Hvala, ker ste obiskali Nature.com. Uporabljate različico brskalnika z omejeno podporo za CSS. Za najboljšo izkušnjo priporočamo uporabo posodobljenega brskalnika (ali onemogočanje načina združljivosti v Internet Explorerju). Poleg tega za zagotovitev stalne podpore spletno mesto prikazujemo brez slogov in JavaScripta.
Prikaže vrtiljak treh diapozitivov hkrati. Za premikanje med tremi diapozitivi hkrati uporabite gumba Prejšnji in Naslednji ali pa drsnike na koncu za premikanje med tremi diapozitivi hkrati.
Samosestavljajoči se nevronski organeli predstavljajo obetavno in vitro platformo za modeliranje človeškega razvoja in bolezni. Vendar pa organoidom manjka povezljivost, ki obstaja in vivo, kar omejuje zorenje in preprečuje integracijo z drugimi vezji, ki nadzorujejo vedenje. Tukaj prikazujemo, da kortikalni organoidi, pridobljeni iz človeških matičnih celic, presajeni v somatosenzorično skorjo novorojenih golih podgan, razvijejo zrele celične tipe, ki se integrirajo v senzorična in motivacijska vezja. Magnetna resonanca (MRI) je pokazala rast organoidov po presaditvi v več linijah matičnih celic in pri živalih, medtem ko je analiza enega jedra pokazala napredovanje kortikogeneze in nastanek transkripcijskega programa, odvisnega od aktivnosti. Presajeni kortikalni nevroni kažejo bolj kompleksne morfološke, sinaptične in notranje membranske lastnosti kot njihovi in ​​vitro ustrezniki, kar omogoča odkrivanje nevronskih okvar pri bolnikih s Timotejevim sindromom. Anatomsko in funkcionalno sledenje je pokazalo, da presajeni organeli prejemajo talamokortikalne in kortikokortikalne vhode, in vivo posnetki nevronske aktivnosti pa kažejo, da lahko ti vhodi ustvarijo senzorične odzive v človeških celicah. Končno, kortikalni organoidi raztezajo aksone po možganih podgan, njihova optogenetska aktivacija pa vodi do vedenja, ki išče nagrado. Tako presajeni nevroni človeške skorje dozorijo in sodelujejo v gostiteljskih vezjih, ki nadzorujejo vedenje. Pričakujemo, da bo ta pristop olajšal odkrivanje fenotipov na ravni verig v celicah, pridobljenih od pacienta, ki jih ni mogoče odkriti z drugimi sredstvi.
Razvijajoči se človeški možgani so izjemen samoorganizirajoči se proces, v katerem se celice razmnožujejo, diferencirajo, migrirajo in povezujejo, da tvorijo funkcionalna nevronska vezja, ki se s senzoričnimi izkušnjami dodatno izpopolnjujejo. Ključni problem pri razumevanju razvoja človeških možganov, zlasti v kontekstu bolezni, je pomanjkanje dostopa do možganskega tkiva. Samoorganizirajoče se organele, vključno z organoidi človeške skorje (hCO; znane tudi kot sfera človeške skorje), lahko ustvarijo 2, 3, 4, 5, 6. Vendar pa več omejitev omejuje njihovo širšo uporabo na razumevanje razvoja in delovanja nevronskih vezij. Zlasti ni jasno, ali je zorenje hCO omejeno z odsotnostjo določenih mikrookoljskih in senzoričnih vhodov, ki so prisotni in vivo. Poleg tega je njihova uporabnost pri modeliranju genetsko kompleksnih in vedenjskih nevropsihiatričnih motenj trenutno omejena, ker hCO niso integrirani v vezja, ki lahko ustvarjajo vedenjske izide.
Presaditev hCO v nepoškodovane žive možgane lahko premaga te omejitve. Prejšnje študije so pokazale, da so človeški nevroni, presajeni v skorjo glodalcev, sposobni preživeti, projicirati in komunicirati z glodalskimi celicami7,8,9,10,11,12. Vendar pa se ti poskusi običajno izvajajo na odraslih živalih, kar lahko omeji sinaptično in aksonsko integracijo. Tukaj opisujemo paradigmo presaditve, v kateri smo 3D hCO, pridobljen iz celic hiPS, presadili v primarno somatosenzorično skorjo (S1) imunsko pomanjkljivih podgan v zgodnji fazi plastičnega razvoja. Presajeni nevroni hCO (t-hCO) doživijo znatno dozorevanje, prejemajo talamokortikalne in kortikalno-kortikalne vhode, ki izzovejo senzorične odzive, in razširjajo aksonske projekcije v možgane podgan, da spodbujajo vedenje iskanja nagrade. Podaljšano zorenje t-hCO je razkrilo nevronske okvare pri bolnikih s Timotejevim sindromom (TS), hudo genetsko motnjo, ki jo povzročajo mutacije v napetostno občutljivem kalcijevem kanalu CaV1.2 tipa L (kodira ga CACNA1C).
Za preučevanje človeških kortikalnih nevronov v vezjih in vivo smo stereotaktično presadili intaktni 3D hCO v S1 zgodnjih postnatalnih atimičnih podgan (3.–7. dan po rojstvu) (slika 1a in razširjeni podatki na slikah 1a–c). Na tej točki talamokortikalne in kortikokortikalne aksonske projekcije še niso zaključile svoje inervacije S1 (sklic 13). Zato je ta pristop zasnovan tako, da maksimizira integracijo t-hCO in hkrati zmanjša vpliv na endogena vezja. Za vizualizacijo lokacije t-hCO pri živih živalih smo izvedli T2-utežene MRI rekonstrukcije možganov podgan 2–3 mesece po presaditvi (slika 1b in razširjeni podatki, slika 1d). t-hCO2 so bili zlahka opazni, meritve volumna t-hCO2 pa so bile podobne tistim, izračunanim iz fiksnih rezin (razširjeni podatki, slika 1d,e; P > 0,05). t-hCO2 so bili zlahka opazni, meritve volumna t-hCO2 pa so bile podobne tistim, izračunanim iz fiksnih rezin (razširjeni podatki, slika 1d,e; P > 0,05). t-hCO so bile zlahka opazne, prostorninske meritve t-hCO so bile enako izračunane za fiksirane reze (razširjeni podatki, slika 1d, e; P> 0,05). t-hCO2 so bile zlahka opazne, volumetrične meritve t-hCO2 pa so bile podobne tistim, izračunanim za fiksne odseke (razširjeni podatki, slika 1d, e; P > 0,05).很容易观察到t-hCO，并且t-hCO的体积测量值与从固定切片计算的测量值相似（扩展数据图1d、e；P > 0,05）。很容易观察到t-hCO，并且t-hCO t-hCO se je zlahka opazil, vsebne meritve t-hCO pa so bile enako izračunane za fiksirane reze (razširjeni podatki, slika 1d, e; P> 0,05). t-hCO je bil zlahka opazen, volumetrične meritve t-hCO pa so bile podobne tistim, izračunanim za fiksne odseke (razširjeni podatki, slika 1d, e; P > 0,05).Približno 2 meseca po presaditvi smo t-hCO2 določili pri 81 % presajenih živali (n = 72 živali; hCO2 iz 10 celičnih linij hiPS; celične linije hiPS v dodatni tabeli 1). Od teh se jih je 87 % nahajalo v možganski skorji (slika 1c). Z izvedbo serijskih MRI posnetkov v več časovnih točkah pri isti presajeni podgani smo ugotovili devetkratno povečanje volumna t-hCO2 v 3 mesecih (slika 1d in razširjeni podatki, slika 1f). Presajene živali so imele visoko stopnjo preživetja (74 %) 12 mesecev po presaditvi (razširjeni podatki, slika 1g in dodatna tabela 2) in niso bile ugotovljene nobene očitne motorične ali spominske okvare, glioze ali elektroencefalograma (EEG). Podatki (slika 1g in dodatna tabela 2). 1h–m in 3e).
a, Shema eksperimentalne zasnove. hCO2, pridobljen iz celic hiPS, je bil presajen v S1 novorojenih golih podgan v 30.–60. dnevu diferenciacije. b, T2-utežene koronalne in horizontalne MRI slike, ki prikazujejo t-hCO2 v S1 2 meseca po presaditvi. Merilna črta, 2 mm. c, Kvantifikacija stopenj uspešnosti presadka, prikazana za vsako celično linijo hiPS (n = 108, številke znotraj stolpcev označujejo količino t-hCO2 na celično linijo hIPS) in kortikalno ali subkortikalno lokacijo (n = 88). d, MRI slika koronarne arterije (levo; merilna črta, 3 mm) in ustrezna 3D volumetrična rekonstrukcija (merilna črta, 3 mm), ki kaže povečanje t-hCO2 v 3 mesecih. e, Pregled vzorcev t-hCO2 v možganski skorji podgan. Merilna črta, 1 mm. f, Reprezentativne imunocitokemične slike t-hCO, prikazane od zgoraj leve proti desni (med diferenciacijo): PPP1R17 (star 4 mesece), NeuN (star 8 mesecev), SOX9 in GFAP (star 8 mesecev), PDGFRα; (8 mesecev), MAP2 (8 mesecev) in IBA1 (8 mesecev). Merilna črta, 20 µm. Sočasna ekspresija HNA označuje celice človeškega izvora. g, snRNA-seq: Slikanje z zmanjšanjem dimenzionalnosti poenotene mnogoterosti in projekcije (UMAP) vseh visokokakovostnih jeder t-hCO po Seuratovi integraciji (n=3 vzorci t-hCO, n=2 celični liniji hiPS). Astrociti, celice astrocitne linije; cyc prog, krožeči progenitorji; GluN DL, globoki glutamatergični nevroni; GluN DL/SP, globoki in sublamelarni glutamatergični nevroni; GluN UL, glutamatergični nevroni zgornje plasti; oligodendrociti, oligodendrociti; OPC, oligodendrocitne progenitorske celice; RELN, reelin nevroni. h, Analiza obogatitve z gensko ontologijo (GO) genov, ki so bili v glutamatergičnih nevronih t-hCO2 znatno povečani (prilagojen P <0,05, kratna sprememba > 2, izraženo v vsaj 10 % jeder) v primerjavi z glutamatergičnimi nevroni hCO2. h, Analiza obogatitve z gensko ontologijo (GO) genov, ki so bili v glutamatergičnih nevronih t-hCO2 znatno povečani (prilagojen P <0,05, kratna sprememba > 2, izraženo v vsaj 10 % jeder) v primerjavi z glutamatergičnimi nevroni hCO2. h, obogateni izrazi genske ontologije (GO) za genove z visoko aktivacijo (popravljen P <0,05, analiza kratnosti > 2, ekspresija v skrajni meri v 10 % jedra) v glutamatergenskih nevronih t-hCO v primerjavi z glutamatergenskimi nevroni hCO. h, Analiza obogatitve z gensko ontologijo (GO) za gene s pomembno aktivacijo (prilagojen P <0,05, sprememba krat >2, izražanje v vsaj 10 % jeder) v glutamatergičnih nevronih t-hCO v primerjavi z glutamatergičnimi nevroni hCO. h，与hCO 谷氨酸能神经元相比，t-hCO 谷氨酸能神经元中基因显着上调（调整后P < 0,05，倍数变化> 2，在至少10 % 的细胞核中表达＾）的基因本体论(GO) 术语富集分析。 h ， 与 hco 谷氨酸 能 元 相比 ， t-hco 谷氨酸 能 神经 元 基因 显着 上调 （后 后 p <0,05 ，变化 变化> 2 ， 至少 10 % 的 核中 表达） 基因 基因 基因 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的的 的 的 的本体论(GO) 术语富集分析。 h, geni so bili močno aktivirani (popravljen P <0,05, kratnost spremembe> 2, ekstremno ekspresirano v meritvi 10% jedra) v glutamatergenskih nevronih t-hCO v primerjavi z glutamatergenimi nevroni hCO Ontološka (GO) analiza termina obogatitev. h, geni so bili v glutamatergičnih nevronih t-hCO znatno povečani (prilagojen P < 0,05, kratna sprememba > 2, izraženi v vsaj 10 % jeder) v primerjavi z glutamatergičnimi nevroni hCO Ontološka (GO) analiza obogatitvenega izraza.Črtkana črta označuje vrednost aq 0,05. i, UMAP slikanje tipov celic GluN v t-hCO2 z uporabo prenosa oznak iz referenčnega nabora podatkov 22 snRNA-seq odrasle motorične skorje. CT — kortikotalamične celice, ET — ekstracerebralne celice, IT — notranje telencefalne celice, NP — bližnja projekcija.
Nato smo ocenili citoarhitekturo in celotno celično sestavo t-hCO. Barvanje protiteles podganjih endotelijskih celic je razkrilo vaskularizacijo s t-hCO, medtem ko je barvanje z IBA1 razkrilo prisotnost podganjih mikroglij po celotnem presadku (slika 1f in razširjeni podatki, slika 3c,d). Imunobarvanje je razkrilo celice, pozitivne na človeški jedrski antigen (HNA), ki sočasno izražajo PPP1R17 (kortikalni progenitorji), NeuN (nevroni), SOX9 in GFAP (celice, pridobljene iz glije) ali PDGFRα (oligodendrocitne progenitorje) (slika 1f). Za preučevanje celične sestave t-hCO pri ločljivosti posameznih celic smo po približno 8 mesecih diferenciacije izvedli sekvenciranje enojedrne RNA (snRNA-seq). Z masno filtracijo in odstranitvijo podganjih jeder smo dobili 21.500 visokokakovostnih človeških mononuklearnih zemljevidov (slika 1g in razširjeni podatki, slika 4a,b). Vzorci izražanja tipičnih markerjev celičnega tipa so identificirali skupine glavnih razredov kortikalnih celic, vključno z globokimi in površinskimi glutamatergičnimi nevroni, progenitorji v krvnem obtoku, oligodendrociti in astrocitno linijo (slika 1g, razširjeni podatki, slika 4c in dodatna tabela 3). Imunsko barvanje za SATB2 in CTIP2 je pokazalo, da kljub prisotnosti kortikalnih podtipov t-hCO ni pokazal jasne anatomske stratifikacije (razširjeni podatki, slika 3a). Stadijsko usklajena snRNA-seq hCO je ustvarila v veliki meri podobne celične razrede, z nekaj izjemami, vključno z odsotnostjo oligodendrocitov in prisotnostjo GABAergičnih nevronov, kar lahko odraža prej opisane ugodne pogoje in vitro za lateralne progenitorske celice15 (razširjeni podatki, slika 4f-i in dodatna tabela 4). Analiza diferencialne genske ekspresije je pokazala pomembne razlike v glutamatergičnih nevronih med t-hCO in hCO (dodatna tabela 5), ​​vključno z aktivacijo nizov genov, povezanih z zorenjem nevronov, kot so sinaptična signalizacija, dendritična lokalizacija in napetostno odvisna aktivnost kanalov (slika 1h in dodatna tabela 5, tabela 6). V skladu s tem so kortikalni glutamatergični t-hCO nevroni pokazali pospešeno transkripcijsko zorenje.
