Tankewol foar jo besite oan Nature.com. Jo brûke in browserferzje mei beheinde CSS-stipe. Foar de bêste ûnderfining riede wy oan dat jo in bywurke browser brûke (of Kompatibiliteitsmodus yn Internet Explorer útskeakelje). Derneist, om trochgeande stipe te garandearjen, litte wy de side sjen sûnder stilen en JavaScript.
Toant in karrousel fan trije dia's tagelyk. Brûk de knoppen Foarige en Folgjende om troch trije dia's tagelyk te gean, of brûk de skúfknoppen oan 'e ein om troch trije dia's tagelyk te gean.
Sels-assemblearjende neurale organellen fertsjintwurdigje in beloftefol in vitro platfoarm foar it modellearjen fan minsklike ûntwikkeling en sykte. Organoïden misse lykwols de ferbining dy't yn vivo bestiet, wat de ryping beheint en yntegraasje mei oare sirkwy's dy't gedrach kontrolearje foarkomt. Hjir litte wy sjen dat kortikale organoïden ôflaat fan minsklike stamsellen dy't transplantearre binne yn 'e somatosensoryske korteks fan neonatale neakene rotten folwoeksen seltypen ûntwikkelje dy't yntegrearje yn sensoryske en motivaasje-relatearre sirkwy's. MRI liet post-transplantaasje organoïdegroei sjen yn ferskate stamsellinen en bisten, wylst single-core-analyze foarútgong fan kortikogenese en it ûntstean fan in aktiviteitsôfhinklik transkripsjeprogramma liet sjen. Yndied, transplantearre kortikale neuronen litte kompleksere morfologyske, synaptyske en ynterne membraaneigenskippen sjen as har in vitro-tsjinhingers, wêrtroch't neuronale defekten by pasjinten mei it syndroom fan Timothy kinne wurde opspoard. Anatomyske en funksjonele tracing hat oantoand dat transplantearre organellen thalamokortikale en kortikokortikale ynput ûntfange, en in vivo-opnames fan neurale aktiviteit suggerearje dat dizze ynput sensoryske reaksjes kinne generearje yn minsklike sellen. Uteinlik wreidzje kortikale organoïden axonen út troch it rattebrein, en har optogenetyske aktivearring liedt ta beleanningssykjend gedrach. Sa wurde transplantearre minsklike korteksneuronen ryp en nimme se diel oan 'e sirkwy's fan' e gasthear dy't gedrach kontrolearje. Wy ferwachtsje dat dizze oanpak de deteksje fan fenotypen op stringnivo yn sellen fan pasjinten dy't net op oare manieren kinne wurde ûntdutsen, fasilitearret.
It ûntwikkeljende minsklike harsens is in opmerklik selsorganisearjend proses wêryn't sellen proliferearje, differinsjearje, migrearje en ferbine om funksjonele neuronale circuits te foarmjen dy't fierder ferfine wurde troch sensoryske ûnderfining. In kaaiprobleem by it begripen fan 'e ûntwikkeling fan minsklike harsens, benammen yn 'e kontekst fan sykte, is it gebrek oan tagong ta harsensweefsel. Selsorganisearjende organellen, ynklusyf minsklike korteksorganoïden (hCO; ek wol bekend as de minsklike kortekssfear), kinne 2,3,4,5,6 generearje. Ferskate beheiningen beheine lykwols har bredere tapassing op it begripen fan 'e ûntwikkeling en funksjonearjen fan neurale circuits. Yn it bysûnder is it ûndúdlik oft hCO-ryping beheind wurdt troch de ôfwêzigens fan bepaalde mikro-omjouwings- en sensoryske ynput dy't yn vivo oanwêzich binne. Derneist, om't hCO's net yntegrearre binne yn circuits dy't gedrachsútkomsten kinne generearje, is har nut by it modellearjen fan genetysk komplekse en gedrachsneuropsychiatryske steurnissen op it stuit beheind.
De transplantaasje fan hCO yn in yntakt libbend brein kin dizze beheiningen oerwinne. Eardere stúdzjes hawwe oantoand dat minsklike neuronen dy't transplantearre binne yn 'e knaagdierkorteks yn steat binne om te oerlibjen, te projektearjen en te kommunisearjen mei knaagdiersellen7,8,9,10,11,12. Dizze eksperiminten wurde lykwols meastentiids útfierd op folwoeksen bisten, wat synaptyske en axonale yntegraasje kin beheine. Hjir beskriuwe wy in transplantaasjeparadigma wêryn wy 3D hCO ôflaat fan hiPS-sellen transplantearren yn 'e primêre somatosensoryske korteks (S1) fan ymmúndefisjinte rotten yn in ier stadium fan plastyske ûntwikkeling. Transplantearre hCO (t-hCO) neuronen ûndergeane substansjele ryping, ûntfange thalamokortikale en kortikaal-kortikale ynput dy't sensoryske reaksjes oproppe, en wreidzje axonale projeksjes út yn 'e rattebrein om beleanningssykjend gedrach oan te driuwen. Ferlingde ryping fan t-hCO hat neuronale defekten oantoand by pasjinten mei it syndroom fan Timothy (TS), in slimme genetyske oandwaning feroarsake troch mutaasjes yn it spanningsgefoelige L-type CaV1.2 kalsiumkanaal (kodearre troch CACNA1C).
Om minsklike kortikale neuronen yn circuits yn vivo te bestudearjen, hawwe wy stereotaktysk yntakt 3D hCO transplantearre yn S1 fan iere postnatale atymyske rotten (dagen 3-7 postnataal) (Fig. 1a en útwreide gegevens fan Fig. 1a-c). Op dit punt hawwe de thalamokortikale en kortikokortikale axonale projeksjes har S1-innervaasje noch net foltôge (ref. 13). Dêrom is dizze oanpak ûntworpen om t-hCO-yntegraasje te maksimalisearjen, wylst de ynfloed op endogene circuits minimalisearre wurdt. Om de lokaasje fan t-hCO yn libbene bisten te visualisearjen, hawwe wy T2-gewogen MRI-harsensrekonstruksjes fan rotten útfierd 2-3 moannen nei transplantaasje (Fig. 1b en útwreide gegevens, Fig. 1d). t-hCO3 waarden maklik waarnommen en folumemjittingen fan t-hCO3 wiene fergelykber mei dy berekkene út fêste plakjes (Útwreide gegevens Fig. 1d,e; P > 0.05). t-hCO3 waarden maklik waarnommen en folumemjittingen fan t-hCO3 wiene fergelykber mei dy berekkene út fêste plakjes (Útwreide gegevens Fig. 1d,e; P > 0.05). t-hCO легко наблюдались, а объемные измерения t-hCO были аналогичны рассчитанным foar фиксированных расрези, ( рис 1d, e; P> 0,05). t-hCO3 waarden maklik waarnommen, en volumetryske t-hCO3-mjittingen wiene fergelykber mei dy berekkene foar fêste seksjes (útwreide gegevens, Fig. 1d, e; P > 0.05).很容易观察到t-hCO，并且t-hCO的体积测量值与从固定切片计算的测量值相似（扩展数据图1d、e；P>。5）。很容易观察到t-hCO，并且t-hCO t-hCO легко наблюдался, а объемные измерения t-hCO были аналогичны рассчитанным для фиксированных срезиов ( рис 1d, e; P> 0,05). t-hCO waard maklik waarnommen, en volumetryske t-hCO mjittingen wiene fergelykber mei dy berekkene foar fêste seksjes (útwreide gegevens, Fig. 1d, e; P > 0.05).Wy bepaalden t-hCO yn 81% fan 'e transplantearre bisten sawat 2 moannen nei transplantaasje (n = 72 bisten; hCO fan 10 hiPS-sellinen; hiPS-sellinen yn Oanfoljende Tabel 1). Hjirfan wiene 87% yn 'e harsenskorteks (Fig. 1c). Troch seriële MRI-scans út te fieren op meardere tiidpunten yn deselde transplantearre rat, fûnen wy in njoggenfâldige tanimming fan t-hCO-folume binnen 3 moannen (Fig. 1d en útwreide gegevens, Fig. 1f). Transplantearre bisten hienen in hege oerlibjenssifer (74%) 12 moannen nei transplantaasje (útwreide gegevens, Fig. 1g en Oanfoljende Tabel 2), en gjin dúdlike motor- of ûnthâldstoornissen, gliose of elektro-encefalogram (EEG) waarden fûn. Gegevens Fig. 1g en oanfoljende tabel 2). 1h-m en 3e).
a, Skematysk ûntwerp fan eksperiminteel ûntwerp. hCO ôflaat fan hiPS-sellen waard transplantearre yn S1 fan pasgeboren neakene rotten op dagen 30-60 fan differinsjaasje. b, T2-gewichtige koronale en horizontale MRI-ôfbyldings dy't t-hCO yn S1 sjen litte 2 moannen nei transplantaasje. Skaalbalke, 2 mm. c, Kwantifikaasje fan suksesraten fan ynplanting werjûn foar elke hiPS-selline (n = 108, sifers binnen balken jouwe de hoemannichte t-hCO per hIPS-selline oan) en kortikale of subkortikale lokaasje (n = 88). d, MRI-ôfbylding fan in kransslagader (lofts; skaalbalke, 3 mm) en oerienkommende 3D volumetryske rekonstruksje (skaalbalke, 3 mm) dy't in tanimming fan t-hCO oer 3 moannen sjen lit. e, Oersjoch fan t-hCO-patroanen yn 'e harsenskorteks fan ratten. Skaalbalke, 1 mm. f, Represintative immunocytochemyske ôfbyldings fan t-hCO werjûn fan loftsboppe nei rjochts (tidens differinsjaasje): PPP1R17 (4 moannen âld), NeuN (8 moannen âld), SOX9 en GFAP (8 moannen âld), PDGFRα; (8 moannen), MAP2 (8 moannen) en IBA1 (8 moannen). Skaalbalke, 20 µm. Ko-ekspresje fan HNA jout sellen fan minsklike komôf oan. g, snRNA-seq: Unified manifold and projection (UMAP) dimensjonaliteitsreduksjeôfbylding fan alle t-hCO-kearnen fan hege kwaliteit nei Seurat-yntegraasje (n=3 t-hCO-samples, n=2 hiPS-sellinen). Astrocyten, sellen fan 'e astrocyteline; cyc prog, sirkulearjende foarrinners; GluN DL, djippe glutamatergyske neuronen; GluN DL/SP, djippe en sublamellêre glutamatergyske neuronen; GluN UL, boppeste laach glutamatergyske neuronen; oligodendrocyten, oligodendrocyten; OPC, oligodendrocyte-foarrinnersellen; RELN, reelin neuroanen. h, Gene Ontology (GO) termynferrikingsanalyse fan genen dy't signifikant opregulearre binne (oanpast P < 0.05, foldferoaring > 2, útdrukt yn teminsten 10% fan 'e kearnen) yn t-hCO glutamatergyske neuronen yn ferliking mei hCO glutamatergyske neuronen. h, Gene Ontology (GO) termynferrikingsanalyse fan genen dy't signifikant opregulearre binne (oanpast P < 0.05, foldferoaring > 2, útdrukt yn teminsten 10% fan 'e kearnen) yn t-hCO glutamatergyske neuronen yn ferliking mei hCO glutamatergyske neuronen. h, Анализ обогащения терминов Gene Ontology (GO) foar генов со значительной активацией (скорректированный P <0,05, кратность изкратность изктивацией по крайней мере в 10% ядер) в глутаматергических нейронах t-hCO по сравнению с глутаматергическими нейронах. h, Gene Ontology (GO) termynferrikingsanalyse foar genen mei wichtige aktivearring (oanpast P <0,05, foldferoaring > 2, ekspresje yn teminsten 10% kearnen) yn t-hCO glutamatergyske neuronen yn ferliking mei hCO glutamatergyske neuronen. h，与hCO 谷氨酸能神经元相比，t-hCO 谷氨酸能神经元中基因显着上调（谎整后0.05，倍数变化> 2，在至少10% 的细胞核中表达）的基因本体论(GO) 术鐆〭富 h ， 与 hco 谷氨酸 能 元 相比 ， t-hco 谷氨酸 能 神经 元 基因 显着 上谼 弐吃 弐吐.变化 变化> 2 ， 至少 10% 的 核中 表达） 基因 基因 基因 的 的 的 的 的的 的的 的 的 的本体论(GO) 术语富集分析. h, гены значительно активизировались (скорректированный P <0,05, кратность изменения> 2, экспрессируется по 1%) глутаматергических нейронах t-hCO по сравнению с глутаматергическими нейронами hCO Онтологический (GO) анализ. h, genen wiene signifikant opregulearre (oanpast P < 0.05, fold feroaring > 2, útdrukt yn teminsten 10% fan 'e kearnen) yn t-hCO glutamatergyske neuronen yn ferliking mei hCO glutamatergyske neuronen Ontologyske (GO) analyze fan 'e ferrikingsterm.De stippele line jout in aq-wearde fan 0,05 oan. i, UMAP-ôfbylding fan GluN-seltypen yn t-hCO mei help fan label-oerdracht fan in referinsjedataset fan 22 snRNA-seq folwoeksen motorkorteks. CT - kortikothalamyske sellen, ET - ekstraserebrale sellen, IT - ynterne telencefalyske sellen, NP - tichtbyprojeksje.
