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L'organelli neurali autoassemblanti rapprisentanu una piattaforma in vitro promettente per a modellazione di u sviluppu è di e malatie umane. Tuttavia, l'organoidi mancanu di a connettività chì esiste in vivo, chì limita a maturazione è impedisce l'integrazione cù altri circuiti chì cuntrolanu u cumpurtamentu. Quì mostremu chì l'organoidi corticali derivati ​​da cellule staminali umane trapiantate in a corteccia somatosensoriale di ratti nudi neonati sviluppanu tipi di cellule mature chì s'integranu in circuiti sensoriali è ligati à a motivazione. A risonanza magnetica hà rivelatu una crescita di organoidi post-trapianto in parechje linee di cellule staminali è animali, mentre chì l'analisi à core unicu hà rivelatu a progressione di a corticogenesi è l'emergenza di un prugramma di trascrizione dipendente da l'attività. Infatti, i neuroni corticali trapiantati mostranu proprietà morfologiche, sinaptiche è di membrana interna più cumplesse cà i so omologhi in vitro, chì permettenu a rilevazione di difetti neuronali in pazienti cù a sindrome di Timothy. U tracciamentu anatomicu è funzionale hà dimustratu chì l'organelli trapiantati ricevenu input talamocorticali è corticocorticali, è e registrazioni in vivo di l'attività neurale suggerenu chì questi input ponu generà risposte sensoriali in e cellule umane. Infine, l'organoidi corticali estendenu l'assoni in tuttu u cervellu di u rattu, è a so attivazione optogenetica porta à un cumpurtamentu di ricerca di ricumpensa. Cusì, i neuroni di a corteccia umana trasplantati maturanu è participanu à i circuiti di l'ospite chì cuntrolanu u cumpurtamentu. Aspittemu chì questu approcciu faciliti a rilevazione di fenotipi à livellu di filamentu in cellule derivate da u paziente chì ùn ponu esse rilevati per altri mezi.
U sviluppu di u cervellu umanu hè un prucessu rimarchevule d'autourganizazione in u quale e cellule proliferanu, si differenzianu, migranu è si cunnettanu per furmà circuiti neuronali funziunali chì sò ulteriormente raffinati per mezu di l'esperienza sensoriale. Un prublema chjave per capisce u sviluppu di u cervellu umanu, in particulare in u cuntestu di e malatie, hè a mancanza d'accessu à u tissutu cerebrale. L'organelli autourganizanti, cumpresi l'organoidi di a corteccia umana (hCO; cunnisciutu ancu cum'è a sfera di a corteccia umana), ponu generà 2,3,4,5,6. Tuttavia, parechje limitazioni limitanu a so applicazione più larga à a comprensione di u sviluppu è di u funziunamentu di i circuiti neurali. In particulare, ùn hè chjaru se a maturazione di l'hCO hè limitata da l'assenza di certi input microambientali è sensoriali presenti in vivo. Inoltre, postu chì l'hCO ùn sò micca integrati in circuiti chì ponu generà risultati cumportamentali, a so utilità in a modellazione di disordini neuropsichiatrici geneticamente cumplessi è cumportamentali hè attualmente limitata.
U trapianto di hCO in un cervellu vivu intattu pò superà queste limitazioni. Studi precedenti anu dimustratu chì i neuroni umani trapiantati in a corteccia di roditori sò capaci di sopravvive, prughjettà è cumunicà cù e cellule di roditori7,8,9,10,11,12. Tuttavia, questi esperimenti sò generalmente realizati nantu à animali adulti, ciò chì pò limità l'integrazione sinaptica è assonale. Quì, descrivemu un paradigma di trapianto in u quale avemu trapiantatu hCO 3D derivatu da cellule hiPS in a corteccia somatosensoriale primaria (S1) di ratti immunodeficienti in una fase iniziale di u sviluppu plasticu. I neuroni hCO (t-hCO) trapiantati subiscenu una maturazione sustanziale, ricevenu input talamocorticali è cortical-corticali chì suscitanu risposte sensoriali, è estendenu proiezioni assonali in u cervellu di u rattu per guidà un cumpurtamentu di ricerca di ricumpensa. A maturazione estesa di t-hCO hà rivelatu difetti neuronali in pazienti cun sindrome di Timothy (TS), un disordine geneticu severu causatu da mutazioni in u canale di calciu CaV1.2 di tipu L sensibile à u voltaggio (codificatu da CACNA1C).
Per studià i neuroni corticali umani in circuiti in vivo, avemu trasplantatu stereotassicamente hCO 3D intattu in S1 di ratti atimici postnatali precoci (ghjorni 3-7 postnatali) (Fig. 1a è dati espansi di Fig. 1a-c). À questu puntu, e pruiezioni assonali talamocorticali è corticocorticali ùn anu ancu cumpletatu a so innervazione S1 (rif. 13). Cusì, questu approcciu hè cuncipitu per massimizà l'integrazione di t-hCO minimizendu l'impattu nantu à i circuiti endogeni. Per visualizà a situazione di t-hCO in animali vivi, avemu realizatu ricostruzioni cerebrali MRI ponderate in T2 di ratti 2-3 mesi dopu u trapianto (Fig. 1b è dati espansi, Fig. 1d). I t-hCO sò stati facilmente osservati è e misurazioni di u vulume di t-hCO eranu simili à quelle calculate da sezioni fisse (Dati Estesi Fig. 1d, e; P > 0,05). I t-hCO sò stati facilmente osservati è e misurazioni di u vulume di t-hCO eranu simili à quelle calculate da sezioni fisse (Dati Estesi Fig. 1d, e; P > 0,05). t-hCO легко наблюдались, а объемные измерения t-hCO были аналогичны рассчитанным для фиксины фиксины (расширенные данные, рис. 1d, e; P> 0,05). I t-hCO sò stati facilmente osservati, è e misurazioni volumetriche di t-hCO eranu simili à quelle calculate per e sezioni fisse (dati espansi, Fig. 1d, e; P > 0,05).很容易观察到t-hCO，并且t-hCO的体积测量值与从固定切片计算的测量值相似（扩展数据图1d、e；P > 0,05）很容易观察到t-hCO，并且t-hCO t-hCO легко наблюдался, а объемные измерения t-hCO были аналогичны рассчитанным для фиксерово (расширенные данные, рис. 1d, e; P> 0,05). U t-hCO hè statu facilmente osservatu, è e misurazioni volumetriche di t-hCO eranu simili à quelle calculate per e sezioni fisse (dati espansi, Fig. 1d, e; P > 0,05).Avemu determinatu t-hCO in l'81% di l'animali trapiantati circa 2 mesi dopu u trapianto (n = 72 animali; hCO da 10 linee cellulari hiPS; linee cellulari hiPS in a Tabella Supplementare 1). Di questi, 87% eranu situati in a corteccia cerebrale (Fig. 1c). Eseguendu scansioni MRI seriali in parechji punti di tempu in u listessu rattu trapiantatu, avemu trovu un aumentu di nove volte in u vulume di t-hCO in 3 mesi (Fig. 1d è dati espansi, Fig. 1f). L'animali trapiantati avianu un altu tassu di sopravvivenza (74%) à 12 mesi dopu u trapianto (dati espansi, Fig. 1g è Tabella Supplementare 2), è ùn sò stati trovati deficit motori o di memoria evidenti, gliosi o elettroencefalogramma (EEG). Dati Fig. 1g è tabella supplementaria 2). 1h-m è 3e).
a, Schema di u disignu sperimentale. L'hCO derivatu da e cellule hiPS hè statu trasplantatu in S1 di ratti nudi appena nati in i ghjorni 30-60 di differenziazione. b, Immagini MRI coronali è orizzontali ponderate in T2 chì mostranu t-hCO in S1 2 mesi dopu u trapianto. Barra di scala, 2 mm. c, Quantificazione di i tassi di successu di l'attecchimentu mostrati per ogni linea cellulare hiPS (n = 108, i numeri in e barre indicanu a quantità di t-hCO per linea cellulare hIPS) è a situazione corticale o subcorticale (n = 88). d, Immagine MRI di una arteria coronaria (sinistra; barra di scala, 3 mm) è a currispundente ricostruzione volumetrica 3D (barra di scala, 3 mm) chì mostra un aumentu di t-hCO in 3 mesi. e, Revisione di i mudelli di t-hCO in a corteccia cerebrale di u rattu. Barra di scala, 1 mm. f, Immagini immunocitochimiche rappresentative di t-hCO mostrate da cima à manca à diritta (durante a differenziazione): PPP1R17 (4 mesi), NeuN (8 mesi), SOX9 è GFAP (8 mesi), PDGFRα; (8 mesi), MAP2 (8 mesi) è IBA1 (8 mesi). Barra di scala, 20 µm. A coespressione di HNA indica cellule d'origine umana. g, snRNA-seq: Imaging di riduzione di a dimensionalità di a varietà unificata è di a pruiezione (UMAP) di tutti i nuclei di t-hCO di alta qualità dopu l'integrazione di Seurat (n = 3 campioni di t-hCO, n = 2 linee cellulari hiPS). Astrociti, cellule di a linea di astrociti; cyc prog, progenitori circulanti; GluN DL, neuroni glutammatergici profondi; GluN DL / SP, neuroni glutammatergici profondi è sublamellari; GluN UL, neuroni glutammatergici di u stratu superiore; oligodendrociti, oligodendrociti; OPC, cellule progenitrici di oligodendrociti; RELN, neuroni reelina. h, analisi di arricchimentu di termini di Gene Ontology (GO) di geni significativamente sovraregulati (P ​​aghjustatu < 0,05, cambiamentu di piega > 2, espressi in almenu u 10% di i nuclei) in i neuroni glutamatergici t-hCO paragunatu à i neuroni glutamatergici hCO. h, analisi di arricchimentu di termini di Gene Ontology (GO) di geni significativamente sovraregulati (P ​​aghjustatu < 0,05, cambiamentu di piega > 2, espressi in almenu u 10% di i nuclei) in i neuroni glutamatergici t-hCO paragunatu à i neuroni glutamatergici hCO. h, Анализ обогащения терминов Gene Ontology (GO) для генов со значительной активацией (скоррективацией (скоррективацией) изменения > 2, экспрессия по крайней мере в 10% ядер) в глутаматергических нейронах t-hCO по сира глутаматергическими нейронами hCO. h, analisi di arricchimentu di termini di Gene Ontology (GO) per i geni cù attivazione significativa (P <0,05 aghjustatu, cambiamentu di piega > 2, espressione in almenu 10% di nuclei) in i neuroni glutamatergici t-hCO paragunatu à i neuroni glutamatergici hCO. h，与hCO 谷氨酸能神经元相比，t-hCO 谷氨酸能神经元中基因显着上调（谎P整0.05，倍数变化> 2，在至少10% 的细胞核中表达）的基因本体论(GO) 术语富核中表达）的基因本体论(GO) 术语富核中表达 h ， 与 hco 谷氨酸 能 元 相比 ， t-hco 谷氨酸 能 神经 元 基因 显着 上调 ０5 同 ，变化 变化> 2 ， 至少 10% 的 核中 表达） 基因 基因 基因 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的的 的 的 的本体论(GO) 术语富集分析。 h, гены значительно активизировались (скорректированный P <0,05, кратность изменения> 2, эсруспия крайней мере в 10% ядер) в глутаматергических нейронах t-hCO по сравнению с глутаматергичергических нейронах t-hCO по сравнению с глутаматергичергических нейронах Онтологический (GO) анализ термина обогащения. h, i geni eranu significativamente sovraregulati (P ​​aghjustatu < 0,05, cambiamentu di volta > 2, espressi in almenu u 10% di i nuclei) in i neuroni glutamatergici t-hCO paragunatu à i neuroni glutamatergici hCO Analisi ontologica (GO) di u termine d'arricchimentu.A linea punteggiata indica un valore aq di 0,05. i, imaging UMAP di i tipi di cellule GluN in t-hCO utilizendu u trasferimentu di etichette da un inseme di dati di corteccia motoria adulta di riferimentu di 22 snRNA-seq. CT - cellule corticotalamiche, ET - cellule extracerebrali, IT - cellule telencefaliche interne, NP - pruiezione vicina.
Avemu dopu valutatu a citoarchitettura è a cumpusizione cellulare generale di t-hCO. A culurazione di l'anticorpi di e cellule endoteliali di u ratu hà rivelatu a vascolarizazione cù t-hCO, mentre chì a culurazione IBA1 hà rivelatu a presenza di microglia di u ratu in tuttu l'injertu (Fig. 1f è dati espansi, Fig. 3c,d). L'immunocolorazione hà rivelatu cellule positive per l'antigene nucleare umanu (HNA) chì coesprimenu PPP1R17 (progenitori corticali), NeuN (neuroni), SOX9 è GFAP (cellule derivate da glia) o PDGFRα (progenitori di oligodendrociti) (Figura 1f). Per studià a cumpusizione cellulare di t-hCO à risoluzione di una sola cellula, avemu realizatu u sequenziamentu di l'RNA à core unicu (snRNA-seq) dopu circa 8 mesi di differenziazione. A filtrazione in massa è a rimozione di i nuclei di u ratu anu pruduttu 21.500 mappe mononucleari umane di alta qualità (Fig. 1g è dati espansi, Fig. 4a,b). I mudelli d'espressione di marcatori tipici di tipu cellulare anu identificatu gruppi di classi di cellule corticali principali, cumpresi i neuroni glutamatergici profondi è superficiali, i progenitori circulanti, l'oligodendrociti è a ligna di astrociti (Fig. 1g, dati espansi, Fig. 4c, è Tabella Supplementare 3). L'immunocolorazione per SATB2 è CTIP2 hà dimustratu chì, malgradu a presenza di sottotipi corticali, t-hCO ùn hà micca mostratu una stratificazione anatomica chjara (dati espansi, Fig. 3a). L'hCO snRNA-seq currispundente à u stadiu hà pruduttu classi di cellule largamente simili, cù alcune eccezioni, cumprese l'assenza di oligodendrociti è a presenza di neuroni GABAergici, chì ponu riflette e cundizioni in vitro favurevuli precedentemente riportate per e cellule progenitrici laterali15 (dati espansi, Fig. 4f - i è Tabella Supplementare 4). L'analisi di l'espressione genica differenziale hà rivelatu differenze significative in i neuroni glutammatergici trà t-hCO è hCO (Tabella Supplementare 5), cumprese l'attivazione di insiemi di geni assuciati à a maturazione neuronale cum'è a segnalazione sinaptica, a lucalizazione dendritica è l'attività di u canale voltaggio-dipendente (Figura 1h è Tabella Supplementare 5). tabella 6). Di cunsiguenza, i neuroni glutammatergici t-hCO corticali anu mostratu una maturazione trascrizionale accelerata.
