Nature.com ପରିଦର୍ଶନ କରିବା ପାଇଁ ଆପଣଙ୍କୁ ଧନ୍ୟବାଦ। ଆପଣ ସୀମିତ CSS ସମର୍ଥନ ସହିତ ଏକ ବ୍ରାଉଜର ସଂସ୍କରଣ ବ୍ୟବହାର କରୁଛନ୍ତି। ସର୍ବୋତ୍ତମ ଅଭିଜ୍ଞତା ପାଇଁ, ଆମେ ଆପଣଙ୍କୁ ଏକ ଅପଡେଟ୍ ବ୍ରାଉଜର ବ୍ୟବହାର କରିବାକୁ ସୁପାରିଶ କରୁଛୁ (କିମ୍ବା ଇଣ୍ଟରନେଟ୍ ଏକ୍ସପ୍ଲୋରରରେ ସୁସଙ୍ଗତତା ମୋଡ୍ ଅକ୍ଷମ କରନ୍ତୁ)। ଏହା ସହିତ, ନିରନ୍ତର ସମର୍ଥନ ସୁନିଶ୍ଚିତ କରିବା ପାଇଁ, ଆମେ ଷ୍ଟାଇଲ୍ ଏବଂ ଜାଭାସ୍କ୍ରିପ୍ଟ ବିନା ସାଇଟ୍ ଦେଖାଉଛୁ।
ଏକାଥରେ ତିନୋଟି ସ୍ଲାଇଡର ଏକ କାରୋସେଲ ପ୍ରଦର୍ଶିତ କରେ। ଗୋଟିଏ ସମୟରେ ତିନୋଟି ସ୍ଲାଇଡ ଦେଇ ଯିବା ପାଇଁ ପୂର୍ବ ଏବଂ ପରବର୍ତ୍ତୀ ବଟନ ବ୍ୟବହାର କରନ୍ତୁ, କିମ୍ବା ଗୋଟିଏ ସମୟରେ ତିନୋଟି ସ୍ଲାଇଡ ଦେଇ ଯିବା ପାଇଁ ଶେଷରେ ଥିବା ସ୍ଲାଇଡର ବଟନ ବ୍ୟବହାର କରନ୍ତୁ।
ସ୍ୱୟଂ-ସଂଯୋଗିତ ନ୍ୟୁରାଲ ଅର୍ଗାନେଲଗୁଡ଼ିକ ମାନବ ବିକାଶ ଏବଂ ରୋଗର ମଡେଲିଂ ପାଇଁ ଏକ ପ୍ରତିଶ୍ରୁତିପୂର୍ଣ୍ଣ ଇନ ଭିଟ୍ରୋ ପ୍ଲାଟଫର୍ମ ପ୍ରତିନିଧିତ୍ୱ କରନ୍ତି। ତଥାପି, ଅର୍ଗାନଏଡ୍ସ ଭିଭୋରେ ଥିବା ସଂଯୋଗର ଅଭାବ ରହିଛି, ଯାହା ପରିପକ୍ୱତାକୁ ସୀମିତ କରେ ଏବଂ ଆଚରଣକୁ ନିୟନ୍ତ୍ରଣ କରୁଥିବା ଅନ୍ୟ ସର୍କିଟ ସହିତ ଏକୀକୃତ ହେବାକୁ ବାଧା ଦିଏ। ଏଠାରେ ଆମେ ଦେଖାଉଛୁ ଯେ ନବଜାତ ନଗ୍ନ ମୂଷାର ସୋମାଟୋସେନ୍ସରୀ କର୍ଟେକ୍ସରେ ପ୍ରତିରୋପିତ ମାନବ ଷ୍ଟେମ୍ କୋଷରୁ ପ୍ରାପ୍ତ କର୍ଟିକାଲ୍ ଅର୍ଗାନଏଡ୍ ପରିପକ୍ୱ କୋଷ ପ୍ରକାର ବିକଶିତ କରେ ଯାହା ସମ୍ବେଦନଶୀଳ ଏବଂ ପ୍ରେରଣା-ସମ୍ବନ୍ଧୀୟ ସର୍କିଟରେ ଏକୀକୃତ ହୁଏ। MRI ଅନେକ ଷ୍ଟେମ୍ କୋଷ ରେଖା ଏବଂ ପ୍ରାଣୀମାନଙ୍କରେ ପ୍ରତିରୋପଣ ପରବର୍ତ୍ତୀ ଅର୍ଗାନଏଡ୍ ବୃଦ୍ଧି ପ୍ରକାଶ କରିଥିଲା, ଯେତେବେଳେ ଏକକ-କୋର ବିଶ୍ଳେଷଣ କର୍ଟିକୋଜେନେସିସର ଅଗ୍ରଗତି ଏବଂ ଏକ କାର୍ଯ୍ୟକଳାପ-ନିର୍ଭରଶୀଳ ଟ୍ରାନ୍ସକ୍ରିପସନ୍ ପ୍ରୋଗ୍ରାମର ଆବିର୍ଭାବ ପ୍ରକାଶ କରିଥିଲା। ପ୍ରକୃତରେ, ପ୍ରତିରୋପିତ କର୍ଟିକାଲ୍ ନ୍ୟୁରନ୍ ସେମାନଙ୍କର ଇନ ଭିଟ୍ରୋ ପ୍ରତିରୂପ ଅପେକ୍ଷା ଅଧିକ ଜଟିଳ ଆକୃତିଗତ, ସିନାପ୍ଟିକ୍ ଏବଂ ଆଭ୍ୟନ୍ତରୀଣ ଝିଲ୍ଲୀ ଗୁଣ ପ୍ରଦର୍ଶନ କରେ, ଯାହା ଟିମୋଥି ସିଣ୍ଡ୍ରୋମ୍ ସହିତ ରୋଗୀଙ୍କ ମଧ୍ୟରେ ନ୍ୟୁରୋନାଲ ତ୍ରୁଟି ଚିହ୍ନଟ କରିବାକୁ ଅନୁମତି ଦିଏ। ଆନାଟୋମିକାଲ୍ ଏବଂ କାର୍ଯ୍ୟକ୍ଷମ ଟ୍ରେସିଂ ଦେଖାଇଛି ଯେ ପ୍ରତିରୋପିତ ଅର୍ଗାନେଲଗୁଡ଼ିକ ଥାଲାମୋକର୍ଟିକାଲ୍ ଏବଂ କର୍ଟିକୋକର୍ଟିକାଲ୍ ଇନପୁଟ୍ ଗ୍ରହଣ କରନ୍ତି, ଏବଂ ନ୍ୟୁରାଲ କାର୍ଯ୍ୟକଳାପର ଭିଭୋ ରେକର୍ଡିଂ ସୂଚାଇ ଦିଏ ଯେ ଏହି ଇନପୁଟ୍ ମାନବ କୋଷରେ ସମ୍ବେଦନଶୀଳ ପ୍ରତିକ୍ରିୟା ସୃଷ୍ଟି କରିପାରିବ। ଶେଷରେ, କର୍ଟିକାଲ୍ ଅର୍ଗାନଏଡ୍ସ ସମଗ୍ର ମୂଷା ମସ୍ତିଷ୍କରେ ଆକ୍ସନଗୁଡ଼ିକୁ ବିସ୍ତାର କରନ୍ତି, ଏବଂ ସେମାନଙ୍କର ଅପ୍ଟୋଜେନେଟିକ୍ ସକ୍ରିୟକରଣ ପୁରସ୍କାର-ଖୋଜିବା ଆଚରଣକୁ ନେଇଯାଏ। ଏହିପରି, ପ୍ରତିରୋପିତ ମାନବ କର୍ଟେକ୍ସ ନ୍ୟୁରନ୍ ପରିପକ୍ୱ ହୁଅନ୍ତି ଏବଂ ଆଚରଣକୁ ନିୟନ୍ତ୍ରଣ କରୁଥିବା ହୋଷ୍ଟର ସର୍କିଟରେ ଅଂଶଗ୍ରହଣ କରନ୍ତି। ଆମେ ଆଶା କରୁଛୁ ଯେ ଏହି ପଦ୍ଧତି ରୋଗୀ-ପ୍ରାପ୍ତ କୋଷଗୁଡ଼ିକରେ ଷ୍ଟ୍ରାଣ୍ଡ-ସ୍ତରୀୟ ଫେନୋଟାଇପ୍ ଚିହ୍ନଟକୁ ସହଜ କରିବ ଯାହା ଅନ୍ୟ ଉପାୟରେ ଚିହ୍ନଟ କରାଯାଇପାରିବ ନାହିଁ।
ବିକାଶଶୀଳ ମାନବ ମସ୍ତିଷ୍କ ଏକ ଉଲ୍ଲେଖନୀୟ ସ୍ୱ-ସଂଗଠିତ ପ୍ରକ୍ରିୟା ଯେଉଁଥିରେ କୋଷଗୁଡ଼ିକ ବୃଦ୍ଧି ପାଏ, ଭିନ୍ନ ହୁଏ, ସ୍ଥାନାନ୍ତରିତ ହୁଏ ଏବଂ କାର୍ଯ୍ୟକ୍ଷମ ନ୍ୟୁରୋନାଲ୍ ସର୍କିଟ୍ ଗଠନ ପାଇଁ ସଂଯୋଗ ହୁଏ ଯାହା ଇନ୍ଦ୍ରିୟ ଅଭିଜ୍ଞତା ମାଧ୍ୟମରେ ଆହୁରି ପରିଷ୍କୃତ ହୁଏ। ମାନବ ମସ୍ତିଷ୍କ ବିକାଶକୁ ବୁଝିବାରେ ଏକ ପ୍ରମୁଖ ସମସ୍ୟା ହେଉଛି, ବିଶେଷକରି ରୋଗ ପରିପ୍ରେକ୍ଷୀରେ, ମସ୍ତିଷ୍କ ଟିସୁକୁ ପ୍ରବେଶର ଅଭାବ। ମାନବ କର୍ଟେକ୍ସ ଅର୍ଗାନଏଡ୍ସ (hCO; ମାନବ କର୍ଟେକ୍ସ ସ୍ଫିଅର ଭାବରେ ମଧ୍ୟ ଜଣାଶୁଣା) ସମେତ ସ୍ୱ-ସଂଗଠିତ ଅର୍ଗାନେଲ୍ସ 2,3,4,5,6 ସୃଷ୍ଟି କରିପାରେ। ତଥାପି, ଅନେକ ସୀମା ସ୍ନାୟୁ ସର୍କିଟର ବିକାଶ ଏବଂ କାର୍ଯ୍ୟକାରିତାକୁ ବୁଝିବା ପାଇଁ ସେମାନଙ୍କର ବ୍ୟାପକ ପ୍ରୟୋଗକୁ ସୀମିତ କରେ। ବିଶେଷକରି, ଏହା ସ୍ପଷ୍ଟ ନୁହେଁ ଯେ ଭିଭୋରେ ଉପସ୍ଥିତ କିଛି ସୂକ୍ଷ୍ମ ପରିବେଶଗତ ଏବଂ ଇନ୍ଦ୍ରିୟ ଇନପୁଟ୍‌ର ଅନୁପସ୍ଥିତି ଦ୍ୱାରା hCO ପରିପକ୍ୱତା ସୀମିତ କି ନାହିଁ। ଏହା ବ୍ୟତୀତ, କାରଣ hCO ଗୁଡ଼ିକ ଆଚରଣଗତ ଫଳାଫଳ ସୃଷ୍ଟି କରିପାରୁଥିବା ସର୍କିଟରେ ସଂହତ ହୋଇନାହିଁ, ତେଣୁ ଜେନେଟିକାଲ୍ ଜଟିଳ ଏବଂ ଆଚରଣଗତ ନ୍ୟୁରୋସାଇକିଆଟ୍ରିକ୍ ବ୍ୟାଧି ମଡେଲିଂରେ ସେମାନଙ୍କର ଉପଯୋଗିତା ବର୍ତ୍ତମାନ ସୀମିତ।
ଏକ ଅକ୍ଷୁର୍ଣ୍ଣ ଜୀବନ୍ତ ମସ୍ତିଷ୍କରେ hCO ପ୍ରତିରୋପଣ ଏହି ସୀମାଗୁଡ଼ିକୁ ଦୂର କରିପାରିବ। ପୂର୍ବ ଅଧ୍ୟୟନଗୁଡ଼ିକ ଦର୍ଶାଇଛି ଯେ ରୋଡେଣ୍ଟ କର୍ଟେକ୍ସରେ ପ୍ରତିରୋପିତ ମାନବ ନ୍ୟୁରନ୍‌ଗୁଡ଼ିକ ବଞ୍ଚି ରହିବା, ପ୍ରକ୍ଷେପଣ କରିବା ଏବଂ ରୋଡେଣ୍ଟ କୋଷଗୁଡ଼ିକ ସହିତ ଯୋଗାଯୋଗ କରିବାକୁ ସକ୍ଷମ 7,8,9,10,11,12। ତଥାପି, ଏହି ପରୀକ୍ଷଣଗୁଡ଼ିକ ସାଧାରଣତଃ ବୟସ୍କ ପ୍ରାଣୀମାନଙ୍କ ଉପରେ କରାଯାଏ, ଯାହା ସିନାପ୍ଟିକ୍ ଏବଂ ଆକ୍ସୋନାଲ୍ ଇଣ୍ଟିଗ୍ରେସନ୍‌କୁ ସୀମିତ କରିପାରେ। ଏଠାରେ, ଆମେ ଏକ ପ୍ରତିରୋପଣ ପାରଦର୍ଶିତା ବର୍ଣ୍ଣନା କରୁଛୁ ଯେଉଁଥିରେ ଆମେ ପ୍ଲାଷ୍ଟିକ୍ ବିକାଶର ପ୍ରାରମ୍ଭିକ ପର୍ଯ୍ୟାୟରେ ଇମ୍ୟୁନୋଡେଫିସିଏନ୍ସିଅନ୍ ମୂଷାର ପ୍ରାଥମିକ ସୋମାଟୋସେନ୍ସରୀ କର୍ଟେକ୍ସ (S1) ରେ hiPS କୋଷରୁ ପ୍ରାପ୍ତ 3D hCO ପ୍ରତିରୋପଣ କରିଥିଲୁ। ପ୍ରତିରୋପିତ hCO (t-hCO) ନ୍ୟୁରନ୍‌ଗୁଡ଼ିକ ଯଥେଷ୍ଟ ପରିପକ୍ୱତା ପାଆନ୍ତି, ଥାଲାମୋକର୍ଟିକାଲ୍ ଏବଂ କର୍ଟିକାଲ୍-କର୍ଟିକାଲ୍ ଇନପୁଟ୍ ଗ୍ରହଣ କରନ୍ତି ଯାହା ସମ୍ବେଦନଶୀଳ ପ୍ରତିକ୍ରିୟା ସୃଷ୍ଟି କରେ, ଏବଂ ପୁରସ୍କାର-ଅନ୍ୱେଷଣ ଆଚରଣକୁ ଚଲାଇବା ପାଇଁ ମୂଷା ମସ୍ତିଷ୍କରେ ଆକ୍ସୋନାଲ୍ ପ୍ରୋଜେକ୍ସନ୍ ବିସ୍ତାର କରନ୍ତି। t-hCO ର ବର୍ଦ୍ଧିତ ପରିପକ୍ୱତା ଟିମୋଥି'ସ୍ ସିଣ୍ଡ୍ରୋମ୍ (TS) ରୋଗୀଙ୍କ ମଧ୍ୟରେ ନ୍ୟୁରୋନାଲ୍ ତ୍ରୁଟି ପ୍ରକାଶ କରିଛି, ଏହା ଭୋଲ୍ଟେଜ୍-ସମ୍ବେଦନଶୀଳ L-ଟାଇପ୍ CaV1.2 କ୍ୟାଲସିୟମ୍ ଚ୍ୟାନେଲରେ ମ୍ୟୁଟେସନ୍ ଯୋଗୁଁ ସୃଷ୍ଟି ହୋଇଥିବା ଏକ ଗମ୍ଭୀର ଜେନେଟିକ୍ ବ୍ୟାଧି (CACNA1C ଦ୍ୱାରା ଏନକୋଡେଡ୍)।
ଭିଭୋ ସର୍କିଟରେ ମାନବ କର୍ଟିକାଲ୍ ନ୍ୟୁରନ୍ ଅଧ୍ୟୟନ କରିବା ପାଇଁ, ଆମେ ଷ୍ଟେରିଓଟାକ୍ଟିକାଲ୍ ଭାବରେ ପ୍ରାରମ୍ଭିକ ପ୍ରସବ ପରବର୍ତ୍ତୀ ଆଥିମିକ୍ ମୂଷା (ପ୍ରସବ ପରବର୍ତ୍ତୀ 3-7 ଦିନ) (ଚିତ୍ର 1a ଏବଂ ଚିତ୍ର 1a-c ର ବିସ୍ତାରିତ ତଥ୍ୟ) ର S1 ରେ ଅକ୍ଷତ 3D hCO ପ୍ରତିରୋପଣ କରିଥିଲୁ। ଏହି ସମୟରେ, ଥାଲାମୋକର୍ଟିକାଲ୍ ଏବଂ କର୍ଟିକୋକର୍ଟିକାଲ୍ ଆକ୍ସୋନାଲ୍ ପ୍ରୋଜେକ୍ସନ୍ ଏପର୍ଯ୍ୟନ୍ତ ସେମାନଙ୍କର S1 ଇନର୍ଭେସନ୍ (ସନ୍ଦର୍ଭ 13) ସମାପ୍ତ କରିନାହିଁ। ତେଣୁ, ଏହି ପଦ୍ଧତିଟି ଏଣ୍ଡୋଜେନ୍ସ୍ ସର୍କିଟ୍ ଉପରେ ପ୍ରଭାବକୁ କମ କରିବା ସହିତ t-hCO ଏକୀକରଣକୁ ସର୍ବାଧିକ କରିବା ପାଇଁ ଡିଜାଇନ୍ କରାଯାଇଛି। ଜୀବନ୍ତ ପ୍ରାଣୀମାନଙ୍କରେ t-hCO ର ସ୍ଥାନ କଳ୍ପନା କରିବା ପାଇଁ, ଆମେ ପ୍ରତିରୋପଣର 2-3 ମାସ ପରେ ମୂଷାର T2-ଓଜନଯୁକ୍ତ MRI ମସ୍ତିଷ୍କ ପୁନଃନିର୍ମାଣ କରିଥିଲୁ (ଚିତ୍ର 1b ଏବଂ ବିସ୍ତାରିତ ତଥ୍ୟ, ଚିତ୍ର 1d)। t-hCO ସହଜରେ ପର୍ଯ୍ୟବେକ୍ଷଣ କରାଯାଇଥିଲା ଏବଂ t-hCO ର ଆୟତନ ମାପ ସ୍ଥିର ସ୍ଲାଇସରୁ ଗଣନା କରାଯାଇଥିବା ପରିମାଣ ସହିତ ସମାନ ଥିଲା (ବିସ୍ତାରିତ ତଥ୍ୟ ଚିତ୍ର 1d,e; P > 0.05)। t-hCO ସହଜରେ ପର୍ଯ୍ୟବେକ୍ଷଣ କରାଯାଇଥିଲା ଏବଂ t-hCO ର ଆୟତନ ମାପ ସ୍ଥିର ସ୍ଲାଇସରୁ ଗଣନା କରାଯାଇଥିବା ପରିମାଣ ସହିତ ସମାନ ଥିଲା (ବିସ୍ତାରିତ ତଥ୍ୟ ଚିତ୍ର 1d,e; P > 0.05)। t-hCO легко наблюдались, а оемемные измерения t-hCO былы аналогичны рассчитанным для фик кинованных срезов (расширенные кснейе, рис। 1d, e; P> 0,05) t-hCO ସହଜରେ ପର୍ଯ୍ୟବେକ୍ଷଣ କରାଯାଇଥିଲା, ଏବଂ ଭଲ୍ୟୁମେଟ୍ରିକ୍ t-hCO ମାପ ସ୍ଥିର ବିଭାଗ ପାଇଁ ଗଣନା କରାଯାଇଥିବା ପରି ସମାନ ଥିଲା (ବିସ୍ତାରିତ ତଥ୍ୟ, ଚିତ୍ର 1d, e; P > 0.05)।很容易观察到 t-hCO ，并且 t-hCO 的体积测量值与从固定切片计算的测量值相似（扩展数据图 1d 、 e ； P> 0.05 ）。很容易观察到 t-hCO ，并且 t-hCO | t-hCO легко наблюдался, а оемемные измерения t-hCO былы аналогичны рассчитанным для фик кинованных срезов (расширенные кснейе, рис। 1d, e; P> 0,05) t-hCO ସହଜରେ ପର୍ଯ୍ୟବେକ୍ଷଣ କରାଯାଇଥିଲା, ଏବଂ ଭଲ୍ୟୁମେଟ୍ରିକ୍ t-hCO ମାପ ସ୍ଥିର ବିଭାଗ ପାଇଁ ଗଣନା କରାଯାଇଥିବା ପରି ସମାନ ଥିଲା (ବିସ୍ତାରିତ ତଥ୍ୟ, ଚିତ୍ର 1d, e; P > 0.05)।ପ୍ରତିରୋପଣର ପ୍ରାୟ 2 ମାସ ପରେ ଆମେ ପ୍ରତିରୋପିତ ପ୍ରାଣୀଙ୍କ ମଧ୍ୟରୁ 81% ରେ t-hCO ନିର୍ଣ୍ଣୟ କରିଥିଲୁ (n = 72 ପ୍ରାଣୀ; 10 hiPS କୋଷ ରେଖାରୁ hCO; ପରିପୂରକ ସାରଣୀ 1 ରେ hiPS କୋଷ ରେଖା)। ଏଥିମଧ୍ୟରୁ, 87% ମସ୍ତିଷ୍କ କର୍ଟେକ୍ସରେ ଅବସ୍ଥିତ ଥିଲା (ଚିତ୍ର 1c)। ସମାନ ପ୍ରତିରୋପିତ ମୂଷାରେ ଏକାଧିକ ସମୟ ବିନ୍ଦୁରେ ସିରିଏଲ୍ MRI ସ୍କାନ କରି, ଆମେ 3 ମାସ ମଧ୍ୟରେ t-hCO ପରିମାଣରେ ନଅ ଗୁଣ ବୃଦ୍ଧି ପାଇଲୁ (ଚିତ୍ର 1d ଏବଂ ବିସ୍ତାରିତ ତଥ୍ୟ, ଚିତ୍ର 1f)। ପ୍ରତିରୋପଣ ପରେ 12 ମାସ (ବିସ୍ତାରିତ ତଥ୍ୟ, ଚିତ୍ର 1g ଏବଂ ପରିପୂରକ ସାରଣୀ 2) ରେ ପ୍ରତିରୋପିତ ପ୍ରାଣୀଙ୍କର ବଞ୍ଚିବା ହାର (74%) ଅଧିକ ଥିଲା, ଏବଂ କୌଣସି ସ୍ପଷ୍ଟ ମୋଟର କିମ୍ବା ସ୍ମୃତି ଦୁର୍ବଳତା, ଗ୍ଲାଇଓସିସ୍, କିମ୍ବା ଇଲେକ୍ଟ୍ରୋଏନସେଫାଲୋଗ୍ରାମ (EEG) ମିଳିଲା ନାହିଁ। ତଥ୍ୟ ଚିତ୍ର 1g ଏବଂ ପରିପୂରକ ସାରଣୀ 2)। 1h–m ଏବଂ 3e)।
a, ପରୀକ୍ଷାମୂଳକ ଡିଜାଇନର ଯୋଜନା। hiPS କୋଷରୁ ପ୍ରାପ୍ତ hCO କୁ ଭିନ୍ନତାର 30-60 ଦିନ ପରେ ନବଜାତ ନଗ୍ନ ମୂଷାଙ୍କ S1 ରେ ପ୍ରତିରୋପଣ କରାଯାଇଥିଲା। b, ପ୍ରତିରୋପଣର 2 ମାସ ପରେ S1 ରେ t-hCO ଦେଖାଉଥିବା T2-ଓଜନଯୁକ୍ତ କରୋନାଲ୍ ଏବଂ ଭୂସମାନ୍ତର MRI ଚିତ୍ର। ସ୍କେଲ୍ ବାର୍, 2 mm। c, ପ୍ରତ୍ୟେକ hiPS କୋଷ ରେଖା ପାଇଁ ଦର୍ଶାଯାଇଥିବା ଏନଗ୍ରାଫ୍ମେଣ୍ଟ୍ମେଣ୍ଟ ସଫଳତା ହାରର ପରିମାଣ (n = 108, ବାର୍ ମଧ୍ୟରେ ସଂଖ୍ୟାଗୁଡ଼ିକ hIPS କୋଷ ରେଖା ପ୍ରତି t-hCO ପରିମାଣ ସୂଚାଇଥାଏ) ଏବଂ କର୍ଟିକାଲ୍ କିମ୍ବା ସବକର୍ଟିକାଲ୍ ସ୍ଥାନ (n = 88)। d, ଏକ କରୋନାରୀ ଧମନୀ (ବାମ; ସ୍କେଲ୍ ବାର୍, 3 mm) ଏବଂ ଅନୁରୂପ 3D ଭଲ୍ୟୁମେଟ୍ରିକ୍ ପୁନଃନିର୍ମାଣ (ସ୍କେଲ ବାର୍, 3 mm) ର MRI ପ୍ରତିଛବି ଯାହା 3 ମାସ ମଧ୍ୟରେ t-hCO ରେ ବୃଦ୍ଧି ଦେଖାଉଛି। e, ମୂଷା ମସ୍ତିଷ୍କ କର୍ଟେକ୍ସରେ t-hCO ପ୍ୟାଟର୍ଣ୍ଣର ସମୀକ୍ଷା। ସ୍କେଲ୍ ବାର୍, 1 mm। f, ଉପର ବାମରୁ ଡାହାଣକୁ ଦେଖାଯାଇଥିବା t-hCO ର ପ୍ରତିନିଧି ଇମ୍ୟୁନୋସାଇଟୋକେମିକାଲ୍ ପ୍ରତିଛବି (ବିଭେଦ ସମୟରେ): PPP1R17 (4 ମାସ ପୁରୁଣା), NeuN (8 ମାସ ପୁରୁଣା), SOX9 ଏବଂ GFAP (8 ମାସ ପୁରୁଣା), PDGFRα; (8 ମାସ), MAP2 (8 ମାସ) ଏବଂ IBA1 (8 ମାସ)। ସ୍କେଲ୍ ବାର୍, 20 µm। HNA ର ସହ-ପ୍ରକାଶନ ମାନବ ଉତ୍ପତ୍ତିର କୋଷଗୁଡ଼ିକୁ ସୂଚିତ କରେ। g, snRNA-seq: Seurat ଏକୀକରଣ ପରେ ସମସ୍ତ ଉଚ୍ଚ-ଗୁଣବତ୍ତା t-hCO ନ୍ୟୁକ୍ଲିୟରର ଏକୀକୃତ ମେନିଫୋଲ୍ଡ ଏବଂ ପ୍ରୋଜେକ୍ସନ (UMAP) ଡାଇମେନ୍ସିନାଲିଟି ରିଡକ୍ସନ୍ ଇମେଜିଂ (n=3 t-hCO ନମୁନା, n=2 hiPS କୋଷ ରେଖା)। ଆଷ୍ଟ୍ରୋସାଇଟ୍, ଆଷ୍ଟ୍ରୋସାଇଟ୍ ରେଖାର କୋଷ; ସାଇକ୍ ପ୍ରୋଗ୍, ସଞ୍ଚାଳନକାରୀ ପୂର୍ବପୁରୁଷ; GluN DL, ଗଭୀର ଗ୍ଲୁଟାମେଟର୍ଜିକ୍ ନ୍ୟୁରନ୍; GluN DL/SP, ଗଭୀର ଏବଂ ସବଲାମେଲାର୍ ଗ୍ଲୁଟାମେଟର୍ଜିକ୍ ନ୍ୟୁରନ୍; GluN UL, ଉପର ସ୍ତର ଗ୍ଲୁଟାମେଟର୍ଜିକ୍ ନ୍ୟୁରନ୍; ଅଲିଗୋଡେଣ୍ଡ୍ରୋସାଇଟ୍, ଅଲିଗୋଡେଣ୍ଡ୍ରୋସାଇଟ୍; OPC, ଅଲିଗୋଡେଣ୍ଡ୍ରୋସାଇଟ୍ ପ୍ରଜେନିଟର କୋଷ; RELN, ରିଲିନ୍ ନ୍ୟୁରନ୍। h, hCO ଗ୍ଲୁଟାମେଟରଜିକ୍ ନ୍ୟୁରନ୍ ତୁଳନାରେ t-hCO ଗ୍ଲୁଟାମେଟରଜିକ୍ ନ୍ୟୁରନ୍‌ରେ ଉଲ୍ଲେଖନୀୟ ଭାବରେ ବୃଦ୍ଧି ପାଇଥିବା ଜିନ୍‌ର ଜିନ୍ ଅଣ୍ଟୋଲୋଜି (GO) ଶବ୍ଦ ସମୃଦ୍ଧି ବିଶ୍ଳେଷଣ (ସମାୟୋଜିତ P < 0.05, ଫୋଲ୍ଡ ପରିବର୍ତ୍ତନ > 2, ଅତି କମରେ 10% ନ୍ୟୁକ୍ଲିୟସ୍‌ରେ ପ୍ରକାଶିତ)। h, hCO ଗ୍ଲୁଟାମେଟରଜିକ୍ ନ୍ୟୁରନ୍ ତୁଳନାରେ t-hCO ଗ୍ଲୁଟାମେଟରଜିକ୍ ନ୍ୟୁରନ୍‌ରେ ଉଲ୍ଲେଖନୀୟ ଭାବରେ ବୃଦ୍ଧି ପାଇଥିବା ଜିନ୍‌ର ଜିନ୍ ଅଣ୍ଟୋଲୋଜି (GO) ଶବ୍ଦ ସମୃଦ୍ଧି ବିଶ୍ଳେଷଣ (ସମାୟୋଜିତ P < 0.05, ଫୋଲ୍ଡ ପରିବର୍ତ୍ତନ > 2, ଅତି କମରେ 10% ନ୍ୟୁକ୍ଲିୟସ୍‌ରେ ପ୍ରକାଶିତ)। ଘ бөтенронами hCO h, hCO ଗ୍ଲୁଟାମେଟରଜିକ୍ ନ୍ୟୁରନ୍ ତୁଳନାରେ t-hCO ଗ୍ଲୁଟାମେଟରଜିକ୍ ନ୍ୟୁରନ୍‌ରେ ଗୁରୁତ୍ୱପୂର୍ଣ୍ଣ ସକ୍ରିୟକରଣ (ସମାୟୋଜିତ P<0.05, ଫୋଲ୍ଡ ପରିବର୍ତ୍ତନ >2, ଅତି କମରେ 10% ନ୍ୟୁକ୍ଲିୟସ୍‌ରେ ପ୍ରକାଶନ) ସହିତ ଜିନ୍ ପାଇଁ ଜିନ୍ ଅଣ୍ଟୋଲୋଜି (GO) ଶବ୍ଦ ସମୃଦ୍ଧି ବିଶ୍ଳେଷଣ। h ，与 hCO 谷氨酸能神经元相比， t-hCO 谷氨酸能神经元中基因显着上调（调整后 P <0.05 ，倍数变化> 2 ，在至少 10% 的细胞核中表达）的基因本体论 (GO) 术语富集分析。 h ， co hco 谷氨酸 能-t-hco 谷氨酸 能 后 <

2 ， 至少 10% 的%% 基因 基因 的 的 的 的 的 GO (GO) 术语富集分析。 ଘ (GO) ماжа аа обощщения h, hCO ଗ୍ଲୁଟାମେଟରଜିକ୍ ନ୍ୟୁରନ୍ ତୁଳନାରେ t-hCO ଗ୍ଲୁଟାମେଟରଜିକ୍ ନ୍ୟୁରନ୍‌ରେ ଜିନ୍‌ଗୁଡ଼ିକୁ ଯଥେଷ୍ଟ ଭାବରେ ଉନ୍ନତ କରାଯାଇଥିଲା (P < 0.05, ଫୋଲ୍ଡ ପରିବର୍ତ୍ତନ > 2, ଅତି କମରେ 10% ନ୍ୟୁକ୍ଲିୟସ୍‌ରେ ପ୍ରକାଶିତ) ସମୃଦ୍ଧ ଶବ୍ଦର ଅଣ୍ଟୋଲୋଜିକାଲ୍ (GO) ବିଶ୍ଳେଷଣ।ବିନ୍ଦୁଯୁକ୍ତ ରେଖା 0.05 ର aq ମୂଲ୍ୟ ସୂଚାଇଥାଏ। i, ଏକ ସନ୍ଦର୍ଭ 22 snRNA-seq ବୟସ୍କ ମୋଟର କର୍ଟେକ୍ସ ଡାଟାସେଟରୁ ଲେବଲ ସ୍ଥାନାନ୍ତର ବ୍ୟବହାର କରି t-hCO ରେ GluN କୋଷ ପ୍ରକାରର UMAP ଇମେଜିଂ। CT - କର୍ଟିକୋଥାଲାମିକ୍ କୋଷ, ET - ଏକ୍ସଟ୍ରାସେରେବ୍ରାଲ୍ କୋଷ, IT - ଆଭ୍ୟନ୍ତରୀଣ ଟେଲେନସେଫାଲିକ୍ କୋଷ, NP - ପ୍ରୋଜେକ୍ସନ ନିକଟରେ।
ତା'ପରେ ଆମେ ସାଇଟୋଆର୍କିଟେକ୍ଚର ଏବଂ t-hCO ର ସାମଗ୍ରିକ କୋଷୀୟ ଗଠନ ମୂଲ୍ୟାଙ୍କନ କଲୁ। ମୂଷା ଏଣ୍ଡୋଥେଲିଆଲ୍ କୋଷଗୁଡ଼ିକର ଆଣ୍ଟିବଡି ସ୍ଟେନିଂ t-hCO ସହିତ ଭାସ୍କୁଲାରାଇଜେସନ୍ ପ୍ରକାଶ କଲା, ଯେତେବେଳେ IBA1 ସ୍ଟେନିଂ ସମଗ୍ର ଗ୍ରାଫ୍ଟରେ ମୂଷା ମାଇକ୍ରୋଗ୍ଲିଆର ଉପସ୍ଥିତି ପ୍ରକାଶ କଲା (ଚିତ୍ର 1f ଏବଂ ବିସ୍ତାରିତ ତଥ୍ୟ, ଚିତ୍ର 3c,d)। ଇମ୍ୟୁନୋଷ୍ଟେନିଂ ମାନବ ନ୍ୟୁକ୍ଲିୟର ଆଣ୍ଟିଜେନ୍ (HNA) ପଜିଟିଭ୍ କୋଷଗୁଡ଼ିକୁ PPP1R17 (କର୍ଟିକାଲ୍ ପ୍ରୋଜେନିଟର), NeuN (ନ୍ୟୁରନ୍), SOX9 ଏବଂ GFAP (ଗ୍ଲିଆଲ୍-ଉତ୍ପନ୍ନ କୋଷ) କିମ୍ବା PDGFRα (ଅଲିଗୋଡେଣ୍ଡ୍ରୋସାଇଟ୍ ପ୍ରୋଜେନିଟର) ସହ-ପ୍ରକାଶ କରୁଥିବା ପ୍ରକାଶ କଲା (ଚିତ୍ର 1f)। ଏକକ କୋଷ ରିଜୋଲ୍ୟୁସନରେ t-hCO ର କୋଷୀୟ ଗଠନ ଅଧ୍ୟୟନ କରିବା ପାଇଁ, ଆମେ ପ୍ରାୟ 8 ମାସର ପାର୍ଥକ୍ୟ ପରେ ଏକକ-କୋର RNA ସିକୋଇନ୍ସିଂ (snRNA-seq) କରିଥିଲୁ। ମୂଷା ନ୍ୟୁକ୍ଲିୟରର ବଲ୍କ ଫିଲ୍ଟେରେସନ୍ ଏବଂ ଅପସାରଣ 21,500 ଉଚ୍ଚ-ଗୁଣବତ୍ତା ମାନବ ମୋନୋନ୍ୟୁକ୍ଲିୟର ମାନଚିତ୍ର (ଚିତ୍ର 1g ଏବଂ ବିସ୍ତାରିତ ତଥ୍ୟ, ଚିତ୍ର 4a,b) ପ୍ରଦାନ କରିଥିଲା। ସାଧାରଣ କୋଷ-ପ୍ରକାର ମାର୍କରଗୁଡ଼ିକର ପ୍ରକାଶନ ଢାଞ୍ଚାଗୁଡ଼ିକ ପ୍ରମୁଖ କର୍ଟିକାଲ୍ କୋଷ ଶ୍ରେଣୀଗୁଡ଼ିକର କ୍ଲଷ୍ଟରଗୁଡ଼ିକୁ ଚିହ୍ନଟ କରିଥିଲା, ଯେଉଁଥିରେ ଗଭୀର ଏବଂ ଉପରସ୍ତରର ଗ୍ଲୁଟାମେଟର୍ଜିକ୍ ନ୍ୟୁରନ୍, ସଞ୍ଚାଳନକାରୀ ପ୍ରୋଜେନିଟର, ଅଲିଗୋଡେଣ୍ଡ୍ରୋସାଇଟ୍ସ ଏବଂ ଆଷ୍ଟ୍ରୋସାଇଟ୍ ବଂଶ ଅନ୍ତର୍ଭୁକ୍ତ (ଚିତ୍ର 1g, ବିସ୍ତାରିତ ତଥ୍ୟ, ଚିତ୍ର 4c, ଏବଂ ପରିପୂରକ ସାରଣୀ 3)। SATB2 ଏବଂ CTIP2 ପାଇଁ ଇମ୍ୟୁନୋଷ୍ଟେନିଂ ଦେଖାଇଥିଲା ଯେ କର୍ଟିକାଲ୍ ଉପପ୍ରକାରର ଉପସ୍ଥିତି ସତ୍ତ୍ୱେ, t-hCO ସ୍ପଷ୍ଟ ଆନାଟୋମିକ୍ ସ୍ତରୀକରଣ ଦେଖାଇ ନଥିଲା (ବିସ୍ତାରିତ ତଥ୍ୟ, ଚିତ୍ର 3a)। ପର୍ଯ୍ୟାୟ-ମେଳ ଖାଉଥିବା snRNA-seq hCO ବ୍ୟାପକ ଭାବରେ ସମାନ କୋଷ ଶ୍ରେଣୀ ଉତ୍ପାଦନ କରିଥିଲା, କିଛି ବ୍ୟତିକ୍ରମ ସହିତ, ଅଲିଗୋଡେଣ୍ଡ୍ରୋସାଇଟ୍ସର ଅନୁପସ୍ଥିତି ଏବଂ GABAergic ନ୍ୟୁରନ୍‌ର ଉପସ୍ଥିତି, ଯାହା ପାର୍ଶ୍ଵବର୍ତ୍ତୀ ପ୍ରୋଜେନିଟର କୋଷ ପାଇଁ ପୂର୍ବରୁ ରିପୋର୍ଟ କରାଯାଇଥିବା ଅନୁକୂଳ ଇନ ଭିଟ୍ରୋ ପରିସ୍ଥିତିକୁ ପ୍ରତିଫଳିତ କରିପାରେ15 (ବିସ୍ତାରିତ ତଥ୍ୟ, ଚିତ୍ର 4f – i ଏବଂ ପରିପୂରକ ସାରଣୀ 4)। ଡିଫରେନ୍ସିଆଲ୍ ଜିନ୍ ପ୍ରକାଶନ ବିଶ୍ଳେଷଣ t-hCO ଏବଂ hCO ମଧ୍ୟରେ ଗ୍ଲୁଟାମେଟର୍ଜିକ୍ ନ୍ୟୁରନ୍‌ରେ ଗୁରୁତ୍ୱପୂର୍ଣ୍ଣ ପାର୍ଥକ୍ୟ ପ୍ରକାଶ କରିଥିଲା ​​(ପରିପୂରକ ସାରଣୀ 5), ଯେଉଁଥିରେ ସିନାପ୍ଟିକ୍ ସିଗନାଲିଂ, ଡେଣ୍ଡ୍ରିଟିକ୍ ସ୍ଥାନୀୟକରଣ ଏବଂ ଭୋଲଟେଜ୍-ଗେଟେଡ୍ ଚ୍ୟାନେଲ୍ କାର୍ଯ୍ୟକଳାପ (ଚିତ୍ର 1h ଏବଂ ପରିପୂରକ ସାରଣୀ 5) ଭଳି ନ୍ୟୁରୋନାଲ୍ ପରିପକ୍ୱତା ସହିତ ଜଡିତ ଜିନ୍‌ର ସେଟ୍‌ର ସକ୍ରିୟକରଣ ଅନ୍ତର୍ଭୁକ୍ତ। ସାରଣୀ 6)। ତଦନୁସାରେ, କର୍ଟିକାଲ୍ ଗ୍ଲୁଟାମେଟର୍ଜିକ୍ t-hCO ନ୍ୟୁରନ୍‌ଗୁଡ଼ିକ ତ୍ୱରିତ ଟ୍ରାନ୍ସକ୍ରିପସନ୍‌ ପରିପକ୍ୱତା ପ୍ରଦର୍ଶନ କରିଥିଲେ।
