Salamat sa pagbisita sa Nature.com. Gumagamit ka ng bersyon ng browser na may limitadong suporta sa CSS. Para sa pinakamagandang karanasan, inirerekomenda namin na gumamit ka ng na-update na browser (o huwag paganahin ang Compatibility Mode sa Internet Explorer). Bilang karagdagan, upang matiyak ang patuloy na suporta, ipinapakita namin ang site na walang mga istilo at JavaScript.
Nagpapakita ng carousel ng tatlong slide nang sabay-sabay. Gamitin ang Nakaraang at Susunod na mga pindutan upang lumipat sa tatlong mga slide sa isang pagkakataon, o gamitin ang mga pindutan ng slider sa dulo upang lumipat sa tatlong mga slide sa isang pagkakataon.
Ang self-assembling neural organelles ay kumakatawan sa isang promising in vitro platform para sa pagmomodelo ng pag-unlad at sakit ng tao. Gayunpaman, ang mga organoid ay kulang sa koneksyon na umiiral sa vivo, na naglilimita sa pagkahinog at pinipigilan ang pagsasama sa iba pang mga circuit na kumokontrol sa pag-uugali. Dito ipinapakita namin na ang mga cortical organoids na nagmula sa stem cell ng tao na inilipat sa somatosensory cortex ng mga neonatal nude na daga ay bumuo ng mga mature na uri ng cell na sumasama sa mga sensory at motivation-related circuits. Ang MRI ay nagsiwalat ng post-transplant organoid growth sa ilang mga stem cell line at hayop, habang ang single-core analysis ay nagsiwalat ng pag-unlad ng corticogenesis at ang paglitaw ng isang aktibidad na umaasa sa transcription program. Sa katunayan, ang mga inilipat na cortical neuron ay nagpapakita ng mas kumplikadong mga katangian ng morphological, synaptic, at panloob na lamad kaysa sa kanilang mga in vitro na katapat, na nagpapahintulot sa pagtuklas ng mga depekto sa neuronal sa mga pasyente na may Timothy's syndrome. Ang anatomical at functional tracing ay nagpakita na ang mga transplanted organelles ay tumatanggap ng thalamocortical at corticocortical input, at in vivo recording ng neural activity ay nagmumungkahi na ang mga input na ito ay maaaring makabuo ng mga sensory na tugon sa mga cell ng tao. Sa wakas, ang mga cortical organoid ay nagpapalawak ng mga axon sa buong utak ng daga, at ang kanilang optogenetic activation ay humahantong sa pag-uugali na naghahanap ng gantimpala. Kaya, ang mga inilipat na cortex neuron ng tao ay nag-mature at nakikilahok sa mga circuit ng host na kumokontrol sa pag-uugali. Inaasahan namin na ang diskarteng ito ay mapadali ang pagtuklas ng mga strand-level phenotypes sa mga cell na nagmula sa pasyente na hindi matukoy ng ibang paraan.
Ang pagbuo ng utak ng tao ay isang kahanga-hangang proseso ng pag-aayos sa sarili kung saan ang mga cell ay dumarami, nag-iiba, lumilipat, at kumonekta upang bumuo ng mga functional na neuronal circuit na higit na pinadalisay sa pamamagitan ng pandama na karanasan. Ang isang pangunahing problema sa pag-unawa sa pag-unlad ng utak ng tao, lalo na sa konteksto ng sakit, ay ang kakulangan ng access sa tisyu ng utak. Ang mga organel na nagsasaayos sa sarili, kabilang ang mga organoid ng cortex ng tao (hCO; kilala rin bilang globo ng cortex ng tao), ay maaaring makabuo ng 2,3,4,5,6. Gayunpaman, nililimitahan ng ilang mga limitasyon ang kanilang mas malawak na aplikasyon sa pag-unawa sa pagbuo at paggana ng mga neural circuit. Sa partikular, hindi malinaw kung ang pagkahinog ng hCO ay limitado sa kawalan ng ilang mga microenvironmental at sensory input na naroroon sa vivo. Bilang karagdagan, dahil ang mga hCO ay hindi isinama sa mga circuit na maaaring makabuo ng mga resulta ng pag-uugali, ang kanilang utility sa pagmomodelo ng genetically complex at behavioral neuropsychiatric disorder ay kasalukuyang limitado.
Ang paglipat ng hCO sa isang buo na buhay na utak ay maaaring malampasan ang mga limitasyong ito. Ipinakita ng mga naunang pag-aaral na ang mga neuron ng tao na inilipat sa rodent cortex ay kayang mabuhay, magproyekto, at makipag-usap sa mga rodent cells7,8,9,10,11,12. Gayunpaman, ang mga eksperimentong ito ay karaniwang ginagawa sa mga pang-adultong hayop, na maaaring limitahan ang synaptic at axonal integration. Dito, inilalarawan namin ang isang paradigm ng paglipat kung saan inilipat namin ang 3D hCO na nagmula sa mga hiPS cells sa pangunahing somatosensory cortex (S1) ng mga immunodeficient na daga sa isang maagang yugto ng pag-unlad ng plastik. Ang mga na-transplant na hCO (t-hCO) na mga neuron ay sumasailalim sa malaking pagkahinog, tumatanggap ng thalamocortical at cortical-cortical input na nakakakuha ng mga sensory na tugon, at nagpapalawak ng mga axonal projection sa utak ng daga upang himukin ang pag-uugali na naghahanap ng gantimpala. Ang pinalawig na pagkahinog ng t-hCO ay nagsiwalat ng mga depekto sa neuronal sa mga pasyenteng may Timothy's syndrome (TS), isang malubhang genetic disorder na dulot ng mga mutasyon sa boltahe-sensitive na L-type na CaV1.2 calcium channel (naka-encode ng CACNA1C).
Upang pag-aralan ang mga cortical neuron ng tao sa mga circuits sa vivo, stereotactically naming inilipat ang buo na 3D hCO sa S1 ng maagang postnatal athymic rats (mga araw 3-7 postnatally) (Fig. 1a at pinalawak na data ng Fig. 1a-c). Sa puntong ito, ang thalamocortical at corticocortical axonal projection ay hindi pa nakumpleto ang kanilang S1 innervation (ref. 13). Kaya, ang diskarte na ito ay idinisenyo upang i-maximize ang pagsasama ng t-hCO habang pinapaliit ang epekto sa mga endogenous circuit. Upang mailarawan ang lokasyon ng t-hCO sa mga live na hayop, nagsagawa kami ng T2-weighted MRI brain reconstructions ng mga daga 2-3 buwan pagkatapos ng paglipat (Larawan 1b at pinalawak na data, Fig. 1d). Ang t-hCO ay kaagad na naobserbahan at ang mga sukat ng dami ng t-hCO ay katulad sa mga kinakalkula mula sa mga nakapirming hiwa (Extended Data Fig. 1d, e; P > 0.05). Ang t-hCO ay kaagad na naobserbahan at ang mga sukat ng dami ng t-hCO ay katulad sa mga kinakalkula mula sa mga nakapirming hiwa (Extended Data Fig. 1d, e; P > 0.05). t-hCO легко наблюдались, а объемные измерения t-hCO были аналогичны рассчитанным для фиксированных срезов (рассид срезов) 1d, e; P> 0,05). Ang t-hCO ay madaling naobserbahan, at ang mga sukat ng volumetric na t-hCO ay katulad sa mga kinakalkula para sa mga nakapirming seksyon (pinalawak na data, Fig. 1d, e; P > 0.05).很容易观察到t-hCO，并且t-hCO的体积测量值与从固定切片计算的测量值相似（扩展数据图1d,e；P > 0.05）。很容易观察到t-hCO，并且t-hCO t-hCO легко наблюдался, а объемные измерения t-hCO были аналогичны рассчитанным для фиксированных срезов (рассид срезов) 1d, e; P> 0,05). Ang t-hCO ay madaling naobserbahan, at ang mga sukat ng volumetric na t-hCO ay katulad sa mga kinakalkula para sa mga nakapirming seksyon (pinalawak na data, Fig. 1d, e; P > 0.05).Natukoy namin ang t-hCO sa 81% ng mga inilipat na hayop humigit-kumulang 2 buwan pagkatapos ng paglipat (n = 72 mga hayop; hCO mula sa 10 hiPS cell line; hiPS cell lines sa Karagdagang Talahanayan 1). Sa mga ito, 87% ay matatagpuan sa cerebral cortex (Larawan 1c). Sa pamamagitan ng pagsasagawa ng mga serial MRI scan sa maraming time point sa parehong transplanted na daga, nakakita kami ng siyam na beses na pagtaas sa dami ng t-hCO sa loob ng 3 buwan (Fig. 1d at pinalawak na data, Fig. 1f). Ang mga inilipat na hayop ay may mataas na rate ng kaligtasan ng buhay (74%) sa 12 buwan na post-transplantation (pinalawak na data, Fig. 1g at Karagdagang Talahanayan 2), at walang nakitang labis na kapansanan sa motor o memorya, gliosis, o electroencephalogram (EEG). Data Fig. 1g at pandagdag na talahanayan 2). 1h–m at 3e).
a, Schematic ng eksperimental na disenyo. Ang hCO na nagmula sa mga cell ng hiPS ay inilipat sa S1 ng mga bagong panganak na hubad na daga sa mga araw na 30-60 ng pagkita ng kaibhan. b, T2-weighted coronal at pahalang na mga imahe ng MRI na nagpapakita ng t-hCO sa S1 2 buwan pagkatapos ng paglipat. Scale bar, 2 mm. c, Ang dami ng mga rate ng tagumpay ng engraftment na ipinapakita para sa bawat hiPS cell line (n = 108, ang mga numero sa loob ng mga bar ay nagpapahiwatig ng dami ng t-hCO bawat linya ng hIPS cell) at cortical o subcortical na lokasyon (n = 88). d, MRI na imahe ng coronary artery (kaliwa; scale bar, 3 mm) at kaukulang 3D volumetric reconstruction (scale bar, 3 mm) na nagpapakita ng pagtaas sa t-hCO sa loob ng 3 buwan. e, Pagsusuri ng mga pattern ng t-hCO sa rat cerebral cortex. Scale bar, 1 mm. f, Mga kinatawan ng immunocytochemical na larawan ng t-hCO na ipinapakita mula kaliwa sa itaas hanggang kanan (sa panahon ng pagkita ng kaibhan): PPP1R17 (4 na buwang gulang), NeuN (8 buwang gulang), SOX9 at GFAP (8 buwang gulang), PDGFRα; (8 buwan), MAP2 (8 buwan) at IBA1 (8 buwan). Scale bar, 20 µm. Ang co-expression ng HNA ay nagpapahiwatig ng mga cell na pinagmulan ng tao. g, snRNA-seq: Unified manifold and projection (UMAP) dimensionality reduction imaging ng lahat ng mataas na kalidad na t-hCO nuclei pagkatapos ng integration ng Seurat (n=3 t-hCO sample, n=2 hiPS cell lines). Astrocytes, mga selula ng linya ng astrocyte; cyc prog, circulating progenitors; GluN DL, malalim na glutamatergic neuron; GluN DL/SP, malalim at sublamellar na glutamatergic neuron; GluN UL, upper layer glutamatergic neurons; oligodendrocytes, oligodendrocytes; OPC, oligodendrocyte progenitor cells; RELN, reelin neurons. h, Gene Ontology (GO) term enrichment analysis ng mga gene na makabuluhang na-upregulated (naayos P <0.05, fold change> 2, na ipinahayag sa hindi bababa sa 10% ng nuclei) sa t-hCO glutamatergic neuron kumpara sa hCO glutamatergic neuron. h, Gene Ontology (GO) term enrichment analysis ng mga gene na makabuluhang na-upregulated (naayos P <0.05, fold change> 2, na ipinahayag sa hindi bababa sa 10% ng nuclei) sa t-hCO glutamatergic neuron kumpara sa hCO glutamatergic neuron. h, Анализ обогащения терминов Gene Ontology (GO) для генов со значительной активацией (скорректированный P <0,05, кразноснеть ия экспрессия по крайней мере в 10% ядер) в глутаматергических нейронах t-hCO по сравнению с глутаматергическим им. h, Gene Ontology (GO) term enrichment analysis para sa mga gene na may makabuluhang activation (adjusted P<0.05, fold change>2, expression sa hindi bababa sa 10% nuclei) sa t-hCO glutamatergic neurons kumpara sa hCO glutamatergic neurons. h，与hCO 谷氨酸能神经元相比，t-hCO 谷氨酸能神经元中基因显着上调（调整后P ， 0 2，在至少10% 的细胞核中表达）的基因本体论(GO) 术语富集分析。 h ， 与 hco 谷氨酸 能 元 相比 ， t-hco 谷氨酸 能 神经 元 基因 显着 上调 （后 后 后 .变化> 2 ， 至少 10% 的 核中 表达） 基因 基因 基因 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的, GO术语富集分析。 h, гены значительно активизировались (скорректированный P <0,05, кратность изменения> 2, экспрессируется по крайне ве мрев) глутаматергических нейронах t-hCO по сравнению с глутаматергическими нейронами hCO Онтологический (GO) анализ тебяониа. h, ang mga gene ay makabuluhang na-upregulated (nababagay P <0.05, fold change> 2, na ipinahayag sa hindi bababa sa 10% ng nuclei) sa t-hCO glutamatergic neuron kumpara sa hCO glutamatergic neurons Ontological (GO) na pagsusuri ng termino ng pagpapayaman.Ang tuldok na linya ay nagpapahiwatig ng aq na halaga na 0.05. i, UMAP imaging ng mga uri ng GluN cell sa t-hCO gamit ang paglilipat ng label mula sa isang reference na 22 snRNA-seq adult motor cortex dataset. CT — corticothalamic cells, ET — extracerebral cells, IT — internal telencephalic cells, NP — malapit sa projection.
