Merci fir Äre Besuch op Nature.com. Dir benotzt eng Browserversioun mat limitéierter CSS-Ënnerstëtzung. Fir déi bescht Erfahrung empfeelen mir Iech en aktualiséierte Browser ze benotzen (oder de Kompatibilitéitsmodus am Internet Explorer auszeschalten). Zousätzlech, fir eng weider Ënnerstëtzung ze garantéieren, weisen mir d'Websäit ouni Stiler a JavaScript.
Weist e Karussell vun dräi Folien gläichzäiteg un. Benotzt d'Knäppercher "Virdrun" an "Nächst" fir duerch dräi Folien gläichzäiteg ze navigéieren, oder benotzt d'Schieberknäppercher um Enn fir duerch dräi Folien gläichzäiteg ze navigéieren.
Selbstorganiséierend neuronal Organellen stellen eng villverspriechend In-vitro-Plattform fir d'Modeléierung vun der mënschlecher Entwécklung a Krankheet duer. Wéi och ëmmer, Organoiden feelen déi Konnektivitéit, déi in vivo existéiert, wat d'Reifung limitéiert an d'Integratioun mat anere Circuiten verhënnert, déi d'Verhalen kontrolléieren. Hei weisen mir, datt aus mënschleche Stammzellen ofgeleet kortikal Organoiden, déi an de somatosensoresche Cortex vun neonatalen plakege Ratten transplantéiert ginn, reif Zelltypen entwéckelen, déi sech a sensoresch a motivatiounsbezunnen Circuiten integréieren. D'MRI huet e posttransplantéierte Organoidwuesstum a verschiddene Stammzelllinnen an Déieren gewisen, während d'Single-Core-Analyse de Fortschrëtt vun der Kortikogenese an d'Entstoe vun engem Aktivitéitsofhängegen Transkriptiounsprogramm gewisen huet. Tatsächlech weisen transplantéiert kortikal Neuronen méi komplex morphologesch, synaptesch an intern Membraneigenschaften wéi hir In-vitro-Géigeparteien, wat d'Detektioun vun neuronalen Defekter bei Patienten mam Timothy-Syndrom erméiglecht. Anatomesch a funktionell Tracing huet gewisen, datt transplantéiert Organellen thalamokortikal an kortikokortikal Inputen kréien, an In-vivo-Opzeechnunge vun der neuronaler Aktivitéit suggeréieren, datt dës Inputen sensoresch Reaktiounen a mënschleche Zellen generéiere kënnen. Schlussendlech verlängeren kortikal Organoiden Axonen duerch d'Rattegehir, an hir optogenetesch Aktivatioun féiert zu engem Belounungssichende Verhalen. Sou reife transplantéiert mënschlech Cortex-Neuronen a bedeelege sech un de Kreeslafe vum Wirt, déi d'Verhale kontrolléieren. Mir erwaarden, datt dësen Usaz d'Detektioun vu Phenotypen op Strangniveau a Patientenzellen erliichtert, déi net mat anere Mëttele nogewise kënne ginn.
Dat sech entwéckelend mënschlecht Gehir ass e bemierkenswäerte selbstorganiséierende Prozess, bei deem Zellen sech proliferéieren, differenzéieren, migréieren a sech verbannen, fir funktionell neuronal Circuiten ze bilden, déi duerch sensoresch Erfahrung weider verfeinert ginn. E Schlësselproblem fir d'Entwécklung vum mënschleche Gehir ze verstoen, besonnesch am Kontext vu Krankheeten, ass de Manktem u Zougang zu Gehirgewebe. Selbstorganiséierend Organellen, dorënner mënschlech Cortex Organoiden (hCO; och bekannt als mënschlech Cortexkugel), kënnen 2,3,4,5,6 generéieren. Wéi och ëmmer, verschidde Limitatiounen limitéieren hir méi breet Uwendung fir d'Entwécklung a Funktioun vun neuronalen Circuiten ze verstoen. Besonnesch ass et net kloer, ob d'Reifung vun hCO duerch d'Feele vu bestëmmte mikroëmweltlechen an sensoreschen Inputen limitéiert ass, déi in vivo präsent sinn. Zousätzlech, well hCOs net a Circuiten integréiert sinn, déi Verhalensresultater generéiere kënnen, ass hiren Notzen bei der Modelléierung vu genetesch komplexen a verhalensneuropsychiatresche Stéierungen de Moment limitéiert.
D'Transplantatioun vun hCO an en intakt liewegt Gehir kann dës Aschränkungen iwwerwannen. Fréier Studien hunn gewisen, datt mënschlech Neuronen, déi an de Nagetiercortex transplantéiert goufen, fäeg sinn ze iwwerliewen, ze projizéieren a mat Nagetierzellen ze kommunizéieren7,8,9,10,11,12. Dës Experimenter ginn awer normalerweis op erwuessene Déieren duerchgefouert, wat d'synaptesch an axonaler Integratioun limitéiere kann. Hei beschreiwe mir e Transplantatiounsparadigma, an deem mir 3D hCO, deen aus hiPS-Zellen ofgeleet ass, an de primäre somatosensoresche Cortex (S1) vun immunodefizienten Ratten an engem fréie Stadium vun der plastescher Entwécklung transplantéiert hunn. Transplantéiert hCO (t-hCO) Neuronen ënnerleien enger substanzieller Reifung, kréien thalamokortikal an kortikal-kortikal Inputen, déi sensoresch Reaktiounen ausléisen, an erweideren axonal Projektiounen an d'Rattegehir fir e Belounungssichend Verhalen ze steigeren. Eng verlängert Reifung vun t-hCO huet neuronal Defekter bei Patienten mam Timothy-Syndrom (TS) opgedeckt, eng schwéier genetesch Stéierung, déi duerch Mutatiounen am spannungsempfindlechen L-Typ CaV1.2 Kalziumkanal (kodéiert vu CACNA1C) verursaacht gëtt.
Fir mënschlech kortikale Neuronen a Schaltkreesser in vivo ze studéieren, hu mir stereotaktesch intakt 3D hCO an den S1 vu fréie postnatalen athymesche Ratten transplantéiert (Deeg 3-7 postnatal) (Fig. 1a an erweidert Donnéeën aus Fig. 1a-c). Zu dësem Zäitpunkt hunn déi thalamokortikal an kortikokortikal axonal Projektiounen hir S1-Innervatioun nach net ofgeschloss (Ref. 13). Dofir ass dësen Usaz entwéckelt fir d't-hCO Integratioun ze maximéieren an den Impakt op endogen Schaltkreesser ze minimiséieren. Fir d'Lokalisatioun vun t-hCO a liewegen Déieren ze visualiséieren, hu mir T2-gewichtete MRI-Gehirrekonstruktioune vu Ratten 2-3 Méint no der Transplantatioun duerchgefouert (Fig. 1b an erweidert Donnéeën, Fig. 1d). t-hCO3 goufen einfach observéiert an d'Volumenmiessunge vun t-hCO3 waren ähnlech wéi déi, déi aus fixe Scheiwen berechent goufen (Erweidert Daten Fig. 1d,e; P > 0,05). t-hCO3 goufen einfach observéiert an d'Volumenmiessunge vun t-hCO3 waren ähnlech wéi déi, déi aus fixe Scheiwen berechent goufen (Erweidert Daten Fig. 1d,e; P > 0,05). t-hCO легко наблюдались, а объемные измерения t-hCO были аналогичны рассчитанным fir фиксированных расрезиз ( рис 1d, e; P> 0,05). t-hCO₂ konnten einfach observéiert ginn, an d'volumetresch t-hCO₂-Miessunge ware ähnlech wéi déi, déi fir fix Sektiounen berechent goufen (erweidert Donnéeën, Abb. 1d, e; P > 0,05).很容易观察到t-hCO，并且t-hCO的体积测量值与从固定切片计算的测量值相似（扩展数据图1d、e；P>。>。5）。5）很容易观察到t-hCO，并且t-hCO t-hCO легко наблюдался, а объемные измерения t-hCO были аналогичны рассчитанным fir фиксированных срезив ( рис 1d, e; P> 0,05). t-hCO₂ konnt liicht observéiert ginn, an d'volumetresch t-hCO₂-Miessunge ware ähnlech wéi déi, déi fir fix Sektiounen berechent goufen (erweidert Donnéeën, Abb. 1d, e; P > 0,05).Mir hunn t-hCO3 bei 81% vun den transplantéierten Déieren ongeféier 2 Méint no der Transplantatioun bestëmmt (n = 72 Déieren; hCO3 aus 10 hiPS-Zell-Linnen; hiPS-Zell-Linnen an der Ergänzungstabell 1). Vun dësen waren 87% am Gehircortex lokaliséiert (Fig. 1c). Duerch d'Duerchféierung vu serielle MRI-Scanne zu verschiddenen Zäitpunkten an der selwechter transplantéierter Ratt hu mir eng néngfach Erhéijung vum t-hCO3-Volumen bannent 3 Méint festgestallt (Fig. 1d an erweidert Donnéeën, Fig. 1f). Transplantéiert Déieren haten eng héich Iwwerliewensquote (74%) 12 Méint no der Transplantatioun (erweidert Donnéeën, Fig. 1g an Ergänzungstabell 2), an et goufen keng sichtbar motoresch oder Gedächtnisstéierungen, Gliose oder Elektroenzephalogramm (EEG) fonnt. Donnéeën Fig. 1g an Ergänzungstabell 2). 1h–m an 3e).
a, Schema vum experimentellen Design. hCO3, dat aus hiPS-Zellen ofgeleet gouf, gouf an den S1 vun neigebuerene plakege Ratten un den Deeg 30-60 vun der Differenzéierung transplantéiert. b, T2-gewichtete koronal an horizontal MRI-Biller, déi t-hCO3 an S1 2 Méint no der Transplantatioun weisen. Skala-Balke, 2 mm. c, Quantifizéierung vun den Engraftment-Erfolgsraten, déi fir all hiPS-Zelllinn gewisen ginn (n = 108, Zuelen an de Balke weisen d'Quantitéit vun t-hCO3 pro hIPS-Zelllinn un) a kortikal oder subkortikal Lag (n = 88). d, MRI-Bild vun enger Koronararterie (lénks; Skala-Balke, 3 mm) an entspriechend 3D-volumetresch Rekonstruktioun (Skala-Balke, 3 mm), déi eng Erhéijung vun t-hCO3 iwwer 3 Méint weist. e, Iwwerpréiwung vun den t-hCO3-Muster am Gehircortex vun der Ratt. Skala-Balke, 1 mm. f, Representativ immunozytochemesch Biller vun t-hCO vun uewe lénks no riets gewisen (wärend der Differenzéierung): PPP1R17 (4 Méint al), NeuN (8 Méint al), SOX9 an GFAP (8 Méint al), PDGFRα; (8 Méint), MAP2 (8 Méint) an IBA1 (8 Méint). Skala-Balk, 20 µm. Koexpression vun HNA weist Zellen vu mënschlechen Urspronk un. g, snRNA-seq: Unified Manifold and Projection (UMAP) Dimensionalitéitsreduktiounsbildgebung vun allen héichqualitativen t-hCO Kären no Seurat-Integratioun (n=3 t-hCO Proben, n=2 hiPS Zell-Linnen). Astrozyten, Zellen vun der Astrozyten-Linn; cyc prog, zirkulierend Virleefer; GluN DL, déif glutamatergesch Neuronen; GluN DL/SP, déif a sublamellär glutamatergesch Neuronen; GluN UL, glutamatergesch Neuronen an der ieweschter Schicht; Oligodendrozyten, Oligodendrozyten; OPC, Oligodendrozyten-Virleeferzellen; RELN, Reelin-Neuronen. h, Genontologie (GO)-Termanreicherungsanalyse vu Genen, déi signifikant eropreguléiert waren (ugepasst P < 0,05, Falännerung > 2, expriméiert an op d'mannst 10% vun den Zellkären) an t-hCO glutamatergen Neuronen am Verglach mat hCO glutamatergen Neuronen. h, Genontologie (GO)-Termanreicherungsanalyse vu Genen, déi signifikant eropreguléiert waren (ugepasst P < 0,05, Falännerung > 2, expriméiert an op d'mannst 10% vun den Zellkären) an t-hCO glutamatergen Neuronen am Verglach mat hCO glutamatergen Neuronen. h, Анализ обогащения терминов Gene Ontology (GO) fir генов со значительной активацией (скорректированный P <0,05, кратность изкратность изктивацией по крайней мере в 10% ядер) в глутаматергических нейронах t-hCO op сравнению mat глутаматергическими нейронах. h, Genontologie (GO) Termberäicherreicherungsanalyse fir Genen mat bedeitender Aktivatioun (ugepasst P<0,05, Falännerung >2, Expressioun an op d'mannst 10% Kären) an t-hCO glutamatergen Neuronen am Verglach mat hCO glutamatergen Neuronen. h，与hCO 谷氨酸能神经元相比，t-hCO 谷氨酸能神经元中基因显着上调（谎整吃整0,05，倍数变化> 2，在至少10% 的细胞核中表达）的基因本体论(GO) 术〭富 h ， 与 hco 谷氨酸 能 元 相比 ， t-hco 谷氨酸 能 神经 元 基因 显着 上谼 p <0 ０同变化 变化> 2 ， 至少 10% 的 核中 表达） 基因 基因 基因 的 的 的 的 的 的 的 的的 的 的 的本体论(GO) 术语富集分析. h, гены значительно активизировались (скорректированный P <0,05, кратность измения> 2, экспрессируется op 1%) глутаматергических нейронах t-hCO по сравнению с глутаматергическими нейронами hCO Онтологический (GO) анализими. h, Genen ware signifikant eropreguléiert (ugepasst P < 0,05, Ännerung vun der Gréisst > 2, expriméiert an op d'mannst 10% vun den Zellkären) an t-hCO glutamatergen Neuronen am Verglach mat hCO glutamatergen Neuronen Ontologesch (GO) Analyse vum Anreicherungsterm.Déi gepunkelt Linn weist en aq-Wäert vun 0,05 un. i, UMAP-Bildgebung vu GluN-Zelltypen an t-hCO mat Hëllef vun engem Labeltransfer vun engem Referenz-22-snRNA-seq-Datesaz vum Motorcortex vun Erwuessenen. CT — kortikothalamesche Zellen, ET — extrazerebral Zellen, IT — intern telencephalesch Zellen, NP — No bei Projektioun.
Mir hunn duerno d'Zytoarchitektur an d'allgemeng zellulär Zesummesetzung vun t-hCO ënnersicht. Antikörperfärbung vun den Endothelzellen vun der Ratt huet eng Vaskulariséierung mat t-hCO gewisen, während d'IBA1-Färbung d'Präsenz vu Rattemikroglia am ganze Transplantat gewisen huet (Fig. 1f an erweidert Donnéeën, Fig. 3c,d). Immunfärbung huet Zellen, déi positiv fir mënschlecht Nuklearantigen (HNA) sinn, gewisen, déi PPP1R17 (kortikal Virleefer), NeuN (Neuronen), SOX9 a GFAP (Gliazellen) oder PDGFRα (Oligodendrozyten-Virleefer) ko-expriméieren (Figur 1f). Fir d'zellulär Zesummesetzung vun t-hCO bei enger eenzeger Zellopléisung ze studéieren, hu mir no ongeféier 8 Méint Differenzéierung eng Single-Core RNA-Sequenzéierung (snRNA-seq) duerchgefouert. D'Bulkfiltratioun an d'Entfernung vu Rattekären hunn 21.500 héichqualitativ mënschlech mononuklear Kaarte geliwwert (Fig. 1g an erweidert Donnéeën, Fig. 4a,b). Expressiounsmuster vun typesche Zelltypmarkéierer hunn Cluster vu wichtege kortikale Zellklassen identifizéiert, dorënner déif a superfiziel glutamaterg Neuronen, zirkulierend Virleefer, Oligodendrozyten an Astrozyten-Linn (Fig. 1g, erweidert Donnéeën, Fig. 4c, an Ergänzungstabell 3). Immunfärbung fir SATB2 an CTIP2 huet gewisen, datt trotz der Präsenz vu kortikalen Ënnertypen, t-hCO keng kloer anatomesch Stratifikatioun gewisen huet (erweidert Donnéeën, Fig. 3a). Stadium-matched snRNA-seq hCO huet breet ähnlech Zellklassen produzéiert, mat e puer Ausnamen, dorënner d'Feele vun Oligodendrozyten an d'Präsenz vu GABAergeschen Neuronen, wat déi virdru gemellt favorabel In-vitro-Konditioune fir lateral Virleeferzellen15 reflektéiere kéint (erweidert Donnéeën, Fig. 4f - i an Ergänzungstabell 4). Differenziell Genexpressionsanalysen hunn signifikant Ënnerscheeder an de glutamatergen Neuronen tëscht t-hCO an hCO opgedeckt (Ergänzungstabell 5), dorënner d'Aktivéierung vu Sätz vu Genen, déi mat der neuronaler Reifung assoziéiert sinn, wéi synaptesch Signalgebung, dendritesch Lokalisatioun a spannungsgesteiert Kanalaktivitéit (Figur 1h an Ergänzungstabell 5). Tabelle 6). Dementspriechend hunn kortikal glutamaterg t-hCO Neuronen eng beschleunegt transkriptionell Reifung gewisen.