t-hCO ରେ ଏହି ଟ୍ରାନ୍ସକ୍ରିପସନଲ୍ ପରିବର୍ତ୍ତନଗୁଡ଼ିକ hCO ଇନ୍ ଭିଟ୍ରୋ ଏବଂ t-hCO ଇନ୍ ଭିଭୋ ମଧ୍ୟରେ ରୂପଗତ ପାର୍ଥକ୍ୟ ସହିତ ଜଡିତ କି ନାହିଁ ତାହା ସ୍ପଷ୍ଟ କରିବା ପାଇଁ, ଆମେ 7-8 ମାସର ପାର୍ଥକ୍ୟ ପରେ ତୀବ୍ର ବିଭାଗରେ ପର୍ଯ୍ୟାୟ-ମେଳ ଖାଉଥିବା ବାୟୋସାଇଟିନ୍-ଭରା hCO ଏବଂ hCO ପୁନଃନିର୍ମାଣ କରିଥିଲୁ। hCO ନ୍ୟୁରନ୍ (ଚିତ୍ର 2a)। t-hCO ନ୍ୟୁରନ୍ ଯଥେଷ୍ଟ ବଡ଼ ଥିଲା, ସୋମା ବ୍ୟାସର 1.5 ଗୁଣ, ଡେଣ୍ଡ୍ରାଇଟ୍‌ର ଦୁଇଗୁଣ ଏବଂ ଇନ ଭିଟ୍ରୋ hCO ତୁଳନାରେ ମୋଟ ଡେଣ୍ଡ୍ରିଟିକ୍ ଲମ୍ବରେ ସାମଗ୍ରିକ ଛଅ ଗୁଣ ବୃଦ୍ଧି ପାଇଥିଲା (ଚିତ୍ର 2b)। ଏହା ସହିତ, ଆମେ hCO ନ୍ୟୁରନ୍ ତୁଳନାରେ t-hCO ନ୍ୟୁରନ୍‌ରେ ଡେଣ୍ଡ୍ରିଟିକ୍ ମେରୁଦଣ୍ଡର ଏକ ଉଲ୍ଲେଖନୀୟ ଭାବରେ ଅଧିକ ଘନତ୍ୱ ଦେଖିଲୁ (ଚିତ୍ର 2c)। ଏହା ସୂଚାଇ ଦିଏ ଯେ t-hCO ନ୍ୟୁରନ୍‌ଗୁଡ଼ିକ ବ୍ୟାପକ ଡେଣ୍ଡ୍ରିଟିକ୍ ଲମ୍ବନ ଏବଂ ଶାଖାକରଣରୁ ବର୍ତ୍ତି ପାରନ୍ତି, ଯାହା ନିରନ୍ତର କୋଷ ପ୍ରସାର ସହିତ ମିଶ୍ରଣ କରି, ପ୍ରତିରୋପଣ ପରେ t-hCO ର ଘନ ବୃଦ୍ଧିରେ ଯୋଗଦାନ ଦେଇପାରେ (ଚିତ୍ର 1d ଏବଂ ବିସ୍ତାରିତ ତଥ୍ୟ ଚିତ୍ର 1f)। ଏହା ଆମକୁ ଇଲେକ୍ଟ୍ରୋଫିଜିଓଲୋଜିକାଲ୍ ଗୁଣଗୁଡ଼ିକର ତଦନ୍ତ କରିବାକୁ ପ୍ରେରଣା ଦେଇଥିଲା। ମେମ୍ବ୍ରେନ୍ କ୍ୟାପାସିଟାନ୍ସ ଆଠ ଗୁଣ ଅଧିକ ଥିଲା (ବିସ୍ତାରିତ ତଥ୍ୟ, ଚିତ୍ର 8d), ବିଶ୍ରାମ-ଅବସ୍ଥା ମେମ୍ବ୍ରେନ୍ ପୋଟେନ୍ସିଆଲ୍ ଅଧିକ ହାଇପରପୋଲାରାଇଜଡ୍ ଥିଲା (ପ୍ରାୟ 20 mV), ଏବଂ କରେଣ୍ଟ ଇଞ୍ଜେକ୍ସନ୍ hCO ନ୍ୟୁରନ୍ ତୁଳନାରେ t-hCO ନ୍ୟୁରନ୍‌ରେ ସର୍ବାଧିକ ଉତ୍ତେଜନା ହାରକୁ ପ୍ରେରିତ କରିଥିଲା। ଇନ୍ ଭିଟ୍ରୋ (ଚିତ୍ର 2d), e), ଯାହା t-hCO ର ବୃହତ ଏବଂ ଅଧିକ ଜଟିଳ ରୂପଗତ ବୈଶିଷ୍ଟ୍ୟଗୁଡ଼ିକ ସହିତ ସୁସଙ୍ଗତ। ଏହା ସହିତ, t-hCO ନ୍ୟୁରନ୍‌ରେ ସ୍ୱତଃସ୍ଫୂର୍ତ୍ତ ଉତ୍ତେଜକ ପୋଷ୍ଟସିନାପ୍ଟିକ୍ କରେଣ୍ଟ ଇଭେଣ୍ଟସ୍ (EPSC) ର ଫ୍ରିକ୍ୱେନ୍ସି ଯଥେଷ୍ଟ ଅଧିକ ଥିଲା (ଚିତ୍ର 2f), ଯାହା ସୂଚାଇ ଦିଏ ଯେ t-hCO ନ୍ୟୁରନ୍‌ରେ ପରିଲକ୍ଷିତ ଡେଣ୍ଡ୍ରିଟିକ୍ ମେରୁଦଣ୍ଡର ବର୍ଦ୍ଧିତ ଘନତ୍ୱ କାର୍ଯ୍ୟକ୍ଷମ ଉତ୍ତେଜନା ସହିତ ଜଡିତ ଥିଲା। ଯୌନ ସିନାପ୍ସ। ଆମେ ଲେବଲ୍ ହୋଇଥିବା ଗ୍ଲୁଟାମେଟର୍ଜିକ୍ ନ୍ୟୁରନ୍ (ବିସ୍ତାରିତ ତଥ୍ୟ, ଚିତ୍ର 6a-c) ରେକର୍ଡ କରି ଭିଟ୍ରୋରେ hCO ନ୍ୟୁରନ୍‌ର ଅପରିପକ୍ୱ ଚରିତ୍ରକୁ ନିଶ୍ଚିତ କରିଥିଲୁ।
a, 8 ମାସର ପାର୍ଥକ୍ୟ ପରେ ବାୟୋସାଇଟିନ୍-ଭରା hCO ଏବଂ t-hCO ନ୍ୟୁରନ୍‌ର 3D ପୁନଃନିର୍ମାଣ। b, ଆକୃତିଗତ ବୈଶିଷ୍ଟ୍ୟଗୁଡ଼ିକର ପରିମାଣକରଣ (n = 8 hCO ନ୍ୟୁରନ୍, n = 6 t-hCO ନ୍ୟୁରନ୍; **P = 0.0084, *P = 0.0179 ଏବଂ ***P < 0.0001)। b, ଆକୃତିଗତ ବୈଶିଷ୍ଟ୍ୟଗୁଡ଼ିକର ପରିମାଣକରଣ (n = 8 hCO ନ୍ୟୁରନ୍, n = 6 t-hCO ନ୍ୟୁରନ୍; **P = 0.0084, *P = 0.0179 ଏବଂ ***P < 0.0001)। б, количественная оценка морфологических признаков (n = 8 кирононов hCO, n = 6 киронронов t-hCO; ** P = 0,0084, * P = 0,0179 и *** P <0,0001)। b, ଆକୃତିଗତ ବୈଶିଷ୍ଟ୍ୟଗୁଡ଼ିକର ପରିମାଣକରଣ (n=8 hCO ନ୍ୟୁରନ୍, n=6 t-hCO ନ୍ୟୁରନ୍; **P=0.0084, *P=0.0179, ଏବଂ ***P<0.0001)। b ，形态学特征的量化（ n = 8 个 hCO 神经元， n = 6 个 t-hCO 神经元； ** P = 0.0084 ， * P = 0.0179 和 *** P <0.0001 ）。 b ，形态学特征的量化（ n = 8 个 hCO 神经元， n = 6 个 t-hCO 神经元； ** P = 0.0084 ， * P = 0.0179 和 *** P <0.0001 ）。 б, количественная оценка морфологических признаков (n = 8 кирононов hCO, n = 6 киронронов t-hCO; ** P = 0,0084, * P = 0,0179 и *** P <0,0001)। b, ଆକୃତିଗତ ବୈଶିଷ୍ଟ୍ୟଗୁଡ଼ିକର ପରିମାଣକରଣ (n=8 hCO ନ୍ୟୁରନ୍, n=6 t-hCO ନ୍ୟୁରନ୍; **P=0.0084, *P=0.0179, ଏବଂ ***P<0.0001)।c, 8 ମାସର ପାର୍ଥକ୍ୟ ପରେ hCO ଏବଂ t-hCO ଡେଣ୍ଡ୍ରିଟିକ୍ ଶାଖାଗୁଡ଼ିକର 3D ପୁନଃନିର୍ମାଣ। ଲାଲ ତାରକା ଚିହ୍ନ ପୋଟେଟିଭ୍ ଡେଣ୍ଡ୍ରିଟିକ୍ ମେରୁଦଣ୍ଡକୁ ସୂଚିତ କରେ। ଡେଣ୍ଡ୍ରିଟିକ୍ ମେରୁଦଣ୍ଡ ଘନତା ପରିମାଣ (n = 8 hCO ନ୍ୟୁରନ୍, n = 6 t-hCO ନ୍ୟୁରନ୍; **P = 0.0092)। d, ବିଶ୍ରାମ ଝିଲ୍ଲୀ ସମ୍ଭାବନାର ପରିମାଣ (n = 25 hCO ନ୍ୟୁରନ୍, n = 16 t-hCO ନ୍ୟୁରନ୍; ***P < 0.0001)। d, ବିଶ୍ରାମ ଝିଲ୍ଲୀ ସମ୍ଭାବନାର ପରିମାଣ (n = 25 hCO ନ୍ୟୁରନ୍, n = 16 t-hCO ନ୍ୟୁରନ୍; ***P < 0.0001)। ଘ d, ବିଶ୍ରାମକାଳୀନ ମେମ୍ବ୍ରାନ୍ ପୋଟେନସିଆଲ୍ ପରିମାଣୀକରଣ (n = 25 hCO ନ୍ୟୁରନ୍, n = 16 t-hCO ନ୍ୟୁରନ୍; ***P < 0.0001)। d ，静息膜电位的量化（ n = 25 hCO 神经元， n = 16 t-hCO 神经元； *** P <0.0001 ）。 d ，静息膜电位的量化（ n = 25 hCO 神经元， n = 16 t-hCO 神经元； *** P <0.0001 ）。 ଘ d, ବିଶ୍ରାମକାଳୀନ ମେମ୍ବ୍ରାନ୍ ପୋଟେନସିଆଲ୍ ପରିମାଣୀକରଣ (n = 25 hCO ନ୍ୟୁରନ୍, n = 16 t-hCO ନ୍ୟୁରନ୍; ***P < 0.0001)। e, ବର୍ଦ୍ଧିତ କରେଣ୍ଟ ଇଞ୍ଜେକ୍ସନ ଦ୍ୱାରା ପ୍ରେରିତ hCO ଏବଂ t-hCO ରେ ପୁନରାବୃତ୍ତି କ୍ରିୟା ବିଭବ ଫାୟାରିଂ, ଏବଂ ସର୍ବାଧିକ ଫାୟାରିଂ ହାରର ପରିମାଣ (n = 25 hCO ନ୍ୟୁରନ୍, n = 16 t-hCO ନ୍ୟୁରନ୍; ***P < 0.0001)। e, ବର୍ଦ୍ଧିତ କରେଣ୍ଟ ଇଞ୍ଜେକ୍ସନ ଦ୍ୱାରା ପ୍ରେରିତ hCO ଏବଂ t-hCO ରେ ପୁନରାବୃତ୍ତି କ୍ରିୟା ବିଭବ ଫାୟାରିଂ, ଏବଂ ସର୍ବାଧିକ ଫାୟାରିଂ ହାରର ପରିମାଣ (n = 25 hCO ନ୍ୟୁରନ୍, n = 16 t-hCO ନ୍ୟୁରନ୍; ***P < 0.0001)। , e, ସର୍ବାଧିକ ଫାୟାରିଂ ହାରର ବର୍ତ୍ତମାନର ବୃଦ୍ଧି ଏବଂ ପରିମାଣୀକରଣ ଦ୍ୱାରା hCO ଏବଂ t-hCO ରେ କ୍ରିୟା ବିଭବ ପୁନଃ-ଫାୟାରିଂ (n = 25 hCO ନ୍ୟୁରନ୍, n = 16 t-hCO ନ୍ୟୁରନ୍; *** P < 0.0001)। e ，通过增加电流注入诱导的 hCO 和 t-hCO 重复动作电位放电，以及最大放电率的量化（ n = 25 个 hCO 神经元， n = 16 个 t-hCO 神经元； *** P <0.0001 ）。 E ， 通过 增加 电流 co co hco 和 t-hco 重复 电位 放电 = = = （（ = n = 25 个 hco 神经 ， n = 16 个 t-hco 神经 ； *** p <0.0001）。 , e, ବର୍ଦ୍ଧିତ କରେଣ୍ଟ ଯୋଗାଣ ଏବଂ ସର୍ବାଧିକ ଫାୟାରିଂ ହାରର ପରିମାଣୀକରଣ ଦ୍ୱାରା ପ୍ରେରିତ hCO ଏବଂ t-hCO କ୍ରିୟା କ୍ଷମତାର ପୁନରାବୃତ୍ତି ଫାୟାରିଂ (n = 25 hCO ନ୍ୟୁରନ୍, n = 16 t-hCO ନ୍ୟୁରନ୍; *** P < 0.0001)। f, 8 ମାସର ପାର୍ଥକ୍ୟରେ hCO ଏବଂ t-hCO ନ୍ୟୁରନ୍‌ରେ ସ୍ୱତଃସ୍ଫୂର୍ତ୍ତ EPSCs (sEPSCs), ଏବଂ ସିନାପ୍ଟିକ୍ ଘଟଣାଗୁଡ଼ିକର ଆବୃତ୍ତିର ପରିମାଣ (n = 25 hCO ନ୍ୟୁରନ୍, n = 17 t-hCO ନ୍ୟୁରନ୍; ***P < 0.0001)। f, 8 ମାସର ପାର୍ଥକ୍ୟରେ hCO ଏବଂ t-hCO ନ୍ୟୁରନ୍‌ରେ ସ୍ୱତଃସ୍ଫୂର୍ତ୍ତ EPSCs (sEPSCs), ଏବଂ ସିନାପ୍ଟିକ୍ ଘଟଣାଗୁଡ଼ିକର ଆବୃତ୍ତିର ପରିମାଣ (n = 25 hCO ନ୍ୟୁରନ୍, n = 17 t-hCO ନ୍ୟୁରନ୍; ***P < 0.0001)। f, спонтанные EPSC (sEPSC) варонахах hCO и t-hCO через 8 месяцев диф фццировки һәм количественная оценка частоты синаптических событий (n = 25 କାରିରୋନୋଭ hCO, n = 17 କାନронов t-hCO) *** P <0,0001; f, 8 ମାସର ସିନାପ୍ଟିକ୍ ଘଟଣା ହାରର ପାର୍ଥକ୍ୟ ଏବଂ ପରିମାଣୀକରଣରେ hCO ଏବଂ t-hCO ନ୍ୟୁରନ୍‌ରେ ସ୍ୱତଃସ୍ଫୂର୍ତ୍ତ EPSCs (sEPSCs) (n=25 hCO ନ୍ୟୁରନ୍, n=17 t-hCO ନ୍ୟୁରନ୍; ***P<0.0001)। f ，分化 8 个月时 hCO 和 t-hCO 神经元中的自发性 EPSCs (sEPSCs) ，以及突触事件频率的量化（ n = 25 hCO 神经元， n = 17 t-hCO 神经元； *** P <0.0001） | f ，分化 8 个月时 hCO 和 t-hCO 神经元中的自发性 EPSCs (sEPSCs) ，以及突触事件频率的量匼（ n = 25 hCO 神率的量匼（ n = 25 hCO 神率的量匼（ n = 25hCO P <0.0001） | f, спонтанные EPSC (sEPSC) варонахах hCO и t-hCO через 8 месяцев диф фццировки һәм количественная оценка частоты синаптических событий (n = 25 କାରିରୋନୋଭ hCO, n = 17 କାନронов t-hCO) *** P <0,0001; f, 8 ମାସର ସିନାପ୍ଟିକ୍ ଘଟଣା ହାରର ପାର୍ଥକ୍ୟ ଏବଂ ପରିମାଣୀକରଣରେ hCO ଏବଂ t-hCO ନ୍ୟୁରନ୍‌ରେ ସ୍ୱତଃସ୍ଫୂର୍ତ୍ତ EPSCs (sEPSCs) (n = 25 hCO ନ୍ୟୁରନ୍, n = 17 t-hCO ନ୍ୟୁରନ୍; *** P<0.0001)।bf ପାଇଁ, 1208-2 ରେ ଥିବା hCO ଏବଂ t-hCO ସମାନ ଭିନ୍ନତା ବ୍ୟାଚ୍ ରୁ ନିଆଯାଇଥିଲା ଯାହା ସମାନ୍ତରାଳ ଭାବରେ ପରିଚାଳିତ ହୋଇଥିଲା। g, ଏକ ଭିଭୋ ମାଉସ ଅଧ୍ୟୟନ 16 ଏବଂ ଇନ୍ ଭିଟ୍ରୋ ନ୍ୟୁରନ 17 ରୁ ମାନବ-ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟ LRGs ଚିହ୍ନଟ ହୋଇଥିବା ପ୍ରାରମ୍ଭିକ-ପ୍ରତିକ୍ରିୟା (ERG) ଏବଂ ବିଳମ୍ବ-ପ୍ରତିକ୍ରିୟା (LRG) କାର୍ଯ୍ୟକଳାପ-ନିର୍ଭରଶୀଳ ଜିନ୍ ସହିତ hCO ଗ୍ଲୁଟାମେଟରଜିକ୍ ନ୍ୟୁରନ୍ ତୁଳନାରେ t-hCO ଗ୍ଲୁଟାମେଟରଜିକ୍ ନ୍ୟୁରନ୍‌ରେ ଉଲ୍ଲେଖନୀୟ ଭାବରେ ବୃଦ୍ଧି ପାଇଥିବା (ସମଯୋଜିତ P < 0.05, ଫୋଲ୍ଡ ପରିବର୍ତ୍ତନ > 2, ଅତି କମରେ 10% ନ୍ୟୁକ୍ଲିୟସ୍‌ରେ ପ୍ରକାଶିତ) ଜିନ୍ ସେଟ୍ ସମୃଦ୍ଧି ବିଶ୍ଳେଷଣ (ଏକ-ପାର୍ଶ୍ଵ ଫିସରଙ୍କ ସଠିକ୍ ପରୀକ୍ଷା)। g, ଏକ ଭିଭୋ ମାଉସ ଅଧ୍ୟୟନ 16 ଏବଂ ଇନ୍ ଭିଟ୍ରୋ ନ୍ୟୁରନ 17 ରୁ ମାନବ-ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟ LRGs ଚିହ୍ନଟ ହୋଇଥିବା ପ୍ରାରମ୍ଭିକ-ପ୍ରତିକ୍ରିୟା (ERG) ଏବଂ ବିଳମ୍ବ-ପ୍ରତିକ୍ରିୟା (LRG) କାର୍ଯ୍ୟକଳାପ-ନିର୍ଭରଶୀଳ ଜିନ୍ ସହିତ hCO ଗ୍ଲୁଟାମେଟରଜିକ୍ ନ୍ୟୁରନ୍ ତୁଳନାରେ t-hCO ଗ୍ଲୁଟାମେଟରଜିକ୍ ନ୍ୟୁରନ୍‌ରେ ଉଲ୍ଲେଖନୀୟ ଭାବରେ ବୃଦ୍ଧି ପାଇଥିବା (ସମଯୋଜିତ P < 0.05, ଫୋଲ୍ଡ ପରିବର୍ତ୍ତନ > 2, ଅତି କମରେ 10% ନ୍ୟୁକ୍ଲିୟସ୍‌ରେ ପ୍ରକାଶିତ) ଜିନ୍ ସେଟ୍ ସମୃଦ୍ଧି ବିଶ୍ଳେଷଣ (ଏକ-ପାର୍ଶ୍ଵ ଫିସରଙ୍କ ସଠିକ୍ ପରୀକ୍ଷା)। گ сравнению с глута муерергическ амирононами hCO наб атинов как раннего (ERG), так и позднего (LRG) жанов, зависящих от активности, идентифицированных в исследовании на мшах виво16, и специичеческих дляйововека LRG из ишроновов। g, ଭିଭୋ ମାଉସ16 ରେ ଚିହ୍ନଟ ହୋଇଥିବା ପ୍ରାରମ୍ଭିକ (ERG) ଏବଂ ଶେଷ (LRG) କାର୍ଯ୍ୟକଳାପ-ନିର୍ଭରଶୀଳ ଜିନ୍ ଏବଂ ଭିଟ୍ରୋ17 ରେ ନ୍ୟୁରନ୍ ରୁ ମାନବ-ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟ LRGs ର hCO ଗ୍ଲୁଟାମେଟରଜିକ୍ ନ୍ୟୁରନ୍ ସେଟ୍ ତୁଳନାରେ t-hCO ଗ୍ଲୁଟାମେଟରଜିକ୍ ନ୍ୟୁରନ୍‌ରେ ଗୁରୁତ୍ୱପୂର୍ଣ୍ଣ ସକ୍ରିୟକରଣ (ସମାୟୋଜିତ P<0.05, ଫୋଲ୍ଡ ପରିବର୍ତ୍ତନ >2, ଅତି କମରେ 10% ନ୍ୟୁକ୍ଲିୟସ୍‌ରେ ପ୍ରକାଶନ) ସହିତ ଜିନ୍‌ର ଜିନ୍ ସେଟ୍ ସମୃଦ୍ଧି (ଏକ-ଲାଞ୍ଜ ଫିସରଙ୍କ ସଠିକ୍ ପରୀକ୍ଷା) ବିଶ୍ଳେଷଣ। g ， t-hCO 谷氨酸能神经元与 hCO 谷氨酸能神经元相比， t-hCO 谷氨酸能神经元显着上调（调整后 P <0.05 ，倍数变化 | > 2 ，在至少 10% 的细胞核中表达）的基因集富集分析（单侧 ମତ୍ସ୍ୟ 精确检验）从体内小鼠研究中鉴定的早期反应 (ERG) 和晚期反应 (LRG) 活性依赖性基因的基因组 16 和体外神经元 17 中的人类特异性 LRG。 g ， t-hco 谷氨酸 神经 co co hco 谷氨酸 元-，-

2 ， 至少 至少 10% 的 细胞 核中 表达） isher isher isher isher isher isher 中 的 早期 l l (lrg) 活性 基因 基因组 16 和 神经元 17 中 中 17 中 17 的人类特异性 LRG。 گ فى Фиураа) раннего ответа (ERG) ଏବଂ позднего кыы, зависящие от активности ответа (LRG), идентифицированные в исследованях на мышах vivo 16 ରେ и витрон17 LRG, специфичные дляековека। g, t-hCO ଗ୍ଲୁଟାମେଟରଜିକ୍ ନ୍ୟୁରନ୍ hCO ଗ୍ଲୁଟାମେଟରଜିକ୍ ନ୍ୟୁରନ୍ ତୁଳନାରେ ଯଥେଷ୍ଟ ଭାବରେ ଉପନିୟନ୍ତ୍ରିତ ହୋଇଥିଲା (ସମାୟୋଜିତ P<0.05, ଫୋଲ୍ଡ ପରିବର୍ତ୍ତନ >2, ଅତି କମରେ 10% ପ୍ରାରମ୍ଭିକ ପ୍ରତିକ୍ରିୟା (ERG) ଏବଂ ବିଳମ୍ବ ପ୍ରତିକ୍ରିୟା ଜିନ୍ ସମୃଦ୍ଧି ବିଶ୍ଳେଷଣ (ଏକ-ଲାଞ୍ଜ ଫିସରଙ୍କ ସଠିକ୍ ପରୀକ୍ଷା) ପ୍ରତିକ୍ରିୟା କାର୍ଯ୍ୟକଳାପ ନିର୍ଭରଶୀଳ ଜିନ୍ (LRGs) ଭିଭୋ ମାଇସ16 ଏବଂ ଇନ ଭିଟ୍ରୋ ନ୍ୟୁରନ୍ରେ ଚିହ୍ନଟ ହୋଇଛି।17 ମାନବ ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟ LRGs।ବିନ୍ଦୁଯୁକ୍ତ ରେଖା 0.05.h ର ଏକ Bonferroni-ସଂଶୋଧିତ P ମୂଲ୍ୟ ସୂଚାଇଥାଏ, T-hCO ଗ୍ଲୁଟାମେଟରଜିକ୍ ନ୍ୟୁରନ୍‌ରେ LRG ଜିନ୍‌ର snRNA-seq ପ୍ରତିକୃତିରେ GluN ଜିନ୍‌ ପ୍ରକାଶନ (ପ୍ରତ୍ୟେକ ଜିନ୍‌ର ସୁଡୋ-ପ୍ୟାକେଜ୍ ଏବଂ ସ୍କେଲିଂ) ଉଲ୍ଲେଖନୀୟ ଭାବରେ ବୃଦ୍ଧି ପାଇଥିଲା। i, t-hCO (ଉପର) ଏବଂ hCO (ନିମ୍ନ) ନ୍ୟୁରନ୍‌ରେ SCG2 ପ୍ରକାଶନ ଦେଖାଉଥିବା ଇମ୍ୟୁନୋଷ୍ଟେନିଂ। ଧଳା ତୀର SCG2+ କୋଷଗୁଡ଼ିକୁ ସୂଚାଇଥାଏ। ସ୍କେଲ୍ ବାର୍, 25 µm। ତଥ୍ୟକୁ ମଧ୍ୟମ ± ମାନକ ବିଚ୍ୟୁତି ଭାବରେ ପ୍ରକାଶ କରାଯାଇଛି।
ଏକ୍ସ ଭିଭୋ ସ୍ଲାଇସରେ ପରିଲକ୍ଷିତ t-hCO ର ବର୍ଦ୍ଧିତ କାର୍ଯ୍ୟକଳାପ ଉପରେ ଆଧାର କରି, snRNA-seq hCO ଇନ ଭିଟ୍ରୋ ତୁଳନାରେ t-hCO ରେ ଜିନ୍ ଟ୍ରାନ୍ସକ୍ରିପ୍ଟର ଏକ କାର୍ଯ୍ୟକଳାପ-ନିର୍ଭରଶୀଳ ଅପରେଗୁଲେସନ୍ ପ୍ରକାଶ କରିଥିଲା। ଗ୍ଲୁଟାମାଟର୍ଜିକ୍ t-hCO ନ୍ୟୁରନ୍ ବିଳମ୍ବ ପ୍ରତିକ୍ରିୟା କାର୍ଯ୍ୟକଳାପକୁ ନିୟନ୍ତ୍ରଣ କରୁଥିବା ଜିନ୍ (ଚିତ୍ର 2g,h) ର ଉଚ୍ଚ ସ୍ତର ପ୍ରକାଶ କରିଥିଲା, ଯାହା ମୂଷା ଏବଂ ମାନବ ନ୍ୟୁରନ୍ 16,17 ରେ ପୂର୍ବ ଅଧ୍ୟୟନରେ ମିଳିଥିଲା। ଉଦାହରଣ ସ୍ୱରୂପ, BDNF18, SCG2, ଏବଂ OSTN, ଏକ ପ୍ରାଇମେଟ୍-ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟ କାର୍ଯ୍ୟକଳାପ-ନିୟନ୍ତ୍ରକ ଜିନ୍, hCO ନ୍ୟୁରନ୍ ତୁଳନାରେ t-hCO ନ୍ୟୁରନ୍ ରେ ବର୍ଦ୍ଧିତ ପ୍ରକାଶନ ଦେଖାଇଥିଲା (ଚିତ୍ର 2g-i)। ତେଣୁ, t-hCO ନ୍ୟୁରନ୍ ଟ୍ରାନ୍ସକ୍ରିପସନାଲ୍, ଆକୃତିଗତ ଏବଂ କାର୍ଯ୍ୟକ୍ଷମ ବିଶ୍ଳେଷଣ ଦ୍ୱାରା hCO ନ୍ୟୁରନ୍ ତୁଳନାରେ ବର୍ଦ୍ଧିତ ପରିପକ୍ୱତା ବୈଶିଷ୍ଟ୍ୟ ପ୍ରଦର୍ଶନ କରିଥିଲା।