Per elucidà se sti cambiamenti trascrizionali in t-hCO eranu ligati à differenze morfologiche trà hCO in vitro è t-hCO in vivo, avemu ricustruitu hCO è hCO pieni di biocitina currispondenti à u stadiu in sezioni acute dopu à 7-8 mesi di differenziazione. Neuroni hCO (Fig. 2a). I neuroni t-hCO eranu significativamente più grandi, avianu 1,5 volte u diametru di u soma, u doppiu di dendriti è un aumentu generale di sei volte di a lunghezza dendritica totale paragunata à hCO in vitro (Fig. 2b). Inoltre, avemu osservatu una densità significativamente più alta di spine dendritiche in i neuroni t-hCO chè in i neuroni hCO (Fig. 2c). Questu suggerisce chì i neuroni t-hCO subiscenu un allungamentu è una ramificazione dendritica estensivi, chì, in cumbinazione cù a proliferazione cellulare cuntinua, ponu cuntribuisce à a crescita intensiva di t-hCO dopu u trapianto (Fig. 1d è Dati Estesi Fig. 1f). Questu ci hà spintu à investigà e proprietà elettrofisiologiche. A capacità di membrana era ottu volte più alta (dati espansi, Fig. 8d), u putenziale di membrana in statu di riposu era più iperpolarizatu (circa 20 mV), è l'iniezione di corrente hà induttu una velocità di eccitazione massima più alta in i neuroni t-hCO chè in i neuroni hCO. in vitro (Fig. 2d), e), chì hè coerente cù e caratteristiche morfologiche più grande è più cumplesse di t-hCO. Inoltre, a frequenza di eventi di corrente postsinaptica eccitatoria spontanea (EPSC) era significativamente più alta in i neuroni t-hCO (Fig. 2f), ciò chì suggerisce chì l'aumentata densità di spine dendritiche osservata in i neuroni t-hCO era assuciata à l'eccitabilità funzionale. sinapsi sessuale. Avemu cunfirmatu u caratteru immaturu di i neuroni hCO in vitro registrendu i neuroni glutamatergici marcati (dati espansi, Fig. 6a-c).
a, ricustruzzione 3D di neuroni hCO è t-hCO pieni di biocitina dopu à 8 mesi di differenziazione. b, Quantificazione di e caratteristiche morfologiche (n = 8 neuroni hCO, n = 6 neuroni t-hCO; **P = 0,0084, *P = 0,0179 è ***P < 0,0001). b, Quantificazione di e caratteristiche morfologiche (n = 8 neuroni hCO, n = 6 neuroni t-hCO; **P = 0,0084, *P = 0,0179 è ***P < 0,0001). б, количественная оценка морфологических признаков (n = 8 нейронов hCO, n = 6 нейронка морфологических признаков) *** P <0,0001). b, quantificazione di e caratteristiche morfologiche (n = 8 neuroni hCO, n = 6 neuroni t-hCO; ** P = 0,0084, * P = 0,0179, è *** P <0,0001). b，形态学特征的量化（n = 8 个hCO 神经元，n = 6 个t-hCO 神经元；**P = 0,0084，*P = 90 个t-hCO 神经元；**P = 0,0084，*P = P 90 0,0001). b，形态学特征的量化（n = 8 个hCO 神经元，n = 6 个t-hCO 神经元；**P = 0,0084，*P = 90 个t-hCO 神经元；**P = 0,0084，*P = P 90 0,0001). б, количественная оценка морфологических признаков (n = 8 нейронов hCO, n = 6 нейронка морфологических признаков) *** P <0,0001). b, quantificazione di e caratteristiche morfologiche (n = 8 neuroni hCO, n = 6 neuroni t-hCO; ** P = 0,0084, * P = 0,0179, è *** P <0,0001).c, ricustruzzione 3D di i rami dendritici di hCO è t-hCO dopu à 8 mesi di differenziazione. L'asterischi rossi indicanu spine dendritiche putative. Quantificazione di a densità di e spine dendritiche (n = 8 neuroni hCO, n = 6 neuroni t-hCO; **P = 0,0092). d, Quantificazione di u putenziale di membrana à riposu (n = 25 neuroni hCO, n = 16 neuroni t-hCO; ***P < 0,0001). d, Quantificazione di u putenziale di membrana à riposu (n = 25 neuroni hCO, n = 16 neuroni t-hCO; ***P < 0,0001). d, количественная оценка мембранного потенциала покоя (n = 25 нейронов hCO, n = 16 нейронов t-hCO; *** P). d, quantificazione di u putenziale di membrana à riposu (n = 25 neuroni hCO, n = 16 neuroni t-hCO; ***P < 0,0001). d，静息膜电位的量化（n = 25 hCO 神经元，n = 16 t-hCO 神经元；***P < 0,0001）。 d，静息膜电位的量化（n = 25 hCO 神经元，n = 16 t-hCO 神经元；***P < 0,0001）。 d, количественная оценка мембранного потенциала покоя (n = 25 нейронов hCO, n = 16 нейронов t-hCO; *** P). d, quantificazione di u putenziale di membrana à riposu (n = 25 neuroni hCO, n = 16 neuroni t-hCO; ***P < 0,0001). e, Potenziale d'azione ripetitiva in hCO3 è t-hCO3 induttu da iniezioni di corrente crescenti, è quantificazione di a velocità massima di attivazione (n = 25 neuroni hCO3, n = 16 neuroni t-hCO3; ***P < 0,0001). e, Potenziale d'azione ripetitiva in hCO3 è t-hCO3 induttu da iniezioni di corrente crescenti, è quantificazione di a velocità massima di attivazione (n = 25 neuroni hCO3, n = 16 neuroni t-hCO3; ***P < 0,0001). e, повторное возбуждение потенциала действия в hCO и t-hCO, вызванное увеличением тока, и количением тока, и конса волич максимальной скорости возбуждения (n = 25 нейронов hCO, n = 16 нейронов t-hCO; *** P <0,0001). e, riattivazione di u putenziale d'azione in hCO è t-hCO indutta da l'aumentu di a corrente è a quantificazione di a frequenza massima di attivazione (n = 25 neuroni hCO, n = 16 neuroni t-hCO; *** P < 0,0001). e，通过增加电流注入诱导的hCO 和t-hCO 重复动作电位放电，以及最大放电大放电率玏n个hCO 神经元，n = 16 个t-hCO 神经元；***P <0.0001）。 E ， 通过 增加 电流 注入 的 的 hco 和 t-hco 重复 电位 放电 ， 以及 最 大 及 最 大 大 大 缈 （ （ 2 重复个 hco 神经 ， n = 16 个 t-hco 神经 ； *** p <0,0001） 。 e, повторяющееся возбуждение потенциала действия hCO и t-hCO, вызванное увеличением подакач, и и подакач количественная оценка максимальной скорости возбуждения (n = 25 нейронов hCO, n = 16 нейронов hCO, n = 16 нейронов t-10,00в *** p-10). e, scarica ripetitiva di potenziali d'azione hCO è t-hCO indotti da un aumentu di l'offerta di corrente è da a quantificazione di a velocità massima di scarica (n = 25 neuroni hCO, n = 16 neuroni t-hCO; *** P < 0,0001). f, EPSC spontanei (sEPSC) in neuroni hCO è t-hCO à 8 mesi di differenziazione, è quantificazione di a frequenza di l'eventi sinaptici (n = 25 neuroni hCO, n = 17 neuroni t-hCO; ***P < 0,0001). f, EPSC spontanei (sEPSC) in neuroni hCO è t-hCO à 8 mesi di differenziazione, è quantificazione di a frequenza di l'eventi sinaptici (n = 25 neuroni hCO, n = 17 neuroni t-hCO; ***P < 0,0001). f, спонтанные EPSC (sEPSC) в нейронах hCO и t-hCO через 8 месяцев дифференцировки и количественая количественая нак синаптических событий (n = 25 нейронов hCO, n = 17 нейронов t-hCO; *** P <0,0001) . f, EPSC spontanei (sEPSC) in neuroni hCO è t-hCO à 8 mesi di differenziazione è quantificazione di i tassi di eventi sinaptici (n = 25 neuroni hCO, n = 17 neuroni t-hCO; *** P <0,0001). f，分化8 个月时hCO 和t-hCO 神经元中的自发性EPSCs (sEPSCs)，以及突触事件频率延频率的CO hCO2神经元，n = 17 t-hCO 神经元；***P <0,0001） . f，分化8 个月时hCO 和t-hCO 神经元中的自发性EPSCs (sEPSCs)，以及突触事件频率延频率的CO hCO神率的量匼（n = 25 hCO 神率的量匼（n = 25hCO P < 0,0001） . f, спонтанные EPSC (sEPSC) в нейронах hCO и t-hCO через 8 месяцев дифференцировки и количественая количественая нак синаптических событий (n = 25 нейронов hCO, n = 17 нейронов t-hCO; *** P <0,0001). f, EPSC spontanei (sEPSC) in neuroni hCO è t-hCO à 8 mesi di differenziazione è quantificazione di i tassi di eventi sinaptici (n = 25 neuroni hCO, n = 17 neuroni t-hCO; *** P<0,0001).Per bf, hCO è t-hCO in a linea 1208-2 sò stati presi da u listessu lottu di differenziazione mantinutu in parallelu. g, Analisi di l'arricchimentu di l'inseme di geni (test esattu di Fisher unilaterale) di geni significativamente sovraregulati (P ​​aghjustatu < 0,05, cambiamentu di piega > 2, espressi in almenu u 10% di i nuclei) in i neuroni glutammatergici t-hCO paragunatu à i neuroni glutammatergici hCO cù insemi di geni dipendenti da l'attività di risposta precoce (ERG) è di risposta tardiva (LRG) identificati da un studiu di topi in vivo16 è LRG specifichi di l'omu da neuroni in vitro17. g, Analisi di l'arricchimentu di l'inseme di geni (test esattu di Fisher unilaterale) di geni significativamente sovraregulati (P ​​aghjustatu < 0,05, cambiamentu di piega > 2, espressi in almenu u 10% di i nuclei) in i neuroni glutammatergici t-hCO paragunatu à i neuroni glutammatergici hCO cù insemi di geni dipendenti da l'attività di risposta precoce (ERG) è di risposta tardiva (LRG) identificati da un studiu di topi in vivo16 è LRG specifichi di l'omu da neuroni in vitro17. g, анализ обогащения набора генов (односторонний точный критерий Фишера) генов со знатьчитей (скорректированный P <0,05, кратность изменения > 2, экспрессия по меньшей мере в 10% ядетерь в гадетерь в гадетерь нейронах t-hCO по сравнению с глутаматергическими нейронами hCO наборы генов как раннего (ERG), так и позднего (LRG) генов, зависящих от активности, идентифицированнысфицированныснед ванныснед ванныснед мышах in vivo16, è специфических для человека LRG из нейронов in vitro17. g, analisi di l'arricchimentu di l'inseme di geni (test esattu di Fisher à una coda) di geni cù attivazione significativa (P <0,05 aghjustatu, cambiamentu di piega > 2, espressione in almenu u 10% di i nuclei) in i neuroni glutammatergici t-hCO paragunatu à l'insemi di neuroni glutammatergici hCO di geni dipendenti da l'attività sia precoce (ERG) sia tardiva (LRG) identificati in topi in vivo16 è LRG specifichi di l'omu da neuroni in vitro17. g，t-hCO谷氨酸能神经元与hCO谷氨酸能神经元相比，t -hCO谷氨酸能神经元显着上调（调整后P<0,05，倍数变化>2，在至少10%的细胞核中表达）的基因集富集分析（单侧F isher精确检验）从体内小鼠研究中鉴定的早期反应(ERG)和晚期反应(LRG) 活性依赖性基因的基因组16 和体外神经元17 中的人类牧异悀性LRG。 g ， t-hco 谷氨酸 神经 元 与 hco 谷氨酸 神经 元 相比 ， t-hco 谷氨酸 神经 元 神经 元 上 元 比<0.05 ， 倍数> 2 ， 至少 至少 10%的 细胞 核中 表达） 的 集富集 分析 （分析 （分析 （分析 （单（单）体内 小鼠 研究 中 的 早期 反应 反应 反应 和 晚期 反应 反应 (lrg) 活性 基因 的 基因组 16 因组 16 和 煞 神 神7中 中 17 中 17的人类特异性LRG。 g, глутаматергические нейроны t-hCO были значительно активизированы по сравнению с глутамч глутамч нейронами hCO (скорректированный P<0,05, кратность изменения> 2, не менее 10% Анализ обогаща гниогаще (односторонний точный тест Фишера) раннего ответа (ERG) и позднего гены, зависящие от активности ответа (LRG), идентифицированные в исследованиях на мышах in vivo16 è нейронах in vitro17. LRG, специфичные для человека. I neuroni glutamatergici g, t-hCO eranu significativamente sovraregulati paragunatu à i neuroni glutamatergici hCO (P <0,05 aghjustatu, cambiamentu di volta > 2, almenu 10% Analisi di arricchimentu di geni di risposta precoce (ERG) è di risposta tardiva (test esattu di Fisher à una coda) geni dipendenti da l'attività di risposta (LRG) identificati in topi in vivo16 è neuroni in vitro.17 LRG specifichi umani.A linea punteggiata indica un valore P currettu da Bonferroni di 0,05. h, l'espressione di u genu GluN (pseudo-pacchettu è scalatura di ogni genu) era significativamente sovraregulata in repliche snRNA-seq di geni LRG in neuroni glutammatergici t-hCO. i, immunocolorazione chì mostra l'espressione di SCG2 in neuroni t-hCO (superiore) è hCO (inferiore). E frecce bianche indicanu e cellule SCG2+. Barra di scala, 25 µm. I dati sò espressi cum'è media ± deviazione standard.
