont été identifiées par l'expression de TTR, et les cellules de type méningé ont exprimé les gènes associés aux fibroblastes et les cellules piales/vasculaires cartographiées de l'ensemble de données de référence.
Français L'analyse différentielle de l'expression génique entre les sous-classes t-hCO et hCO a été réalisée à l'aide d'une méthode de pseudo-lot nouvellement développée, reproduite dans des échantillons implémentés à l'aide du package Libra R (version 1.0.0). Plus précisément, des tests de vraisemblance logarithmique edgeR (version 3.36.0, package R) ont été effectués pour les groupes en additionnant le nombre de gènes dans les cellules pour une classe cellulaire donnée pour chaque réplication d'échantillon. Pour la visualisation de la carte thermique, les valeurs normalisées par million (CPM) sont calculées à l'aide d'edgeR (fonction cpm()) et mises à l'échelle (pour obtenir une moyenne = 0, écart type = 1). Une analyse d'enrichissement de l'ontologie génétique (GO) des gènes t-hCO GluN significativement régulés à la hausse a été réalisée (valeur P corrigée de Benjamini-Hochberg inférieure à 0,05 exprimée dans au moins 10 % des cellules t-hCO GluN et une augmentation du changement d'au moins 2 fois). réalisé à l'aide de ToppGene Suite (https://toppgene.cchmc.org/)37. Nous utilisons l'application ToppFun avec les paramètres par défaut et rapportons les valeurs P corrigées par Benjamini-Hochberg calculées à partir de tests hypergéométriques annotés GO.
Pour apparier nos clusters snRNA-seq avec les clusters cellulaires annotés issus d'études de référence d'ARN-seq primaire unicellulaire ou d'ARN-seq adulte19,20,21,22, nous avons appliqué une approche d'intégration d'ensembles de données appariés. Nous avons utilisé le workflow de normalisation SCTransform (v2) de Seurat pour intégrer et comparer les chevauchements de clusters entre les ensembles de données (en utilisant les mêmes paramètres que ci-dessus). Chaque ensemble de données a été sous-divisé aléatoirement jusqu'à 500 cellules ou noyaux par cluster d'origine pour une efficacité de calcul accrue. En utilisant une approche similaire à celle décrite précédemment, le chevauchement de cluster a été défini comme la proportion de cellules ou de noyaux dans chaque cluster groupé chevauchant l'étiquette du cluster de référence. Pour classer plus précisément les GluN, nous avons utilisé le workflow TransferData de Seurat pour les données de sous-ensembles de GluN afin d'attribuer des étiquettes d'ensemble de données de référence à nos cellules GluN.
Français Pour évaluer l'état de maturation du transcriptome global des échantillons de t-hCO et de hCO, nous avons comparé nos échantillons pseudo-bulk avec BrainSpan/psychENCODE23, qui consiste en une grande séquence d'ARN couvrant le développement du cerveau humain. Nous avons effectué une ACP sur une matrice d'expression génique normalisée par motif combinée provenant d'échantillons corticaux 10 semaines après la conception et plus tard, dans 5567 gènes (avec nos données) qui avaient été précédemment identifiés comme actifs dans les échantillons corticaux BrainSpan (définis comme plus de 50 % de la variance développementale expliquée par l'âge à l'aide d'un modèle cubique)38. De plus, nous avons dérivé les gènes associés aux principales signatures transcriptomiques du neurodéveloppement en utilisant la factorisation matricielle non négative comme décrit précédemment. Les poids d'échantillon calculés à l'aide de la procédure de factorisation matricielle non négative sont représentés sur les figures 5b avec des données étendues pour chacune des cinq signatures décrites par Zhu et al.38. Là encore, les marqueurs transcriptionnels dépendants de l'activité ont été dérivés d'études publiées précédemment. Français En particulier, ERG et LRG ont été significativement régulés à la hausse dans les neurones glutamatergiques identifiés par la collection snRNA-seq du cortex visuel de souris après stimulation visuelle du tableau supplémentaire 3 Hrvatin et al.16. Les LRG enrichis en humains ont été obtenus à partir de cultures de cerveau fœtal humain activées par KCl et récoltés 6 heures après la stimulation, et les gènes filtrés ont été significativement régulés à la hausse chez les humains mais pas chez les rongeurs (tableau supplémentaire 4). L'analyse de l'enrichissement des ensembles de gènes à l'aide de ces ensembles de gènes a été réalisée à l'aide d'un test exact de Fisher à un facteur.