Fir ze klären, ob dës transkriptionell Ännerungen an t-hCO mat morphologeschen Ënnerscheeder tëscht hCO in vitro an t-hCO in vivo zesummenhänken, hu mir no 7-8 Méint Differenzéierung stage-matched Biocytin-gefëllte hCO an hCO an akuten Sektiounen rekonstruéiert. hCO Neuronen (Fig. 2a). t-hCO Neuronen ware wesentlech méi grouss, haten en 1,5-mol sou groussen Soma-Duerchmiesser, duebel sou vill Dendriten an eng sechsfach Erhéijung vun der gesamter dendritescher Längt am Verglach zu in vitro hCO (Fig. 2b). Zousätzlech hu mir eng wesentlech méi héich Dicht vun dendritesche Spinn an t-hCO Neuronen observéiert wéi an hCO Neuronen (Fig. 2c). Dëst weist drop hin, datt t-hCO Neuronen eng extensiv dendritesch Verlängerung a Verzweigung duerchmaachen, wat a Kombinatioun mat weiderer Zellproliferatioun zum intensiven Wuesstum vun t-hCO no der Transplantatioun bäidroe kann (Fig. 1d an erweidert Donnéeën Fig. 1f). Dëst huet eis dozou bruecht, d'elektrophysiologesch Eegeschafte z'ënnersichen. D'Membrankapazitanz war aachtmol méi héich (erweidert Donnéeën, Abb. 8d), de Membranpotential am Rouzoustand war méi hyperpolariséiert (ongeféier 20 mV), an d'Strouminjektioun huet eng méi héich maximal Anregungsquote an t-hCO Neuronen induzéiert wéi an hCO Neuronen. in vitro (Abb. 2d), e), wat mat de gréisseren a méi komplexe morphologesche Charakteristike vun t-hCO konsequent ass. Zousätzlech war d'Frequenz vun spontanen excitatoreschen postsynapteschen Stroumevenementer (EPSC) däitlech méi héich an t-hCO Neuronen (Abb. 2f), wat drop hiweist, datt déi erhéicht Dicht vun dendritesche Spinn, déi an t-hCO Neuronen observéiert gouf, mat der funktioneller Erregbarkeet vun der sexueller Synaps assoziéiert war. Mir hunn den onreife Charakter vun hCO Neuronen in vitro bestätegt andeems mir markéiert glutamatergesch Neuronen opgeholl hunn (erweidert Donnéeën, Abb. 6a-c).
a, 3D-Rekonstruktioun vun Biocytin-gefëllten hCO- an t-hCO-Neuronen no 8 Méint Differenzéierung. b, Quantifizéierung vu morphologesche Charakteristiken (n = 8 hCO Neuronen, n = 6 t-hCO Neuronen; **P = 0,0084, *P = 0,0179 an ***P < 0,0001). b, Quantifizéierung vu morphologesche Charakteristiken (n = 8 hCO Neuronen, n = 6 t-hCO Neuronen; **P = 0,0084, *P = 0,0179 an ***P < 0,0001). б, количественная оценка морфологических признаков (n = 8 нейронов hCO, n = 6 нейронов t-hCO; ** P = 0,0084, * P = 9 и 0,01***). b, Quantifizéierung vu morphologesche Charakteristiken (n=8 hCO Neuronen, n=6 t-hCO Neuronen; **P=0,0084, *P=0,0179, an ***P<0,0001). b，形态学特征的量化（n = 8 个hCO 神经元，n = 6 个t-hCO 神经元；**P = 0.0084，1*P9 0.0084，1***P90 0.0001). b，形态学特征的量化（n = 8 个hCO 神经元，n = 6 个t-hCO 神经元；**P = 0.0084，1*P9 0.0084，1***P90 0.0001). б, количественная оценка морфологических признаков (n = 8 нейронов hCO, n = 6 нейронов t-hCO; ** P = 0,0084, * P = 9 и 0,01***). b, Quantifizéierung vu morphologesche Charakteristiken (n=8 hCO Neuronen, n=6 t-hCO Neuronen; **P=0,0084, *P=0,0179, an ***P<0,0001).c, 3D-Rekonstruktioun vun dendritesche Branchen vun hCO₃ an t-hCO₃ no 8 Méint Differenzéierung. Rout Asterisken weisen op vermutlech dendritesch Wirbelsailen hin. Dichtquantifizéierung vun der dendritescher Wirbelsail (n = 8 hCO₃ Neuronen, n = 6 t-hCO Neuronen; **P = 0,0092). d, Quantifizéierung vum Roumembranpotential (n = 25 hCO Neuronen, n = 16 t-hCO Neuronen; ***P < 0,0001). d, Quantifizéierung vum Roumembranpotential (n = 25 hCO Neuronen, n = 16 t-hCO Neuronen; ***P < 0,0001). d, количественная оценка мембранного потенциала покоя (n = 25 нейронов hCO, n = 16 нейронов t-hCO; *** P <0,0001). d, Quantifizéierung vum Roumembranpotential (n = 25 hCO Neuronen, n = 16 t-hCO Neuronen; ***P < 0,0001). d，静息膜电位的量化（n = 25 hCO 神经元，n = 16 t-hCO 神经元；***P < 0.0001）. d，静息膜电位的量化（n = 25 hCO 神经元，n = 16 t-hCO 神经元；***P < 0.0001）. d, количественная оценка мембранного потенциала покоя (n = 25 нейронов hCO, n = 16 нейронов t-hCO; *** P <0,0001). d, Quantifizéierung vum Roumembranpotential (n = 25 hCO Neuronen, n = 16 t-hCO Neuronen; ***P < 0,0001). e, Widderhuelend Aktiounspotenzialausléisen an hCO an t-hCO induzéiert duerch Erhéijung vun de Strouminjektiounen, a Quantifizéierung vun der maximaler Feierrate (n = 25 hCO Neuronen, n = 16 t-hCO Neuronen; ***P < 0,0001). e, Widderhuelend Aktiounspotenzialausléisen an hCO an t-hCO induzéiert duerch Erhéijung vun de Strouminjektiounen, a Quantifizéierung vun der maximaler Feierrate (n = 25 hCO Neuronen, n = 16 t-hCO Neuronen; ***P < 0,0001). e, повторное возбуждение потенциала действия в hCO an t-hCO, вызванное увеличением тока, a количествия скорости возбуждения (n = 25 нейронов hCO, n = 16 нейронов t-hCO; *** P <0,0001). e, Neiopléisung vum Aktiounspotenzial an hCO an t-hCO, induzéiert duerch Stroumerhéijung an Quantifizéierung vun der maximaler Feierrate (n = 25 hCO Neuronen, n = 16 t-hCO Neuronen; *** P < 0,0001). e，通过增加电流注入诱导的hCO 和t-hCO 重复动作电位放电，以及最大攌电缇n =2个hCO 神经元，n = 16 个t-hCO 神经元；***P < 0.0001）. E ， 通过 增加 电流 注入 的 的 hco 和 t-hco 重复 电位 放电 ， 以及 最 的 的  n = 2个 hco 神经 ， n = 16 个 t-hco 神经 ； *** p <0.0001） 。 e, повторяющееся возбуждение потенциала действия hCO an t-hCO, вызванное увеличением подачи токениче, и коциче максимальной скорости возбуждения (n = 25 нейронов hCO, n = 16 нейронов t-hCO; *** P <0,0001). e, widderhuelend Ausléisen vun hCO- an t-hCO-Aktiounspotenzialer, induzéiert duerch erhéicht Stroumversuergung an Quantifizéierung vun der maximaler Ausléisquote (n = 25 hCO-Neuronen, n = 16 t-hCO-Neuronen; *** P < 0,0001). f, Spontan EPSCs (sEPSCs) an hCO- an t-hCO-Neuronen no 8 Méint Differenzéierung, a Quantifizéierung vun der Frequenz vun synapteschen Eventer (n = 25 hCO-Neuronen, n = 17 t-hCO-Neuronen; ***P < 0,0001). f, Spontan EPSCs (sEPSCs) an hCO- an t-hCO-Neuronen no 8 Méint Differenzéierung, a Quantifizéierung vun der Frequenz vun synapteschen Eventer (n = 25 hCO-Neuronen, n = 17 t-hCO-Neuronen; ***P < 0,0001). f, спонтанные EPSC (sEPSC) в нейронах hCO an t-hCO через 8 месяцев дифференцировки a количественная оценка часипаты событий (n = 25 нейронов hCO, n = 17 нейронов t-hCO; *** P <0,0001) . f, Spontan EPSCs (sEPSCs) an hCO- an t-hCO-Neuronen no 8 Méint Differenzéierung a Quantifizéierung vun de synapteschen Eventraten (n=25 hCO-Neuronen, n=17 t-hCO-Neuronen; ***P<0,0001). f，分化8 个月时hCO 和t-hCO 神经元中的自发性EPSCs (sEPSCs)，以及突触事件频率的神经元，n = 17 t-hCO 神经元；***P < 0,0001）. f，分化8 个月时hCO 和t-hCO 神经元中的自发性EPSCs (sEPSCs)，以及突触事件频率的神率的量匼（n = 25 hCO 神率的量匼（n = 25hCO P < 0,0001）. f, спонтанные EPSC (sEPSC) в нейронах hCO an t-hCO через 8 месяцев дифференцировки a количественная оценка часипаты событий (n = 25 нейронов hCO, n = 17 нейронов t-hCO; *** P <0,0001). f, Spontan EPSCs (sEPSCs) an hCO- an t-hCO-Neuronen no 8 Méint Differenzéierung a Quantifizéierung vun synapteschen Eventraten (n = 25 hCO-Neuronen, n = 17 t-hCO-Neuronen; *** P<0,0001).Fir bf goufen hCO3 an t-hCO3 an der Linn 1208-2 aus dem selwechten Differenzéierungsbatch geholl, deen parallel gehale gouf. g, Genset-Anreicherungsanalyse (eenseitege Fisher-exakten Test) vu Genen, déi signifikant eropreguléiert sinn (ugepasst P < 0,05, Faltännerung > 2, expriméiert an op d'mannst 10% vun den Zellkären) an t-hCO glutamatergen Neuronen am Verglach mat hCO glutamatergen Neuronen mat Gensätz vu souwuel fréier-Äntwert (ERG) wéi och spéit-Äntwert (LRG) Aktivitéitsofhängegen Genen, déi aus enger in vivo Mausstudie identifizéiert goufen16 an mënschespezifesche LRGs aus in vitro Neuronen17. g, Genset-Anreicherungsanalyse (eenseitege Fisher-exakten Test) vu Genen, déi signifikant eropreguléiert sinn (ugepasst P < 0,05, Faltännerung > 2, expriméiert an op d'mannst 10% vun den Zellkären) an t-hCO glutamatergen Neuronen am Verglach mat hCO glutamatergen Neuronen mat Gensätz vu souwuel fréier-Äntwert (ERG) wéi och spéit-Äntwert (LRG) Aktivitéitsofhängegen Genen, déi aus enger in vivo Mausstudie identifizéiert goufen16 an mënschespezifesche LRGs aus in vitro Neuronen17. g, анализ обогащения набора генов (односторонний точный критерий Фишера) генов со значительной активацивацие (5,0,0 кратность изменения > 2, экспрессия по меньшей мере в 10% ядер) an глутаматергических нейровнах t-hCO по сратность глутаматергическими нейронами hCO наборы генов как раннего (ERG), так и позднего (LRG) генов, зависящих от Aktualiséierungen, идентифицированных в исследовании на мышах in vivo16, an специфических fir человека LRG из ней1ронов. g, Analyse vun der Gen-Set-Anreicherung (eensäitege Fisher-Exakt-Test) vu Genen mat bedeitender Aktivatioun (ugepasst P<0,05, Falenännerung >2, Expressioun an op d'mannst 10% vun den Zellkären) an t-hCO glutamatergen Neuronen am Verglach mat hCO glutamatergen Neuronen-Sets vu souwuel fréien (ERG) wéi och spéiten (LRG) Aktivitéitsofhängegen Genen, déi an in vivo Mais16 a mënschespezifesche LRGs aus Neuronen in vitro17 identifizéiert goufen. g，t-hCO谷氨酸能神经元与hCO谷氨酸能神经元相比，t -hCO谷氨酸能神经元显着上调（调整后P<0.05，倍数变化>2，在至少10%的细胞核中表达）的基因集富集分析（单侧F isher精确检验）从体内小鼠研究中鉴定的早期反应(ERG)和晚期反应(LRG) 活性依赖性基因的基因组16 和体外神经元17 中的人类特异 g ， t-hco 谷氨酸 神经 元 与 hco 谷氨酸 神经 元 相比 ， t-hco 谷氨酸 神经 兰 谷氨酸 神经 兰<0.05 ， 倍数> 2 ， 至少 至少 10%的 细胞 核中 表达） 的 集富集 分析 羧单） （单体内 小鼠 研究 中 的 早期 反应 反应 反应 和 晚期 反应 反应 (lrg) 活性 基因 的 基因 经 16神经元 17 中 中 17 中 17的人类特异性LRG. g, глутаматергические нейроны t-hCO были значительно активизированы по сравнению с глутаматергическими нейкронов ( P<0,05, кратность измения> 2, не менее 10% позднего гены, зависящие от активности ответа (LRG), идентифицированные в исследованиях на мышах in vivo16 an нейронах in vitro17. LRG, специфичные для человека. g, t-hCO glutamatergesch Neuronen ware signifikant eropreguléiert am Verglach mat hCO glutamatergeschen Neuronen (ugepasst P < 0,05, Ännerung vun der Fachhéicht > 2, op d'mannst 10 %. Analyse vun der Genberäicherung vun der fréier Äntwert (ERG) an der spéider Äntwert (eensäitege Fisher-Exakt-Test) mat Äntwertaktivitéitsofhängegen Genen (LRGs), déi an in vivo Mais16 an in vitro Neuronen identifizéiert goufen.17 Mënschspezifesch LRGs.Déi gepunkelt Linn weist e Bonferroni-korrigéierte P-Wäert vun 0,05 un. h, d'GluN-Genexpression (Pseudo-Package a Skaléierung vun all Gen) war signifikant eropreguléiert an snRNA-seq-Replike vun LRG-Genen an t-hCO glutamatergen Neuronen. i, Immunfärbung déi d'SCG2-Expressioun an t-hCO (ieweschten) an hCO (ënnen) Neuronen weist. Wäiss Pfeile weisen op SCG2+ Zellen. Skala-Balk, 25 µm. D'Donnéeë ginn als Mëttelwäert ± Standardofwäichung ausgedréckt.