ମାନବ ମସ୍ତିଷ୍କ ବିକାଶ ସହିତ t-hCO ପରିପକ୍ୱତାର ସମ୍ପର୍କକୁ ଆହୁରି ମୂଲ୍ୟାଙ୍କନ କରିବା ପାଇଁ, ଆମେ ଭ୍ରୁଣ ଏବଂ ବୟସ୍କ କର୍ଟିକାଲ୍ କୋଷ ପ୍ରକାର 19,20 ଏବଂ ବୟସ୍କ 21,22 ର ଟ୍ରାନ୍ସକ୍ରିପ୍ଟୋମିକ୍ ତୁଳନା ଏବଂ ବିକାଶ ସମୟରେ କର୍ଟିକାଲ୍ ଜିନ୍ ପ୍ରକାଶନ 23 ଉପରେ ବ୍ୟାପକ ତଥ୍ୟ (ବିସ୍ତାରିତ ତଥ୍ୟ, ଚିତ୍ର 5) କରିଥିଲୁ। ପୂର୍ବ କାର୍ଯ୍ୟ 24 ସହିତ, 7-8 ମାସର ଭିନ୍ନତାରେ ବିଶ୍ୱସ୍ତରୀୟ hCO ଏବଂ t-hCO ଟ୍ରାନ୍ସକ୍ରିପ୍ଟୋମ୍ ପରିପକ୍ୱତା ସ୍ଥିତି ଭିଭୋ ବିକାଶ ସମୟ ସହିତ ବ୍ୟାପକ ଭାବରେ ସୁସଙ୍ଗତ ଏବଂ ଏହା ଶେଷ ଭ୍ରୁଣ ଜୀବନ ସହିତ ସର୍ବାଧିକ ସମତୁଲ୍ୟ (ବିସ୍ତାରିତ ତଥ୍ୟ ଚିତ୍ର 5a)। ଉଲ୍ଲେଖନୀୟ ଭାବରେ, ଆମେ ବୟସ ସହିତ ମେଳ ଖାଉଥିବା hCO ତୁଳନାରେ t-hCO ରେ ବର୍ଦ୍ଧିତ ଟ୍ରାନ୍ସକ୍ରିପ୍ଟୋମ୍ ପରିପକ୍ୱତା ଦେଖିଥିଲୁ, ଏବଂ ସିନାପ୍ଟୋଜେନେସିସ୍, ଆଷ୍ଟ୍ରୋଜେନେସିସ୍ ଏବଂ ମାଇଲିନେସନ୍ ସହିତ ଜଡିତ ଟ୍ରାନ୍ସକ୍ରିପ୍ଟୋମ୍ ସକ୍ରିୟକରଣ (ବିସ୍ତାରିତ ତଥ୍ୟ, ଚିତ୍ର 5b-d) ଦେଖିଥିଲୁ। କୋଷୀୟ ସ୍ତରରେ, ଆମେ t-hCO ରେ ଏକ ପତଳା କର୍ଟେକ୍ସ ଉପପ୍ରକାରର ପ୍ରମାଣ ପାଇଲୁ, ଯେଉଁଥିରେ ଗ୍ଲୁଟାମେଟର୍ଜିକ୍ ନ୍ୟୁରନ୍ କ୍ଲଷ୍ଟରଗୁଡ଼ିକ ବୟସ୍କ L2/3, L5, ଏବଂ L6 ନ୍ୟୁରନ୍ ଉପପ୍ରକାର ସହିତ ଓଭରଲାପ୍ ହେଉଛି (ଚିତ୍ର 1i)। ବିପରୀତରେ, ଗର୍ଭଧାରଣର ମଧ୍ୟଭାଗରେ ଗ୍ଲୁଟାମେଟରଜିକ୍ t-hCO ନ୍ୟୁରନ୍ ଏବଂ ଭ୍ରୁଣ କର୍ଟିକାଲ୍ ନ୍ୟୁରନ୍ ମଧ୍ୟରେ କ୍ଲଷ୍ଟର ଓଭରଲାପ୍ ଅଧିକ ସୀମିତ ଥିଲା (ବିସ୍ତାରିତ ତଥ୍ୟ, ଚିତ୍ର 5e-j)। t-hCO ନ୍ୟୁରନ୍ ମାନବ ପ୍ରସବ ପରବର୍ତ୍ତୀ ନିଓକର୍ଟିକାଲ୍ ନ୍ୟୁରନ୍ ସହିତ କାର୍ଯ୍ୟକ୍ଷମ ଭାବରେ ସମାନ କି ନାହିଁ ତାହା ନିର୍ଣ୍ଣୟ କରିବା ପାଇଁ, ଆମେ ମାନବ ପ୍ରସବ ପରବର୍ତ୍ତୀ କର୍ଟେକ୍ସର ତୀକ୍ଷ୍ଣ ଅଂଶରେ ମାନବ L2/3 ପିରାମିଡାଲ୍ ନ୍ୟୁରନ୍ ର ଇଲେକ୍ଟ୍ରୋଫିଜିଓଲୋଜିକାଲ୍ ରେକର୍ଡିଂ ଏବଂ ଆନାଟୋମିକ୍ ପୁନଃନିର୍ମାଣ କରିଥିଲୁ (ବିସ୍ତାରିତ ତଥ୍ୟ, ଚିତ୍ର 7a)। L2/3 ପିରାମିଡାଲ୍ ନ୍ୟୁରନ୍ ର ଇଲେକ୍ଟ୍ରୋଫିଜିଓଲୋଜିକାଲ୍ ଗୁଣଗୁଡ଼ିକ t-hCO ପିରାମିଡାଲ୍ ନ୍ୟୁରନ୍ (ବିସ୍ତାରିତ ତଥ୍ୟ, ଚିତ୍ର 7e) ସହିତ ସମାନ ଥିଲା। ରୂପଗତ ଭାବରେ, ପ୍ରସବ ପରବର୍ତ୍ତୀ ମାନବ ନମୁନାରୁ L2/3 ନ୍ୟୁରନ୍ hCO ଅପେକ୍ଷା t-hCO ସହିତ ଅଧିକ ସମାନ ଥିଲା, ଯଦିଓ L2/3 କୋଷଗୁଡ଼ିକ ଲମ୍ବା ଥିଲା, ସାମଗ୍ରିକ ଭାବରେ ଅଧିକ ଶାଖା ଧାରଣ କରିଥିଲା, ଏବଂ ମେରୁଦଣ୍ଡ ଘନତା ଅଧିକ ଥିଲା (ଚିତ୍ର 3g ଏବଂ ବିସ୍ତାରିତ ତଥ୍ୟ, ଚିତ୍ର 7b-)। G)।
a, ନିୟନ୍ତ୍ରଣ ଏବଂ TS hiPS କୋଷ ରେଖା ଦ୍ୱାରା ଉତ୍ପାଦିତ hCO ର ନବଜାତ ମୂଷାରେ ପ୍ରତିରୋପଣ। b, 8 ମାସର ଭିନ୍ନତା ପରେ ବାୟୋସାଇଟିନ୍-ଭରା t-hCO ନ୍ୟୁରନ୍‌ର 3D ପୁନଃନିର୍ମାଣ। c, ହାରାହାରି ଡେଣ୍ଡ୍ରିଟିକ୍ ଲମ୍ବ ପରିମାଣ (n = 19 ନିୟନ୍ତ୍ରଣ ନ୍ୟୁରନ୍, n = 21 TS ନ୍ୟୁରନ୍; **P = 0.0041)। d, ନିୟନ୍ତ୍ରଣ ଏବଂ TS t-hCO ରୁ 3D-ପୁନର୍ନିର୍ମିତ ଡେଣ୍ଡ୍ରିଟିକ୍ ଶାଖାଗୁଡ଼ିକ 8 ମାସର ଭିନ୍ନତାରେ, ଏବଂ ଡେଣ୍ଡ୍ରିଟିକ୍ ମେରୁଦଣ୍ଡ ଘନତ୍ୱର ପରିମାଣ (n = 16 ନିୟନ୍ତ୍ରଣ ନ୍ୟୁରନ୍, n = 21 TS ନ୍ୟୁରନ୍, ***P < 0.0001)। d, ନିୟନ୍ତ୍ରଣ ଏବଂ TS t-hCO ରୁ 3D-ପୁନର୍ନିର୍ମିତ ଡେଣ୍ଡ୍ରିଟିକ୍ ଶାଖାଗୁଡ଼ିକ 8 ମାସର ଭିନ୍ନତାରେ, ଏବଂ ଡେଣ୍ଡ୍ରିଟିକ୍ ମେରୁଦଣ୍ଡ ଘନତ୍ୱର ପରିମାଣ (n = 16 ନିୟନ୍ତ୍ରଣ ନ୍ୟୁରନ୍, n = 21 TS ନ୍ୟୁରନ୍, ***P < 0.0001)। , d, 8 ମାସର ଭିନ୍ନତା ଏବଂ ଡେଣ୍ଡ୍ରିଟିକ୍ ମେରୁଦଣ୍ଡ ଘନତା ପରିମାଣୀକରଣରେ ନିୟନ୍ତ୍ରଣ ଏବଂ t-hCO TS ରୁ ଡେଣ୍ଡ୍ରିଟିକ୍ ଶାଖାଗୁଡ଼ିକର 3D ପୁନଃନିର୍ମାଣ (n=16 ନିୟନ୍ତ୍ରଣ ନ୍ୟୁରନ୍, n=21 TS ନ୍ୟୁରନ୍, ***P<0.0001)। d ，分化 8 个月时对照和 TS t-hCO 的 3D 重建树突分支，以及树突棘密度的量化（ n = 16 个对照神经元， n = 21 个 TS 神经元， *** P <0.0001 ）。 d ， 分化 8 个 时 s ts t-hco 的 3d 重建 分支 分支 树突棘 = = n = 16 个 元 ， n = 21 个 ts 神经 p *** p <0.0001 ）。 , d, 8 ମାସର ଭିନ୍ନତା ଏବଂ ଡେଣ୍ଡ୍ରିଟିକ୍ ମେରୁଦଣ୍ଡ ଘନତା ପରିମାଣୀକରଣରେ ନିୟନ୍ତ୍ରଣ ଡେଣ୍ଡ୍ରିଟିକ୍ ଶାଖା ଏବଂ TS t-hCO ର 3D ପୁନଃନିର୍ମାଣ (n=16 ନିୟନ୍ତ୍ରଣ ନ୍ୟୁରନ୍, n=21 TS ନ୍ୟୁରନ୍, ***P<0.0001)।ଲାଲ ତାରକା ଚିହ୍ନ ପୋଟେଟିଭ୍ ଡେଣ୍ଡ୍ରିଟିକ୍ ମେରୁଦଣ୍ଡକୁ ସୂଚିତ କରେ। e, ନିୟନ୍ତ୍ରଣରେ ସ୍ୱତଃସ୍ଫୂର୍ତ୍ତ EPSC ଏବଂ 8 ମାସର ଭିନ୍ନତା ପରେ TS t-hCO ନ୍ୟୁରନ୍। f, କ୍ରମବର୍ଦ୍ଧିତ ଫ୍ରିକ୍ୱେନ୍ସି ପ୍ଲଟ୍ ଏବଂ ସିନାପ୍ଟିକ୍ ଘଟଣାଗୁଡ଼ିକର ଫ୍ରିକ୍ୱେନ୍ସି ଏବଂ ଆମ୍ପ୍ଲିଚ୍ୟୁଡର ପରିମାଣ (n=32 ନିୟନ୍ତ୍ରଣ ନ୍ୟୁରନ୍, n=26 TS ନ୍ୟୁରନ୍; **P=0.0076 ଏବଂ P=0.8102)। g, hCO ଏବଂ t-hCO ରେ TS ଏବଂ ନିୟନ୍ତ୍ରଣ ନ୍ୟୁରନ୍‌ର Scholl ବିଶ୍ଳେଷଣ। ଡ୍ୟାସ୍ଡ୍ ରେଖାଗୁଡ଼ିକ ତୁଳନା ପାଇଁ ମାନବ L2/3 ପ୍ରସବପର ପିରାମିଡାଲ୍ ନ୍ୟୁରନ୍ ଦେଖାଏ (n = 24 ନିୟନ୍ତ୍ରଣ t-hCO ନ୍ୟୁରନ୍, n = 21 TS t-hCO ନ୍ୟୁରନ୍, n = 8 ନିୟନ୍ତ୍ରଣ hCO ନ୍ୟୁରନ୍, ଏବଂ n = 7 TS hCO ନ୍ୟୁରନ୍)। ତଥ୍ୟକୁ ମଧ୍ୟମା ± ମାନକ ବିଚ୍ୟୁତି ଭାବରେ ପ୍ରକାଶ କରାଯାଇଛି।
ଉଚ୍ଚ ସ୍ତରରେ ମାନବ କର୍ଟେକ୍ସ ନ୍ୟୁରନର ଆକୃତିଗତ ଏବଂ କାର୍ଯ୍ୟକ୍ଷମ ବୈଶିଷ୍ଟ୍ୟଗୁଡ଼ିକୁ ପ୍ରତିକୃତି କରିବା ପାଇଁ t-hCO ର କ୍ଷମତା ଆମକୁ ଅନୁସନ୍ଧାନ କରିବାକୁ ପ୍ରେରଣା ଦେଇଥିଲା ଯେ ରୋଗ ଫେନୋଟାଇପ୍ ଚିହ୍ନଟ କରିବା ପାଇଁ t-hCO ବ୍ୟବହାର କରାଯାଇପାରିବ କି ନାହିଁ। ଆମେ TS ଉପରେ ଧ୍ୟାନ ଦେଇଥିଲୁ, CaV1.2 ଜିନ୍ ଏନକୋଡିଂରେ ଲାଭ-ଅଫ୍-ଫଙ୍କସନ୍ ମ୍ୟୁଟେସନ୍ ଯୋଗୁଁ ଏକ ଗମ୍ଭୀର ନ୍ୟୁରୋଡେଭଲପମେଣ୍ଟାଲ୍ ବ୍ୟାଧି, ଯାହା ନ୍ୟୁରନ୍‌ରେ କାର୍ଯ୍ୟକଳାପ-ନିର୍ଭରଶୀଳ ଜିନ୍ ଟ୍ରାନ୍ସକ୍ରିପସନ୍ ଆରମ୍ଭ କରେ। ଆମେ ସବୁଠାରୁ ସାଧାରଣ ପ୍ରତିସ୍ଥାପନ (p.G406R) ଏବଂ ତିନୋଟି ନିୟନ୍ତ୍ରଣ (ଚିତ୍ର 3a) ବହନ କରୁଥିବା ତିନି ଜଣ TS ରୋଗୀଙ୍କଠାରୁ hCO ପାଇଲୁ। ପ୍ରତିରୋପଣ ପରେ, ଆମେ ଦେଖିଲୁ ଯେ ନିୟନ୍ତ୍ରଣ (ଚିତ୍ର 3b ଏବଂ ବିସ୍ତାରିତ ତଥ୍ୟ, ଚିତ୍ର 8a,b) ତୁଳନାରେ TS ନ୍ୟୁରନ୍‌ରେ ଡେଣ୍ଡ୍ରିଟିକ୍ ଆକୃତି ପରିବର୍ତ୍ତନ କରାଯାଇଥିଲା, ପ୍ରାଥମିକ ଡେଣ୍ଡ୍ରାଇଟ୍ ସଂଖ୍ୟାରେ ଦୁଇ ଗୁଣ ବୃଦ୍ଧି ଏବଂ ଡେଣ୍ଡ୍ରାଇଟିକ୍ ଲମ୍ବରେ ସାମଗ୍ରିକ ବୃଦ୍ଧି ଏବଂ ସାମଗ୍ରିକ ହ୍ରାସ (ଚିତ୍ର 3c ଏବଂ ବିସ୍ତାରିତ ତଥ୍ୟ, ଚିତ୍ର 8c) ସହିତ। ଏହା ନିୟନ୍ତ୍ରଣ ନ୍ୟୁରନ ତୁଳନାରେ TS ରେ ମେରୁଦଣ୍ଡର ବର୍ଦ୍ଧିତ ଘନତା ଏବଂ ସ୍ୱତଃସ୍ଫୂର୍ତ୍ତ EPSCs ର ବର୍ଦ୍ଧିତ ଫ୍ରିକ୍ୱେନ୍ସି ସହିତ ଜଡିତ ଥିଲା (ଚିତ୍ର 3d–f ଏବଂ ବିସ୍ତାରିତ ତଥ୍ୟ, ଚିତ୍ର 8g)। ଅଧିକ ବିଶ୍ଳେଷଣ ନିୟନ୍ତ୍ରଣ ତୁଳନାରେ t-hCO TS ରେ ଅସ୍ୱାଭାବିକ ଡେଣ୍ଡ୍ରିଟିକ୍ ଶାଖାକରଣର ନମୁନା ପ୍ରକାଶ କରିଥିଲା, କିନ୍ତୁ ସମାନ ପର୍ଯ୍ୟାୟରେ ଭିନ୍ନତା (ଚିତ୍ର 3g) ରେ ଭିଟ୍ରୋ TS hCO ରେ ନୁହେଁ। ଏହା TS ରେ କାର୍ଯ୍ୟକଳାପ-ନିର୍ଭରଶୀଳ ଡେଣ୍ଡ୍ରିଟିକ୍ ସଙ୍କୋଚନର ଆମର ପୂର୍ବ ରିପୋର୍ଟ ସହିତ ସୁସଙ୍ଗତ ଏବଂ ଭିଭୋରେ ରୋଗ ଫେନୋଟାଇପ୍ ଚିହ୍ନଟ କରିବା ପାଇଁ ଏହି ପ୍ରତିରୋପଣ ପ୍ଲାଟଫର୍ମର କ୍ଷମତାକୁ ଉଜ୍ଜ୍ୱଳ କରିଥାଏ।
ତା'ପରେ ଆମେ ପଚାରିଲୁ ଯେ ଟି-ଏଚ୍CO କୋଷଗୁଡ଼ିକ କେତେ ପରିମାଣରେ କାର୍ଯ୍ୟକ୍ଷମ ଭାବରେ ମୂଷା S1 ରେ ସଂଲଗ୍ନ। ମୂଷାମାନଙ୍କ ମଧ୍ୟରେ S1 ipsilateral ventral basal ଏବଂ posterior thalamic nuclei, ଏବଂ ipsilateral motor ଏବଂ secondary somatosenry cortices, ଏବଂ contralateral S1 (ଚିତ୍ର 4a) ରୁ ଶକ୍ତିଶାଳୀ synaptic ଇନପୁଟ୍ ଗ୍ରହଣ କରେ। ଇନର୍ଭେସନ୍ ପ୍ୟାଟର୍ନକୁ ପୁନଃସ୍ଥାପିତ କରିବା ପାଇଁ, ଆମେ hCO କୁ ରେବିଜ୍ ଭାଇରସ୍-dG-GFP/AAV-G ସହିତ ସଂକ୍ରମିତ କରିଥିଲୁ ଏବଂ 3 ଦିନ ପରେ hCO କୁ S1 ମୂଷାରେ ପ୍ରତିରୋପଣ କରିଥିଲୁ। ପ୍ରତିରୋପଣର 7-14 ଦିନ ପରେ ଆମେ ipsilateral S1 ଏବଂ ventral basal ganglia ର ନ୍ୟୁରନ୍‌ରେ ଘନ GFP ପ୍ରକାଶନ ଦେଖିଥିଲୁ (ଚିତ୍ର 4b, c)। ଏହା ସହିତ, ଥାଲାମିକ୍ ମାର୍କର ନେଟ୍ରିନ୍ G1 ର ଆଣ୍ଟିବଡି ସ୍ଟେନ୍ t-hCO ରେ ଥାଲାମିକ୍ ଶେଷର ଉପସ୍ଥିତି ପ୍ରକାଶ କରିଥିଲା ​​(ଚିତ୍ର 4d, e)। ଏହି ଆଫେରେଣ୍ଟ୍ ପ୍ରୋଜେକ୍ସନ୍ t-hCO କୋଷଗୁଡ଼ିକରେ ସିନାପ୍ଟିକ୍ ପ୍ରତିକ୍ରିୟା ସୃଷ୍ଟି କରିପାରିବ କି ନାହିଁ ତାହା ମୂଲ୍ୟାଙ୍କନ କରିବା ପାଇଁ, ଆମେ ଥାଲାମୋକର୍ଟିକାଲ୍ ସ୍ତରର ତୀକ୍ଷ୍ଣ ଅଂଶରେ ମାନବ କୋଷରୁ ସମ୍ପୂର୍ଣ୍ଣ କୋଷ ରେକର୍ଡିଂ କରିଥିଲୁ। AMPA ରିସେପ୍ଟର ପ୍ରତିପକ୍ଷ NBQX ସହିତ ସଂସ୍ପର୍ଶରେ ଆସିଥିବା t-hCO ନ୍ୟୁରନ୍‌ରେ ମୂଷା S1, ଆଭ୍ୟନ୍ତରୀଣ କ୍ୟାପସୁଲ୍, ଧଳା ପଦାର୍ଥ, t-hCO ନିକଟରେ ତନ୍ତୁ କିମ୍ବା t-hCO ରେ ଅପ୍ସିନ୍-ପ୍ରକାଶକ ଥାଲାମିକ୍ ଶେଷର ଅପ୍ଟୋଜେନେଟିକ୍ ସକ୍ରିୟକରଣର ବୈଦ୍ୟୁତିକ ଉତ୍ତେଜନା। (ଚିତ୍ର 4f, g ଏବଂ ବିସ୍ତାରିତ ତଥ୍ୟ, ଚିତ୍ର 9a-g)। ଏହି ତଥ୍ୟଗୁଡ଼ିକ ଦର୍ଶାଏ ଯେ t-hCO ଶରୀରଗତ ଭାବରେ ମୂଷା ମସ୍ତିଷ୍କରେ ସଂଯୁକ୍ତ ଏବଂ ମୂଷା ହୋଷ୍ଟ ଟିସୁ ଦ୍ୱାରା ସକ୍ରିୟ ହୋଇପାରିବ।
a, ଏକ ରାବିଜ୍ ଟ୍ରାକିଂ ପରୀକ୍ଷଣର ଯୋଜନାବଦ୍ଧ ଚିତ୍ର। b, GFP ଏବଂ t-hCO ଏବଂ ମୂଷା ସେରେବ୍ରାଲ୍ କର୍ଟେକ୍ସ (ଉପର ପ୍ୟାନେଲ୍) ମଧ୍ୟରେ ମାନବ-ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟ STEM121 ପ୍ରକାଶନ। ମୂଷା ipsilateral ventral basal nucleus (VB) (ତଳ ବାମ) ଏବଂ ipsilateral S1 (ତଳ ଡାହାଣ) ରେ GFP ପ୍ରକାଶନ ମଧ୍ୟ ଦେଖାଯାଇଛି। ସ୍କେଲ୍ ବାର୍, 50 µm। ଲାଲ ବର୍ଗ ମସ୍ତିଷ୍କର ସେହି କ୍ଷେତ୍ରଗୁଡ଼ିକୁ ପ୍ରତିନିଧିତ୍ୱ କରେ ଯେଉଁଠାରେ ଚିତ୍ରଗୁଡ଼ିକ ନିଆଯାଇଥିଲା। c, GFP ପ୍ରକାଶ କରୁଥିବା କୋଷଗୁଡ଼ିକର ପରିମାଣ (n = 4 ମୂଷା)। d, e — t-hCO ରେ Netrin G1+ ଥାଲାମିକ୍ ଟର୍ମିନାଲ। d t-hCO ଏବଂ VB ନ୍ୟୁକ୍ଲିୟସ୍ ଧାରଣ କରିଥିବା ଏକ କରୋନାଲ୍ ଅଂଶ ଦେଖାଏ। ସ୍କେଲ୍ ବାର୍, 2 mm। e t-hCO (ବାମ) ଏବଂ VB (ଡାହାଣ) ନ୍ୟୁରନ୍‌ରେ Netrin G1 ଏବଂ STEM121 ପ୍ରକାଶନ ଦେଖାଏ। ସ୍କେଲ୍ ବାର୍, 50 µm। କମଳା ବିନ୍ଦୁଯୁକ୍ତ ରେଖା t-hCO ସୀମାକୁ ସୂଚିତ କରେ। f, g, S1 ରାଟ୍ (f) କିମ୍ବା ଆଭ୍ୟନ୍ତରୀଣ କ୍ୟାପସୁଲ୍ (g), (ବାଇଗଣୀ) କିମ୍ବା ବିନା (କଳା) NBQX (ବାମ) ରେ ବୈଦ୍ୟୁତିକ ଉତ୍ତେଜନା ପରେ t-hCO ନ୍ୟୁରନ୍‌ର ବର୍ତ୍ତମାନର ଚିହ୍ନ। NBQX ସହିତ ଏବଂ ବିନା EPSC ଆମ୍ପ୍ଲିଚ୍ୟୁଡ୍ (n = 6 S1 ନ୍ୟୁରନ୍, *P = 0.0119; ଏବଂ n = 6 ଆଭ୍ୟନ୍ତରୀଣ କ୍ୟାପସୁଲ୍ ନ୍ୟୁରନ୍, **P = 0.0022) (ମଧ୍ୟ)। ରାଟ୍ S1 (f) କିମ୍ବା ଆଭ୍ୟନ୍ତରୀଣ କ୍ୟାପସୁଲ୍ (g) (ଡାହାଣ) ର ବୈଦ୍ୟୁତିକ ଉତ୍ତେଜନାର ପ୍ରତିକ୍ରିୟାରେ EPSC ଦେଖାଉଥିବା t-hCO ନ୍ୟୁରନ୍‌ର ପ୍ରତିଶତ। aCSF, କୃତ୍ରିମ ସେରେବ୍ରୋସ୍ପାଇନାଲ୍ ତରଳ ପଦାର୍ଥ। h, 2P ଇମେଜିଂ ପରୀକ୍ଷଣର ସ୍କିମେଟିକ୍ ଡାଏଗ୍ରାମ (ବାମ)। t-hCO (ମଧ୍ୟ) ରେ GCaMP6s ର ପ୍ରକାଶନ। ସ୍କେଲ୍ ବାର୍, 100 µm। GCaMP6s (ଡାହାଣ) ର ଫ୍ଲୋରୋସେନ୍ସ ସମୟ ଲାପ୍ସ। i, ସ୍ୱତଃସ୍ଫୂର୍ତ୍ତ କାର୍ଯ୍ୟକଳାପ ଫ୍ଲୋରୋସେନ୍ସର Z-ସ୍କୋର୍। j, ଶୂଳ ଉତ୍ତେଜନାର ସ୍କିମେଟିକ୍ ଚିତ୍ରଣ। k, ଗୋଟିଏ ପରୀକ୍ଷଣରେ z-ସ୍କୋର୍ ହୋଇଥିବା 2P ଫ୍ଲୋରୋସେନ୍ସ ଟ୍ରାଜେକ୍ଟୋରୀ, ଉଦାହରଣ କୋଷଗୁଡ଼ିକରେ ଶୂନ୍ୟ ସମୟରେ ହ୍ୱିସ୍କର ବିଚ୍ୟୁତି ସହିତ ସଂଯୁକ୍ତ। l, ଶୂନ୍ୟ ସମୟରେ ହ୍ୱିସ୍କର ବିଚ୍ୟୁତି ସହିତ ସଂଯୁକ୍ତ ସମସ୍ତ କୋଷଗୁଡ଼ିକର ଜନସଂଖ୍ୟା-ହାରାହାରି z-ସ୍କୋର୍ ପ୍ରତିକ୍ରିୟା (ଡାସ୍ଡ୍ ରେଖା) (ଲାଲ) କିମ୍ବା ଅନିୟମିତ ଭାବରେ ସୃଷ୍ଟି ହୋଇଥିବା ଟାଇମଷ୍ଟାମ୍ପ (ଧୂସର)। m. ଅପ୍ଟିକାଲ୍ ମାର୍କିଂ ଉପରେ ପରୀକ୍ଷଣର ଯୋଜନାବଦ୍ଧ ଚିତ୍ର। n, ନୀଳ ଲେଜର ଉତ୍ତେଜନା କିମ୍ବା ହ୍ୱିସ୍କର ବିଚ୍ୟୁତି ସମୟରେ t-hCO କୋଷର ଏକ ଉଦାହରଣରୁ ରଞ୍ଚ ଭୋଲଟେଜ୍ ବକ୍ର। ଲାଲ ତୀର ଆଲୋକ (ଉପର) କିମ୍ବା ହ୍ୱିସ୍କର ବିଚ୍ୟୁତି (ତଳ) ଦ୍ୱାରା ସୃଷ୍ଟି ହୋଇଥିବା ପ୍ରଥମ ସ୍ପାଇକ୍ ସୂଚିତ କରେ। ଧୂସର ଛାଇ ହ୍ୱିସ୍କର ବିଚ୍ୟୁତିର ଅବଧି ସୂଚିତ କରେ। o, ଶିଖର ଆଲୋକ ତରଙ୍ଗରୂପ ଏବଂ ହ୍ୱିସ୍କର ବିଚ୍ୟୁତି ପ୍ରତିକ୍ରିୟା। p, ଏକ ପ୍ରୟାସର ସ୍ପାଇକ୍, ଉଦାହରଣର କୋଷଗୁଡ଼ିକରେ ହ୍ୱିସ୍କର ବିଚ୍ୟୁତି ସହିତ ସଂଯୁକ୍ତ। 0 ହ୍ୱିସ୍କର ବିଚ୍ୟୁତି (ଡାସ୍ଡ୍ ରେଖା) ସୂଚିତ କରେ। q, ସମସ୍ତ ଫଟୋସେନ୍ଟିଭ୍ କୋଷ ପାଇଁ ଜନସଂଖ୍ୟା-ହାରାହାରି z-ସ୍କୋର୍ ଫାୟାରିଂ ହାର, ଶୂନ୍ୟ ସମୟରେ ହ୍ୱିସ୍କର ବିଚ୍ୟୁତି ସହିତ ସଂଯୁକ୍ତ (ଡାସ୍ଡ୍ ରେଖା) (ଲାଲ) କିମ୍ବା ଅନିୟମିତ ଭାବରେ ସୃଷ୍ଟି ହୋଇଥିବା ଟାଇମଷ୍ଟାମ୍ପ (ଧୂସର)। r, ହ୍ୱିସ୍କର ବିଚ୍ୟୁତି (n = 3 ଟି ମୂଷା) (ବାମ) ଦ୍ୱାରା ଉଲ୍ଲେଖନୀୟ ଭାବରେ ମଡ୍ୟୁଲା ହୋଇଥିବା ଆଲୋକସମ୍ବେଦନଶୀଳ ୟୁନିଟର ଅନୁପାତ। ପିକ୍ z-ସ୍କୋର ଲାଟେନ୍ସି (n = 3 ଟି ମୂଷା; n = 5 (ହାଲୁକା ସବୁଜ), n = 4 (ଗାଢ଼ ସବୁଜ), ଏବଂ n = 4 (ସିଆନ୍) ହ୍ୱିସ୍କର ଡିଫ୍ଲେକ୍ସନ୍ ମଡ୍ୟୁଲାସନ୍ ୟୁନିଟ୍ ପ୍ରତି ମୂଷା) (ଡାହାଣ)। ତଥ୍ୟକୁ ମଧ୍ୟମା ± ମାନକ ବିଚ୍ୟୁତି ଭାବରେ ପ୍ରକାଶ କରାଯାଇଛି।
ଆମେ ତା’ପରେ ପଚାରିଲୁ ଯେ t-hCO କୁ ସଂବେଦନଶୀଳ ଉତ୍ତେଜନା ଦ୍ୱାରା ସକ୍ରିୟ କରାଯାଇପାରିବ କି ନାହିଁ। ଆମେ S1 ମୂଷାରେ ଜେନେଟିକାଲ୍ ଏନକୋଡେଡ୍ କ୍ୟାଲସିୟମ୍ ସୂଚକ GCaMP6 ପ୍ରକାଶ କରୁଥିବା hCO ପ୍ରତିରୋପଣ କରିଥିଲୁ। 150 ଦିନ ପରେ, ଆମେ ଫାଇବର ଫଟୋମେଟ୍ରି କିମ୍ବା ଦୁଇ-ଫୋଟନ୍ କ୍ୟାଲସିୟମ୍ ଇମେଜିଂ କରିଥିଲୁ (ଚିତ୍ର 4h ଏବଂ ବିସ୍ତାରିତ ତଥ୍ୟ, ଚିତ୍ର 10a)। ଆମେ ପାଇଲୁ ଯେ t-hCO କୋଷଗୁଡ଼ିକ ସମନ୍ୱିତ ତାଳବଦ୍ଧ କାର୍ଯ୍ୟକଳାପ ପ୍ରଦର୍ଶନ କରିଥିଲେ (ଚିତ୍ର 4i, ବିସ୍ତାରିତ ତଥ୍ୟ, ଚିତ୍ର 10b ଏବଂ ପରିପୂରକ ଭିଡିଓ 1)। ଶିଖର t-hCO କାର୍ଯ୍ୟକଳାପକୁ ବର୍ଣ୍ଣିତ କରିବା ପାଇଁ, ଆମେ ନିଶ୍ଚେତକ ପ୍ରତିରୋପଣ ମୂଷାରେ ବାହ୍ୟକୋଷୀୟ ଇଲେକ୍ଟ୍ରୋଫିଜିଓଲୋଜିକାଲ୍ ରେକର୍ଡିଂ କରିଥିଲୁ (ବିସ୍ତାରିତ ତଥ୍ୟ, ଚିତ୍ର 10c-f)। ଆମେ MRI ପ୍ରତିଛବିରୁ ଷ୍ଟେରିଓଟାକ୍ସିକ କୋଅର୍ଡିନେଟ୍ ସୃଷ୍ଟି କରିଛୁ; ତେଣୁ, ଏହି ରେକର୍ଡ ହୋଇଥିବା ୟୁନିଟ୍ ପୁଟେଟିଭ୍ ମାନବ ନ୍ୟୁରନ୍ ପ୍ରତିନିଧିତ୍ୱ କରେ, ଯଦିଓ କେବଳ ଇଲେକ୍ଟ୍ରୋଫିଜିଓଲୋଜି ଉତ୍ପତ୍ତିର ଏକ ପ୍ରଜାତିକୁ ନିର୍ଣ୍ଣୟ କରିବାକୁ ଅନୁମତି ଦିଏ ନାହିଁ। ଆମେ କାର୍ଯ୍ୟକଳାପର ସମନ୍ୱିତ ବିସ୍ଫୋରଣ (ବିସ୍ତାରିତ ତଥ୍ୟ, ଚିତ୍ର 10d) ଦେଖିଥିଲୁ। ବିସ୍ଫୋରଣଗୁଡ଼ିକ ପ୍ରାୟ 460 ମିସେକେଣ୍ଡ ପର୍ଯ୍ୟନ୍ତ ଚାଲିଥିଲା ​​ଏବଂ ପ୍ରାୟ 2 ସେକେଣ୍ଡର ନୀରବତା ଅବଧି ଦ୍ୱାରା ପୃଥକ କରାଯାଇଥିଲା (ବିସ୍ତାରିତ ତଥ୍ୟ, ଚିତ୍ର 10d, e)। ବ୍ୟକ୍ତିଗତ ୟୁନିଟ୍ ପ୍ରତି ବିସ୍ଫୋରଣରେ ହାରାହାରି ପ୍ରାୟ ତିନି ରାଉଣ୍ଡ ଗୁଳି ଚଳାଇଥିଲା, ଯାହା ପ୍ରତି ବିସ୍ଫୋରଣରେ ପଞ୍ଜିକୃତ ୟୁନିଟ୍‌ର ପ୍ରାୟ 73%। ବ୍ୟକ୍ତିଗତ ୟୁନିଟ୍‌ଗୁଡ଼ିକର କାର୍ଯ୍ୟକଳାପ ଅତ୍ୟନ୍ତ ସହସଂବନ୍ଧିତ ଥିଲା, ଏବଂ ଏହି ସହସଂବନ୍ଧ ସମାନ ପରିସ୍ଥିତିରେ ରେକର୍ଡ ହୋଇଥିବା ଅଣ-ଟିକାକରଣ ପ୍ରାଣୀମାନଙ୍କରେ ଚିହ୍ନଟ ହୋଇଥିବା ୟୁନିଟ୍‌ଗୁଡ଼ିକ ଅପେକ୍ଷା ଅଧିକ ଥିଲା (ବିସ୍ତାରିତ ତଥ୍ୟ, ଚିତ୍ର 10f)। ଚିହ୍ନଟ ହୋଇଥିବା ମାନବ-ଉତ୍ପନ୍ନ ନ୍ୟୁରନ୍‌ଗୁଡ଼ିକର ସ୍ପାଇକ୍ ପ୍ରତିକ୍ରିୟାଗୁଡ଼ିକୁ ଆହୁରି ବର୍ଣ୍ଣିତ କରିବା ପାଇଁ, ଆମେ ଆଲୋକ-ସମ୍ବେଦନଶୀଳ କାଟେସନ୍ ଚ୍ୟାନେଲ୍ ରୋଡୋପସିନ୍ 2 (hChR2) ପ୍ରକାଶ କରି hCO ସହିତ ପ୍ରତିରୋପିତ ନିଶ୍ଚେତକ ମୂଷା ଉପରେ ଆଲୋକ-ଟ୍ୟାଗିଂ ପରୀକ୍ଷଣ କରିଥିଲୁ, ଯାହା ମାଧ୍ୟମରେ ନୀଳ ଆଲୋକ ଉଦ୍ଦୀପନାର ପ୍ରତିକ୍ରିୟାରେ t-hCO ନ୍ୟୁରନ୍ ସର୍ଟ-ଲେଟେନ୍ସି ଚିହ୍ନଟ (10 ମିସେକେଣ୍ଡରୁ କମ୍) (ଚିତ୍ର 4m–o)। t-hCO ନ୍ୟୁରନ୍‌ଗୁଡ଼ିକ କ୍ୟାଲସିୟମ୍ ଇମେଜିଂରେ ପରିଲକ୍ଷିତ ଫ୍ରିକ୍ୱେନ୍ସିରେ ସ୍ୱତଃସ୍ଫୂର୍ତ୍ତ କାର୍ଯ୍ୟକଳାପର ବିସ୍ଫୋରଣ ପ୍ରଦର୍ଶନ କରିଥିଲେ, ଏବଂ ଆଲୋକ ଚିହ୍ନିତ ନ ହେବା (ବିସ୍ତାରିତ ତଥ୍ୟ, ଚିତ୍ର 10c-g) ଅନୁପସ୍ଥିତିରେ t-hCO ରେ କରାଯାଇଥିବା ଇଲେକ୍ଟ୍ରୋଫିଜିଓଲୋଜିକାଲ୍ ରେକର୍ଡିଂ ମଧ୍ୟ ପ୍ରଦର୍ଶନ କରିଥିଲେ। ଭିଟ୍ରୋରେ ରେକର୍ଡ ହୋଇଥିବା hCO ର ସମ୍ପୃକ୍ତ ପର୍ଯ୍ୟାୟରେ କୌଣସି ସ୍ୱତଃସ୍ଫୂର୍ତ୍ତ କାର୍ଯ୍ୟକଳାପ ପରିଲକ୍ଷିତ ହୋଇନଥିଲା। ସମ୍ବେଦନଶୀଳ ଉଦ୍ଦୀପନା ଦ୍ୱାରା t-hCO ସକ୍ରିୟ ହୋଇପାରିବ କି ନାହିଁ ତାହା ମୂଲ୍ୟାଙ୍କନ କରିବା ପାଇଁ, ଆମେ ସଂକ୍ଷେପରେ ମୂଷା ହ୍ୱିସ୍କରଗୁଡ଼ିକୁ t-hCO ଠାରୁ ଦୂରକୁ ବିଚଳିତ କରିଥିଲୁ (ଚିତ୍ର 4j,m ଏବଂ ବିସ୍ତାରିତ ତଥ୍ୟ, ଚିତ୍ର 10h,k)। ପୂର୍ବ ଅଧ୍ୟୟନ ଅନୁଯାୟୀ 8,10, t-hCO କୋଷଗୁଡ଼ିକର ଏକ ଉପସେଟ୍ ହ୍ୱିସ୍କର ବିଚ୍ଛିନ୍ନତାର ପ୍ରତିକ୍ରିୟାରେ ବର୍ଦ୍ଧିତ କାର୍ଯ୍ୟକଳାପ ଦେଖାଇଥିଲା, ଯାହା ତଥ୍ୟକୁ ଅନିୟମିତ ସମୟ ଷ୍ଟାମ୍ପ ସହିତ ତୁଳନା କରିବା ସମୟରେ ପରିଲକ୍ଷିତ ହୋଇନଥିଲା (ଚିତ୍ର 4k–q ଏବଂ ବିସ୍ତାରିତ ତଥ୍ୟ, ଚିତ୍ର 10h–q)। ପ୍ରକୃତରେ, ଅପଟୋ-ଲେବଲ୍ ହୋଇଥିବା ଏକକ ୟୁନିଟ୍‌ଗୁଡ଼ିକର ପ୍ରାୟ 54% ହ୍ୱିସ୍କର ଉତ୍ତେଜନା ପରେ ଏକ ଉଲ୍ଲେଖନୀୟ ବୃଦ୍ଧି ହୋଇଥିବା ଉତ୍ତେଜନା ହାର ଦେଖାଇଥିଲା, ଯାହା ପ୍ରାୟ 650 ms (ଚିତ୍ର 4r) ରେ ପହଞ୍ଚିଥିଲା। ଏକତ୍ରିତ ଭାବରେ ନିଆଯାଇ, ଏହି ତଥ୍ୟ ସୂଚାଇ ଦିଏ ଯେ t-hCO ଉପଯୁକ୍ତ କାର୍ଯ୍ୟକ୍ଷମ ଇନପୁଟ୍ ଗ୍ରହଣ କରେ ଏବଂ ପରିବେଶଗତ ପ୍ରେରଣା ଦ୍ୱାରା ସକ୍ରିୟ ହୋଇପାରିବ।