Sinuri namin pagkatapos ang cytoarchitecture at pangkalahatang komposisyon ng cellular ng t-hCO. Ang paglamlam ng antibody ng mga rat endothelial cells ay nagsiwalat ng vascularization na may t-hCO, habang ang paglamlam ng IBA1 ay nagsiwalat ng pagkakaroon ng rat microglia sa buong graft (Fig. 1f at pinalawak na data, Fig. 3c, d). Ang immunostaining ay nagsiwalat ng mga positibong selula ng nuclear antigen (HNA) ng tao na co-expressing PPP1R17 (cortical progenitors), NeuN (neurons), SOX9 at GFAP (glial-derived cells) o PDGFRα (oligodendrocyte progenitors) (Larawan 1f). Upang pag-aralan ang cellular na komposisyon ng t-hCO sa solong resolusyon ng cell, nagsagawa kami ng single-core RNA sequencing (snRNA-seq) pagkatapos ng humigit-kumulang 8 buwan ng pagkita ng kaibhan. Ang maramihang pagsasala at pag-alis ng nuclei ng daga ay nagbunga ng 21,500 mataas na kalidad na mga mapa ng mononuclear ng tao (Larawan 1g at pinalawak na data, Larawan 4a,b). Ang mga pattern ng expression ng mga tipikal na cell-type marker ay nakilala ang mga kumpol ng mga pangunahing klase ng cortical cell, kabilang ang malalim at mababaw na glutamatergic neuron, circulating progenitors, oligodendrocytes, at astrocyte lineage (Fig. 1g, pinalawak na data, Fig. 4c, at Supplement Table 3). Ang immunostaining para sa SATB2 at CTIP2 ay nagpakita na sa kabila ng pagkakaroon ng mga cortical subtypes, ang t-hCO ay hindi nagpakita ng malinaw na anatomical stratification (pinalawak na data, Fig. 3a). ang stage-matched na snRNA-seq hCO ay gumawa ng malawak na katulad na mga klase ng cell, na may ilang mga pagbubukod, kabilang ang kawalan ng oligodendrocytes at ang pagkakaroon ng GABAergic neurons, na maaaring sumasalamin sa naunang naiulat na paborableng in vitro na mga kondisyon para sa mga lateral progenitor cells15 (pinalawak na data, Fig. 4f - i at Karagdagang Talahanayan 4). Ang pagkakaiba-iba ng pagsusuri sa expression ng gene ay nagsiwalat ng mga makabuluhang pagkakaiba sa mga glutamatergic neuron sa pagitan ng t-hCO at hCO (Karagdagang Talahanayan 5), kabilang ang pag-activate ng mga hanay ng mga gene na nauugnay sa neuronal maturation tulad ng synaptic signaling, dendritic localization, at aktibidad ng channel na may boltahe (Larawan 1h at Karagdagang Talahanayan 5). talahanayan 6). Alinsunod dito, ang mga cortical glutamatergic t-hCO neuron ay nagpakita ng pinabilis na pagkahinog ng transkripsyon.
Upang maipaliwanag kung ang mga pagbabagong ito sa transkripsyon sa t-hCO ay nauugnay sa mga pagkakaiba-iba ng morphological sa pagitan ng hCO sa vitro at t-hCO sa vivo, muling itinayo namin ang yugto na tumutugma sa biocytin na puno ng hCO at hCO sa mga talamak na seksyon pagkatapos ng 7-8 na buwan ng pagkita ng kaibahan. hCO neurons (Larawan 2a). Ang mga t-hCO neuron ay makabuluhang mas malaki, mayroong 1.5 beses ang diameter ng soma, dalawang beses na mas maraming dendrite, at isang pangkalahatang anim na beses na pagtaas sa kabuuang haba ng dendritic kumpara sa in vitro hCO (Fig. 2b). Bilang karagdagan, napansin namin ang isang makabuluhang mas mataas na density ng dendritic spines sa t-hCO neuron kaysa sa hCO neurons (Fig. 2c). Iminumungkahi nito na ang mga t-hCO neuron ay sumasailalim sa malawak na dendritic elongation at branching, na, kasama ng patuloy na paglaganap ng cell, ay maaaring mag-ambag sa masinsinang paglaki ng t-hCO pagkatapos ng transplantation (Fig. 1d at Extended Data Fig. 1f). Nag-udyok ito sa amin na siyasatin ang mga katangian ng electrophysiological. Ang kapasidad ng lamad ay walong beses na mas mataas (pinalawak na data, Fig. 8d), ang potensyal ng lamad ng resting-state ay mas hyperpolarized (humigit-kumulang 20 mV), at ang kasalukuyang iniksyon ay nag-udyok ng mas mataas na maximum na rate ng paggulo sa mga t-hCO neuron kaysa sa mga hCO neuron. in vitro (Larawan 2d), e), na naaayon sa mas malaki at mas kumplikadong mga tampok na morphological ng t-hCO. Bilang karagdagan, ang dalas ng spontaneous excitatory postsynaptic current events (EPSC) ay makabuluhang mas mataas sa t-hCO neurons (Fig. 2f), na nagmumungkahi na ang tumaas na density ng dendritic spines na sinusunod sa t-hCO neurons ay nauugnay sa functional excitability. sekswal na synapse. Kinumpirma namin ang immature character ng hCO neurons in vitro sa pamamagitan ng pag-record ng may label na glutamatergic neurons (pinalawak na data, Fig. 6a-c).
a, 3D reconstruction ng biocytin-filled hCO at t-hCO neurons pagkatapos ng 8 buwan ng pagkita ng kaibhan. b, Pagbibilang ng mga tampok na morphological (n = 8 hCO neuron, n = 6 t-hCO neuron; **P = 0.0084, *P = 0.0179 at ***P <0.0001). b, Pagbibilang ng mga tampok na morphological (n = 8 hCO neuron, n = 6 t-hCO neuron; **P = 0.0084, *P = 0.0179 at ***P <0.0001). б, количественная оценка морфологических признаков (n = 8 нейронов hCO, n = 6 нейронов t-hCO; ** P = 0,0084, * P = 0,001). b, dami ng mga tampok na morphological (n=8 hCO neuron, n=6 t-hCO neuron; **P=0.0084, *P=0.0179, at ***P<0.0001). b，形态学特征的量化（n = 8 个hCO 神经元，n = 6 个t-hCO 神经元；**P = 0.0084，*P = 0.0179 。 b，形态学特征的量化（n = 8 个hCO 神经元，n = 6 个t-hCO 神经元；**P = 0.0084，*P = 0.0179 。 б, количественная оценка морфологических признаков (n = 8 нейронов hCO, n = 6 нейронов t-hCO; ** P = 0,0084, * P = 0,001). b, dami ng mga tampok na morphological (n=8 hCO neuron, n=6 t-hCO neuron; **P=0.0084, *P=0.0179, at ***P<0.0001).c, 3D na muling pagtatayo ng hCO at t-hCO dendritic na mga sanga pagkatapos ng 8 buwan ng pagkita ng kaibahan. Ang mga pulang asterisk ay nagpapahiwatig ng mga putative dendritic spines. Dendritic spine density quantification (n = 8 hCO neuron, n = 6 t-hCO neuron; **P = 0.0092). d, Pagsusuri ng potensyal ng resting lamad (n = 25 hCO neuron, n = 16 t-hCO neuron; ***P <0.0001). d, Pagsusuri ng potensyal ng resting lamad (n = 25 hCO neuron, n = 16 t-hCO neuron; ***P <0.0001). d, количественная оценка мембранного потенциала покоя (n = 25 нейронов hCO, n = 16 нейронов t-hCO; *** P <0,0001). d, resting membrane potential quantification (n = 25 hCO neuron, n = 16 t-hCO neuron; ***P <0.0001). d，静息膜电位的量化（n = 25 hCO 神经元，n = 16 t-hCO 神经元；***P < 0.0001）。 d，静息膜电位的量化（n = 25 hCO 神经元，n = 16 t-hCO 神经元；***P < 0.0001）。 d, количественная оценка мембранного потенциала покоя (n = 25 нейронов hCO, n = 16 нейронов t-hCO; *** P <0,0001). d, resting membrane potential quantification (n = 25 hCO neuron, n = 16 t-hCO neuron; ***P <0.0001). e, Ang paulit-ulit na pagkilos na potensyal na pagpapaputok sa hCO at t-hCO na sapilitan sa pamamagitan ng pagtaas ng kasalukuyang mga iniksyon, at dami ng pinakamataas na rate ng pagpapaputok (n = 25 hCO neuron, n = 16 t-hCO neuron; *** P <0.0001). e, Ang paulit-ulit na pagkilos na potensyal na pagpapaputok sa hCO at t-hCO na sapilitan sa pamamagitan ng pagtaas ng kasalukuyang mga iniksyon, at dami ng pinakamataas na rate ng pagpapaputok (n = 25 hCO neuron, n = 16 t-hCO neuron; *** P <0.0001). e. возбуждения (n = 25 нейронов hCO, n = 16 нейронов t-hCO; *** P <0,0001). e, ang potensyal na pagkilos na muling pagpapaputok sa hCO at t-hCO na dulot ng kasalukuyang pagtaas at dami ng pinakamataas na rate ng pagpapaputok (n = 25 hCO neuron, n = 16 t-hCO neuron; *** P <0.0001). e，通过增加电流注入诱导的hCO 和t-hCO 重复动作电位放电，以及最大放电率的量化 的（n化神经元，n = 16 个t-hCO 神经元；***P < 0.0001）。 E ， 通过 增加 电流 注入 的 的 hco 和 t-hco 重复 电位 放电 ， 以及 最 大 的 量化 （2（n ， n = 16 个 t-hco 神经 ； *** p <0.0001） 。 e. скорости возбуждения (n = 25 нейронов hCO, n = 16 нейронов t-hCO; *** P <0,0001). e, paulit-ulit na pagpapaputok ng hCO at t-hCO na mga potensyal na aksyon na dulot ng pagtaas ng kasalukuyang supply at dami ng maximum na rate ng pagpapaputok (n = 25 hCO neuron, n = 16 t-hCO neuron; *** P <0.0001). f, Spontaneous EPSCs (sEPSCs) sa hCO at t-hCO neuron sa 8 buwan ng pagkita ng kaibhan, at dami ng dalas ng synaptic na mga kaganapan (n = 25 hCO neuron, n = 17 t-hCO neuron; *** P <0.0001). f, Spontaneous EPSCs (sEPSCs) sa hCO at t-hCO neuron sa 8 buwan ng pagkita ng kaibhan, at dami ng dalas ng synaptic na mga kaganapan (n = 25 hCO neuron, n = 17 t-hCO neuron; ***P <0.0001). f, спонтанные EPSC (sEPSC) sa нейронах hCO at t-hCO через 8 месяцев дифференцировки и количественная оценка частотыч синаптич нейронов hCO, n = 17 нейронов t-hCO; f, Spontaneous EPSCs (sEPSCs) sa hCO at t-hCO neuron sa 8 buwan ng pagkita ng kaibahan at dami ng synaptic na mga rate ng kaganapan (n=25 hCO neuron, n=17 t-hCO neuron; *** P<0.0001). f，分化8 个月时hCO 和t-hCO 神经元中的自发性EPSCs (sEPSCs)，以及突触事件频率的量化（n 的量化（n 17 t-hCO 神经元；***P < 0.0001） . f，分化8 个月时hCO 和t-hCO 神经元中的自发性EPSCs (sEPSCs)，以及突触事件频率的量匼（n CO2神率的量匼（n = 25 hCO 神率的量匼（n = 25hCO P < 0.0001） . f, спонтанные EPSC (sEPSC) sa нейронах hCO at t-hCO через 8 месяцев дифференцировки и количественная оценка частотыч синаптич нейронов hCO, n = 17 нейронов t-hCO; f, Spontaneous EPSCs (sEPSCs) sa hCO at t-hCO neuron sa 8 buwan ng pagkita ng kaibahan at dami ng synaptic na mga rate ng kaganapan (n = 25 hCO neuron, n = 17 t-hCO neuron; *** P<0.0001).Para sa bf, hCO at t-hCO sa linya 1208-2 ay kinuha mula sa parehong batch ng pagkita ng kaibhan na pinananatili nang magkatulad. g, Gene set enrichment analysis (one-sided Fisher's exact test) ng mga genes na makabuluhang na-upregulated (adjusted P <0.05, fold change> 2, na ipinahayag sa hindi bababa sa 10% ng nuclei) sa t-hCO glutamatergic neurons kumpara sa hCO glutamatergic neurons na may gene sets ng parehong early-response-response (ERG) at mga gene na natukoy na late-response (ERG) na gene (ERG) na natukoy na gene (ERG) mouse study16 at human-specific LRGs mula sa in vitro neurons17. g, Gene set enrichment analysis (one-sided Fisher's exact test) ng mga genes na makabuluhang na-upregulated (adjusted P <0.05, fold change> 2, na ipinahayag sa hindi bababa sa 10% ng nuclei) sa t-hCO glutamatergic neurons kumpara sa hCO glutamatergic neurons na may gene sets ng parehong early-response-response (ERG) at mga gene na natukoy na late-response (ERG) na gene (ERG) na natukoy na gene (ERG) mouse study16 at human-specific LRGs mula sa in vitro neurons17. g. изменения > 2, экспрессия по меньшей мере в 10% ядер) в глутаматергических нейронах t-hCO по сравнению по сравнению стергимита стергимита hCO наборы генов как раннего (ERG), так и позднего (LRG) генов, зависящих от активности, идентифицированных в иванных в иснисла в иснисла и специфических для человека LRG из нейронов in vitro17. g, pagsusuri ng gene set enrichment (one-tailed Fisher's exact test) ng mga genes na may makabuluhang activation (adjusted P<0.05, fold change>2, expression sa hindi bababa sa 10% ng nuclei) sa t-hCO glutamatergic neurons kumpara sa hCO glutamatergic neurons sets ng parehong maagang (ERG) at late (LRG) na aktibidad na nakadepende sa genesce16 independent (LRG) at late (LRG). Mga LRG mula sa mga neuron sa vitro17. g，t-hCO谷氨酸能神经元与hCO谷氨酸能神经元相比，t -hCO谷氨酸能神经元显着上调（调整后P<0.05，倍数变化>2，在至少10%的细胞核中表达）的基因集富集分析（单侧F isher精确检验）从体内小鼠研究中鉴定的早期反应(ERG)和晚期反应(LRG) 活性依赖性基因的基因组16 和体外神经元17 中的人类特异性LRG。 g ， t-hco 谷氨酸 神经 元 与 hco 谷氨酸 神经 元 相比 ， t-hco 谷氨酸 神经 元 上调 5 p. ， 倍数> 2 ， 至少 至少 10%的 细胞 核中 表达） 的 集富集 分析 （单侧 fisher 精确）研究 中 的 早期 反应 反应 反应 和 晚期 反应 反应 (lrg) 活性 基因 的 基应 和 晚期 反应 反应 (lrg) 活性 基因 的基因 的 基因 璌 16神经元 17 中 中 17 中 17的人类特异性LRG。 g, глутаматергические нейроны t-hCO были значительно активизированы по сравнению с глутаматергическими нейсиронами hCO P<0,05, кратность изменения> 2, не менее 10% Анализ обогащения набора генов (односторонний точный тест Фишетра) ранота позднего гены, зависящие от активности ответа (LRG), идентифицированные в исследованиях на мышах in vivo16 и нейиефсч для человека. g, ang mga t-hCO glutamatergic neuron ay makabuluhang na-upregulated kumpara sa hCO glutamatergic neurons (na-adjust P<0.05, fold change>2, hindi bababa sa 10% Early response (ERG) at late response gene enrichment analysis (one-tailed Fisher's exact test) response activity dependent genes (LRGs) na natukoy sa vivo vitro7 mice16 neuron.Ang may tuldok na linya ay nagpapahiwatig ng Bonferroni-corrected P value na 0.05. h, GluN gene expression (pseudo-package at scaling ng bawat gene) ay makabuluhang na-upregulated sa snRNA-seq replicas ng LRG genes sa t-hCO glutamatergic neurons. i, immunostaining na nagpapakita ng expression ng SCG2 sa t-hCO (itaas) at hCO (mas mababang) neuron. Ang mga puting arrow ay tumuturo sa mga SCG2+ na cell. Scale bar, 25 µm. Ang data ay ipinahayag bilang mean ± standard deviation.