Basatu annantu à l'aumentu di l'attività di t-hCO osservatu in sezioni ex vivo, snRNA-seq hà revelatu una sovra-regulazione dipendente da l'attività di i trascritti genichi in t-hCO paragunatu à hCO in vitro. I neuroni t-hCO glutamatergici anu espressu livelli più alti di geni chì regulanu l'attività di risposta tardiva (Fig. 2g,h), chì sò stati truvati in studii precedenti in neuroni di topo è umani16,17. Per esempiu, BDNF18, SCG2, è OSTN, un genu chì regula l'attività specificu di i primati, anu mostratu una maggiore espressione in i neuroni t-hCO paragunatu à i neuroni hCO (Fig. 2g-i). Cusì, i neuroni t-hCO anu mostratu caratteristiche di maturazione migliorate paragunatu à i neuroni hCO per analisi trascrizionali, morfologiche è funziunali.
Per valutà ulteriormente l'associazione di a maturazione di t-hCO cù u sviluppu di u cervellu umanu, avemu realizatu paragoni trascrittomici di i tipi di cellule corticali fetali è adulte19,20 è adulte21,22, è ancu dati estensivi nantu à l'espressione genica corticale23 durante u sviluppu (dati espansi, Fig. 5). Cù u travagliu precedente24, u statu di maturazione di u trascrittoma globale di hCO è t-hCO à 7-8 mesi di differenziazione hè largamente coerente cù u tempu di sviluppu in vivo è hè più equivalente à a vita fetale tardiva (Dati Estesi Fig. 5a). In particulare, avemu osservatu una maggiore maturità di u trascrittoma in t-hCO paragunata à hCO currispundente per età, è ancu l'attivazione di u trascrittoma assuciata à a sinaptogenesi, l'astrogenesi è a mielinazione (dati espansi, Fig. 5b-d). À u livellu cellulare, avemu trovu evidenza di un sottotipu di corteccia più sottile in t-hCO, cù gruppi di neuroni glutammatergici chì si sovrappongono à i sottotipi di neuroni adulti L2/3, L5 è L6 (Figura 1i). In cuntrastu, a sovrapposizione di cluster trà i neuroni glutammatergici t-hCO è i neuroni corticali fetali era più limitata à a mità di a gravidanza (dati espansi, Figura 5e-j). Per determinà se i neuroni t-hCO sò funziunalmente simili à i neuroni neocorticali postnatali umani, avemu realizatu registrazioni elettrofisiologiche è ricostruzioni anatomiche di neuroni piramidali L2/3 umani in sezioni affilate di a corteccia postnatale umana (dati espansi, Fig. 7a). E proprietà elettrofisiologiche di i neuroni piramidali L2/3 eranu simili à quelle di i neuroni piramidali t-hCO (dati espansi, Fig. 7e). Morfologicamente, i neuroni L2/3 di campioni umani postnatali eranu più simili à t-hCO chè à hCO, ancu se e cellule L2/3 eranu più lunghe, cuntenevanu più rami in generale è avianu una densità di spina dorsale più alta (Fig. 3g è dati espansi, Fig. 7b-). G).
a, trapianto di hCO pruduttu da linee cellulari di cuntrollu è TS hiPS in ratti neonatali. b, ricostruzione 3D di neuroni t-hCO pieni di biocitina dopu à 8 mesi di differenziazione. c, quantificazione di a lunghezza dendritica media (n = 19 neuroni di cuntrollu, n = 21 neuroni TS; **P = 0,0041). d, rami dendritici ricostruiti in 3D da u cuntrollu è TS t-hCO à 8 mesi di differenziazione, è quantificazione di a densità di a spina dendritica (n = 16 neuroni di cuntrollu, n = 21 neuroni TS, ***P < 0,0001). d, rami dendritici ricostruiti in 3D da u cuntrollu è TS t-hCO à 8 mesi di differenziazione, è quantificazione di a densità di a spina dendritica (n = 16 neuroni di cuntrollu, n = 21 neuroni TS, ***P < 0,0001). d, 3D-реконструкция дендритных ветвей из контроля и TS t-hCO через 8 месяцев дифференцев дифференцча контроля всерез оценка плотности дендритных шипов (n = 16 контрольных нейронов, n = 21 TS нейронов, *** P <0,0001). d, ricustruzzione 3D di rami dendritici da cuntrollu è t-hCO TS à 8 mesi di differenziazione è quantificazione di a densità di a spina dendritica (n = 16 neuroni di cuntrollu, n = 21 neuroni TS, *** P <0,0001). d，分化8 个月时对照和TS t-hCO 的3D 重建树突分支，以及树突棘密度的量化=1（n6个对照神经元，n = 21 个TS 神经元，***P < 0,0001）。 d ， 分化 8 个 时 对照 和 ts t-hco 的 3d 重建 分支 分支 以及 树突棘 密度 棘 密度 重建   分支神经 元 ， n = 21 个 ts 神经 ， *** p <0,0001 ）。 d, 3D-реконструкция дендритных ветвей контроля и TS t-hCO через 8 месяцев дифференцирововей контроля через 8 месяцев дифференцирововей контроля на оценка плотности дендритных шипов (n = 16 контрольных нейронов, n = 21 TS нейронов, *** P <0,0001). d, ricustruzzione 3D di i rami dendritici di cuntrollu è TS t-hCO à 8 mesi di differenziazione è quantificazione di a densità di a spina dendritica (n = 16 neuroni di cuntrollu, n = 21 neuroni TS, *** P <0,0001).L'asterischi rossi indicanu spine dendritiche putative. e, EPSC spontanei in neuroni di cuntrollu è TS t-hCO dopu à 8 mesi di differenziazione. f, graficu di frequenza cumulativa è quantificazione di a frequenza è di l'ampiezza di l'eventi sinaptici (n=32 neuroni di cuntrollu, n=26 neuroni TS; **P=0,0076 è P=0,8102). g, analisi Scholl di i neuroni TS è di cuntrollu in hCO è t-hCO. E linee tratteggiate mostranu i neuroni piramidali postnatali L2/3 umani per paragone (n=24 neuroni t-hCO di cuntrollu, n=21 neuroni TS t-hCO, n=8 neuroni hCO di cuntrollu, è n=7 neuroni TS hCO). I dati sò espressi cum'è a media ± deviazione standard.
A capacità di t-hCO di replicà e caratteristiche morfologiche è funziunali di i neuroni di a corteccia umana à un livellu altu ci hà incitatu à esplorà se t-hCO puderia esse adupratu per rilevà fenotipi di malatie. Ci simu cuncentrati nantu à TS, un disordine neurodevelopmentale severu causatu da mutazioni di guadagnu di funzione in u genu chì codifica CaV1.2, chì inizia a trascrizione di geni dipendente da l'attività in i neuroni. Avemu ottenutu hCO da trè pazienti TS chì portavanu a sustituzione più cumuna (p.G406R) è trè cuntrolli (Fig. 3a). Dopu u trapianto, avemu trovu chì a morfologia dendritica era alterata in i neuroni TS paragunatu à i cuntrolli (Fig. 3b è dati espansi, Fig. 8a,b), cù un aumentu di duie volte in u numeru di dendriti primari è un aumentu generale di a diminuzione media è generale di a lunghezza dendritica (Fig. 3c è dati estesi, Fig. 8c). Questu era assuciatu à una maggiore densità di spine è una maggiore frequenza di EPSC spontanei in TS paragunatu à i neuroni di cuntrollu (Fig. 3d-f è dati espansi, Fig. 8g). Ulteriori analisi anu rivelatu mudelli di ramificazione dendritica anormale in t-hCO TS paragunatu à i cuntrolli, ma micca in TS hCO in vitro in un stadiu simile di differenziazione (Fig. 3g). Questu hè coerente cù i nostri rapporti precedenti di restringimentu dendritico dipendente da l'attività in TS è mette in risaltu a capacità di sta piattaforma di trapianto di rilevà fenotipi di malattia in vivo.
Dopu avemu dumandatu finu à chì puntu e cellule t-hCO sò funziunalmente integrate in u ratu S1. S1 in i roditori riceve forti input sinaptici da i nuclei basali ventrali ipsilaterali è talamici posteriori, è ancu da e cortecce motorie ipsilaterali è somatosensoriali secondarie, è S1 contralaterale (Fig. 4a). Per restaurà u schema di innervazione, avemu infettatu hCO cù u virus di a rabbia-dG-GFP/AAV-G è trasplantatu hCO in u ratu S1 3 ghjorni dopu. Avemu osservatu una densa espressione di GFP in i neuroni di u S1 ipsilaterale è di i gangli basali ventrali 7-14 ghjorni dopu u trapianto (Fig. 4b, c). Inoltre, a culurazione di l'anticorpi di u marcatore talamicu netrina G1 hà rivelatu a presenza di terminazioni talamiche in t-hCO (Fig. 4d, e). Per valutà se queste proiezioni afferenti puderanu suscità risposte sinaptiche in e cellule t-hCO, avemu realizatu registrazioni di cellule intere da cellule umane in sezioni nitide di u stratu talamocorticale. Stimulazione elettrica di S1 ​​di rattu, capsula interna, materia bianca, fibre vicinu à t-hCO o attivazione optogenetica di terminazioni talamiche chì esprimenu opsina in EPSC à corta latenza indotta da t-hCO in neuroni t-hCO esposti à l'antagonista di u receptore AMPA NBQX. (Fig. 4f, g è dati estesi, Fig. 9a-g). Quessi dati dimustranu chì t-hCO hè anatomicamente integratu in u cervellu di u rattu è hè capace di esse attivatu da u tissutu ospite di u rattu.
a, Schema di un esperimentu di tracciamentu di a rabbia. b, GFP è espressione STEM121 specifica di l'omu trà t-hCO è a corteccia cerebrale di u ratu (pannellu superiore). Hè ancu mostrata l'espressione di GFP in u nucleu basale ventrale ipsilaterale di u ratu (VB) (in bassu à manca) è S1 ipsilaterale (in bassu à diritta). Barra di scala, 50 µm. I quadrati rossi rapprisentanu e zone di u cervellu induve sò state scattate l'imagine. c, quantificazione di e cellule chì esprimenu GFP (n = 4 ratti). d, e - Terminali talamici Netrin G1+ in t-hCO. d mostra una sezione coronale chì cuntene i nuclei t-hCO è VB. Barra di scala, 2 mm. e mostra l'espressione di Netrin G1 è STEM121 in i neuroni t-hCO (à manca) è VB (à diritta). Barra di scala, 50 µm. A linea punteggiata arancione indica u bordu t-hCO. f, g, Tracce attuali di neuroni t-hCO dopu a stimulazione elettrica in u rattu S1 (f) o capsula interna (g), cù (viola) o senza (neru) NBQX (sinistra). Ampiezze EPSC cù è senza NBQX (n = 6 neuroni S1, *P = 0,0119; è n = 6 neuroni di a capsula interna, **P = 0,0022) (centru). Percentuale di neuroni t-hCO chì mostranu EPSC in risposta à a stimulazione elettrica di u rattu S1 (f) o capsula interna (g) (destra). aCSF, fluidu cerebrospinale artificiale. h, diagramma schematicu di l'esperimentu di imaging 2P (sinistra). Espressione di GCaMP6s in t-hCO (mezu). Barra di scala, 100 µm. Lapse di tempu di fluorescenza di GCaMP6s (destra). i, Z-score di fluorescenza di attività spontanea. j, illustrazione schematica di a stimulazione di i mustacchi. k, traiettorie di fluorescenza 2P cù puntuazione z in una prova, allineate cù a deviazione di i baffi à u tempu zero (linea tratteggiata) in e cellule d'esempiu. l, risposte di puntuazione z mediate da a pupulazione di tutte e cellule allineate cù a deviazione di i baffi à u tempu zero (linea tratteggiata) (rossa) o timestamp generati aleatoriamente (grisgiu). m. Schema di l'esperimentu nantu à a marcatura ottica. n, Curve di tensione grezza da una cellula d'esempiu t-hCO durante a stimulazione laser blu o a deflessione di i baffi. E frecce rosse indicanu i primi picchi causati da a luce (in cima) o causati da a deflessione di i baffi (in fondu). L'ombreggiatura grisgia indica periodi di deflessione di i baffi. o, Forme d'onda di luce di piccu è risposte di deflessione di i baffi. p, picchi di un solu tentativu, allineati cù a deviazione di i baffi in e cellule di l'esempiu. 0 indica a deviazione di i baffi (linea tratteggiata). q, velocità di attivazione di puntuazione z mediata da a pupulazione per tutte e cellule fotosensibili, allineata cù a deviazione di i baffi à u tempu zero (linea tratteggiata) (rossa) o timestamp generati aleatoriamente (grisgiu). r, Proporzione di unità fotosensibili modulate significativamente da a deviazione di i baffi (n = 3 ratti) (sinistra). Latenza di punta di u z-score (n = 3 ratti; n = 5 (verde chjaru), n = 4 (verde scuru) è n = 4 (cian) unità di modulazione di deflessione di i baffi per rattu) (destra). I dati sò espressi cum'è media ± deviazione standard
Dopu avemu dumandatu s'ellu u t-hCO puderia esse attivatu da stimuli sensoriali in vivo. Avemu trasplantatu hCO chì esprime l'indicatori di calciu geneticamente codificati GCaMP6 in ratti S1. Dopu à 150 ghjorni, avemu realizatu fotometria di fibra o imaging di calciu à dui fotoni (Fig. 4h è dati espansi, Fig. 10a). Avemu trovu chì e cellule t-hCO anu mostratu attività ritmica sincronizata (Figura 4i, Dati Espansi, Figura 10b è Video Supplementare 1). Per caratterizà l'attività massima di t-hCO, avemu realizatu registrazioni elettrofisiologiche extracellulari in ratti trapiantati anestetizzati (dati espansi, Fig. 10c-f). Avemu generatu coordinate stereotassiche da immagini MRI; cusì, queste unità registrate rapprisentanu putativi neuroni umani, ancu se l'elettrofisiologia da sola ùn permette micca di determinà una spezia d'origine. Avemu osservatu scoppi di attività sincronizati (dati espansi, Fig. 10d). I scoppi sò durati circa 460 ms è eranu separati da periodi di silenziu di circa 2 s (dati espansi, Fig. 10d, e). L'unità individuali anu sparatu una media di circa trè colpi per scoppiu, chì hè circa u 73% di l'unità registrate per scoppiu. L'attività di l'unità individuali eranu altamente correlate, è queste correlazioni eranu più alte di quelle di l'unità identificate in animali non vaccinati registrati in e stesse condizioni (dati espansi, Fig. 10f). Per caratterizà ulteriormente e risposte à i picchi di i neuroni derivati ​​da l'omu identificati, avemu realizatu esperimenti di marcatura à luce nantu à ratti anestetizzati trapiantati cù hCO chì esprime u canale cationicu sensibile à a luce rodopsina 2 (hChR2), attraversu u quale i neuroni t-hCO anu un ricunniscenza à corta latenza (menu di 10 ms) in risposta à stimuli di luce blu (Fig. 4m-o). I neuroni t-hCO anu mostratu scoppi d'attività spontanea à frequenze simili à quelle osservate in l'imaghjini di calciu, è ancu registrazioni elettrofisiologiche realizate in t-hCO in assenza di marcatura luminosa (dati espansi, Fig. 10c-g). Nisuna attività spontanea hè stata osservata in e fasi currispondenti di hCO registrate in vitro. Per valutà se t-hCO puderia esse attivatu da stimuli sensoriali, avemu deviatu brevemente i baffi di rattu luntanu da t-hCO (Fig. 4j,m è dati espansi, Fig. 10h,k). Sicondu studii precedenti8,10, un sottoinsieme di cellule t-hCO hà mostratu una maggiore attività in risposta à a deflessione di i baffi, chì ùn hè stata osservata quandu i dati sò stati paragunati cù timestamp aleatorii (Fig. 4k-q è dati espansi, Fig. 10h-q). Infatti, circa u 54% di e singole unità opto-marcate anu mostratu un tassu di eccitazione significativamente aumentatu dopu a stimulazione di i baffi, cù un piccu di circa 650 ms (Fig. 4r). Pigliati inseme, sti dati suggerenu chì u t-hCO riceve input funziunali adatti è pò esse attivatu da stimuli ambientali.
