Vă mulțumim că ați vizitat Nature.com. Folosiți o versiune de browser cu suport CSS limitat. Pentru o experiență optimă, vă recomandăm să utilizați un browser actualizat (sau să dezactivați Modul de compatibilitate în Internet Explorer). În plus, pentru a asigura suport continuu, afișăm site-ul fără stiluri și JavaScript.
Afișează un carusel cu trei diapozitive simultan. Folosește butoanele Anterior și Următor pentru a parcurge trei diapozitive simultan sau folosește butoanele cursorului de la final pentru a parcurge trei diapozitive simultan.
Organilele neuronale autoasamblate reprezintă o platformă in vitro promițătoare pentru modelarea dezvoltării și bolilor umane. Cu toate acestea, organoidele nu au conectivitatea existentă in vivo, ceea ce limitează maturarea și previne integrarea cu alte circuite care controlează comportamentul. Aici arătăm că organoidele corticale derivate din celule stem umane transplantate în cortexul somatosenzorial al șobolanilor nuzi nou-născuți dezvoltă tipuri de celule mature care se integrează în circuite senzoriale și legate de motivație. RMN-ul a relevat creșterea organoidelor post-transplant în mai multe linii de celule stem și animale, în timp ce analiza single-core a relevat progresia corticogenezei și apariția unui program de transcripție dependent de activitate. Într-adevăr, neuronii corticali transplantați prezintă proprietăți morfologice, sinaptice și de membrană internă mai complexe decât omologii lor in vitro, permițând detectarea defectelor neuronale la pacienții cu sindromul Timothy. Trasarea anatomică și funcțională a arătat că organitele transplantate primesc inputuri talamocorticale și corticocorticale, iar înregistrările in vivo ale activității neuronale sugerează că aceste inputuri pot genera răspunsuri senzoriale în celulele umane. În cele din urmă, organoidele corticale extind axonii în tot creierul șobolanului, iar activarea lor optogenetică duce la un comportament de căutare a recompensei. Astfel, neuronii transplantați din cortexul uman se maturizează și participă la circuitele gazdei care controlează comportamentul. Ne așteptăm ca această abordare să faciliteze detectarea fenotipurilor la nivel de catenă în celulele derivate de la pacient, care nu pot fi detectate prin alte mijloace.
Dezvoltarea creierului uman este un proces remarcabil de auto-organizare în care celulele proliferează, se diferențiază, migrează și se conectează pentru a forma circuite neuronale funcționale care sunt rafinate în continuare prin experiența senzorială. O problemă cheie în înțelegerea dezvoltării creierului uman, în special în contextul bolilor, este lipsa accesului la țesutul cerebral. Organelele auto-organizate, inclusiv organoidele cortexului uman (hCO; cunoscute și sub numele de sfera cortexului uman), pot genera 2,3,4,5,6. Cu toate acestea, mai multe limitări limitează aplicarea lor mai largă la înțelegerea dezvoltării și funcționării circuitelor neuronale. În special, nu este clar dacă maturarea hCO este limitată de absența anumitor inputuri senzoriale și de micromediu prezente in vivo. În plus, deoarece hCO-urile nu sunt integrate în circuite care pot genera rezultate comportamentale, utilitatea lor în modelarea tulburărilor neuropsihiatrice genetic complexe și comportamentale este în prezent limitată.
Transplantul de hCO într-un creier viu intact poate depăși aceste limitări. Studiile anterioare au arătat că neuronii umani transplantați în cortexul rozătoarelor sunt capabili să supraviețuiască, să proiecteze și să comunice cu celulele rozătoarelor7,8,9,10,11,12. Cu toate acestea, aceste experimente sunt de obicei efectuate pe animale adulte, ceea ce poate limita integrarea sinaptică și axonală. Aici, descriem o paradigmă de transplant în care am transplantat hCO 3D derivat din celule hiPS în cortexul somatosenzorial primar (S1) al șobolanilor imunodeficienți într-un stadiu incipient al dezvoltării plastice. Neuronii hCO (t-hCO) transplantați suferă o maturare substanțială, primesc inputuri talamocorticale și cortico-corticale care provoacă răspunsuri senzoriale și extind proiecțiile axonale în creierul șobolanului pentru a stimula comportamentul de căutare a recompensei. Maturarea extinsă a t-hCO a relevat defecte neuronale la pacienții cu sindromul Timothy (TS), o tulburare genetică severă cauzată de mutații în canalul de calciu CaV1.2 de tip L sensibil la voltaj (codificat de CACNA1C).
Pentru a studia neuronii corticali umani în circuite in vivo, am transplantat stereotactic hCO 3D intact în S1 la șobolani atimici postnatali timpurii (zilele 3-7 postnatal) (Fig. 1a și date extinse din Fig. 1a-c). În acest moment, proiecțiile axonale talamocorticale și corticocorticale nu și-au finalizat încă inervația S1 (ref. 13). Astfel, această abordare este concepută pentru a maximiza integrarea t-hCO, minimizând în același timp impactul asupra circuitelor endogene. Pentru a vizualiza locația t-hCO la animalele vii, am efectuat reconstrucții cerebrale prin RMN ponderate T2 la șobolani la 2-3 luni după transplant (Fig. 1b și date extinse, Fig. 1d). t-hCO3 au fost ușor observate, iar măsurătorile volumului de t-hCO3 au fost similare cu cele calculate din secțiuni fixe (Date extinse Fig. 1d, e; P > 0,05). t-hCO3 au fost ușor observate, iar măsurătorile volumului de t-hCO3 au fost similare cu cele calculate din secțiuni fixe (Date extinse Fig. 1d, e; P > 0,05). t-hCO легко наблюдались, а объемные измерения t-hCO были аналогичны рассчитанным длеро фиксиры фиксины (расширенные данные, рис. 1d, e; P> 0,05). t-hCO₃ au fost ușor de observat, iar măsurătorile volumetrice ale t-hCO₃ au fost similare cu cele calculate pentru secțiuni fixe (date extinse, Fig. 1d, e; P > 0,05).很容易观察到t-hCO，并且t-hCO的体积测量值与从固定切片计算的测量值相似（扩展数据图1d、e；P > 0,05）很容易观察到t-hCO，并且t-hCO t-hCO легко наблюдался, а объемные измерения t-hCO были аналогичны рассчитанным для фиксезмерения (расширенные данные, рис. 1d, e; P> 0,05). t-hCO a fost ușor de observat, iar măsurătorile volumetrice ale t-hCO au fost similare cu cele calculate pentru secțiuni fixe (date extinse, Fig. 1d, e; P > 0,05).Am determinat t-hCO la 81% dintre animalele transplantate la aproximativ 2 luni după transplant (n = 72 de animale; hCO din 10 linii celulare hiPS; linii celulare hiPS în Tabelul suplimentar 1). Dintre acestea, 87% au fost localizate în cortexul cerebral (Fig. 1c). Prin efectuarea de scanări RMN seriale la momente multiple în timp la același șobolan transplantat, am constatat o creștere de nouă ori a volumului de t-hCO în decurs de 3 luni (Fig. 1d și date extinse, Fig. 1f). Animalele transplantate au avut o rată ridicată de supraviețuire (74%) la 12 luni după transplant (date extinse, Fig. 1g și Tabelul suplimentar 2) și nu s-au constatat deficiențe motorii sau de memorie evidente, glioză sau electroencefalogramă (EEG). Date Fig. 1g și tabelul suplimentar 2). 1h-m și 3e).
a, Schema designului experimental. hCO derivat din celule hiPS a fost transplantat în S1 de șobolani nuzi nou-născuți în zilele 30-60 de diferențiere. b, Imagini RMN coronale și orizontale ponderate T2 care arată t-hCO în S1 la 2 luni după transplant. Bara de scală, 2 mm. c, Cuantificarea ratelor de succes ale grefării prezentate pentru fiecare linie celulară hiPS (n = 108, numerele din bare indică cantitatea de t-hCO per linie celulară hIPS) și locația corticală sau subcorticală (n = 88). d, Imagine RMN a unei artere coronare (stânga; bară de scală, 3 mm) și reconstrucția volumetrică 3D corespunzătoare (bară de scală, 3 mm) care arată o creștere a t-hCO pe parcursul a 3 luni. e, Revizuirea modelelor de t-hCO în cortexul cerebral de șobolan. Bara de scală, 1 mm. f, Imagini imunocitochimice reprezentative ale t-hCO, prezentate de sus la stânga la dreapta (în timpul diferențierii): PPP1R17 (4 luni), NeuN (8 luni), SOX9 și GFAP (8 luni), PDGFRα; (8 luni), MAP2 (8 luni) și IBA1 (8 luni). Bara de scală, 20 µm. Co-exprimarea HNA indică celule de origine umană. g, secvențiere snRNA: imagistică de reducere a dimensionalității cu multiplex și proiecție unificată (UMAP) a tuturor nucleilor t-hCO de înaltă calitate după integrarea Seurat (n = 3 probe t-hCO, n = 2 linii celulare hiPS). Astrocite, celule ale liniei de astrocite; cyc prog, progenitori circulanți; GluN DL, neuroni glutamatergici profunzi; GluN DL/SP, neuroni glutamatergici profunzi și sublamelari; GluN UL, neuroni glutamatergici din stratul superior; oligodendrocite, oligodendrocite; OPC, celule progenitoare ale oligodendrocitelor; RELN, neuroni reelină. h, Analiza de îmbogățire a termenilor Gene Ontology (GO) a genelor semnificativ suprareglate (P ajustat < 0,05, modificare de ori > 2, exprimate în cel puțin 10% din nuclee) în neuronii glutamatergici t-hCO comparativ cu neuronii glutamatergici hCO. h, Analiza de îmbogățire a termenilor Gene Ontology (GO) a genelor semnificativ suprareglate (P ajustat < 0,05, modificare de ori > 2, exprimate în cel puțin 10% din nuclee) în neuronii glutamatergici t-hCO comparativ cu neuronii glutamatergici hCO. h, Анализ обогащения терминов Gene Ontology (GO) для генов со значительной активацией (скоррективацией (скоррективацией, скоррективацией) изменения > 2, экспрессия по крайней мере в 10% ядер) в глутаматергических нейронах t-hCO по снира глутаматергическими нейронами hCO. h, Analiza de îmbogățire a termenilor Gene Ontology (GO) pentru genele cu activare semnificativă (P ajustat <0,05, modificare de ori >2, expresie în cel puțin 10% din nuclee) în neuronii glutamatergici t-hCO comparativ cu neuronii glutamatergici hCO. h，与hCO 谷氨酸能神经元相比，t-hCO 谷氨酸能神经元中基因显着上调（谎P整0,05，倍数变化> 2，在至少10% 的细胞核中表达）的基因本体论(GO) 术语富核中表达）的基因本体论(GO) 术语富核中表达 h ， 与 hco 谷氨酸 能 元 相比 ， t-hco 谷氨酸 能 神经 元 基因 显着 上调 ０ 后 （ 05 后 .变化 变化> 2 ， 至少 10% 的 核中 表达） 基因 基因 基因 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的的 的 的 的本体论(GO) 术语富集分析。 h, гены значительно активизировались (скорректированный P <0,05, кратность изменения> 2, эсрусспия крайней мере в 10% ядер) в глутаматергических нейронах t-hCO по сравнению с глутаматергичамнескических нейронах t-hCO Онтологический (GO) анализ термина обогащения. h, genele au fost semnificativ suprareglate (P ajustat < 0,05, modificarea oriilor > 2, exprimate în cel puțin 10% din nuclee) în neuronii glutamatergici t-hCO comparativ cu neuronii glutamatergici hCO. Analiza ontologică (GO) a termenului de îmbogățire.Linia punctată indică valoarea ap de 0,05. i, imagistica UMAP a tipurilor de celule GluN în t-hCO folosind transferul de marcaj dintr-un set de date de referință cu 22 de secvențe snRNA din cortexul motor adult. CT — celule corticotalamice, ET — celule extracerebrale, IT — celule telencefalice interne, NP — proiecție apropiată.