Anesthésier les rats avec de l'isoflurane, prélever les cerveaux et les placer dans une solution de saccharose oxygénée froide (environ 4 °C) (95 % O2 et 5 % CO2) pour les sections contenant : 234 mM de saccharose, 11 mM de glucose, 26 mM de NaHCO3, 2,5 mM de KCl, 1,25 mM de NaH2PO4, 10 mM de MgSO4 et 0,5 mM de CaCl2 (environ 310 mOsm). Des sections coronales de cerveau de rat (300–400 µm) contenant du t-hCO ont été réalisées à l'aide d'un vibratome Leica VT1200 comme décrit précédemment39. Français Les sections ont ensuite été transférées dans une chambre de coupe avec oxygénation continue à température ambiante contenant de l'aCSF préparé à partir de : 10 mM de glucose, 26 mM de NaHCO3, 2,5 mM de KCl, 1,25 mM de NaHPO4, 1 mM de MgSO4, 2 mM de CaCl2 et 126 mM de NaCl (298 mOsm). au moins 45 minutes avant l'enregistrement. Les sections ont été enregistrées dans une chambre immergée où elles ont été continuellement perfusées avec de l'aCSF (flacon à 95 % d'O2 et 5 % de CO2). Toutes les données ont été enregistrées à température ambiante. Les neurones t-hCO ont été terminés avec une pipette en verre borosilicaté remplie d'une solution contenant 127 mM de gluconate de potassium, 8 mM de NaCl, 4 mM d'ATP de magnésium, 0,3 mM de GTP de sodium, 10 mM d'HEPES et 0,6 mM d'EGTA, pH 7,2, solution interne ajustée avec KOH (290 mOsm). Afin de récupérer, de la biocytine (0,2%) a été ajoutée à la solution d'enregistrement.
Les données ont été acquises à l'aide d'un amplificateur MultiClamp 700B (Molecular Devices) et d'un numériseur Digidata 1550B (Molecular Devices), filtrées passe-bas à 2 kHz, numérisées à 20 kHz et analysées à l'aide de Clampfit (Molecular Devices), Origin (OriginPro). 2021b, OriginLab). et des fonctions MATLAB personnalisées (Mathworks). Le potentiel de jonction a été calculé à l'aide de JPCalc et les entrées ont été ajustées à la valeur calculée de -14 mV. L'opération IV consiste en une série d'échelons de courant par paliers de 10 à 25 pA, de -250 à 750 pA.
Le thalamus, la substance blanche et les afférences S1 ont été stimulés électriquement sur des coupes thalamocorticales lors d'un enregistrement en patch-clamp de neurones hCO, comme décrit précédemment. En bref, le cerveau a été placé sur une table d'impression 3D inclinée à 10°, et la partie antérieure du cerveau a été coupée à 35°. Le cerveau a ensuite été collé à la surface coupée et sectionné, préservant les axones thalamocorticaux saillants. Des électrodes bipolaires en tungstène (0,5 MΩ) ont été montées sur un second micromanipulateur et positionnées stratégiquement pour stimuler quatre régions par cellule (capsule interne, substance blanche, S1 et hCO). Les réponses synaptiques ont été enregistrées après une stimulation phasique de 300 µA à 0,03–0,1 Hz.
Des neurones hCO exprimant hChR2 ont été activés à 480 nm et des impulsions lumineuses générées par une LED (Prizmatix) ont été appliquées à travers un objectif × 40 (0,9 NA ; Olympus) pour enregistrer l'expression de hChR2 à proximité des cellules. Le diamètre du champ éclairé est d'environ 0,5 mm et la puissance totale est de 10 à 20 mW. La largeur d'impulsion a été fixée à 10 ms, ce qui correspond à l'impulsion donnée lors de l'expérience d'apprentissage comportemental. Différentes fréquences de stimulation ont été utilisées, de 1 à 20 Hz, mais seule la première impulsion de la série a été utilisée pour la quantification. Les intervalles entre les trains sont généralement supérieurs à 30 s afin de minimiser l'effet sur les voies synaptiques inhibitrices ou facilitatrices. Pour vérifier si la réponse hChR2 était monosynaptique, nous avons appliqué du TTX (1 μM) au bain jusqu'à disparition de la réaction EPSC, puis de la 4-aminopyridine (4-AP ; 100 μM). En règle générale, une réponse est renvoyée en quelques minutes, avec un délai légèrement plus long entre le déclenchement de la LED et la génération de l'EPSC. NBQX (10 μM) a été utilisé pour tester si la réponse est pilotée par les récepteurs AMPA.