Avemu dopu investigatu se u t-hCO puderia attivà circuiti in i ratti per cuntrullà u cumpurtamentu. Avemu prima investigatu se l'assoni di i neuroni t-hCO prughjettanu in i tessuti circundanti di u ratu. Avemu infettatu hCO cù un lentivirus chì codifica hChR2 fusu à EYFP (hChR2-EYFP). Dopu à 110 ghjorni, avemu osservatu l'espressione di EYFP in e regioni corticali ipsilaterali, cumprese e cortecce auditive, motorie è somatosensoriali, è ancu in e regioni subcorticali, cumprese u striatu, l'ippocampu è u talamu (Fig. 5a). Per valutà se queste pruiezioni efferenti puderianu suscità risposte sinaptiche in e cellule di u ratu, avemu attivatu otticamente e cellule t-hCO chì esprimenu hChR2-EYFP registrendu e cellule di a corteccia cerebrale di u ratu in sezioni cerebrali nitide. L'attivazione di l'assoni t-hCO cù luce blu hà indottu EPSC à corta latenza in neuroni di a corteccia piramidale di u ratu, chì sò stati bluccati da NBQX (Fig. 5b-g). Inoltre, queste risposte puderanu esse bluccate da a tetrodotossina (TTX) è restaurate da a 4-aminopiridina (4-AP), ciò chì suggerisce ch'elle sò state causate da cunnessione monosinaptiche (Fig. 5e).
a, Schema di u tracciamentu di l'assoni (à manca). Espressione di t-hCO EYFP (à diritta). Barra di scala, 100 µm. A1, corteccia auditiva, ACC, corteccia cingulata anteriore, d. striatu, striatu dorsale, HPC, ippocampu; Diaframma, settu laterale, mPFC, corteccia prefrontale mediale, piri, corteccia piriforme, v. striatu, striatu ventrale, VPM, nucleu ventropostomediale di u talamu, VTA, regione tegmentale ventrale. I quadrati rossi rapprisentanu e zone di u cervellu induve sò state scattate l'imagine. b, Schema di l'esperimentu di stimulazione. c, d, Esempi di a risposta di a fotocorrente indotta da a luce blu (in cima) è di a tensione (in fondu) in cellule umane (c) EYFP+ t-hCO o di rattu (d) EYFP-. e, f, Tracce attuali di neuroni di rattu dopu a stimulazione cù luce blu di l'assoni t-hCO cù TTX è 4-AR (verde), TTX (grisgiu) o aCSF (neru) (e), cù (viola) o senza (neru)) NBQX (e). g, latenza di e risposte indotte da a luce blu in e cellule di rattu (n = 16 cellule); e barre orizzontali indicanu a latenza media (7,13 ms) (sinistra). Ampiezza di EPSC evocati da a luce registrati cù o senza NBQX (n = 7 cellule; ***P < 0,0001) (mezu). Ampiezza di EPSC evocati da a luce registrati cù o senza NBQX (n = 7 cellule; ***P < 0,0001) (mezu). Амплитуда вызванных светом EPSC, зарегистрированных с или без NBQX (n = 7 клеток; ***P <0,0001) (в трецен). Ampiezza di EPSC indotte da a luce registrate cù o senza NBQX (n = 7 cellule; ***P < 0,0001) (centru).使用或不使用NBQX 记录的光诱发EPSC 的振幅（n = 7 个细胞；***P < 0.0001）（中）。使用或不使用NBQX 记录的光诱发EPSC 的振幅（n = 7 个细胞；***P < 0.0001）（中）。 Амплитуда вызванных светом EPSC, зарегистрированных с или без NBQX (n = 7 клеток; ***P <0,0001) (в трецен). Ampiezza di EPSC indotte da a luce registrate cù o senza NBQX (n = 7 cellule; ***P < 0,0001) (centru).Percentuale di cellule di rattu chì mostranu EPSC chì rispondenu à a luce blu (à diritta). h, Schema di un compitu cumportamentale. d0, ghjornu 0. i. Prestazione di animali esemplari u ghjornu 1 (à manca) o u ghjornu 15 (à diritta) di furmazione. U numeru mediu di leccate realizate u ghjornu 1 (sinistra) o u ghjornu 15 (centru à diritta) (n = 150 prove cù luce blu, n = 150 prove cù luce rossa; ***P < 0,0001). U numeru mediu di leccate realizate u ghjornu 1 (sinistra) o u ghjornu 15 (centru à diritta) (n = 150 prove cù luce blu, n = 150 prove cù luce rossa; ***P < 0,0001). Среднее количество облизываний, выполненных в день 1 (слева) или день 15 (в центре спра 150 (в центре справа150) синим светом, n = 150 испытаний с красным светом ***P <0,0001). Numeru mediu di leccate realizate u ghjornu 1 (sinistra) o u ghjornu 15 (centru à diritta) (n = 150 prove cù luce blu, n = 150 prove cù luce rossa; ***P < 0,0001).第1 天（左）或第15 天（右中）执行的平均舔次数（n = 150 次蓝光试验（n = 150次红光试验；***P < 0.0001）。第1 天（左）或第15 天（右中）执行的平均舔次数（n = 150 次蓝光试验（n = 150次红光试验；***P < 0.001 Среднее количество облизываний, выполненных в день 1 (слева) или день 15 (в центре спра 150 (в центре справа150) синим светом, n = 150 испытаний с красным светом ***P <0,0001). Numeru mediu di leccate realizate u ghjornu 1 (sinistra) o u ghjornu 15 (centru à diritta) (n = 150 prove cù luce blu, n = 150 prove cù luce rossa; ***P < 0,0001).Leccate cumulative per e prove di luce rossa è blu u ghjornu 1 (centru sinistra) o u ghjornu 15 (destra). NS, micca significativu. j,k, Caratteristiche cumportamentali di tutti l'animali trapiantati cù t-hCO chì esprimenu hChR2-EYFP (j) o fluoroforu di cuntrollu (k) u ghjornu 1 o 15 (hChR2-EYFP: n = 9 ratti, ** P = 0,0049; cuntrollu: n = 9, P = 0,1497). l, Evoluzione di u puntuatu di preferenza (n = 9 hChR2, n = 9 cuntrollu; **P < 0,001, ***P < 0,0001). l, Evoluzione di u puntuatu di preferenza (n = 9 hChR2, n = 9 cuntrollu; **P < 0,001, ***P < 0,0001). l, Эволюция показателя предпочтения (n = 9 hChR2, n = 9 контрольных; **P <0,001, ***P <0,0001). l, Evoluzione di u puntuatu di preferenza (n = 9 hChR2, n = 9 cuntrolli; **P < 0,001, ***P < 0,0001). l，偏好评分的演变（n = 9 hChR2，n = 9 对照；**P <0,001，***P <0,0001）。 l，偏好评分的演变（n = 9 hChR2，n = 9 对照；**P <0,001，***P <0,0001）。 l, Эволюция показателей предпочтения (n = 9 hChR2, n = 9 контролей; **P <0,001, ***P <0,0001). l, Evoluzione di i punteggi di preferenza (n = 9 hChR2, n = 9 cuntrolli; **P < 0,001, ***P < 0,0001).m, espressione di FOS in risposta à l'attivazione optogenetica di t-hCO in S1. L'imagine di l'espressione FOS (à manca) è a quantificazione (n = 3 per gruppu; *P < 0,05, **P < 0,01 è ***P < 0,001) (à diritta) sò mostrate. L'imagine di l'espressione FOS (à manca) è a quantificazione (n = 3 per gruppu; *P < 0,05, **P < 0,01 è ***P < 0,001) (à diritta) sò mostrate. Показаны изображения экспрессии FOS (слева) и количественного определения (n = 3 на групрессии, <0,0, * P** P**, <0,0 P**, <0,0 P** P <0,001) (справа). L'imagine di l'espressione FOS (à manca) è di a quantificazione (n = 3 per gruppu; *P<0,05, **P<0,01, è ***P<0,001) sò mostrate (à diritta).显示了FOS 表达（左）和量化（每组n = 3；*P < 0.05、**P < 0.01 和***P < 0.001）（右倂（右）显示了FOS 表达（左）和量化（每组n = 3；*P < 0.05、**P < 0.01 和***P < 0.001）（右倂（右） Показаны изображения экспрессии FOS (слева) и количественного определения (n = 3 на групрессии, <0,0, * P** P**, <0,0 P**, <0,0 P** P <0,001) (справа). L'imagine di l'espressione FOS (à manca) è di a quantificazione (n = 3 per gruppu; *P<0,05, **P<0,01, è ***P<0,001) sò mostrate (à diritta).Barra di scala, 100 µm. I dati sò espressi cum'è media ± errore standard di BLA, tonsilla basolaterale, MDT, nucleu talamicu dorsomediale, PAG, grisgiu periacqueduttale.
Infine, avemu dumandatu s'ellu u t-hCO puderia modulà u cumpurtamentu di i ratti. Per pruvà questu, avemu trasplantatu hCO chì esprime hChR2-EYFP in S1, è 90 ghjorni dopu, avemu impiantatu fibre ottiche in t-hCO per a consegna di luce. Dopu avemu furmatu i ratti cù un paradigma di cundiziunamentu operante mudificatu (Fig. 5h). Avemu piazzatu l'animali in una camera di test cumportamentale è avemu applicatu à casu stimuli laser blu (473 nm) è rossi (635 nm) di 5 secondi. L'animali anu ricevutu una ricumpensa d'acqua s'elli leccavanu durante a stimulazione cù luce blu, ma ùn leccavanu micca durante a stimulazione cù luce rossa. U primu ghjornu di furmazione, l'animali ùn anu mostratu alcuna differenza in u leccamentu quandu sò stati stimulati cù luce blu o rossa. Tuttavia, u ghjornu 15, l'animali trasplantati cù hCO chì esprime hChR2-EYFP anu mostratu leccamenti più attivi quandu sò stati stimulati cù luce blu paragunatu à a stimulazione cù luce rossa. Questi cambiamenti in u cumpurtamentu di leccamentu ùn sò stati osservati in l'animali di cuntrollu trasplantati cù hCO chì esprimenu u fluoroforu di cuntrollu (tassa di successu di l'apprendimentu: hChR2 89%, EYFP 0%, Figura 5i-1 è Video Supplementare 2). Questi dati suggerenu chì e cellule t-hCO ponu attivà i neuroni di u rattu per stimulà u cumpurtamentu di ricerca di ricumpensa. Per scopre quali circuiti neurali t-hCO di u rattu puderanu esse implicati in questi cambiamenti cumportamentali, avemu attivatu optogeneticamente t-hCO in animali addestrati è raccoltu tessuti 90 minuti dopu. L'immunoistochimica hà rivelatu l'espressione di a proteina FOS dipendente da l'attività in parechje regioni di u cervellu implicate in u cumpurtamentu motivatu, cumprese a corteccia prefrontale mediale, u talamu mediale è a materia grisgia periacqueduttale, chì hè stata espressa sia in animali di cuntrollu micca stimulati sia in animali. risu. 5m). Pigliati inseme, questi dati suggerenu chì t-hCO pò modulà l'attività neuronale di u rattu per guidà u cumpurtamentu.
L'organoidi neurali rapprisentanu un sistema promettente per studià u sviluppu umanu è e malatie in vitro, ma sò limitati da a mancanza di cunnessione trà i circuiti chì esistenu in vivo. Avemu sviluppatu una nova piattaforma in a quale avemu trasplantatu hCO in S1 di ratti postnatali precoci immunocompromessi per studià u sviluppu è a funzione di e cellule umane in vivo. Avemu dimustratu chì t-hCO sviluppa tipi di cellule mature micca osservati in vitro28 è chì t-hCO hè anatomicamente è funziunalmente integratu in u cervellu di i roditori. L'integrazione di t-hCO in i circuiti neurali di i roditori ci hà permessu di stabilisce un ligame trà l'attività cellulare umana è u cumpurtamentu animale studiatu, dimustrendu chì i neuroni t-hCO ponu modulà l'attività neuronale di i ratti per guidà e risposte cumportamentali.
