Nature.comን ስለጎበኙ እናመሰግናለን። የተወሰነ የሲኤስኤስ ድጋፍ ያለው የአሳሽ ስሪት እየተጠቀሙ ነው። ለበለጠ ልምድ፣ የዘመነ አሳሽ እንድትጠቀም እንመክርሃለን (ወይም የተኳኋኝነት ሁነታን በኢንተርኔት ኤክስፕሎረር አሰናክል)። በተጨማሪም, ቀጣይነት ያለው ድጋፍ ለማረጋገጥ, ጣቢያውን ያለ ቅጦች እና ጃቫስክሪፕት እናሳያለን.
በአንድ ጊዜ የሶስት ስላይዶችን ካርሶል ያሳያል። በአንድ ጊዜ በሶስት ስላይዶች ለመንቀሳቀስ የቀደመውን እና ቀጣይ ቁልፎችን ይጠቀሙ ወይም በመጨረሻው ላይ ያሉትን ተንሸራታቾች በአንድ ጊዜ በሶስት ስላይዶች ለማለፍ ይጠቀሙ።
እራስን የሚገጣጠሙ የነርቭ አካላት የሰውን ልጅ እድገት እና በሽታን ለመቅረጽ ተስፋ ሰጪ የሆነ የ in vitro መድረክን ይወክላሉ። ነገር ግን ኦርጋኖይዶች በ Vivo ውስጥ ያለው ግንኙነት የላቸውም, ይህም ብስለት የሚገድበው እና ባህሪን ከሚቆጣጠሩ ሌሎች ወረዳዎች ጋር እንዳይዋሃድ ይከላከላል. እዚህ ላይ በሰው ልጅ ግንድ ሴል የሚመነጩ ኮርቲካል ኦርጋኖይድስ ወደ somatosensory cortex የአራስ እርቃን አይጦች የተተከሉ የጎለመሱ የሕዋስ ዓይነቶችን ከስሜት ህዋሳት እና ተነሳሽነት ጋር በተያያዙ ወረዳዎች ውስጥ እንደሚዋሃዱ እናሳያለን። ኤምአርአይ የድህረ-ትራንስፕላንት ኦርጋኖይድ እድገትን በበርካታ የስቴም ሴል መስመሮች እና በእንስሳት ላይ ያሳየ ሲሆን ነጠላ-ኮር ትንታኔ ደግሞ የኮርቲጂኔሲስ እድገት እና በእንቅስቃሴ ላይ የተመሰረተ የጽሁፍ ግልባጭ ፕሮግራም መፈጠሩን ያሳያል። በእርግጥ፣ የተተከሉ ኮርቲካል ነርቮች ከኢንቪትሮ አቻዎቻቸው የበለጠ የተወሳሰቡ የሞርፎሎጂ፣ ሲናፕቲክ እና የውስጥ ሽፋን ባህሪያትን ያሳያሉ፣ ይህም የቲሞቲስ ሲንድሮም ባለባቸው ታካሚዎች ላይ የነርቭ ጉድለቶችን ለመለየት ያስችላል። የአናቶሚካል እና የተግባር ክትትል እንደሚያሳየው የተተከሉ የአካል ክፍሎች ታላሞኮርቲካል እና ኮርቲኮኮርቲካል ግብአቶችን ይቀበላሉ, እና የነርቭ እንቅስቃሴ ቀረጻዎች እነዚህ ግብአቶች በሰው ሴሎች ውስጥ የስሜት ህዋሳትን ሊፈጥሩ እንደሚችሉ ይጠቁማሉ. በመጨረሻም፣ ኮርቲካል ኦርጋኖይድ በመላው አይጥ አንጎል ውስጥ አክሰንን ያሰፋዋል፣ እና የኦፕቶጄኔቲክ ማግበር ሽልማቶችን የመፈለግ ባህሪን ያስከትላል። ስለዚህ፣ የተተከሉ የሰው ኮርቴክስ ነርቮች ብስለት እና ባህሪን በሚቆጣጠሩት የአስተናጋጁ ወረዳዎች ውስጥ ይሳተፋሉ። ይህ አካሄድ በሌሎች መንገዶች ሊገኙ የማይችሉ በትዕግስት በተገኙ ህዋሶች ውስጥ የስትራንድ-ደረጃ ፍኖታይፕን ለመለየት ያመቻቻል ብለን እንጠብቃለን።
በማደግ ላይ ያለው የሰው ልጅ አእምሮ ሴሎች የሚባዙበት፣ የሚለያዩበት፣ የሚሰደዱበት እና የሚገናኙበት እና በስሜታዊ ልምምዶች የበለጠ የተጣሩ ተግባራዊ የነርቭ ሴክተሮች የሚፈጠሩበት አስደናቂ ራስን የማደራጀት ሂደት ነው። የሰው ልጅን የአዕምሮ እድገት በተለይም ከበሽታ ጋር በተያያዙ ጉዳዮች ላይ የመረዳት ቁልፍ ችግር የአንጎል ቲሹ ተደራሽነት ማጣት ነው። የሰው ኮርቴክስ ኦርጋኖይድ (hCO፣ የሰው ኮርቴክስ ሉል በመባልም የሚታወቀው)ን ጨምሮ እራሳቸውን የሚያደራጁ የአካል ክፍሎች 2,3,4,5,6 ማመንጨት ይችላሉ. ሆኖም ፣ በርካታ ገደቦች የነርቭ ምልልሶችን እድገት እና አሠራር ለመረዳት የእነሱን ሰፊ መተግበሪያ ይገድባሉ። በተለይም የ hCO ብስለት የተገደበው በ Vivo ውስጥ የሚገኙ የተወሰኑ የማይክሮ ምህዳራዊ እና የስሜት ህዋሳት አለመኖራቸው ግልጽ አይደለም። በተጨማሪም hCO ዎች የባህርይ ውጤቶችን ሊፈጥሩ በሚችሉ ወረዳዎች ውስጥ ስላልተዋሃዱ የጄኔቲክ ውስብስብ እና የባህርይ ኒውሮሳይካትሪ መዛባቶችን ሞዴል ለማድረግ ያላቸው ጥቅም በአሁኑ ጊዜ የተገደበ ነው.
የ hCO ወደ ያልተነካ ሕያው አንጎል መሸጋገር እነዚህን ገደቦች ሊያሸንፍ ይችላል. ቀደም ሲል የተደረጉ ጥናቶች እንደሚያሳዩት ወደ አይጥንም ኮርቴክስ የተተከሉ የሰው ነርቮች መኖር፣ ፕሮጄክት እና ከአይጥ ህዋሶች ጋር መገናኘት ችለዋል7,8,9,10,11,12. ይሁን እንጂ እነዚህ ሙከራዎች በአብዛኛው የሚከናወኑት በአዋቂ እንስሳት ላይ ነው, ይህም የሲናፕቲክ እና የአክሶናል ውህደትን ሊገድብ ይችላል. እዚህ በፕላስቲክ እድገት የመጀመሪያ ደረጃ ላይ ከሂፒኤስ ሴሎች የተገኘውን 3D hCO ወደ ዋናው somatosensory cortex (S1) ወደ ቀዳሚው የ somatosensory cortex (S1) የተከልንበትን የንቅለ ተከላ ሁኔታ እንገልፃለን። የተተከሉ hCO (t-hCO) ነርቮች ከፍተኛ ብስለት ያልፋሉ፣ የስሜት ህዋሳትን የሚያገኙ thalamocortical እና cortical-cortical ግብዓቶችን ይቀበላሉ፣ እና የሽልማት ፈላጊ ባህሪን ለመንዳት የአክሶናል ትንበያዎችን ወደ አይጥ አንጎል ያስፋፋሉ። የቲ-hCO የተራዘመ ብስለት በቲሞቲስ ሲንድሮም (ቲኤስ) በሽተኞች ላይ የነርቭ ጉድለቶችን አሳይቷል, በቮልቴጅ-ስሱ ኤል-አይነት CaV1.2 ካልሲየም ቻናል (በ CACNA1C የተመዘገበ) ውስጥ በሚውቴሽን ምክንያት የሚከሰት ከባድ የጄኔቲክ መታወክ.
በ Vivo ውስጥ ባሉ ወረዳዎች ውስጥ የሰዎችን ኮርቲካል ነርቮች ለማጥናት stereotactically ያልተነካ 3D hCO ወደ S1 ወደ ቀድሞ ከወሊድ በኋላ የሚመጡ የአቲሚክ አይጦችን (ከ3-7 ቀናት ከወሊድ በኋላ) (ምስል 1 ሀ እና የስዕል 1 ሀ-ሐ የተስፋፋ መረጃ) ተክለናል። በዚህ ጊዜ የ thalamocortical እና corticocortical axonal ግምቶች S1 innervation (ማጣቀሻ 13) ገና አላጠናቀቁም. ስለዚህ ይህ አካሄድ የ t-hCO ውህደትን ከፍ ለማድረግ የተነደፈ ሲሆን በውስጣዊ ዑደቶች ላይ ያለውን ተጽእኖ እየቀነሰ ነው። በህይወት እንስሳት ውስጥ የ t-hCO ቦታን በዓይነ ሕሊና ለማየት ከ 2-3 ወራት በኋላ የአይጦችን የቲ-2-ክብደት ኤምአርአይ አንጎል መልሶ ማቋቋምን አደረግን (ምስል 1 ለ እና የተራዘመ መረጃ, ምስል 1d). t-hCO በቀላሉ ታይቷል እና የ t-hCO መጠን መለኪያዎች ከቋሚ ቁርጥራጭ ከተሰሉት ጋር ተመሳሳይ ናቸው (የተራዘመ የውሂብ ምስል 1d,e; P> 0.05). t-hCO በቀላሉ ታይቷል እና የ t-hCO መጠን መለኪያዎች ከቋሚ ቁርጥራጭ ከተሰሉት ጋር ተመሳሳይ ናቸው (የተራዘመ የውሂብ ምስል 1d,e; P> 0.05). t-hCO легко наблюдались, а объемные измерения t-hCO ዳኒዬ፣ ሪስ 1d፣ ሠ; t-hCO በቀላሉ ታይቷል, እና የድምጽ መጠን t-hCO መለኪያዎች ለቋሚ ክፍሎች (የተስፋፋ መረጃ, ምስል 1d, e; P> 0.05) ከተሰሉት ጋር ተመሳሳይ ናቸው.很容易观察到t-hCO，并且t-hCO的体积测量值与从固定切片计算的测量值相似（扩展数据图1d、e；P > 0.05）很容易观察到t-hCO，并且t-hCO t-hCO легко наблюдался፣ а объемные измерения t-hCO ዳኒዬ፣ ሪስ 1d፣ ሠ; t-hCO በቀላሉ ታይቷል, እና የድምጽ መጠን t-hCO መለኪያዎች ለቋሚ ክፍሎች (የተስፋፋ መረጃ, ምስል 1d, e; P> 0.05) ከተሰሉት ጋር ተመሳሳይ ናቸው.ከተተከሉ ከ2 ወራት ገደማ በኋላ (n = 72 እንስሳት፣ hCO ከ10 hiPS ሴል መስመሮች፣ የሂፒኤስ ሴል መስመሮች በማሟያ ሠንጠረዥ 1) በ81% ከተተከሉ እንስሳት ውስጥ t-hCO ወስነናል። ከእነዚህ ውስጥ 87% የሚሆኑት በሴሬብራል ኮርቴክስ (ምስል 1 ሐ) ውስጥ ይገኛሉ. በተከታታይ ኤምአርአይ (MRI) ምርመራዎችን በበርካታ ጊዜያት በተመሳሳይ የተተከለ አይጥ በማካሄድ በ 3 ወራት ውስጥ የ t-hCO መጠን ዘጠኝ እጥፍ ጭማሪ አግኝተናል (ምስል 1 ዲ እና የተስፋፋ መረጃ ፣ ምስል 1 ረ)። የተተከሉ እንስሳት ከፍተኛ የመዳን ፍጥነት (74%) ነበራቸው 12 ወራት በኋላ (የተስፋፋ መረጃ, ምስል 1g እና ተጨማሪ ሰንጠረዥ 2), እና ምንም ግልጽ የሞተር ወይም የማስታወስ እክሎች, gliosis, ወይም electroencephalogram (EEG) አልተገኙም. የውሂብ ምስል 1g እና ተጨማሪ ሰንጠረዥ 2). 1 ሰ - ሜትር እና 3 ሠ).
a, የሙከራ ንድፍ ንድፍ. ከኤችአይፒኤስ ሴሎች የተገኘ hCO ወደ ኤስ 1 አዲስ የተወለዱ ራቁት አይጦች በ30-60 ቀናት ልዩነት ተተክሏል። b, T2-weighted coronal እና አግድም MRI ምስሎች t-hCO በ S1 ውስጥ የሚያሳዩ 2 ወራት ከተተከሉ በኋላ። የመጠን ባር, 2 ሚሜ. ሐ፣ ለእያንዳንዱ የሂፒኤስ ሴል መስመር የሚታየው የኢንግራፍመንት ስኬት ተመኖች መጠን (n = 108፣ በአሞሌ ውስጥ ያሉት ቁጥሮች የ t-hCO መጠን በ hIPS ሴል መስመር ያመለክታሉ) እና ኮርቲካል ወይም ንዑስ ኮርቲካል ቦታ (n = 88)። d, MRI ምስል የልብ ወሳጅ ቧንቧ (በግራ; ሚዛን ባር, 3 ሚሜ) እና ተዛማጅ 3D volumetric ተሃድሶ (ሚዛን ባር, 3 ሚሜ) የ t-hCO በ 3 ወራት ውስጥ መጨመርን ያሳያል. ሠ፣ በአይጥ ሴሬብራል ኮርቴክስ ውስጥ የ t-hCO ቅጦች ግምገማ። የመጠን ባር, 1 ሚሜ. ረ, ከላይ ከግራ ወደ ቀኝ የሚታዩ የ t-hCO ተወካይ የበሽታ መከላከያ ኬሚካላዊ ምስሎች (በልዩነት ጊዜ): PPP1R17 (4 ወር), NeuN (የ 8 ወር), SOX9 እና GFAP (የ 8 ወር), PDGFRα; (8 ወራት)፣ MAP2 (8 ወራት) እና IBA1 (8 ወራት)። የመጠን አሞሌ፣ 20µm የኤች ኤን ኤ በጋራ መግለጽ የሰው ልጅ መገኛ ሴሎችን ያመለክታል. g, snRNA-seq: የተዋሃደ ማኒፎልድ እና ትንበያ (UMAP) የሁሉም ከፍተኛ ጥራት ያላቸው t-hCO ኒውክሊየሮች ከሴውራት ውህደት በኋላ (n=3 t-hCO ናሙናዎች፣ n=2 hiPS ሕዋስ መስመሮች) አስትሮይቶች, የአስትሮሳይት መስመር ሴሎች; ሳይክ ፕሮግ, የደም ዝውውር ቅድመ አያቶች; ግሉኤን ዲኤል, ጥልቅ የ glutamatergic የነርቭ ሴሎች; ግሉኤን ዲኤል/ኤስፒ፣ ጥልቅ እና ንዑስ-ነቀርሳ ግሉታማተርጂክ የነርቭ ሴሎች; ግሉኤን UL, የላይኛው ሽፋን ግሉታማተርጂክ የነርቭ ሴሎች; oligodendrocytes, oligodendrocytes; OPC, oligodendrocyte ቅድመ ሕዋሳት; RELN፣ ሪሊን የነርቭ ሴሎች። h, የጂን ኦንቶሎጂ (GO) የጂኖች ማበልጸጊያ ትንተና በከፍተኛ ደረጃ ተስተካክሏል (የተስተካከለ P <0.05, fold change> 2, ቢያንስ በ 10% ኒውክሊየስ ውስጥ ይገለጻል) በ t-hCO glutamatergic neurons ከ hCO glutamatergic neurons ጋር ሲነጻጸር. h, የጂን ኦንቶሎጂ (GO) የጂኖች ማበልጸጊያ ትንተና በከፍተኛ ደረጃ ተስተካክሏል (የተስተካከለ P <0.05, fold change> 2, ቢያንስ በ 10% ኒውክሊየስ ውስጥ ይገለጻል) በ t-hCO glutamatergic neurons ከ hCO glutamatergic neurons ጋር ሲነጻጸር. h, Анализ обогащения терминов ጂን ኦንቶሎጂ (GO) для генов со значительной 2, ኤክሲፕረሲያ ፖ ክራይን መረ 10% ያደር) ቭሉታምቴርጂስ ኒይሮናህ t-hCO po sravnenychuu s ጉሉታሚን hCO h, የጂን ኦንቶሎጂ (GO) የቃል ማበልጸጊያ ትንተና ለጂኖች ጉልህ በሆነ አግብር (የተስተካከለ P<0.05, fold change>2, ቢያንስ በ 10% ኒውክሊየስ ውስጥ መግለጫ) በ t-hCO glutamatergic neurons ውስጥ ከ hCO glutamatergic neurons ጋር ሲነጻጸር. h, 与hCO 谷氨酸能神经元相比，t-hCO 谷氨酸能神经元中基因显着上调尃匕（调整同同同。 2,在至少10% 的给胞核中表达）的基因本体论(GO) 术语富集分析。 h 与 hco 谷氨酸 能 元 相比 ， t-hco 谷氨酸 能 神经 元 基因 显着 上调 （后 5变化> 2 ፣ 至少 10% 的 核中表达）术语富集分析。 ሸ፣ገንይ ዝናቺቴልኖ አክቲቪዚሮቫሊስ (ስኮርሬክቲሮቫንይ ፒ <0,05፣ ክራትነስት ይዝመንያ> 2፣ ኤክስፐርሰንት 1%) ядер) в глутаматергических нейронах t-hCO по сравнению обогащения. h, በ t-hCO glutamatergic neurons ውስጥ ጂኖች በከፍተኛ ሁኔታ ተስተካክለዋል (የተስተካከለ P <0.05, የታጠፈ ለውጥ> 2, ቢያንስ በ 10% ኒውክሊየስ ውስጥ ይገለጻል) ከ hCO glutamatergic neurons ኦንቶሎጂካል (GO) የማበልጸጊያ ቃል ትንተና ጋር ሲነጻጸር.ነጥብ ያለው መስመር የ 0.05 aq እሴትን ያሳያል። i፣ በ t-hCO ውስጥ ያሉ የ UMAP የግሉኤን ሴል ዓይነቶች ከማጣቀሻ 22 snRNA-seq የጎልማሳ የሞተር ኮርቴክስ ዳታሴስ መለያ ማስተላለፍን በመጠቀም። ሲቲ - ኮርቲኮታላሚክ ሴሎች, ET - ኤክስትራሴሬብራል ሴሎች, IT - የውስጥ ቴሌንሴፋሊክ ሴሎች, ኤንፒ - ትንበያ አቅራቢያ.