Baséierend op der erhéichter Aktivitéit vun t-hCO, déi an ex vivo Scheiwen observéiert gouf, huet snRNA-seq eng Aktivitéitsofhängeg Upreguléierung vu Gentranskripten an t-hCO am Verglach zu hCO in vitro opgedeckt. Glutamatergesch t-hCO Neuronen hunn méi héich Niveauen vu Genen expriméiert, déi d'Aktivitéit vun der spéider Reaktioun reguléieren (Fig. 2g,h), déi a fréiere Studien a Maus- an mënschlechen Neuronen fonnt goufen16,17. Zum Beispill hunn BDNF18, SCG2 an OSTN, e primatenspezifescht Aktivitéitsreguléierungsgen, eng erhéicht Expressioun an t-hCO Neuronen am Verglach zu hCO Neuronen gewisen (Fig. 2g-i). Dofir hunn t-hCO Neuronen duerch transkriptionell, morphologesch a funktionell Analysen verbessert Reifungseigenschaften am Verglach zu hCO Neuronen gewisen.
Fir d'Associatioun vun der t-hCO-Reifung mat der Entwécklung vum mënschleche Gehir weider ze evaluéieren, hu mir transkriptomesch Vergläicher vu fetalen an erwuessene Kortekszelltypen19,20 an Erwuessenen21,22 duerchgefouert, souwéi extensiv Donnéeën iwwer d'kortikal Genexpression23 während der Entwécklung (erweidert Donnéeën, Abb. 5). Mat fréierer Aarbecht24 ass de globale hCO- an t-hCO-Transkriptom-Reifungsstatus no 7-8 Méint Differenzéierung am Groussen a Ganzen mat der In-vivo-Entwécklungszäit iwwereneestëmmend an ass am meeschten gläichwäerteg mam spéide fetale Liewen (Erweidert Donnéeën, Abb. 5a). Bemierkenswäert ass, datt mir eng erhéicht Transkriptom-Reifung an t-hCO am Verglach zu altersgerechten hCO observéiert hunn, souwéi eng Transkriptom-Aktivéierung a Verbindung mat Synaptogenese, Astrogenese a Myeliniséierung (erweidert Donnéeën, Abb. 5b-d). Op zellulärem Niveau hu mir Beweiser fir en dënnen Kortex-Subtyp an t-hCO fonnt, mat Cluster vu glutamatergen Neuronen, déi sech mat erwuessene L2/3-, L5- an L6-Neuron-Subtypen iwwerlappen (Figur 1i). Am Géigesaz dozou war d'Iwwerlappung vu Clusteren tëscht glutamatergen t-hCO Neuronen a fetale kortikalen Neuronen an der Mëtt vun der Schwangerschaft méi limitéiert (erweidert Donnéeën, Figur 5e-j). Fir festzestellen, ob t-hCO Neuronen funktionell ähnlech wéi mënschlech postnatal neokortikal Neuronen sinn, hu mir elektrophysiologesch Opzeechnungen an anatomesch Rekonstruktioune vu mënschlechen L2/3 Pyramidneuronen a schaarfe Schnëtter vum mënschleche postnatale Cortex duerchgefouert (erweidert Donnéeën, Fig. 7a). Déi elektrophysiologesch Eegeschafte vun den L2/3 Pyramidneuronen waren ähnlech wéi déi vun den t-hCO Pyramidneuronen (erweidert Donnéeën, Fig. 7e). Morphologesch waren L2/3 Neuronen aus postnatale mënschleche Proben méi ähnlech wéi t-hCO wéi hCO, obwuel L2/3 Zellen méi laang waren, am Allgemengen méi Äscht enthalen hunn an eng méi héich Wirbelsaildicht haten (Fig. 3g an erweidert Donnéeën, Fig. 7b-). G).
a, Transplantatioun vun hCO, produzéiert vu Kontroll- an TS hiPS-Zell-Linnen, an nei gebuer Ratten. b, 3D-Rekonstruktioun vun Biocytin-gefëllten t-hCO-Neuronen no 8 Méint Differenzéierung. c, Quantifizéierung vun der mëttlerer dendritescher Längt (n = 19 Kontrollneuronen, n = 21 TS-Neuronen; **P = 0,0041). d, 3D-rekonstruéiert dendritesch Branchen aus Kontroll an TS t-hCO no 8 Méint Differenzéierung, a Quantifizéierung vun der dendritescher Wirbelsaildicht (n = 16 Kontrollneuronen, n = 21 TS-Neuronen, ***P < 0,0001). d, 3D-rekonstruéiert dendritesch Branchen aus Kontroll an TS t-hCO no 8 Méint Differenzéierung, a Quantifizéierung vun der dendritescher Wirbelsaildicht (n = 16 Kontrollneuronen, n = 21 TS-Neuronen, ***P < 0,0001). d, 3D-Réckkonstanz ветвей из контроля an TS t-hCO через 8 месяцев диференцировки a контролический дендритных шипов (n = 16 контрольных нейронов, n = 21 TS нейронов, *** P <0,0001). d, 3D-Rekonstruktioun vun dendritesche Branchen aus Kontroll- an t-hCO TS no 8 Méint Differenzéierung a Quantifizéierung vun der dendritescher Wirbelsaildicht (n=16 Kontrollneuronen, n=21 TS-Neuronen, ***P<0,0001). d，分化8 个月时对照和TS t-hCO 的3D 重建树突分支，以及树突棘密度的量化1,6个对照神经元，n = 21 个TS 神经元，***P < 0.0001）. d ， 分化 8 个 时 对照 和 ts t-hco 的 3d 重建 分支 分支 以及 树突棘 导度 1 n = 6神经 元 ， n = 21 个 ts 神经 ， *** p <0.0001 ）. d, 3D-Réckkonstanz an TS t-hCO iwwer 8 Méint Konstruktioun a Konstruktioun дендритных шипов (n = 16 контрольных нейронов, n = 21 TS нейронов, *** P <0,0001). d, 3D-Rekonstruktioun vun de Kontroll-dendritesche Branchen an TS t-hCO no 8 Méint Differenzéierung a Dichtquantifizéierung vun der dendritescher Wirbelsail (n=16 Kontrollneuronen, n=21 TS-Neuronen, ***P<0,0001).Rout Asterisken weisen op vermutlech dendritesch Wirbelsäule hin. e, spontan EPSCs a Kontroll- an TS t-hCO Neuronen no 8 Méint Differenzéierung. f, kumulativ Frequenzdiagramm a Quantifizéierung vun der Frequenz an Amplitude vu synapteschen Eventer (n=32 Kontrollneuronen, n=26 TS Neuronen; **P=0,0076 an P=0,8102). g, Scholl-Analyse vun TS- an Kontrollneuronen an hCO an t-hCO. Gestreckelt Linnen weisen mënschlech L2/3 postnatal pyramidesch Neuronen zum Verglach (n = 24 Kontroll t-hCO Neuronen, n = 21 TS t-hCO Neuronen, n = 8 Kontroll hCO Neuronen, an n = 7 TS hCO Neuronen). D'Donnéeë ginn als Mëttelwäert ± Standardofwäichung ausgedréckt.
D'Fäegkeet vun t-hCO, déi morphologesch a funktionell Charakteristike vun mënschleche Cortex-Neuronen op engem héijen Niveau ze replizéieren, huet eis dozou bruecht ze ënnersichen, ob t-hCO benotzt ka ginn, fir Krankheetsphenotypen z'entdecken. Mir hunn eis op TS konzentréiert, eng schwéier neurologesch Entwécklungsstéierung, déi duerch Gain-of-Function-Mutatiounen am Gen verursaacht gëtt, dat CaV1.2 kodéiert, wat d'Aktivitéitsofhängeg Gentranskriptioun an Neuronen initiéiert. Mir hunn hCO vun dräi TS-Patienten kritt, déi déi heefegst Substitutioun (p.G406R) an dräi Kontrollen (Fig. 3a) haten. No der Transplantatioun hu mir festgestallt, datt d'dendritesch Morphologie an TS-Neuronen am Verglach mat Kontrollen verännert war (Fig. 3b an erweidert Donnéeën, Fig. 8a,b), mat enger duebeler Erhéijung vun der Zuel vun den primären Dendriten an enger allgemenger Erhéijung vun der duerchschnëttlecher an allgemenger Ofsenkung vun der dendritescher Längt (Fig. 3c an erweidert Donnéeën, Fig. 8c). Dëst war mat enger erhéichter Dicht vu Stachelen an enger erhéichter Frequenz vu spontanen EPSCs an TS am Verglach mat Kontrollneuronen assoziéiert (Fig. 3d-f an erweidert Donnéeën, Fig. 8g). Weider Analysen hunn Mustere vun anormaler dendritescher Verzweigung an t-hCO TS am Verglach mat Kontrollen opgedeckt, awer net an in vitro TS hCO an engem ähnlechen Differenzéierungsstadium (Fig. 3g). Dëst stëmmt mat eise fréiere Berichter iwwer Aktivitéitsofhängeg dendritesch Schrumpfung an TS iwwereneen a weist d'Fäegkeet vun dëser Transplantatiounsplattform ënner, Krankheetsphenotypen in vivo z'entdecken.
Mir hunn dann gefrot, a wéi engem Mooss t-hCO Zellen funktionell an den S1 vun der Ratt integréiert sinn. Den S1 bei Nagetieren kritt staark synaptesch Inputen vun den ipsilateralen ventrale basalen an posterioren Thalamuskären, souwéi vun den ipsilateralen motoreschen a sekundären somatosensoresche Cortexen, an dem kontralateralen S1 (Fig. 4a). Fir den Innervatiounsmuster ze restauréieren, hu mir hCO mat Tollwutvirus-dG-GFP/AAV-G infizéiert an hCO 3 Deeg méi spéit an d'S1 Ratt transplantéiert. Mir hunn eng dicht GFP-Expressioun an Neuronen vum ipsilateralen S1 a ventrale Basalganglien 7-14 Deeg no der Transplantatioun observéiert (Fig. 4b, c). Zousätzlech huet d'Antikörperfärbung vum Thalamusmarker Netrin G1 d'Präsenz vun Thalamusendungen an t-hCO opgedeckt (Fig. 4d, e). Fir ze evaluéieren, ob dës afferent Projektiounen synaptesch Äntwerten an t-hCO Zellen ausléise kéinten, hu mir Ganzzellopname vu mënschlechen Zellen a schaarfe Schnëtter vun der thalamokortikaler Schicht duerchgefouert. Elektresch Stimulatioun vum Ratten-S1, der interner Kapsel, der wäisser Substanz, de Faseren no bei t-hCO oder optogenetesch Aktivatioun vun Opsin-expriméierenden Thalamus-Enden an t-hCO hunn EPSCs mat kuerzer Latenz an t-hCO Neuronen induzéiert, déi dem AMPA-Rezeptor-Antagonist NBQX ausgesat waren. (Fig. 4f, g an erweidert Donnéeën, Fig. 9a-g). Dës Donnéeë weisen datt t-hCO anatomesch am Rattegehir integréiert ass a vum Rattewirtgewebe aktivéiert ka ginn.
a, Schematesch Diagramm vun engem Tollwut-Tracking-Experiment. b, GFP an mënschespezifesch STEM121-Expressioun tëscht t-hCO a Rattenhirncortex (iewescht Panel). Och gewisen ass d'GFP-Expressioun am ipsilateralen ventrale Basalkär (VB) vun der Ratt (ënnen lénks) an ipsilateralen S1 (ënnen riets). Skala-Balk, 50 µm. Déi rout Quadraten representéieren d'Gebitter vum Gehir, wou d'Biller gemaach goufen. c, Quantifizéierung vun Zellen, déi GFP expriméieren (n = 4 Ratten). d, e - Netrin G1+ Thalamusterminalen an t-hCO. d weist eng koronal Sektioun mat t-hCO- a VB-Kären. Skala-Balk, 2 mm. e weist d'Netrin G1- an STEM121-Expressioun an t-hCO- (lénks) an VB- (riets) Neuronen. Skala-Balk, 50 µm. Déi orange gepunktete Linn weist d't-hCO-Grenz un. f, g, Aktuell Spuere vun t-hCO Neuronen no elektrescher Stimulatioun an der S1 Ratt (f) oder interner Kapsel (g), mat (violett) oder ouni (schwaarz) NBQX (lénks). EPSC Amplituden mat an ouni NBQX (n = 6 S1 Neuronen, *P = 0,0119; an n = 6 intern Kapsel Neuronen, **P = 0,0022) (Mëtt). Prozentsaz vun t-hCO Neuronen, déi EPSC als Äntwert op elektresch Stimulatioun vun der Ratt S1 (f) oder interner Kapsel (g) weisen (riets). aCSF, künstlech Zerebrospinalflëssegkeet. h, schematescht Diagramm vum 2P-Bildgebungsexperiment (lénks). Expressioun vu GCaMP6s an t-hCO (Mëtt). Skala-Staang, 100 µm. Fluoreszenz-Zäitlaf vu GCaMP6s (riets). i, Z-Score vun der spontaner Aktivitéitsfluoreszenz. j, schematesch Illustratioun vun der Moustache-Stimulatioun. k, z-bewäert 2P-Fluoreszenztrajektorien an engem Versuch, ausgeriicht mat der Whisker-Ofwäichung zum Zäitpunkt Null (gestreckte Linn) a Beispillzellen. l, Populatiounsduerchschnëttlech z-Score-Äntwerten vun allen Zellen, ausgeriicht mat der Whisker-Ofwäichung zum Zäitpunkt Null (gestreckte Linn) (rout) oder zoufälleg generéiert Zäitstempel (gro). m. Schematescht Diagramm vum Experiment iwwer optesch Markéierung. n, Réi Spannungskurven vun enger Beispill-t-hCO-Zell während der Blolaserstimulatioun oder Whisker-Ofwäichung. Rout Pfeiler weisen déi éischt Spëtzen un, déi duerch Liicht verursaacht ginn (uewen) oder duerch Whisker-Ofwäichung (ënnen). Gro Schattéierung weist Perioden vun der Whisker-Ofwäichung un. o, Peak-Liichtwellenformen a Whisker-Ofwäichungsäntwerten. p, Spëtzen vun engem eenzege Versuch, ausgeriicht mat der Ofwäichung vun de Whisker an den Zellen vum Beispill. 0 weist Whisker-Ofwäichung un (gestreckte Linn). q, Populatiounsduerchschnëttlech z-Score-Feierrate fir all photosensitiv Zellen, ausgeriicht mat der Whisker-Ofwäichung zum Zäitpunkt Null (gestreckte Linn) (rout) oder zoufälleg generéiert Zäitstempel (gro). r, Proportioun vun de photosensitiven Eenheeten, déi signifikant duerch d'Schnurresofwäichung moduléiert sinn (n = 3 Ratten) (lénks). Peak z-Score Latenz (n = 3 Ratten; n = 5 (hellgréng), n = 4 (donkelgréng) an n = 4 (cyan) Schnurresofwäichungsmodulatiounseenheeten pro Ratt) (riets). D'Donnéeë ginn als Moyenne ± Standardofwäichung ausgedréckt.