A piattaforma chì descrivemu hà parechji vantaghji rispetto à a ricerca precedente nantu à u trapianto di cellule umane in cervelli di roditori. Prima, avemu trapiantatu hCO in a corteccia in sviluppu di ratti postnatali precoci, ciò chì pò facilità l'integrazione anatomica è funzionale. Siconda, u monitoraghju MRI di t-hCO ci hà permessu di studià a pusizione è a crescita di l'innesto in animali vivi, permettendoci di realizà studii multi-animali à longu andà è di stabilisce l'affidabilità di parechje linee cellulari hiPS. Infine, avemu trapiantatu organoidi intatti, invece di sospensioni di cellule singole isolate, chì sò menu distruttive per e cellule umane è ponu prumove l'integrazione è a generazione di neuroni di a corteccia umana in cervelli di ratti.
Ricunnoscemu chì, malgradu i progressi in questa piattaforma, i vincoli temporali, spaziali è interspecifici impediscenu a furmazione di circuiti neurali umani cù alta fedeltà, ancu dopu u trapianto in una fase iniziale di sviluppu. Per esempiu, ùn hè chjaru se l'attività spontanea osservata in t-hCO rapprisenta un fenotipu di sviluppu simile à l'attività ritmica osservata durante u sviluppu corticale, o se hè dovuta à l'assenza di tipi di cellule suppressive presenti in t-hCO. In listessu modu, ùn hè chjaru in chì misura l'assenza di laminazione in t-hCO affetta a connettività di a catena30. U travagliu futuru si concentrerà nantu à l'integrazione di altri tipi di cellule cum'è a microglia umana, e cellule endoteliali umane è proporzioni variabili di interneuroni GABAergici cum'è mostratu aduprendu l'assemblea 6 in vitro, è ancu nantu à a comprensione di cumu l'integrazione è l'elaborazione neurale ponu accade in livelli alterati di t-hCO trascrizionali, sinaptici è cumportamentali in cellule ottenute da i pazienti.
In generale, sta piattaforma in vivo rapprisenta una risorsa putente chì pò cumplementà u sviluppu di u cervellu umanu in vitro è a ricerca nantu à e malatie. Anticipemu chì sta piattaforma ci permetterà di scopre novi fenotipi à livellu di filamentu in cellule derivate da i pazienti altrimenti sfuggenti è di testà nuove strategie terapeutiche.
Avemu generatu hCO2.5 da e cellule HiPS cum'è descrittu prima. Per inizià a pruduzzione di hCO da e cellule hiPS cultivate nantu à strati alimentatori, e culonie intatte di cellule hiPS sò state rimosse da e piastre di cultura aduprendu dispasi (0,35 mg/mL) è trasferite in culture di plastica à attaccamentu ultra bassu chì cuntenenu piastre cù mezu di cultura cellulare hiPS. (Corning) supplementatu cù dui inibitori SMAD dorsomorfina (5 μM; P5499, Sigma-Aldrich) è SB-431542 (10 μM; 1614, Tocris) è l'inibitore ROCK Y-27632 (10 μM; S1049, Selleckchem). Durante i primi 5 ghjorni, u mezu di cultura cellulare hiPS hè statu cambiatu ogni ghjornu è sò stati aghjunti dorsomorfina è SB-431542. U sestu ghjornu in suspensione, i sferoidi neurali sò stati trasferiti in un mezu neurale chì cuntene neurobasal-A (10888, Life Technologies), supplementu B-27 senza vitamina A (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies), penicillina è streptomicina (1:100, Life Technologies) è supplementati cù u fattore di crescita epidermica (EGF; 20 ng ml−1; R&D Systems) è u fattore di crescita di fibroblasti 2 (FGF2; 20 ng ml−1; R&D Systems) finu à u ghjornu 24. Da u ghjornu 25 à u ghjornu 42, u mezu hè statu supplementatu cù fattore neurotroficu derivatu da u cervellu (BDNF; 20 ng ml−1, Peprotech) è neurotrofina 3 (NT3; 20 ng ml−1; Peprotech) cù cambiamenti di mezu ogni dui ghjorni. U sestu ghjornu in suspensione, i sferoidi neurali sò stati trasferiti in un mezu neurale chì cuntene neurobasal-A (10888, Life Technologies), supplementu B-27 senza vitamina A (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies), penicillina è streptomicina (1:100, Life Technologies) è supplementati cù u fattore di crescita epidermica (EGF; 20 ng ml−1; R&D Systems) è u fattore di crescita di fibroblasti 2 (FGF2; 20 ng ml−1; R&D Systems) finu à u ghjornu 24. Da u ghjornu 25 à u ghjornu 42, u mezu hè statu supplementatu cù fattore neurotroficu derivatu da u cervellu (BDNF; 20 ng ml−1, Peprotech) è neurotrofina 3 (NT3; 20 ng ml−1; Peprotech) cù cambiamenti di mezu ogni dui ghjorni.U sestu ghjornu in suspensione, i sferoidi neurali sò stati trasferiti in un mezu neurale chì cuntene Neurobasal-A (10888, Life Technologies), supplementu B-27 senza vitamina A (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies), penicillina.и стрептомицин (1:100, Life Technologies) è дополнены эпидермальным фактором роста (EGF; 20 нг/мл; R&D Systems) и фактором роста фибробластов 2 (FGF2; 20 нг/мл; R&D Systems) до 24-го дня. è streptomicina (1:100, Life Technologies) è supplementatu cù fattore di crescita epidermica (EGF; 20 ng/ml; R&D Systems) è fattore di crescita di fibroblasti 2 (FGF2; 20 ng/ml; R&D Systems) finu à u ghjornu 24.Da i ghjorni 25 à 42, u fattore neurotroficu derivatu da u cervellu (BDNF; 20 ng ml-1, Peprotech) è a neurotrofina 3 (NT3; 20 ng ml-1, Peprotech) sò stati aghjunti à u mezu, cambiendu u mezu ogni dui ghjorni.在悬浮的第6 天，将神经球体转移到含有neurobasal-A（10888，Life Technologies）、不含维生素-A27补充剂（12587，Life Technologies）、GlutaMax（1:100，Life Technologies）、青霉素的神经培养基中和链霉（1000，Life Technologies）并辅以表皮生长因子（EGF；20 ng ml-1；R&D Systems）和成纤维细胞生长因子2（FGF2；20 ng ml-1；R&D Systems）直至第24 天。在 悬浮 的 第 第 6 天 将 神经 球体 转移 含有 含有 neurobasal-a （10888 ， Life Technologies， a Life Technologies） 縠 含有b-27 补充剂 （12587 ， Life Technologies） Glutamax （1: 100 ， Life TechNOGIS青霉素 的 神经 培养 基 中 链1（ （ 100 Technologies） 表皮 生长 因子 （（（20 ng ml-1 ； R & D Systems） 成 纤维 细胞 生长 2 （fgf2 ； 20 ng ml- 1；R&D Systems）直至穬㬀24宬 На 6-й день суспензии нейросферы были переведены на добавку, содержащую нейробащую нейробаферы были переведены на добавку, содержащую нейробащую нейробаферы (10базал88), На базал88 В-27 без витамина А (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies), пенициллин- нейтрализованный стрептомицин, (1:) Life Technologies добавлением эпидермального фактора роста (EGF; 20 нг мл-1; R&D Systems) è фактора роста фибробластов 2 (FGF2; 20 нг мл-1) 1; U ghjornu 6, e suspensioni di neurosfere sò state cambiate à un supplementu chì cuntene neurobasal-A (10888, Life Technologies), supplementu B-27 senza vitamina A (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies), streptomicina neutralizzata da penicillina (1:100, Life Technologies) supplementata cù fattore di crescita epidermica (EGF; 20 ng ml-1; R&D Systems) è fattore di crescita di fibroblasti 2 (FGF2; 20 ng ml-1) 1; Sistemi R&D) до 24-го дня. Sistemi di R&D) finu à u ghjornu 24.Da i ghjorni 25 à 42, u fattore neurotroficu derivatu da u cervellu (BDNF; 20 ng ml-1, Peprotech) è u fattore neurotroficu 3 (NT3; 20 ng ml-1, Peprotech) sò stati aghjunti à u mezu di cultura ogni dui ghjorni. Cambiate u mezu una volta.À partesi da u ghjornu 43, l'hCO hè statu mantinutu in un mediu neurobasale-A senza supplementu (NM; 1088022, Thermo Fisher) cù un cambiamentu di mediu ogni 4-6 ghjorni. Per ottene hCO da e cellule hiPS cultivate in cundizioni senza alimentatore, e cellule hiPS sò state incubate cù Accutase (AT-104, Innovate Cell Technologies) à 37°C per 7 minuti, dissociate in cellule singole è piastrate nantu à piastre AggreWell 800 (34815, STEMCELL Technologies) à una densità di 3 × 106 cellule singole per pozzettu in un mediu Essential 8 supplementatu cù l'inibitore ROCK Y-27632 (10 μM; S1049, Selleckchem). Dopu à 24 ore, i mezi in i pozzi sò stati pipettati in su è in giù in mezi chì cuntenenu mezi Essential 6 (A1516401, Life Technologies) supplementati cù dorsomorfina (2,5 μM; P5499, Sigma-Aldrich) è SB-431542 (10 μM; 1614). , Tocrida). Da u ghjornu 2 à u 6, u mezu Essential 6 hè statu rimpiazzatu ogni ghjornu cù dorsomorfina è supplementu SB-431542. Da u sestu ghjornu, e suspensioni di neurosfere sò state trasferite à u mezu neurobasale è mantenute cum'è descrittu sopra.
Tutte e procedure per l'animali sò state realizate in cunfurmità cù e linee guida per a cura di l'animali appruvate da u Cumitatu Amministrativu per a Cura di l'Animali di Laboratoriu di l'Università di Stanford (APLAC). I ratti eutimici RNU (rnu/+) incinti sò stati acquistati (Charles River Laboratories) o allughjati. L'animali sò stati tenuti in un ciclu di luce-scurità di 12 ore cù alimentu è acqua ad libitum. I cuccioli di ratti nudi (FOXN1–/–) di età trà trè è sette ghjorni sò stati identificati da a crescita di baffi immaturi prima di l'abbattimentu. I cuccioli (maschi è femine) sò stati anestetizzati cù 2-3% isoflurano è posti nantu à un quadru stereotassicu. Una trapanazione di u craniu cù un diametru di circa 2-3 mm sopra S1 hè stata realizata mantenendu l'integrità di a dura madre. Dopu, aduprate un agulla di 30-G (circa 0,3 mm) appena fora di a craniotomia per perforà a dura madre. Dopu, applicate HCO3 à un parafilm sottile di 3×3 cm è rimuovete u mezu in eccessu. Cù una siringa Hamilton attaccata à un agulla 23 G, 45°, aspirate delicatamente hCO3 in l'estremità più distale di l'agulla. Poi installate a siringa nantu à a pompa di siringa cunnessa à u dispusitivu stereotassicu. Poi mette a punta di l'agulla sopra un foru di puntura di 0,3 mm di larghezza fattu prima in a dura madre (z = 0 mm) è restringete a siringa di 1-2 mm (z = circa -1,5 mm) finu à chì l'agulla sia trà a dura madre A. Si forma una sigillatura densa. Poi alzate a siringa à u centru di a superficia corticale à z = -0,5 mm è iniettate hCO3 à una velocità di 1-2 µl per minutu. Dopu à a fine di l'iniezione di hCO3, l'agulla hè ritratta à una velocità di 0,2-0,5 mm per minutu, a pelle hè suturata è u cucciolu hè immediatamente piazzatu nantu à un cuscinettu riscaldante finu à a cumpleta guarigione. Certi animali sò stati trapiantati bilateralmente.
Tutte e procedure animali sò state realizate in cunfurmità cù e linee guida per a cura di l'animali appruvate da l'APLAC di l'Università di Stanford. I ratti (più di 60 ghjorni dopu u trapianto) sò stati indotti cù anestesia à 5% d'isoflurane è anestetizzati cù 1-3% d'isoflurane durante l'imaghjini. Per a visualizazione, hè statu utilizatu un scanner di fori orizzontali schermati attivamente da 7 Tesla Bruker (Bruker Corp.) cù un azionamentu à gradiente di l'International Electric Company (IECO), un insertu à gradiente schermatu cù un diametru internu di 120 mm (600 mT/m, 1000 T/m/s) utilizendu AVANCE. III, capacità RF multi-bobina à ottu canali è multi-core, è a piattaforma Paravision 6.0.1 chì l'accumpagna. A registrazione hè stata realizata utilizendu una bobina RF volumetrica disaccoppiata attivamente cù un diametru internu di 86 mm è una bobina RF raffreddata criogenica à quattru canali solu per a ricezione. Turbo-RARE 2D assiale (tempu di ripetizione = 2500 ms, tempu d'ecu = 33 ms, 2 medie) cù 16 catture di fetta, spessore di fetta 0,6–0,8 mm, cuntenendu 256 × 256 campioni. I signali sò stati ricevuti aduprendu una bobina RF volumetrica di transceiver in quadratura cù un diametru internu di 2 cm (Rapid MR International, LLC). Infine, aduprate e funzioni di stima di a superficia Imaris (BitPlane) integrate per u rendering 3D è l'analisi di u vulume. Un trapianto riesciutu hè statu definitu cum'è quellu in u quale sò state furmate zone di signale MRI ponderatu in T2 cuntinuu in l'emisferu trapiantatu. U rigettu di l'injertu hè statu definitu cum'è un injertu chì ùn hà micca pruduttu zone di signale MRI ponderatu in T2 cuntinuu in l'emisferu trapiantatu. A t-hCO subcorticale hè stata esclusa da l'analisi successive.