Français Des sections nettes de hCO ont été créées comme décrit précédemment. Brièvement, les sections de hCO ont été incluses dans de l'agarose à 4 % et transférées dans des cellules contenant 126 mM de NaCl, 2,5 mM de KCl, 1,25 mM de NaH2PO4, 1 mM de MgSO4, 2 mM de CaCl2, 26 mM de NaHCO3 et 10 mM de d-(+)-glucose. Les sections ont été coupées à 200-300 µm à température ambiante à l'aide d'un vibrateur Leica VT1200 et conservées dans de l'ASF à température ambiante. Ensuite, un enregistrement patch-camp de cellules entières a été réalisé sur des sections de hCO sous un microscope direct SliceScope (Scientifica). Les sections ont été perfusées avec du LCRa (95 % d'O2 et 5 % de CO2) et les signaux cellulaires ont été enregistrés à température ambiante. Les neurones hCO ont été appliqués à l'aide d'une pipette en verre borosilicaté remplie d'une solution contenant 127 mM de gluconate de potassium, 8 mM de NaCl, 4 mM d'ATP magnésien, 0,3 mM de GTP sodique, 10 mM d'HEPES et 0,6 mM d'EGTA, pH interne 7,2, ajusté avec du KOH (osmolarité 290). Pour la récupération, ajouter 0,2 % de Biocytin à la solution interne.
Les données ont été acquises par Clampex (Clampex 11.1, Molecular Devices) à l'aide d'un amplificateur MultiClamp 700B (Molecular Devices) et d'un numériseur Digidata 1550B (Molecular Devices), filtrées passe-bas à 2 kHz, numérisées à 20 kHz et analysées à l'aide de Clampfit (version 10.6) pour l'analyse, molecular devices) et de fonctions MATLAB personnalisées (MATLAB 2019b, Mathworks). Le potentiel de jonction a été calculé à l'aide de JPCalc et les entrées ont été ajustées au potentiel de jonction calculé de -14 mV. L'opération IV consiste en une série d'échelons de courant par paliers de 5 à 10 pA de -50 à 250 pA.
Pour la reconstruction morphologique des neurones pincés, 0,2 % de biocytine (Sigma-Aldrich) a été ajouté à la solution interne. Les cellules sont amorcées pendant au moins 15 minutes après le piratage. La pipette est ensuite aspirée lentement pendant 1 à 2 minutes jusqu'à ce que la membrane enregistrée soit complètement scellée. Après la procédure de physiologie des coupes, les coupes ont été fixées toute la nuit à 4 °C dans du PFA à 4 %, lavées avec du PBS X3 et diluées au 1:1000 avec du DyLight 549 ou du DyLight 405 conjugué à la streptavidine (Vector Labs). Les cellules remplies de biocytine (2 % ; Sigma-Aldrich) ont été marquées lors de l'enregistrement par patch clamp à température ambiante pendant 2 heures. Les sections ont ensuite été montées sur des lames de microscopie à l'aide d'un Aquamount (Thermo Scientific) et visualisées le lendemain sur un microscope confocal Leica TCS SP8 à l'aide d'un objectif à immersion dans l'huile avec une ouverture numérique × 40 1,3, un grossissement × 0,9–1,0, xy. Le taux d'échantillonnage est d'environ 7 pixels par micron. Des piles Z à des intervalles de 1 µm ont été obtenues en série, et des mosaïques de piles Z et un assemblage automatique basé sur Leica ont été réalisés pour couvrir l'intégralité de l'arbre dendritique de chaque neurone. Les neurones ont ensuite été suivis semi-manuellement à l'aide de l'interface neuTube 40 et des fichiers SWC ont été générés. Les fichiers ont ensuite été téléchargés vers le plugin SimpleNeuriteTracer41 Fiji (ImageJ, version 2.1.0 ; NIH).