Apoi am evaluat citoarhitectura și compoziția celulară generală a t-hCO. Colorarea cu anticorpi a celulelor endoteliale de șobolan a evidențiat vascularizație cu t-hCO, în timp ce colorarea cu IBA1 a relevat prezența microgliei de șobolan în întreaga grefă (Fig. 1f și date extinse, Fig. 3c,d). Imunomarcarea a relevat celule pozitive pentru antigenul nuclear uman (HNA) care coexprimă PPP1R17 (progenitori corticali), NeuN (neuroni), SOX9 și GFAP (celule derivate din glie) sau PDGFRα (progenitori de oligodendrocite) (Figura 1f). Pentru a studia compoziția celulară a t-hCO la rezoluție unică de celule, am efectuat secvențierea ARN cu un singur nucleu (snRNA-seq) după aproximativ 8 luni de diferențiere. Filtrarea în vrac și îndepărtarea nucleilor de șobolan au produs 21.500 de hărți mononucleare umane de înaltă calitate (Fig. 1g și date extinse, Fig. 4a,b). Modelele de expresie ale markerilor tipici de tip celular au identificat grupuri de clase celulare corticale majore, inclusiv neuroni glutamatergici profunzi și superficiali, progenitori circulanți, oligodendrocite și linie de astrocite (Fig. 1g, date extinse, Fig. 4c și Tabelul suplimentar 3). Imunomarcarea pentru SATB2 și CTIP2 a arătat că, în ciuda prezenței subtipurilor corticale, t-hCO nu a prezentat o stratificare anatomică clară (date extinse, Fig. 3a). hCO cu secvențiere snRNA potrivită în funcție de stadiu a produs clase celulare în general similare, cu câteva excepții, inclusiv absența oligodendrocitelor și prezența neuronilor GABAergici, ceea ce poate reflecta condițiile in vitro favorabile raportate anterior pentru celulele progenitoare laterale15 (date extinse, Fig. 4f-i și Tabelul suplimentar 4). Analiza diferențială a expresiei genelor a relevat diferențe semnificative în neuronii glutamatergici între t-hCO și hCO (Tabelul suplimentar 5), inclusiv activarea seturilor de gene asociate cu maturarea neuronală, cum ar fi semnalizarea sinaptică, localizarea dendritică și activitatea canalului voltaj-dependent (Figura 1h și Tabelul suplimentar 5). În consecință, neuronii glutamatergici t-hCO corticali au prezentat o maturare transcripțională accelerată.
Pentru a elucida dacă aceste modificări transcripționale ale t-hCO au fost legate de diferențele morfologice dintre hCO in vitro și t-hCO in vivo, am reconstruit hCO și hCO umplute cu biocitină, în secțiuni acute, după 7-8 luni de diferențiere. Neuroni hCO (Fig. 2a). Neuronii t-hCO au fost semnificativ mai mari, au avut un diametru somatic de 1,5 ori mai mare, de două ori mai multe dendrite și o creștere generală de șase ori a lungimii dendritice totale în comparație cu hCO in vitro (Fig. 2b). În plus, am observat o densitate semnificativ mai mare de spini dendritici în neuronii t-hCO decât în neuronii hCO (Fig. 2c). Acest lucru sugerează că neuronii t-hCO suferă o alungire și ramificare dendritică extinsă, care, în combinație cu proliferarea celulară continuă, pot contribui la creșterea intensivă a t-hCO după transplant (Fig. 1d și Date extinse Fig. 1f). Acest lucru ne-a determinat să investigăm proprietățile electrofiziologice. Capacitatea membranei a fost de opt ori mai mare (date extinse, Fig. 8d), potențialul membranei în stare de repaus a fost mai hiperpolarizat (aproximativ 20 mV), iar injecția de curent a indus o rată maximă de excitație mai mare în neuronii t-hCO decât în neuronii hCO in vitro (Fig. 2d), e), ceea ce este în concordanță cu caracteristicile morfologice mai ample și mai complexe ale t-hCO. În plus, frecvența evenimentelor de curent postsinaptic excitatoriu spontan (EPSC) a fost semnificativ mai mare în neuronii t-hCO (Fig. 2f), sugerând că densitatea crescută a spinilor dendritici observată în neuronii t-hCO a fost asociată cu excitabilitatea funcțională a sinapsei sexuale. Am confirmat caracterul imatur al neuronilor hCO in vitro prin înregistrarea neuronilor glutamatergici marcați (date extinse, Fig. 6a-c).
a, reconstrucție 3D a neuronilor hCO și t-hCO umpluți cu biocitină după 8 luni de diferențiere. b, Cuantificarea caracteristicilor morfologice (n = 8 neuroni hCO, n = 6 neuroni t-hCO; **P = 0,0084, *P = 0,0179 și ***P < 0,0001). b, Cuantificarea caracteristicilor morfologice (n = 8 neuroni hCO, n = 6 neuroni t-hCO; **P = 0,0084, *P = 0,0179 și ***P < 0,0001). б, количественная оценка морфологических признаков (n = 8 нейронов hCO, n = 6 нейронка морфологических признаков) *** P <0,0001). b, cuantificarea caracteristicilor morfologice (n = 8 neuroni hCO, n = 6 neuroni t-hCO; **P = 0,0084, *P = 0,0179 și ***P <0,0001). b，形态学特征的量化（n = 8 个hCO 神经元，n = 6 个t-hCO 神经元；**P = 0,0084，*P = P = 0,01*** 元；**P = 0,017 0,0001). b，形态学特征的量化（n = 8 个hCO 神经元，n = 6 个t-hCO 神经元；**P = 0,0084，*P = P = 0,01*** 元；**P = 0,017 0,0001). б, количественная оценка морфологических признаков (n = 8 нейронов hCO, n = 6 нейронка морфологических признаков) *** P <0,0001). b, cuantificarea caracteristicilor morfologice (n = 8 neuroni hCO, n = 6 neuroni t-hCO; **P = 0,0084, *P = 0,0179 și ***P <0,0001).c, Reconstrucție 3D a ramurilor dendritice hCO și t-hCO după 8 luni de diferențiere. Asteriscurile roșii indică posibilele spini dendritici. Cuantificarea densității spinilor dendritici (n = 8 neuroni hCO, n = 6 neuroni t-hCO; **P = 0,0092). d, Cuantificarea potențialului membranei de repaus (n = 25 neuroni hCO3, n = 16 neuroni t-hCO3; ***P < 0,0001). d, Cuantificarea potențialului membranei de repaus (n = 25 neuroni hCO3, n = 16 neuroni t-hCO3; ***P < 0,0001). d, количественная оценка мембранного потенциала покоя (n = 25 нейронов hCO, n = 16 нейронов t-hCO,; *** P). d, cuantificarea potențialului membranei de repaus (n = 25 neuroni hCO, n = 16 neuroni t-hCO; ***P < 0,0001). d，静息膜电位的量化（n = 25 hCO 神经元，n = 16 t-hCO 神经元；***P < 0,0001）。 d，静息膜电位的量化（n = 25 hCO 神经元，n = 16 t-hCO 神经元；***P < 0,0001）。 d, количественная оценка мембранного потенциала покоя (n = 25 нейронов hCO, n = 16 нейронов t-hCO,; *** P). d, cuantificarea potențialului membranei de repaus (n = 25 neuroni hCO, n = 16 neuroni t-hCO; ***P < 0,0001). e, Activarea repetitivă a potențialului de acțiune în hCO3 și t-hCO3 indusă prin creșterea injecțiilor de curent și cuantificarea ratei maxime de activare (n = 25 neuroni hCO3, n = 16 neuroni t-hCO3; ***P < 0,0001). e, Activarea repetitivă a potențialului de acțiune în hCO3 și t-hCO3 indusă prin creșterea injecțiilor de curent și cuantificarea ratei maxime de activare (n = 25 neuroni hCO3, n = 16 neuroni t-hCO3; ***P < 0,0001). e, повторное возбуждение потенциала действия в hCO и t-hCO, вызванное увеличением тока, и количением тока, и количне колич количением максимальной скорости возбуждения (n = 25 нейронов hCO, n = 16 нейронов t-hCO; *** P <0,0001). e, reactivarea potențialului de acțiune în hCO și t-hCO indusă de creșterea curentului și cuantificarea ratei maxime de declanșare (n = 25 neuroni hCO, n = 16 neuroni t-hCO; *** P < 0,0001). e，通过增加电流注入诱导的hCO 和t-hCO 重复动作电位放电，以及最大放电率率甄复动作电位放电，以及最大放电燏率甄复动作电位放电个hCO 神经元，n = 16 个t-hCO 神经元；***P < 0,0001）。 E ， 通过 增加 电流 注入 的 的 hco 和 t-hco 重复 电位 放电 ， 以及 最 大 及 大 及 （ （ （ 2 重复个 hco 神经 ， n = 16 个 t-hco 神经 ； *** p <0,0001） 。 e, повторяющееся возбуждение потенциала действия hCO и t-hCO, вызванное увеличением потокач, и и количественная оценка максимальной скорости возбуждения (n = 25 нейронов hCO, n = 16 нейронов hCO, n = 16 нейронов t-10,000в ***0
Pe baza activității crescute a t-hCO observate în secțiuni ex vivo, secvențierea snRNA a relevat o creștere dependentă de activitate a transcrierilor genetice în t-hCO în comparație cu hCO in vitro. Neuronii t-hCO glutamatergici au exprimat niveluri mai ridicate de gene care reglează activitatea de răspuns tardiv (Fig. 2g, h), care au fost găsite în studii anterioare pe neuroni de șoarece și oameni16,17. De exemplu, BDNF18, SCG2 și OSTN, o genă de reglare a activității specifică primatelor, au arătat o expresie crescută în neuronii t-hCO în comparație cu neuronii hCO (Fig. 2g-i). Astfel, neuronii t-hCO au prezentat caracteristici de maturare îmbunătățite în comparație cu neuronii hCO prin analize transcripționale, morfologice și funcționale.
Pentru a evalua în continuare asocierea maturării t-hCO cu dezvoltarea creierului uman, am efectuat comparații transcriptomice ale tipurilor de celule corticale fetale și adulte19,20 și adulte21,22, precum și date extinse privind expresia genelor corticale23 în timpul dezvoltării (date extinse, Fig. 5). Conform studiilor anterioare24, starea de maturare transcriptomică globală a hCO și t-hCO la 7-8 luni de diferențiere este în general consistentă cu timpul de dezvoltare in vivo și este cel mai echivalentă cu viața fetală târzie (Date extinse, Fig. 5a). În special, am observat o maturitate transcriptomică crescută în t-hCO în comparație cu hCO de aceeași vârstă, precum și activarea transcriptomică asociată cu sinaptogeneza, astrogeneza și mielinizarea (date extinse, Fig. 5b-d). La nivel celular, am găsit dovezi ale unui subtip de cortex mai subțire în t-hCO, cu grupuri de neuroni glutamatergici care se suprapun cu subtipurile de neuroni L2/3, L5 și L6 adulți (Figura 1i). În schimb, suprapunerea clusterelor între neuronii glutamatergici t-hCO și neuronii corticali fetali a fost mai limitată la mijlocul sarcinii (date extinse, Figura 5e-j). Pentru a determina dacă neuronii t-hCO sunt similari din punct de vedere funcțional cu neuronii neocorticali postnatali umani, am efectuat înregistrări electrofiziologice și reconstrucții anatomice ale neuronilor piramidali L2/3 umani în secțiuni ascuțite ale cortexului postnatal uman (date extinse, Fig. 7a). Proprietățile electrofiziologice ale neuronilor piramidali L2/3 au fost similare cu cele ale neuronilor piramidali t-hCO (date extinse, Fig. 7e). Din punct de vedere morfologic, neuronii L2/3 din probele umane postnatale au fost mai similari cu t-hCO decât cu hCO, deși celulele L2/3 erau mai lungi, conțineau mai multe ramificații în general și aveau o densitate mai mare a coloanei vertebrale (Fig. 3g și date extinse, Fig. 7b-). G).
a, transplant de hCO produs de liniile celulare hiPS de control și TS la șobolani nou-născuți. b, reconstrucție 3D a neuronilor t-hCO umpluți cu biocitină după 8 luni de diferențiere. c, cuantificarea lungimii dendritice medii (n = 19 neuroni de control, n = 21 neuroni TS; **P = 0,0041). d, ramuri dendritice reconstruite 3D din control și TS t-hCO3 la 8 luni de diferențiere și cuantificarea densității coloanei dendritice (n = 16 neuroni de control, n = 21 neuroni TS, ***P < 0,0001). d, ramuri dendritice reconstruite 3D din control și TS t-hCO3 la 8 luni de diferențiere și cuantificarea densității coloanei dendritice (n = 16 neuroni de control, n = 21 neuroni TS, ***P < 0,0001). d, 3D-реконструкция дендритных ветвей из контроля и TS t-hCO через 8 месяцев диффференцев дифференца ировковколинца оценка плотности дендритных шипов (n = 16 контрольных нейронов, n = 21 TS нейронов, *** P <0,0001). d, Reconstrucție 3D a ramurilor dendritice din lotul de control și din lotul t-hCO3 TS la 8 luni de diferențiere și cuantificare a densității coloanei dendritice (n = 16 neuroni de control, n = 21 neuroni TS, ***P <0,0001). d，分化8 个月时对照和TS t-hCO 的3D 重建树突分支，以及树突棘密度的量化（n 16个对照神经元，n = 21 个TS 神经元，***P < 0,0001）。 d ， 分化 8 个 时 对照 和 ts t-hco 的 3d 重建 分支 分支 以及 树突棘 密度 密度 密度 重建 分支神经 元 ， n = 21 个 ts 神经 ， *** p <0,0001 ）。 d, 3D-реконструкция дендритных ветвей контроля и TS t-hCO через 8 месяцев дифференцирововей контроля и через оценка плотности дендритных шипов (n = 16 контрольных нейронов, n = 21 TS нейронов, *** P <0,0001). d, Reconstrucție 3D a ramurilor dendritice de control și TS t-hCO la 8 luni de diferențiere și cuantificarea densității coloanei dendritice (n = 16 neuroni de control, n = 21 neuroni TS, ***P <0,0001).Asteriscurile roșii indică posibile spine dendritice. e, EPSC-uri spontane în neuronii t-hCO de control și TS după 8 luni de diferențiere. f, graficul frecvenței cumulative și cuantificarea frecvenței și amplitudinii evenimentelor sinaptice (n = 32 neuroni de control, n = 26 neuroni TS; **P = 0,0076 și P = 0,8102). g, analiza Scholl a neuronilor TS și de control în hCO și t-hCO. Liniile punctate prezintă neuronii piramidali postnatali umani L2/3 pentru comparație (n = 24 neuroni t-hCO de control, n = 21 neuroni t-hCO TS, n = 8 neuroni hCO de control și n = 7 neuroni hCO TS). Datele sunt exprimate ca medie ± deviație standard.