Mir hunn duerno gefrot, ob t-hCO duerch sensoresch Stimuli in vivo aktivéiert ka ginn. Mir hunn hCO, deen déi genetesch kodéiert Kalziumindikatoren GCaMP6 expriméiert, an S1-Ratten transplantéiert. No 150 Deeg hu mir Faserphotometrie oder Zwei-Photon-Kalziumbildgebung duerchgefouert (Fig. 4h an erweidert Donnéeën, Fig. 10a). Mir hunn festgestallt, datt t-hCO-Zellen eng synchroniséiert rhythmesch Aktivitéit gewisen hunn (Figur 4i, Erweidert Donnéeën, Figur 10b an Ergänzungsvideo 1). Fir d'Spëtzt vun der t-hCO-Aktivitéit ze charakteriséieren, hu mir extrazellulär elektrophysiologesch Opzeechnungen an anästhetiséierten Transplantatiounsratten duerchgefouert (erweidert Donnéeën, Fig. 10c-f). Mir hunn stereotaktesch Koordinaten aus MRI-Biller generéiert; dofir representéieren dës opgeholl Eenheeten potenziell mënschlech Neuronen, obwuel d'Elektrophysiologie eleng et net erlaabt, eng Hierkonftsaart ze bestëmmen. Mir hunn synchroniséiert Aktivitéitsausbréch observéiert (erweidert Donnéeën, Fig. 10d). D'Sturmen hunn ongeféier 460 ms gedauert a goufe vun Rouperioden vun ongeféier 2 Sekonnen getrennt (erweidert Donnéeën, Abb. 10d, e). Eenzel Eenheeten hunn am Duerchschnëtt ongeféier dräi Schëss pro Burst ofgefeiert, wat ongeféier 73% vun den registréierten Eenheeten pro Burst ass. D'Aktivitéite vun den eenzelnen Eenheeten ware staark korreléiert, an dës Korrelatioune ware méi héich wéi déi vun Eenheeten, déi an net geimpfte Déieren identifizéiert goufen, déi ënner de selwechte Konditiounen opgeholl goufen (erweidert Donnéeën, Abb. 10f). Fir d'Spike-Äntwerten vun identifizéierten, vu Mënschen ofgeleeten Neuronen weider ze charakteriséieren, hu mir Liicht-Tagging-Experimenter op anästhetiséierte Ratten duerchgefouert, déi mat hCO transplantéiert goufen, deen de liichtempfindleche Kationekanal Rhodopsin 2 (hChR2) expriméiert, duerch deen t-hCO Neuronen eng kuerz Latenz erkennen (manner wéi 10 ms) als Äntwert op blo Liichtstimuli (Abb. 4m-o). t-hCO Neuronen hunn Ausbréch vu spontaner Aktivitéit bei Frequenzen gewisen, déi ähnlech wéi déi an der Kalziumbildgebung observéiert goufen, souwéi elektrophysiologesch Opzeechnungen, déi an t-hCO ouni Liichtmarkéierung duerchgefouert goufen (erweidert Donnéeën, Abb. 10c-g). Keng spontan Aktivitéit gouf an de korrespondéierende Stadien vun hCO observéiert, déi in vitro opgeholl goufen. Fir ze bewäerten, ob t-hCO duerch sensoresch Stimuli aktivéiert ka ginn, hu mir d'Ratte-Whirstbarb kuerz vum t-hCO ewechgelenkt (Abb. 4j,m an erweidert Donnéeën, Abb. 10h,k). Laut fréiere Studien8,10 huet eng Ënnergrupp vun t-hCO Zellen eng erhéicht Aktivitéit als Äntwert op d'Whirstbarb-Oflenkung gewisen, wat net observéiert gouf, wéi d'Donnéeë mat zoufällegen Zäitstempel verglach goufen (Abb. 4k-q an erweidert Donnéeën, Abb. 10h-q). Tatsächlech hunn ongeféier 54% vun den opto-markéierten eenzelnen Eenheeten eng signifikant erhéicht Erregungsquote no der Wirstbarb-Stimulatioun gewisen, mat engem Héichpunkt vu ronn 650 ms (Abb. 4r). Zesummegeholl suggeréieren dës Donnéeën, datt t-hCO entspriechend funktionell Inputen kritt a duerch Ëmweltreizer aktivéiert ka ginn.
Mir hunn duerno ënnersicht, ob t-hCO Schaltkreesser bei Ratten aktivéiere kann, fir d'Verhalen ze kontrolléieren. Mir hunn als éischt ënnersicht, ob d'Axonen vun t-hCO Neuronen an d'Ëmgéigendgewebe vun der Ratt projizéieren. Mir hunn hCO mat engem Lentivirus infizéiert, deen hChR2 kodéiert, deen mat EYFP fusionéiert ass (hChR2-EYFP). No 110 Deeg hu mir d'EYFP-Expressioun an ipsilateralen kortikalen Regiounen observéiert, dorënner den auditive, motoreschen a somatosensoresche Cortex, souwéi a subkortikalen Regiounen, dorënner de Striatum, den Hippocampus an den Thalamus (Fig. 5a). Fir ze bewäerten, ob dës efferent Projektiounen synaptesch Reaktiounen a Rattenzellen ausléise kéinten, hu mir t-hCO Zellen, déi hChR2-EYFP expriméieren, optesch aktivéiert, andeems mir Rattenhirncortexzellen a schaarfe Gehirschnëtter opgeholl hunn. Aktivéierung vun t-hCO Axonen mat bloe Liicht induzéiert kuerz-latenz EPSCs a pyramidesch-cortex Neuronen vun der Ratt, déi duerch NBQX blockéiert goufen (Fig. 5b-g). Zousätzlech kéinten dës Reaktiounen duerch Tetrodotoxin (TTX) blockéiert a duerch 4-Aminopyridin (4-AP) restauréiert ginn, wat drop hiweist, datt se duerch monosynaptesch Verbindungen verursaacht goufen (Fig. 5e).
a, Schematescht Diagramm vun der Axonverfolgung (lénks). t-hCO EYFP-Expressioun (riets). Skala-Staang, 100 µm. A1, auditiven Cortex, ACC, anterior cinguläre Cortex, d. Striatum, dorsale Striatum, HPC, Hippocampus; Diaphragma, lateralen Septum, mPFC, mediale präfrontale Cortex, Piri, Piriforme Cortex, v. Striatum, ventralen Striatum, VPM, ventropostomedialen Nucleus vum Thalamus, VTA, ventral tegmental Regioun. Déi rout Quadraten representéieren d'Gebidder vum Gehir, wou d'Biller opgeholl goufen. b, Schematescht Diagramm vum Stimulatiounsexperiment. c, d, Beispiller vun der Reaktioun vu bloe Liicht-induzéiertem Photostroum (uewen) a Spannung (ënnen) a mënschlechen (c) EYFP+ t-hCO oder Ratten (d) EYFP- Zellen. e, f, Aktuell Spuere vun Rattenneuronen no der Blo-Liicht-Stimulatioun vun t-hCO-Axonen mat TTX an 4-AR (gréng), TTX (gro) oder aCSF (schwaarz) (e), mat (violett) oder ouni (schwaarz)) NBQX (e). g, Latenz vun de Reaktiounen, déi duerch Blo-Liicht a Rattenzellen induzéiert ginn (n = 16 Zellen); horizontal Balken weisen déi duerchschnëttlech Latenz (7,13 ms) un (lénks). Amplitude vun de liicht-evozéierten EPSCs, déi mat oder ouni NBQX opgeholl goufen (n = 7 Zellen; ***P < 0,0001) (Mëtt). Amplitude vun de liicht-evozéierten EPSCs, déi mat oder ouni NBQX opgeholl goufen (n = 7 Zellen; ***P < 0,0001) (Mëtt). D'Amplitus vum EPSC, deen och ouni NBQX ass (n = 7 Kl.; ***P <0,0001) (vu Senn). Amplitude vun de liichtinduzéierte EPSCs, déi mat oder ouni NBQX opgeholl goufen (n = 7 Zellen; ***P < 0,0001) (Mëtt).使用或不使用NBQX 记录的光诱发EPSC 的振幅（n = 7 个细胞；***P < 0.0001）（中）。使用或不使用NBQX 记录的光诱发EPSC 的振幅（n = 7 个细胞；***P < 0.0001）（中）。 D'Amplitus vum EPSC, deen och ouni NBQX ass (n = 7 Kl.; ***P <0,0001) (vu Senn). Amplitude vun de liichtinduzéierte EPSCs, déi mat oder ouni NBQX opgeholl goufen (n = 7 Zellen; ***P < 0,0001) (Mëtt).Prozentsaz vun de Rattenzellen, déi EPSCs weisen, déi op blo Liicht reagéieren (riets). h, Schematesch Diagramm vun enger Verhalensaufgab. d0, Dag 0. i. Leeschtung vun exemplareschen Déieren um Dag 1 (lénks) oder Dag 15 (riets) vum Training. Déi duerchschnëttlech Zuel vun de Leckungen, déi um Dag 1 (lénks) oder Dag 15 (riets Mëtt) duerchgefouert goufen (n = 150 Tester mat bloem Liicht, n = 150 Tester mat roudem Liicht; ***P < 0,0001). Déi duerchschnëttlech Zuel vun de Leckungen, déi um Dag 1 (lénks) oder Dag 15 (riets Mëtt) duerchgefouert goufen (n = 150 Tester mat bloem Liicht, n = 150 Tester mat roudem Liicht; ***P < 0,0001). Среднее количество облизываний, выполненных в день 1 (слева) или день 15 (am центре справа) (n = 150 справация справа) n = 150 испытаний с красным светом ***P <0,0001). Duerchschnëttlech Zuel vun de Leckübungen um Dag 1 (lénks) oder Dag 15 (Mëtt riets) (n = 150 Tester mat bloem Liicht, n = 150 Tester mat roudem Liicht; ***P < 0,0001).第1 天（左）或第15 天（右中）执行的平均舔次数（n = 150 次蓝光试验,150n = 150次红光试验；***P < 0.0001）.第1 天（左）或第15 天（右中）执行的平均舔次数（n = 150 次蓝光试验,150n = 150次红光试验；***P < 0.001 Среднее количество облизываний, выполненных в день 1 (слева) или день 15 (am центре справа) (n = 150 справация справа) n = 150 испытаний с красным светом ***P <0,0001). Duerchschnëttlech Zuel vun de Leckübungen um Dag 1 (lénks) oder Dag 15 (Mëtt riets) (n = 150 Tester mat bloem Liicht, n = 150 Tester mat roudem Liicht; ***P < 0,0001).Kumulativ Leckzuelen fir rout a blo Liichtversich um Dag 1 (Mëtt lénks) oder Dag 15 (riets). NS, net signifikant. j,k, Verhalenscharakteristike vun allen Déieren, déi mat t-hCO transplantéiert goufen, deen hChR2-EYFP (j) oder Kontrollfluorophor (k) um Dag 1 oder 15 expriméiert (hChR2-EYFP: n = 9 Ratten, ** P = 0,0049; Kontroll: n = 9, P = 0,1497). l, Entwécklung vum Präferenzscore (n = 9 hChR2, n = 9 Kontroll; **P < 0,001, ***P < 0,0001). l, Entwécklung vum Präferenzscore (n = 9 hChR2, n = 9 Kontroll; **P < 0,001, ***P < 0,0001). l, Эволюция показателя предпочтения (n = 9 hChR2, n = 9 контрольных; **P <0,001, ***P <0,0001). l, Entwécklung vum Präferenzscore (n = 9 hChR2, n = 9 Kontrollen; **P < 0,001, ***P < 0,0001). l，偏好评分的演变（n = 9 hChR2，n = 9 对照；**P < 0.001，***P < 0.0001）. l，偏好评分的演变（n = 9 hChR2，n = 9 对照；**P < 0.001，***P < 0.0001）. l, Эволюция показателей предпочтения (n = 9 hChR2, n = 9 контролей; **P <0,001, ***P <0,0001). l, Entwécklung vun de Präferenzscores (n = 9 hChR2, n = 9 Kontrollen; **P < 0,001, ***P < 0,0001).m, FOS-Expressioun als Äntwert op d'optogenetesch Aktivatioun vun t-hCO an S1. Biller vun der FOS-Expressioun (lénks) a Quantifizéierung (n = 3 pro Grupp; *P < 0,05, **P < 0,01 an ***P < 0,001) (riets) ginn gewisen. Biller vun der FOS-Expressioun (lénks) a Quantifizéierung (n = 3 pro Grupp; *P < 0,05, **P < 0,01 an ***P < 0,001) (riets) ginn gewisen. Показаны изображения экспрессии FOS (слева) и количественного определения (n = 3 pro Stonn; * P <0,05, 01** P <0***) (Säit). Biller vun der FOS-Expressioun (lénks) a Quantifizéierung (n = 3 pro Grupp; *P<0,05, **P<0,01, an ***P<0,001) ginn (riets) gewisen.显示了FOS 表达（左）和量化（每组n = 3；*P < 0.05、**P < 0.01 和***P < 0.001）（像〳）（像〳）显示了FOS 表达（左）和量化（每组n = 3；*P < 0.05、**P < 0.01 和***P < 0.001）（像〳）（像〳） Показаны изображения экспрессии FOS (слева) и количественного определения (n = 3 pro Stonn; * P <0,05, 01** P <0***) (Säit). Biller vun der FOS-Expressioun (lénks) a Quantifizéierung (n = 3 pro Grupp; *P<0,05, **P<0,01, an ***P<0,001) ginn (riets) gewisen.Skalabalk, 100 µm. D'Donnéeë ginn als Moyenne ± Standardfehler vun BLA, basolateraler Mandel, MDT, dorsomedialer Thalamuskär, PAG, periaqueduktaler Grau ausgedréckt.
Schlussendlech hu mir gefrot, ob t-hCO d'Verhale vu Ratte moduléiere kéint. Fir dëst ze testen, hu mir hChR2-EYFP-expriméierend hCO an S1 transplantéiert, an 90 Deeg méi spéit hu mir optesch Faseren an t-hCO fir Liichtliwwerung implantéiert. Mir hunn dann d'Ratten mat engem modifizéierten operanten Konditionéierungsparadigma trainéiert (Fig. 5h). Mir hunn d'Déieren an eng Verhalenstestkammer gesat an zoufälleg 5-Sekonnen blo (473 nm) a rout (635 nm) Laserstimuli ugewannt. D'Déieren kruten eng Waasserbelounung, wa se während der bloer Liichtstimulatioun geleckt hunn, awer net während der rouder Liichtstimulatioun. Um éischten Dag vum Training hunn d'Déieren keen Ënnerscheed beim Lecken gewisen, wa se mat bloem oder roudem Liicht stimuléiert goufen. Um 15. Dag hunn Déieren, déi mat hCO-expriméierender hChR2-EYFP transplantéiert goufen, awer méi aktiv Lecken gewisen, wa se mat bloem Liicht stimuléiert goufen, am Verglach mat der rouder Liichtstimulatioun. Dës Ännerungen am Leckverhalen goufen net bei Kontrolldéieren observéiert, bei deenen hCO transplantéiert gouf, deen de Kontrollfluorophor expriméiert (Léiererfollegsquote: hChR2 89%, EYFP 0%, Figur 5i-1 an Ergänzungsvideo 2). Dës Donnéeë suggeréieren, datt t-hCO Zellen Rattenneuronen aktivéiere kënnen, fir Belounungssichend Verhalen ze stimuléieren. Fir erauszefannen, wéi eng t-hCO Neuronalkreesser bei Ratten un dëse Verhalensännerungen bedeelegt kéinte sinn, hu mir t-hCO optogenetesch bei trainéierten Déieren aktivéiert a 90 Minutte méi spéit Gewëss gesammelt. Immunhistochemie huet d'Expressioun vum Aktivitéitsofhängegen FOS Protein a verschiddene Gehirregiounen opgedeckt, déi u motivéiertem Verhalen bedeelegt sinn, dorënner de mediale präfrontale Cortex, den mediale Thalamus an déi periaqueduktal gro Matière, déi entweder an onstimuléierte Kontrolldéieren oder an Déieren expriméiert gouf. Reis. 5m). Zesummegeholl suggeréieren dës Donnéeën, datt t-hCO d'Neuronalaktivitéit bei Ratten moduléiere kann, fir d'Verhalen ze steieren.
