Nature.com saytına daxil olduğunuz üçün təşəkkür edirik. Siz məhdud CSS dəstəyi ilə brauzer versiyasından istifadə edirsiniz. Ən yaxşı təcrübə üçün sizə yenilənmiş brauzerdən istifadə etməyi tövsiyə edirik (və ya Internet Explorer-də Uyğunluq rejimini söndürün). Bundan əlavə, davamlı dəstəyi təmin etmək üçün biz saytı üslub və JavaScript olmadan göstəririk.
Eyni anda üç slayddan ibarət karuseli göstərir. Eyni anda üç slayd arasında hərəkət etmək üçün Əvvəlki və Sonrakı düymələrindən istifadə edin və ya bir anda üç slayd arasında hərəkət etmək üçün sonundakı sürüşmə düymələrindən istifadə edin.
Öz-özünə yığılan sinir orqanelləri insan inkişafı və xəstəliklərin modelləşdirilməsi üçün perspektivli in vitro platformadır. Bununla belə, orqanoidlərdə in vivo mövcud olan əlaqə yoxdur, bu da yetkinləşməni məhdudlaşdırır və davranışı idarə edən digər sxemlərlə inteqrasiyanın qarşısını alır. Burada biz göstəririk ki, yeni doğulmuş çılpaq siçovulların somatosensor korteksinə köçürülmüş insan kök hüceyrələrindən alınan kortikal orqanoidlər sensor və motivasiya ilə əlaqəli dövrələrə inteqrasiya edən yetkin hüceyrə növlərini inkişaf etdirir. MHİ bir neçə kök hüceyrə xəttində və heyvanda transplantasiyadan sonra orqanoid böyüməsini aşkar etdi, tək nüvəli analiz isə kortikogenezin gedişatını və fəaliyyətdən asılı transkripsiya proqramının ortaya çıxmasını aşkar etdi. Həqiqətən, transplantasiya edilmiş kortikal neyronlar in vitro analoqlarına nisbətən daha mürəkkəb morfoloji, sinaptik və daxili membran xüsusiyyətləri nümayiş etdirir və Timoti sindromu olan xəstələrdə neyron qüsurlarını aşkar etməyə imkan verir. Anatomik və funksional izləmə göstərdi ki, transplantasiya edilmiş orqanoidlər talamokortikal və kortikokortikal girişlər alır və sinir fəaliyyətinin in vivo qeydləri bu girişlərin insan hüceyrələrində sensor reaksiyalar yarada biləcəyini göstərir. Nəhayət, kortikal orqanoidlər siçovulların beynində aksonları genişləndirir və onların optogenetik aktivasiyası mükafat axtaran davranışa gətirib çıxarır. Beləliklə, köçürülmüş insan korteks neyronları yetkinləşir və davranışı idarə edən ev sahibinin sxemlərində iştirak edirlər. Bu yanaşmanın başqa vasitələrlə aşkarlana bilməyən xəstədən əldə edilən hüceyrələrdə zəncir səviyyəli fenotiplərin aşkarlanmasını asanlaşdıracağını gözləyirik.
İnkişaf etməkdə olan insan beyni, hüceyrələrin çoxaldığı, fərqləndiyi, miqrasiya etdiyi və sensor təcrübə ilə daha da təkmilləşdirilmiş funksional neyron dövrələri yaratmaq üçün birləşdirildiyi əlamətdar özünü təşkil edən bir prosesdir. Xüsusilə xəstəlik kontekstində insan beyninin inkişafını başa düşməkdə əsas problem beyin toxumasına çıxışın olmamasıdır. İnsan korteksinin orqanoidləri (hCO; insan korteks sferası kimi də tanınır) daxil olmaqla, özünü təşkil edən orqanellər 2,3,4,5,6 yarada bilər. Bununla belə, bir sıra məhdudiyyətlər onların sinir sxemlərinin inkişafı və fəaliyyətini başa düşmək üçün daha geniş tətbiqini məhdudlaşdırır. Xüsusilə, hCO yetişməsinin in vivo olaraq mövcud olan müəyyən mikro-mühit və sensor girişlərin olmaması ilə məhdudlaşıb-məhdudlaşdığı aydın deyil. Bundan əlavə, hCO-lar davranış nəticələrini yarada bilən sxemlərə inteqrasiya olunmadığından, onların genetik cəhətdən mürəkkəb və davranışsal nöropsikiyatrik pozğunluqların modelləşdirilməsində faydası hazırda məhduddur.
HCO-nun bütöv bir canlı beyinə köçürülməsi bu məhdudiyyətləri aradan qaldıra bilər. Əvvəlki tədqiqatlar gəmiricinin qabığına köçürülmüş insan neyronlarının sağ qalmağı, layihələndirməyi və gəmirici hüceyrələri ilə əlaqə qura bildiyini göstərdi7,8,9,10,11,12. Bununla belə, bu təcrübələr adətən yetkin heyvanlar üzərində aparılır ki, bu da sinaptik və aksonal inteqrasiyanı məhdudlaşdıra bilər. Burada, biz plastik inkişafın erkən mərhələsində immun çatışmazlığı olan siçovulların ilkin somatosensor korteksinə (S1) hiPS hüceyrələrindən əldə edilən 3D hCO-nu nəql etdiyimiz bir transplantasiya paradiqmasını təsvir edirik. Transplantasiya edilmiş hCO (t-hCO) neyronları əhəmiyyətli dərəcədə yetkinləşməyə məruz qalır, duyğu reaksiyaları yaradan talamokortikal və kortikal-kortikal girişləri alır və mükafat axtaran davranışı idarə etmək üçün siçovulların beyninə aksonal proqnozları genişləndirir. t-hCO-nun uzadılmış yetişməsi gərginliyə həssas L-tipli CaV1.2 kalsium kanalında (CACNA1C tərəfindən kodlaşdırılmış) mutasiyalar nəticəsində yaranan ağır genetik pozğunluq olan Timoti sindromu (TS) olan xəstələrdə neyron qüsurlarını aşkar etmişdir.
In vivo dövrələrdə insan kortikal neyronlarını öyrənmək üçün biz stereotaktik olaraq bütöv 3D hCO-nu erkən postnatal atimik siçovulların (postnatal 3-7-ci günlər) S1-ə köçürdük (Şəkil 1a və Şəkil 1a-c-nin genişləndirilmiş məlumatları). Bu nöqtədə, talamokortikal və kortikokortikal aksonal proyeksiyalar hələ S1 innervasiyasını tamamlamayıb (istinad 13). Beləliklə, bu yanaşma endogen sxemlərə təsiri minimuma endirərkən t-hCO inteqrasiyasını maksimuma çatdırmaq üçün nəzərdə tutulmuşdur. Canlı heyvanlarda t-hCO-nun yerini görselleştirmek üçün biz transplantasiyadan 2-3 ay sonra siçovulların T2-çəkili MRT beyin rekonstruksiyalarını həyata keçirdik (Şəkil 1b və genişləndirilmiş məlumatlar, Şəkil 1d). t-hCO asanlıqla müşahidə edildi və t-hCO-nun həcm ölçüləri sabit dilimlərdən hesablananlara oxşar idi (Genişləndirilmiş Məlumat Fig. 1d,e; P > 0.05). t-hCO asanlıqla müşahidə edildi və t-hCO-nun həcm ölçüləri sabit dilimlərdən hesablananlara oxşar idi (Genişləndirilmiş Məlumat Fig. 1d,e; P > 0.05). t-hCO legko nablyudaliсь, a obъemnıe izmereniya t-hCO ilə analoji rasschitannım üçün fiksirovannıx srezov (rəsşirennıe dannıe, ris. 1d, e; P> 0,05). t-hCO asanlıqla müşahidə edildi və həcmli t-hCO ölçmələri sabit bölmələr üçün hesablananlara oxşar idi (genişlənmiş məlumatlar, Şəkil 1d, e; P> 0.05).很容易观察到t-hCO，并且t-hCO的体积测量值与从固定切片计算的测量值相似（扩展数据图1d、e；P > 0.05）很容易观察到t-hCO，并且t-hCO t-hCO leqko nabludalsya, a obъemnıe izmereniya t-hCO ilə analoji rasschitannım üçün fiksasiya olunmuş srezov (rəsşirennıe dannıe, ris. 1d, e; P> 0,05). t-hCO asanlıqla müşahidə edildi və həcmli t-hCO ölçmələri sabit bölmələr üçün hesablananlara oxşar idi (genişlənmiş məlumatlar, Şəkil 1d, e; P> 0.05).Transplantasiyadan təxminən 2 ay sonra transplantasiya edilmiş heyvanların 81% -də t-hCO təyin etdik (n = 72 heyvan; 10 hiPS hüceyrə xəttindən hCO; Əlavə Cədvəl 1-də hiPS hüceyrə xətləri). Bunlardan 87% beyin qabığında yerləşirdi (şəkil 1c). Eyni transplantasiya edilmiş siçovulda birdən çox vaxt nöqtəsində ardıcıl MRT taramalarını həyata keçirərək, 3 ay ərzində t-hCO həcmində doqquz dəfə artım tapdıq (Şəkil 1d və genişləndirilmiş məlumatlar, Şəkil 1f). Transplantasiya edilmiş heyvanlarda transplantasiyadan sonrakı 12 ayda yüksək sağ qalma nisbəti (74%) olmuşdur (genişlənmiş məlumatlar, Şəkil 1g və Əlavə Cədvəl 2) və heç bir açıq motor və ya yaddaş pozğunluğu, glioz və ya elektroensefaloqramma (EEQ) aşkar edilməmişdir. Məlumat Şəkil 1g və əlavə cədvəl 2). 1h-m və 3e).
a, Eksperimental dizaynın sxemi. hiPS hüceyrələrindən əldə edilən hCO differensiasiyanın 30-60-cı günündə yeni doğulmuş çılpaq siçovulların S1-ə köçürüldü. b, transplantasiyadan 2 ay sonra S1-də t-hCO-nu göstərən T2-çəkili koronal və üfüqi MRT şəkilləri. Ölçək çubuğu, 2 mm. c, Hər bir hiPS hüceyrə xətti (n = 108, çubuqlardakı nömrələr hIPS hüceyrə xətti başına t-hCO miqdarını göstərir) və kortikal və ya subkortikal yer (n = 88) üçün göstərilən engraftment müvəffəqiyyət dərəcələrinin kəmiyyəti. d, 3 ay ərzində t-hCO artımını göstərən koronar arteriyanın MRT görüntüsü (solda; şkala çubuğu, 3 mm) və müvafiq 3D həcmli rekonstruksiya (miqyas çubuğu, 3 mm). e, Siçovulların beyin qabığında t-hCO nümunələrinin nəzərdən keçirilməsi. Ölçək çubuğu, 1 mm. f, yuxarı soldan sağa göstərilən t-hCO-nun nümayəndəsi immunositokimyəvi şəkilləri (diferensiasiya zamanı): PPP1R17 (4 aylıq), NeuN (8 aylıq), SOX9 və GFAP (8 aylıq), PDGFRα; (8 ay), MAP2 (8 ay) və IBA1 (8 ay). Ölçək çubuğu, 20 µm. HNA-nın birgə ifadəsi insan mənşəli hüceyrələri göstərir. g, snRNA-seq: Seurat inteqrasiyasından sonra bütün yüksək keyfiyyətli t-hCO nüvələrinin vahid manifold və proyeksiya (UMAP) ölçülü azaldılması təsviri (n = 3 t-hCO nümunəsi, n = 2 hiPS hüceyrə xətti). Astrositlər, astrosit xəttinin hüceyrələri; cyc prog, dövran edən atalar; GluN DL, dərin glutamaterjik neyronlar; GluN DL/SP, dərin və sublamellar glutamaterjik neyronlar; GluN UL, yuxarı təbəqənin glutamaterjik neyronları; oliqodendrositlər, oliqodendrositlər; OPC, oliqodendrosit progenitor hüceyrələr; RELN, reelin neyronları. h, hCO glutamaterjik neyronları ilə müqayisədə t-hCO glutamaterjik neyronlarda əhəmiyyətli dərəcədə yuxarı tənzimlənmiş genlərin Gen Ontologiyası (GO) müddətinin zənginləşdirilməsi təhlili (tənzimlənmiş P <0.05, qat dəyişməsi > 2, nüvələrin ən azı 10% -ində ifadə edilir). h, hCO glutamaterjik neyronları ilə müqayisədə t-hCO glutamaterjik neyronlarda əhəmiyyətli dərəcədə yuxarı tənzimlənmiş genlərin Gen Ontologiyası (GO) müddətinin zənginləşdirilməsi təhlili (tənzimlənmiş P <0.05, qat dəyişməsi > 2, nüvələrin ən azı 10% -ində ifadə edilir). h, Gene Ontology (GO) üçün genlər üçün terminlərin təhlili aktivləşdirilir (P <0,05, kratnost izmeneniya > 2, 10% civarında ekspressiya) t-hCO-nun qlutamatergik neyron t-hCO sravicheskiye təsirini artırır. h, hCO glutamaterjik neyronlarla müqayisədə t-hCO glutamaterjik neyronlarda əhəmiyyətli aktivləşdirmə (tənzimlənmiş P <0.05, qat dəyişməsi > 2, ən azı 10% nüvələrdə ifadə) olan genlər üçün Gen Ontologiyası (GO) müddətinin zənginləşdirilməsi təhlili. h，与hCO 谷氨酸能神经元相比，t-hCO 谷氨酸能神经元中基因显着上调（调整天0.05，倍数变化> 2，在至少10% 的细胞核中表达）的基因本体论(GO) 术语毌集。 h ， 与 hco 谷氨酸 能 元 相比 ， t-hco 谷氨酸 能 神经 元 基因 显着 上调 ０05.（式式开变化 变化> 2 ， 至少 10% 的 核中 表达） 基因 基因 基因 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的的 的 的 的本体论(GO) 术语富集分析。 h, geni znachitelno aktivləşdirilir (skorrektirilmiş P <0,05, kratnost izmeneniya> 2, ekspressiruetsya po krayney mere v 10% yader) t-hCO qlutatergik neyron analizi ilə sravnensiya ilə qlutamatergik terminoloji hCO (on qlutamatergik terminoloji hCO) ilə. h, genlər hCO glutamaterjik neyronları ilə müqayisədə t-hCO glutamaterjik neyronlarda zənginləşdirmə müddətinin Ontoloji (GO) təhlili ilə müqayisədə əhəmiyyətli dərəcədə yuxarı tənzimləndi (tənzimlənmiş P <0,05, qat dəyişməsi> 2, nüvələrin ən azı 10% -ində ifadə edildi).Nöqtəli xətt 0,05 aq dəyərini göstərir. i, istinad 22 snRNA-seq yetkin motor korteks məlumat dəstindən etiket transferindən istifadə edərək t-hCO-da GluN hüceyrə növlərinin UMAP görüntüsü. CT - kortikotalamik hüceyrələr, ET - ekstraserebral hüceyrələr, İT - daxili teleensefalik hüceyrələr, NP - proyeksiyaya yaxın.