ତା’ପରେ ଆମେ ଅନୁସନ୍ଧାନ କଲୁ ଯେ t-hCO ମୂଷାଙ୍କ ଆଚରଣ ନିୟନ୍ତ୍ରଣ ପାଇଁ ସର୍କିଟକୁ ସକ୍ରିୟ କରିପାରିବ କି ନାହିଁ। ଆମେ ପ୍ରଥମେ ଅନୁସନ୍ଧାନ କଲୁ ଯେ t-hCO ନ୍ୟୁରନ୍‌ର ଆକ୍ସନ୍‌ଗୁଡ଼ିକ ମୂଷାର ଆଖପାଖର ଟିସୁରେ ପ୍ରକ୍ଷେପିତ ହୁଏ କି ନାହିଁ। ଆମେ HCO କୁ EYFP (hChR2-EYFP) ସହିତ ଫ୍ୟୁଜ୍ ହୋଇଥିବା hChR2 ଏନକୋଡିଂ କରି ଏକ ଲେଣ୍ଟିଭାଇରସ୍ ସହିତ ସଂକ୍ରମିତ କଲୁ। 110 ଦିନ ପରେ, ଆମେ ଶ୍ରବଣ, ମୋଟର ଏବଂ ସୋମାଟୋସେନ୍ସରୀ କର୍ଟିସେସ୍ ସମେତ ipsilateral କର୍ଟିକାଲ୍ କ୍ଷେତ୍ରଗୁଡ଼ିକରେ EYFP ପ୍ରକାଶନ ଦେଖିଲୁ, ଏବଂ ଷ୍ଟ୍ରିଏଟମ୍, ହିପୋକ୍ୟାମ୍ପସ୍ ଏବଂ ଥାଲାମସ୍ ସମେତ ସବକର୍ଟିକାଲ୍ କ୍ଷେତ୍ରଗୁଡ଼ିକରେ ମଧ୍ୟ (ଚିତ୍ର 5a)। ଏହି ଇଫେରେଣ୍ଟ୍ ପ୍ରୋଜେକ୍ସନ୍ ମୂଷା କୋଷଗୁଡ଼ିକରେ ସିନାପ୍ଟିକ୍ ପ୍ରତିକ୍ରିୟା ସୃଷ୍ଟି କରିପାରିବ କି ନାହିଁ ତାହା ମୂଲ୍ୟାଙ୍କନ କରିବା ପାଇଁ, ଆମେ ତୀକ୍ଷ୍ଣ ମସ୍ତିଷ୍କ ବିଭାଗରେ ମୂଷା ସେରେବ୍ରାଲ୍ କର୍ଟେକ୍ସ କୋଷଗୁଡ଼ିକୁ ରେକର୍ଡ କରି hChR2-EYFP ପ୍ରକାଶ କରୁଥିବା t-hCO କୋଷଗୁଡ଼ିକୁ ଅପ୍ଟିକାଲ୍ ଭାବରେ ସକ୍ରିୟ କଲୁ। ମୂଷା ପିରାମିଡାଲ୍ କର୍ଟେକ୍ସ ନ୍ୟୁରନ୍‌ରେ ନୀଳ ଆଲୋକ ପ୍ରେରିତ କ୍ଷୁଦ୍ର-ଲାଟେନ୍ସି EPSC ସହିତ t-hCO ଆକ୍ସନ୍‌ଗୁଡ଼ିକର ସକ୍ରିୟକରଣ, ଯାହା NBQX ଦ୍ୱାରା ଅବରୋଧିତ ହୋଇଥିଲା (ଚିତ୍ର 5b-g)। ଏହା ସହିତ, ଏହି ପ୍ରତିକ୍ରିୟାଗୁଡ଼ିକୁ ଟେଟ୍ରୋଡୋଟକ୍ସିନ୍ (TTX) ଦ୍ୱାରା ଅବରୋଧ କରାଯାଇପାରିବ ଏବଂ 4-ଆମିନୋପାଇରିଡିନ୍ (4-AP) ଦ୍ୱାରା ପୁନଃସ୍ଥାପିତ କରାଯାଇପାରିବ, ଯାହା ସୂଚାଇ ଦିଏ ଯେ ଏଗୁଡ଼ିକ ମୋନୋସିନାପ୍ଟିକ୍ ସଂଯୋଗ ଦ୍ୱାରା ହୋଇଥିଲା (ଚିତ୍ର 5e)।
a, ଆକ୍ସନ୍ ଟ୍ରାକିଂର ଯୋଜନାବଦ୍ଧ ଚିତ୍ର (ବାମ)। t-hCO EYFP ପ୍ରକାଶନ (ଡାହାଣ)। ସ୍କେଲ୍ ବାର୍, 100 µm। A1, ଶ୍ରବଣ କର୍ଟେକ୍ସ, ACC, ପୂର୍ବବର୍ତ୍ତୀ ସିଙ୍ଗୁଲେଟ୍ କର୍ଟେକ୍ସ, d. ଷ୍ଟ୍ରିଆଟମ୍, ଡୋର୍ସଲ୍ ଷ୍ଟ୍ରିଆଟମ୍, HPC, ହିପୋକ୍ୟାମ୍ପସ୍; ଡାୟାଫ୍ରାମ, ପାର୍ଶ୍ଵ ସେପ୍ଟମ୍, mPFC, ମେଡିଆଲ୍ ପ୍ରିଫ୍ରଣ୍ଟାଲ୍ କର୍ଟେକ୍ସ, ପିରି, ପାଇରିଫର୍ମ କର୍ଟେକ୍ସ, v. ଷ୍ଟ୍ରିଆଟମ୍, ଭେଣ୍ଟ୍ରାଲ୍ ଷ୍ଟ୍ରିଆଟମ୍, VPM, ଥାଲାମସ୍ ର ଭେଣ୍ଟ୍ରୋପୋଷ୍ଟୋମେଡିଆଲ୍ ନ୍ୟୁକ୍ଲିୟସ୍, VTA, ଭେଣ୍ଟ୍ରାଲ୍ ଟେଗମେଣ୍ଟାଲ୍ ଅଞ୍ଚଳ। ଲାଲ ବର୍ଗ ମସ୍ତିଷ୍କର ସେହି କ୍ଷେତ୍ରଗୁଡ଼ିକୁ ପ୍ରତିନିଧିତ୍ୱ କରେ ଯେଉଁଠାରେ ଚିତ୍ରଗୁଡ଼ିକ ନିଆଯାଇଥିଲା। b, ଉତ୍ତେଜନା ପରୀକ୍ଷଣର ଯୋଜନାବଦ୍ଧ ଚିତ୍ର। c, d, ମଣିଷ (c) EYFP+ t-hCO କିମ୍ବା ମୂଷା (d) EYFP- କୋଷରେ ନୀଳ ଆଲୋକ-ପ୍ରେରିତ ଫଟୋଧାରକ (ଉପର) ଏବଂ ଭୋଲଟେଜ୍ (ତଳ) ର ପ୍ରତିକ୍ରିୟାର ଉଦାହରଣ। e, f, TTX ଏବଂ 4-AR (ସବୁଜ), TTX (ଧୂସର) କିମ୍ବା aCSF (କଳା) (e), (ବାଇଗଣୀ) ସହିତ କିମ୍ବା (କଳା) ବିନା (କଳା) ସହିତ t-hCO ଆକ୍ସନର ନୀଳ ଆଲୋକ ଉତ୍ତେଜନା ପରେ ମୂଷା ନ୍ୟୁରନର ବର୍ତ୍ତମାନର ଚିହ୍ନ। NBQX (e)। g, ମୂଷା କୋଷରେ ନୀଳ ଆଲୋକ ଦ୍ୱାରା ପ୍ରେରିତ ପ୍ରତିକ୍ରିୟାଗୁଡ଼ିକର ବିଳମ୍ବତା (n = 16 କୋଷ); ଭୂସମାନ୍ତର ବାର୍ ହାରାହାରି ବିଳମ୍ବତା (7.13 ms) (ବାମ) ସୂଚିତ କରେ। NBQX ସହିତ କିମ୍ବା ବିନା ରେକର୍ଡ ହୋଇଥିବା ଆଲୋକ-ଉଦ୍ଭାବିତ EPSC ଗୁଡ଼ିକର ପ୍ରଶସ୍ତତା (n = 7 କୋଷ; ***P < 0.0001) (ମଧ୍ୟଭାଗ)। NBQX ସହିତ କିମ୍ବା ବିନା ରେକର୍ଡ ହୋଇଥିବା ଆଲୋକ-ଉଦ୍ଭାବିତ EPSC ଗୁଡ଼ିକର ପ୍ରଶସ୍ତତା (n = 7 କୋଷ; ***P < 0.0001) (ମଧ୍ୟଭାଗ)। Амплитуда в лавванных светом EPSC, зарегистрированных с или ди NBQX (n = 7 клеток; *** P <0,0001) (в центре) | NBQX ସହିତ କିମ୍ବା ବିନା ରେକର୍ଡ ହୋଇଥିବା ଆଲୋକ-ପ୍ରେରିତ EPSC ର ପ୍ରଶସ୍ତତା (n = 7 କୋଷ; ***P < 0.0001) (ମଧ୍ୟରେ)।使用或不使用 NBQX 记录的光诱发 EPSC 的振幅（ n = 7 个细胞； *** P <0.0001 ）（中）。使用或不使用 NBQX 记录的光诱发 EPSC 的振幅（ n = 7 个细胞； *** P <0.0001 ）（中）。 Амплитуда в лавванных светом EPSC, зарегистрированных с или ди NBQX (n = 7 клеток; *** P <0,0001) (в центре) | NBQX ସହିତ କିମ୍ବା ବିନା ରେକର୍ଡ ହୋଇଥିବା ଆଲୋକ-ପ୍ରେରିତ EPSC ର ପ୍ରଶସ୍ତତା (n = 7 କୋଷ; ***P < 0.0001) (ମଧ୍ୟରେ)।ନୀଳ ଆଲୋକ (ଡାହାଣ) ପ୍ରତି ପ୍ରତିକ୍ରିୟା କରୁଥିବା EPSC ଦେଖାଉଥିବା ମୂଷା କୋଷଗୁଡ଼ିକର ଶତକଡ଼ା। h, ଏକ ଆଚରଣଗତ କାର୍ଯ୍ୟର ଯୋଜନାବଦ୍ଧ ଚିତ୍ର। d0, ଦିନ 0। i. ତାଲିମର ଦିନ 1 (ବାମ) କିମ୍ବା ଦିନ 15 (ଡାହାଣ) ରେ ଆଦର୍ଶ ପ୍ରାଣୀଙ୍କ ପ୍ରଦର୍ଶନ। ଦିନ ୧ (ବାମ) କିମ୍ବା ଦିନ ୧୫ (ଡାହାଣ ମଧ୍ୟଭାଗ) ରେ କରାଯାଇଥିବା ଲିକର ହାରାହାରି ସଂଖ୍ୟା (n = ୧୫୦ ନୀଳ ଆଲୋକ ପରୀକ୍ଷଣ, n = ୧୫୦ ଲାଲ ଆଲୋକ ପରୀକ୍ଷଣ; ***P < ୦.୦୦୦୧)। ଦିନ ୧ (ବାମ) କିମ୍ବା ଦିନ ୧୫ (ଡାହାଣ ମଧ୍ୟଭାଗ) ରେ କରାଯାଇଥିବା ଲିକର ହାରାହାରି ସଂଖ୍ୟା (n = ୧୫୦ ନୀଳ ଆଲୋକ ପରୀକ୍ଷଣ, n = ୧୫୦ ଲାଲ ଆଲୋକ ପରୀକ୍ଷଣ; ***P < ୦.୦୦୦୧)। Среднее количесто облизываний, выполненных в день 1 (слева) или день 15 (в центре справа) (n = 150 испытаний с синим светом, n = 150 испытаний с красным светом; *** P <0,0001)। ଦିନ ୧ (ବାମ) କିମ୍ବା ଦିନ ୧୫ (ଡାହାଣ ମଧ୍ୟଭାଗରେ) ରେ କରାଯାଇଥିବା ଲିକର ହାରାହାରି ସଂଖ୍ୟା (n = ୧୫୦ ନୀଳ ଆଲୋକ ପରୀକ୍ଷଣ, n = ୧୫୦ ଲାଲ ଆଲୋକ ପରୀକ୍ଷଣ; ***P < ୦.୦୦୦୧)।第 1 天（左）或第 15 天（右中）执行的平均舔次数（ n = 150 次蓝光试验， n = 150 次红光试验； *** P <0.0001 ）。第 1 天（左）或第 15 天（右中）执行的平均舔次数（ n = 150 次蓝光试验， n = 150 次红光试验； *** P <0.001 | Среднее количесто облизываний, выполненных в день 1 (слева) или день 15 (в центре справа) (n = 150 испытаний с синим светом, n = 150 испытаний с красным светом; *** P <0,0001)। ଦିନ ୧ (ବାମ) କିମ୍ବା ଦିନ ୧୫ (ଡାହାଣ ମଧ୍ୟଭାଗରେ) ରେ କରାଯାଇଥିବା ଲିକର ହାରାହାରି ସଂଖ୍ୟା (n = ୧୫୦ ନୀଳ ଆଲୋକ ପରୀକ୍ଷଣ, n = ୧୫୦ ଲାଲ ଆଲୋକ ପରୀକ୍ଷଣ; ***P < ୦.୦୦୦୧)।ଦିନ 1 (ମଧ୍ୟରେ ବାମ) କିମ୍ବା ଦିନ 15 (ଡାହାଣ) ରେ ଲାଲ ଏବଂ ନୀଳ ଆଲୋକ ପରୀକ୍ଷଣ ପାଇଁ କ୍ରମବର୍ଦ୍ଧିତ ଲିକ୍ସ। NS, ଗୁରୁତ୍ୱପୂର୍ଣ୍ଣ ନୁହେଁ। j,k, ଦିନ 1 କିମ୍ବା 15 ରେ hChR2-EYFP (j) ପ୍ରକାଶ କରୁଥିବା t-hCO ସହିତ ପ୍ରତିରୋପିତ ସମସ୍ତ ପ୍ରାଣୀଙ୍କ ଆଚରଣଗତ ବୈଶିଷ୍ଟ୍ୟ କିମ୍ବା ଫ୍ଲୋରୋଫୋର (k) ନିୟନ୍ତ୍ରଣ (hChR2-EYFP: n = 9 ମୂଷା, ** P = 0.0049; ନିୟନ୍ତ୍ରଣ: n = 9, P = 0.1497)। l, ପସନ୍ଦ ସ୍କୋରର ବିବର୍ତ୍ତନ (n = 9 hChR2, n = 9 ନିୟନ୍ତ୍ରଣ; **P < 0.001, ***P < 0.0001)। l, ପସନ୍ଦ ସ୍କୋରର ବିବର୍ତ୍ତନ (n = 9 hChR2, n = 9 ନିୟନ୍ତ୍ରଣ; **P < 0.001, ***P < 0.0001)। l, Э ацция показателя предпоч сентия (n = 9 hChR2, n = 9 كانных; ** P <0,001, *** P <0,0001) | l, ପସନ୍ଦ ସ୍କୋରର ବିକାଶ (n = 9 hChR2, n = 9 ନିୟନ୍ତ୍ରଣ; **P < 0.001, ***P < 0.0001)। l ，偏好评分的演变（ n = 9 hChR2 ， n = 9 对照； ** P <0.001 ， *** P <0.0001 ）。 l ，偏好评分的演变（ n = 9 hChR2 ， n = 9 对照； ** P <0.001 ， *** P <0.0001 ）。 l, Э ацж по позазате пред предпоч сентия (n = 9 hChR2, n = 9 кили; ** P <0,001, *** P <0,0001) | l, ପସନ୍ଦ ସ୍କୋରର ବିବର୍ତ୍ତନ (n = 9 hChR2, n = 9 ନିୟନ୍ତ୍ରଣ; **P < 0.001, ***P < 0.0001)।m, S1 ରେ t-hCO ର ଅପ୍ଟୋଜେନେଟିକ୍ ସକ୍ରିୟକରଣ ପ୍ରତିକ୍ରିୟାରେ FOS ପ୍ରକାଶନ। FOS ପ୍ରକାଶନ (ବାମ) ଏବଂ ପରିମାଣୀକରଣ (ପ୍ରତି ଗୋଷ୍ଠୀରେ n = 3; *P < 0.05, **P < 0.01 ଏବଂ ***P < 0.001) (ଡାହାଣ) ର ପ୍ରତିଛବି ଦେଖାଯାଇଛି। FOS ପ୍ରକାଶନ (ବାମ) ଏବଂ ପରିମାଣୀକରଣ (ପ୍ରତି ଗୋଷ୍ଠୀରେ n = 3; *P < 0.05, **P < 0.01 ଏବଂ ***P < 0.001) (ଡାହାଣ) ର ପ୍ରତିଛବି ଦେଖାଯାଇଛି। Показнан изображения кресрессии FOS (слева) һәм количественного определения (n = 3 на группу; * P <0,05, ** P <0,01 и *** P <0,001) (справа)। FOS ପ୍ରକାଶନ (ବାମ) ଏବଂ ପରିମାଣୀକରଣର ପ୍ରତିଛବି (ପ୍ରତି ଗୋଷ୍ଠୀରେ n = 3; *P<0.05, **P<0.01, ଏବଂ ***P<0.001) ଦେଖାଯାଇଛି (ଡାହାଣ)।显示了 FOS 表达（左）和量化（每组 n = 3 ； * P <0.05 、 ** P <0.01 和 *** P <0.001 ）（右）的图像。显示了 FOS 表达（左）和量化（每组 n = 3 ； * P <0.05 、 ** P <0.01 和 *** P <0.001 ）（右）的图像。 Показнан изображения кресрессии FOS (слева) һәм количественного определения (n = 3 на группу; * P <0,05, ** P <0,01 и *** P <0,001) (справа)। FOS ପ୍ରକାଶନ (ବାମ) ଏବଂ ପରିମାଣୀକରଣର ପ୍ରତିଛବି (ପ୍ରତି ଗୋଷ୍ଠୀରେ n = 3; *P<0.05, **P<0.01, ଏବଂ ***P<0.001) ଦେଖାଯାଇଛି (ଡାହାଣ)।ସ୍କେଲ୍ ବାର୍, 100 µm। ତଥ୍ୟକୁ BLA, ବାସୋଲେଟାରଲ୍ ଟନସିଲ୍, MDT, ଡୋର୍ସୋମେଡିଆଲ୍ ଥାଲାମିକ୍ ନ୍ୟୁକ୍ଲିୟସ୍, PAG, ପେରିଆକ୍ୱେଡକ୍ଟଲ୍ ଗ୍ରେ ର ମଧ୍ୟମ ± ମାନକ ତ୍ରୁଟି ଭାବରେ ପ୍ରକାଶ କରାଯାଇଛି।
ଶେଷରେ, ଆମେ ପଚାରିଲୁ ଯେ t-hCO ମୂଷା ଆଚରଣକୁ ନିୟନ୍ତ୍ରଣ କରିପାରିବ କି? ଏହାକୁ ପରୀକ୍ଷା କରିବା ପାଇଁ, ଆମେ hChR2-EYFP-ପ୍ରକାଶକ hCO କୁ S1 ରେ ପ୍ରତିରୋପଣ କରିଥିଲୁ, ଏବଂ 90 ଦିନ ପରେ, ଆମେ ଆଲୋକ ବିତରଣ ପାଇଁ t-hCO ରେ ଅପ୍ଟିକାଲ୍ ଫାଇବର ପ୍ରତିରୋପଣ କରିଥିଲୁ। ତା'ପରେ ଆମେ ମୂଷାମାନଙ୍କୁ ଏକ ପରିବର୍ତ୍ତିତ ଅପରେଣ୍ଟାଲ୍ କଣ୍ଡିସନିଂ ପ୍ୟାରାଡିମ୍ (ଚିତ୍ର 5h) ସହିତ ତାଲିମ ଦେଇଥିଲୁ। ଆମେ ପ୍ରାଣୀମାନଙ୍କୁ ଏକ ଆଚରଣଗତ ପରୀକ୍ଷା ଚାମ୍ବରରେ ରଖିଥିଲୁ ଏବଂ ଅନିୟମିତ ଭାବରେ 5 ସେକେଣ୍ଡ ନୀଳ (473 nm) ଏବଂ ଲାଲ (635 nm) ଲେଜର ଉଦ୍ଦୀପନା ପ୍ରୟୋଗ କରିଥିଲୁ। ନୀଳ ଆଲୋକ ଉତ୍ତେଜନା ସମୟରେ ଚାଟିଲେ ପ୍ରାଣୀମାନେ ଜଳ ପୁରସ୍କାର ପାଇଥିଲେ କିନ୍ତୁ ଲାଲ ଆଲୋକ ଉତ୍ତେଜନା ସମୟରେ ଚାଟିଲେ ନାହିଁ। ତାଲିମର ପ୍ରଥମ ଦିନରେ, ପ୍ରାଣୀମାନେ ନୀଳ କିମ୍ବା ଲାଲ ଆଲୋକ ସହିତ ଉଜ୍ଜ୍ୱଳ ହେଲେ ଚାଟିବାରେ କୌଣସି ପାର୍ଥକ୍ୟ ଦେଖାଇଲେ ନାହିଁ। ତଥାପି, 15 ତମ ଦିନରେ, hChR2-EYFP ପ୍ରକାଶକ hCO ସହିତ ପ୍ରତିରୋପଣ କରାଯାଇଥିବା ପ୍ରାଣୀମାନେ ଲାଲ ଆଲୋକ ଉତ୍ତେଜନା ତୁଳନାରେ ନୀଳ ଆଲୋକ ସହିତ ଉଜ୍ଜ୍ୱଳ ହେଲେ ଅଧିକ ସକ୍ରିୟ ଚାଟି ଦେଖାଇଥିଲେ। ନିୟନ୍ତ୍ରଣ ଫ୍ଲୋରୋଫୋର ପ୍ରକାଶ କରି hCO ସହିତ ପ୍ରତିରୋପିତ ନିୟନ୍ତ୍ରଣ ପ୍ରାଣୀମାନଙ୍କରେ ଚାଟିବା ଆଚରଣରେ ଏହି ପରିବର୍ତ୍ତନ ପରିଲକ୍ଷିତ ହୋଇନାହିଁ (ଶିକ୍ଷଣ ସଫଳତା ହାର: hChR2 89%, EYFP 0%, ଚିତ୍ର 5i-1 ଏବଂ ପରିପୂରକ ଭିଡିଓ 2)। ଏହି ତଥ୍ୟଗୁଡ଼ିକ ସୂଚାଇ ଦିଏ ଯେ t-hCO କୋଷଗୁଡ଼ିକ ପୁରସ୍କାର-ଅନ୍ୱେଷଣ ଆଚରଣକୁ ଉତ୍ତେଜିତ କରିବା ପାଇଁ ମୂଷା ନ୍ୟୁରନଗୁଡ଼ିକୁ ସକ୍ରିୟ କରିପାରିବେ। ଏହି ଆଚରଣଗତ ପରିବର୍ତ୍ତନଗୁଡ଼ିକରେ କେଉଁ ମୂଷା t-hCO ନ୍ୟୁରାଲ ସର୍କିଟ୍ ସାମିଲ ହୋଇପାରେ ତାହା ଜାଣିବା ପାଇଁ, ଆମେ 90 ମିନିଟ୍ ପରେ ତାଲିମପ୍ରାପ୍ତ ପ୍ରାଣୀ ଏବଂ ଅମଳ କରାଯାଇଥିବା ଟିସୁଗୁଡ଼ିକରେ ଅପ୍ଟୋଜେନେଟିକାଲି t-hCO ସକ୍ରିୟ କରିଥିଲୁ। ଇମ୍ୟୁନୋହିଷ୍ଟୋକେମିଷ୍ଟ୍ରି ପ୍ରେରଣାଦାୟକ ଆଚରଣରେ ଜଡିତ ଅନେକ ମସ୍ତିଷ୍କ ଅଞ୍ଚଳରେ କାର୍ଯ୍ୟକଳାପ-ନିର୍ଭରଶୀଳ FOS ପ୍ରୋଟିନର ପ୍ରକାଶ କରିଥିଲା, ଯେଉଁଥିରେ ମେଡିଆଲ୍ ପ୍ରିଫ୍ରଣ୍ଟାଲ୍ କର୍ଟେକ୍ସ, ମେଡିଆଲ୍ ଥାଲାମସ୍ ଏବଂ ପେରିଆକ୍ୱେଡକ୍ଟଲ୍ ଗ୍ରେ ମ୍ୟାଟର ଅନ୍ତର୍ଭୁକ୍ତ, ଯାହା ଅଣଉତ୍ତେଜିତ ନିୟନ୍ତ୍ରଣ ପ୍ରାଣୀମାନଙ୍କରେ କିମ୍ବା ପ୍ରାଣୀମାନଙ୍କରେ ପ୍ରକାଶିତ ହୋଇଥିଲା। ଚାଉଳ। 5 ମି)। ଏକତ୍ରିତ ଭାବରେ ନିଆଯାଇ, ଏହି ତଥ୍ୟଗୁଡ଼ିକ ସୂଚାଇ ଦିଏ ଯେ t-hCO ଆଚରଣକୁ ଚଳାଇବା ପାଇଁ ମୂଷା ନ୍ୟୁରୋନାଲ୍ କାର୍ଯ୍ୟକଳାପକୁ ନିୟନ୍ତ୍ରଣ କରିପାରିବ।
ନ୍ୟୁରାଲ ଅର୍ଗାନଏଡ୍‌ଗୁଡ଼ିକ ମାନବ ବିକାଶ ଏବଂ ରୋଗ ଅଧ୍ୟୟନ ପାଇଁ ଏକ ପ୍ରତିଶ୍ରୁତିପୂର୍ଣ୍ଣ ପ୍ରଣାଳୀ ପ୍ରତିନିଧିତ୍ୱ କରନ୍ତି, କିନ୍ତୁ ଭିଭୋରେ ଥିବା ସର୍କିଟ୍ ମଧ୍ୟରେ ସଂଯୋଗ ଅଭାବ ଯୋଗୁଁ ସେଗୁଡ଼ିକ ସୀମିତ। ଆମେ ଏକ ନୂତନ ପ୍ଲାଟଫର୍ମ ବିକଶିତ କରିଛୁ ଯେଉଁଥିରେ ଆମେ ମାନବ କୋଷ ବିକାଶ ଏବଂ ଭିଭୋରେ କାର୍ଯ୍ୟ ଅଧ୍ୟୟନ କରିବା ପାଇଁ ଇମ୍ୟୁନୋକମ୍ପ୍ରୋମାଇଜ୍ଡ ପ୍ରାରମ୍ଭିକ ପ୍ରସବ ପରେ ମୂଷାଙ୍କ S1 ରେ hCO ପ୍ରତିରୋପଣ କରିଛୁ। ଆମେ ଦେଖାଇଛୁ ଯେ t-hCO ଭିଟ୍ରୋ28 ରେ ପରିଲକ୍ଷିତ ହୋଇନଥିବା ପରିପକ୍ୱ କୋଷ ପ୍ରକାର ବିକଶିତ କରେ ଏବଂ t-hCO ଶରୀରଗତ ଏବଂ କାର୍ଯ୍ୟକ୍ଷମ ଭାବରେ ମୂଷା ମସ୍ତିଷ୍କରେ ସଂଯୁକ୍ତ। ମୂଷା ନ୍ୟୁରାଲ ସର୍କିଟ୍‌ରେ t-hCO ର ସମନ୍ୱୟ ଆମକୁ ମାନବ କୋଷୀୟ କାର୍ଯ୍ୟକଳାପ ଏବଂ ଅଧ୍ୟୟନ କରାଯାଇଥିବା ପଶୁ ଆଚରଣ ମଧ୍ୟରେ ଏକ ଲିଙ୍କ ସ୍ଥାପନ କରିବାକୁ ଅନୁମତି ଦେଇଥିଲା, ଯାହା ଦର୍ଶାଉଛି ଯେ t-hCO ନ୍ୟୁରନ୍‌ଗୁଡ଼ିକ ଆଚରଣଗତ ପ୍ରତିକ୍ରିୟା ଚଲାଇବା ପାଇଁ ମୂଷା ନ୍ୟୁରୋନାଲ୍ କାର୍ଯ୍ୟକଳାପକୁ ପରିବର୍ତ୍ତନ କରିପାରିବ।
ଆମେ ଯେଉଁ ପ୍ଲାଟଫର୍ମ ବର୍ଣ୍ଣନା କରୁଛୁ ତାହା ମୂଷା ମସ୍ତିଷ୍କରେ ମାନବ କୋଷ ପ୍ରତିରୋପଣ ଉପରେ ପୂର୍ବ ଗବେଷଣା ତୁଳନାରେ ଅନେକ ସୁବିଧା ପ୍ରଦାନ କରେ। ପ୍ରଥମତଃ, ଆମେ ପ୍ରାରମ୍ଭିକ ପ୍ରସବ ପରବର୍ତ୍ତୀ ମୂଷାର ବିକାଶଶୀଳ କର୍ଟେକ୍ସରେ hCO ପ୍ରତିରୋପଣ କରିଥିଲୁ, ଯାହା ଶରୀରଗତ ଏବଂ କାର୍ଯ୍ୟକ୍ଷମ ଏକୀକରଣକୁ ସହଜ କରିପାରେ। ଦ୍ୱିତୀୟତଃ, t-hCO MRI ମନିଟରିଂ ଆମକୁ ଜୀବନ୍ତ ପ୍ରାଣୀମାନଙ୍କରେ ଗ୍ରାଫ୍ଟ ସ୍ଥିତି ଏବଂ ବୃଦ୍ଧି ଅଧ୍ୟୟନ କରିବାକୁ ଅନୁମତି ଦେଇଥିଲା, ଯାହା ଆମକୁ ଦୀର୍ଘକାଳୀନ ବହୁ-ଜୀବୀ ଅଧ୍ୟୟନ କରିବାକୁ ଏବଂ ଅନେକ hiPS କୋଷ ରେଖାର ନିର୍ଭରଯୋଗ୍ୟତା ସ୍ଥାପନ କରିବାକୁ ଅନୁମତି ଦେଇଥିଲା। ଶେଷରେ, ଆମେ ପୃଥକ ଏକକ କୋଷ ସସପେନସନ ପରିବର୍ତ୍ତେ ଅକ୍ଷତ ଅର୍ଗାନଏଡ୍ ପ୍ରତିରୋପଣ କରିଥିଲୁ, ଯାହା ମାନବ କୋଷ ପାଇଁ କମ୍ ବିନାଶକାରୀ ଏବଂ ମୂଷା ମସ୍ତିଷ୍କରେ ମାନବ କର୍ଟେକ୍ସ ନ୍ୟୁରନ୍‌ର ଏକୀକରଣ ଏବଂ ସୃଷ୍ଟିକୁ ପ୍ରୋତ୍ସାହିତ କରିପାରିବ।
