Nature.com ကိုလာရောက်လည်ပတ်တဲ့အတွက် ကျေးဇူးတင်ပါတယ်။ သင်သည် အကန့်အသတ်ရှိသော CSS ပံ့ပိုးမှုဖြင့် ဘရောက်ဆာဗားရှင်းကို အသုံးပြုနေပါသည်။ အကောင်းဆုံးအတွေ့အကြုံအတွက်၊ အပ်ဒိတ်လုပ်ထားသောဘရောက်ဆာ (သို့မဟုတ် Internet Explorer တွင် လိုက်ဖက်ညီသောမုဒ်ကိုပိတ်ပါ) ကိုအသုံးပြုရန် ကျွန်ုပ်တို့အကြံပြုအပ်ပါသည်။ ထို့အပြင်၊ ဆက်လက်ပံ့ပိုးမှုသေချာစေရန်၊ ပုံစံများနှင့် JavaScript မပါဘဲ ဝဘ်ဆိုက်ကို ပြသပါသည်။
ဆလိုက် သုံးခုပါသော အဝိုင်းကို တစ်ပြိုင်နက် ပြသသည်။ တစ်ကြိမ်လျှင် ဆလိုက်သုံးခုကို ရွှေ့ရန် ယခင်နှင့် နောက်ခလုတ်များကို အသုံးပြုပါ သို့မဟုတ် တစ်ကြိမ်လျှင် ဆလိုက်သုံးခုကို ရွှေ့ရန် အဆုံးရှိ ဆလိုက်ခလုတ်များကို အသုံးပြုပါ။
အာရုံကြော organelles များသည် လူသားများ ဖွံ့ဖြိုးတိုးတက်မှုနှင့် ရောဂါများကို စံနမူနာပြုရန်အတွက် အလားအလာရှိသော in vitro platform ကို ကိုယ်စားပြုသည်။ သို့သော်လည်း၊ organoids များသည် vivo တွင်ရှိသော ချိတ်ဆက်မှု ကင်းမဲ့ပြီး ရင့်ကျက်မှုကို ကန့်သတ်ပြီး အပြုအမူကို ထိန်းချုပ်သည့် အခြားသော ဆားကစ်များနှင့် ပေါင်းစည်းခြင်းကို တားဆီးပေးသည်။ မွေးကင်းစကလေးများ၏ ကိုယ်လုံးတီးကြွက်များ၏ somatosensory cortex တွင် အစားထိုးစိုက်ထားသော လူ့ပင်မဆဲလ်မှရရှိသည့် ကော်တီဆီဂျင်အော်ဂဲနစ်များသည် အာရုံခံနှင့်လှုံ့ဆော်မှုဆိုင်ရာ ဆားကစ်များအတွင်း ပေါင်းစပ်ထားသည့် အရွယ်ရောက်သောဆဲလ်အမျိုးအစားများ ဖြစ်ပေါ်လာကြောင်း ကျွန်ုပ်တို့ပြသပါသည်။ MRI သည် ပင်မဆဲလ်လိုင်းများနှင့် တိရိစ္ဆာန်အများအပြားတွင် အစားထိုးကုသမှုလွန် organoid ကြီးထွားမှုကို ထုတ်ဖော်ပြသခဲ့ပြီး single-core ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုသည် corticogenesis တိုးတက်မှုနှင့် လှုပ်ရှားမှု-မူတည်သော စာသားမှတ်တမ်းပရိုဂရမ်တစ်ခု ပေါ်ပေါက်လာမှုကို ထင်ရှားစေသည်။ အမှန်စင်စစ်၊ အစားထိုးထားသော cortical neurons များသည် Timothy's syndrome ရှိလူနာများတွင် အာရုံကြောဆိုင်ရာ ချို့ယွင်းချက်များအား ရှာဖွေတွေ့ရှိနိုင်စေမည့် ၎င်းတို့၏ in vitro counterparts များထက် ပိုမိုရှုပ်ထွေးသော morphological, synaptic, နှင့် internal membrane ဂုဏ်သတ္တိများကို ပြသသည်။ ခန္ဓာဗေဒနှင့် လုပ်ဆောင်မှုဆိုင်ရာ ခြေရာခံခြင်းများသည် အစားထိုးထားသော organelles များသည် thalamocortical နှင့် corticocortical သွင်းအားစုများကို လက်ခံရရှိကြောင်း ပြသထားပြီး အာရုံကြောလှုပ်ရှားမှုများ၏ vivo မှတ်တမ်းများတွင် အဆိုပါထည့်သွင်းမှုများသည် လူသားဆဲလ်များတွင် အာရုံခံတုံ့ပြန်မှုများကို ထုတ်ပေးနိုင်သည်ဟု ညွှန်ပြထားသည်။ နောက်ဆုံးတွင်၊ Cortical organoids များသည် ကြွက်ဦးနှောက်တစ်လျှောက် axons ကို ချဲ့ထွင်ပြီး ၎င်းတို့၏ optogenetic activation သည် ဆုလာဘ်ကို ရှာဖွေသော အပြုအမူဆီသို့ ဦးတည်စေသည်။ ထို့ကြောင့် အစားထိုးစိုက်ထားသော လူ့ကော်တက်စ် အာရုံကြောများ ရင့်ကျက်ပြီး အပြုအမူကို ထိန်းချုပ်သည့် လက်ခံသူ၏ ဆားကစ်များတွင် ပါဝင်ပါသည်။ ဤချဉ်းကပ်နည်းသည် လူနာမှရရှိသောဆဲလ်များတွင် အခြားနည်းလမ်းဖြင့် ထောက်လှမ်း၍မရသော strand-level phenotypes များကို ထောက်လှမ်းရာတွင် လွယ်ကူချောမွေ့စေရန် ကျွန်ုပ်တို့ မျှော်လင့်ပါသည်။
ဖွံ့ဖြိုးဆဲ လူ့ဦးနှောက်သည် ဆဲလ်များ ကြီးထွား၊ ကွဲကွဲပြားပြား၊ ရွှေ့ပြောင်းကာ အာရုံခံအတွေ့အကြုံမှတဆင့် ပိုမိုသန့်စင်သော လုပ်ဆောင်နိုင်သော အာရုံကြောဆားကစ်များအဖြစ် ချိတ်ဆက်ပေးသည့် ထူးထူးခြားခြား ထူးထူးခြားခြား ကိုယ်တိုင်စုစည်းမှု လုပ်ငန်းစဉ်ဖြစ်သည်။ အထူးသဖြင့် ရောဂါအခြေအနေတွင် လူသားတို့၏ ဦးနှောက်ဖွံ့ဖြိုးမှုကို နားလည်ရန် အဓိကပြဿနာမှာ ဦးနှောက်တစ်ရှူးများထံသို့ ဝင်ရောက်နိုင်မှု မရှိခြင်းပင်ဖြစ်သည်။ လူ့ကော်တက်စ် organoids (hCO; human cortex စက်လုံးဟုလည်း ခေါ်သည်) အပါအဝင် ကိုယ်တိုင်ဖွဲ့စည်းထားသော organelles များသည် 2,3,4,5,6 ကို ထုတ်ပေးနိုင်သည်။ သို့သော်၊ ကန့်သတ်ချက်များသည် အာရုံကြောဆားကစ်များ ဖွံ့ဖြိုးတိုးတက်မှုနှင့် လုပ်ဆောင်မှုကို နားလည်ရန် ၎င်းတို့၏ ကျယ်ပြန့်သောအသုံးချမှုကို ကန့်သတ်ထားသည်။ အထူးသဖြင့်၊ vivo တွင်ပါရှိသော microenvironmental နှင့် sensory inputs အချို့မရှိခြင်းကြောင့် hCO ရင့်ကျက်မှုကို ကန့်သတ်ထားခြင်းရှိမရှိ မရှင်းလင်းပါ။ ထို့အပြင်၊ hCO များသည် အပြုအမူဆိုင်ရာရလဒ်များကိုထုတ်ပေးနိုင်သော ဆားကစ်များတွင် ပေါင်းစည်းမထားသောကြောင့်၊ မျိုးရိုးဗီဇဆိုင်ရာရှုပ်ထွေးပြီး အပြုအမူဆိုင်ရာ အာရုံကြောရောဂါဆိုင်ရာရောဂါများကို ပုံစံထုတ်ရာတွင် ၎င်းတို့၏အသုံးဝင်မှုမှာ လက်ရှိတွင် အကန့်အသတ်ရှိသည်။
hCO ကို နဂိုအတိုင်း အသက်ရှင်နေသော ဦးနှောက်သို့ အစားထိုးခြင်းသည် ဤကန့်သတ်ချက်များကို ကျော်လွှားနိုင်သည်။ ယခင်လေ့လာချက်များအရ ကြွက်ကော်တက်ဆီတွင် အစားထိုးထားသော အာရုံကြောများသည် ကြွက်ဆဲလ်များ 7,8,9,10,11,12 နှင့် ဆက်သွယ်၍ ရှင်သန်နိုင်ပြီး၊ ပရောဂျက်နှင့် ဆက်သွယ်နိုင်ကြောင်း ပြသထားသည်။ သို့သော်၊ ဤစမ်းသပ်မှုများကို များသောအားဖြင့် အရွယ်ရောက်ပြီးသော တိရစ္ဆာန်များတွင် ပြုလုပ်လေ့ရှိပြီး synaptic နှင့် axonal ပေါင်းစပ်မှုကို ကန့်သတ်ထားနိုင်သည်။ ဤတွင်၊ ကျွန်ုပ်တို့သည် ပလပ်စတစ်ဖွံ့ဖြိုးမှုအစောပိုင်းအဆင့်တွင် hiPS ဆဲလ်များမှရရှိသော 3D hCO ကို ခုခံအားမကောင်းတဲ့ကြွက်များ၏ မူလ somatosensory cortex (S1) သို့ အစားထိုးစိုက်ခင်းကို ဖော်ပြထားပါသည်။ အစားထိုးထားသော hCO (t-hCO) အာရုံကြောများသည် ကြီးမားသောရင့်ကျက်မှုကို ခံယူကာ အာရုံခံတုံ့ပြန်မှုများကို လှုံ့ဆော်ပေးသည့် thalamocortical နှင့် cortical-cortical သွင်းအားစုများကို လက်ခံရရှိကာ ဆုလာဘ်ရှာဖွေသောအပြုအမူကို မောင်းနှင်ရန်အတွက် ကြွက်ဦးနှောက်ထဲသို့ axonal projections များကို တိုးချဲ့ပေးသည်။ t-hCO ၏သက်တမ်းတိုးခြင်းသည် Timothy's syndrome (TS) ရှိသော လူနာများတွင် ဗို့အား-ထိခိုက်လွယ်သော L-type CaV1.2 ကယ်လစီယမ်ချန်နယ် (CACNA1C ဖြင့် ကုဒ်လုပ်ထားသော) ဗီဇပြောင်းလဲမှုများကြောင့် ဖြစ်ပေါ်လာသော ပြင်းထန်သောမျိုးရိုးဗီဇချို့ယွင်းချက်များကို ထုတ်ဖော်ပြသခဲ့သည်။
vivo ရှိ ဆားကစ်များရှိ လူ့ကော်တီကယ် အာရုံကြောများကို လေ့လာရန်အတွက်၊ ကျွန်ုပ်တို့သည် မူလအတိုင်း 3D hCO ကို S1 သို့ stereotactically အစားထိုး စိုက်ပျိုးခဲ့သည် (၃-၇ ရက် နောက်ပိုင်းတွင်) (ပုံ. 1a နှင့် ပုံ. 1a-c) ၏ ချဲ့ထွင်ထားသော ဒေတာကို S1 သို့ စိုက်ထည့်ခဲ့သည်။ ဤအချိန်တွင်၊ thalamocortical နှင့် corticocortical axonal projections များသည် ၎င်းတို့၏ S1 innervation (ref. 13) ကို မပြီးမြောက်သေးပါ။ ထို့ကြောင့်၊ ဤချဉ်းကပ်မှုသည် endogenous ဆားကစ်များပေါ်တွင်သက်ရောက်မှုအနည်းဆုံးဖြစ်အောင်နေစဉ် t-hCO ပေါင်းစပ်မှုကိုတိုးမြှင့်ရန်ဒီဇိုင်းပြုလုပ်ထားသည်။ သက်ရှိတိရိစ္ဆာန်များတွင် t-hCO ၏တည်နေရာကိုမြင်ယောင်နိုင်ရန်၊ အစားထိုးကုသမှုပြီးနောက် 2-3 လအကြာတွင် ကြွက်များ၏ T2 အလေးချိန်ရှိသော MRI ဦးနှောက်ပြန်လည်တည်ဆောက်မှုကို လုပ်ဆောင်ခဲ့သည် (ပုံ 1b နှင့် တိုးချဲ့ဒေတာ၊ ပုံ 1d)။ t-hCO ကို အလွယ်တကူ သတိပြုမိကြပြီး t-hCO ၏ ထုထည် အတိုင်းအတာသည် ပုံသေချပ်များမှ တွက်ချက်ထားသော အမျိုးအစားများနှင့် ဆင်တူသည် (Extended Data Fig. 1d,e; P > 0.05)။ t-hCO ကို အလွယ်တကူ သတိပြုမိကြပြီး t-hCO ၏ ထုထည် အတိုင်းအတာသည် ပုံသေချပ်များမှ တွက်ချက်ထားသော အမျိုးအစားများနှင့် ဆင်တူသည် (Extended Data Fig. 1d,e; P > 0.05)။ t-hCO легко наблюдались, а объемные измерения t-hCO были аналогичны рассчитанным для фиксированшных рсе данные, рис 1d, e; P> 0,05)။ t-hCO ကို အလွယ်တကူ လေ့လာတွေ့ရှိနိုင်ပြီး volumetric t-hCO တိုင်းတာမှုများသည် ပုံသေအပိုင်းများအတွက် တွက်ချက်ထားသည့် ပုံစံများနှင့် ဆင်တူသည် (တိုးချဲ့ဒေတာ၊ ပုံ 1d၊ e; P > 0.05)။很内易观察到t-hCO，并且t-hCO的体积测量值与从固定切片计算的测量值相似（找屰算的测量值相伕၀.၀၅)။很内易观察到t-hCO၊ 并且t-hCO t-hCO легко наблюдался, а объемные измерения t-hCO были аналогичны рассчитанным для фиксированновых срасчитанным данные, рис 1d, e; P> 0,05)။ t-hCO သည် အလွယ်တကူ လေ့လာတွေ့ရှိနိုင်ပြီး volumetric t-hCO တိုင်းတာမှုများသည် ပုံသေအပိုင်းများအတွက် တွက်ချက်ထားသည့် ပုံစံများနှင့် ဆင်တူသည် (တိုးချဲ့ဒေတာ၊ ပုံ 1d၊ e; P > 0.05)။အစားထိုးစိုက်ပျိုးပြီးနောက် 2 လခန့်အကြာ ခန့်မှန်းခြေအားဖြင့် အစားထိုးထားသောတိရစ္ဆာန်များ၏ 81% တွင် t-hCO ကိုကျွန်ုပ်တို့သတ်မှတ်ခဲ့သည် (n = 72 တိရိစ္ဆာန်များ; hiPS ဆဲလ် 10 လိုင်းမှ hCO; နောက်ဆက်တွဲဇယား 1 တွင် hiPS ဆဲလ်လိုင်းများ) ကို ကျွန်ုပ်တို့သတ်မှတ်ခဲ့သည်။ ယင်းတို့အနက် 87% သည် cerebral cortex (ပုံ 1c) တွင်တည်ရှိသည်။ အစားထိုးထားသော ကြွက်တစ်ခုတည်းတွင် အကြိမ်ပေါင်းများစွာ အမှတ်စဉ် MRI စကင်န်များကို လုပ်ဆောင်ခြင်းဖြင့် 3 လအတွင်း t-hCO ပမာဏ ကိုးဆတိုးလာသည် (ပုံ 1d ​​နှင့် တိုးချဲ့ဒေတာ၊ ပုံ 1f)။ အစားထိုးစိုက်ထားသောတိရစ္ဆာန်များသည် 12 လကြာ အစားထိုးပြီးနောက် ရှင်သန်မှုနှုန်း (74%) တွင် မြင့်မားသောရှင်သန်မှုနှုန်း (74%) တွင် (ချဲ့ထွင်ထားသောဒေတာ၊ ပုံ 1g နှင့် နောက်ဆက်တွဲဇယား 2) တွင် မော်တာ သို့မဟုတ် မှတ်ဉာဏ်ချို့ယွင်းမှု၊ gliosis သို့မဟုတ် electroencephalogram (EEG) မတွေ့ပါ။ ဒေတာပုံ။ 1g နှင့် နောက်ဆက်တွဲဇယား 2)။ 1 နာရီ-m နှင့် 3e)။
a၊ စမ်းသပ်မှုပုံစံ ဇယား။ hiPS ဆဲလ်များမှရရှိသော hCO ကို ကွဲပြားခြင်း၏ ရက် 30-60 တွင် မွေးကင်းစ ကိုယ်တုံးလုံးကြွက်များ၏ S1 သို့ အစားထိုးခဲ့သည်။ b၊ အစားထိုးကုသမှုပြီးနောက် 2 လအကြာ S1 တွင် t-hCO ကိုပြသသော T2-အလေးချိန်ရှိသော coronal နှင့် အလျားလိုက် MRI ပုံများ။ စကေးဘား၊ 2 မီလီမီတာ။ c၊ hiPS ဆဲလ်လိုင်းတစ်ခုစီအတွက် ပြသထားသော အောင်မြင်မှုနှုန်းအရေအတွက် (n = 108၊ ဘားများအတွင်းရှိ နံပါတ်များသည် hIPS ဆဲလ်လိုင်းတစ်ခုလျှင် t-hCO ပမာဏကိုဖော်ပြသည်) နှင့် cortical သို့မဟုတ် subcortical တည်နေရာ (n = 88)။ ဃ၊ သွေးကြောဆိုင်ရာသွေးလွှတ်ကြောတစ်ခု၏ MRI ပုံ (ဘယ်ဘက်၊ စကေးဘား၊ 3 မီလီမီတာ) နှင့် သက်ဆိုင်ရာ 3D ထုထည်ပြန်လည်တည်ဆောက်မှု (စကေးဘား၊ 3 မီလီမီတာ) သည် 3 လကျော်တွင် t-hCO တိုးလာကြောင်းပြသသည်။ e၊ ကြွက်ဦးနှောက်တွင်းရှိ t-hCO ပုံစံများကို ပြန်လည်သုံးသပ်ခြင်း။ စကေးဘား၊ 1 မီလီမီတာ။ f၊ အပေါ်ဘယ်မှညာသို့ပြသထားသည့် t-hCO ၏ကိုယ်ခံစွမ်းအားဆိုင်ရာ ဓာတုဓာတ်ပြုပုံများ (ကွဲပြားမှုအတွင်း)- PPP1R17 (အသက် 4 လ), NeuN (8 လသားအရွယ်), SOX9 နှင့် GFAP (8 လအရွယ်), PDGFRα; (8 လ)၊ MAP2 (8 လ) နှင့် IBA1 (8 လ)။ စကေးဘား၊ 20 µm။ HNA ၏ ပူးတွဲဖော်ပြချက်သည် လူ့ဇာတိဆဲလ်များကို ဖော်ပြသည်။ g၊ snRNA-seq- Seurat ပေါင်းစပ်ပြီးနောက် အရည်အသွေးမြင့် t-hCO နူကလီးယပ်အားလုံး၏ ပေါင်းစည်းထားသော အ manifold နှင့် projection (UMAP) အတိုင်းအတာ လျှော့ချရေးပုံရိပ်ဖော်ခြင်း (n=3 t-hCO နမူနာများ၊ n=2 hiPS ဆဲလ်လိုင်းများ)။ Astrocytes၊ astrocyte လိုင်း၏ဆဲလ်များ၊ cyc prog, ပျံ့နှံ့နေသော progenitors; GluN DL၊ နက်နဲသော glutamatergic အာရုံကြောများ၊ GluN DL/SP၊ နက်နဲပြီး sublamellar glutamatergic neurons၊ GluN UL, အပေါ်အလွှာ glutamatergic အာရုံကြောများ; oligodendrocytes၊ oligodendrocytes၊ OPC၊ oligodendrocyte progenitor ဆဲလ်များ၊ RELN၊ ရီလင် အာရုံကြောများ။ h၊ Gene Ontology (GO) ဝေါဟာရ ကြွယ်ဝမှု ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှု သည် t-hCO glutamatergic neurons နှင့် နှိုင်းယှဉ်ထားသော hCO glutamatergic neurons နှင့် နှိုင်းယှဉ်ထားသော (ချိန်ညှိထားသော P < 0.05၊ ခေါက်ပြောင်းလဲမှု > 2၊ ခေါက်ပြောင်းလဲမှု > 2၊ ဗီဇ၏ ကြွယ်ဝမှုကို ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာခြင်း)။ h၊ Gene Ontology (GO) ဝေါဟာရ ကြွယ်ဝမှု ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှု သည် t-hCO glutamatergic neurons နှင့် နှိုင်းယှဉ်ထားသော hCO glutamatergic neurons နှင့် နှိုင်းယှဉ်ထားသော (ချိန်ညှိထားသော P < 0.05၊ ခေါက်ပြောင်းလဲမှု > 2၊ ခေါက်ပြောင်းလဲမှု > 2၊ ဗီဇ၏ ကြွယ်ဝမှုကို ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာခြင်း)။ h, Анализ обогащения терминов Gene Ontology (GO) для генов со значительной активацией (скорректированный P <0,05, скорректированный P <0,05, 2, экспрессия по крайней мере в 10% ядер) в глутаматергических нейронах t-hCO по сравнению с глусагм нейронами hCO။ h၊ သိသာထင်ရှားသောတက်ကြွမှုရှိသော မျိုးဗီဇများအတွက် Gene Ontology (GO) ဝေါဟာရ ကြွယ်ဝမှု ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှု (ချိန်ညှိထားသော P<0.05၊ ခေါက်ပြောင်းလဲမှု >2၊ t-hCO glutamatergic neurons ရှိ t-hCO glutamatergic neurons နှင့် နှိုင်းယှဉ်ထားသော ဖော်ပြမှု။ h，与hCO 谷氨酸能神经元相比，t-hCO 谷氨酸能神经元中基因显着上调（调整后P<倘> 0.00> 2，在至少10%的细胞核中表达）的基因本体论(GO) 术语富集分析။ h，与 hco 谷氨酸能元相比，t-hco 谷氨酸能神经元基因显着上调（后变匎5> 0. 