Da bi razjasnili, ali so bile te transkripcijske spremembe v t-hCO povezane z morfološkimi razlikami med hCO in vitro in t-hCO in vivo, smo po 7–8 mesecih diferenciacije rekonstruirali stadijno usklajene z biocitinom napolnjene hCO in hCO v akutnih odsekih. hCO nevroni (slika 2a). t-hCO nevroni so bili bistveno večji, imeli so 1,5-krat večji premer some, dvakrat več dendritov in skupno šestkratno povečanje skupne dendritične dolžine v primerjavi z in vitro hCO (slika 2b). Poleg tega smo v t-hCO nevronih opazili bistveno večjo gostoto dendritičnih bodic kot v hCO nevronih (slika 2c). To kaže, da so t-hCO nevroni podvrženi obsežnemu dendritičnemu podaljševanju in razvejanju, kar lahko v kombinaciji z nadaljnjo proliferacijo celic prispeva k intenzivni rasti t-hCO po presaditvi (slika 1d in razširjeni podatki, slika 1f). To nas je spodbudilo k raziskavi elektrofizioloških lastnosti. Membranska kapacitivnost je bila osemkrat večja (razširjeni podatki, slika 8d), membranski potencial v mirovanju je bil bolj hiperpolariziran (približno 20 mV), injiciranje toka pa je povzročilo višjo največjo hitrost vzbujanja v t-hCO nevronih kot v hCO nevronih. in vitro (slika 2d), e), kar je skladno z večjimi in bolj kompleksnimi morfološkimi značilnostmi t-hCO. Poleg tega je bila pogostost spontanih ekscitatornih postsinaptičnih tokovnih dogodkov (EPSC) bistveno višja v t-hCO nevronih (slika 2f), kar kaže na to, da je bila povečana gostota dendritičnih bodic, opaženih v t-hCO nevronih, povezana s funkcionalno vzdražljivostjo. spolna sinapsa. Nezrel značaj hCO nevronov smo potrdili in vitro s snemanjem označenih glutamatergičnih nevronov (razširjeni podatki, slika 6a-c).
a, 3D rekonstrukcija nevronov hCO in t-hCO, napolnjenih z biocitinom, po 8 mesecih diferenciacije. b, Kvantifikacija morfoloških značilnosti (n = 8 hCO nevronov, n = 6 t-hCO nevronov; **P = 0,0084, *P = 0,0179 in ***P < 0,0001). b, Kvantifikacija morfoloških značilnosti (n = 8 hCO nevronov, n = 6 t-hCO nevronov; **P = 0,0084, *P = 0,0179 in ***P < 0,0001). b, količinska ocena morfoloških priznakov (n = 8 nevronov hCO, n = 6 nevronov t-hCO; ** P = 0,0084, * P = 0,0179 и *** P <0,0001). b, kvantifikacija morfoloških značilnosti (n=8 hCO nevronov, n=6 t-hCO nevronov; **P=0,0084, *P=0,0179 in ***P<0,0001). b，形态学特征的量化（n = 8 个hCO 神经元, n = 6 个t-hCO 神经元；**P = 0,0084，*P = 0,0179 和***P < 0,0001). b，形态学特征的量化（n = 8 个hCO 神经元, n = 6 个t-hCO 神经元；**P = 0,0084，*P = 0,0179 和***P < 0,0001). b, količinska ocena morfoloških priznakov (n = 8 nevronov hCO, n = 6 nevronov t-hCO; ** P = 0,0084, * P = 0,0179 и *** P <0,0001). b, kvantifikacija morfoloških značilnosti (n=8 hCO nevronov, n=6 t-hCO nevronov; **P=0,0084, *P=0,0179 in ***P<0,0001).c, 3D rekonstrukcija dendritičnih vej hCO in t-hCO po 8 mesecih diferenciacije. Rdeče zvezdice označujejo domnevne dendritične trne. Kvantifikacija gostote dendritičnih trnov (n = 8 hCO nevronov, n = 6 t-hCO nevronov; **P = 0,0092). d, Kvantifikacija mirujočega membranskega potenciala (n = 25 hCO nevronov, n = 16 t-hCO nevronov; ***P < 0,0001). d, Kvantifikacija mirujočega membranskega potenciala (n = 25 hCO nevronov, n = 16 t-hCO nevronov; ***P < 0,0001). d, količinska ocena membranskega potenciala pokoja (n = 25 nevronov hCO, n = 16 nevronov t-hCO; *** P <0,0001). d, kvantifikacija membranskega potenciala v mirovanju (n = 25 hCO nevronov, n = 16 t-hCO nevronov; ***P < 0,0001). d，静息膜电位的量化（n = 25 hCO 神经元，n = 16 t-hCO 神经元；***P < 0,0001）。 d，静息膜电位的量化（n = 25 hCO 神经元，n = 16 t-hCO 神经元；***P < 0,0001）。 d, količinska ocena membranskega potenciala pokoja (n = 25 nevronov hCO, n = 16 nevronov t-hCO; *** P <0,0001). d, kvantifikacija membranskega potenciala v mirovanju (n = 25 hCO nevronov, n = 16 t-hCO nevronov; ***P < 0,0001). e, Ponavljajoče se sprožitev akcijskega potenciala v hCO in t-hCO, povzročeno z naraščajočimi tokovnimi injekcijami, in kvantifikacija maksimalne hitrosti sprožitve (n = 25 hCO nevronov, n = 16 t-hCO nevronov; ***P < 0,0001). e, Ponavljajoče se sprožitev akcijskega potenciala v hCO in t-hCO, povzročeno z naraščajočimi tokovnimi injekcijami, in kvantifikacija maksimalne hitrosti sprožitve (n = 25 hCO nevronov, n = 16 t-hCO nevronov; ***P < 0,0001). e, ponavljajoče se potencialno delovanje v hCO in t-hCO, povišano povečanje toka, in količinska ocena največje hitrosti vzbujanja (n = 25 nevronov hCO, n = 16 nevronov t-hCO; *** P <0,0001). e, ponovno sprožitev akcijskega potenciala v hCO in t-hCO, povzročeno s povečanjem toka in kvantifikacijo največje hitrosti sprožitve (n = 25 hCO nevronov, n = 16 t-hCO nevronov; *** P < 0,0001). e，通过增加电流注入诱导的hCO 和t-hCO 重复动作电位放电，以及最大放电率的量化（n = 25个hCO 神经元，n = 16 个t-hCO 神经元；***P < 0,0001）。 E ， 通过 增加 电流 注入 的 的 hco 和 t-hco 重复 电位 放电 ， 以及 最 大 的 量化 （（n = 25个 hco 神经 ， n = 16 个 t-hco 神经 ； *** p <0,0001） 。 e, ponavljajoče se vnetje potenciala delovanja hCO in t-hCO, povečano povečanje oddanega toka, in količinska ocena največje hitrosti vnetja (n = 25 nevronov hCO, n = 16 nevronov t-hCO; *** P <0,0001). e, ponavljajoče se proženje akcijskih potencialov hCO in t-hCO, ki ga povzroča povečana dobava toka in kvantifikacija največje hitrosti proženja (n = 25 hCO nevronov, n = 16 t-hCO nevronov; *** P < 0,0001). f, Spontane EPSC (sEPSC) v hCO in t-hCO nevronih po 8 mesecih diferenciacije in kvantifikacija pogostosti sinaptičnih dogodkov (n = 25 hCO nevronov, n = 17 t-hCO nevronov; ***P < 0,0001). f, Spontane EPSC (sEPSC) v hCO in t-hCO nevronih po 8 mesecih diferenciacije in kvantifikacija pogostosti sinaptičnih dogodkov (n = 25 hCO nevronov, n = 17 t-hCO nevronov; ***P < 0,0001). f, spontani EPSC (sEPSC) v nevronih hCO in t-hCO v 8 mesecih diferenciacije in količinska ocena pogostosti sinaptičnih dogodkov (n = 25 nevronov hCO, n = 17 nevronov t-hCO; *** P <0,0001). f, Spontane EPSC (sEPSC) v hCO in t-hCO nevronih po 8 mesecih diferenciacije in kvantifikacije stopenj sinaptičnih dogodkov (n = 25 hCO nevronov, n = 17 t-hCO nevronov; ***P < 0,0001). f，分化8 个月时hCO 和t-hCO 神经元中的自发性EPSC (sEPSC)，以及突触事件频率的量化（n = 25 hCO神经元，n = 17 t-hCO 神经元；***P < 0,0001） . f，分化8 个月时hCO 和t-hCO 神经元中的自发性EPSC (sEPSC)，以及突触事件频率的量匼（n = 25 hCO神率的量匼（n = 25 hCO 神率的量匼（n = 25hCO P < 0,0001） . f, spontani EPSC (sEPSC) v nevronih hCO in t-hCO v 8 mesecih diferenciacije in količinska ocena pogostosti sinaptičnih dogodkov (n = 25 nevronov hCO, n = 17 nevronov t-hCO; *** P <0,0001). f, Spontane EPSC (sEPSC) v hCO in t-hCO nevronih po 8 mesecih diferenciacije in kvantifikacije stopenj sinaptičnih dogodkov (n = 25 hCO nevronov, n = 17 t-hCO nevronov; *** P <0,0001).Za bf sta bila hCO in t-hCO v liniji 1208-2 vzeta iz iste diferenciacijske serije, ki je bila vzdrževana vzporedno. g, Analiza obogatitve genskega nabora (enostranski Fisherjev natančen test) genov, ki so bili v glutamatergičnih nevronih t-hCO znatno povečano izraženi (prilagojen P < 0,05, kratna sprememba > 2, izraženo v vsaj 10 % jeder) v primerjavi z glutamatergičnimi nevroni hCO z genskimi nabori genov, odvisnih od aktivnosti zgodnjega odziva (ERG), in poznega odziva (LRG), identificiranih iz študije in vivo na miših16, in človeško specifičnimi LRG iz nevronov in vitro17. g, Analiza obogatitve genskega nabora (enostranski Fisherjev natančen test) genov, ki so bili v glutamatergičnih nevronih t-hCO znatno povečano izraženi (prilagojen P < 0,05, kratna sprememba > 2, izraženo v vsaj 10 % jeder) v primerjavi z glutamatergičnimi nevroni hCO z genskimi nabori genov, odvisnih od aktivnosti zgodnjega odziva (ERG), in poznega odziva (LRG), identificiranih iz študije in vivo na miših16, in človeško specifičnimi LRG iz nevronov in vitro17. g, analiza obogatitve nabora genov (odnostranski točni kriterij Fišera) genov z visoko aktivacijo (popravljen P <0,05, hitrost spremembe > 2, ekspresija z manjšo meritvijo v 10 % jedra) v glutamatergenskih nevronih t-hCO v primerjavi z glutamatergenskimi nevroni hCO nabor genov kot prejšnji (ERG), tako in poznejši (LRG) genov, zavisnih od aktivnosti, ugotovljenih v raziskavah na miših in vivo16, in specifičnih za človeka LRG iz nevronov in vitro17. g, analiza obogatitve genskega nabora (enostranski Fisherjev natančen test) genov s pomembno aktivacijo (prilagojen P <0,05, sprememba kratnosti >2, izražanje v vsaj 10 % jeder) v glutamatergičnih nevronih t-hCO v primerjavi z nabori glutamatergičnih nevronov hCO tako zgodnjih (ERG) kot poznih (LRG) genov, odvisnih od aktivnosti, identificiranih pri miših in vivo16 in človeško specifičnimi LRG iz nevronov in vitro17. g，t-hCO谷氨酸能神经元与hCO谷氨酸能神经元相比，t -hCO谷氨酸能神经元显着上调（调整后P<0,05，倍数变化>2，在至少10% 的细胞核中表达＾)的基因集富集分析（单侧F isher精确检验）从体内小鼠研究中鉴定的早期反应(ERG)和晚期反应(LRG) 活性依赖性基因的基因组16 和体外神经元17 中的人类特异性LRG。 g ， t-hco 谷氨酸 神经 元 与 hco 谷氨酸 神经 元 相比 ， t-hco 谷氨酸 神经 元 上调 （调整 后 p <0,05 ， 倍数> 2 ， 至少 至少 10 %的 细胞 核中 表达） 的 集富集 分析 （单侧 fisher 精确）)体内 小鼠 研究 中 的 早期 反应 反应 反应 和 晚期 反应 反应 (lrg) 活性 基因 的 基因组 16 和神经元 神经元 17 中 中 17 中 17的人类特异性LRG。 g, glutamatergenski nevroni t-hCO so bili znatno aktivirani v primerjavi z glutamaturgičnimi nevroni hCO (popravljen P<0,05, kratnost sprememb> 2, ne manj kot 10% Analiza obogatenega nabora genov (odnostranski točni Fišerov test) zgodnjega odgovora (ERG) in poznejših genov, odvisno od odgovora aktivnosti (LRG), identificiranih v raziskavah мышах in vivo16 и нейронах in vitro17, специфические для человека. g, t-hCO glutamatergični nevroni so bili v primerjavi z hCO glutamatergičnimi nevroni (prilagojen P < 0,05, kratna sprememba > 2, vsaj 10 % Analiza obogatitve genov zgodnjega odziva (ERG) in poznega odziva (enostranski Fisherjev natančen test) geni, odvisni od aktivnosti odziva (LRG), identificirani pri miših in vivo16 in nevronih in vitro.17 Človeški specifični LRG.Črtkana črta označuje Bonferronijevo korigirano vrednost P 0,05. h-1 je bila ekspresija gena GluN (psevdo-paket in skaliranje vsakega gena) znatno povečana v replikah snRNA-seq genov LRG v t-hCO glutamatergičnih nevronih. i, imunološko barvanje, ki prikazuje ekspresijo SCG2 v t-hCO (zgornji) in hCO (spodnji) nevronih. Bele puščice kažejo na celice SCG2+. Merilna črta, 25 µm. Podatki so izraženi kot povprečje ± standardni odklon.