ଆମେ ସ୍ୱୀକାର କରୁଛୁ ଯେ ଏହି ପ୍ଲାଟଫର୍ମରେ ଉନ୍ନତି ସତ୍ତ୍ୱେ, ବିକାଶର ପ୍ରାରମ୍ଭିକ ପର୍ଯ୍ୟାୟରେ ପ୍ରତିରୋପଣ ପରେ ମଧ୍ୟ, ସାମୟିକ, ସ୍ଥାନିକ ଏବଂ କ୍ରସ୍-ପ୍ରଜାତି ପ୍ରତିବନ୍ଧକଗୁଡ଼ିକ ଉଚ୍ଚ ବିଶ୍ୱସ୍ତତା ସହିତ ମାନବ ନ୍ୟୁରାଲ୍ ସର୍କିଟ୍ ଗଠନକୁ ବାଧା ଦିଏ। ଉଦାହରଣ ସ୍ୱରୂପ, ଏହା ସ୍ପଷ୍ଟ ନୁହେଁ ଯେ t-hCO ରେ ପରିଲକ୍ଷିତ ସ୍ୱତଃସ୍ଫୂର୍ତ୍ତ କାର୍ଯ୍ୟକଳାପ କର୍ଟିକାଲ୍ ବିକାଶ ସମୟରେ ପରିଲକ୍ଷିତ ତାଳପୂର୍ଣ୍ଣ କାର୍ଯ୍ୟକଳାପ ସହିତ ସମାନ ଏକ ବିକାଶମୂଳକ ଫେନୋଟାଇପ୍ ପ୍ରତିନିଧିତ୍ୱ କରେ କି ନାହିଁ, କିମ୍ବା ଏହା t-hCO ରେ ଉପସ୍ଥିତ ଦମନକାରୀ କୋଷ ପ୍ରକାରର ଅନୁପସ୍ଥିତି ଯୋଗୁଁ। ସେହିପରି, t-hCO ରେ ଲାମିନେସନ୍ ର ଅନୁପସ୍ଥିତି ଚେନ୍ ସଂଯୋଗକୁ କେତେ ପରିମାଣରେ ପ୍ରଭାବିତ କରେ ତାହା ସ୍ପଷ୍ଟ ନୁହେଁ। ଭବିଷ୍ୟତ କାର୍ଯ୍ୟ ମାନବ ମାଇକ୍ରୋଗ୍ଲିଆ, ମାନବ ଏଣ୍ଡୋଥେଲିଆଲ୍ କୋଷ ଏବଂ ଭିଟ୍ରୋରେ ଆସେମ୍ବଲି 6 ବ୍ୟବହାର କରି ଦେଖାଯାଇଥିବା GABAergic ଇଣ୍ଟରନ୍ୟୁରନ୍ ପରି ଅନ୍ୟାନ୍ୟ କୋଷ ପ୍ରକାରଗୁଡ଼ିକୁ ଏକୀକୃତ କରିବା ଉପରେ ଧ୍ୟାନ ଦେବ, ଏବଂ ରୋଗୀଙ୍କଠାରୁ ପ୍ରାପ୍ତ କୋଷରେ କିପରି ନ୍ୟୁରାଲ୍ ସମନ୍ୱୟ ଏବଂ ପ୍ରକ୍ରିୟାକରଣ ହୋଇପାରେ ତାହା ବୁଝିବ। ଟ୍ରାନ୍ସକ୍ରିପସନାଲ୍, ସିନାପ୍ଟିକ୍ ଏବଂ ଆଚରଣଗତ ସ୍ତର।
ସାମଗ୍ରିକ ଭାବରେ, ଏହି ଇନ୍ ଭିଭୋ ପ୍ଲାଟଫର୍ମ ଏକ ଶକ୍ତିଶାଳୀ ସମ୍ବଳକୁ ପ୍ରତିନିଧିତ୍ୱ କରେ ଯାହା ଇନ୍ ଭିଟ୍ରୋ ମାନବ ମସ୍ତିଷ୍କ ବିକାଶ ଏବଂ ରୋଗ ଗବେଷଣାକୁ ପରିପୂରକ କରିପାରିବ। ଆମେ ଆଶା କରୁଛୁ ଯେ ଏହି ପ୍ଲାଟଫର୍ମ ଆମକୁ ଅନ୍ୟଥା ଭ୍ରମାତ୍ମକ ରୋଗୀ-ପ୍ରାପ୍ତ କୋଷଗୁଡ଼ିକରେ ନୂତନ ଷ୍ଟ୍ରାଣ୍ଡ-ସ୍ତରୀୟ ଫେନୋଟାଇପ୍ ଆବିଷ୍କାର କରିବାକୁ ଏବଂ ନୂତନ ଚିକିତ୍ସା ରଣନୀତି ପରୀକ୍ଷା କରିବାକୁ ଅନୁମତି ଦେବ।
ଆମେ ପୂର୍ବରୁ ବର୍ଣ୍ଣିତ HiPS କୋଷରୁ hCO2.5 ସୃଷ୍ଟି କରିଥିଲୁ। ଫିଡର ସ୍ତରଗୁଡ଼ିକରେ କଲଚର ହୋଇଥିବା hiPS କୋଷରୁ hCO ଉତ୍ପାଦନ ଆରମ୍ଭ କରିବା ପାଇଁ, hiPS କୋଷଗୁଡ଼ିକର ଅକ୍ଷତ କଲୋନୀଗୁଡ଼ିକୁ ଡିସପେସ୍ (0.35 mg/mL) ବ୍ୟବହାର କରି କଲଚର ଡିସ୍ ରୁ ବାହାର କରାଯାଇଥିଲା ଏବଂ hiPS କୋଷ କଲଚର ମାଧ୍ୟମ ସହିତ ଡିସ୍ ଧାରଣ କରୁଥିବା ଅଲ୍ଟ୍ରା-ଲୋ ଆଟାଚମେଣ୍ଟ ପ୍ଲାଷ୍ଟିକ୍ କଲଚରକୁ ସ୍ଥାନାନ୍ତରିତ କରାଯାଇଥିଲା। (କର୍ଣ୍ଣିଂ) ଦୁଇଟି SMAD ଇନହିବିଟର ଡୋରସୋମର୍ଫିନ୍ (5 μM; P5499, Sigma-Aldrich) ଏବଂ SB-431542 (10 μM; 1614, Tocris) ଏବଂ ROCK ଇନହିବିଟର Y-27632 (10 μM; S1049, Selleckchem) ସହିତ ପରିପୂରକ କରାଯାଇଥିଲା। ପ୍ରଥମ 5 ଦିନ ମଧ୍ୟରେ, hiPS କୋଷ ମାଧ୍ୟମ ପ୍ରତିଦିନ ପରିବର୍ତ୍ତନ କରାଯାଉଥିଲା ଏବଂ ଡୋରସୋମର୍ଫିନ୍ ଏବଂ SB-431542 ଯୋଡାଯାଉଥିଲା। ସସପେନସନର ଷଷ୍ଠ ଦିନରେ, ନ୍ୟୁରାଲ ସ୍ଫେରଏଡଗୁଡ଼ିକୁ ନ୍ୟୁରୋବାସାଲ-ଏ (୧୦୮୮୮, ଲାଇଫ୍ ଟେକ୍ନୋଲୋଜି), ଭିଟାମିନ୍ ଏ ବିନା B-୨୭ ସପ୍ଲିମେଣ୍ଟ (୧୨୫୮୭, ଲାଇଫ୍ ଟେକ୍ନୋଲୋଜି), ଗ୍ଲୁଟାମ୍ୟାକ୍ସ (୧:୧୦୦, ଲାଇଫ୍ ଟେକ୍ନୋଲୋଜି), ପେନିସିଲିନ୍ ଏବଂ ଷ୍ଟ୍ରେପ୍ଟୋମାଇସିନ୍ (୧:୧୦୦, ଲାଇଫ୍ ଟେକ୍ନୋଲୋଜି) ଧାରଣ କରିଥିବା ନ୍ୟୁରାଲ ମାଧ୍ୟମକୁ ସ୍ଥାନାନ୍ତରିତ କରାଯାଇଥିଲା ଏବଂ ୨୪ ତାରିଖ ପର୍ଯ୍ୟନ୍ତ ଏପିଡର୍ମାଲ ଗ୍ରୋଥ୍ ଫ୍ୟାକ୍ଟର (EGF; ୨୦ ng ml−୧; R&D ସିଷ୍ଟମ୍ସ) ଏବଂ ଫାଇବ୍ରୋବ୍ଲାଷ୍ଟ ଗ୍ରୋଥ୍ ଫ୍ୟାକ୍ଟର ୨ (FGF2; ୨୦ ng ml−୧; R&D ସିଷ୍ଟମ୍ସ) ସହିତ ପରିପୂରକ କରାଯାଇଥିଲା। ୨୫ ତାରିଖରୁ ୪୨ ତାରିଖ ପର୍ଯ୍ୟନ୍ତ, ମଧ୍ୟମକୁ ମସ୍ତିଷ୍କରୁ ପ୍ରାପ୍ତ ନ୍ୟୁରୋଟ୍ରୋଫିନ୍ ଫ୍ୟାକ୍ଟର (BDNF; ୨୦ ng ml−୧, Peprotech) ଏବଂ ନ୍ୟୁରୋଟ୍ରୋଫିନ୍ ୩ (NT3; ୨୦ ng ml−୧; Peprotech) ସହିତ ପରିପୂରକ କରାଯାଇଥିଲା ଯାହା ପ୍ରତି ଅନ୍ୟ ଦିନ ମଧ୍ୟମ ପରିବର୍ତ୍ତନ ସହିତ ପରିପୂରକ କରାଯାଇଥିଲା। ସସପେନସନର ଷଷ୍ଠ ଦିନରେ, ନ୍ୟୁରାଲ ସ୍ଫେରଏଡଗୁଡ଼ିକୁ ନ୍ୟୁରୋବାସାଲ-ଏ (୧୦୮୮୮, ଲାଇଫ୍ ଟେକ୍ନୋଲୋଜି), ଭିଟାମିନ୍ ଏ ବିନା B-୨୭ ସପ୍ଲିମେଣ୍ଟ (୧୨୫୮୭, ଲାଇଫ୍ ଟେକ୍ନୋଲୋଜି), ଗ୍ଲୁଟାମ୍ୟାକ୍ସ (୧:୧୦୦, ଲାଇଫ୍ ଟେକ୍ନୋଲୋଜି), ପେନିସିଲିନ୍ ଏବଂ ଷ୍ଟ୍ରେପ୍ଟୋମାଇସିନ୍ (୧:୧୦୦, ଲାଇଫ୍ ଟେକ୍ନୋଲୋଜି) ଧାରଣ କରିଥିବା ନ୍ୟୁରାଲ ମାଧ୍ୟମକୁ ସ୍ଥାନାନ୍ତରିତ କରାଯାଇଥିଲା ଏବଂ ୨୪ ତାରିଖ ପର୍ଯ୍ୟନ୍ତ ଏପିଡର୍ମାଲ ଗ୍ରୋଥ୍ ଫ୍ୟାକ୍ଟର (EGF; ୨୦ ng ml−୧; R&D ସିଷ୍ଟମ୍ସ) ଏବଂ ଫାଇବ୍ରୋବ୍ଲାଷ୍ଟ ଗ୍ରୋଥ୍ ଫ୍ୟାକ୍ଟର ୨ (FGF2; ୨୦ ng ml−୧; R&D ସିଷ୍ଟମ୍ସ) ସହିତ ପରିପୂରକ କରାଯାଇଥିଲା। ୨୫ ତାରିଖରୁ ୪୨ ତାରିଖ ପର୍ଯ୍ୟନ୍ତ, ମଧ୍ୟମକୁ ମସ୍ତିଷ୍କରୁ ପ୍ରାପ୍ତ ନ୍ୟୁରୋଟ୍ରୋଫିନ୍ ଫ୍ୟାକ୍ଟର (BDNF; ୨୦ ng ml−୧, Peprotech) ଏବଂ ନ୍ୟୁରୋଟ୍ରୋଫିନ୍ ୩ (NT3; ୨୦ ng ml−୧; Peprotech) ସହିତ ପରିପୂରକ କରାଯାଇଥିଲା ଯାହା ପ୍ରତି ଅନ୍ୟ ଦିନ ମଧ୍ୟମ ପରିବର୍ତ୍ତନ ସହିତ ପରିପୂରକ କରାଯାଇଥିଲା।ସସପେନସନର ଷଷ୍ଠ ଦିନରେ, ନ୍ୟୁରାଲ ସ୍ଫେରଏଡଗୁଡ଼ିକୁ ନ୍ୟୁରୋବାସାଲ-ଏ (୧୦୮୮୮, ଲାଇଫ୍ ଟେକ୍ନୋଲୋଜି), ଭିଟାମିନ୍ ଏ ବିନା B-୨୭ ସପ୍ଲିମେଣ୍ଟ (୧୨୫୮୭, ଲାଇଫ୍ ଟେକ୍ନୋଲୋଜି), ଗ୍ଲୁଟାମ୍ୟାକ୍ସ (୧:୧୦୦, ଲାଇଫ୍ ଟେକ୍ନୋଲୋଜି), ପେନିସିଲିନ୍ ଯୁକ୍ତ ଏକ ନ୍ୟୁରାଲ ମାଧ୍ୟମରେ ସ୍ଥାନାନ୍ତରିତ କରାଯାଇଥିଲା।и ст кпомомицин (1: 100, ଲାଇଫ୍ ଟେକ୍ନୋଲୋଜି) ଏବଂ дополнены эпидер кидерм агом рост (EGF; 20 нг / гир; R&D системалары) и игом рост фибробластов 2 (FGF2; 20 нг / иш; R&D ସିଷ୍ଟମ୍) до 24-г дня। ଏବଂ ଷ୍ଟ୍ରେପ୍ଟୋମାଇସିନ୍ (୧:୧୦୦, ଲାଇଫ୍ ଟେକ୍ନୋଲୋଜି) ଏବଂ ଏପିଡର୍ମାଲ ଗ୍ରୋଥ୍ ଫ୍ୟାକ୍ଟର (EGF; ୨୦ ng/ml; R&D ସିଷ୍ଟମ୍ସ) ଏବଂ ଫାଇବ୍ରୋବ୍ଲାଷ୍ଟ ଗ୍ରୋଥ୍ ଫ୍ୟାକ୍ଟର ୨ (FGF2; ୨୦ ng/ml; R&D ସିଷ୍ଟମ୍ସ) ସହିତ ପରିପୂରକ ୨୪ ଦିନ ପର୍ଯ୍ୟନ୍ତ।୨୫ ରୁ ୪୨ ଦିନ ପର୍ଯ୍ୟନ୍ତ, ମସ୍ତିଷ୍କରୁ ପ୍ରାପ୍ତ ନ୍ୟୁରୋଟ୍ରୋଫିନ୍ ଫ୍ୟାକ୍ଟର (BDNF; ୨୦ ng ml-୧, ପେପ୍ରୋଟେକ୍) ଏବଂ ନ୍ୟୁରୋଟ୍ରୋଫିନ୍ ୩ (NT3; ୨୦ ng ml-୧, ପେପ୍ରୋଟେକ୍) ମାଧ୍ୟମରେ ଯୋଡା ଯାଇଥିଲା, ପ୍ରତ୍ୟେକ ଦିନ ମାଧ୍ୟମ ପରିବର୍ତ୍ତନ କରାଯାଉଥିଲା।在悬浮的第 6 天，将神经球体转移到含有 neurobasal-A （10888 ， Life Technologies ）、不含维生素 A 的 B-27 补充剂（ 12587 ， ଜୀବନ ଟେକ୍ନୋଲୋଜି ）、 GlutaMax （1: 100 ， ଜୀବନ ଟେକ୍ନୋଲୋଜି ）、青霉素的神经培养基中和链霉素（ 1: 100 ， ଜୀବନ ଟେକ୍ନୋଲୋଜି ）并辅以表皮生长因子（ EGF ； 20 ng ml-1 ； R&D ସିଷ୍ଟମ୍ ）和成纤维细胞生长因子 2 （FGF2 ； 20 ng ml-1 ； R&D ସିଷ୍ଟମ୍ ）直至第 24 天。含有 悬浮 的 第 6 天 含有 含有 含有 含有 ob ob 含有 ob 含有 ob ob 88 88 88 88 88 88 88 88--- （（（ 20 ng ml-1 ； r & d ସିଷ୍ଟମ୍） 成 纤维 细胞 生长 2 （fgf2 ； 20 ng ml- 1 ； R&D ସିଷ୍ଟମ୍ ）直至第 24 天。 На 6-й день суспензии ацросферы были переведены на добавку, содержащую нагробазал-А (10888, ଲାଇଫ୍ ଟେକ୍ନୋଲୋଜି), добавку В-27 ସିଟ୍ витамина А (12587, ଲାଇଫ୍ ଟେକ୍ନୋଲୋଜି), ଗ୍ଲୁଟାମାକ୍ସ (1: 100, ଲାଇଫ୍ ଟେକ୍ନୋଲୋଜି) । за рост фибробластов 2 (FGF2; 20 нг гир-1) 1; ଷଷ୍ଠ ଦିନରେ, ନ୍ୟୁରୋସ୍ଫିୟର ସସପେନସନଗୁଡ଼ିକୁ ନ୍ୟୁରୋବାସାଲ-ଏ (୧୦୮୮୮, ଲାଇଫ୍ ଟେକ୍ନୋଲୋଜି), ଭିଟାମିନ୍ ଏ ବିନା B-୨୭ ସପ୍ଲିମେଣ୍ଟ (୧୨୫୮୭, ଲାଇଫ୍ ଟେକ୍ନୋଲୋଜି), ଗ୍ଲୁଟାମ୍ୟାକ୍ସ (୧:୧୦୦, ଲାଇଫ୍ ଟେକ୍ନୋଲୋଜି), ପେନିସିଲିନ-ନିରପେକ୍ଷ ଷ୍ଟ୍ରେପ୍ଟୋମାଇସିନ୍ (୧:୧୦୦, ଲାଇଫ୍ ଟେକ୍ନୋଲୋଜି) ସହିତ ଏପିଡର୍ମାଲ ଗ୍ରୋଥ୍ ଫ୍ୟାକ୍ଟର (EGF; ୨୦ ng ml-୧; R&D ସିଷ୍ଟମ୍ସ) ଏବଂ ଫାଇବ୍ରୋବ୍ଲାଷ୍ଟ ଗ୍ରୋଥ୍ ଫ୍ୟାକ୍ଟର ୨ (FGF2; ୨୦ ng ml-୧) ୧ ସହିତ ପରିପୂରକ ସହିତ ପରିପୂରକ ଭାବରେ ପରିବର୍ତ୍ତନ କରାଯାଇଥିଲା; R&D ସିଷ୍ଟମ୍) 24-го дня। (ଆର ଆଣ୍ଡ ଡି ସିଷ୍ଟମ) ୨୪ ତାରିଖ ପର୍ଯ୍ୟନ୍ତ।୨୫ ରୁ ୪୨ ଦିନ ପର୍ଯ୍ୟନ୍ତ, ମସ୍ତିଷ୍କରୁ ପ୍ରାପ୍ତ ନ୍ୟୁରୋଟ୍ରୋଫିକ୍ ଫ୍ୟାକ୍ଟର (BDNF; ୨୦ ng ml-୧, ପେପ୍ରୋଟେକ୍) ଏବଂ ନ୍ୟୁରୋଟ୍ରୋଫିକ୍ ଫ୍ୟାକ୍ଟର ୩ (NT3; ୨୦ ng ml-୧, ପେପ୍ରୋଟେକ୍) କୁ ପ୍ରତି ଦିନ କଲଚର ମାଧ୍ୟମରେ ଯୋଡା ଯାଇଥିଲା। ଥରେ ମଧ୍ୟମ ପରିବର୍ତ୍ତନ କରାଯାଇଥିଲା।୪୩ ତମ ଦିନରୁ ଆରମ୍ଭ କରି, ପ୍ରତି ୪-୬ ଦିନରେ ମଧ୍ୟମ ପରିବର୍ତ୍ତନ ସହିତ hCO କୁ ଅସମ୍ପୂର୍ଣ୍ଣ ନ୍ୟୁରୋବାସାଲ-A ମାଧ୍ୟମ (NM; ୧୦୮୮୦୨୨, ଥର୍ମୋ ଫିସର) ରେ ରଖାଯାଉଥିଲା। ଫିଡରଲେସ ପରିସ୍ଥିତିରେ ସଂଶ୍ଳିଷ୍ଟ hiPS କୋଷରୁ hCO ପାଇବା ପାଇଁ, hiPS କୋଷଗୁଡ଼ିକୁ Accutase (AT-୧୦୪, ଇନୋଭେଟ୍ ସେଲ୍ ଟେକ୍ନୋଲୋଜିସ୍) ସହିତ ୩୭°C ତାପମାତ୍ରାରେ ୭ ମିନିଟ୍ ପାଇଁ ଇନକ୍ୟୁବେଟେଡ୍ କରାଯାଇଥିଲା, ଏକକ କୋଷରେ ବିଚ୍ଛିନ୍ନ କରାଯାଇଥିଲା, ଏବଂ ROCK ଇନହିବିଟର Y-୨୭୬୩୨ (୧୦ μM; S୧୦୪୯, Selleckchem) ସହିତ ପରିପୂରକ Essential 8 ମାଧ୍ୟମର ପ୍ରତି କୂଅରେ ୩ × ୧୦୬ ଏକକ କୋଷ ଘନତାରେ AggreWell 800 ପ୍ଲେଟ୍ (୩୪୮୧୫, STEMCELL ଟେକ୍ନୋଲୋଜିସ୍) ରେ ପ୍ଲେଟ୍ କରାଯାଇଥିଲା। 24 ଘଣ୍ଟା ପରେ, କୂପଗୁଡ଼ିକରେ ଥିବା ଗଣମାଧ୍ୟମକୁ ପାଇପେଟ୍ କରାଯାଇଥିଲା ଯେଉଁଥିରେ ଏସେନ୍ସିଆଲ୍ 6 ମିଡିଆ (A1516401, ଲାଇଫ୍ ଟେକ୍ନୋଲୋଜିସ୍) ଡୋର୍ସୋମର୍ଫିନ୍ (2.5 μM; P5499, ସିଗମା-ଆଲଡ୍ରିଚ୍) ଏବଂ SB-431542 (10 μM; 1614) ସହିତ ପରିପୂରକ କରାଯାଇଥିଲା। , ଟୋକ୍ରିଡା)। ଦିନ 2 ରୁ 6 ପର୍ଯ୍ୟନ୍ତ, ଏସେନ୍ସିଆଲ୍ 6 ମାଧ୍ୟମକୁ ପ୍ରତିଦିନ ଡୋର୍ସୋମର୍ଫିନ୍ ଏବଂ ପରିପୂରକ SB-431542 ସହିତ ବଦଳାଯାଉଥିଲା। ଷଷ୍ଠ ଦିନରୁ, ନ୍ୟୁରୋସ୍ଫିଅର୍ ସସପେନ୍ସନଗୁଡ଼ିକୁ ନ୍ୟୁରୋବାସାଲ୍ ମାଧ୍ୟମରେ ସ୍ଥାନାନ୍ତରିତ କରାଯାଇଥିଲା ଏବଂ ଉପରେ ବର୍ଣ୍ଣିତ ଅନୁସାରେ ରକ୍ଷଣାବେକ୍ଷଣ କରାଯାଇଥିଲା।
ଷ୍ଟାନଫୋର୍ଡ ବିଶ୍ୱବିଦ୍ୟାଳୟ ଲାବୋରେଟୋରୀ ପଶୁ ଯତ୍ନ ପ୍ରଶାସନିକ କମିଟି (APLAC) ଦ୍ୱାରା ଅନୁମୋଦିତ ପଶୁ ଯତ୍ନ ନିର୍ଦ୍ଦେଶାବଳୀ ଅନୁଯାୟୀ ସମସ୍ତ ପ୍ରାଣୀ ପ୍ରକ୍ରିୟା କରାଯାଇଥିଲା। ଗର୍ଭବତୀ ଇଉଥିମିକ୍ RNU (rnu/+) ମୂଷାମାନଙ୍କୁ (ଚାର୍ଲ୍ସ ରିଭର ଲାବୋରେଟୋରୀ) କିଣାଯାଇଥିଲା କିମ୍ବା ରଖାଯାଇଥିଲା। ପଶୁମାନଙ୍କୁ ଖାଦ୍ୟ ଏବଂ ପାଣି ସହିତ 12 ଘଣ୍ଟା ଆଲୋକ-ଅନ୍ଧକାର ଚକ୍ରରେ ରଖାଯାଇଥିଲା। ତିନି ରୁ ସାତ ଦିନ ବୟସର ନଗ୍ନ (FOXN1–/–) ମୂଷା ଛୁଆମାନଙ୍କୁ କାଟିବା ପୂର୍ବରୁ ଅପରିପକ୍ୱ ଝିଙ୍କ ବୃଦ୍ଧି ଦ୍ୱାରା ଚିହ୍ନଟ କରାଯାଇଥିଲା। କୁକୁର ଛୁଆ (ପୁରୁଷ ଏବଂ ମହିଳା)ଙ୍କୁ 2-3% ଆଇସୋଫ୍ଲୁରେନ୍ ସହିତ ନିଶ୍ଚେତକ କରାଯାଇଥିଲା ଏବଂ ଏକ ଷ୍ଟେରିଓଟାକ୍ସିକ ଫ୍ରେମରେ ରଖାଯାଇଥିଲା। ଡୁରା ମାଟରର ଅଖଣ୍ଡତା ବଜାୟ ରଖି S1 ଉପରେ ପ୍ରାୟ 2-3 ମିମି ବ୍ୟାସ ସହିତ ଖପୁରୀର ଏକ ଟ୍ରେପାନେସନ୍ କରାଯାଇଥିଲା। ତା'ପରେ ଡୁରାକୁ ବିନ୍ଧିବା ପାଇଁ କ୍ରାନିଓଟୋମି ବାହାରେ 30-G ସୂଚୀ (ପ୍ରାୟ 0.3 ମିମି) ବ୍ୟବହାର କରନ୍ତୁ। ତା'ପରେ HCO କୁ ଏକ ପତଳା 3×3 ସେମି ପାରାଫିଲ୍ମରେ ପ୍ରୟୋଗ କରନ୍ତୁ ଏବଂ ଅତିରିକ୍ତ ମାଧ୍ୟମକୁ ବାହାର କରନ୍ତୁ। 23 G, 45° ଛୁଞ୍ଚି ସହିତ ସଂଲଗ୍ନ ଏକ ହାମିଲଟନ୍ ସିରିଞ୍ଜ ବ୍ୟବହାର କରି, ଛୁଞ୍ଚିର ସବୁଠାରୁ ଦୂରବର୍ତ୍ତୀ ପ୍ରାନ୍ତରେ hCO କୁ ଧୀରେ ଧୀରେ ଟାଣନ୍ତୁ। ତା'ପରେ ଷ୍ଟେରିଓଟାକ୍ସିକ ଡିଭାଇସ୍ ସହିତ ସଂଲଗ୍ନ ସିରିଞ୍ଜ ପମ୍ପରେ ସିରିଞ୍ଜ ସ୍ଥାପନ କରନ୍ତୁ। ତା'ପରେ ଛୁଞ୍ଚିର ଅଗ୍ରଭାଗକୁ ଡୁରାରେ ପୂର୍ବରୁ ତିଆରି 0.3 ମିମି ଚଉଡା ପଙ୍କଚର ଗାତ ଉପରେ ରଖନ୍ତୁ (z = 0 ମିମି) ଏବଂ ସିରିଞ୍ଜକୁ 1-2 ମିମି (z = ପ୍ରାୟ –1.5 ମିମି) ସଙ୍କୁଚିତ କରନ୍ତୁ ଯେପର୍ଯ୍ୟନ୍ତ ଛୁଞ୍ଚି ଡୁରା ମାଟର A ମଧ୍ୟରେ ନଥାଏ। ଏକ ଘନ ସିଲ୍ ଗଠିତ ହୁଏ। ତା'ପରେ z = -0.5 ମିମିରେ କର୍ଟିକାଲ୍ ପୃଷ୍ଠର କେନ୍ଦ୍ରକୁ ସିରିଞ୍ଜକୁ ଉଠାନ୍ତୁ ଏବଂ ପ୍ରତି ମିନିଟ୍ ରେ 1-2 µl ହାରରେ hCO ଇଞ୍ଜେକ୍ସନ କରନ୍ତୁ। hCO ଇଞ୍ଜେକ୍ସନ ସମାପ୍ତ ହେବା ପରେ, ଛୁଞ୍ଚିକୁ ପ୍ରତି ମିନିଟ୍ ରେ 0.2-0.5 ମିମି ହାରରେ ପ୍ରତ୍ୟାହାର କରାଯାଏ, ଚର୍ମ ସିଲେଇ କରାଯାଏ, ଏବଂ କୁକୁରଛୁଆକୁ ସମ୍ପୂର୍ଣ୍ଣ ସୁସ୍ଥ ହେବା ପର୍ଯ୍ୟନ୍ତ ତୁରନ୍ତ ଏକ ଉଷ୍ମ ଗରମ ପ୍ୟାଡ୍ ଉପରେ ରଖାଯାଏ। କିଛି ପ୍ରାଣୀଙ୍କୁ ଦ୍ୱିପାକ୍ଷିକ ଭାବରେ ପ୍ରତିରୋପଣ କରାଯାଇଥିଲା।
ସମସ୍ତ ପ୍ରାଣୀ ପ୍ରକ୍ରିୟା ଷ୍ଟାନଫୋର୍ଡ ବିଶ୍ୱବିଦ୍ୟାଳୟ APLAC-ଅନୁମୋଦିତ ପଶୁ ଯତ୍ନ ନିର୍ଦ୍ଦେଶାବଳୀ ଅନୁଯାୟୀ କରାଯାଇଥିଲା। ପ୍ରତିରୋପଣ ପରେ 60 ଦିନରୁ ଅଧିକ ସମୟ ପାଇଁ ମୂଷାମାନଙ୍କୁ 5% ଆଇସୋଫ୍ଲୁରେନ୍ ଆନାସ୍ଥେସିଆ ସହିତ ପ୍ରେରିତ କରାଯାଇଥିଲା ଏବଂ ଇମେଜିଂ ସମୟରେ 1-3% ଆଇସୋଫ୍ଲୁରେନ୍ ସହିତ ଆନାସ୍ଥେସିଆ ଦିଆଯାଇଥିଲା। ଭିଜୁଆଲାଇଜେସନ୍ ପାଇଁ, ଏକ 7 ଟେସ୍ଲା ସକ୍ରିୟ ଭାବରେ ସୁରକ୍ଷାପ୍ରାପ୍ତ ହରିଜୋଣ୍ଟାଲ୍ ବୋରହୋଲ୍ ସ୍କାନର୍ ବ୍ରୁକର (ବ୍ରୁକର କର୍ପୋରେସନ୍) ଏକ ଆଭ୍ୟନ୍ତରୀଣ ବ୍ୟାସ ସହିତ ଏକ ଆଭ୍ୟନ୍ତରୀଣ ବ୍ୟାସ ଏକ ଆଭ୍ୟନ୍ତରୀଣ ବ୍ୟାସ 120 mm (600 mT/m, 1000 T/m/s) AVANCE ବ୍ୟବହାର କରି ବ୍ୟବହାର କରାଯାଇଥିଲା। III, ଆଠ-ଚ୍ୟାନେଲ୍ ମଲ୍ଟି-କଏଲ୍ RF ଏବଂ ମଲ୍ଟି-କୋର୍ କ୍ଷମତା, ଏବଂ ସଂଲଗ୍ନ ପାରାଭିଜନ 6.0.1 ପ୍ଲାଟଫର୍ମ। 86 mm ଆଭ୍ୟନ୍ତରୀଣ ବ୍ୟାସ ସହିତ ଏକ ସକ୍ରିୟ ଭାବରେ ଡିକପଲ୍ ଭଲ୍ୟୁମେଟ୍ରିକ୍ RF କଏଲ୍ ଏବଂ କେବଳ ଗ୍ରହଣ ପାଇଁ ଏକ ଚାରି-ଚ୍ୟାନେଲ୍ କ୍ରାୟୋ-କୁଲ୍ଡ RF କଏଲ୍ ବ୍ୟବହାର କରି ରେକର୍ଡିଂ କରାଯାଇଥିଲା। ଅକ୍ଷୀୟ 2D ଟର୍ବୋ-RARE (ପୁନରାବୃତ୍ତି ସମୟ = 2500 ms, ପ୍ରତିଧ୍ୱନି ସମୟ = 33 ms, 2 ହାରାହାରି) 16 ଟି ସ୍ଲାଇସ୍ କ୍ୟାପଚର ସହିତ, ସ୍ଲାଇସ୍ ଘନତା 0.6–0.8 mm, 256 × 256 ନମୁନା ଧାରଣ କରିଛି। 2 ସେମି ଆଭ୍ୟନ୍ତରୀଣ ବ୍ୟାସ ସହିତ ଏକ କ୍ୱାଡ୍ରେଚର ଟ୍ରାନ୍ସସିଭର ଭଲ୍ୟୁମେଟ୍ରିକ୍ RF କଏଲ ବ୍ୟବହାର କରି ସିଗନାଲଗୁଡ଼ିକ ଗ୍ରହଣ କରାଯାଇଥିଲା (ରାପିଡ୍ MR ଇଣ୍ଟରନ୍ୟାସନାଲ୍, LLC)। ଶେଷରେ, 3D ରେଣ୍ଡରିଂ ଏବଂ ଭଲ୍ୟୁମ୍ ବିଶ୍ଳେଷଣ ପାଇଁ ବିଲ୍ଟ-ଇନ୍ ଇମାରିସ୍ (ବିଟପ୍ଲେନ୍) ପୃଷ୍ଠ ଆକଳନ କାର୍ଯ୍ୟ ବ୍ୟବହାର କରନ୍ତୁ। ଏକ ସଫଳ ପ୍ରତିରୋପଣକୁ ଏପରି ଭାବରେ ପରିଭାଷିତ କରାଯାଇଥିଲା ଯେଉଁଥିରେ ପ୍ରତିରୋପିତ ଗୋଲାର୍ଦ୍ଧରେ ନିରନ୍ତର T2-ଓଜନଯୁକ୍ତ MRI ସିଗନାଲର କ୍ଷେତ୍ରଗୁଡ଼ିକ ଗଠିତ ହୋଇଥିଲା। ଗ୍ରାଫ୍ଟ ପ୍ରତ୍ୟାଖ୍ୟାନକୁ ଏକ ଗ୍ରାଫ୍ଟ ଭାବରେ ପରିଭାଷିତ କରାଯାଇଥିଲା ଯାହା ପ୍ରତିରୋପିତ ଗୋଲାର୍ଦ୍ଧରେ ନିରନ୍ତର T2-ଓଜନଯୁକ୍ତ MRI ସିଗନାଲର କ୍ଷେତ୍ରଗୁଡ଼ିକ ଉତ୍ପାଦନ କରିନଥିଲା। ପରବର୍ତ୍ତୀ ବିଶ୍ଳେଷଣରୁ ସବକର୍ଟିକାଲ୍ t-hCO କୁ ବାଦ ଦିଆଯାଇଥିଲା।
ଦୁଇ-ଫୋଟନ୍ କ୍ୟାଲସିୟମ୍ ଇମେଜିଂ ପାଇଁ hCO ରେ GCaMP6s ସ୍ଥିର ଭାବରେ ପ୍ରକାଶ କରିବା ପାଇଁ, hiPS କୋଷଗୁଡ଼ିକୁ pLV[Exp]-EF1a::GcaMP6s-WPRE-Puro ଦ୍ୱାରା ସଂକ୍ରମିତ କରାଯାଇଥିଲା ଏବଂ ତା'ପରେ ଆଣ୍ଟିବାୟୋଟିକ୍ ଚୟନ କରାଯାଇଥିଲା। ସଂକ୍ଷେପରେ, କୋଷଗୁଡ଼ିକୁ EDTA ସହିତ ବିଚ୍ଛିନ୍ନ କରାଯାଇଥିଲା ଏବଂ ପଲିବ୍ରେନ୍ (5 μg/ml) ଏବଂ 15 μl ଭାଇରସ୍ ଉପସ୍ଥିତିରେ ପ୍ରାୟ 300,000 କୋଷ ଘନତାରେ 1 ml Essential 8 ମାଧ୍ୟମରେ ନିଲମ୍ବିତ କରାଯାଇଥିଲା। ତା'ପରେ କୋଷଗୁଡ଼ିକୁ 60 ମିନିଟ୍ ପାଇଁ ସସପେନସନରେ ଇନକ୍ୟୁବେଟେଡ୍ କରାଯାଇଥିଲା ଏବଂ ପ୍ରତି କୂଅରେ 50,000 କୋଷ ଘନତାରେ ବୀଜ କରାଯାଇଥିଲା। ସଂଗମ ପରେ, କୋଷଗୁଡ଼ିକୁ 5-10 ଦିନ ପାଇଁ କିମ୍ବା ସ୍ଥିର କଲୋନୀ ଦେଖାଯିବା ପର୍ଯ୍ୟନ୍ତ 5-10 μg ml-1 puromycin ସହିତ ଚିକିତ୍ସା କରାଯାଇଥିଲା। କିଛି ପରିବର୍ତ୍ତନ ସହିତ ପୂର୍ବରୁ ବର୍ଣ୍ଣନା କରାଯାଇଥିବା 5 ପରି ତୀବ୍ର hCO ସଂକ୍ରମଣ କରାଯାଇଥିଲା। ସଂକ୍ଷେପରେ, ଦିନ 30-45 hCO କୁ 100 μl ସ୍ନାୟୁ ମାଧ୍ୟମ ଧାରଣ କରିଥିବା 1.5 ml Eppendorf ମାଇକ୍ରୋସେଣ୍ଟ୍ରିଫ୍ୟୁଜ୍ ଟ୍ୟୁବରେ ସ୍ଥାନାନ୍ତର କରନ୍ତୁ। ତା’ପରେ ପ୍ରାୟ 90 µl ମାଧ୍ୟମ ବାହାର କରାଯାଏ, 3-6 µl ଉଚ୍ଚ ଟାଇଟର ଲେଣ୍ଟିଭାଇରସ୍ (0.5 x 108 ରୁ 1.2 x 109 ପର୍ଯ୍ୟନ୍ତ) ଟ୍ୟୁବରେ ଯୋଡାଯାଏ, ଏବଂ hCO କୁ 30 ମିନିଟ୍ ପାଇଁ ଇନକ୍ୟୁବେଟରକୁ ସ୍ଥାନାନ୍ତରିତ କରାଯାଏ। ତା’ପରେ ପ୍ରତ୍ୟେକ ଟ୍ୟୁବରେ 90-100 µl ମାଧ୍ୟମ ଯୋଡାଯାଏ ଏବଂ ଟ୍ୟୁବଗୁଡ଼ିକୁ ରାତାରାତି ଇନକ୍ୟୁବେଟରକୁ ଫେରାଇ ଆସେ। ପରଦିନ, କମ୍ ସଂଲଗ୍ନ ପ୍ଲେଟରେ ତାଜା ସ୍ନାୟୁ ମାଧ୍ୟମକୁ hCO ସ୍ଥାନାନ୍ତରିତ କରନ୍ତୁ। 7 ଦିନ ପରେ, ସଂକ୍ରମଣ ଗୁଣବତ୍ତାର ଦୃଶ୍ୟ ଏବଂ ମୂଲ୍ୟାଙ୍କନ ପାଇଁ hCO କୁ 24-କୂପ କାଚ ତଳ ପ୍ଲେଟକୁ ସ୍ଥାନାନ୍ତରିତ କରାଯାଇଥିଲା। pLV[Exp]-SYN1::EYFP-WPRE ଏବଂ pLV[Exp]-SYN1::hChR2-EYFP-WPRE ଭେକ୍ଟରବିଲ୍ଡର ଦ୍ୱାରା ସୃଷ୍ଟି କରାଯାଇଥିଲା। ଲେଣ୍ଟିଭାଇରସ୍ ଅଧିକାଂଶ ପରୀକ୍ଷଣରେ ବ୍ୟବହୃତ ହୁଏ କାରଣ ଏହା ହୋଷ୍ଟ ଜିନୋମରେ ସଂଯୁକ୍ତ, ସଂକ୍ରମିତ କୋଷ ରେଖାରେ ରିପୋର୍ଟର ଜିନ୍ ପ୍ରକାଶନକୁ ଅନୁମତି ଦିଏ। ରାବିଜ୍ ଫଲୋ-ଅପ୍ ପାଇଁ, ଦିନ 30-45 hCO କୁ ରାବିଜ୍-ΔG-eGFP ଏବଂ AAV-DJ-EF1a-CVS-G-WPRE-pGHpA (ପ୍ଲାଜମିଡ୍ #67528, ଆଡ୍ଜିନ୍) ସହିତ ସହ-ସଂକ୍ରମିତ କରାଯାଇଥିଲା, 3 ଦିନ ପାଇଁ ଭଲ ଭାବରେ ଧୋଇ ଦିଆଯାଇଥିଲା, ଏବଂ S1 ରେ ମୂଷାମାନଙ୍କ ମଧ୍ୟରେ ପ୍ରତିରୋପଣ କରାଯାଇଥିଲା ଏବଂ 7-14 ଦିନ ପାଇଁ ଭିଭୋରେ ରଖାଯାଇଥିଲା।