2 ，至少 10%的核中表达）基因基因基因的的的的的的的的的的的的的的的的的的的的的的的的的的的本体论(這子朆舆的本体论(限子)。 h, гены значительно активизировались (скорректированный P <0,05, кратность изменения> 2, экспрессируе т 10% ядер) в глутаматергических нейронах t-hCO по сравнению с глутаматергическими (нейронами hCO гинтолол) термина обогащения။ h၊ မျိုးဗီဇများကို သိသာထင်ရှားစွာ ထိန်းညှိပေးသည် (ချိန်ညှိထားသော P < 0.05၊ ခေါက်ပြောင်းလဲမှု > 2၊ အနည်းဆုံး နူကလိယ၏ 10% တွင် ဖော်ပြသည်) t-hCO glutamatergic neurons တွင် hCO glutamatergic neurons Ontological (GO) ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှု၏ ကြွယ်ဝမှုဝေါဟာရကို ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာခြင်း။အစက်ချမျဉ်းသည် aq တန်ဖိုး 0.05 ကိုဖော်ပြသည်။ i၊ အညွှန်း 22 snRNA-seq အရွယ်ရောက်ပြီးသူ မော်တာကော်တက်စ်ဒေတာအတွဲမှ အညွှန်းလွှဲပြောင်းခြင်းကို အသုံးပြု၍ t-hCO ရှိ GluN ဆဲလ်အမျိုးအစားများ၏ UMAP ပုံရိပ်ဖော်ခြင်း။ CT — corticothalamic ဆဲလ်များ၊ ET — ဦးနှောက်ပြင်ပဆဲလ်များ၊ IT — အတွင်းပိုင်းတယ်လီစဖလစ်ဆဲလ်များ၊ NP — ပရိုဂရမ်အနီး။
ထို့နောက် ကျွန်ုပ်တို့သည် t-hCO ၏ cytoarchitecture နှင့် အလုံးစုံဆဲလ်လူလာဖွဲ့စည်းမှုကို အကဲဖြတ်ခဲ့ပါသည်။ ကြွက် endothelial ဆဲလ်များ၏ ပဋိပစ္စည်း စွန်းထင်းမှုသည် t-hCO ဖြင့် သွေးကြောချဲ့ခြင်းကို ထင်ရှားစေပြီး၊ IBA1 မှ ရောင်ခြယ်မှုတွင် ကြွက် microglia ပါဝင်မှုကို ပြသသည် (ပုံ 1f နှင့် တိုးချဲ့ဒေတာ၊ ပုံ 3c,d)။ Immunostaining သည် PPP1R17 (cortical progenitors)၊ NeuN (နျူရွန်)၊ SOX9 နှင့် GFAP (glial-derived cells) သို့မဟုတ် PDGFRα (oligodendrocyte progenitors) (ပုံ 1f) တို့ကို ပူးတွဲဖော်ပြသည့် လူသားနျူကလီးယား အန်တီဂျင် (HNA) အပြုသဘောဆောင်သည့်ဆဲလ်များကို ခုခံကာကွယ်ခြင်းမှ ထင်ရှားစေသည်။ ဆဲလ်တစ်ခုတည်း ကြည်လင်ပြတ်သားမှုတွင် t-hCO ၏ ဆယ်လူလာဖွဲ့စည်းမှုကို လေ့လာရန်၊ ကျွန်ုပ်တို့သည် ကွဲပြားမှုကို 8 လခန့်အကြာတွင် single-core RNA စီစီကိန်း (snRNA-seq) လုပ်ဆောင်ခဲ့သည်။ အစုလိုက်အပြုံလိုက် စစ်ထုတ်ခြင်းနှင့် ကြွက်နျူကလိယကို ဖယ်ရှားခြင်းသည် အရည်အသွေးမြင့် လူသားမိုနိုနျူကလီးယားမြေပုံ 21,500 ကို ထုတ်ပေးသည် (ပုံ။ 1g နှင့် တိုးချဲ့ဒေတာ၊ ပုံ 4a၊b)။ ပုံမှန်ဆဲလ်အမျိုးအစား အမှတ်အသားများ၏ ဖော်ပြမှုပုံစံများသည် နက်နဲပြီး အပေါ်ယံ glutamatergic neurons၊ ပျံ့နှံ့နေသော progenitors၊ oligodendrocytes နှင့် astrocyte မျိုးရိုး (ပုံ 1g၊ တိုးချဲ့ဒေတာ၊ ပုံ 4c၊ နှင့် နောက်ဆက်တွဲဇယား 3) အပါအဝင် အဓိက cortical cell အတန်းများကို ခွဲခြားသတ်မှတ်ထားပါသည်။ SATB2 နှင့် CTIP2 အတွက် immunostaining သည် Cortical အမျိုးအစားခွဲများရှိနေသော်လည်း t-hCO သည် ထင်ရှားသော ခန္ဓာဗေဒဆိုင်ရာ အမျိုးအစားခွဲခြင်းအား မပြသခဲ့သည် (တိုးချဲ့ဒေတာ၊ ပုံ 3a)။ အဆင့်-လိုက်ဖက်သော snRNA-seq hCO သည် oligodendrocytes မရှိခြင်းနှင့် GABAergic neurons များပါဝင်ခြင်းအပါအဝင် ခြွင်းချက်အနည်းငယ်ဖြင့် ကျယ်ကျယ်ပြန့်ပြန့်ဆင်တူသောဆဲလ်အတန်းအစားများကို ထုတ်ပေးသည် ကွဲပြားသော ဗီဇဖော်ပြမှု ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုတွင် t-hCO နှင့် hCO (နောက်ဆက်တွဲဇယား 5) အကြား glutamatergic အာရုံကြောများတွင် သိသာထင်ရှားသော ကွာခြားချက်များကို ဖော်ထုတ်တွေ့ရှိခဲ့သည်)၊ အာရုံကြောဆိုင်ရာ ရင့်ကျက်မှုနှင့် ဆက်နွယ်နေသော ဗီဇအစုံများဖြစ်သည့် synaptic အချက်ပြခြင်း၊ dendritic နယ်မြေသတ်မှတ်ခြင်း နှင့် ဗို့အားများသော ချန်နယ်လှုပ်ရှားမှုများ (ပုံ 1h နှင့် နောက်ဆက်တွဲဇယား 5)။ ဇယား ၆)။ ထို့ကြောင့်၊ cortical glutamargic t-hCO အာရုံကြောများ သည် အရှိန်မြှင့် ကူးယူဖော်ပြမှု ရင့်ကျက်မှုကို ပြသသည်။
t-hCO တွင် ဤစာသားပြောင်းခြင်းပြောင်းလဲမှုများသည် vivo ရှိ hCO in vitro နှင့် t-hCO အကြား morphological ခြားနားချက်များနှင့် ဆက်စပ်မှုရှိမရှိ ရှင်းလင်းရန်အတွက် ကျွန်ုပ်တို့သည် 7-8 လကြာ ကွဲပြားပြီးနောက် ပြင်းထန်သောအပိုင်းများတွင် အဆင့်-လိုက်ဖက်သော biocytin-filled hCO နှင့် hCO ကို ပြန်လည်တည်ဆောက်ခဲ့သည်။ hCO အာရုံကြောများ (ပုံ။ 2a)။ t-hCO နျူရွန်များသည် သိသိသာသာ ပိုကြီးသည်၊ ဆိုမာအချင်း 1.5 ဆ၊ ဒန်းဒရိုက်များ နှစ်ဆပိုများပြီး in vitro hCO (ပုံ 2b) နှင့် နှိုင်းယှဉ်ပါက စုစုပေါင်း dendritic အရှည် ခြောက်ဆတိုးလာသည်။ ထို့အပြင်၊ hCO နူရွန်များထက် t-hCO နူရိုရွန်များတွင် dendritic ကျောရိုးများ၏ သိပ်သည်းဆ သိသိသာသာ မြင့်မားသည်ကို ကျွန်ုပ်တို့ တွေ့ရှိခဲ့သည်။ t-hCO နျူရွန်များသည် ဆဲလ်များဆက်လက်ပေါက်ပွားမှုနှင့် ပေါင်းစပ်၍ ကျယ်ပြန့်သော dendritic elongation နှင့် အကိုင်းအခက်များကို ခံယူပြီး အစားထိုးကုသမှုပြီးနောက် t-hCO ၏ အကြိတ်အနယ်ကြီးထွားမှုကို အထောက်အကူဖြစ်စေနိုင်သည် (ပုံ။ 1d နှင့် တိုးချဲ့ထားသောဒေတာပုံ။ 1f)။ ယင်းက ကျွန်ုပ်တို့အား အီလက်ထရောနစ်ဇီဝကမ္မဆိုင်ရာ ဂုဏ်သတ္တိများကို စုံစမ်းရန် လှုံ့ဆော်ခဲ့သည်။ Membrane capacitance သည် ရှစ်ဆပိုမိုမြင့်မားသည် (ချဲ့ထွင်ထားသောဒေတာ၊ ပုံ 8d)၊ ငြိမ်နေသောအမြှေးပါးအလားအလာသည် ပိုမိုမြင့်မားလာသည် (ခန့်မှန်းခြေအားဖြင့် 20 mV) နှင့် လက်ရှိဆေးထိုးခြင်းသည် hCO နျူရွန်များထက် t-hCO နျူရွန်များထက် ပိုမိုမြင့်မားသော အမြင့်ဆုံးစိတ်လှုပ်ရှားမှုနှုန်းကို ဖြစ်ပေါ်စေသည်။ in vitro (ပုံ။ 2d)၊ e) t-hCO ၏ ကြီးမားပြီး ပိုမိုရှုပ်ထွေးသော အသွင်အပြင်များနှင့် ကိုက်ညီသော၊ ထို့အပြင်၊ t-hCO အာရုံကြောများ (ပုံ 2f) တွင် spontaneous excitatory postsynaptic current events (EPSC) ၏ အကြိမ်ရေသည် t-hCO အာရုံကြောများ (ပုံ. 2f) တွင် သိသာထင်ရှားစွာ မြင့်မားနေပါသည်။ လိင်ပိုင်းဆိုင်ရာ synapse ။ glutamatergic neurons (ချဲ့ထွင်ထားသောဒေတာ၊ ပုံ 6a-c) ကိုမှတ်တမ်းတင်ခြင်းဖြင့် vitro in vitro အတွင်းရှိ hCO အာရုံကြောများ၏ မရင့်ကျက်သောဇာတ်ကောင်ကို ကျွန်ုပ်တို့ အတည်ပြုပါသည်။
a၊ ကွဲပြားမှု 8 လကြာပြီးနောက် biocytin-filled hCO နှင့် t-hCO အာရုံကြောများကို 3D ပြန်လည်တည်ဆောက်ခြင်း။ b၊ ပုံသဏ္ဍာန်အင်္ဂါရပ်များ အရေအတွက် (n = 8 hCO အာရုံကြောများ၊ n = 6 t-hCO နူရွန်များ; **P = 0.0084၊ *P = 0.0179 နှင့် ***P < 0.0001)။ b၊ ပုံသဏ္ဍာန်အင်္ဂါရပ်များ အရေအတွက် (n = 8 hCO အာရုံကြောများ၊ n = 6 t-hCO နူရွန်များ; **P = 0.0084၊ *P = 0.0179 နှင့် ***P < 0.0001)။ б, количественная оценка морфологических признаков (n = 8 нейронов hCO, n = 6 нейронов t-hCO; ** P = 0,0084,0 *** 10) P = 0,0084,0 * 10. b၊ ရုပ်ပိုင်းဆိုင်ရာအင်္ဂါရပ်များ (n=8 hCO အာရုံကြောများ၊ n=6 t-hCO နူရွန်များ; **P=0.0084၊ *P=0.0179၊ နှင့် ***P<0.0001)။ b，形态学特征的量化（n = 8 个hCO神经元，n = 6 个t-hCO神经元；**P = 0.0084，*P = 0.0179 < 0.0179 ）။ b，形态学特征的量化（n = 8 个hCO神经元，n = 6 个t-hCO神经元；**P = 0.0084，*P = 0.0179 < 0.0179 ）။ б, количественная оценка морфологических признаков (n = 8 нейронов hCO, n = 6 нейронов t-hCO; ** P = 0,0084,0 *** 10) P = 0,0084,0 * 10. b၊ ရုပ်ပိုင်းဆိုင်ရာအင်္ဂါရပ်များ (n=8 hCO အာရုံကြောများ၊ n=6 t-hCO နူရွန်များ; **P=0.0084၊ *P=0.0179၊ နှင့် ***P<0.0001)။c၊ 8 လ ကွဲပြားပြီးနောက် hCO နှင့် t-hCO dendritic အကိုင်းအခက်များကို 3D ပြန်လည်တည်ဆောက်ခြင်း။ အနီရောင် ကြယ်ပွင့်များသည် putative dendritic ကျောရိုးများကို ညွှန်ပြသည်။ Dendritic ကျောရိုးသိပ်သည်းဆပမာဏ (n = 8 hCO နျူရွန်၊ n = 6 t-hCO နူရွန်များ; ** P = 0.0092)။ ဃ၊ အနားယူအမြှေးပါးအလားအလာ (n = 25 hCO နူရွန်၊ n = 16 t-hCO နူရွန်များ; ***P < 0.0001)။ ဃ၊ အနားယူအမြှေးပါးအလားအလာ (n = 25 hCO နူရွန်၊ n = 16 t-hCO နူရွန်များ; ***P < 0.0001)။ d, количественная оценка мембранного потенциала покоя (n = 25 нейронов hCO, n = 16 нейронов t-hCO; *** P <0,001)။ d၊ အနားယူအမြှေးပါး အလားအလာ ပမာဏ (n = 25 hCO အာရုံကြောများ၊ n = 16 t-hCO နူရွန်များ; ***P < 0.0001)။ d，静息膜电位的量化(n = 25 hCO 神经元，n = 16 t-hCO 神经元；***P < 0.0001)။ d，静息膜电位的量化(n = 25 hCO 神经元，n = 16 t-hCO 神经元；***P < 0.0001)။ d, количественная оценка мембранного потенциала покоя (n = 25 нейронов hCO, n = 16 нейронов t-hCO; *** P <0,001)။ d၊ အနားယူအမြှေးပါး အလားအလာ ပမာဏ (n = 25 hCO အာရုံကြောများ၊ n = 16 t-hCO နူရွန်များ; ***P < 0.0001)။ e၊ လက်ရှိထိုးသွင်းမှုများ တိုးမြှင့်ခြင်းဖြင့် လှုံ့ဆော်ပေးသော hCO နှင့် t-hCO တွင် ထပ်တလဲလဲ ပစ်ခတ်နိုင်သည့် အလားအလာ၊ အမြင့်ဆုံး ပစ်ခတ်မှုနှုန်း (n = 25 hCO နျူရွန်၊ n = 16 t-hCO နူရွန်၊ ***P < 0.0001)။ e၊ လက်ရှိထိုးသွင်းမှုများ တိုးမြှင့်ခြင်းဖြင့် လှုံ့ဆော်ပေးသော hCO နှင့် t-hCO တွင် ထပ်တလဲလဲ ပစ်ခတ်နိုင်သည့် အလားအလာ၊ အမြင့်ဆုံး ပစ်ခတ်မှုနှုန်း (n = 25 hCO နျူရွန်၊ n = 16 t-hCO နူရွန်၊ ***P < 0.0001)။ e, повторное возбуждение потенциала действия в hCO နှင့် t-hCO, вызванное увеличением тока, и количнокамтвенная скорости возбуждения (n = 25 нейронов hCO, n = 16 нейронов t-hCO; *** P <0,0001)။ e၊ အမြင့်ဆုံးပစ်ခတ်မှုနှုန်း (n = 25 hCO နျူရွန်၊ n = 16 t-hCO နျူရွန်; *** P < 0.0001) ဖြင့် လှုံ့ဆော်ပေးသော hCO နှင့် t-hCO တွင် ပြန်လည်ပစ်ခတ်နိုင်သည့် အလားအလာ။ e，通过增加电流注入诱导的hCO 和t-hCO 重复动作电位放电，以及最大放电率的量化5 (n =神经元，n = 16个t-hCO神经元；***P < 0.0001)။ E ，通过增加电流注入的的 hco 和 t-hco 重复电位放电，以及最大的量化（n = h 25 神 6个 t-hco 神经； ***p <0.0001). e, повторяющееся возбуждение потенциала действия hCO и t-hCO, вызванное увеличением подачи тоненеч, и колием максимальной скорости возбуждения (n = 25 нейронов hCO, n = 16 нейронов t-hCO; *** P <0,0001)။ e၊ တိုးမြှင့်ထားသော လက်ရှိထောက်ပံ့မှုနှင့် အမြင့်ဆုံးပစ်ခတ်မှုနှုန်း၏ အရေအတွက် (n = 25 hCO နျူရွန်၊ n = 16 t-hCO နျူရွန်၊ *** P < 0.0001) ဖြင့် လှုံ့ဆော်ပေးသော hCO နှင့် t-hCO လုပ်ဆောင်ချက်အလားအလာများကို ထပ်ခါတလဲလဲ ပစ်ခတ်ခြင်း။ f၊ ကွဲပြားသော 8 လကြာတွင် hCO နှင့် t-hCO နျူရွန်များတွင် အလိုအလျောက် EPSCs (sEPSCs) နှင့် synaptic ဖြစ်ရပ်များ၏ အကြိမ်ရေ (n = 25 hCO နူရွန်၊ n = 17 t-hCO နူရွန်များ; ***P < 0.0001)။ f၊ ကွဲပြားသော 8 လကြာတွင် hCO နှင့် t-hCO နျူရွန်များတွင် spontaneous EPSCs (sEPSCs) နှင့် synaptic ဖြစ်ရပ်များ၏ အကြိမ်ရေ (n = 25 hCO နူရွန်၊ n = 17 t-hCO နူရွန်များ; ***P < 0.0001) ။ f, спонтанные EPSC (sEPSC) в нейронах hCO и t-hCO через 8 месяцев дифференцировки и количественная оцичена оциченка событий (n = 25 нейронов hCO, n = 17 нейронов t-hCO; *** P <0,0001)။ f၊ Synaptic event rates (n=25 hCO neurons၊ n=17 t-hCO နူရွန်များ; ***P<0.0001) f၊ 8 လကြာ ကွဲပြားခြင်းနှင့် ပမာဏခွဲခြားခြင်းတွင် hCO နှင့် t-hCO နျူရွန်များတွင် အလိုအလျောက် EPSCs (sEPSCs) များ။ f，分化8 个月时hCO和t-hCO 神经元中的自发性EPSCs (sEPSCs)，以及突触事件频率的量化 7 hCO (n = 2) t-hCO 神经元；***P < 0.0001)။ f，分化8个月时hCO和t-hCO神经元中的自发性EPSCs (sEPSCs)，以及突触事件频率的量匼的 2率的量匼。 = 25 hCO 神率的量匼（n = 25hCO P < 0.0001）။ f, спонтанные EPSC (sEPSC) в нейронах hCO и t-hCO через 8 месяцев дифференцировки и количественная оцичена оциченка событий (n = 25 нейронов hCO, n = 17 нейронов t-hCO; *** P <0,0001)။ f၊ Synaptic event rates များကို 8 လကြာ ကွဲပြားခြင်းနှင့် ပမာဏခွဲခြားခြင်းတွင် hCO နှင့် t-hCO နျူရွန်များတွင် အလိုအလျောက် EPSCs (sEPSCs) များ (n = 25 hCO နျူရွန်၊ n = 17 t-hCO နူရွန်များ; *** P<0.0001)။bf အတွက်၊ မျဉ်း 1208-2 ရှိ hCO နှင့် t-hCO ကို မျဉ်းပြိုင်တွင် ထိန်းသိမ်းထားသည့် တူညီသောကွဲပြားမှုအသုတ်မှ ထုတ်ယူခဲ့သည်။ g၊ Gene set enrichment analysis (တစ်ဖက်သတ် Fisher ၏ အတိအကျ စမ်းသပ်မှု) သည် ဗီဇများကို သိသာထင်ရှားစွာ ထိန်းညှိထားသော (ချိန်ညှိထားသော P < 0.05၊ ခေါက်ပြောင်းလဲမှု > 2၊ အနည်းဆုံး နူကလိယ၏ 10% တွင် ဖော်ပြသည်) t-hCO glutamatergic neurons နှင့် နှိုင်းယှဉ်ပါက hCO glutamatergic neurons (အစောပိုင်း ER-sets နှင့် ER-respons နှစ်ခုလုံးပါရှိသော) Glutamatergic neurons (Glutamatergic အာရုံကြောများ) (LRG) in vivo mouse study16 နှင့် in vitro neurons17 မှ လူသားသီးသန့် LRGs တို့မှ ဖော်ထုတ်ထားသော လှုပ်ရှားမှု-မှီခိုမျိုးဗီဇများ။ g၊ Gene set enrichment analysis (တစ်ဖက်သတ် Fisher ၏ အတိအကျ စမ်းသပ်မှု) သည် ဗီဇများကို သိသာထင်ရှားစွာ ထိန်းညှိထားသော (ချိန်ညှိထားသော P < 0.05၊ ခေါက်ပြောင်းလဲမှု > 2၊ အနည်းဆုံး နူကလိယ၏ 10% တွင် ဖော်ပြသည်) t-hCO glutamatergic neurons နှင့် နှိုင်းယှဉ်ပါက hCO glutamatergic neurons (အစောပိုင်း ER-sets နှင့် ER-respons နှစ်ခုလုံးပါရှိသော) Glutamatergic neurons (Glutamatergic အာရုံကြောများ) (LRG) in vivo mouse study16 နှင့် in vitro neurons17 မှ လူသားသီးသန့် LRGs တို့မှ ဖော်ထုတ်ထားသော လှုပ်ရှားမှု-မှီခိုမျိုးဗီဇများ။ g, анализ обогащения набора генов (односторонний точный критерий Фишера) генов со значительной активсцией активсцией <0.05, кратность изменения > 2, экспрессия по меньшей мере в 10% ядер) в глутаматергических нейрона хнейрона глутаматергическими нейронами hCO наборы генов как раннего (ERG), так и позднего (LRG) генов, зависяктих, от асяктих идентифицированных в исследовании на мышах in vivo16, и специфических для человека LRG из нейронов in vitro17။ g၊ သိသာထင်ရှားသော အသက်ဝင်မှုရှိသော ဗီဇများ (ချိန်ညှိထားသော P<0.05၊ ခေါက်ပြောင်းလဲမှု >2၊ t-hCO glutamatergic neurons) တွင် t-hCO glutamatergic neurons နှင့် နှိုင်းယှဉ်ထားသော genes (ERde) glutamatergic neurons နှင့် နှိုင်းယှဉ်ထားသော g၊ g၊ gene set enrichment ကိုခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာခြင်း (one-tailed Fisher's exact test) vivo ကြွက် 16 တွင် နှင့် vitro17 ရှိ နျူရွန်များမှ လူသားသီးသန့် LRG များကို ဖော်ထုတ်ထားသည်။ g，t-hCO谷氨酸能神经元与hCO谷氨酸能神经元相比，t -hCO谷氨酸能神经元显着上调（调整后P<0.05，倍数变化>2，在至少10%的细胞核中表达）的基因集富集分析（单侧F isher精确检验）从体内小鼠研究中鉴定的早期反应(ERG)和晚期反应(LRG) 活性依赖性基因的基因组16 和体外神经元17 中的人类特异性LRG။ g ，t-hco 谷氨酸神经元与 hco 谷氨酸神经元相比，t-hco 谷氨酸神经元< 上05 p倍数> 2 ，至少至少 10%的细胞 核中表达）的集富集分析（单侧 တံငါသည်精确）的集富集分析（单侧 တံငါ精确） 中頼内尓的精确）早期反应反应反应和晚期反应反应 (lrg) 活性基因的基因组 16 和神廏中 17 中 17的人类特异性LRG။ g, глутаматергические нейроны t-hCO были значительно активизированы по сравнению с глутаоматергический (скорректированный P<0,05, кратность изменения> 2, не менее 10% Анализ обогащения набора генов (односйт онетй Фишера) раннего ответа (ERG) и позднего гены, зависящие от активности ответа (LRG), идентифицихроввансниле in vivo16 နှင့် vitro17 တွင် LRG၊ специфичные для человека။ g၊ t-hCO glutamatergic neurons များသည် hCO glutamatergic neurons (ချိန်ညှိထားသော P<0.05၊ ခေါက်ပြောင်းလဲမှု >2၊ အနည်းဆုံး 10% အစောပိုင်းတုံ့ပြန်မှု (ERG) နှင့် နောက်ကျသောတုံ့ပြန်မှုမျိုးဗီဇကြွယ်ဝမှု ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှု (one-tailed Fisher's အတိအကျစမ်းသပ်မှု) တုံ့ပြန်မှုလုပ်ဆောင်မှု ဗီဇများတွင် အကျုံးဝင်သော mRG 6) နှင့် ဗီဇများတွင် ပျက်ပြယ်သည် (L vitro neurons.17 လူ့ သီးခြား LRG များ။အစက်ချမျဉ်းသည် Bonferroni-ပြင်ဆင်ထားသော P တန်ဖိုး 0.05 ကိုညွှန်ပြသည်။ h၊ GluN ဗီဇဖော်ပြချက် (ဗီဇတစ်ခုစီ၏ pseudo-package နှင့် scaling) ကို t-hCO glutamatergic neurons ရှိ snRNA-seq ၏ LRG ဗီဇပုံတူများတွင် သိသာထင်ရှားစွာ ထိန်းညှိထားသည်။ i၊ t-hCO (အပေါ်ပိုင်း) နှင့် hCO (အောက်) အာရုံကြောများတွင် SCG2 ဖော်ပြချက်ကိုပြသသော immunostaining။ အဖြူရောင်မြှားများသည် SCG2+ ဆဲလ်များကို ညွှန်ပြသည်။ စကေးဘား၊ 25 µm။ ဒေတာကို ပျမ်းမျှ±စံသွေဖည်မှုအဖြစ် ဖော်ပြသည်။
ex vivo အချပ်များတွင် တွေ့ရှိရသော t-hCO ၏ တိုးမြင့်လာမှုအပေါ် အခြေခံ၍ snRNA-seq သည် hCO in vitro နှင့် နှိုင်းယှဉ်ပါက t-hCO တွင် gene transcripts များ၏ လှုပ်ရှားမှု-မှီခိုမှုဆိုင်ရာ စည်းမျဉ်းများကို ဖော်ပြခဲ့သည်။ Glutamatergic t-hCO အာရုံကြောများသည် နောက်ကျတုံ့ပြန်မှုလုပ်ဆောင်မှုကို ထိန်းညှိပေးသည့် ဗီဇအဆင့်များ (ပုံ. 2g,h) ကို ဖော်ပြခဲ့ပြီး ယခင်လေ့လာမှုများတွင် mouse နှင့် human neurons16,17 တို့တွင် တွေ့ရှိခဲ့သည်။ ဥပမာအားဖြင့်၊ BDNF18၊ SCG2၊ နှင့် OSTN၊ primate-specific activity-regulating gene သည် hCO neurons (ပုံ. 2g-i) နှင့် နှိုင်းယှဉ်ပါက t-hCO နူရွန်များတွင် တိုးများလာသောဖော်ပြမှုကို ပြသခဲ့သည်။ ထို့ကြောင့် t-hCO နူရွန်များသည် စာသားမှတ်တမ်း၊ ပုံသဏ္ဍာန်နှင့် လုပ်ဆောင်မှုဆိုင်ရာ ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုများဖြင့် hCO အာရုံကြောများနှင့် နှိုင်းယှဉ်ပါက ပိုမိုကောင်းမွန်သော ရင့်ကျက်မှုလက္ခဏာများကို ပြသခဲ့သည်။
လူ့ဦးနှောက်ဖွံ့ဖြိုးမှုနှင့် t-hCO ရင့်ကျက်မှု၏ဆက်စပ်မှုကို အကဲဖြတ်ရန်အတွက် ကျွန်ုပ်တို့သည် သန္ဓေသားနှင့် အရွယ်ရောက်ပြီးသူ cortical cell အမျိုးအစား 19,20 နှင့် adult21,22 တို့အပြင် ဖွံ့ဖြိုးတိုးတက်မှုကာလအတွင်း cortical gene expression23 ဆိုင်ရာ ကျယ်ပြန့်သောဒေတာများ (ချဲ့ထွင်ထားသောဒေတာ၊ ပုံ 5)။ ) ယခင်အလုပ် 24 ဖြင့်၊ ကွဲပြားမှု၏ 7-8 လတွင် ကမ္ဘာလုံးဆိုင်ရာ hCO နှင့် t-hCO မှတ်တမ်း ရင့်ကျက်မှုအခြေအနေသည် vivo ဖွံ့ဖြိုးတိုးတက်မှုအချိန်နှင့် ကျယ်ပြန့်စွာကိုက်ညီပြီး နှောင်းပိုင်းသန္ဓေသားဘဝနှင့် တူညီသည် (တိုးချဲ့ဒေတာပုံ 5a)။ မှတ်သားဖွယ်အချက်မှာ၊ t-hCO တွင် အသက်အရွယ်နှင့်လိုက်ဖက်သော hCO နှင့် နှိုင်းယှဉ်ပါက t-hCO တွင် မှတ်တမ်းမှတ်ရာ ရင့်ကျက်မှု တိုးလာခြင်းနှင့် synaptogenesis၊ astrogenesis နှင့် myelination နှင့်ဆက်စပ်သော စာသားမှတ်တမ်းကို အသက်ဝင်စေခြင်း (ချဲ့ထွင်ထားသော အချက်အလက်၊ ပုံ 5b-d) ကို တွေ့ရှိခဲ့သည်။ ဆယ်လူလာအဆင့်တွင်၊ အရွယ်ရောက်ပြီးသူ L2/3၊ L5၊ နှင့် L6 နျူရွန်အမျိုးအစားခွဲများနှင့် ထပ်နေသည့် glutamatergic neurons အစုအဝေးများဖြင့် t-hCO တွင် ပိုမိုပါးလွှာသော cortex အမျိုးအစားခွဲ၏ အထောက်အထားကို တွေ့ရှိခဲ့သည်။ ဆန့်ကျင်ဘက်အနေနှင့်၊ glutamatergic t-hCO နူရွန်များနှင့် သန္ဓေသား၏ ကော်တီလာ အာရုံကြောများကြားတွင် အစုလိုက်ထပ်နေခြင်းသည် ကိုယ်ဝန်အလယ်အလတ်တွင် ပိုမိုကန့်သတ်ထားသည် (ချဲ့ထားသောဒေတာ၊ ပုံ 5e-j)။ t-hCO နျူရွန်များသည် လူ့မီးဖွားပြီးနောက် ကော်တီကယ် အာရုံကြောများနှင့် ဆင်တူခြင်း ရှိ၊ မရှိ ဆုံးဖြတ်ရန်၊ ကျွန်ုပ်တို့သည် လူသား၏ နောက်ဆက်တွဲ ကော်တီရွန်၏ ချွန်ထက်သော အပိုင်းများတွင် လူသား L2/3 ပိရမစ် အာရုံကြောများ (ချဲ့ထွင်ထားသော အချက်အလက်၊ ပုံ 7a) ၏ လျှပ်စစ်ဇီဝကမ္မဆိုင်ရာ မှတ်တမ်းများနှင့် ခန္ဓာဗေဒဆိုင်ရာ ပြန်လည်တည်ဆောက်မှုများကို လုပ်ဆောင်ခဲ့ပါသည်။ L2/3 ပိရမစ်နျူရွန်များ၏ အီလက်ထရောနစ် ဇီဝကမ္မဂုဏ်သတ္တိများသည် t-hCO ပိရမစ်နျူရွန်များနှင့် ဆင်တူသည် (တိုးချဲ့ဒေတာ၊ ပုံ 7e)။ ပုံသဏ္ဍာန်အရ၊ မီးယပ်လူသားနမူနာမှ L2/3 ဆဲလ်များသည် hCO ထက် t-hCO နှင့် ပို၍ဆင်တူသော်လည်း L2/3 ဆဲလ်များသည် ပိုရှည်သည်၊ ခြုံငုံအကိုင်းအခက်များပါရှိပြီး ကျောရိုးသိပ်သည်းဆ ပိုမြင့်မားသည် (ပုံ။ 3g နှင့် တိုးချဲ့ဒေတာ၊ ပုံ။ 7b-)။ ဆ)။
a၊ ထိန်းချုပ်မှုမှထုတ်လုပ်သော hCO နှင့် TS hiPS ဆဲလ်လိုင်းများကိုမွေးကင်းစကလေးကြွက်များအဖြစ်သို့အစားထိုးခြင်း။ b၊ ကွဲပြားမှု 8 လကြာပြီးနောက် biocytin-filled t-hCO အာရုံကြောများကို 3D ပြန်လည်တည်ဆောက်ခြင်း။ c၊ ပျမ်းမျှ dendritic အရှည် (n = 19 ထိန်းချုပ်နျူရွန်၊ n = 21 TS အာရုံကြောများ; ** P = 0.0041) d၊ ထိန်းချုပ်မှုမှ 3D-reconstructed dendritic အကိုင်းအခက်များနှင့် TS t-hCO ကွဲပြားမှု 8 လတွင်၊ နှင့် dendritic ကျောရိုးသိပ်သည်းဆကို ပမာဏသတ်မှတ်ခြင်း (n = 16 ထိန်းချုပ်နျူရွန်၊ n = 21 TS အာရုံကြောများ၊ ***P < 0.0001)။ d၊ ထိန်းချုပ်မှုမှ 3D-reconstructed dendritic အကိုင်းအခက်များနှင့် TS t-hCO ကွဲပြားမှု 8 လတွင်၊ နှင့် dendritic ကျောရိုးသိပ်သည်းဆကို ပမာဏသတ်မှတ်ခြင်း (n = 16 ထိန်းချုပ်နျူရွန်၊ n = 21 TS အာရုံကြောများ၊ ***P < 0.0001)။ d၊ 3D-реконструкция дендритных ветвей из контроля и TS t-hCO через 8 месяцев дифференцировки и колионен плотности дендритных шипов(n=16 контрольных нейронов, n=21 TS нейронов, ***P <0,0001)။ ဃ၊ ထိန်းချုပ်မှုမှ dendritic အကိုင်းအခက်များကို 3D ပြန်လည်တည်ဆောက်ခြင်းနှင့် t-hCO TS ကွဲပြားခြင်းနှင့် ကျောရိုးသိပ်သည်းဆကို 8 လကြာ 3D ပြန်လည်တည်ဆောက်ခြင်း (n=16 ထိန်းချုပ်နျူရွန်များ၊ n=21 TS အာရုံကြောများ၊ ***P<0.0001)။ d，分化8 个月时对照和TS t-hCO的3D 重建树突分支，以及树突棘密度的量化（n = 16珃煞珦21 个TS 神经元，***P < 0.0001)။ d，分化 8 个时对照和 ts t-hco的 3d 重建 分支 分支 以及树突棘 密媖（重建 分支 以及树突棘密媖（量建縏化 16元 , n = 21 个 ts 神经 , *** p < 0.0001 ) ။ d၊ 3D-реконструкция дендритных ветвей контроля и TS t-hCO через 8 месяцев дифференцировки и нкаволичеят плотности дендритных шипов(n=16 контрольных нейронов, n=21 TS нейронов, ***P <0,0001)။ d၊ 8 လကြာ ကွဲပြားမှုနှင့် dendritic ကျောရိုးသိပ်သည်းဆ ပမာဏကို 8 လတွင် ထိန်းချုပ်ထားသော dendritic အကိုင်းအခက်များနှင့် TS t-hCO တို့ကို 3D ပြန်လည်တည်ဆောက်ခြင်း (n=16 ထိန်းချုပ်နျူရွန်၊ n=21 TS နူရွန်၊ ***P<0.0001)။အနီရောင် ကြယ်ပွင့်များသည် putative dendritic ကျောရိုးများကို ညွှန်ပြသည်။ e၊ ထိန်းချုပ်မှုတွင် အလိုအလျောက် EPSC များနှင့် TS t-hCO အာရုံကြောများ ကွဲပြားမှု ၈ လကြာပြီးနောက်။ f၊ များပြားလှသော ကြိမ်နှုန်းကွက်ကွက်နှင့် synaptic ဖြစ်ရပ်များ၏ ကြိမ်နှုန်းနှင့် ပမာဏ၏ ပမာဏ (n=32 ထိန်းချုပ်မှုဆိုင်ရာ အာရုံကြောများ၊ n=26 TS နူရွန်များ၊ **P=0.0076 နှင့် P=0.8102)။ g၊ Scholl ၏ TS နှင့် hCO နှင့် t-hCO ရှိ အာရုံကြောထိန်းချုပ်မှုဆိုင်ရာ ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာခြင်း။ Dashed လိုင်းများသည် လူ့ L2/3 မီးဖွားပြီးနောက် ပိရမစ် နျူရွန်များကို နှိုင်းယှဉ်ပြသသည် (n = 24 control t-hCO neurons, n = 21 TS t-hCO neurons, n = 8 control hCO neurons, and n = 7 TS hCO neurons)။ ဒေတာကို ပျမ်းမျှ ± စံသွေဖည်မှုအဖြစ် ဖော်ပြသည်။