ከዚያም የ t-hCO የሳይቶአርክቴክቸር እና አጠቃላይ ሴሉላር ስብጥርን ገምግመናል። የአይጥ endothelial ሕዋሳት አንቲቦዲ ቀለም ከ t-hCO ጋር የደም ቧንቧ መፈጠርን ያሳያል ፣ IBA1 ማቅለም በአጠቃላይ የአይጥ ማይክሮግሊያ (ምስል 1f እና የተስፋፋ መረጃ ፣ ምስል 3c,d) መኖሩን ያሳያል ። Immunostaining የሰው ኑክሌር አንቲጂን (HNA) አወንታዊ ሴሎች PPP1R17 (cortical progenitors), NeuN (neurons), SOX9 እና GFAP (glial-derived cells) ወይም PDGFRα (oligodendrocyte progenitors) (ምስል 1f) በጋራ በመግለጽ ገልጿል። የ t-hCO ሴሉላር ስብጥርን በነጠላ ሴል ጥራት ለማጥናት በግምት ከ8 ወራት ልዩነት በኋላ ነጠላ-ኮር አር ኤን ኤ ሴኬቲንግ (snRNA-seq) አከናውነናል። የጅምላ ማጣሪያ እና የአይጥ ኒውክሊየስ መወገድ 21,500 ከፍተኛ ጥራት ያላቸው የሰው ሞኖኑክሌር ካርታዎች (ምስል 1g እና የተስፋፋ መረጃ, ምስል 4a,b). የዓይነተኛ የሕዋስ ዓይነት ማርከሮች አገላለጽ ቅጦች ጥልቅ እና ላዩን glutamatergic ነርቭ ሴሎች፣ የደም ዝውውር ቅድመ አያቶች፣ oligodendrocytes እና astrocyte የዘር ሐረግን ጨምሮ ዋና ዋና የኮርቲካል ሴል ስብስቦችን ለይተው አውቀዋል (ምስል 1g፣ የተስፋፋ መረጃ፣ ምስል 4c እና ተጨማሪ ሠንጠረዥ 3)። ለ SATB2 እና CTIP2 የበሽታ መከላከያዎች እንደሚያሳየው የኮርቲካል ንዑስ ዓይነቶች ቢኖሩም, t-hCO ግልጽ የሆነ የሰውነት አቀማመጥ (የተስፋፋ መረጃ, ምስል 3 ሀ) አላሳየም. ደረጃ-ተዛማጅ snRNA-seq hCO በሰፊው ተመሳሳይ የሕዋስ ክፍሎችን አምርቷል ፣ከጥቂቶች በስተቀር ፣ oligodendrocytes አለመኖር እና የ GABAergic ነርቭ ሴሎች መኖራቸውን ጨምሮ ፣ይህም ቀደም ሲል ሪፖርት የተደረገውን በጎን ቅድመ ህዋሳት ውስጥ ምቹ ሁኔታዎችን ሊያንፀባርቅ ይችላል (የተስፋፋ መረጃ ፣ ምስል 4f - i እና ተጨማሪ ሰንጠረዥ 4) ዲፈረንሻል የጂን አገላለጽ ትንተና በ t-hCO እና hCO (ተጨማሪ ሠንጠረዥ 5) መካከል በ glutamatergic neurons ውስጥ ከፍተኛ ልዩነቶችን አሳይቷል፣ እንደ ሲናፕቲክ ምልክት ማድረጊያ ፣ የዴንድሪቲክ አከባቢ እና የቮልቴጅ-የተሰራ ሰርጥ እንቅስቃሴ (ምስል 1h እና ተጨማሪ ሠንጠረዥ 5) ከኒውሮናል ብስለት ጋር የተያያዙ የጂኖች ስብስቦችን ማግበርን ጨምሮ። ሠንጠረዥ 6) በዚህ መሠረት ኮርቲካል ግሉታማተርጂክ ቲ-hCO የነርቭ ሴሎች የተፋጠነ የጽሑፍ ብስለት አሳይተዋል።
እነዚህ በ t-hCO ውስጥ ያሉ የጽሑፍ ግልባጭ ለውጦች በ hCO in vitro እና t-hCO በ Vivo መካከል ካለው የስነ-ሕዋስ ልዩነት ጋር የተዛመዱ መሆናቸውን ለማብራራት ከ7-8 ወራት ልዩነት በኋላ በደረጃ-ተዛማጅ ባዮሳይቲን የተሞላ hCO እና hCO በከባድ ክፍሎች ውስጥ እንደገና ገንብተናል። hCO የነርቭ ሴሎች (ምስል 2 ሀ). t-hCO ነርቮች በጣም ትልቅ ነበሩ, ከሶማ ዲያሜትር 1.5 እጥፍ, ብዙ dendrites ነበራቸው, እና በአጠቃላይ ስድስት እጥፍ በቫይትሮ hCO (ምስል 2b) ውስጥ በጠቅላላው የዴንዶቲክ ርዝመት ስድስት እጥፍ ይጨምራል. በተጨማሪም, በ t-hCO ነርቭ ሴሎች ውስጥ ከ hCO ነርቭ ሴሎች (ምስል 2 ሐ) በጣም ከፍ ያለ የዴንዶቲክ እሾህ መጠን ተመልክተናል. ይህ የሚያመለክተው t-hCO የነርቭ ሴሎች ሰፊ የዴንዶሪቲክ ማራዘሚያ እና ቅርንጫፎችን ይከተላሉ, ይህም ከቀጣይ የሴል ስርጭት ጋር በማጣመር, ከተቀየረ በኋላ ለ t-hCO ከፍተኛ እድገት አስተዋጽኦ ሊያደርግ ይችላል (ምስል 1d እና Extended Data Fig. 1f). ይህ ኤሌክትሮፊዚዮሎጂያዊ ባህሪያትን እንድንመረምር አነሳሳን. Membrane capacitance ስምንት እጥፍ ከፍ ያለ ነው (የተስፋፋ መረጃ፣ ምስል 8d)፣ የማረፊያ-ግዛት ሽፋን አቅም የበለጠ ሃይፐርፖላራይዝድ (በግምት 20 mV) ነበር፣ እና አሁን ያለው መርፌ በ t-hCO ነርቭ ሴሎች ውስጥ ከ hCO ነርቭ ሴሎች የበለጠ ከፍተኛ የመነቃቃት ፍጥነት አስከትሏል። በብልቃጥ ውስጥ (ምስል 2d), ሠ), ይህም ከትልቅ እና የበለጠ ውስብስብ የ t-hCO morphological ባህሪያት ጋር የሚስማማ ነው. በተጨማሪም, በ t-hCO የነርቭ ሴሎች (ምስል 2f) ላይ የድንገተኛ የድንገተኛ ጊዜ አነቃቂ ፖስትሲናፕቲክ ወቅታዊ ክስተቶች (EPSC) በጣም ከፍ ያለ ነበር, ይህም በ t-hCO የነርቭ ሴሎች ውስጥ የተስተዋሉ የዴንዶቲክ አከርካሪዎች መጨመር ከተግባራዊ ተነሳሽነት ጋር የተያያዘ ነው. ወሲባዊ ሲናፕስ. በብልቃጥ ውስጥ የ hCO የነርቭ ሴሎችን ያልበሰለ ባህሪ አረጋግጠናል የተሰየሙ ግሉታማተርጂክ ነርቮች (የተስፋፋ መረጃ፣ ምስል 6a-c) በመመዝገብ።
a, 3D በባዮሳይቲን የተሞሉ hCO እና t-hCO የነርቭ ሴሎችን ከ 8 ወራት ልዩነት በኋላ እንደገና መገንባት. ለ, የስነ-ቁሳዊ ባህሪያት መጠን (n = 8 hCO የነርቭ ሴሎች, n = 6 t-hCO የነርቭ ሴሎች; ** P = 0.0084, * P = 0.0179 እና *** P <0.0001). ለ, የስነ-ቁሳዊ ባህሪያት መጠን (n = 8 hCO የነርቭ ሴሎች, n = 6 t-hCO የነርቭ ሴሎች; ** P = 0.0084, * P = 0.0179 እና *** P <0.0001). б, количественная оценка морфологических признаков (n = 8 нейронов hCO, n = 6 нейронов t-hCO; ** P = 0,0080 , * 0 P = 0,0084, * 0 ፒ. ለ, የሞርሞሎጂ ባህሪያት መጠን (n=8 hCO ነርቮች, n=6 t-hCO የነርቭ ሴሎች; ** P=0.0084, * P=0.0179, እና *** P<0.0001). b，形态学特征的量化（n = 8 个hCO 神经元，n = 6 个t-hCO 神经元；**P = 0.0084፣*P = 0.0179 展开 b，形态学特征的量化（n = 8 个hCO 神经元，n = 6 个t-hCO 神经元；**P = 0.0084፣*P = 0.0179 展开 б, количественная оценка морфологических признаков (n = 8 нейронов hCO, n = 6 нейронов t-hCO; ** P = 0,0080 , * 0 P = 0,0084, * 0 ፒ. ለ, የሞርሞሎጂ ባህሪያት መጠን (n=8 hCO ነርቮች, n=6 t-hCO የነርቭ ሴሎች; ** P=0.0084, * P=0.0179, እና *** P<0.0001).ሐ, ከ 8 ወራት ልዩነት በኋላ የ hCO እና t-hCO dendritic ቅርንጫፎች 3D እንደገና መገንባት. ቀይ ኮከቦች የተለጠፈ የዴንድሪቲክ አከርካሪዎችን ያመለክታሉ. የዴንድሪቲክ የአከርካሪ እፍጋት መጠን (n = 8 hCO የነርቭ ሴሎች, n = 6 t-hCO የነርቭ ሴሎች; ** P = 0.0092). መ, የማረፊያ ሽፋን እምቅ መጠን (n = 25 hCO የነርቭ ሴሎች, n = 16 t-hCO የነርቭ ሴሎች; *** P <0.0001). መ, የማረፊያ ሽፋን እምቅ መጠን (n = 25 hCO የነርቭ ሴሎች, n = 16 t-hCO የነርቭ ሴሎች; *** P <0.0001). d, количественная оценка мембраного потенциала покоя (n = 25 ኔይሮኖቭ hCO, n = 16 ኔይሮኖቭ t-hCO; *** P <0,0001). መ, የማረፊያ ሽፋን እምቅ መጠን (n = 25 hCO የነርቭ ሴሎች, n = 16 t-hCO የነርቭ ሴሎች; *** P <0.0001). d，静息膜电位的量化（n = 25 hCO 神经元，n = 16 t-hCO 神经元；***P <0.0001） d，静息膜电位的量化（n = 25 hCO 神经元，n = 16 t-hCO 神经元；***P <0.0001） d, количественная оценка мембраного потенциала покоя (n = 25 ኔይሮኖቭ hCO, n = 16 ኔይሮኖቭ t-hCO; *** P <0,0001). መ, የማረፊያ ሽፋን እምቅ መጠን (n = 25 hCO የነርቭ ሴሎች, n = 16 t-hCO የነርቭ ሴሎች; *** P <0.0001). ሠ፣ በ hCO እና t-hCO ውስጥ ተደጋጋሚ እርምጃ እምቅ መተኮስ የወቅቱ መርፌዎችን በመጨመር እና ከፍተኛውን የተኩስ መጠን መጠን (n = 25 hCO ነርቭ ሴሎች ፣ n = 16 t-hCO ነርቭ ሴሎች ፣ *** P <0.0001)። ሠ፣ በ hCO እና t-hCO ውስጥ ተደጋጋሚ እርምጃ እምቅ መተኮስ የወቅቱ መርፌዎችን በመጨመር እና ከፍተኛውን የተኩስ መጠን መጠን (n = 25 hCO ነርቭ ሴሎች ፣ n = 16 t-hCO ነርቭ ሴሎች ፣ *** P <0.0001)። e, повторное возбуждение потенциала действия в hCO и t-hCO скорости возбуждения (n = 25 нейронов hCO, n = 16 нейронов t-hCO; *** P <0,0001). ሠ, በ hCO እና t-hCO ውስጥ ያለው የእርምጃ እምቅ ዳግም መተኮስ በአሁኑ ጊዜ መጨመር እና ከፍተኛው የተኩስ መጠን በመለካት (n = 25 hCO neurons, n = 16 t-hCO ነርቮች; *** P <0.0001). ኢ፣通过加电注入诱导的hCO 和t-hCO神经元，n = 16 个t-hCO 神经元；***P <0.0001）。 的 的 hco 和 t-hco 重复 电位, n = 16 个 t-hco 神经 ； *** p <0.0001） ሠ максимальной скорости возбуждения (n = 25 нейронов hCO, n = 16 нейронов t-hCO; *** P <0,0001). ሠ፣ የ hCO እና t-hCO እርምጃ አቅምን ተደጋጋሚ መተኮስ የወቅቱን አቅርቦት እና ከፍተኛ የተኩስ መጠን በመለካት (n = 25 hCO የነርቭ ሴሎች፣ n = 16 t-hCO ነርቮች፤ *** P <0.0001)። ረ, በ hCO እና t-hCO የነርቭ ሴሎች ውስጥ ድንገተኛ EPSCs (sEPSCs) በ 8 ወራት ልዩነት, እና የሲናፕቲክ ክስተቶች ድግግሞሽ መጠን (n = 25 hCO የነርቭ ሴሎች, n = 17 t-hCO ነርቮች; *** P <0.0001). ረ, ድንገተኛ EPSCs (sEPSCs) በ hCO እና t-hCO ነርቭ ሴሎች ውስጥ በ 8 ወራት ልዩነት, እና የሲናፕቲክ ክስተቶች ድግግሞሽ መጠን (n = 25 hCO የነርቭ ሴሎች, n = 17 t-hCO ነርቮች; *** P <0.0001) . f, спонтаные EPSC (sEPSC) в нейронах hCO и t-hCO ቼሬዝ 8 ደቂቃ собыty (n = 25 нейронов hCO, n = 17 ኔይሮኖቭ t-hCO; *** P <0,0001) . ረ, ድንገተኛ EPSCs (sEPSCs) በ hCO እና t-hCO ነርቭ ሴሎች ውስጥ በ 8 ወራት ልዩነት እና የሲናፕቲክ ክስተት መጠኖች (n = 25 hCO የነርቭ ሴሎች, n = 17 t-hCO የነርቭ ሴሎች; *** P<0.0001). f፣分化8 17 t-hCO 神经元；***P <0.0001） f፣分化8神率的量匼（n = 25 hCO 神率的量匼（n = 25hCO P <0.0001） f, спонтаные EPSC (sEPSC) в нейронах hCO и t-hCO ቼሬዝ 8 ደቂቃ собыtyй (n = 25 нейронов hCO, n = 17 ኔይሮኖቭ t-hCO; *** P <0,0001). ረ, ድንገተኛ EPSCs (sEPSCs) በ hCO እና t-hCO ነርቭ ሴሎች ውስጥ በ 8 ወራት ልዩነት እና የሲናፕቲክ ክስተት መጠኖች መጠን (n = 25 hCO የነርቭ ሴሎች, n = 17 t-hCO ነርቮች; *** P<0.0001).ለ bf፣ hCO እና t-hCO በመስመር 1208-2 ከተመሳሳይ የልዩነት ስብስብ በትይዩ ተወስደዋል። g, የጂን ስብስብ ማበልጸጊያ ትንተና (የአንድ-ጎን ፊሸር ትክክለኛ ሙከራ) የጂኖች በጣም ተሻሽሏል (የተስተካከለ P <0.05, fold change> 2, ቢያንስ በ 10% ኒውክሊየስ ውስጥ የተገለፀው) በ hCO glutamatergic neurons ውስጥ ከ hCO glutamatergic neurons ጋር ሲነፃፀር ከሁለቱም ቀደምት ምላሽ ሰጪዎች (ERG) እና የጂን-ተኮር እንቅስቃሴ (RG) ከ In vivo mouse ጥናት16 እና ሰው-ተኮር LRGs ከ in vitro neurons17 ተለይቷል። g, የጂን ስብስብ ማበልጸጊያ ትንተና (የአንድ-ጎን ፊሸር ትክክለኛ ሙከራ) የጂኖች በጣም ተሻሽሏል (የተስተካከለ P <0.05, fold change> 2, ቢያንስ በ 10% ኒውክሊየስ ውስጥ የተገለፀው) በ hCO glutamatergic neurons ውስጥ ከ hCO glutamatergic neurons ጋር ሲነፃፀር ከሁለቱም ቀደምት ምላሽ ሰጪዎች (ERG) እና የጂን-ተኮር እንቅስቃሴ (RG) ከ In vivo mouse ጥናት16 እና ሰው-ተኮር LRGs ከ in vitro neurons17 ተለይቷል። ሰ P <0,05, kratnost izmenyya > 2, эkspressyya ፖ ሜንሽን ሜር 10% ያደር) глутаматергическими нейронами hCO наborы генов как RANNEGO (ERG), так и позднего (LRG) генов, зависящит, идентифицированных в исследовании на мыshах in vivo16, እና специфических для человека LRG из нейронов in vivo17. ሰ፣ የጂን ስብስብ ማበልፀጊያ ትንተና (አንድ-ጭራ ፊሸር ትክክለኛ ሙከራ) ጉልህ አግብር (የተስተካከለ P<0.05፣ fold change>2፣ በ t-hCO glutamatergic neurons) በ t-hCO glutamatergic neurons ከ hCO glutamatergic neurons ጋር ሲነጻጸር በሁለቱም መጀመሪያ (ERG) እና ዘግይቶ-ጥገኛ (ኤአርጂ) ውስጥ በጂን 6 እንቅስቃሴ ውስጥ ያሉ ጂኖች (የተስተካከለ P<0.05፣ fold change>2) ሰው-ተኮር LRGs ከነርቭ ሴሎች በ vitro17። g，t-hCO谷氨酸能神经元与hCO谷氨酸能神经元相比，t -hCO谷氨酸能神经元显着上调（调整后P<0.05，倍数变化>2,在至少10%的细胞核中表达）的基因集富集分析（单侧F isher精确检验）从体内小鼠研究中鉴定的早期反应(ERG)和晚期反应(LRG) 活性依赖性基因的基因组16 和体外神经元17 中的人类特异性LRG g ፣ t-hco 谷氨酸 神经 元 与 hco , 倍数> 2 , 至少 至少 10%研究 中 的 早期 反应 反应 反应 和 晚期 反应 反应 (lrg)神经元 17 中 中 中 17 中 17的人类特异性LRG。 g, глутаматергические нейроны t-hCO были значительно ( скорректированный P<0,05, кратность изменения> 2, не менее 10% Фишера) раннего ответа (ERG) ማይሻ በ vivo16 እና ኔይሮናህ in vitro17። g, t-hCO glutamatergic ነርቮች ከ hCO glutamatergic neurons (የተስተካከለ P<0.05, fold change>2, ቢያንስ 10% ቀደም ምላሽ (ERG) እና ዘግይቶ ምላሽ የጂን ማበልጸጊያ ትንተና (አንድ-ጭራ ፊሸር ትክክለኛ ፈተና) ምላሽ እንቅስቃሴ ጥገኛ ጂኖች (LRGs) በ vitron 6 ውስጥ ተለይቶ የሚታወቀው በቪኦኤን 1 ውስጥ ተለይቶ ይታወቃል. LRGsነጥብ ያለው መስመር በBonferroni የተስተካከለ ፒ ዋጋ 0.05 ያሳያል። ሸ፣ የግሉኤን ጂን አገላለጽ (የእያንዳንዱ ጂን የውሸት ጥቅል እና ልኬት) በ snRNA-seq የLRG ጂኖች በ t-hCO glutamatergic neurons ውስጥ በከፍተኛ ሁኔታ ተስተካክሏል። እኔ፣ የበሽታ መከላከያ መድሃኒት በ t-hCO (የላይኛው) እና በ hCO (ዝቅተኛ) የነርቭ ሴሎች ውስጥ የ SCG2 አገላለጽ ያሳያል። ነጭ ቀስቶች ወደ SCG2+ ሕዋሳት ይጠቁማሉ። የመጠን አሞሌ፣ 25µm መረጃ በአማካይ ± መደበኛ መዛባት ተገልጿል.