Capacitatea t-hCO de a replica caracteristicile morfologice și funcționale ale neuronilor din cortexul uman la un nivel înalt ne-a determinat să explorăm dacă t-hCO ar putea fi utilizat pentru a detecta fenotipurile bolilor. Ne-am concentrat pe TS, o tulburare neurodezvoltării severe cauzată de mutații de tip „gain-of-function” în gena care codifică CaV1.2, care inițiază transcripția genelor dependente de activitate în neuroni. Am obținut hCO de la trei pacienți cu TS care purtau cea mai frecventă substituție (p.G406R) și trei pacienți din grupul de control (Fig. 3a). După transplant, am constatat că morfologia dendritică a fost modificată în neuronii TS comparativ cu grupul de control (Fig. 3b și date extinse, Fig. 8a,b), cu o creștere de două ori a numărului de dendrite primare și o creștere generală a scăderii medii și generale a lungimii dendritice (Fig. 3c și date extinse, Fig. 8c). Aceasta a fost asociată cu o densitate crescută a spinilor și o frecvență crescută a EPSC-urilor spontane în TS comparativ cu neuronii din grupul de control (Fig. 3d-f și date extinse, Fig. 8g). Analize ulterioare au relevat modele de ramificare dendritică anormală în TS t-hCO₃ în comparație cu grupul de control, dar nu și în TS hCO₃ in vitro într-un stadiu similar de diferențiere (Fig. 3g). Acest lucru este în concordanță cu rapoartele noastre anterioare privind contracția dendritică dependentă de activitate în TS și evidențiază capacitatea acestei platforme de transplant de a detecta fenotipurile bolii in vivo.
Apoi, ne-am întrebat în ce măsură celulele t-hCO sunt integrate funcțional în S1 de șobolan. S1 la rozătoare primește inputuri sinaptice puternice de la nucleii bazali ventrali ipsilaterali și talamici posteriori, precum și de la cortexul motor ipsilateral și somatosenzorial secundar și de la S1 contralateral (Fig. 4a). Pentru a restabili modelul de inervație, am infectat hCO cu virusul rabiei-dG-GFP/AAV-G și am transplantat hCO la șobolanul S1 3 zile mai târziu. Am observat o expresie densă a GFP în neuronii ganglionilor bazali ventrali și ai S1 ipsilaterali la 7-14 zile după transplant (Fig. 4b, c). În plus, colorarea cu anticorpi a markerului talamic netrin G1 a relevat prezența terminațiilor talamice în t-hCO (Fig. 4d, e). Pentru a evalua dacă aceste proiecții aferente ar putea provoca răspunsuri sinaptice în celulele t-hCO, am efectuat înregistrări ale celulelor întregi din celule umane în secțiuni ascuțite ale stratului talamocortical. Stimularea electrică a zonei S1 de șobolan, a capsulei interne, a substanței albe, a fibrelor din apropierea t-hCO sau activarea optogenetică a terminațiilor talamice care exprimă opsină în EPSC-uri cu latență scurtă induse de t-hCO în neuronii t-hCO expuși la antagonistul receptorului AMPA NBQX. (Fig. 4f, g și date extinse, Fig. 9a-g). Aceste date demonstrează că t-hCO este integrat anatomic în creierul șobolanului și poate fi activat de țesutul gazdă de șobolan.
a, Diagramă schematică a unui experiment de urmărire a rabiei. b, Expresia GFP și a STEM121 specifică omului între t-hCO și cortexul cerebral de șobolan (panoul superior). De asemenea, este prezentată expresia GFP în nucleul bazal ventral ipsilateral (VB) (stânga jos) și S1 ipsilateral (dreapta jos) la șobolan. Bara de scală, 50 µm. Pătratele roșii reprezintă zonele creierului unde au fost realizate imaginile. c, Cuantificarea celulelor care exprimă GFP (n = 4 șobolani). d, e — Terminale talamice Netrin G1+ în t-hCO. d prezintă o secțiune coronală care conține nucleii t-hCO și VB. Bara de scală, 2 mm. e prezintă expresia Netrin G1 și STEM121 în neuronii t-hCO (stânga) și VB (dreapta). Bara de scală, 50 µm. Linia punctată portocalie indică marginea t-hCO. f, g, Urme de curent ale neuronilor t-hCO după stimularea electrică la șobolanul S1 (f) sau la capsula internă (g), cu (violet) sau fără (negru) NBQX (stânga). Amplitudini EPSC cu și fără NBQX (n = 6 neuroni S1, *P = 0,0119; și n = 6 neuroni din capsula internă, **P = 0,0022) (centru). Procentul de neuroni t-hCO care prezintă EPSC ca răspuns la stimularea electrică a șobolanului S1 (f) sau a capsulei interne (g) (dreapta). aCSF, lichid cefalorahidian artificial. h, diagramă schematică a experimentului de imagistică 2P (stânga). Expresia GCaMP6s în t-hCO (mijloc). Bara de scală, 100 µm. Interval de timp al fluorescenței GCaMP6s (dreapta). i, scorul Z al fluorescenței activității spontane. j, ilustrație schematică a stimulării mustății. k, traiectorii de fluorescență 2P cu scor z într-un studiu, aliniate cu deviația mustăților la momentul zero (linie punctată) în celulele exemplu. l, răspunsuri scor z medii ale populației pentru toate celulele aliniate cu deviația mustăților la momentul zero (linie punctată) (roșu) sau timestamp-uri generate aleatoriu (gri). m. Diagramă schematică a experimentului privind marcarea optică. n, Curbe brute de tensiune dintr-o celulă t-hCO3 exemplu în timpul stimulării cu laser albastru sau deformării mustăților. Săgețile roșii indică primele vârfuri cauzate de lumină (sus) sau cauzate de deformarea mustăților (jos). Umbra gri indică perioadele de deformare a mustăților. o, Forme de undă luminoase de vârf și răspunsuri de deformare a mustăților. p, vârfuri ale unei singure încercări, aliniate cu deviația mustăților în celulele exemplului. 0 indică deviația mustăților (linie punctată). q, rata de declanșare a scorului z medie a populației pentru toate celulele fotosensibile, aliniată cu deviația mustăților la momentul zero (linie punctată) (roșu) sau timestamp-uri generate aleatoriu (gri). r, Proporția unităților fotosensibile modulate semnificativ de deviația mustăților (n = 3 șobolani) (stânga). Latența maximă a scorului z (n = 3 șobolani; n = 5 (verde deschis), n = 4 (verde închis) și n = 4 (cian) unități de modulație a deformării mustăților per șobolan) (dreapta). Datele sunt exprimate ca medie ± deviație standard.
Apoi ne-am întrebat dacă t-hCO ar putea fi activat de stimuli senzoriali in vivo. Am transplantat hCO care exprimă indicatorii de calciu codificați genetic GCaMP6 în șobolani S1. După 150 de zile, am efectuat fotometrie cu fibre sau imagistică cu calciu cu doi fotoni (Fig. 4h și date extinse, Fig. 10a). Am constatat că celulele t-hCO au prezentat o activitate ritmică sincronizată (Figura 4i, Date extinse, Figura 10b și Video suplimentar 1). Pentru a caracteriza activitatea maximă a t-hCO, am efectuat înregistrări electrofiziologice extracelulare la șobolani transplantați anesteziați (date extinse, Fig. 10c-f). Am generat coordonate stereotaxice din imagini RMN; astfel, aceste unități înregistrate reprezintă neuroni umani prezumtivi, deși electrofiziologia singură nu permite determinarea unei specii de origine. Am observat explozii sincronizate de activitate (date extinse, Fig. 10d). Rafalele au durat aproximativ 460 ms și au fost separate de perioade de liniște de aproximativ 2 secunde (date extinse, Fig. 10d, e). Unitățile individuale au tras în medie aproximativ trei runde per rafală, ceea ce reprezintă aproximativ 73% din unitățile înregistrate per rafală. Activitățile unităților individuale au fost puternic corelate, iar aceste corelații au fost mai mari decât cele ale unităților identificate la animalele nevaccinate înregistrate în aceleași condiții (date extinse, Fig. 10f). Pentru a caracteriza în continuare răspunsurile la vârfuri ale neuronilor derivați din organismul uman identificați, am efectuat experimente de marcare cu lumină pe șobolani anesteziați transplantați cu hCO3 care exprimă canalul cationic fotosensibil rodopsină 2 (hChR2), prin care neuronii t-hCO3 au o latență scurtă de recunoaștere (mai puțin de 10 ms) ca răspuns la stimuli de lumină albastră (Fig. 4m-o). Neuronii t-hCO au prezentat explozii de activitate spontană la frecvențe similare cu cele observate în imagistica cu calciu, precum și în înregistrările electrofiziologice efectuate în t-hCO în absența marcajului luminos (date extinse, Fig. 10c-g). Nu s-a observat nicio activitate spontană în etapele corespunzătoare ale hCO înregistrate in vitro. Pentru a evalua dacă t-hCO ar putea fi activat de stimuli senzoriali, am deviat scurt mustățile de șobolan departe de t-hCO (Fig. 4j,m și date extinse, Fig. 10h,k). Conform studiilor anterioare8,10, un subset de celule t-hCO a prezentat o activitate crescută ca răspuns la devierea mustăților, ceea ce nu a fost observat atunci când datele au fost comparate cu marcaje temporale aleatorii (Fig. 4k-q și date extinse, Fig. 10h-q). Într-adevăr, aproximativ 54% din unitățile individuale marcate opto au prezentat o rată de excitare semnificativ crescută după stimularea mustăților, atingând un vârf de aproximativ 650 ms (Fig. 4r). Luate împreună, aceste date sugerează că t-hCO primește inputuri funcționale adecvate și poate fi activat de stimuli de mediu.