t-hCO ၏ မြင့်မားသောအဆင့်တွင် လူ့ cortex နျူရွန်များ၏ ပုံသဏ္ဍာန်နှင့် လုပ်ဆောင်ချက်ဆိုင်ရာ အင်္ဂါရပ်များကို ပုံတူပွားနိုင်မှုသည် ကျွန်ုပ်တို့အား t-hCO ကို ရောဂါ phenotypes များသိရှိရန် အသုံးပြုနိုင်ခြင်း ရှိ၊ မရှိ စူးစမ်းလေ့လာရန် လှုံ့ဆော်ပေးခဲ့သည်။ ကျွန်ုပ်တို့သည် အာရုံကြောများတွင် လှုပ်ရှားမှု-မူတည်သည့် ဗီဇအသွင်ပြောင်းခြင်းကို အစပြုသည့် ဗီဇကုဒ်နံပါတ် CaV1.2 ရှိ ဗီဇကုဒ်နံပါတ် CaV1.2 တွင် ရရှိ-of-function ကြောင့်ဖြစ်သော ပြင်းထန်သော အာရုံကြောဖွံ့ဖြိုးမှုဆိုင်ရာချို့ယွင်းမှုရောဂါကို အာရုံစိုက်ခဲ့ပါသည်။ အသုံးအများဆုံး အစားထိုးပစ္စည်း (p.G406R) နှင့် ထိန်းချုပ်မှု သုံးခု (ပုံ 3a) ကို သယ်ဆောင်သည့် TS လူနာ 3 ဦးထံမှ hCO ကို ရယူထားပါသည်။ အစားထိုးကုသမှုပြီးနောက်၊ ထိန်းချုပ်မှုများ (ပုံ 3b နှင့် တိုးချဲ့ထားသောဒေတာ၊ ပုံ 8a၊ b) နှင့် နှိုင်းယှဉ်ပါက dendritic ပုံသဏ္ဍာန်ကို TS အာရုံကြောများတွင် ပြောင်းလဲသွားသည်ကို ကျွန်ုပ်တို့တွေ့ရှိခဲ့ရပြီး မူလ dendrites အရေအတွက် နှစ်ဆတိုးလာပြီး dendritic အရှည်၏ပျမ်းမျှနှင့် အလုံးစုံကျဆင်းမှု (ပုံ 3c နှင့် တိုးချဲ့ဒေတာ)၊ ပုံ 8c)။ ၎င်းသည် အာရုံကြောထိန်းချုပ်မှုဆိုင်ရာ အာရုံကြောများနှင့် နှိုင်းယှဉ်ပါက ကျောရိုး၏သိပ်သည်းဆ တိုးမြင့်လာခြင်းနှင့် TS ရှိ အလိုအလျောက် EPSC များ၏ အကြိမ်ရေ တိုးလာခြင်းနှင့် ဆက်စပ်နေသည် (ပုံ။ 3d–f နှင့် တိုးချဲ့ထားသောဒေတာ၊ ပုံ။ 8g)။ ထပ်ဆင့်ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာခြင်းသည် ထိန်းချုပ်မှုများနှင့် နှိုင်းယှဉ်ပါက t-hCO TS တွင် ပုံမှန်မဟုတ်သော dendritic အကိုင်းအခက်များ၏ ပုံစံများကို ဖော်ပြခဲ့သည်၊ သို့သော် ကွဲပြားခြင်း၏အလားတူအဆင့်တွင် in vitro TS hCO တွင်မဟုတ်ပါ (ပုံ။ 3g)။ ၎င်းသည် TS ရှိ လှုပ်ရှားမှု-မှီခို dendritic ကျုံ့ခြင်းဆိုင်ရာ ကျွန်ုပ်တို့၏ယခင်အစီရင်ခံစာများနှင့် ကိုက်ညီပြီး vivo တွင် ရောဂါ phenotypes ကိုရှာဖွေရန် ဤအစားထိုးပလပ်ဖောင်း၏စွမ်းရည်ကို မီးမောင်းထိုးပြပါသည်။
ထို့နောက် ကျွန်ုပ်တို့သည် t-hCO ဆဲလ်များကို ကြွက် S1 တွင် မည်သည့်အတိုင်းအတာအထိ လုပ်ဆောင်နိုင်သနည်းဟု မေးမြန်းခဲ့သည်။ ကြွက်များတွင် S1 သည် ipsilateral ventral basal နှင့် posterior thalamic nuclei အပြင် ipsilateral motor နှင့် secondary somatosensory cortices နှင့် contralateral S1 (ပုံ 4a) တို့မှ ခိုင်မာသော synaptic inputs များကို လက်ခံရရှိပါသည်။ innervation ပုံစံကို ပြန်လည်ရယူရန်၊ ကျွန်ုပ်တို့သည် hCO ကို ခွေးရူးပြန်ဗိုင်းရပ်-dG-GFP/AAV-G ဖြင့် ကူးစက်ခဲ့ပြီး hCO ကို S1 ကြွက်သို့ အစားထိုးပြီး ၃ ရက်အကြာတွင် ပြုလုပ်ခဲ့သည်။ အစားထိုးကုသမှုပြီးနောက် 7-14 ရက်အကြာတွင် ipsilateral S1 နှင့် ventral basal ganglia ၏ အာရုံကြောများတွင် အလွန်သိပ်သည်းသော GFP ထုတ်ဖော်မှုကို ကျွန်ုပ်တို့ တွေ့ရှိခဲ့သည် (ပုံ။ 4b၊ ဂ)။ ထို့အပြင်၊ thalamic အမှတ်အသား netrin G1 ၏ ပဋိပစ္စည်း စွန်းထင်းမှုသည် t-hCO (ပုံ 4d၊ e) တွင် thalamic endings ပါဝင်မှုကို ထင်ရှားစေသည်။ ဤ afferent projections များသည် t-hCO ဆဲလ်များတွင် synaptic တုံ့ပြန်မှုများကို ထုတ်ယူနိုင်သည်ဆိုသည်ကို အကဲဖြတ်ရန်အတွက် thalamocortical အလွှာ၏ ပြတ်သားသောအပိုင်းများတွင် လူသားဆဲလ်များမှ ဆဲလ်တစ်ခုလုံးကို မှတ်တမ်းတင်ခြင်းများကို လုပ်ဆောင်ခဲ့ပါသည်။ ကြွက် S1၊ အတွင်းပိုင်းဆေးတောင့်၊ အဖြူရောင်ပစ္စည်း၊ t-hCO အနီးရှိ အမျှင်များ သို့မဟုတ် AMPA receptor antagonist NBQX မှ ထိတွေ့သော t-hCO အာရုံကြောများရှိ t-hCO အာရုံကြောများတွင် opsin-expressing thalamic endings များ၏ opsin-expressing thalamic endings ၏ optogenetic activation။ (ပုံ။ 4f၊ g နှင့် တိုးချဲ့ဒေတာ၊ ပုံ။ 9a–g)။ ဤဒေတာများသည် t-hCO ကို ကြွက်ဦးနှောက်ထဲသို့ ခန္ဓာဗေဒအရ ပေါင်းစပ်ထားပြီး ကြွက်အိမ်ရှင်တစ်ရှူးဖြင့် အသက်သွင်းနိုင်သည်ကို သက်သေပြနေသည်။
a၊ ခွေးရူးပြန်ရောဂါ ခြေရာခံစမ်းသပ်မှု၏ ဇယားကွက်။ b၊ GFP နှင့် t-hCO နှင့် rat cerebral cortex (အပေါ်ပိုင်း panel) တို့ကြားတွင် လူသားသီးသန့် STEM121 စကားရပ်။ ကြွက် ipsilateral ventral basal nucleus (VB) (ဘယ်ဘက်အောက်) နှင့် ipsilateral S1 (ညာဘက်အောက်) ရှိ GFP အညွှန်းကို ပြထားသည်။ စကေးဘား၊ 50 µm။ အနီရောင်စတုရန်းများသည် ပုံရိပ်များရိုက်ယူသည့် ဦးနှောက်၏ ဧရိယာများကို ကိုယ်စားပြုသည်။ c၊ GFP (n = 4 ကြွက်များ) ကိုဖော်ပြသည့်ဆဲလ်များ၏အရေအတွက်။ d၊ e — t-hCO ရှိ Netrin G1+ thalamic terminals d သည် t-hCO နှင့် VB nuclei ပါရှိသော coronal အပိုင်းကိုပြသသည်။ စကေးဘား၊ 2 မီလီမီတာ။ e သည် t-hCO (ဘယ်) နှင့် VB (ညာ) အာရုံကြောများတွင် Netrin G1 နှင့် STEM121 စကားရပ်ကို ပြသသည်။ စကေးဘား၊ 50 µm။ လိမ္မော်ရောင် အစက်ချမျဉ်းသည် t-hCO နယ်နိမိတ်ကို ညွှန်ပြသည်။ f၊ g၊ S1 ကြွက် (စ) တွင် လျှပ်စစ်လှုံ့ဆော်မှုပြီးနောက် t-hCO အာရုံကြောများ၏ လက်ရှိခြေရာများ သို့မဟုတ် အတွင်းပိုင်းဆေးတောင့် (g)၊ (ခရမ်းရောင်) သို့မဟုတ် (အနက်ရောင်) NBQX (ဘယ်ဘက်)။ EPSC သည် NBQX (n = 6 S1 neurons၊ *P = 0.0119; နှင့် n = 6 အတွင်းပိုင်းဆေးတောင့်၊ **P = 0.0022) (ဗဟို)။ ကြွက် S1 (f) သို့မဟုတ် အတွင်းပိုင်းဆေးတောင့် (g) (ညာဘက်) ကို တုံ့ပြန်ရန် EPSC ကိုပြသသည့် t-hCO အာရုံကြောများ၏ ရာခိုင်နှုန်း။ aCSF၊ ဦးနှောက်အာရုံကြောအတုအရည်။ h၊ 2P ပုံရိပ်ဖော်စမ်းသပ်မှု၏ ဇယားကွက် (ဘယ်ဘက်)။ t-hCO (အလယ်) တွင် GCaMP6s ၏ ဖော်ပြချက်။ စကေးဘား၊ 100 µm။ GCaMP6s ၏ မီးချောင်းများ အချိန်လွန်ခြင်း (ညာဘက်)။ i၊ အလိုအလျောက်လှုပ်ရှားမှု fluorescence ၏ Z-ရမှတ်။ j၊ နှုတ်ခမ်းမွေး နှိုးဆွခြင်း၏ သရုပ်ဖော်ပုံ။ အစမ်းတစ်ကြိမ်တွင် k၊ z-ရမှတ် 2P မီးချောင်းလမ်းကြောင်းများကို နမူနာဆဲလ်ရှိ အချိန် သုည (dashed line) တွင် ပါးသိုင်းမွှေးသွေဖည်မှုနှင့် ချိန်ညှိထားသည်။ l၊ ဆဲလ်အားလုံး၏ လူဦးရေ ပျမ်းမျှ z-ရမှတ် တုံ့ပြန်မှုများသည် အချိန် သုည (dashed line) (အနီရောင်) သို့မဟုတ် ကျပန်းထုတ်ပေးသော အချိန်တံဆိပ်များ (မီးခိုးရောင်) နှင့် ချိန်ညှိထားသည်။ ဍ optical marking ဆိုင်ရာ စမ်းသပ်မှု၏ ဇယားကွက်။ n၊ အပြာရောင်လေဆာ လှုံ့ဆော်မှု သို့မဟုတ် ပါးသိုင်းမွေးလှန်နေစဉ် ဥပမာ t-hCO ဆဲလ်မှ ဗို့အားအကြမ်းမျဉ်းကွေး။ အနီရောင်မြှားများသည် အလင်း (အပေါ်ပိုင်း) သို့မဟုတ် ပါးသိုင်းမွှေး (အောက်ခြေ) ကြောင့် ဖြစ်ပေါ်လာသော ပထမဆုံး မြှားများကို ညွှန်ပြသည်။ မီးခိုးရောင်အရိပ်သည် ပါးသိုင်းမွှေးလှန်သည့်အချိန်များကို ညွှန်ပြသည်။ o၊ Peak light waveforms နှင့် whisker deflection တုံ့ပြန်မှုများ။ p၊ တစ်ခုတည်းသောကြိုးစားမှု၏ spikes၊ ဥပမာ၏ဆဲလ်ရှိပါးသိုင်းမွှေးများ၏သွေဖည်မှုနှင့်ညီညွတ်သည်။ 0 သည် ပါးသိုင်းသွေဖည်ခြင်း (dashed line) ကို ညွှန်ပြသည်။ q၊ အချိန် သုည (ကက်ရှ်မျဉ်း) (အနီရောင်) သို့မဟုတ် ကျပန်းထုတ်ပေးသည့် အချိန်တံဆိပ်များ (မီးခိုးရောင်) နှင့် ပေါင်းစပ်ထားသော ဓါတ်ပုံများအာရုံခံဆဲလ်အားလုံးအတွက် လူဦးရေ ပျမ်းမျှ z-ရမှတ် ပစ်ခတ်မှုနှုန်း။ r၊ ပါးသိုင်းမွှေးသွေဖည်ခြင်းဖြင့် သိသာထင်ရှားစွာ ပြုပြင်ထားသော ဓါတ်ပြုနိုင်သော ယူနစ်များ၏ အချိုး (n = 3 rats) (ဘယ်ဘက်)။ peak z-score latency (n = 3 rats; n = 5 (အစိမ်းဖျော့)၊ n = 4 (စိမ်းပြာရောင်) နှင့် n = 4 (စိမ်းပြာရောင်) whisker deflection modulation unit) (ညာဘက်)။ ဒေတာကို ပျမ်းမျှ ± စံသွေဖည်မှုအဖြစ် ဖော်ပြသည်။
ထို့နောက် ကျွန်ုပ်တို့သည် t-hCO ကို vivo တွင် အာရုံခံလှုံ့ဆော်မှုဖြင့် အသက်သွင်းနိုင်မလား။ ကျွန်ုပ်တို့သည် မျိုးဗီဇကုဒ်သွင်းထားသော ကုဒ်နံပါတ်များ GCaMP6 ကို S1 ကြွက်များအဖြစ် ဖော်ပြသည့် hCO ကို အစားထိုးစိုက်ပျိုးခဲ့ပါသည်။ ရက်ပေါင်း 150 ကြာပြီးနောက်၊ ကျွန်ုပ်တို့သည် ဖိုက်ဘာဓာတ်ပုံရိုက်ခြင်း သို့မဟုတ် ဖိုတွန် ကယ်လ်စီယမ် ဓါတ်ပုံနှစ်ပုံ (ပုံ။ 4h နှင့် တိုးချဲ့ထားသောဒေတာ၊ ပုံ 10a) ကို လုပ်ဆောင်ခဲ့ပါသည်။ t-hCO ဆဲလ်များသည် စည်းချက်ညီညီလုပ်ဆောင်မှု (ပုံ 4i၊ Expanded Data၊ ပုံ 10b နှင့် နောက်ဆက်တွဲ ဗီဒီယို 1) ကို ပြသထားကြောင်း ကျွန်ုပ်တို့ တွေ့ရှိခဲ့သည်။ အထွတ်အထိပ် t-hCO လုပ်ဆောင်ချက်ကို လက္ခဏာရပ်ပြရန်၊ ကျွန်ုပ်တို့သည် မေ့ဆေးအစားထိုးထားသော ကြွက်များတွင် extracellular electrophysiological recordings (တိုးချဲ့ဒေတာ၊ ပုံ 10c-f) ကို လုပ်ဆောင်ခဲ့ပါသည်။ ကျွန်ုပ်တို့သည် MRI ပုံများမှ stereotaxic သြဒိနိတ်များကို ထုတ်လုပ်ထားပါသည်။ ထို့ကြောင့်၊ ဤမှတ်တမ်းတင်ထားသော ယူနစ်များသည် လူသားများ၏ အာရုံကြောများကို ကိုယ်စားပြုသော်လည်း အီလက်ထရောနစ် ဇီဝကမ္မဗေဒ တစ်ခုတည်းက မျိုးစိတ်တစ်ခုအား ဆုံးဖြတ်ရန် ခွင့်မပြုပေ။ တစ်ပြိုင်နက်တည်း ဆက်တိုက်ပေါက်ကွဲနေသော လှုပ်ရှားမှုများကို ကျွန်ုပ်တို့ တွေ့ရှိခဲ့သည် (တိုးချဲ့ဒေတာ၊ ပုံ 10d)။ ပေါက်ကွဲသံများသည် 460 ms ခန့်ကြာမြင့်ပြီး 2 စက္ကန့်ခန့် အသံတိတ်ကာလဖြင့် ပိုင်းခြားထားသည် (တိုးချဲ့ဒေတာ၊ ပုံ 10d၊ င)။ တစ်ဦးချင်းယူနစ်များသည် ဆက်တိုက်ပေါက်ကွဲလျှင် ပျမ်းမျှအားဖြင့် သုံးကြိမ်ခန့် ပစ်ခတ်ခဲ့ပြီး ယင်းသည် ပေါက်ကွဲတိုင်းတွင် စာရင်းသွင်းယူနစ်၏ 73% ခန့်ရှိသည်။ ယူနစ်တစ်ခုချင်းစီ၏ လှုပ်ရှားမှုများသည် အလွန်ဆက်စပ်မှုရှိသည်၊ နှင့် ယင်းဆက်စပ်ဆက်နွယ်မှုသည် တူညီသောအခြေအနေအောက်တွင် မှတ်တမ်းတင်ထားသော ကာကွယ်ဆေးမထိုးရသေးသောတိရစ္ဆာန်များတွင် သတ်မှတ်ထားသော ယူနစ်များထက် ပိုများသည် (တိုးချဲ့ဒေတာ၊ ပုံ 10f)။ လူမှဆင်းသက်လာသော အာရုံကြောများ၏ နှောင့်နှေးတုံ့ပြန်မှုများကို ထပ်လောင်းလက္ခဏာပြရန်၊ ကျွန်ုပ်တို့သည် အလင်း-အာရုံခံနိုင်သော cation ချန်နယ် rhodopsin 2 (hChR2) ကိုဖော်ပြသည့် hCO ဖြင့် အစားထိုးထားသော မေ့ဆေးပေးထားသော ကြွက်များတွင် အလင်း-တဂ်လုပ်ခြင်း စမ်းသပ်မှုများကို လုပ်ဆောင်ခဲ့ပြီး t-hCO အာရုံကြောများ တိုတောင်းသော latency အသိအမှတ်ပြုမှု (10 ms ထက်နည်း၍ အပြာရောင်) တုံ့ပြန်မှု။i t-hCO နျူရွန်များသည် ကယ်လစီယမ်ပုံရိပ်ဖော်ခြင်းတွင် လေ့လာတွေ့ရှိသည့် ကြိမ်နှုန်းများနှင့် ဆင်တူသည့် ကြိမ်နှုန်းများဖြင့် သူ့အလိုလို လှုပ်ရှားမှုများကို ပေါက်ကြားစေပြီး အလင်းအမှတ်အသားမရှိသည့် t-hCO တွင် ပြုလုပ်သော လျှပ်စစ်ဇီဝကမ္မမှတ်တမ်းများ (ချဲ့ထွင်ထားသော အချက်အလက်၊ ပုံ 10c-g)။ vitro တွင်မှတ်တမ်းတင်ထားသော hCO ၏သက်ဆိုင်ရာအဆင့်များတွင်အလိုအလျောက်လှုပ်ရှားမှုကိုမတွေ့ရှိပါ။ t-hCO ကို အာရုံခံလှုံ့ဆော်မှုဖြင့် အသက်သွင်းနိုင်ခြင်း ရှိ၊ မရှိ အကဲဖြတ်ရန်၊ ကျွန်ုပ်တို့သည် t-hCO မှ ကြွက်ပါးသိုင်းမွှေးများကို တိုတိုတုတ်တုတ် (ပုံ။ 4j၊ m နှင့် တိုးချဲ့ဒေတာ၊ ပုံ။ 10h,k)။ ယခင်လေ့လာမှု 8,10 အရ t-hCO ဆဲလ်များ၏ အစိတ်အပိုင်းတစ်ခုသည် ဒေတာကို ကျပန်းအချိန်တံဆိပ်တုံးများနှင့် နှိုင်းယှဉ်သောအခါတွင် သတိပြုမိခြင်းမရှိသည့် ပါးသိုင်းမွှေးလှန်ခြင်းကို တုံ့ပြန်သည့်အနေဖြင့် လှုပ်ရှားမှုတိုးလာသည်ကို ပြသခဲ့သည် (ပုံ။ 4k–q နှင့် တိုးချဲ့ဒေတာ၊ ပုံ 10h–q)။ အမှန်မှာ၊ opto-တံဆိပ်တပ်ထားသည့်တစ်ခုတည်းယူနစ်များ၏ 54% ခန့်သည် ပါးသိုင်းမွှေးလှုံ့ဆော်မှုပြီးနောက် သိသိသာသာတိုးလာကာ 650 ms ခန့်တွင် အထွတ်အထိပ်သို့ရောက်ရှိနေသည်ကိုပြသခဲ့သည် (ပုံ. 4r)။ စုစည်းထားသော ဤဒေတာများသည် t-hCO သည် သင့်လျော်သော လုပ်ဆောင်မှုဆိုင်ရာ ထည့်သွင်းမှုများကို လက်ခံရရှိပြီး ပတ်ဝန်းကျင်ဆိုင်ရာ လှုံ့ဆော်မှုများဖြင့် အသက်သွင်းနိုင်သည်ဟု အကြံပြုထားသည်။