Neuronal Organoide stellen e villverspriechend System fir d'mënschlech Entwécklung a Krankheeten in vitro duer, awer si sinn duerch de Manktem u Verbindungen tëscht de Kreesleef, déi in vivo existéieren, limitéiert. Mir hunn eng nei Plattform entwéckelt, op där mir hCO an S1 vun immunkompromittéierte fréie postnatale Ratten transplantéiert hunn, fir d'Entwécklung a Funktioun vu mënschlechen Zellen in vivo ze studéieren. Mir hunn gewisen, datt t-hCO reif Zelltypen entwéckelt, déi net in vitro observéiert ginn28, an datt t-hCO anatomesch a funktionell am Gehir vun Nagetieren integréiert ass. D'Integratioun vun t-hCO an d'Neuralkreesleef vun Nagetieren huet et eis erlaabt, eng Verbindung tëscht der mënschlecher Zellaktivitéit an dem studéierten Déiereverhalen opzebauen, wat weist, datt t-hCO Neuronen d'Neuronalaktivitéit vu Ratten moduléiere kënnen, fir Verhalensreaktiounen ze steiern.
Déi Plattform, déi mir beschreiwen, huet verschidde Virdeeler géintiwwer fréierer Fuerschung iwwer d'Transplantatioun vu mënschlechen Zellen an Nagetiergehirer. Éischtens hu mir hCO an den sech entwéckelende Cortex vu fréie postnatale Ratten transplantéiert, wat d'anatomesch a funktionell Integratioun erliichtere kann. Zweetens huet d't-hCO MRI-Iwwerwaachung et eis erméiglecht, d'Transplantatpositioun an de Wuesstum bei liewegen Déieren ze studéieren, wat eis erlaabt huet, laangfristeg Studien mat verschiddenen Déieren duerchzeféieren an d'Zouverlässegkeet vu verschiddene hiPS-Zelllinien ze etabléieren. Schlussendlech hu mir intakt Organoiden transplantéiert, anstatt isoléiert Eenzelzelluspensiounen, déi manner zerstéierend fir mënschlech Zellen sinn a kënnen d'Integratioun an d'Generatioun vu mënschleche Cortexneuronen am Rattegehirer förderen.
Mir erkennen un, datt trotz Fortschrëtter op dëser Plattform, zäitlech, raimlech a speziesiwwergräifend Restriktiounen d'Bildung vu mënschlechen neuronalen Circuiten mat héijer Qualitéit verhënneren, och no enger Transplantatioun an engem fréie Stadium vun der Entwécklung. Zum Beispill ass et net kloer, ob déi spontan Aktivitéit, déi an t-hCO observéiert gëtt, e Entwécklungsphenotyp duerstellt, ähnlech wéi déi rhythmesch Aktivitéit, déi während der kortikaler Entwécklung observéiert gëtt, oder ob se op d'Feele vun suppressiven Zelltypen zréckzeféieren ass, déi an t-hCO präsent sinn. Ähnlech ass et net kloer, a wéi engem Mooss d'Feele vu Laminéierung an t-hCO d'Kettenkonnektivitéit beaflosst30. Déi zukünfteg Aarbecht wäert sech op d'Integratioun vun aneren Zelltypen konzentréieren, wéi mënschlech Mikroglia, mënschlech Endothelzellen a variéierend Proportiounen vu GABAergeschen Interneuronen, wéi mat Hëllef vun der Assembly 6 in vitro gewisen, souwéi op d'Verständnis, wéi neuronal Integratioun a Veraarbechtung an verännerten t-hCO transkriptionellen, synapteschen a Verhalensniveauen an Zellen, déi vu Patienten kritt ginn, optriede kënnen.
Insgesamt stellt dës In-vivo-Plattform eng mächteg Ressource duer, déi d'in-vitro-Entwécklung vum mënschleche Gehir a Krankheetsfuerschung ergänze kann. Mir erwaarden, datt dës Plattform eis erlaabt, nei Phenotypen op Strangniveau an soss schwéier ze fannen Zellen, déi vu Patienten ofgeleet sinn, z'entdecken an nei therapeutesch Strategien ze testen.
Mir hunn hCO2.5 aus HiPS-Zellen generéiert, wéi virdru beschriwwen. Fir d'hCO2-Produktioun aus hiPS-Zellen, déi op Feeder-Schichten kultivéiert goufen, ze initiéieren, goufen intakt Kolonien vun hiPS-Zellen aus Kulturschalen mat Dispase (0,35 mg/ml) erausgeholl an an ultra-niddreg-Attachment-Plastikkulturen transferéiert, déi Schalen mat hiPS-Zellkulturmedium (Corning) enthalen hunn, ergänzt mat zwee SMAD-Inhibitoren Dorsomorphin (5 μM; P5499, Sigma-Aldrich) an SB-431542 (10 μM; 1614, Tocris) an ROCK-Inhibitor Y-27632 (10 μM; S1049, Selleckchem). Wärend den éischten 5 Deeg gouf den hiPS-Zellmedium all Dag gewiesselt an Dorsomorphin an SB-431542 goufen derbäigesat. Um sechsten Dag an der Suspension goufen d'neural Sphäroiden an en neuralt Medium transferéiert, dat Neurobasal-A (10888, Life Technologies), B-27-Ergänzung ouni Vitamin A (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies), Penicillin a Streptomycin (1:100, Life Technologies) enthält an bis zum 24. Dag mat dem epidermalen Wuestumsfaktor (EGF; 20 ng ml−1; R&D Systems) a Fibroblast-Wuestumsfaktor 2 (FGF2; 20 ng ml−1; R&D Systems) ergänzt gouf. Vum 25. bis zum 42. Dag gouf de Medium mat gehirn-derivéierten neurotrophen Faktor (BDNF; 20 ng ml−1, Peprotech) an Neurotrophin 3 (NT3; 20 ng ml−1; Peprotech) ergänzt, mat Mediumwiessel all zweeten Dag. Um sechsten Dag an der Suspension goufen d'neural Sphäroiden an en neuralt Medium transferéiert, dat Neurobasal-A (10888, Life Technologies), B-27-Ergänzung ouni Vitamin A (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies), Penicillin a Streptomycin (1:100, Life Technologies) enthält an bis zum 24. Dag mat dem epidermalen Wuestumsfaktor (EGF; 20 ng ml−1; R&D Systems) a Fibroblast-Wuestumsfaktor 2 (FGF2; 20 ng ml−1; R&D Systems) ergänzt gouf. Vum 25. bis zum 42. Dag gouf de Medium mat gehirn-derivéierten neurotrophen Faktor (BDNF; 20 ng ml−1, Peprotech) an Neurotrophin 3 (NT3; 20 ng ml−1; Peprotech) ergänzt, mat Mediumwiessel all zweeten Dag.Um sechsten Dag an der Suspension goufen d'neural Sphäroiden an en neuralt Medium transferéiert, dat Neurobasal-A (10888, Life Technologies), B-27 Ergänzung ouni Vitamin A (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies) a Penicillin enthält.и стрептомицин (1:100, Life Technologies) и дополнены эпидермальным фактором роста (EGF; 20 нг/мл; R&D Systems) a фактором робста20F; нг/мл; R&D Systems) bis 24-го дня. a Streptomycin (1:100, Life Technologies) a mat epidermalem Wuestumsfaktor (EGF; 20 ng/ml; R&D Systems) a Fibroblast-Wuestumsfaktor 2 (FGF2; 20 ng/ml; R&D Systems) bis zum 24. Dag ergänzt.Vum 25. bis zum 42. Dag goufen aus dem Gehir gewonnenen neurotrophe Faktor (BDNF; 20 ng ml-1, Peprotech) an Neurotrophin 3 (NT3; 20 ng ml-1, Peprotech) an de Medium bäigefüügt, woubäi de Medium all zweeten Dag gewiesselt gouf.在悬浮的第6 天，将神经球体转移到含有neurobasal-A（10888，Life Technologies）、不含维生素B-27甚焠补充剂（12587，Life Technologies）、GlutaMax（1:100，Life Technologies）、青霉素的神经培养基丠和铼，Life Technologies）:10 Technologies）并辅以表皮生长因子（EGF；20 ng ml-1；R&D Systems）和成纤维细胞生长因子2（FGF2；20 ng ml-1；R&D Systems）直至第24 天.在 悬浮 的 第 第 6 天 将 神经 球体 转移 含有 含有 neurobasal-a （10888 ， Life Technologies０ 焫 縍b-27 补充剂 （12587 ， Life Technologies） Glutamax （1: 100 ， Life TechNOGIS青霉素 的 祴经 培养 基 中 链链铼 1， 链链霉:0 Technologies） 表皮 生长 因子 （（（20 ng ml-1 ； r & d Systems） 成 纤维 细胞 生长 2 （fgf2 ； 20 ng ml- 1；R&D SystemsＳ因子 На 6-й день суспензии нейросферы были переведены на добавку, содержащую нейробазал-А (10888, Life Technologies), добва-27), А (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies), пенициллин- нейтрализованный стрептомицин (1:100, Life Technologies) с добавлением фальпицин (EGF; 20 нг мл-1; R&D Systems) a фактора роста фибробластов 2 (FGF2; 20 нг ml-1) 1; Um 6. Dag goufen d'Neurosphäresuspensionen op en Nahrungsergänzungsmittel mat Neurobasal-A (10888, Life Technologies), B-27-Nahrungsergänzungsmittel ouni Vitamin A (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies), Penicillin-neutraliséiertem Streptomycin (1:100, Life Technologies) ergänzt mat epidermalem Wuestumsfaktor (EGF; 20 ng ml-1; R&D Systems) a Fibroblast-Wuestumsfaktor 2 (FGF2; 20 ng ml-1) ëmgestallt. R&D Systems) bis 24 Joer. Fuerschungs- a Entwécklungssystemer) bis den 24.Vum 25. bis zum 42. Dag goufen all zweeten Dag den neurotrophe Faktor, deen aus dem Gehir gewonnen gëtt (BDNF; 20 ng ml-1, Peprotech) an den neurotrophe Faktor 3 (NT3; 20 ng ml-1, Peprotech) an d'Kulturmedium bäigefüügt. De Medium gouf eemol gewiesselt.Vum 43. Dag un gouf hCO3 an engem net ergänzten Neurobasal-A Medium (NM; 1088022, Thermo Fisher) mat engem Mediumwiessel all 4-6 Deeg gehalen. Fir hCO3 aus hiPS-Zellen ze kréien, déi ënner Fudderbedingungen kultivéiert goufen, goufen d'hiPS-Zellen 7 Minutten mat Accutase (AT-104, Innovate Cell Technologies) bei 37°C inkubéiert, an eenzel Zellen dissoziéiert an op AggreWell 800 Placken (34815, STEMCELL Technologies) mat enger Dicht vun 3 × 106 eenzel Zellen pro Lach an Essential 8 Medium ergänzt mam ROCK-Inhibitor Y-27632 (10 μM; S1049, Selleckchem) ausgeplatt. No 24 Stonnen goufen d'Medien an de Lächer no uewen an no ënnen a Medien pipettéiert, déi Essential 6 Medien enthalen hunn (A1516401, Life Technologies), ergänzt mat Dorsomorphin (2,5 μM; P5499, Sigma-Aldrich) an SB-431542 (10 μM; 1614). , Tocrida). Vum 2. bis zum 6. Dag gouf Essential 6 Medium all Dag duerch Dorsomorphin an den Ergänzungsstoff SB-431542 ersat. Vum sechsten Dag un goufen d'Neurosphäresuspensionen an den neurobasalen Medium transferéiert a wéi uewe beschriwwen ënnerhalen.
All Déierprozedure goufen am Aklang mat de Richtlinne fir Déierefleeg duerchgefouert, déi vum Stanford University Laboratory Animal Care Administrative Committee (APLAC) guttgeheescht goufen. Schwanger euthymesch RNU (rnu/+) Ratten goufen kaaft (Charles River Laboratories) oder ënnerbruecht. D'Déiere goufen an engem 12-Stonne Liicht-Donkel-Zyklus mat Iessen a Waasser ad libitum gehalen. Nackt (FOXN1–/–) Rattewelpen am Alter vun dräi bis siwen Deeg goufen duerch de Wuesstum vun onreife Schnurres virun der Ausschluechtung identifizéiert. D'Welpen (männlech a weiblech) goufen mat 2-3% Isofluran anästhetiséiert a op e stereotaxesche Frame gesat. Eng Trepanatioun vum Schädel mat engem Duerchmiesser vun ongeféier 2-3 mm iwwer S1 gouf duerchgefouert, während d'Integritéit vun der Dura mater erhale bliwwen ass. Dann gouf eng 30-G Nool (ongeféier 0,3 mm) just ausserhalb vun der Kraniotomie benotzt fir d'Dura ze duerchbriechen. Dann HCO3 op e dënne 3×3 cm Parafilm applizéiert an iwwerschësseg Medium ewechgeholl. Mat enger Hamilton-Sprëtz, déi un eng 23 G, 45°-Nadel befestegt ass, gëtt hCO3 virsiichteg an dat distalst Enn vun der Nadel gezunn. Dann d'Sprëtz op d'Sprëtzepomp montéieren, déi mam stereotaxeschen Apparat verbonnen ass. Dann d'Spëtzt vun der Nadel iwwer e virdru gemaachten 0,3 mm breede Lach an der Dura (z = 0 mm) leeën a d'Sprëtz ëm 1-2 mm verengen (z = ongeféier –1,5 mm), bis d'Nadel tëscht der Dura mater A ass. Eng dicht Dichtung entsteet. Dann d'Sprëtz an d'Mëtt vun der kortikaler Uewerfläch bei z = -0,5 mm hiewen an hCO3 mat enger Geschwindegkeet vun 1-2 µl pro Minutt injizéiert. Nom Ofschloss vun der hCO3-Injektioun gëtt d'Nadel mat enger Geschwindegkeet vun 0,2-0,5 mm pro Minutt zréckgezunn, d'Haut gëtt zesummegenäht an den Welpen direkt op e waarmt Heizkissen geluecht, bis hien komplett erholl ass. E puer Déiere goufen bilateral transplantéiert.
All Déierprozedure goufen am Aklang mat de vun der Stanford University APLAC guttgeheescht Déierefleegrichtlinne duerchgefouert. Ratten (méi wéi 60 Deeg no der Transplantatioun) goufen mat 5% Isofluran-Anästhesie induzéiert an während der Bildgebung mat 1-3% Isofluran anästhetiséiert. Fir d'Visualiséierung gouf en 7 Tesla aktiv ofgeschiermten horizontalen Buerlachscanner Bruker (Bruker Corp.) mat engem International Electric Company (IECO) Gradientenundriff, en ofgeschiermten Gradienteninsatz mat engem bannenzegen Duerchmiesser vun 120 mm (600 mT/m, 1000 T/m/s) mat AVANCE. III, aacht-Kanal Multi-Coil RF a Multi-Core-Fäegkeeten, an der begleedender Paravision 6.0.1 Plattform benotzt. D'Opnam gouf mat enger aktiv entkoppelter volumetrescher RF-Spule mat engem bannenzegen Duerchmiesser vun 86 mm an enger véier-Kanal kryo-gekillter RF-Spule nëmme fir den Empfang duerchgefouert. Axial 2D Turbo-RARE (Widderhuelungszäit = 2500 ms, Echozäit = 33 ms, 2 Duerchschnëttswäerter) mat 16 Slice Captures, Slice Dicke 0,6–0,8 mm, mat 256 × 256 Proben. D'Signaler goufen mat enger Quadratur-Transceiver volumetrescher HF-Spule mat engem bannenzegen Duerchmiesser vun 2 cm (Rapid MR International, LLC) empfaangen. Schlussendlech goufen déi agebaute Imaris (BitPlane) Uewerflächenschätzungsfunktiounen fir 3D-Rendering a Volumenanalyse benotzt. Eng erfollegräich Transplantatioun gouf definéiert als eng, bei där Beräicher mat kontinuéierleche T2-gewichteten MRI-Signal an der transplantéierter Hemisphär geformt goufen. Transplantat-Ofstoßung gouf definéiert als en Transplantat, dat keng Beräicher mat kontinuéierleche T2-gewichteten MRI-Signal an der transplantéierter Hemisphär produzéiert huet. Subkortikalen t-hCO gouf vun der spéiderer Analyse ausgeschloss.