Na podlagi povečane aktivnosti t-hCO, opažene v rezinah ex vivo, je snRNA-seq razkrila od aktivnosti odvisno povečano regulacijo genskih transkriptov v t-hCO v primerjavi s hCO in vitro. Glutamatergični t-hCO nevroni so izražali višje ravni genov, ki uravnavajo aktivnost poznega odziva (slika 2g,h), kar so bile ugotovljeno v prejšnjih študijah na mišjih in človeških nevronih16,17. Na primer, BDNF18, SCG2 in OSTN, gen, ki uravnava aktivnost, specifičen za primate, so pokazali povečano izražanje v t-hCO nevronih v primerjavi z hCO nevroni (slika 2g-i). Tako so t-hCO nevroni pokazali izboljšane značilnosti zorenja v primerjavi z hCO nevroni, kar je bilo ugotovljeno z transkripcijskimi, morfološkimi in funkcionalnimi analizami.
Za nadaljnjo oceno povezave zorenja t-hCO z razvojem človeških možganov smo izvedli transkriptomske primerjave tipov fetalnih in odraslih kortikalnih celic19,20 in odraslih21,22, kot tudi obsežne podatke o izražanju kortikalnih genov23 med razvojem (razširjeni podatki, slika 5). Glede na prejšnje delo24 je globalni status zorenja transkriptoma hCO in t-hCO pri 7–8 mesecih diferenciacije v veliki meri skladen s časom razvoja in vivo in je najbolj enakovreden poznemu fetalnemu življenju (razširjeni podatki, slika 5a). Opazili smo povečano zrelost transkriptoma pri t-hCO v primerjavi s starostno primerljivim hCO, pa tudi aktivacijo transkriptoma, povezano s sinaptogenezo, astrogenezo in mielinacijo (razširjeni podatki, slika 5b-d). Na celični ravni smo našli dokaze o tanjšem podtipu skorje pri t-hCO, s skupki glutamatergičnih nevronov, ki se prekrivajo z odraslimi podtipi nevronov L2/3, L5 in L6 (slika 1i). V nasprotju s tem je bilo prekrivanje grozdov med glutamatergičnimi t-hCO nevroni in fetalnimi kortikalnimi nevroni sredi nosečnosti bolj omejeno (razširjeni podatki, slika 5e-j). Da bi ugotovili, ali so t-hCO nevroni funkcionalno podobni človeškim postnatalnim neokortikalnim nevronom, smo izvedli elektrofiziološke posnetke in anatomske rekonstrukcije človeških piramidnih nevronov L2/3 v ostrih odsekih človeške postnatalne skorje (razširjeni podatki, slika 7a). Elektrofiziološke lastnosti piramidnih nevronov L2/3 so bile podobne lastnostim piramidnih nevronov t-hCO (razširjeni podatki, slika 7e). Morfološko so bili nevroni L2/3 iz postnatalnih človeških vzorcev bolj podobni t-hCO kot hCO, čeprav so bile celice L2/3 daljše, so vsebovale več vej in imele večjo gostoto hrbtenjače (slika 3g in razširjeni podatki, slika 7b-). G).
a, presaditev hCO, ki ga proizvajajo kontrolne in TS hiPS celične linije, v novorojene podgane. b, 3D rekonstrukcija z biocitinom napolnjenih t-hCO nevronov po 8 mesecih diferenciacije. c, kvantifikacija povprečne dolžine dendritov (n = 19 kontrolnih nevronov, n = 21 TS nevronov; **P = 0,0041). d, 3D-rekonstruirane dendritične veje iz kontrolnega in TS t-hCO pri 8 mesecih diferenciacije in kvantifikacija gostote dendritičnih hrbtenic (n = 16 kontrolnih nevronov, n = 21 TS nevronov, ***P < 0,0001). d, 3D-rekonstruirane dendritične veje iz kontrolnega in TS t-hCO pri 8 mesecih diferenciacije in kvantifikacija gostote dendritičnih hrbtenic (n = 16 kontrolnih nevronov, n = 21 TS nevronov, ***P < 0,0001). d, 3D-rekonstrukcija dendritnih vezja iz nadzora in TS t-hCO čez 8 mesecev diferenciranja in količinske ocene trdnosti dendritnih šipov (n = 16 kontrolnih nevronov, n = 21 TS nevronov, *** P <0,0001). d, 3D rekonstrukcija dendritičnih vej iz kontrolnega in t-hCO TS pri 8 mesecih diferenciacije in kvantifikacija gostote dendritičnih hrbtenic (n = 16 kontrolnih nevronov, n = 21 TS nevronov, ***P < 0,0001). d，分化8 个月时对照和TS t-hCO 的3D 重建树突分支，以及树突棘密度的量化（n = 16个对照神经元，n = 21 个TS 神经元，***P < 0,0001）。 d ， 分化 8 个 时 对照 和 ts t-hco 的 3d 重建 分支 分支 以及 树突棘 密度 量化 （n = 16 个神经 元 ， n = 21 个 ts 神经 ， *** p <0,0001 ）。 d, 3D-rekonstrukcija dendritnih veznih nadzora in TS t-hCO čez 8 mesecev diferenciranja in količinske ocene trdnosti dendritnih šipov (n = 16 kontrolnih nevronov, n = 21 TS nevronov, *** P <0,0001). d, 3D rekonstrukcija kontrolnih dendritičnih vej in TS t-hCO pri 8 mesecih diferenciacije in kvantifikacija gostote dendritičnih hrbtenic (n = 16 kontrolnih nevronov, n = 21 TS nevronov, ***P < 0,0001).Rdeče zvezdice označujejo domnevne dendritične trne. e, spontani EPSC v kontrolnih in TS t-hCO nevronih po 8 mesecih diferenciacije. f, kumulativni frekvenčni graf in kvantifikacija frekvence in amplitude sinaptičnih dogodkov (n = 32 kontrolnih nevronov, n = 26 TS nevronov; **P = 0,0076 in P = 0,8102). g, Schollova analiza TS in kontrolnih nevronov v hCO in t-hCO. Črtkane črte prikazujejo človeške postnatalne piramidne nevrone L2/3 za primerjavo (n = 24 kontrolnih t-hCO nevronov, n = 21 TS t-hCO nevronov, n = 8 kontrolnih hCO nevronov in n = 7 TS hCO nevronov). Podatki so izraženi kot povprečje ± standardni odklon.
Sposobnost t-hCO, da na visoki ravni replicira morfološke in funkcionalne značilnosti nevronov človeške skorje, nas je spodbudila k raziskovanju, ali bi se t-hCO lahko uporabil za odkrivanje bolezenskih fenotipov. Osredotočili smo se na TS, hudo nevrološko razvojno motnjo, ki jo povzročajo mutacije s pridobitvijo funkcije v genu, ki kodira CaV1.2 in sproži od aktivnosti odvisno transkripcijo genov v nevronih. HCO smo pridobili od treh bolnikov s TS, ki so nosili najpogostejšo substitucijo (p.G406R), in treh kontrolnih oseb (slika 3a). Po presaditvi smo ugotovili, da je bila dendritična morfologija pri nevronih TS spremenjena v primerjavi s kontrolnimi osebami (slika 3b in razširjeni podatki, slika 8a,b), z dvakratnim povečanjem števila primarnih dendritov in splošnim povečanjem povprečne in skupne zmanjšane dolžine dendritov (slika 3c in razširjeni podatki, slika 8c). To je bilo povezano s povečano gostoto bodic in povečano pogostostjo spontanih EPSC pri TS v primerjavi s kontrolnimi nevroni (slika 3d–f in razširjeni podatki, slika 8g). Nadaljnja analiza je razkrila vzorce nenormalnega dendritičnega razvejanja v t-hCO TS v primerjavi s kontrolami, ne pa tudi v in vitro TS hCO na podobni stopnji diferenciacije (slika 3g). To je skladno z našimi prejšnjimi poročili o od aktivnosti odvisnem dendritičnem krčenju v TS in poudarja sposobnost te presaditvene platforme za odkrivanje bolezenskih fenotipov in vivo.
Nato smo se vprašali, v kolikšni meri so celice t-hCO funkcionalno integrirane v podganji S1. S1 pri glodavcih prejema močne sinaptične vhode iz ipsilateralnega ventralnega bazalnega in posteriornega talamičnega jedra, pa tudi iz ipsilateralnega motoričnega in sekundarnega somatosenzoričnega korteksa ter kontralateralnega S1 (slika 4a). Da bi obnovili vzorec inervacije, smo hCO okužili z virusom stekline-dG-GFP/AAV-G in 3 dni kasneje presadili hCO v podganji S1. 7–14 dni po presaditvi smo opazili gosto izražanje GFP v nevronih ipsilateralnega S1 in ventralnih bazalnih ganglijev (slika 4b, c). Poleg tega je obarvanje talamičnega markerja netrin G1 s protitelesi razkrilo prisotnost talamičnih končičev v t-hCO (slika 4d, e). Da bi ocenili, ali lahko te aferentne projekcije izzovejo sinaptične odzive v celicah t-hCO, smo izvedli posnetke celih celic iz človeških celic v ostrih odsekih talamokortikalne plasti. Električna stimulacija podganjega S1, notranje kapsule, bele snovi, vlaken v bližini t-hCO ali optogenetska aktivacija talamičnih končičev, ki izražajo opsin, v t-hCO je povzročila kratkolatentne EPSC v t-hCO nevronih, izpostavljenih antagonistu AMPA receptorja NBQX. (slika 4f, g in razširjeni podatki, slika 9a–g). Ti podatki kažejo, da je t-hCO anatomsko integriran v možgane podgane in ga lahko aktivira gostiteljsko tkivo podgane.
a, Shematski diagram poskusa sledenja steklini. b, GFP in izražanje STEM121, specifično za človeka, med t-hCO in možgansko skorjo podgan (zgornja plošča). Prikazana je tudi ekspresija GFP v ipsilateralnem ventralnem bazalnem jedru (VB) podgan (spodaj levo) in ipsilateralnem S1 (spodaj desno). Merilna vrstica, 50 µm. Rdeči kvadratki predstavljajo področja možganov, kjer so bile posnete slike. c, kvantifikacija celic, ki izražajo GFP (n = 4 podgane). d, e — talamični terminali Netrin G1+ v t-hCO. d prikazuje koronalni prerez, ki vsebuje jedra t-hCO in VB. Merilna vrstica, 2 mm. e prikazuje izražanje Netrin G1 in STEM121 v nevronih t-hCO (levo) in VB (desno). Merilna vrstica, 50 µm. Oranžna pikčasta črta označuje mejo t-hCO. f, g, Sledi toka nevronov t-hCO po električni stimulaciji v podgani S1 (f) ali notranji kapsuli (g), z (vijolično) ali brez (črno) NBQX (levo). Amplitude EPSC z in brez NBQX (n = 6 nevronov S1, *P = 0,0119; in n = 6 nevronov notranje kapsule, **P = 0,0022) (sredina). Odstotek nevronov t-hCO, ki kažejo EPSC kot odziv na električno stimulacijo podganje S1 (f) ali notranje kapsule (g) (desno). aCSF, umetna cerebrospinalna tekočina. h, shematski diagram slikovnega eksperimenta 2P (levo). Ekspresija GCaMP6 v t-hCO (na sredini). Merilna vrstica, 100 µm. Časovni zamik fluorescence GCaMP6 (desno). i, Z-vrednost spontane aktivnosti fluorescence. j, shematski prikaz stimulacije brkov. k, z-vrednotene trajektorije fluorescence 2P v enem poskusu, poravnane z odstopanjem brkov v času nič (črtkana črta) v primernih celicah. l, populacijsko povprečeni z-vrednostni odzivi vseh celic, poravnani z odstopanjem brkov v času nič (črtkana črta) (rdeča) ali naključno generirani časovni žigi (siva). m. Shematski diagram poskusa optičnega označevanja. n, Surove napetostne krivulje iz primerne celice t-hCO med stimulacijo z modrim laserjem ali odklonom brkov. Rdeče puščice označujejo prve konice, ki jih povzroča svetloba (zgoraj) ali ki jih povzroča odklon brkov (spodaj). Sivo senčenje označuje obdobja odklona brkov. o, Oblike valov svetlobe vrhov in odzivi odklona brkov. p, konice enega samega poskusa, poravnane z odstopanjem brkov v celicah primera. 0 označuje odstopanje brkov (črtkana črta). q, populacijsko povprečena hitrost sprožitve z-vrednosti za vse fotoobčutljive celice, poravnana z odstopanjem brkov v času nič (črtkana črta) (rdeča) ali naključno generirani časovni žigi (siva). r, Delež fotosenzitivnih enot, ki jih bistveno modulira odklon brkov (n = 3 podgane) (levo). Najvišja latenca z-vrednosti (n = 3 podgane; n = 5 (svetlo zelena), n = 4 (temno zelena) in n = 4 (cijan) modulacijske enote odklona brkov na podgano) (desno). Podatki so izraženi kot povprečje ± standardni odklon.