Du tissu cortical humain a été obtenu avec le consentement éclairé des patients, conformément à un protocole approuvé par le comité d'éthique de l'université de Stanford. Deux échantillons de tissu post-partum humain (âgés de 3 et 18 ans) ont été prélevés par résection du cortex frontal (gyrus frontal moyen) dans le cadre d'une intervention chirurgicale pour épilepsie réfractaire. Après résection, le tissu a été prélevé dans du NMDG-aCSF glacé contenant : 92 mM de NMDG, 2,5 mM de KCl, 1,25 mM de NaH2PO4, 30 mM de NaHCO3, 20 mM d'HEPES, 25 mM de glucose, 2 mM de thiourée, 5 mM d'ascorbate de sodium, 3 mM de pyruvate de sodium, 0,5 mM de CaCl2·4H2O et 10 mM de MgSO4·7H2O. Titrer à pH 7,3-7,4 avec de l'acide chlorhydrique concentré. Les tissus ont été livrés au laboratoire dans les 30 minutes et des coupes coronales ont été prélevées selon la procédure décrite ci-dessus.
Toutes les procédures animales ont été réalisées conformément aux directives de soins aux animaux approuvées par l'APLAC de l'Université de Stanford. Les rats (plus de 140 jours après la transplantation) ont été induits par une anesthésie à l'isoflurane à 5 % et anesthésiés avec de l'isoflurane à 1-3 % en peropératoire. Les animaux ont été placés dans un cadre stéréotaxique (Kopf) et de la buprénorphine à libération prolongée (SR) a été injectée par voie sous-cutanée. Le crâne a été exposé, nettoyé et 3 à 5 vis osseuses ont été insérées. Pour cibler le t-hCO, nous avons généré des coordonnées stéréotaxiques à partir d'images IRM. Un trou de trépan a été foré au site d'intérêt et des fibres (400 µm de diamètre, NA 0,48, dorique) ont été descendues à 100 µm sous la surface du hCO et fixées au crâne avec du ciment dentaire durcissable aux UV (Relyx).
Des enregistrements photométriques à fibre optique ont été réalisés comme décrit précédemment42. Pour enregistrer l'activité spontanée, les rats ont été placés dans une cage propre et un câble de raccordement à fibre optique de 400 µm de diamètre (Doric) connecté à un système d'acquisition de données photométriques à fibre optique a été connecté au câble à fibre optique implanté. Pendant les 10 minutes d'enregistrement de l'activité motrice, les animaux étaient libres d'explorer la cage. Pour enregistrer l'activité évoquée, les rats (plus de 140 jours après la transplantation) ont été anesthésiés avec 5 % d'isoflurane pour l'induction et 1 à 3 % d'isoflurane pour l'entretien. Placer l'animal dans un cadre stéréotaxique (Kopf) et les moustaches du côté opposé du t-hCO sont coupées à environ 2 cm et passées à travers un treillis connecté à un actionneur piézoélectrique (PI). Un câble de raccordement à fibre optique de 400 µm (Doric) a été connecté à la fibre implantée et au système d'acquisition de données. Les moustaches opposées au t-hCO ont ensuite été déviées 50 fois (2 mm à 20 Hz, 2 s par présentation) à des moments aléatoires par un entraînement piézoélectrique sur une période d'enregistrement de 20 minutes. Utilisez le package de support Arduino MATLAB pour contrôler le temps de déviation avec un code MATLAB personnalisé. Les événements sont synchronisés avec le logiciel d'acquisition de données par des impulsions logiques transistor-transistor (TTL).
Des rats (plus de 140 jours après la transplantation) ont été induits par une anesthésie à l'isoflurane à 5 % et anesthésiés avec de l'isoflurane à 1-3 % en peropératoire. Les animaux ont été placés dans un cadre stéréotaxique (Kopf) et de la buprénorphine à libération prolongée et de la dexaméthasone ont été injectées par voie sous-cutanée. Le crâne a été exposé, nettoyé et 3 à 5 vis osseuses ont été insérées. Pour cibler le t-hCO, nous avons généré des coordonnées stéréotaxiques à partir d'images IRM. Une craniotomie circulaire (environ 1 cm de diamètre) a été réalisée à l'aide d'une perceuse à grande vitesse directement sur le hCO transplanté. Une fois l'os aussi fin que possible, mais avant de le percer entièrement, le disque pelvien intact restant a été retiré à l'aide d'une pince afin de révéler le t-hCO sous-jacent. La craniotomie a été remplie de solution saline stérile, et une lamelle couvre-objet et une broche à tête spéciale ont été fixées au crâne avec du ciment dentaire durci aux UV (Relyx).