Daha sonra t-hCO-nun sitoarxitekturasını və ümumi hüceyrə tərkibini qiymətləndirdik. Siçovulların endotel hüceyrələrinin antikor boyanması t-hCO ilə vaskulyarizasiyanı aşkar etdi, IBA1 boyanması isə greft boyunca siçovul mikrogliasının mövcudluğunu aşkar etdi (Şəkil 1f və genişləndirilmiş məlumatlar, Şəkil 3c,d). İmmun boyama zamanı PPP1R17 (kortikal sələflər), NeuN (neyronlar), SOX9 və GFAP (glial törəmə hüceyrələr) və ya PDGFRa (oliqodendrosit sələfləri) birgə ifadə edən insan nüvə antigeni (HNA) müsbət hüceyrələri aşkar edildi (Şəkil 1f). Tək hüceyrə həllində t-hCO-nun hüceyrə tərkibini öyrənmək üçün təxminən 8 aylıq fərqləndirmədən sonra tək nüvəli RNT ardıcıllığını (snRNA-seq) həyata keçirdik. Kütləvi filtrasiya və siçovul nüvələrinin çıxarılması nəticəsində 21500 yüksək keyfiyyətli insan mononüvə xəritəsi əldə edildi (Şəkil 1g və genişləndirilmiş məlumatlar, Şəkil 4a,b). Tipik hüceyrə tipli markerlərin ifadə nümunələri dərin və səthi glutamaterjik neyronlar, dövran edən atalar, oliqodendrositlər və astrosit nəsli daxil olmaqla əsas kortikal hüceyrə siniflərinin qruplarını müəyyən etdi (Şəkil 1g, genişləndirilmiş məlumatlar, Şəkil 4c və Əlavə Cədvəl 3). SATB2 və CTIP2 üçün immunostaining göstərdi ki, kortikal alt tiplərin olmasına baxmayaraq, t-hCO aydın anatomik təbəqələşmə göstərmir (genişlənmiş məlumatlar, Şəkil 3a). Mərhələ uyğunlaşdırılmış snRNA-seq hCO, oliqodendrositlərin olmaması və GABAergik neyronların mövcudluğu da daxil olmaqla, bir neçə istisna olmaqla, geniş oxşar hüceyrə sinifləri istehsal etdi, bu da lateral progenitor hüceyrələr üçün əvvəllər bildirilən əlverişli in vitro şəraiti əks etdirə bilər15 (genişlənmiş məlumatlar, Şəkil 4f - i və əlavə). Diferensial gen ifadə analizi t-hCO və hCO (Əlavə Cədvəl 5) arasında glutamaterjik neyronlarda əhəmiyyətli fərqlər aşkar etdi (Əlavə Cədvəl 5), o cümlədən sinaptik siqnal, dendritik lokalizasiya və gərginliyə bağlı kanal fəaliyyəti kimi neyronların yetişməsi ilə əlaqəli gen dəstlərinin aktivləşdirilməsi (Şəkil 1h və Əlavə Cədvəl 5). cədvəl 6). Müvafiq olaraq, kortikal glutamaterjik t-hCO neyronları sürətlənmiş transkripsiya olgunlaşmasını nümayiş etdirdi.
T-hCO-dakı bu transkripsiya dəyişikliklərinin in vitro və t-hCO in vivo arasında morfoloji fərqlərlə əlaqəli olub olmadığını aydınlaşdırmaq üçün 7-8 aylıq fərqləndirmədən sonra kəskin hissələrdə mərhələyə uyğun biositinlə doldurulmuş hCO və hCO-nu yenidən qurduq. hCO neyronları (Şəkil 2a). t-hCO neyronları əhəmiyyətli dərəcədə daha böyük idi, soma diametrindən 1,5 dəfə, dendritlərdən iki dəfə çox idi və in vitro hCO ilə müqayisədə ümumi dendritik uzunluğunda ümumi altı dəfə artım var idi (Şəkil 2b). Bundan əlavə, hCO neyronlarına nisbətən t-hCO neyronlarında dendritik tikanların əhəmiyyətli dərəcədə yüksək sıxlığını müşahidə etdik (Şəkil 2c). Bu, t-hCO neyronlarının geniş dendritik uzanma və budaqlanmaya məruz qaldığını göstərir, bu da davam edən hüceyrə proliferasiyası ilə birlikdə transplantasiyadan sonra t-hCO-nun intensiv böyüməsinə kömək edə bilər (Şəkil 1d və Genişləndirilmiş Məlumat Fig. 1f). Bu, bizi elektrofizioloji xüsusiyyətləri araşdırmağa sövq etdi. Membran tutumu səkkiz dəfə yüksək idi (genişlənmiş məlumatlar, Şəkil 8d), istirahət vəziyyətində olan membran potensialı daha hiperpolarizasiyaya məruz qaldı (təxminən 20 mV) və cari inyeksiya hCO neyronlarına nisbətən t-hCO neyronlarında daha yüksək maksimum həyəcan sürətinə səbəb oldu. in vitro (şəkil 2d), e), t-hCO-nun daha böyük və daha mürəkkəb morfoloji xüsusiyyətlərinə uyğundur. Bundan əlavə, t-hCO neyronlarında spontan həyəcanlandırıcı postsinaptik cərəyan hadisələrinin (EPSC) tezliyi əhəmiyyətli dərəcədə yüksək idi (Şəkil 2f), t-hCO neyronlarında müşahidə olunan dendritik tikanların artan sıxlığının funksional həyəcanlanma ilə əlaqəli olduğunu göstərir. cinsi sinaps. Etiketli glutamaterjik neyronları (genişlənmiş məlumatlar, Şəkil 6a-c) qeyd etməklə in vitro hCO neyronlarının yetişməmiş xarakterini təsdiqlədik.
a, 8 aylıq fərqləndirmədən sonra biositinlə dolu hCO və t-hCO neyronlarının 3D rekonstruksiyası. b, Morfoloji xüsusiyyətlərin kəmiyyəti (n = 8 hCO neyronları, n = 6 t-hCO neyronları; ** P = 0.0084, * P = 0.0179 və *** P < 0.0001). b, Morfoloji xüsusiyyətlərin kəmiyyəti (n = 8 hCO neyronları, n = 6 t-hCO neyronları; ** P = 0.0084, * P = 0.0179 və *** P < 0.0001). b, kolichestvennaya osenka morfologicheskix priznakov (n = 8 neyron hCO, n = 6 neyron t-hCO; ** P = 0,0084, * P = 0,0179 və *** P <0,0001). b, morfoloji xüsusiyyətlərin kəmiyyəti (n=8 hCO neyronları, n=6 t-hCO neyronları; **P = 0.0084, * P = 0.0179 və *** P <0.0001). b，形态学特征的量化（n = 8 个hCO 神经元，n = 6 个t-hCO 神经元；**P = 0,0084，*1**P <9*0. 0.0001）. b，形态学特征的量化（n = 8 个hCO 神经元，n = 6 个t-hCO 神经元；**P = 0,0084，*1**P <9*0. 0.0001）. b, kolichestvennaya osenka morfologicheskix priznakov (n = 8 neyron hCO, n = 6 neyron t-hCO; ** P = 0,0084, * P = 0,0179 və *** P <0,0001). b, morfoloji xüsusiyyətlərin kəmiyyəti (n=8 hCO neyronları, n=6 t-hCO neyronları; **P = 0.0084, * P = 0.0179 və *** P <0.0001).c, 8 aylıq fərqləndirmədən sonra hCO və t-hCO dendritik filiallarının 3D rekonstruksiyası. Qırmızı ulduzlar ehtimal olunan dendritik tikanları göstərir. Dendritik bel sıxlığının ölçülməsi (n = 8 hCO neyronları, n = 6 t-hCO neyronları; ** P = 0.0092). d, İstirahət membran potensialının kəmiyyəti (n = 25 hCO neyronları, n = 16 t-hCO neyronları; *** P <0.0001). d, İstirahət membran potensialının kəmiyyəti (n = 25 hCO neyronları, n = 16 t-hCO neyronları; *** P <0.0001). d, koliçestvennaya osenka membrannoq potensiala pokoya (n = 25 neyron hCO, n = 16 neyron t-hCO; *** P <0,0001). d, istirahət membran potensialının ölçülməsi (n = 25 hCO neyronları, n = 16 t-hCO neyronları; *** P <0.0001). d，静息膜电位的量化（n = 25 hCO 神经元，n = 16 t-hCO 神经元；***P < 0,0001）。 d，静息膜电位的量化（n = 25 hCO 神经元，n = 16 t-hCO 神经元；***P < 0,0001）。 d, koliçestvennaya osenka membrannoq potensiala pokoya (n = 25 neyron hCO, n = 16 neyron t-hCO; *** P <0,0001). d, istirahət membran potensialının ölçülməsi (n = 25 hCO neyronları, n = 16 t-hCO neyronları; *** P <0.0001). e, HCO və t-hCO-da təkrarlanan fəaliyyət potensialı, artan cərəyan inyeksiyaları ilə induksiya olunur və maksimal atəş sürətinin kəmiyyəti (n = 25 hCO neyronları, n = 16 t-hCO neyronları; *** P < 0.0001). e, HCO və t-hCO-da təkrarlanan fəaliyyət potensialı, artan cərəyan inyeksiyaları ilə induksiya olunur və maksimal atəş sürətinin kəmiyyəti (n = 25 hCO neyronları, n = 16 t-hCO neyronları; *** P < 0.0001). e, hCO və t-hCO-da potensial potensialın təsirini artırır, yüksək sürət və maksimum nəticə əldə etməyə imkan verir (n = 25 hCO neyronu, n = 16 neyron t-hCO; *** P <00, *** P <0,). e, hCO və t-hCO-da fəaliyyət potensialının yenidən atəşə tutulması, cari artım və maksimum atəş sürətinin kəmiyyətinin müəyyən edilməsi (n = 25 hCO neyronları, n = 16 t-hCO neyronları; *** P < 0.0001). e，通过增加电流注入诱导的hCO 和t-hCO 重复动作电位放电，以及最大放电，以及最大放电（2，n个hCO 神经元，n = 16 个t-hCO 神经元；***P < 0,0001）。 E ， 通过 增加 电流 注入 的 的 hco 和 t-hco 重复 电位 放电 ， 以及 最 大（（大（匄n个 hco 神经 ， n = 16 个 t-hco 神经 ； *** p <0,0001） 。 e, hCO və t-hCO potensial potensialını gücləndirir, yüksək təsir göstərir və maksimum mənfi təsir göstərir (n = 25 sinir hCO, n = 16 sinir t-hCO0; ***1). e, hCO və t-hCO fəaliyyət potensialının təkrarlanan atəşi artan cərəyan təchizatı və maksimum atəş sürətinin kəmiyyətinin müəyyən edilməsi (n = 25 hCO neyronları, n = 16 t-hCO neyronları; *** P < 0.0001). f, 8 aylıq fərqləndirmədə hCO və t-hCO neyronlarında kortəbii EPSCs (sEPSCs) və sinaptik hadisələrin tezliyinin kəmiyyəti (n = 25 hCO neyronları, n = 17 t-hCO neyronları; *** P <0.0001). f, 8 aylıq fərqləndirmədə hCO və t-hCO neyronlarında kortəbii EPSCs (sEPSCs) və sinaptik hadisələrin tezliyinin kəmiyyəti (n = 25 hCO neyronları, n = 17 t-hCO neyronları; *** P < 0.0001) . f, spontanlı EPSC (sEPSC) hCO və t-hCO-da 8 ay ərzində diferensial diferensivlər və sinaptik təsirlər (n = 25 hCO neyronları, n = 17 t-hCO neyronları; *** P <0,00). f, hCO və t-hCO neyronlarında spontan EPSCs (sEPSCs) 8 aylıq fərqləndirmə və sinaptik hadisə dərəcələrinin miqdarı (n = 25 hCO neyronları, n = 17 t-hCO neyronları; *** P <0.0001). f，分化8 个月时hCO 和t-hCO 神经元中的自发性EPSCs (sEPSCs)，以及突触事件频突触事件频率的CO神经元，n = 17 t-hCO 神经元；***P < 0,0001） . f，分化8 个月时hCO 和t-hCO 神经元中的自发性EPSCs (sEPSCs)，以及突触事件频突触事件频率的CO神率的量匼（n = 25 hCO 神率的量匼（n = 25hCO P < 0,0001） . f, spontan EPSC (sEPSC) hCO və t-hCO-da 8 ay ərzində differensial diferensivlər və sinaptik təsirlər (n = 25 hCO, n = 17 sinir t-hCO; *** P <0,00). f, hCO və t-hCO neyronlarında spontan EPSCs (sEPSCs) 8 aylıq fərqləndirmə və sinaptik hadisə dərəcələrinin miqdarı (n = 25 hCO neyronları, n = 17 t-hCO neyronları; *** P <0.0001).bf üçün 1208-2 sətirində hCO və t-hCO paralel olaraq saxlanılan eyni diferensiallaşma partiyasından götürülüb. g, t-hCO glutamaterjik neyronlarda əhəmiyyətli dərəcədə yuxarı tənzimlənmiş genlərin gen zənginləşdirmə təhlili (birtərəfli Fişerin dəqiq testi) (tənzimlənmiş P <0,05, qat dəyişməsi > 2, nüvələrin ən azı 10% -ində ifadə edilir) hCO glutamaterjik neyronlarla (erkən və gec-gec genlər) (LRG) in vivo siçan tədqiqatından müəyyən edilmiş fəaliyyətdən asılı genlər16 və in vitro neyronlardan insana xas LRG-lər17. g, t-hCO glutamaterjik neyronlarda əhəmiyyətli dərəcədə yuxarı tənzimlənmiş genlərin gen zənginləşdirmə təhlili (birtərəfli Fişerin dəqiq testi) (tənzimlənmiş P <0,05, qat dəyişməsi > 2, nüvələrin ən azı 10% -ində ifadə edilir) hCO glutamaterjik neyronlarla (erkən və gec-gec genlər) (LRG) in vivo siçan tədqiqatından müəyyən edilmiş fəaliyyətdən asılı genlər16 və in vitro neyronlardan insana xas LRG-lər17. g, analiz обогащения набора генов (odnostoroniy toch neyronic analiz Fishera) genov so znachitelnoy aktivaciey (skorrektirovannyy P <0,05, kratnost izmeneniya > 2, ekspressiya po menshey mere v 10% yader) glutamatergicheskyh neyrыycheskyh poternыycheskye slunen. hCO nabory genov kak rannego (ERG), tək və pozdnego (LRG) genov, aktivləşdirici, in vivo16-da identifikasiya, və insanlar üçün xüsusi LRG in vitro17. g, hCO glutamaterjik neyronlarla müqayisədə t-hCO glutamaterjik neyronlarda əhəmiyyətli aktivləşdirmə (tənzimlənmiş P<0.05, qat dəyişməsi >2, nüvələrin ən azı 10%-də ifadə) olan genlərin gen dəstinin zənginləşdirilməsinin (bir quyruqlu Fişerin dəqiq sınağı) təhlili, həm də gec-asılı (ERG) genlərin erkən müəyyən edilmiş aktivliyi (ERG) siçanlar16 və in vitro17 neyronlardan insana xas LRG-lər. g，t-hCO谷氨酸能神经元与hCO谷氨酸能神经元相比，t -hCO谷氨酸能神经元显着上调（调整后P<0.05，倍数变化>2，在至少10%的细胞核中表达）的基因集富集分析（单侧F isher精确检验）从体内小鼠研究中鉴定的早期反应(ERG)和晚期反应(LRG) 活性依赖性基因的基因组16 和体外神经元17 中的人类特开LRG g ， t-hco 谷氨酸 神经 元 与 hco 谷氨酸 神经 元 相比 ， t-hco 谷氨酸 神经 元 与 hco 谷氨酸 神经 元 与<0.05 ， 倍数> 2 ， 至少 至少 10%的 细胞 核中 表达） 的 集富集 分析 （单缧（单便体内 小鼠 研究 中 的 早期 反应 反应 反应 和 晚期 反应 反应 (lrg) 活性 庄 盻性 基和 神经元 神经元 17 中 中 17 中 17 的人类特异性LRG。 g, t-hCO ilə qlutamatergicheskie sinirlərin qlutamatergicheskie sinirinin hCO ilə sravnenyu üzrə aktivləşdirilməsini aktivləşdirir (skorrektirovannıy P<0,05, kratnost izmeneniya> 2, nə mənee 10% Analiz avaqaşeniya nabora fişəng testlər (əlavə olaraq) (ERG) və cinsləri aktivləşdirin, aktivləşdirin (LRG), in vivo16 və in vitro17 üçün neyronların identifikasiyası. g, t-hCO glutamaterjik neyronları hCO glutamaterjik neyronlarla (tənzimlənmiş P<0.05, qat dəyişikliyi >2, ən azı 10% Erkən cavab (ERG) və gec cavab gen zənginləşdirmə analizi (bir quyruqlu Fişerin dəqiq testi) reaksiya aktivliyindən asılı genlər (inRG-dən asılı genlər) ilə müqayisədə əhəmiyyətli dərəcədə yuxarı tənzimlənmişdir. neyronlar.17 İnsana xas LRG-lər.Nöqtəli xətt Bonferroni tərəfindən düzəldilmiş 0,05 P dəyərini göstərir. h, GluN gen ifadəsi (psevdo-paket və hər genin miqyası) t-hCO glutamaterjik neyronlarda LRG genlərinin snRNA-seq replikalarında əhəmiyyətli dərəcədə yuxarı tənzimləndi. i, t-hCO (yuxarı) və hCO (aşağı) neyronlarda SCG2 ifadəsini göstərən immun boyama. Ağ oxlar SCG2+ hüceyrələrinə işarə edir. Ölçək çubuğu, 25 µm. Məlumatlar orta ± standart sapma kimi ifadə edilir.