Nato smo se vprašali, ali se t-hCO lahko aktivira s senzoričnimi dražljaji in vivo. Podganam S1 smo presadili hCO, ki izraža gensko kodirane kalcijeve indikatorje GCaMP6. Po 150 dneh smo izvedli vlaknasto fotometrijo ali dvofotonsko slikanje kalcija (slika 4h in razširjeni podatki, slika 10a). Ugotovili smo, da celice t-hCO kažejo sinhronizirano ritmično aktivnost (slika 4i, razširjeni podatki, slika 10b in dodatni video 1). Za karakterizacijo najvišje aktivnosti t-hCO smo izvedli zunajcelične elektrofiziološke posnetke pri anesteziranih presajenih podganah (razširjeni podatki, slika 10c-f). Iz MRI slik smo ustvarili stereotaksične koordinate; tako te posnete enote predstavljajo domnevne človeške nevrone, čeprav sama elektrofiziologija ne omogoča določitve vrstnega izvora. Opazovali smo sinhronizirane izbruhe aktivnosti (razširjeni podatki, slika 10d). Izbruhi so trajali približno 460 ms in so bili ločeni s obdobji tišine približno 2 s (razširjeni podatki, slika 10d, e). Posamezne enote so v povprečju izstrelile približno tri naboje na rafal, kar predstavlja približno 73 % registriranih enot na rafal. Aktivnosti posameznih enot so bile zelo korelirane, te korelacije pa so bile višje od tistih pri enotah, identificiranih pri necepljenih živalih, zabeleženih pod enakimi pogoji (razširjeni podatki, slika 10f). Za nadaljnjo karakterizacijo odzivov konic identificiranih nevronov človeškega izvora smo izvedli poskuse svetlobnega označevanja na anesteziranih podganah, ki so jim presadili hCO, ki izraža svetlobno občutljiv kationski kanal rodopsin 2 (hChR2), prek katerega t-hCO nevroni prepoznajo kratko latenco (manj kot 10 ms) kot odziv na dražljaje modre svetlobe (slika 4m–o). t-hCO nevroni so pokazali izbruhe spontane aktivnosti pri frekvencah, podobnih tistim, ki so jih opazili pri slikanju s kalcijem, kot tudi elektrofiziološke posnetke, izvedene v t-hCO brez svetlobnega označevanja (razširjeni podatki, slika 10c-g). V ustreznih fazah hCO, zabeleženih in vitro, ni bila opažena nobena spontana aktivnost. Da bi ocenili, ali se t-hCO lahko aktivira s senzoričnimi dražljaji, smo na kratko odklonili podganje brke stran od t-hCO (slika 4j,m in razširjeni podatki, slika 10h,k). Glede na prejšnje študije8,10 je podmnožica celic t-hCO pokazala povečano aktivnost kot odziv na odklon brkov, česar nismo opazili pri primerjavi podatkov z naključnimi časovnimi žigi (slika 4k–q in razširjeni podatki, slika 10h–q). Dejansko je približno 54 % opto-označenih posameznih enot pokazalo znatno povečano stopnjo vzburjenja po stimulaciji brkov, ki je dosegla vrh pri približno 650 ms (slika 4r). Skupaj ti podatki kažejo, da t-hCO prejema ustrezne funkcionalne vnose in ga lahko aktivirajo okoljski dražljaji.
Nato smo raziskali, ali lahko t-hCO aktivira vezja pri podganah za nadzor vedenja. Najprej smo raziskali, ali aksoni nevronov t-hCO projicirajo v okoliška tkiva podgane. HCO smo okužili z lentivirusom, ki kodira hChR2, spojen z EYFP (hChR2-EYFP). Po 110 dneh smo opazovali izražanje EYFP v ipsilateralnih kortikalnih regijah, vključno s slušnim, motoričnim in somatosenzoričnim korteksom, ter v subkortikalnih regijah, vključno s striatumom, hipokampusom in talamusom (slika 5a). Da bi ocenili, ali lahko te eferentne projekcije izzovejo sinaptične odzive v podganjih celicah, smo optično aktivirali t-hCO celice, ki izražajo hChR2-EYFP, s snemanjem celic možganske skorje podgan v ostrih možganskih rezinah. Aktivacija aksonov t-hCO z modro svetlobo je povzročila kratkolatentne EPSC v nevronih piramidalne skorje podgan, ki jih je blokiral NBQX (sliki 5b–g). Poleg tega bi te odzive lahko blokiral tetrodotoksin (TTX) in jih obnovil 4-aminopiridin (4-AP), kar kaže na to, da so jih povzročile monosinaptične povezave (slika 5e).
a, Shematski diagram sledenja aksonov (levo). Izražanje t-hCO EYFP (desno). Merilna črta, 100 µm. A1, slušna skorja, ACC, anteriorna cingulatna skorja, d. striatum, dorzalni striatum, HPC, hipokampus; diafragma, lateralni septum, mPFC, medialna prefrontalna skorja, piri, piriformna skorja, v. striatum, ventralni striatum, VPM, ventropostomedialno jedro talamusa, VTA, ventralna tegmentalna regija. Rdeči kvadratki predstavljajo področja možganov, kjer so bile posnete slike. b, Shematski diagram stimulacijskega poskusa. c, d, Primera odziva fototoka, induciranega z modro svetlobo (zgoraj) in napetosti (spodaj), v človeških (c) EYFP+ t-hCO ali podganjih (d) EYFP- celicah. e, f, Sledi toka podganjih nevronov po stimulaciji aksonov t-hCO z modro svetlobo s TTX in 4-AR (zelena), TTX (siva) ali aCSF (črna) (e), z (vijolična) ali brez (črna) ) ) NBQX (e). g, latenca odzivov, ki jih povzroča modra svetloba v podganjih celicah (n = 16 celic); vodoravne črte označujejo povprečno latenco (7,13 ms) (levo). Amplituda svetlobno sproženih EPSC, zabeleženih z ali brez NBQX (n = 7 celic; ***P < 0,0001) (na sredini). Amplituda svetlobno sproženih EPSC, zabeleženih z ali brez NBQX (n = 7 celic; ***P < 0,0001) (na sredini). Amplituda izzvanega sveta EPSC, registriranih z ali brez NBQX (n = 7 celic; ***P <0,0001) (v središču). Amplituda svetlobno induciranih EPSC, zabeleženih z ali brez NBQX (n = 7 celic; ***P < 0,0001) (sredina).使用或不使用NBQX 记录的光诱发EPSC 的振幅（n = 7 个细胞；***P < 0,0001）（中）。使用或不使用NBQX 记录的光诱发EPSC 的振幅（n = 7 个细胞；***P < 0,0001）（中）。 Amplituda izzvanega sveta EPSC, registriranih z ali brez NBQX (n = 7 celic; ***P <0,0001) (v središču). Amplituda svetlobno induciranih EPSC, zabeleženih z ali brez NBQX (n = 7 celic; ***P < 0,0001) (sredina).Odstotek podganjih celic, ki kažejo EPSC, ki se odzivajo na modro svetlobo (desno). h, Shematski diagram vedenjske naloge. d0, dan 0. i. Učinkovitost vzorčnih živali 1. dan (levo) ali 15. dan (desno) treninga. Povprečno število lizanja, opravljenih 1. dan (levo) ali 15. dan (desno na sredini) (n = 150 poskusov z modro svetlobo, n = 150 poskusov z rdečo svetlobo; ***P < 0,0001). Povprečno število lizanja, opravljenih 1. dan (levo) ali 15. dan (desno na sredini) (n = 150 poskusov z modro svetlobo, n = 150 poskusov z rdečo svetlobo; ***P < 0,0001). Srednje število zaokroženih, izvedenih v 1. dnevu (naslednji) ali 15. dnevu (v sredini zadeve) (n = 150 preizkusov s sinjim svetom, n = 150 preizkusov z rdečim svetom; ***P <0,0001). Povprečno število lizanja, opravljenih 1. dan (levo) ali 15. dan (desno na sredini) (n = 150 poskusov z modro svetlobo, n = 150 poskusov z rdečo svetlobo; ***P < 0,0001).第1 天（左）或第15 天（右中）执行的平均舔次数（n = 150 次蓝光试验，, n = 150次红光试验；***P < 0,0001）。第1 天（左）或第15 天（右中）执行的平均舔次数（n = 150 次蓝光试验，, n = 150次红光试验；***P < 0,001 Srednje število zaokroženih, izvedenih v 1. dnevu (naslednji) ali 15. dnevu (v sredini zadeve) (n = 150 preizkusov s sinjim svetom, n = 150 preizkusov z rdečim svetom; ***P <0,0001). Povprečno število lizanja, opravljenih 1. dan (levo) ali 15. dan (desno na sredini) (n = 150 poskusov z modro svetlobo, n = 150 poskusov z rdečo svetlobo; ***P < 0,0001).Kumulativni liži za poskuse z rdečo in modro svetlobo 1. dan (levo na sredini) ali 15. dan (desno). NS, ni statistično pomembno. j,k, Vedenjske značilnosti vseh živali, ki so jim 1. ali 15. dan presadili t-hCO, ki izraža hChR2-EYFP (j), ali kontrolni fluorofor (k) (hChR2-EYFP: n = 9 podgan, ** P = 0,0049; kontrola: n = 9, P = 0,1497). l, Razvoj preferenčnega rezultata (n = 9 hChR2, n = 9 kontrola; **P < 0,001, ***P < 0,0001). l, Razvoj preferenčnega rezultata (n = 9 hChR2, n = 9 kontrola; **P < 0,001, ***P < 0,0001). l, Evolucija kazalnika prednostnih lastnosti (n = 9 hChR2, n = 9 kontrolnih; **P <0,001, ***P <0,0001). l, Razvoj preferenčnega rezultata (n = 9 hChR2, n = 9 kontrol; **P < 0,001, ***P < 0,0001). l，偏好评分的演变８(n = 9 hChR2，n = 9 对照；**P < 0,001，***P < 0,0001）). l，偏好评分的演变８(n = 9 hChR2，n = 9 对照；**P < 0,001，***P < 0,0001）). l, Эволюционные показатели предпочтений (n = 9 hChR2, n = 9 kontrol; **P <0,001, ***P <0,0001). l, Razvoj preferenčnih rezultatov (n = 9 hChR2, n = 9 kontrol; **P < 0,001, ***P < 0,0001).m, izražanje FOS kot odgovor na optogenetsko aktivacijo t-hCO v S1. Prikazane so slike izražanja FOS (levo) in kvantifikacije (n = 3 na skupino; *P < 0,05, **P < 0,01 in ***P < 0,001) (desno). Prikazane so slike izražanja FOS (levo) in kvantifikacije (n = 3 na skupino; *P < 0,05, **P < 0,01 in ***P < 0,001) (desno). Prikazani slikovni izrazi FOS (levo) in količinske ugotovitve (n = 3 v skupini; * P <0,05, ** P <0,01 и *** P <0,001) (popravilo). Prikazane so slike izražanja FOS (levo) in kvantifikacije (n = 3 na skupino; *P<0,05, **P<0,01 in ***P<0,001) (desno).显示了FOS 表达（左）和量化（每组n = 3；*P < 0,05、**P < 0,01 和***P < 0,001）（右）的图像。显示了FOS 表达（左）和量化（每组n = 3；*P < 0,05、**P < 0,01 和***P < 0,001）（右）的图像。 Prikazani slikovni izrazi FOS (levo) in količinske ugotovitve (n = 3 v skupini; * P <0,05, ** P <0,01 и *** P <0,001) (popravilo). Prikazane so slike izražanja FOS (levo) in kvantifikacije (n = 3 na skupino; *P<0,05, **P<0,01 in ***P<0,001) (desno).Merilna lestvica, 100 µm. Podatki so izraženi kot povprečje ± standardna napaka BLA, bazolateralnega tonzila, MDT, dorzomedialnega talamičnega jedra, PAG, periakveduktalne sive barve.
Nazadnje smo se vprašali, ali lahko t-hCO modulira vedenje podgan. Da bi to preizkusili, smo v S1 presadili hCO, ki izraža hChR2-EYFP, in 90 dni kasneje smo v t-hCO vsadili optična vlakna za dovajanje svetlobe. Nato smo podgane trenirali s spremenjeno paradigmo operantnega pogojevanja (slika 5h). Živali smo postavili v komoro za vedenjsko testiranje in naključno uporabili 5-sekundne modre (473 nm) in rdeče (635 nm) laserske dražljaje. Živali so prejele vodno nagrado, če so med stimulacijo z modro svetlobo lizale, med stimulacijo z rdečo svetlobo pa niso. Prvi dan treninga živali niso pokazale razlike v lizanju pri stimulaciji z modro ali rdečo svetlobo. Vendar pa so 15. dan živali, ki so jim presadili hCO, ki izraža hChR2-EYFP, pokazale bolj aktivno lizanje pri stimulaciji z modro svetlobo v primerjavi s stimulacijo z rdečo svetlobo. Teh sprememb v vedenju lizanja pri kontrolnih živalih, ki so jim presadili hCO, ki izraža kontrolni fluorofor, niso opazili (stopnja uspešnosti učenja: hChR2 89 %, EYFP 0 %, slika 5i-1 in dodatni video 2). Ti podatki kažejo, da lahko celice t-hCO aktivirajo podganje nevrone in spodbudijo vedenje iskanja nagrade. Da bi ugotovili, katera podganja nevronska vezja t-hCO bi lahko bila vključena v te vedenjske spremembe, smo pri dresiranih živalih optogenetsko aktivirali t-hCO in 90 minut kasneje odvzeli tkiva. Imunohistokemija je pokazala izražanje od aktivnosti odvisnega proteina FOS v več možganskih regijah, ki sodelujejo pri motiviranem vedenju, vključno z medialnim prefrontalnim korteksom, medialnim talamusom in periakveduktalno sivo snovjo, ki je bila izražena bodisi pri nestimuliranih kontrolnih živalih bodisi pri živalih. riž. 5m). Skupaj ti podatki kažejo, da lahko t-hCO modulira aktivnost podganjih nevronov in tako spodbuja vedenje.