Fir GCaMP6s an hCO stabil fir Zwei-Photon-Kalziumbildgebung ze expriméieren, goufen hiPS-Zellen mat pLV[Exp]-EF1a::GcaMP6s-WPRE-Puro infizéiert, gefollegt vun der Auswiel vun Antibiotike. Kuerz gesot, goufen d'Zellen mat EDTA dissoziéiert an an 1 ml Essential 8 Medium mat enger Dicht vun ongeféier 300.000 Zellen a Präsenz vu Polybren (5 μg/ml) an 15 μl Virus suspendéiert. D'Zellen goufen dann 60 Minutten an der Suspension inkubéiert an mat enger Dicht vun 50.000 Zellen pro Lach ausgesaat. Nom Konfluenz goufen d'Zellen mat 5-10 μg ml-1 Puromycin fir 5-10 Deeg behandelt oder bis stabil Kolonien opgetruede sinn. Eng akut hCO Infektioun gouf wéi virdru beschriwwen5 mat e puer Modifikatiounen duerchgefouert. Kuerz gesot, den Dag 30-45 hCO an 1,5 ml Eppendorf-Mikrozentrifugenréier mat 100 µl Nervenmedium transferéiert. Dann ginn ongeféier 90 µl vum Medium erausgeholl, 3-6 µl Lentivirus mat héijem Titer (vun 0,5 x 108 bis 1,2 x 109) ginn an d'Röhr bäigefüügt, an den hCO3 gëtt fir 30 Minutten an den Inkubator transferéiert. Dann ginn 90–100 µl Medium an all Réier bäigefüügt an d'Röhrchen iwwer Nuecht zréck an den Inkubator gesat. Den nächsten Dag gëtt hCO3 op frësch Nervenmedium a Placke mat gerénger Attachment transferéiert. No 7 Deeg gouf hCO3 op 24-Lëns Glasbodenplacke transferéiert fir d'Visualiséierung an d'Evaluatioun vun der Infektiounsqualitéit. pLV[Exp]-SYN1::EYFP-WPRE a pLV[Exp]-SYN1::hChR2-EYFP-WPRE goufen duerch VectorBuilder generéiert. De Lentivirus gëtt an de meeschten Experimenter benotzt, well en an den Hostgenom integréiert ass, wat d'Reportergenexpression an infizéierte Zellkulturen erméiglecht. Fir d'Tollwut-Nofollegstudie gouf den hCO um Dag 30-45 mat Tollwut-ΔG-eGFP an AAV-DJ-EF1a-CVS-G-WPRE-pGHpA (Plasmid #67528, Addgene) koinfizéiert, 3 Deeg laang grëndlech gewäsch an a Ratten an S1 transplantéiert an 7-14 Deeg in vivo gehalen.
Fir d'Immunocytochemie goufen d'Déieren anästhetiséiert a transkardial mat PBS perfuséiert, gefollegt vun 4% Paraformaldehyd (PFA a PBS; Electron Microscopy Sciences). D'Gehirer goufen 2 Stonnen oder iwwer Nuecht bei 4°C a 4% PFA fixéiert, 48-72 Stonnen a 30% Saccharose a PBS kryokonservéiert an an 1:1, 30% Saccharose:OCT (Tissue-Tek OCT Compound 4583, Sakura Finetek) agebett, an et goufen Koronalschnëtter mat engem Kryostat (Leica) bei 30 µm gemaach. Fir d'Immunhistochemie vun décke Schnëtter goufen d'Déieren mat PBS perfuséiert, an d'Gehir gouf dissekéiert a koronal mat engem Vibratom (Leica) bei 300–400 µm geschnidden, an d'Schnëtter goufen 30 Minutte laang mat 4% PFA fixéiert. Duerno goufen d'Kryoschnëtter oder déck Schnëtter mat PBS gewäsch, 1 Stonn bei Raumtemperatur blockéiert (10% normalt Eselserum (NDS) an 0,3% Triton X-100 verdënnt a PBS) a mat enger Blockéierungsléisung bei 4°C blockéiert. – Inkubatioun D'Kryoschnëtter goufen iwwer Nuecht inkubéiert an déck Schnëtter goufen 5 Deeg inkubéiert. Déi primär Antikörper, déi benotzt goufen, waren: Anti-NeuN (Maus, 1:500; ab104224, abcam) Anti-CTIP2 (Ratt, 1:300; ab18465, abcam), Anti-GFAP (Kanéngchen, 1:1.000; Z0334, Dako), Anti-GFP (Poulet, 1:1.000; GTX13970, GeneTex), Anti-HNA (Maus, 1:200; ab191181, abcam), Anti-NeuN (Kanéngchen, 1:500; ABN78, Millipore), Anti-PDGFRA (Kanéngchen, 1:200; sc-338, Santa Cruz), Anti-PPP1R17 (Kanéngchen, 1:200; HPA047819, Atlas Antibodies), Anti-RECA-1 (Maus, 1:50; ab9774, abcam), Anti-SCG2 (Kanéngchen, 1:100; 20357-1-AP, Proteintech), Anti-SOX9 (Geess, 1:500; AF3075, R&D Systems), Netrin G1a (Geess, 1:100; AF1166, R&D Systems), Anti-STEM121 (Maus, 1:200; Y40410, Takara Bio), Anti-SATB2 (Maus, 1:50; ab51502, abcam), Anti-GAD65/67 (Kanéngchen, 1:400; ABN904, Millipore) an Anti-IBA1 (Geess, 1:100; ab5076, abcam). Déi primär Antikörper, déi benotzt goufen, waren: Anti-NeuN (Maus, 1:500; ab104224, abcam) Anti-CTIP2 (Ratt, 1:300; ab18465, abcam), Anti-GFAP (Kanéngchen, 1:1.000; Z0334, Dako), Anti-GFP (Poulet, 1:1.000; GTX13970, GeneTex), Anti-HNA (Maus, 1:200; ab191181, abcam), Anti-NeuN (Kanéngchen, 1:500; ABN78, Millipore), Anti-PDGFRA (Kanéngchen, 1:200; sc-338, Santa Cruz), Anti-PPP1R17 (Kanéngchen, 1:200; HPA047819, Atlas Antibodies), Anti-RECA-1 (Maus, 1:50; ab9774, abcam), Anti-SCG2 (Kanéngchen, 1:100; 20357-1-AP, Proteintech), Anti-SOX9 (Geess, 1:500; AF3075, R&D Systems), Netrin G1a (Geess, 1:100; AF1166, R&D Systems), Anti-STEM121 (Maus, 1:200; Y40410, Takara Bio), Anti-SATB2 (Maus, 1:50; ab51502, abcam), Anti-GAD65/67 (Kanéngchen, 1:400; ABN904, Millipore) an Anti-IBA1 (Geess, 1:100; ab5076, abcam). Использовались следующие первичные антитела: анти-NeuN (мышиные, 1:500; ab104224, abcam), анти-CTIP2 (крысин:340, abcam), abcam, abcam анти-GFAP (кроличьи, 1:1000; Z0334, Dako), анти- -GFP (курица, 1:1000; GTX13970, GeneTex), анти-HNA (мышь, 1:200; ab19118, кам, 19118, 19118, 1911, 1911, 1911, 1911, 2000, 1:500; ABN78, Millipore), анти-PDGFRA (кролик, 1:200; sc-338, Санта-Круз), анти-PPP1R17 (кролик, 1:200; HPA047819, Atlas Antibodies), анти-RECA-1 (мышь, 1:50; ab9774, abcam), анти-SCG2, анти-SCG2 ( 20357-1-AP, Proteintech), анти-SOX9 (козий, 1:500; AF3075, R&D Systems), нетрин G1a (козий, 1:100; AF1166, R&D Systems), анти-STEM121 (мый:20ши; Y40410, Takara Bio), анти-SATB2 (мышь, 1:50; ab51502, abcam), анти-GAD65/67 (кролик, 1:400; ABN904, Millipore) an анти-IBA1 (коза, 1:100; аб5076, абкам). Déi primär benotzt Antikörper waren: Anti-NeuN (Maus, 1:500; ab104224, abcam), Anti-CTIP2 (Ratt, 1:300; ab18465, abcam), Anti-GFAP (Kanéngchen, 1:1000; Z0334, Dako), Anti-GFP (Poulet, 1:1000; GTX13970, GeneTex), Anti-HNA (Maus, 1:200; ab191181, abcam), Anti-NeuN (Kanéngchen, 1:500; ABN78, Millipore), Anti-PDGFRA (Kanéngchen, 1:200; sc-338, Santa Cruz), Anti-PPP1R17 (Kanéngchen, 1:200; HPA047819, Atlas Antibodies), Anti-RECA-1 (Maus, 1:50; ab9774, abcam), Anti-SCG2 (Kanéngchen, 1:100; 20357-1-AP, Proteintech), Anti-SOX9 (Geess, 1:500; AF3075, R&D Systems), Netrin G1a (Geess, 1:100; AF1166, R&D Systems), Anti-STEM121 (Maus, 1:200; Y40410, Takara Bio), Anti-SATB2 (Maus, 1:50; ab51502, abcam), Anti-GAD65/67 (Kanéngchen, 1:400; ABN904, Millipore) an Anti-IBA1 (Geess, 1:100; ab5076, abkam).使用的一抗是：抗NeuN（小鼠，1:500；ab104224，abcam）抗CTIP2（大鼠，1:3 00；ab18465，abcam），抗GFAP（兔，1:1.000；Z0334，Dako），抗-GF P（鸡，1:1.000；GTX13970，GeneTex），抗HNA（小鼠，1:200；ab1911 81，abcam），抗NeuN（兔，1:500；ABN78，Millipore），抗PDGFRA（兔， 1:200；sc-338，Santa Cruz），抗PPP1R17（兔，1:200；HPA047819，Atlas抗体），抗RECA-1（小鼠，1:50；ab9774，abcam），抗SCG2（兔） , 1:100；20357-1-AP，Proteintech），抗SOX9（山羊，1:500；AF3075，R&D Systems），Netrin G1a（山羊，（山羊，，，1100，1:10AF， Systems），抗STEM121（小鼠, 1:200;使用的一抗是：抗NeuN（小鼠，1:500；ab104224，abcam）抗CTIP2（大鼠，1 :300；ab18465，abcam），抗GFAP（兔，1:1,000；Z0334，Dako），抗-GFP（鸡，1:1.000；GTX13970，GeneTex），抗HNA（小鼠，1:200；ab 191181，abcam），抗NeuN（兔，1:500；ABN78，Millipore％弔，抗1: 200；sc-338，Santa Cruz），抗PPP1R17（兔，1:200；HPA047819，Atlas抗体），抗RECA-1（小鼠，1:50；ab9774，abcam），抗SCG2 100；20357-1-AP，Proteintech），抗SOX9（山羊，1:500；AF3075，R&D Systems），Netrin G1a（山羊，1:106，F106， Systemer）頏1:20, ;Y40410, Takara Bio), Anti-SATB2 (Maus, 1:50; ab51502, abcam), Anti-GAD65/67 (Kanéngchen, 1:400; ABN904, Millipore) an Anti-IBA1 (Geess, 1:100; ab5076, abcam).Déi primär benotzt Antikörper waren: Anti-NeuN (Maus, 1:500; ab104224, abcam), Anti-CTIP2 (Ratt, 1:300; ab18465, abcam), Anti-GFAP (Kanéngchen, 1:1000; Z0334, Dako). , Anti-GFP (Poulet, 1:1000; GTX13970, GeneTex), Anti-HNA (Maus, 1:200; ab191181, abcam), Anti-NeuN (Kanéngchen, 1:500; ABN78, Millipore), Anti-PDGFRA (Kanéngchen, 1:200; sc-338, Santa Cruz), Anti-PPP1R17 (Kanéngchen, 1:200; HPA047819, Atlas-Antikörper), Anti-RECA-1 (Maus, 1:50; ab9774, abcam), Anti-SCG2 (Kanéngchen), 1:100;20357-1-AP, Proteintech), анти-SOX9 (коза, 1:500; AF3075, R&D Systems), Нетрин G1a (коза, 1:100; AF1166, R&D Systems), анти -STEM121, мы4ш000, мы4ш000; Bio), анти-SATB2 (мышь, 1:50; ab51502, abcam), анти-GAD65/67 (кролик, 1:400; ABN904, Millipore) an анти-IBA1 (коза, 1:100; аба5076, аба5076, аба5076, аба507, аба504). 20357-1-AP, Proteintech), Anti-SOX9 (Geess, 1:500; AF3075, R&D Systems), Netrin G1a (Geess, 1:100; AF1166, R&D Systems), Anti-STEM121 (Maus, 1:200; Y40410, Takara Bio), Anti-SATB2 (Maus, 1:50; ab51502, abcam), Anti-GAD65/67 (Kanéngchen, 1:400; ABN904, Millipore) an Anti-IBA1 (Geess, 1:100; ab5076, abkam).D'Schnëtter goufen dann mat PBS gewäsch an 1 Stonn bei Raumtemperatur (gefruer Schnëtter) oder iwwer Nuecht bei 4°C (déck Schnëtter) mat engem sekundären Antikörper inkubéiert. Den Alexa Fluor sekundären Antikörper (Life Technologies), verdënnt 1:1000 an enger Blockéierungsléisung, gouf benotzt. Nom Wäsche mat PBS goufen d'Käre mat engem Hoechst 33258 (Life Technologies) visualiséiert. Schlussendlech goufen d'Präparater mat Deckglieser (Fisher Scientific) mat engem Aquamount (Polysciences) op e Mikroskop geluecht an op engem Keyence Fluoreszenzmikroskop (BZ-X Analysator) oder engem Leica TCS SP8 Konfokalmikroskop (Las-X) um Bild analyséiert. D'Biller goufen mam ImageJ Programm (Fiji) veraarbecht. Fir den Undeel vun de mënschlechen Neuronen an t-hCO an dem Rattecortex ze quantifizéieren, goufen 387,5 μm breet rechteckeg Biller an der Mëtt vum t-hCO, um oder no beim Rand vum Rattecortex gemaach. Transplantatränner goufen duerch d'Bewäertung vun Ännerungen an der Gewëbstransparenz, HNA+ Kären an/oder dem Virhandesein vun der Gewëbsautofluoreszenz bestëmmt. An all Bild gouf déi total Zuel vun NeuN+ an HNA+ Zellen duerch déi total Zuel vun NeuN+ Zellen am selwechte Beräich gedeelt. Fir sécherzestellen, datt nëmme Zellen mat Zellkären an der Bildfläch gezielt ginn, ginn nëmmen Zellen, déi och Hoechst+ sinn, an d'Berechnung abegraff. Zwee Biller, déi op d'mannst 1 mm vuneneen ewech waren, goufen duerchschnëttlech berechent, fir de statistesche Feeler ze reduzéieren.