Ex vivo dilimlərdə müşahidə edilən t-hCO-nun artan aktivliyinə əsaslanaraq, snRNA-seq, in vitro hCO ilə müqayisədə t-hCO-da gen transkriptlərinin aktivliyə bağlı yuxarı tənzimlənməsini aşkar etdi. Glutamaterjik t-hCO neyronları, siçan və insan neyronlarında əvvəlki tədqiqatlarda aşkar edilmiş gec cavab fəaliyyətini tənzimləyən genlərin daha yüksək səviyyələrini ifadə etdi (Şəkil 2g, h) 16,17. Məsələn, BDNF18, SCG2 və OSTN, primatlara xas aktivliyi tənzimləyən gen, hCO neyronları ilə müqayisədə t-hCO neyronlarında ifadənin artdığını göstərdi (Şəkil 2g-i). Beləliklə, t-hCO neyronları transkripsiya, morfoloji və funksional analizlərlə hCO neyronları ilə müqayisədə inkişaf etmiş olgunlaşma xüsusiyyətlərini nümayiş etdirdi.
İnsan beyninin inkişafı ilə t-hCO olgunlaşmasının əlaqəsini daha da qiymətləndirmək üçün biz fetal və yetkin kortikal hüceyrə tiplərinin19,20 və yetkin21,22 transkriptomik müqayisələrini, eləcə də inkişaf zamanı kortikal gen ifadəsi23 haqqında geniş məlumatı həyata keçirdik (genişlənmiş məlumatlar, Şəkil 5). ). əvvəlki iş 24 ilə, qlobal hCO və t-hCO transkriptom yetişmə statusu fərqləndirmə 7-8 ay geniş şəkildə in vivo inkişaf vaxtı ilə uyğundur və gec fetal həyat (Genişləndirilmiş Data Fig. 5a) ən ekvivalentdir. Xüsusilə, biz yaşa uyğun hCO ilə müqayisədə t-hCO-da transkriptom yetkinliyinin artması, həmçinin sinaptogenez, astrogenez və miyelinasiya ilə əlaqəli transkriptomun aktivləşdirilməsini müşahidə etdik (genişlənmiş məlumatlar, Şəkil 5b-d). Hüceyrə səviyyəsində, t-hCO-da daha nazik korteks alt tipinin sübutunu tapdıq, glutamaterjik neyron qrupları yetkin L2/3, L5 və L6 neyron alt tipləri ilə üst-üstə düşür (Şəkil 1i). Bunun əksinə olaraq, glutamaterjik t-hCO neyronları və fetal kortikal neyronlar arasında çoxluq üst-üstə düşməsi hamiləliyin ortalarında daha məhdud idi (genişlənmiş məlumatlar, Şəkil 5e-j). t-hCO neyronlarının insan postnatal neokortikal neyronlarına funksional olaraq oxşar olub olmadığını müəyyən etmək üçün insan postnatal korteksinin kəskin bölmələrində insan L2 / 3 piramidal neyronlarının elektrofizioloji qeydləri və anatomik rekonstruksiyalarını həyata keçirdik (genişlənmiş məlumatlar, Şəkil 7a). L2/3 piramidal neyronların elektrofizioloji xassələri t-hCO piramidal neyronların xüsusiyyətlərinə bənzəyirdi (genişlənmiş məlumatlar, Şəkil 7e). Morfoloji olaraq, postnatal insan nümunələrindən L2 / 3 neyronları hCO-dan daha çox t-hCO-ya bənzəyirdi, baxmayaraq ki, L2 / 3 hüceyrələri daha uzun idi, ümumi olaraq daha çox filial ehtiva edirdi və daha yüksək onurğa sıxlığına malikdir (Şəkil 3g və genişləndirilmiş məlumatlar, Şəkil 7b-). G).
a, nəzarət və TS hiPS hüceyrə xətləri tərəfindən istehsal edilən hCO-nun neonatal siçovullara transplantasiyası. b, 8 aylıq fərqləndirmədən sonra biositinlə dolu t-hCO neyronlarının 3D yenidən qurulması. c, orta dendritik uzunluğun kəmiyyəti (n = 19 nəzarət neyronları, n = 21 TS neyronları; ** P = 0.0041). d, 8 aylıq fərqləndirmədə nəzarət və TS t-hCO-dan 3D-rekonstruksiya edilmiş dendritik filiallar və dendritik bel sıxlığının kəmiyyəti (n = 16 nəzarət neyronları, n = 21 TS neyronları, *** P <0.0001). d, 8 aylıq fərqləndirmədə nəzarət və TS t-hCO-dan 3D-rekonstruksiya edilmiş dendritik filiallar və dendritik bel sıxlığının kəmiyyəti (n = 16 nəzarət neyronları, n = 21 TS neyronları, *** P <0.0001). d, 3D-rekonstruksiya dendritnıx vetveyi nəzarət və TS t-hCO ilə 8 ay ərzində differensivlər və yüksək təzyiqlər (n = 16 nəzarət neyronları, n = 21 TS sinirləri, ***0 P <0,). d, 8 aylıq diferensiallaşma və dendritik bel sıxlığının ölçülməsində nəzarət və t-hCO TS-dən dendritik filialların 3D yenidən qurulması (n = 16 nəzarət neyronları, n = 21 TS neyronları, *** P <0.0001). d，分化8 个月时对照和TS t-hCO 的3D 重建树突分支，以及树突棘密度的量化（6个对照神经元，n = 21 个TS 神经元，***P < 0,0001）。 d ， 分化 8 个 时 对照 和 ts t-hco 的 3d 重建 分支 分支 以及 树突棘 密度 （突棘 密度 ， 弈度神经 元 ， n = 21 个 ts 神经 ， *** p <0,0001 ）。 d, 3D-rekonstruksiya dendritnıx vetvey nəzarəti və TS t-hCO 8 ay ərzində diferensial və yüksək təzyiq (n = 16 nəzarət neyron, n = 21 TS neyronov, *** P <0,00). d, 8 aylıq diferensiallaşma və dendritik bel sıxlığının ölçülməsində nəzarət dendritik filiallarının və TS t-hCO-nun 3D yenidən qurulması (n = 16 nəzarət neyronları, n = 21 TS neyronları, *** P <0.0001).Qırmızı ulduzlar ehtimal olunan dendritik tikanları göstərir. e, 8 aylıq fərqləndirmədən sonra nəzarətdə olan spontan EPSC-lər və TS t-hCO neyronları. f, sinaptik hadisələrin tezliyi və amplitudasının məcmu tezlik planı və kəmiyyəti (n=32 nəzarət neyronu, n=26 TS neyron; **P=0,0076 və P=0,8102). g, hCO və t-hCO-da TS və nəzarət neyronlarının Scholl təhlili. Kəsik xətlər müqayisə üçün insan L2/3 postnatal piramidal neyronlarını göstərir (n = 24 nəzarət t-hCO neyronları, n = 21 TS t-hCO neyronları, n = 8 nəzarət hCO neyronları və n = 7 TS hCO neyronları). Məlumatlar orta ± standart sapma kimi ifadə edilir
t-hCO-nun insan korteks neyronlarının morfoloji və funksional xüsusiyyətlərini yüksək səviyyədə təkrarlamaq qabiliyyəti bizi t-hCO-nun xəstəlik fenotiplərini aşkar etmək üçün istifadə oluna biləcəyini araşdırmağa sövq etdi. Biz neyronlarda fəaliyyətdən asılı gen transkripsiyasını başlatan CaV1.2-ni kodlayan gendə funksiyanın artması mutasiyaları nəticəsində yaranan ağır neyroinkişaf pozğunluğu olan TS-ə diqqət yetirdik. Ən çox görülən əvəzetmə (p.G406R) və üç nəzarət (Şəkil 3a) daşıyan üç TS xəstəsindən hCO əldə etdik. Transplantasiyadan sonra biz dendritik morfologiyanın nəzarətlərlə müqayisədə TS neyronlarında dəyişdirildiyini tapdıq (Şəkil 3b və genişləndirilmiş məlumatlar, Şəkil 8a, b), ilkin dendritlərin sayında iki dəfə artım və dendritik uzunluğun orta və ümumi azalması ilə ümumi artım (Şəkil 3c və uzadılmış məlumatlar, Şəkil 8c). Bu, nəzarət neyronları ilə müqayisədə TS-də onurğaların artan sıxlığı və spontan EPSC-lərin artan tezliyi ilə əlaqələndirildi (Şəkil 3d-f və genişləndirilmiş məlumatlar, Şəkil 8g). Əlavə təhlil nəzarət ilə müqayisədə t-hCO TS-də anormal dendritik budaqlanma nümunələrini aşkar etdi, lakin fərqləndirmənin oxşar mərhələsində in vitro TS hCO-da deyil (Şəkil 3g). Bu, TS-də aktivliyə bağlı dendritik büzülmə ilə bağlı əvvəlki hesabatlarımıza uyğundur və bu transplantasiya platformasının xəstəlik fenotiplərini in vivo aşkar etmək qabiliyyətini vurğulayır.
Daha sonra t-hCO hüceyrələrinin S1 siçovuluna funksional olaraq nə dərəcədə inteqrasiya olunduğunu soruşduq. Gəmiricilərdəki S1, ipsilateral ventral bazal və posterior talamik nüvələrdən, eləcə də ipsilateral motor və ikincil somatosensor kortekslərdən və kontralateral S1-dən güclü sinaptik girişlər alır (Şəkil 4a). İnnervasiya modelini bərpa etmək üçün hCO-nu quduz virusu-dG-GFP/AAV-G ilə yoluxdurduq və 3 gün sonra hCO-nu S1 siçovuluna köçürdük. Transplantasiyadan 7-14 gün sonra ipsilateral S1 və ventral bazal qanqliyaların neyronlarında sıx GFP ifadəsini müşahidə etdik (Şəkil 4b, c). Bundan əlavə, thalamic marker netrin G1 antikor boyanması t-hCO (Şəkil. 4d, e) talamus sonluğu mövcudluğunu aşkar. Bu afferent proqnozların t-hCO hüceyrələrində sinaptik reaksiyalar yarada biləcəyini qiymətləndirmək üçün biz talamokortikal təbəqənin kəskin hissələrində insan hüceyrələrindən bütün hüceyrə qeydlərini həyata keçirdik. Siçovul S1-in, daxili kapsulun, ağ maddənin, t-hCO yaxınlığındakı liflərin elektrik stimullaşdırılması və ya AMPA reseptor antaqonisti NBQX-ə məruz qalan t-hCO neyronlarında t-hCO-nun yaratdığı qısa gecikmə EPSC-lərdə opsin ifadə edən talamik sonluqların optogenetik aktivasiyası. (Şəkil 4f, g və genişləndirilmiş məlumatlar, Şəkil 9a-g). Bu məlumatlar t-hCO-nun anatomik olaraq siçovul beyninə inteqrasiya olunduğunu və siçovulların ev sahibi toxuması tərəfindən aktivləşdirilə biləcəyini nümayiş etdirir.