Nevronski organoidi predstavljajo obetaven sistem za preučevanje človeškega razvoja in bolezni in vitro, vendar so omejeni zaradi pomanjkanja povezav med vezji, ki obstajajo in vivo. Razvili smo novo platformo, na kateri smo presadili hCO v S1 imunokompromitiranih zgodnjih postnatalnih podgan, da bi preučili razvoj in delovanje človeških celic in vivo. Pokazali smo, da t-hCO razvija zrele tipe celic, ki jih in vitro nismo opazili28, in da je t-hCO anatomsko in funkcionalno integriran v možgane glodalcev. Integracija t-hCO v nevronska vezja glodalcev nam je omogočila vzpostavitev povezave med človeško celično aktivnostjo in preučevanim vedenjem živali, kar kaže, da lahko t-hCO nevroni modulirajo nevronsko aktivnost podgan in tako spodbujajo vedenjske odzive.
Platforma, ki jo opisujemo, ima več prednosti pred prejšnjimi raziskavami o presaditvi človeških celic v možgane glodalcev. Prvič, hCO2 smo presadili v razvijajočo se skorjo podgan v zgodnjem postnatalnem obdobju, kar lahko olajša anatomsko in funkcionalno integracijo. Drugič, spremljanje MRI s t-hCO2 nam je omogočilo preučevanje položaja in rasti presadka pri živih živalih, kar nam je omogočilo izvajanje dolgoročnih študij na več živalih in ugotavljanje zanesljivosti več celičnih linij hiPS. Nazadnje smo presadili intaktne organoide namesto izoliranih suspenzij posameznih celic, ki so manj uničujoči za človeške celice in lahko spodbujajo integracijo in nastanek nevronov človeške skorje v možganih podgan.
Priznavamo, da kljub napredku na tej platformi časovne, prostorske in medvrstne omejitve preprečujejo nastanek človeških nevronskih vezij z visoko natančnostjo, tudi po presaditvi v zgodnji fazi razvoja. Na primer, ni jasno, ali spontana aktivnost, opažena v t-hCO, predstavlja razvojni fenotip, podoben ritmični aktivnosti, opaženi med kortikalnim razvojem, ali pa je posledica odsotnosti supresivnih tipov celic, prisotnih v t-hCO. Podobno ni jasno, v kolikšni meri odsotnost laminacije v t-hCO vpliva na povezljivost verige30. Prihodnje delo se bo osredotočilo na integracijo drugih tipov celic, kot so človeška mikroglija, človeške endotelijske celice in različni deleži GABAergičnih internevronov, kot je prikazano z uporabo sestavljanja 6 in vitro, ter na razumevanje, kako lahko pride do nevronske integracije in obdelave v spremenjenih transkripcijskih, sinaptičnih in vedenjskih ravneh t-hCO v celicah, pridobljenih od bolnikov.
Na splošno ta in vivo platforma predstavlja močan vir, ki lahko dopolni in vitro raziskave razvoja človeških možganov in bolezni. Pričakujemo, da nam bo ta platforma omogočila odkrivanje novih fenotipov na ravni verig v sicer nedosegljivih celicah, pridobljenih od pacientov, in testiranje novih terapevtskih strategij.
Iz celic HiPS smo ustvarili hCO2,5, kot je bilo opisano že prej. Za začetek proizvodnje hCO2 iz celic hiPS, gojenih na hranilnih plasteh, smo intaktne kolonije celic hiPS odstranili iz gojitvenih posod z dispazo (0,35 mg/ml) in prenesli v plastične kulture z ultra nizko vezavo, ki so vsebovale posode z gojiščem za celice hiPS (Corning), dopolnjenim z dvema inhibitorjema SMAD, dorsomorfinom (5 μM; P5499, Sigma-Aldrich) in SB-431542 (10 μM; 1614, Tocris) ter inhibitorjem ROCK Y-27632 (10 μM; S1049, Selleckchem). V prvih 5 dneh smo gojišče za celice hiPS dnevno menjali in dodali dorsomorfin in SB-431542. Šesti dan suspenzije so bili nevronski sferoidi preneseni v nevronski medij, ki je vseboval nevrobazalni A (10888, Life Technologies), dodatek B-27 brez vitamina A (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies), penicilin in streptomicin (1:100, Life Technologies) ter dopolnjen z epidermalnim rastnim faktorjem (EGF; 20 ng ml−1; R&D Systems) in fibroblastnim rastnim faktorjem 2 (FGF2; 20 ng ml−1; R&D Systems) do 24. dne. Od 25. do 42. dne je bil medij dopolnjen z možganskim nevrotrofičnim faktorjem (BDNF; 20 ng ml−1, Peprotech) in nevrotrofinom 3 (NT3; 20 ng ml−1; Peprotech) z menjavo medija vsak drugi dan. Šesti dan suspenzije so bili nevronski sferoidi preneseni v nevronski medij, ki je vseboval nevrobazalni A (10888, Life Technologies), dodatek B-27 brez vitamina A (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies), penicilin in streptomicin (1:100, Life Technologies) ter dopolnjen z epidermalnim rastnim faktorjem (EGF; 20 ng ml−1; R&D Systems) in fibroblastnim rastnim faktorjem 2 (FGF2; 20 ng ml−1; R&D Systems) do 24. dne. Od 25. do 42. dne je bil medij dopolnjen z možganskim nevrotrofičnim faktorjem (BDNF; 20 ng ml−1, Peprotech) in nevrotrofinom 3 (NT3; 20 ng ml−1; Peprotech) z menjavo medija vsak drugi dan.Šesti dan suspenzije so bili nevronski sferoidi preneseni v nevronski medij, ki je vseboval Neurobasal-A (10888, Life Technologies), dodatek B-27 brez vitamina A (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies) in penicilin.in streptomicin (1:100, Life Technologies) in dopolnjen epidermalni faktor rasti (EGF; 20 ng/ml; R&D Systems) in faktor rasti fibroblastov 2 (FGF2; 20 ng/ml; R&D Systems) do 24 dni. in streptomicin (1:100, Life Technologies) ter dopolnjen z epidermalnim rastnim faktorjem (EGF; 20 ng/ml; R&D Systems) in fibroblastnim rastnim faktorjem 2 (FGF2; 20 ng/ml; R&D Systems) do 24. dne.Od 25. do 42. dneva sta bila v medij dodana možganski nevrotrofični faktor (BDNF; 20 ng ml-1, Peprotech) in nevrotrofin 3 (NT3; 20 ng ml-1, Peprotech), medij pa se je menjal vsak drugi dan.在悬浮的第6 天，将神经球体转移到含有neurobasal-A（10888，Life Technologies）、不含维生素A 的B-27补充剂（12587，Life Technologies）、GlutaMax（1:100，Life Technologies）、青霉素的神经培养基中和链霉素（1:100，Life Technologies）并辅以表皮生长因子（EGF；20 ng ml-1；R&D Systems）和成纤维细胞生长因子2（FGF2；20 ng ml-1；R&R Sistemi) 直至第24 天.在 悬浮 的 第 第 6 天 将 神经 球体 转移 含有 含有 neurobasal-a （10888 ， Life Technologies） 不 含 维生素 a的 b-27 补充剂 （12587 ， Life Technologies） Glutamax （1: 100 ， Life TechNOGIS青霉素 的 神经 培养 基 中 链霉素（（1: 100 ， Life Technologies） 表皮 生长 因子 （（（20 ng ml-1 ； sistemi za raziskave in razvoj） 成 纤维 细胞 生长 2 （fgf2 ； 20 ng ml-1；R&D Sistemi) 直至第24天. V 6-dnevni suspenziji so bile nevrosfere spremenjene v dodatek, ki vsebuje nevrobazal-A (10888, Life Technologies), dodatek B-27 brez vitamina A (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies), penicilin-nevtraliziran streptomicin (1:100, Life). Tehnologije) z dodajanjem epidermalnega faktorja rasti (EGF; 20 ng ml-1; R&D Systems) in faktorja rasti fibroblastov 2 (FGF2; 20 ng ml-1) 1; 6. dan so suspenzije nevrosfer prešli na dodatek, ki je vseboval nevrobazalni A (10888, Life Technologies), dodatek B-27 brez vitamina A (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies), s penicilinom nevtraliziran streptomicin (1:100, Life Technologies), dopolnjen z epidermalnim rastnim faktorjem (EGF; 20 ng ml-1; R&D Systems) in fibroblastnim rastnim faktorjem 2 (FGF2; 20 ng ml-1) 1; sistemi za raziskave in razvoj) do 24 dni. sistemi za raziskave in razvoj) do 24. dne.Od 25. do 42. dneva sta bila v gojišče vsak drugi dan dodana možganski nevrotrofični faktor (BDNF; 20 ng ml-1, Peprotech) in nevrotrofični faktor 3 (NT3; 20 ng ml-1, Peprotech). Gojišče je bilo enkrat zamenjano.Od 43. dne naprej se je hCO2 vzdrževal v nedopolnjenem nevrobazalnem mediju A (NM; 1088022, Thermo Fisher) z menjavo medija vsakih 4–6 dni. Za pridobitev hCO2 iz celic hiPS, gojenih v pogojih brez podajalnika, so bile celice hiPS inkubirane z Accutase (AT-104, Innovate Cell Technologies) pri 37 °C 7 minut, disociirane na posamezne celice in nanesene na plošče AggreWell 800 (34815, STEMCELL Technologies) pri gostoti 3 × 106 posameznih celic na vdolbinico v mediju Essential 8, dopolnjenem z inhibitorjem ROCK Y-27632 (10 μM; S1049, Selleckchem). Po 24 urah smo medij v vdolbinicah pipetirali gor in dol v medij, ki je vseboval medij Essential 6 (A1516401, Life Technologies), dopolnjen z dorsomorfinom (2,5 μM; P5499, Sigma-Aldrich) in SB-431542 (10 μM; 1614). (Tocrida). Od 2. do 6. dne smo medij Essential 6 dnevno nadomeščali z dorsomorfinom in dodatkom SB-431542. Od šestega dne naprej smo suspenzije nevrosfer prenesli v nevrobazalni medij in vzdrževali, kot je opisano zgoraj.
Vsi postopki na živalih so bili izvedeni v skladu s smernicami za oskrbo živali, ki jih je odobril Upravni odbor za oskrbo laboratorijskih živali Univerze Stanford (APLAC). Breje evtimne podgane RNU (rnu/+) so bile kupljene (Charles River Laboratories) ali nastanjene. Živali so bile vzdrževane v 12-urnem ciklu svetlobe in teme s hrano in vodo ad libitum. Mladiče golih podgan (FOXN1–/–), stare od tri do sedem dni, so pred izločitvijo prepoznali po rasti nezrelih brkov. Mladiče (samce in samice) so anestezirali z 2–3 % izofluranom in namestili na stereotaksični okvir. Izvedena je bila trepanacija lobanje s premerom približno 2–3 mm nad S1, pri čemer je bila ohranjena celovitost dure mater. Nato je bila z iglo 30-G (približno 0,3 mm) tik zunaj kraniotomije prebodena dura mater. Nato je bila na tanek parafilm velikosti 3 × 3 cm nanesena HCO3 in odstranjen odvečni medij. Z brizgo Hamilton, pritrjeno na iglo 23 G pod kotom 45°, nežno potegnite hCO₃ v najbolj distalni konec igle. Nato namestite brizgo na črpalko za brizgo, priključeno na stereotaksično napravo. Konico igle namestite čez predhodno narejeno 0,3 mm široko luknjo v duri (z = 0 mm) in zožite brizgo za 1–2 mm (z = približno –1,5 mm), dokler igla ni med duro mater A. Ne nastane gosto tesnilo. Nato dvignite brizgo na sredino kortikalne površine pri z = -0,5 mm in injicirajte hCO₃ s hitrostjo 1–2 µl na minuto. Po končanem injiciranju hCO₃ se igla izvleče s hitrostjo 0,2–0,5 mm na minuto, koža se zašije in mladiček se takoj položi na toplo grelno blazinico do popolnega okrevanja. Nekatere živali so bile presajene bilateralno.
Vsi postopki na živalih so bili izvedeni v skladu s smernicami za oskrbo živali, ki jih je odobrila Univerza Stanford APLAC. Podgane (starejše od 60 dni po presaditvi) so bile anestezirane s 5 % izofluranom in med slikanjem anestezirane z 1–3 % izofluranom. Za vizualizacijo je bil uporabljen 7-teslov aktivno zaščiten horizontalni skener vrtin Bruker (Bruker Corp.) z gradientnim pogonom International Electric Company (IECO), zaščitenim gradientnim vložkom z notranjim premerom 120 mm (600 mT/m, 1000 T/m/s) z uporabo AVANCE.III, osemkanalne večtuljavne RF in večjedrnih zmogljivosti ter pripadajoče platforme Paravision 6.0.1. Snemanje je bilo izvedeno z aktivno ločeno volumetrično RF tuljavo z notranjim premerom 86 mm in štirikanalno kriogeno hlajeno RF tuljavo samo za sprejem. Aksialni 2D Turbo-RARE (čas ponovitve = 2500 ms, čas odmeva = 33 ms, 2 povprečji) s 16 zajetimi rezinami, debelina rezine 0,6–0,8 mm, ki vsebuje 256 × 256 vzorcev. Signali so bili sprejeti z uporabo kvadraturne oddajno-sprejemne volumetrične RF tuljave z notranjim premerom 2 cm (Rapid MR International, LLC). Nazadnje so bile uporabljene vgrajene funkcije za ocenjevanje površine Imaris (BitPlane) za 3D-upodabljanje in analizo volumna. Uspešna presaditev je bila opredeljena kot tista, pri kateri so se v presajeni hemisferi oblikovala območja neprekinjenega T2-uteženega MRI signala. Zavrnitev presadka je bila opredeljena kot presadek, ki v presajeni hemisferi ni ustvaril območij neprekinjenega T2-uteženega MRI signala. Subkortikalni t-hCO2 je bil iz nadaljnje analize izključen.