በ ex vivo ቁርጥራጭ ላይ በሚታየው የ t-hCO የጨመረ እንቅስቃሴ ላይ በመመስረት፣ snRNA-seq በ t-hCO ውስጥ ከ hCO በብልቃጥ ጋር ሲነፃፀር በእንቅስቃሴ ላይ የተመሰረተ የጂን ግልባጭ ለውጥ አሳይቷል። Glutamatergic t-hCO ነርቮች ዘግይቶ ምላሽ እንቅስቃሴን የሚቆጣጠሩ ከፍተኛ የጂኖች ደረጃዎችን ገልጸዋል (ምስል 2g, h), ቀደም ሲል በመዳፊት እና በሰው ነርቭ ነርቭ 16,17 ውስጥ በተደረጉ ጥናቶች ውስጥ ተገኝተዋል. ለምሳሌ, BDNF18, SCG2 እና OSTN, ዋና-ተኮር እንቅስቃሴን የሚቆጣጠር ዘረ-መል (ጅን) ከ hCO ነርቮች (ምስል 2g-i) ጋር ሲነፃፀር በ t-hCO ነርቭ ሴሎች ውስጥ መጨመርን አሳይቷል. ስለዚህም t-hCO ነርቮች ከ hCO ነርቮች ጋር ሲነፃፀሩ የተሻሻሉ የብስለት ባህሪያትን በጽሁፍ ግልባጭ፣ morphological እና በተግባራዊ ትንተና አሳይተዋል።
የ t-hCO ብስለትን ከሰው አንጎል እድገት ጋር ያለውን ግንኙነት የበለጠ ለመገምገም የፅንስ እና የጎልማሳ ኮርቲካል ሴል ዓይነቶች19,20 እና ጎልማሳ 21,22 እንዲሁም በእድገት ወቅት በኮርቲካል ጂን ኤክስፕረስ 23 ላይ ሰፊ መረጃን (የተስፋፋ መረጃ, ምስል 5) ንፅፅር አደረግን. ). ከቀድሞው ሥራ 24 ጋር, በ 7-8 ወራት ልዩነት ውስጥ ያለው ዓለም አቀፋዊ hCO እና t-hCO ትራንስክሪፕት ብስለት ሁኔታ በ Vivo የእድገት ጊዜ ውስጥ በሰፊው የሚስማማ እና በጣም ዘግይቶ የፅንስ ህይወት ጋር እኩል ነው (የተራዘመ መረጃ ምስል 5 ሀ). በተለይም በ t-hCO ውስጥ ከዕድሜ ጋር ከተመሳሰለ hCO ጋር ሲነፃፀር የጨመረው የትራንስክሪፕት ብስለት ተመልክተናል, እንዲሁም ከ synaptogenesis, astrogenesis እና myelination (የተስፋፋ መረጃ, ምስል 5b-d) ጋር የተገናኘ የትራንስክሪፕት ማግበር. በሴሉላር ደረጃ፣ በ t-hCO ውስጥ የቀጭን ኮርቴክስ ንዑስ ዓይነት፣ የ glutamatergic neurons ስብስቦች ከአዋቂዎች L2/3፣ L5 እና L6 የነርቭ ንዑስ ዓይነቶች ጋር ተደራራቢ ማስረጃ አግኝተናል (ምስል 1i)። በአንጻሩ፣ በክላስተር መደራረብ በglutamatergic t-hCO የነርቭ ሴሎች እና በፅንስ ኮርቲካል ነርቮች መካከል በእርግዝና አጋማሽ ላይ የበለጠ የተገደበ ነበር (የተስፋፋ መረጃ፣ ምስል 5e-j)። t-hCO ነርቮች በሰው ልጅ ድህረ ወሊድ ኒዮኮርቲካል ነርቮች ጋር ተመሳሳይ መሆናቸውን ለማወቅ የኤሌክትሮፊዚዮሎጂ ቀረጻዎችን እና የሰው ልጅ L2/3 ፒራሚዳል ነርቮች በሰውነት የድህረ ወሊድ ኮርቴክስ ሹል ክፍሎች (የተስፋፋ መረጃ፣ ምስል 7 ሀ) አድርገናል። የ L2/3 ፒራሚዳል ነርቮች ኤሌክትሮፊዚዮሎጂያዊ ባህሪያት ከ t-hCO ፒራሚዳል ነርቮች (የተስፋፋ መረጃ, ምስል 7e) ጋር ተመሳሳይ ናቸው. በሞርፎሎጂያዊ ሁኔታ, ከድህረ-ወሊድ የሰው ናሙናዎች የ L2 / 3 ነርቮች ከ hCO የበለጠ ከ t-hCO ጋር ተመሳሳይ ናቸው, ምንም እንኳን L2 / 3 ሴሎች ረዘም ያለ, በአጠቃላይ ብዙ ቅርንጫፎችን ይይዛሉ እና ከፍተኛ የአከርካሪ እፍጋት (ምስል 3g እና የተስፋፋ መረጃ, ምስል 7b-). ሰ)
ሀ፣ በመቆጣጠሪያ የሚመረተውን hCO እና TS hiPS ሕዋስ መስመሮችን ወደ አራስ አይጦች መቀየር። ለ, ከ 8 ወራት ልዩነት በኋላ ባዮሳይቲን የተሞሉ t-hCO የነርቭ ሴሎችን 3D እንደገና መገንባት. ሐ, አማካይ የዴንዶቲክ ርዝመት መጠን (n = 19 ቁጥጥር የነርቭ ሴሎች, n = 21 TS የነርቭ ሴሎች; ** P = 0.0041). d, 3D-እንደገና የተገነቡ የዴንዶቲክ ቅርንጫፎች ከቁጥጥር እና TS t-hCO በ 8 ወራት ልዩነት, እና የዴንዶቲክ አከርካሪ እፍጋት (n = 16 control neurons, n = 21 TS neurons, *** P <0.0001). d, 3D-እንደገና የተገነቡ የዴንዶቲክ ቅርንጫፎች ከቁጥጥር እና TS t-hCO በ 8 ወራት ልዩነት, እና የዴንዶቲክ አከርካሪ እፍጋት (n = 16 control neurons, n = 21 TS neurons, *** P <0.0001). d, 3D-реконструкция дендритныh ветвей из контроля и TS t-hCO ቼሬዝ 8 ደቂቃ ዲሲፕሊን плотности дендритных шипов (n = 16 контрольных нейронов, n = 21 TS нейронов, *** P <0,0001). d, 3D የዴንደሪቲክ ቅርንጫፎችን ከቁጥጥር እና t-hCO TS በ 8 ወራት ልዩነት እና የዴንዶሪቲክ የአከርካሪ እፍጋት መጠን (n=16 ቁጥጥር የነርቭ ሴሎች, n = 21 TS neurons, *** P<0.0001) እንደገና መገንባት. መ ፣ 分化8 个月时对照和TS t-hCO 的3D 21 个TS 神经元፣***P <0.0001） መ ፣ 分化 8 个 时 对照 和 ts t-hco 的 3d元 ፣ n = 21 个 ረጥ 神经 ፣ *** p <0.0001 ） d, 3D-реконструкция дендритных ветвей контроля и TS t-hCO ቼሬዝ 8 ሚስጥሮች ዲሲፕሊን плотности дендритных шипов (n = 16 контрольных нейронов, n = 21 TS нейронов, *** P <0,0001). መ, የ 3D የቁጥጥር የዴንድሪቲክ ቅርንጫፎችን እና TS t-hCO በ 8 ወራት ልዩነት እና የዴንዶሪቲክ የአከርካሪ እፍጋት መጠን (n=16 control neurons, n=21 TS neurons, *** P<0.0001) እንደገና መገንባት.ቀይ ኮከቦች የተለጠፈ የዴንድሪቲክ አከርካሪዎችን ያመለክታሉ. ሠ, ድንገተኛ EPSCs ቁጥጥር እና TS t-hCO የነርቭ ሴሎች ከ 8 ወራት ልዩነት በኋላ. ረ፣ ድምር ድግግሞሽ ሴራ እና የድግግሞሽ ብዛት እና የሲናፕቲክ ክስተቶች መጠን (n=32 ቁጥጥር የነርቭ ሴሎች፣ n=26 TS የነርቭ ሴሎች፣ ** P=0.0076 እና P=0.8102)። g, Scholl የቲኤስ ትንተና እና በ hCO እና t-hCO ውስጥ የነርቭ ሴሎችን መቆጣጠር. የተሰረዙ መስመሮች የሰው ልጅ L2/3 የድህረ ወሊድ ፒራሚዳል ነርቮች ንፅፅር ያሳያሉ (n = 24 ቁጥጥር t-hCO ነርቭ, n = 21 TS t-hCO ነርቮች, n = 8 ቁጥጥር hCO ነርቮች, እና n = 7 TS hCO ነርቮች). መረጃው እንደ አማካኝ ± መደበኛ መዛባት ተገልጿል
የ t-hCO የሰው ኮርቴክስ ነርቭ ሴሎችን ሞርሞሎጂያዊ እና ተግባራዊ ባህሪያትን በከፍተኛ ደረጃ ለመድገም ያለው ችሎታ t-hCO የበሽታ ፌኖታይፕስ ለመለየት ጥቅም ላይ መዋል አለመቻሉን እንድንመረምር አነሳሳን። በ TS ላይ ትኩረት አድርገን ነበር፣ በነርቭ ሴሎች ውስጥ በእንቅስቃሴ ላይ የተመሰረተ የጂን ግልባጭ በጀመረው CaV1.2 ጂን ውስጥ በሚውቴሽን ትርፍ-of-function ሚውቴሽን ምክንያት የሚመጣ ከባድ የነርቭ ልማት ችግር። በጣም የተለመደው ምትክ (p.G406R) እና ሶስት መቆጣጠሪያዎችን (ምስል 3 ሀ) ከተሸከሙት ከሶስት TS ታካሚዎች hCO አግኝተናል. ከተቀየረ በኋላ, የዴንደሪቲክ ሞርፎሎጂ በቲኤስ ነርቮች ውስጥ ከቁጥጥር ጋር ሲነፃፀር (ምስል 3 ለ እና የተስፋፋ መረጃ, ምስል 8a,b) ተቀይሯል, የመጀመሪያ ደረጃ የዴንዶራይትስ ቁጥር ሁለት እጥፍ በመጨመር እና በአጠቃላይ የዴንድሪቲክ ርዝማኔ አማካይ እና አጠቃላይ ቅነሳ (ምስል 3c እና የተራዘመ መረጃ, ምስል 8c). ይህ ከነርቭ ሴሎች ቁጥጥር ጋር ሲነፃፀር የአከርካሪ አጥንት መጨመር እና በቲኤስ ውስጥ ድንገተኛ የኢ.ፒ.ኤስ.ሲ. ተጨማሪ ትንታኔ በ t-hCO TS ውስጥ ከመቆጣጠሪያዎች ጋር ሲነፃፀር ያልተለመደ የዴንዶቲክ ቅርንጫፎች ንድፎችን አሳይቷል, ነገር ግን በብልቃጥ ውስጥ አይደለም TS hCO በተመሳሳይ የመለየት ደረጃ (ምስል 3 ግ). ይህ በቲኤስ ውስጥ በእንቅስቃሴ ላይ የተመሰረተ የዴንድሪቲክ shrinkage ከቀደምት ሪፖርቶቻችን ጋር የሚጣጣም እና የዚህ ንቅለ ተከላ መድረክ በ Vivo ውስጥ ያሉ የበሽታ phenotypes የመለየት ችሎታን ያጎላል።
ከዚያ የ t-hCO ህዋሶች ወደ አይጥ S1 ምን ያህል እንደሚዋሃዱ ጠየቅን። S1 በ rodents ውስጥ ጠንካራ የሲናፕቲክ ግብዓቶችን ከአይፕሲላተራል ventral basal እና ከኋላ thalamic ኒውክላይ, እንዲሁም የኢፒሲላታል ሞተር እና ሁለተኛ ደረጃ somatosensory cortices እና contralateral S1 (ምስል 4a) ይቀበላል. የኢነርቬሽን ጥለትን ለመመለስ hCO በእብድ ቫይረስ-dG-GFP/AAV-G በመበከል ከ3 ቀናት በኋላ hCO ወደ S1 ራት ተክለናል። በ ipsilateral S1 እና ventral basal ganglia የነርቭ ሴሎች ውስጥ ጥቅጥቅ ያለ የጂኤፍፒ አገላለጽ አስተውለናል (ምስል 4b, c) ከተተከለ ከ7-14 ቀናት ውስጥ። በተጨማሪም፣ የthalamic ማርከር netrin G1 ፀረ እንግዳ አካላት በt-hCO ውስጥ የthalamic endings መኖራቸውን አሳይቷል (ምስል 4d, e)። እነዚህ የእይታ ትንበያዎች በቲ-hCO ሴሎች ውስጥ የሲናፕቲክ ምላሾችን ሊያስከትሉ እንደሚችሉ ለመገምገም፣ ሙሉ የሕዋስ ቅጂዎችን ከሰው ሕዋሶች በታላሞኮርቲካል ሽፋን ሹል ክፍሎች ውስጥ አድርገናል። የአይጥ S1 የኤሌክትሪክ ማነቃቂያ ፣ የውስጥ ካፕሱል ፣ ነጭ ቁስ ፣ በ ​​t-hCO አቅራቢያ ያሉ ፋይበርዎች ወይም ኦፕሲን-ኤግዚቢሽን thalamic endings በ t-hCO ውስጥ በአጭር ጊዜ መዘግየት EPSCs ውስጥ ለ AMPA ተቀባይ ተቀባይ ተቃዋሚ NBQX በተጋለጡ የኦፕሲን-ኤግዚቢሽን አግብር። (ምስል 4f, g እና የተራዘመ መረጃ, ምስል 9a-g). እነዚህ መረጃዎች እንደሚያሳዩት t-hCO በአይጦች አንጎል ውስጥ በአናቶሚ የተዋሃደ እና በአይጦች አስተናጋጅ ቲሹ ሊነቃ ይችላል።
ሀ፣ የእብድ ውሻ መከታተያ ሙከራ መርሐግብር። b, GFP እና ሰው-ተኮር STEM121 አገላለጽ በ t-hCO እና በአይጥ ሴሬብራል ኮርቴክስ (የላይኛው ፓነል) መካከል። በተጨማሪም የጂኤፍፒ አገላለጽ በአይጥ ipsilateral ventral basal nucleus (VB) (ከታች ግራ) እና ipsilateral S1 (ከታች በስተቀኝ) ውስጥ ይታያል። የመጠን አሞሌ፣ 50µm ቀይ ካሬዎች ምስሎቹ የተነሱበትን የአንጎል አካባቢዎችን ያመለክታሉ. ሐ፣ ጂኤፍፒን የሚገልጹ ሕዋሳት መጠን (n = 4 ራት)። d, e - Netrin G1+ thalamic ተርሚናሎች በ t-hCO ውስጥ። d t-hCO እና VB ኒውክላይዎችን የያዘ የክሮናል ክፍል ያሳያል። የመጠን ባር, 2 ሚሜ. ሠ Netrin G1 እና STEM121 አገላለጽ በ t-hCO (በግራ) እና በቪቢ (በቀኝ) የነርቭ ሴሎች ያሳያል። የመጠን አሞሌ፣ 50µm ብርቱካንማ ነጥብ ያለው መስመር የ t-hCO ድንበርን ያመለክታል። f, g, በ S1 rat (f) ወይም በውስጣዊ ካፕሱል (g) ውስጥ ከኤሌክትሪክ ማነቃቂያ በኋላ የ t-hCO የነርቭ ሴሎች ወቅታዊ ምልክቶች, ከ (ሐምራዊ) ወይም ያለ (ጥቁር) NBQX (በግራ). የ EPSC ስፋቶች ከ NBQX ጋር እና ያለሱ (n = 6 S1 የነርቭ ሴሎች, * P = 0.0119; እና n = 6 ውስጣዊ የኬፕሱል ነርቮች, ** P = 0.0022) (መሃል). ለአይጥ S1 (ረ) ወይም የውስጥ ካፕሱል (g) (በቀኝ) የኤሌክትሪክ ማነቃቂያ ምላሽ EPSC የሚያሳዩ t-hCO የነርቭ ሴሎች መቶኛ። aCSF፣ ሰው ሰራሽ cerebrospinal ፈሳሽ። ሸ፣ የ2P ኢሜጂንግ ሙከራ ንድፍ (በግራ)። የ GCaMP6s መግለጫ በ t-hCO (መሃል)። የመጠን ባር፣ 100µm የ GCaMP6s የፍሎረሰንት ጊዜ ያለፈበት (በስተቀኝ)። i፣ ዜድ-ውጤት ድንገተኛ የእንቅስቃሴ ፍሎረሰንት። j፣ የጢም ማነቃቂያ ሥዕላዊ መግለጫ። k፣ z-ነጥብ ያስመዘገቡ 2P fluorescence trajectories በአንድ ሙከራ ውስጥ፣ ከዊስክ መዛባት በጊዜ ዜሮ (የተሰበረ መስመር) በምሳሌ ሕዋሳት። l፣ የሕዝብ አማካይ z-ነጥብ ምላሾች የሁሉም ሕዋሳት ከዊስክ መዛባት ጋር በጊዜ ዜሮ (የተሰበረ መስመር) (ቀይ) ወይም በዘፈቀደ የመነጩ የጊዜ ማህተሞች (ግራጫ)። ኤም. በኦፕቲካል ምልክት ማድረጊያ ላይ ያለው የሙከራ ንድፍ ንድፍ። n፣ በሰማያዊ ሌዘር ማነቃቂያ ወይም ዊስክ ማፈንገጥ ወቅት ጥሬ የቮልቴጅ ኩርባዎች ከምሳሌ t-hCO ሕዋስ። ቀይ ቀስቶች በብርሃን (ከላይ) የተከሰቱትን ወይም በዊስክ ማፈንገጥ (ከታች) የተፈጠሩትን የመጀመሪያዎቹን ሹሎች ያመለክታሉ። ግራጫ ጥላ የዊስክ ማፈንገጥ ጊዜዎችን ያሳያል። o፣ የፒክ የብርሃን ሞገዶች እና የዊስክ ማፈንገጥ ምላሾች። p, የአንድ ሙከራ ሹል, በምሳሌው ሕዋሳት ውስጥ ካለው የጢስ ማውጫ መዛባት ጋር የተጣጣመ. 0 የሚያመለክተው የዊስክ መዛባት (የተሰበረ መስመር) ነው። q፣ የህዝብ አማካይ የz-ነጥብ የተኩስ መጠን ለሁሉም የፎቶ ሴንሲቭ ሴሎች፣ በጊዜ ዜሮ (የተሰበረ መስመር) (ቀይ) ወይም በዘፈቀደ የመነጨ የጊዜ ማህተም (ግራጫ) ከዊስክ መዛባት ጋር የተስተካከለ። r፣ የፎቶ ሴንሲቲቭ አሃዶች መጠን በዊስክ ልዩነት (n = 3 ራት) (በግራ) በከፍተኛ ሁኔታ የተቀየረ። ከፍተኛ የዝ-ውጤት መዘግየት (n = 3 አይጦች፣ n = 5 (ቀላል አረንጓዴ)፣ n = 4 (ጥቁር አረንጓዴ) እና n = 4 (ሳይያን) የዊስክ ማፈንገጫ አሃዶች በአንድ አይጥ) (በስተቀኝ)። መረጃ በአማካይ ± መደበኛ መዛባት ተገልጿል
ከዚያም t-hCO በ Vivo ውስጥ በስሜት ህዋሳት ሊነቃ ይችል እንደሆነ ጠየቅን። በጄኔቲክ የተመሰጠሩትን የካልሲየም አመልካቾችን GCaMP6ን ወደ S1 አይጥ በመግለጽ hCO ተክለናል። ከ 150 ቀናት በኋላ, ፋይበር ፎተሜትሪ ወይም ባለ ሁለት-ፎቶ ካልሲየም ኢሜጂንግ (ምስል 4h እና የተስፋፋ መረጃ, ምስል 10 ሀ). የ t-hCO ህዋሶች የተመሳሰለ ምት እንቅስቃሴን (ምስል 4i፣ የተዘረጋ ውሂብ፣ ምስል 10b እና ተጨማሪ ቪዲዮ 1) አሳይተናል። ከፍተኛ የ t-hCO እንቅስቃሴን ለመለየት፣ በደንዘዙ ትራንስፕላንት አይጦች (የተስፋፋ መረጃ፣ ምስል 10c-f) ውስጥ ከሴሉላር ኤሌክትሮፊዚዮሎጂካል ቅጂዎች ጋር አደረግን። ከኤምአርአይ ምስሎች stereotaxic መጋጠሚያዎችን ፈጥረናል; ስለዚህ እነዚህ የተመዘገቡ ክፍሎች የሰውን የነርቭ ሴሎች ይወክላሉ፣ ምንም እንኳን ኤሌክትሮፊዚዮሎጂ ብቻውን የትውልድ ዝርያን ለመወሰን ባይፈቅድም። የተመሳሰሉ የእንቅስቃሴ ፍንዳታዎችን ተመልክተናል (የተስፋፋ መረጃ፣ ምስል 10መ)። ፍንዳታዎቹ ወደ 460 ሚሴ ያህል የቆዩ ሲሆን በ 2 ሰከንድ አካባቢ በፀጥታ ጊዜ ተለያይተዋል (የተስፋፋ መረጃ፣ ምስል 10መ፣ ሠ)። የግለሰብ ክፍሎች በአንድ ፍንዳታ በአማካይ ሦስት ዙር ያቃጥላሉ፣ ይህም በአንድ ፍንዳታ 73% ገደማ ከተመዘገቡት ክፍሎች ነው። የግለሰብ ክፍሎች እንቅስቃሴዎች በጣም የተቆራኙ ናቸው, እና እነዚህ ግንኙነቶች በተመሳሳይ ሁኔታ ውስጥ ከተመዘገቡት ያልተከተቡ እንስሳት ተለይተው ከተቀመጡት ክፍሎች ከፍ ያለ ናቸው (የተስፋፋ መረጃ, ምስል 10f). ተለይተው የሚታወቁት በሰው የተገኙ የነርቭ ህዋሶች የሹል ምላሾችን የበለጠ ለመለየት፣ በ hCO በተተከሉት በ hCO በተተከሉ አይጦች ላይ የብርሃን መለያ ሙከራዎችን አድርገናል ለብርሃን ምላሽ የሚሰጥ የ t-hCO የነርቭ ሴሎች የአጭር ጊዜ መዘግየት እውቅና (ከ10 ms በታች) ለሰማያዊ ብርሃን ምላሽ። t-hCO ነርቮች በካልሲየም ኢሜጂንግ ላይ ከሚታዩት ድግግሞሾች ላይ ድንገተኛ የእንቅስቃሴ ፍንዳታ እና እንዲሁም የብርሃን ምልክት በሌለበት በ t-hCO ውስጥ የተከናወኑ ኤሌክትሮፊዚዮሎጂያዊ ቀረጻዎች (የተስፋፋ መረጃ፣ ምስል 10c-g) አሳይተዋል። በቪትሮ ውስጥ በተመዘገቡት የ hCO ተጓዳኝ ደረጃዎች ውስጥ ምንም ድንገተኛ እንቅስቃሴ አልታየም. t-hCO በስሜት ህዋሳት መነቃቃት ይችል እንደሆነ ለመገምገም፣ የአይጥ ጢሙ ከ t-hCO (ምስል 4j፣m እና የተራዘመ መረጃ፣ ምስል 10h፣k) ራቅ ብለን በአጭሩ ገለጽን። ቀደም ባሉት ጥናቶች8,10 መሠረት, የ t-hCO ህዋሶች ስብስብ ለዊስክ ማዞር ምላሽ በመስጠት እንቅስቃሴን ጨምሯል, ይህም መረጃው ከዘፈቀደ የጊዜ ማህተሞች ጋር ሲወዳደር አልታየም (ምስል 4k-q እና የተስፋፋ መረጃ, ምስል 10h-q). በእርግጥ 54% የሚሆኑት በኦፕቶ ምልክት የተደረገባቸው ነጠላ ክፍሎች ከዊስክ ማነቃቂያ በኋላ በከፍተኛ ሁኔታ የመነቃቃት መጠን አሳይተዋል ፣ ይህም ወደ 650 ms (ምስል 4r) ደርሷል። እነዚህ መረጃዎች ሲደመር t-hCO ተገቢ የተግባር ግብአቶችን እንደሚቀበል እና በአካባቢ ማነቃቂያዎች ሊነቃ ይችላል።
ከዚያም t-hCO ባህሪን ለመቆጣጠር በአይጦች ውስጥ ወረዳዎችን ማግበር ይችል እንደሆነ መርምረናል። በመጀመሪያ የ t-hCO ነርቭ ሴሎች ወደ አይጥ አካባቢ ቲሹዎች ይገቡ እንደሆነ መርምረናል። hCO ከ EYFP (hChR2-EYFP) ጋር በተጣመረ hChR2 ኮድ በተቀመጠ ሌንቲ ቫይረስ ያዝነው። ከ 110 ቀናት በኋላ የ EYFP አገላለጽ በአይፕሲያል ኮርቲካል ክልሎች ማለትም የመስማት ፣ የሞተር እና የ somatosensory cortices ፣ እንዲሁም በንዑስ ኮርቲካል ክልሎች ውስጥ ፣ እስትሪየም ፣ ሂፖካምፐስ እና ታላመስን ጨምሮ (ምስል 5 ሀ) ተመልክተናል። እነዚህ የትንፋሽ ትንበያዎች በአይጦች ሴሎች ውስጥ የሲናፕቲክ ምላሾችን ሊያስከትሉ እንደሚችሉ ለመገምገም፣ የአይጥ ሴሬብራል ኮርቴክስ ሴሎችን በሹል የአንጎል ክፍሎች ውስጥ በመመዝገብ hChR2-EYFPን የሚገልጹ t-hCO ህዋሶችን በኦፕቲካል ገቢር አድርገናል። በNBQX (ምስል 5b-g) የታገዱት በአይጥ ፒራሚዳል ኮርቴክስ ነርቭ ሴሎች ውስጥ የቲ-hCO አክሰኖች ከሰማያዊ ብርሃን ጋር የፈጠሩት የአጭር ጊዜ መዘግየት EPSCs ማግበር። በተጨማሪም, እነዚህ ምላሾች በ tetrodotoxin (TTX) ሊታገዱ እና በ 4-aminopyridine (4-AP) ሊመለሱ ይችላሉ, ይህም በ monosynaptic ግንኙነቶች (ምስል 5e) የተከሰቱ ናቸው.