a, Quduzluğu izləmə təcrübəsinin sxematik diaqramı. b, GFP və t-hCO və siçovul serebral korteksi (yuxarı panel) arasında insana xas STEM121 ifadəsi. Siçovulun ipsilateral ventral bazal nüvəsində (VB) (aşağı sol) və ipsilateral S1 (aşağı sağ) GFP ifadəsi də göstərilir. Ölçək çubuğu, 50 µm. Qırmızı kvadratlar beynin şəkillərin çəkildiyi sahələri təmsil edir. c, GFP ifadə edən hüceyrələrin kəmiyyəti (n = 4 siçovul). d, e — t-hCO-da Netrin G1+ talamik terminallar. d, t-hCO və VB nüvələrini ehtiva edən koronal bölməni göstərir. Ölçək çubuğu, 2 mm. e, t-hCO (solda) və VB (sağ) neyronlarında Netrin G1 və STEM121 ifadəsini göstərir. Ölçək çubuğu, 50 µm. Narıncı nöqtəli xətt t-hCO sərhədini göstərir. f, g, S1 siçovulunda (f) və ya daxili kapsulda (g) elektrik stimullaşdırılmasından sonra t-hCO neyronlarının cari izləri, (bənövşəyi) və ya olmayan (qara) NBQX (solda). NBQX olan və olmayan EPSC amplitüdləri (n = 6 S1 neyron, *P = 0,0119; və n = 6 daxili kapsul neyron, **P = 0,0022) (mərkəz). Siçovul S1 (f) və ya daxili kapsulun (g) (sağda) elektrik stimullaşdırılmasına cavab olaraq EPSC göstərən t-hCO neyronlarının faizi. aCSF, süni serebrospinal maye. h, 2P görüntüləmə təcrübəsinin sxematik diaqramı (solda). GCaMP6-ların t-hCO-da ifadəsi (orta). Ölçək çubuğu, 100 µm. GCaMP6-ların flüoresan vaxt fasiləsi (sağda). i, spontan fəaliyyət flüoresansının Z-balı. j, bığların stimullaşdırılmasının sxematik təsviri. k, bir sınaqda z-hesablanmış 2P flüoresan trayektoriyaları, misal xanalarda sıfır zamanında (kesikli xətt) bığ sapması ilə uyğunlaşdırılmışdır. l, sıfır anda (qırmızı xətt) (qırmızı) və ya təsadüfi yaradılan zaman ştamplarına (boz) bığ sapmasına uyğunlaşdırılmış bütün hüceyrələrin populyasiya üzrə orta z-hesab cavabları. m. Optik işarələmə üzrə təcrübənin sxematik diaqramı. n, Mavi lazer stimullaşdırılması və ya bığın əyilməsi zamanı nümunə t-hCO hüceyrəsindən xam gərginlik əyriləri. Qırmızı oxlar işığın (yuxarıda) və ya bığın əyilməsinin (aşağıda) səbəb olduğu ilk sünbülləri göstərir. Boz kölgə bığların əyilmə dövrlərini göstərir. o, Pik işıq dalğa formaları və bığların əyilmə reaksiyaları. p, nümunənin hüceyrələrində bığların sapması ilə uyğunlaşdırılmış bir cəhdin sünbülləri. 0 bığ sapmasını göstərir (kesik xətt). q, bütün fotohəssas hüceyrələr üçün populyasiya üzrə orta hesablanmış z-balı atəş sürəti, sıfır anda (kesik xətt) (qırmızı) və ya təsadüfi yaradılan vaxt ştamplarına (boz) uyğunlaşdırılmış bığ sapması. r, Bığ sapması (n = 3 siçovul) ilə əhəmiyyətli dərəcədə modulyasiya edilən fotosensitiv bölmələrin nisbəti (solda). Pik z-hesab gecikmə (n = 3 siçovul; n = 5 (açıq yaşıl), n = 4 (tünd yaşıl) və siçovul başına n = 4 (göy) bığ sapmasının modulyasiya vahidi) (sağda). Məlumatlar orta ± standart sapma kimi ifadə edilir
Daha sonra t-hCO-nun in vivo duyğu stimulları ilə aktivləşdirilə biləcəyini soruşduq. Genetik olaraq kodlanmış kalsium göstəriciləri GCaMP6-nı ifadə edən hCO-nu S1 siçovullarına köçürdük. 150 gündən sonra biz lif fotometriyası və ya iki fotonlu kalsium görüntüləmə apardıq (Şəkil 4h və genişləndirilmiş məlumatlar, Şəkil 10a). Biz t-hCO hüceyrələrinin sinxronlaşdırılmış ritmik fəaliyyət nümayiş etdirdiyini aşkar etdik (Şəkil 4i, Genişləndirilmiş Məlumat, Şəkil 10b və Əlavə Video 1). Pik t-hCO fəaliyyətini xarakterizə etmək üçün anesteziya edilmiş transplantasiya siçovullarında hüceyrədənkənar elektrofizioloji qeydlər apardıq (genişlənmiş məlumatlar, Şəkil 10c-f). MRT görüntülərindən stereotaksik koordinatlar yaratdıq; beləliklə, bu qeydə alınmış vahidlər ehtimal olunan insan neyronlarını təmsil edir, baxmayaraq ki, tək elektrofiziologiya mənşə növünü müəyyən etməyə imkan vermir. Sinxronlaşdırılmış fəaliyyət partlayışlarını müşahidə etdik (genişlənmiş məlumatlar, Şəkil 10d). Partlayışlar təxminən 460 ms davam etdi və təxminən 2 saniyəlik səssizlik dövrləri ilə ayrıldı (genişlənmiş məlumatlar, Şəkil 10d, e). Ayrı-ayrı bölmələr hər partlayışda orta hesabla təxminən üç mərmi atdı ki, bu da hər partlayış üçün qeydə alınmış bölmələrin təxminən 73%-ni təşkil edir. Fərdi bölmələrin fəaliyyəti yüksək nisbətdə idi və bu korrelyasiya eyni şəraitdə qeydə alınan peyvənd olunmamış heyvanlarda müəyyən edilmiş vahidlərdən daha yüksək idi (genişlənmiş məlumatlar, Şəkil 10f). Müəyyən edilmiş insan mənşəli neyronların sünbül reaksiyalarını daha da xarakterizə etmək üçün, işığa həssas kation kanalı rhodopsin 2 (hChR2) ifadə edən hCO ilə transplantasiya edilmiş anesteziya edilmiş siçovullar üzərində işıq etiketləmə təcrübələri apardıq, bunun vasitəsilə t-hCO neyronları qısa gecikmə müddətində tanınır (mavi işığa cavab 10 ms-dən az). t-hCO neyronları kalsium görüntüləməsində müşahidə olunanlara bənzər tezliklərdə spontan fəaliyyət partlayışlarını, eləcə də işıq işarəsi olmadıqda t-hCO-da elektrofizioloji qeydləri nümayiş etdirdi (genişlənmiş məlumatlar, Şəkil 10c-g). In vitro qeydə alınmış hCO-nun müvafiq mərhələlərində heç bir kortəbii fəaliyyət müşahidə edilməmişdir. t-hCO-nun sensor stimullar tərəfindən aktivləşdirilə biləcəyini qiymətləndirmək üçün biz siçovulların bığlarını t-hCO-dan qısa müddətə yayındırdıq (Şəkil 4j, m və genişləndirilmiş məlumatlar, Şəkil 10h, k). Əvvəlki tədqiqatlara görə8,10, t-hCO hüceyrələrinin bir alt qrupu, məlumatların təsadüfi vaxt möhürləri ilə müqayisə edildiyi zaman müşahidə olunmayan, bığ sapmasına cavab olaraq artan fəaliyyət göstərdi (Şəkil. 4k-q və genişləndirilmiş məlumatlar, Şəkil 10h-q). Həqiqətən, opto-etiketli vahid vahidlərin təxminən 54% -i, təxminən 650 ms-də zirvəyə çatan, bığ stimullaşdırılmasından sonra əhəmiyyətli dərəcədə artan həyəcan dərəcəsini göstərdi (Şəkil 4r). Birlikdə götürüldükdə, bu məlumatlar t-hCO-nun müvafiq funksional girişləri qəbul etdiyini və ətraf mühitin stimulları ilə aktivləşdirilə biləcəyini göstərir.
Daha sonra t-hCO-nun davranışa nəzarət etmək üçün siçovullarda dövrələri aktivləşdirə biləcəyini araşdırdıq. Əvvəlcə t-hCO neyronlarının aksonlarının siçovulun ətraf toxumalarına proyeksiya edib-etmədiyini araşdırdıq. Biz hCO-nu EYFP (hChR2-EYFP) ilə birləşdirilən hChR2 kodlayan lentivirusla yoluxdurduq. 110 gündən sonra eşitmə, motor və somatosensor kortekslər də daxil olmaqla ipsilateral kortikal bölgələrdə, həmçinin striatum, hipokampus və talamus da daxil olmaqla subkortikal bölgələrdə EYFP ifadəsini müşahidə etdik (Şəkil 5a). Bu efferent proqnozların siçovul hüceyrələrində sinaptik reaksiyalara səbəb olub-olmadığını qiymətləndirmək üçün biz kəskin beyin hissələrində siçovul beyin qabığı hüceyrələrini qeyd etməklə hChR2-EYFP ifadə edən t-hCO hüceyrələrini optik olaraq aktivləşdirdik. Mavi işıq ilə t-hCO aksonlarının aktivləşdirilməsi, NBQX tərəfindən bloklanan siçovul piramidal korteks neyronlarında qısa gecikmə EPSC-lərə səbəb oldu (Şəkil 5b-g). Bundan əlavə, bu cavablar tetrodotoksin (TTX) tərəfindən bloklana və 4-aminopiridin (4-AP) tərəfindən bərpa edilə bilər ki, bu da onların monosinaptik əlaqələrdən qaynaqlandığını göstərir (Şəkil 5e).
a, akson izləmənin sxematik diaqramı (solda). t-hCO EYFP ifadəsi (sağda). Ölçək çubuğu, 100 µm. A1, eşitmə qabığı, ACC, anterior singulat korteks, d. zolaq, dorsal zolaq, HPC, hipokampus; Diafraqma, lateral septum, mPFC, medial prefrontal korteks, piri, piriform korteks, v. striatum, ventral striatum, VPM, talamusun ventropostomedial nüvəsi, VTA, ventral tegmental bölgə. Qırmızı kvadratlar beynin şəkillərin çəkildiyi sahələri təmsil edir. b, stimullaşdırma təcrübəsinin sxematik diaqramı. c, d, İnsan (c) EYFP+ t-hCO və ya siçovul (d) EYFP- hüceyrələrində mavi işığın yaratdığı foto cərəyan (üst) və gərginliyin (aşağıda) reaksiya nümunələri. e, f, TTX və 4-AR (yaşıl), TTX (boz) və ya aCSF (qara) (e), (bənövşəyi) və ya olmayan (qara) ilə t-hCO aksonlarının mavi işıq stimullaşdırılmasından sonra siçovul neyronlarının cari izləri ) ) NBQX (e). g, siçovul hüceyrələrində mavi işığın səbəb olduğu cavabların gecikməsi (n = 16 hüceyrə); üfüqi zolaqlar orta gecikmə müddətini (7,13 ms) göstərir (solda). NBQX ilə və ya NBQX olmadan qeydə alınan işıqla oyanmış EPSC-lərin amplitüdü (n = 7 hüceyrə; *** P < 0.0001) (orta). NBQX ilə və ya NBQX olmadan qeydə alınan işıqla oyanmış EPSC-lərin amplitüdü (n = 7 hüceyrə; *** P < 0.0001) (orta). Genişlənmiş EPSC, pulsuz və ya NBQX (n = 7 kletok; ***P <0,0001) (mərkəzdə). NBQX ilə və ya NBQX olmadan qeydə alınmış işığın səbəb olduğu EPSC-lərin amplitüdü (n = 7 hüceyrə; *** P < 0.0001) (mərkəz).使用或不使用NBQX 记录的光诱发EPSC 的振幅（n = 7 个细胞；***P < 0,0001）（中）使用或不使用NBQX 记录的光诱发EPSC 的振幅（n = 7 个细胞；***P < 0,0001）（中） Genişlənmiş EPSC, pulsuz və ya NBQX (n = 7 kletok; ***P <0,0001) (mərkəzdə). NBQX ilə və ya NBQX olmadan qeydə alınmış işığın səbəb olduğu EPSC-lərin amplitüdü (n = 7 hüceyrə; *** P < 0.0001) (mərkəz).Mavi işığa cavab verən EPSC-ləri göstərən siçovul hüceyrələrinin faizi (sağda). h, Davranış tapşırığının sxematik diaqramı. d0, gün 0. i. Təlimin 1-ci günü (solda) və ya 15-ci günündə (sağda) nümunəvi heyvanların çıxışı. 1-ci gündə (solda) və ya 15-ci gündə (sağ mərkəzdə) həyata keçirilən yalamaların orta sayı (n = 150 mavi işıq sınağı, n = 150 qırmızı işıq sınağı; *** P < 0.0001). 1-ci gündə (solda) və ya 15-ci gündə (sağ mərkəzdə) həyata keçirilən yalamaların orta sayı (n = 150 mavi işıq sınağı, n = 150 qırmızı işıq sınağı; *** P < 0.0001). Среднее количество облизываний, выполненных в день 1 (слева) vəя день 15 (v centre справа) (n = 150 ispytanis sinim svetom, n = 150 ispytanis krasnım svetom; ***P <0,0001). 1-ci gündə (solda) və ya 15-ci gündə (mərkəzdə sağda) həyata keçirilən yalamaların orta sayı (n = 150 mavi işıq sınağı, n = 150 qırmızı işıq sınağı; *** P < 0.0001).第1 天（左）或第15 天（右中）执行的平均舔次数（n = 150 次蓝光试验，，n =次红光试验；***P <0,0001）。第1 天（左）或第15 天（右中）执行的平均舔次数（n = 150 次蓝光试验，，n =次红光试验；***P < 0,001 Среднее количество облизываний, выполненных в день 1 (слева) vəя день 15 (v centre справа) (n = 150 ispytanis sinim svetom, n = 150 ispytanis krasnım svetom; ***P <0,0001). 1-ci gündə (solda) və ya 15-ci gündə (mərkəzdə sağda) həyata keçirilən yalamaların orta sayı (n = 150 mavi işıq sınağı, n = 150 qırmızı işıq sınağı; *** P < 0.0001).1-ci gündə (mərkəzdə solda) və ya 15-ci gündə (sağda) qırmızı və mavi işıq sınaqları üçün məcmu yalamalar. NS, əhəmiyyətli deyil. j,k, 1 və ya 15-ci gündə hChR2-EYFP (j) və ya nəzarət flüoroforunu (k) ifadə edən t-hCO ilə transplantasiya edilmiş bütün heyvanların davranış xüsusiyyətləri (hChR2-EYFP: n = 9 siçovul, ** P = 0,0049; nəzarət: n = 9, P = 0,14). l, üstünlük hesabının təkamülü (n = 9 hChR2, n = 9 nəzarət; **P <0.001, ***P <0.0001). l, üstünlük hesabının təkamülü (n = 9 hChR2, n = 9 nəzarət; **P <0.001, ***P <0.0001). l, Эволюция показателя предпочтения (n = 9 hChR2, n = 9 nəzarət; **P <0,001, ***P <0,0001). l, üstünlük hesabının təkamülü (n = 9 hChR2, n = 9 nəzarət; **P <0.001, ***P <0.0001). l，偏好评分的演变（n = 9 hChR2，n = 9 对照；**P <0,001，***P <0,0001）。 l，偏好评分的演变（n = 9 hChR2，n = 9 对照；**P <0,001，***P <0,0001）。 l, Эволюция показателей предпочтения (n = 9 hChR2, n = 9 nəzarət; **P <0,001, ***P <0,0001). l, üstünlük ballarının təkamülü (n = 9 hChR2, n = 9 nəzarət; **P <0.001, ***P <0.0001).m, S1-də t-hCO-nun optogenetik aktivləşdirilməsinə cavab olaraq FOS ifadəsi. FOS ifadəsi (solda) və kəmiyyət göstəriciləri (qrup başına n = 3; *P <0.05, **P <0.01 və ***P <0.001) (sağda) göstərilir. FOS ifadəsi (solda) və kəmiyyət göstəriciləri (qrup başına n = 3; *P <0.05, **P <0.01 və ***P <0.001) (sağda) göstərilir. Tərkibindəki FOS (slova) və kolicestvennogo əməliyyatları (n = 3 qrup; * P <0,05, ** P <0,01 və *** P <0,001) (sprava). FOS ifadəsi (solda) və kəmiyyət göstəriciləri (qrup başına n = 3; *P<0.05, **P<0.01 və ***P<0.001) göstərilir (sağda).显示了FOS 表达（左）和量化（每组n = 3；*P < 0,05、**P <0,01 和***P < 0,001）（右）（右）显示了FOS 表达（左）和量化（每组n = 3；*P < 0,05、**P <0,01 和***P < 0,001）（右）（右） Tərkibindəki FOS (slova) və kolicestvennogo əməliyyatları (n = 3 qrup; * P <0,05, ** P <0,01 və *** P <0,001) (sprava). FOS ifadəsi (solda) və kəmiyyət göstəriciləri (qrup başına n = 3; *P<0.05, **P<0.01 və ***P<0.001) göstərilir (sağda).Ölçək çubuğu, 100 µm. Məlumatlar BLA, bazolateral tonzil, MDT, dorsomedial talamik nüvə, PAG, periaqueductal bozun orta ± standart səhvi kimi ifadə edilir.
Nəhayət, t-hCO-nun siçovulların davranışını modulyasiya edə biləcəyini soruşduq. Bunu sınamaq üçün biz hChR2-EYFP ifadə edən hCO-nu S1-ə köçürdük və 90 gün sonra işıq çatdırılması üçün optik lifləri t-hCO-ya implantasiya etdik. Daha sonra siçovulları dəyişdirilmiş operant kondisioner paradiqması ilə öyrətdik (Şəkil 5h). Heyvanları davranış test kamerasına yerləşdirdik və təsadüfi olaraq 5 saniyəlik mavi (473 nm) və qırmızı (635 nm) lazer stimulunu tətbiq etdik. Heyvanlar mavi işığın stimullaşdırılması zamanı yaladıqları halda, qırmızı işığın stimullaşdırılması zamanı yalamadıqları halda su mükafatı aldılar. Təlimin ilk günündə heyvanlar mavi və ya qırmızı işıqla stimullaşdırıldıqda yalamada heç bir fərq göstərmədilər. Bununla belə, 15-ci gündə hChR2-EYFP ifadə edən hCO ilə transplantasiya edilmiş heyvanlar, qırmızı işıq stimullaşdırılması ilə müqayisədə mavi işıqla stimullaşdırıldıqda daha aktiv yalama göstərdilər. Yalama davranışındakı bu dəyişikliklər nəzarət flüoroforunu ifadə edən hCO ilə transplantasiya edilmiş nəzarət heyvanlarında müşahidə edilmədi (öyrənmə müvəffəqiyyət dərəcəsi: hChR2 89%, EYFP 0%, Şəkil 5i-1 və Əlavə Video 2). Bu məlumatlar t-hCO hüceyrələrinin mükafat axtaran davranışı stimullaşdırmaq üçün siçovul neyronlarını aktivləşdirə biləcəyini göstərir. Bu davranış dəyişikliklərində hansı siçovulların t-hCO sinir dövrələrinin iştirak edə biləcəyini öyrənmək üçün 90 dəqiqə sonra təlim keçmiş heyvanlarda və yığılmış toxumalarda t-hCO-nu optogenetik olaraq aktivləşdirdik. İmmunohistokimya, stimullaşdırılmamış nəzarət heyvanlarında və ya heyvanlarda ifadə olunan medial prefrontal korteks, medial talamus və periaqueduktal boz maddə daxil olmaqla, motivasiya edilmiş davranışda iştirak edən bir neçə beyin bölgəsində fəaliyyətdən asılı FOS zülalının ifadəsini aşkar etdi. düyü. 5 m). Birlikdə götürüldükdə, bu məlumatlar göstərir ki, t-hCO davranışı idarə etmək üçün siçovulların neyron fəaliyyətini modullaşdıra bilər.