Apoi am investigat dacă t-hCO ar putea activa circuite la șobolani pentru a controla comportamentul. Mai întâi am investigat dacă axonii neuronilor t-hCO se proiectează în țesuturile înconjurătoare ale șobolanului. Am infectat hCO cu un lentivirus care codifică hChR2 fuzionat cu EYFP (hChR2-EYFP). După 110 zile, am observat expresia EYFP în regiunile corticale ipsilaterale, inclusiv cortexul auditiv, motor și somatosenzorial, precum și în regiunile subcorticale, inclusiv striatumul, hipocampul și talamusul (Fig. 5a). Pentru a evalua dacă aceste proiecții eferente ar putea provoca răspunsuri sinaptice în celulele de șobolan, am activat optic celulele t-hCO care exprimă hChR2-EYFP prin înregistrarea celulelor cortexului cerebral de șobolan în secțiuni cerebrale clare. Activarea axonilor t-hCO cu lumină albastră a indus EPSC-uri cu latență scurtă în neuronii cortexului piramidal de șobolan, care au fost blocați de NBQX (Fig. 5b-g). În plus, aceste răspunsuri ar putea fi blocate de tetrodotoxină (TTX) și restabilite de 4-aminopiridină (4-AP), ceea ce sugerează că au fost cauzate de conexiuni monosinaptice (Fig. 5e).
a, Diagramă schematică a urmăririi axonilor (stânga). Expresia t-hCO EYFP (dreapta). Bara de scală, 100 µm. A1, cortex auditiv, ACC, cortex cingular anterior, d. striat, striat dorsal, HPC, hipocampus; Diafragmă, sept lateral, mPFC, cortex prefrontal medial, piri, cortex piriform, v. striat, striat ventral, VPM, nucleul ventropostomedial al talamusului, VTA, regiunea tegmentală ventrală. Pătratele roșii reprezintă zonele creierului unde au fost realizate imaginile. b, Diagramă schematică a experimentului de stimulare. c, d, Exemple de răspuns al fotocurentului indus de lumină albastră (sus) și voltajului (jos) în celulele EYFP+ t-hCO umane (c) sau EYFP- de șobolan (d). e, f, Urme actuale ale neuronilor de șobolan după stimularea cu lumină albastră a axonilor t-hCO cu TTX și 4-AR (verde), TTX (gri) sau aCSF (negru) (e), cu (violet) sau fără (negru)) ) NBQX (e). g, latența răspunsurilor induse de lumină albastră în celulele de șobolan (n = 16 celule); barele orizontale indică latența medie (7,13 ms) (stânga). Amplitudinea EPSC-urilor evocate de lumină înregistrate cu sau fără NBQX (n = 7 celule; ***P < 0,0001) (mijloc). Amplitudinea EPSC-urilor evocate de lumină înregistrate cu sau fără NBQX (n = 7 celule; ***P < 0,0001) (mijloc). Амплитуда вызванных светом EPSC, зарегистрированных с или без NBQX (n = 7 клеток; ***P <0,0001) (в трецен). Amplitudinea EPSC-urilor induse de lumină înregistrate cu sau fără NBQX (n = 7 celule; ***P < 0,0001) (centru).使用或不使用NBQX 记录的光诱发EPSC 的振幅（n = 7 个细胞；***P < 0,0001）（中）。使用或不使用NBQX 记录的光诱发EPSC 的振幅（n = 7 个细胞；***P < 0,0001）（中）。 Амплитуда вызванных светом EPSC, зарегистрированных с или без NBQX (n = 7 клеток; ***P <0,0001) (в трецен). Amplitudinea EPSC-urilor induse de lumină înregistrate cu sau fără NBQX (n = 7 celule; ***P < 0,0001) (centru).Procentul de celule de șobolan care prezintă EPSC-uri care răspund la lumina albastră (dreapta). h, Diagramă schematică a unei sarcini comportamentale. d0, ziua 0. i. Performanța animalelor exemplare în ziua 1 (stânga) sau ziua 15 (dreapta) de antrenament. Numărul mediu de lingeri efectuate în ziua 1 (stânga) sau în ziua 15 (centru dreapta) (n = 150 de încercări cu lumină albastră, n = 150 de încercări cu lumină roșie; ***P < 0,0001). Numărul mediu de lingeri efectuate în ziua 1 (stânga) sau în ziua 15 (centru dreapta) (n = 150 de încercări cu lumină albastră, n = 150 de încercări cu lumină roșie; ***P < 0,0001). Среднее количество облизываний, выполненных в день 1 (слева) или день 15 (в центре справа 150 (в центре справа150) синим светом, n = 150 испытаний с красным светом ***P <0,0001). Numărul mediu de lingeri efectuate în ziua 1 (stânga) sau în ziua 15 (centru dreapta) (n = 150 de încercări cu lumină albastră, n = 150 de încercări cu lumină roșie; ***P < 0,0001).第1 天（左）或第15 天（右中）执行的平均舔次数（n = 150 次蓝光试验（n = 150次红光试验；***P < 0,0001）。第1 天（左）或第15 天（右中）执行的平均舔次数（n = 150 次蓝光试验（n = 150次红光试验；***P < 0,001 Среднее количество облизываний, выполненных в день 1 (слева) или день 15 (в центре справа 150 (в центре справа150) синим светом, n = 150 испытаний с красным светом ***P <0,0001). Numărul mediu de lingeri efectuate în ziua 1 (stânga) sau în ziua 15 (centru dreapta) (n = 150 de încercări cu lumină albastră, n = 150 de încercări cu lumină roșie; ***P < 0,0001).Lingeri cumulative pentru testele cu lumină roșie și albastră în ziua 1 (centru stânga) sau ziua 15 (dreapta). NS, nesemnificativ. j,k, Caracteristici comportamentale ale tuturor animalelor transplantate cu t-hCO care exprimă hChR2-EYFP (j) sau fluorofor de control (k) în ziua 1 sau 15 (hChR2-EYFP: n = 9 șobolani, ** P = 0,0049; control: n = 9, P = 0,1497). l, Evoluția scorului de preferință (n = 9 hChR2, n = 9 control; **P < 0,001, ***P < 0,0001). l, Evoluția scorului de preferință (n = 9 hChR2, n = 9 control; **P < 0,001, ***P < 0,0001). l, Эволюция показателя предпочтения (n = 9 hChR2, n = 9 контрольных; **P <0,001, ***P <0,0001). l, Evoluția scorului de preferință (n = 9 hChR2, n = 9 controale; **P < 0,001, ***P < 0,0001). l，偏好评分的演变（n = 9 hChR2，n = 9 对照；**P < 0,001，***P < 0,0001）。 l，偏好评分的演变（n = 9 hChR2，n = 9 对照；**P < 0,001，***P < 0,0001）。 l, Эволюция показателей предпочтения (n = 9 hChR2, n = 9 контролей; **P <0,001, ***P <0,0001). l, Evoluția scorurilor de preferință (n = 9 hChR2, n = 9 controale; **P < 0,001, ***P < 0,0001).m, expresia FOS ca răspuns la activarea optogenetică a t-hCO în S1. Sunt prezentate imagini cu expresia FOS (stânga) și cuantificarea (n = 3 per grup; *P < 0,05, **P < 0,01 și ***P < 0,001) (dreapta). Sunt prezentate imagini cu expresia FOS (stânga) și cuantificarea (n = 3 per grup; *P < 0,05, **P < 0,01 și ***P < 0,001) (dreapta). Показаны изображения экспрессии FOS (слева) и количественного определения (n = 3 на групрессии, * P*** <0,0 5, * P** <0,0 5 P** P*** <0,001) (справа). Imaginile expresiei FOS (stânga) și ale cuantificării (n = 3 per grup; *P<0,05, **P<0,01 și ***P<0,001) sunt prezentate (dreapta).显示了FOS 表达（左）和量化（每组n = 3；*P < 0,05、**P < 0,01 和***P < 0,001）（叄右）显示了FOS 表达（左）和量化（每组n = 3；*P < 0,05、**P < 0,01 和***P < 0,001）（叄右） Показаны изображения экспрессии FOS (слева) и количественного определения (n = 3 на групрессии, * P*** <0,0 5, * P** <0,0 5 P** P*** <0,001) (справа). Imaginile expresiei FOS (stânga) și ale cuantificării (n = 3 per grup; *P<0,05, **P<0,01 și ***P<0,001) sunt prezentate (dreapta).Bara de scală, 100 µm. Datele sunt exprimate ca medie ± eroare standard a BLA, amigdalei bazolaterale, MDT, nucleului talamic dorsomedial, PAG, cenușiu periaqueductal.
În cele din urmă, ne-am întrebat dacă t-hCO ar putea modula comportamentul șobolanilor. Pentru a testa acest lucru, am transplantat hCO care exprimă hChR2-EYFP în S1, iar 90 de zile mai târziu, am implantat fibre optice în t-hCO pentru livrarea de lumină. Apoi, am antrenat șobolanii cu o paradigmă de condiționare operantă modificată (Fig. 5h). Am plasat animalele într-o cameră de testare comportamentală și am aplicat aleatoriu stimuli laser albaștri (473 nm) și roșii (635 nm) timp de 5 secunde. Animalele au primit o recompensă cu apă dacă au lins în timpul stimulării cu lumină albastră, dar nu au lins în timpul stimulării cu lumină roșie. În prima zi de antrenament, animalele nu au prezentat nicio diferență în ceea ce privește linsul atunci când au fost stimulate cu lumină albastră sau roșie. Cu toate acestea, în ziua 15, animalele transplantate cu hCO care exprimă hChR2-EYFP au prezentat un lins mai activ atunci când au fost stimulate cu lumină albastră, comparativ cu stimularea cu lumină roșie. Aceste modificări ale comportamentului de lins nu au fost observate la animalele de control transplantate cu hCO care exprimă fluoroforul de control (rata de succes a învățării: hChR2 89%, EYFP 0%, Figura 5i-1 și Video suplimentar 2). Aceste date sugerează că celulele t-hCO pot activa neuronii de șobolan pentru a stimula comportamentul de căutare a recompensei. Pentru a afla ce circuite neuronale t-hCO de șobolan ar putea fi implicate în aceste modificări comportamentale, am activat optogenetic t-hCO la animale antrenate și am recoltat țesuturi 90 de minute mai târziu. Imunohistochimia a relevat exprimarea proteinei FOS dependente de activitate în mai multe regiuni ale creierului implicate în comportamentul motivat, inclusiv cortexul prefrontal medial, talamusul medial și materia cenușie periaqueductală, care a fost exprimată fie la animalele de control nestimulate, fie la animale. orez. 5m). Luate împreună, aceste date sugerează că t-hCO poate modula activitatea neuronală a șobolanului pentru a determina comportamentul.
Organoizii neuronali reprezintă un sistem promițător pentru studierea dezvoltării umane și a bolilor in vitro, dar sunt limitați de lipsa conexiunilor dintre circuite care există in vivo. Am dezvoltat o platformă nouă în care am transplantat hCO în S1 de șobolani imunocompromiși în perioada postnatală timpurie pentru a studia dezvoltarea și funcția celulelor umane in vivo. Am demonstrat că t-hCO dezvoltă tipuri de celule mature care nu au fost observate in vitro28 și că t-hCO este integrat anatomic și funcțional în creierul rozătoarelor. Integrarea t-hCO în circuitele neuronale ale rozătoarelor ne-a permis să stabilim o legătură între activitatea celulară umană și comportamentul animal studiat, arătând că neuronii t-hCO pot modula activitatea neuronală a șobolanului pentru a stimula răspunsurile comportamentale.
Platforma pe care o descriem are mai multe avantaje față de cercetările anterioare privind transplantul de celule umane în creierul rozătoarelor. În primul rând, am transplantat hCO₂ în cortexul în curs de dezvoltare al șobolanilor în perioada postnatal timpurie, ceea ce poate facilita integrarea anatomică și funcțională. În al doilea rând, monitorizarea RMN cu t-hCO₂ ne-a permis să studiem poziția și creșterea grefei la animale vii, permițându-ne să efectuăm studii pe termen lung pe mai multe animale și să stabilim fiabilitatea mai multor linii celulare hiPS. În cele din urmă, am transplantat organoizi intacți, în loc de suspensii de celule individuale izolate, care sunt mai puțin distructive pentru celulele umane și pot promova integrarea și generarea de neuroni din cortexul uman în creierul șobolanilor.
Recunoaștem că, în ciuda progreselor înregistrate în această platformă, constrângerile temporale, spațiale și interspecifice împiedică formarea circuitelor neuronale umane cu fidelitate ridicată, chiar și după transplant într-un stadiu incipient de dezvoltare. De exemplu, nu este clar dacă activitatea spontană observată în t-hCO reprezintă un fenotip de dezvoltare similar cu activitatea ritmică observată în timpul dezvoltării corticale sau dacă se datorează absenței tipurilor de celule supresoare prezente în t-hCO. În mod similar, nu este clar în ce măsură absența laminării în t-hCO afectează conectivitatea lanțului30. Lucrările viitoare se vor concentra pe integrarea altor tipuri de celule, cum ar fi microglia umană, celulele endoteliale umane și proporții variabile de interneuroni GABAergici, așa cum se arată folosind asamblarea 6 in vitro, precum și pe înțelegerea modului în care integrarea și procesarea neuronală pot avea loc la niveluri alterate de t-hCO, transcripționale, sinaptice și comportamentale în celulele obținute de la pacienți.
Per total, această platformă in vivo reprezintă o resursă puternică ce poate completa dezvoltarea in vitro a creierului uman și cercetarea bolilor. Anticipăm că această platformă ne va permite să descoperim noi fenotipuri la nivel de catenă în celule derivate de la pacienți, altfel dificil de identificat, și să testăm noi strategii terapeutice.