ထို့နောက် t-hCO သည် အပြုအမူကို ထိန်းချုပ်ရန်အတွက် ကြွက်များတွင် ဆားကစ်များကို အသက်သွင်းနိုင်ခြင်း ရှိမရှိ စုံစမ်းစစ်ဆေးခဲ့သည်။ t-hCO အာရုံကြောများ၏ axons များသည် ကြွက်၏ပတ်ဝန်းကျင်ရှိ တစ်ရှူးများအတွင်းသို့ ပရောဂျက်ရှိမရှိကို ဦးစွာ စုံစမ်းစစ်ဆေးခဲ့သည်။ ကျွန်ုပ်တို့သည် EYFP (hChR2-EYFP) သို့ ပေါင်းစပ်ထားသော lentivirus encoding hChR2 ဖြင့် hCO ကို ကူးစက်ခဲ့သည်။ ရက်ပေါင်း 110 ပြီးနောက်၊ နား၊ မော်တာနှင့် somatosensory cortices အပါအဝင် ipsilateral cortical ဒေသများတွင် EYFP ၏အသုံးအနှုန်းကို ကျွန်ုပ်တို့ စောင့်ကြည့်လေ့လာခဲ့ပြီး striatum၊ hippocampus နှင့် thalamus (ပုံ 5a) အပါအဝင် subcortical ဒေသများတွင် တွေ့ရှိခဲ့သည်။ အဆိုပါ ပြင်းထန်သော ခန့်မှန်းချက်များသည် ကြွက်ဆဲလ်များတွင် synaptic တုံ့ပြန်မှုများကို လှုံ့ဆော်ပေးနိုင်ခြင်း ရှိ၊ မရှိ အကဲဖြတ်ရန်၊ ကျွန်ုပ်တို့သည် ထက်ထက်သော ဦးနှောက်အပိုင်းများတွင် hChR2-EYFP ကို ​​ဖော်ပြသည့် t-hCO ဆဲလ်များကို ကြွက်ဦးနှောက် cortex ဆဲလ်များကို ဖမ်းယူခြင်းဖြင့် optically activate လုပ်ပါသည်။ အပြာရောင်အလင်းဖြင့် t-hCO axons ကို အသက်သွင်းခြင်းသည် NBQX (ပုံ။ 5b–g) မှ ပိတ်ဆို့ထားသော ကြွက်ပိရမစ်ကော်တက်ဆဲလ်ရှိ ကြွက်ပိရမစ်ကော်တက်ဆဲလ်များတွင် တိုတောင်းသောကြာချိန်ကို လှုံ့ဆော်ပေးသော EPSC များ။ ထို့အပြင်၊ ဤတုံ့ပြန်မှုများကို tetrodotoxin (TTX) ဖြင့် ပိတ်ဆို့နိုင်ပြီး 4-aminopyridine (4-AP) ဖြင့် ၎င်းတို့ကို monosynaptic ချိတ်ဆက်မှုများကြောင့် ဖြစ်ရကြောင်း အကြံပြုခြင်းဖြစ်သည် (ပုံ။ 5e)။
a၊ axon ခြေရာခံခြင်း၏ ဇယားကွက် (ဘယ်ဘက်)။ t-hCO EYFP စကားရပ် (ညာဘက်)။ စကေးဘား၊ 100 µm။ A1၊ auditory cortex၊ ACC၊ anterior cingulate cortex၊ ဃ။ striatum, dorsal striatum, HPC, hippocampus; Diaphragm၊ ဘေးဘက် septum၊ mPFC၊ medial prefrontal cortex၊ piri၊ piriform cortex၊ v. striatum၊ ventral striatum၊ VPM၊ thalamus ၏ ventropostomedial nucleus၊ VTA၊ ventral tegmental ဒေသ။ အနီရောင်စတုရန်းများသည် ပုံရိပ်များရိုက်ယူသည့် ဦးနှောက်၏ ဧရိယာများကို ကိုယ်စားပြုသည်။ b၊ လှုံ့ဆော်မှုစမ်းသပ်မှု၏ ဇယားကွက်။ c၊ d၊ လူရှိ အပြာရောင်အလင်း-ဖြစ်ပေါ်စေသော ဖိုတိုလျှပ်စီးကြောင်း (အပေါ်) နှင့် ဗို့အား (အောက်ခြေ) တို့၏ တုံ့ပြန်မှု ဥပမာများ (ဂ) EYFP+ t-hCO သို့မဟုတ် ကြွက် (ဃ) EYFP-ဆဲလ်များ။ e၊ f၊ အပြာရောင်အလင်းဖြင့် TTX နှင့် 4-AR (အစိမ်းရောင်)၊ TTX (မီးခိုးရောင်) သို့မဟုတ် aCSF (အနက်ရောင်) (င)၊ (ခရမ်းရောင်) သို့မဟုတ် (အနက်ရောင်) မပါဘဲ t-hCO axons များကို လှုံ့ဆော်ပြီးနောက် ကြွက်နူးရွန်များ၏ လက်ရှိခြေရာများ )) NBQX (e) g၊ ကြွက်ဆဲလ်ရှိ အပြာရောင်အလင်းကြောင့် ဖြစ်ပေါ်လာသော တုံ့ပြန်မှု ကြာချိန် (n = 16 ဆဲလ်)၊ အလျားလိုက်ဘားများသည် ပျမ်းမျှကြာချိန် (7.13 ms) (ဘယ်ဘက်) ကိုညွှန်ပြသည်။ NBQX (n = 7 ဆဲလ်များ; ***P < 0.0001) (အလယ်) ဖြင့် မှတ်တမ်းတင်ထားသော အလင်း-လှုံ့ဆော်သော EPSC များ၏ ပမာဏ။ NBQX (n = 7 ဆဲလ်များ; ***P < 0.0001) (အလယ်) ဖြင့် မှတ်တမ်းတင်ထားသော အလင်း-လှုံ့ဆော်သော EPSC များ၏ ပမာဏ။ Амплитуда вызванных светом EPSC, зарегистрированных с или без NBQX (n = 7 клеток; ***P <0,0001) (в центре)။ NBQX (n = 7 ဆဲလ်များ; ***P < 0.0001) (ဗဟို) ဖြင့် မှတ်တမ်းတင်ထားသော အလင်း-သွေးဆောင် EPSC များ၏ ပမာဏ။使用或不使用NBQX 记录的光诱发EPSC的振幅（n = 7 个细胞；***P < 0.0001）（中）။使用或不使用NBQX 记录的光诱发EPSC的振幅（n = 7 个细胞；***P < 0.0001）（中）။ Амплитуда вызванных светом EPSC, зарегистрированных с или без NBQX (n = 7 клеток; ***P <0,0001) (в центре)။ NBQX (n = 7 ဆဲလ်များ; ***P < 0.0001) (ဗဟို) ဖြင့် မှတ်တမ်းတင်ထားသော အလင်း-သွေးဆောင် EPSC များ၏ ပမာဏ။အပြာရောင်အလင်းကို တုံ့ပြန်သည့် EPSC များကိုပြသသည့် ကြွက်ဆဲလ်များ၏ ရာခိုင်နှုန်း (ညာဘက်)။ h၊ အပြုအမူဆိုင်ရာလုပ်ဆောင်မှုတစ်ခု၏ ဇယားကွက်။ d0၊ နေ့ 0. i. လေ့ကျင့်မှု 1 ရက် (ဘယ်) သို့မဟုတ် 15 (ညာ) တွင်စံပြတိရစ္ဆာန်များ၏စွမ်းဆောင်ရည်။ နေ့ 1 (ဘယ်) သို့မဟုတ် 15 (ညာဘက်အလယ်ဗဟို) (n = 150 blue light trials, n = 150 red light trials; ***P < 0.0001). နေ့ 1 (ဘယ်) သို့မဟုတ် 15 (ညာဘက်အလယ်ဗဟို) (n = 150 blue light trials, n = 150 red light trials; ***P < 0.0001). Среднее количество облизываний, выполненных в день 1 (слева) или день 15 (в центре справа) (n = 150 иснитай светом, n = 150 испытаний с красным светом; ***P <0,0001)။ နေ့ 1 (ဘယ်) သို့မဟုတ် 15 (အလယ်ဗဟို) တွင်ပြုလုပ်သော ပျမ်းမျှ lick အရေအတွက် (n = အပြာရောင်အလင်းစမ်းသပ်မှု 150၊ n = 150 အနီရောင်အလင်းစမ်းသပ်မှုများ; ***P < 0.0001)။第1天（左）或第15天（右中）执行的平均舔次数（n=150次蓝光试验，n=150次红验。；150次红匉。５第1天（左）或第15天（右中）执行的平均舔次数（n=150次蓝光试验，n=150次红验，n=150次红匉載 Среднее количество облизываний, выполненных в день 1 (слева) или день 15 (в центре справа) (n = 150 иснитай светом, n = 150 испытаний с красным светом; ***P <0,0001)။ နေ့ 1 (ဘယ်) သို့မဟုတ် 15 (အလယ်ဗဟို) တွင်ပြုလုပ်သော ပျမ်းမျှ lick အရေအတွက် (n = အပြာရောင်အလင်းစမ်းသပ်မှု 150၊ n = 150 အနီရောင်အလင်းစမ်းသပ်မှုများ; ***P < 0.0001)။ရက် 1 (ဘယ်ဘက်အလယ်) သို့မဟုတ် ရက် 15 (ညာဘက်) တွင် အနီရောင်နှင့် အပြာရောင်အလင်းစမ်းသပ်မှုများအတွက် စုစည်းမှု licks။ NS၊ သိသိသာသာမဟုတ်ပါဘူး။ j,k၊ hChR2-EYFP (ည) ကိုဖော်ပြသည့် t-hCO ဖြင့် အစားထိုးစိုက်ထားသော တိရစ္ဆာန်အားလုံး၏ အပြုအမူဆိုင်ရာ ဝိသေသလက္ခဏာများသည် hChR2-EYFP (ည) သို့မဟုတ် 1 သို့မဟုတ် 15 တွင် ထိန်းချုပ်သည့် fluorophore (k) (hChR2-EYFP: n = 9 ကြွက်များ၊ ** P = 0.0049; ထိန်းချုပ်မှု- n = 9၊ P = 0.1497)။ l၊ ဦးစားပေးရမှတ်၏ ဆင့်ကဲဖြစ်စဉ် (n = 9 hChR2၊ n = 9 ထိန်းချုပ်မှု; **P < 0.001၊ ***P < 0.0001)။ l၊ ဦးစားပေးရမှတ်၏ ဆင့်ကဲဖြစ်စဉ် (n = 9 hChR2၊ n = 9 ထိန်းချုပ်မှု; **P < 0.001၊ ***P < 0.0001)။ l, Эволюция показателя предпочтения (n = 9 hChR2, n = 9 контрольных; **P <0,001, ***P <0,0001)။ l၊ ဦးစားပေးရမှတ်၏ ဆင့်ကဲဖြစ်စဉ် (n = 9 hChR2၊ n = 9 ထိန်းချုပ်မှုများ၊ **P < 0.001၊ ***P < 0.0001)။ l，偏好评分的演变（n = 9 hChR2，n = 9对照；**P < 0.001，***P < 0.0001）။ l，偏好评分的演变（n = 9 hChR2，n = 9对照；**P < 0.001，***P < 0.0001）။ l, Эволюция показателей предпочтения (n = 9 hChR2, n = 9 контролей; **P <0,001, ***P <0,0001)။ l၊ ဦးစားပေးရမှတ်များ ဆင့်ကဲပြောင်းလဲခြင်း (n = 9 hChR2၊ n = 9 ထိန်းချုပ်မှုများ၊ **P < 0.001၊ ***P < 0.0001)။m၊ S1 တွင် t-hCO ၏ optogenetic activation ကိုတုံ့ပြန်သည့်အနေဖြင့် FOS စကားရပ်။ FOS စကားရပ်၏ပုံများ (ဘယ်) နှင့် အရေအတွက် (အုပ်စုတစ်ခုလျှင် n = 3; *P < 0.05၊ **P < 0.01 နှင့် ***P < 0.001) (ညာဘက်) ကို ပြသထားသည်။ FOS စကားရပ်၏ပုံများ (ဘယ်) နှင့် အရေအတွက် (အုပ်စုတစ်ခုလျှင် n = 3; *P < 0.05၊ **P < 0.01 နှင့် ***P < 0.001) (ညာဘက်) ကို ပြသထားသည်။ Показаны изображения экспрессии FOS (слева) и количественного определения (n = 3 на группу; * P<0,05, **P <0,01) (0,01)။ FOS စကားရပ် (ဘယ်) နှင့် အရေအတွက် (အုပ်စုတစ်ခုလျှင် n = 3; *P<0.05၊ **P<0.01 နှင့် ***P<0.001) ၏ပုံများကို (ညာဘက်) ပြထားသည်။显示了FOS 表达（左）和量化（每组n = 3；*P < 0.05、**P < 0.01 和***P < 0.001）（右）的图像。显示了FOS 表达（左）和量化（每组n = 3；*P < 0.05、**P < 0.01 和***P < 0.001）（右）的图像。 Показаны изображения экспрессии FOS (слева) и количественного определения (n = 3 на группу; * P<0,05, **P <0,01) (0,01)။ FOS စကားရပ် (ဘယ်) နှင့် အရေအတွက် (အုပ်စုတစ်ခုလျှင် n = 3; *P<0.05၊ **P<0.01 နှင့် ***P<0.001) ၏ပုံများကို (ညာဘက်) ပြထားသည်။စကေးဘား၊ 100 µm။ ဒေတာကို BLA၊ basolateral အာသီး၊ MDT၊ dorsomedial thalamic nucleus၊ PAG၊ periaqueductal grey ၏ ပျမ်းမျှ ± စံအမှားအဖြစ် ဖော်ပြသည်။
နောက်ဆုံးတွင်၊ t-hCO သည် ကြွက်အပြုအမူကို ပြုပြင်နိုင်မလား။ ၎င်းကိုစမ်းသပ်ရန်အတွက်၊ ကျွန်ုပ်တို့သည် hChR2-EYFP-expressing hCO ကို S1 သို့ အစားထိုးခဲ့ပြီး ရက် 90 ကြာပြီးနောက်၊ အလင်းပေးပို့ရန်အတွက် t-hCO သို့ optical fiber များကို စိုက်ထည့်ခဲ့ပါသည်။ ထို့နောက် ကျွန်ုပ်တို့သည် ကြွက်များကို ပြုပြင်မွမ်းမံထားသော အအေးပေးစက်ပါရာဒိုင်း (ပုံ။ ၅ နာရီ) ဖြင့် လေ့ကျင့်သင်ကြားပေးပါသည်။ ကျွန်ုပ်တို့သည် တိရစ္ဆာန်များကို အပြုအမူဆိုင်ရာစမ်းသပ်ခန်းတွင် ထားရှိကာ 5 စက္ကန့်အပြာရောင် (473 nm) နှင့် အနီရောင် (635 nm) လေဆာလှုံ့ဆော်မှုကို ကျပန်းအသုံးပြုပါသည်။ တိရိစ္ဆာန်များသည် အပြာရောင်အလင်းလှုံ့ဆော်မှုအတွင်း နို့သော်လည်း အနီရောင်အလင်းနှိုးဆွမှုအတွင်း နို့မတိုက်ပါက ရေဆုချီးမြှင့်ခံရသည်။ လေ့ကျင့်မှုပထမနေ့တွင် တိရစ္ဆာန်များသည် အပြာရောင် သို့မဟုတ် အနီရောင်အလင်းဖြင့် နှိုးဆွလိုက်သောအခါ လျှာဖြင့် နမ်းခြင်းတွင် ထူးခြားမှုမတွေ့ရပေ။ သို့သော်၊ 15 ရက်၌ hCO နှင့် hChR2-EYFP ကိုဖော်ပြသည့် hCO ဖြင့် အစားထိုးထားသော တိရစ္ဆာန်များသည် အပြာရောင်အလင်းဖြင့် နှိုးဆွလိုက်သောအခါတွင် အနီရောင်အလင်းလှုံ့ဆော်မှုထက်စာလျှင် ပိုမိုတက်ကြွစွာ လျှာကိုပြသခဲ့သည်။ ထိန်းချုပ်မှု fluorophore ကိုဖော်ပြသော hCO ဖြင့် အစားထိုးထားသော ထိန်းချုပ်တိရစ္ဆာန်များတွင် လျှာဖြင့်အမူအရာပြောင်းလဲမှုများကို မတွေ့ရှိရပါ ဤအချက်အလက်များအရ t-hCO ဆဲလ်များသည် ဆုလာဘ်ရှာဖွေသောအပြုအမူကို လှုံ့ဆော်ရန် ကြွက်နူရွန်များကို အသက်သွင်းနိုင်သည်ဟု အကြံပြုထားသည်။ ဤအပြုအမူပြောင်းလဲမှုများတွင် မည်သည့်ကြွက် t-hCO အာရုံကြောဆားကစ်များ ပါဝင်နိုင်သည်ကို ရှာဖွေရန်၊ ကျွန်ုပ်တို့သည် လေ့ကျင့်ထားသောတိရစ္ဆာန်များတွင် t-hCO ကို optogenetically အသက်သွင်းပြီး မိနစ် 90 အကြာတွင် တစ်ရှူးများကို ရိတ်သိမ်းပါသည်။ Immunohistochemistry သည် လှုံ့ဆော်မှုမရှိဘဲ ထိန်းချုပ်ထားသောတိရစ္ဆာန်များတွင်ဖြစ်စေ သို့မဟုတ် တိရစ္ဆာန်များတွင်ဖြစ်စေ ဖော်ပြသည့် medial prefrontal cortex၊ medial thalamus နှင့် periaqueductal gray matter အပါအဝင် လှုံ့ဆော်မှုရှိသောအပြုအမူတွင်ပါဝင်သော ဦးနှောက်ဒေသအများအပြားရှိ လှုပ်ရှားမှု-မှီခို FOS ပရိုတိန်း၏ဖော်ပြချက်ကို ထုတ်ဖော်ပြသခဲ့သည်။ ဆန် ၅ မီတာ)။ စုစည်းထားသော ဤအချက်အလက်များအရ t-hCO သည် အပြုအမူကို မောင်းနှင်ရန် ကြွက်များ၏ အာရုံကြောဆိုင်ရာ လုပ်ဆောင်ချက်ကို ပြုပြင်ပြောင်းလဲနိုင်သည်ဟု အကြံပြုထားသည်။
Neural organoids များသည် vitro တွင်ရှိသော လူသားများ၏ ဖွံ့ဖြိုးတိုးတက်မှုနှင့် ရောဂါများကို လေ့လာရန်အတွက် အလားအလာရှိသော စနစ်တစ်ခုကို ကိုယ်စားပြုသော်လည်း ၎င်းတို့သည် vivo တွင်ရှိသော ဆားကစ်များကြားတွင် ချိတ်ဆက်မှုနည်းပါးခြင်းကြောင့် ၎င်းတို့ကို ကန့်သတ်ထားသည်။ ကျွန်ုပ်တို့သည် လူ့ဆဲလ်ဖွံ့ဖြိုးတိုးတက်မှုနှင့် vivo တွင် လူ့ဆဲလ်ဖွံ့ဖြိုးတိုးတက်မှုနှင့် လုပ်ဆောင်ချက်များကို လေ့လာရန် hCO ကို S1 အဖြစ် ခုခံအားကျစေသော အစောပိုင်းကြွက်များကို S1 သို့ အစားထိုးပြီး တီထွင်ခဲ့သည်။ t-hCO သည် vitro28 တွင် မတွေ့ရှိရသော ရင့်ကျက်သောဆဲလ်အမျိုးအစားများကို ဖွံ့ဖြိုးစေပြီး t-hCO သည် ကြွက်ဦးနှောက်ထဲသို့ ခန္ဓာဗေဒအရ ပေါင်းစပ်လုပ်ဆောင်နိုင်သည်ကို ကျွန်ုပ်တို့ပြသခဲ့သည်။ t-hCO ၏ပေါင်းစပ်မှုသည် ကြွက်အာရုံကြောဆားကစ်များအတွင်းသို့ ပေါင်းစပ်ခြင်းသည် ကျွန်ုပ်တို့အား လူသားဆဲလ်လူလာလှုပ်ရှားမှုနှင့် လေ့လာထားသောတိရစ္ဆာန်အမူအကျင့်များကြား ချိတ်ဆက်မှုကို ထူထောင်နိုင်စေကာ t-hCO အာရုံကြောများသည် အပြုအမူဆိုင်ရာတုံ့ပြန်မှုများကို တွန်းအားပေးရန်အတွက် ကြွက်များ၏အာရုံကြောဆိုင်ရာလုပ်ဆောင်ချက်ကို ပြုပြင်ပြောင်းလဲနိုင်ကြောင်း ပြသခဲ့သည်။