Eng Woch virun der Proufsammlung ginn d'hCO3-Transplantatiounsdéieren (ongeféier 8 Méint Differenzéierung) an en donkelt Raum gesat, wou d'Schnurres ofgeschnidden sinn, fir d'sensoresch Stimulatioun ze minimiséieren. D'Isolatioun vun den Zellkäre gouf wéi virdru beschriwwen duerchgefouert, mat e puer Modifikatiounen. Kuerz gesot, goufen t-hCO3 an hCO3 mat Hëllef vun enger detergent-mechanescher Zelllyse an engem 2 ml Glasgewebe-Mëndungsmëttel (D8938, Sigma-Aldrich/KIMBLE) zerstéiert. Déi rau Zellkäre goufen dann mat engem 40 µm Filter ofgefiltert an 10 Minutte bei 320 g bei 4 °C zentrifugéiert, ier e Saccharosedichtgradient duerchgefouert gouf. Nom Zentrifugatiounsschratt (320 g fir 20 Minutte bei 4 °C) goufen d'Prouwe mat 0,04% BSA/PBS mat Zousaz vun 0,2 Eenheeten µl-1 RNase-Inhibitor (40 u µl-1, AM2682, Ambion) resuspendéiert an duerch e 40 µm Flowfilter geleet. Déi dissoziéiert Käre goufen dann a PBS mat 0,02% BSA resuspendéiert an op e Chromium Single Cell 3′ Chip gelueden (geschätzte Erhuelung vun 8.000 Zellen pro Spur). snRNA-seq-Bibliothéike goufe mam Chromium Single cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics) virbereet. snRNA-seq-Bibliothéike goufe mam Chromium Single cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics) virbereet. Библиотеки snRNA-seq были приготовлены с помощью Chromium Single cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics). D'snRNA-seq-Bibliothéike goufe mat Chromium Single cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics) virbereet. snRNA-seq 文库是使用Chromium Single cell 3′ GEM、Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics) 制备的。 snRNA-seq 文库是使用Chromium Single cell 3′ GEM、Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics) 制备的。 Библиотеку snRNA-seq готовили с использованием Chromium Single Cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics). D'snRNA-seq-Bibliothéik gouf mat Chromium Single Cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics) virbereet.Bibliothéike vu verschiddene Prouwe goufe vun Admera Health op NovaSeq S4 (Illumina) zesummegefaasst a sequenzéiert.
D'Genexpressionsniveauen fir all mutmassleche nukleare Barcode goufen mat dem 10x Genomics CellRanger Analysesoftwarepaket (Versioun 6.1.2) quantifizéiert. Genauer gesot goufen d'Liesungen mat enger Kombinatioun vu mënschlechen (GRCh38, Ensemble, Versioun 98) a Ratten (Rnor_6.0, Ensemble, Versioun 100) Referenzgenomer verglach, déi mam mkref Kommando erstallt goufen an "count" mam -include-introns=TRUE Kommando benotzt goufen, fir d'Inklusiounsliesungen, déi op Intronregiounen ofgebild sinn, ze quantifizéieren. Fir t-hCO Proben goufen mënschlech Kären op Basis vun der konservativer Fuerderung identifizéiert, datt op d'mannst 95% vun alle afgebildte Liesungen mam mënschleche Genom iwwereneestëmmen. All spéider Analysen goufen op engem gefilterten Barcode-Array vum CellRanger mat dem R-Paket (Versioun 4.1.2) Seurat (Versioun 4.1.1)32 duerchgefouert.
Fir sécherzestellen, datt nëmmen héichqualitativ Kären an déi spéider Analyse abegraff sinn, gouf fir all Prouf en iterative Filterprozess ëmgesat. Als éischt ginn niddregqualitativ Kären mat manner wéi 1000 eenzegaartege Genen a méi wéi 20% vun de gesamte Mitochondrien identifizéiert an ewechgeholl. Duerno gouf déi rau Genzuelmatrix duerch regulariséiert negativ binomial Regressioun normaliséiert mat der sctransform(vst.flavor=”v2″) Funktioun, déi och déi 3000 variabelst Genen mat Standardparameteren identifizéiert huet. Dimensiounsreduktioun gouf op den ieweschte variable Genen mat der Principal Component Analysis (PCA) mat Standardparameteren duerchgefouert, andeems eng Datensazdimensioun vun 30 benotzt gouf (dims = 30 gouf op Basis vun der visueller Inspektioun vun de Knéiplazen gewielt a fir all Proben an Ensembleanalysen benotzt). Mir hunn duerno e puer Ronnen vun iterativer Clustering (Opléisung = 1) duerchgefouert, fir Genen op Basis vun anormal niddreger Genzuel (Median ënner dem 10. Perzentil), anormal héijer mitochondrialen Genzuel (Median iwwer dem 95. Perzentil) ze klassifizéieren, fir potenziell Zellen vun niddereger Qualitéit z'identifizéieren an ze entfernen. Clusteren an/oder en héije Prozentsaz vu verdächtege Zwillingen, déi mat dem DoubletFinder33 Package identifizéiert goufen (duerchschnëttleche DoubletFinder Score iwwer dem 95. Perzentil). t-hCO Proben (n=3) an hCO Proben (n=3) goufen separat mat der IntegrateData Funktioun mat den uewe genannten Parameteren integréiert. Dann Eng weider Ronn vu qualitativer Filterung vum integréierten Datesaz gouf wéi uewe beschriwwen duerchgefouert.
Nodeems déi niddregqualitativ Kären ewechgeholl goufen, gouf den integréierten Datesaz gruppéiert (Opléisung = 0,5) an fir UMAP34 Visualiséierungszwecker agebett. Markergenen fir all Cluster goufen mat der FindMarkers Funktioun mat Standardparameter bestëmmt, déi aus normaliséierten Genexpressionsdaten berechent goufen. Mir identifizéieren a klassifizéieren wichteg Zellklassen andeems mir Referenzdatensätz vu fetaler an erwuessener Kortex mat der Markergenexpression 19,20,21,35 an Annotatioun kombinéieren. Besonnesch zirkulierend Virleefer goufen duerch d'Expressioun vun MKI67 an TOP2A identifizéiert. Progenitorcluster goufen definéiert duerch d'Feele vu mitotischen Transkripten, eng héich Iwwerlappung mat multipotenten gliale Progenitorcluster, déi am spéide Metaphase-Fetalcortex beschriwwe ginn, an d'EGFR- an OLIG1-Expressioun. Mir benotzen den Term Astrozyt fir verschidde Stadien vun der Astrozyten-Differenzéierung ze beschreiwen, vu spéider radialer Glia bis zur Reifung vun Astrozyten. Astrozytencluster expriméieren héich Niveauen vun SLC1A3 an AQP4 a goufen gewisen, datt se mat Subtypen vu fetaler radialer Glia an/oder erwuessenen Astrozyten kartéieren. OPCe expriméieren PDGFRA an SOX10, während Oligodendrozyten Myeliniséierungsmarker expriméieren (MOG an MYRF). Glutamatergesch Neuronen goufen duerch d'Präsenz vun neuronalen Transkripten (SYT1 an SNAP25), d'Feele vu GABAergesche Marker (GAD2) an d'Expressioun vun NEUROD6, SLC17A7, BCL11B oder SATB2 identifizéiert. GluN-Neuronen goufen weider an iewescht (SATB2-Expressioun a Verloscht vu BCL11B) an déif (BCL11B-Expressioun) Ënnerklassen opgedeelt. Putativ Subplackenneuronen (SP-Neuronen) expriméieren bekannt SP18-Markéierer wéi ST18 an SORCS1 zousätzlech zu déiwe GluN-Markéierer. Choroidplexus-ähnlech Zellen goufen duerch TTR-Expressioun identifizéiert, a meningeal-ähnlech Zellen hunn Fibroblast-assoziéiert Genen expriméiert a Pial-/vaskulär Zellen aus dem Referenzdatensatz kartéiert.
Eng Differenzialanalyse vun der Genexpression tëscht t-hCO- an hCO-Ënnerklassen gouf mat enger nei entwéckelter Pseudo-Batch-Method duerchgefouert, déi a Proben reproduzéiert gouf, déi mam Libra R-Paket (Versioun 1.0.0) implementéiert goufen. Speziell goufen edgeR-Log-Likelihood-Tester (Versioun 3.36.0, Package R) fir Gruppen duerchgefouert, andeems d'Zuel vun de Genen an Zellen fir eng bestëmmt Zellklass fir all Proufreplikatioun summéiert gouf. Fir d'Heatmap-Visualiséierung goufen normaliséiert pro Millioun (CPM) Wäerter mat edgeR (cpm() Funktioun) berechent a skaléiert (fir e Moyenne = 0, Standardofwäichung = 1 z'erreechen). Eng Genontologie (GO)-Beräicherungsanalyse vu signifikant eropreguléierten t-hCO-GluN-Genen gouf duerchgefouert (e Benjamini-Hochberg-korrigéierte P-Wäert vu manner wéi 0,05 ausgedréckt an op d'mannst 10% vun den t-hCO-GluN-Zellen an eng Erhéijung vun der Ännerung vun op d'mannst dem 2-fache), déi mat der ToppGene Suite (https://toppgene.cchmc.org/)37 duerchgefouert gouf. Mir benotzen d'ToppFun App mat Standardparameteren a mellen Benjamini-Hochberg-korrigéiert P-Wäerter, déi aus GO-annotéierten hypergeometreschen Tester berechent goufen.
Fir eis snRNA-seq Cluster mat annotéierten Zellcluster aus Referenzstudien iwwer primär Eenzelzell-RNA-seq oder Erwuessenen-snRNA-seq19,20,21,22 ofzestëmmen, hu mir e gepaarten Dateset-Integratiounsusaz ugewannt. Mir hunn den SCTransform (v2) Normaliséierungsworkflow a Seurat benotzt fir Cluster-Iwwerlappungen tëscht Datensätz z'integréieren an ze vergläichen (mat de selwechte Parameteren wéi uewen). Individuell Datensätz goufen zoufälleg bis zu 500 Zellen oder Kären pro urspréngleche Cluster fir d'Berechnungseffizienz ënnergruppéiert. Mat engem ähnlechen Usaz wéi virdru beschriwwen, gouf Cluster-Iwwerlappung als den Undeel vun Zellen oder Kären an all gepoolte Cluster definéiert, déi sech mam Label vum Referenzcluster iwwerlappt hunn. Fir GluNs weider ze klassifizéieren, hu mir de Seurat säin TransferData Workflow fir GluN-Ënnergruppdaten benotzt fir Referenzdateset-Labels un eis GluN-Zellen zouzeweisen.
Fir de Reifungsstatus vum globale Transkriptom vun t-hCO- a hCO-Prouwe ze evaluéieren, hu mir eis Pseudo-Bulk-Prouwe mat BrainSpan/psychENCODE23 verglach, déi aus enger grousser RNA-Sequenz besteet, déi d'Entwécklung vum mënschleche Gehir ëmfaasst. Mir hunn PCA op enger kombinéierter musternormaliséierter Genexpressionsmatrix aus kortikale Prouwe 10 Wochen no der Konzeptioun a spéider a 5567 Genen (zesumme mat eisen Donnéeën) duerchgefouert, déi virdru als aktiv a BrainSpan-kortikale Prouwe identifizéiert goufen (definéiert als méi wéi 50% an der Entwécklungsvarians erkläert duerch Alter mat engem kubesche Modell)38. Zousätzlech hu mir Genen ofgeleet, déi mat wichtegen Transkriptomsignaturen vun der Neuroentwécklung assoziéiert sinn, andeems mir net-negativ Matrixfaktoriséierung benotzt hunn, wéi virdru beschriwwen. D'Proufgewichte, déi mat der net-negativer Matrixfaktoriséierungsprozedur berechent goufen, sinn an de Fig. 5b mat erweiderten Donnéeën fir all vun de fënnef Signaturen, déi vum Zhu et al.38 beschriwwe goufen, duergestallt. Och hei goufen Aktivitéitsofhängeg Transkriptiounsmarkéierer aus virdru publizéierte Studien ofgeleet. Besonnesch ERG an LRG waren an glutamatergen Neuronen, déi duerch d'snRNA-seq-Sammlung vum visuelle Cortex vun der Maus identifizéiert goufen, no der visueller Stimulatioun aus der Ergänzungstabell 3 Hrvatin et al.16, signifikant eropreguléiert. Mënsch-angeräichert LRGs goufen aus KCl-aktivéierte mënschleche fetale Gehirkulturen kritt a 6 Stonnen no der Stimulatioun gesammelt, an déi gefiltert Genen waren beim Mënsch signifikant eropreguléiert, awer net bei Nager (Ergänzungstabell 4). D'Analyse vun der Genset-Anreicherung mat dëse Gensätz gouf mat engem One-Way-Fisher-Exakt-Test duerchgefouert.
Anästhetiséiert d'Ratten mat Isofluran, huelt d'Gehirer eraus a leet se an eng kal (ongeféier 4°C) sauerstoffräich (95% O2 a 5% CO2) Saccharoseléisung fir Schnëtter mat: 234 mM Saccharose, 11 mM Glukos, 26 mM NaHCO3, 2,5 mM KCl, 1,25 mM NaH2PO4, 10 mM MgSO4 an 0,5 mM CaCl2 (ongeféier 310 mOsm). Koronalschnëtter vum Rattegehir (300–400 µm) mat t-hCO3 goufen mat engem Leica VT1200 Vibratom gemaach, wéi virdru beschriwwen. D'Schnëtter goufen dann an eng Schnëttkammer mat kontinuéierlecher Sauerstoffversuergung bei Raumtemperatur transferéiert, déi aCSF enthält, deen aus folgendem preparéiert gouf: 10 mM Glukos, 26 mM NaHCO3, 2,5 mM KCl, 1,25 mM NaHPO4, 1 mM MgSO4, 2 mM CaCl2 an 126 mM NaCl (298 mOsm), mindestens 45 Minutte virun der Opnam. D'Schnëtter goufen an enger Tauchkammer opgeholl, wou se kontinuéierlech mat aCSF (95% O2 an 5% CO2 Fläschchen) perfuséiert goufen. All Donnéeë goufen bei Raumtemperatur opgeholl. t-hCO Neuronen goufen mat enger Borosilikatglaspipette terminéiert, déi mat enger Léisung gefëllt war, déi 127 mM Kaliumglukonat, 8 mM NaCl, 4 mM Magnesium ATP, 0,3 mM Natrium GTP, 10 mM HEPES an 0,6 mM EGTA, pH 7,2, intern Léisung ugepasst mat KOH (290 mOsm). Fir d'Rekonstruktioun gouf Biocytin (0,2%) an d'Opnamléisung bäigefüügt.
D'Donnéeë goufe mat engem MultiClamp 700B Verstärker (Molecular Devices) an engem Digidata 1550B Digitalisator (Molecular Devices) gesammelt, Tiefpassfilter bei 2 kHz, digitaliséiert bei 20 kHz an analyséiert mat Clampfit (Molecular Devices), Origin (OriginPro). 2021b, OriginLab) a personaliséierte MATLAB Funktiounen (Mathworks). De Junction Potential gouf mat JPCalc berechent an d'Entréeën goufen op de berechente Wäert vun -14 mV ugepasst. Operatioun IV besteet aus enger Serie vu Stroumschrëtt a Schrëtt vun 10-25 pA, vun -250 bis 750 pA.
Den Thalamus, déi wäiss Substanz an d'S1-Afferenten goufen an thalamokortikalen Scheiwen elektresch stimuléiert während der Patch-Clamp-Opzeechnung vun hCO-Neuronen, wéi virdru beschriwwen. Kuerz gesot, gouf d'Gehir op engem 3D-Dréckdësch placéiert, deen an engem 10°-Wénkel gekippt war, an d'Front vum Gehir gouf an engem 35°-Wénkel geschnidden. D'Gehir gouf dann op d'Schnëttoberfläche gepecht a geschnidden, wouduerch déi thalamokortikal erausstinnend Axonen erhale bliwwe sinn. Bipolar Wolframelektroden (0,5 MΩ) goufen op engem zweete Mikromanipulator montéiert a strategesch positionéiert, fir véier Regioune pro Zell ze stimuléieren (bannenzeg Kapsel, wäiss Substanz, S1 an hCO). Synaptesch Äntwerten no 300 µA phasescher Stimulatioun bei 0,03–0,1 Hz ophuelen.
hChR2-expriméierend hCO Neuronen goufen bei 480 nm aktivéiert an Liichtimpulse, déi vun enger LED (Prizmatix) generéiert goufen, goufen duerch en ×40 Objektiv (0.9 NA; Olympus) applizéiert fir d'hChR2-Expressioun no bei den Zellen opzehuelen. Den Duerchmiesser vum beliichte Feld ass ongeféier 0,5 mm an d'Gesamtleistung ass 10-20 mW. D'Pulsbreet gouf op 10 ms agestallt, wat dem Puls entsprécht, deen während dem Verhalensléierexperiment ginn ass. Verschidde Stimulatiounsfrequenzen goufen benotzt, vun 1 bis 20 Hz, awer nëmmen den éischten Puls vun der Serie gouf fir d'Quantifizéierung benotzt. D'Intervalle tëscht den Zich sinn normalerweis méi laang wéi 30 s fir den Effekt op synaptesch inhibitoresch oder erliichternd Weeër ze minimiséieren. Fir ze testen ob d'hChR2-Äntwert monosynaptesch war, hu mir TTX (1 μM) op d'Bad applizéiert bis d'EPSC-Reaktioun verschwonnen ass, an duerno 4-Aminopyridin (4-AP; 100 μM) applizéiert. Typesch gëtt eng Äntwert bannent e puer Minutten zréckginn, mat enger liicht méi laanger Verzögerung tëscht der LED-Ausléisung an der EPSC-Generatioun. NBQX (10 μM) gouf benotzt fir ze testen, ob d'Äntwert vun AMPA-Rezeptoren ugedriwwe gëtt.