ଇମ୍ୟୁନୋସାଇଟୋକେମିଷ୍ଟ୍ରି ପାଇଁ, ପ୍ରାଣୀମାନଙ୍କୁ ନିଶ୍ଚେତକ ଦିଆଯାଇଥିଲା ଏବଂ PBS ସହିତ ଟ୍ରାନ୍ସକାର୍ଡିଆଲି ପର୍ଫ୍ୟୁଜ କରାଯାଇଥିଲା ଏବଂ ତା’ପରେ 4% ପାରାଫର୍ମାଲ୍ଡିହାଇଡ୍ (PBS ରେ PFA; ଇଲେକ୍ଟ୍ରୋନ୍ ମାଇକ୍ରୋସ୍କୋପି ସାଇନ୍ସ) ଦିଆଯାଇଥିଲା। ମସ୍ତିଷ୍କକୁ 4% PFA ରେ 2 ଘଣ୍ଟା ପାଇଁ କିମ୍ବା ରାତିସାରା 4°C ରେ ସ୍ଥିର କରାଯାଇଥିଲା, PBS ରେ 30% ସୁକ୍ରୋଜ୍ ରେ 48-72 ଘଣ୍ଟା ପାଇଁ କ୍ରାଇଓପ୍ରିଜର୍ଭ କରାଯାଇଥିଲା, ଏବଂ 1:1, 30% ସୁକ୍ରୋଜ୍ ରେ ଏମ୍ବେଡେଡ୍ କରାଯାଇଥିଲା: OCT (ଟିସୁ-ଟେକ୍ OCT କମ୍ପାଉଣ୍ଡ 4583, ସାକୁରା ଫିନେଟେକ୍) ଏବଂ କ୍ରାଇଓଷ୍ଟାଟ୍ (Leica) ବ୍ୟବହାର କରି 30 µm ରେ କରୋନାଲ୍ ସେକ୍ସନ କରାଯାଇଥିଲା। ଘନ ସେକ୍ସନର ଇମ୍ୟୁନୋହିଷ୍ଟୋକେମିଷ୍ଟ୍ରି ପାଇଁ, ପ୍ରାଣୀମାନଙ୍କୁ PBS ସହିତ ପରଫ୍ୟୁଜ କରାଯାଇଥିଲା, ଏବଂ ମସ୍ତିଷ୍କକୁ ଏକ ଭାଇବ୍ରାଟୋମ୍ (Leica) ବ୍ୟବହାର କରି 300-400 µm ରେ କରୋନାଲ୍ ସେକ୍ସନ କରାଯାଇଥିଲା ଏବଂ ସେକ୍ସନଗୁଡ଼ିକୁ 30 ମିନିଟ୍ ପାଇଁ 4% PFA ସହିତ ସ୍ଥିର କରାଯାଇଥିଲା। ତା'ପରେ କ୍ରାଇଓସେକ୍ସନ କିମ୍ବା ଘନ ଅଂଶଗୁଡ଼ିକୁ PBS ସହିତ ଧୋଇ ଦିଆଯାଇଥିଲା, କୋଠରୀ ତାପମାତ୍ରାରେ 1 ଘଣ୍ଟା ପାଇଁ ଅବରୋଧ କରାଯାଇଥିଲା (10% ସାଧାରଣ ଗଧ ସେରମ୍ (NDS) ଏବଂ 0.3% ଟ୍ରାଇଟନ୍ X-100 PBS ରେ ମିଶ୍ରିତ) ଏବଂ 4°C ତାପମାତ୍ରାରେ ବ୍ଲକିଂ ଦ୍ରବଣ ସହିତ ଅବରୋଧ କରାଯାଇଥିଲା। – ଇନକ୍ୟୁବେସନ୍ କ୍ରାଇଓସେକ୍ସନଗୁଡ଼ିକୁ ରାତାରାତି ଇନକ୍ୟୁବେଟ୍ କରାଯାଇଥିଲା ଏବଂ ଘନ ଅଂଶଗୁଡ଼ିକୁ 5 ଦିନ ପାଇଁ ଇନକ୍ୟୁବେଟ୍ କରାଯାଇଥିଲା। ବ୍ୟବହୃତ ପ୍ରାଥମିକ ଆଣ୍ଟିବଡିଗୁଡ଼ିକ ଥିଲା: ଆଣ୍ଟି-ନ୍ୟୁଏନ୍ (ମୂଷା, 1:500; ab104224, abcam) ଆଣ୍ଟି-CTIP2 (ମୁଷା, 1:300; ab18465, abcam), ଆଣ୍ଟି-GFAP (ଖରଗୋଶ, 1:1,000; Z0334, ଡାକୋ), ଆଣ୍ଟି-GFP (କୁକୁଡ଼ା, 1:1,000; GTX13970, GeneTex), ଆଣ୍ଟି-HNA (ମୂଷା, 1:200; ab191181, abcam), ଆଣ୍ଟି-ନ୍ୟୁଏନ୍ (ଖରଗୋଶ, 1:500; ABN78, ମିଲିପୋର), ଆଣ୍ଟି-PDGFRA (ଖରଗୋଶ, 1:200; sc-338, ସାଣ୍ଟା କ୍ରୁଜ୍), ଆଣ୍ଟି-PPP1R17 (ଖରଗୋଶ, 1:200; HPA047819, ଆଟଲାସ୍ ଆଣ୍ଟିବଡିଜ୍), ଆଣ୍ଟି-RECA-1 (ମୂଷା, 1:50; ab9774, abcam), ଆଣ୍ଟି-SCG2 (ଖରାପତ, 1:100; 20357-1-AP, ପ୍ରୋଟିନଟେକ୍), ଆଣ୍ଟି-SOX9 (ଛେଳି, 1:500; AF3075, R&D ସିଷ୍ଟମ୍ସ), Netrin G1a (ଛେଳି, 1:100; AF1166, R&D ସିଷ୍ଟମ୍ସ), ଆଣ୍ଟି-STEM121 (ମୁଷା, 1:200; Y40410, ଟାକାରା ବାୟୋ), ଆଣ୍ଟି-SATB2 (ମୁଷା, 1:50; ab51502, abcam), ଆଣ୍ଟି-GAD65/67 (ଖରାପତ, 1:400; ABN904, ମିଲିପୋର) ଏବଂ ଆଣ୍ଟି-IBA1 (ଛେଳି, 1:100; ab5076, abcam)। ବ୍ୟବହୃତ ପ୍ରାଥମିକ ଆଣ୍ଟିବଡିଗୁଡ଼ିକ ଥିଲା: ଆଣ୍ଟି-ନ୍ୟୁଏନ୍ (ମୂଷା, 1:500; ab104224, abcam) ଆଣ୍ଟି-CTIP2 (ମୂଷା, 1:300; ab18465, abcam), ଆଣ୍ଟି-GFAP (ଖରଗୋଶ, 1:1,000; Z0334, ଡାକୋ), ଆଣ୍ଟି-GFP (କୁକୁଡ଼ା, 1:1,000; GTX13970, GeneTex), ଆଣ୍ଟି-HNA (ମୂଷା, 1:200; ab191181, abcam), ଆଣ୍ଟି-ନ୍ୟୁଏନ୍ (ଖରଗୋଶ, 1:500; ABN78, ମିଲିପୋର), ଆଣ୍ଟି-PDGFRA (ଖରଗୋଶ, 1:200; sc-338, ସାଣ୍ଟା କ୍ରୁଜ୍), ଆଣ୍ଟି-PPP1R17 (ଖରଗୋଶ, 1:200; HPA047819, ଆଟଲାସ୍ ଆଣ୍ଟିବଡିଜ୍), ଆଣ୍ଟି-RECA-1 (ମୂଷା, 1:50; ab9774, abcam), ଆଣ୍ଟି-SCG2 (ଖରାପତ, 1:100; 20357-1-AP, ପ୍ରୋଟିନଟେକ୍), ଆଣ୍ଟି-SOX9 (ଛେଳି, 1:500; AF3075, R&D ସିଷ୍ଟମ୍ସ), Netrin G1a (ଛେଳି, 1:100; AF1166, R&D ସିଷ୍ଟମ୍ସ), ଆଣ୍ଟି-STEM121 (ମୁଷା, 1:200; Y40410, ଟାକାରା ବାୟୋ), ଆଣ୍ଟି-SATB2 (ମୁଷା, 1:50; ab51502, abcam), ଆଣ୍ଟି-GAD65/67 (ଖରାପତ, 1:400; ABN904, ମିଲିପୋର) ଏବଂ ଆଣ୍ଟି-IBA1 (ଛେଳି, 1:100; ab5076, abcam)। Использовались следующие первичные антитела: ки-NeuN (мшиные, 1: 500; ab104224, abcam), анти--CTIP2 1: 1000; yin-PDGFRA (кролик, 1: 200; sc-338, କାର୍ଟା-କ୍ରୁଜ୍), କାନ୍-PPP1R17 (кролик, 1: 200; HPA047819, ଆଟଲାସ୍ ଆଣ୍ଟିବଡି), ଗଜ-ରେକା -1 । yin-SATB2 (мышь, 1:50; ab51502, abcam), କାନ-GAD65 / 67 (кролик, 1: 400; ABN904, ମିଲିପୋର) ଏବଂ ଇଜି- IBA1 (କୋଜା, 1: 100; ଅବ 5076, ଅବକାମ) | ବ୍ୟବହୃତ ପ୍ରାଥମିକ ଆଣ୍ଟିବଡିଗୁଡ଼ିକ ହେଲା: ଆଣ୍ଟି-ନ୍ୟୁଏନ୍ (ମୂଷା, 1:500; ab104224, abcam), ଆଣ୍ଟି-CTIP2 (ମୁଷା, 1:300; ab18465, abcam), ଆଣ୍ଟି-GFAP (ଖରଗୋଶ, 1:1000; Z0334, ଡାକୋ), ଆଣ୍ଟି-GFP (କୁକୁଡ଼ା, 1:1000; GTX13970, GeneTex), ଆଣ୍ଟି-HNA (ମୂଷା, 1:200; ab191181, abcam), ଆଣ୍ଟି-ନ୍ୟୁଏନ୍ (ଖରଗୋଶ, 1:500; ABN78, ମିଲିପୋର), ଆଣ୍ଟି-PDGFRA (ଖରଗୋଶ, 1:200; sc-338, ସାଣ୍ଟା କ୍ରୁଜ୍), ଆଣ୍ଟି-PPP1R17 (ଖରଗୋଶ, 1:200; HPA047819, ଆଟଲାସ୍ ଆଣ୍ଟିବଡିଜ୍), ଆଣ୍ଟି-RECA-1 (ମୂଷା, 1:50; ab9774, abcam), ଆଣ୍ଟି-SCG2 (ଖରାପତ, 1:100; 20357-1-AP, ପ୍ରୋଟିନଟେକ୍), ଆଣ୍ଟି-SOX9 (ଛେଳି, 1:500; AF3075, R&D ସିଷ୍ଟମ୍ସ), ନେଟ୍ରିନ୍ G1a (ଛେଳି, 1:100; AF1166, R&D ସିଷ୍ଟମ୍ସ), ଆଣ୍ଟି-STEM121 (ମୁଷା, 1:200; Y40410, ଟାକାରା ବାୟୋ), ଆଣ୍ଟି-SATB2 (ମୁଷା, 1:50; ab51502, abcam), ଆଣ୍ଟି-GAD65/67 (ଖରାପତ, 1:400; ABN904, ମିଲିପୋର) ଏବଂ ଆଣ୍ଟି-IBA1 (ଛେଳି, 1:100; ab5076, abkam)।U NeuN （小鼠， 1: 500 ； ab104224 ， abcam ）抗 CTIP2 （大鼠， 1: 300 ； ab18465 ， abcam ），抗 GFAP （兔， 1: 1000 ； Z0334 ， ଡାକୋ ），抗 -GF P （鸡， 1: 1000 ； GTX13970 ， GeneTex ），抗 HNA （小鼠， 1: 200 ； ab191181 ， abcam ），抗 NeuN （兔， 1: 500 ； ABN78 ， ମିଲିପୋର ），抗 PDGFRA （兔， 1: 200 ； sc-338 ， ସାଣ୍ଟା କ୍ରୁଜ୍ ），抗 PPP1R17 （兔， 1: 200 ； HPA047819 ， ଆଟଲାସ୍ 抗体），抗 RECA-1 （小鼠， 1: 50 ； ab9774 ， abcam ），抗 SCG2 （兔）, 1: 100 ； 20357-1-AP ， Proteintech ），抗 SOX9 （山羊， 1 500 500 ； G1a （山羊， 1: 100 ； AF1166 ， R & D ସିଷ୍ଟମ୍ ），抗 STEM121 （小鼠, 1: 200;U NeuN （小鼠， 1: 500 ； ab104224 ， abcam ）抗 CTIP2 （大鼠， 1: 300 ； ab18465 ， abcam ），抗 GFAP （兔， 1: 1000 ； Z0334 ， ଡାକୋ ），抗-GFP （鸡， 1: 1000 ； GTX13970 ， GeneTex ），抗 HNA （小鼠， 1: 200 ； ab191181 ， abcam ），抗 NeuN （兔， 1: 500 ； ABN78 ， ମିଲିପୋର ％弔，抗 1: 200 ； sc-338 ， ସାଣ୍ଟା | କ୍ରୁଜ୍ ），抗 PPP1R17 （兔， 1: 200 ； HPA047819 ， ଆଟଲାସ୍ 抗体），抗 RECA-1 （小鼠， 1: 50 ； ab9774 ， abcam ），抗 SCG2 100 ； 20357-1-AP ， ପ୍ରୋଟିନ୍ଟେକ୍ ），抗 SOX9 （山羊， 1: 500 ； AF3075 ， R & D ସିଷ୍ଟମ୍ ）， ନେଟ୍ରିନ୍ G1a ସିଷ୍ଟମ୍ ）頏 1:20 ,;Y40410, ଟାକାରା ବାୟୋ), ଆଣ୍ଟି-SATB2 (ମୂଷା, 1:50; ab51502, abcam), ଆଣ୍ଟି-GAD65/67 (ଖରାଆ, 1:400; ABN904, ମିଲିପୁର) ଏବଂ ଆଣ୍ଟି-IBA1 (ଛେଳି, 1:100; ab5076, abcam)।ବ୍ୟବହୃତ ପ୍ରାଥମିକ ଆଣ୍ଟିବଡିଗୁଡ଼ିକ ଥିଲା: ଆଣ୍ଟି-ନ୍ୟୁଏନ୍ (ମୂଷା, 1:500; ab104224, abcam), ଆଣ୍ଟି-CTIP2 (ମୁଷା, 1:300; ab18465, abcam), ଆଣ୍ଟି-GFAP (ଖରଗୋଶ, 1:1000; Z0334, ଡାକୋ)। , ଆଣ୍ଟି-GFP (କୁକୁଡ଼ା, 1:1000; GTX13970, GeneTex), ଆଣ୍ଟି-HNA (ମୂଷା, 1:200; ab191181, abcam), ଆଣ୍ଟି-NeuN (ଖରଗୋଶ, 1:500; ABN78, ମିଲିପୋର), ଆଣ୍ଟି-PDGFRA (ଖରଗୋଶ, 1:200; sc-338, ସାଣ୍ଟା କ୍ରୁଜ୍), ଆଣ୍ଟି-PPP1R17 (ଖରଗୋଶ, 1:200; HPA047819, ଆଟଲାସ୍ ଆଣ୍ଟିବଡି), ଆଣ୍ଟି-RECA-1 (ମୂଷା, 1:50; ab9774, abcam), ଆଣ୍ଟି-SCG2 (ଖରଗୋଶ), 1:100;20387 (кролик, 1: 400; ABN904, ମିଲିପୋର) ଏବଂ ଇଜ-ଆଇବିଏ 1 20357-1-AP, ପ୍ରୋଟିନଟେକ୍), ଆଣ୍ଟି-SOX9 (ଛେଳି, 1:500; AF3075, R&D ସିଷ୍ଟମ୍ସ), ନେଟ୍ରିନ୍ G1a (ଛେଳି, 1:100; AF1166, R&D ସିଷ୍ଟମ୍ସ), ଆଣ୍ଟି-STEM121 (ମୁଷା, 1:200; Y40410, ଟାକାରା ବାୟୋ), ଆଣ୍ଟି-SATB2 (ମୁଷା, 1:50; ab51502, abcam), ଆଣ୍ଟି-GAD65/67 (ଖରଗୋଶ, 1:400; ABN904, ମିଲିପୋର), ଏବଂ ଆଣ୍ଟି-IBA1 (ଛେଳି, 1:100; ab5076, abkam)।ତା’ପରେ ସେକ୍ସନଗୁଡ଼ିକୁ PBS ସହିତ ଧୋଇ ଦିଆଯାଇଥିଲା ଏବଂ ରୁମ୍ ତାପମାତ୍ରାରେ (ଫ୍ରୋଜେନ୍ ସେକ୍ସନ) କିମ୍ବା 4°C (ଘୁ ସେକ୍ସନ) ରାତାରାତି 1 ଘଣ୍ଟା ପାଇଁ ଦ୍ୱିତୀୟ ଆଣ୍ଟିବଡି ସହିତ ଇନ୍କ୍ୟୁବେଟେଡ୍ କରାଯାଇଥିଲା। ଆଲେକ୍ସା ଫ୍ଲୋର ଦ୍ୱିତୀୟ ଆଣ୍ଟିବଡି (ଲାଇଫ୍ ଟେକ୍ନୋଲୋଜି) 1:1000 ରେ ଦ୍ରବୀଭୂତ ବ୍ଲକିଂ ଦ୍ରବଣ ବ୍ୟବହାର କରାଯାଇଥିଲା। PBS ସହିତ ଧୋଇବା ପରେ, ନ୍ୟୁକ୍ଲିଅସ୍‌କୁ ହୋଚ୍ଷ୍ଟ 33258 (ଲାଇଫ୍ ଟେକ୍ନୋଲୋଜି) ସହିତ ଦୃଶ୍ୟମାନ କରାଯାଇଥିଲା। ଶେଷରେ, ସ୍ଲାଇଡ୍‌ଗୁଡ଼ିକୁ ଆକ୍ୱାମାଉଣ୍ଟ (ପଲିସାଇନ୍ସ) ବ୍ୟବହାର କରି କଭରସ୍ଲିପ୍ସ (ଫିଶର୍ ସାଇଣ୍ଟିଫିକ୍) ସହିତ ଏକ ମାଇକ୍ରୋସ୍କୋପରେ ରଖାଯାଇଥିଲା ଏବଂ ପ୍ରତିଛବିରେ ଏକ କୀଏନ୍ସ ଫ୍ଲୋରୋସେଣ୍ଟ ମାଇକ୍ରୋସ୍କୋପ୍ (BZ-X ବିଶ୍ଳେଷକ) କିମ୍ବା ଏକ Leica TCS SP8 କନଫୋକାଲ୍ ମାଇକ୍ରୋସ୍କୋପ୍ (ଲାସ୍-X) ରେ ବିଶ୍ଳେଷଣ କରାଯାଇଥିଲା। ପ୍ରତିଛବିଗୁଡ଼ିକୁ ImageJ ପ୍ରୋଗ୍ରାମ୍ (ଫିଜି) ବ୍ୟବହାର କରି ପ୍ରକ୍ରିୟାକରଣ କରାଯାଇଥିଲା। t-hCO ଏବଂ ମୂଷା କର୍ଟେକ୍ସରେ ମାନବ ନ୍ୟୁରନ୍‌ର ଅନୁପାତ ପରିମାଣ କରିବା ପାଇଁ, 387.5 μm ପ୍ରସ୍ଥ ଆୟତାକାର ପ୍ରତିଛବିଗୁଡ଼ିକୁ t-hCO ର କେନ୍ଦ୍ରରେ, ମୂଷା କର୍ଟେକ୍ସର ଧାରରେ କିମ୍ବା ନିକଟରେ ନିଆଯାଇଥିଲା। ଟିସୁ ସ୍ୱଚ୍ଛତା, HNA+ ନ୍ୟୁକ୍ଲିଅସ୍ ଏବଂ/ଅଥବା ଟିସୁ ଅଟୋଫ୍ଲୋରେସେନ୍ସର ଉପସ୍ଥିତିରେ ପରିବର୍ତ୍ତନ ମୂଲ୍ୟାଙ୍କନ କରି ଗ୍ରାଫ୍ଟ ମାର୍ଜିନ୍ ନିର୍ଣ୍ଣୟ କରାଯାଇଥିଲା। ପ୍ରତ୍ୟେକ ପ୍ରତିଛବିରେ, NeuN+ ଏବଂ HNA+ କୋଷଗୁଡ଼ିକର ମୋଟ ସଂଖ୍ୟାକୁ ସମାନ କ୍ଷେତ୍ରରେ ଥିବା NeuN+ କୋଷଗୁଡ଼ିକର ମୋଟ ସଂଖ୍ୟା ଦ୍ୱାରା ବିଭକ୍ତ କରାଯାଇଥିଲା। ପ୍ରତିଛବି ସମତଳରେ କେବଳ ନ୍ୟୁକ୍ଲିଅସ୍ ଥିବା କୋଷଗୁଡ଼ିକୁ ଗଣନା କରାଯିବା ନିଶ୍ଚିତ କରିବା ପାଇଁ, କେବଳ Hoechst+ କୋଷଗୁଡ଼ିକୁ ଗଣନାରେ ଅନ୍ତର୍ଭୁକ୍ତ କରାଯାଇଛି। ପରିସଂଖ୍ୟାନଗତ ତ୍ରୁଟିକୁ ହ୍ରାସ କରିବା ପାଇଁ ଅତି କମରେ 1 mm ଦ୍ୱାରା ପୃଥକ କରାଯାଇଥିବା ଦୁଇଟି ପ୍ରତିଛବିକୁ ହାରାହାରି କରାଯାଇଥିଲା।
ନମୁନା ସଂଗ୍ରହର ଗୋଟିଏ ସପ୍ତାହ ପୂର୍ବରୁ, hCO ପ୍ରତିରୋପଣ ପଶୁମାନଙ୍କୁ (ପ୍ରାୟ 8 ମାସର ପୃଥକୀକରଣ) ଏକ ଅନ୍ଧାର କୋଠରୀରେ ରଖନ୍ତୁ ଯାହାର ଝିଣ୍ଟିକା କଟାଯାଇ ଇନ୍ଦ୍ରିୟଗତ ଉତ୍ତେଜନାକୁ କମ କରିବା ପାଇଁ କଣ୍ଟା ହୋଇଥାଏ। ପୂର୍ବରୁ ବର୍ଣ୍ଣିତ ଅନୁସାରେ କିଛି ପରିବର୍ତ୍ତନ ସହିତ ନ୍ୟୁକ୍ଲିୟର ପୃଥକୀକରଣ କରାଯାଇଥିଲା। ସଂକ୍ଷେପରେ, ଡିଟରଜେଣ୍ଟ-ଯାନ୍ତ୍ରିକ କୋଷ ଲିସିସ୍ ଏବଂ 2 ମିଲି ଗ୍ଲାସ୍ ଟିସୁ ଗ୍ରାଇଣ୍ଡର୍ (D8938, ସିଗମା-ଆଲଡ୍ରିଚ୍/କିମ୍ବଲେ) ବ୍ୟବହାର କରି t-hCO ଏବଂ hCO ନଷ୍ଟ କରାଯାଇଥିଲା। ତା'ପରେ ଅଶୋଧିତ ନ୍ୟୁକ୍ଲିୟଗୁଡ଼ିକୁ 40 µm ଫିଲ୍ଟର ବ୍ୟବହାର କରି ଫିଲ୍ଟର କରାଯାଇଥିଲା ଏବଂ ସୁକ୍ରୋଜ୍ ଘନତା ଗ୍ରାଡିଏଣ୍ଟ କରିବା ପୂର୍ବରୁ 4 °C ରେ 10 ମିନିଟ୍ ପାଇଁ 320 ଗ୍ରାମ ସେଣ୍ଟ୍ରିଫ୍ୟୁଗ୍ କରାଯାଇଥିଲା। ସେଣ୍ଟ୍ରିଫ୍ୟୁଗେସନ୍ ପଦକ୍ଷେପ ପରେ (4°C ରେ 20 ମିନିଟ୍ ପାଇଁ 320 ଗ୍ରାମ), ନମୁନାଗୁଡ଼ିକୁ 0.2 ୟୁନିଟ୍ μl-1 RNase ଇନହିବିଟର (40 u µl-1, AM2682, ଆମ୍ବିଆନ୍) ଯୋଗ କରି 0.04% BSA/PBS ରେ ପୁନଃସ୍ଥାପିତ କରାଯାଇଥିଲା ଏବଂ ଏକ 40 µm ପ୍ରବାହ ଫିଲ୍ଟର ମାଧ୍ୟମରେ ଗଲା। ତା’ପରେ ବିଚ୍ଛିନ୍ନ ନ୍ୟୁକ୍ଲିୟଗୁଡ଼ିକୁ 0.02% BSA ଧାରଣ କରିଥିବା PBSରେ ପୁନଃସ୍ଥାପିତ କରାଯାଇଥିଲା ଏବଂ ଏକ କ୍ରୋମିୟମ ସିଙ୍ଗଲ୍ ସେଲ୍ 3′ ଚିପ୍ (ପ୍ରତି ଲେନ୍ ପାଇଁ 8,000 କୋଷର ଆନୁମାନିକ ପୁନରୁଦ୍ଧାର) ଉପରେ ଲୋଡ୍ କରାଯାଇଥିଲା। snRNA-seq ଲାଇବ୍ରେରୀଗୁଡ଼ିକୁ Chromium Single cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics) ସହିତ ପ୍ରସ୍ତୁତ କରାଯାଇଥିଲା। snRNA-seq ଲାଇବ୍ରେରୀଗୁଡ଼ିକୁ Chromium Single cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics) ସହିତ ପ୍ରସ୍ତୁତ କରାଯାଇଥିଲା। Библиотеки snRNA-seq были приготовлены с помощью କ୍ରୋମିୟମ୍ ଏକକ କକ୍ଷ 3 ′ GEM, ଲାଇବ୍ରେରୀ ଏବଂ ଜେଲ୍ ବିଡ୍ କିଟ୍ v3 (10x ଜେନୋମିକ୍ସ) | snRNA-seq ଲାଇବ୍ରେରୀଗୁଡ଼ିକ Chromium Single cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics) ବ୍ୟବହାର କରି ପ୍ରସ୍ତୁତ କରାଯାଇଥିଲା। snRNA-seq rom କ୍ରୋମିୟମ୍ ଏକକ କକ୍ଷ 3 ′ GEM 、 ଲାଇବ୍ରେରୀ ଏବଂ ଜେଲ୍ ବିଡ୍ କିଟ୍ v3 (10x ଜେନୋମିକ୍ସ) 制备的。 snRNA-seq rom କ୍ରୋମିୟମ୍ ଏକକ କକ୍ଷ 3 ′ GEM 、 ଲାଇବ୍ରେରୀ ଏବଂ ଜେଲ୍ ବିଡ୍ କିଟ୍ v3 (10x ଜେନୋମିକ୍ସ) 制备的。 Библиотеку snRNA-seq готовили с использованием କ୍ରୋମିୟମ୍ ଏକକ ସେଲ୍ 3 ′ GEM, ଲାଇବ୍ରେରୀ ଏବଂ ଜେଲ୍ ବିଡ୍ କିଟ୍ v3 (10x ଜେନୋମିକ୍ସ) | snRNA-seq ଲାଇବ୍ରେରୀଟି Chromium Single Cell 3′ GEM, ଲାଇବ୍ରେରୀ ଏବଂ ଜେଲ୍ ବିଡ୍ କିଟ୍ v3 (10x ଜେନୋମିକ୍ସ) ବ୍ୟବହାର କରି ପ୍ରସ୍ତୁତ କରାଯାଇଥିଲା।ବିଭିନ୍ନ ନମୁନାରୁ ଲାଇବ୍ରେରୀଗୁଡ଼ିକୁ Admera Health ଦ୍ୱାରା NovaSeq S4 (Illumina) ରେ ସଂଗ୍ରହ ଏବଂ କ୍ରମବଦ୍ଧ କରାଯାଇଥିଲା।
ପ୍ରତ୍ୟେକ ପୋଟେଟିଭ୍ ନ୍ୟୁକ୍ଲିୟର ବାରକୋଡ୍ ପାଇଁ ଜିନ୍ ପ୍ରକାଶନ ସ୍ତରଗୁଡ଼ିକୁ 10x ଜେନୋମିକ୍ସ ସେଲରେଞ୍ଜର ବିଶ୍ଳେଷଣ ସଫ୍ଟୱେର୍ ପ୍ୟାକେଜ୍ (ସଂସ୍କରଣ 6.1.2) ବ୍ୟବହାର କରି ପରିମାଣ କରାଯାଇଥିଲା। ବିଶେଷକରି, ପଠନଗୁଡ଼ିକୁ ମାନବ (GRCh38, ଏନସେମ୍ବଲ୍, ସଂସ୍କରଣ 98) ଏବଂ ରାଟ୍ (Rnor_6.0, ଏନସେମ୍ବଲ୍, ସଂସ୍କରଣ 100) ସନ୍ଦର୍ଭ ଜିନୋମର ମିଶ୍ରଣ ସହିତ ମେଳ କରାଯାଇଥିଲା ଯାହା mkref କମାଣ୍ଡ ସହିତ ସୃଷ୍ଟି କରାଯାଇଥିଲା ଏବଂ –include-introns=TRUE କମାଣ୍ଡ ସହିତ ଗଣନା ବ୍ୟବହାର କରି ପରିମାଣୀକରଣରେ ଇଣ୍ଟ୍ରନ୍ ଅଞ୍ଚଳଗୁଡ଼ିକରେ ମ୍ୟାପ୍ ହୋଇଥିବା ପଠନ ଅନ୍ତର୍ଭୁକ୍ତ କରାଯାଇଥିଲା। t-hCO ନମୁନା ପାଇଁ, ସମସ୍ତ ମ୍ୟାପ୍ ହୋଇଥିବା ପଠନର ଅତି କମରେ 95% ମାନବ ଜିନୋମ୍ ସହିତ ମେଳ ହେଉଥିବା ରକ୍ଷଣଶୀଳ ଆବଶ୍ୟକତା ଉପରେ ଆଧାର କରି ମାନବ ନ୍ୟୁକ୍ଲିୟସ୍ ଚିହ୍ନଟ କରାଯାଇଥିଲା। ସମସ୍ତ ପରବର୍ତ୍ତୀ ବିଶ୍ଳେଷଣଗୁଡ଼ିକ R ପ୍ୟାକେଜ୍ (ସଂସ୍କରଣ 4.1.2) ସେଉରାଟ୍ (ସଂସ୍କରଣ 4.1.1)32 ବ୍ୟବହାର କରି ସେଲରେଞ୍ଜରରୁ ଏକ ଫିଲ୍ଟର ହୋଇଥିବା ବାରକୋଡ୍ ଆରେ ଆଉଟପୁଟ୍ ଉପରେ କରାଯାଇଥିଲା।