Batay sa tumaas na aktibidad ng t-hCO na sinusunod sa mga ex vivo slice, ang snRNA-seq ay nagsiwalat ng isang aktibidad na umaasa sa pag-iipon ng mga transcript ng gene sa t-hCO kumpara sa hCO sa vitro. Ang mga glutamatergic t-hCO neuron ay nagpahayag ng mas mataas na antas ng mga gene na kumokontrol sa aktibidad ng late response (Fig. 2g, h), na natagpuan sa mga nakaraang pag-aaral sa mouse at human neurons16,17. Halimbawa, ang BDNF18, SCG2, at OSTN, isang primate-specific na activity-regulating gene, ay nagpakita ng pagtaas ng expression sa t-hCO neurons kumpara sa hCO neurons (Fig. 2g-i). Kaya, ang mga t-hCO neuron ay nagpakita ng pinahusay na mga katangian ng pagkahinog kumpara sa mga hCO neuron sa pamamagitan ng transcriptional, morphological, at functional analysis.
Upang higit pang suriin ang kaugnayan ng t-hCO maturation sa pag-unlad ng utak ng tao, nagsagawa kami ng mga transcriptomic na paghahambing ng mga pangsanggol at pang-adultong cortical cell type19,20 at adult21,22 pati na rin ang malawak na data sa cortical gene expression23 sa panahon ng pag-unlad (pinalawak na data, Fig. 5). ). sa nakaraang gawain 24 , ang pandaigdigang hCO at t-hCO transcriptome maturation status sa 7-8 na buwan ng pagkita ng kaibahan ay malawak na naaayon sa oras ng pag-unlad ng vivo at pinakakatumbas sa huling buhay ng pangsanggol (Extended Data Fig. 5a). Kapansin-pansin, napansin namin ang tumaas na transcriptome maturity sa t-hCO kumpara sa hCO na katugma sa edad, pati na rin ang transcriptome activation na nauugnay sa synaptogenesis, astroogenesis, at myelination (pinalawak na data, Fig. 5b-d). Sa antas ng cellular, nakakita kami ng katibayan ng isang mas manipis na cortex subtype sa t-hCO, na may mga kumpol ng mga glutamatergic neuron na magkakapatong sa mga pang-adultong L2 / 3, L5, at L6 na mga subtype ng neuron (Larawan 1i). Sa kaibahan, ang cluster overlap sa pagitan ng glutamatergic t-hCO neuron at fetal cortical neuron ay mas limitado sa kalagitnaan ng pagbubuntis (pinalawak na data, Figure 5e-j). Upang matukoy kung ang mga t-hCO neuron ay gumaganang katulad sa mga postnatal neocortical neuron ng tao, nagsagawa kami ng mga electrophysiological recording at anatomical reconstructions ng mga L2/3 pyramidal neuron ng tao sa mga matutulis na seksyon ng human postnatal cortex (pinalawak na data, Fig. 7a). Ang mga electrophysiological na katangian ng L2/3 pyramidal neuron ay katulad ng sa t-hCO pyramidal neurons (pinalawak na data, Fig. 7e). Morphologically, L2/3 neurons mula sa postnatal human sample ay mas katulad sa t-hCO kaysa sa hCO, bagaman L2/3 cells ay mas mahaba, naglalaman ng mas maraming sangay sa pangkalahatan, at may mas mataas na spine density (Fig. 3g at pinalawak na data, Fig. 7b-). G).
a, paglipat ng hCO na ginawa ng kontrol at TS hiPS na mga linya ng cell sa mga neonatal na daga. b, 3D na muling pagtatayo ng mga t-hCO neuron na puno ng biocytin pagkatapos ng 8 buwan ng pagkita ng kaibhan. c, dami ng ibig sabihin ng haba ng dendritik (n = 19 control neuron, n = 21 TS neuron; **P = 0.0041). d, 3D-reconstructed dendritic branches mula sa control at TS t-hCO sa 8 buwan ng pagkita ng kaibhan, at quantification ng dendritic spine density (n = 16 control neurons, n = 21 TS neurons, ***P <0.0001). d, 3D-reconstructed dendritic branches mula sa control at TS t-hCO sa 8 buwan ng pagkita ng kaibhan, at quantification ng dendritic spine density (n = 16 control neurons, n = 21 TS neurons, ***P <0.0001). d, 3D-реконструкция дендритных ветвей из контроля и TS t-hCO через 8 месяцев дифференцировки и количественнка стоцлоция дендритных шипов (n = 16 контрольных нейронов, n = 21 TS нейронов, *** P <0,0001). d, 3D reconstruction ng dendritic branches mula sa control at t-hCO TS sa 8 buwan ng pagkita ng kaibhan at dendritic spine density quantification (n=16 control neurons, n=21 TS neurons, ***P<0.0001). d，分化8 个月时对照和TS t-hCO 的3D 重建树突分支，以及树突棘密度的量化（n = 16 个化（n = 16 个化21 个TS 神经元，***P < 0.0001）。 d ， 分化 8 个 时 对照 和 ts t-hco 的 3d 重建 分支 分支 以及 树突棘 密度 量化 ／化 （n元 ， n = 21 个 ts 神经 ， *** p <0.0001 ）。 d, 3D-реконструкция дендритных ветвей контроля at TS t-hCO через 8 месяцев дендритных ветвей контроля at TS t-hCO 3 шипов (n = 16 контрольных нейронов, n = 21 TS нейронов, *** P <0,0001). d, 3D reconstruction ng control dendritic branch at TS t-hCO sa 8 buwan ng pagkita ng kaibhan at dendritic spine density quantification (n=16 control neurons, n=21 TS neurons, ***P<0.0001).Ang mga pulang asterisk ay nagpapahiwatig ng mga putative dendritic spines. e, kusang mga EPSC sa kontrol at TS t-hCO neuron pagkatapos ng 8 buwan ng pagkita ng kaibhan. f, pinagsama-samang frequency plot at quantification ng frequency at amplitude ng synaptic na mga kaganapan (n=32 control neuron, n=26 TS neuron; **P=0.0076 at P=0.8102). g, pagsusuri ng Scholl ng TS at mga control neuron sa hCO at t-hCO. Ang mga gitling na linya ay nagpapakita ng mga L2/3 postnatal pyramidal neuron ng tao para sa paghahambing (n = 24 control t-hCO neurons, n = 21 TS t-hCO neurons, n = 8 control hCO neurons, at n = 7 TS hCO neurons). Ang data ay ipinahayag bilang mean ± standard deviation
Ang kakayahan ng t-hCO upang kopyahin ang mga morphological at functional na mga tampok ng mga neuron ng cortex ng tao sa isang mataas na antas ay nag-udyok sa amin upang galugarin kung ang t-hCO ay maaaring magamit upang makita ang mga phenotypes ng sakit. Nakatuon kami sa TS, isang malubhang neurodevelopmental disorder na dulot ng gain-of-function na mutations sa gene encoding CaV1.2, na nagpapasimula ng transcription ng gene na umaasa sa aktibidad sa mga neuron. Nakuha namin ang hCO mula sa tatlong mga pasyente ng TS na nagdadala ng pinakakaraniwang pagpapalit (p.G406R) at tatlong mga kontrol (Larawan 3a). Pagkatapos ng paglipat, nalaman namin na ang dendritic morphology ay binago sa mga TS neuron kumpara sa mga kontrol (Fig. 3b at pinalawak na data, Fig. 8a, b), na may dalawang beses na pagtaas sa bilang ng mga pangunahing dendrite at isang pangkalahatang pagtaas sa mean at pangkalahatang pagbaba sa haba ng dendritic (Fig. 3c at pinalawak na data, Fig. 8c). Ito ay nauugnay sa isang pagtaas ng density ng mga spine at isang pagtaas ng dalas ng mga kusang EPSC sa TS kumpara sa mga control neuron (Larawan 3d-f at pinalawak na data, Fig. 8g). Ang karagdagang pagsusuri ay nagsiwalat ng mga pattern ng abnormal na dendritic branching sa t-hCO TS kumpara sa mga kontrol, ngunit hindi sa in vitro TS hCO sa isang katulad na yugto ng pagkita ng kaibhan (Fig. 3g). Ito ay naaayon sa aming mga nakaraang ulat ng dendritic shrinkage na umaasa sa aktibidad sa TS at itinatampok ang kakayahan ng platform ng transplant na ito na makita ang mga phenotype ng sakit sa vivo.
Pagkatapos ay tinanong namin kung hanggang saan ang mga t-hCO cells ay gumaganang isinama sa daga S1. Ang S1 sa mga rodent ay tumatanggap ng malakas na synaptic input mula sa ipsilateral ventral basal at posterior thalamic nuclei, pati na rin ang ipsilateral motor at secondary somatosensory cortices, at contralateral S1 (Fig. 4a). Upang maibalik ang pattern ng innervation, nahawahan namin ang hCO ng rabies virus-dG-GFP/AAV-G at inilipat ang hCO sa S1 na daga makalipas ang 3 araw. Napansin namin ang siksik na expression ng GFP sa mga neuron ng ipsilateral S1 at ventral basal ganglia 7-14 araw pagkatapos ng paglipat (Larawan 4b, c). Bilang karagdagan, ang paglamlam ng antibody ng thalamic marker netrin G1 ay nagsiwalat ng pagkakaroon ng mga thalamic na pagtatapos sa t-hCO (Larawan 4d, e). Upang masuri kung ang mga afferent projection na ito ay maaaring makakuha ng mga synaptic na tugon sa mga t-hCO cells, nagsagawa kami ng buong pag-record ng cell mula sa mga cell ng tao sa matalim na mga seksyon ng thalamocortical layer. Electrical stimulation ng rat S1, internal capsule, white matter, fibers malapit sa t-hCO o optogenetic activation ng opsin-expressing thalamic endings sa t-hCO induced short-latency EPSCs sa t-hCO neurons na nakalantad sa AMPA receptor antagonist NBQX. (Fig. 4f, g at pinalawig na data, Fig. 9a–g). Ang mga datos na ito ay nagpapakita na ang t-hCO ay anatomically na isinama sa utak ng daga at naisaaktibo ng rat host tissue.
a, Schematic diagram ng isang eksperimento sa pagsubaybay sa rabies. b, GFP at ekspresyong STEM121 na partikular sa tao sa pagitan ng t-hCO at rat cerebral cortex (itaas na panel). Ipinakita rin ang expression ng GFP sa daga na ipsilateral ventral basal nucleus (VB) (ibabang kaliwa) at ipsilateral S1 (ibabang kanan). Scale bar, 50 µm. Ang mga pulang parisukat ay kumakatawan sa mga bahagi ng utak kung saan kinunan ang mga larawan. c, dami ng mga cell na nagpapahayag ng GFP (n = 4 na daga). d, e — Netrin G1+ thalamic terminals sa t-hCO. d ay nagpapakita ng isang coronal na seksyon na naglalaman ng t-hCO at VB nuclei. Scale bar, 2 mm. e nagpapakita ng expression ng Netrin G1 at STEM121 sa t-hCO (kaliwa) at VB (kanan) na mga neuron. Scale bar, 50 µm. Ang orange na tuldok na linya ay nagpapahiwatig ng hangganan ng t-hCO. f, g, Kasalukuyang mga bakas ng t-hCO neuron pagkatapos ng elektrikal na pagpapasigla sa S1 daga (f) o panloob na kapsula (g), na may (purple) o walang (itim) NBQX (kaliwa). EPSC amplitude na may at walang NBQX (n = 6 S1 neuron, *P = 0.0119; at n = 6 panloob na capsule neuron, **P = 0.0022) (gitna). Porsiyento ng mga t-hCO neuron na nagpapakita ng EPSC bilang tugon sa elektrikal na pagpapasigla ng daga S1 (f) o panloob na kapsula (g) (kanan). aCSF, artipisyal na cerebrospinal fluid. h, schematic diagram ng 2P imaging experiment (kaliwa). Pagpapahayag ng mga GCaMP6 sa t-hCO (gitna). Scale bar, 100 µm. Fluorescence time lapse ng GCaMP6s (kanan). i, Z-score ng spontaneous activity fluorescence. j, eskematiko na paglalarawan ng pagpapasigla ng bigote. k, z-scored 2P fluorescence trajectories sa isang pagsubok, na nakahanay sa whisker deviation sa oras na zero (dashed line) sa mga halimbawang cell. l, mga tugon ng z-score na may average na populasyon ng lahat ng mga cell na nakahanay sa paglihis ng whisker sa oras na zero (linya ng putol-putol) (pula) o mga random na nabuong timestamp (grey). m. Schematic diagram ng eksperimento sa optical marking. n, Raw voltage curves mula sa isang halimbawang t-hCO cell sa panahon ng blue laser stimulation o whisker deflection. Ang mga pulang arrow ay nagpapahiwatig ng mga unang spike na dulot ng liwanag (itaas) o sanhi ng paglihis ng whisker (ibaba). Ang kulay abong pagtatabing ay nagpapahiwatig ng mga panahon ng pagpapalihis ng whisker. o, Peak light waveforms at whisker deflection responses. p, mga spike ng isang solong pagtatangka, na nakahanay sa paglihis ng mga whisker sa mga cell ng halimbawa. 0 ay nagpapahiwatig ng whisker deviation (dashed line). q, rate ng pagpapaputok ng z-score na may average na populasyon para sa lahat ng mga photosensitive na cell, na nakahanay sa paglihis ng whisker sa oras na zero (dashed line) (pula) o random na nabuong timestamp (grey). r, Proporsyon ng mga photosensitive unit na makabuluhang na-modulate ng whisker deviation (n = 3 daga) (kaliwa). Peak z-score latency (n = 3 daga; n = 5 (light green), n = 4 (dark green), at n = 4 (cyan) whisker deflection modulation units bawat daga) (kanan). Ang data ay ipinahayag bilang mean ± standard deviation
Pagkatapos ay tinanong namin kung ang t-hCO ay maaaring maisaaktibo ng sensory stimuli sa vivo. Inilipat namin ang hCO na nagpapahayag ng genetically encoded na mga tagapagpahiwatig ng calcium na GCaMP6 sa mga daga ng S1. Pagkatapos ng 150 araw, nagsagawa kami ng fiber photometry o two-photon calcium imaging (Fig. 4h at pinalawak na data, Fig. 10a). Natagpuan namin na ang mga t-hCO cells ay nagpakita ng naka-synchronize na aktibidad ng ritmo (Larawan 4i, Pinalawak na Data, Larawan 10b at Karagdagang Video 1). Upang makilala ang peak na aktibidad ng t-hCO, nagsagawa kami ng extracellular electrophysiological recording sa mga anesthetized transplant na daga (pinalawak na data, Fig. 10c-f). Nakabuo kami ng mga stereotaxic na coordinate mula sa mga imahe ng MRI; kaya, ang mga naitala na yunit na ito ay kumakatawan sa mga putative na neuron ng tao, bagaman ang electrophysiology lamang ay hindi nagpapahintulot ng isang species ng pinagmulan na matukoy. Naobserbahan namin ang naka-synchronize na pagsabog ng aktibidad (pinalawak na data, Fig. 10d). Ang mga pagsabog ay tumagal ng halos 460 ms at pinaghiwalay ng mga panahon ng katahimikan na humigit-kumulang 2 s (pinalawak na data, Fig. 10d, e). Ang mga indibidwal na unit ay nagpaputok ng average na humigit-kumulang tatlong round bawat pagsabog, na humigit-kumulang 73% ng mga nakarehistrong unit sa bawat pagsabog. Ang mga aktibidad ng mga indibidwal na yunit ay lubos na nauugnay, at ang mga ugnayang ito ay mas mataas kaysa sa mga yunit na natukoy sa mga hindi nabakunahan na hayop na naitala sa ilalim ng parehong mga kondisyon (pinalawak na data, Fig. 10f). Upang higit na makilala ang mga spike na tugon ng mga natukoy na neuron na nagmula sa tao, nagsagawa kami ng mga eksperimento sa light-tagging sa mga anesthetized na daga na inilipat gamit ang hCO na nagpapahayag ng light-sensitive cation channel rhodopsin 2 (hChR2), kung saan ang t-hCO neurons short-latency recognition (mas mababa sa 10 ms) bilang tugon sa blue light stimuli4im–Fig. Ang mga t-hCO neuron ay nagpakita ng mga pagsabog ng kusang aktibidad sa mga frequency na katulad ng naobserbahan sa calcium imaging, pati na rin ang mga electrophysiological recording na isinagawa sa t-hCO nang walang light marking (pinalawak na data, Fig. 10c-g). Walang kusang aktibidad ang naobserbahan sa kaukulang mga yugto ng hCO na naitala sa vitro. Upang masuri kung ang t-hCO ay maaaring maisaaktibo ng sensory stimuli, saglit naming pinalihis ang mga whisker ng daga palayo sa t-hCO (Larawan 4j,m at pinalawak na data, Fig. 10h,k). Ayon sa mga nakaraang pag-aaral8,10, ang isang subset ng t-hCO cells ay nagpakita ng pagtaas ng aktibidad bilang tugon sa whisker deflection, na hindi naobserbahan kapag ang data ay inihambing sa mga random na time stamp (Fig. 4k–q at pinalawak na data, Fig. 10h–q). Sa katunayan, humigit-kumulang 54% ng mga single unit na may label na opto ay nagpakita ng makabuluhang pagtaas ng rate ng pagpukaw pagkatapos ng whisker stimulation, na umabot sa humigit-kumulang 650 ms (Fig. 4r). Kung sama-sama, iminumungkahi ng mga datos na ito na ang t-hCO ay tumatanggap ng naaangkop na mga pag-input sa pagganap at maaaring maisaaktibo ng mga pampasigla sa kapaligiran.