Za stabilno izražanje GCaMP6s v hCO2 za dvofotonsko slikanje kalcija so bile celice hiPS okužene s pLV[Exp]-EF1a::GcaMP6s-WPRE-Puro, čemur je sledila selekcija antibiotikov. Na kratko, celice so bile disociirane z EDTA in suspendirane v 1 ml medija Essential 8 pri gostoti približno 300.000 celic v prisotnosti polibrena (5 μg/ml) in 15 μl virusa. Celice so bile nato inkubirane v suspenziji 60 minut in zasejane pri gostoti 50.000 celic na vdolbinico. Po konfluenci so bile celice tretirane s 5-10 μg ml-1 puromicina 5-10 dni oziroma dokler se niso pojavile stabilne kolonije. Akutna okužba s hCO je bila izvedena, kot je bilo opisano že prej5 z nekaj spremembami. Na kratko, hCO2 je bil 30.-45. dan prenesen v 1,5 ml mikrocentrifugalne epruvete Eppendorf, ki so vsebovale 100 µl živčnega medija. Nato se odstrani približno 90 µl gojišča, v epruveto doda 3–6 µl lentivirusa z visokim titrom (od 0,5 x 108 do 1,2 x 109) in hCO3 se za 30 minut prenese v inkubator. Nato se v vsako epruveto doda 90–100 µl gojišča in epruvete čez noč vrnejo v inkubator. Naslednji dan se hCO3 prenese v svež živčni medij v ploščah z nizko pritrditvijo. Po 7 dneh se hCO3 prenese na plošče s 24 vdolbinicami s steklenim dnom za vizualizacijo in oceno kakovosti okužbe. pLV[Exp]-SYN1::EYFP-WPRE in pLV[Exp]-SYN1::hChR2-EYFP-WPRE sta bila ustvarjena z VectorBuilderjem. Lentivirus se uporablja v večini poskusov, ker je integriran v gostiteljski genom, kar omogoča izražanje reporterskih genov v okuženih celičnih linijah. Za spremljanje stekline je bil hCO 30.–45. dan sočasno okužen z virusom stekline ΔG-eGFP in AAV-DJ-EF1a-CVS-G-WPRE-pGHpA (plazmid št. 67528, Addgene), 3 dni temeljito oprane in presajene v podgane v S1 ter vzdrževane in vivo 7–14 dni.
Za imunocitokemijo so bile živali anestezirane in transkardialno perfuzirane s PBS, ki mu je sledil 4 % paraformaldehid (PFA v PBS; Electron Microscopy Sciences). Možgani so bili fiksirani v 4 % PFA 2 uri ali čez noč pri 4 °C, kriokonzervirani v 30 % saharozi v PBS 48–72 ur in vgrajeni v 1:1, 30 % saharozo:OCT (Tissue-Tek OCT Compound 4583, Sakura Finetek) ter koronalni rezi so bili narejeni pri 30 µm z uporabo kriostata (Leica). Za imunohistokemijo debelih rezov so bile živali perfuzirane s PBS, možgani pa so bili secirani in koronalno prerezani pri 300–400 µm z uporabo vibratoma (Leica) in rezi so bili fiksirani s 4 % PFA 30 minut. Nato so bili kriosekcije ali debele rezine sprane s PBS, blokirane 1 uro pri sobni temperaturi (10 % normalni oslovski serum (NDS) in 0,3 % Triton X-100, razredčen v PBS) in blokirane z blokirno raztopino pri 4 °C. – Inkubacija Kriosekcije so bile inkubirane čez noč, debele rezine pa 5 dni. Primarna uporabljena protitelesa so bila: anti-NeuN (miš, 1:500; ab104224, abcam) anti-CTIP2 (podgana, 1:300; ab18465, abcam), anti-GFAP (zajec, 1:1000; Z0334, Dako), anti-GFP (piščanec, 1:1000; GTX13970, GeneTex), anti-HNA (miš, 1:200; ab191181, abcam), anti-NeuN (zajec, 1:500; ABN78, Millipore), anti-PDGFRA (zajec, 1:200; sc-338, Santa Cruz), anti-PPP1R17 (zajec, 1:200; HPA047819, Atlas Antibodies), anti-RECA-1 (miš, 1:50; ab9774, abcam), anti-SCG2 (zajec, 1:100; 20357-1-AP, Proteintech), anti-SOX9 (koza, 1:500; AF3075, R&D Systems), Netrin G1a (koza, 1:100; AF1166, R&D Systems), anti-STEM121 (miš, 1:200; Y40410, Takara Bio), anti-SATB2 (miš, 1:50; ab51502, abcam), anti-GAD65/67 (zajec, 1:400; ABN904, Millipore) in anti-IBA1 (koza, 1:100; ab5076, abcam). Primarna uporabljena protitelesa so bila: anti-NeuN (miš, 1:500; ab104224, abcam) anti-CTIP2 (podgana, 1:300; ab18465, abcam), anti-GFAP (zajec, 1:1000; Z0334, Dako), anti-GFP (piščanec, 1:1000; GTX13970, GeneTex), anti-HNA (miš, 1:200; ab191181, abcam), anti-NeuN (zajec, 1:500; ABN78, Millipore), anti-PDGFRA (zajec, 1:200; sc-338, Santa Cruz), anti-PPP1R17 (zajec, 1:200; HPA047819, Atlas Antibodies), anti-RECA-1 (miš, 1:50; ab9774, abcam), anti-SCG2 (zajec, 1:100; 20357-1-AP, Proteintech), anti-SOX9 (koza, 1:500; AF3075, R&D Systems), Netrin G1a (koza, 1:100; AF1166, R&D Systems), anti-STEM121 (miš, 1:200; Y40410, Takara Bio), anti-SATB2 (miš, 1:50; ab51502, abcam), anti-GAD65/67 (zajec, 1:400; ABN904, Millipore) in anti-IBA1 (koza, 1:100; ab5076, abcam). Uporabili so naslednja primarna antitela: anti-NeuN (myshine, 1:500; ab104224, abcam), anti-CTIP2 (krisinye, 1:300; ab18465, abcam), anti-GFAP (krolični, 1:1000; Z0334, Dako), anti- -GFP (kurica, 1:1000; GTX13970, GeneTex), anti-HNA (moj, 1:200; ab191181, abcam), anti-NeuN (krolik, 1:500; ABN78, Millipore), anti-PDGFRA (krolik, 1:200; sc-338, Santa-Kruz), anti-PPP1R17 (krolik, 1:200; HPA047819, Atlas Antibodies), anti-RECA-1 (myшь, 1:50; ab9774, abcam), anti-SCG2 (krolik, 1:100; 20357-1-AP, Proteintech), anti-SOX9 (kozij, 1:500; AF3075, R&D Systems), netrin G1a (kozij, 1:100; AF1166, R&D Systems), anti-STEM121 (мышиный , 1:200; Y40410, Takara Bio), anti-SATB2 (мышь, 1:50; ab51502, abcam), anti-GAD65/67 (krolik, 1:400; ABN904, Millipore) in anti-IBA1 (koza, 1:100; ab5076, abkom). Primarna uporabljena protitelesa so bila: anti-NeuN (miš, 1:500; ab104224, abcam), anti-CTIP2 (podgana, 1:300; ab18465, abcam), anti-GFAP (zajec, 1:1000; Z0334, Dako), anti-GFP (piščanec, 1:1000; GTX13970, GeneTex), anti-HNA (miš, 1:200; ab191181, abcam), anti-NeuN (zajec, 1:500; ABN78, Millipore), anti-PDGFRA (zajec, 1:200; sc-338, Santa Cruz), anti-PPP1R17 (zajec, 1:200; HPA047819, Atlas Antibodies), anti-RECA-1 (miš, 1:50; ab9774), abcam), anti-SCG2 (zajec, 1:100; 20357-1-AP, Proteintech), anti-SOX9 (koza, 1:500; AF3075, R&D Systems), netrin G1a (koza, 1:100; AF1166, R&D Systems), anti-STEM121 (miš, 1:200; Y40410, Takara Bio), anti-SATB2 (miš, 1:50; ab51502, abcam), anti-GAD65/67 (zajec, 1:400; ABN904, Millipore) in anti-IBA1 (koza, 1:100; ab5076, abkam).使用的一抗是：抗NeuN（小鼠，1:500；ab104224，abcam）抗CTIP2（大鼠，1:3 00；ab18465，abcam），抗GFAP（兔，1:1,000；Z0334，Dako），抗-GF P（鸡，1:1.000；GTX13970，GeneTex），抗HNA（小鼠，1:200；ab1911 81，abcam），抗NeuN（兔，1:500；ABN78，Millipore，，抗PDGFRA（兔， 1:200；sc-338，Santa Cruz），抗PPP1R17（兔，1:200；HPA047819，Atlas抗体），抗RECA-1(小鼠，1:50；ab9774，abcam），抗SCG2(兔）), 1:100；20357-1-AP，Proteintech），抗SOX9（山羊＊,1:500；AF3075，R&D Systems，Netrin G1a（山羊＊,1:100；AF1166，R&D Systems，抗STEM121＠(小鼠, 1:200;使用的一抗是：抗NeuN（小鼠，1:500；ab104224，abcam）抗CTIP2（大鼠，1 :300；ab18465，abcam），抗GFAP（兔，1:1,000；Z0334，Dako），抗-GFP（鸡，1:1.000；GTX13970，GeneTex），抗HNA（小鼠，1:200；ab 191181，abcam）,抗NeuN４(兔,1:500；ABN78，Millipore％弔４,抗1: 200；sc-338，Santa Cruz），抗PPP1R17（兔，1:200；HPA047819，Atlas抗体，，抗RECA-1（小鼠，1:50；ab9774，abcam），抗SCG2 100；20357-1-AP，Proteintech），抗SOX9（山羊，1:500；AF3075，R&D Systems，Netrin G1a（山羊，1:100；AF1166，R&R Sistemi）頏1:20, ;Y40410, Takara Bio), anti-SATB2 (miš, 1:50; ab51502, abcam), anti-GAD65/67 (zajec, 1:400; ABN904, Millipore) in anti-IBA1 (koza, 1:100; ab5076, abcam).Primarna uporabljena protitelesa so bila: anti-NeuN (miš, 1:500; ab104224, abcam), anti-CTIP2 (podgana, 1:300; ab18465, abcam) in anti-GFAP (zajec, 1:1000; Z0334, Dako). , anti-GFP (piščanec, 1:1000; GTX13970, GeneTex), anti-HNA (miš, 1:200; ab191181, abcam), anti-NeuN (zajec, 1:500; ABN78, Millipore), anti-PDGFRA (zajec, 1:200; sc-338, Santa Cruz), anti-PPP1R17 (zajec, 1:200; HPA047819, Atlas protitelo), anti-RECA-1 (miš, 1:50; ab9774, abcam), anti-SCG2 (zajec), 1:100;20357-1-AP, Proteintech), anti-SOX9 (koza, 1:500; AF3075, R&D Systems), Netrin G1a (koza, 1:100; AF1166, R&D Systems), anti-STEM121 (moš, 1:200; Y40410, Takara Bio), anti-SATB2 (мышь, 1:50; ab51502, abcam), anti-GAD65/67 (krolik, 1:400; ABN904, Millipore) in anti-IBA1 (koza, 1:100; ab5076, abcam). 20357-1-AP, Proteintech), anti-SOX9 (koza, 1:500; AF3075, R&D Systems), Netrin G1a (koza, 1:100; AF1166, R&D Systems), anti-STEM121 (miš, 1:200; Y40410, Takara Bio), anti-SATB2 (miš, 1:50; ab51502, abcam), anti-GAD65/67 (zajec, 1:400; ABN904, Millipore) in anti-IBA1 (koza, 1:100; ab5076, abkam).Rezine smo nato sprali s PBS in inkubirali s sekundarnim protitelesom 1 uro pri sobni temperaturi (zamrznjeni rezini) ali čez noč pri 4 °C (debeli rezini). Uporabili smo sekundarno protitelo Alexa Fluor (Life Technologies), razredčeno 1:1000 v blokirni raztopini. Po izpiranju s PBS smo jedra vizualizirali s Hoechst 33258 (Life Technologies). Na koncu smo preparate namestili na mikroskop s krovnimi stekelci (Fisher Scientific) z uporabo Aquamount (Polysciences) in analizirali na fluorescentnem mikroskopu Keyence (analizator BZ-X) ali konfokalnem mikroskopu Leica TCS SP8 (Las-X) na sliki. Slike smo obdelali s programom ImageJ (Fiji). Za kvantifikacijo deleža človeških nevronov v t-hCO in podganji skorji smo posneli pravokotne slike širine 387,5 μm v središču t-hCO, na robu podganje skorje ali blizu njega. Robove presadka smo določili z oceno sprememb v prosojnosti tkiva, jedrih HNA+ in/ali prisotnosti avtofluorescence tkiva. Na vsaki sliki je bilo skupno število celic NeuN+ in HNA+ deljeno s skupnim številom celic NeuN+ na istem območju. Da bi zagotovili štetje le celic z jedri v slikovni ravnini, so v izračun vključene le celice, ki so tudi Hoechst+. Za zmanjšanje statistične napake sta bili povprečeni dve sliki, ki sta med seboj oddaljeni vsaj 1 mm.