Per sprime stabilmente GCaMP6s in hCO per l'imaghjini di calciu à dui fotoni, e cellule hiPS sò state infettate cù pLV[Exp]-EF1a::GcaMP6s-WPRE-Puro seguitate da a selezzione di antibiotici. In breve, e cellule sò state dissociate cù EDTA è sospese in 1 ml di mezu Essential 8 à una densità di circa 300.000 cellule in presenza di polibrene (5 μg/ml) è 15 μl di virus. E cellule sò state poi incubate in sospensione per 60 minuti è seminate à una densità di 50.000 cellule per pozzetto. Dopu a confluenza, e cellule sò state trattate cù 5-10 μg ml-1 puromicina per 5-10 ghjorni o finu à chì sò apparse culonie stabili. L'infezione acuta da hCO hè stata realizata cum'è descrittu prima5 cù alcune mudificazioni. In breve, trasferisce u ghjornu 30-45 di hCO in tubi per microcentrifuga Eppendorf da 1,5 ml chì cuntenenu 100 µl di mezu nervosu. Dopu, circa 90 µl di u mezu sò rimossi, 3-6 µl di lentivirus à altu titulu (da 0,5 x 108 à 1,2 x 109) sò aghjunti à u tubu, è l'hCO hè trasferitu à l'incubatore per 30 minuti. Dopu, aghjunghje 90-100 µl di mezu à ogni tubu è rimette i tubi à l'incubatore durante a notte. U ghjornu dopu, trasferisce l'hCO à u mezu nervosu frescu in piastre à bassa attaccatura. Dopu à 7 ghjorni, l'hCO hè statu trasferitu à piastre cù fondu di vetru à 24 pozzetti per a visualizazione è a valutazione di a qualità di l'infezione. pLV[Exp]-SYN1::EYFP-WPRE è pLV[Exp]-SYN1::hChR2-EYFP-WPRE sò stati generati da VectorBuilder. U lentivirus hè utilizatu in a maiò parte di l'esperimenti perchè hè integratu in u genomu ospite, permettendu l'espressione di u genu reporter in linee cellulari infettate. Per u seguitu di a rabbia, u ghjornu 30-45, l'hCO hè statu coinfettatu cù rabies-ΔG-eGFP è AAV-DJ-EF1a-CVS-G-WPRE-pGHpA (plasmid #67528, Addgene), lavatu accuratamente per 3 ghjorni, è trasplantatu in ratti in S1 è mantinutu in vivo per 7-14 ghjorni.
Per l'immunocitochimica, l'animali sò stati anestetizzati è perfusi transcardialmente cù PBS seguitatu da 4% paraformaldeide (PFA in PBS; Electron Microscopy Sciences). I cervelli sò stati fissati in 4% PFA per 2 ore o tutta a notte à 4°C, crioconservati in 30% saccarosio in PBS per 48-72 ore, è inclusi in 1:1, 30% saccarosio: OCT (Tissue-Tek OCT Compound 4583, Sakura Finetek) è e sezioni coronali sò state fatte à 30 µm aduprendu un criostato (Leica). Per l'immunoistochimica di sezioni spesse, l'animali sò stati perfusi cù PBS, è u cervellu hè statu dissezionatu è sezionatu coronalmente à 300-400 µm aduprendu un vibratomu (Leica) è e sezioni sò state fissate cù 4% PFA per 30 minuti. Dopu, e criosezioni o e sezioni spesse sò state lavate cù PBS, bluccate per 1 ora à temperatura ambiente (10% di serum d'asino nurmale (NDS) è 0,3% di Triton X-100 diluitu in PBS) è bluccate cù una soluzione bloccante à 4 ° C. - Incubazione E criosezioni sò state incubate durante a notte è e sezioni spesse sò state incubate per 5 ghjorni. L'anticorpi primari utilizati eranu: anti-NeuN (topu, 1:500; ab104224, abcam) anti-CTIP2 (ratu, 1:300; ab18465, abcam), anti-GFAP (cunigliulu, 1:1.000; Z0334, Dako), anti-GFP (pollu, 1:1.000; GTX13970, GeneTex), anti-HNA (topu, 1:200; ab191181, abcam), anti-NeuN (cunigliulu, 1:500; ABN78, Millipore), anti-PDGFRA (cunigliulu, 1:200; sc-338, Santa Cruz), anti-PPP1R17 (cunigliulu, 1:200; HPA047819, Atlas Antibodies), anti-RECA-1 (topu, 1:50;). ab9774, abcam), anti-SCG2 (cunigliulu, 1:100; 20357-1-AP, Proteintech), anti-SOX9 (capra, 1:500; AF3075, R&D Systems), Netrin G1a (capra, 1:100; AF1166, R&D Systems), anti-STEM121 (topu, 1:200; Y40410, Takara Bio), anti-SATB2 (topu, 1:50; ab51502, abcam), anti-GAD65/67 (cunigliulu, 1:400; ABN904, Millipore) è anti-IBA1 (capra, 1:100; ab5076, abcam). L'anticorpi primari utilizati eranu: anti-NeuN (topu, 1:500; ab104224, abcam) anti-CTIP2 (ratu, 1:300; ab18465, abcam), anti-GFAP (cunigliulu, 1:1.000; Z0334, Dako), anti-GFP (pollu, 1:1.000; GTX13970, GeneTex), anti-HNA (topu, 1:200; ab191181, abcam), anti-NeuN (cunigliulu, 1:500; ABN78, Millipore), anti-PDGFRA (cunigliulu, 1:200; sc-338, Santa Cruz), anti-PPP1R17 (cunigliulu, 1:200; HPA047819, Atlas Antibodies), anti-RECA-1 (topu, 1:50;). ab9774, abcam), anti-SCG2 (cunigliulu, 1:100; 20357-1-AP, Proteintech), anti-SOX9 (capra, 1:500; AF3075, R&D Systems), Netrin G1a (capra, 1:100; AF1166, R&D Systems), anti-STEM121 (topu, 1:200; Y40410, Takara Bio), anti-SATB2 (topu, 1:50; ab51502, abcam), anti-GAD65/67 (cunigliulu, 1:400; ABN904, Millipore) è anti-IBA1 (capra, 1:100; ab5076, abcam). Использовались следующие первичные антитела: анти-NeuN (мышиные, 1:500; ab104224, abcam), анти-CTIP:си2 (Использовались) ab18465, abcam), анти-GFAP (кроличьи, 1:1000; Z0334, Dako), анти- -GFP (курица, 1:1000; GTX13970, GeneTex), анти-HNA (1,1:1:1000), анти-HNA (1;1:1:1000) abcam), анти-NeuN (кролик, 1:500; ABN78, Millipore), анти-PDGFRA (кролик, 1:200; sc-338, Санта-Круз), анти-PPP1R17 (кролик, 1:200; HPA047819, Atlas Antibodies), анти-RECA-1 (мыш40, ab97:5ь, ab97:5ь; анти-SCG2 (кролик , 1:100; 20357-1-AP, Proteintech), анти-SOX9 (козий, 1:500; AF3075, Sistemi R&D), нетрин G1a (коз1060, 6, козий, 1:500; AF3075, Sistemi R&D), анти-STEM121 (мышиный , 1:200; Y40410, Takara Bio), анти-SATB2 (мышь, 1:50; ab51502, abcam), анти-GAD65/67 (кролик, 1:400; ABN904, Millipore) è анти-IBA1 (коза, 1:100; абббка, аббка, маб5076, бабка). L'anticorpi primari utilizati eranu: anti-NeuN (topu, 1:500; ab104224, abcam), anti-CTIP2 (ratu, 1:300; ab18465, abcam), anti-GFAP (cunigliulu, 1:1000; Z0334, Dako), anti-GFP (pollu, 1:1000; GTX13970, GeneTex), anti-HNA (topu, 1:200; ab191181, abcam), anti-NeuN (cunigliulu, 1:500; ABN78, Millipore), anti-PDGFRA (cunigliulu, 1:200; sc-338, Santa Cruz), anti-PPP1R17 (cunigliulu, 1:200; HPA047819, Atlas Antibodies), anti-RECA-1 (topu, 1:50;). ab9774, abcam), anti-SCG2 (cunigliulu, 1:100; 20357-1-AP, Proteintech), anti-SOX9 (capra, 1:500; AF3075, R&D Systems), netrina G1a (capra, 1:100; AF1166, R&D Systems), anti-STEM121 (topu, 1:200; Y40410, Takara Bio), anti-SATB2 (topu, 1:50; ab51502, abcam), anti-GAD65/67 (cunigliulu, 1:400; ABN904, Millipore) è anti-IBA1 (capra, 1:100; ab5076, abkam).使用的一抗是：抗NeuN（小鼠，1:500；ab104224，abcam）抗CTIP2（大鼠，1:3 00；ab18465，abcam），抗GFAP（兔，1:1,000；Z0334，Dako），抗-GF P（鸡，1:1,000；GTX13970，GeneTex），抗HNA（小鼠，1:200；ab1911 81，abcam），抗NeuN（兔，1:500；ABN78，Millipore），抗PDGFRA（兔， 1:200；sc-338，Santa Cruz），抗PPP1R17（兔，1:200；HPA047819，Atlas抗体），抗RECA-1（小鼠，1:50；ab9774，abcam），抗SCG2（兔）, 1:100；20357-1-AP，Proteintech），抗SOX9（山羊，1:500；AF3075，R&D Systems），Netrin G1a（山羊（山羊，1:10D66；AF3075，R&D Systems） Sistemi），抗STEM121（小鼠, 1:200;使用的一抗是：抗NeuN（小鼠，1:500；ab104224，abcam）抗CTIP2（大鼠，1 : 300；ab18465，abcam），抗GFAP（兔，1:1,000；Z0334，Dako），抗-GFP（鸡，1:1,000；GTX13970，GeneTex），抗HNA（小鼠，1:200；ab 191181，abcam），抗NeuN（兔，1:500；ABN78，Millipore％弔，抗1: 200；sc-338，Santa Cruz），抗PPP1R17（兔，1:200；HPA047819，Atlas抗体），抗RECA-1（小鼠，1:50；ab9774，abcam），抗SCG2 100；20357-1-AP，Proteintech），抗SOX9（山羊，1:500；AF3075，R&D Systems），Netrin G1a（屼羊（山羊，1:106；AFR&D； Sistemi）頏1:20, ;Y40410, Takara Bio), anti-SATB2 (topu, 1:50; ab51502, abcam), anti-GAD65/67 (cunigliulu, 1:400; ABN904, Millipore) è anti-IBA1 (capra, 1:100; ab5076, abcam).L'anticorpi primari utilizati eranu: anti-NeuN (topu, 1:500; ab104224, abcam), anti-CTIP2 (ratu, 1:300; ab18465, abcam), anti-GFAP (cunigliulu, 1:1000; Z0334, Dako). , anti-GFP (pollu, 1:1000; GTX13970, GeneTex), anti-HNA (topu, 1:200; ab191181, abcam), anti-NeuN (cunigliulu, 1:500; ABN78, Millipore), anti-PDGFRA (cunigliulu, 1:200; sc-338, Santa Cruz), anti-PPP1R17 (cunigliulu, 1:200; HPA047819, anticorpu Atlas), anti-RECA-1 (topu, 1:50; ab9774, abcam), anti-SCG2 (cunigliulu), 1:100;20357-1-AP, Proteintech), анти-SOX9 (коза, 1:500; AF3075, Sistemi R&D), Нетрин G1a (коза, 1:100; AF1166, Sistemi R&D), анти (коза, 1:500; AF3075, мы:12ь -STEM:12ь, -STEM, 1:121 Y40410, Takara Bio), анти-SATB2 (мышь, 1:50; ab51502, abcam), анти-GAD65/67 (кролик, 1:400; ABN904, Millipore) и анти-IBA1, ка6:за1 (; кролик, 1:400, Millipore) абкам). 20357-1-AP, Proteintech), anti-SOX9 (capra, 1:500; AF3075, R&D Systems), Netrin G1a (capra, 1:100; AF1166, R&D Systems), anti-STEM121 (topu, 1:200; Y40410, Takara Bio), anti-SATB2 (topu, 1:50; ab51502, abcam), anti-GAD65/67 (cunigliulu, 1:400; ABN904, Millipore), è anti-IBA1 (capra, 1:100; ab5076, abkam).E sezioni sò state poi lavate cù PBS è incubate cù anticorpi secundarii per 1 ora à temperatura ambiente (sezioni congelate) o per tutta a notte à 4°C (sezioni spesse). Hè statu utilizatu l'anticorpu secundariu Alexa Fluor (Life Technologies) diluitu 1:1000 in una soluzione bloccante. Dopu u lavaggiu cù PBS, i nuclei sò stati visualizati cù un Hoechst 33258 (Life Technologies). Infine, i vetrini sò stati posti nantu à un microscopiu cù vetrini coprioggetto (Fisher Scientific) utilizendu un Aquamount (Polysciences) è analizzati nantu à un microscopiu fluorescente Keyence (analizzatore BZ-X) o un microscopiu cunfocale Leica TCS SP8 (Las-X) nantu à l'immagine. L'immagine sò state trattate utilizendu u prugramma ImageJ (Fiji). Per quantificà a proporzione di neuroni umani in t-hCO è in a corteccia di u rattu, sò state scattate immagini rettangulari di 387,5 μm di larghezza à u centru di u t-hCO, à o vicinu à u bordu di a corteccia di u rattu. I margini di l'innestu sò stati determinati valutendu i cambiamenti in a trasparenza di i tessuti, i nuclei HNA+, è/o a presenza di autofluorescenza tissutale. In ogni imagine, u numeru tutale di cellule NeuN+ è HNA+ hè statu divisu per u numeru tutale di cellule NeuN+ in a stessa zona. Per assicurà chì solu e cellule cù nuclei in u pianu di l'imagine sianu cuntate, solu e cellule chì sò ancu Hoechst+ sò incluse in u calculu. Dui imagine separate da almenu 1 mm sò state mediate per riduce l'errore statisticu.