Scharf hCO₃-Schnëtter goufen erstallt, wéi virdru beschriwwen. Kuerz gesot, goufen hCO₃-Schnëtter an 4% Agarose agebett an op Zellen transferéiert, déi 126 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM NaH₂PO₄, 1 mM MgSO₄, 2 mM CaCl₂, 26 mM NaHCO₃ an 10 mM d-(+)-Glukos enthalen. D'Schnëtter goufen bei Raumtemperatur mat engem Leica VT1200 Vibrator mat 200–300 µm geschnidden an an ASF bei Raumtemperatur gelagert. Duerno gouf eng Patch-Camp-Opnam vu ganze Zellen op hCO₃-Schnëtter ënner engem direkten SliceScope-Mikroskop (Scientifica) duerchgefouert. D'Schnëtter goufen mat aCSF (95% O₂ a 5% CO₂) perfuséiert an d'Zellsignaler goufen bei Raumtemperatur opgeholl. hCO Neuronen goufen mat enger Borosilikatglaspipette applizéiert, déi mat enger Léisung gefëllt war, déi 127 mM Kaliumglukonat, 8 mM NaCl, 4 mM Magnesium ATP, 0,3 mM Natrium GTP, 10 mM HEPES an 0,6 mM EGTA enthält, internen pH 7, 2, ugepasst mat KOH (Osmolaritéit 290). Fir d'Erhuelung goufen 0,2% Biocytin an déi intern Léisung bäigefüügt.
D'Donnéeë goufe vu Clampex (Clampex 11.1, Molecular Devices) mat engem MultiClamp 700B Verstärker (Molecular Devices) an engem Digidata 1550B Digitalisator (Molecular Devices) gesammelt, Tiefpass bei 2 kHz gefiltert, bei 20 kHz digitaliséiert an mat Clampfit (Versioun 10.6) fir d'Analyse (molekulare Geräter) a personaliséierte MATLAB Funktiounen (MATLAB 2019b, Mathworks) analyséiert. De Junction Potential gouf mat JPCalc berechent an d'Entréeën goufen op de berechente Junction Potential vun -14 mV ugepasst. Operatioun IV besteet aus enger Serie vu Stroumschrëtt a 5-10 pA Schrëtt vun -50 bis 250 pA.
Fir d'morphologesch Rekonstruktioun vun agefaangenen Neuronen gouf 0,2% Biocytin (Sigma-Aldrich) an d'intern Léisung bäigefüügt. D'Zellen ginn no der Hacking fir op d'mannst 15 Minutten geprimt. D'Pipette gëtt dann lues fir 1-2 Minutten eran gezunn, bis déi registréiert Membran komplett versiegelt ass. No der Schnëttphysiologieprozedur goufen d'Schnëtter iwwer Nuecht bei 4°C a 4% PFA fixéiert, mat PBS X3 gewäsch an 1:1000 mat Streptavidin-konjugéiertem DyLight 549 oder DyLight 405 (Vector Labs) verdënnt. Zellen, déi mat Biocytin (2%; Sigma-Aldrich) gefëllt waren, goufen während der Patch-Clamp-Opnam bei Raumtemperatur fir 2 Stonnen markéiert. D'Schnëtter goufen dann op Mikroskopie-Objeten mat engem Aquamount (Thermo Scientific) montéiert an den nächsten Dag op engem Leica TCS SP8 Konfokalmikroskop mat engem Ueleg-Immersiounsobjektiv mat enger numerescher Apertur ×40 1.3, Vergréisserung ×0.9–1.0, xy visualiséiert. D'Samplingrate ass ongeféier 7 Pixel pro Mikron. Z-Stacks an Intervalle vun 1 µm goufen seriell opgeholl, an z-Stack Mosaiken an Leica-baséiert Auto-Stitching goufen duerchgefouert fir de ganze dendritesche Bam vun all Neuron ze bedecken. D'Neuronen goufen dann semi-manuell mat der neuTube 40 Interface verfollegt an SWC-Dateie goufen generéiert. D'Dateie goufen dann an de SimpleNeuriteTracer41 Fiji Plugin eropgelueden (ImageJ, Versioun 2.1.0; NIH).
Mënschlecht Korteksgewebe gouf mat informéierter Zoustëmmung no engem Protokoll gesammelt, deen vum Institutional Review Board vun der Stanford University guttgeheescht gouf. Zwee Prouwe vu mënschlechem postpartalen Gewief (3 an 18 Joer al) goufen duerch Resektioun vum Frontalcortex (mittele Frontalgyrus) am Kader vun enger Operatioun fir refraktär Epilepsie gesammelt. Nom Resektioun gouf Gewief an äiskaler NMDG-aCSF gesammelt, déi folgendes enthält: 92 mM NMDG, 2,5 mM KCl, 1,25 mM NaH2PO4, 30 mM NaHCO3, 20 mM HEPES, 25 mM Glukos, 2 mM Thioharnstoff, 5 mM Natriumascorbat, 3 mM Natriumpyruvat, 0,5 mM CaCl2 4H2O an 10 mM MgSO4 7H2O. Titréiert op pH 7,3-7,4 mat konzentréierter Salzsäure. D'Gewief goufen bannent 30 Minutten an de Laboratoire geliwwert an d'Koronalschnëtter goufen no der uewe beschriwwener Prozedur geholl.
All Déierprozedure goufen am Aklang mat de vun der Stanford University APLAC guttgeheeschte Richtlinne fir Déierefleeg duerchgefouert. Ratten (méi wéi 140 Deeg no der Transplantatioun) goufen mat 5% Isofluran-Anästhesie induzéiert an intraoperativ mat 1-3% Isofluran anästhetiséiert. D'Déiere goufen an e stereotaxesche Frame (Kopf) gesat a Buprenorphin mat verlängerter Fräisetzung (SR) gouf subkutan injizéiert. De Schädel gëtt fräigeluecht, gebotzt an 3-5 Knachschrauwen ginn agesat. Fir t-hCO3 unzezielen, hu mir stereotaxesch Koordinaten aus MRI-Biller generéiert. E Buerlach gouf op der interesséierter Plaz gebuert an d'Faseren (400 µm Duerchmiesser, NA 0,48, Doric) goufen 100 µm ënner d'hCO3-Uewerfläch erofgesat a mat UV-härtbaren Zännzement (Relyx) um Schädel befestegt.
Glasfaserphotometresch Opzeechnunge goufen wéi virdru beschriwwen duerchgefouert42. Fir spontan Aktivitéit opzehuelen, goufen d'Ratten an e proppere Käfeg gesat an e Glasfaser-Patchkabel (Doric) mat engem Duerchmiesser vu 400 µm, deen un e glasfaser-photometrescht Datenerfassungssystem ugeschloss war, gouf mam implantéierte Glasfaserkabel verbonnen. Wärend der 10-Minutte-Opzeechnung vun der motorescher Aktivitéit konnten d'Déieren de Käfeg fräi entdecken. Fir déi evozéiert Aktivitéit opzehuelen, goufen d'Ratten (méi wéi 140 Deeg no der Transplantatioun) mat 5% Isofluran fir Induktioun an 1-3% Isofluran fir Ënnerhalt anästhetiséiert. D'Déier gëtt an e stereotaktesche Kader (Kopf) gesat an d'Barrhår op der anerer Säit vum t-hCO ginn op ongeféier 2 cm geschnidden an duerch e Mesh gefouert, dat mat engem piezoelektreschen Aktuator (PI) verbonnen ass. E 400 µm Glasfaser-Patchkabel (Doric) gouf mat der implantéierter Faser verbonnen an dem Datenerfassungssystem verbonnen. D'Whirstchairs op der anerer Säit vum t-hCO goufen dann 50 Mol (2 mm bei 20 Hz, 2 Sekonnen pro Presentatioun) zu zoufällegen Zäiten vun engem piezoelektreschen Undriff iwwer eng Opnamzäit vun 20 Minutten ofgelenkt. Benotzt den Arduino MATLAB Support Package fir d'Oflenkungszäit mat personaliséiertem MATLAB Code ze kontrolléieren. D'Evenementer ginn mat der Datenerfassungssoftware synchroniséiert andeems Transistor-Transistor-Logik (TTL) Impulser benotzt ginn.
Ratten (méi wéi 140 Deeg no der Transplantatioun) goufen mat 5% Isofluran-Anästhesie induzéiert an intraoperativ mat 1-3% Isofluran anästhetiséiert. D'Déiere goufen an e stereotaxesche Frame (Kopf) gesat a Buprenorphin SR an Dexamethason goufen subkutan injizéiert. De Schädel gëtt fräigeluecht, gebotzt an 3-5 Knachschrauwen ginn agesat. Fir t-hCO3 gezielt ze bestëmmen, hu mir stereotaxesch Koordinaten aus MRI-Biller generéiert. Eng kreesfërmeg Kraniotomie (ongeféier 1 cm Duerchmiesser) gouf mat engem Héichgeschwindegkeetsbuer direkt iwwer dem transplantéierten hCO3 duerchgefouert. Soubal de Knach sou dënn wéi méiglech ass, awer ier een duerch de ganze Knach buert, benotzt eng Pinzette fir déi verbleiwen intakt Beckenscheif ze entfernen, fir den ënnerläitenden t-hCO3 ze weisen. D'Kraniotomie gouf mat steriler Salzléisung gefëllt, an e Deckglas an e spezielle Kappstift goufen mat UV-gehäertetem Zännzement (Relyx) um Schädel befestegt.
D'Zwei-Photonen-Bildgebung gouf mat engem Bruker Multiphoton-Mikroskop mat engem Nikon LWD (×16, 0,8 NA) Objektiv duerchgefouert. D'GCaMP6-Bildgebung gouf bei 920 nm mat 1,4x eenzeger z-Plane-Vergréisserung an engem 8x Duerchschnëtt vun 7,5 fps duerchgefouert. D'Ratte goufen mat 5% Isofluran-Anästhesie induzéiert a mat 1-3% Isofluran gehalen. D'Ratte goufen an eng speziell gemaachte Kappfixture gesat a ënnert der Lëns positionéiert. Eng 3-Minutte Hannergrondopnam vun der motorescher Aktivitéit gouf gemaach. Am Laf vun 20 Minutte Opnam goufen 50 Puffs (jeeweils 100 ms laang) zoufälleg op de Whisker-Pad vis-à-vis vun t-hCO mat engem Picospricer geliwwert. Benotzt den Arduino MATLAB Support Package fir d'Burstzäit mat personaliséiertem MATLAB Code ze kontrolléieren. Synchroniséiert Eventer mat Datenerfassungssoftware (PrairieView 5.5) mat TTL-Impulser. Fir d'Analyse goufen d'Biller fir xy-Bewegung mat affiner Korrektur am MoCo-Programm, deen zu Fidschi gestart gouf, korrigéiert. Extraktioun vu fluoreszenten Spueren aus eenzelnen Zellen mat CNMF-E43. D'Fluoreszenz gouf fir all Regioun vun Interesse extrahéiert, an dF/F-Kurven ëmgewandelt an duerno an z-Scores ëmgewandelt.
Ratten (méi wéi 140 Deeg no der Transplantatioun) goufen mat 5% Isofluran-Anästhesie induzéiert an intraoperativ mat 1-3% Isofluran anästhetiséiert. D'Déiere goufen an e stereotaxesche Frame (Kopf) gesat a Buprenorphin SR an Dexamethason goufen subkutan injizéiert. D'Barrhår op der anerer Säit vum t-hCO goufen op ongeféier 2 cm geschnidden an duerch e Mesh gefouert, dat mat engem piezoelektreschen Aktuator verbonnen ass. De Schädel gëtt fräigeluecht a gebotzt. Eng Buedemschrauf aus Edelstol gëtt um Schädel befestegt. Fir t-hCO ze zielen, hu mir stereotaxesch Koordinaten aus MRI-Biller generéiert. Maacht eng kreesfërmeg Kraniotomie (ongeféier 1 cm Duerchmiesser) mat engem Héichgeschwindegkeetsbuer just iwwer dem t-hCO. Soubal de Schank sou dënn wéi méiglech ass, awer ier Dir duerch de ganze Schank buert, benotzt eng Pinzette fir déi verbleiwen intakt Beckenscheif ze entfernen, fir den ënnerläitenden t-hCO ze weisen. Eenzel Zellen goufen mat 32-Kanal- oder 64-Kanal-Héichdicht-Siliciumsonden (Cambridge Neurotech) opgeholl, déi mat Äerdschrauwen geerdet a mat RHD-Verstärker (Intan) virverstäerkt waren. Benotzt de Manipulator fir d'Elektroden duerch d'Kraniotomie op d'Zilplaz ze senken, déi mat steriler Salzléisung gefëllt ass. D'Datenerfassung gouf mat enger Frequenz vun 30 kHz mat dem Open Ephys Datenerfassungssystem duerchgefouert. D'Opnam gouf nëmme weidergefouert, wéi mir héich korreléiert rhythmesch spontan Aktivitéit a méi wéi 10 Kanäl festgestallt hunn, wat drop hiweist, datt d'Elektroden am Transplantat lokaliséiert waren (baséiert op Zwei-Photon-Kalzium-Bildgebungsdaten). Eng 10-Minutte Hannergrondopnam vun der motorescher Aktivitéit gouf gemaach. D'Whirstchairs op der anerer Säit vum t-hCO goufen dann 50 Mol (2 mm bei 20 Hz, 2 s pro Presentatioun) zu zoufällegen Zäiten vun engem piezoelektreschen Undriff iwwer eng Opnamzäit vun 20 Minutten ofgelenkt. Mat dem MATLAB Support Package fir Arduino (MATLAB 2019b) kann d'Oflenkungszäit mat personaliséiertem MATLAB-Code kontrolléiert ginn. Benotzt TTL-Impulser fir Eventer mat Datenerfassungssoftware ze synchroniséieren.
Fir optesch Markéierungsexperimenter gouf en 200 µm laangen optesche Patchkabel (Doric), deen un e 473 nm Laser (Omicron) ugeschloss war, un eng 200 µm laang optesch Faser ugeschloss, déi iwwer der Kraniotomie placéiert war. Direkt virdrun gouf d'Jumperleistung op 20 mW agestallt. Benotzt de Manipulator fir d'Elektroden duerch d'Kraniotomie, déi mat steriler Salzléisung gefëllt ass, op d'Zilplaz ze senken. Um Ufank vun der Opnam goufen zéng Liichtimpulse vu 473 nm (Frequenz 2 Hz, Pulsdauer 10 ms) ausgestraalt. Liichtempfindlech Zellen goufen als Zellen definéiert, déi a 70% oder méi vun de Versich eng Spike-Äntwert bannent 10 ms Liicht gewisen hunn.