Wy hawwe doe de cytoarsjitektuer en de algemiene sellulêre gearstalling fan t-hCO beoardiele. Antistofkleuring fan rotte-endotheelzellen liet vaskularisaasje mei t-hCO sjen, wylst IBA1-kleuring de oanwêzigens fan rotte-mikroglia yn it heule transplantaat liet sjen (Fig. 1f en útwreide gegevens, Fig. 3c,d). Immunokleuring liet minsklike nukleêre antygen (HNA) positive sellen sjen dy't PPP1R17 (kortikale foarrinners), NeuN (neuronen), SOX9 en GFAP (glia-ôflaatte sellen) of PDGFRα (oligodendrocyte-foarrinners) ko-ekspressearje (Figuer 1f). Om de sellulêre gearstalling fan t-hCO by ienkelselresolúsje te bestudearjen, hawwe wy single-core RNA-sekwinsje (snRNA-seq) útfierd nei sawat 8 moannen fan differinsjaasje. Bulkfiltraasje en ferwidering fan rottekernen levere 21.500 minsklike mononukleêre kaarten fan hege kwaliteit op (Fig. 1g en útwreide gegevens, Fig. 4a,b). Ekspresjepatroanen fan typyske seltypemarkers identifisearren klusters fan wichtige kortikale selklassen, ynklusyf djippe en oerflakkige glutamatergyske neuronen, sirkulearjende foargongers, oligodendrocyten en astrocytenôfstamming (Fig. 1g, útwreide gegevens, Fig. 4c, en Oanfoljende Tabel 3). Immunokleuring foar SATB2 en CTIP2 liet sjen dat nettsjinsteande de oanwêzigens fan kortikale subtypen, t-hCO gjin dúdlike anatomyske stratifikaasje liet sjen (útwreide gegevens, Fig. 3a). Stadium-matched snRNA-seq hCO produsearre breed ferlykbere selklassen, mei in pear útsûnderingen, ynklusyf de ôfwêzigens fan oligodendrocyten en de oanwêzigens fan GABAergyske neuronen, wat de earder rapportearre geunstige in vitro-omstannichheden foar laterale foargongersellen15 kin reflektearje (útwreide gegevens, Fig. 4f - i en Oanfoljende Tabel 4). Differinsjele genekspresje-analyze liet wichtige ferskillen sjen yn glutamatergyske neuronen tusken t-hCO en hCO (Oanfoljende tabel 5), ynklusyf aktivearring fan sets genen dy't ferbûn binne mei neuronale ryping lykas synaptyske sinjalearring, dendrityske lokalisaasje en spanningsôfhinklike kanaalaktiviteit (Ofbylding 1h en Oanfoljende tabel 5). tabel 6). Dêrtroch lieten kortikale glutamatergyske t-hCO neuronen fersnelde transkripsjonele ryping sjen.
Om te ferdúdlikjen oft dizze transkripsjonele feroarings yn t-hCO relatearre wiene oan morfologyske ferskillen tusken hCO yn vitro en t-hCO yn vivo, hawwe wy stadia-oerienkommende biocytine-folle hCO en hCO yn akute seksjes rekonstruearre nei 7-8 moannen fan differinsjaasje. hCO neuronen (Fig. 2a). t-hCO neuronen wiene signifikant grutter, hienen 1,5 kear de soma-diameter, twa kear safolle dendriten, en in algemiene seisfâldige tanimming fan totale dendrityske lingte yn ferliking mei in vitro hCO (Fig. 2b). Derneist observearren wy in signifikant hegere tichtheid fan dendrityske stekels yn t-hCO neuronen as yn hCO neuronen (Fig. 2c). Dit suggerearret dat t-hCO neuronen wiidweidige dendrityske ferlinging en fertakking ûndergeane, wat, yn kombinaasje mei trochgeande selproliferaasje, kin bydrage oan 'e yntinsive groei fan t-hCO nei transplantaasje (Fig. 1d en Útwreide Gegevens Fig. 1f). Dit sette ús derta om de elektrofysiologyske eigenskippen te ûndersykjen. De membraankapasitans wie acht kear heger (útwreide gegevens, Fig. 8d), it membraanpotinsjaal yn rêststeat wie mear hyperpolarisearre (sawat 20 mV), en stroomynjeksje feroarsake in hegere maksimale eksitaasjesnelheid yn t-hCO neuronen as yn hCO neuronen. yn vitro (Fig. 2d), e), wat oerienkomt mei de gruttere en kompleksere morfologyske skaaimerken fan t-hCO. Derneist wie de frekwinsje fan spontane eksitatoryske postsynaptyske stroombarrens (EPSC) signifikant heger yn t-hCO neuronen (Fig. 2f), wat suggerearret dat de ferhege tichtheid fan dendrityske stekels dy't waarnommen waard yn t-hCO neuronen assosjeare wie mei funksjonele eksitabiliteit. seksuele synaps. Wy befêstigen it ûnrype karakter fan hCO neuronen yn vitro troch labelde glutamatergyske neuronen op te nimmen (útwreide gegevens, Fig. 6a-c).
a, 3D-rekonstruksje fan biocytine-folle hCO- en t-hCO-neuronen nei 8 moannen fan differinsjaasje. b, Kwantifikaasje fan morfologyske skaaimerken (n = 8 hCO neuronen, n = 6 t-hCO neuronen; **P = 0.0084, *P = 0.0179 en ***P < 0.0001). b, Kwantifikaasje fan morfologyske skaaimerken (n = 8 hCO neuronen, n = 6 t-hCO neuronen; **P = 0.0084, *P = 0.0179 en ***P < 0.0001). б, количественная оценка морфологических признаков (n = 8 нейронов hCO, n = 6 нейронов t-hCO; ** P = 0,0084, * P = 9 и 0,01***). b, kwantifikaasje fan morfologyske skaaimerken (n=8 hCO neuronen, n=6 t-hCO neuronen; **P=0.0084, *P=0.0179, en ***P<0.0001). b，形态学特征的量化（n = 8 个hCO 神经元，n = 6 个t-hCO 神经元；**P = 0.0084，和1***P90 < 0.0001). b，形态学特征的量化（n = 8 个hCO 神经元，n = 6 个t-hCO 神经元；**P = 0.0084，和1***P90 < 0.0001). б, количественная оценка морфологических признаков (n = 8 нейронов hCO, n = 6 нейронов t-hCO; ** P = 0,0084, * P = 9 и 0,01***). b, kwantifikaasje fan morfologyske skaaimerken (n=8 hCO neuronen, n=6 t-hCO neuronen; **P=0.0084, *P=0.0179, en ***P<0.0001).c, 3D-rekonstruksje fan hCO3- en t-hCO3-dendrityske tûken nei 8 moannen fan differinsjaasje. Reade asterisken jouwe oan dat der fertochte dendrityske stekels binne. Kwantifikaasje fan dendrityske stekeldichtheid (n = 8 hCO3-neurons, n = 6 t-hCO3-neurons; **P = 0.0092). d, Kwantifikaasje fan it rêstmembraanpotinsjaal (n = 25 hCO neuronen, n = 16 t-hCO neuronen; ***P < 0.0001). d, Kwantifikaasje fan it rêstmembraanpotinsjaal (n = 25 hCO neuronen, n = 16 t-hCO neuronen; ***P < 0.0001). d, количественная оценка мембранного потенциала покоя (n = 25 нейронов hCO, n = 16 нейронов t-hCO; *** P <0,0001). d, kwantifikaasje fan rêstmembraanpotinsjeel (n = 25 hCO neuronen, n = 16 t-hCO neuronen; ***P < 0.0001). d，静息膜电位的量化（n = 25 hCO 神经元，n = 16 t-hCO 神经元；***P < 0.0001）. d，静息膜电位的量化（n = 25 hCO 神经元，n = 16 t-hCO 神经元；***P < 0.0001）. d, количественная оценка мембранного потенциала покоя (n = 25 нейронов hCO, n = 16 нейронов t-hCO; *** P <0,0001). d, kwantifikaasje fan rêstmembraanpotinsjeel (n = 25 hCO neuronen, n = 16 t-hCO neuronen; ***P < 0.0001). e, Werhelle aksjepotinsjeelfjoer yn hCO en t-hCO ynducearre troch tanimmende stroomynjeksjes, en kwantifikaasje fan 'e maksimale fjoersnelheid (n = 25 hCO neuronen, n = 16 t-hCO neuronen; ***P < 0.0001). e, Werhelle aksjepotinsjeelfjoer yn hCO en t-hCO ynducearre troch tanimmende stroomynjeksjes, en kwantifikaasje fan 'e maksimale fjoersnelheid (n = 25 hCO neuronen, n = 16 t-hCO neuronen; ***P < 0.0001). e, повторное возбуждение потенциала действия в hCO en t-hCO, вызванное увеличением тока, en количеставия скорости возбуждения (n = 25 нейронов hCO, n = 16 нейронов t-hCO; *** P <0,0001). e, opnij ûntstean fan aksjepotinsjeel yn hCO en t-hCO feroarsake troch stroomferheging en kwantifikaasje fan maksimale ûntstekkingssnelheid (n = 25 hCO neuronen, n = 16 t-hCO neuronen; *** P < 0.0001). e，通过增加电流注入诱导的hCO 和t-hCO 重复动作电位放电，以及最大攌善＇n =2个hCO 神经元，n = 16 个t-hCO 神经元；***P < 0.0001）. E ， 通过 增加 电流 注入 的 的 hco 和 t-hco 重复 电位 放电 ， 以及 最 夼刏 n = 2个 hco 神经 ， n = 16 个 t-hco 神经 ； *** p <0.0001） 。 e, повторяющееся возбуждение потенциала действия hCO en t-hCO, вызванное увеличением подачи токениче, и коциче максимальной скорости возбуждения (n = 25 нейронов hCO, n = 16 нейронов t-hCO; *** P <0,0001). e, werhelle ôffjurring fan hCO3- en t-hCO3-aksjepotinsjalen feroarsake troch ferhege stroomfoarsjenning en kwantifikaasje fan maksimale ôffjurringssnelheid (n = 25 hCO3-neuronen, n = 16 t-hCO3-neuronen; *** P < 0.0001). f, Spontane EPSC's (sEPSC's) yn hCO- en t-hCO-neuronen nei 8 moannen fan differinsjaasje, en kwantifikaasje fan 'e frekwinsje fan synaptyske barrens (n ​​= 25 hCO-neuronen, n = 17 t-hCO-neuronen; ***P < 0.0001). f, Spontane EPSC's (sEPSC's) yn hCO- en t-hCO-neuronen nei 8 moannen fan differinsjaasje, en kwantifikaasje fan 'e frekwinsje fan synaptyske barrens (n ​​= 25 hCO-neuronen, n = 17 t-hCO-neuronen; ***P < 0.0001). f, спонтанные EPSC (sEPSC) в нейронах hCO en t-hCO через 8 месяцев дифференцировки и количественная оценка часистичаты событий (n = 25 нейронов hCO, n = 17 нейронов t-hCO; *** P <0,0001) . f, Spontane EPSC's (sEPSC's) yn hCO- en t-hCO-neuronen nei 8 moannen fan differinsjaasje en kwantifikaasje fan synaptyske barrensraten (n=25 hCO-neuronen, n=17 t-hCO-neuronen; ***P<0.0001). f，分化8 个月时hCO 和t-hCO 神经元中的自发性EPSCs (sEPSCs)，以及突触事件频率的 5 CO神经元，n = 17 t-hCO 神经元；***P < 0.0001）. f，分化8 个月时hCO 和t-hCO 神经元中的自发性EPSCs (sEPSCs)，以及突触事件频率的 5 CO神率的量匼（n = 25 hCO 神率的量匼（n = 25hCO P < 0.0001）. f, спонтанные EPSC (sEPSC) в нейронах hCO en t-hCO через 8 месяцев дифференцировки и количественная оценка часистичаты событий (n = 25 нейронов hCO, n = 17 нейронов t-hCO; *** P <0,0001). f, Spontane EPSC's (sEPSC's) yn hCO- en t-hCO-neuronen nei 8 moannen fan differinsjaasje en kwantifikaasje fan synaptyske barrensraten (n = 25 hCO-neuronen, n = 17 t-hCO-neuronen; *** P <0.0001).Foar bf waarden hCO3 en t-hCO3 yn rigel 1208-2 nommen út deselde differinsjaasjebatch dy't parallel ûnderhâlden waard. g, Genset-ferrikingsanalyse (iensidige Fisher's krekte test) fan genen dy't signifikant opregulearre binne (oanpast P < 0.05, foldferoaring > 2, útdrukt yn teminsten 10% fan 'e kearnen) yn t-hCO glutamatergyske neuronen yn ferliking mei hCO glutamatergyske neuronen mei gensets fan sawol iere-antwurd (ERG) as lette-antwurd (LRG) aktiviteitsôfhinklike genen identifisearre út in in vivo mûsstúdzje16 en minskspesifike LRG's fan in vitro neuronen17. g, Genset-ferrikingsanalyse (iensidige Fisher's krekte test) fan genen dy't signifikant opregulearre binne (oanpast P < 0.05, foldferoaring > 2, útdrukt yn teminsten 10% fan 'e kearnen) yn t-hCO glutamatergyske neuronen yn ferliking mei hCO glutamatergyske neuronen mei gensets fan sawol iere-antwurd (ERG) as lette-antwurd (LRG) aktiviteitsôfhinklike genen identifisearre út in in vivo mûsstúdzje16 en minskspesifike LRG's fan in vitro neuronen17. g, анализ обогащения набора генов (односторонний точный критерий Фишера) генов со значительной активацорекий (sk,0,5,0 кратность изменения > 2, экспрессия по меньшей мере в 10% ядер) in глутаматергических нейровнах t-hCO по сратность глутаматергическими нейронами hCO наборы генов как раннего (ERG), так и позднего (LRG) генов, зависящих от активности, идентифицированных в исследовании op мышах yn vivo16, en специфических foar человека LRG из ней1ронов. g, analyze fan ferriking fan genen (iensidige Fisher's krekte test) fan genen mei wichtige aktivearring (oanpast P < 0,05, foldferoaring > 2, ekspresje yn teminsten 10% fan 'e kearnen) yn t-hCO glutamatergyske neuronen yn ferliking mei hCO glutamatergyske neuronen sets fan sawol iere (ERG) as lette (LRG) aktiviteitsôfhinklike genen identifisearre yn in vivo mûzen16 en minsklike-spesifike LRG's fan neuronen yn vitro17. g，t-hCO谷氨酸能神经元与hCO谷氨酸能神经元相比，t -hCO谷氨酸能神经元显着上调（调整后P<0.05，倍数变化>2，在至少10%的细胞核中表达）的基因集富集分析（单侧F isher精确检验）从体内小鼠研究中鉴定的早期反应(ERG)和晚期反应(LRG) 活性依赖性基因的基因组16 和体外神经元17 中的人类特异 g ， t-hco 谷氨酸 神经 元 与 hco 谷氨酸 神经 元 相比 ， t-hco 谷氨酸 神经 兰<0.05 ， 倍数> 2 ， 至少 至少 10%的 细胞 核中 表达） 的 集富集 分析 Ｇ单）（单体内 小鼠 研究 中 的 早期 反应 反应 反应 和 晚期 反应 反应 (lrg) 活性 基因 嚄 基因瞻经 16神经元 17 中 中 17 中 17的人类特异性LRG. g, глутаматергические нейроны t-hCO были значительно активизированы по сравнению с глутаматергическическими нейрованы P<0,05, кратность изменения> 2, не менее 10% позднего гены, зависящие от активности ответа (LRG), идентифицированные в исследованиях на мышах in vivo16 en нейронах in vitro17. LRG, специфичные для человека. g, t-hCO glutamatergyske neuronen wiene signifikant opregulearre yn ferliking mei hCO glutamatergyske neuronen (oanpast P <0,05, foldferoaring >2, teminsten 10%. Iere respons (ERG) en lette responsgenferrikingsanalyze (iensidige Fisher's krekte test) responsaktiviteitsôfhinklike genen (LRG's) identifisearre yn in vivo mûzen16 en in vitro neuronen.17 Minskespesifike LRG's.De stippele line jout in Bonferroni-korrizjearre P-wearde fan 0,05 oan. h, GluN-genekspresje (pseudo-pakket en skalearring fan elk gen) wie signifikant opregulearre yn snRNA-seq-replika's fan LRG-genen yn t-hCO glutamatergyske neuronen. i, immunokleuring dy't SCG2-ekspresje yn t-hCO (boppeste) en hCO (ûnderste) neuronen sjen lit. Wite pylken wize nei SCG2+ sellen. Skaalbalke, 25 µm. Gegevens wurde útdrukt as gemiddelde ± standertôfwiking.