Am generat hCO2.5 din celule HiPS așa cum s-a descris anterior. Pentru a iniția producția de hCO din celulele hiPS cultivate pe straturi de alimentare, coloniile intacte de celule hiPS au fost îndepărtate din plăcile de cultură folosind dispază (0,35 mg/mL) și transferate în culturi din plastic cu atașament ultra-scăzut conținând plăci cu mediu de cultură celulară hiPS (Corning) suplimentat cu doi inhibitori SMAD, dorsomorfină (5 μM; P5499, Sigma-Aldrich) și SB-431542 (10 μM; 1614, Tocris) și inhibitorul ROCK Y-27632 (10 μM; S1049, Selleckchem). În primele 5 zile, mediul celular hiPS a fost schimbat zilnic și s-au adăugat dorsomorfină și SB-431542. În a șasea zi de suspensie, sferoizii neuronali au fost transferați într-un mediu neuronal conținând neurobasal-A (10888, Life Technologies), supliment B-27 fără vitamina A (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies), penicilină și streptomicină (1:100, Life Technologies) și suplimentat cu factorul de creștere epidermal (EGF; 20 ng ml−1; R&D Systems) și factorul de creștere a fibroblastelor 2 (FGF2; 20 ng ml−1; R&D Systems) până în ziua 24. Din ziua 25 până în ziua 42, mediul a fost suplimentat cu factor neurotrofic derivat din creier (BDNF; 20 ng ml−1, Peprotech) și neurotrofină 3 (NT3; 20 ng ml−1; Peprotech) cu schimbări de mediu o dată la două zile. În a șasea zi de suspensie, sferoizii neuronali au fost transferați într-un mediu neuronal conținând neurobasal-A (10888, Life Technologies), supliment B-27 fără vitamina A (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies), penicilină și streptomicină (1:100, Life Technologies) și suplimentat cu factorul de creștere epidermal (EGF; 20 ng ml−1; R&D Systems) și factorul de creștere a fibroblastelor 2 (FGF2; 20 ng ml−1; R&D Systems) până în ziua 24. Din ziua 25 până în ziua 42, mediul a fost suplimentat cu factor neurotrofic derivat din creier (BDNF; 20 ng ml−1, Peprotech) și neurotrofină 3 (NT3; 20 ng ml−1; Peprotech) cu schimbări de mediu o dată la două zile.În a șasea zi de suspendare, sferoizii neuronali au fost transferați într-un mediu neuronal conținând Neurobasal-A (10888, Life Technologies), supliment B-27 fără vitamina A (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies), penicilină.și стрептомицин (1:100, Life Technologies) și дополнены эпидермальным фактором роста (EGF; 20 нг/мл; R&D Systems) și фактором роста (EGF; 20 нг/мл; R&D Systems) și фактором роста фибробластов 2 (FGF2; 20 нг/мл; R&D Systems) până la 24-го дня. și streptomicină (1:100, Life Technologies) și suplimentate cu factor de creștere epidermală (EGF; 20 ng/ml; R&D Systems) și factor de creștere a fibroblastelor 2 (FGF2; 20 ng/ml; R&D Systems) până în ziua 24.Din zilele 25 până în zilele 42, factorul neurotrofic derivat din creier (BDNF; 20 ng ml-1, Peprotech) și neurotrofina 3 (NT3; 20 ng ml-1, Peprotech) au fost adăugate în mediu, schimbând mediul o dată la două zile.在悬浮的第6 天，将神经球体转移到含有neurobasal-A（10888，Life Technologies）、不含维生素-A27补充剂（12587，Life Technologies）、GlutaMax（1:100，Life Technologies）、青霉素的神经培养基中和链霉（Life:1000 Tehnologii）并辅以表皮生长因子（EGF；20 ng ml-1；R&D Sisteme）和成纤维细胞生长因子2（FGF2；20 ng ml-1；R&D Systems）直至第24 天。在 悬浮 的 第 第 6 天 将 神经 球体 转移 含有 含有 neurobazal-a (10888) b-27 补充剂 （12587 ， Life Technologies） Glutamax （1: 100 ， Life TechNOGIS青霉素 的 神经 培养 基 中 链 （ （ 链 ， （ 10 （ （ 100 Tehnologii） 表皮 生长 因子 （（（20 ng ml-1 ； R&D Systems） 成 纤维 细胞 生长 2 （fgf2 ； 20 ng ml- 1；R&D Systems）直至穬24嬀 На 6-й день суспензии нейросферы были переведены на добавку, содержащую нейробаферы (Life Technologies), Н10ведены на добавку В-27 без витамина А (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies), пенициллин- нейтрализованный стрептомицин, Life Technologies (1:1000) добавлением эпидермального фактора роста (EGF; 20 нг мл-1; R&D Systems) și фактора роста фибробластов 2 (FGF2; 20 нг мл-1) 1; În ziua 6, suspensiile de neurosfere au fost trecute la un supliment care conține neurobasal-A (10888, Life Technologies), supliment B-27 fără vitamina A (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies), streptomicină neutralizată cu penicilină (1:100, Life Technologies) suplimentat cu factor de creștere epidermală (EGF; 20 ng ml-1; R&D Systems) și factor de creștere a fibroblastelor 2 (FGF2; 20 ng ml-1)1; R&D Systems) до 24-го дня. Sisteme de cercetare și dezvoltare) până în ziua 24.Din zilele 25 până în zilele 42, factorul neurotrofic derivat din creier (BDNF; 20 ng ml-1, Peprotech) și factorul neurotrofic 3 (NT3; 20 ng ml-1, Peprotech) au fost adăugați în mediul de cultură o dată la două zile. Mediul se schimbă o dată.Începând cu ziua 43, hCO a fost menținut în mediu neurobazal-A nesuplimentat (NM; 1088022, Thermo Fisher) cu schimbarea mediului la fiecare 4-6 zile. Pentru a obține hCO din celule hiPS cultivate în condiții feederless, celulele hiPS au fost incubate cu Accutase (AT-104, Innovate Cell Technologies) la 37°C timp de 7 minute, disociate în celule individuale și plasate pe plăci AggreWell 800 (34815, STEMCELL Technologies) la o densitate de 3 × 106 celule individuale per godeu în mediu Essential 8 suplimentat cu inhibitorul ROCK Y-27632 (10 μM; S1049, Selleckchem). După 24 de ore, mediile din godeuri au fost pipetate în sus și în jos în medii conținând mediu Essential 6 (A1516401, Life Technologies) suplimentat cu dorsomorfină (2,5 μM; P5499, Sigma-Aldrich) și SB-431542 (10 μM; 1614, Tocrida). Din zilele 2 până în 6, mediul Essential 6 a fost înlocuit zilnic cu dorsomorfină și supliment SB-431542. Din a șasea zi, suspensiile de neurosfere au fost transferate în mediul neurobazal și menținute așa cum s-a descris mai sus.
Toate procedurile efectuate pe animale au fost efectuate în conformitate cu ghidurile de îngrijire a animalelor aprobate de Comitetul Administrativ pentru Îngrijirea Animalelor de Laborator (APLAC) al Universității Stanford. Șobolanii eutimici RNU (rnu/+) gestanți au fost achiziționați (Charles River Laboratories) sau adăpostiți. Animalele au fost ținute într-un ciclu lumină-întuneric de 12 ore, cu hrană și apă ad libitum. Puii de șobolan nud (FOXN1–/–) cu vârsta cuprinsă între trei și șapte zile au fost identificați după creșterea mustăților imature înainte de sacrificare. Puii (masculi și femele) au fost anesteziați cu 2-3% izofluran și plasați pe un cadru stereotaxic. S-a efectuat o trepanare a craniului cu un diametru de aproximativ 2-3 mm peste S1, menținând în același timp integritatea durei mater. Apoi, s-a folosit un ac de 30-G (aproximativ 0,3 mm) chiar în afara craniotomiei pentru a perfora durema mater. Apoi, s-a aplicat HCO3 pe un parafilm subțire de 3×3 cm și s-a îndepărtat excesul de mediu. Folosind o seringă Hamilton atașată la un ac de calibru 23 G, 45°, trageți ușor hCO3 în capătul cel mai distal al acului. Apoi instalați seringa pe pompa de seringă conectată la dispozitivul stereotaxic. Apoi, plasați vârful acului peste un orificiu de puncție de 0,3 mm lățime, realizat anterior în dura mater (z = 0 mm) și îngustați seringa cu 1-2 mm (z = aproximativ –1,5 mm) până când acul se află între dura mater A. Se formează o etanșare densă. Apoi, ridicați seringa în centrul suprafeței corticale la z = -0,5 mm și injectați hCO3 cu o rată de 1-2 µl pe minut. După finalizarea injecției cu hCO3, acul este retras cu o rată de 0,2-0,5 mm pe minut, pielea este suturată, iar cățelușul este imediat plasat pe o pernă încălzitoare până la recuperarea completă. Unele animale au fost transplantate bilateral.
Toate procedurile efectuate pe animale au fost efectuate în conformitate cu ghidurile de îngrijire a animalelor aprobate de Universitatea Stanford, APLAC. Șobolanii (la mai mult de 60 de zile după transplant) au fost anesteziați cu izofluran 5% și anesteziați cu izofluran 1-3% în timpul imagisticii. Pentru vizualizare, s-a utilizat un scaner orizontal de sondă Bruker (Bruker Corp.) cu ecranare activă de 7 Tesla, cu un acționare în gradient de la International Electric Company (IECO), un insert de gradient ecranat cu un diametru intern de 120 mm (600 mT/m, 1000 T/m/s) utilizând AVANCE.III, RF multi-bobină cu opt canale și capacități multi-core și platforma Paravision 6.0.1 însoțitoare. Înregistrarea a fost efectuată utilizând o bobină RF volumetrică decuplată activ cu un diametru intern de 86 mm și o bobină RF răcită criogenic cu patru canale, numai pentru recepție. Turbo-RARE axial 2D (timp de repetiție = 2500 ms, timp de ecou = 33 ms, 2 medii) cu 16 capturi de secțiune, grosimea secțiunii 0,6–0,8 mm, conținând 256 × 256 eșantioane. Semnalele au fost recepționate utilizând o bobină RF volumetrică de tip transceiver în cuadratură cu un diametru intern de 2 cm (Rapid MR International, LLC). În final, s-au utilizat funcțiile de estimare a suprafeței Imaris (BitPlane) încorporate pentru randare 3D și analiza volumului. Un transplant reușit a fost definit ca acela în care s-au format zone de semnal RMN ponderat T2 continuu în emisfera transplantată. Respingerea grefei a fost definită ca o grefă care nu a produs zone de semnal RMN ponderat T2 continuu în emisfera transplantată. t-hCO subcortical a fost exclus din analiza ulterioară.
Pentru a exprima stabil GCaMP6s în hCO₃ pentru imagistica calciului cu doi fotoni, celulele hiPS au fost infectate cu pLV[Exp]-EF1a::GcaMP6s-WPRE-Puro, urmată de selectarea antibioticelor. Pe scurt, celulele au fost disociate cu EDTA și suspendate în 1 ml de mediu Essential 8 la o densitate de aproximativ 300.000 de celule în prezența polibrenei (5 μg/ml) și 15 μl de virus. Celulele au fost apoi incubate în suspensie timp de 60 de minute și însămânțate la o densitate de 50.000 de celule per godeu. După confluență, celulele au fost tratate cu 5-10 μg ml-1 puromicină timp de 5-10 zile sau până la apariția coloniilor stabile. Infecția acută cu hCO₃ a fost efectuată așa cum s-a descris anterior5, cu unele modificări. Pe scurt, se transferă hCO₃ în ziua 30-45 în tuburi de microcentrifugă Eppendorf de 1,5 ml conținând 100 µl de mediu nervos. Apoi, se îndepărtează aproximativ 90 µl din mediu, se adaugă în eprubetă 3-6 µl de lentivirus cu titru ridicat (de la 0,5 x 108 la 1,2 x 109), iar hCO3 se transferă în incubator timp de 30 de minute. Se adaugă apoi 90-100 µl de mediu în fiecare eprubetă și se pun eprubetele înapoi în incubator peste noapte. A doua zi, se transferă hCO3 în mediu nervos proaspăt în plăci cu atașament redus. După 7 zile, hCO3 a fost transferat pe plăci cu fund de sticlă cu 24 de godeuri pentru vizualizare și evaluarea calității infecției. pLV[Exp]-SYN1::EYFP-WPRE și pLV[Exp]-SYN1::hChR2-EYFP-WPRE au fost generate de VectorBuilder. Lentivirusul este utilizat în majoritatea experimentelor deoarece este integrat în genomul gazdă, permițând exprimarea genei reporter în liniile celulare infectate. Pentru urmărirea cazurilor de rabie, în ziua 30-45, hCO a fost co-infectat cu rabies-ΔG-eGFP și AAV-DJ-EF1a-CVS-G-WPRE-pGHpA (plasmida #67528, Addgene), spălat bine timp de 3 zile și transplantat la șobolani în S1 și menținut in vivo timp de 7-14 zile.