ሀ፣ የአክሰን መከታተያ ንድፍ (በግራ)። t-hCO EYFP አገላለጽ (በስተቀኝ)። የመጠን ባር፣ 100µm A1፣ auditory cortex፣ ACC፣ anterior cingulate cortex፣ መ. striatum, dorsal striatum, HPC, hippocampus; ዲያፍራም, ላተራል septum, mPFC, medial prefrontal ኮርቴክስ, piri, piriform cortex, v. striatum, ventral striatum, VPM, የ thalamus ventropostomedial ኒውክሊየስ, VTA, ventral tegmental ክልል. ቀይ ካሬዎች ምስሎቹ የተነሱበትን የአንጎል አካባቢዎችን ያመለክታሉ. ለ፣ የማነቃቂያ ሙከራው ስዕላዊ መግለጫ። ሐ፣ መ፣ በሰዎች ውስጥ በሰማያዊ ብርሃን ምክንያት የተፈጠረ የፎቶcurrent (ከላይ) እና የቮልቴጅ (ታች) ምላሽ ምሳሌዎች (ሐ) EYFP+ t-hCO ወይም ራት (መ) EYFP- ሕዋሳት። ሠ, f, የ t-hCO axon በ TTX እና 4-AR (አረንጓዴ) ፣ TTX (ግራጫ) ወይም aCSF (ጥቁር) (ሠ) ከ (ቫዮሌት) ወይም ያለ (ጥቁር) (ጥቁር) (ሠ) ሰማያዊ ብርሃን ማነቃቂያ በኋላ የአይጥ የነርቭ ሴሎች ወቅታዊ ምልክቶች። ሰ, በአይጦች ሴሎች ውስጥ በሰማያዊ ብርሃን የሚቀሰቅሱ ምላሾች መዘግየት (n = 16 ሕዋሳት); አግድም አሞሌዎች አማካይ መዘግየት (7.13 ሚሴ) (በግራ) ያመለክታሉ። በNBQX (n = 7 ሕዋሶች፤ *** P <0.0001) (መካከለኛ) የተመዘገቡ የብርሃን-የተፈጠሩ EPSCዎች ስፋት። በNBQX (n = 7 ሕዋሶች፤ *** P <0.0001) (መካከለኛ) የተመዘገቡ የብርሃን-የተፈጠሩ EPSCዎች ስፋት። Амплитуда выzvannыh светом EPSC, зарегистрированых с или беz NBQX (n = 7 kletok; *** P <0,0001) (в центре). በ NBQX (n = 7 ሕዋሳት; *** P <0.0001) (መሃል) የተመዘገቡ የብርሃን-የተፈጠሩ EPSCዎች ስፋት.使用或不使用NBQX 记录的光诱发EPSC 的振幅（n = 7 个细胞；***P <0.0001）（中）使用或不使用NBQX 记录的光诱发EPSC 的振幅（n = 7 个细胞；***P <0.0001）（中） Амплитуда выzvannыh светом EPSC, зарегистрированых с или беz NBQX (n = 7 kletok; *** P <0,0001) (в центре). በ NBQX (n = 7 ሕዋሳት; *** P <0.0001) (መሃል) የተመዘገቡ የብርሃን-የተፈጠሩ EPSCዎች ስፋት.ለሰማያዊ ብርሃን ምላሽ የሚሰጡ EPSCs የሚያሳዩ የአይጥ ሴሎች መቶኛ። ሸ፣ የባህሪ ተግባር ስዕላዊ መግለጫ። d0፣ ቀን 0. i. በስልጠና ቀን 1 (በግራ) ወይም በ 15 (በቀኝ) የአርአያነት እንስሳት አፈፃፀም። በቀን 1 (በግራ) ወይም በ 15 ቀን (በቀኝ መሃል) የተከናወኑት የሊኮች አማካይ ብዛት (n = 150 ሰማያዊ ብርሃን ሙከራዎች ፣ n = 150 የቀይ ብርሃን ሙከራዎች ፣ *** P <0.0001)። በቀን 1 (በግራ) ወይም በ 15 ቀን (በቀኝ መሃል) የተከናወኑት የሊኮች አማካይ ብዛት (n = 150 ሰማያዊ ብርሃን ሙከራዎች ፣ n = 150 የቀይ ብርሃን ሙከራዎች ፣ *** P <0.0001)። Среднее количество облизываний, выполненных в день 1 (слева) или день 15 (в центре справа) (n = 150 n = 150 испытаний с красным светом; *** P <0,0001). በቀን 1 (በግራ) ወይም በ15ኛው ቀን (በመሃል ቀኝ) የተከናወኑ አማካኝ የሊኮች ብዛት (n = 150 ሰማያዊ ብርሃን ሙከራዎች፣ n = 150 የቀይ ብርሃን ሙከራዎች፤ *** P <0.0001)።第1 天（左）或第15 天（右中）执行的平均舔次数（n = 150 次蓝光试验，n = 150次红光试验；**P <0.0001）。第1 天（左）或第15 天（右中）执行的平均舔次数（n = 150 次蓝光试验，n = 150次红光试验；***P < 0.001 Среднее количество облизываний, выполненных в день 1 (слева) или день 15 (в центре справа) (n = 150 n = 150 испытаний с красным светом; *** P <0,0001). በቀን 1 (በግራ) ወይም በ15ኛው ቀን (በመሃል ቀኝ) የተከናወኑ አማካኝ የሊኮች ብዛት (n = 150 ሰማያዊ ብርሃን ሙከራዎች፣ n = 150 የቀይ ብርሃን ሙከራዎች፤ *** P <0.0001)።በቀን 1 (በመሃል ግራ) ወይም በ15 (በቀኝ) ላይ ለቀይ እና ሰማያዊ ብርሃን ሙከራዎች ድምር ልቅሶች። ኤን.ኤስ, ጉልህ አይደለም. j,k, በ t-hCO የተተከሉ ሁሉም እንስሳት hChR2-EYFP (j) ወይም ቁጥጥር ፍሎሮፎሬ (k) በቀን 1 ወይም 15 (hChR2-EYFP: n = 9 ራት, ** P = 0.0049; ቁጥጥር: n = 9, P = 0.1497) የባህሪ ባህሪያት. l, የምርጫ ውጤት ዝግመተ ለውጥ (n = 9 hChR2, n = 9 ቁጥጥር; ** P <0.001, *** P <0.0001). l, የምርጫ ውጤት ዝግመተ ለውጥ (n = 9 hChR2, n = 9 ቁጥጥር; ** P <0.001, *** P <0.0001). l, Эvolyutsyya pokazatelya predpochtenyya (n = 9 hChR2, n = 9 kontrolnыh; ** P <0,001, *** P <0,0001). l, የምርጫ ውጤት ዝግመተ ለውጥ (n = 9 hChR2, n = 9 መቆጣጠሪያዎች; ** P <0.001, *** P <0.0001). l፣偏好评分的演变（n = 9 hChR2，n = 9 对照；**P <0.001፣***P <0.0001） l፣偏好评分的演变（n = 9 hChR2，n = 9 对照；**P <0.001፣***P <0.0001） l, ኢቮሉሺያ ፖካዛቴሌይ ፕሮጄክቴኒያ (n = 9 hChR2, n = 9 ካንትሮሌይ; ** P <0,001, *** P <0,0001). l, የምርጫ ውጤቶች ዝግመተ ለውጥ (n = 9 hChR2, n = 9 መቆጣጠሪያዎች; ** P <0.001, *** P <0.0001).m, FOS አገላለጽ በ S1 ውስጥ t-hCO optogenetic ማግበር ምላሽ. የ FOS አገላለጽ ምስሎች (በግራ) እና መጠናቸው (n = 3 በቡድን፤ * P <0.05, ** P < 0.01 እና *** P <0.001) (በቀኝ) ይታያሉ. የ FOS አገላለጽ ምስሎች (በግራ) እና መጠናቸው (n = 3 በቡድን፤ * P <0.05, ** P < 0.01 እና *** P <0.001) (በቀኝ) ይታያሉ. ፖካዛንይ ዚዞብራዥንያ ኤክስፕረስሲ ፎስ (ስሌቫ) እና ኮሊቼስተንኖግ ኦፕሬዴሌንያ (n = 3 ና ግሮፕዩ; *** P <0,05, ** P <0,01 , ፒ <0,01 , ፒ <0,01 , ፒ <0,01 . የ FOS አገላለጽ ምስሎች (በግራ) እና መጠናቸው (n = 3 በቡድን; * P<0.05, ** P<0.01, እና *** P<0.001) (በቀኝ) ይታያሉ.显示了FOS 表达（左）和量化（每组n = 3；*P <0.05、**P <0.01 和***P < 0.001））右显示了FOS 表达（左）和量化（每组n = 3；*P <0.05、**P <0.01 和***P < 0.001））右 ፖካዛንይ ዚዞብራዥንያ ኤክስፕረስሲ ፎስ (ስሌቫ) እና ኮሊቼስተንኖግ ኦፕሬዴሌንያ (n = 3 ና ግሮፕዩ; *** P <0,05, ** P <0,01 , ፒ <0,01 , ፒ <0,01 , ፒ <0,01 . የ FOS አገላለጽ ምስሎች (በግራ) እና መጠናቸው (n = 3 በቡድን; * P<0.05, ** P<0.01, እና *** P<0.001) (በቀኝ) ይታያሉ.የመጠን ባር፣ 100µm መረጃው በአማካይ ± መደበኛ የBLA ስህተት፣ ባሶላተራል ቶንሲል፣ ኤምዲቲ፣ dorsomedial thalamic nucleus፣ PAG፣ periaqueductal gray ተብሎ ይገለጻል።
በመጨረሻ፣ t-hCO የአይጥ ባህሪን ማስተካከል ይችል እንደሆነ ጠየቅን። ይህንን ለመፈተሽ hChR2-EYFP-expressing hCOን ወደ S1 ተክለን እና ከ90 ቀናት በኋላ የጨረር ፋይበርን ወደ t-hCO ተተከልን ለብርሃን አቅርቦት። ከዚያም አይጦቹን በተሻሻለ የኦፕሬሽን ኮንዲሽነሪንግ ፓራዲጅ (ምስል 5h) አሠልጥነናል. እንስሳቱን በባህሪ የሙከራ ክፍል ውስጥ አስቀመጥናቸው እና በዘፈቀደ 5 ሰከንድ ሰማያዊ (473 nm) እና ቀይ (635 nm) ሌዘር ማነቃቂያዎችን ተግባራዊ እናደርጋለን። እንስሳት በሰማያዊ ብርሃን ማነቃቂያ ጊዜ ከላሱ ነገር ግን በቀይ ብርሃን ማነቃቂያ ጊዜ ካልላሱ የውሃ ሽልማት አግኝተዋል። በስልጠናው የመጀመሪያ ቀን እንስሳቱ በሰማያዊ ወይም በቀይ ብርሃን ሲነቃቁ በመምጠጥ ላይ ምንም ልዩነት አላሳዩም. ነገር ግን፣ በ15ኛው ቀን፣ በ hCO የተተከሉ እንስሳት hChR2-EYFP ሲገልጹ በሰማያዊ ብርሃን ሲነቃቁ ከቀይ ብርሃን ማነቃቂያ ጋር ሲነፃፀሩ የበለጠ ንቁ የሆነ የመላሳት ታይተዋል። እነዚህ የመልሳት ባህሪ ለውጦች የመቆጣጠሪያው ፍሎሮፎርን በሚገልጹ በ hCO በተተከሉ ተቆጣጣሪ እንስሳት ላይ አልተስተዋሉም (የስኬት መጠን፡ hChR2 89%፣ EYFP 0%፣ ምስል 5i-1 እና ተጨማሪ ቪዲዮ 2)። እነዚህ መረጃዎች እንደሚያሳዩት t-hCO ሕዋሳት ሽልማትን የመፈለግ ባህሪን ለማነቃቃት የአይጥ የነርቭ ሴሎችን ማግበር ይችላሉ። በእነዚህ የባህሪ ለውጦች ውስጥ የትኞቹ የአይጥ t-hCO የነርቭ ምልልሶች ሊሳተፉ እንደሚችሉ ለማወቅ፣ ከ90 ደቂቃዎች በኋላ t-hCO በሰለጠኑ እንስሳት እና በተሰበሰቡ ቲሹዎች ውስጥ በኦፕቶጀኔቲክ እንዲነቃ እናደርጋለን። ኢሚውኖሂስቶኬሚስትሪ በተነሳሽ ባህሪ ውስጥ በተሳተፉ በርካታ የአንጎል ክልሎች ውስጥ በእንቅስቃሴ ላይ የተመሰረተ የFOS ፕሮቲን አገላለጽ፣ መካከለኛው ቅድመ-ፊትራል ኮርቴክስ፣ ሚዲያል ታላመስ እና ፔሪያክዋልድታል ግራጫ ቁስን ጨምሮ፣ ይህም ባልተነቃቁ ቁጥጥር እንስሳት ወይም በእንስሳት ውስጥ ነው። ሩዝ. 5 ሚ. እነዚህ መረጃዎች አንድ ላይ ሆነው፣ t-hCO ባህሪን ለመንዳት የአይጥ የነርቭ እንቅስቃሴን ማስተካከል እንደሚችል ይጠቁማሉ።
የነርቭ ኦርጋኖይድስ የሰው ልጅ እድገትን እና በሽታን በብልቃጥ ውስጥ ለማጥናት ተስፋ ሰጪ ስርዓትን ይወክላል, ነገር ግን በ Vivo ውስጥ ባሉ ወረዳዎች መካከል ያለው ግንኙነት ባለመኖሩ የተገደቡ ናቸው. የሰው ልጅን የሕዋስ እድገት እና ተግባርን Vivo ውስጥ ለማጥናት hCO ወደ ኤስ 1 የበሽታ መቋቋም አቅም የሌላቸው ቀደምት ድህረ ወሊድ አይጦችን የተከልንበት ልብ ወለድ መድረክ አዘጋጅተናል። t-hCO በ vitro28 ውስጥ ያልተስተዋሉ የበሰሉ የሕዋስ ዓይነቶችን እንደሚያዳብር እና t-hCO በአናቶሚ እና በተግባር ከአይጥ አንጎል ጋር የተዋሃደ መሆኑን አሳይተናል። የ t-hCO ከሮደንት ነርቭ ሰርኮች ጋር መቀላቀል በሰው ሴሉላር እንቅስቃሴ እና በተጠና የእንስሳት ባህሪ መካከል ያለውን ግንኙነት ለመመስረት አስችሎናል፣ ይህም ቲ-hCO የነርቭ ሴሎች የባህሪ ምላሾችን ለመንዳት የአይጥ የነርቭ እንቅስቃሴን ማስተካከል እንደሚችሉ ያሳያል።
የገለጽነው መድረክ የሰውን ህዋሶች ወደ አይጥ አእምሮ በመትከል ላይ ከተደረጉት ጥናቶች ብዙ ጥቅሞች አሉት። በመጀመሪያ፣ hCO ወደ ታዳጊ ድህረ ወሊድ አይጦችን ተክተናል፣ ይህም የሰውነት እና ተግባራዊ ውህደትን ሊያመቻች ይችላል። ሁለተኛ፣ t-hCO ኤምአርአይ ክትትል በህይወት እንስሳት ላይ የችግኝትን አቀማመጥ እና እድገት እንድናጠና አስችሎናል፣ ይህም የረዥም ጊዜ የብዙ እንስሳት ጥናቶችን እንድናደርግ እና የበርካታ የሂፒኤስ ሴል መስመሮችን አስተማማኝነት ለመመስረት አስችሎናል። በመጨረሻም፣ ለሰው ልጅ ህዋሶች ብዙም አጥፊ ያልሆኑ እና በአይጦች አንጎል ውስጥ የሰው ኮርቴክስ ነርቭ ሴሎች እንዲዋሃዱ እና እንዲፈጠሩ ከሚያበረታቱ ነጠላ ሴል እገዳዎች ይልቅ ያልተነካ ኦርጋኖይድ ተክለናል።
ምንም እንኳን በዚህ መድረክ ውስጥ መሻሻሎች ቢደረጉም, ጊዜያዊ, የቦታ እና ተሻጋሪ ዝርያዎች ገደቦች የሰው ልጅ የነርቭ ምልልሶች በከፍተኛ ታማኝነት እንዳይፈጠሩ ይከላከላሉ, ምንም እንኳን በመጀመሪያ የእድገት ደረጃ ላይ ከተተከሉ በኋላ እንኳን. ለምሳሌ ፣ በ t-hCO ውስጥ የሚታየው ድንገተኛ እንቅስቃሴ በኮርቲካል ልማት ወቅት ከሚታየው ምት እንቅስቃሴ ጋር ተመሳሳይ የሆነ የእድገት ፌኖታይፕን ይወክላል ወይም በ t-hCO ውስጥ የሚገኙትን የማፈን ሴል ዓይነቶች ባለመኖሩ ግልፅ አይደለም ። በተመሳሳይም በ t-hCO ውስጥ የላሜሽን አለመኖር በሰንሰለት ግንኙነት30 ላይ ምን ያህል ተጽዕኖ እንደሚያሳድር ግልጽ አይደለም. የወደፊት ሥራ ሌሎች የሕዋስ ዓይነቶችን ማለትም የሰው ማይክሮሊያን፣ ​​የሰው endothelial ሕዋሳት፣ እና የተለያዩ የ GABAergic interneurs መጠንን በማዋሃድ ላይ ያተኩራል። ከሕመምተኞች በተገኙ ሕዋሳት ውስጥ የጽሑፍ, የሲናፕቲክ እና የባህሪ ደረጃዎች.