Op basis fan 'e ferhege aktiviteit fan t-hCO waarnommen yn ex vivo plakjes, liet snRNA-seq in aktiviteitsôfhinklike opregulearring fan gentranskripten yn t-hCO sjen yn ferliking mei hCO yn vitro. Glutamatergyske t-hCO neuronen ekspressearren hegere nivo's fan genen dy't lette responsaktiviteit regelje (Fig. 2g,h), dy't fûn waarden yn eardere stúdzjes yn mûs- en minsklike neuronen16,17. Bygelyks, BDNF18, SCG2, en OSTN, in primaat-spesifyk aktiviteitsregulearjend gen, lieten ferhege ekspresje sjen yn t-hCO neuronen yn ferliking mei hCO neuronen (Fig. 2g-i). Sa lieten t-hCO neuronen ferbettere rypingskarakteristiken sjen yn ferliking mei hCO neuronen troch transkripsjonele, morfologyske en funksjonele analyses.
Om de assosjaasje fan t-hCO-ryping mei minsklike harsensûntwikkeling fierder te evaluearjen, hawwe wy transkriptomyske fergelikingen útfierd fan fetale en folwoeksen kortikale seltypen19,20 en folwoeksen21,22, lykas wiidweidige gegevens oer kortikale genekspresje23 tidens ûntwikkeling (útwreide gegevens, Fig. 5). mei earder wurk24, is de wrâldwide hCO- en t-hCO-transkriptoomrypingsstatus op 7-8 moannen fan differinsjaasje breed oerienkommend mei in vivo ûntwikkelingstiid en is it meast lykweardich oan lette fetale libben (Útwreide gegevens Fig. 5a). Opmerklik is dat wy ferhege transkriptoomryping yn t-hCO observearren yn ferliking mei leeftyd-oerienkommende hCO, lykas transkriptoomaktivaasje assosjeare mei synaptogenese, astrogenese en myelinaasje (útwreide gegevens, Fig. 5b-d). Op sellulêr nivo fûnen wy bewiis fan in tinner kortekssubtype yn t-hCO, mei klusters fan glutamaterge neuronen dy't oerlappe mei folwoeksen L2/3-, L5- en L6-neuronsubtypen (Figuer 1i). Yn tsjinstelling, wie klusteroerlaap tusken glutamatergyske t-hCO-neurons en fetale kortikale neuronen beheinder yn 'e midden fan' e swangerskip (útwreide gegevens, Figuer 5e-j). Om te bepalen oft t-hCO-neurons funksjoneel fergelykber binne mei minsklike postnatale neokortikale neuronen, hawwe wy elektrofysiologyske opnames en anatomyske rekonstruksjes útfierd fan minsklike L2/3-piramidale neuronen yn skerpe seksjes fan 'e minsklike postnatale korteks (útwreide gegevens, Fig. 7a). De elektrofysiologyske eigenskippen fan L2/3-piramidale neuronen wiene fergelykber mei dy fan t-hCO-piramidale neuronen (útwreide gegevens, Fig. 7e). Morfologysk wiene L2/3-neurons fan postnatale minsklike samples mear ferlykber mei t-hCO dan mei hCO, hoewol L2/3-sellen langer wiene, mear tûken yn 't algemien befette, en in hegere rêchbonkedichtheid hiene (Fig. 3g en útwreide gegevens, Fig. 7b-). G).
a, transplantaasje fan hCO produsearre troch kontrôle- en TS hiPS-sellinen yn neonatale rotten. b, 3D-rekonstruksje fan biocytine-folle t-hCO-neuronen nei 8 moannen fan differinsjaasje. c, kwantifikaasje fan gemiddelde dendrityske lingte (n = 19 kontrôleneuronen, n = 21 TS-neuronen; **P = 0.0041). d, 3D-rekonstrueare dendrityske tûken fan kontrôle en TS t-hCO nei 8 moannen fan differinsjaasje, en kwantifikaasje fan dendrityske rêchbonketichtens (n ​​= 16 kontrôleneuronen, n = 21 TS-neuronen, ***P < 0.0001). d, 3D-rekonstrueare dendrityske tûken fan kontrôle en TS t-hCO nei 8 moannen fan differinsjaasje, en kwantifikaasje fan dendrityske rêchbonketichtens (n ​​= 16 kontrôleneuronen, n = 21 TS-neuronen, ***P < 0.0001). d, 3D-rekonsintraasje ветвей из контроля en TS t-hCO через 8 месяцев диференцировки и контролический дендритных шипов (n = 16 контрольных нейронов, n = 21 TS нейронов, *** P <0,0001). d, 3D-rekonstruksje fan dendrityske tûken fan kontrôle en t-hCO TS nei 8 moannen fan differinsjaasje en kwantifikaasje fan dendrityske rêchbonketichtens (n=16 kontrôleneuronen, n=21 TS-neuronen, ***P<0.0001). d，分化8 个月时对照和TS t-hCO 的3D 重建树突分支，以及树突棘密度的量化1,6个对照神经元，n = 21 个TS 神经元，***P < 0.0001）. d神经 元 ， n = 21 个 ts 神经 ， *** p <0.0001 ）。 d, 3D-rekonsintraasje дендритных ветвей контроля en TS t-hCO sjoch 8 moannen дендритных шипов (n = 16 контрольных нейронов, n = 21 TS нейронов, *** P <0,0001). d, 3D-rekonstruksje fan kontrôle dendrityske tûken en TS t-hCO nei 8 moannen fan differinsjaasje en kwantifikaasje fan dendrityske rêchbonkedichtheid (n=16 kontrôleneuronen, n=21 TS-neuronen, ***P<0.0001).Reade asterisken jouwe oan dat der fertochte dendrityske stekels binne. e, spontane EPSC's yn kontrôle- en TS t-hCO-neuronen nei 8 moannen fan differinsjaasje. f, kumulative frekwinsjeplot en kwantifikaasje fan frekwinsje en amplitude fan synaptyske barrens (n ​​= 32 kontrôleneuronen, n = 26 TS-neuronen; **P = 0,0076 en P = 0,8102). g, Scholl-analyze fan TS- en kontrôleneuronen yn hCO en t-hCO. Stippele linen litte minsklike L2/3 postnatale piramidale neuronen sjen foar fergeliking (n = 24 kontrôle t-hCO-neuronen, n = 21 TS t-hCO-neuronen, n = 8 kontrôle hCO-neuronen, en n = 7 TS hCO-neuronen). Gegevens wurde útdrukt as it gemiddelde ± standertôfwiking.
It fermogen fan t-hCO om de morfologyske en funksjonele skaaimerken fan minsklike korteksneuronen op in heech nivo te replikearjen, sette ús derta om te ûndersiikjen oft t-hCO brûkt wurde koe om syktefenotypen te detektearjen. Wy hawwe ús rjochte op TS, in slimme neurologyske ûntwikkelingssteurnis feroarsake troch gain-of-function-mutaasjes yn it gen dat kodearret foar CaV1.2, dat aktiviteitsôfhinklike gentranskripsje yn neuronen inisjearret. Wy krigen hCO fan trije TS-pasjinten dy't de meast foarkommende substituasje (p.G406R) en trije kontrôles droegen (Fig. 3a). Nei transplantaasje fûnen wy dat dendrityske morfology feroare wie yn TS-neuronen yn ferliking mei kontrôles (Fig. 3b en útwreide gegevens, Fig. 8a,b), mei in twafâldige tanimming fan it oantal primêre dendriten en in algemiene tanimming fan gemiddelde en algemiene ôfname yn dendrityske lingte (Fig. 3c en útwreide gegevens, Fig. 8c). Dit wie assosjeare mei in ferhege tichtens fan stekels en in ferhege frekwinsje fan spontane EPSC's yn TS yn ferliking mei kontrôleneuronen (Fig. 3d-f en útwreide gegevens, Fig. 8g). Fierdere analyze liet patroanen fan abnormale dendrityske fertakking sjen yn t-hCO TS yn ferliking mei kontrôles, mar net yn in vitro TS hCO yn in ferlykber stadium fan differinsjaasje (Fig. 3g). Dit komt oerien mei ús eardere rapporten fan aktiviteitsôfhinklike dendrityske krimp yn TS en markearret it fermogen fan dit transplantaasjeplatfoarm om syktefenotypen yn vivo te detektearjen.
Wy fregen doe yn hoefier't t-hCO-sellen funksjoneel yntegrearre binne yn rat S1. S1 yn knaagdieren ûntfangt sterke synaptyske ynput fan 'e ipsilaterale ventrale basale en posterior thalamuskernen, lykas de ipsilaterale motor- en sekundêre somatosensoryske kortex, en kontralaterale S1 (Fig. 4a). Om it innervaasjepatroan te herstellen, hawwe wy hCO ynfektearre mei rabiësfirus-dG-GFP/AAV-G en transplantearre hCO 3 dagen letter yn S1-rat. Wy observearren tichte GFP-ekspresje yn neuronen fan 'e ipsilaterale S1 en ventrale basale ganglia 7-14 dagen nei transplantaasje (Fig. 4b, c). Derneist liet antistofkleuring fan 'e thalamusmarker netrin G1 de oanwêzigens fan thalamusúteinen yn t-hCO sjen (Fig. 4d, e). Om te evaluearjen oft dizze afferente projeksjes synaptyske reaksjes yn t-hCO-sellen útlokke koene, hawwe wy opnames fan hiele sellen útfierd fan minsklike sellen yn skerpe seksjes fan 'e thalamokortikale laach. Elektryske stimulearring fan rat S1, ynterne kapsule, wite stof, fezels tichtby t-hCO of optogenetyske aktivearring fan opsine-ekspressearjende thalamusúteinen yn t-hCO-induzearre koarte-latency EPSC's yn t-hCO-neuronen bleatsteld oan de AMPA-reseptorantagonist NBQX. (Fig. 4f, g en útwreide gegevens, Fig. 9a-g). Dizze gegevens litte sjen dat t-hCO anatomysk yntegrearre is yn it rattebrein en aktivearre wurde kin troch rattegastheerweefsel.