ကျွန်ုပ်တို့ဖော်ပြသည့် ပလက်ဖောင်းသည် လူသားဆဲလ်များကို ကြွက်ဦးနှောက်အဖြစ်သို့ အစားထိုးခြင်းဆိုင်ရာ ယခင်သုတေသနများထက် အားသာချက်များစွာရှိသည်။ ဦးစွာ၊ ကျွန်ုပ်တို့သည် ခန္ဓာဗေဒနှင့် လုပ်ငန်းဆိုင်ရာ ပေါင်းစပ်မှုကို လွယ်ကူချောမွေ့စေမည့် အစောပိုင်း မီးဖွားပြီးနောက် ကြွက်များ၏ ကော်တီဇောသို့ hCO ကို အစားထိုး စိုက်ပျိုးခဲ့ပါသည်။ ဒုတိယ၊ t-hCO MRI စောင့်ကြည့်ခြင်းသည် ကျွန်ုပ်တို့အား သက်ရှိတိရိစ္ဆာန်များတွင် အကျင့်ပျက်ခြစားမှု အနေအထားနှင့် ကြီးထွားမှုကို လေ့လာနိုင်စေပြီး၊ ကျွန်ုပ်တို့အား ရေရှည်တိရစ္ဆာန်ပေါင်းစုံလေ့လာမှုများ ပြုလုပ်ရန်နှင့် hiPS ဆဲလ်အများအပြား၏ ယုံကြည်စိတ်ချရမှုကို ထူထောင်နိုင်စေပါသည်။ နောက်ဆုံးတွင်၊ ကျွန်ုပ်တို့သည် လူသားဆဲလ်များကို ပျက်စီးမှုနည်းပြီး ကြွက်ဦးနှောက်ရှိ လူ့ကော်တီရွန်များ၏ ပေါင်းစည်းမှုနှင့် မျိုးဆက်ပွားမှုကို မြှင့်တင်ပေးနိုင်သည့် သီးခြားဆဲလ်ဆိုင်းဆိုင်းများကို ခွဲထုတ်မည့်အစား မပျက်မစီးသော organoids များကို အစားထိုးစိုက်ပျိုးခဲ့သည်။
ဤပလပ်ဖောင်းတွင် တိုးတက်မှုများရှိနေသော်လည်း၊ ယာယီ၊ အာကာသနှင့် မျိုးစိတ်ဖြတ်ကျော်မှု ကန့်သတ်ချက်များသည် ဖွံ့ဖြိုးတိုးတက်မှု၏အစောပိုင်းအဆင့်တွင်ပင် အစားထိုးကုသမှုပြီးနောက်တွင်ပင် လူသားတို့၏ အာရုံကြောဆားကစ်များ ဖွဲ့စည်းခြင်းကို တားဆီးကာကွယ်နိုင်သည်ကို ကျွန်ုပ်တို့ အသိအမှတ်ပြုပါသည်။ ဥပမာအားဖြင့်၊ t-hCO တွင်တွေ့ရှိရသော spontaneous လုပ်ဆောင်ချက်သည် cortical ဖွံ့ဖြိုးတိုးတက်မှုအတွင်း လေ့လာတွေ့ရှိထားသော စည်းချက်နှင့်ဆင်တူသည့် ဖွံ့ဖြိုးတိုးတက်မှုဆိုင်ရာ phenotype ကိုကိုယ်စားပြုခြင်းရှိ၊ မရှိ၊ သို့မဟုတ် t-hCO တွင်ပါရှိသောဖိနှိပ်ထားသောဆဲလ်အမျိုးအစားများမရှိခြင်းကြောင့်ဖြစ်မဖြစ် မရှင်းလင်းပါ။ အလားတူ၊ t-hCO တွင် lamination မရှိခြင်းသည် ကွင်းဆက်ချိတ်ဆက်မှု 30 ကို မည်မျှအတိုင်းအတာအထိ သက်ရောက်မှုရှိသည်ကို ရှင်းရှင်းလင်းလင်းမသိရပါ။ အနာဂတ်လုပ်ငန်းသည် လူသား microglia၊ လူ့ endothelial ဆဲလ်များနှင့် GABAergic interneurons အစိတ်အပိုင်းများကို တပ်ဆင်ခြင်း 6 in vitro ကိုအသုံးပြု၍ ပြသထားသည့်အတိုင်း အခြားဆဲလ်အမျိုးအစားများ ပေါင်းစပ်ခြင်းအပေါ် အာရုံစိုက်မည်ဖြစ်ပြီး ပြောင်းလဲလာသော t-hCO တွင် အာရုံကြောပေါင်းစပ်ခြင်းနှင့် စီမံဆောင်ရွက်ပေးနိုင်ပုံကို နားလည်ခြင်း။ လူနာထံမှရရှိသော ဆဲလ်များတွင် ကူးယူဖော်ပြမှု၊ synaptic နှင့် အပြုအမူဆိုင်ရာ အဆင့်များ။
ယေဘုယျအားဖြင့်၊ ၎င်းသည် vivo ပလပ်ဖောင်းရှိ လူ့ဦးနှောက်ဖွံ့ဖြိုးမှုနှင့် ရောဂါသုတေသနတွင် ဖြည့်စွက်နိုင်သည့် အစွမ်းထက်သောအရင်းအမြစ်ကို ကိုယ်စားပြုသည်။ ဤပလပ်ဖောင်းသည် အခြားတွေ့ရခဲသော လူနာမှဆင်းသက်လာသောဆဲလ်များတွင် ဆန်းသစ်သော strand-level phenotypes များကို ရှာဖွေတွေ့ရှိနိုင်ပြီး ကုထုံးနည်းဗျူဟာအသစ်များကို စမ်းသပ်နိုင်မည်ဟု ကျွန်ုပ်တို့ မျှော်လင့်ပါသည်။
ကျွန်ုပ်တို့သည် ယခင်က ဖော်ပြထားသည့်အတိုင်း HiPS ဆဲလ်များမှ hCO2.5 ကို ထုတ်လုပ်ခဲ့သည်။ feeder အလွှာများပေါ်တွင် မွေးမြူထားသော hiPS ဆဲလ်များမှ hCO ထုတ်လုပ်မှုကို စတင်ရန်အတွက်၊ hiPS ဆဲလ်ယဉ်ကျေးမှု အလယ်အလတ်ရှိသော ပန်းကန်များပါရှိသော ပန်းကန်ပြားများပါရှိသော hiPS ဆဲလ်များ၏ နဂိုအတိုင်း ကိုလိုနီများကို ဖယ်ထုတ်ခြင်း (0.35 mg/mL) မှ ဖယ်ရှားခဲ့သည်။ (Corning) သည် SMAD inhibitors dorsomorphine (5 μM; P5499, Sigma-Aldrich) နှင့် SB-431542 (10 μM; 1614, Tocris) နှင့် ROCK inhibitor Y-27632 (10 μM; S1049, Selleckchem) တို့ဖြင့် ဖြည့်စွက်ထားသည်။ ပထမ 5 ရက်အတွင်း၊ hiPS ဆဲလ်အလတ်စားကိုနေ့စဉ်ပြောင်းလဲခဲ့ပြီး dorsomorphine နှင့် SB-431542 တို့ကိုထည့်သွင်းခဲ့သည်။ ဆိုင်းငံ့ခံရသည့် ခြောက်ရက်မြောက်နေ့တွင်၊ အာရုံကြော spheroids များကို neurobasal-A (10888၊ Life Technologies)၊ ဗီတာမင် A မပါဘဲ B-27 ဖြည့်စွက်စာ (12587၊ Life Technologies)၊ GlutaMax (1:100၊ Life Technologies)၊ penicillin နှင့် 1000 ပါ၀င်သော ဇီဝဗေဒဆိုင်ရာ ဖြည့်စွက်စာ၊ epidermal ကြီးထွားမှုအချက် (EGF; 20 ng ml−1; R&D စနစ်များ) နှင့် fibroblast ကြီးထွားမှုအချက် 2 (FGF2; 20 ng ml−1; R&D စနစ်များ) သည် နေ့ရက် 24 ရက်အထိ။ 25 ရက်မှ 42 ရက်အထိ၊ အလယ်အလတ်ကို ဦးနှောက်မှဆင်းသက်လာသော အာရုံကြောဆိုင်ရာအချက် (BDNF; 20 ng ml−1) နှင့် neurotrophin 3 ml တို့နှင့် ဖြည့်စွက်ထားပါသည်။ ng ml−1; Peprotech) အလယ်အလတ်ပြောင်းလဲမှုများနှင့် နေ့ချင်းညချင်း။ ဆိုင်းငံ့ခံရသည့် ခြောက်ရက်မြောက်နေ့တွင်၊ အာရုံကြော spheroids များကို neurobasal-A (10888၊ Life Technologies)၊ ဗီတာမင် A မပါဘဲ B-27 ဖြည့်စွက်စာ (12587၊ Life Technologies)၊ GlutaMax (1:100၊ Life Technologies)၊ penicillin နှင့် 1000 ပါ၀င်သော ဇီဝဗေဒဆိုင်ရာ ဖြည့်စွက်စာ၊ epidermal ကြီးထွားမှုအချက် (EGF; 20 ng ml−1; R&D စနစ်များ) နှင့် fibroblast ကြီးထွားမှုအချက် 2 (FGF2; 20 ng ml−1; R&D စနစ်များ) သည် နေ့ရက် 24 ရက်အထိ။ 25 ရက်မှ 42 ရက်အထိ၊ အလယ်အလတ်ကို ဦးနှောက်မှဆင်းသက်လာသော အာရုံကြောဆိုင်ရာအချက် (BDNF; 20 ng ml−1) နှင့် neurotrophin 3 ml တို့နှင့် ဖြည့်စွက်ထားပါသည်။ ng ml−1; Peprotech) အလယ်အလတ်ပြောင်းလဲမှုများနှင့် နေ့ချင်းညချင်း။ဆိုင်းငံ့ထားသည့် ခြောက်ရက်မြောက်နေ့တွင်၊ အာရုံကြော spheroids များကို Neurobasal-A (10888၊ Life Technologies)၊ ဗီတာမင် A (12587၊ Life Technologies) မပါဘဲ B-27 ဖြည့်စွက်စာ၊ GlutaMax (1:100၊ Life Technologies) ပါရှိသော အာရုံကြောကြားခံသို့ လွှဲပြောင်းပေးခဲ့သည်။и стрептомицин (1:100၊ Life Technologies) နှင့် дополнены эпидермальным фактором роста (EGF; 20 нг/мл; R&D Systems) နှင့် факто фибробластов 2 (FGF2; 20 нг/мл; R&D စနစ်များ) до 24-го дня. နှင့် streptomycin (1:100၊ Life Technologies) နှင့် epidermal growth factor (EGF; 20 ng/ml; R&D Systems) နှင့် fibroblast growth factor 2 (FGF2; 20 ng/ml; R&D Systems) တို့ဖြင့် ဖြည့်စွက်ပြီး နေ့ 24 ရက်အထိ။ရက်ပေါင်း 25 မှ 42 ရက်အထိ၊ ဦးနှောက်မှရရှိသော neurotrophic factor (BDNF; 20 ng ml-1, Peprotech) နှင့် neurotrophin 3 (NT3; 20 ng ml-1, Peprotech) ကို အလတ်စားသို့ ပေါင်းထည့်ခဲ့ပြီး ကြားခံကို နေ့စဥ်ပြောင်းလဲပါသည်။在悬浮的第6天，将神经球体转移到含有neurobasal-A(10888၊Life Technologies)、不含维生素A的B-27，肥充5前နည်းပညာများ), GlutaMax (1:100၊ Life Technologies)၊ ml-1；R&D စနစ်များ)和成纤维细胞生长因子2(FGF2；20 ng ml-1；R&D စနစ်များ)直至第24天။Facebook (12587၊ Life Technologies) Glutamax (1:100၊ Life TechNOGIS青霉素的神经培养基中链霉素 (1:100၊ Life Technologies) (((20 ng ml-1； r&d စနစ်များ) 成纤维细胞生长 2 (fgf2 ； 20 ng ml- 1；R&D Systems)直至第24天။ На 6-й день суспензии нейросферы были переведены на добавку, содержащую нейробазал-А (10888, Life Technologies-2зал-А) витамина А (12587၊ Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies), пенициллин- нейтрализованный стрептомицин (1:100, Life Technologies) эпидермального фактора роста (EGF; 20 нг мл-1; R&D စနစ်များ) и фактора роста фибробластов 2 (FGF2; 20 нг); 1м-1 6 ရက် နေ့တွင်၊ neurosphere suspension များကို neurobasal-A (10888၊ Life Technologies)၊ B-27 supplemented vitamin A (12587၊ Life Technologies)၊ GlutaMax (1:100၊ Life Technologies)၊ penicillin-neutralized streptomycin ပါ၀င်သော ဖြည့်စွက်အားဆေးသို့ ပြောင်းခဲ့သည်၊ Life-1: (EGF; 20 ng ml-1; R&D စနစ်များ) နှင့် fibroblast ကြီးထွားမှုအချက် 2 (FGF2; 20 ng ml-1) 1; R&D စနစ်များ) до 24-го дня. R&D စနစ်များ) 24 ရက်အထိ။ရက်ပေါင်း 25 မှ 42 ရက်အထိ၊ ဦးနှောက်မှရရှိသော neurotrophic factor (BDNF; 20 ng ml-1, Peprotech) နှင့် neurotrophic factor 3 (NT3; 20 ng ml-1, Peprotech) ကို ယဉ်ကျေးမှုအလတ်စားထဲသို့ နေ့စဉ်ထည့်သွင်းခဲ့သည်။ အလယ်အလတ် တခါပြောင်းတယ်။43 ရက်မှစတင်၍ hCO အား ဖြည့်စွက်မထားသော neurobasal-A ကြားခံ (NM; 1088022၊ Thermo Fisher) ကို 4-6 ရက်တိုင်း အလယ်အလတ်ပြောင်းလဲမှုဖြင့် ထိန်းသိမ်းထားပါသည်။ အစာမကျွေးနိုင်သော အခြေအနေအောက်တွင် မွေးမြူထားသော hiPS ဆဲလ်များမှ hCO ကို ရယူရန်၊ hiPS ဆဲလ်များကို Accutase (AT-104၊ Innovate Cell Technologies) ဖြင့် 37°C တွင် 7 မိနစ်ကြာ ပေါက်ဖွားခဲ့ပြီး ဆဲလ်တစ်ခုတည်းအဖြစ်သို့ ခွဲထုတ်ကာ AggreWell 800 ပြားများ (34815၊ 10s ဆဲလ်တစ်ခုလျှင် Essential Technologies) တွင် ဆဲလ်တစ်ခုလျှင် 34815 × STEMCELL နည်းပညာများ) 8 အလယ်အလတ်ကို ROCK inhibitor Y-27632 (10 μM; S1049၊ Selleckchem) ဖြင့် ဖြည့်စွက်ထားသည်။ 24 နာရီအကြာတွင်၊ ရေတွင်းအတွင်းရှိမီဒီယာကို Essential 6 media (A1516401၊ Life Technologies) ပါဝင်သော dorsomorphine (2.5 μM; P5499၊ Sigma-Aldrich) နှင့် SB-431542 (10 μM) ပါဝင်သော မီဒီယာသို့ ပိုက်ချသည်။ , Tocrida) ။ 2 ရက်မှ 6 ရက်အတွင်း Essential 6 ကြားခံအား နေ့စဉ် dorsomorphine နှင့် ဖြည့်စွက်စာ SB-431542 ဖြင့် အစားထိုးခဲ့သည်။ ဆဋ္ဌမနေ့မှစ၍၊ အာရုံကြောဆိုင်ရာ ဆိုင်းငံ့မှုများကို neurobasal ကြားခံသို့ လွှဲပြောင်းပြီး အထက်တွင်ဖော်ပြထားသည့်အတိုင်း ထိန်းသိမ်းထားသည်။
Stanford University Laboratory Animal Care Administration Committee (APLAC) မှ အတည်ပြုထားသော တိရစ္ဆာန်စောင့်ရှောက်မှု လမ်းညွှန်ချက်များနှင့်အညီ တိရစ္ဆာန်လုပ်ထုံးလုပ်နည်းများအားလုံးကို လုပ်ဆောင်ခဲ့ပါသည်။ ကိုယ်ဝန်ဆောင် euthymic RNU (rnu/+) ကြွက်များကို (Charles River Laboratories) မှ ဝယ်ယူခဲ့သည် သို့မဟုတ် အိမ်တွင်ထားပါ။ တိရစ္ဆာန်များကို အစာနှင့် ရေဖြင့် 12 နာရီ အလင်း-အမှောင် လည်ပတ်မှုတွင် ထိန်းသိမ်းထားသည်။ မသုတ်မီ အရွယ်မရောက်သေးသော ပါးသိုင်းမွှေးများ ကြီးထွားလာမှုကြောင့် အသက်သုံးရက်မှ ခုနစ်ရက်အတွင်း အသက်သုံးရက်မှ ခုနစ်ရက်အတွင်း ကိုယ်လုံးတီး (FOXN1–/–) ကြွက်ကလေးများကို တွေ့ရှိခဲ့သည်။ ခွေးပေါက်လေးများ (အထီးနှင့်အမ) များကို 2-3% isoflurane ဖြင့် မေ့ဆေးပေးပြီး စတီရီယိုတာစင်ဘောင်ပေါ်တွင် ထားရှိခဲ့သည်။ S1 အထက်တွင် ခန့်မှန်းခြေ 2-3 မီလီမီတာ အချင်းရှိသော ဦးခေါင်းခွံကို trepanation ပြုလုပ်ပြီး dura mater ၏ ခိုင်မာမှုကို ထိန်းသိမ်းထားသည်။ ထို့နောက် dura ကိုဖောက်ရန် craniotomy အပြင်ဘက်ရှိ 30-G အပ်တစ်ချောင်း (ခန့်မှန်းခြေ 0.3 မီလီမီတာ) ကိုအသုံးပြုပါ။ ထို့နောက် HCO ကို ပါးလွှာသော 3×3 cm parafilm တွင် လိမ်းပြီး ပိုနေသော medium ကို ဖယ်ရှားပါ။ 23 G၊ 45° အပ်တစ်ချောင်းနှင့် တွဲထားသော Hamilton ပြွတ်တစ်ချောင်းကို အသုံးပြု၍ အပ်၏အစွန်းဆုံးသို့ hCO ကို ညင်သာစွာဆွဲပါ။ ထို့နောက် stereotaxic ကိရိယာနှင့် ချိတ်ဆက်ထားသော ဆေးထိုးပန့်ပေါ်တွင် ဆေးထိုးဆေးကို တပ်ဆင်ပါ။ ထို့နောက် အပ်၏ထိပ်ဖျားကို dura (z = 0 mm) တွင် ယခင်လုပ်ထားသော 0.3 မီလီမီတာ ကျယ်သော ထိုးဖောက်အပေါက်ပေါ်တွင် ထားကာ ဆေးထိုးအပ်ကို 1-2 မီလီမီတာ (z = ခန့်မှန်းခြေ -1.5 မီလီမီတာ) ကျဉ်းစေကာ အပ်ကို dura mater A. အကြားသိပ်သည်းသော တံဆိပ်တစ်ခု ဖြစ်ပေါ်လာသည်အထိ ဖြစ်သည်။ ထို့နောက် z = -0.5 mm ဖြင့် ကော်တီလာမျက်နှာပြင်၏အလယ်ဗဟိုသို့ ဆေးပြွတ်ကိုမြှင့်ပြီး hCO နှုန်း တစ်မိနစ်လျှင် 1-2 µl နှုန်းဖြင့် ထိုးသွင်းပါ။ hCO ဆေးထိုးခြင်းပြီးပါက၊ အပ်ကို တစ်မိနစ်လျှင် 0.2-0.5 မီလီမီတာနှုန်းဖြင့် ပြန်လည်ရုပ်သိမ်းပြီး အရေပြားကို ဆူပွက်စေပြီး ခွေးကလေးအား ပြန်လည်ကောင်းမွန်လာသည်အထိ နွေးထွေးသောအပူပေးပြားပေါ်တွင် ချက်ချင်းတင်ထားသည်။ အချို့သော တိရိစ္ဆာန်များကို နှစ်ဖက် အစားထိုး စိုက်ပျိုးကြသည်။