ପରବର୍ତ୍ତୀ ବିଶ୍ଳେଷଣରେ କେବଳ ଉଚ୍ଚମାନର ନ୍ୟୁକ୍ଲିଅର ଅନ୍ତର୍ଭୁକ୍ତ ହେବା ନିଶ୍ଚିତ କରିବା ପାଇଁ, ପ୍ରତ୍ୟେକ ନମୁନା ପାଇଁ ଏକ ପୁନରାବୃତ୍ତି ଫିଲ୍ଟରିଂ ପ୍ରକ୍ରିୟା କାର୍ଯ୍ୟକାରୀ କରାଯାଇଥିଲା। ପ୍ରଥମେ, 1000 ରୁ କମ୍ ଅନନ୍ୟ ଜିନ୍ ମିଳିଥିବା ଏବଂ ମୋଟ ମାଇଟୋକଣ୍ଡ୍ରିଆର 20% ରୁ ଅଧିକ ସହିତ ନିମ୍ନମାନର ନ୍ୟୁକ୍ଲିଅର ଚିହ୍ନଟ କରାଯାଇ ଅପସାରିତ କରାଯାଇଥିଲା। ପରବର୍ତ୍ତୀ ସମୟରେ, sctransform(vst.flavor=”v2″) ଫଙ୍କସନ୍ ବ୍ୟବହାର କରି ନିୟମିତ ନକାରାତ୍ମକ ଦ୍ୱିପଦୀୟ ପ୍ରତିଗମନ ଦ୍ୱାରା କଞ୍ଚା ଜିନ୍ ନମ୍ବର ମ୍ୟାଟ୍ରିକ୍ସକୁ ସାଧାରଣ କରାଯାଇଥିଲା, ଯାହା ଡିଫଲ୍ଟ ପାରାମିଟର ବ୍ୟବହାର କରି 3000 ସର୍ବାଧିକ ପରିବର୍ତ୍ତନଶୀଳ ଜିନ୍ ଚିହ୍ନଟ କରିଥିଲା। ମୁଖ୍ୟ କମ୍ପୋନେଣ୍ଟ ବିଶ୍ଳେଷଣ (PCA) ବ୍ୟବହାର କରି ଉପର ପରିବର୍ତ୍ତନଶୀଳ ଜିନ୍ ଉପରେ ଡାଇମେନ୍ସନ୍ ହ୍ରାସ କରାଯାଇଥିଲା ଯାହା ଡିଫଲ୍ଟ ପାରାମିଟର 30 ବ୍ୟବହାର କରି ଡିଫଲ୍ଟ ପାରାମିଟର ସହିତ କରାଯାଇଥିଲା (ଡିମ୍ସ = 30 ଆଣ୍ଠୁ ସ୍ଥାନଗୁଡ଼ିକର ଦୃଶ୍ୟ ନିରୀକ୍ଷଣ ଉପରେ ଆଧାର କରି ବାଛି ଦିଆଯାଇଥିଲା ଏବଂ ସମସ୍ତ ନମୁନା ଏବଂ ଏନସେମ୍ବଲ୍ ବିଶ୍ଳେଷଣ ପାଇଁ ବ୍ୟବହୃତ ହୋଇଥିଲା)। ତା’ପରେ ଆମେ ଅସ୍ୱାଭାବିକ ଭାବରେ କମ୍ ଜିନ୍ ଗଣନା (10ମ ପ୍ରତିଶତ ତଳେ ମଧ୍ୟମା), ଅସ୍ୱାଭାବିକ ଭାବରେ ଉଚ୍ଚ ମାଇଟୋକଣ୍ଡ୍ରିଆଲ୍ ଜିନ୍ ଗଣନା (95ମ ପ୍ରତିଶତ ଉପରେ ମଧ୍ୟମା) ଉପରେ ଆଧାରିତ ଜିନ୍ ବର୍ଗୀକରଣ କରିବା ପାଇଁ ପୁନରାବୃତ୍ତି କ୍ଲଷ୍ଟରିଂ (ରିଜୋଲ୍ୟୁସନ୍ = 1) ର ଅନେକ ରାଉଣ୍ଡ କରିଥିଲୁ ଯାହା ନିମ୍ନ ଗୁଣବତ୍ତାର ପୁଟେଟିଭ୍ କୋଷଗୁଡ଼ିକୁ ଚିହ୍ନଟ ଏବଂ ଅପସାରଣ କରିଥିଲା। କ୍ଲଷ୍ଟର ଏବଂ/କିମ୍ବା DoubletFinder33 ପ୍ୟାକେଜ୍ (95ମ ପ୍ରତିଶତ ଉପରେ ହାରାହାରି DoubletFinder ସ୍କୋର) ବ୍ୟବହାର କରି ଚିହ୍ନଟ ହୋଇଥିବା ସନ୍ଦେହଜନକ ଯମଜଙ୍କ ଏକ ଉଚ୍ଚ ଅନୁପାତ। t-hCO ନମୁନା (n=3) ଏବଂ hCO ନମୁନା (n=3) ପୃଥକ ଭାବରେ ସଂଯୁକ୍ତ କରାଯାଇଥିଲା। ଉପରୋକ୍ତ ପାରାମିଟରଗୁଡ଼ିକ ସହିତ IntegrateData ଫଙ୍କସନ୍। ତା'ପରେ ଉପରେ ବର୍ଣ୍ଣିତ ପରି ସମନ୍ୱିତ ଡାଟା ସେଟର ଗୁଣାତ୍ମକ ଫିଲ୍ଟରିଂର ଆଉ ଏକ ପର୍ଯ୍ୟାୟ କରାଯାଇଥିଲା।
ନିମ୍ନ ଗୁଣବତ୍ତା କର୍ଣ୍ଣେଲଗୁଡ଼ିକୁ ଅପସାରଣ କରିବା ପରେ, ସମନ୍ୱିତ ଡାଟାସେଟ୍ ଗୋଷ୍ଠୀଭୁକ୍ତ କରାଯାଇଥିଲା (ରିଜୋଲ୍ୟୁସନ୍ = 0.5) ଏବଂ UMAP34 ଭିଜୁଆଲାଇଜେସନ୍ ଉଦ୍ଦେଶ୍ୟରେ ଏମ୍ବେଡ୍ କରାଯାଇଥିଲା। ସାଧାରଣକୃତ ଜିନ୍ ପ୍ରକାଶନ ତଥ୍ୟରୁ ଗଣନା କରାଯାଇଥିବା ଡିଫଲ୍ଟ ପାରାମିଟର ସହିତ FindMarkers ଫଙ୍କସନ୍ ବ୍ୟବହାର କରି ପ୍ରତ୍ୟେକ କ୍ଲଷ୍ଟର ପାଇଁ ମାର୍କର ଜିନ୍ ନିର୍ଣ୍ଣୟ କରାଯାଇଥିଲା। ଆମେ ମାର୍କର ଜିନ୍ ପ୍ରକାଶନ 19,20,21,35 ଏବଂ ଆନୋଟେସନ୍ ସହିତ ଭ୍ରୁଣ ଏବଂ ବୟସ୍କ କର୍ଟିକାଲ୍ ରେଫରେନ୍ସ ଡାଟାସେଟ୍ ମିଶ୍ରଣ କରି ପ୍ରମୁଖ କୋଷ ଶ୍ରେଣୀଗୁଡ଼ିକୁ ଚିହ୍ନଟ ଏବଂ ବର୍ଗୀକରଣ କରୁ। ବିଶେଷକରି, MKI67 ଏବଂ TOP2A ର ପ୍ରକାଶନ ଦ୍ୱାରା ପରିଚାଳିତ ପୂର୍ବବର୍ତ୍ତୀଗୁଡ଼ିକୁ ଚିହ୍ନଟ କରାଯାଇଥିଲା। ପ୍ରୋଜେନିଟର କ୍ଲଷ୍ଟରଗୁଡ଼ିକୁ ମାଇଟୋଟିକ୍ ଟ୍ରାନ୍ସକ୍ରିପ୍ଟର ଅନୁପସ୍ଥିତି, ବିଳମ୍ବ ମେଟାଫେଜ୍ ଭ୍ରୁଣ କର୍ଟେକ୍ସରେ ବର୍ଣ୍ଣିତ ମଲ୍ଟିପୋଟେଣ୍ଟ ଗ୍ଲିଆଲ୍ ପ୍ରୋଜେନିଟର କ୍ଲଷ୍ଟର ସହିତ ଉଚ୍ଚ ଓଭରଲାପ୍ ଏବଂ EGFR ଏବଂ OLIG1 ପ୍ରକାଶନ ଦ୍ୱାରା ପରିଭାଷିତ କରାଯାଇଥିଲା। ଆମେ ବିଳମ୍ବ ରେଡିଆଲ୍ ଗ୍ଲିଆରୁ ଆଷ୍ଟ୍ରୋସାଇଟର ପରିପକ୍ୱତା ପର୍ଯ୍ୟନ୍ତ ଆଷ୍ଟ୍ରୋସାଇଟ୍ ଭିନ୍ନତାର ଅନେକ ଅବସ୍ଥାକୁ ଅନ୍ତର୍ଭୁକ୍ତ କରିବା ପାଇଁ ଆଷ୍ଟ୍ରୋସାଇଟ୍ ଶବ୍ଦ ବ୍ୟବହାର କରୁ। ଆଷ୍ଟ୍ରୋସାଇଟ୍ କ୍ଲଷ୍ଟରଗୁଡ଼ିକ SLC1A3 ଏବଂ AQP4 ର ଉଚ୍ଚ ସ୍ତର ପ୍ରକାଶ କରନ୍ତି ଏବଂ ଭ୍ରୁଣ ରେଡିଆଲ୍ ଗ୍ଲିଆ ଏବଂ/କିମ୍ବା ବୟସ୍କ ଆଷ୍ଟ୍ରୋସାଇଟର ଉପପ୍ରକାର ସହିତ ମ୍ୟାପ୍ କରିବା ଦେଖାଯାଇଛି। OPCଗୁଡ଼ିକ PDGFRA ଏବଂ SOX10 ପ୍ରକାଶ କରନ୍ତି ଯେତେବେଳେ ଅଲିଗୋଡେଣ୍ଡ୍ରୋସାଇଟ୍ ମାଇଲିନେସନ୍ ମାର୍କର (MOG ଏବଂ MYRF) ପ୍ରକାଶ କରନ୍ତି। ଗ୍ଲୁଟାମାଟର୍ଜିକ୍ ନ୍ୟୁରନ୍ ନ୍ୟୁରୋନାଲ୍ ଟ୍ରାନ୍ସକ୍ରିପ୍ଟ (SYT1 ଏବଂ SNAP25), GABAergic ମାର୍କର (GAD2) ର ଅନୁପସ୍ଥିତି ଏବଂ NEUROD6, SLC17A7, BCL11B, କିମ୍ବା SATB2 ର ପ୍ରକାଶନ ଦ୍ୱାରା ଚିହ୍ନଟ କରାଯାଇଥିଲା। GluN ନ୍ୟୁରନ୍ କୁ ଆହୁରି ଉପର (SATB2 ପ୍ରକାଶନ ଏବଂ BCL11B ର କ୍ଷତି) ଏବଂ ଗଭୀର (BCL11B ପ୍ରକାଶନ) ଉପବର୍ଗରେ ବିଭକ୍ତ କରାଯାଇଥିଲା। ପୁଟେଟିଭ୍ ସବପ୍ଲେଟ୍ (SP) ନ୍ୟୁରନ୍ ଗଭୀର GluN ମାର୍କର ସହିତ ST18 ଏବଂ SORCS1 ପରି ଜଣାଶୁଣା SP18 ମାର୍କରକୁ ପ୍ରକାଶ କରନ୍ତି। କୋରଏଡ୍ ପ୍ଲେକ୍ସସ୍ ପରି କୋଷଗୁଡ଼ିକୁ TTR ପ୍ରକାଶନ ଦ୍ୱାରା ଚିହ୍ନଟ କରାଯାଇଥିଲା, ଏବଂ ମେନିଞ୍ଜିଆଲ୍ ପରି କୋଷଗୁଡ଼ିକ ଫାଇବ୍ରୋବ୍ଲାଷ୍ଟ୍-ସମ୍ପର୍କିତ ଜିନ୍ ଏବଂ ରେଫରେନ୍ସ ଡାଟା ସେଟର ମ୍ୟାପ୍ ପିଆଲ୍/ଭାସ୍କୁଲାର୍ କୋଷଗୁଡ଼ିକୁ ପ୍ରକାଶ କରିଥିଲେ।
ଲିବ୍ରା R ପ୍ୟାକେଜ (ସଂସ୍କରଣ 1.0.0) ବ୍ୟବହାର କରି କାର୍ଯ୍ୟକାରୀ ହୋଇଥିବା ନମୁନାରେ ପୁନଃଉତ୍ପାଦିତ ଏକ ନୂତନ ବିକଶିତ ସ୍ୟୁଡୋ-ବ୍ୟାଚ୍ ପଦ୍ଧତି ବ୍ୟବହାର କରି t-hCO ଏବଂ hCO ଉପଶ୍ରେଣୀ ମଧ୍ୟରେ ଜିନ୍ ପ୍ରକାଶନର ଭିନ୍ନ ବିଶ୍ଳେଷଣ କରାଯାଇଥିଲା। ବିଶେଷକରି, ପ୍ରତ୍ୟେକ ନମୁନା ପ୍ରତିକୃତି ପାଇଁ ଏକ ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟ କୋଷ ଶ୍ରେଣୀ ପାଇଁ କୋଷଗୁଡ଼ିକରେ ଜିନ୍ ସଂଖ୍ୟା ସାରାଂଶ କରି ଗୋଷ୍ଠୀଗୁଡ଼ିକ ପାଇଁ edgeR ଲଗ୍-ସମ୍ଭାବନା ପରୀକ୍ଷା (ସଂସ୍କରଣ 3.36.0, ପ୍ୟାକେଜ୍ R) କରାଯାଇଥିଲା। ହିଟ୍ମ୍ୟାପ୍ ଭିଜୁଆଲାଇଜେସନ୍ ପାଇଁ, edgeR (cpm() ଫଙ୍କସନ୍) ବ୍ୟବହାର କରି ସାଧାରଣକୃତ ପ୍ରତି ମିଲିୟନ (CPM) ମୂଲ୍ୟ ଗଣନା କରାଯାଏ ଏବଂ ସ୍କେଲ୍ କରାଯାଏ (ମାହାନ = 0, ମାନକ ବିଚ୍ୟୁତି = 1 ହାସଲ କରିବା ପାଇଁ)। ଉଲ୍ଲେଖନୀୟ ଭାବରେ ଅପରେଗୁଲେଟେଡ୍ t-hCO GluN ଜିନ୍‌ର ଜିନ୍ ଅଣ୍ଟୋଲୋଜି (GO) ସମୃଦ୍ଧି ବିଶ୍ଳେଷଣ କରାଯାଇଥିଲା (ବେଞ୍ଜାମିନି-ହୋଚବର୍ଗ ସଂଶୋଧିତ P ମୂଲ୍ୟ 0.05 ରୁ କମ୍ t-hCO GluN କୋଷର ଅତି କମରେ 10% ରେ ପ୍ରକାଶିତ ଏବଂ ଅତି କମରେ 2 ଥର ପରିବର୍ତ୍ତନରେ ଏକ ଗୁଣ ବୃଦ୍ଧି)। ToppGene Suite (https://toppgene.cchmc.org/)37 ବ୍ୟବହାର କରି କରାଯାଇଥିଲା। ଆମେ ଡିଫଲ୍ଟ ପାରାମିଟର ସହିତ ToppFun ଆପ୍ ବ୍ୟବହାର କରୁ ଏବଂ GO-ଆନୋଟେଡ୍ ହାଇପରଜେମୋଟ୍ରିକ୍ ପରୀକ୍ଷାରୁ ଗଣନା କରାଯାଇଥିବା ବେଞ୍ଜାମିନି-ହୋଚବର୍ଗ-ସଂଶୋଧିତ P-ମୂଲ୍ୟଗୁଡ଼ିକୁ ରିପୋର୍ଟ କରୁ।
ପ୍ରାଥମିକ ଏକକ-କୋଷ RNA-seq କିମ୍ବା ବୟସ୍କ snRNA-seq19,20,21,22 ର ସନ୍ଦର୍ଭ ଅଧ୍ୟୟନରୁ ଆନୋଟେଟେଡ୍ କୋଷ କ୍ଲଷ୍ଟର ସହିତ ଆମର snRNA-seq କ୍ଲଷ୍ଟରଗୁଡ଼ିକୁ ମେଳ କରିବା ପାଇଁ, ଆମେ ଏକ ଯୋଡା ଡାଟାସେଟ୍ ସମନ୍ୱୟ ପଦ୍ଧତି ପ୍ରୟୋଗ କରିଥିଲୁ। ଆମେ ଡାଟାସେଟ୍ ମଧ୍ୟରେ କ୍ଲଷ୍ଟର ଓଭରଲାପ୍ ସମନ୍ୱିତ ଏବଂ ତୁଳନା କରିବା ପାଇଁ Seurat ରେ SCTransform (v2) ସାଧାରଣୀକରଣ କାର୍ଯ୍ୟପ୍ରଣାଳୀ ବ୍ୟବହାର କରିଥିଲୁ (ଉପରୋକ୍ତ ପରି ସମାନ ପାରାମିଟର ବ୍ୟବହାର କରି)। ଗଣନା ଦକ୍ଷତା ପାଇଁ ବ୍ୟକ୍ତିଗତ ଡାଟାସେଟ୍ ପ୍ରତି ମୂଳ କ୍ଲଷ୍ଟରରେ 500 କୋଷ କିମ୍ବା କୋର ପର୍ଯ୍ୟନ୍ତ ଅନିୟମିତ ଭାବରେ ସବସେଟ୍ କରାଯାଇଥିଲା। ପୂର୍ବରୁ ବର୍ଣ୍ଣିତ ସମାନ ପଦ୍ଧତି ବ୍ୟବହାର କରି, କ୍ଲଷ୍ଟର ଓଭରଲାପ୍ ପ୍ରତ୍ୟେକ ପୁଲ୍ ହୋଇଥିବା କ୍ଲଷ୍ଟରରେ କୋଷ କିମ୍ବା ନ୍ୟୁକ୍ଲିୟର ଅନୁପାତ ଭାବରେ ପରିଭାଷିତ ହୋଇଥିଲା ଯାହା ସନ୍ଦର୍ଭ କ୍ଲଷ୍ଟରର ଲେବଲ୍ ସହିତ ଓଭରଲାପ୍ ହୋଇଥିଲା। GluN ଗୁଡ଼ିକୁ ଆହୁରି ବର୍ଗୀକରଣ କରିବା ପାଇଁ, ଆମେ ଆମର GluN କୋଷଗୁଡ଼ିକୁ ସବସେଟ୍ ଡାଟା ପାଇଁ Seurat ର TransferData କାର୍ଯ୍ୟପ୍ରଣାଳୀ ବ୍ୟବହାର କରିଥିଲୁ।
t-hCO ଏବଂ hCO ନମୁନାର ବିଶ୍ୱ ଟ୍ରାନ୍ସକ୍ରିପ୍ଟୋମର ପରିପକ୍ୱତା ସ୍ଥିତି ମୂଲ୍ୟାଙ୍କନ କରିବା ପାଇଁ, ଆମେ ଆମର ସ୍ୟୁଡୋ-ବଲ୍କ ନମୁନାଗୁଡ଼ିକୁ BrainSpan/psychENCODE23 ସହିତ ତୁଳନା କରିଥିଲୁ, ଯାହା ମାନବ ମସ୍ତିଷ୍କ ବିକାଶକୁ ବ୍ୟାପୀ ଏକ ବଡ଼ RNA କ୍ରମ ନେଇ ଗଠିତ। ଆମେ ଗର୍ଭଧାରଣର 10 ସପ୍ତାହ ପରେ ଏବଂ ପରେ, 5567 ଜିନ୍ (ଆମର ତଥ୍ୟ ସହିତ) ରେ କର୍ଟିକାଲ୍ ନମୁନାରୁ ଏକ ମିଳିତ ପ୍ୟାଟର୍ନ-ସାଧାରଣକୃତ ଜିନ୍ ପ୍ରକାଶନ ମାଟ୍ରିକ୍ସ ଉପରେ PCA କରିଥିଲୁ ଯାହା ପୂର୍ବରୁ BrainSpan କର୍ଟିକାଲ୍ ନମୁନାରେ ସକ୍ରିୟ ଭାବରେ ଚିହ୍ନଟ କରାଯାଇଥିଲା (ଏକ ଘନ ମଡେଲ୍ ବ୍ୟବହାର କରି ବୟସ ଦ୍ୱାରା ବ୍ୟାଖ୍ୟା କରାଯାଇଥିବା ବିକାଶମୂଳକ ଭିନ୍ନତାରେ 50% ରୁ ଅଧିକ ଭାବରେ ପରିଭାଷିତ) 38। ଏହା ସହିତ, ଆମେ ପୂର୍ବରୁ ବର୍ଣ୍ଣିତ ଭାବରେ ଅଣ-ନେଗେଟିଭ୍ ମ୍ୟାଟ୍ରିକ୍ସ ଫ୍ୟାକ୍ଟରାଇଜେସନ୍ ବ୍ୟବହାର କରି ନ୍ୟୁରୋଡେଭଲପମେଣ୍ଟର ପ୍ରମୁଖ ଟ୍ରାନ୍ସକ୍ରିପ୍ଟୋମ୍ ସ୍ୱାକ୍ଷର ସହିତ ଜଡିତ ଜିନ୍ ଅର୍ଜନ କରିଥିଲୁ। ଅଣ-ନେଗେଟିଭ୍ ମ୍ୟାଟ୍ରିକ୍ସ ଫ୍ୟାକ୍ଟରାଇଜେସନ୍ ପ୍ରକ୍ରିୟା ବ୍ୟବହାର କରି ଗଣନା କରାଯାଇଥିବା ନମୁନା ଓଜନକୁ ଝୁ ଏଟ୍ ଅଲ୍ ଦ୍ୱାରା ବର୍ଣ୍ଣିତ ପାଞ୍ଚଟି ସ୍ୱାକ୍ଷର ମଧ୍ୟରୁ ପ୍ରତ୍ୟେକ ପାଇଁ ବିସ୍ତାରିତ ତଥ୍ୟ ସହିତ ଚିତ୍ର 5b ରେ ପ୍ଲଟ୍ କରାଯାଇଛି। ପୁଣି, କାର୍ଯ୍ୟକଳାପ ନିର୍ଭରଶୀଳ ଟ୍ରାନ୍ସକ୍ରିପ୍ସନାଲ୍ ମାର୍କରଗୁଡ଼ିକ ପୂର୍ବରୁ ପ୍ରକାଶିତ ଅଧ୍ୟୟନରୁ ପ୍ରାପ୍ତ ହୋଇଥିଲା। ବିଶେଷକରି, ପରିପୂରକ ସାରଣୀ 3 Hrvatin et al.16 ରୁ ଦୃଶ୍ୟ ଉତ୍ତେଜନା ପରେ ମୂଷା ଭିଜୁଆଲ୍ କର୍ଟେକ୍ସ snRNA-seq ସଂଗ୍ରହ ଦ୍ୱାରା ଚିହ୍ନଟ ହୋଇଥିବା ଗ୍ଲୁଟାମେଟରଜିକ୍ ନ୍ୟୁରନ୍‌ଗୁଡ଼ିକରେ ERG ଏବଂ LRG ଉଲ୍ଲେଖନୀୟ ଭାବରେ ବୃଦ୍ଧି ପାଇଥିଲା। ମାନବ-ସମୃଦ୍ଧ LRG ଗୁଡ଼ିକ KCl-ସକ୍ରିୟ ମାନବ ଭ୍ରୁଣ ମସ୍ତିଷ୍କ ସଂସ୍କୃତିରୁ ପ୍ରାପ୍ତ ହୋଇଥିଲା ଏବଂ ଉତ୍ତେଜନା ପରେ 6 ଘଣ୍ଟା ଅମଳ କରାଯାଇଥିଲା, ଏବଂ ଫିଲ୍ଟର ହୋଇଥିବା ଜିନ୍‌ଗୁଡ଼ିକ ମଣିଷରେ ଉଲ୍ଲେଖନୀୟ ଭାବରେ ବୃଦ୍ଧି ପାଇଥିଲା କିନ୍ତୁ ରୋଡେଣ୍ଟମାନଙ୍କରେ ନୁହେଁ (ପରିପୂରକ ସାରଣୀ 4)। ଏହି ଜିନ୍ ସେଟ୍ ବ୍ୟବହାର କରି ଜିନ୍ ସେଟ୍ ସମୃଦ୍ଧିର ବିଶ୍ଳେଷଣ ଏକ-ପାଖ ଫିସରଙ୍କ ସଠିକ୍ ପରୀକ୍ଷା ବ୍ୟବହାର କରି କରାଯାଇଥିଲା।
ଆଇସୋଫ୍ଲୁରେନ୍ ସହିତ ମୂଷାମାନଙ୍କୁ ନିଶ୍ଚେତକ ଦିଅନ୍ତୁ, ମସ୍ତିଷ୍କ ବାହାର କରନ୍ତୁ ଏବଂ ଥଣ୍ଡା (ପ୍ରାୟ 4°C) ଅମ୍ଳଜାନଯୁକ୍ତ (95% O2 ଏବଂ 5% CO2) ସୁକ୍ରୋଜ୍ ଦ୍ରବଣରେ ରଖନ୍ତୁ ଯାହା 234 mM ସୁକ୍ରୋଜ୍, 11 mM ଗ୍ଲୁକୋଜ୍, 26 mM NaHCO3, 2.5 mM KCl, 1.25 mM। NaH2PO4, 10 mM MgSO4 ଏବଂ 0.5 mM CaCl2 (ପ୍ରାୟ 310 mOsm) ଧାରଣ କରିଥାଏ। ପୂର୍ବରୁ ବର୍ଣ୍ଣିତ 39 ପରି ମୂଷା ମସ୍ତିଷ୍କ କରୋନାଲ୍ ସେକ୍ସନ୍ (300-400 µm) ଏକ Leica VT1200 ଭାଇବ୍ରେଟୋମ୍ ବ୍ୟବହାର କରି ତିଆରି କରାଯାଇଥିଲା। ତା’ପରେ ବିଭାଗଗୁଡ଼ିକୁ ଏକ ସେକ୍ସନିଂ ଚାମ୍ବରକୁ ସ୍ଥାନାନ୍ତରିତ କରାଯାଇଥିଲା ଯେଉଁଥିରେ ନିରନ୍ତର କୋଠରୀ ତାପମାତ୍ରାରେ ଅମ୍ଳଜାନ ଧାରଣ କରାଯାଇଥିଲା ଯାହା ମଧ୍ୟରୁ aCSF ପ୍ରସ୍ତୁତ କରାଯାଇଥିଲା: 10 mM ଗ୍ଲୁକୋଜ୍, 26 mM NaHCO3, 2.5 mM KCl, 1.25 mM NaHPO4, 1 mM MgSO4, 2 mM CaCl2 ଏବଂ 126 mM NaCl (298 mOsm)। ରେକର୍ଡିଂର ଅତି କମରେ 45 ମିନିଟ୍ ପୂର୍ବରୁ। ବିଭାଗଗୁଡ଼ିକୁ ଏକ ବୁଡ଼ାଇ ଦିଆଯାଇଥିବା ଚାମ୍ବରରେ ରେକର୍ଡ କରାଯାଇଥିଲା ଯେଉଁଠାରେ ସେଗୁଡ଼ିକୁ aCSF (95% O2 ଏବଂ 5% CO2 ଭାଏଲ୍) ସହିତ ନିରନ୍ତର ପରଫ୍ୟୁଜ କରାଯାଇଥିଲା। ସମସ୍ତ ତଥ୍ୟ କୋଠରୀ ତାପମାତ୍ରାରେ ରେକର୍ଡ କରାଯାଇଥିଲା। t-hCO ନ୍ୟୁରନଗୁଡ଼ିକୁ 127 mM ପୋଟାସିୟମ୍ ଗ୍ଲୁକୋନେଟ୍, 8 mM NaCl, 4 mM ମ୍ୟାଗ୍ନେସିୟମ୍ ATP, 0.3 mM ସୋଡିୟମ୍ GTP, 10 mM HEPES, ଏବଂ 0.6 mM EGTA, pH 7.2, KOH (290 mOsm) ସହିତ ଆଡଜଷ୍ଟ କରାଯାଇଥିବା ଆଭ୍ୟନ୍ତରୀଣ ଦ୍ରବଣ ସହିତ ପୂର୍ଣ୍ଣ ଏକ ବୋରୋସିଲିକେଟ୍ ଗ୍ଲାସ୍ ପାଇପେଟ୍ ସହିତ ସମାପ୍ତ କରାଯାଇଥିଲା। ସୁସ୍ଥ ହେବା ପାଇଁ, ରେକର୍ଡିଂ ଦ୍ରବଣରେ ବାୟୋସାଇଟିନ୍ (0.2%) ଯୋଡା ଯାଇଥିଲା।
ଏକ MultiClamp 700B ଆମ୍ପ୍ଲିଫାୟର (ଆଣବିକ ଡିଭାଇସ୍) ଏବଂ ଏକ Digidata 1550B ଡିଜିଟାଇଜର (ଆଣବିକ ଡିଭାଇସ୍) ବ୍ୟବହାର କରି ତଥ୍ୟ ସଂଗ୍ରହ କରାଯାଇଥିଲା, 2 kHz ରେ କମ୍-ପାସ୍ ଫିଲ୍ଟର କରାଯାଇଥିଲା, 20 kHz ରେ ଡିଜିଟାଇଜ କରାଯାଇଥିଲା, ଏବଂ Clampfit (ଆଣବିକ ଡିଭାଇସ୍), Origin (OriginPro). 2021b, OriginLab). ଏବଂ କଷ୍ଟମ୍ MATLAB ଫଙ୍କସନ୍ସ (Mathworks) ବ୍ୟବହାର କରି ବିଶ୍ଳେଷଣ କରାଯାଇଥିଲା। JPCalc ବ୍ୟବହାର କରି ଜଙ୍କସନ୍ ପୋଟେନସିଆଲ୍ ଗଣନା କରାଯାଇଥିଲା ଏବଂ ଏଣ୍ଟ୍ରିଗୁଡ଼ିକୁ -14 mV ର ଗଣନା ମୂଲ୍ୟ ସହିତ ଆଡଜଷ୍ଟ କରାଯାଇଥିଲା। ଅପରେସନ୍ IV ରେ -250 ରୁ 750 pA ପର୍ଯ୍ୟନ୍ତ 10-25 pA ପଦକ୍ଷେପରେ ଏକ ଧାରାବାହିକ ବର୍ତ୍ତମାନ ପଦକ୍ଷେପ ଅନ୍ତର୍ଭୁକ୍ତ।
ପୂର୍ବରୁ ବର୍ଣ୍ଣିତ ପରି, hCO ନ୍ୟୁରନ୍‌ର ପ୍ୟାଚ୍-କ୍ଲାମ୍ପ ରେକର୍ଡିଂ ସମୟରେ ଥାଲାମସ୍, ଧଳା ପଦାର୍ଥ ଏବଂ S1 ଆଫେରେଣ୍ଟ୍‌ଗୁଡ଼ିକୁ ଥାଲାମୋକର୍ଟିକାଲ୍ ସ୍ଲାଇସ୍‌ରେ ବୈଦ୍ୟୁତିକ ଭାବରେ ଉତ୍ତେଜିତ କରାଯାଇଥିଲା। ସଂକ୍ଷେପରେ, ମସ୍ତିଷ୍କକୁ 10° କୋଣରେ ଢଳାଇ ଏକ 3D ପ୍ରିଣ୍ଟିଂ ଟେବୁଲ୍ ଉପରେ ରଖାଯାଇଥିଲା, ଏବଂ ମସ୍ତିଷ୍କର ସମ୍ମୁଖ ଭାଗକୁ 35° କୋଣରେ କଟାଯାଇଥିଲା। ତା’ପରେ ମସ୍ତିଷ୍କକୁ କଟା ପୃଷ୍ଠରେ ଲଗାଯାଇ ବିଭାଗ କରାଯାଇଥିଲା, ଥାଲାମୋକର୍ଟିକାଲ୍ ପ୍ରୋଟ୍ରୁଡିଂ ଆକ୍ସନ୍‌ଗୁଡ଼ିକୁ ସଂରକ୍ଷଣ କରି ରଖାଯାଇଥିଲା। ବାଇପୋଲାର୍ ଟଙ୍ଗଷ୍ଟନ୍ ଇଲେକ୍ଟ୍ରୋଡ୍ (0.5 MΩ) ଏକ ଦ୍ୱିତୀୟ ମାଇକ୍ରୋମାନିପୁଲେଟର୍‌ରେ ଲଗାଯାଇଥିଲା ଏବଂ ପ୍ରତି କୋଷରେ ଚାରୋଟି ଅଞ୍ଚଳ (ଭିତର କ୍ୟାପସୁଲ୍, ଧଳା ପଦାର୍ଥ, S1 ଏବଂ hCO)କୁ ଉତ୍ତେଜିତ କରିବା ପାଇଁ ରଣନୀତିକ ଭାବରେ ସ୍ଥାନିତ କରାଯାଇଥିଲା। 0.03–0.1 Hz ରେ 300 µA ଫାସିକ୍ ଉତ୍ତେଜନା ପରେ ସିନାପ୍ଟିକ୍ ପ୍ରତିକ୍ରିୟା ରେକର୍ଡ କରାଯାଇଥିଲା।
hChR2-ପ୍ରକାଶକ hCO ନ୍ୟୁରନ୍‌ଗୁଡ଼ିକୁ 480 nm ରେ ସକ୍ରିୟ କରାଯାଇଥିଲା ଏବଂ ଏକ LED (Prizmatix) ଦ୍ୱାରା ସୃଷ୍ଟି ହୋଇଥିବା ଆଲୋକ ସ୍ପନ୍ଦନକୁ ×40 ଅବଜେକ୍ଟିଭ୍ (0.9 NA; Olympus) ମାଧ୍ୟମରେ ପ୍ରୟୋଗ କରାଯାଇଥିଲା ଯାହା ଦ୍ୱାରା କୋଷ ନିକଟରେ hChR2 ପ୍ରକାଶନ ରେକର୍ଡ କରାଯାଇଥିଲା। ଆଲୋକିତ କ୍ଷେତ୍ର ବ୍ୟାସ ପ୍ରାୟ 0.5 mm ଏବଂ ମୋଟ ଶକ୍ତି 10-20 mW। ସ୍ପନ୍ଦନ ପ୍ରସ୍ଥ 10 ms ରେ ସେଟ୍ କରାଯାଇଥିଲା, ଯାହା ଆଚରଣଗତ ଶିକ୍ଷା ପରୀକ୍ଷଣ ସମୟରେ ଦିଆଯାଇଥିବା ସ୍ପନ୍ଦନ ସହିତ ସମାନ। 1 ରୁ 20 Hz ପର୍ଯ୍ୟନ୍ତ ବିଭିନ୍ନ ଉତ୍ତେଜନା ଫ୍ରିକ୍ୱେନ୍ସି ବ୍ୟବହାର କରାଯାଇଥିଲା, କିନ୍ତୁ ପରିମାଣୀକରଣ ପାଇଁ ସିରିଜର କେବଳ ପ୍ରଥମ ସ୍ପନ୍ଦନ ବ୍ୟବହାର କରାଯାଇଥିଲା। ସିନାପ୍ଟିକ୍ ଇନହିବିଟୋରି କିମ୍ବା ସୁବିଧାଜନକ ପଥ ଉପରେ ପ୍ରଭାବକୁ କମ କରିବା ପାଇଁ ଟ୍ରେନଗୁଡ଼ିକ ମଧ୍ୟରେ ବ୍ୟବଧାନ ସାଧାରଣତଃ 30 ସେକେଣ୍ଡରୁ ଅଧିକ ହୋଇଥାଏ। hChR2 ପ୍ରତିକ୍ରିୟା ମୋନୋସିନାପ୍ଟିକ୍ ଥିଲା କି ନାହିଁ ପରୀକ୍ଷା କରିବା ପାଇଁ, ଆମେ EPSC ପ୍ରତିକ୍ରିୟା ଅଦୃଶ୍ୟ ହେବା ପର୍ଯ୍ୟନ୍ତ ବାଥରେ TTX (1 μM) ପ୍ରୟୋଗ କରିଥିଲୁ, ଏବଂ ତା’ପରେ 4-aminopyridine (4-AP; 100 μM) ପ୍ରୟୋଗ କରିଥିଲୁ। ସାଧାରଣତଃ, କିଛି ମିନିଟ୍ ମଧ୍ୟରେ ଏକ ପ୍ରତିକ୍ରିୟା ଫେରସ୍ତ କରାଯାଏ, LED ଫାୟାରିଂ ଏବଂ EPSC ଜେନେରେସନ୍ ମଧ୍ୟରେ ଟିକିଏ ଅଧିକ ବିଳମ୍ବ ହୋଇଥାଏ। ପ୍ରତିକ୍ରିୟା AMPA ରିସେପ୍ଟର ଦ୍ୱାରା ପରିଚାଳିତ ହେଉଛି କି ନାହିଁ ତାହା ପରୀକ୍ଷା କରିବା ପାଇଁ NBQX (10 μM) ବ୍ୟବହାର କରାଯାଇଥିଲା।