Pagkatapos ay sinisiyasat namin kung ang t-hCO ay maaaring mag-activate ng mga circuit sa mga daga upang makontrol ang pag-uugali. Una naming sinisiyasat kung ang mga axon ng t-hCO neuron ay nag-project sa nakapalibot na mga tisyu ng daga. Nahawahan namin ang hCO ng isang lentivirus na naka-encode na hChR2 na pinagsama sa EYFP (hChR2-EYFP). Pagkatapos ng 110 araw, naobserbahan namin ang expression ng EYFP sa mga ipsilateral cortical na rehiyon, kabilang ang auditory, motor, at somatosensory cortices, pati na rin sa mga subcortical na rehiyon, kabilang ang striatum, hippocampus, at thalamus (Fig. 5a). Upang masuri kung ang mga efferent projection na ito ay maaaring makakuha ng mga synaptic na tugon sa mga rat cells, optically naming na-activate ang t-hCO cells na nagpapahayag ng hChR2-EYFP sa pamamagitan ng pag-record ng rat cerebral cortex cells sa matalim na mga seksyon ng utak. Ang pag-activate ng mga t-hCO axon na may asul na ilaw ay nag-udyok ng mga short-latency na EPSC sa mga rat pyramidal cortex neuron, na na-block ng NBQX (Fig. 5b–g). Bilang karagdagan, ang mga tugon na ito ay maaaring ma-block ng tetrodotoxin (TTX) at maibalik ng 4-aminopyridine (4-AP), na nagmumungkahi na ang mga ito ay sanhi ng mga monosynaptic na koneksyon (Fig. 5e).
a, Schematic diagram ng axon tracking (kaliwa). t-hCO EYFP expression (kanan). Scale bar, 100 µm. A1, auditory cortex, ACC, anterior cingulate cortex, d. striatum, dorsal striatum, HPC, hippocampus; Diaphragm, lateral septum, mPFC, medial prefrontal cortex, piri, piriform cortex, v. striatum, ventral striatum, VPM, ventropostomedial nucleus ng thalamus, VTA, ventral tegmental region. Ang mga pulang parisukat ay kumakatawan sa mga bahagi ng utak kung saan kinunan ang mga larawan. b, Schematic diagram ng eksperimento sa pagpapasigla. c, d, Mga halimbawa ng pagtugon ng asul na ilaw-induced photocurrent (itaas) at boltahe (ibaba) sa tao (c) EYFP+ t-hCO o daga (d) EYFP- cells. e, f, Kasalukuyang mga bakas ng mga neuron ng daga pagkatapos ng blue light stimulation ng t-hCO axons na may TTX at 4-AR (berde), TTX (grey) o aCSF (black) (e), na may (violet) o wala (black) ) ) NBQX (e). g, latency ng mga tugon na sapilitan ng asul na ilaw sa mga selula ng daga (n = 16 na selula); Ang mga pahalang na bar ay nagpapahiwatig ng average na latency (7.13 ms) (kaliwa). Amplitude ng mga light-evoked EPSC na naitala na mayroon o walang NBQX (n = 7 cells; ***P <0.0001) (gitna). Amplitude ng mga light-evoked EPSC na naitala na mayroon o walang NBQX (n = 7 cells; ***P <0.0001) (gitna). Амплитуда вызванных светом EPSC, зарегистрированных с или без NBQX (n = 7 клеток; ***P <0,0001) (sa центре). Amplitude ng mga light-induced na EPSC na naitala na mayroon o walang NBQX (n = 7 cells; ***P <0.0001) (gitna).使用或不使用NBQX 记录的光诱发EPSC 的振幅（n = 7 个细胞；***P < 0.0001）（中）。使用或不使用NBQX 记录的光诱发EPSC 的振幅（n = 7 个细胞；***P < 0.0001）（中）。 Амплитуда вызванных светом EPSC, зарегистрированных с или без NBQX (n = 7 клеток; ***P <0,0001) (sa центре). Amplitude ng mga light-induced na EPSC na naitala na mayroon o walang NBQX (n = 7 cells; ***P <0.0001) (gitna).Porsiyento ng mga selula ng daga na nagpapakita ng mga EPSC na tumutugon sa asul na ilaw (kanan). h, Schematic diagram ng isang gawain sa pag-uugali. d0, araw 0. i. Pagganap ng mga huwarang hayop sa araw 1 (kaliwa) o araw 15 (kanan) ng pagsasanay. Ang ibig sabihin ng bilang ng mga pagdila na ginawa sa araw 1 (kaliwa) o araw 15 (kanang gitna) (n = 150 asul na ilaw na pagsubok, n = 150 pulang ilaw na pagsubok; ***P <0.0001). Ang ibig sabihin ng bilang ng mga pagdila na ginawa sa araw 1 (kaliwa) o araw 15 (kanang gitna) (n = 150 asul na ilaw na pagsubok, n = 150 pulang ilaw na pagsubok; ***P <0.0001). Среднее количество облизываний, выполненных в день 1 (слева) o день 15 (sa центре справа) (n = 150 испытаний с = ситоним, с исветоний с = си1м испытаний с красным светом; ***P <0,0001). Ang ibig sabihin ng bilang ng mga pagdila na ginawa sa araw 1 (kaliwa) o araw 15 (gitna kanan) (n = 150 asul na ilaw na pagsubok, n = 150 pulang ilaw na pagsubok; ***P <0.0001).第1 天（左）或第15 天（右中）执行的平均舔次数（n = 150 次蓝光试验，n = 150次红光试验；***P < 0.0001）。第1 天（左）或第15 天（右中）执行的平均舔次数（n = 150 次蓝光试验，n = 150次红光试验；***P < 0.001 Среднее количество облизываний, выполненных в день 1 (слева) o день 15 (sa центре справа) (n = 150 испытаний с = ситоним, с исветоний с = си1м испытаний с красным светом; ***P <0,0001). Ang ibig sabihin ng bilang ng mga pagdila na ginawa sa araw 1 (kaliwa) o araw 15 (gitna kanan) (n = 150 asul na ilaw na pagsubok, n = 150 pulang ilaw na pagsubok; ***P <0.0001).Mga pinagsama-samang pagdila para sa pula at asul na liwanag na mga pagsubok sa araw 1 (gitna sa kaliwa) o araw 15 (kanan). NS, hindi makabuluhan. j, k, Mga katangian ng pag-uugali ng lahat ng mga hayop na inilipat na may t-hCO na nagpapahayag ng hChR2-EYFP (j) o kontrolin ang fluorophore (k) sa araw 1 o 15 (hChR2-EYFP: n = 9 daga, ** P = 0.0049; kontrol: n = 9, P = 0.1497). l, Ebolusyon ng marka ng kagustuhan (n = 9 hChR2, n = 9 na kontrol; **P <0.001, ***P <0.0001). l, Ebolusyon ng marka ng kagustuhan (n = 9 hChR2, n = 9 na kontrol; **P <0.001, ***P <0.0001). l, Эволюция показателя предпочтения (n = 9 hChR2, n = 9 контрольных; **P <0,001, ***P <0,0001). l, Ebolusyon ng marka ng kagustuhan (n = 9 hChR2, n = 9 na kontrol; **P <0.001, ***P <0.0001). l，偏好评分的演变（n = 9 hChR2，n = 9 对照；**P < 0.001，***P < 0.0001）。 l，偏好评分的演变（n = 9 hChR2，n = 9 对照；**P < 0.001，***P < 0.0001）。 l, Эволюция показателей предпочтения (n = 9 hChR2, n = 9 контролей; **P <0,001, ***P <0,0001). l, Ebolusyon ng mga marka ng kagustuhan (n = 9 hChR2, n = 9 na kontrol; **P <0.001, ***P <0.0001).m, expression ng FOS bilang tugon sa optogenetic activation ng t-hCO sa S1. Ang mga larawan ng FOS expression (kaliwa), at quantification (n = 3 bawat pangkat; *P <0.05, **P <0.01 at ***P <0.001) (kanan) ay ipinapakita. Ang mga larawan ng FOS expression (kaliwa), at quantification (n = 3 bawat pangkat; *P <0.05, **P <0.01 at ***P <0.001) (kanan) ay ipinapakita. Показаны изображения экспрессии FOS (слева) at количественного определения (n = 3 на группу; * P <0,05, ** P <0,01, и *** P <0,01, и *** P). Ang mga larawan ng FOS expression (kaliwa) at quantification (n = 3 bawat pangkat; *P<0.05, **P<0.01, at ***P<0.001) ay ipinapakita (kanan).显示了FOS 表达（左）和量化（每组n = 3；*P < 0.05、**P < 0.01 和***P < 0.001））（叾弳）显示了FOS 表达（左）和量化（每组n = 3；*P < 0.05、**P < 0.01 和***P < 0.001））（叾弳） Показаны изображения экспрессии FOS (слева) at количественного определения (n = 3 на группу; * P <0,05, ** P <0,01, и *** P <0,01, и *** P). Ang mga larawan ng FOS expression (kaliwa) at quantification (n = 3 bawat pangkat; *P<0.05, **P<0.01, at ***P<0.001) ay ipinapakita (kanan).Scale bar, 100 µm. Ang data ay ipinahayag bilang mean ± standard error ng BLA, basolateral tonsil, MDT, dorsomedial thalamic nucleus, PAG, periaqueductal grey.
Sa wakas, tinanong namin kung ang t-hCO ay maaaring baguhin ang pag-uugali ng daga. Upang subukan ito, inilipat namin ang hChR2-EYFP-expressing hCO sa S1, at pagkaraan ng 90 araw, nagtanim kami ng mga optical fiber sa t-hCO para sa magaan na paghahatid. Pagkatapos ay sinanay namin ang mga daga gamit ang isang binagong operant conditioning paradigm (Fig. 5h). Inilagay namin ang mga hayop sa isang silid ng pagsubok sa pag-uugali at sapalarang inilapat ang 5 segundong asul (473 nm) at pula (635 nm) laser stimuli. Nakatanggap ang mga hayop ng gantimpala ng tubig kung dumila sila sa panahon ng blue light stimulation ngunit hindi dumila sa red light stimulation. Sa unang araw ng pagsasanay, ang mga hayop ay nagpakita ng walang pagkakaiba sa pagdila kapag pinasigla ng asul o pulang ilaw. Gayunpaman, sa araw na 15, ang mga hayop na inilipat na may hCO na nagpapahayag ng hChR2-EYFP ay nagpakita ng mas aktibong pagdila kapag pinasigla ng asul na ilaw kumpara sa pulang ilaw na pagpapasigla. Ang mga pagbabagong ito sa pag-uugali ng pagdila ay hindi naobserbahan sa mga control na hayop na inilipat na may hCO na nagpapahayag ng control fluorophore (rate ng tagumpay sa pag-aaral: hChR2 89%, EYFP 0%, Figure 5i-1 at Karagdagang Video 2). Iminumungkahi ng mga datos na ito na ang mga t-hCO cells ay maaaring mag-activate ng mga neuron ng daga upang pasiglahin ang pag-uugali na naghahanap ng gantimpala. Upang malaman kung aling mga rat t-hCO neural circuits ang maaaring kasangkot sa mga pagbabagong ito sa pag-uugali, optogenetically naming na-activate ang t-hCO sa mga sinanay na hayop at nag-ani ng mga tisyu makalipas ang 90 minuto. Ang immunohistochemistry ay nagsiwalat ng pagpapahayag ng protina ng FOS na umaasa sa aktibidad sa ilang mga rehiyon ng utak na kasangkot sa motivated na pag-uugali, kabilang ang medial prefrontal cortex, medial thalamus, at periaqueductal grey matter, na ipinahayag alinman sa hindi na-stimulate na mga kontrol na hayop o sa mga hayop. kanin. 5m). Kung sama-sama, iminumungkahi ng mga datos na ito na ang t-hCO ay maaaring baguhin ang aktibidad ng neuronal ng daga upang himukin ang pag-uugali.