L'imagerie à deux photons a été réalisée à l'aide d'un microscope multiphotonique Bruker équipé d'un objectif Nikon LWD (×16, 0,8 NA). L'imagerie GCaMP6 a été réalisée à 920 nm avec un grossissement de 1,4x sur un seul plan z et une moyenne de 8x de 7,5 images par seconde. Les rats ont été anesthésiés à 5 % d'isoflurane et maintenus avec 1 à 3 % d'isoflurane. Les rats ont été placés dans un support de tête sur mesure et positionnés sous l'objectif. Un enregistrement de fond de 3 minutes de l'activité motrice a été réalisé. Pendant 20 minutes d'enregistrement, 50 bouffées (chacune d'une durée de 100 ms) ont été délivrées aléatoirement sur le coussinet vibratile opposé au t-hCO à l'aide d'un picospricer. Utilisez le package de support Arduino MATLAB pour contrôler la durée des rafales avec un code MATLAB personnalisé. Synchronisez les événements avec le logiciel d'acquisition de données (PrairieView 5.5) à l'aide d'impulsions TTL. Pour l'analyse, les images ont été corrigées du mouvement xy par correction affine dans le cadre du programme MoCo lancé aux Fidji. Extraction des traces de fluorescence de cellules individuelles à l'aide du CNMF-E43. La fluorescence a été extraite pour chaque région d'intérêt, convertie en courbes dF/F, puis en scores z.
Des rats (plus de 140 jours après la transplantation) ont été induits par une anesthésie à l'isoflurane à 5 % et anesthésiés avec de l'isoflurane à 1-3 % en peropératoire. Les animaux ont été placés dans un cadre stéréotaxique (Kopf) et de la buprénorphine à libération prolongée et de la dexaméthasone ont été injectées par voie sous-cutanée. Les vibrisses du côté opposé au t-hCO ont été coupées à environ 2 cm et enfilées dans un treillis relié à un actionneur piézoélectrique. Le crâne est exposé et nettoyé. Une vis de mise à la terre en acier inoxydable est fixée au crâne. Pour cibler le t-hCO, nous avons généré des coordonnées stéréotaxiques à partir d'images IRM. Une craniotomie circulaire (environ 1 cm de diamètre) est réalisée à l'aide d'une perceuse à grande vitesse juste au-dessus du t-hCO. Une fois l'os aussi fin que possible, mais avant de percer l'os entier, utilisez une pince pour retirer le disque pelvien intact restant afin de révéler le t-hCO sous-jacent. Les cellules individuelles ont été enregistrées à l'aide de sondes en silicium haute densité à 32 ou 64 canaux (Cambridge Neurotech), reliées à des vis de mise à la terre et préamplifiées par des amplificateurs RHD (Intan). À l'aide du manipulateur, abaissez les électrodes jusqu'au site cible à travers la craniotomie, remplie de solution saline stérile. La collecte des données a été réalisée à une fréquence de 30 kHz à l'aide du système d'acquisition de données Open Ephys. L'enregistrement n'a continué que lorsque nous avons détecté une activité rythmique spontanée fortement corrélée dans plus de 10 canaux, suggérant que les électrodes étaient situées dans le greffon (d'après les données d'imagerie calcique à deux photons). Un enregistrement de fond de 10 minutes de l'activité motrice a été obtenu. Les moustaches situées du côté opposé au t-hCO ont ensuite été déviées 50 fois (2 mm à 20 Hz, 2 s par présentation) à des moments aléatoires par un entraînement piézoélectrique sur une période d'enregistrement de 20 minutes. Grâce au package de support MATLAB pour Arduino (MATLAB 2019b), contrôlez le temps de déflexion avec du code MATLAB personnalisé. Utilisez des impulsions TTL pour synchroniser les événements avec le logiciel d'acquisition de données.
Pour les expériences de marquage optique, un cordon optique de 200 µm (Doric) relié à un laser de 473 nm (Omicron) a été connecté à une fibre optique de 200 µm placée sur la craniotomie. Juste avant, réglez la puissance du cavalier sur 20 mW. Utilisez le manipulateur pour abaisser les électrodes jusqu'au site cible à travers la craniotomie, remplie de solution saline stérile. Au début de l'enregistrement, dix impulsions lumineuses de 473 nm (fréquence 2 Hz, durée d'impulsion 10 ms) ont été émises. Les cellules photosensibles ont été définies comme présentant une réponse de pointe dans les 10 ms suivant l'exposition à la lumière dans 70 % ou plus des essais.