Una settimana prima di a raccolta di u campione, mette l'animali trasplantati cù hCO3 (circa 8 mesi di differenziazione) in una stanza scura cù i baffi tagliati per minimizà a stimulazione sensoriale. L'isolamentu di i nuclei hè statu realizatu cum'è descrittu prima, cù alcune mudificazioni. In breve, t-hCO3 è hCO3 sò stati distrutti utilizendu a lisi cellulare meccanica detergente è un macinatore di tessuti di vetru di 2 ml (D8938, Sigma-Aldrich/KIMBLE). I nuclei grezzi sò stati poi filtrati utilizendu un filtru di 40 µm è centrifugati à 320 g per 10 minuti à 4 °C prima di realizà un gradiente di densità di saccarosio. Dopu a fase di centrifugazione (320 g per 20 min à 4 °C), i campioni sò stati risospesi in 0,04% BSA/PBS cù l'aggiunta di 0,2 unità di inibitore di RNasi µl-1 (40 u µl-1, AM2682, Ambion) è passati per un filtru di flussu di 40 µm. I nuclei dissociati sò stati poi risospesi in PBS chì cuntene 0,02% BSA è caricati nantu à un chip Chromium Single Cell 3′ (recuperu stimatu di 8.000 cellule per corsia). E biblioteche snRNA-seq sò state preparate cù u Chromium Single cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics). E biblioteche snRNA-seq sò state preparate cù u Chromium Single cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics). Библиотеки snRNA-seq были приготовлены с помощью Chromium Single cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomica). E biblioteche snRNA-seq sò state preparate aduprendu Chromium Single cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics). snRNA-seq 文库是使用Chromium Single cell 3′ GEM、Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics) 制备的。 snRNA-seq 文库是使用Chromium Single cell 3′ GEM、Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics) 制备的。 Библиотеку snRNA-seq готовили с использованием Chromium Single Cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomica). A biblioteca snRNA-seq hè stata preparata aduprendu Chromium Single Cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics).E biblioteche di diversi campioni sò state raggruppate è sequenziate da Admera Health nantu à NovaSeq S4 (Illumina).
I livelli d'espressione genica per ogni presuntu codice à barre nucleare sò stati quantificati utilizendu u pacchettu di software d'analisi 10x Genomics CellRanger (versione 6.1.2). Specificamente, e letture sò state currispundenti à una cumbinazione di genomi di riferimentu umani (GRCh38, Ensemble, versione 98) è di rattu (Rnor_6.0, Ensemble, versione 100) creati cù u cumandamentu mkref è utilizendu count cù u cumandamentu –include-introns=TRUE per a quantificazione include letture mappate in regioni introniche. Per i campioni t-hCO, i nuclei umani sò stati identificati basendu si nantu à u requisitu cunservativu chì almenu u 95% di tutte e letture mappate currispondenu à u genomu umanu. Tutte l'analisi successive sò state realizate nantu à un array di codici à barre filtratu in uscita da CellRanger utilizendu u pacchettu R (versione 4.1.2) Seurat (versione 4.1.1)32.
Per assicurà chì solu i nuclei di alta qualità sianu inclusi in l'analisi successiva, hè statu implementatu un prucessu di filtrazione iterativu per ogni campione. Prima, i nuclei di bassa qualità cù menu di 1000 geni unichi truvati è più di u 20% di i mitocondri totali sò identificati è rimossi. In seguitu, a matrice di u numeru di geni grezzi hè stata nurmalizzata da una regressione binomiale negativa regularizata utilizendu a funzione sctransform(vst.flavor="v2", chì hà ancu identificatu i 3000 geni più variabili utilizendu parametri predefiniti. A riduzione di a dimensione hè stata effettuata nantu à i geni variabili superiori utilizendu l'Analisi di i Cumponenti Principali (PCA) cù parametri predefiniti utilizendu una dimensione di u set di dati di 30 (dims = 30 hè statu sceltu basatu annantu à l'ispezione visuale di i siti di u ghjinochju è utilizatu per tutti i campioni è l'analisi d'ensemble). Dopu avemu realizatu parechji cicli di clustering iterativu (risoluzione = 1) per classificà i geni basati annantu à un numeru di geni anormalmente bassu (mediana sottu à u 10u percentile), un numeru di geni mitocondriali anormalmente altu (mediana sopra à u 95u percentile) per identificà è rimuovere e cellule putative di bassa qualità. cluster è/o una alta proporzione di gemelli suspettati identificati utilizendu u pacchettu DoubletFinder33 (punteggio mediu DoubletFinder sopra à u 95u percentile). I campioni di t-hCO (n = 3) è i campioni di hCO (n = 3) sò stati integrati separatamente utilizendu a funzione IntegrateData cù i parametri sopra. Dopu Un altru ciclu di filtrazione qualitativa di u set di dati integratu hè statu realizatu cum'è descrittu sopra.
Dopu avè eliminatu i kernel di bassa qualità, u dataset integratu hè statu raggruppatu (risoluzione = 0,5) è integratu per scopi di visualizazione UMAP34. I geni marcatori per ogni cluster sò stati determinati utilizendu a funzione FindMarkers cù parametri predefiniti calculati da dati di espressione genica nurmalizzati. Identificemu è classifichemu e classi cellulari principali cumbinendu datasets di riferimentu corticali fetali è adulti cù l'espressione di geni marcatori 19,20,21,35 è l'annotazione. In particulare, i precursori circulanti sò stati identificati da l'espressione di MKI67 è TOP2A. I cluster progenitori sò stati definiti da l'assenza di trascritti mitotici, alta sovrapposizione cù cluster progenitori gliali multipotenti descritti in a corteccia fetale in metafase tardiva, è espressione di EGFR è OLIG1. Usemu u termine astrocita per abbraccià parechji stati di differenziazione di l'astrociti, da a glia radiale tardiva à a maturazione di l'astrociti. I cluster di astrociti esprimenu alti livelli di SLC1A3 è AQP4 è hè statu dimustratu chì si mappanu cù sottotipi di glia radiale fetale è/o astrociti adulti. L'OPC esprimenu PDGFRA è SOX10 mentre l'oligodendrociti esprimenu marcatori di mielinizazione (MOG è MYRF). I neuroni glutamatergici sò stati identificati da a presenza di trascritti neuronali (SYT1 è SNAP25), l'assenza di marcatori GABAergici (GAD2) è l'espressione di NEUROD6, SLC17A7, BCL11B, o SATB2. I neuroni GluN sò stati ulteriormente divisi in sottoclassi superiori (espressione SATB2 è perdita di BCL11B) è profonde (espressione BCL11B). I neuroni putativi di a sottopiastra (SP) esprimenu marcatori SP18 cunnisciuti cum'è ST18 è SORCS1 in più di i marcatori GluN profondi. E cellule simili à u plessu coroideu sò state identificate da l'espressione di TTR, è e cellule simili à e meningee anu espressu geni assuciati à i fibroblasti è anu mappatu e cellule piali/vasculari di u set di dati di riferimentu.
L'analisi differenziale di l'espressione genica trà e sottoclassi t-hCO è hCO hè stata realizata utilizendu un metudu pseudo-batch recentemente sviluppatu ripruduttu in campioni implementati utilizendu u pacchettu Libra R (versione 1.0.0). Specificamente, i testi di log-verosimiglianza edgeR (versione 3.36.0, pacchettu R) sò stati realizati per i gruppi summendu u numeru di geni in e cellule per una data classe cellulare per ogni replicazione di u campione. Per a visualizazione di a mappa di calore, i valori nurmalizzati per milione (CPM) sò calculati utilizendu edgeR (funzione cpm()) è scalati (per ottene media = 0, deviazione standard = 1). L'analisi di arricchimentu di Gene Ontology (GO) di geni t-hCO GluN significativamente sovraregulati hè stata realizata (valore P currettu da Benjamini-Hochberg inferiore à 0,05 espressu in almenu u 10% di e cellule t-hCO GluN è un aumentu di cambiamentu di almenu 2 volte). realizata utilizendu ToppGene Suite (https://toppgene.cchmc.org/)37. Adupremu l'applicazione ToppFun cù parametri predefiniti è riportemu i valori P curretti da Benjamini-Hochberg calculati da testi ipergeometrici annotati da GO.
Per abbinà i nostri cluster snRNA-seq cù cluster di cellule annotate da studii di riferimentu di RNA-seq unicellulare primariu o snRNA-seq adultu19,20,21,22, avemu applicatu un approcciu d'integrazione di dataset appaiati. Avemu utilizatu u flussu di travagliu di nurmalizazione SCTransform (v2) in Seurat per integrà è paragunà e sovrapposizioni di cluster trà i datasets (usendu i stessi parametri cum'è sopra). I datasets individuali sò stati subsettati aleatoriamente finu à 500 cellule o core per cluster originale per l'efficienza computazionale. Usendu un approcciu simile à quellu descrittu prima, a sovrapposizione di cluster hè stata definita cum'è a proporzione di cellule o nuclei in ogni cluster raggruppatu chì si sovrapponevanu cù l'etichetta di u cluster di riferimentu. Per classificà ulteriormente i GluN, avemu utilizatu u flussu di travagliu TransferData di Seurat per i dati di subset GluN per assignà etichette di dataset di riferimentu à e nostre cellule GluN.
Per valutà u statu di maturazione di u trascrittoma glubale di i campioni di t-hCO è hCO, avemu paragunatu i nostri campioni pseudo-bulk cù BrainSpan/psychENCODE23, chì hè custituitu da una grande sequenza di RNA chì abbraccia u sviluppu di u cervellu umanu. Avemu realizatu PCA nantu à una matrice di espressione genica nurmalizzata per mudelli cumminati da campioni corticali 10 settimane dopu à u cuncepimentu è dopu, in 5567 geni (inseme cù i nostri dati) chì eranu stati precedentemente identificati cum'è attivi in ​​i campioni corticali BrainSpan (definiti cum'è più di 50% in a varianza di u sviluppu spiegata da l'età utilizendu un mudellu cubicu)38. Inoltre, avemu derivatu geni assuciati à e principali firme trascrittoma di u neurosviluppu utilizendu a fattorizazione di matrice non negativa cum'è descrittu prima. I pesi di u campione calculati utilizendu a prucedura di fattorizazione di matrice non negativa sò tracciati in e Fig. 5b cù dati espansi per ognuna di e cinque firme descritte da Zhu et al.38. Ancu una volta, i marcatori trascrizionali dipendenti da l'attività sò stati derivati ​​da studii publicati prima. In particulare, ERG è LRG eranu significativamente sovraregulati in i neuroni glutamatergici identificati da a cullezzione snRNA-seq di a corteccia visuale di u topu dopu a stimulazione visuale da a Tabella Supplementare 3 Hrvatin et al.16. I LRG arricchiti in l'omu sò stati ottenuti da culture di cervellu fetale umanu attivate da KCl è raccolti 6 ore dopu a stimulazione, è i geni filtrati eranu significativamente sovraregulati in l'omu ma micca in i roditori (Tabella Supplementare 4). L'analisi di l'arricchimentu di u set di geni utilizendu questi set di geni hè stata realizata utilizendu un test esattu di Fisher à una via.
Anestetizà i ratti cù isofluranu, caccià i cervelli è metteli in una suluzione di saccarosiu fredda (circa 4°C) ossigenata (95% O2 è 5% CO2) per e sezioni chì cuntenenu: 234 mM di saccarosiu, 11 mM di glucosiu, 26 mM di NaHCO3, 2,5 mM di KCl, 1,25 mM di NaH2PO4, 10 mM di MgSO4 è 0,5 mM di CaCl2 (circa 310 mOsm). E sezioni coronali di cervellu di rattu (300-400 µm) chì cuntenenu t-hCO sò state fatte cù un vibratomu Leica VT1200 cum'è descrittu prima39. E sezioni sò state poi trasferite in una camera di sezionamentu cù ossigenazione cuntinua à temperatura ambiente chì cuntene aCSF preparatu da: 10 mM glucosiu, 26 mM NaHCO3, 2,5 mM KCl, 1,25 mM NaHPO4, 1 mM MgSO4, 2 mM CaCl2 è 126 mM NaCl (298 mOsm). almenu 45 minuti prima di a registrazione. E sezioni sò state registrate in una camera immersa induve sò state perfuse cuntinuamente cù aCSF (95% O2 è 5% CO2 fiala). Tutti i dati sò stati registrati à temperatura ambiente. I neuroni t-hCO sò stati terminati cù una pipetta di vetru borosilicatu piena di una soluzione chì cuntene 127 mM gluconatu di potassiu, 8 mM NaCl, 4 mM ATP di magnesiu, 0,3 mM GTP di sodiu, 10 mM HEPES è 0,6 mM EGTA, pH 7,2, soluzione interna aghjustata cù KOH (290 mOsm). Per ricuperà, a biocitina (0,2%) hè stata aghjunta à a suluzione di registrazione.
I dati sò stati acquistati cù un amplificatore MultiClamp 700B (Molecular Devices) è un digitalizzatore Digidata 1550B (Molecular Devices), filtrati à passa-bassu à 2 kHz, digitalizati à 20 kHz, è analizati cù Clampfit (Molecular Devices), Origin (OriginPro). 2021b, OriginLab). è funzioni MATLAB persunalizate (Mathworks). U putenziale di giunzione hè statu calculatu cù JPCalc è l'entrate sò state aghjustate à u valore calculatu di -14 mV. L'operazione IV consiste in una seria di passi di corrente in passi di 10-25 pA, da -250 à 750 pA.
U talamu, a sustanza bianca è l'afferenze S1 sò stati stimulati elettricamente in fette talamocorticali durante a registrazione patch-clamp di i neuroni hCO, cum'è descrittu prima. In breve, u cervellu hè statu piazzatu nantu à una tavola di stampa 3D inclinata à un angulu di 10°, è a parte anteriore di u cervellu hè stata tagliata à un angulu di 35°. U cervellu hè statu poi incollatu à a superficia tagliata è sezionatu, priservendu l'assoni sporgenti talamocorticali. Elettrodi bipolari di tungstenu (0,5 MΩ) sò stati muntati nantu à un secondu micromanipulatore è strategicamente posizionati per stimulà quattru regioni per cellula (capsula interna, sustanza bianca, S1 è hCO). Registrate e risposte sinaptiche dopu a stimulazione fasica di 300 µA à 0,03–0,1 Hz.