በአጠቃላይ ይህ በ Vivo መድረክ ውስጥ የሰውን አንጎል እድገት እና የበሽታ ምርምርን ሊያሟላ የሚችል ኃይለኛ ምንጭን ይወክላል። ይህ ፕላትፎርም በሌላ መልኩ ሊታዩ በማይችሉ ታካሚ-የተገኙ ህዋሶች ውስጥ አዲስ የስትራንድ-ደረጃ ፍኖተ-ፎቶዎችን እንድናገኝ እና አዳዲስ የህክምና ስልቶችን እንድንፈትሽ ያስችለናል ብለን እንጠብቃለን።
ቀደም ሲል እንደተገለፀው hCO2.5 ከ HiPS ህዋሶች ፈጥረናል። በመጋቢ ንብርብሮች ላይ የሰለጠኑ የኤችፒኤስ ሴሎች የ hCO ምርትን ለመጀመር ያልተነኩ የሂፒኤስ ህዋሶች ቅኝ ግዛቶች ዲስፓይስ (0.35 mg/mL) በመጠቀም ከባህል ምግቦች ተወግደው እጅግ በጣም ዝቅተኛ ተያያዥነት ባላቸው የፕላስቲክ ባህሎች የ hiPS ሴል ባህል መካከለኛ ወደ ያዙ ምግቦች ተላልፈዋል። (ኮርኒንግ) በሁለት SMAD አጋቾች dorsomorphine (5 μM; P5499, Sigma-Aldrich) እና SB-431542 (10 μM; 1614, Tocris) እና ROCK inhibitor Y-27632 (10 μM; S1049, Selleck) ተጨምሯል. በመጀመሪያዎቹ 5 ቀናት ውስጥ የሂፒኤስ ሴል መካከለኛ በየቀኑ ተቀይሯል እና dorsomorphine እና SB-431542 ተጨምረዋል. በእገዳው በስድስተኛው ቀን የነርቭ ስፌሮይድ ወደ ኒውሮባሳል-ኤ (10888 ፣ Life Technologies) ፣ B-27 ተጨማሪ ቪታሚን ኤ (12587 ፣ የህይወት ቴክኖሎጂዎች) ፣ ግሉታማክስ (1: 100 ፣ የህይወት ቴክኖሎጂዎች) ፣ ፔኒሲሊን እና ስትሬፕቶማይሲን (1: 100 ፣ የህይወት ቴክኖሎጂዎች) እና ኤፍ 1 ኤፒደርማል ፋክተር (ኢ.ጂ.ኤፍ. R & D Systems) እና ፋይብሮብላስት እድገት 2 (FGF2; 20 ng ml-1; R & D Systems) እስከ ቀን 24. ከቀን 25 እስከ ቀን 42, መካከለኛው በአንጎል-የተገኘ ኒውሮትሮፊክ ፋክተር (BDNF; 20 ng ml-1, Peprotech) እና ሌሎች ኒውሮቶሮፊን 3 (NT3); - 20 በየእለቱ ይለዋወጣል. በእገዳው በስድስተኛው ቀን የነርቭ ስፌሮይድ ወደ ኒውሮባሳል-ኤ (10888 ፣ Life Technologies) ፣ B-27 ተጨማሪ ቪታሚን ኤ (12587 ፣ የህይወት ቴክኖሎጂዎች) ፣ ግሉታማክስ (1: 100 ፣ የህይወት ቴክኖሎጂዎች) ፣ ፔኒሲሊን እና ስትሬፕቶማይሲን (1: 100 ፣ የህይወት ቴክኖሎጂዎች) እና ኤፍ 1 ኤፒደርማል ፋክተር (ኢ.ጂ.ኤፍ. R & D Systems) እና ፋይብሮብላስት እድገት 2 (FGF2; 20 ng ml-1; R & D Systems) እስከ ቀን 24. ከቀን 25 እስከ ቀን 42, መካከለኛው በአንጎል-የተገኘ ኒውሮትሮፊክ ፋክተር (BDNF; 20 ng ml-1, Peprotech) እና ሌሎች ኒውሮቶሮፊን 3 (NT3); - 20 በየእለቱ ይለዋወጣል.በተንጠለጠለበት በስድስተኛው ቀን የነርቭ ስፕሮይድስ ኒውሮባሳል-ኤ (10888, የህይወት ቴክኖሎጂዎች), B-27 ተጨማሪ ቪታሚን ኤ (12587, የህይወት ቴክኖሎጂዎች), ግሉታማክስ (1: 100, የህይወት ቴክኖሎጂዎች), ፔኒሲሊን ወደያዘው የነርቭ መካከለኛ ተላልፈዋል.እና ስትሮፕቶሚሽን (1፡100፣ ላይፍ ቴክኖሎጂስ) እና ዶፖልነኒ ኤፒደርማልኒም ፋክቶሮም ሮዝ (FGF2፤ 20 нг/мл፤ R&D ሲስተምስ) እስከ 24-го дня። እና ስትሬፕቶማይሲን (1:100, Life Technologies) እና በ epidermal እድገት ምክንያት (EGF; 20 ng/ml; R&D Systems) እና ፋይብሮብላስት እድገት ምክንያት 2 (FGF2; 20 ng/ml; R&D Systems) እስከ 24 ቀን ድረስ ተጨምሯል።ከ 25 እስከ 42 ባሉት ቀናት ከአእምሮ የተገኘ ኒውሮትሮፊክ ፋክተር (BDNF; 20 ng ml-1, Peprotech) እና neurotrophin 3 (NT3; 20 ng ml-1, Peprotech) ወደ መካከለኛው ተጨምረዋል, መካከለኛውን በየቀኑ ይቀይሩ.在悬浮的第6 天，将神经球体转移到含有neurobasal-A）10888፣ላይፍ ቴክኖሎጂስ ቴክኖሎጂዎች)፣ ግሉታማክስ (1፡100፣ ላይፍ ቴክኖሎጂዎች) ቴክኖሎጂዎች）并辅以表皮生长因子（EGF；20 ng ml-1；R&D ሲስተምስ）和成纤维细胞生长因子2（FGF2；2R&D ሲስተምስ)直至第24 天።在 悬浮 的 第 第 6 天 将 神经 球体 转移 含有 含有 neurobasal-a （10888 ህይወት ቴክኖሎጂዎች４补充剂 （12587፣ የህይወት ቴክኖሎጂዎች） Glutamax (1፡ 100፣ ላይፍ ቴክኖጂስ› 的 神经生长 因子 （； (20 ng ml-1 ； r & d ሲስተምስ）) На 6-й день суспензи нейросферы были переведены на добавку, содержащую нейробазазал-A (108888, ላይፍ ቴክኖሎጂስ) ቪታሚና ኤ (12587፣ ላይፍ ቴክኖሎጂስ)፣ GlutaMax (1፡100፣ የህይወት ቴክኖሎጂዎች)፣ ፔኒቲሲሊን- ናይትራሊዞቫኒ ስትሬፕቶሚሽን (1፡100፣ ላይፍ ቴክኖሎጂስ) ፋክቶራ ሮስታ (EGF፤ 20 нг мл-1፤ R&D ሲስተምስ) እና ፋክቶራ ሮስታ ሼብሮብላይስቶቭ 2 (FGF2፤ 20 нг мл-1) 1; በ6 ኛው ቀን የኒውሮስፔር እገዳዎች ኒውሮባሳል-ኤ (10888፣ ህይወት ቴክኖሎጂዎች)፣ B-27 ተጨማሪ ቪታሚን ኤ (12587፣ የህይወት ቴክኖሎጂዎች)፣ ግሉታማክስ (1፡100፣ የህይወት ቴክኖሎጂዎች)፣ ፔኒሲሊን-ገለልተኛ የሆነ ስትሬፕቶማይሲን (1፡100፣ ህይወት ቴክኖሎጂዎች) ከኤፒደር ፋክተር ጋር ተጨምሮ (ኤፒደርኤፍ) ስርዓቶች) እና ፋይብሮብላስት እድገት 2 (FGF2; 20 ng ml-1) 1; R&D ሲስተምስ) እስከ 24-го дня. R&D ሲስተምስ) እስከ 24 ቀን ድረስ።ከ 25 እስከ 42 ባሉት ቀናት ከአእምሮ የተገኘ ኒውሮትሮፊክ ፋክተር (BDNF፤ 20 ng ml-1, Peprotech) እና neurotrophic factor 3 (NT3; 20 ng ml-1, Peprotech) በየሁለት ቀኑ ወደ ባህል ማእከል ተጨመሩ። መካከለኛ ለውጥ አንዴ።ከ 43 ኛው ቀን ጀምሮ hCO በየ 4-6 ቀናት ውስጥ በየ 4-6 ቀናት ውስጥ በሚለዋወጥ የኒውሮባሳል-ኤ መካከለኛ (NM; 1088022, Thermo Fisher) ውስጥ ይጠበቃል. hCOን ከሂፒኤስ ህዋሶች ለማግኘት መጋቢ በሌለበት ሁኔታ የሰለጠኑ የሂፒኤስ ህዋሶች በ 37°C ለ 7 ደቂቃዎች በAccutase (AT-104, Innovate Cell Technologies) ተክለዋል፣ ወደ ነጠላ ህዋሶች ተለያይተው እና በ AggreWell 800 plates (34815፣ STEMCELL ቴክኖሎጂስ) በ E ድሜ 6 ተጨማሪ ሕዋሶች በ 3 × 18 መካከለኛ መጠን። ROCK inhibitor Y-27632 (10 μM; S1049, Selleckchem). ከ 24 ሰአታት በኋላ በውሃ ጉድጓዶች ውስጥ ያሉ መገናኛ ብዙሃን ወደላይ እና ወደ ታች በቧንቧ ተዘርግተዋል Essential 6 ሚዲያ (A1516401, Life Technologies) በ dorsomorphine (2.5 μM; P5499, Sigma-Aldrich) እና SB-431542 (10 μM; 1614) የተጨመሩ. , ቶክሪዳ). ከ 2 እስከ 6 ባሉት ቀናት ውስጥ አስፈላጊ 6 መካከለኛ በየቀኑ በ dorsomorphine ተተካ እና SB-431542 ተጨማሪ። ከስድስተኛው ቀን ጀምሮ የኒውሮልፌር እገዳዎች ወደ ኒውሮባሳል መካከለኛ ተላልፈዋል እና ከላይ እንደተገለፀው ተጠብቀዋል.
ሁሉም የእንስሳት ሂደቶች የተከናወኑት በስታንፎርድ ዩኒቨርሲቲ ላብራቶሪ የእንስሳት እንክብካቤ አስተዳደር ኮሚቴ (APAC) በተፈቀደው የእንስሳት እንክብካቤ መመሪያ መሰረት ነው። ነፍሰ ጡር euthymic RNU (rnu/+) አይጦች (Charles River Laboratories) ተገዙ ወይም ተቀምጠዋል። እንስሳት በምግብ እና በውሃ ማስታወቂያ ሊቢቲም በ12 ሰአታት ብርሃን-ጨለማ ዑደት ላይ እንዲቆዩ ተደርገዋል። እርቃን (FOXN1–/-) እድሜያቸው ከሶስት እስከ ሰባት ቀናት የሆኑ የአይጥ ግልገሎች የሚታወቁት ከመቁረጥ በፊት ባልበሰሉ የጢስ ማውጫዎች እድገት ነው። ቡችላዎች (ወንድ እና ሴት) ከ2-3% አይዞፍሉራኔን በማደንዘዝ በስቲሪዮታክሲክ ፍሬም ላይ ተቀምጠዋል። የዱራ ማተርን ታማኝነት በመጠበቅ ላይ ከ2-3 ሚ.ሜ በላይ የሆነ ዲያሜትር ያለው የራስ ቅሉ ትሬፓኒሽን ተከናውኗል። ከዚያም ዱራውን ለመውጋት ከክራኒዮቲሞሚ ውጭ ባለ 30-ጂ መርፌ (በግምት 0.3 ሚሜ) ይጠቀሙ። ከዚያ HCO ን በቀጭኑ 3×3 ሴ.ሜ ፓራፊልም ላይ ይተግብሩ እና ከመጠን በላይ መካከለኛ ያስወግዱ። ከ 23 ጂ 45° መርፌ ጋር የተያያዘውን የሃሚልተን መርፌን በመጠቀም hCOን ወደ መርፌው በጣም ሩቅ ጫፍ በቀስታ ይሳሉ። ከዚያም መርፌውን ከስቴሪዮታክሲክ መሳሪያው ጋር በተገናኘው የሲሪን ፓምፕ ላይ ይጫኑ. ከዚያም የመርፌውን ጫፍ ቀደም ሲል በተሰራው 0.3 ሚሊ ሜትር ስፋት ባለው የዱራ ቀዳዳ ላይ ያስቀምጡ (z = 0 ሚሜ) እና መርፌውን ከ1-2 ሚሜ (z = በግምት -1.5 ሚሜ) በማጥበብ መርፌው በዱራማተር መካከል እስኪሆን ድረስ ጥቅጥቅ ያለ ማህተም እስኪፈጠር ድረስ. ከዚያም መርፌውን ወደ ኮርቲካል ወለል መሃል በ z = -0.5 ሚ.ሜ ከፍ ያድርጉት እና hCO በደቂቃ ከ1-2 µl ፍጥነት ያስገቡ። የ hCO መርፌው ከተጠናቀቀ በኋላ መርፌው በደቂቃ ከ 0.2-0.5 ሚ.ሜ ወደ ኋላ ይመለሳል, ቆዳው የተሰፋ ነው, እና ቡችላ ሙሉ በሙሉ እስኪያገግም ድረስ ወዲያውኑ በሙቀት ማሞቂያ ላይ ይቀመጣል. አንዳንድ እንስሳት በሁለትዮሽ ተክለዋል.