En teden pred odvzemom vzorcev smo živali s presadkom hCO (približno 8 mesecev diferenciacije) namestili v temno sobo s pristriženimi brki, da bi zmanjšali senzorično stimulacijo. Izolacijo jeder smo izvedli, kot je opisano že prej, z nekaj spremembami. Na kratko, t-hCO in hCO sta bila uničena z detergentno-mehansko celično lizo in 2 ml steklenim mlinčkom za tkivo (D8938, Sigma-Aldrich/KIMBLE). Surova jedra smo nato filtrirali s 40 µm filtrom in centrifugirali pri 320 g 10 minut pri 4 °C, preden smo izvedli gradient gostote saharoze. Po koraku centrifugiranja (320 g 20 minut pri 4 °C) smo vzorce resuspendirali v 0,04 % BSA/PBS z dodatkom 0,2 enot µl-1 inhibitorja RNaze (40 u µl-1, AM2682, Ambion) in jih prepustili skozi 40 µm pretočni filter. Disociirana jedra so nato resuspendirali v PBS, ki je vseboval 0,02 % BSA, in naložili na čip Chromium Single Cell 3′ (ocenjena količina 8000 celic na stezo). Knjižnice snRNA-seq so bile pripravljene s kompletom Chromium Single cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics). Knjižnice snRNA-seq so bile pripravljene s kompletom Chromium Single cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics). Biblioteke snRNA-seq so bile pripravljene s pomočjo Chromium Single cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics). Knjižnice snRNA-seq so bile pripravljene z uporabo kompleta Chromium Single cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics). snRNA-seq 文库是使用Chromium Single cell 3′ GEM、Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics) 制备的。 snRNA-seq 文库是使用Chromium Single cell 3′ GEM、Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics) 制备的。 Biblioteko snRNA-seq smo pripravili z uporabo Chromium Single Cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics). Knjižnica snRNA-seq je bila pripravljena z uporabo kompleta Chromium Single Cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics).Knjižnice iz različnih vzorcev so bile združene in sekvencirane s programom Admera Health na NovaSeq S4 (Illumina).
Ravni izražanja genov za vsako domnevno jedrno črtno kodo so bile kvantificirane z uporabo programskega paketa za analizo 10x Genomics CellRanger (različica 6.1.2). Natančneje, odčitki so bili primerjani s kombinacijo referenčnih genomov človeka (GRCh38, Ensemble, različica 98) in podganjega (Rnor_6.0, Ensemble, različica 100), ustvarjenih z ukazom mkref, in z uporabo ukaza count z ukazom –include-introns=TRUE za kvantifikacijo, vključno z odčitki, preslikanimi na intronske regije. Pri vzorcih t-hCO so bila človeška jedra identificirana na podlagi konzervativne zahteve, da se vsaj 95 % vseh preslikanih odčitkov ujema s človeškim genomom. Vse nadaljnje analize so bile izvedene na filtriranem izhodu matrike črtnih kod iz CellRangerja z uporabo paketa R (različica 4.1.2) Seurat (različica 4.1.1)32.
Da bi zagotovili, da so v nadaljnjo analizo vključena le jedra visoke kakovosti, je bil za vsak vzorec izveden iterativni postopek filtriranja. Najprej so identificirana in odstranjena jedra nizke kakovosti z manj kot 1000 najdenimi edinstvenimi geni in več kot 20 % vseh mitohondrijev. Nato je bila matrika surovega števila genov normalizirana z regularizirano negativno binomsko regresijo z uporabo funkcije sctransform(vst.flavor=”v2″), ki je identificirala tudi 3000 najbolj variabilnih genov z uporabo privzetih parametrov. Zmanjšanje dimenzije je bilo izvedeno na zgornjih variabilnih genih z uporabo analize glavnih komponent (PCA) s privzetimi parametri z uporabo dimenzije nabora podatkov 30 (dims = 30 je bila izbrana na podlagi vizualnega pregleda mest kolen in uporabljena za vse vzorce in analize ansambla). Nato smo izvedli več krogov iterativnega združevanja (ločljivost = 1) za razvrščanje genov na podlagi nenormalno nizkega števila genov (mediana pod 10. percentilom), nenormalno visokega števila mitohondrijskih genov (mediana nad 95. percentilom) za identifikacijo in odstranitev domnevnih celic nizke kakovosti, grozdov in/ali visokega deleža domnevnih dvojčkov, identificiranih z uporabo paketa DoubletFinder33 (povprečna vrednost DoubletFinder nad 95. percentilom). Vzorci t-hCO (n=3) in vzorci hCO (n=3) so bili ločeno integrirani z uporabo funkcije IntegrateData z zgornjimi parametri. Nato Izveden je bil še en krog kvalitativnega filtriranja integriranega nabora podatkov, kot je opisano zgoraj.
Po odstranitvi nizkokakovostnih jeder je bil integriran nabor podatkov združen (ločljivost = 0,5) in vdelan za namene vizualizacije UMAP34. Marker geni za vsako gručo so bili določeni z uporabo funkcije FindMarkers s privzetimi parametri, izračunanimi iz normaliziranih podatkov o izražanju genov. Glavne celične razrede identificiramo in razvrščamo z združevanjem referenčnih naborov podatkov fetalne in odrasle skorje z izražanjem marker genov 19,20,21,35 in opombami. Zlasti krožeče prekurzorje identificiramo z izražanjem MKI67 in TOP2A. Gruče progenitorjev so bile opredeljene z odsotnostjo mitotičnih transkriptov, visokim prekrivanjem z multipotentnimi glialnimi gručami progenitorjev, opisanimi v pozni metafazni fetalni skorji, ter izražanjem EGFR in OLIG1. Izraz astrocit uporabljamo za zajemanje več stanj diferenciacije astrocitov, od pozne radialne glije do zorenja astrocitov. Gruče astrocitov izražajo visoke ravni SLC1A3 in AQP4 ter se je pokazalo, da se preslikajo s podtipi fetalne radialne glije in/ali odraslih astrocitov. OPC izražajo PDGFRA in SOX10, medtem ko oligodendrociti izražajo mielinacijske markerje (MOG in MYRF). Glutamatergični nevroni so bili identificirani s prisotnostjo nevronskih transkriptov (SYT1 in SNAP25), odsotnostjo GABAergičnih markerjev (GAD2) in izražanjem NEUROD6, SLC17A7, BCL11B ali SATB2. GluN nevroni so bili nadalje razdeljeni v zgornje (izražanje SATB2 in izguba BCL11B) in globoke (izražanje BCL11B) podrazrede. Domnevni podploščni (SP) nevroni poleg globokih GluN markerjev izražajo znane SP18 markerje, kot sta ST18 in SORCS1. Celice, podobne žilnemu pleksusu, so bile identificirane z izražanjem TTR, meningealne celice pa so izražale gene, povezane s fibroblasti, in preslikale pialne/žilne celice referenčnega nabora podatkov.
Diferencialna analiza izražanja genov med podrazredi t-hCO in hCO je bila izvedena z uporabo novo razvite psevdo-šaržne metode, reproducirane v vzorcih, implementiranih s paketom Libra R (različica 1.0.0). Natančneje, za skupine so bili izvedeni log-verjetnostni testi edgeR (različica 3.36.0, paket R) s seštevanjem števila genov v celicah za dani celični razred za vsako replikacijo vzorca. Za vizualizacijo toplotnega zemljevida so bile normalizirane vrednosti na milijon (CPM) izračunane z uporabo edgeR (funkcija cpm()) in skalirane (da se doseže povprečje = 0, standardni odklon = 1). Izvedena je bila analiza obogatitve Gene Ontology (GO) znatno povečanih genov t-hCO GluN (vrednost P, popravljena z Benjamini-Hochbergom, manjša od 0,05, izražena v vsaj 10 % celic t-hCO GluN in povečanje spremembe za vsaj 2-krat), izvedena z uporabo ToppGene Suite (https://toppgene.cchmc.org/)37. Uporabljamo aplikacijo ToppFun s privzetimi parametri in poročamo o P-vrednostih, popravljenih z Benjamini-Hochbergom, izračunanih iz hipergeometričnih testov, označenih z GO.
Za ujemanje naših grozdov snRNA-seq z označenimi celičnimi grozdi iz referenčnih študij primarnega enoceličnega RNA-seq ali odraslega snRNA-seq19,20,21,22 smo uporabili pristop integracije parnih naborov podatkov. Za integracijo in primerjavo prekrivanj grozdov med nabori podatkov smo uporabili potek dela normalizacije SCTransform (v2) v Seuratu (z uporabo enakih parametrov kot zgoraj). Posamezni nabori podatkov so bili zaradi računske učinkovitosti naključno podmnoženi do 500 celic ali jeder na izvirni grozd. Z uporabo podobnega pristopa, kot je opisan že prej, je bilo prekrivanje grozdov definirano kot delež celic ali jeder v vsakem združenem grozdu, ki se prekriva z oznako referenčnega grozda. Za nadaljnjo klasifikacijo GluN smo uporabili Seuratov potek dela TransferData za podatke podmnožice GluN, da smo našim celicam GluN dodelili oznake referenčnih naborov podatkov.
Za oceno stanja zorenja globalnega transkriptoma vzorcev t-hCO in hCO smo naše psevdo-množične vzorce primerjali z BrainSpan/psychENCODE23, ki je sestavljen iz velikega zaporedja RNA, ki zajema razvoj človeških možganov. PCA smo izvedli na kombinirani matriki genske ekspresije, normalizirani z vzorci, iz kortikalnih vzorcev 10 tednov po spočetju in kasneje, v 5567 genih (skupaj z našimi podatki), ki so bili predhodno identificirani kot aktivni v kortikalnih vzorcih BrainSpan (opredeljeno kot več kot 50 % razvojne variance, pojasnjene s starostjo z uporabo kubičnega modela)38. Poleg tega smo z uporabo nenegativne matrične faktorizacije, kot je bilo opisano prej, izpeljali gene, povezane z glavnimi transkriptomskimi podpisi nevrorazvoja. Uteži vzorcev, izračunane z uporabo postopka nenegativne matrične faktorizacije, so prikazane na sliki 5b z razširjenimi podatki za vsak od petih podpisov, ki so jih opisali Zhu et al.38. Tudi tukaj so bili transkripcijski markerji, odvisni od aktivnosti, izpeljani iz predhodno objavljenih študij. Zlasti sta bila ERG in LRG znatno povečana v glutamatergičnih nevronih, identificiranih z zbirko snRNA-seq mišje vidne skorje po vizualni stimulaciji iz dodatne tabele 3 Hrvatin et al.16. LRG, obogatene s človekom, so bile pridobljene iz kultur človeških fetalnih možganov, aktiviranih s KCl, in pobrane 6 ur po stimulaciji, filtrirani geni pa so bili znatno povečani pri ljudeh, ne pa tudi pri glodavcih (dodatna tabela 4). Analiza obogatitve genskega nabora z uporabo teh genskih naborov je bila izvedena z enosmernim Fisherjevim natančnim testom.
Podgane anestezirajte z izofluranom, odstranite možgane in jih postavite v hladno (približno 4 °C) oksigenirano (95 % O2 in 5 % CO2) raztopino saharoze za rezine, ki vsebujejo: 234 mM saharoze, 11 mM glukoze, 26 mM NaHCO3, 2,5 mM KCl, 1,25 mM NaH2PO4, 10 mM MgSO4 in 0,5 mM CaCl2 (približno 310 mOsm). Koronalne rezine podganjih možganov (300–400 µm), ki vsebujejo t-hCO2, so bile narejene z vibratomom Leica VT1200, kot je opisano že prej39. Rezine so nato prenesli v komoro za rezanje s kontinuirano oksigenacijo pri sobni temperaturi, ki je vsebovala aCSF, pripravljeno iz: 10 mM glukoze, 26 mM NaHCO3, 2,5 mM KCl, 1,25 mM NaHPO4, 1 mM MgSO4, 2 mM CaCl2 in 126 mM NaCl (298 mOsm). vsaj 45 minut pred snemanjem. Rezine so bile posnete v potopljeni komori, kjer so bile neprekinjeno perfuzirane z aCSF (viala z 95 % O2 in 5 % CO2). Vsi podatki so bili posneti pri sobni temperaturi. t-hCO nevroni so bili prekinjeni z borosilikatno stekleno pipeto, napolnjeno z raztopino, ki je vsebovala 127 mM kalijevega glukonata, 8 mM NaCl, 4 mM magnezijevega ATP, 0,3 mM natrijevega GTP, 10 mM HEPES in 0,6 mM EGTA, pH 7,2, notranja raztopina pa je bila prilagojena s KOH (290 mOsm). Za regeneracijo je bil snemalni raztopini dodan biocitin (0,2 %).
Podatki so bili pridobljeni z ojačevalnikom MultiClamp 700B (Molecular Devices) in digitalizatorjem Digidata 1550B (Molecular Devices), nizkoprepustno filtrirani pri 2 kHz, digitalizirani pri 20 kHz in analizirani z uporabo Clampfit (Molecular Devices), Origin (OriginPro). 2021b, OriginLab) in prilagojenih funkcij MATLAB (Mathworks). Potencial stika je bil izračunan z uporabo JPCalc, vnosi pa so bili prilagojeni izračunani vrednosti -14 mV. Operacija IV je sestavljena iz serije tokovnih korakov v korakih po 10–25 pA, od -250 do 750 pA.
Talamus, bela snov in aferentne živce S1 so bili električno stimulirani v talamokortikalnih rezinah med snemanjem nevronov hCO s patch-clamp metodo, kot je bilo opisano že prej. Na kratko, možgani so bili postavljeni na mizo za 3D-tiskanje, nagnjeno pod kotom 10°, sprednji del možganov pa je bil prerezan pod kotom 35°. Možgani so bili nato prilepljeni na prerezano površino in prerezani, pri čemer so se ohranili štrleči aksoni talamokortika. Bipolarne volframove elektrode (0,5 MΩ) so bile nameščene na drugi mikromanipulator in strateško nameščene za stimulacijo štirih regij na celico (notranja kapsula, bela snov, S1 in hCO). Sinaptične odzive smo zabeležili po fazni stimulaciji s 300 µA pri 0,03–0,1 Hz.