တိရိစ္ဆာန်လုပ်ထုံးလုပ်နည်းအားလုံးကို စတန်းဖို့ဒ်တက္ကသိုလ် APLAC ခွင့်ပြုထားသော တိရစ္ဆာန်စောင့်ရှောက်မှုလမ်းညွှန်ချက်များနှင့်အညီ လုပ်ဆောင်ခဲ့သည်။ ကြွက်များကို အစားထိုးပြီး ရက်ပေါင်း 60 ထက်ပို၍ မေ့ဆေး 5% isoflurane ဖြင့် သွေးဆောင်ကာ ဓါတ်ပုံရိုက်နေစဉ် 1-3% isoflurane ဖြင့် မေ့ဆေးပေးပါသည်။ အမြင်အာရုံအတွက်၊ 7 Tesla သည် အလျားလိုက် တွင်းတွင်းစကင်နာ Bruker (Bruker Corp.) ကို အပြည်ပြည်ဆိုင်ရာလျှပ်စစ်ကုမ္ပဏီ (IECO) gradient drive ဖြင့် တက်ကြွစွာကာကွယ်ထားသော၊ အတွင်းပိုင်းအချင်း 120 mm (600 mT/m, 1000 T/m/s) ဖြင့် AVANCE ကို အသုံးပြုထားသည်။ III၊ ရှစ်လိုင်း ဘက်စုံကွိုင် RF နှင့် multi-core စွမ်းရည်များနှင့် ပါရှိသော Paravision 6.0.1 ပလပ်ဖောင်း။ လက်ခံရန်အတွက်သာ 86 မီလီမီတာ အတွင်းပိုင်း အချင်းရှိသော 86 မီလီမီတာ နှင့် လေးလိုင်းချောင်း အအေးခံ RF ကွိုင်ကို အသုံးပြု၍ အသံဖမ်းခြင်းကို လုပ်ဆောင်သည်။ Axial 2D Turbo-RARE (ထပ်ခါတလဲလဲအချိန် = 2500 ms၊ ပဲ့တင်သံ = 33 ms၊ ပျမ်းမျှ 2 ခု)၊ အချပ် ၁၆ ချပ်၊ အထူ 0.6–0.8 မီလီမီတာ၊ 256 × 256 နမူနာများ ပါရှိသည်။ အတွင်းအချင်း 2 စင်တီမီတာ (Rapid MR International, LLC) ရှိသော volumetric RF coil ဖြင့် အချက်ပြမှုများကို လက်ခံရရှိခဲ့သည်။ နောက်ဆုံးတွင်၊ 3D ပုံဖေါ်ခြင်းနှင့် အသံပိုင်းခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာခြင်းအတွက် built-in Imaris (BitPlane) မျက်နှာပြင် ခန့်မှန်းချက်လုပ်ဆောင်ချက်များကို အသုံးပြုပါ။ အောင်မြင်သောအစားထိုးကုသမှုကို အစားထိုးစိုက်ထားသောကမ္ဘာခြမ်းတွင် စဉ်ဆက်မပြတ် T2 အလေးချိန်ရှိသော MRI အချက်ပြသည့်နေရာများအဖြစ် သတ်မှတ်သည်။ အဂတိလိုက်စားမှု ငြင်းပယ်ခြင်းကို အစားထိုးထားသော ကမ္ဘာခြမ်းရှိ စဉ်ဆက်မပြတ် T2 အလေးချိန်ရှိသော MRI အချက်ပြမှု၏ ဧရိယာများကို မထုတ်ပေးသည့် လာဘ်စားမှုအဖြစ် သတ်မှတ်သည်။ Subcortical t-hCO ကို နောက်ဆက်တွဲ ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုမှ ဖယ်ထုတ်ထားသည်။
ဓါတ်ပုံနှစ်ပုံ ကယ်လ်စီယမ်ပုံရိပ်အတွက် hCO တွင် GCaMP6s ကို တည်ငြိမ်စွာဖော်ပြရန်၊ hiPS ဆဲလ်များသည် pLV[Exp]-EF1a::GcaMP6s-WPRE-Puro ဖြင့် ပိုးသတ်ပြီးနောက်တွင် ပဋိဇီဝဆေးရွေးချယ်မှုဖြင့်။ အတိုချုပ်အားဖြင့်၊ ဆဲလ်များသည် EDTA နှင့် ဆက်စပ်နေပြီး 1 ml of Essential 8 ကြားခံအား polybrine (5 μg/ml) နှင့် virus 15 μl ပါဝင်မှုတွင် ခန့်မှန်းခြေ 300,000 ဆဲလ်သိပ်သည်းဆတွင် ဆိုင်းငံ့ထားသည်။ ထို့နောက် ဆဲလ်များကို ဆိုင်းငံ့ထားကာ မိနစ် 60 ကြာ ပေါက်ဖွားပြီး ရေတွင်းတစ်ခုလျှင် ဆဲလ် 50,000 ရှိသော သိပ်သည်းဆဖြင့် မျိုးစေ့ချသည်။ ဆုံပြီးနောက်၊ ဆဲလ်များကို 5-10 μg ml-1 puromycin ဖြင့် 5-10 ရက်ကြာ သို့မဟုတ် တည်ငြိမ်သော ကိုလိုနီများပေါ်လာသည်အထိ ကုသပေးခဲ့သည်။ အချို့သော ပြုပြင်မွမ်းမံမှုများဖြင့် ယခင်က ဖော်ပြထားသည့်အတိုင်း စူးရှသော hCO ကူးစက်မှုကို လုပ်ဆောင်ခဲ့သည်။ အတိုချုပ်အားဖြင့်၊ နေ့ 30-45 hCO ကို 1.5 ml အာရုံကြောအလတ်စား 100 µl ပါဝင်သော Eppendorf microcentrifuge ပြွန်များထဲသို့ လွှဲပြောင်းပါ။ ထို့နောက်အလတ်စား၏ 90 µl ခန့်ကိုဖယ်ရှားပြီး၊ မြင့်မားသော titer lentivirus 3-6 µl (0.5 x 108 မှ 1.2 x 109) ကိုပြွန်ထဲသို့ထည့်ကာ hCO ကို incubator သို့ မိနစ် 30 လွှဲပြောင်းပေးသည်။ ထို့နောက် ပြွန်တစ်ခုစီသို့ အလတ်စား 90-100 µl ထည့်ပြီး သားဥပြွန်များကို မီးဖိုထဲသို့ ညတွင်းချင်း ပြန်ထည့်ပါ။ နောက်တစ်နေ့တွင်၊ hCO ကို လတ်ဆတ်သော အာရုံကြောအလယ်အလတ်သို့ ချိတ်ဆက်မှုနည်းသော ပန်းကန်ပြားများဖြင့် လွှဲပြောင်းပါ။ 7 ရက်အကြာတွင်၊ hCO ကို ပိုးဝင်ခြင်းအရည်အသွေးကို ပုံဖော်ခြင်းနှင့် အကဲဖြတ်ရန်အတွက် ၂၄ တွင်းရှိသော ဖန်အောက်ခြေပြားများသို့ လွှဲပြောင်းခဲ့သည်။ pLV[Exp]-SYN1::EYFP-WPRE နှင့် pLV[Exp]-SYN1::hChR2-EYFP-WPRE ကို VectorBuilder မှ ထုတ်လုပ်ခဲ့သည်။ Lentivirus ကို စမ်းသပ်မှုအများစုတွင် ၎င်းကို host genome တွင် ပေါင်းစည်းထားသောကြောင့် ရောဂါပိုးရှိဆဲလ်လိုင်းများတွင် သတင်းထောက် gene ထုတ်ဖော်မှုကို ခွင့်ပြုပေးသောကြောင့်ဖြစ်သည်။ ခွေးရူးပြန်ရောဂါနောက်ဆက်တွဲအတွက်၊ နေ့ 30-45 hCO သည် ခွေးရူးပြန်ရောဂါ-ΔG-eGFP နှင့် AAV-DJ-EF1a-CVS-G-WPRE-pGHpA (plasmid #67528၊ Addgene) ဖြင့် ခွေးရူးပြန်ရောဂါကို ၃ ရက်ကြာ သေချာဆေးကြောပြီး S1 တွင် ကြွက်အစားထိုးစိုက်ပြီး ၇-၁၄ ရက်ကြာ ထိန်းသိမ်းထားသည်။
immunocytochemistry အတွက်၊ တိရစ္ဆာန်များကို မေ့ဆေးပေးပြီး PBS ဖြင့် transcardially ရောနှောပြီး နောက်တွင် 4% paraformaldehyde (PBS; Electron Microscopy Sciences) တွင် 4% ပါဝင်သည်။ ဦးနှောက်ကို 4% PFA တွင် 2 နာရီကြာ သို့မဟုတ် 4°C တွင် တစ်ညလုံးပြုပြင်ပြီး၊ PBS တွင် 30% sucrose တွင် 48-72 နာရီကြာ၊ 1:1၊ 30% sucrose တွင်ထည့်သွင်းထားသည်- OCT (Tissue-Tek OCT Compound 4583 , Sakura Finetek 3 ကိုအသုံးပြု၍ coronal cryo အပိုင်း) နှင့် statm ကိုအသုံးပြုထားသည်။ (Leica)။ ထူထပ်သောအပိုင်းများ၏ immunohistochemistry အတွက်၊ တိရစ္ဆာန်များကို PBS ဖြင့် ရောနှောပြီး ဦးနှောက်ကို 300-400 µm တွင် vibratome (Leica) သုံးပြီး ခွဲစိပ်ပေးကာ အပိုင်းများကို 4% PFA ဖြင့် မိနစ် 30 ကြာ ပြုပြင်ထားသည်။ ထို့နောက် cryosections သို့မဟုတ် ထူထဲသောအပိုင်းများကို PBS ဖြင့်ဆေးကြောပြီး အခန်းအပူချိန်တွင် 1 နာရီ (10% ပုံမှန်မြည်းသွေးရည်ကြည် (NDS) နှင့် 0.3% Triton X-100 PBS တွင် ရောထားသော) နှင့် ပိတ်ဆို့ခြင်းဖြေရှင်းချက် 4°C တွင်ပိတ်ဆို့ထားသည်။ - Incubation Cryosections ကို ညတွင်းချင်း ပေါက်ဖွားပြီး ထူထဲသောအပိုင်းများကို 5 ရက်ကြာ ပေါက်ဖွားစေပါသည်။ အသုံးပြုထားသော မူလပဋိပစ္စည်းများမှာ- ဆန့်ကျင်-NeuN (မောက်စ်၊ 1:500; ab104224၊ abcam) ဆန့်ကျင် CTIP2 (ကြွက်၊ 1:300; ab18465၊ abcam)၊ ဆန့်ကျင်-GFAP (ယုန်၊ 1:1,000; Z0334၊ Dako)၊ anti-GFP (01ch)၊ GTX13970၊ GeneTex)၊ anti-HNA (မောက်စ်၊ 1:200; ab191181၊ abcam)၊ anti-NeuN (ယုန်၊ 1:500; ABN78၊ Millipore)၊ anti-PDGFRA (ယုန်၊ 1:200; sc-338၊ Santa Cruz)၊ ဆန့်ကျင်ဘက် (2) HPA047819၊ Atlas Antibodies), anti-RECA-1 (မောက်စ်၊ 1:50; ab9774, abcam), anti-SCG2 (ယုန်၊ 1:100; 20357-1-AP, Proteintech), anti-SOX9 (ဆိတ်၊ 1:500; AF3075)၊ 1:100; AF1166၊ R&D စနစ်များ)၊ anti-STEM121 (မောက်စ်၊ 1:200; Y40410၊ Takara Bio)၊ anti-SATB2 (မောက်စ်၊ 1:50၊ ab51502၊ abcam), anti-GAD65/67 (ယုန်၊ 1:4900)၊ 1:100; ab5076၊ abcam)။ အသုံးပြုထားသော ပင်မပဋိပစ္စည်း များမှာ- ဆန့်ကျင်-NeuN (မောက်စ်၊ 1:500; ab104224၊ abcam) ဆန့်ကျင် CTIP2 (ကြွက်၊ 1:300; ab18465၊ abcam)၊ ဆန့်ကျင်-GFAP (ယုန်၊ 1:1,000; Z0334၊ Dako), anti-GFP (01ch; GTX13970၊ GeneTex)၊ anti-HNA (မောက်စ်၊ 1:200; ab191181၊ abcam)၊ anti-NeuN (ယုန်၊ 1:500; ABN78၊ Millipore)၊ anti-PDGFRA (ယုန်၊ 1:200; sc-338၊ Santa Cruz)၊ ဆန့်ကျင်ဘက် (2) HPA047819၊ Atlas Antibodies), anti-RECA-1 (မောက်စ်၊ 1:50; ab9774, abcam), anti-SCG2 (ယုန် , 1:100; 20357-1-AP, Proteintech), anti-SOX9 (ဆိတ်၊ 1:500; Rgo Net, G500)၊ 1:100; AF1166၊ R&D စနစ်များ)၊ ဆန့်ကျင်ဘက် STEM121 (မောက်စ် , 1:200; Y40410, Takara Bio), ဆန့်ကျင် SATB2 (မောက်စ်၊ 1:50; ab51502, abcam), ဆန့်ကျင်-GAD65/67 (ယုန်၊ 1:4000; 1:400; 1:100; ab5076၊ abcam)။ Использовались следующие первичные антитела: анти-NeuN (мышиные၊ 1:500; ab104224, abcam), анти-CTIP2 (кр,80,5сины) abcam), анти-GFAP (кроличьи, 1:1000; Z0334, Dako), анти- -GFP (курица, 1:1000; GTX13970, GeneTex), анти-HNA (мышь, 8:1910), 1,2010 анти-NeuN (кролик၊ 1:500; ABN78၊ Millipore), анти-PDGFRA (кролик, 1:200; sc-338, Санта-Круз), анти-PPP1R17 (кролик, 1:200; ပဋိပစ္စည်း), анти-RECA-1 (мышь, 1:50; ab9774, abcam), анти-SCG2 (кролик , 1:100; 20357-1-AP, ပရိုတိန်းနည်းပညာ), анти-SOX9 (козий, 1:35&07; AF)၊ нетрин G1a (козий, 1:100; AF1166, R&D Systems), анти-STEM121 (мышиный , 1:200; Y40410, Takara Bio), анти-SATB2 (мышь, 1:50), 1:50; анти-GAD65/67 (кролик, 1:400; ABN904, Millipore) နှင့် анти-IBA1 (коза, 1 :100; аб5076, абкам)။ အသုံးပြုထားသော ပင်မပဋိပစ္စည်းများမှာ- ဆန့်ကျင်-NeuN (မောက်စ်၊ 1:500; ab104224၊ abcam)၊ anti-CTIP2 (ကြွက်၊ 1:300; ab18465၊ abcam)၊ anti-GFAP (ယုန်၊ 1:1000၊ Z0334၊ Dako)၊ anti-GFP; GFP1010(ကြက်သား)၊ GeneTex)၊ anti-HNA (မောက်စ်၊ 1:200; ab191181၊ abcam)၊ anti-NeuN (ယုန်၊ 1:500; ABN78၊ Millipore)၊ anti-PDGFRA (ယုန်၊ 1:200; sc-338၊ Santa Cruz)၊ anti-PPP1R17 (ယုန်၊ 19:204၊ At)၊ ပဋိပစ္စည်း), ဆန့်ကျင် RECA-1 (မောက်စ်၊ 1:50; ab9774၊ abcam), ဆန့်ကျင်- SCG2 (ယုန်၊ 1:100; 20357-1-AP၊ ပရိုတင်းနည်းပညာ)၊ ဆန့်ကျင်-SOX9 (ဆိတ်၊ 1:500; AF3075၊ R&D စနစ်များ-AF100၊ G10၊ AF10၊ G1a၊ R&D စနစ်များ)၊ ဆန့်ကျင်သော STEM121 (မောက်စ်၊ 1:200; Y40410၊ Takara Bio)၊ anti-SATB2 (မောက်စ်၊ 1:50၊ ab51502၊ abcam)၊ GAD65/67 (ယုန်၊ 1:400၊ ABN904၊ Millipore) နှင့်ဆန့်ကျင်သော SATB10 (goat၊ 6010) abkam)။使用的一抗是：抗NeuN(小鼠၊1:500；ab104224၊abcam)抗CTIP2(大鼠၊1:3 00；ab18465၊abcam)၊抗GFAP(兔၊1:1,000；Z0334၊Dako)၊抗-GF P(鸡၊1:1,000；GTX13970၊GeneTex)၊抗HNA(小鼠၊1:200；ab191181၊abcam)၊抗NeuN(兔၊1:500；ABN78၊Millipore)၊抗PDG 1:200；sc-338၊Santa Cruz)၊抗PPP1R17(兔၊1:200；HPA047819၊Atlas抗体)၊抗RECA-1(小鼠၊1:50；ab9774劔၊ SC) 1:100；20357-1-AP၊Proteintech)၊抗SOX9(山羊၊1:500；AF3075၊R&D Systems)၊Netrin G1a(1:100；AF1166၊R&D စနစ်များ 1:207၊ ST;Download -GFP(鸡၊1:1,000；GTX13970၊GeneTex)၊抗HNA(小鼠၊1:200；ab191181၊abcam)၊抗NeuN(兔၊1:500；ABN78၊Milloperore＊弊弊200；sc-338၊Santa Cruz)၊抗PPP1R17(兔၊1:200；HPA047819၊Atlas抗体)၊抗RECA-1(小鼠၊1:50；ab9774၊ abcam)၊ 100；20357-1-AP၊Proteintech)၊抗SOX9(山羊၊1:500；AF3075၊ R&D စနစ်များ)၊Netrin G1a(1:100；AF1166၊ R&D စနစ်များ)၊ 頏1:20Y40410၊ Takara Bio)၊ anti-SATB2 (မောက်စ်၊ 1:50; ab51502၊ abcam)၊ anti-GAD65/67 (ယုန်၊ 1:400; ABN904၊ Millipore) နှင့် anti-IBA1 (ဆိတ်၊ 1:100; ab5076၊ abcam)။အသုံးပြုထားသော ပင်မပဋိပစ္စည်းများမှာ- ဆန့်ကျင်-NeuN (မောက်စ်၊ 1:500; ab104224၊ abcam), ဆန့်ကျင် CTIP2 (ကြွက်၊ 1:300; ab18465၊ abcam), ဆန့်ကျင်-GFAP (ယုန်၊ 1:1000; Z0334၊ Dako)။ ဆန့်ကျင်သော GFP (ကြက်၊ 1:1000; GTX13970၊ GeneTex)၊ anti-HNA (မောက်စ်၊ 1:200; ab191181၊ abcam)၊ ဆန့်ကျင်ဘက် NeuN (ယုန်၊ 1:500; ABN78၊ Millipore)၊ anti-PDGFRA (000၊ ယုန်၊ 1-1:00) ဆန့်ကျင် PPP1R17 (ယုန်၊ 1:200; HPA047819၊ Atlas ပဋိပစ္စည်း)၊ ဆန့်ကျင် RECA-1 (မောက်စ်၊ 1:50; ab9774၊ abcam), ဆန့်ကျင်- SCG2 (ယုန်), 1:100;20357-1-AP၊ Proteintech), анти-SOX9 (коза, 1:500; AF3075, R&D Systems), Нетрин G1a (коза, 1:100; AF1166, R&D Systems), анть1 (1:20; STEM) Y40410၊ Takara Bio), анти-SATB2 (мышь, 1:50; ab51502, abcam), анти-GAD65/67 (кролик, 1:400; ABN904, Millipore) и анти-5B70; , ко:1зба70; абкам)။ 