ሁሉም የእንስሳት ሂደቶች የተከናወኑት በስታንፎርድ ዩኒቨርሲቲ APLAC በተፈቀደ የእንስሳት እንክብካቤ መመሪያዎች መሰረት ነው። አይጦች (ከተተከሉ ከ60 ቀናት በላይ የሚበልጡ) በ 5% isoflurane ማደንዘዣ እና በምስል በሚታይበት ጊዜ ከ1-3% ኢሶፍሉራን ሰመመን ተወስደዋል። ለዕይታ፣ 7 Tesla በንቃት የሚከላከል የአግድም ጉድጓድ ስካነር ብሩከር (ብሩከር ኮርፖሬሽን) ከአለም አቀፍ ኤሌክትሪክ ኩባንያ (IECO) የግራዲየንት ድራይቭ ጋር፣ 120 ሚሜ (600 ሜቲ/ሜ፣ 1000 ቲ/ሜ/ሰ) ውስጣዊ ዲያሜትር ያለው ጋሻ ግሬዲየንት ማስገቢያ AVANCEን በመጠቀም ጥቅም ላይ ውሏል። III, ስምንት-ቻናል ባለብዙ-ሽብል RF እና ባለብዙ-ኮር ችሎታዎች, እና ተጓዳኝ Paravision 6.0.1 መድረክ. ቀረጻው የተካሄደው በንቃት የተገነጠለ ቮልሜትሪክ RF ጠመዝማዛ በ 86 ሚሜ ውስጣዊ ዲያሜትር እና ባለአራት ቻናል ክሪዮ-ቀዘቀዘ RF ጠመዝማዛ ለመቀበል ብቻ ነው። Axial 2D Turbo-RARE (የድግግሞሽ ጊዜ = 2500 ms፣ echo time = 33 ms፣ 2 አማካኝ) በ16 ስክሪፕት ቀረጻዎች፣ የተቆራረጠ ውፍረት 0.6-0.8 ሚሜ፣ 256 × 256 ናሙናዎችን የያዘ። ምልክቶቹ የተቀበሉት ባለ quadrature transceiver volumetric RF coil በ 2 ሴንቲ ሜትር ውስጣዊ ዲያሜትር (Rapid MR International, LLC) በመጠቀም ነው. በመጨረሻም፣ አብሮ የተሰራውን Imaris (BitPlane) የገጽታ ግምት ተግባራትን ለ3D አተረጓጎም እና የድምጽ መጠን ትንተና ተጠቀም። የተሳካ ንቅለ ተከላ በተተከለው ንፍቀ ክበብ ውስጥ ቀጣይነት ያለው የT2-ክብደት ኤምአርአይ ሲግናል የተፈጠሩበት አንዱ ተብሎ ይገለጻል። የግራፍት ውድቅ ማድረግ በተተከለው ንፍቀ ክበብ ውስጥ ቀጣይነት ያለው የT2-ክብደት ኤምአርአይ ምልክት ቦታዎችን የማያመጣ እንደ መተከል ተብሎ ይገለጻል። Subcortical t-hCO ከተከታይ ትንታኔ ተገለለ።
GCaMP6s በ hCO ውስጥ ባለ ሁለት ፎቶ ካልሲየም ኢሜጂንግ ለመግለፅ፣ የሂፒኤስ ህዋሶች በpLV[Exp] -EF1a::GcaMP6s-WPRE-Puro የተያዙ ሲሆን በመቀጠል አንቲባዮቲክስ በመምረጥ። በአጭሩ፣ ህዋሶች ከ EDTA ጋር ተለያይተው በ 1 ሚሊር አስፈላጊ 8 መካከለኛ መጠን በግምት 300,000 ህዋሶች ፖሊብሬን (5 μg/ml) እና 15 μl ቫይረስ ባሉበት ጥግግት ታግደዋል። ከዚያም ሴሎቹ ለ 60 ደቂቃዎች በእገዳ ውስጥ ተተክለዋል እና በአንድ ጉድጓድ 50,000 ሴሎች ውስጥ ተዘርተዋል. ከተዋሃዱ በኋላ, ሴሎች በ 5-10 μg ml-1 ፑሮማይሲን ለ 5-10 ቀናት ወይም የተረጋጋ ቅኝ ግዛቶች እስኪታዩ ድረስ. አጣዳፊ hCO ኢንፌክሽን ቀደም ሲል እንደተገለፀው 5 ከአንዳንድ ማሻሻያዎች ጋር ተካሂዷል. ባጭሩ፣ ቀን 30-45 hCO ወደ 1.5 ml Eppendorf microcentrifuge tubes 100 μl ነርቭ መካከለኛ ወደ ያዙ ያስተላልፉ። ከዚያም በግምት 90 µl መካከለኛው ይወገዳል፣ 3-6 µl ከፍተኛ ቲተር ሌንቲቫይረስ (ከ0.5 x 108 እስከ 1.2 x 109) ወደ ቱቦው ይጨመራል እና hCO ለ 30 ደቂቃዎች ወደ ማቀፊያው ይተላለፋል። ከዚያም በእያንዳንዱ ቱቦ ውስጥ 90-100 µl መካከለኛ ይጨምሩ እና ቱቦዎቹን በአንድ ሌሊት ወደ ማቀፊያው ይመልሱ። በማግሥቱ፡ hCOን በትንሹ ተያያዥነት ባላቸው ሳህኖች ወደ አዲስ የነርቭ መካከለኛ ያስተላልፉ። ከ 7 ቀናት በኋላ hCO የኢንፌክሽን ጥራትን ለማየት እና ለመገምገም ወደ ባለ 24-ጉድጓድ የመስታወት የታችኛው ሰሌዳዎች ተላልፏል። pLV[Exp]-SYN1::EYFP-WPRE እና pLV[Exp]-SYN1::hChR2-EYFP-WPRE የተፈጠሩት በቬክተር Builder ነው። ሌንቲ ቫይረስ በአብዛኛዎቹ ሙከራዎች ውስጥ ጥቅም ላይ ይውላል, ምክንያቱም በአስተናጋጁ ጂኖም ውስጥ የተዋሃደ ነው, ይህም በተበከሉ የሴል መስመሮች ውስጥ የሪፖርተር ዘረ-መል (ጅን) መግለጽ ያስችላል. ለእብድ ውሻ ክትትል፣ ቀን 30-45 hCO በእብድ ውሻ-ΔG-eGFP እና AAV-DJ-EF1a-CVS-G-WPRE-pGHpA (ፕላዝማይድ #67528፣ አድጂን) ለ3 ቀናት በደንብ ታጥቦ በS1 ውስጥ ወደ አይጥ ተተክሎ እና ለ 7-1 ቀናት ውስጥ ተይዟል።
ለኢሚውኖሳይቶኬሚስትሪ፣ እንስሳት ሰመመን ተሰጥቷቸው እና በፒቢኤስ የልብ ደም ተወስደዋል ከዚያም 4% paraformaldehyde (PFA in PBS፣ Electron Microscope Sciences)። አንጎሎች በ 4% PFA ውስጥ ለ 2 ሰዓታት ወይም በአንድ ሌሊት በ 4 ° ሴ ተስተካክለዋል ፣ በ 30% sucrose በ PBS ውስጥ ለ 48-72 ሰአታት ተጠብቀው ፣ እና በ 1: 1 ፣ 30% sucrose ውስጥ ተካትተዋል: OCT (Tissue-Tek OCT Compound 4583 ፣ Sakura Finetek) በመጠቀም ኮሮናል ስታት (ላይካ) ለወፍራም ክፍል ኢሚዩሂስቶኬሚስትሪ፣ እንስሳት በፒ.ቢ.ኤስ ተበክለዋል፣ እና አንጎሉ ተከፋፍሎ በ300-400 µm ቫይራቶም (ሌይካ) ተጠቅሞ ኮሮና ተከፋፍሏል እና ክፍሎቹ በ4% PFA ለ30 ደቂቃዎች ተስተካክለዋል። ከዚያም ክሪዮሴክሽን ወይም ጥቅጥቅ ያሉ ክፍሎች በፒቢኤስ ታጥበው ለ 1 ሰአት በክፍል ሙቀት (10% መደበኛ የአህያ ሴረም (ኤን.ዲ.ኤስ.) እና 0.3% ትሪቶን X-100 በፒ.ቢ.ኤስ. ተጨምረዋል) እና በ 4 ዲግሪ ሴንቲ ግሬድ ውስጥ በማገጃ መፍትሄ ታግደዋል. - የመታቀፊያ ክሪዮሴክሽን በአንድ ምሽት እና ወፍራም ክፍሎች ለ 5 ቀናት ተወስደዋል. ዋና ፀረ እንግዳ አካላት ጥቅም ላይ የዋሉት፡- ፀረ-NeuN (አይጥ፣ 1፡500፣ ab104224፣ abcam) ፀረ-CTIP2 (አይጥ፣ 1፡300፣ ab18465፣ abcam)፣ ፀረ-ጂኤፍኤፒ (ጥንቸል፣ 1፡1,000፣ ዛ0334፣ ዳኮ)፣ ጸረ-ጂኤፍፒ፡104224፣ ጂን፣9ቲ ፀረ-HNA (አይጥ፣ 1:200፣ ab191181፣ abcam)፣ ፀረ-NeuN (ጥንቸል፣ 1:500፣ ABN78፣ ሚሊፖሬ)፣ ፀረ-PDGFRA (ጥንቸል፣ 1:200፣ sc-338፣ ሳንታ ክሩዝ)፣ ፀረ-PPP1R17 (ጥንቸል፣ 19፣2008)፣ HPAdies ፀረ-RECA-1 (አይጥ፣ 1:50፣ ab9774፣ abcam)፣ ፀረ-SCG2 (ጥንቸል፣ 1:100፣ 20357-1-AP፣ Proteintech)፣ ፀረ-SOX9 (ፍየል፣ 1:500፣ AF3075፣ R&D ሲስተምስ)፣ Netrin G1a (ፍየል፣ 6፣10 ሲስተምስ)፣ 1:10 ፀረ-STEM121 (አይጥ፣ 1:200፣ Y40410፣ ታካራ ባዮ)፣ ጸረ-SATB2 (አይጥ፣ 1:50፣ ab51502፣ abcam)፣ ፀረ-GAD65/67 (ጥንቸል፣ 1:400፣ ABN904፣ ሚሊፖሬ) እና ፀረ-IBA1 (ፍየል፣ 1:06፣ abcam)። ዋና ፀረ እንግዳ አካላት ጥቅም ላይ የዋሉት፡- ፀረ-NeuN (አይጥ፣ 1፡500፣ ab104224፣ abcam) ፀረ-CTIP2 (አይጥ፣ 1፡300፣ ab18465፣ abcam)፣ ፀረ-ጂኤፍኤፒ (ጥንቸል፣ 1፡1,000፣ ዛ0334፣ ዳኮ)፣ ፀረ -ጂኤፍፒ፡1(ዶሮ፣9ቲ) ፀረ-HNA (አይጥ፣ 1:200፣ ab191181፣ abcam)፣ ፀረ-NeuN (ጥንቸል፣ 1:500፣ ABN78፣ ሚሊፖሬ)፣ ፀረ-PDGFRA (ጥንቸል፣ 1:200፣ sc-338፣ ሳንታ ክሩዝ)፣ ፀረ-PPP1R17 (ጥንቸል፣ 19፣2008)፣ HPAdies ፀረ-RECA-1 (አይጥ፣ 1:50፤ ab9774፣ abcam)፣ ፀረ-SCG2 (ጥንቸል፣ 1:100፣ 20357-1-AP፣ Proteintech)፣ ፀረ-SOX9 (ፍየል፣ 1:500፣ AF3075፣ R&D ሲስተምስ)፣ Netrin G1a (ፍየል፣ 1006፣10) ፀረ-STEM121 (አይጥ፣ 1:200፣ Y40410፣ ታካራ ባዮ)፣ ጸረ-SATB2 (መዳፊት፣ 1:50፣ ab51502፣ abcam)፣ ፀረ-GAD65/67 (ጥንቸል፣ 1:400፣ ABN904፣ ሚሊፖሬ) እና ፀረ-IBA1 (ፍየል) 1760፣ 1 ካሜራ። Использовались следующие первичные антитела: አንቲ-ኔዩን (мышиные, 1:500; ab104224, abcam), анти-CTIP2: 3крысы; ab18465፣ abcam)፣ አንቲ-ጂኤፍኤፕ (ካርኦሊች፣ 1፡1000፣ ዜድ0334፣ ዳኮ)፣ አንቲ- -ጂኤፍፒ (курица፣ 1:1000፣ GTX13970፣ GeneTex)፣ አንቲ-HNA (አብ፡1900)፣ 19901 አንቲ-NeuN (ክሮሊክ፣ 1:500፣ ABN78፣ ሚሊፖሬ)፣ አንቲ-PDGFRA (ክሮሊክ፣ 1:200፣ ስክ-338፣ ቻንቴ-ክሮዝ)፣ አንቲ-PPP1R17 (ክሮ: 900፣ HPAlas) ፀረ እንግዳ አካላት)፣ አንቲ-RECA-1 (мышь፣ 1:50፤ ab9774፣ abcam)፣ አንቲ-SCG2 (кролик, 1:100፤ 20357-1-AP፣ Proteintech)፣ አንቲ-SOX9 (козий፣ 1:507) нетрин G1a (козий፣ 1:100፤ AF1166፣ R&D Systems)፣ አንቲ-STEM121 (ሜይሺንይ፣ 1፡200፣ Y40410፣ ታካራ ባዮ)፣ አንቲ-SATB2 (мышь፣ ab51):50; አንቲ-ጋድ65/67 (ከሮሊክ፣ 1፡400፣ ABN904፣ ሚሊፖሬ) እና አንቲ-ኢባ1 (ኮዛ፣ 1፡100፣ ኤቢ5076፣ አባካም)። ዋና ፀረ እንግዳ አካላት ጥቅም ላይ የዋሉት፡- ፀረ-NeuN (አይጥ፣ 1፡500፣ ab104224፣ abcam)፣ ፀረ-CTIP2 (አይጥ፣ 1፡300፣ ab18465፣ abcam)፣ ፀረ-ጂኤፍኤፒ (ጥንቸል፣ 1:1000፣ ዛ0334፣ ዳኮ)፣ ፀረ-ጂኤፍፒ (ዶሮ፣ 103070) ፀረ-ኤች ኤን ኤ (አይጥ፣ 1:200፣ ab191181፣ abcam)፣ ፀረ-NeuN (ጥንቸል፣ 1:500፣ ABN78፣ ሚሊፖሬ)፣ ፀረ-PDGFRA (ጥንቸል፣ 1:200፣ sc-338፣ Santa Cruz)፣ ፀረ-PPP1R17 (ጥንቸል፣ 1:0478)፣ HPAdies ፀረ-RECA-1 (አይጥ፣ 1:50፣ ab9774፣ abcam)፣ ፀረ- SCG2 (ጥንቸል፣ 1፡100፣ 20357-1-AP፣ Proteintech)፣ ፀረ-SOX9 (ፍየል፣ 1፡500፣ AF3075፣ R&D ሲስተምስ)፣ netrin G1a (ፍየል፣ 1፡106፣100) STEM121 (አይጥ፣ 1:200፣ Y40410፣ ታካራ ባዮ)፣ ፀረ-SATB2 (አይጥ፣ 1:50፣ ab51502፣ abcam)፣ ፀረ-GAD65/67 (ጥንቸል፣ 1:400፣ ABN904፣ ሚሊፖሬ) እና ፀረ-IBA1 (ፍየል፣ ab51502፣ 15m)።使用的一抗是：抗NeuN（小鼠，1:500；ab104224，abcam）抗CTIP2（大鼠，1:3 00;ab18465፣abcam)፣ 抗 ጂኤፍኤፒ (兔፣ 1:1,000; Z0334፣ ዳኮ)፣ 抗-ጂኤፍ ፒ (鸡፣ 1:1,000;GTX13970፣ GeneTex)፣ 抗HNA（小鼠፣1:200；ab1911 81፣abcam)፣ 抗NeuN (兔፣ 1:500;ABN78፣ Millipore)፣ 抗PDGFRA（兔፣ 1:200;sc-338፣ሳንታ ክሩዝ)፣抗PPP1R17 (兔፣1:200፣HPA047819፣አትላስ抗体）፣ 抗RECA-1（小鼠፣1፡50；ab9774፣abcam）፣抗SCG2（兔） 1: 100; 20357-1-AP, ፕሮቲን, 抗 SOX9 (山羊, 1:500; AF3075, R&D ሲስተምስ) ፣ ኔትሪን ጂ1a (1:100 ፣ AF1166 ፣ R&D) ሲስተምስ)፣ 抗STEM121 (小鼠፣ 1:200;使用的一抗是：抗NeuN（小鼠，1:500；ab104224፣abcam）抗CTIP2（大鼠，1 :300;ab18465፣abcam)፣ 抗GFAP (兔፣ 1:1,000;Z0334፣ ዳኮ)፣ 抗- ጂኤፍፒ (鸡，1:1,000;GTX13970፣ GeneTex）፣抗HNA（小鼠，1፡200；ab191181፣abcam）抗NeuN（兔፣1:500％兔，1:500；兔，1:500；兔，1:500；兔，1:500；兔፣1MiABNre 200；sc-338፣ሳንታ ክሩዝ)፣ 抗PPP1R17（兔፣1፡200；HPA047819፣ አትላስ 抗体）፣抗RECA-1（小鼠፣1፡50）,abcam97；abcam97） 100;20357-1-AP፣ ፕሮቲንቴክ፣ 抗 SOX9（山羊፣1:500；AF3075፣ R&D ሲስተምስ፣ Netrin G1a (山羊፣1:100 AF1166፣ R&D ሲስተምስ：1፡100)Y40410፣ Takara Bio)፣ ፀረ-SATB2 (አይጥ፣ 1፡50፣ ab51502፣ abcam)፣ ፀረ-GAD65/67 (ጥንቸል፣ 1፡400፣ ABN904፣ ሚሊፖሬ) እና ፀረ-IBA1 (ፍየል፣ 1፡100፣ ab5076፣ abcam)።ዋና ፀረ እንግዳ አካላት ጥቅም ላይ የዋሉት፡ ፀረ-NeuN (አይጥ፣ 1፡500፣ ab104224፣ abcam)፣ ፀረ-CTIP2 (አይጥ፣ 1፡300፣ ab18465፣ abcam)፣ ፀረ-ጂኤፍኤፒ (ጥንቸል፣ 1፡1000፣ Z0334፣ ዳኮ) . , ፀረ-ጂኤፍፒ (ዶሮ, 1: 1000; GTX13970, GeneTex), ፀረ-ኤች ኤን ኤ (አይጥ, 1: 200; ab191181, abcam), ፀረ-NeuN (ጥንቸል, 1:500; ABN78, ሚሊፖሬ), ፀረ-PDGFRA (ጥንቸል, 1-330, 1 አንቲ-ፒ.ፒ.ፒ.ፒ.), ሳንታ-ፒ.ፒ.ፒ. (ጥንቸል, 1:200; HPA047819, Atlas antibody), ፀረ-RECA-1 (አይጥ, 1:50; ab9774, abcam), ፀረ- SCG2 (ጥንቸል), 1:100;እ.ኤ.አ. Y40410፣ ታካራ ባዮ)፣ አንቲ-SATB2 (мышь፣ 1:50፤ ab51502፣ abcam)፣ አንቲ-GAD65/67 (кролик, 1:400፤ ABN904፣ ሚሊፖሬ) እና አንቲ-ኢባ1 (коза00) አባካም) እ.ኤ.አ. ab51502፣ abcam)፣ ፀረ-GAD65/67 (ጥንቸል፣ 1፡400፣ ABN904፣ ሚሊፖሬ) እና ፀረ-IBA1 (ፍየል፣ 1፡100፣ ab5076፣ abkam)።ከዚያም ክፍሎቹ በፒቢኤስ ታጥበው በሁለተኛ ደረጃ ፀረ እንግዳ አካላት ለ 1 ሰዓት በክፍል ሙቀት (በቀዘቀዙ ክፍሎች) ወይም በአንድ ምሽት በ 4 ° ሴ (ወፍራም ክፍሎች) ይታጠባሉ. Alexa Fluor secondary antibody (Life Technologies) በ 1:1000 የተሟጠጠ የማገጃ መፍትሄ ጥቅም ላይ ውሏል። በፒቢኤስ ከታጠበ በኋላ ኒውክሊየሎቹ በ Hoechst 33258 (Life Technologies) ታይተዋል። በመጨረሻም ተንሸራታቾቹ Aquamount (ፖሊሳይንስ) በመጠቀም ከሽፋኖች (ፊሸር ሳይንቲፊክ) ጋር በማይክሮስኮፕ ላይ ተቀምጠዋል እና በ Keyence fluorescent ማይክሮስኮፕ (BZ-X analyzer) ወይም Leica TCS SP8 confocal microscope (Las-X) በምስሉ ላይ ተተነተኑ። ምስሎቹ የተከናወኑት ImageJ ፕሮግራም (ፊጂ) በመጠቀም ነው። በ t-hCO እና በአይጥ ኮርቴክስ ውስጥ ያሉትን የሰዎች የነርቭ ሴሎች መጠን ለመለካት 387.5 μm ስፋት ያላቸው አራት ማዕዘን ምስሎች በ t-hCO መሃል ላይ ወይም በአይጥ ኮርቴክስ ጠርዝ አጠገብ ተወስደዋል። የግራፍ ህዳጎች የሚወሰኑት በቲሹ ግልጽነት፣ HNA+ nuclei እና/ወይም የቲሹ አውቶፍሎረሰንስ መኖርን በመገምገም ነው። በእያንዳንዱ ምስል ውስጥ፣ የኒውኤን+ እና የኤችኤንኤ+ ህዋሶች አጠቃላይ ቁጥር በተመሳሳይ አካባቢ ባሉት የኒውኤን+ ህዋሶች ተከፋፍለዋል። በምስሉ አውሮፕላኑ ውስጥ ኒውክሊየስ ያላቸው ሴሎች ብቻ መቆጠሩን ለማረጋገጥ Hoechst+ የሆኑት ሴሎች ብቻ በስሌቱ ውስጥ ይካተታሉ። ስታትስቲካዊ ስህተቱን ለመቀነስ ሁለት ምስሎች ቢያንስ በ1 ሚሜ ተለያይተዋል።