a, Skematysk diagram fan in rabies-tracking-eksperimint. b, GFP en minsk-spesifike STEM121-ekspresje tusken t-hCO en ratte-harsenskorteks (boppeste paniel). Ek te sjen is GFP-ekspresje yn 'e ipsilaterale ventrale basale kearn (VB) fan 'e rat (linksûnder) en ipsilaterale S1 (rjochtsûnder). Skaalbalke, 50 µm. De reade fjouwerkanten fertsjintwurdigje de gebieten fan 'e harsens dêr't de ôfbyldings makke binne. c, kwantifikaasje fan sellen dy't GFP ekspressearje (n = 4 rotten). d, e - Netrin G1+ thalamusterminals yn t-hCO. d lit in koronale seksje sjen mei t-hCO- en VB-kearnen. Skaalbalke, 2 mm. e lit Netrin G1- en STEM121-ekspresje sjen yn t-hCO (links) en VB (rjochts) neuroanen. Skaalbalke, 50 µm. De oranje stippele line jout de t-hCO-grins oan. f, g, Hjoeddeiske spoaren fan t-hCO neuroanen nei elektryske stimulearring yn S1 rat (f) of ynterne kapsule (g), mei (pears) of sûnder (swart) NBQX (lofts). EPSC-amplitudes mei en sûnder NBQX (n = 6 S1 neuroanen, *P = 0.0119; en n = 6 ynterne kapsule neuroanen, **P = 0.0022) (midden). Persintaazje t-hCO neuroanen dy't EPSC sjen litte as reaksje op elektryske stimulearring fan rat S1 (f) of ynterne kapsule (g) (rjochts). aCSF, keunstmjittige harsensfocht. h, skematysk diagram fan it 2P-ôfbyldingseksperimint (lofts). Ekspresje fan GCaMP6's yn t-hCO (midden). Skaalbalke, 100 µm. Fluoreszinsjetiidferrin fan GCaMP6's (rjochts). i, Z-skoare fan spontane aktiviteitsfluoreszinsje. j, skematyske yllustraasje fan snorstimulaasje. k, z-skoare 2P fluoreszinsjetrajekten yn ien proef, ôfstimd mei whisker-ôfwiking op tiid nul (stippele line) yn foarbyldsellen. l, populaasje-gemiddelde z-skoare-antwurden fan alle sellen ôfstimd mei whisker-ôfwiking op tiid nul (stippele line) (read) of willekeurich generearre tiidstempels (griis). m. Skematysk diagram fan it eksperimint oer optyske markearring. n, Rauwe spanningskurven fan in foarbyld t-hCO sel tidens blauwe laserstimulaasje of whisker-ôfbûging. Reade pylken jouwe de earste pieken oan feroarsake troch ljocht (boppe) of feroarsake troch whisker-ôfbûging (ûnder). Grijze skaad jout perioaden fan whisker-ôfbûging oan. o, Peak ljochtgolffoarmen en whisker-ôfbûgingsreaksjes. p, pieken fan in ienige poging, ôfstimd mei de ôfwiking fan 'e whiskers yn' e sellen fan it foarbyld. 0 jout whisker-ôfwiking oan (stippele line). q, populaasje-gemiddelde z-skoare-fjoersnelheid foar alle ljochtgefoelige sellen, ôfstimd mei whisker-ôfwiking op tiid nul (stippele line) (read) of willekeurich generearre tiidstempels (griis). r, Oanpart fan ljochtgefoelige ienheden dy't signifikant modulearre binne troch whiskerôfwiking (n = 3 rotten) (lofts). Peak z-skoare latency (n = 3 rotten; n = 5 (ljochtgrien), n = 4 (donkergrien), en n = 4 (syaan) whiskerôfwikingsmodulaasje-ienheden per rat) (rjochts). Gegevens wurde útdrukt as gemiddelde ± standertôfwiking
Wy fregen doe oft t-hCO yn vivo aktivearre wurde koe troch sensoryske stimuli. Wy transplantearren hCO dy't de genetysk kodearre kalsiumindikatoaren GCaMP6 útdrukte yn S1-rotten. Nei 150 dagen fierden wy glêstriedfotometry of twa-foton kalsiumôfbylding út (Fig. 4h en útwreide gegevens, Fig. 10a). Wy fûnen dat t-hCO-sellen syngronisearre ritmyske aktiviteit sjen lieten (Figuer 4i, Útwreide gegevens, Fig. 10b en Oanfoljende fideo 1). Om de pyk t-hCO-aktiviteit te karakterisearjen, fierden wy ekstrasellulêre elektrofysiologyske opnames út yn anaesthesisearre transplantearre rotten (útwreide gegevens, Fig. 10c-f). Wy hawwe stereotaksyske koördinaten generearre út MRI-ôfbyldings; sadwaande fertsjintwurdigje dizze opnommen ienheden fertochte minsklike neuronen, hoewol elektrofysiology allinich it net mooglik makket om in soarte fan oarsprong te bepalen. Wy observearren syngronisearre útbarstings fan aktiviteit (útwreide gegevens, Fig. 10d). De bursts duorren sawat 460 ms en waarden skieden troch stilteperioaden fan sawat 2 s (útwreide gegevens, Fig. 10d, e). Yndividuele ienheden fjoerden gemiddeld sawat trije rûndes per burst ôf, wat sawat 73% is fan 'e registrearre ienheden per burst. De aktiviteiten fan yndividuele ienheden wiene tige korrelearre, en dizze korrelaasjes wiene heger as dy fan ienheden identifisearre yn net-faksinearre bisten dy't ûnder deselde omstannichheden opnommen binne (útwreide gegevens, Fig. 10f). Om de spike-reaksjes fan identifisearre minsklike neuronen fierder te karakterisearjen, hawwe wy ljocht-tagging-eksperiminten útfierd op anesthetisearre rotten transplantearre mei hCO3 dy't it ljochtgefoelige kationkanaal rhodopsine 2 (hChR2) ekspressearje, wêrtroch t-hCO3-neuronen koarte-latency-erkenning (minder dan 10 ms) hawwe as reaksje op blauwe ljochtstimuli (Fig. 4m-o). t-hCO-neuronen lieten útbarstings fan spontane aktiviteit sjen by frekwinsjes fergelykber mei dy waarnommen yn kalsiumôfbylding, lykas elektrofysiologyske opnames útfierd yn t-hCO yn 'e ôfwêzigens fan ljochtmarkering (útwreide gegevens, Fig. 10c-g). Gjin spontane aktiviteit waard waarnommen yn 'e oerienkommende stadia fan hCO opnommen yn vitro. Om te beoardieljen oft t-hCO aktivearre wurde koe troch sensoryske stimuli, hawwe wy de rattebaarden koart fuort fan t-hCO ôfbûgd (Fig. 4j,m en útwreide gegevens, Fig. 10h,k). Neffens eardere stúdzjes8,10 liet in subset fan t-hCO-sellen ferhege aktiviteit sjen yn reaksje op whisker-ôfbûging, wat net waarnommen waard doe't de gegevens waarden fergelike mei willekeurige tiidstempels (Fig. 4k-q en útwreide gegevens, Fig. 10h-q). Yndied lieten sawat 54% fan 'e opto-labelde ienige ienheden in signifikant ferhege wekkeringssnelheid sjen nei whisker-stimulaasje, mei in pyk fan sawat 650 ms (Fig. 4r). Mei-inoar suggerearje dizze gegevens dat t-hCO passende funksjonele ynputen krijt en aktivearre wurde kin troch miljeu-stimuli.
Wy hawwe doe ûndersocht oft t-hCO circuits yn rotten aktivearje koe om gedrach te kontrolearjen. Wy hawwe earst ûndersocht oft de axonen fan t-hCO neuronen projektearje yn 'e omlizzende weefsels fan' e rat. Wy ynfekteare hCO mei in lentivirus dat kodearret foar hChR2 fusearre mei EYFP (hChR2-EYFP). Nei 110 dagen observearren wy EYFP-ekspresje yn ipsilaterale kortikale regio's, ynklusyf de auditive, motoryske en somatosensoryske kortex, lykas yn subkortikale regio's, ynklusyf it striatum, hippocampus en thalamus (Fig. 5a). Om te beoardieljen oft dizze efferente projeksjes synaptyske reaksjes yn rottesellen útlokke koene, hawwe wy optysk t-hCO-sellen aktivearre dy't hChR2-EYFP ekspressearje troch rotte harsenskorteksellen op te nimmen yn skerpe harsensseksjes. Aktivaasje fan t-hCO-axonen mei blau ljocht ynducearre koarte-latency EPSC's yn rottepiramidale korteksneuronen, dy't blokkearre waarden troch NBQX (Figs. 5b-g). Derneist koenen dizze reaksjes blokkearre wurde troch tetrodotoxine (TTX) en werombrocht wurde troch 4-aminopyridine (4-AP), wat suggerearret dat se feroarsake waarden troch monosynaptyske ferbiningen (Fig. 5e).
a, Skematysk diagram fan axonfolging (lofts). t-hCO EYFP-ekspresje (rjochts). Skaalbalke, 100 µm. A1, auditive korteks, ACC, anterior cingulate korteks, d. striatum, dorsale striatum, HPC, hippocampus; Diafragma, laterale septum, mPFC, mediale prefrontale korteks, piri, piriforme korteks, v. striatum, ventrale striatum, VPM, ventropostomediale kearn fan 'e thalamus, VTA, ventrale tegmentale regio. De reade fjouwerkanten fertsjintwurdigje de gebieten fan 'e harsens dêr't de ôfbyldings makke binne. b, Skematysk diagram fan it stimulearringseksperimint. c, d, Foarbylden fan 'e reaksje fan blau ljocht-induzearre fotostroom (boppe) en spanning (ûnder) yn minsklike (c) EYFP+ t-hCO of rat (d) EYFP- sellen. e, f, Hjoeddeiske spoaren fan ratteneuronen nei blau ljochtstimulaasje fan t-hCO-aksonen mei TTX en 4-AR (grien), TTX (griis) of aCSF (swart) (e), mei (fiolet) of sûnder (swart)) NBQX (e). g, latency fan reaksjes feroarsake troch blau ljocht yn rattesellen (n = 16 sellen); horizontale balken jouwe gemiddelde latency oan (7,13 ms) (links). Amplitude fan ljocht-oproppen EPSC's opnommen mei of sûnder NBQX (n = 7 sellen; ***P < 0.0001) (midden). Amplitude fan ljocht-oproppen EPSC's opnommen mei of sûnder NBQX (n = 7 sellen; ***P < 0.0001) (midden). Амплитуда вызванных светом EPSC, зарегистрированных of NBQX (n = 7 клеток; ***P <0,0001) (yn центре). Amplitude fan ljocht-induzearre EPSC's opnommen mei of sûnder NBQX (n = 7 sellen; ***P < 0.0001) (midden).使用或不使用NBQX 记录的光诱发EPSC 的振幅（n = 7 个细胞；***P < 0.0001）（中）。使用或不使用NBQX 记录的光诱发EPSC 的振幅（n = 7 个细胞；***P < 0.0001）（中）。 Амплитуда вызванных светом EPSC, зарегистрированных of NBQX (n = 7 клеток; ***P <0,0001) (yn центре). Amplitude fan ljocht-induzearre EPSC's opnommen mei of sûnder NBQX (n = 7 sellen; ***P < 0.0001) (midden).Persintaazje rattesellen dy't EPSC's sjen litte dy't reagearje op blau ljocht (rjochts). h, Skematysk diagram fan in gedrachstaak. d0, dei 0. i. Prestaasjes fan foarbylddieren op dei 1 (lofts) of dei 15 (rjochts) fan training. It gemiddelde oantal likken útfierd op dei 1 (lofts) of dei 15 (rjochts midden) (n = 150 blau ljochtproeven, n = 150 read ljochtproeven; ***P < 0.0001). It gemiddelde oantal likken útfierd op dei 1 (lofts) of dei 15 (rjochts midden) (n = 150 blau ljochtproeven, n = 150 read ljochtproeven; ***P < 0.0001). Среднее количество облизываний, выполненных в день 1 (slева) of день 15 (yn центре справа) (n = 150 исправа) n = 150 испытаний с красным светом ***P <0,0001). Gemiddeld oantal likken útfierd op dei 1 (lofts) of dei 15 (midden rjochts) (n = 150 blau ljochtproeven, n = 150 read ljochtproeven; ***P < 0.0001).第1 天（左）或第15 天（右中）执行的平均舔次数（n = 150 次蓝光试验,150n = 150次红光试验；***P < 0.0001).第1 天（左）或第15 天（右中）执行的平均舔次数（n = 150 次蓝光试验,150n = 150次红光试验；***P < 0.001 Среднее количество облизываний, выполненных в день 1 (slева) of день 15 (yn центре справа) (n = 150 исправа) n = 150 испытаний с красным светом ***P <0,0001). Gemiddeld oantal likken útfierd op dei 1 (lofts) of dei 15 (midden rjochts) (n = 150 blau ljochtproeven, n = 150 read ljochtproeven; ***P < 0.0001).Kumulative likken foar read- en blau ljochtproeven op dei 1 (midden lofts) of dei 15 (rjochts). NS, net signifikant. j,k, Gedrachskarakteristiken fan alle bisten transplantearre mei t-hCO dy't hChR2-EYFP (j) of kontrôlefluorofoor (k) ekspressearje op dei 1 of 15 (hChR2-EYFP: n = 9 rotten, ** P = 0.0049; kontrôle: n = 9, P = 0.1497). l, Evolúsje fan foarkarsskoare (n = 9 hChR2, n = 9 kontrôle; **P < 0.001, ***P < 0.0001). l, Evolúsje fan foarkarsskoare (n = 9 hChR2, n = 9 kontrôle; **P < 0.001, ***P < 0.0001). l, Эволюция показателя предпочтения (n = 9 hChR2, n = 9 контрольных; **P <0,001, ***P <0,0001). l, Evolúsje fan foarkarsskoare (n = 9 hChR2, n = 9 kontrôles; **P < 0.001, ***P < 0.0001). l，偏好评分的演变（n = 9 hChR2，n = 9 对照；**P < 0.001，***P < 0.0001）. l，偏好评分的演变（n = 9 hChR2，n = 9 对照；**P < 0.001，***P < 0.0001）. l, Эволюция показателей предпочтения (n = 9 hChR2, n = 9 контролей; **P <0,001, ***P <0,0001). l, Evolúsje fan foarkarsskoares (n = 9 hChR2, n = 9 kontrôles; **P < 0.001, ***P < 0.0001).m, FOS-ekspresje yn reaksje op optogenetyske aktivearring fan t-hCO yn S1. Ofbyldings fan FOS-ekspresje (lofts), en kwantifikaasje (n = 3 per groep; *P < 0.05, **P < 0.01 en ***P < 0.001) (rjochts) wurde werjûn. Ofbyldings fan FOS-ekspresje (lofts), en kwantifikaasje (n = 3 per groep; *P < 0.05, **P < 0.01 en ***P < 0.001) (rjochts) wurde werjûn. Показаны изображения экспрессии FOS (слева) en количественного определения (n = 3 foar spiel; * P <0,05, 01** P <0***) (spraва). Ofbyldings fan FOS-ekspresje (lofts) en kwantifikaasje (n = 3 per groep; *P<0.05, **P<0.01, en ***P<0.001) wurde werjûn (rjochts).显示了FOS 表达（左）和量化（每组n = 3；*P < 0.05、**P < 0.01 和***P < 0.001）（像〳）显示了FOS 表达（左）和量化（每组n = 3；*P < 0.05、**P < 0.01 和***P < 0.001）（像〳） Показаны изображения экспрессии FOS (слева) en количественного определения (n = 3 foar spiel; * P <0,05, 01** P <0***) (spraва). Ofbyldings fan FOS-ekspresje (lofts) en kwantifikaasje (n = 3 per groep; *P<0.05, **P<0.01, en ***P<0.001) wurde werjûn (rjochts).Skaalbalke, 100 µm. Gegevens wurde útdrukt as gemiddelde ± standertflater fan BLA, basolaterale tonsil, MDT, dorsomediale thalamuskearn, PAG, periaqueduktaal griis.
Uteinlik fregen wy oft t-hCO it gedrach fan ratten modulearje koe. Om dit te testen, transplantearren wy hChR2-EYFP-ekspressearjende hCO yn S1, en 90 dagen letter ymplantearren wy optyske fezels yn t-hCO foar ljochtlevering. Wy trainden doe de rotten mei in oanpast operante kondysjonearringsparadigma (Fig. 5h). Wy pleatsten de bisten yn in gedrachstestkeamer en pasten willekeurich 5 sekonden blauwe (473 nm) en reade (635 nm) laserstimuli ta. Dieren krigen in wetterbeleanning as se slikken tidens stimulearring mei blau ljocht, mar net tidens stimulearring mei read ljocht. Op 'e earste dei fan training lieten de bisten gjin ferskil sjen yn likken doe't se stimulearre waarden mei blau of read ljocht. Op dei 15 lieten bisten transplantearre mei hCO dy't hChR2-EYFP ekspressearre lykwols aktiver likken sjen doe't se stimulearre waarden mei blau ljocht yn ferliking mei stimulearring mei read ljocht. Dizze feroarings yn likgedrach waarden net waarnommen by kontrôledieren transplantearre mei hCO dy't de kontrôlefluorofoor útdrukte (learsuksesrate: hChR2 89%, EYFP 0%, figuer 5i-1 en oanfoljende fideo 2). Dizze gegevens suggerearje dat t-hCO-sellen ratteneurons kinne aktivearje om beleanningssykjend gedrach te stimulearjen. Om út te finen hokker ratte t-hCO neurale circuits belutsen kinne wêze by dizze gedrachsferoarings, hawwe wy optogenetysk t-hCO aktivearre yn traine bisten en 90 minuten letter weefsels rispe. Immunohistochemy liet ekspresje sjen fan it aktiviteitsôfhinklike FOS-proteïne yn ferskate harsensregio's dy't belutsen binne by motivearre gedrach, ynklusyf de mediale prefrontale korteks, mediale thalamus, en periaqueduktale grize matearje, dy't útdrukt waard yn net-stimulearre kontrôledieren of yn bisten. rys. 5m). Tegearre suggerearje dizze gegevens dat t-hCO ratteneuronale aktiviteit kin modulearje om gedrach oan te driuwen.