Ang mga neural organoid ay kumakatawan sa isang promising system para sa pag-aaral ng pag-unlad ng tao at sakit sa vitro, ngunit nalilimitahan sila ng kakulangan ng mga koneksyon sa pagitan ng mga circuit na umiiral sa vivo. Nakabuo kami ng isang nobelang platform kung saan inilipat namin ang hCO sa S1 ng immunocompromised early postnatal rats upang pag-aralan ang pagbuo at paggana ng cell ng tao sa vivo. Ipinakita namin na ang t-hCO ay bumubuo ng mga mature na uri ng cell na hindi sinusunod sa vitro28 at ang t-hCO ay anatomically at functionally na isinama sa rodent na utak. Ang pagsasama ng t-hCO sa mga rodent neural circuit ay nagpapahintulot sa amin na magtatag ng isang link sa pagitan ng aktibidad ng cellular ng tao at pinag-aralan ang pag-uugali ng hayop, na nagpapakita na ang mga t-hCO neuron ay maaaring baguhin ang aktibidad ng neuronal ng daga upang himukin ang mga tugon sa pag-uugali.
Ang platform na inilalarawan namin ay may ilang mga pakinabang sa nakaraang pananaliksik sa paglipat ng mga selula ng tao sa mga rodent na utak. Una, inilipat namin ang hCO sa pagbuo ng cortex ng maagang postnatal rats, na maaaring mapadali ang anatomical at functional integration. Pangalawa, pinahintulutan kami ng pagsubaybay ng t-hCO MRI na pag-aralan ang posisyon ng graft at paglaki sa mga live na hayop, na nagpapahintulot sa amin na magsagawa ng pangmatagalang multi-hayop na pag-aaral at maitaguyod ang pagiging maaasahan ng ilang hiPS cell line. Sa wakas, nag-transplant kami ng mga buo na organoids, sa halip na nakahiwalay na mga solong cell suspension, na hindi gaanong nakakasira sa mga selula ng tao at maaaring magsulong ng pagsasama at pagbuo ng mga cortex neuron ng tao sa mga utak ng daga.
Kinikilala namin na sa kabila ng mga pagsulong sa platform na ito, pinipigilan ng temporal, spatial, at cross-species na mga hadlang ang pagbuo ng mga neural circuit ng tao na may mataas na katapatan, kahit na pagkatapos ng paglipat sa isang maagang yugto ng pag-unlad. Halimbawa, hindi malinaw kung ang kusang aktibidad na sinusunod sa t-hCO ay kumakatawan sa isang developmental phenotype na katulad ng ritmikong aktibidad na sinusunod sa panahon ng pag-unlad ng cortical, o kung ito ay dahil sa kawalan ng mga suppressive na uri ng cell na naroroon sa t-hCO. Katulad nito, hindi malinaw kung hanggang saan ang kawalan ng lamination sa t-hCO ay nakakaapekto sa pagkakakonekta ng chain30. Ang hinaharap na gawain ay tututuon sa pagsasama ng iba pang mga uri ng cell tulad ng microglia ng tao, mga endothelial cell ng tao, at iba't ibang proporsyon ng GABAergic interneuron tulad ng ipinapakita gamit ang assembly 6 in vitro, pati na rin ang pag-unawa kung paano maaaring mangyari ang neural integration at pagproseso sa binagong t-hCO. transcriptional, synaptic at behavioral na antas sa mga cell na nakuha mula sa mga pasyente.
Sa pangkalahatan, ito sa vivo platform ay kumakatawan sa isang malakas na mapagkukunan na maaaring umakma sa in vitro na pag-unlad ng utak ng tao at pananaliksik sa sakit. Inaasahan namin na ang platform na ito ay magbibigay-daan sa amin na tumuklas ng mga bagong strand-level na phenotype sa kung hindi man ay mailap na mga cell na nagmula sa pasyente at sumubok ng mga bagong therapeutic na diskarte.
Nakabuo kami ng hCO2.5 mula sa mga cell ng HiPS tulad ng inilarawan dati. Upang simulan ang produksyon ng hCO mula sa mga hiPS cells na naka-culture sa feeder layer, ang mga intact colonies ng hiPS cells ay inalis mula sa mga culture dish gamit ang dispase (0.35 mg/mL) at inilipat sa ultra-low attachment plastic cultures na naglalaman ng mga dish na may hiPS cell culture medium. (Corning) na dinagdagan ng dalawang SMAD inhibitors dorsomorphine (5 μM; P5499, Sigma-Aldrich) at SB-431542 (10 μM; 1614, Tocris) at ROCK inhibitor Y-27632 (10 μM; S1049, Selleckchem). Sa unang 5 araw, ang hiPS cell medium ay binago araw-araw at idinagdag ang dorsomorphine at SB-431542. Sa ika-anim na araw sa pagsususpinde, ang mga neural spheroid ay inilipat sa neural medium na naglalaman ng neurobasal-A (10888, Life Technologies), suplemento ng B-27 na walang bitamina A (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies), penicillin at streptomycin (1:100, Life Technologies) at dinagdagan ng e (1000, Life Technologies) at dinagdagan ng e (1000 ml; Epidermal factor; R&D Systems) at fibroblast growth factor 2 (FGF2; 20 ng ml−1; R&D Systems) hanggang araw 24. Mula araw 25 hanggang araw 42, ang daluyan ay dinagdagan ng brain-derived neurotrophic factor (BDNF; 20 ng ml−1, Peprotech) at neurotrophin 3 (NT3; 20 ng ml na medium) na may mga pagbabago sa bawat araw. Sa ika-anim na araw sa pagsususpinde, ang mga neural spheroid ay inilipat sa neural medium na naglalaman ng neurobasal-A (10888, Life Technologies), suplemento ng B-27 na walang bitamina A (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies), penicillin at streptomycin (1:100, Life Technologies) at dinagdagan ng e (1000, Life Technologies) at dinagdagan ng e (1000 ml; Epidermal factor; R&D Systems) at fibroblast growth factor 2 (FGF2; 20 ng ml−1; R&D Systems) hanggang araw 24. Mula araw 25 hanggang araw 42, ang daluyan ay dinagdagan ng brain-derived neurotrophic factor (BDNF; 20 ng ml−1, Peprotech) at neurotrophin 3 (NT3; 20 ng ml na medium) na may mga pagbabago sa bawat araw.Sa ikaanim na araw sa pagsususpinde, ang mga neural spheroid ay inilipat sa isang neural medium na naglalaman ng Neurobasal-A (10888, Life Technologies), B-27 supplement na walang bitamina A (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies), penicillin.и стрептомицин (1:100, Life Technologies) и дополнены эпидермальным фактором роста (EGF; 20 нг/мл; R&D Systems) at фактором роста фиброб (0FGF2вг2броб) R&D Systems) hanggang 24-го дня. at streptomycin (1:100, Life Technologies) at dinagdagan ng epidermal growth factor (EGF; 20 ng/ml; R&D Systems) at fibroblast growth factor 2 (FGF2; 20 ng/ml; R&D Systems) hanggang araw 24.Mula sa mga araw 25 hanggang 42, ang neurotrophic factor na nagmula sa utak (BDNF; 20 ng ml-1, Peprotech) at neurotrophin 3 (NT3; 20 ng ml-1, Peprotech) ay idinagdag sa daluyan, binabago ang daluyan tuwing ibang araw.在悬浮的第6 天，将神经球体转移到含有neurobosal-A（10888，Life Technologies）、不含维生素A 的B-27补充剂（12587，Life Technologies）、GlutaMax（1:100，Life Technologies）、青霉素的神经培养基中和链霉素（1:10（1:10 Technologies）并辅以表皮生长因子（EGF；20 ng ml-1；R&D Systems）和成纤维细胞生长因子2（FGF ngR-1；20 Systems）直至第24 天。在 悬浮 的 第 第 6 天 将 神经 球体 转移 含有 含有 neurobasal-a （10888 ， Life Technologies） 不 含 的索2补充剂 （12587 ， Life Technologies） Glutamax （1: 100 ， Life TechNOGIS青霉素 的 神经 培养 基 中 链霉素 （1（素 （1（素 （1（素 （1（素 （1（素生长 因子 （（（20 ng ml-1 ； r & d Systems） 成 纤维 细胞 生长 2 （fgf2 ； 20 ng ml- 1；笛紬华＇ На 6-й день суспензии нейросферы были переведены на добавку, содержащую нейробазал-А (10888, Life Technologies), добиз2в А (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies), пенициллин- нейтрализованный стрептомицин (1:100, Life Technologies) с добавлением эпидермальакото эпидермальакото нг мл-1; R&D Systems) и фактора роста фибробластов 2 (FGF2; 20 нг мл-1) 1; Sa araw na 6, ang mga pagsususpinde ng neurosphere ay inilipat sa isang suplemento na naglalaman ng neurobasal-A (10888, Life Technologies), B-27 supplement na walang bitamina A (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies), penicillin-neutralized streptomycin (1:100, Life Technologies) na pupunan ng epidermal growth factor (EGF; 1; 2) factor ng paglago ng epidermal 1. fibroblast growth factor 2 (FGF2; 20 ng ml-1) 1; R&D Systems) hanggang 24-го дня. R&D Systems) hanggang ika-24 araw.Mula sa mga araw 25 hanggang 42, ang neurotrophic factor na nagmula sa utak (BDNF; 20 ng ml-1, Peprotech) at neurotrophic factor 3 (NT3; 20 ng ml-1, Peprotech) ay idinagdag sa medium ng kultura tuwing ibang araw. Katamtamang pagbabago ng isang beses.Simula sa araw na 43, ang hCO ay pinananatili sa hindi nadagdag na neurobasal-A medium (NM; 1088022, Thermo Fisher) na may medium na pagbabago tuwing 4-6 na araw. Upang makakuha ng hCO mula sa mga hiPS cells na na-culture sa ilalim ng feederless na mga kondisyon, ang mga hiPS cell ay na-incubate ng Accutase (AT-104, Innovate Cell Technologies) sa 37 ° C sa loob ng 7 minuto, nahiwalay sa mga solong cell, at naka-plate sa AggreWell 800 plates (34815, STEMCELL Technologies) na may density na 3 × 106 na mga cell na may suplemento na solong mga cell na may 106 na suplemento ng ECK. Y-27632 (10 μM; S1049, Selleckchem). Pagkatapos ng 24 na oras, ang media sa mga balon ay na-pipette pataas at pababa sa media na naglalaman ng Essential 6 media (A1516401, Life Technologies) na pupunan ng dorsomorphine (2.5 μM; P5499, Sigma-Aldrich) at SB-431542 (10 μM; 1614). , Tocrida). Mula sa mga araw 2 hanggang 6, ang Essential 6 medium ay pinalitan araw-araw ng dorsomorphine at suplemento ng SB-431542. Mula sa ikaanim na araw, ang mga suspensyon ng neurosphere ay inilipat sa daluyan ng neurobasal at pinananatili tulad ng inilarawan sa itaas.
Ang lahat ng mga pamamaraan ng hayop ay isinagawa alinsunod sa mga alituntunin sa pangangalaga ng hayop na inaprubahan ng Stanford University Laboratory Animal Care Administrative Committee (APLAC). Ang mga buntis na euthymic RNU (rnu/+) na daga ay binili (Charles River Laboratories) o pinatira. Ang mga hayop ay pinananatili sa isang 12-hour light-dark cycle na may ad libitum ng pagkain at tubig. Ang hubo't hubad (FOXN1–/–) na mga tuta ng daga na may edad tatlo hanggang pitong araw ay nakilala sa pamamagitan ng paglaki ng mga hindi pa nabubuong whisker bago ang pag-culling. Ang mga tuta (lalaki at babae) ay na-anesthetize ng 2-3% isoflurane at inilagay sa isang stereotaxic frame. Ang isang trepanation ng bungo na may diameter na humigit-kumulang 2-3 mm sa itaas ng S1 ay isinagawa habang pinapanatili ang integridad ng dura mater. Pagkatapos ay gumamit ng 30-G na karayom ​​(humigit-kumulang 0.3 mm) sa labas lamang ng craniotomy upang mabutas ang dura. Pagkatapos ay ilapat ang HCO sa isang manipis na 3×3 cm parafilm at alisin ang labis na daluyan. Gamit ang isang Hamilton syringe na nakakabit sa isang 23 G, 45° na karayom, dahan-dahang iguhit ang hCO sa pinakadistal na dulo ng karayom. Pagkatapos ay i-install ang syringe sa syringe pump na konektado sa stereotaxic device. Pagkatapos ay ilagay ang dulo ng karayom ​​sa isang dati nang ginawang 0.3 mm na lapad na butas ng butas sa dura (z = 0 mm) at paliitin ang syringe 1–2 mm (z = humigit-kumulang –1.5 mm) hanggang ang karayom ​​ay nasa pagitan ng dura mater A. isang siksik na selyo ay nabuo. Pagkatapos ay itaas ang syringe sa gitna ng cortical surface sa z = -0.5 mm at mag-iniksyon ng hCO sa bilis na 1-2 µl kada minuto. Matapos makumpleto ang iniksyon ng hCO, ang karayom ​​ay binawi sa bilis na 0.2-0.5 mm bawat minuto, ang balat ay tinatahi, at ang tuta ay agad na inilagay sa isang mainit na heating pad hanggang sa kumpletong paggaling. Ang ilang mga hayop ay inilipat nang bilaterally.
Ang lahat ng mga pamamaraan ng hayop ay isinagawa alinsunod sa mga alituntunin sa pangangalaga ng hayop na inaprubahan ng Stanford University APLAC. Ang mga daga (higit sa 60 araw pagkatapos ng paglipat) ay na-induce ng 5% isoflurane anesthesia at na-anesthetize ng 1-3% na isoflurane sa panahon ng imaging. Para sa visualization, ginamit ang isang 7 Tesla na aktibong naka-shield sa horizontal borehole scanner na Bruker (Bruker Corp.) na may gradient drive ng International Electric Company (IECO), isang shielded gradient insert na may panloob na diameter na 120 mm (600 mT/m, 1000 T/m/s) gamit ang AVANCE. III, walong-channel na multi-coil RF at multi-core na mga kakayahan, at ang kasamang Paravision 6.0.1 platform. Ang pagre-record ay isinagawa gamit ang isang aktibong decoupled volumetric RF coil na may panloob na diameter na 86 mm at isang four-channel cryo-cooled RF coil para sa pagtanggap lamang. Axial 2D Turbo-RARE (oras ng pag-uulit = 2500 ms, oras ng echo = 33 ms, 2 average) na may 16 na pag-capture ng slice, 0.6–0.8 mm ang kapal ng slice, na naglalaman ng 256 × 256 na sample. Ang mga signal ay natanggap gamit ang isang quadrature transceiver volumetric RF coil na may panloob na diameter na 2 cm (Rapid MR International, LLC). Panghuli, gamitin ang built-in na Imaris (BitPlane) na mga function ng surface estimation para sa 3D rendering at volume analysis. Ang isang matagumpay na transplant ay tinukoy bilang isa kung saan ang mga lugar ng tuluy-tuloy na T2-weighted MRI signal ay nabuo sa transplanted hemisphere. Ang pagtanggi sa graft ay tinukoy bilang isang graft na hindi gumagawa ng mga lugar ng tuluy-tuloy na T2-weighted MRI signal sa transplanted hemisphere. Ang subcortical t-hCO ay hindi kasama sa kasunod na pagsusuri.