ናሙና ከመሰብሰቡ አንድ ሳምንት ቀደም ብሎ የ hCO ንቅለ ተከላ እንስሳትን (በግምት 8 ወር የሚደርስ ልዩነት) በጨለማ ክፍል ውስጥ የስሜት መነቃቃትን ለመቀነስ በጢስካዎች ተቆርጧል። ቀደም ሲል እንደተገለፀው ኒውክሊየስን ማግለል በአንዳንድ ማሻሻያዎች ተከናውኗል። በአጭሩ፣ t-hCO እና hCO የተበላሹት ሳሙና-ሜካኒካል ሴል ሊሲስ እና ባለ 2 ሚሊር ብርጭቆ ቲሹ መፍጫ (D8938፣ Sigma-Aldrich/KIMBLE) በመጠቀም ነው። ከዚያም ድፍድፍ ኒውክሊየሎቹ በ 40 μm ማጣሪያ ተጠቅመው ተጣርተው በ 320 ግራም ለ 10 ደቂቃዎች በ 4 ዲግሪ ሴንቲ ግሬድ ውስጥ የሱክሮዝ እፍጋታ ቅልመትን ከማከናወንዎ በፊት ተጠርገዋል። ከሴንትሪፉግሽን ደረጃ በኋላ (320 ግ ለ 20 ደቂቃ በ 4 ዲግሪ ሴንቲ ግሬድ) ፣ ናሙናዎቹ በ 0.04% BSA/PBS 0.2 ዩኒት µl-1 RNase inhibitor (40 u µl-1, AM2682, Ambion) በመጨመር እና በ 40.µ ፍሰት ማጣሪያ ውስጥ ተላልፈዋል. ከዚያም የተከፋፈሉት ኒዩክሊየሮች 0.02% BSA በያዙ PBS ውስጥ እንደገና ታግደዋል እና በChromium ነጠላ ሴል 3′ ቺፕ ላይ ተጭነዋል (በአንድ መስመር 8,000 ህዋሶች እንደሚመለሱ ይገመታል)። snRNA-seq ቤተ-መጻሕፍት በChromium Single cell 3′ GEM፣ Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics) ተዘጋጅተዋል። snRNA-seq ቤተ-መጻሕፍት በChromium Single cell 3′ GEM፣ Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics) ተዘጋጅተዋል። Библиотеки snRNA-seq были приготовлены с помощью Chromium ነጠላ ሴል 3′ GEM፣ Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics)። የsnRNA-seq ቤተ-መጽሐፍት የተዘጋጀው Chromium Single cell 3′ GEM፣ Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics) በመጠቀም ነው። snRNA-seq 文库是使用Chromium ነጠላ ሕዋስ 3′ GEM፣Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics) 制备的。 snRNA-seq 文库是使用Chromium ነጠላ ሕዋስ 3′ GEM፣Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics) 制备的。 Библиотеку snRNA-seq готовили с использованием Chromium ነጠላ ሴል 3′ GEM፣ Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics)። የsnRNA-seq ቤተ-መጽሐፍት የተዘጋጀው Chromium Single Cell 3′ GEM፣ Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics) በመጠቀም ነው።ከተለያዩ ናሙናዎች የተውጣጡ ቤተ-መጻሕፍት በ Admera Health በ NovaSeq S4 (ኢሉሚና) ላይ ተሰብስበው በቅደም ተከተል ተቀምጠዋል።
ለእያንዳንዱ የኑክሌር ባርኮድ የጂን አገላለጽ ደረጃዎች በ10x የጂኖሚክስ ሴል ሬንጀር ትንተና ሶፍትዌር ፓኬጅ (ስሪት 6.1.2) ተጠቅመዋል። በተለይም፣ ንባቦቹ ከሰው (GRCh38፣ ስብስብ፣ ስሪት 98) እና አይጥ (Rnor_6.0፣ ስብስብ፣ ስሪት 100) ማጣቀሻ ጂኖም ከ mkref ትዕዛዝ ጋር ከተፈጠሩ እና በቁጥር -include-introns=TRUE ትእዛዝን በመጠቀም ብዛት ወደ ውስጠ-ክልሎች የተነደፉ ንባቦችን ያካትታል። ለ t-hCO ናሙናዎች፣ 95% የካርታ ንባብ ቢያንስ 95% የሚሆነው ከሰው ጂኖም ጋር የሚዛመድ መሆኑን በተጠበቀው መስፈርት መሰረት የሰው ኒዩክሊየሮች ተለይተዋል። ሁሉም ተከታይ ትንታኔዎች የተከናወኑት የ R ጥቅልን (ስሪት 4.1.2) Seurat (ስሪት 4.1.1)32 በመጠቀም ከሴል ሬንጀር በተጣራ የአሞሌ ድርድር ውፅዓት ነው።
በቀጣይ ትንተና ውስጥ ከፍተኛ ጥራት ያላቸው ኒውክሊየሮች ብቻ መያዛቸውን ለማረጋገጥ ለእያንዳንዱ ናሙና ተደጋጋሚ የማጣራት ሂደት ተተግብሯል። በመጀመሪያ ደረጃ ከ 1000 ያነሱ ልዩ ጂኖች የተገኙ እና ከ 20% በላይ የሚሆኑት ሚቶኮንድሪያ ዝቅተኛ ጥራት ያላቸው ኒውክሊየሮች ተለይተው ይታወቃሉ እና ይወገዳሉ. በመቀጠልም የጥሬው የጂን ቁጥር ማትሪክስ በ sctransform(vst.flavor=”v2″) ተግባርን በመጠቀም በመደበኛነት በአሉታዊ ሁለትዮሽ ሪግሬሽን ተስተካክሏል፣ይህም 3000 በጣም ተለዋዋጭ የሆኑትን ጂኖች ነባሪ መለኪያዎችን ለይቷል።የልኬት ቅነሳ በከፍተኛ ተለዋዋጭ ጂኖች ላይ ዋና አካል ትንተና (PCA) በመጠቀም ነባሪ መለኪያዎችን በመጠቀም (በምሥል የተመረጠ ጉልበት 3 መጠን) ጣቢያዎች እና ለሁሉም ናሙናዎች እና ስብስብ ትንታኔዎች ጥቅም ላይ የዋለ) ብዙ ዙሮች አደረግን (ጥራት = 1) ባልተለመደ ዝቅተኛ የጂን ብዛት (ከ10ኛ ፐርሰንታይል በታች ያለው መካከለኛ)፣ ያልተለመደ ከፍተኛ ሚቶኮንድሪያል ዘረ-መል (ከ95ኛ ፐርሰንታይል በላይ ሚዲያን) ከፍተኛ ጥራት ያላቸውን ስብስቦችን ለመለየት እና ለማስወገድ DoubletFinder33 ጥቅል (ከ95ኛ ፐርሰንታይል በላይ ያለው የDoubletFinder ነጥብ) እና የ hCO ናሙናዎች (n=3) የተቀናጀ የውሂብ ስብስብን ከላይ በተገለጹት መለኪያዎች ለየብቻ ተካሂደዋል።
ዝቅተኛ ጥራት ያላቸውን ከርነሎች ካስወገዱ በኋላ፣ የተቀናጀው የውሂብ ስብስብ በቡድን (ጥራት = 0.5) እና ለ UMAP34 ምስላዊ ዓላማዎች ተካቷል። ለእያንዳንዱ ዘለላ አመልካች ጂኖች የFindMarkers ተግባርን ከመደበኛው የጂን አገላለጽ መረጃ ከተሰሉት ነባሪ መለኪያዎች ጋር ተወስነዋል። ዋና ዋና የሕዋስ ክፍሎችን ለይተን የምንከፋፍለው የፅንስ እና የጎልማሳ ኮርቲካል ማመሳከሪያ ዳታ ስብስቦችን ከአመልካች ጂን አገላለጽ 19፣20፣21፣35 እና ማብራሪያ ጋር በማጣመር ነው። በተለይም በMKI67 እና TOP2A አገላለጽ የሚዘዋወሩ ቀዳሚዎች ተለይተዋል። የፕሮጀኒተር ዘለላዎች የተገለጹት ሚቶቲክ ግልባጮች በሌሉበት፣ ከፍተኛ መደራረብ ከባለብዙ ሃይል ግላይያል ፕሮጄኒተር ዘለላዎች ጋር በኋለኛው ሜታፋዝ የፅንስ ኮርቴክስ ውስጥ በተገለጹት እና EGFR እና OLIG1 አገላለጽ ነው። አስትሮሳይት የሚለውን ቃል የምንጠቀመው በርካታ የአስትሮሳይት ልዩነትን ለማካተት ነው፣ ከኋለኛ ራዲያል ግሊያ እስከ አስትሮሳይት ብስለት። የአስትሮሳይት ስብስቦች ከፍተኛ የSLC1A3 እና AQP4 ደረጃዎችን ይገልጻሉ እና በፅንስ ራዲያል ግሊያ እና/ወይም በአዋቂ አስትሮሴቶች ንዑስ ዓይነቶች ካርታ ታይተዋል። ኦፒሲዎች PDGFRA እና SOX10ን ሲገልጹ oligodendrocytes ደግሞ የማየላይንሽን ምልክቶችን (MOG እና MYRF) ይገልጻሉ። የግሉተማተርጂክ ነርቮች በነርቭ ግልባጮች (SYT1 እና SNAP25) ፣ የ GABAergic ማርከሮች (GAD2) አለመኖር እና የ NEUROD6 ፣ SLC17A7 ፣ BCL11B ወይም SATB2 መግለጫዎች ተለይተዋል ። የግሉኤን ነርቮች በተጨማሪ ወደ ከፍተኛ (SATB2 አገላለጽ እና የ BCL11B መጥፋት) እና ጥልቅ (BCL11B አገላለጽ) ንዑስ ክፍሎች ተከፍለዋል። ፑቲቲቭ ንኡስ ፕሌት (SP) የነርቭ ሴሎች እንደ ST18 እና SORCS1 ያሉ የታወቁትን የ SP18 ማርከሮች ከ GluN ማርከሮች በተጨማሪ ይገልጻሉ። Choroid plexus የሚመስሉ ሴሎች በቲቲአር አገላለጽ ተለይተዋል፣ እና ሜንጅያል መሰል ህዋሶች ፋይብሮብላስት-ተያይዘው ጂኖች እና የካርታ ፒያል/ቫስኩላር ህዋሶችን የማጣቀሻ መረጃ ስብስብ ይገልጻሉ።
በ t-hCO እና hCO ንዑስ ክፍሎች መካከል ያለው የጂን አገላለጽ ልዩነት የተካሄደው የሊብራ አር ጥቅልን (ስሪት 1.0.0) በመጠቀም በተተገበሩ ናሙናዎች ውስጥ በአዲስ የተሻሻለ የውሸት-ባች ዘዴ በመጠቀም ነው። በተለይም የ EdgeR ሎግ-ሊሆድ ሙከራዎች (ስሪት 3.36.0፣ ፓኬጅ R) ለእያንዳንዱ የናሙና ማባዛት ለተወሰነ ሕዋስ ክፍል በሴሎች ውስጥ ያሉትን የጂኖች ብዛት በማጠቃለል ለቡድኖች ተካሂደዋል። ለሙቀት ካርታ እይታ፣በሚሊዮን (ሲፒኤም) የተለመዱ እሴቶች በ EdgeR (cpm() ተግባር) እና በመጠን (አማካኝ = 0 ለማሳካት ፣ መደበኛ መዛባት = 1) በመጠቀም ይሰላሉ ። የጂን ኦንቶሎጂ (GO) ማበልፀጊያ ትንተና በከፍተኛ ደረጃ ቁጥጥር የተደረገባቸው t-hCO GluN ጂኖች ተካሂደዋል (ቤንጃሚን-ሆችበርግ የተስተካከለ ፒ እሴት ከ 0.05 ያነሰ ቢያንስ በ 10% t-hCO GluN ሴሎች ውስጥ ይገለጻል እና ቢያንስ 2 ጊዜ ለውጦች በእጥፍ ይጨምራል)። ToppGene Suite (https://toppgene.cchmc.org/) 37 በመጠቀም ተከናውኗል። የTopFun መተግበሪያን ከነባሪ መለኪያዎች ጋር እንጠቀማለን እና በቢኒያኒ-ሆችበርግ የተስተካከሉ ፒ-እሴቶችን ከGO-የተብራራ የሃይፐርጂኦሜትሪክ ሙከራዎች ሪፖርት እናደርጋለን።
የኛን snRNA-seq ዘለላዎች ከዋና ነጠላ ሴል አር ኤን ኤ-ሴክ ወይም አዋቂ snRNA-seq19,20,21,22 ማመሳከሪያ ጥናቶች የተብራሩ የሕዋስ ስብስቦችን ለማዛመድ የተጣመረ የውሂብ ስብስብ ውህደት ዘዴን ተግባራዊ አድርገናል። በክላስተር መደራረብ (ከላይ ያሉትን ተመሳሳይ መመዘኛዎች በመጠቀም) ለማዋሃድ እና ለማነፃፀር በሱራት ውስጥ የ SCTransform (v2) መደበኛ የስራ ፍሰትን ተጠቅመንበታል። የግለሰብ የውሂብ ስብስቦች በዘፈቀደ እስከ 500 ህዋሶች ወይም ኮሮች በአንድ ኦሪጅናል ክላስተር ለስሌት ቅልጥፍና ተቀምጠዋል። ቀደም ሲል እንደተገለፀው ተመሳሳይ አካሄድ በመጠቀም ክላስተር መደራረብ በእያንዳንዱ የተጠቃለለ ክላስተር ውስጥ ያሉት የሴሎች ወይም ኒውክሊየስ መጠን ከማጣቀሻ ክላስተር መለያ ጋር ተደራራቢ ነው ተብሏል። ግሉኤንን የበለጠ ለመከፋፈል፣ የማጣቀሻ የውሂብ ስብስብ መለያዎችን ለግሉኤን ህዋሳችን ለመመደብ የSurat's TransferData የስራ ፍሰትን ለግሉኤን ንዑስ ስብስብ መረጃ ተጠቀምን።
የ t-hCO እና hCO ናሙናዎች አለምአቀፍ ትራንስክሪፕት የብስለት ሁኔታን ለመገምገም፣የእኛን የውሸት-ጅምላ ናሙናዎችን ከ BrainSpan/psychENCODE23 ጋር አነጻጽረናል፣ይህም ትልቅ የአር ኤን ኤ ቅደም ተከተል ያለው የሰውን አእምሮ እድገት ነው። ከተፀነስን ከ10 ሳምንታት በኋላ እና በኋላ በ 5567 ጂኖች (ከእኛ መረጃ ጋር) ቀደም ሲል በብሬይንስፓን ኮርቲካል ናሙናዎች ውስጥ ንቁ ሆነው ተለይተው በታወቁት (ከ 50% በላይ በዕድገት ልዩነት በኩቢ ሞዴል ሲገለጽ) ከኮርቲካል ናሙናዎች ፒሲኤውን በተቀናጀ የሥርዓተ-መደበኛ የጂን አገላለጽ ማትሪክስ ላይ ሠርተናል። በተጨማሪም፣ ቀደም ሲል እንደተገለፀው አሉታዊ ያልሆነ ማትሪክስ ፋክተርላይዜሽን በመጠቀም ከዋና ዋና የኒውሮ ልማት ፊርማዎች ጋር የተቆራኙ ጂኖችን አግኝተናል። አሉታዊ ያልሆነ የማትሪክስ ፋክተሪንግ አሰራርን በመጠቀም የተሰሉት የናሙና ክብደቶች በምስል ውስጥ ተቀምጠዋል። 5b በZhu et al.38 ለተገለጹት ለእያንዳንዱ አምስት ፊርማዎች ከተስፋፋ መረጃ ጋር። እንደገና፣ የእንቅስቃሴ ጥገኛ ግልባጭ ምልክቶች ከዚህ ቀደም ከታተሙ ጥናቶች የተገኙ ናቸው። በተለይም ERG እና LRG ከተጨማሪ ሠንጠረዥ 3 ህርቫቲን እና ሌሎች 16 የእይታ ማነቃቂያ በኋላ በመዳፊት ቪዥዋል ኮርቴክስ snRNA-seq ስብስብ ተለይተው በታወቁት glutamatergic neurons ውስጥ በከፍተኛ ደረጃ ተሻሽለዋል። በሰው የበለጸጉ LRGs ከKCl-activated human fetal brain cultures የተገኙ እና ከተነቃቁ በኋላ ለ6 ሰአታት የተሰበሰቡ ሲሆን የተጣሩ ጂኖች በሰዎች ላይ በከፍተኛ ሁኔታ ተስተካክለዋል ነገር ግን በአይጦች ውስጥ አልነበሩም (ተጨማሪ ሠንጠረዥ 4)። እነዚህን የጂን ስብስቦች በመጠቀም የጂን ስብስብ ማበልጸጊያ ትንተና የተካሄደው የአንድ-መንገድ ፊሸር ትክክለኛ ፈተናን በመጠቀም ነው።
አይጦችን በ isoflurane ማደንዘዝ ፣ አንጎልን ያስወግዱ እና በቀዝቃዛ (በግምት 4 ዲግሪ ሴንቲ ግሬድ) ኦክሲጂን ያለበት (95% O2 እና 5% CO2) የሱክሮዝ መፍትሄ ለያዙ ክፍሎች ያኑሩ 234 ሚሜ ስኩሮስ ፣ 11 ሚሜ ግሉኮስ ፣ 26 ሚሜ ናኤችኮ3 ፣ 2.5 ሚሜ ኬሲል ፣ 1.25 ሚሜ NaH2PO4፣ 10 mM MgSO4 እና 0.5 mM CaCl2 (ወደ 310 mOsm)። t-hCO የያዙ የአይጥ አንጎል ኮርኒናል ክፍሎች (300-400 µm) የተሰሩት ቀደም ሲል እንደተገለጸው ሊካ VT1200 ቪራቶም በመጠቀም ነው። ከዚያም ክፍሎች ከ 10 ሚሜ ግሉኮስ, 26 ሚሜ NaHCO3, 2.5 ሚሜ KCl, 1.25 ሚሜ NaHPO4, 1 mM MgSO4, 2 ሚሜ CaCl2 እና 126 ሚሜ NaCl (298 mM) ACSF የያዘ ቀጣይነት ያለው ክፍል ሙቀት oxygenation ጋር ክፍል ክፍል ውስጥ ተላልፈዋል. ከመቅዳት ቢያንስ 45 ደቂቃዎች በፊት. ክፍሎች ያለማቋረጥ በ aCSF (95% O2 እና 5% CO2 vial) በተቀባ በተጠመቀ ክፍል ውስጥ ተመዝግበዋል ። ሁሉም መረጃዎች በክፍል ሙቀት ውስጥ ተመዝግበዋል. t-hCO የነርቭ ሴሎች 127 ሚሜ ፖታስየም gluconate, 8 mM NaCl, 4 mM ማግኒዥየም ATP, 0.3 ሚሜ ሶዲየም GTP, 10 ሚሜ HEPES, እና 0.6 ሚሜ EGTA, pH 7.2, ውስጣዊ መፍትሄ በ KOH (ኤም.ኤም. 2) የተስተካከለ መፍትሄ በተሞላው መፍትሄ በተሞላው የቦሮሲሊኬት መስታወት ፒፕት ተዘግቷል. ለማገገም, ባዮሳይቲን (0.2%) ወደ ቀረጻ መፍትሄ ተጨምሯል.
መረጃ የተገኘው MultiClamp 700B amplifier (Molecular Devices) እና Digidata 1550B digitizer (Molecular Devices)፣ ዝቅተኛ ማለፊያ በ2 kHz፣ በ20 kHz ዲጂታል የተደረገ፣ እና ክላምፕፊት (ሞለኪውላር መሳሪያዎች)፣ አመጣጥ (ኦሪጂን ፕሮ) በመጠቀም የተተነተነ ነው። 2021b፣ OriginLab)። እና ብጁ MATLAB ተግባራት (Mathworks)። የመስቀለኛ መንገዱ አቅም JPCalc በመጠቀም ይሰላል እና ግቤቶች ከተሰላው እሴት -14 mV ጋር ተስተካክለዋል። ኦፕሬሽን IV በ10-25 pA ደረጃዎች ከ -250 እስከ 750 ፒኤ ውስጥ ተከታታይ ወቅታዊ ደረጃዎችን ያካትታል።
ቀደም ሲል እንደተገለፀው የ thalamus፣ ነጭ ቁስ እና ኤስ 1 አፋረንቶች በ thalamocortical slices ውስጥ በኤሌክትሪካዊ አነሳስተዋል የ hCO ነርቮች በፕላፕ ክላምፕ ቀረጻ ወቅት። በአጭሩ አንጎሉ በ 10 ዲግሪ ማዕዘን ላይ በተጣበቀ የ 3 ዲ ማተሚያ ጠረጴዛ ላይ ተቀምጧል እና የአዕምሮው ፊት በ 35 ° አንግል ላይ ተቆርጧል. ከዚያም አንጎሉ በተቆረጠው ቦታ ላይ ተጣብቆ ተከፋፍሏል, ታላሞኮርቲካል ወጣ ያሉ አክሰኖች ተጠብቆ ነበር. ባይፖላር የተንግስተን ኤሌክትሮዶች (0.5 MΩ) በሁለተኛው ማይክሮማኒፑሌተር ላይ ተጭነዋል እና በሴል አራት ክልሎችን ለማነቃቃት ስልታዊ በሆነ መልኩ ተቀምጠዋል (ውስጣዊ ካፕሱል፣ ነጭ ቁስ፣ S1 እና hCO)። ከ300 μA ፋሲክ ማነቃቂያ በኋላ የሲናፕቲክ ምላሾችን በ0.03-0.1 Hz ይመዝግቡ።
hChR2 ገላጭ hCO ነርቮች በ 480 nm ገብረዋል እና በ LED (Prizmatix) የሚመነጩ የብርሃን ምቶች በ ×40 ዓላማ (0.9 NA; Olympus) በኩል በሴሎች አቅራቢያ hChR2 አገላለጽ ለመመዝገብ ተተግብረዋል. የበራ የመስክ ዲያሜትር በግምት 0.5 ሚሜ እና አጠቃላይ ኃይል 10-20 mW ነው. የልብ ምት ስፋቱ ወደ 10 ms ተቀናብሯል፣ ይህም በባህሪ ትምህርት ሙከራ ወቅት ከተሰጠው የልብ ምት ጋር ይዛመዳል። ከ1 እስከ 20 ኸርዝ የተለያዩ የማነቃቂያ ድግግሞሾች ጥቅም ላይ ውለው ነበር፣ ነገር ግን የተከታታዩ የመጀመሪያ የልብ ምት ብቻ ለመጠኑ ጥቅም ላይ ውሏል። በሲናፕቲክ ማገጃ ወይም በማመቻቸት መንገዶች ላይ ያለውን ተጽእኖ ለመቀነስ በባቡሮች መካከል ያለው ክፍተት አብዛኛውን ጊዜ ከ30 ሰከንድ በላይ ነው። የ hChR2 ምላሽ ሞኖሲናፕቲክ መሆኑን ለመፈተሽ የ EPSC ምላሽ እስኪጠፋ ድረስ TTX (1 μM) ወደ ገላ መታጠቢያው እንጠቀማለን እና ከዚያም 4-aminopyridine (4-AP; 100 μM) ተጠቀምን። በተለምዶ፣ ምላሽ በጥቂት ደቂቃዎች ውስጥ ይመለሳል፣ በ LED ተኩስ እና በ EPSC ትውልድ መካከል ትንሽ ረዘም ያለ መዘግየት። NBQX (10 μM) ምላሹ በ AMPA ተቀባዮች የሚመራ መሆኑን ለመፈተሽ ጥቅም ላይ ውሏል።
ቀደም ሲል እንደተገለፀው ሹል hCO ክፍሎች ተፈጥረዋል። በአጭሩ, የ hCO ክፍሎች በ 4% agarose ውስጥ ተጭነዋል እና 126 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM NaH2PO4, 1 mM MgSO4, 2 mM CaCl2, 26 mM NaHCO3 እና 10 mM dse (+ 0) ወደ ሴክሽን - 0 - 0 ሴክሽን ተቆርጠዋል. µm በክፍል ሙቀት Leica VT1200 ንዝረትን በመጠቀም እና በክፍል ሙቀት ውስጥ በኤኤስኤፍ ውስጥ ይከማቻል። ከዚያም፣ የሙሉ ህዋሶች የ patch-cam ቀረጻ በ hCO ክፍሎች ላይ በቀጥታ SliceScope ማይክሮስኮፕ (ሳይንቲፊካ) ተካሂዷል። ክፍሎች በ aCSF (95% O2 እና 5% CO2) እና የሕዋስ ምልክቶች በክፍል ሙቀት ውስጥ ተመዝግበዋል. hCO የነርቭ ሴሎች 127 ሚሜ ፖታሲየም gluconate, 8 mM NaCl, 4 ሚሜ ማግኒዥየም ATP, 0.3 ሚሜ ሶዲየም GTP, 10 ሚሜ HEPES, እና 0.6 ሚሜ EGTA, ውስጣዊ pH 7, 2, KOH (osmolarity) ጋር የተስተካከለ መፍትሄ ጋር የተሞላ አንድ መፍትሄ ጋር የተሞላ borosilicate ብርጭቆ pipette ተጠቅሟል. ለማገገም ዓላማዎች 0.2% ባዮሳይቲን ወደ ውስጣዊ መፍትሄ ያክሉት.