Neurale organoïden fertsjintwurdigje in beloftefol systeem foar it bestudearjen fan minsklike ûntwikkeling en sykte yn vitro, mar se wurde beheind troch it gebrek oan ferbiningen tusken circuits dy't yn vivo besteane. Wy hawwe in nij platfoarm ûntwikkele wêryn wy hCO transplantearre hawwe yn S1 fan ymmúnkompromittearre iere postnatale rotten om minsklike selûntwikkeling en funksje yn vivo te bestudearjen. Wy hawwe oantoand dat t-hCO folwoeksen seltypen ûntwikkelt dy't net yn vitro waarnommen wurde28 en dat t-hCO anatomysk en funksjoneel yntegrearre is yn it brein fan knaagdieren. De yntegraasje fan t-hCO yn neurale circuits fan knaagdieren stelde ús yn steat om in ferbining te lizzen tusken minsklike sellulêre aktiviteit en bestudearre diergedrach, wat oantoand dat t-hCO neuroanen de neuronale aktiviteit fan ratten kinne modulearje om gedrachsreaksjes oan te driuwen.
It platfoarm dat wy beskriuwe hat ferskate foardielen boppe earder ûndersyk nei it transplantearjen fan minsklike sellen yn knaagdierharsens. Earst hawwe wy hCO transplantearre yn 'e ûntwikkeljende korteks fan iere postnatale rotten, wat anatomyske en funksjonele yntegraasje kin fasilitearje. Twad, t-hCO MRI-monitoring stelde ús yn steat om de posysje en groei fan transplantaat yn libbene bisten te bestudearjen, wêrtroch't wy lange-termyn stúdzjes mei meardere bisten útfiere koene en de betrouberens fan ferskate hiPS-sellinen fêststelle koene. Uteinlik hawwe wy yntakte organoïden transplantearre, ynstee fan isolearre iensellige suspensjes, dy't minder destruktyf binne foar minsklike sellen en de yntegraasje en generaasje fan minsklike korteksneuronen yn ratteharsens kinne befoarderje.
Wy erkenne dat nettsjinsteande foarútgong yn dit platfoarm, tydlike, romtlike en soarte-oerstiigjende beheiningen de foarming fan minsklike neurale circuits mei hege betrouberens foarkomme, sels nei transplantaasje yn in ier stadium fan ûntwikkeling. Bygelyks, it is net dúdlik oft de spontane aktiviteit dy't waarnommen wurdt yn t-hCO in ûntwikkelingsfenotype fertsjintwurdiget dy't fergelykber is mei de ritmyske aktiviteit dy't waarnommen wurdt tidens kortikale ûntwikkeling, of oft it te tankjen is oan 'e ôfwêzigens fan ûnderdrukkende seltypen oanwêzich yn t-hCO. Likegoed is it net dúdlik yn hoefier't de ôfwêzigens fan laminaasje yn t-hCO ynfloed hat op keatlingferbining30. Takomstich wurk sil him rjochtsje op it yntegrearjen fan oare seltypen lykas minsklike mikroglia, minsklike endotheelzellen, en ferskillende proporsjes fan GABAergyske ynterneuronen lykas werjûn mei assemblage 6 yn vitro, lykas it begripen fan hoe't neurale yntegraasje en ferwurking kinne foarkomme yn feroare t-hCO. transkripsjonele, synaptyske en gedrachsnivo's yn sellen dy't krigen binne fan pasjinten.
Oer it algemien fertsjintwurdiget dit in vivo platfoarm in krêftige boarne dy't in vitro minsklike harsensûntwikkeling en sykteûndersyk kin oanfolje. Wy ferwachtsje dat dit platfoarm ús tastean sil om nije fenotypen op strânnivo te ûntdekken yn oars ûntwykende sellen fan pasjinten en nije terapeutyske strategyen te testen.
Wy generearren hCO2.5 út HiPS-sellen lykas earder beskreaun. Om de hCO-produksje te begjinnen út hiPS-sellen dy't kultivearre waarden op feederlagen, waarden yntakte koloanjes fan hiPS-sellen út kultuerskûtels helle mei dispase (0,35 mg/mL) en oerdroegen nei plestikkulturen mei ultra-lege oanhechting dy't skûtels befette mei hiPS-selkultuermedium. (Corning) oanfolle mei twa SMAD-ynhibitoren dorsomorfine (5 μM; P5499, Sigma-Aldrich) en SB-431542 (10 μM; 1614, Tocris) en ROCK-ynhibitor Y-27632 (10 μM; S1049, Selleckchem). Tidens de earste 5 dagen waard it hiPS-selmedium deistich feroare en waarden dorsomorfine en SB-431542 tafoege. Op de sechsde dei yn suspensje waarden neurale sferoïden oerdroegen nei neuraal medium mei neurobasal-A (10888, Life Technologies), B-27-supplement sûnder fitamine A (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies), penisilline en streptomycine (1:100, Life Technologies) en oanfolle mei de epidermale groeifaktor (EGF; 20 ng ml−1; R&D Systems) en fibroblastgroeifaktor 2 (FGF2; 20 ng ml−1; R&D Systems) oant dei 24. Fan dei 25 oant dei 42 waard it medium oanfolle mei harsens-ôflaatte neurotrofyske faktor (BDNF; 20 ng ml−1, Peprotech) en neurotrofine 3 (NT3; 20 ng ml−1; Peprotech) mei mediumwikselingen om de oare dei. Op de sechsde dei yn suspensje waarden neurale sferoïden oerdroegen nei neuraal medium mei neurobasal-A (10888, Life Technologies), B-27-supplement sûnder fitamine A (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies), penisilline en streptomycine (1:100, Life Technologies) en oanfolle mei de epidermale groeifaktor (EGF; 20 ng ml−1; R&D Systems) en fibroblastgroeifaktor 2 (FGF2; 20 ng ml−1; R&D Systems) oant dei 24. Fan dei 25 oant dei 42 waard it medium oanfolle mei harsens-ôflaatte neurotrofyske faktor (BDNF; 20 ng ml−1, Peprotech) en neurotrofine 3 (NT3; 20 ng ml−1; Peprotech) mei mediumwikselingen om de oare dei.Op de sechsde dei yn suspensje waarden de neurale sferoïden oerdroegen nei in neuraal medium mei Neurobasal-A (10888, Life Technologies), B-27-supplement sûnder fitamine A (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies), penisilline.и стрептомицин (1:100, Life Technologies) и дополнены эпидермальным фактором роста (EGF; 20 нг/ml; R&D Systems) en фактором роста (20 нг/ml; R&D Systems) en фактором робста20F; нг/мл; R&D Systems) oant 24-го дня. en streptomycine (1:100, Life Technologies) en oanfolle mei epidermale groeifaktor (EGF; 20 ng/ml; R&D Systems) en fibroblastgroeifaktor 2 (FGF2; 20 ng/ml; R&D Systems) oant dei 24.Fan dagen 25 oant 42 waarden harsens-ôflaatte neurotrofyske faktor (BDNF; 20 ng ml-1, Peprotech) en neurotrofine 3 (NT3; 20 ng ml-1, Peprotech) tafoege oan it medium, wêrby't it medium om de oare dei feroare waard.在悬浮的第6 天，将神经球体转移到含有neurobasal-A（10888，Life Technologies）、不含维甚焠B-27甚焠补充剂（12587，Life Technologies）、GlutaMax（1:100，Life Technologies）、青霉素的神经培养基中和铼:链霉:链霉Technologies）并辅以表皮生长因子（EGF；20 ng ml-1；R&D Systems）和成纤维细胞生长因子2（FGF2；20 ng ml-1；R&D Systems）直至第24 天.在 悬浮 的 第 第 6 天 将 神经 球体 转移 含有 含有 neurobasal-a （10888 ， Life Technologies０ 焫 縍b-27 补充剂 （12587 ， Life Technologies） Glutamax （1: 100 ， Life TechNOGIS青霉素 的 祴经 培养 基 丼缈链链霉） Technologies） 表皮 生长 因子 （（（20 ng ml-1 ； r & d Systems） 成 纤维 细胞 生长 2 （fgf2 ； 20 ng ml- 1；R&D SystemsＳ瀩瀬2 На 6-й день суспензии нейросферы были переведены на добавку, содержащую нейробазал-А (10888, Life Technologies), oant 27, добавку А (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies), пенициллин- нейтрализованный стрептомицин (1:100, Life Technologies) с добавлением эпицин (EGF; 20 нг мл-1; R&D Systems) en фактора роста фибробластов 2 (FGF2; 20 нг ml-1) 1; Op dei 6 waarden neurosfearsuspensjes oerskeakele nei in oanfolling mei neurobasal-A (10888, Life Technologies), B-27-oanfolling sûnder fitamine A (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies), penisilline-neutralisearre streptomycine (1:100, Life Technologies) oanfolle mei epidermale groeifaktor (EGF; 20 ng ml-1; R&D Systems) en fibroblastgroeifaktor 2 (FGF2; 20 ng ml-1) 1; R&D Systems) oant 24-hou дня. R&D Systems) oant dei 24.Fan dagen 25 oant 42 waarden harsens-ôflaatte neurotrofyske faktor (BDNF; 20 ng ml-1, Peprotech) en neurotrofyske faktor 3 (NT3; 20 ng ml-1, Peprotech) om de oare dei tafoege oan it kweekmedium. Mediumwikseling ien kear.Fanôf dei 43 waard hCO2 ûnderhâlden yn net-oanfolle neurobasaal-A medium (NM; 1088022, Thermo Fisher) mei mediumwikseling elke 4-6 dagen. Om hCO2 te krijen fan hiPS-sellen dy't ûnder feedleaze omstannichheden kultivearre waarden, waarden hiPS-sellen 7 minuten ynkubearre mei Accutase (AT-104, Innovate Cell Technologies) by 37 °C, dissosiearre yn ienkele sellen, en útplaat op AggreWell 800-platen (34815, STEMCELL Technologies) mei in tichtens fan 3 × 106 ienkele sellen per putsje yn Essential 8-medium oanfolle mei de ROCK-remmer Y-27632 (10 μM; S1049, Selleckchem). Nei 24 oeren waarden de media yn 'e putjes op en del pipetteare yn media mei Essential 6-media (A1516401, Life Technologies) oanfolle mei dorsomorfine (2,5 μM; P5499, Sigma-Aldrich) en SB-431542 (10 μM; 1614). , Tocrida). Fan dagen 2 oant 6 waard Essential 6-medium deistich ferfongen troch dorsomorfine en oanfolling SB-431542. Fan 'e sechsde dei ôf waarden de neurosfearsuspensjes oerdroegen nei it neurobasale medium en ûnderhâlden lykas hjirboppe beskreaun.
Alle bistprosedueres waarden útfierd neffens de rjochtlinen foar bistefersoarging dy't goedkard binne troch it Stanford University Laboratory Animal Care Administrative Committee (APLAC). Drachtige euthymyske RNU (rnu/+) rotten waarden oankocht (Charles River Laboratories) of ûnderbrocht. Dieren waarden hâlden op in 12-oere ljocht-tsjuster-syklus mei iten en wetter ad libitum. Neaken (FOXN1–/–) rattewelpen fan trije oant sân dagen âld waarden identifisearre troch de groei fan ûnrype snorhierren foar it útskieden. Welpen (mantsjes en wyfkes) waarden anaesthesiaare mei 2-3% isofluraan en op in stereotaksysk frame pleatst. In trepanaasje fan 'e skedel mei in diameter fan sawat 2-3 mm boppe S1 waard útfierd, wylst de yntegriteit fan 'e dura mater bewarre bleau. Brûk dan in 30-G-naald (sawat 0,3 mm) krekt bûten de kraniotomy om de dura te trochboarjen. Bring dan HCO oan op in tinne parafilm fan 3 × 3 sm en ferwiderje oerstallich medium. Brûk in Hamilton-spuit dy't oan in 23 G, 45°-naald befestige is, om foarsichtich hCO3 yn it meast distale ein fan 'e naald te lûken. Ynstallearje dan de spuit op 'e spuitpomp dy't ferbûn is mei it stereotaksyske apparaat. Plak dan de punt fan 'e naald oer in earder makke 0,3 mm breed punksjegat yn 'e dura (z = 0 mm) en meitsje de spuit 1-2 mm smeller (z = sawat –1,5 mm) oant de naald tusken de dura mater A sit. In tichte ôfsluting wurdt foarme. Til dan de spuit nei it sintrum fan it kortikale oerflak by z = -0,5 mm en ynjeksjearje hCO3 mei in snelheid fan 1-2 µl per minuut. Nei it foltôgjen fan 'e hCO3-ynjeksje wurdt de naald weromlutsen mei in snelheid fan 0,2-0,5 mm per minuut, wurdt de hûd hechte, en wurdt de puppy fuortendaliks op in waarm ferwaarmingskussen pleatst oant folslein herstel. Guon bisten waarden bilateraal transplantearre.
Alle bistprosedueres waarden útfierd neffens de troch Stanford University APLAC goedkarde rjochtlinen foar bistefersoarging. Rotten (âlder as 60 dagen nei transplantaasje) waarden ynducearre mei 5% isofluraan-anestesy en anesthetisearre mei 1-3% isofluraan tidens ôfbylding. Foar fisualisaasje waard in 7 Tesla aktyf ôfskerme horizontale boorgatscanner Bruker (Bruker Corp.) mei in gradiëntoandriuwing fan 'e International Electric Company (IECO), in ôfskerme gradiëntynfoegsel mei in ynterne diameter fan 120 mm (600 mT/m, 1000 T/m/s) brûkt mei AVANCE. III, acht-kanaals multi-coil RF- en multi-core-mooglikheden, en it begeliedende Paravision 6.0.1-platfoarm. De opname waard útfierd mei in aktyf ûntkoppelde volumetryske RF-spoel mei in ynterne diameter fan 86 mm en in fjouwer-kanaals kryo-kuolle RF-spoel allinich foar ûntfangen. Axial 2D Turbo-RARE (werhellingstiid = 2500 ms, echotiid = 33 ms, 2 gemiddelden) mei 16 slice-opnamen, slice-dikte 0,6–0,8 mm, mei 256 × 256 samples. De sinjalen waarden ûntfongen mei in kwadratuer transceiver volumetryske RF-spoel mei in ynterne diameter fan 2 sm (Rapid MR International, LLC). Brûk úteinlik de ynboude Imaris (BitPlane) oerflakskattingsfunksjes foar 3D-rendering en folume-analyze. In suksesfolle transplantaasje waard definiearre as ien wêryn gebieten fan trochgeand T2-gewogen MRI-sinjaal foarme waarden yn 'e transplantearre hemisfear. Transplantaatôfwizing waard definiearre as in transplantaat dat gjin gebieten fan trochgeand T2-gewogen MRI-sinjaal produsearre yn 'e transplantearre hemisfear. Subkortikale t-hCO waard útsletten fan folgjende analyze.