Sinir orqanoidləri insan inkişafı və in vitro xəstəliklərin öyrənilməsi üçün perspektivli sistemi təmsil edir, lakin onlar in vivo mövcud olan sxemlər arasında əlaqələrin olmaması ilə məhdudlaşır. Biz in vivo olaraq insan hüceyrəsinin inkişafını və funksiyasını öyrənmək üçün immun çatışmazlığı olan erkən postnatal siçovulların S1-ə hCO-nu köçürdük. Biz t-hCO-nun vitro28-də müşahidə olunmayan yetkin hüceyrə növlərini inkişaf etdirdiyini və t-hCO-nun anatomik və funksional olaraq gəmirici beyinə inteqrasiya etdiyini göstərdik. t-hCO-nun gəmirici sinir sxemlərinə inteqrasiyası bizə insanın hüceyrə fəaliyyəti ilə tədqiq edilmiş heyvan davranışı arasında əlaqə yaratmağa imkan verdi ki, t-hCO neyronları davranış reaksiyalarını idarə etmək üçün siçovulların neyron fəaliyyətini modullaşdıra bilər.
Təsvir etdiyimiz platforma insan hüceyrələrinin gəmiricilərin beyninə köçürülməsi ilə bağlı əvvəlki tədqiqatlara nisbətən bir sıra üstünlüklərə malikdir. Birincisi, hCO-nu anatomik və funksional inteqrasiyanı asanlaşdıra biləcək erkən postnatal siçovulların inkişaf edən korteksinə köçürdük. İkincisi, t-hCO MHİ monitorinqi bizə canlı heyvanlarda qraftın vəziyyətini və böyüməsini öyrənməyə imkan verdi, uzunmüddətli çox heyvan tədqiqatları aparmağa və bir neçə hiPS hüceyrə xəttinin etibarlılığını təyin etməyə imkan verdi. Nəhayət, insan hüceyrələri üçün daha az dağıdıcı olan və siçovulların beyinlərində insan korteks neyronlarının inteqrasiyasını və nəslini təşviq edə bilən təcrid olunmuş tək hüceyrəli süspansiyonlar əvəzinə, bütöv orqanoidləri köçürdük.
Biz etiraf edirik ki, bu platformada irəliləyişlərə baxmayaraq, müvəqqəti, məkan və növlər arası məhdudiyyətlər inkişafın erkən mərhələsində transplantasiyadan sonra belə yüksək dəqiqliklə insan sinir dövrələrinin formalaşmasına mane olur. Məsələn, t-hCO-da müşahidə edilən kortəbii fəaliyyətin kortikal inkişaf zamanı müşahidə olunan ritmik fəaliyyətə bənzər bir inkişaf fenotipini təmsil edib-etmədiyi və ya bunun t-hCO-da mövcud olan supressiv hüceyrə növlərinin olmaması ilə əlaqədar olduğu aydın deyil. Eynilə, t-hCO-da laminasiyanın olmaması zəncir bağlantısına nə dərəcədə təsir etdiyi aydın deyil30. Gələcək iş insan mikroqliyası, insan endotel hüceyrələri və 6-cı məclisdən istifadə edərək göstərildiyi kimi müxtəlif nisbətlərdə GABAergik interneyronlar kimi digər hüceyrə növlərinin inteqrasiyasına, eləcə də dəyişdirilmiş t-hCO-da sinir inteqrasiyası və emalının necə baş verə biləcəyini başa düşməyə yönəldiləcəkdir. xəstələrdən alınan hüceyrələrdə transkripsiya, sinaptik və davranış səviyyələri.
Ümumiyyətlə, bu in vivo platforma in vitro insan beyninin inkişafı və xəstəliklərin tədqiqatını tamamlaya bilən güclü mənbədir. Biz gözləyirik ki, bu platforma başqa cür mümkün olmayan xəstələrdən əldə edilən hüceyrələrdə yeni zəncir səviyyəli fenotipləri kəşf etməyə və yeni terapevtik strategiyaları sınaqdan keçirməyə imkan verəcək.
Biz daha əvvəl təsvir edildiyi kimi HiPS hüceyrələrindən hCO2.5 yaratdıq. Qidalandırıcı təbəqələrdə yetişdirilmiş hiPS hüceyrələrindən hCO istehsalını başlatmaq üçün hiPS hüceyrələrinin bütöv koloniyaları dispase (0,35 mq/mL) istifadə edərək mədəniyyət qablarından çıxarıldı və tərkibində hiPS hüceyrə mədəniyyət mühiti olan qablar olan ultra aşağı bərkidici plastik kulturalara köçürüldü. (Corning) iki SMAD inhibitoru dorsomorfin (5 μM; P5499, Sigma-Aldrich) və SB-431542 (10 μM; 1614, Tocris) və ROCK inhibitoru Y-27632 (10 μM; S1049, Selleckchem) ilə əlavə edilmişdir. İlk 5 gün ərzində hiPS hüceyrə mühiti gündəlik dəyişdirildi və dorsomorfin və SB-431542 əlavə edildi. Süspansiyonun altıncı günündə neyrobazal-A (10888, Life Technologies), A vitamini olmayan B-27 əlavəsi (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies), penisilin və Life Technologies, 24-cü günə qədər epidermal böyümə faktoru (EGF; 20 ng ml−1; R&D Systems) və fibroblast böyümə faktoru 2 (FGF2; 20 ng ml−1; R&D Systems) ilə tamamlandı. 25-ci gündən 42-ci günə qədər mühit beyindən əldə edilən neyrotrofik amil (BD-2) və Petex-ml-2 ilə tamamlandı. neyrotrofin 3 (NT3; 20 ng ml-1; Peprotech) hər gün orta dəyişikliklərlə. Süspansiyonun altıncı günündə neyrobazal-A (10888, Life Technologies), A vitamini olmayan B-27 əlavəsi (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies), penisilin və Life Technologies, 24-cü günə qədər epidermal böyümə faktoru (EGF; 20 ng ml−1; R&D Systems) və fibroblast böyümə faktoru 2 (FGF2; 20 ng ml−1; R&D Systems) ilə tamamlandı. 25-ci gündən 42-ci günə qədər mühit beyindən əldə edilən neyrotrofik amil (BD-2) və Petex-ml-2 ilə tamamlandı. neyrotrofin 3 (NT3; 20 ng ml-1; Peprotech) hər gün orta dəyişikliklərlə.Süspansiyonun altıncı günündə sinir sferoidləri Neyrobasal-A (10888, Life Technologies), A vitamini olmayan B-27 əlavəsi (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies), penisilin olan sinir mühitinə köçürüldü.və streptomisin (1:100, Life Technologies) və əlavə epidermal faktorlar (EGF; 20 нг/мл; R&D Systems) və faktor sağa fibroblastov 2 (FGF2; 20 нг/мл; R&D Systems) 24-ə qədər. və streptomisin (1:100, Life Technologies) və epidermal böyümə faktoru (EGF; 20 ng/ml; R&D Systems) və fibroblast böyümə faktoru 2 (FGF2; 20 ng/ml; R&D Systems) ilə 24-cü günə qədər əlavə edilmişdir.25-ci gündən 42-ci günə qədər mühitə beyindən əldə edilən neyrotrofik amil (BDNF; 20 ng ml-1, Peprotech) və neyrotrofin 3 (NT3; 20 ng ml-1, Peprotech) əlavə edildi, mühit hər gün dəyişdirildi.在悬浮的第6 天，将神经球体转移到含有neurobasal-A（10888，Life Technologies）、不含维A2生生补充剂（12587，Life Technologies）、GlutaMax（1:100，Life Technologies）、青霉素的神经培养基中弈1（1） Technologies）并辅以表皮生长因子（EGF；20 ng ml-1；R&D Systems）和成纤维维细胞生长因子2（F2（F2（R&D Systems）直至第24 天。在 悬浮 的 第 第 6 天 将 神经 球体 转移 含有 含有 neurobasal-a （10888 ， Life Technologies（维维的 b-27 补充剂 （12587 ， Life Technologies） Glutamax （1: 100 ， Life TechNOGIS青霉素 的 神经 培酻 基100 ， Life Technologies） 表皮 生长 因子 （（（20 ng ml-1 ； r & d Systems） 成 纤维 细胞 生长 细胞 生长 2（fg 2（fng 1；R&D Systems）直至第24天。 6 yaşdan çox olan neyrobazal-A (10888, Life Technologies), dobavku V-27 (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies), Neyrobazal-A (10888) стрептомицин (1:100, Life Technologies) epidermal faktorun sağalması (EGF; 20 ng ml-1; R&D Systems) və faktor sağa fibroblastov 2 (FGF2; 20 нг мл-1) 1; 6-cı gündə neyrobazal-A (10888, Life Technologies), A vitamini olmayan B-27 əlavəsi (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies), penisilin-neytrallaşdırılmış Life Technologies (1088, Life Technologies), neyrobazal-A (10888, Life Technologies), neyrobazal süspansiyonlar (1088, Life Technologies), penisilin-neytrallaşdırılmış Life Technologies (1088, Life Technologies), epidermal böyümə faktoru (EGF; 20 ng ml-1; R&D Systems) və fibroblast böyümə faktoru 2 (FGF2; 20 ng ml-1) 1 ilə əlavə edilmişdir; R&D Systems) 24-ə qədər. R&D Systems) 24-cü günə qədər.25-ci gündən 42-ci günə qədər beyindən alınan neyrotrofik amil (BDNF; 20 ng ml-1, Peprotech) və neyrotrofik amil 3 (NT3; 20 ng ml-1, Peprotech) hər gün mədəniyyət mühitinə əlavə edildi. Bir dəfə orta dəyişiklik.43-cü gündən başlayaraq, hCO əlavə olunmamış neyrobazal-A mühitində (NM; 1088022, Thermo Fisher) hər 4-6 gündən bir orta dəyişikliklə saxlanıldı. Qidalandırıcısız şəraitdə yetişdirilmiş hiPS hüceyrələrindən hCO əldə etmək üçün hiPS hüceyrələri Accutase (AT-104, Innovate Cell Technologies) ilə 7 dəqiqə ərzində 37°C-də inkubasiya edilmiş, tək hüceyrələrə ayrılmış və AggreWell 800 boşqablarına (34815, STEMCELL Technologies × 3 quyusunda) örtülmüşdür. ROCK inhibitoru Y-27632 (10 μM; S1049, Selleckchem) ilə əlavə edilmiş əsas 8 mühiti. 24 saatdan sonra quyulardakı media dorsomorfin (2,5 μM; P5499, Sigma-Aldrich) və SB-431542 (10 μM4;) ilə əlavə edilmiş Essential 6 mühiti (A1516401, Life Technologies) olan mediaya yuxarı və aşağı pipetlə vuruldu. , Tocrida). 2-ci gündən 6-cı günə qədər Essential 6 mühiti gündəlik dorsomorfin və SB-431542 əlavəsi ilə əvəz edilmişdir. Altıncı gündən etibarən neyrosfer süspansiyonları neyrobazal mühitə köçürüldü və yuxarıda göstərildiyi kimi saxlanıldı.
Bütün heyvan prosedurları Stanford Universitetinin Laboratoriya Heyvanlarına Qulluq İnzibati Komitəsi (APLAC) tərəfindən təsdiq edilmiş heyvanlara qulluq qaydalarına uyğun olaraq həyata keçirilmişdir. Hamilə evtimik RNU (rnu/+) siçovulları alınmış (Charles River Laboratories) və ya yerləşdirilmişdir. Heyvanlar 12 saatlıq işıq-qaranlıq dövründə qida və su ad libitum ilə saxlanılırdı. Üç-yeddi günlük çılpaq (FOXN1–/–) siçovul balaları kəsilmədən əvvəl yetişməmiş bığların böyüməsi ilə müəyyən edilmişdir. Kuklalar (erkək və dişi) 2-3% izofluran ilə anesteziya edildi və stereotaksik çərçivəyə yerləşdirildi. S1-dən yuxarı təxminən 2-3 mm diametrli kəllə sümüyünün trepanasiyası dura materinin bütövlüyünü qoruyaraq həyata keçirildi. Sonra duranı deşmək üçün kraniotomiyadan kənarda 30 G iynə (təxminən 0,3 mm) istifadə edin. Sonra nazik 3×3 sm parafilm üzərinə HCO tətbiq edin və artıq mühiti çıxarın. 23 G, 45° iynəyə bərkidilmiş Hamilton şprisindən istifadə edərək hCO-nu iynənin ən distal ucuna yumşaq bir şəkildə çəkin. Sonra şprisi stereotaksik cihaza qoşulmuş şpris pompasına quraşdırın. Sonra iynənin ucunu durada əvvəllər düzəldilmiş 0,3 mm enində deşilmiş çuxurun üzərinə qoyun (z = 0 mm) və iynə dura mater A arasında olana qədər şprisi 1–2 mm (z = təxminən –1,5 mm) daraldın. Sıx möhür əmələ gələnə qədər. Sonra şprisi z = -0,5 mm-də kortikal səthin mərkəzinə qaldırın və dəqiqədə 1-2 µl sürətlə hCO yeridin. hCO inyeksiyası başa çatdıqdan sonra iynə dəqiqədə 0,2-0,5 mm sürətlə geri çəkilir, dəri tikilir və bala dərhal tam sağalana qədər isti istilik yastığına qoyulur. Bəzi heyvanlar ikitərəfli transplantasiya edildi.
Bütün heyvan prosedurları Stanford Universitetinin APLAC tərəfindən təsdiqlənmiş heyvanlara qulluq qaydalarına uyğun olaraq həyata keçirildi. Siçovullar (transplantasiyadan sonra 60 gündən çox) 5% izofluran anesteziyası ilə induksiya edilmiş və görüntüləmə zamanı 1-3% izofluran ilə anesteziya edilmişdir. Vizuallaşdırma üçün AVANCE istifadə edərək, Beynəlxalq Elektrik Şirkəti (IECO) gradient sürücüsü ilə 7 Tesla aktiv şəkildə qorunan üfüqi quyu skaneri Bruker (Bruker Corp.), daxili diametri 120 mm (600 mT/m, 1000 T/m/s) olan ekranlaşdırılmış qradiyent əlavədən istifadə edilmişdir. III, səkkiz kanallı çox bobinli RF və çox nüvəli imkanlar və onu müşayiət edən Paravision 6.0.1 platforması. Qeydiyyat 86 mm daxili diametrli aktiv şəkildə ayrılmış həcmli RF bobinindən və yalnız qəbul üçün dörd kanallı krio-soyudulmuş RF bobinindən istifadə etməklə aparılmışdır. Eksenel 2D Turbo-RARE (təkrar vaxtı = 2500 ms, əks-səda vaxtı = 33 ms, 2 orta) 16 dilim çəkilişi, dilim qalınlığı 0,6-0,8 mm, 256 × 256 nümunədən ibarətdir. Siqnallar daxili diametri 2 sm (Rapid MR International, LLC) olan kvadrat ötürücü həcmli RF bobinindən istifadə edərək qəbul edilmişdir. Nəhayət, 3D göstərmə və həcm təhlili üçün daxili Imaris (BitPlane) səthi qiymətləndirmə funksiyalarından istifadə edin. Uğurlu transplantasiya, nəql edilmiş yarımkürədə davamlı T2-çəkili MRT siqnalının sahələrinin formalaşdığı bir transplant kimi müəyyən edildi. Qraftın rədd edilməsi, transplantasiya edilmiş yarımkürədə davamlı T2-çəkili MRT siqnalının sahələrini yaratmayan bir greft kimi müəyyən edilmişdir. Subkortikal t-hCO sonrakı analizdən çıxarıldı.