የውሂብ ግንድ በ parplex (Cloverx 11.1, ሞለኪንግ መሣሪያዎች (ሞለኪውላዊ መሣሪያዎች (ሞለኪውላዊ መሣሪያዎች) እና ክሊክሎክ (ስሪት 10.6) እና ለቅጅ ማትላቢ ተግባራት (MATLAB 2019b፣ Mathworks)። የመስቀለኛ መንገዱ አቅም JPCalc በመጠቀም ይሰላል እና ግቤቶች ከተሰላው የመገናኛ አቅም -14 mV ጋር ተስተካክለዋል። ኦፕሬሽን IV በ 5-10 pA ደረጃዎች ከ -50 እስከ 250 ፒኤ ውስጥ ተከታታይ ወቅታዊ ደረጃዎችን ያካትታል.
ለቆንጣጣ ነርቮች ሞርሞሎጂካል መልሶ መገንባት, 0.2% ባዮሳይቲን (ሲግማ-አልድሪች) ወደ ውስጣዊ መፍትሄ ተጨምሯል. ሴሎቹ ከተጠለፉ በኋላ ቢያንስ ለ 15 ደቂቃዎች ይዘጋጃሉ. የተመዘገበው ሽፋን ሙሉ በሙሉ እስኪዘጋ ድረስ ፒፔት ቀስ በቀስ ለ 1-2 ደቂቃዎች ይሳባል. የሴክሽን ፊዚዮሎጂ ሂደትን ተከትሎ ክፍሎች በአንድ ሌሊት በ 4 ° ሴ በ 4% ፒኤፍኤ ተስተካክለዋል፣ በPBS X3 ታጥበው 1:1000 በ streptavidin-conjugated DyLight 549 ወይም DyLight 405 (Vector Labs) ተቀላቅለዋል። በባዮሳይቲን የተሞሉ ህዋሶች (2%፤ ሲግማ-አልድሪች) በክፍል ሙቀት ውስጥ ለ 2 ሰአታት በ patch clamp ቀረጻ ወቅት ምልክት ተደርጎባቸዋል። ከዚያም ክፍሎቹ Aquamount (Thermo Scientific) በመጠቀም በማይክሮስኮፒ ስላይዶች ላይ ተጭነዋል እና በማግሥቱ በሊካ TCS SP8 ኮንፎካል ማይክሮስኮፕ ላይ የዘይት ጥምቀት ዓላማን በቁጥር ቀዳዳ ×40 1.3፣ ማጉላት ×0.9-1.0፣ xy። የናሙና መጠኑ በግምት 7 ፒክሰሎች በአንድ ማይክሮን ነው። የZ-ቁልል በ1 µm ክፍተቶች በተከታታይ ተገኝተዋል፣ እና z-stack mosaics እና Leica-based auto-stitching የእያንዳንዱን የነርቭ ሴል አጠቃላይ የዴንድሪቲክ ዛፍ ለመሸፈን ተካሂደዋል። ኒዩዩብ 40 በይነገጽን በመጠቀም ነርቮች ከፊል-እጅ ክትትል ተደረገላቸው እና የ SWC ፋይሎች ተፈጠሩ። ከዚያም ፋይሎቹ ወደ SimpleNeuriteTracer41 Fiji ተሰቅለዋል (ImageJ፣ ስሪት 2.1.0፤ NIH)።
የስታንፎርድ ዩኒቨርሲቲ ተቋማዊ ግምገማ ቦርድ ባፀደቀው ፕሮቶኮል መሠረት የሰው ኮርቲካል ቲሹ በመረጃ ፈቃድ የተገኘ ነው። ሁለት የሰው ልጅ የድህረ ወሊድ ቲሹ (3 እና 18 አመት እድሜ ያላቸው) ናሙናዎች የፊት ለፊት ኮርቴክስ (መካከለኛው የፊት ክፍል ጋይረስ) በ refractory የሚጥል በሽታ ቀዶ ጥገና አካል በመሆን ተገኝተዋል. ከተቆረጠ በኋላ የመከር ቲሹ በበረዶ ቀዝቃዛ NMDG-aCSF የያዙት: 92 ሚሜ NMDG, 2.5 ሚሜ KCl, 1.25 ሚሜ NaH2PO4, 30 ሚሜ NaHCO3, 20 ሚሜ HEPES, 25 ሚሜ ግሉኮስ, 2 ሚሜ thiourea, 5 mMpy3 mbate, sodium ascorvate. CaCl2 4H2O እና 10 ሚሜ MgSO4 7H2O. ከተከማቸ ሃይድሮክሎሪክ አሲድ ጋር ወደ ፒኤች 7.3-7.4 Titrate. ቲሹዎች በ 30 ደቂቃዎች ውስጥ ወደ ላቦራቶሪ ተወስደዋል እና ከላይ በተገለጸው አሰራር መሰረት የኮርኒካል ክፍሎች ተወስደዋል.
ሁሉም የእንስሳት ሂደቶች የተከናወኑት በስታንፎርድ ዩኒቨርሲቲ APLAC በተፈቀደ የእንስሳት እንክብካቤ መመሪያዎች መሰረት ነው። አይጦች (ከተተከሉ ከ140 ቀናት በላይ የሚበልጡ) በ 5% isoflurane ማደንዘዣ እና ከ1-3% isoflurane ውስጠ-ቀዶ ሕክምና ተወስደዋል። እንስሳት በስቴሪዮታክሲክ ፍሬም (ኮፕፍ) ውስጥ ተቀምጠዋል እና ቀጣይነት ያለው መለቀቅ ቡፕረኖርፊን (SR) ከቆዳ በታች ተወጉ። የራስ ቅሉ ይገለጣል, ይጸዳል እና 3-5 የአጥንት ብሎኖች ገብተዋል. t-hCO ላይ ለማነጣጠር፣ ከኤምአርአይ ምስሎች stereotaxic መጋጠሚያዎችን ፈጥረናል። በፍላጎት ቦታ ላይ የቡር ጉድጓድ ተቆፍሯል እና ፋይበር (400 µm ዲያሜትር፣ ኤንኤ 0.48፣ ዶሪክ) ከ hCO ወለል በታች 100 μm ዝቅ ብሏል እና ከራስ ቅሉ ጋር በ UV ሊታከም በሚችል የጥርስ ሲሚንቶ (ሪሊክስ) ተጣብቋል።
የፋይበር ፎቶሜትሪክ ቅጂዎች ቀደም ሲል እንደተገለፀው ተካሂደዋል42. ድንገተኛ እንቅስቃሴን ለመመዝገብ አይጦችን በንፁህ ቤት ውስጥ እንዲቀመጡ ተደርገዋል እና 400 µm ዲያሜትር ያለው የፋይበር ኦፕቲክ ፕላስተር ኬብል (ዶሪክ) ከፋይበር ኦፕቲክ የፎቶሜትሪክ መረጃ ማግኛ ስርዓት ጋር ከተተከለው የፋይበር ኦፕቲክ ገመድ ጋር ተገናኝቷል። በ10 ደቂቃ የሞተር እንቅስቃሴ ቀረጻ ወቅት፣ እንስሳቱ ጎጆውን ለመመርመር ነጻ ነበሩ። የተቀሰቀሰውን እንቅስቃሴ ለመመዝገብ አይጦች (ከተተከሉ ከ 140 ቀናት በላይ) በ 5% isoflurane እና 1-3% isoflurane ለጥገና ደንዝዘዋል። እንስሳውን በስቲሪዮታክቲክ ፍሬም (ኮፕፍ) ውስጥ ያስቀምጡ እና ከ t-hCO በተቃራኒው በኩል ያሉት ጢሙ ወደ 2 ሴ.ሜ ያህል ተቆርጦ ከፓይዞኤሌክትሪክ አንቀሳቃሽ (PI) ጋር በተገናኘ መረብ ውስጥ ያልፋል። 400 µm የፋይበር ኦፕቲክ ጠጋኝ ገመድ (ዶሪክ) ከተተከለው ፋይበር ጋር ተገናኝቶ ከመረጃ ማግኛ ስርዓቱ ጋር ተገናኝቷል። ከ t-hCO በተቃራኒው በኩል ያሉት ጢስ ማውጫዎች 50 ጊዜ (2 ሚሜ በ20 ኸርዝ፣ 2 ሰከንድ በአንድ አቀራረብ) በዘፈቀደ ጊዜ በፓይዞኤሌክትሪክ ድራይቭ በ20 ደቂቃ የቀረጻ ጊዜ ውስጥ ተገለበጡ። የመቀየሪያ ጊዜን በብጁ MATLAB ኮድ ለመቆጣጠር የ Arduino MATLAB ድጋፍ ጥቅልን ይጠቀሙ። ክስተቶች ትራንዚስተር-ትራንዚስተር ሎጂክ (TTL) ጥራዞችን በመጠቀም ከመረጃ ማግኛ ሶፍትዌር ጋር ይመሳሰላሉ።
አይጦች (ከተተከሉ ከ140 ቀናት በላይ የሚበልጡ) በ 5% isoflurane ማደንዘዣ እና ከ1-3% isoflurane ውስጠ-ቀዶ ሕክምና ተወስደዋል። እንስሳት በስቴሪዮታክሲክ ፍሬም (ኮፕፍ) ውስጥ ተቀምጠዋል እና ቡፕረኖርፊን SR እና dexamethasone ከቆዳ በታች ተወጉ። የራስ ቅሉ ይገለጣል, ይጸዳል እና 3-5 የአጥንት ብሎኖች ገብተዋል. t-hCO ላይ ለማነጣጠር፣ ከኤምአርአይ ምስሎች stereotaxic መጋጠሚያዎችን ፈጥረናል። ክብ ቅርጽ ያለው ክራንዮቶሚ (በግምት 1 ሴንቲ ሜትር የሆነ ዲያሜትር) በከፍተኛ ፍጥነት ያለው ቁፋሮ በቀጥታ በተተከለው hCO ላይ ተከናውኗል. አንዴ አጥንቱ በተቻለ መጠን ቀጭን ከሆነ፣ ነገር ግን ሙሉውን አጥንቱን ከመቆፈርዎ በፊት፣ የቀረውን ያልነካውን የፔልቪክ ዲስክን ለማስወገድ የቲ-hCO ስር ያለውን ለመለየት ሃይል ይጠቀሙ። ክራንዮቲሞሚው በንፁህ ሳላይን ተሞልቷል, እና የሽፋን መሸፈኛ እና ልዩ የጭንቅላት ፒን ከ UV-የታከመ የጥርስ ሲሚንቶ (ሬሊክስ) ጋር ተያይዟል.
ባለ ሁለት ፎቶ ምስል የተከናወነው በብሩከር ባለብዙ ፎቶ ማይክሮስኮፕ ከኒኮን LWD (×16፣ 0.8 NA) ዓላማ ጋር ነው። GCaMP6 ኢሜጂንግ በ920 nm በ1.4x ነጠላ ዜድ-አውሮፕላን ማጉላት እና 8x አማካኝ 7.5fps ተከናውኗል። አይጦች በ 5% isoflurane ማደንዘዣ ተመርተው ከ1-3% አይሶፍሉራንን ጠብቀዋል። አይጦቹ በብጁ በተሰራ የጭንቅላት እቃ ውስጥ ተቀምጠዋል እና በሌንስ ስር ተቀምጠዋል። የሞተር እንቅስቃሴ የ3 ደቂቃ የጀርባ ቀረጻ ተገኝቷል። በ20 ደቂቃ ቀረጻ 50 ፓፍ (እያንዳንዱ የዝግጅት አቀራረብ 100 ሚሴ ርዝመት ያለው) ፒኮስፕሪሰርን በመጠቀም ከ t-hCO ተቃራኒ ወዳለው ዊስክ ፓድ በዘፈቀደ ደርሰዋል። የፍንዳታ ጊዜን በብጁ MATLAB ኮድ ለመቆጣጠር የ Arduino MATLAB ድጋፍ ጥቅልን ይጠቀሙ። TTL ጥራዞችን በመጠቀም ክስተቶችን ከውሂብ ማግኛ ሶፍትዌር (PrairieView 5.5) ጋር ያመሳስሉ። ለመተንተን ምስሎቹ በፊጂ በተጀመረው የሞኮ ፕሮግራም ውስጥ የአፊን እርማትን በመጠቀም ለ xy motion ተስተካክለዋል። CNMF-E43 በመጠቀም የፍሎረሰንት ዱካዎችን ከግለሰብ ሴሎች ማውጣት። Fluorescence ለእያንዳንዱ የፍላጎት ክልል እንዲወጣ ተደርጓል፣ ወደ dF/F ኩርባዎች ተለወጠ እና ከዚያም ወደ z-scores ተለወጠ።
አይጦች (ከተተከሉ ከ140 ቀናት በላይ የሚበልጡ) በ 5% isoflurane ማደንዘዣ እና ከ1-3% isoflurane ውስጠ-ቀዶ ሕክምና ተወስደዋል። እንስሳት በስቴሪዮታክሲክ ፍሬም (ኮፕፍ) ውስጥ ተቀምጠዋል እና ቡፕረኖርፊን SR እና dexamethasone ከቆዳ በታች ተወጉ። ከ t-hCO በተቃራኒው በኩል ያለው ጢስ ማውጫ ወደ 2 ሴ.ሜ ያህል ተቆርጦ ከፓይዞኤሌክትሪክ አንቀሳቃሽ ጋር በተገናኘ መረብ ውስጥ ተዘርግቷል። የራስ ቅሉ ይገለጣል እና ይጸዳል. ከማይዝግ ብረት የተሰራ የመሬት ሽክርክሪት ከራስ ቅሉ ጋር ተያይዟል. t-hCO ላይ ለማነጣጠር፣ ከኤምአርአይ ምስሎች stereotaxic መጋጠሚያዎችን ፈጥረናል። ክብ ቅርጽ ያለው ክራንዮቶሚ (በግምት 1 ሴንቲ ሜትር የሆነ ዲያሜትር) በከፍተኛ ፍጥነት መሰርሰሪያ ከ t-hCO በላይ ያድርጉ። አንዴ አጥንቱ በተቻለ መጠን ቀጭን ከሆነ፣ ነገር ግን ሙሉውን አጥንቱን ከመቆፈርዎ በፊት፣ የቀረውን ያልነካውን የፔልቪክ ዲስክን ለማስወገድ የቲ-hCO ስር ያለውን ለመለየት ሃይል ይጠቀሙ። የግለሰብ ህዋሶች የተመዘገቡት ባለ 32-ቻናል ወይም 64-ቻናል ከፍተኛ መጠን ያለው የሲሊኮን ፕሮብስ (ካምብሪጅ ኒውሮቴክ) በመጠቀም በመሬት ዊንች ላይ የተመሰረቱ እና በRHD amplifiers (Intan) ቀድመው የተጨመሩ ናቸው። በንጽሕና ሳላይን በተሞላው ክራንዮቶሚ በኩል ኤሌክትሮዶችን ወደ ዒላማው ቦታ ለማውረድ ማኒፑላተሩን ይጠቀሙ። የመረጃ አሰባሰብ በ 30 kHz ድግግሞሽ የተከናወነው የ Open Ephys መረጃ ማግኛ ስርዓትን በመጠቀም ነው። ቀረጻው የቀጠለው ከ10 በላይ በሆኑ ቻናሎች ውስጥ በጣም የተዛመደ ምት ድንገተኛ እንቅስቃሴን ስናይ ብቻ ነው፣ ይህም ኤሌክትሮዶች በችግኝቱ ውስጥ እንደሚገኙ ይጠቁማል (ባለሁለት ፎቶ ካልሲየም ምስል መረጃ ላይ በመመስረት)። የሞተር እንቅስቃሴ የ10 ደቂቃ የጀርባ ቀረጻ ተገኝቷል። ከ t-hCO በተቃራኒው በኩል ያሉት ጢስ ማውጫዎች 50 ጊዜ (2 ሚሜ በ20 ኸርዝ፣ 2 ሰከንድ በአንድ አቀራረብ) በዘፈቀደ ጊዜ በፓይዞኤሌክትሪክ ድራይቭ በ20 ደቂቃ የቀረጻ ጊዜ ውስጥ ተገለበጡ። የMATLAB የድጋፍ ጥቅልን ለአርዱኢኖ (MATLAB 2019b) በመጠቀም የመቀየሪያ ጊዜን በብጁ MATLAB ኮድ ይቆጣጠሩ። ክስተቶችን ከመረጃ ማግኛ ሶፍትዌር ጋር ለማመሳሰል TTL ጥራዞችን ይጠቀሙ።
ለኦፕቲካል ምልክት ማድረጊያ ሙከራዎች፣ 200 µm የኦፕቲካል ፕላስተር ገመድ (ዶሪክ) ከ473 nm ሌዘር (Omicron) ጋር የተገናኘ ከ200 μm የጨረር ፋይበር በክራንዮቶሚ ላይ ከተቀመጠው ጋር ተገናኝቷል። ከዚህ በፊት ወዲያውኑ የጁፐር ኃይልን ወደ 20 ሜጋ ዋት ያስተካክሉት. በንጽሕና ሳላይን በተሞላው ክራንዮቶሚ በኩል ኤሌክትሮዶችን ወደ ዒላማው ቦታ ለማውረድ ማኒፑላተሩን ይጠቀሙ። በቀረጻው መጀመሪያ ላይ አሥር የብርሃን ጨረሮች 473 nm (ድግግሞሽ 2 Hz, የ pulse duration 10 ms) ተለቀቀ. Photosensitive ሕዋሳት በ 70% ወይም ከዚያ በላይ በሆኑ ሙከራዎች ውስጥ በ10 ms ብርሃን ውስጥ የከፍታ ምላሽን የሚያሳዩ ሕዋሳት ተብለው ተገልጸዋል።