Om GCaMP6s stabyl út te drukken yn hCO foar twa-foton kalsiumôfbylding, waarden hiPS-sellen ynfekteare mei pLV[Exp]-EF1a::GcaMP6s-WPRE-Puro, folge troch seleksje fan antibiotika. Koartsein, sellen waarden dissosiearre mei EDTA en suspendearre yn 1 ml Essential 8 medium mei in tichtens fan sawat 300.000 sellen yn 'e oanwêzigens fan polybreen (5 μg/ml) en 15 μl firus. De sellen waarden doe 60 minuten yn suspensje ynkubearre en siedde mei in tichtens fan 50.000 sellen per putsje. Nei konfluinsje waarden sellen behannele mei 5-10 μg ml-1 puromycine foar 5-10 dagen of oant stabile koloanjes ferskynden. Akute hCO-ynfeksje waard útfierd lykas earder beskreaun5 mei wat oanpassingen. Koartsein, oerdrage dei 30-45 hCO yn 1,5 ml Eppendorf mikrosentrifugebuizen mei 100 μl senuwmedium. Dan wurdt sawat 90 µl fan it medium fuorthelle, 3-6 µl hege titer lentivirus (fan 0,5 x 108 oant 1,2 x 109) wurdt tafoege oan 'e buis, en de hCO3 wurdt oerdroegen nei de ynkubator foar 30 minuten. Foegje dan 90-100 µl medium ta oan elke buis en set de buizen werom yn 'e ynkubator oernachtich. De oare deis, oerdrage hCO3 nei fars senuwmedium yn platen mei lege oanhechting. Nei 7 dagen waard hCO3 oerdroegen nei platen mei 24 putten mei glêzen boaiem foar fisualisaasje en evaluaasje fan ynfeksjekwaliteit. pLV[Exp]-SYN1::EYFP-WPRE en pLV[Exp]-SYN1::hChR2-EYFP-WPRE waarden generearre troch VectorBuilder. Lentivirus wurdt brûkt yn 'e measte eksperiminten, om't it yntegrearre is yn it gastheargenoom, wêrtroch reportergenekspresje yn ynfekteare sellinen mooglik is. Foar rabies-follow-up waard hCO op dei 30-45 ko-ynfekteare mei rabies-ΔG-eGFP en AAV-DJ-EF1a-CVS-G-WPRE-pGHpA (plasmide #67528, Addgene), 3 dagen goed wosken en transplantearre yn rotten yn S1 en 7-14 dagen yn vivo hâlden.
Foar immunocytochemy waarden bisten anaesthesia en transkardiaal perfusearre mei PBS folge troch 4% paraformaldehyde (PFA yn PBS; Electron Microscopy Sciences). Harsens waarden 2 oeren of oernachtich by 4°C fiksearre yn 4% PFA, 48-72 oeren kryopreservearre yn 30% sukrose yn PBS, en ynbêde yn 1:1, 30% sukrose: OCT (Tissue-Tek OCT Compound 4583, Sakura Finetek) en koronale seksjes waarden makke op 30 µm mei in kryostaat (Leica). Foar immunohistochemy fan dikke seksjes waarden bisten perfusearre mei PBS, en waarden de harsens dissekearre en koronaal seksjeare op 300-400 µm mei in vibratome (Leica) en de seksjes waarden 30 minuten fiksearre mei 4% PFA. Doe waarden kryoseksjes of dikke seksjes wosken mei PBS, 1 oere blokkearre by keamertemperatuer (10% normaal ezelsserum (NDS) en 0,3% Triton X-100 ferdund yn PBS) en blokkearre mei blokkearjende oplossing by 4 °C. – Ynkubaasje Kryoseksjes waarden oernachts ynkubearre en dikke seksjes waarden 5 dagen ynkubearre. De primêre antistoffen dy't brûkt waarden wiene: anti-NeuN (mûs, 1:500; ab104224, abcam) anti-CTIP2 (rat, 1:300; ab18465, abcam), anti-GFAP (knyn, 1:1.000; Z0334, Dako), anti-GFP (kip, 1:1.000; GTX13970, GeneTex), anti-HNA (mûs, 1:200; ab191181, abcam), anti-NeuN (knyn, 1:500; ABN78, Millipore), anti-PDGFRA (knyn, 1:200; sc-338, Santa Cruz), anti-PPP1R17 (knyn, 1:200; HPA047819, Atlas Antibodies), anti-RECA-1 (mûs, 1:50; ab9774, abcam), anti-SCG2 (knyn, 1:100; 20357-1-AP, Proteintech), anti-SOX9 (geit, 1:500; AF3075, R&D Systems), Netrin G1a (geit, 1:100; AF1166, R&D Systems), anti-STEM121 (mûs, 1:200; Y40410, Takara Bio), anti-SATB2 (mûs, 1:50; ab51502, abcam), anti-GAD65/67 (knyn, 1:400; ABN904, Millipore) en anti-IBA1 (geit, 1:100; ab5076, abcam). De primêre antistoffen dy't brûkt waarden wiene: anti-NeuN (mûs, 1:500; ab104224, abcam) anti-CTIP2 (rat, 1:300; ab18465, abcam), anti-GFAP (knyn, 1:1.000; Z0334, Dako), anti-GFP (kip, 1:1.000; GTX13970, GeneTex), anti-HNA (mûs, 1:200; ab191181, abcam), anti-NeuN (knyn, 1:500; ABN78, Millipore), anti-PDGFRA (knyn, 1:200; sc-338, Santa Cruz), anti-PPP1R17 (knyn, 1:200; HPA047819, Atlas Antibodies), anti-RECA-1 (mûs, 1:50; ab9774, abcam), anti-SCG2 (knyn, 1:100; 20357-1-AP, Proteintech), anti-SOX9 (geit, 1:500; AF3075, R&D Systems), Netrin G1a (geit, 1:100; AF1166, R&D Systems), anti-STEM121 (mûs, 1:200; Y40410, Takara Bio), anti-SATB2 (mûs, 1:50; ab51502, abcam), anti-GAD65/67 (knyn, 1:400; ABN904, Millipore) en anti-IBA1 (geit, 1:100; ab5076, abcam). Использовались следующие первичные антитела: анти-NeuN (мышиные, 1:500; ab104224, abcam), анти-CTIP2 (крысин34, abcam), abcam, abcam анти-GFAP (кроличьи, 1:1000; Z0334, Dako), анти- -GFP (курица, 1:1000; GTX13970, GeneTex), анти-HNA (мышь, 1:200; курица, 1:1000; GTX13970, GeneTex), анти-HNA (мышь, 1:200; курица, 19118) 1:500; ABN78, Millipore), анти-PDGFRA (кролик, 1:200; sc-338, Санта-Круз), анти-PPP1R17 (кролик, 1:200; HPA047819, Atlas Antibodies), анти-RECA-1 (мышь, 1:50; ab9774, abcam), анти-SCG2, анти-SCG2, 10, 10; 20357-1-AP, Proteintech), анти-SOX9 (козий, 1:500; AF3075, R&D Systems), нетрин G1a (козий, 1:100; AF1166, R&D Systems), анти-STEM121 (мынй, 121; Y40410, Takara Bio), анти-SATB2 (мышь, 1:50; ab51502, abcam), анти-GAD65/67 (кролик, 1:400; ABN904, Millipore) en анти-IBA1 (коза, 1:100; аб5076, абкам). De primêre antistoffen dy't brûkt waarden wiene: anti-NeuN (mûs, 1:500; ab104224, abcam), anti-CTIP2 (rat, 1:300; ab18465, abcam), anti-GFAP (knyn, 1:1000; Z0334, Dako), anti-GFP (kip, 1:1000; GTX13970, GeneTex), anti-HNA (mûs, 1:200; ab191181, abcam), anti-NeuN (knyn, 1:500; ABN78, Millipore), anti-PDGFRA (knyn, 1:200; sc-338, Santa Cruz), anti-PPP1R17 (knyn, 1:200; HPA047819, Atlas Antibodies), anti-RECA-1 (mûs, 1:50; ab9774, abcam), anti-SCG2 (knyn, 1:100; 20357-1-AP, Proteintech), anti-SOX9 (geit, 1:500; AF3075, R&D Systems), netrin G1a (geit, 1:100; AF1166, R&D Systems), anti-STEM121 (mûs, 1:200; Y40410, Takara Bio), anti-SATB2 (mûs, 1:50; ab51502, abcam), anti-GAD65/67 (knyn, 1:400; ABN904, Millipore) en anti-IBA1 (geit, 1:100; ab5076, abkam).使用的一抗是：抗NeuN（小鼠，1:500；ab104224，abcam）抗CTIP2（大鼠，1:3 00；ab18465，abcam），抗GFAP（兔，1:1,000；Z0334，Dako），抗-GF P（鸡，1:1.000；GTX13970，GeneTex），抗HNA（小鼠，1:200；ab1911 81，abcam），抗NeuN（兔，1:500；ABN78，Millipore），抗PDGFRA（兔， 1:200；sc-338，Santa Cruz），抗PPP1R17（兔，1:200；HPA047819，Atlas抗体），抗RECA-1（小鼠，1:50；ab9774，abcam），抗SCG2（兔） , 1:100；20357-1-AP，Proteintech），抗SOX9（山羊，1:500；AF3075，R&D Systems），Netrin G1a（山羊，（山羊＼，，1:10 Systems），抗STEM121（小鼠, 1:200;使用的一抗是：抗NeuN（小鼠，1:500；ab104224，abcam）抗CTIP2（大鼠，1 :300；ab18465，abcam），抗GFAP（兔，1:1,000；Z0334，Dako），抗-GFP（鸡，1:1.000；GTX13970，GeneTex），抗HNA（小鼠，1:200；ab 191181，abcam），抗NeuN（兔，1:500；ABN78，Millipore％弔，抗1: 200；sc-338，Santa Cruz），抗PPP1R17（兔，1:200；HPA047819，Atlas抗体），抗RECA-1（小鼠，1:50；ab9774，abcam），抗SCG2 100；20357-1-AP，Proteintech），抗SOX9（山羊，1:500；AF3075，R&D Systems），Netrin G1a（山羊，1:106，AF306， Systems）頏1:20, ;Y40410, Takara Bio), anti-SATB2 (mûs, 1:50; ab51502, abcam), anti-GAD65/67 (knyn, 1:400; ABN904, Millipore) en anti-IBA1 (geit, 1:100; ab5076, abcam).De primêre brûkte antistoffen wiene: anti-NeuN (mûs, 1:500; ab104224, abcam), anti-CTIP2 (rat, 1:300; ab18465, abcam), anti-GFAP (knyn, 1:1000; Z0334, Dako). , anti-GFP (kip, 1:1000; GTX13970, GeneTex), anti-HNA (mûs, 1:200; ab191181, abcam), anti-NeuN (knyn, 1:500; ABN78, Millipore), anti-PDGFRA (knyn, 1:200; sc-338, Santa Cruz), anti-PPP1R17 (knyn, 1:200; HPA047819, Atlas-antistof), anti-RECA-1 (mûs, 1:50; ab9774, abcam), anti-SCG2 (knyn), 1:100;20357-1-AP, Proteintech), анти-SOX9 (коза, 1:500; AF3075, R&D Systems), Нетрин G1a (коза, 1:100; AF1166, R&D Systems), анти -STEM121, мы4ш000; Bio), анти-SATB2 (мышь, 1:50; ab51502, abcam), анти-GAD65/67 (кролик, 1:400; ABN904, Millipore) en анти-IBA1 (коза, 1:100; аба507, аба5076, аба507). 20357-1-AP, Proteintech), anti-SOX9 (geit, 1:500; AF3075, R&D Systems), Netrin G1a (geit, 1:100; AF1166, R&D Systems), anti-STEM121 (mûs, 1:200; Y40410, Takara Bio), anti-SATB2 (mûs, 1:50; ab51502, abcam), anti-GAD65/67 (knyn, 1:400; ABN904, Millipore), en anti-IBA1 (geit, 1:100; ab5076, abkam).De seksjes waarden doe wosken mei PBS en 1 oere by keamertemperatuer (beferzen seksjes) of oernachtich by 4 °C (dikke seksjes) ynkubearre mei sekundêr antistof. Alexa Fluor sekundêr antistof (Life Technologies) ferdund 1:1000 yn blokkearjende oplossing waard brûkt. Nei it waskjen mei PBS waarden de kearnen visualisearre mei in Hoechst 33258 (Life Technologies). Uteinlik waarden de dia's op in mikroskoop pleatst mei dekglaasjes (Fisher Scientific) mei in Aquamount (Polysciences) en analysearre op in Keyence fluoreszinte mikroskoop (BZ-X analyzer) of in Leica TCS SP8 konfokale mikroskoop (Las-X) op 'e ôfbylding. De ôfbyldings waarden ferwurke mei it ImageJ-programma (Fiji). Om de proporsje fan minsklike neuronen yn t-hCO en de rattekorteks te kwantifisearjen, waarden 387,5 μm brede rjochthoekige ôfbyldings makke yn it sintrum fan 'e t-hCO, op of tichtby de râne fan 'e rattekorteks. Transplantaatmarzjes waarden bepaald troch feroaringen yn weefseltransparânsje, HNA+ kearnen, en/of de oanwêzigens fan weefselautofluoreszinsje te beoardieljen. Yn elke ôfbylding waard it totale oantal NeuN+ en HNA+ sellen dield troch it totale oantal NeuN+ sellen yn itselde gebiet. Om te soargjen dat allinich sellen mei kearnen yn it ôfbyldingsflak teld wurde, wurde allinich sellen dy't ek Hoechst+ binne opnommen yn 'e berekkening. Twa ôfbyldings dy't op syn minst 1 mm útinoar lizze, waarden gemiddeld om de statistyske flater te ferminderjen.