İki fotonlu kalsium görüntüləməsi üçün hCO-da GCaMP6-ları stabil şəkildə ifadə etmək üçün hiPS hüceyrələri pLV[Exp]-EF1a::GcaMP6s-WPRE-Puro ilə yoluxduruldu və sonra antibiotiklər seçildi. Qısaca, hüceyrələr EDTA ilə dissosiasiya edildi və polibrenin (5 μg/ml) və 15 μl virusun iştirakı ilə təxminən 300.000 hüceyrə sıxlığında 1 ml Essential 8 mühitində dayandırıldı. Hüceyrələr daha sonra 60 dəqiqə süspansiyonda inkubasiya edildi və hər quyuya 50.000 hüceyrə sıxlığında toxum səpildi. Birləşdikdən sonra hüceyrələr 5-10 gün ərzində və ya sabit koloniyalar görünənə qədər 5-10 μg ml-1 puromisin ilə müalicə edildi. Kəskin hCO infeksiyası əvvəllər təsvir edildiyi kimi5 bəzi dəyişikliklərlə həyata keçirilmişdir. Qısaca, gün 30-45 hCO-nu 100 µl sinir mühiti olan 1,5 ml Eppendorf mikrosentrifuqa borularına köçürün. Sonra təxminən 90 µl mühit çıxarılır, boruya 3-6 µl yüksək titrli lentivirus (0,5 x 108-dən 1,2 x 109-a qədər) əlavə edilir və hCO 30 dəqiqə ərzində inkubatora köçürülür. Sonra hər boruya 90-100 µl mühit əlavə edin və boruları gecə ərzində inkubatora qaytarın. Növbəti gün, aşağı əlavə plitələr təzə sinir orta hCO transfer. 7 gündən sonra hCO infeksiya keyfiyyətinin vizuallaşdırılması və qiymətləndirilməsi üçün 24 quyulu şüşə dib plitələrə köçürüldü. pLV[Exp]-SYN1::EYFP-WPRE və pLV[Exp]-SYN1::hChR2-EYFP-WPRE VectorBuilder tərəfindən yaradılıb. Lentivirus əksər eksperimentlərdə istifadə olunur, çünki o, ev sahibinin genomuna inteqrasiya olunub, yoluxmuş hüceyrə xətlərində reportyor gen ifadəsinə imkan verir. Quduzluğun təqibi üçün 30-45-ci gün hCO quduz-ΔG-eGFP və AAV-DJ-EF1a-CVS-G-WPRE-pGHpA (plazmid # 67528, Addgene) ilə birgə yoluxmuş, 3 gün ərzində hərtərəfli yuyulmuş və S1-də 7 gün ərzində siçovullara köçürülmüşdür.
İmmunositokimya üçün heyvanlar anesteziyaya məruz qaldı və PBS ilə transkardial olaraq perfuziya edildi, ardınca 4% paraformaldehid (PBS-də PFA; Elektron Mikroskopiya Elmləri). Beyinlər 4% PFA-da 2 saat və ya bir gecədə 4°C-də sabitlənmiş, 48-72 saat ərzində PBS-də 30% saxarozada dondurulmuş və 1:1, 30% saxarozaya yerləşdirilmişdir: OCT (Tissue-Tek OCT Compound 4583, Sakura Finetek) və coron a 0m3 istifadə edərək hazırlanmışdır. (Leica). Qalın kəsiklərin immunohistokimyası üçün heyvanlar PBS ilə perfuziya edildi və beyin parçalandı və vibratom (Leica) istifadə edərək 300-400 µm-də koronal hissələrə bölündü və bölmələr 30 dəqiqə ərzində 4% PFA ilə sabitləndi. Sonra kriyoseksiyalar və ya qalın kəsiklər PBS ilə yuyuldu, 1 saat otaq temperaturunda (10% normal eşşək serumu (NDS) və PBS-də seyreltilmiş 0,3% Triton X-100) bloklandı və 4 ° C-də blokaj məhlulu ilə bağlandı. – İnkubasiya Kriyoseksiyaları bir gecədə inkubasiya edildi və qalın kəsiklər 5 gün ərzində inkubasiya edildi. İstifadə olunan ilkin antikorlar bunlardır: anti-NeuN (siçan, 1:500; ab104224, abcam) anti-CTIP2 (siçovul, 1:300; ab18465, abcam), anti-GFAP (dovşan, 1:1,000; Z0334, Dako), anti-GFP, G17,10, toyuq; GeneTex), anti-HNA (siçan, 1:200; ab191181, abcam), anti-NeuN (dovşan, 1:500; ABN78, Millipore), anti-PDGFRA (dovşan, 1:200; sc-338, Santa Cruz), anti-PPP1R17 (dovşan, H42019); Anticisimlər), anti-RECA-1 (siçan, 1:50; ab9774, abcam), anti-SCG2 (dovşan, 1:100; 20357-1-AP, Proteintech), anti-SOX9 (keçi, 1:500; AF3075, R&D Systems), Netrin, R610; Sistemlər), anti-STEM121 (siçan, 1:200; Y40410, Takara Bio), anti-SATB2 (siçan, 1:50; ab51502, abcam), anti-GAD65/67 (dovşan, 1:400; ABN904, Millipore) və anti-IBA1 (goat, ab17, ab10;). İstifadə olunan əsas anticisimlər bunlardır: anti-NeuN (siçan, 1:500; ab104224, abcam) anti-CTIP2 (siçovul, 1:300; ab18465, abcam), anti-GFAP (dovşan, 1:1,000; Z0334, Dako), anti-GFP (toyuq, G17,10; GeneTex), anti-HNA (siçan, 1:200; ab191181, abcam), anti-NeuN (dovşan, 1:500; ABN78, Millipore), anti-PDGFRA (dovşan, 1:200; sc-338, Santa Cruz), anti-PPP1R17 (dovşan, H42019); Antikorlar), anti-RECA-1 (siçan, 1:50; ab9774, abcam), anti-SCG2 (dovşan, 1:100; 20357-1-AP, Proteintech), anti-SOX9 (keçi, 1:500; AF3075, R&D Systems), Netrin, G01; R&D Systems), anti-STEM121 (siçan, 1:200; Y40410, Takara Bio), anti-SATB2 (siçan, 1:50; ab51502, abcam), anti-GAD65/67 (dovşan, 1:400; ABN904, Millipore) və anti-IBA1, ab701; abcam). İstifadə olunan birinci antitela: anti-NeuN (мышиные, 1:500; ab104224, abcam), anti-CTIP2 (крысиные, 1:300; ab18465, abcam), anti-GFAP (кроличьи, 1:10ko), anti-GFAP (кроличьи, 1:1030) (курица, 1:1000; GTX13970, GeneTex), анти-HNA (мышь, 1:200; ab191181, abcam), anti-NeuN (krolik, 1:500; ABN78, Millipore), anti-PDGFRA (krolik, 1:200, anti-PDGFRA), anti-PDGFRA (krolik, 1:200, anti-sc-PP11); (krolik, 1:200; HPA047819, Atlas Antikorları), анти-RECA-1 (мышь, 1:50; ab9774, abcam), anti-SCG2 (krolik , 1:100; 20357-1-AP, Proteintech), anti-SOX9 (козий, R350; & Systems), & Systems нетрин G1a (koziy, 1:100; AF1166, R&D Systems), anti-STEM121 (мышиный , 1:200; Y40410, Takara Bio), anti-SATB2 (мышь, 1:50; ab51502, abcam), anti-GAD65/67:AB409; Millipore) və анти-IBA1 (коза, 1 :100; аб5076, абкам). İstifadə edilən əsas antikorlar bunlardır: anti-NeuN (siçan, 1:500; ab104224, abcam), anti-CTIP2 (siçovul, 1:300; ab18465, abcam), anti-GFAP (dovşan, 1:1000; Z0334, Dako), anti-GFP (toyuq, GTX100); anti-HNA (siçan, 1:200; ab191181, abcam), anti-NeuN (dovşan, 1:500; ABN78, Millipore), anti-PDGFRA (dovşan, 1:200; sc-338, Santa Cruz), anti-PPP1R17 (dovşan, H1907), Anti-PAdi; anti-RECA-1 (siçan, 1:50; ab9774, abcam), anti- SCG2 (dovşan, 1:100; 20357-1-AP, Proteintech), anti-SOX9 (keçi, 1:500; AF3075, R&D Systems), netrin G1a (keçi, R16; 16), anti-Sistem STEM121 (siçan, 1:200; Y40410, Takara Bio), anti-SATB2 (siçan, 1:50; ab51502, abcam), anti-GAD65/67 (dovşan, 1:400; ABN904, Millipore) və anti-IBA1 (keçi, abkam, 1507).使用的一抗是：抗NeuN（小鼠＠,1:500；ab104224，abcam）抗CTIP2（大鼠＠,1:3 00；ab18465，abcam），抗GFAP（兔，1:1,000；Z0334，Dako）,抗-GF P（鸡，1:1,000；GTX13970，GeneTex），抗HNA（小鼠＠,1:200；ab1911 81，abcam），抗NeuN（兔，1:500；ABN78，Millipore），抗PDGFRA（兔， 1:200；sc-338，Santa Cruz），抗PPP1R17（兔，1:200；HPA047819，Atlas抗体），抗RECA-1（小鼠＠,1:50；ab9774，abcam），抗SCG2（兔）, 1:100；20357-1-AP，Proteintech），抗SOX9（山羊，1:500；AF3075，Ar-ge Sistemləri），Netrin G1a（山羊6（6（AF10，1:11 Sistemlər），抗STEM121（小鼠, 1:200;使用的一抗是：抗NeuN（小鼠＠,1:500；ab104224，abcam）抗CTIP2（大鼠＠＠，1 :300；ab18465，abcam），抗GFAP（兔，1:1,000；Z0334，Dako），抗-GFP（鸡，1:1,000；GTX13970，GeneTex），抗HNA（小鼠＠,1:200；ab 191181，abcam），抗NeuN（兔，1:500；ABN78，Millipore％弔４抗1: 200；sc-338，Santa Cruz），抗PPP1R17（兔，1:200；HPA047819，Atlas抗体），抗RECA-1（小鼠＠,1:50；ab9774，abcam），抗SCG2 100；20357-1-AP，Proteintech），抗SOX9（山羊，1:500；AF3075，R&D Systems），Netrin G1a（山羊；AF，1:110D Sistemlər）頏1:20, ;Y40410, Takara Bio), anti-SATB2 (siçan, 1:50; ab51502, abcam), anti-GAD65/67 (dovşan, 1:400; ABN904, Millipore) və anti-IBA1 (keçi, 1:100; ab5076, abcam)。İstifadə olunan əsas antikorlar bunlardır: anti-NeuN (siçan, 1:500; ab104224, abcam), anti-CTIP2 (siçovul, 1:300; ab18465, abcam), anti-GFAP (dovşan, 1:1000; Z0334, Dako). , anti-GFP (toyuq, 1:1000; GTX13970, GeneTex), anti-HNA (siçan, 1:200; ab191181, abcam), anti-NeuN (dovşan, 1:500; ABN78, Millipore), anti-PDGFRA (dovşan, C200, C200); anti-PPP1R17 (dovşan, 1:200; HPA047819, Atlas antikoru), anti-RECA-1 (siçan, 1:50; ab9774, abcam), anti-SCG2 (dovşan), 1:100;20357-1-AP, Proteintech), анти-SOX9 (koza, 1:500; AF3075, R&D Systems), Нетрин G1a (koza, 1:100; AF1166, R&D Systems), анти -STEM121 (мышь, 1:200, TakaraSA, Y40410) 1:50; ab51502, abcam), анти-GAD65/67 (кролик, 1:400; ABN904, Millipore) və anti-IBA1 (коза, 1:100; аб5076, абкам). 20357-1-AP, Proteintech), anti-SOX9 (keçi, 1:500; AF3075, R&D Systems), Netrin G1a (keçi, 1:100; AF1166, R&D Systems), anti-STEM121 (siçan, 1:200; Takaramo, Y4021) 1:50; ab51502, abcam), anti-GAD65/67 (dovşan, 1:400; ABN904, Millipore) və anti-IBA1 (keçi, 1:100; ab5076, abkam).Daha sonra bölmələr PBS ilə yuyuldu və ikincil antikor ilə 1 saat otaq temperaturunda (dondurulmuş bölmələr) və ya bir gecədə 4 ° C-də (qalın hissələr) inkubasiya edildi. Bloklama məhlulunda 1:1000 nisbətində seyreltilmiş Alexa Fluor ikincil antikoru (Life Technologies) istifadə edilmişdir. PBS ilə yuyulduqdan sonra nüvələr Hoechst 33258 (Life Technologies) ilə vizuallaşdırıldı. Nəhayət, slaydlar Aquamount (Polysciences) istifadə edərək örtükləri olan (Fisher Scientific) mikroskopun üzərinə yerləşdirildi və şəkil üzərində Keyence flüoresan mikroskopunda (BZ-X analizatoru) və ya Leica TCS SP8 konfokal mikroskopunda (Las-X) təhlil edildi. Şəkillər ImageJ proqramı (Fiji) vasitəsilə işlənib. İnsan neyronlarının t-hCO və siçovul korteksindəki nisbətini ölçmək üçün t-hCO-nun mərkəzində, siçovul qabığının kənarında və ya yaxınlığında 387,5 mkm enində düzbucaqlı şəkillər çəkildi. Qraft kənarları toxuma şəffaflığında, HNA+ nüvələrində və/yaxud toxuma avtoflüoresansındakı dəyişikliklərin qiymətləndirilməsi ilə müəyyən edilmişdir. Hər bir təsvirdə NeuN+ və HNA+ hüceyrələrinin ümumi sayı eyni sahədəki NeuN+ hüceyrələrinin ümumi sayına bölündü. Yalnız təsvir müstəvisində nüvələri olan hüceyrələrin sayılmasını təmin etmək üçün hesablamaya yalnız Hoechst+ olan hüceyrələr daxil edilir. Statistik səhvi azaltmaq üçün ən azı 1 mm ilə ayrılmış iki şəkil ortalandı.
Nümunə toplanmasından bir həftə əvvəl, hCO transplant heyvanlarını (təxminən 8 ay fərqləndirmə) sensor stimullaşdırmanı minimuma endirmək üçün bığları kəsilmiş qaranlıq bir otağa qoyun. Nüvələrin təcrid edilməsi əvvəllər təsvir olunduğu kimi bəzi dəyişikliklərlə aparılmışdır. Qısaca olaraq, t-hCO və hCO yuyucu-mexaniki hüceyrə lizisi və 2 ml şüşə toxuma dəyirmanı (D8938, Sigma-Aldrich/KIMBLE) istifadə edərək məhv edildi. Xam nüvələr daha sonra 40 µm filtrdən istifadə edərək süzüldü və saxaroza sıxlığı gradientini yerinə yetirməzdən əvvəl 320 q-da 4 °C-də 10 dəqiqə sentrifuqa edildi. Santrifüj pilləsindən sonra (4°C-də 20 dəqiqə ərzində 320 q) nümunələr 0,2 vahid µl-1 RNaz inhibitoru (40 u µl-1, AM2682, Ambion) əlavə edilməklə 0,04% BSA/PBS-də yenidən dayandırıldı və 40 µm axın filtrindən keçirildi. Daha sonra dissosiasiya olunmuş nüvələr 0,02% BSA ehtiva edən PBS-də yenidən dayandırıldı və Chromium Single Cell 3′ çipinə yükləndi (hər zolaqda 8000 hüceyrənin təxmini bərpası). snRNA-seq kitabxanaları Chromium Single cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics) ilə hazırlanmışdır. snRNA-seq kitabxanaları Chromium Single cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics) ilə hazırlanmışdır. Biblioteki snRNA-seq ilə qəbul edilmiş Chromium Singlecell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics). SnRNA-seq kitabxanaları Chromium Single cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics) istifadə edərək hazırlanmışdır. snRNA-seq 文库是使用Chromium Singlecell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics) 制备的。 snRNA-seq 文库是使用Chromium Singlecell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics) 制备的。 Kitabxana snRNA-seq istifadə edərək Chromium Single Cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics) istifadə edin. snRNA-seq kitabxanası Chromium Single Cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics) istifadə edərək hazırlanmışdır.Müxtəlif nümunələrdən olan kitabxanalar NovaSeq S4 (Illumina) üzərində Admera Health tərəfindən birləşdirilmiş və ardıcıllıqla tərtib edilmişdir.