Upang matatag na maipahayag ang GCaMP6s sa hCO para sa two-photon calcium imaging, ang mga hiPS cells ay nahawahan ng pLV[Exp]-EF1a::GcaMP6s-WPRE-Puro na sinundan ng pagpili ng mga antibiotics. Sa madaling sabi, ang mga cell ay nahiwalay sa EDTA at nasuspinde sa 1 ml ng Essential 8 medium sa isang density ng humigit-kumulang 300,000 na mga cell sa pagkakaroon ng polybrene (5 μg / ml) at 15 μl ng virus. Ang mga cell ay pagkatapos ay incubated sa suspensyon para sa 60 minuto at seeded sa isang density ng 50,000 mga cell bawat balon. Pagkatapos ng confluence, ang mga cell ay ginagamot ng 5-10 μg ml-1 puromycin sa loob ng 5-10 araw o hanggang sa lumitaw ang mga matatag na kolonya. Ang matinding impeksyon sa hCO ay isinagawa tulad ng naunang inilarawan 5 na may ilang mga pagbabago. Sa madaling sabi, ilipat ang araw na 30-45 hCO sa 1.5 ml Eppendorf microcentrifuge tubes na naglalaman ng 100 µl ng nerve medium. Pagkatapos ay tinatanggal ang humigit-kumulang 90 µl ng medium, 3-6 µl ng high titer lentivirus (mula 0.5 x 108 hanggang 1.2 x 109) ay idinagdag sa tubo, at ang hCO ay inilipat sa incubator sa loob ng 30 minuto. Pagkatapos ay magdagdag ng 90–100 µl ng medium sa bawat tubo at ibalik ang mga tubo sa incubator magdamag. Sa susunod na araw, ilipat ang hCO sa sariwang nerve medium sa mababang attachment plate. Pagkatapos ng 7 araw, ang hCO ay inilipat sa 24-well glass bottom plate para sa visualization at pagsusuri ng kalidad ng impeksyon. Ang pLV[Exp]-SYN1::EYFP-WPRE at pLV[Exp]-SYN1::hChR2-EYFP-WPRE ay binuo ng VectorBuilder. Ginagamit ang Lentivirus sa karamihan ng mga eksperimento dahil isinama ito sa host genome, na nagpapahintulot sa pagpapahayag ng gene ng reporter sa mga nahawaang linya ng cell. Para sa rabies follow-up, ang araw na 30-45 hCO ay co-infected ng rabies-ΔG-eGFP at AAV-DJ-EF1a-CVS-G-WPRE-pGHpA (plasmid #67528, Addgene), hinugasan ng maigi sa loob ng 3 araw, at inilipat sa mga daga sa S1 at napanatili sa vivo 7-14 araw.
Para sa immunocytochemistry, ang mga hayop ay anesthetized at transcardially perfused sa PBS na sinusundan ng 4% paraformaldehyde (PFA sa PBS; Electron Microscopy Sciences). Ang mga utak ay naayos sa 4% PFA sa loob ng 2 oras o magdamag sa 4°C, cryopreserved sa 30% sucrose sa PBS sa loob ng 48-72 oras, at naka-embed sa 1:1, 30% sucrose: OCT (Tissue-Tek OCT Compound 4583 , Sakura Finetek) at coronal 30s na sigaw (coronal 30s) at ginawa sa coronal 30s cryostat. Para sa immunohistochemistry ng makapal na mga seksyon, ang mga hayop ay pinahiran ng PBS, at ang utak ay na-dissect at na-sectioned coronally sa 300-400 μm gamit ang isang vibratome (Leica) at ang mga seksyon ay naayos na may 4% PFA sa loob ng 30 minuto. Pagkatapos ang mga cryosection o makapal na mga seksyon ay hugasan ng PBS, hinarangan ng 1 oras sa temperatura ng silid (10% normal na donkey serum (NDS) at 0.3% Triton X-100 na diluted sa PBS) at hinarangan ng blocking solution sa 4 ° C. – Ang Incubation Cryosections ay incubated magdamag at ang makapal na seksyon ay incubated sa loob ng 5 araw. Ang mga pangunahing antibodies na ginamit ay: anti-NeuN (mouse, 1:500; ab104224, abcam) anti-CTIP2 (rat, 1:300; ab18465, abcam), anti-GFAP (rabbit, 1:1,000; Z0334, Dako), anti-GFP (manok, Genex, 1:100) anti-HNA (mouse, 1:200; ab191181, abcam), anti-NeuN (rabbit, 1:500; ABN78, Millipore), anti-PDGFRA (rabbit, 1:200; sc-338, Santa Cruz), anti-PPP1R17 (rabbit, 1:2078; HPA0, Atlasbo1; anti-RECA-1 (mouse, 1:50; ab9774, abcam), anti-SCG2 (rabbit, 1:100; 20357-1-AP, Proteintech), anti-SOX9 (goat, 1:500; AF3075, R&D Systems), Netrin G1a (goat, 106; R&D Systems), Netrin G1a: 106; R&D anti-STEM121 (mouse, 1:200; Y40410, Takara Bio), anti-SATB2 (mouse, 1:50; ab51502, abcam), anti-GAD65/67 (rabbit, 1:400; ABN904, Millipore) at anti-IBA1 (goat, 1:b5). Ang mga pangunahing antibodies na ginamit ay: anti-NeuN (mouse, 1:500; ab104224, abcam) anti-CTIP2 (rat, 1:300; ab18465, abcam), anti-GFAP (rabbit, 1:1,000; Z0334, Dako), anti -GFP (manok, Genex, 1:1000) anti-HNA (mouse, 1:200; ab191181, abcam), anti-NeuN (rabbit, 1:500; ABN78, Millipore), anti-PDGFRA (rabbit, 1:200; sc-338, Santa Cruz), anti-PPP1R17 (rabbit, 1:2078; HPA0, Atlasbo1; anti-RECA-1 (mouse, 1:50; ab9774, abcam), anti-SCG2 (rabbit , 1:100; 20357-1-AP, Proteintech), anti-SOX9 (goat, 1:500; AF3075, R&D Systems), Netrin AF: R&D Systems, Netrin G1a, 106, R&D anti-STEM121 (mouse , 1:200; Y40410, Takara Bio), anti-SATB2 (mouse, 1:50; ab51502, abcam), anti-GAD65/67 (rabbit, 1:400; ABN904, Millipore) at anti-IBA1 :107; a107 (goat, 6, abcam). Использовались следующие первичные антитела: анти-NeuN (мышиные, 1:500; ab104224, abcam), анти-CTIP2 (крысиные, 51:304; 6; крысиные; 6; анти-GFAP (кроличьи, 1:1000; Z0334, Dako), анти- -GFP (курица, 1:1000; GTX13970, GeneTex), анти-HNA (мышь, 1:200; ab191181, антиклик), анти-Nexam 1:500; ABN78, Millipore), анти-PDGFRA (кролик, 1:200; sc-338, Санта-Круз), анти-PPP1R17 (кролик, 1:200; HPA047819, Atlas , Круз ), анти-PPP1R17 (кролик, 1:200; HPA047819, нти-RECA-1; ab9774, abcam), анти-SCG2 (кролик , 1:100; 20357-1-AP, Proteintech), анти-SOX9 (козий, 1:500; AF3075, R&D Systems), нетрин G1a, нетрин G1a (козий, 1:500; AF3075, R&D Systems), нетрин G1a (коз10), AF10, R&D анти-STEM121 (мышиный , 1:200; Y40410, Takara Bio), анти-SATB2 (мышь, 1:50; ab51502, abcam), анти-GAD65/67 (кролик, 1:4040; Miliore; (коза, 1 :100; аб5076, абкам). Ang mga pangunahing antibodies na ginamit ay: anti-NeuN (mouse, 1:500; ab104224, abcam), anti-CTIP2 (rat, 1:300; ab18465, abcam), anti-GFAP (rabbit, 1:1000; Z0334, Dako), anti-GFP1009; anti-HNA (mouse, 1:200; ab191181, abcam), anti-NeuN (rabbit, 1:500; ABN78, Millipore), anti-PDGFRA ( rabbit, 1:200; sc-338, Santa Cruz), anti-PPP1R17 (rabbit, 1:2078; HPA, Atlasbo1, Atlasbo1, 1:2078; HPA, Atlasbo anti-RECA-1 (mouse, 1:50; ab9774, abcam), anti- SCG2 (rabbit, 1:100; 20357-1-AP, Proteintech), anti-SOX9 (goat, 1:500; AF3075, R&D Systems), netrin G106; R&D Systems, netrin G1A: 106; R&D STEM121 (mouse, 1:200; Y40410, Takara Bio), anti-SATB2 (mouse, 1:50; ab51502, abcam), anti-GAD65/67 (rabbit, 1:400; ABN904, Millipore) at anti-IBA1 (goat, 1:507).使用的一抗是：抗NeuN（小鼠，1:500；ab104224，abcam）抗CTIP2（大鼠，1:3 00；ab18465，abcam），抗GFAP（兔，1:1,000；Z0334，Dako），抗-GF P（鸡，1:1,000；GTX13970，GeneTex），抗HNA（小鼠，1:200；ab1911 81，abcam），抗NeuN（兔，1:500；ABN78，Millipore），抗PDGFRA（兔， 1:200；sc-338，Santa Cruz），抗PPP1R17（兔，1:200；HPA047819，Atlas抗体），抗RECA-1（小鼠，1:50；ab9774，abcam），抗SCG2（兔） , 1:100；20357-1-AP，Proteintech），抗SOX9（山羊，1:500；AF3075，R&D Systems），Netrin G1a（山羊，1:100；AF1166，R&D System），抗STEM121（小鼠, 1:200;使用的一抗是：抗NeuN（小鼠，1:500；ab104224，abcam）抗CTIP2（大鼠，1 :300；ab18465，abcam），抗GFAP（兔，1:1,000；Z0334，Dako），抗-GFP（鸡，1:1,000；GTX13970，GeneTex），抗HNA（小鼠，1:200；ab191181，abcam），抗NeuN（兔，1:500；小鼠，1:200；ab191181，abcam），抗NeuN（兔，1:508；兔；ABNre:7 200；sc-338，Santa Cruz），抗PPP1R17（兔，1:200；HPA047819，Atlas 抗体），抗RECA-1（小鼠，1:50；ab9774，ab9774，ab9774， 100；20357-1-AP，Proteintech），抗SOX9（山羊，1:500；AF3075，R&D Systems），Netrin G1a（山羊，1:100；AF1166，R&D System）;Y40410, Takara Bio), anti-SATB2 (mouse, 1:50; ab51502, abcam), anti-GAD65/67 (rabbit, 1:400; ABN904, Millipore) at anti-IBA1 (goat, 1:100; ab5076, abcam).Ang mga pangunahing antibodies na ginamit ay: anti-NeuN (mouse, 1:500; ab104224, abcam), anti-CTIP2 (rat, 1:300; ab18465, abcam), anti-GFAP (rabbit, 1:1000; Z0334, Dako) . , anti-GFP (manok, 1:1000; GTX13970, GeneTex), anti-HNA (mouse, 1:200; ab191181, abcam), anti-NeuN (rabbit, 1:500; ABN78, Millipore), anti-PDGFRA ( rabbit, 1:2300) (rabbit, 1:200; HPA047819, Atlas antibody), anti-RECA-1 (mouse, 1:50; ab9774, abcam), anti- SCG2 (rabbit), 1:100;20357-1-AP, Proteintech), анти-SOX9 (коза, 1:500; AF3075, R&D Systems), Нетрин G1a (коза, 1:100; AF1166, R&D Systems), анти -STEM121 (мы2ь0ш121); анти-SATB2 (мышь, 1:50; ab51502, abcam), анти-GAD65/67 (кролик, 1:400; ABN904, Millipore) at анти-IBA1 (коза, 1:100; аб5076, аб5076). 20357-1-AP, Proteintech), anti-SOX9 (goat, 1:500; AF3075, R&D Systems), Netrin G1a (goat, 1:100; AF1166, R&D Systems), anti-STEM121 (mouse, 1:200; TaBkara Bio, 500; TaBkara Bio, 10,10; ab51502, abcam), anti-GAD65/67 (rabbit, 1:400; ABN904, Millipore), at anti-IBA1 (goat, 1:100; ab5076, abkam).Ang mga seksyon ay pagkatapos ay hugasan ng PBS at incubated na may pangalawang antibody sa loob ng 1 oras sa temperatura ng silid (mga frozen na seksyon) o magdamag sa 4 ° C (makapal na mga seksyon). Ang Alexa Fluor pangalawang antibody (Life Technologies) diluted 1:1000 sa blocking solution ay ginamit. Pagkatapos ng paghuhugas gamit ang PBS, ang nuclei ay na-visualize gamit ang isang Hoechst 33258 (Life Technologies). Sa wakas, ang mga slide ay inilagay sa isang mikroskopyo na may mga coverslip (Fisher Scientific) gamit ang isang Aquamount (Polysciences) at sinuri sa isang Keyence fluorescent microscope (BZ-X analyzer) o isang Leica TCS SP8 confocal microscope (Las-X) sa imahe. Ang mga imahe ay naproseso gamit ang ImageJ program (Fiji). Upang mabilang ang proporsyon ng mga neuron ng tao sa t-hCO at ang cortex ng daga, 387.5 μm ang lapad na hugis-parihaba na mga imahe ay kinuha sa gitna ng t-hCO, sa o malapit sa gilid ng rat cortex. Ang mga graft margin ay tinutukoy sa pamamagitan ng pagtatasa ng mga pagbabago sa transparency ng tissue, HNA+ nuclei, at/o ang pagkakaroon ng tissue autofluorescence. Sa bawat larawan, ang kabuuang bilang ng mga selulang NeuN+ at HNA+ ay hinati sa kabuuang bilang ng mga selulang NeuN+ sa parehong lugar. Upang matiyak na tanging ang mga cell na may nuclei sa image plane ang binibilang, tanging ang mga cell na Hoechst+ lang ang kasama sa pagkalkula. Dalawang larawang pinaghihiwalay ng hindi bababa sa 1 mm ang na-average upang mabawasan ang error sa istatistika.