Pentru imunocitochimie, animalele au fost anesteziate și perfuzate transcardial cu PBS, urmat de paraformaldehidă 4% (PFA în PBS; Electron Microscopy Sciences). Creierele au fost fixate în PFA 4% timp de 2 ore sau peste noapte la 4°C, crioconservate în zaharoză 30% în PBS timp de 48-72 de ore și incluse în zaharoză 30%:OCT (Tissue-Tek OCT Compound 4583, Sakura Finetek) în raport 1:1, iar secțiunile coronale au fost realizate la 30 µm folosind un criostat (Leica). Pentru imunohistochimia secțiunilor groase, animalele au fost perfuzate cu PBS, iar creierul a fost disecat și secționat coronal la 300-400 µm folosind un vibratom (Leica), iar secțiunile au fost fixate cu PFA 4% timp de 30 de minute. Apoi, criosecțiunile sau secțiunile groase au fost spălate cu PBS, blocate timp de 1 oră la temperatura camerei (10% ser normal de măgar (NDS) și 0,3% Triton X-100 diluat în PBS) și blocate cu soluție de blocare la 4°C. – Incubare Criosecțiunile au fost incubate peste noapte, iar secțiunile groase au fost incubate timp de 5 zile. Anticorpii primari utilizați au fost: anti-NeuN (șoarece, 1:500; ab104224, abcam) anti-CTIP2 (șobolan, 1:300; ab18465, abcam), anti-GFAP (iepure, 1:1.000; Z0334, Dako), anti-GFP (pui, 1:1.000; GTX13970, GeneTex), anti-HNA (șoarece, 1:200; ab191181, abcam), anti-NeuN (iepure, 1:500; ABN78, Millipore), anti-PDGFRA (iepure, 1:200; sc-338, Santa Cruz), anti-PPP1R17 (iepure, 1:200; HPA047819, Atlas Antibodies), anti-RECA-1 (șoarece, 1:50; ab9774, abcam), anti-SCG2 (iepure, 1:100; 20357-1-AP, Proteintech), anti-SOX9 (capră, 1:500; AF3075, R&D Systems), Netrin G1a (capră, 1:100; AF1166, R&D Systems), anti-STEM121 (șoarece, 1:200; Y40410, Takara Bio), anti-SATB2 (șoarece, 1:50; ab51502, abcam), anti-GAD65/67 (iepure, 1:400; ABN904, Millipore) și anti-IBA1 (capră, 1:100; ab5076, abcam). Anticorpii primari utilizați au fost: anti-NeuN (șoarece, 1:500; ab104224, abcam) anti-CTIP2 (șobolan, 1:300; ab18465, abcam), anti-GFAP (iepure, 1:1.000; Z0334, Dako), anti-GFP (pui, 1:1.000; GTX13970, GeneTex), anti-HNA (șoarece, 1:200; ab191181, abcam), anti-NeuN (iepure, 1:500; ABN78, Millipore), anti-PDGFRA (iepure, 1:200; sc-338, Santa Cruz), anti-PPP1R17 (iepure, 1:200; HPA047819, Atlas Antibodies), anti-RECA-1 (șoarece, 1:50; ab9774, abcam), anti-SCG2 (iepure, 1:100; 20357-1-AP, Proteintech), anti-SOX9 (capră, 1:500; AF3075, R&D Systems), Netrin G1a (capră, 1:100; AF1166, R&D Systems), anti-STEM121 (șoarece, 1:200; Y40410, Takara Bio), anti-SATB2 (șoarece, 1:50; ab51502, abcam), anti-GAD65/67 (iepure, 1:400; ABN904, Millipore) și anti-IBA1 (capră, 1:100; ab5076, abcam). Использовались следующие первичные антитела: анти-NeuN (мышиные, 1:500; ab104224, abcam), анти-CTIP:12нка ab18465, abcam), анти-GFAP (кроличьи, 1:1000; Z0334, Dako), анти- -GFP (курица, 1:1000; GTX13970, GeneTex), анти-HNA (,м,191шь (,м,1912ь), abcam), анти-NeuN (кролик, 1:500; ABN78, Millipore), анти-PDGFRA (кролик, 1:200; sc-338, Санта-Круз), анти-PPP1R17 (кролик, 1:200; HPA047819, Atlas Antibodies), анти-RECA-1 (мыш40, ab9775ь, ab9775ь, ab977819; анти-SCG2 (кролик , 1:100; 20357-1-AP, Proteintech), анти-SOX9 (козий, 1:500; AF3075, R&D Systems), нетрин G1a (коз110й, ;, 11160), анти-SCG2 анти-STEM121 (мышиный , 1:200; Y40410, Takara Bio), анти-SATB2 (мышь, 1:50; ab51502, abcam), анти-GAD65/67 (кролик, 1:400; ABN904, Millipore) și анти-IBA1 (коза, 1:100; абббак, абб5076, мабка). Anticorpii primari utilizați au fost: anti-NeuN (șoarece, 1:500; ab104224, abcam), anti-CTIP2 (șobolan, 1:300; ab18465, abcam), anti-GFAP (iepure, 1:1000; Z0334, Dako), anti-GFP (pui, 1:1000; GTX13970, GeneTex), anti-HNA (șoarece, 1:200; ab191181, abcam), anti-NeuN (iepure, 1:500; ABN78, Millipore), anti-PDGFRA (iepure, 1:200; sc-338, Santa Cruz), anti-PPP1R17 (iepure, 1:200; HPA047819, Atlas Antibodies), anti-RECA-1 (șoarece, 1:50; ab9774, abcam), anti-SCG2 (iepure, 1:100; 20357-1-AP, Proteintech), anti-SOX9 (capră, 1:500; AF3075, R&D Systems), netrin G1a (capră, 1:100; AF1166, R&D Systems), anti-STEM121 (șoarece, 1:200; Y40410, Takara Bio), anti-SATB2 (șoarece, 1:50; ab51502, abcam), anti-GAD65/67 (iepure, 1:400; ABN904, Millipore) și anti-IBA1 (capră, 1:100; ab5076, abkam).使用的一抗是：抗NeuN（小鼠，1:500；ab104224，abcam）抗CTIP2（大鼠，1:3 00；ab18465，abcam），抗GFAP（兔，1:1,000；Z0334，Dako），抗-GF P（鸡，1:1.000；GTX13970，GeneTex），抗HNA（小鼠，1:200；ab1911 81，abcam），抗NeuN（兔，1:500；ABN78，Millipore），抗PDGFRA（兔， 1:200；sc-338，Santa Cruz），抗PPP1R17（兔，1:200；HPA047819，Atlas抗体），抗RECA-1（小鼠，1:50；ab9774，abcam），抗SCG2（兔） , 1:100；20357-1-AP，Proteintech），抗SOX9（山羊，1:500；AF3075，R&D Systems），Netrin G1a（山羊（山羊，1:10106；AF1006； Systems），抗STEM121（小鼠, 1:200;使用的一抗是：抗NeuN（小鼠，1:500；ab104224，abcam）抗CTIP2（大鼠，1 :300；ab18465，abcam），抗GFAP（兔，1:1,000；Z0334，Dako），抗-GFP（鸡，1:1.000；GTX13970，GeneTex），抗HNA（小鼠，1:200；ab 191181，abcam），抗NeuN（兔，1:500；ABN78，Millipore％弔，抗1: 200；sc-338，Santa Cruz），抗PPP1R17（兔，1:200；HPA047819，Atlas抗体），抗RECA-1（小鼠，1:50；ab9774，abcam），抗SCG2 100；20357-1-AP，Protetech），抗SOX9（山羊，1:500；AF3075，R&D Systems），Netrin G1a（山羊（山羊；1:1006；AFR&D； Sisteme）頏1:20, ;Y40410, Takara Bio), anti-SATB2 (șoarece, 1:50; ab51502, abcam), anti-GAD65/67 (iepure, 1:400; ABN904, Millipore) și anti-IBA1 (capră, 1:100; ab5076, abcam).Anticorpii primari utilizați au fost: anti-NeuN (șoarece, 1:500; ab104224, abcam), anti-CTIP2 (șobolan, 1:300; ab18465, abcam), anti-GFAP (iepure, 1:1000; Z0334, Dako). , anti-GFP (pui, 1:1000; GTX13970, GeneTex), anti-HNA (șoarece, 1:200; ab191181, abcam), anti-NeuN (iepure, 1:500; ABN78, Millipore), anti-PDGFRA (iepure, 1:200; sc-338, Santa Cruz), anti-PPP1R17 (iepure, 1:200; HPA047819, anticorp Atlas), anti-RECA-1 (șoarece, 1:50; ab9774, abcam), anti-SCG2 (iepure), 1:100;20357-1-AP, Proteintech), анти-SOX9 (коза, 1:500; AF3075, R&D Systems), Нетрин G1a (коза, 1:100; AF1166, R&D Systems), анти (;мы12ь, -STEM,; Y40410, Takara Bio), анти-SATB2 (мышь, 1:50; ab51502, abcam), анти-GAD65/67 (кролик, 1:400; ABN904, Millipore) și анти-IBA1, (; кролик, 1:400; абкам). 20357-1-AP, Proteintech), anti-SOX9 (capră, 1:500; AF3075, R&D Systems), Netrin G1a (capră, 1:100; AF1166, R&D Systems), anti-STEM121 (șoarece, 1:200; Y40410, Takara Bio), anti-SATB2 (șoarece, 1:50; ab51502, abcam), anti-GAD65/67 (iepure, 1:400; ABN904, Millipore) și anti-IBA1 (capră, 1:100; ab5076, abkam).Secțiunile au fost apoi spălate cu PBS și incubate cu anticorp secundar timp de 1 oră la temperatura camerei (secțiuni congelate) sau peste noapte la 4°C (secțiuni groase). S-a utilizat anticorp secundar Alexa Fluor (Life Technologies) diluat 1:1000 în soluție de blocare. După spălarea cu PBS, nucleele au fost vizualizate cu un microscop Hoechst 33258 (Life Technologies). În final, lamele au fost plasate pe un microscop cu lamele (Fisher Scientific) folosind un Aquamount (Polysciences) și analizate pe un microscop fluorescent Keyence (analizator BZ-X) sau un microscop confocal Leica TCS SP8 (Las-X) pe imagine. Imaginile au fost procesate folosind programul ImageJ (Fiji). Pentru a cuantifica proporția de neuroni umani din t-hCO și cortexul de șobolan, au fost realizate imagini dreptunghiulare cu lățimea de 387,5 μm în centrul t-hCO, la sau în apropierea marginii cortexului de șobolan. Marginile grefei au fost determinate prin evaluarea modificărilor transparenței țesuturilor, a nucleilor HNA+ și/sau a prezenței autofluorescenței țesuturilor. În fiecare imagine, numărul total de celule NeuN+ și HNA+ a fost împărțit la numărul total de celule NeuN+ din aceeași zonă. Pentru a se asigura că sunt numărate doar celulele cu nuclei în planul imaginii, în calcul sunt incluse doar celulele care sunt și Hoechst+. Două imagini separate de cel puțin 1 mm au fost mediate pentru a reduce eroarea statistică.
Cu o săptămână înainte de colectarea probei, animalele transplantate cu hCO3 (aproximativ 8 luni de diferențiere) au fost plasate într-o cameră întunecată, cu mustățile tăiate pentru a minimiza stimularea senzorială. Izolarea nucleilor a fost efectuată așa cum s-a descris anterior, cu unele modificări. Pe scurt, t-hCO3 și hCO3 au fost distruse folosind liza celulară mecanică cu detergent și un aparat de măcinat țesut din sticlă de 2 ml (D8938, Sigma-Aldrich/KIMBLE). Nucleii brute au fost apoi filtrați folosind un filtru de 40 µm și centrifugați la 320 g timp de 10 minute la 4 °C înainte de a efectua un gradient de densitate a zaharozei. După etapa de centrifugare (320 g timp de 20 min la 4°C), probele au fost resuspendate în 0,04% BSA/PBS cu adăugarea a 0,2 unități de inhibitor de RNază µl-1 (40 u µl-1, AM2682, Ambion) și trecute printr-un filtru de flux de 40 µm. Nucleii disociați au fost apoi resuspendați în PBS conținând 0,02% BSA și încărcați pe un cip Chromium Single Cell 3′ (recuperare estimată de 8.000 de celule pe bandă). Bibliotecile snRNA-seq au fost preparate cu ajutorul kitului Chromium Single cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics). Bibliotecile snRNA-seq au fost preparate cu ajutorul kitului Chromium Single cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics). Библиотеки snRNA-seq были приготовлены с помощью Chromium Single cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics). Bibliotecile snRNA-seq au fost preparate folosind Chromium Single cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics). snRNA-seq 文库是使用Chromium Single cell 3′ GEM、Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics) 制备的。 snRNA-seq 文库是使用Chromium Single cell 3′ GEM、Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics) 制备的。 Библиотеку snRNA-seq готовили с использованием Chromium Single Cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics). Biblioteca snRNA-seq a fost preparată folosind Chromium Single Cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics).Bibliotecile din diferite probe au fost grupate și secvențiate de Admera Health pe NovaSeq S4 (Illumina).