Hər ehtimal olunan nüvə barkodu üçün gen ifadə səviyyələri 10x Genomics CellRanger analiz proqram paketindən (versiya 6.1.2) istifadə edilməklə ölçüldü. Konkret olaraq, oxunuşlar mkref əmri ilə yaradılmış insan (GRCh38, Ensemble, versiya 98) və siçovul (Rnor_6.0, Ensemble, versiya 100) istinad genomlarının kombinasiyası ilə uyğunlaşdırılıb və kəmiyyət müəyyən etmək üçün –include-introns=TRUE əmri ilə count istifadə edərək intron bölgələrinə uyğunlaşdırılmış oxunuşlar daxildir. t-hCO nümunələri üçün insan nüvələri bütün xəritələnmiş oxunuşların ən azı 95%-nin insan genomuna uyğun olması mühafizəkar tələbi əsasında müəyyən edilmişdir. Bütün sonrakı təhlillər R paketi (versiya 4.1.2) Seurat (versiya 4.1.1)32 istifadə edərək CellRanger-dən süzülmüş barkod massiv çıxışında aparılmışdır.
Sonrakı analizə yalnız yüksək keyfiyyətli nüvələrin daxil olmasını təmin etmək üçün hər bir nümunə üçün iterativ filtrləmə prosesi həyata keçirilmişdir. Birincisi, tapılan 1000-dən az unikal gen və ümumi mitoxondrilərin 20%-dən çoxu olan aşağı keyfiyyətli nüvələr müəyyən edilir və çıxarılır. Sonradan, xam gen sayı matrisi sctransform(vst.flavor=”v2″) funksiyasından istifadə etməklə nizamlanmış mənfi binomial reqressiya ilə normallaşdırıldı ki, bu da defolt parametrlərdən istifadə edərək 3000 ən çox dəyişən geni müəyyən etdi.Ölçü azaldılması yuxarı dəyişən genlərdə həyata keçirildi. 30 (dims = 30 diz sahələrinin vizual təftişi əsasında seçilmiş və bütün nümunələr və ansambl analizləri üçün istifadə edilmişdir) Daha sonra anormal aşağı gen sayına (10-cu faizdən aşağı median), anormal yüksək mitoxondrilin və identifikasiyaedici 9 faizdən yuxarıya əsaslanan genləri təsnif etmək üçün bir neçə təkrarlama klasterləşdirmə (qətnamə = 1) həyata keçirdik. DoubletFinder33 paketi ilə müəyyən edilmiş aşağı keyfiyyətli klasterlər və/yaxud şübhəli əkizlərin yüksək hissəsi (ortalama DoubletFinder 95-ci faizdən yuxarı olan nümunələr (n=3) və hCO nümunələri (n=3) IntegrateData funksiyasından istifadə edərək, yuxarıdakı parametrlər kimi təsvir edilmişdir yuxarıda.
Aşağı keyfiyyətli ləpələr çıxarıldıqdan sonra inteqrasiya olunmuş verilənlər toplusu qruplaşdırıldı (qətnamə = 0.5) və UMAP34 vizuallaşdırma məqsədləri üçün daxil edildi. Hər klaster üçün marker genləri normallaşdırılmış gen ifadə məlumatlarından hesablanmış standart parametrlərlə FindMarkers funksiyasından istifadə etməklə müəyyən edilmişdir. Biz fetal və yetkin kortikal istinad məlumat dəstlərini marker gen ifadəsi 19,20,21,35 və annotasiya ilə birləşdirərək əsas hüceyrə siniflərini müəyyənləşdirir və təsnif edirik. Xüsusilə, dövran edən prekursorlar MKI67 və TOP2A ifadəsi ilə müəyyən edilmişdir. Progenitor klasterlər mitotik transkriptlərin olmaması, gec metafaza fetal korteksdə təsvir olunan multipotent qlial progenitator qrupları ilə yüksək üst-üstə düşməsi və EGFR və OLIG1 ifadəsi ilə müəyyən edilmişdir. Biz astrosit terminindən astrositlərin gec radial gliadan astrositlərin yetişməsinə qədər bir neçə differensiasiya vəziyyətini əhatə etmək üçün istifadə edirik. Astrosit qrupları yüksək səviyyələrdə SLC1A3 və AQP4 ifadə edir və fetal radial glia və/və ya yetkin astrositlərin alt tipləri ilə xəritədə göstərilmişdir. OPC-lər PDGFRA və SOX10-u, oliqodendrositlər isə miyelinləşmə markerlərini (MOG və MYRF) ifadə edir. Qlutamaterjik neyronlar neyron transkriptlərinin (SYT1 və SNAP25), GABAergik markerlərin (GAD2) olmaması və NEUROD6, SLC17A7, BCL11B və ya SATB2 ifadəsinin olması ilə müəyyən edilmişdir. GluN neyronları daha sonra yuxarı (SATB2 ifadəsi və BCL11B itkisi) və dərin (BCL11B ifadəsi) alt siniflərinə bölündü. Ehtimal olunan alt lövhə (SP) neyronları dərin GluN markerlərinə əlavə olaraq ST18 və SORCS1 kimi məlum SP18 markerlərini ifadə edir. Xoroid pleksus kimi hüceyrələr TTR ifadəsi ilə müəyyən edildi və meningeal kimi hüceyrələr fibroblastla əlaqəli genləri və istinad məlumat dəstinin xəritələnmiş pial/damar hüceyrələrini ifadə etdi.
t-hCO və hCO alt sinifləri arasında gen ifadəsinin diferensial təhlili Libra R paketindən (versiya 1.0.0) istifadə edərək həyata keçirilən nümunələrdə təkrarlanan yeni hazırlanmış psevdo-batch metodundan istifadə etməklə aparılmışdır. Xüsusilə, hər bir nümunə replikasiyası üçün müəyyən bir hüceyrə sinfi üçün hüceyrələrdəki genlərin sayını toplamaq yolu ilə qruplar üçün edgeR log-ehtimal testləri (versiya 3.36.0, paket R) həyata keçirilmişdir. İstilik xəritəsinin vizuallaşdırılması üçün, normallaşdırılmış milyon başına (CPM) dəyərlər edgeR (cpm () funksiyası) istifadə edərək hesablanır və miqyaslanır (orta = 0, standart sapma = 1 əldə etmək üçün). Əhəmiyyətli dərəcədə yuxarı tənzimlənmiş t-hCO GluN genlərinin Gen Ontologiyası (GO) zənginləşdirmə təhlili aparıldı (Benjamini-Hochberg, t-hCO GluN hüceyrələrinin ən azı 10% -ində ifadə edilən 0,05-dən az P dəyərini düzəltdi və dəyişiklikdə ən azı 2 dəfə artım). ToppGene Suite (https://toppgene.cchmc.org/) ilə həyata keçirilir37. Biz ToppFun tətbiqindən standart parametrlərlə istifadə edirik və GO ilə qeyd edilmiş hiperhəndəsi testlərdən hesablanmış Benjamini-Hochberg tərəfindən düzəldilmiş P-dəyərlərini bildiririk.
İlkin təkhüceyrəli RNT-seq və ya yetkin snRNA-seq19,20,21,22-nin istinad tədqiqatlarından annotasiya edilmiş hüceyrə qrupları ilə snRNA-seq klasterlərimizi uyğunlaşdırmaq üçün biz qoşalaşmış verilənlər bazası inteqrasiyası yanaşmasını tətbiq etdik. Biz Seurat-da SCTransform (v2) normallaşdırma iş prosesindən verilənlər dəstləri arasında klaster üst-üstə düşmələrini inteqrasiya etmək və müqayisə etmək üçün istifadə etdik (yuxarıda göstərilən parametrlərdən istifadə etməklə). Fərdi məlumat dəstləri hesablama səmərəliliyi üçün hər orijinal çoxluq üçün 500-ə qədər hüceyrə və ya nüvəyə qədər təsadüfi olaraq alt-set edilmişdir. Daha əvvəl təsvir edildiyi kimi oxşar yanaşmadan istifadə edərək, klasterin üst-üstə düşməsi istinad klasterinin etiketi ilə üst-üstə düşən hər bir yığılmış çoxluqdakı hüceyrələrin və ya nüvələrin nisbəti kimi müəyyən edilmişdir. GluN-ləri daha da təsnif etmək üçün biz GluN hüceyrələrimizə istinad verilənlər toplusunun etiketlərini təyin etmək üçün GluN alt çoxluq məlumatları üçün Seuratın TransferData iş prosesindən istifadə etdik.
t-hCO və hCO nümunələrinin qlobal transkriptomunun yetişmə vəziyyətini qiymətləndirmək üçün psevdotoplu nümunələrimizi insan beyninin inkişafını əhatə edən böyük RNT ardıcıllığından ibarət olan BrainSpan/psychENCODE23 ilə müqayisə etdik. Konsepsiyadan 10 həftə sonra və daha sonra, əvvəllər BrainSpan kortikal nümunələrində aktiv olaraq müəyyən edilmiş 5567 gendə (məlumatlarımızla birlikdə) kortikal nümunələrdən kombinə edilmiş nümunə ilə normallaşdırılmış gen ifadə matrisi üzərində PCA həyata keçirdik (kubik modeldən istifadə edərək yaşla izah edilən inkişaf dispersiyasında 50% -dən çox olaraq təyin olundu). Bundan əlavə, biz əvvəllər təsvir edildiyi kimi mənfi olmayan matris faktorizasiyasından istifadə edərək neyroinkişafın əsas transkriptom imzaları ilə əlaqəli genləri əldə etdik. Qeyri-mənfi matris faktorizasiya prosedurundan istifadə etməklə hesablanmış nümunə çəkiləri Şek. Zhu et al.38 tərəfindən təsvir edilən beş imzanın hər biri üçün genişləndirilmiş məlumatlarla 5b. Yenə də fəaliyyətdən asılı olan transkripsiya markerləri əvvəllər dərc edilmiş tədqiqatlardan əldə edilmişdir. Xüsusilə, ERG və LRG, Əlavə Cədvəl 3 Hrvatin və digərlərindən vizual stimullaşdırmadan sonra siçan vizual korteksinin snRNA-seq kolleksiyası ilə müəyyən edilmiş glutamaterjik neyronlarda əhəmiyyətli dərəcədə tənzimləndi. İnsan tərəfindən zənginləşdirilmiş LRG-lər KCl ilə aktivləşdirilmiş insan fetal beyin mədəniyyətlərindən əldə edildi və stimullaşdırmadan 6 saat sonra yığıldı və süzülmüş genlər gəmiricilərdə deyil, insanlarda əhəmiyyətli dərəcədə tənzimləndi (Əlavə Cədvəl 4). Bu gen dəstlərindən istifadə edərək gen dəstinin zənginləşdirilməsinin təhlili birtərəfli Fişerin dəqiq testindən istifadə etməklə həyata keçirilib.
234 mM saxaroza, 11 mM qlükoza, 26 mM NaHCO3, K25 mM, K25.Ml olan bölmələr üçün izofluran ilə siçovulları anesteziya edin, beyinləri çıxarın və soyuq (təxminən 4°C) oksigenli (95% O2 və 5% CO2) saxaroza məhluluna qoyun. NaH2PO4, 10 mM MgSO4 və 0,5 mM CaCl2 (təxminən 310 mOsm). t-hCO ehtiva edən siçovul beyninin tac hissələri (300-400 µm) əvvəllər təsvir edildiyi kimi Leica VT1200 vibratomundan istifadə etməklə hazırlanmışdır39. Bölmələr daha sonra 10 mM qlükoza, 26 mM NaHCO3, 2.5 mM KCl, 1.25 mM NaHPO4, 1 mM MgSO4, 2 mM CaCl2 və NaH29M1Cl-dən hazırlanmış aCSF-dən ibarət davamlı otaq temperaturunda oksigenləşmə ilə bölmə kamerasına köçürüldü. çəkilişdən ən azı 45 dəqiqə əvvəl. Bölmələr aCSF (95% O2 və 5% CO2 flakonu) ilə davamlı olaraq perfuziya edildiyi daldırılmış kamerada qeyd edildi. Bütün məlumatlar otaq temperaturunda qeydə alınıb. t-hCO neyronları 127 mM kalium qlükonat, 8 mM NaCl, 4 mM maqnezium ATP, 0.3 mM natrium GTP, 10 mM HEPES və 0.6 mM HEPES və daxili tənzimlənmiş 0.6, pH2 məhlulu ilə doldurulmuş borosilikat şüşə pipetlə dayandırıldı, KOH2. (290 mOsm). Bərpa etmək üçün qeyd məhluluna biositin (0,2%) əlavə edildi.
Məlumat MultiClamp 700B gücləndiricisi (Molekulyar Cihazlar) və Digidata 1550B rəqəmsallaşdırıcısı (Molekulyar Cihazlar) istifadə edilməklə əldə edilib, 2 kHz-də aşağı ötürücülü süzülüb, 20 kHz-də rəqəmləşdirilib və Clampfit (Molekulyar Cihazlar), Origin (OriginPro) istifadə edərək təhlil edilib. 2021b, OriginLab). və xüsusi MATLAB funksiyaları (Mathworks). Birləşmə potensialı JPCalc istifadə edərək hesablanmış və qeydlər -14 mV hesablanmış dəyərə uyğunlaşdırılmışdır. IV əməliyyat -250-dən 750 pA-a qədər 10-25 pA addımlarda bir sıra cari addımlardan ibarətdir.
Talamus, ağ maddə və S1 afferentləri, əvvəllər təsvir edildiyi kimi, hCO neyronlarının yamaq-qısqac qeydləri zamanı talamokortikal dilimlərdə elektriklə stimullaşdırıldı. Qısaca olaraq beyin 10° bucaq altında əyilmiş 3D çap masasına yerləşdirilib və beynin ön hissəsi 35° bucaq altında kəsilib. Daha sonra beyin kəsilmiş səthə yapışdırıldı və talamokortikal çıxıntılı aksonları qoruyaraq bölmələrə bölündü. Bipolyar volfram elektrodları (0,5 MΩ) ikinci mikromanipulyatora quraşdırılmış və hər bir hüceyrədə dörd bölgəni (daxili kapsul, ağ maddə, S1 və hCO) stimullaşdırmaq üçün strateji olaraq yerləşdirilmişdir. 0,03-0,1 Hz-də 300 µA fazik stimullaşdırmadan sonra sinaptik reaksiyaları qeyd edin.
hChR2-ifadə edən hCO neyronları 480 nm-də aktivləşdirildi və LED (Prizmatix) tərəfindən yaradılan işıq impulsları hüceyrələrin yaxınlığında hChR2 ifadəsini qeyd etmək üçün ×40 obyektiv (0.9 NA; Olympus) vasitəsilə tətbiq edildi. İşıqlandırılan sahənin diametri təxminən 0,5 mm, ümumi gücü isə 10-20 mVt-dır. Nəbz eni 10 ms olaraq təyin edildi, bu, davranış öyrənmə təcrübəsi zamanı verilən nəbzə uyğundur. 1-dən 20 Hz-ə qədər müxtəlif stimullaşdırma tezlikləri istifadə edildi, lakin kəmiyyətin müəyyən edilməsi üçün yalnız seriyanın ilk nəbzindən istifadə edildi. Sinaptik inhibitor və ya asanlaşdırıcı yollara təsirini minimuma endirmək üçün qatarlar arasındakı intervallar adətən 30 saniyədən çox olur. hChR2 cavabının monosinaptik olub olmadığını yoxlamaq üçün EPSC reaksiyası yox olana qədər vannaya TTX (1 μM) tətbiq etdik və sonra 4-aminopiridin (4-AP; 100 μM) tətbiq etdik. Tipik olaraq, cavab LED atəşi və EPSC istehsalı arasında bir az daha uzun gecikmə ilə bir neçə dəqiqə ərzində qaytarılır. NBQX (10 μM) cavabın AMPA reseptorları tərəfindən idarə olunduğunu yoxlamaq üçün istifadə edilmişdir.