Isang linggo bago ang pagkolekta ng sample, ilagay ang mga hayop na transplant ng hCO (humigit-kumulang 8 buwan ng pagkakaiba-iba) sa isang madilim na silid na may mga whisker na pinutol upang mabawasan ang sensory stimulation. Ang paghihiwalay ng nuclei ay isinagawa tulad ng inilarawan dati, na may ilang mga pagbabago. Sa madaling sabi, ang t-hCO at hCO ay nawasak gamit ang detergent-mechanical cell lysis at isang 2 ml glass tissue grinder (D8938, Sigma-Aldrich / KIMBLE). Ang krudo nuclei ay pagkatapos ay na-filter off gamit ang isang 40 µm filter at centrifuged sa 320 g para sa 10 minuto sa 4 ° C bago magsagawa ng isang sucrose density gradient. Pagkatapos ng centrifugation step (320 g para sa 20 min sa 4°C), ang mga sample ay muling nasuspinde sa 0.04% BSA/PBS kasama ang pagdaragdag ng 0.2 units ng µl-1 RNase inhibitor (40 u µl-1, AM2682, Ambion) at dumaan sa isang 40 µm flow filter. Ang dissociated nuclei ay pagkatapos ay muling sinuspinde sa PBS na naglalaman ng 0.02% BSA at na-load sa isang Chromium Single Cell 3′ chip (tinantyang pagbawi ng 8,000 na mga cell bawat linya). Ang mga aklatan ng snRNA-seq ay inihanda gamit ang Chromium Single cell 3′ GEM, Library at Gel Bead Kit v3 (10x Genomics). Ang mga aklatan ng snRNA-seq ay inihanda gamit ang Chromium Single cell 3′ GEM, Library at Gel Bead Kit v3 (10x Genomics). Библиотеки snRNA-seq были приготовлены с помощью Chromium Single cell 3′ GEM, Library at Gel Bead Kit v3 (10x Genomics). Ang mga aklatan ng snRNA-seq ay inihanda gamit ang Chromium Single cell 3′ GEM, Library at Gel Bead Kit v3 (10x Genomics). snRNA-seq 文库是使用Chromium Single cell 3′ GEM、Library at Gel Bead Kit v3 (10x Genomics) 制备的。 snRNA-seq 文库是使用Chromium Single cell 3′ GEM、Library at Gel Bead Kit v3 (10x Genomics) 制备的。 Библиотеку snRNA-seq готовили с использованием Chromium Single Cell 3′ GEM, Library at Gel Bead Kit v3 (10x Genomics). Ang snRNA-seq library ay inihanda gamit ang Chromium Single Cell 3′ GEM, Library at Gel Bead Kit v3 (10x Genomics).Ang mga aklatan mula sa iba't ibang mga sample ay pinagsama at na-sequence ng Admera Health sa NovaSeq S4 (Illumina).
Ang mga antas ng expression ng gene para sa bawat putative nuclear barcode ay binibilang gamit ang 10x Genomics CellRanger analysis software package (bersyon 6.1.2). Sa partikular, ang mga nabasa ay itinugma laban sa kumbinasyon ng tao (GRCh38, Ensemble, bersyon 98) at daga (Rnor_6.0, Ensemble, bersyon 100) na mga reference na genome na nilikha gamit ang mkref command at gamit ang count na may –include-introns=TRUE na utos sa quantitation kasama ang mga pagbabasa na nakamapa sa mga rehiyon ng intron. Para sa mga sample ng t-hCO, ang nuclei ng tao ay nakilala batay sa konserbatibong kinakailangan na hindi bababa sa 95% ng lahat ng mga nakamapang nabasa ay tumutugma sa genome ng tao. Ang lahat ng kasunod na pagsusuri ay isinagawa sa isang na-filter na barcode array output mula sa CellRanger gamit ang R package (bersyon 4.1.2) Seurat (bersyon 4.1.1)32.
Upang matiyak na ang mataas na kalidad na nuclei lamang ang kasama sa kasunod na pagsusuri, isang umuulit na proseso ng pagsala ay ipinatupad para sa bawat sample. Una, ang mababang kalidad na nuclei na may mas mababa sa 1000 natatanging mga gene na natagpuan at higit sa 20% ng kabuuang mitochondria ay natukoy at naalis. Kasunod nito, ang raw gene number matrix ay na-normalize sa pamamagitan ng regularized na negatibong binomial regression gamit ang sctransform(vst.flavor=”v2″) function, na natukoy din ang 3000 most variable genes gamit ang mga default na parameter. Ang pagbabawas ng dimensyon ay isinagawa sa upper variable genes gamit ang Principal Component Analysis (PCA) na may mga napiling parameter na batay sa visual = 330 (mga default na parameter gamit ang isang set ng data) pag-inspeksyon sa mga site ng tuhod at ginamit para sa lahat ng mga sample at pag-aaral ng ensemble). (ibig sabihin ang marka ng DoubletFinder sa itaas ng 95th percentile).
Pagkatapos alisin ang mababang kalidad na mga kernel, ang pinagsama-samang dataset ay pinagsama-sama (resolution = 0.5) at naka-embed para sa UMAP34 visualization purposes. Ang mga marker gene para sa bawat cluster ay natukoy gamit ang FindMarkers function na may mga default na parameter na kinakalkula mula sa normalized na data ng expression ng gene. Tinutukoy at inuri namin ang mga pangunahing klase ng cell sa pamamagitan ng pagsasama-sama ng fetal at adult cortical reference dataset na may marker gene expression 19,20,21,35 at annotation. Sa partikular, ang mga nagpapalipat-lipat na precursor ay nakilala sa pamamagitan ng pagpapahayag ng MKI67 at TOP2A. Ang mga kumpol ng progenitor ay tinukoy sa pamamagitan ng kawalan ng mga mitotic transcript, mataas na magkakapatong sa mga multipotent na glial progenitor na kumpol na inilarawan sa late metaphase fetal cortex, at EGFR at OLIG1 expression. Ginagamit namin ang terminong astrocyte upang sumaklaw sa ilang mga estado ng pagkakaiba-iba ng astrocyte, mula sa huling bahagi ng radial glia hanggang sa pagkahinog ng mga astrocyte. Ang mga kumpol ng Astrocyte ay nagpapahayag ng mataas na antas ng SLC1A3 at AQP4 at ipinakitang nagmapa na may mga subtype ng fetal radial glia at/o mga adult astrocytes. Ang mga OPC ay nagpapahayag ng PDGFRA at SOX10 habang ang mga oligodendrocytes ay nagpapahayag ng mga myelination marker (MOG at MYRF). Ang mga glutamatergic neuron ay nakilala sa pamamagitan ng pagkakaroon ng mga neuronal transcript (SYT1 at SNAP25), ang kawalan ng GABAergic marker (GAD2), at ang pagpapahayag ng NEUROD6, SLC17A7, BCL11B, o SATB2. Ang mga neuron ng GluN ay higit na nahahati sa itaas (SATB2 expression at pagkawala ng BCL11B) at malalim (BCL11B expression) na mga subclass. Ang mga putative subplate (SP) neuron ay nagpapahayag ng mga kilalang SP18 marker tulad ng ST18 at SORCS1 bilang karagdagan sa malalim na GluN marker. Ang mga cell na tulad ng choroid plexus ay nakilala sa pamamagitan ng pagpapahayag ng TTR, at ang mga meningeal-like na mga cell ay nagpahayag ng mga gene na nauugnay sa fibroblast at naka-map na mga pial/vascular cells ng reference data set.
Ang pagkakaiba-iba ng pagsusuri ng expression ng gene sa pagitan ng t-hCO at hCO subclass ay isinagawa gamit ang isang bagong binuo na pseudo-batch na pamamaraan na muling ginawa sa mga sample na ipinatupad gamit ang Libra R package (bersyon 1.0.0). Sa partikular, ang mga pagsubok sa posibilidad ng log ng edgeR (bersyon 3.36.0, package R) ay isinagawa para sa mga grupo sa pamamagitan ng pagbubuod ng bilang ng mga gene sa mga cell para sa isang naibigay na klase ng cell para sa bawat sample na pagtitiklop. Para sa visualization ng heatmap, ang mga halaga ng normalized per million (CPM) ay kinukuwenta gamit ang edgeR (cpm() function) at naka-scale (upang makamit ang mean = 0, standard deviation = 1). Ang Gene Ontology (GO) na pagsusuri sa pagpapayaman ng mga makabuluhang na-upregulated na t-hCO GluN na mga gene ay isinagawa (Benjamini-Hochberg ay naitama ang halaga ng P na mas mababa sa 0.05 na ipinahayag sa hindi bababa sa 10% ng mga t-hCO GluN na mga cell at isang tiklop na pagtaas sa pagbabago ng hindi bababa sa 2 beses). ginanap gamit ang ToppGene Suite (https://toppgene.cchmc.org/)37. Ginagamit namin ang ToppFun app na may mga default na parameter at nag-uulat ng Benjamini-Hochberg-corrected P-values ​​​​na kinakalkula mula sa GO-annotated hypergeometric tests.
Upang itugma ang aming mga snRNA-seq cluster na may annotated na mga cell cluster mula sa mga reference na pag-aaral ng pangunahing single-cell RNA-seq o adult na snRNA-seq19,20,21,22, naglapat kami ng isang nakapares na diskarte sa pagsasama ng dataset. Ginamit namin ang SCTransform (v2) normalization workflow sa Seurat para pagsamahin at paghambingin ang mga cluster overlap sa pagitan ng mga dataset (gamit ang parehong mga parameter tulad ng nasa itaas). Ang mga indibidwal na dataset ay random na na-subset hanggang sa 500 mga cell o mga core bawat orihinal na cluster para sa kahusayan sa pag-compute. Gamit ang isang katulad na diskarte tulad ng inilarawan dati, ang cluster overlap ay tinukoy bilang ang proporsyon ng mga cell o nuclei sa bawat pooled cluster na nag-overlap sa label ng reference cluster. Upang higit pang pag-uri-uriin ang mga GluN, ginamit namin ang Seurat's TransferData workflow para sa GluN subset data upang magtalaga ng mga reference na label ng dataset sa aming mga GluN cells.
Upang masuri ang katayuan ng pagkahinog ng pandaigdigang transcriptome ng t-hCO at hCO sample, inihambing namin ang aming mga pseudo-bulk na sample sa BrainSpan/psychENCODE23, na binubuo ng isang malaking pagkakasunud-sunod ng RNA na sumasaklaw sa pag-unlad ng utak ng tao. Ginawa namin ang PCA sa isang pinagsamang pattern-normalized na gene expression matrix mula sa mga cortical sample 10 linggo pagkatapos ng paglilihi at sa ibang pagkakataon, sa 5567 genes (kasama ang aming data) na dati nang nakilala bilang aktibo sa BrainSpan cortical samples (tinukoy bilang higit sa 50% sa developmental variance na ipinaliwanag ng edad gamit ang isang cubic model)38. Bilang karagdagan, nakuha namin ang mga gene na nauugnay sa mga pangunahing transcriptome signature ng neurodevelopment gamit ang non-negative matrix factorization tulad ng naunang inilarawan. Ang mga sample na timbang na kinakalkula gamit ang non-negative matrix factorization procedure ay naka-plot sa Fig. 5b na may pinalawak na data para sa bawat isa sa limang lagda na inilarawan ni Zhu et al.38. Muli, ang mga transcriptional marker na umaasa sa aktibidad ay nagmula sa mga naunang nai-publish na pag-aaral. Sa partikular, ang ERG at LRG ay makabuluhang na-upregulated sa mga glutamatergic neuron na kinilala ng koleksyon ng mouse visual cortex snRNA-seq pagkatapos ng visual stimulation mula sa Supplement Table 3 Hrvatin et al.16. Ang mga LRG na pinayaman ng tao ay nakuha mula sa KCl-activated human fetal brain culture at ani ng 6 na oras na post-stimulation, at ang mga na-filter na gen ay makabuluhang na-upregulated sa mga tao ngunit hindi sa mga rodent (Karagdagang Talahanayan 4). Ang pagsusuri ng gene set enrichment gamit ang mga gene set na ito ay isinagawa gamit ang one-way na eksaktong pagsubok ni Fisher.
I-anesthetize ang mga daga gamit ang isoflurane, alisin ang mga utak at ilagay sa malamig (humigit-kumulang 4°C) oxygenated (95% O2 at 5% CO2) sucrose solution para sa mga seksyon na naglalaman ng: 234 mM sucrose, 11 mM glucose, 26 mM NaHCO3, 2.5 mM KCl, 1.25 mM. NaH2PO4, 10 mM MgSO4 at 0.5 mM CaCl2 (mga 310 mOsm). Ang mga seksyon ng coronal ng utak ng daga (300–400 µm) na naglalaman ng t-hCO ay ginawa gamit ang isang Leica VT1200 vibratome tulad ng inilarawan dati39. Pagkatapos ay inilipat ang mga seksyon sa isang sectioning chamber na may tuluy-tuloy na room temperature oxygenation na naglalaman ng aCSF na inihanda mula sa: 10 mM glucose, 26 mM NaHCO3, 2.5 mM KCl, 1.25 mM NaHPO4, 1 mM MgSO4, 2 mM CaCl2 at 126 mM NaCl (298 mO). hindi bababa sa 45 minuto bago ang pag-record. Ang mga seksyon ay naitala sa isang immersed chamber kung saan sila ay patuloy na pinahiran ng aCSF (95% O2 at 5% CO2 vial). Ang lahat ng data ay naitala sa temperatura ng silid. Ang mga t-hCO neuron ay tinapos ng isang borosilicate glass pipette na puno ng isang solusyon na naglalaman ng 127 mM potassium gluconate, 8 mM NaCl, 4 mM magnesium ATP, 0.3 mM sodium GTP, 10 mM HEPES, at 0.6 mM EGTA, pH 7.2, panloob na solusyon na nababagay sa KOH (m290). Upang mabawi, ang biocytin (0.2%) ay idinagdag sa solusyon sa pag-record.
Ang data ay nakuha gamit ang isang MultiClamp 700B amplifier (Molecular Devices) at isang Digidata 1550B digitizer (Molecular Devices), low-pass na na-filter sa 2 kHz, na-digitize sa 20 kHz, at nasuri gamit ang Clampfit (Molecular Devices), Origin (OriginPro). 2021b, OriginLab). at mga custom na function ng MATLAB (Mathworks). Ang potensyal ng junction ay kinakalkula gamit ang JPCalc at ang mga entry ay nababagay sa kinakalkula na halaga ng -14 mV. Ang Operation IV ay binubuo ng isang serye ng mga kasalukuyang hakbang sa 10-25 pA na hakbang, mula -250 hanggang 750 pA.
Ang thalamus, white matter, at S1 afferent ay pinasigla ng elektrikal sa mga thalamocortical slice sa panahon ng pag-record ng patch-clamp ng mga hCO neuron, tulad ng inilarawan dati. Sa madaling sabi, ang utak ay inilagay sa isang 3D printing table na nakatagilid sa 10° anggulo, at ang harap ng utak ay pinutol sa isang 35° na anggulo. Ang utak ay pagkatapos ay nakadikit sa ibabaw ng hiwa at pinaghiwa-hiwalay, pinapanatili ang mga thalamocortical na nakausli na mga axon. Ang mga bipolar tungsten electrodes (0.5 MΩ) ay naka-mount sa isang pangalawang micromanipulator at madiskarteng nakaposisyon upang pasiglahin ang apat na rehiyon bawat cell (inner capsule, white matter, S1 at hCO). Magtala ng mga synaptic na tugon pagkatapos ng 300 µA phasic stimulation sa 0.03–0.1 Hz.