I neuroni hCO chì esprimenu hChR2 sò stati attivati ​​à 480 nm è l'impulsi di luce generati da un LED (Prizmatix) sò stati applicati attraversu un obiettivu ×40 (0.9 NA; Olympus) per registrà l'espressione di hChR2 vicinu à e cellule. U diametru di u campu illuminatu hè di circa 0.5 mm è a putenza tutale hè di 10-20 mW. A larghezza di l'impulsu hè stata impostata à 10 ms, chì currisponde à l'impulsu datu durante l'esperimentu di apprendimentu cumportamentale. Diverse frequenze di stimulazione sò state aduprate, da 1 à 20 Hz, ma solu u primu impulsu di a serie hè statu adupratu per a quantificazione. L'intervalli trà i treni sò generalmente più longhi di 30 s per minimizà l'effettu nantu à e vie inibitorie o facilitatrici sinaptiche. Per verificà se a risposta hChR2 era monosinaptica, avemu applicatu TTX (1 μM) à u bagnu finu à chì a reazione EPSC hè sparita, è dopu avemu applicatu 4-aminopiridina (4-AP; 100 μM). Tipicamente, una risposta hè restituita in pochi minuti, cù un ritardu ligeramente più longu trà l'accensione di LED è a generazione di EPSC. NBQX (10 μM) hè statu utilizatu per verificà se a risposta hè guidata da i receptori AMPA.
Sezioni di hCO nitide sò state create cum'è descrittu prima. In breve, e sezioni di hCO sò state incluse in agarosa à 4% è trasferite à cellule chì cuntenenu 126 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM NaH2PO4, 1 mM MgSO4, 2 mM CaCl2, 26 mM NaHCO3 è 10 mM d-(+)-glucosiu. E sezioni sò state tagliate à 200-300 µm à temperatura ambiente utilizendu un vibratore Leica VT1200 è conservate in ASF à temperatura ambiente. Dopu, a registrazione patch-camp di e cellule intere hè stata effettuata nantu à sezioni di hCO sottu à un microscopiu direttu SliceScope (Scientifica). E sezioni sò state perfuse cù aCSF (95% O2 è 5% CO2) è i signali cellulari sò stati registrati à temperatura ambiente. I neuroni hCO3 sò stati applicati aduprendu una pipetta di vetru borosilicatu piena di una suluzione chì cuntene 127 mM di gluconatu di potassiu, 8 mM di NaCl, 4 mM di ATP di magnesiu, 0,3 mM di GTP di sodiu, 10 mM di HEPES è 0,6 mM di EGTA, pH internu 7,2, aghjustatu cù KOH (osmolarità 290). Per scopi di ricuperazione, aghjunghje 0,2% di Biocitina à a suluzione interna.
I dati sò stati acquistati da Clampex (Clampex 11.1, Molecular Devices) utilizendu un amplificatore MultiClamp 700B (Molecular Devices) è un digitalizzatore Digidata 1550B (Molecular Devices), filtrati passa-bassu à 2 kHz, digitalizzati à 20 kHz, è analizati utilizendu Clampfit (versione 10.6) per l'analisi, dispositivi moleculari) è funzioni MATLAB persunalizate (MATLAB 2019b, Mathworks). U putenziale di giunzione hè statu calculatu utilizendu JPCalc è l'entrate sò state aghjustate à u putenziale di giunzione calculatu di -14 mV. L'operazione IV consiste in una seria di passi di corrente in passi di 5-10 pA da -50 à 250 pA.
Per a ricustruzione morfologica di i neuroni pizzicati, hè statu aghjuntu 0,2% di biocitina (Sigma-Aldrich) à a suluzione interna. E cellule sò preparate per almenu 15 minuti dopu l'hacking. A pipetta hè poi aspirata lentamente per 1-2 minuti finu à chì a membrana registrata sia cumpletamente sigillata. Seguendu a prucedura di fisiologia di a sezione, e sezioni sò state fissate durante a notte à 4° C. in 4% PFA, lavate cù PBS X3, è diluite 1:1000 cù DyLight 549 o DyLight 405 (Vector Labs) cunjugati cù streptavidina. E cellule piene di biocitina (2%; Sigma-Aldrich) sò state etichettate durante a registrazione cù patch clamp à temperatura ambiente per 2 ore. E sezioni sò state poi montate nantu à vetrini di microscopia utilizendu un Aquamount (Thermo Scientific) è visualizate u ghjornu dopu nantu à un microscopiu cunfocale Leica TCS SP8 utilizendu un obiettivu à immersione in oliu cù una apertura numerica ×40 1,3, ingrandimentu ×0,9–1,0, xy. A frequenza di campionamentu hè di circa 7 pixel per micron. Z-stacks à intervalli di 1 µm sò stati ottenuti in serie, è mosaici z-stack è auto-stitching basati nantu à Leica sò stati realizati per copre tuttu l'arburu dendriticu di ogni neurone. I neuroni sò stati poi tracciati semi-manualmente utilizendu l'interfaccia neuTube 40 è sò stati generati i fugliali SWC. I fugliali sò stati poi caricati nantu à u plugin SimpleNeuriteTracer41 Fiji (ImageJ, versione 2.1.0; NIH).
U tissutu corticale umanu hè statu ottenutu cù u cunsensu infurmatu secondu un protocolu appruvatu da u Cunsigliu di Revisione Istituzionale di l'Università di Stanford. Dui campioni di tissutu umanu postpartum (3 è 18 anni) sò stati ottenuti per resezione di a corteccia frontale (girus frontale mediu) cum'è parte di a chirurgia per l'epilessia refrattaria. Dopu a resezione, raccoglie u tissutu in NMDG-aCSF ghiacciatu chì cuntene: 92 mM NMDG, 2,5 mM KCl, 1,25 mM NaH2PO4, 30 mM NaHCO3, 20 mM HEPES, 25 mM glucosiu, 2 mM tiourea, 5 mM ascorbatu di sodiu, 3 mM piruvatu di sodiu, 0,5 mM CaCl2 4H2O è 10 mM MgSO4 7H2O. Titola à pH 7,3-7,4 cù acidu cloridricu cuncintratu. I tessuti sò stati cunsegnati à u laburatoriu in 30 minuti è e sezioni coronali sò state prelevate secondu a prucedura descritta sopra.
Tutte e procedure nantu à l'animali sò state realizate in cunfurmità cù e linee guida per a cura di l'animali appruvate da l'APLAC di l'Università di Stanford. I ratti (più di 140 ghjorni dopu u trapianto) sò stati indotti cù anestesia à 5% d'isoflurane è anestetizzati cù 1-3% d'isoflurane intraoperatoriamente. L'animali sò stati posti in un quadru stereotassicu (Kopf) è a buprenorfina à liberazione sustenuta (SR) hè stata iniettata per via sottocutanea. U craniu hè espostu, pulitu è ​​3-5 viti ossee sò inserite. Per indirizzà u t-hCO, avemu generatu coordinate stereotassiche da l'imaghjini MRI. Un foru di fresa hè statu praticatu in u situ d'interessu è e fibre (400 µm di diametru, NA 0,48, Doric) sò state abbassate 100 µm sottu à a superficia di l'hCO è fissate à u craniu cù cimentu dentale curabile à i raggi UV (Relyx).
E registrazioni fotometriche in fibra sò state effettuate cum'è descrittu prima42. Per registrà l'attività spontanea, i ratti sò stati posti in una gabbia pulita è un cavu patch in fibra ottica di 400 µm di diametru (Doric) cunnessu à un sistema di acquisizione di dati fotometrici in fibra ottica hè statu cunnessu à u cavu in fibra ottica impiantatu. Durante a registrazione di 10 minuti di l'attività motoria, l'animali eranu liberi di esplorà a gabbia. Per registrà l'attività evocata, i ratti (più di 140 ghjorni dopu u trapianto) sò stati anestetizzati cù 5% isoflurano per l'induzione è 1-3% isoflurano per u mantenimentu. Pone l'animale in un quadru stereotassicu (Kopf) è i baffi da u latu oppostu di u t-hCO sò tagliati à circa 2 cm è passati attraversu una maglia cunnessa à un attuatore piezoelettricu (PI). Un cavu patch in fibra ottica di 400 µm (Doric) hè statu cunnessu à a fibra impiantata è cunnessu à u sistema di acquisizione di dati. I baffi da u latu oppostu di t-hCO sò stati tandu deviati 50 volte (2 mm à 20 Hz, 2 s per presentazione) à tempi aleatorii da un azionamentu piezoelettricu per un periodu di registrazione di 20 minuti. Aduprate u pacchettu di supportu Arduino MATLAB per cuntrullà u tempu di deflessione cù un codice MATLAB persunalizatu. L'eventi sò sincronizati cù u software di acquisizione di dati utilizendu impulsi di logica transistor-transistor (TTL).
I ratti (più di 140 ghjorni dopu u trapianto) sò stati indotti cù anestesia à 5% d'isoflurane è anestetizzati cù 1-3% d'isoflurane intraoperatoriamente. L'animali sò stati posti in un quadru stereotassicu (Kopf) è buprenorfina SR è desametasone sò stati iniettati per via sottutanea. U craniu hè espostu, pulitu è ​​3-5 viti ossee sò inserite. Per indirizzà u t-hCO, avemu generatu coordinate stereotassiche da l'imaghjini MRI. Una craniotomia circulare (circa 1 cm di diametru) hè stata realizata cù un trapano à alta velocità direttamente sopra l'hCO trapiantatu. Una volta chì l'ossu hè u più finu pussibule, ma prima di perforà tuttu l'ossu, aduprate una pinza per rimuovere u discu pelvicu intattu restante per rivelà u t-hCO sottostante. A craniotomia hè stata riempita cù soluzione salina sterile, è un vetrino coprioggetto è una spilla speciale per la testa sò stati attaccati à u craniu cù cimentu dentale polimerizatu à UV (Relyx).
L'imaghjini à dui fotoni hè stata realizata cù un microscopiu multifotonicu Bruker cù un obiettivu Nikon LWD (×16, 0.8 NA). L'imaghjini GCaMP6 hè stata realizata à 920 nm cù un ingrandimentu di 1.4x in u pianu z unicu è una media di 8x di 7.5 fps. I ratti sò stati indotti cù anestesia à 5% d'isoflurane è mantenuti cù 1-3% d'isoflurane. I ratti sò stati piazzati in un supportu di testa fattu à misura è pusizionati sottu à a lente. Hè stata ottenuta una registrazione di fondu di 3 minuti di l'attività motoria. In u corsu di 20 minuti di registrazione, 50 puff (ogni presentazione di 100 ms di lunghezza) sò stati mandati à casu à u cuscinettu di baffi oppostu à t-hCO3 utilizendu un picospricer. Aduprate u pacchettu di supportu Arduino MATLAB per cuntrullà u tempu di burst cù un codice MATLAB persunalizatu. Sincronizate l'eventi cù u software di acquisizione di dati (PrairieView 5.5) utilizendu impulsi TTL. Per l'analisi, l'imaghjini sò state currette per u muvimentu xy utilizendu a currezzione affine in u prugramma MoCo lanciatu in Fiji. Estrazione di tracce fluorescenti da cellule individuali cù CNMF-E43. A fluorescenza hè stata estratta per ogni regione d'interessu, cunvertita in curve dF/F, è dopu cunvertita in punteggi z.
I ratti (più di 140 ghjorni dopu u trapianto) sò stati indotti cù anestesia à 5% d'isoflurane è anestetizzati cù 1-3% d'isoflurane intraoperatoriamente. L'animali sò stati posti in un quadru stereotassicu (Kopf) è a buprenorfina SR è a desametasone sò state iniettate per via sottocutanea. I baffi da u latu oppostu di u t-hCO sò stati tagliati à circa 2 cm è infilati attraversu una maglia cunnessa à un attuatore piezoelettricu. U craniu hè espostu è pulitu. Una vite di terra in acciaio inox hè attaccata à u craniu. Per indirizzà u t-hCO, avemu generatu coordinate stereotassiche da l'imaghjini MRI. Eseguite una craniotomia circulare (circa 1 cm di diametru) cù un trapano à alta velocità ghjustu sopra u t-hCO. Una volta chì l'ossu hè u più finu pussibule, ma prima di perforà tuttu l'ossu, aduprate una pinza per rimuovere u discu pelvicu intattu restante per rivelà u t-hCO sottostante. E cellule individuali sò state registrate aduprendu sonde di silicone à alta densità à 32 o 64 canali (Cambridge Neurotech) cunnesse à e viti di terra è preamplificate cù amplificatori RHD (Intan). Aduprate u manipulatore per calà l'elettrodi à u situ di destinazione attraversu a craniotomia, chì hè piena di soluzione salina sterile. A raccolta di dati hè stata effettuata à una frequenza di 30 kHz aduprendu u sistema di acquisizione di dati Open Ephys. A registrazione hà cuntinuatu solu quandu avemu rilevatu una attività spontanea ritmica altamente correlata in più di 10 canali, ciò chì suggerisce chì l'elettrodi eranu situati in l'innesto (basatu annantu à dati di imaging di calciu à dui fotoni). Hè stata ottenuta una registrazione di fondu di 10 minuti di l'attività motoria. I baffi da u latu oppostu di t-hCO3 sò stati poi deviati 50 volte (2 mm à 20 Hz, 2 s per presentazione) à tempi aleatorii da un azionamentu piezoelettricu per un periodu di registrazione di 20 minuti. Aduprendu u Pacchettu di Supportu MATLAB per Arduino (MATLAB 2019b), cuntrullà u tempu di deflessione cù un codice MATLAB persunalizatu. Aduprate impulsi TTL per sincronizà l'eventi cù u software d'acquisizione di dati.
Per l'esperimenti di marcatura ottica, un cavu di patch otticu di 200 µm (Doric) cunnessu à un laser di 473 nm (Omicron) hè statu cunnessu à una fibra ottica di 200 µm posta sopra a craniotomia. Immediatamente prima di questu, aghjustate a putenza di u jumper à 20 mW. Aduprate u manipulatore per calà l'elettrodi à u situ di destinazione attraversu a craniotomia, chì hè piena di soluzione salina sterile. À l'iniziu di a registrazione, sò stati emessi dece impulsi di luce di 473 nm (frequenza 2 Hz, durata di l'impulsu 10 ms). E cellule fotosensibili sò state definite cum'è cellule chì anu mostratu una risposta di piccu in 10 ms di luce in u 70% o più di e prove.