Keskin hCO bölmələri əvvəllər təsvir edildiyi kimi yaradılmışdır. Qısaca olaraq, hCO hissələri 4% agarozaya yerləşdirildi və tərkibində 126 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM NaH2PO4, 1 mM MgSO4, 2 mM CaCl2, 26 mM NaHCO3 və 10 mM NaHCO3 və 10-10 mM seqmentdə kəsilmiş hüceyrələrə köçürüldü. Leica VT1200 vibratoru ilə otaq temperaturunda 200–300 µm və otaq temperaturunda ASF-də saxlanılır. Sonra, birbaşa SliceScope mikroskopu (Scientifica) altında hCO bölmələrində bütün hüceyrələrin yamaq düşərgəsi qeydi aparıldı. Bölmələr aCSF (95% O2 və 5% CO2) ilə perfuziya edildi və hüceyrə siqnalları otaq temperaturunda qeyd edildi. hCO neyronları 127 mM kalium qlükonat, 8 mM NaCl, 4 mM maqnezium ATP, 0.3 mM natrium GTP, 10 mM HEPES və 0.6 mH EGTA (daxili KOH2, pOH2 ilə tənzimlənmiş) olan məhlul ilə doldurulmuş borosilikat şüşə pipetka istifadə edərək tətbiq edilmişdir. 290). Bərpa məqsədləri üçün daxili məhlula 0,2% Biocytin əlavə edin.
Məlumat MultiClamp 700B gücləndiricisi (Molekulyar Cihazlar) və Digidata 1550B rəqəmsallaşdırıcısından (Molekulyar Cihazlar) istifadə etməklə Clampex (Clampex 11.1, Molekulyar Cihazlar) tərəfindən əldə edilib, 2 kHz-də aşağı ötürücülü süzülüb, 20 kHz-də rəqəmsallaşdırılıb və Clamp10 üçün analiz edilib, analiz edilib. cihazlar) və xüsusi MATLAB funksiyaları (MATLAB 2019b, Mathworks). Qovşaq potensialı JPCalc istifadə edərək hesablanmış və qeydlər -14 mV hesablanmış birləşmə potensialına uyğunlaşdırılmışdır. IV əməliyyat -50-dən 250 pA-a qədər 5-10 pA addımlarla bir sıra cari addımlardan ibarətdir.
Sıxılmış neyronların morfoloji yenidən qurulması üçün daxili məhlula 0,2% biositin (Sigma-Aldrich) əlavə edildi. Hüceyrələr sındırıldıqdan sonra ən azı 15 dəqiqə astarlanır. Daha sonra qeydə alınmış membran tamamilə bağlanana qədər 1-2 dəqiqə ərzində pipet yavaş-yavaş çəkilir. Bölmə fiziologiyası prosedurundan sonra bölmələr gecə ərzində 4°C-də 4% PFA-da bərkidildi, PBS X3 ilə yuyuldu və streptavidinlə birləşdirilmiş DyLight 549 və ya DyLight 405 (Vector Labs) ilə 1:1000 nisbətində seyreltildi. Biositinlə doldurulmuş hüceyrələr (2%; Sigma-Aldrich) otaq temperaturunda 2 saat ərzində yamaq sıxacının qeydi zamanı etiketlənmişdir. Daha sonra bölmələr Aquamount (Thermo Scientific) istifadə edərək mikroskop slaydlarına quraşdırıldı və ertəsi gün ədədi diafraqma ×40 1,3, böyütmə ×0,9-1,0, xy olan yağa batırma obyektivindən istifadə edərək Leica TCS SP8 konfokal mikroskopunda vizuallaşdırıldı. Nümunə alma sürəti mikron başına təxminən 7 pikseldir. 1 µm intervalla Z-stackləri ardıcıl olaraq əldə edildi və hər bir neyronun bütün dendritik ağacını örtmək üçün z-stack mozaika və Leica əsaslı avtomatik tikiş həyata keçirildi. Daha sonra neuTube 40 interfeysindən istifadə edərək neyronlar yarı əl ilə izlənildi və SWC faylları yaradıldı. Daha sonra fayllar SimpleNeuriteTracer41 Fiji plagininə yükləndi (ImageJ, versiya 2.1.0; NIH).
İnsan kortikal toxuması Stenford Universitetinin İnstitusional Nəzarət Şurası tərəfindən təsdiq edilmiş protokola uyğun olaraq məlumatlı razılıqla əldə edilmişdir. Odadavamlı epilepsiya üçün cərrahiyyə əməliyyatının bir hissəsi kimi frontal korteksin (orta frontal girus) rezeksiyası ilə insan doğuşdan sonrakı toxumasının iki nümunəsi (3 və 18 yaş) əldə edilmişdir. Rezeksiyadan sonra toxumaları buz kimi soyuq NMDG-aCSF-də yığın: 92 mM NMDG, 2.5 mM KCl, 1.25 mM NaH2PO4, 30 mM NaHCO3, 20 mM HEPES, 25 mM qlükoza, 2 mM mM, 3 mM natrium piruvat, 0,5 mM CaCl2 4H2O və 10 mM MgSO4 7H2O. Konsentratlaşdırılmış xlorid turşusu ilə pH 7,3-7,4-ə qədər titr edin. Toxumalar 30 dəqiqə ərzində laboratoriyaya çatdırıldı və yuxarıda göstərilən prosedura uyğun olaraq tac kəsikləri götürüldü.
Bütün heyvan prosedurları Stanford Universitetinin APLAC tərəfindən təsdiqlənmiş heyvanlara qulluq qaydalarına uyğun olaraq həyata keçirildi. Siçovullar (transplantasiyadan sonra 140 gündən çox) 5% izofluran anesteziyası ilə induksiya edilmiş və əməliyyat zamanı 1-3% izofluran ilə anesteziya edilmişdir. Heyvanlar stereotaksik çərçivəyə (Kopf) yerləşdirildi və davamlı salınan buprenorfin (SR) dəri altına yeridildi. Kəllə üzə çıxarılır, təmizlənir və 3-5 sümük vinti taxılır. t-hCO-nu hədəfləmək üçün MRT görüntülərindən stereotaksik koordinatlar yaratdıq. Maraqlanan yerdə bir dəlik qazıldı və liflər (diametri 400 µm, NA 0.48, Doric) hCO səthindən 100 µm aşağı endirildi və UV şüası ilə müalicə olunan diş sementi (Relyx) ilə kəllə sümüyə bərkidildi.
Fiber fotometrik qeydlər əvvəllər təsvir edildiyi kimi yerinə yetirilmişdir42. Kortəbii fəaliyyəti qeyd etmək üçün siçovullar təmiz qəfəsə yerləşdirildi və fiber optik fotometrik məlumat toplama sisteminə qoşulmuş 400 µm diametrli fiber optik yamaq kabeli (Doric) implantasiya edilmiş fiber optik kabelə qoşuldu. Hərəkət fəaliyyətinin 10 dəqiqəlik qeydi zamanı heyvanlar qəfəsi araşdırmaqda sərbəst idilər. Uyarılan aktivliyi qeyd etmək üçün siçovullar (transplantasiyadan sonra 140 gündən çox) induksiya üçün 5% izofluran və baxım üçün 1-3% izofluran ilə anesteziya edilmişdir. Heyvanı stereotaktik çərçivəyə (Kopf) qoyun və t-hCO-nun əks tərəfindəki bığları təxminən 2 sm-ə qədər kəsilir və piezoelektrik aktuator (PI) ilə əlaqəli bir meshdən keçir. 400 µm fiber optik patch kabel (Doric) implantasiya edilmiş lifə qoşuldu və məlumat toplama sisteminə qoşuldu. Daha sonra t-hCO-nun əks tərəfindəki bığlar 20 dəqiqəlik qeyd müddəti ərzində pyezoelektrik sürücü tərəfindən təsadüfi vaxtlarda 50 dəfə (20 Hz-də 2 mm, hər təqdimat üçün 2 s) əyilmişdir. Xüsusi MATLAB kodu ilə əyilmə vaxtını idarə etmək üçün Arduino MATLAB Dəstək Paketindən istifadə edin. Hadisələr tranzistor-tranzistor məntiqi (TTL) impulslarından istifadə edərək məlumatların toplanması proqramı ilə sinxronlaşdırılır.
Siçovullar (transplantasiyadan sonra 140 gündən çox) 5% izofluran anesteziyası ilə induksiya edilmiş və əməliyyat zamanı 1-3% izofluran ilə anesteziya edilmişdir. Heyvanlar stereotaksik çərçivəyə (Kopf) yerləşdirildi və buprenorfin SR və deksametazon dəri altına yeridildi. Kəllə üzə çıxarılır, təmizlənir və 3-5 sümük vinti taxılır. t-hCO-nu hədəfləmək üçün MRT görüntülərindən stereotaksik koordinatlar yaratdıq. Dairəvi kraniotomiya (diametri təxminən 1 sm) birbaşa köçürülmüş hCO üzərində yüksək sürətli qazma ilə həyata keçirildi. Sümük mümkün qədər incə olduqdan sonra, lakin bütün sümüyü qazmadan əvvəl, əsas t-hCO-nu aşkar etmək üçün qalan bütöv çanaq diskini çıxarmaq üçün maşadan istifadə edin. Kraniotomiya steril şoran məhlulu ilə dolduruldu və kəllə sümüyünün üstünə UV şüası ilə bərkidilmiş diş sementi (Relyx) ilə örtük və xüsusi baş sancağı bərkidildi.
İki foton görüntüləmə Nikon LWD (×16, 0.8 NA) obyektivli Bruker multifoton mikroskopundan istifadə edilməklə həyata keçirilmişdir. GCaMP6 təsviri 920 nm-də 1,4x tək z-müstəvi böyütmə və 8x orta 7,5 kadr sürəti ilə həyata keçirilib. Siçovullar 5% izofluran anesteziyası ilə induksiya edildi və 1-3% izofluran ilə saxlanıldı. Siçovullar xüsusi hazırlanmış baş qurğusuna yerləşdirilib və lensin altına yerləşdirilib. Motor fəaliyyətinin 3 dəqiqəlik fon qeydi əldə edildi. 20 dəqiqəlik qeyd müddətində pikospriserdən istifadə edərək 50 puf (hər təqdimat 100 ms uzunluğunda) təsadüfi olaraq t-hCO-nun qarşısındakı bığ yastığına çatdırıldı. Xüsusi MATLAB kodu ilə partlayış vaxtını idarə etmək üçün Arduino MATLAB Dəstək Paketindən istifadə edin. TTL impulslarından istifadə edərək hadisələri məlumatların toplanması proqramı (PrairieView 5.5) ilə sinxronlaşdırın. Təhlil üçün şəkillər Ficidə başladılan MoCo proqramında afin korreksiyasından istifadə edərək xy hərəkəti üçün düzəldildi. CNMF-E43 istifadə edərək fərdi hüceyrələrdən flüoresan izlərin çıxarılması. Flüoressensiya maraq doğuran hər bir bölgə üçün çıxarıldı, dF/F əyrilərinə çevrildi və sonra z-xallarına çevrildi.
Siçovullar (transplantasiyadan sonra 140 gündən çox) 5% izofluran anesteziyası ilə induksiya edilmiş və əməliyyat zamanı 1-3% izofluran ilə anesteziya edilmişdir. Heyvanlar stereotaksik çərçivəyə (Kopf) yerləşdirildi və buprenorfin SR və deksametazon dəri altına yeridildi. t-hCO-nun əks tərəfindəki bığlar təxminən 2 sm-ə qədər kəsilmiş və piezoelektrik aktuatora qoşulmuş bir mesh vasitəsilə yivlənmişdir. Kəllə üzə çıxarılır və təmizlənir. Kəllə sümüyünə paslanmayan poladdan torpaq vinti bərkidilir. t-hCO-nu hədəfləmək üçün MRT görüntülərindən stereotaksik koordinatlar yaratdıq. Yalnız t-hCO yuxarıda yüksək sürətli qazma ilə dairəvi craniotomy (diametri təxminən 1 sm) həyata keçirir. Sümük mümkün qədər incə olduqdan sonra, lakin bütün sümüyü qazmadan əvvəl, əsas t-hCO-nu aşkar etmək üçün qalan bütöv çanaq diskini çıxarmaq üçün maşadan istifadə edin. Fərdi hüceyrələr torpaq vintlərinə əsaslanmış və RHD gücləndiriciləri (Intan) ilə əvvəlcədən gücləndirilmiş 32 kanallı və ya 64 kanallı yüksək sıxlıqlı silikon zondlardan (Cambridge Neurotech) istifadə edərək qeydə alınmışdır. Steril salin ilə doldurulmuş kraniotomiya vasitəsilə elektrodları hədəf sahəsinə endirmək üçün manipulyatordan istifadə edin. Məlumatların toplanması Open Ephys məlumat toplama sistemindən istifadə etməklə 30 kHz tezliyində aparılmışdır. Qeydiyyat yalnız 10-dan çox kanalda yüksək korrelyasiyalı ritmik spontan aktivliyi aşkar etdikdə davam etdi, bu da elektrodların greftdə yerləşdiyini göstərir (iki fotonlu kalsium görüntüləmə məlumatlarına əsasən). Motor fəaliyyətinin 10 dəqiqəlik fon qeydi əldə edildi. Daha sonra t-hCO-nun əks tərəfindəki bığlar 20 dəqiqəlik qeyd müddəti ərzində pyezoelektrik sürücü tərəfindən təsadüfi vaxtlarda 50 dəfə (20 Hz-də 2 mm, hər təqdimat üçün 2 s) əyilmişdir. Arduino üçün MATLAB Dəstək Paketindən (MATLAB 2019b) istifadə edərək, xüsusi MATLAB kodu ilə əyilmə vaxtını idarə edin. Hadisələri məlumat toplama proqramı ilə sinxronlaşdırmaq üçün TTL impulslarından istifadə edin.
Optik işarələmə təcrübələri üçün 473 nm lazerə (Omicron) qoşulmuş 200 µm optik yamaq kabeli (Doric) kraniotomiya üzərində yerləşdirilmiş 200 µm optik lifə qoşuldu. Bundan dərhal əvvəl jumper gücünü 20 mVt-a tənzimləyin. Steril salin ilə doldurulmuş kraniotomiya vasitəsilə elektrodları hədəf sahəsinə endirmək üçün manipulyatordan istifadə edin. Qeydiyyatın əvvəlində 473 nm (tezlik 2 Hz, nəbz müddəti 10 ms) on işıq impulsları buraxıldı. Fotohəssas hüceyrələr sınaqların 70% və ya daha çoxunda 10 ms işıqda sünbül reaksiyası göstərən hüceyrələr kimi müəyyən edilmişdir.