Ien wike foar it sammeljen fan de stekproef, pleats hCO3-transplantearre bisten (sawat 8 moannen fan differinsjaasje) yn in tsjustere keamer mei snorhierren bysnien om sensoryske stimulearring te minimalisearjen. Isolaasje fan kearnen waard útfierd lykas earder beskreaun, mei wat oanpassingen. Koartsein, t-hCO3 en hCO3 waarden ferneatige mei detergent-meganyske sellysis en in 2 ml glêzen weefselslypmasine (D8938, Sigma-Aldrich/KIMBLE). De rûge kearnen waarden doe ôffiltere mei in 40 µm filter en sintrifugearre by 320 g foar 10 minuten by 4 °C foardat in sukrosedichtheidsgradiënt waard útfierd. Nei de sintrifugaasjestap (320 g foar 20 minuten by 4 °C) waarden de stekproeven opnij suspendearre yn 0,04% BSA/PBS mei de tafoeging fan 0,2 ienheden µl-1 RNase-ynhibitor (40 u µl-1, AM2682, Ambion) en troch in 40 µm streamfilter passearre. De dissosiearre kearnen waarden doe opnij suspendearre yn PBS mei 0,02% BSA en laden op in Chromium Single Cell 3′-chip (rûsde herstel fan 8.000 sellen per baan). snRNA-seq-bibleteken waarden taret mei de Chromium Single cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics). snRNA-seq-bibleteken waarden taret mei de Chromium Single cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics). Библиотеки snRNA-seq были приготовлены с помощью Chromium Single cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics). De snRNA-seq-bibleteken waarden taret mei Chromium Single cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics). snRNA-seq 文库是使用Chromium Single cell 3′ GEM、Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics) 制备的。 snRNA-seq 文库是使用Chromium Single cell 3′ GEM、Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics) 制备的。 Библиотеку snRNA-seq готовили с использованием Chromium Single Cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics). De snRNA-seq-bibleteek waard taret mei Chromium Single Cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics).Biblioteken fan ferskate samples waarden gearfoege en sekwinsjearre troch Admera Health op NovaSeq S4 (Illumina).
Genekspresjenivo's foar elke fertochte nukleêre barcode waarden kwantifisearre mei it 10x Genomics CellRanger-analysesoftwarepakket (ferzje 6.1.2). Spesifyk waarden de lêzingen fergelike mei in kombinaasje fan minsklike (GRCh38, Ensemble, ferzje 98) en ratte (Rnor_6.0, Ensemble, ferzje 100) referinsjegenomen makke mei it mkref-kommando en mei it count mei it –include-introns=TRUE-kommando om lêzingen yn te sluten dy't yn kaart brocht binne oan intronregio's. Foar t-hCO-monsters waarden minsklike kearnen identifisearre op basis fan 'e konservative eask dat teminsten 95% fan alle yn kaart brochte lêzingen oerienkomme mei it minsklik genoom. Alle folgjende analyses waarden útfierd op in filtere barcode-array dy't útfier wie fan 'e CellRanger mei it R-pakket (ferzje 4.1.2) Seurat (ferzje 4.1.1)32.
Om te garandearjen dat allinich kearnen fan hege kwaliteit opnommen wurde yn 'e neifolgjende analyze, waard in iteratyf filterproses ymplementearre foar elk stekproef. Earst wurde kearnen fan lege kwaliteit mei minder as 1000 unike genen fûn en mear as 20% fan it totale oantal mitochondria identifisearre en fuorthelle. Dêrnei waard de rûge gennûmermatrix normalisearre troch regularisearre negative binomiale regresje mei de sctransform(vst.flavor=”v2″) funksje, dy't ek de 3000 meast fariabele genen identifisearre mei standertparameters. Diminsjereduksje waard útfierd op 'e boppeste fariabele genen mei Principal Component Analysis (PCA) mei standertparameters mei in datasetdiminsje fan 30 (dims = 30 waard keazen op basis fan fisuele ynspeksje fan knibbelplakken en brûkt foar alle samples en ensemble-analyses). Wy fierden doe ferskate rûndes fan iterative klustering út (resolúsje = 1) om genen te klassifisearjen op basis fan abnormaal leech gental (mediaan ûnder 10e persintyl), abnormaal heech mitochondrial gental (mediaan boppe 95e persintyl) om fertochte sellen fan lege kwaliteit te identifisearjen en te ferwiderjen. klusters en/of in hege proporsje fan fertochte twillingen identifisearre mei it DoubletFinder33-pakket (gemiddelde DoubletFinder-skoare boppe it 95e persintyl). t-hCO-samples (n=3) en hCO-samples (n=3) waarden apart yntegrearre mei de IntegrateData-funksje mei de boppesteande parameters. Doe in oare ronde fan kwalitative filterjen fan 'e yntegreare dataset waard útfierd lykas hjirboppe beskreaun.
Nei it fuortheljen fan 'e kernels fan lege kwaliteit waard de yntegreare dataset groepearre (resolúsje = 0.5) en ynbêde foar UMAP34-visualisaasjedoelen. Markergenen foar elke kluster waarden bepaald mei de FindMarkers-funksje mei standertparameters berekkene út normalisearre genekspresjegegevens. Wy identifisearje en klassifisearje wichtige selklassen troch it kombinearjen fan fetale en folwoeksen kortikale referinsjedatasets mei markergenekspresje 19,20,21,35 en annotaasje. Yn it bysûnder waarden sirkulearjende foargongers identifisearre troch de ekspresje fan MKI67 en TOP2A. Progenitorklusters waarden definieare troch de ôfwêzigens fan mitoatyske transkripten, hege oerlaap mei multipotente gliale progenitorklusters beskreaun yn lette metafase fetale korteks, en EGFR- en OLIG1-ekspresje. Wy brûke de term astrocyte om ferskate steaten fan astrocytdifferinsjaasje te omfetsjen, fan lette radiale glia oant ryping fan astrocyten. Astrocyteklusters ekspressearje hege nivo's fan SLC1A3 en AQP4 en it is oantoand dat se yn kaart komme mei subtypen fan fetale radiale glia en/of folwoeksen astrocyten. OPC's ekspressearje PDGFRA en SOX10, wylst oligodendrocyten myelinisaasjemarkers ekspressearje (MOG en MYRF). Glutamatergyske neuronen waarden identifisearre troch de oanwêzigens fan neuronale transkripten (SYT1 en SNAP25), de ôfwêzigens fan GABAergyske markers (GAD2), en de ekspresje fan NEUROD6, SLC17A7, BCL11B, of SATB2. GluN-neurons waarden fierder ferdield yn boppeste (SATB2-ekspresje en ferlies fan BCL11B) en djippe (BCL11B-ekspresje) subklassen. Putative subplaat (SP) neuronen ekspressearje bekende SP18-markers lykas ST18 en SORCS1 neist djippe GluN-markers. Choroïde plexus-achtige sellen waarden identifisearre troch TTR-ekspresje, en meningeale-achtige sellen ekspressearren fibroblast-assosjeare genen en kaarten pial/vaskulêre sellen fan 'e referinsjedataset.
Differinsjaalanalyse fan genekspresje tusken t-hCO en hCO subklassen waard útfierd mei in nij ûntwikkele pseudo-batchmetoade reprodusearre yn samples ymplementearre mei it Libra R-pakket (ferzje 1.0.0). Spesifyk waarden edgeR log-likelihood-tests (ferzje 3.36.0, pakket R) útfierd foar groepen troch it oantal genen yn sellen foar in bepaalde selklasse foar elke samplereplikaasje op te tellen. Foar heatmap-visualisaasje wurde normalisearre per miljoen (CPM) wearden berekkene mei edgeR (cpm() funksje) en skaalde (om gemiddelde = 0, standertôfwiking = 1 te berikken). Gene Ontology (GO) ferrikingsanalyse fan signifikant opregulearre t-hCO GluN-genen waard útfierd (Benjamini-Hochberg korrizjearre P-wearde fan minder as 0,05 útdrukt yn teminsten 10% fan t-hCO GluN-sellen en in ferheging fan teminsten 2 kear), útfierd mei ToppGene Suite (https://toppgene.cchmc.org/)37. Wy brûke de ToppFun-app mei standertparameters en rapportearje Benjamini-Hochberg-korrizjearre P-wearden berekkene út GO-annotearre hypergeometryske testen.
Om ús snRNA-seq-klusters te oerienkommen mei annotearre selklusters út referinsjestúdzjes fan primêre single-sel RNA-seq of folwoeksen snRNA-seq19,20,21,22, hawwe wy in oanpak foar yntegraasje fan gekoppelde datasetten tapast. Wy hawwe de SCTransform (v2) normalisaasjeworkflow yn Seurat brûkt om klusteroerlaapkes tusken datasets te yntegrearjen en te fergelykjen (mei deselde parameters as hjirboppe). Yndividuele datasets waarden willekeurich subset oant 500 sellen of kearnen per orizjinele kluster foar berekkeningseffisjinsje. Mei in ferlykbere oanpak as earder beskreaun, waard klusteroerlaap definieare as it oandiel fan sellen of kearnen yn elke gearfoege kluster dy't oerlaapte mei it label fan 'e referinsjekluster. Om GluN's fierder te klassifisearjen, hawwe wy de TransferData-workflow fan Seurat brûkt foar GluN-subsetgegevens om referinsjedataslabels ta te wizen oan ús GluN-sellen.
Om de rypingsstatus fan it globale transkriptoom fan t-hCO en hCO samples te beoardieljen, hawwe wy ús pseudo-bulk samples fergelike mei BrainSpan/psychENCODE23, dat bestiet út in grutte RNA-sekwinsje dy't de ûntwikkeling fan it minsklik brein omfiemet. Wy hawwe PCA útfierd op in kombineare patroan-normalisearre genekspresjematrix fan kortikale samples 10 wiken nei konsepsje en letter, yn 5567 genen (tegearre mei ús gegevens) dy't earder identifisearre waarden as aktyf yn BrainSpan kortikale samples (definiearre as grutter as 50% yn ûntwikkelingsfariânsje ferklearre troch leeftyd mei in kubysk model)38. Derneist hawwe wy genen ôflaat dy't assosjeare binne mei wichtige transkriptoom-hantekeningen fan neuro-ûntwikkeling mei net-negative matrixfaktorisaasje lykas earder beskreaun. De samplegewichten berekkene mei de net-negative matrixfaktorisaasjeproseduere binne plot yn Figs. 5b mei útwreide gegevens foar elk fan 'e fiif hantekeningen beskreaun troch Zhu et al.38. Opnij waarden aktiviteitsôfhinklike transkripsjonele markers ôflaat fan earder publisearre stúdzjes. Benammen ERG en LRG wiene signifikant opregulearre yn glutamatergyske neuronen identifisearre troch de snRNA-seq-kolleksje fan 'e fisuele korteks fan 'e mûs nei fisuele stimulearring út Oanfoljende Tabel 3 Hrvatin et al.16. Minske-ferrike LRG's waarden krigen fan KCl-aktivearre minsklike fetale harsenskultueren en 6 oeren nei stimulearring rispe, en de filtere genen wiene signifikant opregulearre yn minsken, mar net yn knaagdieren (Oanfoljende Tabel 4). Analyse fan gensetferriking mei dizze gensets waard útfierd mei in ienwegs Fisher's eksakte test.
Anesthetisearje rotten mei isofluraan, ferwiderje harsens en pleats se yn in kâlde (sawat 4 °C) soerstofrike (95% O2 en 5% CO2) sukrose-oplossing foar seksjes mei: 234 mM sukrose, 11 mM glukoaze, 26 mM NaHCO3, 2,5 mM KCl, 1,25 mM NaH2PO4, 10 mM MgSO4 en 0,5 mM CaCl2 (sawat 310 mOsm). Koronale seksjes fan rotteharsens (300–400 µm) mei t-hCO3 waarden makke mei in Leica VT1200 vibratome lykas earder beskreaun39. De seksjes waarden doe oerbrocht nei in seksjekeamer mei trochgeande soerstoffoarsjenning by keamertemperatuer mei aCSF, taret út: 10 mM glukoaze, 26 mM NaHCO3, 2,5 mM KCl, 1,25 mM NaHPO4, 1 mM MgSO4, 2 mM CaCl2 en 126 mM NaCl (298 mOsm), teminsten 45 minuten foar it opnimmen. De seksjes waarden opnommen yn in ûnderdompele keamer dêr't se kontinu perfusearre waarden mei aCSF (95% O2 en 5% CO2 fleske). Alle gegevens waarden opnommen by keamertemperatuer. t-hCO neuronen waarden ôfsletten mei in borosilikaatglêspipette fol mei in oplossing mei 127 mM kaliumglukonaat, 8 mM NaCl, 4 mM magnesium ATP, 0,3 mM natrium GTP, 10 mM HEPES, en 0,6 mM EGTA, pH 7,2, ynterne oplossing oanpast mei KOH (290 mOsm). Om te herstellen, waard biocytine (0,2%) tafoege oan de opname-oplossing.
Gegevens waarden sammele mei in MultiClamp 700B-fersterker (Molecular Devices) en in Digidata 1550B-digitalisator (Molecular Devices), leechpasfiltere op 2 kHz, digitalisearre op 20 kHz, en analysearre mei Clampfit (Molecular Devices), Origin (OriginPro). 2021b, OriginLab). en oanpaste MATLAB-funksjes (Mathworks). De junctionpotinsjeel waard berekkene mei JPCalc en de ynfieringen waarden oanpast oan de berekkene wearde fan -14 mV. Operaasje IV bestiet út in searje stroomstappen yn stappen fan 10-25 pA, fan -250 oant 750 pA.