ପୂର୍ବରୁ ବର୍ଣ୍ଣିତ ପରି ତୀକ୍ଷ୍ଣ hCO ବିଭାଗ ସୃଷ୍ଟି କରାଯାଇଥିଲା। ସଂକ୍ଷେପରେ, hCO ବିଭାଗଗୁଡ଼ିକୁ 4% ଆଗାରୋଜରେ ଏମ୍ବେଡ୍ କରାଯାଇଥିଲା ଏବଂ 126 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM NaH2PO4, 1 mM MgSO4, 2 mM CaCl2, 26 mM NaHCO3 ଏବଂ 10 mM d-(+) -ଗ୍ଲୁକୋଜ୍ ଧାରଣ କରିଥିବା କୋଷଗୁଡ଼ିକୁ ସ୍ଥାନାନ୍ତରିତ କରାଯାଇଥିଲା। ସେକ୍ସନଗୁଡ଼ିକୁ ଏକ Leica VT1200 ଭାଇବ୍ରେଟର ବ୍ୟବହାର କରି କୋଠରୀ ତାପମାତ୍ରାରେ 200-300 µm ରେ କଟାଯାଇଥିଲା ଏବଂ କୋଠରୀ ତାପମାତ୍ରାରେ ASF ରେ ସଂରକ୍ଷଣ କରାଯାଇଥିଲା। ତା'ପରେ, ଏକ ସିଧାସଳଖ ସ୍ଲାଇସ୍ସ୍କପ୍ ମାଇକ୍ରୋସ୍କୋପ୍ (Scientifica) ଅଧୀନରେ hCO ବିଭାଗରେ ସମ୍ପୂର୍ଣ୍ଣ କୋଷଗୁଡ଼ିକର ପ୍ୟାଚ୍-କ୍ୟାମ୍ପ ରେକର୍ଡିଂ କରାଯାଇଥିଲା। ସେକ୍ସନଗୁଡ଼ିକୁ aCSF (95% O2 ଏବଂ 5% CO2) ସହିତ ପରଫ୍ୟୁଜ କରାଯାଇଥିଲା ଏବଂ କୋଠରୀ ସିଗନାଲଗୁଡ଼ିକୁ କୋଠରୀ ତାପମାତ୍ରାରେ ରେକର୍ଡ କରାଯାଇଥିଲା। 127 mM ପୋଟାସିୟମ୍ ଗ୍ଲୁକୋନେଟ୍, 8 mM NaCl, 4 mM ମ୍ୟାଗ୍ନେସିୟମ୍ ATP, 0.3 mM ସୋଡିୟମ୍ GTP, 10 mM HEPES, ଏବଂ 0.6 mM EGTA, ଆଭ୍ୟନ୍ତରୀଣ pH 7, 2, KOH (ଅସ୍ମୋଲାରିଟି 290) ସହିତ ସଜାଡ଼ି ଏକ ଦ୍ରବଣରେ ପୂର୍ଣ୍ଣ ଏକ ବୋରୋସିଲିକେଟ୍ ଗ୍ଲାସ୍ ପାଇପେଟ୍ ବ୍ୟବହାର କରି hCO ନ୍ୟୁରନ୍ ପ୍ରୟୋଗ କରାଯାଇଥିଲା। ପୁନରୁଦ୍ଧାର ପାଇଁ, ଆଭ୍ୟନ୍ତରୀଣ ଦ୍ରବଣରେ 0.2% ବାୟୋସାଇଟିନ୍ ଯୋଡନ୍ତୁ।
କ୍ଲାମ୍ପେକ୍ସ (କ୍ଲାମ୍ପେକ୍ସ ୧୧.୧, ମଲିକୁଲାର ଡିଭାଇସ୍ସ) ଦ୍ୱାରା ଏକ ମଲ୍ଟିକ୍ଲାମ୍ପ ୭୦୦ବି ଆମ୍ପ୍ଲିଫାୟର (ମଲିକୁଲାର ଡିଭାଇସ୍ସ) ଏବଂ ଏକ ଡିଜିଡାଟା ୧୫୫୦ବି ଡିଜିଟାଇଜର (ମଲିକୁଲାର ଡିଭାଇସ୍ସ) ବ୍ୟବହାର କରି ତଥ୍ୟ ହାସଲ କରାଯାଇଥିଲା, ୨ କିଲୋହର୍ଟଜରେ କମ୍-ପାସ୍ ଫିଲ୍ଟର କରାଯାଇଥିଲା, ୨୦ କିଲୋହର୍ଟଜରେ ଡିଜିଟାଇଜେଡ୍ କରାଯାଇଥିଲା, ଏବଂ ବିଶ୍ଳେଷଣ ପାଇଁ କ୍ଲାମ୍ପଫିଟ୍ (ସଂସ୍କରଣ ୧୦.୬) ବ୍ୟବହାର କରି ବିଶ୍ଳେଷଣ କରାଯାଇଥିଲା, ଆଲିକୁଲାର ଡିଭାଇସ୍ସ) ଏବଂ କଷ୍ଟମ୍ MATLAB ଫଙ୍କସନ୍ସ (MATLAB ୨୦୧୯ବି, ମ୍ୟାଥୱର୍କସ୍)। ଜଙ୍କସନ୍ ପୋଟେନ୍ସିଆଲ୍ JPCalc ବ୍ୟବହାର କରି ଗଣନା କରାଯାଇଥିଲା ଏବଂ ଏଣ୍ଟ୍ରିଗୁଡ଼ିକୁ -୧୪ mV ର ଗଣନା କରାଯାଇଥିବା ଜଙ୍କସନ୍ ପୋଟେନ୍ସିଆଲ୍ ସହିତ ଆଡଜଷ୍ଟ କରାଯାଇଥିଲା। ଅପରେସନ୍ IV ରେ -୫୦ ରୁ ୨୫୦ ପିଏ ପର୍ଯ୍ୟନ୍ତ ୫-୧୦ ପିଏ ପଦକ୍ଷେପରେ ବର୍ତ୍ତମାନର ପଦକ୍ଷେପଗୁଡ଼ିକର ଏକ ଶୃଙ୍ଖଳା ରହିଛି।
ପିଞ୍ଚ୍ ହୋଇଥିବା ନ୍ୟୁରନ୍‌ର ରୂପଗତ ପୁନଃନିର୍ମାଣ ପାଇଁ, ଆଭ୍ୟନ୍ତରୀଣ ଦ୍ରବଣରେ 0.2% ବାୟୋସାଇଟିନ୍ (ସିଗ୍ମା-ଆଲଡ୍ରିଚ୍) ଯୋଡା ଯାଇଥିଲା। ହ୍ୟାକିଂ ପରେ କୋଷଗୁଡ଼ିକୁ ଅତି କମରେ 15 ମିନିଟ୍ ପାଇଁ ପ୍ରାଇମ୍ କରାଯାଏ। ପଞ୍ଜିକୃତ ପରଦା ସମ୍ପୂର୍ଣ୍ଣ ସିଲ୍ ହେବା ପର୍ଯ୍ୟନ୍ତ ପିପେଟ୍‌କୁ ଧୀରେ ଧୀରେ 1-2 ମିନିଟ୍ ପାଇଁ ଟାଣି ନିଆଯାଏ। ସେକ୍ସନ୍ ଫିଜିଓଲୋଜି ପ୍ରକ୍ରିୟା ଅନୁସରଣ କରି, ସେକ୍ସନ୍‌ଗୁଡ଼ିକୁ 4% PFA ରେ 4° C ରେ ରାତାରାତି ସ୍ଥିର କରାଯାଇଥିଲା, PBS X3 ସହିତ ଧୋଇ ଦିଆଯାଇଥିଲା, ଏବଂ 1:1000 ରେ ଷ୍ଟ୍ରେପ୍ଟାଭିଡିନ୍-କଞ୍ଜୁଗେଟେଡ୍ DyLight 549 କିମ୍ବା DyLight 405 (ଭେକ୍ଟର୍ ଲ୍ୟାବ୍ସ) ସହିତ ମିଶ୍ରିତ କରାଯାଇଥିଲା। ବାୟୋସାଇଟିନ୍ (2%; ସିଗ୍ମା-ଆଲଡ୍ରିଚ୍) ସହିତ ପୂର୍ଣ୍ଣ କୋଷଗୁଡ଼ିକୁ କୋଠରୀ ତାପମାତ୍ରାରେ 2 ଘଣ୍ଟା ପାଇଁ ପ୍ୟାଚ୍ କ୍ଲାମ୍ପ ରେକର୍ଡିଂ ସମୟରେ ଲେବଲ୍ କରାଯାଇଥିଲା। ତା'ପରେ ସେକ୍ସନ୍‌ଗୁଡ଼ିକୁ ଆକ୍ୱାମାଉଣ୍ଟ (ଥର୍ମୋ ସାଇଣ୍ଟିଫିକ୍) ବ୍ୟବହାର କରି ମାଇକ୍ରୋସ୍କୋପି ସ୍ଲାଇଡ୍‌ରେ ସ୍ଥାପନ କରାଯାଇଥିଲା ଏବଂ ପରଦିନ ଏକ ଲାଇକା TCS SP8 କନଫୋକାଲ୍ ମାଇକ୍ରୋସ୍କୋପରେ ଏକ ସଂଖ୍ୟାତ୍ମକ ଆପେର୍ଚର ×40 1.3, ମ୍ୟାଗ୍ନିଫିକେସନ୍ ×0.9–1.0, xy ସହିତ ଏକ ତେଲ ନିମଜ୍ଜନ ଅବଜେକ୍ଟିଭ୍ ବ୍ୟବହାର କରି ଭିଜୁଆଲାଇଜ୍ କରାଯାଇଥିଲା। ନମୁନାକରଣ ହାର ପ୍ରାୟ 7 ପିକ୍ସେଲ ପ୍ରତି ମାଇକ୍ରୋନ। 1 µm ବ୍ୟବଧାନରେ Z-ଷ୍ଟାକଗୁଡ଼ିକୁ କ୍ରମିକ ଭାବରେ ପ୍ରାପ୍ତ କରାଯାଇଥିଲା, ଏବଂ ପ୍ରତ୍ୟେକ ନ୍ୟୁରନର ସମ୍ପୂର୍ଣ୍ଣ ଡେଣ୍ଡ୍ରିଟିକ୍ ଗଛକୁ ଆଚ୍ଛାଦିତ କରିବା ପାଇଁ z-ଷ୍ଟାକ ମୋଜାଇକ୍ ଏବଂ Leica-ଆଧାରିତ ସ୍ୱୟଂ-ସିଲାଇ କରାଯାଇଥିଲା। ତା'ପରେ neuTube 40 ଇଣ୍ଟରଫେସ୍ ବ୍ୟବହାର କରି ନ୍ୟୁରନଗୁଡ଼ିକୁ ଅର୍ଦ୍ଧ-ମାନୁଆଲ୍ ଭାବରେ ଟ୍ରାକ୍ କରାଯାଇଥିଲା ଏବଂ SWC ଫାଇଲଗୁଡ଼ିକ ସୃଷ୍ଟି କରାଯାଇଥିଲା। ତା'ପରେ ଫାଇଲଗୁଡ଼ିକୁ SimpleNeuriteTracer41 ଫିଜି ପ୍ଲଗଇନରେ ଅପଲୋଡ୍ କରାଯାଇଥିଲା (ImageJ, ସଂସ୍କରଣ 2.1.0; NIH)।
ଷ୍ଟାନଫୋର୍ଡ ବିଶ୍ୱବିଦ୍ୟାଳୟର ଇନଷ୍ଟିଚ୍ୟୁସନାଲ୍ ରିଭ୍ୟୁ ବୋର୍ଡ ଦ୍ୱାରା ଅନୁମୋଦିତ ପ୍ରୋଟୋକଲ୍ ଅନୁଯାୟୀ ମାନବ କର୍ଟିକାଲ୍ ଟିସୁକୁ ସୂଚିତ ସମ୍ମତି ସହିତ ପ୍ରାପ୍ତ କରାଯାଇଥିଲା। ରିଫ୍ରାକ୍ଟାରୀ ଏପିଲେପ୍ସି ପାଇଁ ଅସ୍ତ୍ରୋପଚାରର ଅଂଶ ଭାବରେ ଫ୍ରଣ୍ଟାଲ୍ କର୍ଟେକ୍ସ (ମଧ୍ୟମ ଫ୍ରଣ୍ଟାଲ୍ ଗାଇରସ୍) ର ରିସେକ୍ସନ ଦ୍ୱାରା ମାନବ ପ୍ରସବ ପରେ ଟିସୁର ଦୁଇଟି ନମୁନା (3 ଏବଂ 18 ବର୍ଷ ବୟସ) ପ୍ରାପ୍ତ କରାଯାଇଥିଲା। ରିସେକ୍ସନ ପରେ, ବରଫ-ଥଣ୍ଡା NMDG-aCSF ରେ ଟିସୁ ଅମଳ କରନ୍ତୁ ଯେଉଁଥିରେ 92 mM NMDG, 2.5 mM KCl, 1.25 mM NaH2PO4, 30 mM NaHCO3, 20 mM HEPES, 25 mM ଗ୍ଲୁକୋଜ୍, 2 mM ଥିଓରିଆ, 5 mM ସୋଡିୟମ୍ ଆସ୍କର୍ବେଟ୍, 3 mM ସୋଡିୟମ୍ ପାଇରୁଭେଟ୍, 0.5 mM CaCl2 4H2O ଏବଂ 10 mM MgSO4 7H2O ଅନ୍ତର୍ଭୁକ୍ତ। ଘନୀଭୂତ ହାଇଡ୍ରୋକ୍ଲୋରିକ୍ ​​ଏସିଡ୍ ସହିତ pH 7.3-7.4 କୁ ଟାଇଟ୍ରେଟ୍ କରନ୍ତୁ। 30 ମିନିଟ୍ ମଧ୍ୟରେ ପରୀକ୍ଷାଗାରକୁ ଟିସୁ ପଠାଯାଇଥିଲା ଏବଂ ଉପରେ ବର୍ଣ୍ଣିତ ପ୍ରକ୍ରିୟା ଅନୁସାରେ କରୋନାଲ୍ ସେକ୍ସନ ନିଆଯାଇଥିଲା।
ସମସ୍ତ ପ୍ରାଣୀ ପ୍ରକ୍ରିୟା ଷ୍ଟାନଫୋର୍ଡ ବିଶ୍ୱବିଦ୍ୟାଳୟ APLAC-ଅନୁମୋଦିତ ପଶୁ ଯତ୍ନ ନିର୍ଦ୍ଦେଶାବଳୀ ଅନୁଯାୟୀ କରାଯାଇଥିଲା। ମୂଷାମାନଙ୍କୁ (ପ୍ରତିରୋପଣ ପରେ 140 ଦିନରୁ ଅଧିକ) 5% ଆଇସୋଫ୍ଲୁରେନ୍ ଆନାସ୍ଥେସିଆ ସହିତ ପ୍ରେରିତ କରାଯାଇଥିଲା ଏବଂ ଅସ୍ତ୍ରୋପଚାର ମଧ୍ୟରେ 1-3% ଆଇସୋଫ୍ଲୁରେନ୍ ସହିତ ଆନାସ୍ଥେସିଆ ଦିଆଯାଇଥିଲା। ପ୍ରାଣୀମାନଙ୍କୁ ଏକ ଷ୍ଟେରିଓଟାକ୍ସିକ ଫ୍ରେମ୍ (Kopf) ରେ ରଖାଯାଇଥିଲା ଏବଂ ସ୍ଥାୟୀ ମୁକ୍ତି ବ୍ୟୁପ୍ରେନର୍ଫାଇନ୍ (SR) କୁ ଚର୍ମତଳେ ଇଞ୍ଜେକ୍ସନ ଦିଆଯାଇଥିଲା। ଖପୁରୀକୁ ଖୋଲା, ସଫା ଏବଂ 3-5 ହାଡ଼ ସ୍କ୍ରୁ ଭର୍ତ୍ତି କରାଯାଇଥିଲା। t-hCO ଟାର୍ଗେଟ କରିବା ପାଇଁ, ଆମେ MRI ପ୍ରତିଛବିରୁ ଷ୍ଟେରିଓଟାକ୍ସିକ କୋଅର୍ଡିନେଟ୍ ସୃଷ୍ଟି କରିଥିଲୁ। ଆଗ୍ରହ ସ୍ଥାନରେ ଏକ ବର୍ର ହୋଲ୍ ଖୋଳାଯାଇଥିଲା ଏବଂ ଫାଇବର (400 µm ବ୍ୟାସ, NA 0.48, Doric) hCO ପୃଷ୍ଠରୁ 100 µm ତଳେ ଖୋଦିତ କରାଯାଇଥିଲା ଏବଂ UV-ନିରାମୟ ଦନ୍ତ ସିମେଣ୍ଟ (Relyx) ସହିତ ଖପୁରୀରେ ସୁରକ୍ଷିତ କରାଯାଇଥିଲା।
ପୂର୍ବରୁ ବର୍ଣ୍ଣିତ 42 ଅନୁସାରେ ଫାଇବର ଫଟୋମେଟ୍ରିକ୍ ରେକର୍ଡିଂ କରାଯାଇଥିଲା। ସ୍ୱତଃସ୍ଫୂର୍ତ୍ତ କାର୍ଯ୍ୟକଳାପ ରେକର୍ଡ କରିବା ପାଇଁ, ମୂଷାମାନଙ୍କୁ ଏକ ସଫା ପିଞ୍ଜରାରେ ରଖାଯାଇଥିଲା ଏବଂ ଏକ ଫାଇବର ଅପ୍ଟିକ୍ ଫଟୋମେଟ୍ରିକ୍ ଡାଟା ଅଧିଗ୍ରହଣ ପ୍ରଣାଳୀ ସହିତ ସଂଯୁକ୍ତ ଏକ 400 µm ବ୍ୟାସର ଫାଇବର ଅପ୍ଟିକ୍ ପ୍ୟାଚ୍ କେବୁଲ୍ (ଡୋରିକ୍) ପ୍ରତିରୋପିତ ଫାଇବର ଅପ୍ଟିକ୍ କେବୁଲ୍ ସହିତ ସଂଯୁକ୍ତ କରାଯାଇଥିଲା। ମୋଟର କାର୍ଯ୍ୟକଳାପର 10-ମିନିଟ୍ ରେକର୍ଡିଂ ସମୟରେ, ପ୍ରାଣୀମାନେ ପିଞ୍ଜରା ଅନୁସନ୍ଧାନ କରିବାକୁ ମୁକ୍ତ ଥିଲେ। ଉତ୍ପନ୍ନ କାର୍ଯ୍ୟକଳାପ ରେକର୍ଡ କରିବା ପାଇଁ, ମୂଷାମାନଙ୍କୁ (ପ୍ରତିରୋପଣ ପରେ 140 ଦିନରୁ ଅଧିକ) ଇଣ୍ଡକ୍ସନ ପାଇଁ 5% ଆଇସୋଫ୍ଲୁରେନ୍ ଏବଂ ରକ୍ଷଣାବେକ୍ଷଣ ପାଇଁ 1-3% ଆଇସୋଫ୍ଲୁରେନ୍ ସହିତ ନିଶ୍ଚେତକ କରାଯାଇଥିଲା। ପ୍ରାଣୀଙ୍କୁ ଏକ ଷ୍ଟେରିଓଟାକ୍ଟିକ୍ ଫ୍ରେମ୍ (Kopf) ରେ ରଖନ୍ତୁ ଏବଂ t-hCO ର ବିପରୀତ ପାର୍ଶ୍ୱରେ ଥିବା ହ୍ୱିସ୍କର୍ସଗୁଡ଼ିକୁ ପ୍ରାୟ 2 ସେମି ପର୍ଯ୍ୟନ୍ତ କାଟି ଏକ ପାଇଜୋଇଲେକ୍ଟ୍ରିକ୍ ଆକ୍ଚୁଏଟର୍ (PI) ସହିତ ସଂଯୁକ୍ତ ଏକ ଜାଲ ଦେଇ ଦିଆଯାଏ। ଏକ 400 µm ଫାଇବର ଅପ୍ଟିକ୍ ପ୍ୟାଚ୍ କେବୁଲ୍ (ଡୋରିକ୍) ପ୍ରତିରୋପିତ ଫାଇବର ସହିତ ସଂଯୁକ୍ତ କରାଯାଇଥିଲା ଏବଂ ତଥ୍ୟ ଅଧିଗ୍ରହଣ ପ୍ରଣାଳୀ ସହିତ ସଂଯୁକ୍ତ କରାଯାଇଥିଲା। t-hCO ର ବିପରୀତ ପାର୍ଶ୍ୱର କଣ୍ଟାଗୁଡ଼ିକୁ 20 ମିନିଟ୍ ରେକର୍ଡିଂ ଅବଧିରେ ଏକ ପିଜୋଇଲେକ୍ଟ୍ରିକ୍ ଡ୍ରାଇଭ୍ ଦ୍ୱାରା ଅନିୟମିତ ସମୟରେ 50 ଥର (20 Hz ରେ 2 mm, ପ୍ରତି ଉପସ୍ଥାପନାରେ 2 ସେକେଣ୍ଡ) ବିଚ୍ୟୁତ କରାଯାଇଥିଲା। କଷ୍ଟମ୍ MATLAB କୋଡ୍ ସହିତ ବିଚ୍ୟୁତି ସମୟ ନିୟନ୍ତ୍ରଣ କରିବାକୁ Arduino MATLAB ସମର୍ଥନ ପ୍ୟାକେଜ୍ ବ୍ୟବହାର କରନ୍ତୁ। ଟ୍ରାଞ୍ଜିଷ୍ଟର-ଟ୍ରାଞ୍ଜିଷ୍ଟର ଲଜିକ୍ (TTL) ପଲ୍ସ ବ୍ୟବହାର କରି ଇଭେଣ୍ଟଗୁଡ଼ିକୁ ଡାଟା ଅଧିଗ୍ରହଣ ସଫ୍ଟୱେର୍ ସହିତ ସିଙ୍କ୍ରୋନାଇଜ୍ କରାଯାଏ।
ପ୍ରତିରୋପଣ ପରେ ୧୪୦ ଦିନରୁ ଅଧିକ ସମୟ ଧରି ମୂଷାମାନଙ୍କୁ ୫% ଆଇସୋଫ୍ଲୁରେନ୍ ଆନାସ୍ଥେସିଆ ସହିତ ପ୍ରେରିତ କରାଯାଇଥିଲା ଏବଂ ଅସ୍ତ୍ରୋପଚାର ମଧ୍ୟରେ ୧-୩% ଆଇସୋଫ୍ଲୁରେନ୍ ସହିତ ନିଶ୍ଚେତକ ଦିଆଯାଇଥିଲା। ପ୍ରାଣୀମାନଙ୍କୁ ଏକ ଷ୍ଟେରିଓଟାକ୍ସିକ ଫ୍ରେମ୍ (Kopf) ରେ ରଖାଯାଇଥିଲା ଏବଂ ବୁପ୍ରେନୋର୍ଫାଇନ୍ SR ଏବଂ ଡେକ୍ସାମେଥାସୋନ୍ ଉପରମୁଣ୍ଡରେ ଇଞ୍ଜେକ୍ସନ ଦିଆଯାଇଥିଲା। ଖପୁରୀକୁ ଖୋଲା, ସଫା ଏବଂ ୩-୫ ହାଡ଼ ସ୍କ୍ରୁ ପ୍ରବେଶ କରାଯାଇଥିଲା। t-hCO ଟାର୍ଗେଟ କରିବା ପାଇଁ, ଆମେ MRI ପ୍ରତିଛବିରୁ ଷ୍ଟେରିଓଟାକ୍ସିକ କୋଅର୍ଡିନେଟ୍ ସୃଷ୍ଟି କରିଥିଲୁ। ପ୍ରତିରୋପିତ hCO ଉପରେ ସିଧାସଳଖ ଏକ ହାଇ ସ୍ପିଡ୍ ଡ୍ରିଲ୍ ସହିତ ଏକ ବୃତ୍ତାକାର କ୍ରାନିଓଟୋମି (ପ୍ରାୟ ୧ ସେମି ବ୍ୟାସ) କରାଯାଇଥିଲା। ହାଡ଼ ଯଥାସମ୍ଭବ ପତଳା ହୋଇଗଲେ, କିନ୍ତୁ ସମ୍ପୂର୍ଣ୍ଣ ହାଡ଼ରେ ଡ୍ରିଲ୍ କରିବା ପୂର୍ବରୁ, ଅବଶିଷ୍ଟ ଅକ୍ଷତ ପେଲଭିକ୍ ଡିସ୍କକୁ ବାହାର କରିବା ପାଇଁ ଫୋରସେପ୍ସ ବ୍ୟବହାର କରନ୍ତୁ ଯାହାଦ୍ୱାରା ଅନ୍ତର୍ନିହିତ t-hCO ପ୍ରକାଶ ପାଇପାରିବ। କ୍ରାନିଓଟୋମି ଜୀବାଣୁମୁକ୍ତ ସାଲାଇନ୍ ସହିତ ପୂର୍ଣ୍ଣ କରାଯାଇଥିଲା, ଏବଂ ଏକ କଭରସ୍ଲିପ୍ ଏବଂ ଏକ ସ୍ୱତନ୍ତ୍ର ହେଡ୍ ପିନ୍ UV-ନିରାମ୍ୟମାଣ ଡେଣ୍ଟାଲ୍ ସିମେଣ୍ଟ (Relyx) ସହିତ ଖପୁରୀ ସହିତ ସଂଯୁକ୍ତ ହୋଇଥିଲା।
ଏକ Nikon LWD (×16, 0.8 NA) ଅବଜେକ୍ଟିଭ୍ ସହିତ ଏକ Bruker ମଲ୍ଟିଫୋଟନ୍ ମାଇକ୍ରୋସ୍କୋପ୍ ବ୍ୟବହାର କରି ଦୁଇ-ଫୋଟନ୍ ଇମେଜିଂ କରାଯାଇଥିଲା। GCaMP6 ଇମେଜିଂ 920 nm ରେ 1.4x ସିଙ୍ଗଲ୍ z-ପ୍ଲେନ୍ ମ୍ୟାଗ୍ନିଫିକେସନ୍ ଏବଂ 8x ହାରାହାରି 7.5 fps ସହିତ କରାଯାଇଥିଲା। ମୂଷାମାନଙ୍କୁ 5% ଆଇସୋଫ୍ଲୁରେନ୍ ଆନାସ୍ଥେସିଆ ସହିତ ପ୍ରେରିତ କରାଯାଇଥିଲା ଏବଂ 1-3% ଆଇସୋଫ୍ଲୁରେନ୍ ସହିତ ରଖା ଯାଇଥିଲା। ମୂଷାଗୁଡ଼ିକୁ ଏକ କଷ୍ଟମ୍ ନିର୍ମିତ ହେଡ୍ ଫିକ୍ସଚର୍ ରେ ରଖାଯାଇଥିଲା ଏବଂ ଲେନ୍ସ ତଳେ ରଖାଯାଇଥିଲା। ମୋଟର କାର୍ଯ୍ୟକଳାପର 3-ମିନିଟ୍ ପୃଷ୍ଠଭୂମି ରେକର୍ଡିଂ ପ୍ରାପ୍ତ ହୋଇଥିଲା। 20 ମିନିଟ୍ ରେକର୍ଡିଂ ସମୟରେ, 50 ପଫ୍ (ପ୍ରତ୍ୟେକ ଉପସ୍ଥାପନା 100 ms ଲମ୍ବା) ଏକ ପିକୋସ୍ପ୍ରାଇସର ବ୍ୟବହାର କରି t-hCO ବିପରୀତ ହ୍ୱିସ୍କର ପ୍ୟାଡ୍ ରେ ଅନିୟମିତ ଭାବରେ ବିତରଣ କରାଯାଇଥିଲା। କଷ୍ଟମ୍ MATLAB କୋଡ୍ ସହିତ ବର୍ଷ୍ଟ ସମୟ ନିୟନ୍ତ୍ରଣ କରିବାକୁ Arduino MATLAB ସମର୍ଥନ ପ୍ୟାକେଜ୍ ବ୍ୟବହାର କରନ୍ତୁ। TTL ପଲ୍ସ ବ୍ୟବହାର କରି ଡାଟା ଅଧିଗ୍ରହଣ ସଫ୍ଟୱେର୍ (PrairieView 5.5) ସହିତ ଇଭେଣ୍ଟଗୁଡ଼ିକୁ ସିଙ୍କ୍ରୋନାଇଜ୍ କରନ୍ତୁ। ବିଶ୍ଳେଷଣ ପାଇଁ, ଫିଜିରେ ଆରମ୍ଭ ହୋଇଥିବା MoCo କାର୍ଯ୍ୟକ୍ରମରେ affine ସଂଶୋଧନ ବ୍ୟବହାର କରି xy ଗତି ପାଇଁ ପ୍ରତିଛବିଗୁଡ଼ିକୁ ସଂଶୋଧନ କରାଯାଇଥିଲା। CNMF-E43 ବ୍ୟବହାର କରି ପୃଥକ କୋଷରୁ ଫ୍ଲୋରୋସେଣ୍ଟ ଟ୍ରେସର ନିଷ୍କାସନ। ପ୍ରତ୍ୟେକ ଆଗ୍ରହର କ୍ଷେତ୍ର ପାଇଁ ଫ୍ଲୋରୋସେନ୍ସ ନିଷ୍କାସନ କରାଯାଇଥିଲା, dF/F କର୍ଭରେ ରୂପାନ୍ତରିତ କରାଯାଇଥିଲା, ଏବଂ ତା’ପରେ z-ସ୍କୋରରେ ରୂପାନ୍ତରିତ କରାଯାଇଥିଲା।
ମୂଷାମାନଙ୍କୁ (ପ୍ରତିରୋପଣ ପରେ 140 ଦିନରୁ ଅଧିକ) 5% ଆଇସୋଫ୍ଲୁରେନ୍ ଆନାସ୍ଥେସିଆ ସହିତ ପ୍ରେରିତ କରାଯାଇଥିଲା ଏବଂ ଅସ୍ତ୍ରୋପଚାର ମଧ୍ୟରେ 1-3% ଆଇସୋଫ୍ଲୁରେନ୍ ସହିତ ନିଶ୍ଚେତକ ଦିଆଯାଇଥିଲା। ପ୍ରାଣୀମାନଙ୍କୁ ଏକ ଷ୍ଟେରିଓଟାକ୍ସିକ ଫ୍ରେମ୍ (Kopf) ରେ ରଖାଯାଇଥିଲା ଏବଂ ବୁପ୍ରେନୋର୍ଫାଇନ୍ SR ଏବଂ ଡେକ୍ସାମେଥାସୋନ୍ କୁ ଚର୍ମ ତଳେ ଇଞ୍ଜେକ୍ସନ ଦିଆଯାଇଥିଲା। t-hCO ର ବିପରୀତ ପାର୍ଶ୍ୱରେ ଥିବା କଣ୍ଟାଗୁଡ଼ିକୁ ପ୍ରାୟ 2 ସେମି କାଟି ଏକ ପାଇଜୋଇଲେକ୍ଟ୍ରିକ୍ ଆକ୍ଚୁଏଟର୍ ସହିତ ସଂଯୁକ୍ତ ଏକ ଜାଲ ମାଧ୍ୟମରେ ଥ୍ରେଡ୍ କରାଯାଇଥିଲା। ଖପୁରୀକୁ ଖୋଲା ଏବଂ ସଫା କରାଯାଇଛି। ଖପୁରୀ ସହିତ ଏକ ଷ୍ଟେନଲେସ୍ ଷ୍ଟିଲ୍ ଗ୍ରାଉଣ୍ଡ ସ୍କ୍ରୁ ସଂଲଗ୍ନ କରାଯାଇଛି। t-hCO ଟାର୍ଗେଟ କରିବା ପାଇଁ, ଆମେ MRI ପ୍ରତିଛବିଗୁଡ଼ିକରୁ ଷ୍ଟେରିଓଟାକ୍ସିକ କୋଅର୍ଡିନେଟ୍ ସୃଷ୍ଟି କରିଥିଲୁ। t-hCO ଉପରେ ଏକ ହାଇ ସ୍ପିଡ୍ ଡ୍ରିଲ୍ ସହିତ ଏକ ବୃତ୍ତାକାର କ୍ରାନିଓଟୋମି (ପ୍ରାୟ 1 ସେମି ବ୍ୟାସ) କରନ୍ତୁ। ହାଡ଼ ଯଥାସମ୍ଭବ ପତଳା ହୋଇଗଲେ, କିନ୍ତୁ ସମ୍ପୂର୍ଣ୍ଣ ହାଡ଼ରେ ଡ୍ରିଲ୍ କରିବା ପୂର୍ବରୁ, ଅନ୍ତର୍ନିହିତ t-hCO ପ୍ରକାଶ କରିବା ପାଇଁ ଅବଶିଷ୍ଟ ଅକ୍ଷତ ପେଲଭିକ୍ ଡିସ୍କକୁ ବାହାର କରିବା ପାଇଁ ଫୋରସେପ୍ସ ବ୍ୟବହାର କରନ୍ତୁ। 32-ଚ୍ୟାନେଲ କିମ୍ବା 64-ଚ୍ୟାନେଲ ଉଚ୍ଚ-ଘନତା ସିଲିକନ୍ ପ୍ରୋବ୍ (କେମ୍ବ୍ରିଜ୍ ନ୍ୟୁରୋଟେକ୍) ବ୍ୟବହାର କରି ବ୍ୟକ୍ତିଗତ କୋଷଗୁଡ଼ିକୁ ରେକର୍ଡ କରାଯାଇଥିଲା ଯାହା ଗ୍ରାଉଣ୍ଡ ସ୍କ୍ରୁକୁ ଗ୍ରାଉଣ୍ଡ କରାଯାଇଥିଲା ଏବଂ RHD ଆମ୍ପ୍ଲିଫାୟର୍ (ଇଣ୍ଟାନ୍) ସହିତ ପ୍ରି-ଆମ୍ପ୍ଲିଫାଏ କରାଯାଇଥିଲା। କ୍ରାନିଓଟୋମି ମାଧ୍ୟମରେ ଇଲେକ୍ଟ୍ରୋଡ୍‌ଗୁଡ଼ିକୁ ଟାର୍ଗେଟ୍ ସାଇଟ୍‌କୁ ତଳକୁ ଆଣିବା ପାଇଁ ମାନିପୁଲେଟର୍ ବ୍ୟବହାର କରନ୍ତୁ, ଯାହା ଷ୍ଟରାଇଲ ସାଲାଇନ୍‌ରେ ପରିପୂର୍ଣ୍ଣ। ଓପନ୍ ଏଫିସ୍ ଡାଟା ଅଧିଗ୍ରହଣ ସିଷ୍ଟମ୍ ବ୍ୟବହାର କରି 30 kHz ଫ୍ରିକ୍ୱେନ୍ସିରେ ଡାଟା ସଂଗ୍ରହ କରାଯାଇଥିଲା। ରେକର୍ଡିଂ କେବଳ ସେତେବେଳେ ଜାରି ରହିଲା ଯେତେବେଳେ ଆମେ 10 ରୁ ଅଧିକ ଚ୍ୟାନେଲ୍‌ରେ ଅତ୍ୟନ୍ତ ସହସଂବନ୍ଧିତ ଲୟବଦ୍ଧ ସ୍ୱତଃସ୍ଫୂର୍ତ୍ତ କାର୍ଯ୍ୟକଳାପ ଚିହ୍ନଟ କରିଥିଲୁ, ଯାହା ସୂଚାଇ ଦେଉଥିଲା ଯେ ଇଲେକ୍ଟ୍ରୋଡ୍‌ଗୁଡ଼ିକ ଗ୍ରାଫ୍ଟରେ ଅବସ୍ଥିତ (ଦୁଇ-ଫୋଟନ୍ କ୍ୟାଲସିୟମ୍ ଇମେଜିଂ ଡାଟା ଉପରେ ଆଧାରିତ)। ମୋଟର କାର୍ଯ୍ୟକଳାପର 10-ମିନିଟ୍ ପୃଷ୍ଠଭୂମି ରେକର୍ଡିଂ ପ୍ରାପ୍ତ ହୋଇଥିଲା। t-hCO ର ବିପରୀତ ପାର୍ଶ୍ୱରେ ଥିବା ହ୍ୱିସ୍କର୍ସଗୁଡ଼ିକୁ 20 ମିନିଟ୍ ରେକର୍ଡିଂ ଅବଧିରେ ଏକ ପାଇଜୋଇଲେକ୍ଟ୍ରିକ୍ ଡ୍ରାଇଭ୍ ଦ୍ୱାରା ଅନିୟମିତ ସମୟରେ 50 ଥର (20 Hz ରେ 2 mm, ପ୍ରତି ଉପସ୍ଥାପନାରେ 2 ସେକେଣ୍ଡ) ବିଚ୍ଛିନ୍ନ କରାଯାଇଥିଲା। Arduino ପାଇଁ MATLAB ସମର୍ଥନ ପ୍ୟାକେଜ୍ (MATLAB 2019b) ବ୍ୟବହାର କରି, କଷ୍ଟମ୍ MATLAB କୋଡ୍ ସହିତ ବିଚ୍ଛିନ୍ନ ସମୟ ନିୟନ୍ତ୍ରଣ କରନ୍ତୁ। ତଥ୍ୟ ଅଧିଗ୍ରହଣ ସଫ୍ଟୱେର୍ ସହିତ ଇଭେଣ୍ଟଗୁଡ଼ିକୁ ସିଙ୍କ୍ରୋନାଇଜ୍ କରିବା ପାଇଁ TTL ପଲ୍ସ ବ୍ୟବହାର କରନ୍ତୁ।
ଅପ୍ଟିକାଲ୍ ମାର୍କିଂ ପରୀକ୍ଷଣ ପାଇଁ, 473 nm ଲେଜର (Omicron) ସହିତ ସଂଯୁକ୍ତ ଏକ 200 µm ଅପ୍ଟିକାଲ୍ ପ୍ୟାଚ୍ କର୍ଡ (Doric) କ୍ରାନିଓଟୋମି ଉପରେ ରଖାଯାଇଥିବା 200 µm ଅପ୍ଟିକାଲ୍ ଫାଇବର ସହିତ ସଂଯୁକ୍ତ ହୋଇଥିଲା। ଏହାର ଠିକ୍ ପୂର୍ବରୁ, ଜମ୍ପର ପାୱାରକୁ 20 mW ରେ ଆଡଜଷ୍ଟ କରନ୍ତୁ। କ୍ରାନିଓଟୋମି ମାଧ୍ୟମରେ ଇଲେକ୍ଟ୍ରୋଡ୍‌ଗୁଡ଼ିକୁ ଟାର୍ଗେଟ୍ ସାଇଟ୍ କୁ କମ କରିବା ପାଇଁ ମାନିପୁଲେଟର୍ ବ୍ୟବହାର କରନ୍ତୁ, ଯାହା ଷ୍ଟରାଇଲ୍ ସାଲାଇନ୍ ସହିତ ପରିପୂର୍ଣ୍ଣ। ରେକର୍ଡିଂ ଆରମ୍ଭରେ, ଦଶଟି ଆଲୋକ ପଲ୍ସ 473 nm (ଫ୍ରିକ୍ୟୁଏନ୍ସି 2 Hz, ପଲ୍ସ ଅବଧି 10 ms) ନିର୍ଗତ ହୋଇଥିଲା। ଫଟୋସେନ୍ସିଟିଭ୍ କୋଷଗୁଡ଼ିକୁ ଏପରି କୋଷ ଭାବରେ ପରିଭାଷିତ କରାଯାଇଥିଲା ଯାହା 70% କିମ୍ବା ଅଧିକ ପରୀକ୍ଷଣରେ 10 ms ଆଲୋକ ମଧ୍ୟରେ ସ୍ପାଇକ୍ ପ୍ରତିକ୍ରିୟା ପ୍ରଦର୍ଶନ କରିଥିଲା।