Nivelurile de expresie genică pentru fiecare cod de bare nuclear prezumtiv au fost cuantificate utilizând pachetul software de analiză 10x Genomics CellRanger (versiunea 6.1.2). Mai exact, citirile au fost comparate cu o combinație de genomuri de referință umane (GRCh38, Ensemble, versiunea 98) și de șobolan (Rnor_6.0, Ensemble, versiunea 100) create cu comanda mkref și utilizând comanda –include-introns=TRUE pentru cuantificare, incluzând citirile mapate în regiunile intronilor. Pentru probele de t-hCO, nucleele umane au fost identificate pe baza cerinței conservatoare ca cel puțin 95% din toate citirile mapate să corespundă genomului uman. Toate analizele ulterioare au fost efectuate pe o matrice de coduri de bare filtrată, rezultată din CellRanger, utilizând pachetul R (versiunea 4.1.2) Seurat (versiunea 4.1.1)32.
Pentru a se asigura că doar nucleele de înaltă calitate sunt incluse în analiza ulterioară, a fost implementat un proces iterativ de filtrare pentru fiecare probă. Mai întâi, sunt identificate și eliminate nucleele de calitate scăzută cu mai puțin de 1000 de gene unice găsite și peste 20% din totalul mitocondriilor. Ulterior, matricea numerică brută a genelor a fost normalizată prin regresie binomială negativă regularizată folosind funcția sctransform(vst.flavor=”v2″), care a identificat și cele mai variabile 3000 de gene folosind parametrii impliciți. Reducerea dimensiunii a fost efectuată asupra genelor variabile superioare folosind Analiza Componentelor Principale (PCA) cu parametrii impliciți folosind o dimensiune a setului de date de 30 (dims = 30 a fost ales pe baza inspecției vizuale a locurilor genunchiului și utilizat pentru toate probele și analizele de ansamblu). Apoi am efectuat mai multe runde de clustering iterativ (rezoluție = 1) pentru a clasifica genele pe baza numărului anormal de scăzut de gene (mediană sub percentila 10), a numărului anormal de ridicat de gene mitocondriale (mediană peste percentila 95) pentru a identifica și elimina celulele putative de calitate scăzută. clustere și/sau o proporție mare de gemeni suspectați identificați folosind pachetul DoubletFinder33 (scor mediu DoubletFinder peste percentila 95). Probele t-hCO (n=3) și probele hCO (n=3) au fost integrate separat folosind funcția IntegrateData cu parametrii de mai sus. Apoi O altă rundă de filtrare calitativă a setului de date integrat a fost efectuată așa cum s-a descris mai sus.
După eliminarea nucleelor de calitate scăzută, setul de date integrat a fost grupat (rezoluție = 0,5) și încorporat în scopuri de vizualizare UMAP34. Genele marker pentru fiecare cluster au fost determinate folosind funcția FindMarkers cu parametri impliciți calculați din datele de expresie genică normalizate. Identificăm și clasificăm clasele celulare majore prin combinarea seturilor de date de referință corticale fetale și adulte cu expresia genelor marker 19,20,21,35 și adnotări. În special, precursorii circulanți au fost identificați prin expresia MKI67 și TOP2A. Clusterele progenitoare au fost definite prin absența transcrierilor mitotice, suprapunerea ridicată cu clusterele progenitoare gliale multipotente descrise în cortexul fetal în metafază târzie și expresia EGFR și OLIG1. Folosim termenul de astrocit pentru a cuprinde mai multe stări de diferențiere a astrocitelor, de la glia radială târzie până la maturarea astrocitelor. Clusterele de astrocite exprimă niveluri ridicate de SLC1A3 și AQP4 și s-a demonstrat că se mapează cu subtipuri de glie radială fetală și/sau astrocite adulte. Celulele plasmatice optice (OPC) exprimă PDGFRA și SOX10, în timp ce oligodendrocitele exprimă markeri de mielinizare (MOG și MYRF). Neuronii glutamatergici au fost identificați prin prezența transcrierilor neuronali (SYT1 și SNAP25), absența markerilor GABAergici (GAD2) și exprimarea NEUROD6, SLC17A7, BCL11B sau SATB2. Neuronii GluN au fost împărțiți în continuare în subclase superioare (expresia SATB2 și pierderea BCL11B) și profunde (expresia BCL11B). Neuronii presupuși ai subplacii (SP) exprimă markeri SP18 cunoscuți, cum ar fi ST18 și SORCS1, pe lângă markerii GluN profunzi. Celulele de tip plex coroidian au fost identificate prin exprimarea TTR, iar celulele de tip meningeal au exprimat gene asociate fibroblastelor și au mapat celulele piale/vasculare din setul de date de referință.
Analiza diferențială a expresiei genelor între subclasele t-hCO și hCO a fost efectuată utilizând o metodă pseudo-batch recent dezvoltată, reprodusă în probe implementate folosind pachetul Libra R (versiunea 1.0.0). Mai exact, testele de log-verosimilitate edgeR (versiunea 3.36.0, pachetul R) au fost efectuate pentru grupuri prin însumarea numărului de gene din celule pentru o anumită clasă de celule pentru fiecare replicare a probei. Pentru vizualizarea hărții termice, valorile normalizate per milion (CPM) sunt calculate folosind edgeR (funcția cpm()) și scalate (pentru a obține o medie = 0, deviația standard = 1). A fost efectuată analiza de îmbogățire Gene Ontology (GO) a genelor t-hCO GluN semnificativ suprareglate (valoare P corectată Benjamini-Hochberg mai mică de 0,05, exprimată în cel puțin 10% din celulele t-hCO GluN și o creștere a schimbării de cel puțin 2 ori). A fost realizată folosind ToppGene Suite (https://toppgene.cchmc.org/)37. Folosim aplicația ToppFun cu parametrii impliciți și raportăm valorile P corectate cu Benjamini-Hochberg, calculate din teste hipergeometrice adnotate cu GO.
Pentru a potrivi clusterele noastre de secvențiere snRNA cu clusterele celulare adnotate din studii de referință ale secvențierilor RNA unicelulare primare sau secvențierilor snRNA adulte19,20,21,22, am aplicat o abordare de integrare a seturilor de date pereche. Am utilizat fluxul de lucru de normalizare SCTransform (v2) în Seurat pentru a integra și compara suprapunerile clusterelor între seturi de date (folosind aceiași parametri ca mai sus). Seturile de date individuale au fost subsetate aleatoriu până la 500 de celule sau nuclee per cluster original pentru eficiență computațională. Folosind o abordare similară cu cea descrisă anterior, suprapunerea clusterelor a fost definită ca proporția de celule sau nuclee din fiecare cluster grupat care se suprapuneau cu eticheta clusterului de referință. Pentru a clasifica în continuare GluN-urile, am utilizat fluxul de lucru TransferData al Seurat pentru datele subseturilor GluN pentru a atribui etichete ale setului de date de referință celulelor noastre GluN.
Pentru a evalua starea de maturare a transcriptomului global al probelor de t-hCO și hCO, am comparat probele noastre pseudo-bulk cu BrainSpan/psychENCODE23, care constă dintr-o secvență mare de ARN care acoperă dezvoltarea creierului uman. Am efectuat PCA pe o matrice combinată de expresie genică normalizată în funcție de model din probe corticale la 10 săptămâni după concepție și ulterior, în 5567 de gene (împreună cu datele noastre) care au fost identificate anterior ca active în probele corticale BrainSpan (definite ca fiind mai mari de 50% în varianța dezvoltării explicată prin vârstă folosind un model cubic)38. În plus, am derivat gene asociate cu semnături transcriptomice majore ale neurodezvoltării folosind factorizarea matriceală non-negativă, așa cum s-a descris anterior. Ponderile probelor calculate folosind procedura de factorizare matriceală non-negativă sunt reprezentate grafic în Fig. 5b cu date extinse pentru fiecare dintre cele cinci semnături descrise de Zhu și colab.38. Din nou, markerii transcripționali dependenți de activitate au fost derivați din studii publicate anterior. În particular, ERG și LRG au fost semnificativ suprareglate în neuronii glutamatergici identificați prin colecția de secvențe snRNA din cortexul vizual al șoarecelui după stimularea vizuală din Tabelul suplimentar 3 Hrvatin et al.16. LRG-urile îmbogățite cu substanțe umane au fost obținute din culturi de creier fetal uman activat cu KCl și recoltate la 6 ore după stimulare, iar genele filtrate au fost semnificativ suprareglate la oameni, dar nu și la rozătoare (Tabelul suplimentar 4). Analiza îmbogățirii setului de gene folosind aceste seturi de gene a fost efectuată folosind un test exact Fisher unidirecțional.
Șobolanii se anesteziază cu izofluran, se scot creierele și se plasează în soluție de zaharoză rece (aproximativ 4°C) oxigenată (95% O2 și 5% CO2) pentru secțiuni care conțin: 234 mM zaharoză, 11 mM glucoză, 26 mM NaHCO3, 2,5 mM KCl, 1,25 mM NaH2PO4, 10 mM MgSO4 și 0,5 mM CaCl2 (aproximativ 310 mOsm). Secțiunile coronale de creier de șobolan (300–400 µm) conținând t-hCO au fost realizate folosind un vibratom Leica VT1200, așa cum s-a descris anterior39. Secțiunile au fost apoi transferate într-o cameră de secționare cu oxigenare continuă la temperatura camerei, conținând aCSF preparat din: 10 mM glucoză, 26 mM NaHCO3, 2,5 mM KCl, 1,25 mM NaHPO4, 1 mM MgSO4, 2 mM CaCl2 și 126 mM NaCl (298 mOsm), cu cel puțin 45 de minute înainte de înregistrare. Secțiunile au fost înregistrate într-o cameră imersată, unde au fost perfuzate continuu cu aCSF (flacon 95% O2 și 5% CO2). Toate datele au fost înregistrate la temperatura camerei. Neuronii t-hCO au fost terminați cu o pipetă din sticlă borosilicată umplută cu o soluție conținând 127 mM gluconat de potasiu, 8 mM NaCl, 4 mM ATP de magneziu, 0,3 mM GTP de sodiu, 10 mM HEPES și 0,6 mM EGTA, pH 7,2, soluție internă ajustată cu KOH (290 mOsm). Pentru recuperare, în soluția de înregistrare s-a adăugat biocitină (0,2%).
Datele au fost achiziționate folosind un amplificator MultiClamp 700B (Molecular Devices) și un digitizor Digidata 1550B (Molecular Devices), filtrate low-pass la 2 kHz, digitalizate la 20 kHz și analizate folosind Clampfit (Molecular Devices), Origin (OriginPro). 2021b, OriginLab) și funcții MATLAB personalizate (Mathworks). Potențialul joncțiunii a fost calculat folosind JPCalc, iar intrările au fost ajustate la valoarea calculată de -14 mV. Operația IV constă dintr-o serie de trepte de curent în trepte de 10-25 pA, de la -250 la 750 pA.
Talamusul, substanța albă și aferențele S1 au fost stimulate electric în secțiuni talamocorticale în timpul înregistrării neuronilor hCO3 prin metoda patch-clamp, așa cum s-a descris anterior. Pe scurt, creierul a fost plasat pe o masă de imprimare 3D înclinată la un unghi de 10°, iar partea frontală a creierului a fost secționată la un unghi de 35°. Creierul a fost apoi lipit de suprafața secționată și secționat, păstrând axonii proeminenți talamocorticali. Electrozi bipolari de tungsten (0,5 MΩ) au fost montați pe un al doilea micromanipulator și poziționați strategic pentru a stimula patru regiuni per celulă (capsula internă, substanța albă, S1 și hCO3). Înregistrați răspunsurile sinaptice după stimulare fazică de 300 µA la 0,03–0,1 Hz.
Neuronii hCO care exprimă hChR2 au fost activați la 480 nm, iar impulsuri de lumină generate de un LED (Prizmatix) au fost aplicate printr-un obiectiv ×40 (0,9 NA; Olympus) pentru a înregistra expresia hChR2 în apropierea celulelor. Diametrul câmpului iluminat este de aproximativ 0,5 mm, iar puterea totală este de 10-20 mW. Lățimea impulsului a fost setată la 10 ms, ceea ce corespunde impulsului dat în timpul experimentului de învățare comportamentală. Au fost utilizate diverse frecvențe de stimulare, de la 1 la 20 Hz, dar doar primul impuls din serie a fost utilizat pentru cuantificare. Intervalele dintre trenuri sunt de obicei mai lungi de 30 s pentru a minimiza efectul asupra căilor sinaptice inhibitorii sau de facilitare. Pentru a testa dacă răspunsul hChR2 a fost monosinaptic, am aplicat TTX (1 μM) în baie până când reacția EPSC a dispărut, apoi am aplicat 4-aminopiridină (4-AP; 100 μM). De obicei, un răspuns este returnat în câteva minute, cu o întârziere puțin mai mare între aprinderea LED-ului și generarea EPSC. NBQX (10 μM) a fost utilizat pentru a testa dacă răspunsul este determinat de receptorii AMPA.