Ang hChR2-expressing hCO neurons ay isinaaktibo sa 480 nm at ang mga light pulse na nabuo ng isang LED (Prizmatix) ay inilapat sa pamamagitan ng isang × 40 na layunin (0.9 NA; Olympus) upang maitala ang expression ng hChR2 malapit sa mga cell. Ang diameter ng iluminado na field ay humigit-kumulang 0.5 mm at ang kabuuang kapangyarihan ay 10-20 mW. Ang lapad ng pulso ay itinakda sa 10 ms, na tumutugma sa pulso na ibinigay sa panahon ng eksperimento sa pag-aaral ng asal. Iba't ibang mga frequency ng pagpapasigla ang ginamit, mula 1 hanggang 20 Hz, ngunit ang unang pulso lamang ng serye ang ginamit para sa dami. Ang mga agwat sa pagitan ng mga tren ay karaniwang mas mahaba sa 30 s upang mabawasan ang epekto sa synaptic inhibitory o facilitating pathways. Upang subukan kung ang tugon ng hChR2 ay monosynaptic, inilapat namin ang TTX (1 μM) sa paliguan hanggang sa mawala ang reaksyon ng EPSC, at pagkatapos ay inilapat ang 4-aminopyridine (4-AP; 100 μM). Karaniwan, ibinabalik ang isang tugon sa loob ng ilang minuto, na may bahagyang mas mahabang pagkaantala sa pagitan ng pagpapaputok ng LED at pagbuo ng EPSC. Ang NBQX (10 μM) ay ginamit upang subukan kung ang tugon ay hinihimok ng mga receptor ng AMPA.
Ang mga matulis na seksyon ng hCO ay nilikha tulad ng inilarawan dati. Sa madaling sabi, ang mga seksyon ng hCO ay naka-embed sa 4% agarose at inilipat sa mga cell na naglalaman ng 126 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM NaH2PO4, 1 mM MgSO4, 2 mM CaCl2, 26 mM NaHCO3 at 10 mM d-(+) -0glucose sa Seksyon 0 - 0-glucose. µm sa room temperature gamit ang Leica VT1200 vibrator at nakaimbak sa ASF sa room temperature. Pagkatapos, ang pag-record ng patch-camp ng buong mga cell ay isinagawa sa mga seksyon ng hCO sa ilalim ng isang direktang SliceScope mikroskopyo (Scientifica). Ang mga seksyon ay pinahiran ng aCSF (95% O2 at 5% CO2) at ang mga signal ng cell ay naitala sa temperatura ng silid. Ang mga hCO neuron ay inilapat gamit ang isang borosilicate glass pipette na puno ng solusyon na naglalaman ng 127 mM potassium gluconate, 8 mM NaCl, 4 mM magnesium ATP, 0.3 mM sodium GTP, 10 mM HEPES, at 0.6 mM EGTA, panloob na pH 7, 2, na nababagay sa KOH (osmolarity). Para sa mga layunin ng pagbawi, magdagdag ng 0.2% Biocytin sa panloob na solusyon.
Ang data ay nakuha ng Clampex (Clampex 11.1, Molecular Devices) gamit ang isang MultiClamp 700B amplifier (Molecular Devices) at isang Digidata 1550B digitizer (Molecular Devices), low-pass na na-filter sa 2 kHz, na-digitize sa 20 kHz, at nasuri gamit ang Clampfit (bersyon 10 at analysis ng MAT) na mga device. (MATLAB 2019b, Mathworks). Ang potensyal ng junction ay kinakalkula gamit ang JPCalc at ang mga entry ay nababagay sa kinakalkula na potensyal na junction ng -14 mV. Ang Operation IV ay binubuo ng isang serye ng mga kasalukuyang hakbang sa 5-10 pA na hakbang mula -50 hanggang 250 pA.
Para sa morphological reconstruction ng pinched neurons, 0.2% biocytin (Sigma-Aldrich) ay idinagdag sa panloob na solusyon. Ang mga cell ay primed nang hindi bababa sa 15 minuto pagkatapos ng pag-hack. Ang pipette ay pagkatapos ay dahan-dahang iginuhit sa loob ng 1-2 min hanggang ang rehistradong lamad ay ganap na natatakan. Kasunod ng pamamaraan ng pisyolohiya ng seksyon, ang mga seksyon ay inayos nang magdamag sa 4° C. sa 4% PFA, hinugasan ng PBS X3, at diluted ang 1:1000 gamit ang streptavidin-conjugated DyLight 549 o DyLight 405 (Vector Labs). Ang mga cell na puno ng biocytin (2%; Sigma-Aldrich) ay may label sa panahon ng pag-record ng patch clamp sa temperatura ng silid sa loob ng 2 oras. Ang mga seksyon ay pagkatapos ay naka-mount sa mga slide ng mikroskopya gamit ang isang Aquamount (Thermo Scientific) at na-visualize sa susunod na araw sa isang Leica TCS SP8 confocal microscope gamit ang layunin ng oil immersion na may numerical aperture ×40 1.3, magnification ×0.9–1.0, xy. Ang sampling rate ay humigit-kumulang 7 pixels bawat micron. Ang mga Z-stack sa 1 µm na pagitan ay nakuha nang sunud-sunod, at ang z-stack mosaic at Leica-based na auto-stitching ay isinagawa upang masakop ang buong dendritic tree ng bawat neuron. Ang mga neuron ay sinusubaybayan nang semi-manual gamit ang neuTube 40 interface at nabuo ang mga SWC file. Ang mga file ay pagkatapos ay na-upload sa SimpleNeuriteTracer41 Fiji plugin (ImageJ, bersyon 2.1.0; NIH).
Ang cortical tissue ng tao ay nakuha nang may kaalamang pahintulot ayon sa isang protocol na inaprubahan ng Institutional Review Board ng Stanford University. Dalawang sample ng human postpartum tissue (3 at 18 taong gulang) ay nakuha sa pamamagitan ng pagputol ng frontal cortex (middle frontal gyrus) bilang bahagi ng operasyon para sa refractory epilepsy. Pagkatapos ng resection, anihin ang tissue sa malamig na yelo na NMDG-aCSF na naglalaman ng: 92 mM NMDG, 2.5 mM KCl, 1.25 mM NaH2PO4, 30 mM NaHCO3, 20 mM HEPES, 25 mM glukos, 2 mM thiourea, 2 mM thiourea, 5 mM thiourea. 0.5 mM CaCl2 4H2O at 10 mM MgSO4 7H2O. Titrate sa pH 7.3-7.4 na may concentrated hydrochloric acid. Ang mga tisyu ay inihatid sa laboratoryo sa loob ng 30 minuto at ang mga seksyon ng korona ay kinuha ayon sa pamamaraang inilarawan sa itaas.
Ang lahat ng mga pamamaraan ng hayop ay isinagawa alinsunod sa mga alituntunin sa pangangalaga ng hayop na inaprubahan ng Stanford University APLAC. Ang mga daga (higit sa 140 araw pagkatapos ng paglipat) ay na-induce ng 5% isoflurane anesthesia at na-anesthetize gamit ang 1-3% isoflurane intraoperatively. Ang mga hayop ay inilagay sa isang stereotaxic frame (Kopf) at ang sustained release buprenorphine (SR) ay iniksyon nang subcutaneously. Ang bungo ay nakalantad, nililinis at ang 3-5 bone screws ay ipinasok. Upang i-target ang t-hCO, nakabuo kami ng mga stereotaxic na coordinate mula sa mga imahe ng MRI. Ang isang burr hole ay na-drill sa lugar ng interes at ang mga hibla (400 µm diameter, NA 0.48, Doric) ay ibinaba ng 100 µm sa ibaba ng hCO surface at sinigurado sa bungo na may UV-curable dental cement (Relyx).
Ang mga pag-record ng fiber photometric ay isinagawa tulad ng naunang inilarawan42. Upang maitala ang kusang aktibidad, ang mga daga ay inilagay sa isang malinis na hawla at isang 400 µm diameter fiber optic patch cable (Doric) na konektado sa isang fiber optic photometric data acquisition system ay konektado sa itinanim na fiber optic cable. Sa loob ng 10 minutong pag-record ng aktibidad ng motor, ang mga hayop ay libre upang galugarin ang hawla. Upang maitala ang napukaw na aktibidad, ang mga daga (higit sa 140 araw pagkatapos ng paglipat) ay na-anesthetize ng 5% isoflurane para sa induction at 1-3% isoflurane para sa pagpapanatili. Ilagay ang hayop sa isang stereotactic frame (Kopf) at ang mga whisker sa tapat ng t-hCO ay pinuputol sa halos 2 cm at dumaan sa isang mesh na konektado sa isang piezoelectric actuator (PI). Ang isang 400 µm fiber optic patch cable (Doric) ay konektado sa implanted fiber at konektado sa data acquisition system. Ang mga whisker sa kabaligtaran ng t-hCO ay pinalihis ng 50 beses (2 mm sa 20 Hz, 2 s bawat presentasyon) sa mga random na oras ng isang piezoelectric drive sa loob ng 20 minutong panahon ng pag-record. Gamitin ang Arduino MATLAB Support Package para kontrolin ang oras ng pagpapalihis gamit ang custom na MATLAB code. Ang mga kaganapan ay naka-synchronize sa data acquisition software gamit ang transistor-transistor logic (TTL) pulses.
Ang mga daga (higit sa 140 araw pagkatapos ng paglipat) ay na-induce ng 5% isoflurane anesthesia at na-anesthetize gamit ang 1-3% isoflurane intraoperatively. Ang mga hayop ay inilagay sa isang stereotaxic frame (Kopf) at ang buprenorphine SR at dexamethasone ay iniksyon nang subcutaneously. Ang bungo ay nakalantad, nililinis at ang 3-5 bone screws ay ipinasok. Upang i-target ang t-hCO, nakabuo kami ng mga stereotaxic na coordinate mula sa mga imahe ng MRI. Ang isang pabilog na craniotomy (humigit-kumulang 1 cm ang lapad) ay isinagawa gamit ang isang high speed drill nang direkta sa ibabaw ng transplanted hCO. Kapag ang buto ay kasing manipis hangga't maaari, ngunit bago mag-drill sa buong buto, gumamit ng mga forceps upang alisin ang natitirang buo na pelvic disc upang ipakita ang pinagbabatayan ng t-hCO. Ang craniotomy ay napuno ng sterile saline, at isang coverslip at isang espesyal na head pin ay nakakabit sa bungo na may UV-cured dental cement (Relyx).
Ang dalawang-photon imaging ay isinagawa gamit ang isang Bruker multiphoton microscope na may layunin ng Nikon LWD (× 16, 0.8 NA). Ang GCaMP6 imaging ay isinagawa sa 920 nm na may 1.4x solong z-plane magnification at 8x average ng 7.5 fps. Ang mga daga ay na-induce ng 5% isoflurane anesthesia at pinananatili ng 1-3% isoflurane. Ang mga daga ay inilagay sa isang custom made head fixture at nakaposisyon sa ilalim ng lens. Nakuha ang 3 minutong background recording ng aktibidad ng motor. Sa paglipas ng 20 minuto ng pag-record, 50 puffs (bawat presentasyon ay 100 ms ang haba) ay random na inihatid sa whisker pad sa tapat ng t-hCO gamit ang isang picospricer. Gamitin ang Arduino MATLAB Support Package para kontrolin ang burst time gamit ang custom na MATLAB code. I-synchronize ang mga event sa data acquisition software (PrairieView 5.5) gamit ang TTL pulses. Para sa pagsusuri, ang mga imahe ay naitama para sa xy motion gamit ang affine correction sa MoCo program na inilunsad sa Fiji. Pagkuha ng mga fluorescent na bakas mula sa mga indibidwal na cell gamit ang CNMF-E43. Ang fluorescence ay nakuha para sa bawat rehiyon ng interes, na-convert sa dF/F curves, at pagkatapos ay na-convert sa z-scores.
Ang mga daga (higit sa 140 araw pagkatapos ng paglipat) ay na-induce ng 5% isoflurane anesthesia at na-anesthetize gamit ang 1-3% isoflurane intraoperatively. Ang mga hayop ay inilagay sa isang stereotaxic frame (Kopf) at ang buprenorphine SR at dexamethasone ay iniksyon nang subcutaneously. Ang mga whisker sa tapat ng t-hCO ay pinutol sa halos 2 cm at sinulid sa isang mesh na konektado sa isang piezoelectric actuator. Ang bungo ay nakalantad at nalinis. Ang isang hindi kinakalawang na asero na ground screw ay nakakabit sa bungo. Upang i-target ang t-hCO, nakabuo kami ng mga stereotaxic na coordinate mula sa mga imahe ng MRI. Magsagawa ng circular craniotomy (humigit-kumulang 1 cm ang lapad) na may high speed drill sa itaas lamang ng t-hCO. Kapag ang buto ay kasing manipis hangga't maaari, ngunit bago mag-drill sa buong buto, gumamit ng mga forceps upang alisin ang natitirang buo na pelvic disc upang ipakita ang pinagbabatayan ng t-hCO. Ang mga indibidwal na cell ay naitala gamit ang 32-channel o 64-channel na high-density silicon probes (Cambridge Neurotech) na pinagbabatayan sa mga ground screw at na-pre-amplified gamit ang RHD amplifier (Intan). Gamitin ang manipulator upang ibaba ang mga electrodes sa target na lugar sa pamamagitan ng craniotomy, na puno ng sterile saline. Ang pagkolekta ng data ay isinagawa sa dalas na 30 kHz gamit ang Open Ephys data acquisition system. Ang pag-record ay nagpatuloy lamang kapag nakita namin ang mataas na nakakaugnay na ritmikong kusang aktibidad sa higit sa 10 mga channel, na nagmumungkahi na ang mga electrodes ay matatagpuan sa graft (batay sa data ng two-photon calcium imaging). Ang isang 10 minutong pag-record sa background ng aktibidad ng motor ay nakuha. Ang mga whisker sa kabaligtaran ng t-hCO ay pinalihis ng 50 beses (2 mm sa 20 Hz, 2 s bawat presentasyon) sa mga random na oras ng isang piezoelectric drive sa loob ng 20 minutong panahon ng pag-record. Gamit ang MATLAB Support Package para sa Arduino (MATLAB 2019b), kontrolin ang oras ng pagpapalihis gamit ang custom na MATLAB code. Gumamit ng TTL pulses para i-synchronize ang mga event sa data acquisition software.
Para sa mga eksperimento sa optical marking, isang 200 µm optical patch cord (Doric) na konektado sa isang 473 nm laser (Omicron) ay konektado sa isang 200 µm optical fiber na inilagay sa ibabaw ng craniotomy. Kaagad bago ito, ayusin ang kapangyarihan ng jumper sa 20 mW. Gamitin ang manipulator upang ibaba ang mga electrodes sa target na lugar sa pamamagitan ng craniotomy, na puno ng sterile saline. Sa simula ng pag-record, sampung pulso ng liwanag na 473 nm (dalas 2 Hz, tagal ng pulso 10 ms) ay inilabas. Ang mga photosensitive na cell ay tinukoy bilang mga cell na nagpakita ng spike na tugon sa loob ng 10 ms ng liwanag sa 70% o higit pa sa mga pagsubok.