Nevroni hChR2, ki izražajo hChR2, so bili aktivirani pri 480 nm, svetlobni impulzi, ki jih je ustvarila LED dioda (Prizmatix), pa so bili uporabljeni skozi objektiv ×40 (0,9 NA; Olympus), da bi zabeležili izražanje hChR2 v bližini celic. Premer osvetljenega polja je približno 0,5 mm, skupna moč pa 10–20 mW. Širina impulza je bila nastavljena na 10 ms, kar ustreza impulzu, oddanemu med poskusom vedenjskega učenja. Uporabljene so bile različne frekvence stimulacije, od 1 do 20 Hz, vendar je bil za kvantifikacijo uporabljen le prvi impulz serije. Intervali med nizi so običajno daljši od 30 s, da se čim bolj zmanjša vpliv na sinaptične inhibitorne ali olajševalne poti. Da bi preverili, ali je bil odziv hChR2 monosinaptičen, smo v kopel nanesli TTX (1 μM), dokler reakcija EPSC ni izginila, nato pa smo nanesli 4-aminopiridin (4-AP; 100 μM). Običajno se odziv vrne v nekaj minutah, z nekoliko daljšo zamudo med sprožitvijo LED diode in generiranjem EPSC. Za preverjanje, ali odziv poganjajo receptorji AMPA, je bil uporabljen NBQX (10 μM).
Ostri hCO rezini so bili narejeni, kot je opisano prej. Na kratko, hCO rezini so bili vdelani v 4% agarozo in preneseni v celice, ki so vsebovale 126 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM NaH2PO4, 1 mM MgSO4, 2 mM CaCl2, 26 mM NaHCO3 in 10 mM d-(+)-glukozo. Rezine so bile narezane na 200–300 µm pri sobni temperaturi z vibratorjem Leica VT1200 in shranjene v ASF pri sobni temperaturi. Nato je bilo na hCO rezinah pod direktnim mikroskopom SliceScope (Scientifica) izvedeno snemanje celih celic s patch-camp metodo. Rezine so bile perfuzirane z aCSF (95% O2 in 5% CO2) in celični signali so bili zabeleženi pri sobni temperaturi. Nevroni hCO so bili naneseni z borosilikatno stekleno pipeto, napolnjeno z raztopino, ki je vsebovala 127 mM kalijevega glukonata, 8 mM NaCl, 4 mM magnezijevega ATP, 0,3 mM natrijevega GTP, 10 mM HEPES in 0,6 mM EGTA, notranji pH 7,2, prilagojen s KOH (osmolarnost 290). Za namene regeneracije smo notranji raztopini dodali 0,2 % biocitina.
Podatki so bili pridobljeni s programom Clampex (Clampex 11.1, Molecular Devices) z uporabo ojačevalnika MultiClamp 700B (Molecular Devices) in digitalizatorja Digidata 1550B (Molecular Devices), nizkoprepustni filtrirani pri 2 kHz, digitalizirani pri 20 kHz in analizirani z uporabo programa Clampfit (različica 10.6) za analizo (Molecular Devices) in prilagojenih funkcij MATLAB (MATLAB 2019b, Mathworks). Potencial stika je bil izračunan z uporabo JPCalc, vnosi pa so bili prilagojeni izračunanemu potencialu stika -14 mV. Operacija IV je sestavljena iz serije tokovnih korakov v korakih po 5-10 pA od -50 do 250 pA.
Za morfološko rekonstrukcijo stisnjenih nevronov smo notranji raztopini dodali 0,2 % biocitina (Sigma-Aldrich). Celice smo po vrezovanju vsaj 15 minut pripravili. Nato smo pipeto počasi potegnili 1–2 minuti, dokler registrirana membrana ni popolnoma zaprta. Po postopku fiziologije rezin smo rezine fiksirali čez noč pri 4 °C v 4 % PFA, sprali s PBS X3 in razredčili v razmerju 1:1000 s streptavidinom konjugiranim DyLight 549 ali DyLight 405 (Vector Labs). Celice, napolnjene z biocitinom (2 %; Sigma-Aldrich), smo označili med snemanjem s patch clamp pri sobni temperaturi 2 uri. Rezine smo nato namestili na mikroskopska stekelca z uporabo Aquamount (Thermo Scientific) in jih naslednji dan vizualizirali na konfokalnem mikroskopu Leica TCS SP8 z uporabo oljnega imerzijskega objektiva z numerično aperturo ×40 1,3, povečavo ×0,9–1,0, xy. Frekvenca vzorčenja je približno 7 slikovnih pik na mikron. Z-skladi v intervalih 1 µm so bili pridobljeni serijsko, za pokritje celotnega dendritičnega drevesa vsakega nevrona pa so bili izvedeni mozaiki z-skladov in samodejno šivanje na osnovi Leice, da bi pokrili celotno dendritično drevo vsakega nevrona. Nevroni so bili nato delno ročno sledeni z uporabo vmesnika neuTube 40 in ustvarjene so bile datoteke SWC. Datoteke so bile nato naložene v vtičnik SimpleNeuriteTracer41 Fiji (ImageJ, različica 2.1.0; NIH).
Človeško kortikalno tkivo je bilo pridobljeno z informiranim soglasjem v skladu s protokolom, ki ga je odobril Institucionalni revizijski odbor Univerze Stanford. Dva vzorca človeškega poporodnega tkiva (starega 3 in 18 let) sta bila pridobljena z resekcijo frontalnega korteksa (srednji frontalni girus) kot del operacije refraktorne epilepsije. Po resekciji je bilo tkivo odvzeto v ledeno mrzlem NMDG-aCSF, ki je vseboval: 92 mM NMDG, 2,5 mM KCl, 1,25 mM NaH2PO4, 30 mM NaHCO3, 20 mM HEPES, 25 mM glukoze, 2 mM tiouree, 5 mM natrijevega askorbata, 3 mM natrijevega piruvata, 0,5 mM CaCl2 × 4H2O in 10 mM MgSO4 × 7H2O. Titrirano je bilo do pH 7,3–7,4 s koncentrirano klorovodikovo kislino. Tkiva so bila dostavljena v laboratorij v 30 minutah, koronalni rezi pa so bili odvzeti v skladu z zgoraj opisanim postopkom.
Vsi postopki na živalih so bili izvedeni v skladu s smernicami za oskrbo živali, ki jih je odobrila Univerza Stanford APLAC. Podgane (starejše od 140 dni po presaditvi) so bile anestezirane s 5 % izofluranom in intraoperativno anestezirane z 1–3 % izofluranom. Živali so bile nameščene v stereotaksični okvir (Kopf) in subkutano so jim injicirali buprenorfin s podaljšanim sproščanjem (SR). Lobanja je bila izpostavljena, očiščena in vstavljenih je bilo 3–5 kostnih vijakov. Za ciljanje t-hCO2 smo iz MRI slik ustvarili stereotaksične koordinate. Na mestu zanimanja je bila izvrtana luknja za sveder, vlakna (premera 400 µm, NA 0,48, Doric) pa so bila spuščena 100 µm pod površino hCO2 in pritrjena na lobanjo z UV-strdljivim zobnim cementom (Relyx).
Posnetki optične fotometrije so bili izvedeni, kot je bilo opisano že prej42. Za beleženje spontane aktivnosti so podgane namestili v čisto kletko, na vsajeno optično vlakno pa je bil priključen optični povezovalni kabel (Doric) s premerom 400 µm, priključen na sistem za zajem optičnih fotometričnih podatkov. Med 10-minutnim beleženjem motorične aktivnosti so živali lahko prosto raziskovale kletko. Za beleženje evocirane aktivnosti so podgane (več kot 140 dni po presaditvi) anestezirali s 5 % izofluranom za indukcijo in 1–3 % izofluranom za vzdrževanje. Žival so namestili v stereotaktični okvir (Kopf), brke na nasprotni strani t-hCO2 pa so obrezali na približno 2 cm in jih napeljali skozi mrežo, priključeno na piezoelektrični aktuator (PI). Na vsajeno optično vlakno je bil priključen optični povezovalni kabel (Doric) s premerom 400 µm in nato na sistem za zajem podatkov. Laske na nasprotni strani t-hCO2 so nato piezoelektrični pogon v 20-minutnem obdobju snemanja naključno odklonil 50-krat (2 mm pri 20 Hz, 2 s na predstavitev). Za nadzor časa odklona s kodo MATLAB po meri uporabite paket podpornih programov Arduino MATLAB. Dogodki so sinhronizirani s programsko opremo za zajem podatkov z uporabo impulzov tranzistor-tranzistorska logika (TTL).
Podgane (starejše od 140 dni po presaditvi) so anestezirali s 5 % izofluranom in jih intraoperativno anestezirali z 1–3 % izofluranom. Živali so namestili v stereotaksični okvir (Kopf) in jim subkutano injicirali buprenorfin SR in deksametazon. Lobanja je bila izpostavljena, očiščena in vstavljeni so bili 3–5 kostnih vijakov. Za ciljanje t-hCO₂ smo iz MRI slik ustvarili stereotaksične koordinate. Z visokohitrostnim svedrom je bila izvedena krožna kraniotomija (s premerom približno 1 cm) neposredno nad presajenim hCO₂. Ko je kost čim tanjša, vendar pred vrtanjem skozi celotno kost, smo s kleščami odstranili preostali nepoškodovani medenični disk, da bi razkrili spodaj ležeči t-hCO₂. Kraniotomija je bila napolnjena s sterilno fiziološko raztopino, na lobanjo pa sta bila z UV-strjenim zobozdravstvenim cementom (Relyx) pritrjena krovno stekelce in poseben zatič za glavo.
Dvofotonsko slikanje je bilo izvedeno z večfotonskim mikroskopom Bruker z objektivom Nikon LWD (×16, 0,8 NA). Slikanje GCaMP6 je bilo izvedeno pri 920 nm z 1,4-kratno povečavo v posamezni z-ravnini in 8-kratnim povprečjem 7,5 fps. Podgane so bile anestezirane s 5 % izofluranom in vzdrževane z 1–3 % izofluranom. Podgane so bile nameščene v prilagojeno naglavno napravo in pod lečo. Pridobljeni so bili 3-minutni posnetki motorične aktivnosti v ozadju. V 20 minutah snemanja je bilo s pikospricerjem naključno dostavljenih 50 vdihov (vsaka predstavitev je bila dolga 100 ms) na blazinico z brki nasproti t-hCO₂. Za nadzor časa izbruha s kodo MATLAB po meri uporabite paket podpornih impulzov Arduino MATLAB. Sinhronizirajte dogodke s programsko opremo za zajem podatkov (PrairieView 5.5) z uporabo impulzov TTL. Za analizo so bile slike popravljene za gibanje xy z uporabo afine korekcije v programu MoCo, ki je bil predstavljen na Fidžiju. Ekstrakcija fluorescentnih sledi iz posameznih celic z uporabo CNMF-E43. Fluorescenca je bila ekstrahirana za vsako območje zanimanja, pretvorjena v krivulje dF/F in nato pretvorjena v z-vrednosti.
Podgane (starejše od 140 dni po presaditvi) so anestezirali s 5 % izofluranom in jih intraoperativno anestezirali z 1–3 % izofluranom. Živali so namestili v stereotaksični okvir (Kopf) in jim subkutano injicirali buprenorfin SR in deksametazon. Brki na nasprotni strani t-hCO2 so bili odrezani na približno 2 cm in napeljani skozi mrežico, povezano s piezoelektričnim aktuatorjem. Lobanja je bila izpostavljena in očiščena. Na lobanjo je bil pritrjen vijak iz nerjavečega jekla za brušenje. Za ciljanje t-hCO2 smo iz MRI slik ustvarili stereotaksične koordinate. Z visokohitrostnim svedrom tik nad t-hCO2 smo izvedli krožno kraniotomijo (s premerom približno 1 cm). Ko je kost čim tanjša, vendar preden vrtate skozi celotno kost, s kleščami odstranite preostali nepoškodovani medenični disk, da razkrijete spodnji t-hCO2. Posamezne celice so bile posnete z uporabo 32-kanalnih ali 64-kanalnih silicijevih sond visoke gostote (Cambridge Neurotech), ozemljenih na ozemljitvene vijake in predhodno ojačanih z ojačevalniki RHD (Intan). Z manipulatorjem smo elektrode spustili na ciljno mesto skozi kraniotomijo, ki je napolnjena s sterilno fiziološko raztopino. Zbiranje podatkov je bilo izvedeno s frekvenco 30 kHz z uporabo sistema za zajem podatkov Open Ephys. Snemanje se je nadaljevalo šele, ko smo zaznali visoko korelirano ritmično spontano aktivnost v več kot 10 kanalih, kar kaže na to, da so bile elektrode nameščene v presadku (na podlagi podatkov dvofotonskega slikanja kalcija). Pridobljen je bil 10-minutni posnetek motorične aktivnosti v ozadju. Laske na nasprotni strani t-hCO2 so nato piezoelektrični pogon v 20-minutnem obdobju snemanja 50-krat (2 mm pri 20 Hz, 2 s na predstavitev) naključno odklonil. Z uporabo MATLAB Support Package za Arduino (MATLAB 2019b) smo nadzorovali čas odklona s kodo MATLAB po meri. Za sinhronizacijo dogodkov s programsko opremo za zajem podatkov smo uporabili TTL impulze.
Za poskuse optičnega označevanja je bil 200 µm optični povezovalni kabel (Doric), priključen na 473 nm laser (Omicron), priključen na 200 µm optično vlakno, nameščeno čez kraniotomijo. Tik pred tem je bila moč mostička nastavljena na 20 mW. Z manipulatorjem so elektrode spustili na ciljno mesto skozi kraniotomijo, ki je napolnjena s sterilno fiziološko raztopino. Na začetku snemanja je bilo oddanih deset svetlobnih impulzov 473 nm (frekvenca 2 Hz, trajanje impulza 10 ms). Fotosenzitivne celice so bile opredeljene kot celice, ki so v 70 % ali več poskusov pokazale odziv s konico v 10 ms svetlobe.