Secțiunile precise de hCO au fost create așa cum s-a descris anterior. Pe scurt, secțiunile de hCO au fost incluse în agaroză 4% și transferate în celule conținând 126 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM NaH2PO4, 1 mM MgSO4, 2 mM CaCl2, 26 mM NaHCO3 și 10 mM d-(+)-glucoză. Secțiunile au fost tăiate la 200–300 µm la temperatura camerei folosind un vibrator Leica VT1200 și depozitate în ASF la temperatura camerei. Apoi, înregistrarea patch-camp a celulelor întregi a fost efectuată pe secțiuni de hCO sub un microscop direct SliceScope (Scientifica). Secțiunile au fost perfuzate cu aCSF (95% O2 și 5% CO2), iar semnalele celulare au fost înregistrate la temperatura camerei. Neuronii hCO3 au fost aplicați folosind o pipetă din sticlă borosilicată umplută cu o soluție ce conține 127 mM gluconat de potasiu, 8 mM NaCl, 4 mM ATP de magneziu, 0,3 mM GTP de sodiu, 10 mM HEPES și 0,6 mM EGTA, pH intern 7,2, ajustat cu KOH (osmolaritate 290). Pentru recuperare, se adaugă 0,2% Biocitină în soluția internă.
Datele au fost achiziționate cu Clampex (Clampex 11.1, Molecular Devices) utilizând un amplificator MultiClamp 700B (Molecular Devices) și un digitizor Digidata 1550B (Molecular Devices), filtrate low-pass la 2 kHz, digitalizate la 20 kHz și analizate folosind Clampfit (versiunea 10.6) pentru analiză, dispozitive moleculare) și funcții MATLAB personalizate (MATLAB 2019b, Mathworks). Potențialul joncțiunii a fost calculat folosind JPCalc, iar intrările au fost ajustate la potențialul joncțiunii calculat de -14 mV. Operația IV constă dintr-o serie de etape de curent în etape de 5-10 pA, de la -50 la 250 pA.
Pentru reconstrucția morfologică a neuronilor ciupiți, s-a adăugat 0,2% biocitină (Sigma-Aldrich) în soluția internă. Celulele sunt amorsate timp de cel puțin 15 minute după ciupire. Pipeta este apoi aspirată lent timp de 1-2 minute până când membrana înregistrată este complet sigilată. Urmând procedura de fiziologie a secțiunilor, secțiunile au fost fixate peste noapte la 4°C în 4% PFA, spălate cu PBS X3 și diluate 1:1000 cu DyLight 549 sau DyLight 405 (Vector Labs) conjugate cu streptavidină. Celulele umplute cu biocitină (2%; Sigma-Aldrich) au fost marcate în timpul înregistrării cu patch clamp la temperatura camerei timp de 2 ore. Secțiunile au fost apoi montate pe lame de microscopie folosind un Aquamount (Thermo Scientific) și vizualizate a doua zi pe un microscop confocal Leica TCS SP8 folosind un obiectiv cu imersie în ulei cu o apertură numerică ×40 1,3, mărire ×0,9–1,0, xy. Rata de eșantionare este de aproximativ 7 pixeli pe micron. S-au obținut serial stive Z la intervale de 1 µm și s-au efectuat mozaicuri z-stack și auto-cusătură bazate pe Leica pentru a acoperi întregul arbore dendritic al fiecărui neuron. Neuronii au fost apoi urmăriți semi-manual folosind interfața neuTube 40 și au fost generate fișiere SWC. Fișierele au fost apoi încărcate în pluginul SimpleNeuriteTracer41 Fiji (ImageJ, versiunea 2.1.0; NIH).
Țesutul cortical uman a fost obținut cu consimțământ informat, conform unui protocol aprobat de Comitetul de Revizuire Instituțională al Universității Stanford. Două probe de țesut uman postpartum (cu vârste de 3 și 18 ani) au fost obținute prin rezecția cortexului frontal (girusul frontal mijlociu) ca parte a unei intervenții chirurgicale pentru epilepsie refractară. După rezecție, țesutul a fost recoltat în NMDG-aCSF rece ca gheața, conținând: 92 mM NMDG, 2,5 mM KCl, 1,25 mM NaH2PO4, 30 mM NaHCO3, 20 mM HEPES, 25 mM glucoză, 2 mM tiouree, 5 mM ascorbat de sodiu, 3 mM piruvat de sodiu, 0,5 mM CaCl24H2O și 10 mM MgSO47H2O. Se titra la pH 7,3-7,4 cu acid clorhidric concentrat. Țesuturile au fost livrate la laborator în decurs de 30 de minute, iar secțiunile coronale au fost prelevate conform procedurii descrise mai sus.
Toate procedurile la animale au fost efectuate în conformitate cu ghidurile de îngrijire a animalelor aprobate de Universitatea Stanford, APLAC. Șobolanii (la mai mult de 140 de zile după transplant) au fost anesteziați cu izofluran 5% și anesteziați intraoperator cu izofluran 1-3%. Animalele au fost plasate într-un cadru stereotaxic (Kopf) și s-a injectat subcutanat buprenorfină cu eliberare susținută (SR). Craniul este expus, curățat și se introduc 3-5 șuruburi osoase. Pentru a viza t-hCO3, am generat coordonate stereotaxice din imaginile RMN. La locul de interes a fost perforat un orificiu de freză, iar fibrele (cu diametrul de 400 µm, NA 0,48, Doric) au fost coborâte la 100 µm sub suprafața hCO3 și fixate pe craniu cu ciment dentar polimerizabil cu UV (Relyx).
Înregistrările fotometrice cu fibră optică au fost efectuate așa cum s-a descris anterior42. Pentru a înregistra activitatea spontană, șobolanii au fost plasați într-o cușcă curată, iar un cablu de patch cu fibră optică (Doric) cu diametrul de 400 µm, conectat la un sistem de achiziție de date fotometrice cu fibră optică, a fost conectat la cablul cu fibră optică implantat. În timpul înregistrării de 10 minute a activității motorii, animalele au fost libere să exploreze cușca. Pentru a înregistra activitatea evocată, șobolanii (la mai mult de 140 de zile după transplant) au fost anesteziați cu 5% izofluran pentru inducție și 1-3% izofluran pentru menținere. Se plasează animalul într-un cadru stereotactic (Kopf), iar mustățile de pe partea opusă a t-hCO3 sunt tăiate la aproximativ 2 cm și trecute printr-o plasă conectată la un actuator piezoelectric (PI). Un cablu de patch cu fibră optică (Doric) de 400 µm a fost conectat la fibra implantată și la sistemul de achiziție de date. Mustățile de pe partea opusă a t-hCO3 au fost apoi deviate de 50 de ori (2 mm la 20 Hz, 2 s per prezentare) la momente aleatorii de către un acționator piezoelectric pe o perioadă de înregistrare de 20 de minute. Utilizați pachetul de asistență Arduino MATLAB pentru a controla timpul de deviere cu cod MATLAB personalizat. Evenimentele sunt sincronizate cu software-ul de achiziție de date folosind impulsuri logice tranzistor-tranzistor (TTL).
Șobolanii (la mai mult de 140 de zile după transplant) au fost anesteziați cu izofluran 5% și anesteziați intraoperator cu izofluran 1-3%. Animalele au fost plasate într-un cadru stereotaxic (Kopf) și li s-au injectat subcutanat buprenorfină SR și dexametazonă. Craniul este expus, curățat și se introduc 3-5 șuruburi osoase. Pentru a viza t-hCO, am generat coordonate stereotaxice din imaginile RMN. A fost efectuată o craniotomie circulară (cu diametrul de aproximativ 1 cm) cu un burghiu de mare viteză direct peste hCO transplantat. Odată ce osul este cât mai subțire posibil, dar înainte de a perfora întregul os, se utilizează un forceps pentru a îndepărta discul pelvin intact rămas pentru a dezvălui t-hCO subiacent. Craniotomia a fost umplută cu soluție salină sterilă, iar o lamelă și un ac special pentru cap au fost atașate la craniu cu ciment dentar întărit cu UV (Relyx).
Imagistica cu doi fotoni a fost efectuată utilizând un microscop multifotonic Bruker cu un obiectiv Nikon LWD (×16, 0.8 NA). Imagistica GCaMP6 a fost efectuată la 920 nm cu o mărire de 1.4x în planul z unic și o medie de 8x de 7.5 fps. Șobolanii au fost induși cu anestezie cu izofluran 5% și menținuți cu izofluran 1-3%. Șobolanii au fost plasați într-un cap de fixare personalizat și poziționați sub lentilă. S-a obținut o înregistrare de fundal de 3 minute a activității motorii. Pe parcursul a 20 de minute de înregistrare, 50 de pufuri (fiecare prezentare având o lungime de 100 ms) au fost administrate aleatoriu pe tamponul de mustăți opus t-hCO3 folosind un picosprecer. Utilizați pachetul de asistență Arduino MATLAB pentru a controla timpul de rafală cu cod MATLAB personalizat. Sincronizați evenimentele cu software-ul de achiziție de date (PrairieView 5.5) folosind impulsuri TTL. Pentru analiză, imaginile au fost corectate pentru mișcarea xy folosind corecție afină în programul MoCo lansat în Fiji. Extracția urmelor fluorescente din celule individuale folosind CNMF-E43. Fluorescența a fost extrasă pentru fiecare regiune de interes, convertită în curbe dF/F și apoi convertită în scoruri z.
Șobolanii (la mai mult de 140 de zile după transplant) au fost anesteziați cu izofluran 5% și anesteziați intraoperator cu izofluran 1-3%. Animalele au fost plasate într-un cadru stereotaxic (Kopf) și li s-au injectat subcutanat buprenorfină SR și dexametazonă. Mustățile de pe partea opusă a t-hCO au fost tăiate la aproximativ 2 cm și înfiletate printr-o plasă conectată la un actuator piezoelectric. Craniul este expus și curățat. Un șurub de șlefuit din oțel inoxidabil este atașat la craniu. Pentru a viza t-hCO, am generat coordonate stereotaxice din imaginile RMN. Se efectuează o craniotomie circulară (aproximativ 1 cm în diametru) cu un burghiu de mare viteză, chiar deasupra t-hCO. Odată ce osul este cât mai subțire posibil, dar înainte de a perfora întregul os, se utilizează un forceps pentru a îndepărta discul pelvin intact rămas pentru a dezvălui t-hCO subiacent. Celulele individuale au fost înregistrate folosind sonde de siliciu de înaltă densitate cu 32 sau 64 de canale (Cambridge Neurotech), conectate la șuruburi de împământare și preamplificate cu amplificatoare RHD (Intan). Utilizați manipulatorul pentru a coborî electrozii la locul țintă prin craniotomie, care este umplută cu soluție salină sterilă. Colectarea datelor a fost efectuată la o frecvență de 30 kHz folosind sistemul de achiziție de date Open Ephys. Înregistrarea a continuat numai atunci când am detectat o activitate spontană ritmică extrem de corelată în mai mult de 10 canale, sugerând că electrozii au fost localizați în grefă (pe baza datelor de imagistică cu calciu cu doi fotoni). A fost obținută o înregistrare de fundal de 10 minute a activității motorii. Mustățile de pe partea opusă a t-hCO3 au fost apoi deviate de 50 de ori (2 mm la 20 Hz, 2 s per prezentare) la momente aleatorii de către un acționator piezoelectric pe o perioadă de înregistrare de 20 de minute. Folosind pachetul de asistență MATLAB pentru Arduino (MATLAB 2019b), controlați timpul de deviere cu cod MATLAB personalizat. Folosește impulsuri TTL pentru a sincroniza evenimentele cu software-ul de achiziție de date.
Pentru experimentele de marcare optică, un cablu de conectare optic de 200 µm (Doric) conectat la un laser de 473 nm (Omicron) a fost conectat la o fibră optică de 200 µm plasată peste craniotomie. Imediat înainte de aceasta, reglați puterea jumperului la 20 mW. Folosiți manipulatorul pentru a coborî electrozii la locul țintă prin craniotomie, care este umplută cu soluție salină sterilă. La începutul înregistrării, au fost emise zece impulsuri de lumină de 473 nm (frecvență 2 Hz, durată impuls 10 ms). Celulele fotosensibile au fost definite ca celule care au prezentat un răspuns la vârfuri de lumină în decurs de 10 ms în 70% sau mai mult din încercări.
Data publicării: 19 noiembrie 2022