De thalamus, wite stof, en S1-afferenten waarden elektrysk stimulearre yn thalamokortikale plakjes tidens patch-clamp-opname fan hCO-neurons, lykas earder beskreaun. Koartsein, it brein waard pleatst op in 3D-printtafel dy't ûnder in hoeke fan 10 ° kantele wie, en de foarkant fan it brein waard ûnder in hoeke fan 35 ° snien. It brein waard doe oan it snijflak lijmd en yn seksjes snien, wêrby't de thalamokortikale útstekkende axonen bewarre bleaunen. Bipolare wolfraamelektroden (0,5 MΩ) waarden op in twadde mikromanipulator monteard en strategysk pleatst om fjouwer regio's per sel te stimulearjen (binnenste kapsule, wite stof, S1 en hCO). Registrearje synaptyske reaksjes nei 300 µA fasyske stimulearring by 0,03–0,1 Hz.
hChR2-ekspressearjende hCO-neuronen waarden aktivearre by 480 nm en ljochtpulsen generearre troch in LED (Prizmatix) waarden tapast fia in ×40-objektiv (0.9 NA; Olympus) om hChR2-ekspresje tichtby de sellen te registrearjen. De diameter fan it ferljochte fjild is sawat 0.5 mm en it totale fermogen is 10-20 mW. De pulsbreedte waard ynsteld op 10 ms, wat oerienkomt mei de puls jûn tidens it gedrachsleareksperimint. Ferskate stimulearringsfrekwinsjes waarden brûkt, fan 1 oant 20 Hz, mar allinich de earste puls fan 'e searje waard brûkt foar kwantifikaasje. De yntervallen tusken treinen binne meastentiids langer as 30 s om it effekt op synaptyske remmende of fasilitearjende paden te minimalisearjen. Om te testen oft de hChR2-reaksje monosynaptysk wie, hawwe wy TTX (1 μM) tapast op it bad oant de EPSC-reaksje ferdwûn, en doe 4-aminopyridine (4-AP; 100 μM) tapast. Typysk wurdt in reaksje binnen in pear minuten weromjûn, mei in wat langere fertraging tusken it ûntstean fan LED en EPSC-generaasje. NBQX (10 μM) waard brûkt om te testen oft de reaksje oandreaun wurdt troch AMPA-reseptors.
Skerpe hCO₂-seksjes waarden makke lykas earder beskreaun. Koartsein, hCO₂-seksjes waarden ynbêde yn 4% agarose en oerdroegen nei sellen mei 126 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM NaH₂PO₄, 1 mM MgSO₄, 2 mM CaCl₂, 26 mM NaHCO₃ en 10 mM d-(+)-glukose yn seksjes. Seksjes waarden snien op 200–300 µm by keamertemperatuer mei in Leica VT1200-vibrator en opslein yn ASF by keamertemperatuer. Dêrnei waard patch-camp-opname fan hiele sellen útfierd op hCO₂-seksjes ûnder in direkte SliceScope-mikroskoop (Scientifica). Seksjes waarden perfusearre mei aCSF (95% O₂ en 5% CO₂) en selsignalen waarden opnommen by keamertemperatuer. hCO-neurons waarden tapast mei in borosilikaatglêspipette fol mei in oplossing mei 127 mM kaliumglukonaat, 8 mM NaCl, 4 mM magnesium ATP, 0,3 mM natrium GTP, 10 mM HEPES, en 0,6 mM EGTA, ynterne pH 7, 2, oanpast mei KOH (osmolariteit 290). Foar hersteldoelen, foegje 0,2% Biocytine ta oan 'e ynterne oplossing.
Gegevens waarden sammele troch Clampex (Clampex 11.1, Molecular Devices) mei in MultiClamp 700B-fersterker (Molecular Devices) en in Digidata 1550B-digitalisator (Molecular Devices), leechpasfiltere op 2 kHz, digitalisearre op 20 kHz, en analysearre mei Clampfit (ferzje 10.6) foar analyze, molekulêre apparaten) en oanpaste MATLAB-funksjes (MATLAB 2019b, Mathworks). De junction-potinsjaal waard berekkene mei JPCalc en de ynfieringen waarden oanpast oan de berekkene junction-potinsjaal fan -14 mV. Operaasje IV bestiet út in searje stroomstappen yn stappen fan 5-10 pA fan -50 oant 250 pA.
Foar morfologyske rekonstruksje fan ynklemde neuronen waard 0,2% biocytine (Sigma-Aldrich) tafoege oan 'e ynterne oplossing. De sellen wurde teminsten 15 minuten nei it hacken primearre. De pipette wurdt dan stadich 1-2 minuten ynlutsen oant it registrearre membraan folslein ôfsletten is. Neffens de proseduere foar seksyfysiology waarden seksjes oernachtich fêstmakke by 4 °C yn 4% PFA, wosken mei PBS X3, en 1:1000 ferdund mei streptavidine-konjugearre DyLight 549 of DyLight 405 (Vector Labs). Sellen fol mei biocytine (2%; Sigma-Aldrich) waarden markearre tidens patchclamp-opname by keamertemperatuer foar 2 oeren. De seksjes waarden doe monteard op mikroskopie-glaasjes mei in Aquamount (Thermo Scientific) en de oare deis visualisearre op in Leica TCS SP8 konfokale mikroskoop mei in oalje-immersjeobjektyf mei in numerike apertuer ×40 1.3, fergrutting ×0.9–1.0, xy. De samplingfrekwinsje is sawat 7 piksels per mikron. Z-stacks mei yntervallen fan 1 µm waarden serieel krigen, en z-stack mozaïeken en Leica-basearre auto-stitching waarden útfierd om de heule dendrityske beam fan elke neuron te dekken. Neuronen waarden doe semi-manueel folge mei de neuTube 40-ynterface en SWC-bestannen waarden generearre. De bestannen waarden doe uploaden nei de SimpleNeuriteTracer41 Fiji-plugin (ImageJ, ferzje 2.1.0; NIH).
Minsklik kortikaal weefsel waard krigen mei ynformearre tastimming neffens in protokol goedkard troch de Institutional Review Board fan Stanford University. Twa samples fan minsklik postpartumweefsel (3 en 18 jier âld) waarden krigen troch reseksje fan 'e frontale korteks (middelste frontale gyrus) as ûnderdiel fan sjirurgy foar refraktêre epilepsy. Nei reseksje, rispje weefsel yn iiskâlde NMDG-aCSF mei: 92 mM NMDG, 2,5 mM KCl, 1,25 mM NaH2PO4, 30 mM NaHCO3, 20 mM HEPES, 25 mM glukoaze, 2 mM thiourea, 5 mM natriumascorbaat, 3 mM natriumpyruvaat, 0,5 mM CaCl2 4H2O en 10 mM MgSO4 7H2O. Titrear oant pH 7,3-7,4 mei konsintrearre sâltsoer. Weefsels waarden binnen 30 minuten nei it laboratoarium brocht en koronale seksjes waarden nommen neffens de hjirboppe beskreaun proseduere.
Alle bistprosedueres waarden útfierd neffens de troch Stanford University APLAC goedkarde rjochtlinen foar bistesoarch. Rotten (mear as 140 dagen nei transplantaasje) waarden ynducearre mei 5% isofluraan-anestesy en intraoperatyf anestetisearre mei 1-3% isofluraan. Dieren waarden yn in stereotaksysk frame (Kopf) pleatst en buprenorfine (SR) mei oanhâldende frijlitting waard subkutaan ynjektearre. De skedel wurdt bleatlein, skjinmakke en 3-5 bonkeskroeven wurde ynfoege. Om t-hCO3 te rjochtsjen, generearren wy stereotaksyske koördinaten út MRI-ôfbyldings. In boorgat waard boarre op it plak fan belang en fezels (400 µm diameter, NA 0.48, Doric) waarden 100 µm ûnder it hCO3-oerflak sakke en oan 'e skedel befestige mei UV-úthardbere tosksement (Relyx).
Fezelfotometryske opnames waarden útfierd lykas earder beskreaun42. Om spontane aktiviteit op te nimmen, waarden rotten yn in skjinne koai pleatst en in glêstriedpatchkabel (Doric) mei in diameter fan 400 µm, ferbûn mei in glêstriedfotometrysk gegevensakwisysjesysteem, waard ferbûn mei de ymplantearre glêstriedkabel. Tidens de 10 minuten duorjende opname fan motoryske aktiviteit koenen de bisten de koai frij ferkenne. Om de oproppen aktiviteit op te nimmen, waarden rotten (mear as 140 dagen nei transplantaasje) anaesthesisearre mei 5% isofluraan foar ynduksje en 1-3% isofluraan foar ûnderhâld. Plak it bist yn in stereotaktysk frame (Kopf) en de snorhierren oan 'e tsjinoerstelde kant fan' e t-hCO wurde oant sawat 2 sm knipt en troch in gaas brocht dat ferbûn is mei in piëzoelektryske aktuator (PI). In glêstriedpatchkabel (Doric) fan 400 µm waard ferbûn mei de ymplantearre glêstried en ferbûn mei it gegevensakwisysjesysteem. De whiskers oan 'e tsjinoerstelde kant fan t-hCO waarden doe 50 kear (2 mm by 20 Hz, 2 s per presintaasje) op willekeurige tiden ôfbûgd troch in piëzoelektryske oandriuwing oer in opnameperioade fan 20 minuten. Brûk it Arduino MATLAB Support Package om de ôfbûgingstiid te kontrolearjen mei oanpaste MATLAB-koade. Eveneminten wurde syngronisearre mei de gegevensakwisysjesoftware mei help fan transistor-transistorlogika (TTL)-pulsen.
Rotten (mear as 140 dagen nei transplantaasje) waarden ynducearre mei 5% isofluraan-anestesy en intraoperatyf anestesearre mei 1-3% isofluraan. Dieren waarden yn in stereotaksysk frame (Kopf) pleatst en buprenorfine SR en dexamethason waarden subkutaan ynjeksjeare. De skedel wurdt bleatlein, skjinmakke en 3-5 bonkeskroeven wurde ynfoege. Om t-hCO te rjochtsjen, hawwe wy stereotaksyske koördinaten generearre út MRI-ôfbyldings. In sirkelfoarmige kraniotomy (sawat 1 sm yn diameter) waard útfierd mei in hege snelheidsboar direkt boppe de transplantearre hCO. Sadree't it bonke sa tin mooglik is, mar foardat jo troch it heule bonke boarje, brûk in tang om de oerbleaune yntakte bekkenskiif te ferwiderjen om de ûnderlizzende t-hCO te sjen litten. De kraniotomy waard fol mei sterile sâltwetteroplossing, en in dekglaasje en in spesjale koppin waarden oan 'e skedel befestige mei UV-útharde dentale semint (Relyx).
Twa-fotonôfbylding waard útfierd mei in Bruker multifotonmikroskoop mei in Nikon LWD (×16, 0.8 NA) objektyf. GCaMP6-ôfbylding waard útfierd by 920 nm mei 1.4x inkele z-flak fergrutting en 8x gemiddelde fan 7.5 fps. Rotten waarden ynducearre mei 5% isofluraan-anestesy en ûnderhâlden mei 1-3% isofluraan. De rotten waarden yn in oanpaste kopbefestiging pleatst en ûnder de lens posysjonearre. In 3-minuten eftergrûnopname fan motoryske aktiviteit waard krigen. Yn 'e rin fan 20 minuten opname waarden 50 pufkes (elke presintaasje 100 ms lang) willekeurich levere oan it whiskerpad tsjinoer t-hCO mei in picospricer. Brûk it Arduino MATLAB Support Package om bursttiid te kontrolearjen mei oanpaste MATLAB-koade. Syngronisearje eveneminten mei gegevensakwisysjesoftware (PrairieView 5.5) mei TTL-pulsen. Foar analyze waarden de ôfbyldings korrizjearre foar xy-beweging mei affine-korreksje yn it MoCo-programma lansearre yn Fidzjy. Ekstraksje fan fluoreszinte spoaren út yndividuele sellen mei CNMF-E43. Fluoreszinsje waard ekstrahearre foar elke regio fan belang, omset nei dF/F-krommen, en doe omset nei z-skoares.
Rotten (mear as 140 dagen nei transplantaasje) waarden ynducearre mei 5% isofluraan-anestesy en intraoperatyf anestesearre mei 1-3% isofluraan. Dieren waarden yn in stereotaksysk frame (Kopf) pleatst en buprenorfine SR en dexamethason waarden subkutaan ynjektearre. De whiskers oan 'e tsjinoerstelde kant fan' e t-hCO waarden ôfsnien ta sawat 2 sm en troch in gaas riden dat ferbûn wie mei in piëzoelektryske aktuator. De skedel wurdt bleatlein en skjinmakke. In roestfrij stielen grûnskroef wurdt oan 'e skedel befestige. Om t-hCO te rjochtsjen, generearren wy stereotaksyske koördinaten út MRI-ôfbyldings. Fier in sirkelfoarmige kraniotomy út (sawat 1 sm yn diameter) mei in hege snelheidsboar krekt boppe de t-hCO. Sadree't it bonke sa tin mooglik is, mar foardat jo troch it heule bonke boarje, brûk in tang om de oerbleaune yntakte bekkenskiif te ferwiderjen om de ûnderlizzende t-hCO te iepenbierjen. Yndividuele sellen waarden opnommen mei 32-kanaals of 64-kanaals hege-tichtens silisium probes (Cambridge Neurotech) ierd mei ierdskroeven en foarfersterke mei RHD-fersterkers (Intan). Brûk de manipulator om de elektroden nei it doelgebiet te sakjen fia de kraniotomy, dy't fol is mei sterile sâltwetter. Gegevensferzameling waard útfierd op in frekwinsje fan 30 kHz mei it Open Ephys gegevensferzamelingssysteem. De opname gie allinich troch doe't wy heech korreleare ritmyske spontane aktiviteit yn mear as 10 kanalen detektearren, wat suggerearret dat de elektroden yn it transplantaat sieten (basearre op twa-foton kalsiumôfbyldingsgegevens). In 10-minuten eftergrûnopname fan motoryske aktiviteit waard krigen. De whiskers oan 'e tsjinoerstelde kant fan t-hCO waarden doe 50 kear (2 mm by 20 Hz, 2 s per presintaasje) op willekeurige tiden ôfbûgd troch in piëzoelektryske oandriuwing oer in opnameperioade fan 20 minuten. Mei it MATLAB Support Package foar Arduino (MATLAB 2019b) kinne jo de ôfbûgingstiid kontrolearje mei oanpaste MATLAB-koade. Brûk TTL-pulsen om eveneminten te syngronisearjen mei software foar gegevensakwisysje.
Foar optyske markearringseksperiminten waard in 200 µm optyske patchkabel (Doric) ferbûn mei in 473 nm laser (Omicron) ferbûn mei in 200 µm optyske glêstried dy't oer de kraniotomy pleatst wie. Direkt dêrfoar, oanpasse it jumperfermogen nei 20 mW. Brûk de manipulator om de elektroden nei it doelgebiet te sakjen fia de kraniotomy, dy't fol is mei sterile sâltwetteroplossing. Oan it begjin fan 'e opname waarden tsien ljochtpulsen fan 473 nm (frekwinsje 2 Hz, pulsduur 10 ms) útstjoerd. Ljochtgefoelige sellen waarden definiearre as sellen dy't in pykrespons binnen 10 ms ljocht lieten sjen yn 70% of mear fan 'e proeven.