20357-1-AP၊ Proteintech)၊ anti-SOX9 (ဆိတ်၊ 1:500; AF3075၊ R&D စနစ်များ)၊ Netrin G1a (ဆိတ်၊ 1:100; AF1166၊ R&D စနစ်များ)၊ anti-STEM121 (မောက်စ်၊ 1:200၊ Takara2041) ဆန့်ကျင်ဘက်၊ 1:50; ab51502၊ abcam)၊ GAD65/67 (ယုန်၊ 1:400; ABN904၊ Millipore) နှင့် anti-IBA1 (ဆိတ်၊ 1:100; ab5076၊ abkam)။ထို့နောက် အပိုင်းများကို PBS ဖြင့် ဆေးကြောပြီး အခန်းအပူချိန် (အေးခဲထားသော အပိုင်းများ) တွင် 1 နာရီကြာ သို့မဟုတ် 4°C (ထူထပ်သော အပိုင်းများ) တွင် ဖောက်ပြန်ပါသည်။ Alexa Fluor ဒုတိယပဋိပစ္စည်း (Life Technologies) ကို ပိတ်ဆို့ခြင်းဖြေရှင်းချက်တွင် 1:1000 မှေးမှိန်သွားသည်ကို အသုံးပြုခဲ့သည်။ PBS ဖြင့် ဆေးကြောပြီးနောက်၊ နျူကလိယကို Hoechst 33258 (Life Technologies) ဖြင့် မြင်ယောင်လာသည်။ နောက်ဆုံးတွင်၊ Aquamount (Polysciences) ကို အသုံးပြု၍ အဖုံးများပါရှိသော အဏုကြည့်မှန်ဘီလူး (Fisher Scientific) ပေါ်တွင် ချထားကာ Keyence fluorescent microscope (BZ-X ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာသူ) သို့မဟုတ် ပုံပေါ်ရှိ Leica TCS SP8 confocal microscope (Las-X) ပေါ်တွင် ပိုင်းခြားစိတ်ဖြာထားသည်။ ပုံများကို ImageJ ပရိုဂရမ် (ဖီဂျီ) ကို အသုံးပြု၍ လုပ်ဆောင်ခဲ့သည်။ t-hCO နှင့် rat cortex ရှိ လူ့အာရုံကြောများ၏ အချိုးအစားကို တွက်ချက်ရန်အတွက် 387.5 μm ကျယ်ဝန်းသော စတုဂံပုံများကို t-hCO ၏ဗဟို၊ ကြွက်ကော်တက်စ်၏အစွန်းတွင် သို့မဟုတ် အနီးအနားတွင် ရိုက်ကူးခဲ့သည်။ တစ်သျှူးထင်သာမြင်သာပြောင်းလဲမှုများ၊ HNA+ နျူကလိယနှင့်/သို့မဟုတ် တစ်ရှူးအော်တိုဖျော့ဖျော့ပါဝင်မှုတို့ကို အကဲဖြတ်ခြင်းဖြင့် လာဘ်စားသည့်အနားသတ်များကို ဆုံးဖြတ်သည်။ ပုံတစ်ပုံချင်းစီတွင် NeuN+ နှင့် HNA+ ဆဲလ်များ၏ စုစုပေါင်းအရေအတွက်ကို တူညီသောဧရိယာရှိ NeuN+ ဆဲလ်များ၏ စုစုပေါင်းအရေအတွက်ဖြင့် ပိုင်းခြားထားသည်။ ပုံပလေယာရှိ နျူကလိယပါရှိသောဆဲလ်များကိုသာ ရေတွက်ကြောင်းသေချာစေရန်၊ Hoechst+ ပါသောဆဲလ်များကိုသာ တွက်ချက်မှုတွင် ထည့်သွင်းထားသည်။ ကိန်းဂဏန်းအမှားကို လျှော့ချရန်အတွက် အနည်းဆုံး 1 မီလီမီတာ ခြားထားသော ပုံနှစ်ခုကို ပျမ်းမျှအားဖြင့် တွက်ချက်ထားသည်။
နမူနာကောက်ယူခြင်းမပြုမီ တစ်ပတ်အလိုတွင်၊ အာရုံခံမှုနှိုးဆွမှုကို လျှော့ချရန် ပါးသိုင်းမွှေးများပါသော အမှောင်ခန်းထဲတွင် hCO အစားထိုး တိရစ္ဆာန်များ (ကွဲပြားမှု ၈ လခန့်) ထားရှိပါ။ အချို့သော ပြုပြင်မွမ်းမံမှုများဖြင့် ယခင်က ဖော်ပြထားသည့်အတိုင်း နျူကလိယကို သီးခြားခွဲထုတ်ခဲ့သည်။ အတိုချုပ်အားဖြင့်၊ t-hCO နှင့် hCO သည် ဆပ်ပြာ-စက်ပိုင်းဆိုင်ရာဆဲလ် lysis နှင့် 2 ml ဖန်တစ်ရှူးကြိတ်စက် (D8938၊ Sigma-Aldrich/KIMBLE) ဖြင့် ဖျက်ဆီးခံခဲ့ရသည်။ ထို့နောက် အကြမ်းထည် နူကလိယအား 40 µm စစ်ထုတ်မှုဖြင့် စစ်ထုတ်ပြီး sucrose သိပ်သည်းဆ gradient ကို မလုပ်ဆောင်မီ 320 g တွင် 10 မိနစ်ကြာ အပူချိန် 4°C တွင် centrifuged လုပ်ခဲ့သည်။ centrifugation အဆင့် (320 g တွင် 4°C တွင် 20 မိနစ်ကြာ)၊ နမူနာများကို µl-1 RNase inhibitor 0.2 ယူနစ် (40 u µl-1, AM2682, Ambion) ၏ 0.04% BSA/PBS တွင် ပြန်လည်ရပ်ဆိုင်းပြီး 40 µm စီးဆင်းမှု filter ကိုဖြတ်သွားခဲ့သည်။ ထို့နောက် ခွဲထွက်နေသော နျူကလိယအား 0.02% BSA ပါ၀င်သော PBS တွင် ပြန်လည်ရပ်ဆိုင်းပြီး Chromium Single Cell 3′ ချစ်ပ်တစ်ခုပေါ်တွင် တင်ထားသည် (လမ်းတစ်ကြောင်းလျှင် ဆဲလ် 8,000 ခန့် ပြန်လည်ရယူသည်)။ snRNA-seq စာကြည့်တိုက်များကို Chromium Single cell 3′ GEM၊ Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics) ဖြင့် ပြင်ဆင်ထားပါသည်။ snRNA-seq စာကြည့်တိုက်များကို Chromium Single cell 3′ GEM၊ Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics) ဖြင့် ပြင်ဆင်ထားပါသည်။ Библиотеки snRNA-seq были приготовлены с помощью Chromium Single cell 3′ GEM၊ Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics)။ snRNA-seq စာကြည့်တိုက်များကို Chromium Single cell 3′ GEM၊ Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics) ကို အသုံးပြု၍ ပြင်ဆင်ထားပါသည်။ snRNA-seq 文库是使用Chromium Single cell 3′ GEM、Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics) 制备的。 snRNA-seq 文库是使用Chromium Single cell 3′ GEM、Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics) 制备的。 Библиотеку snRNA-seq готовили с использованием Chromium Single Cell 3′ GEM၊ Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics)။ snRNA-seq စာကြည့်တိုက်ကို Chromium Single Cell 3′ GEM၊ Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics) ကို အသုံးပြု၍ ပြင်ဆင်ထားပါသည်။မတူညီသောနမူနာများမှ စာကြည့်တိုက်များကို NovaSeq S4 (Illumina) တွင် Admera Health မှ စုစည်းပြီး စီတန်းထားပါသည်။
10x Genomics CellRanger ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုဆော့ဖ်ဝဲလ်ပက်ကေ့ဂျ် (ဗားရှင်း 6.1.2) ကို အသုံးပြု၍ putative nuclear barcode တစ်ခုစီအတွက် မျိုးရိုးဗီဇဖော်ပြမှုအဆင့်များကို တွက်ချက်ထားပါသည်။ အထူးသဖြင့်၊ ဖတ်ထားသောစာများသည် လူသား (GRCh38၊ Ensemble၊ ဗားရှင်း 98) နှင့် ကြွက် (Rnor_6.0၊ Ensemble၊ ဗားရှင်း 100) တို့ကို mkref အမိန့်ဖြင့် ဖန်တီးထားသော အကိုးအကားဂျီနိုမ်များ ပေါင်းစပ်ထားပြီး –include-introns=TRUE command ဖြင့် အရေအတွက်ကို အသုံးပြု၍ အရေအတွက် တွက်ချက်ရန်အတွက် intron ဒေသများသို့ မြေပုံဆွဲထားသော ဖတ်ရှုခြင်း ပါဝင်သည်။ t-hCO နမူနာများအတွက်၊ မြေပုံဖတ်ခြင်းအားလုံး၏ အနည်းဆုံး 95% သည် လူသား genome နှင့် ကိုက်ညီသော ရှေးရိုးဆန်သော လိုအပ်ချက်အပေါ် အခြေခံ၍ ဖော်ထုတ်ခဲ့သည်။ နောက်ဆက်တွဲခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုအားလုံးကို R ပက်ကေ့ဂျ် (ဗားရှင်း 4.1.2) Seurat (ဗားရှင်း 4.1.1)32 ကို အသုံးပြု၍ CellRanger မှ စစ်ထုတ်ထားသော ဘားကုဒ်ခင်းကျင်းမှုအထွက်တွင် လုပ်ဆောင်ခဲ့သည်။
နောက်ဆက်တွဲ ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုတွင် အရည်အသွေးမြင့် နူကလိယများသာ ပါဝင်ကြောင်း သေချာစေရန်၊ နမူနာတစ်ခုစီအတွက် ထပ်တလဲလဲ စစ်ထုတ်ခြင်း လုပ်ငန်းစဉ်ကို လုပ်ဆောင်ခဲ့သည်။ ပထမဦးစွာ၊ ထူးခြားသောမျိုးဗီဇ 1000 ထက်နည်းသော အရည်အသွေးနိမ့် နျူကလိယများကို တွေ့ရှိပြီး စုစုပေါင်း mitochondria ၏ 20% ကျော်ကို ဖော်ထုတ်ပြီး ဖယ်ရှားသည်။ နောက်ပိုင်းတွင်၊ အကြမ်းဗီဇနံပါတ်မက်ထရစ်ကို sctransform(vst.flavor=”v2″) လုပ်ဆောင်ချက်ကိုအသုံးပြု၍ ပုံမှန်အနုတ်လက္ခဏာနှစ်လုံးတွဲဆုတ်ယုတ်မှုဖြင့် ပုံမှန်ပုံစံပြုလုပ်ခဲ့သည်။ Principal (Compound စံနှုန်းသတ်မှတ်ချက်များကိုအသုံးပြု၍ ဒေတာခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုအတိုင်းအတာ) ကိုအသုံးပြု၍ Principal (CompCA) ကိုအသုံးပြု၍ အထက်ပိုင်းကွဲလွဲနိုင်သောဗီဇများပေါ်တွင် ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုတိုင်းတာခြင်း (Compound အတိုင်းအတာ) ကိုအသုံးပြုပြီး 30 (dims = 30 ကို ဒူးနေရာများ၏ အမြင်အာရုံစစ်ဆေးခြင်းအပေါ် အခြေခံ၍ ရွေးချယ်ခဲ့ပြီး နမူနာများနှင့် အစုလိုက် ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုအားလုံးအတွက် အသုံးပြုသည်) ထို့နောက် ကျွန်ုပ်တို့သည် ပုံမှန်မဟုတ်သော ဗီဇအရေအတွက် (10th ရာခိုင်နှုန်းအောက်) မြင့်မားသော 9 % ထက် မနည်းသော မျိုးရိုးဗီဇများကို ခွဲခြားသတ်မှတ်ရန် အကြိမ်ကြိမ် ပြုလုပ်ခဲ့ပါသည်။ DoubletFinder33 ပက်ကေ့ဂျ်ကို အသုံးပြု၍ သတ်မှတ်ထားသော အရည်အသွေးနိမ့်သော အစုအဝေးများ နှင့်/သို့မဟုတ် မြင့်မားသော အချိုးအစားရှိသော ဆဲလ်များကို ခွဲခြားသတ်မှတ်ပြီး ဖယ်ရှားပါ အထက်ဖော်ပြပါအတိုင်း ဆောင်ရွက်ခဲ့ပါသည်။
အရည်အသွေးနိမ့် kernels များကို ဖယ်ရှားပြီးနောက်၊ ပေါင်းစပ်ဒေတာအတွဲကို (resolution = 0.5) ဖြင့် အုပ်စုဖွဲ့ပြီး UMAP34 အမြင်အာရုံပုံဖော်ခြင်းဆိုင်ရာ ရည်ရွယ်ချက်များအတွက် ထည့်သွင်းထားသည်။ အစုအဝေးတစ်ခုစီအတွက် အမှတ်အသား ဗီဇများကို ပုံမှန်ပြုလုပ်ထားသော ဗီဇဖော်ပြချက်ဒေတာမှ တွက်ချက်ထားသော ပုံသေသတ်မှတ်ချက်များဖြင့် FindMarkers လုပ်ဆောင်ချက်ကို အသုံးပြု၍ ဆုံးဖြတ်ခဲ့သည်။ ကျွန်ုပ်တို့သည် သန္ဓေသားနှင့် အရွယ်ရောက်ပြီးသူ cortical ရည်ညွှန်းချက်ဒေတာအတွဲများကို အမှတ်အသားမျိုးဗီဇဖော်ပြချက် 19,20,21,35 နှင့် မှတ်ချက်များ ပေါင်းစပ်ခြင်းဖြင့် အဓိကဆဲလ်အတန်းများကိုခွဲခြားခွဲခြားသတ်မှတ်ပါသည်။ အထူးသဖြင့်၊ ပျံ့နှံ့နေသော ရှေ့ပြေးနိမိတ်များကို MKI67 နှင့် TOP2A ဟူသော စကားရပ်ဖြင့် ဖော်ထုတ်ခဲ့သည်။ နှောင်းပိုင်း metaphase သန္ဓေသား ကော်တီကျစ်တွင်ဖော်ပြထားသော multi-potent glial progenitor အစုအဝေးများနှင့် မြင့်မားသောထပ်နေမှုများကို mitotic စာသားမှတ်တမ်းများမရှိခြင်းဖြင့် သတ်မှတ်ဖော်ပြခဲ့သည်။ ကျွန်ုပ်တို့သည် နှောင်းပိုင်း radial glia မှ astrocytes ၏ရင့်ကျက်မှုအထိ astrocyte ကွဲပြားမှုအခြေအနေများကို လွှမ်းခြုံရန် astrocyte ဟူသော ဝေါဟာရကို အသုံးပြုပါသည်။ Astrocyte အစုအဝေးများသည် SLC1A3 နှင့် AQP4 ၏မြင့်မားသောအဆင့်များကိုဖော်ပြပြီး သန္ဓေသား radial glia နှင့်/သို့မဟုတ် အရွယ်ရောက်ပြီးသူ astrocytes အမျိုးအစားခွဲများနှင့်မြေပုံညွှန်းပြသထားသည်။ OPCs များသည် PDGFRA နှင့် SOX10 ကိုဖော်ပြပြီး oligodendrocytes သည် myelination အမှတ်အသားများ (MOG နှင့် MYRF) ကိုဖော်ပြသည်။ အာရုံကြောဆိုင်ရာ စာသားမှတ်တမ်းများ (SYT1 နှင့် SNAP25)၊ GABAergic အမှတ်အသားများ (GAD2) မရှိခြင်းနှင့် NEUROD6၊ SLC17A7၊ BCL11B သို့မဟုတ် SATB2 တို့၏ ဖော်ပြချက်တို့ကြောင့် Glutamatergic အာရုံကြောများကို ဖော်ထုတ်တွေ့ရှိခဲ့သည်။ GluN အာရုံကြောများကို အပေါ်ပိုင်း (SATB2 ဖော်ပြချက်နှင့် BCL11B ဆုံးရှုံးမှု) နှင့် နက်ရှိုင်းသော (BCL11B ဖော်ပြချက်) အတန်းခွဲများအဖြစ် ခွဲခြားထားသည်။ Putative subplate (SP) neurons သည် နက်နဲသော GluN အမှတ်အသားများအပြင် ST18 နှင့် SORCS1 ကဲ့သို့သော လူသိများသော SP18 အမှတ်အသားများကို ဖော်ပြသည်။ Choroid plexus နှင့်တူသောဆဲလ်များကို TTR ထုတ်ဖော်ပြောဆိုခြင်းဖြင့်ဖော်ထုတ်ခဲ့ပြီး၊ meningeal-like cells များသည် fibroblast-ဆက်စပ်မျိုးဗီဇများနှင့်ရည်ညွှန်းဒေတာအစုံ၏ pial/vascular ဆဲလ်များကိုဖော်ပြသည်။
Libra R ပက်ကေ့ဂျ် (ဗားရှင်း 1.0.0) ကို အသုံးပြု၍ နမူနာများတွင် အသစ်ထုတ်ထားသော pseudo-batch နည်းလမ်းကို အသုံးပြု၍ t-hCO နှင့် hCO အတန်းခွဲများအကြား ဗီဇဖော်ပြမှုဆိုင်ရာ ကွဲပြားသောခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုကို ပြုလုပ်ခဲ့သည်။ အထူးသဖြင့်၊ edgeR log-likelihood tests (ဗားရှင်း 3.36.0၊ package R) သည် နမူနာပုံတူပွားမှုတစ်ခုစီအတွက် ဆဲလ်အတွင်းရှိ genes အရေအတွက်ကို ပေါင်းစပ်ခြင်းဖြင့် အုပ်စုများအတွက် လုပ်ဆောင်ခဲ့ပါသည်။ အပူမြေပုံကို ပုံဖော်ခြင်းအတွက်၊ ပုံမှန်ပြုလုပ်ထားသော (CPM) တန်ဖိုးများကို edgeR (cpm() လုပ်ဆောင်ချက်) ကို အသုံးပြု၍ တွက်ချက်ပြီး အတိုင်းအတာ (ပျမ်းမျှ = 0၊ စံသွေဖည် = 1) ကို တွက်ချက်သည်။ Gene Ontology (GO) တွင် သိသိသာသာ ထိန်းညှိထားသော t-hCO GluN မျိုးဗီဇများ၏ ကြွယ်ဝမှုကို ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာခြင်း ပြုလုပ်ခဲ့သည် (Benjamini-Hochberg သည် t-hCO GluN ဆဲလ်များ၏ အနည်းဆုံး 10% တွင် ဖော်ပြထားသော P တန်ဖိုးထက်နည်းသော P တန်ဖိုးကို ပြုပြင်ပြီး အနည်းဆုံး 2 ကြိမ် တိုးလာသည်)။ TopGene Suite (https://toppgene.cchmc.org/) 37 ကို အသုံးပြု၍ လုပ်ဆောင်ခဲ့သည်။ ကျွန်ုပ်တို့သည် ToppFun အက်ပ်ကို ပုံသေကန့်သတ်ချက်များဖြင့်အသုံးပြုပြီး GO-annotated hypergeometric စမ်းသပ်မှုများမှတွက်ချက်ထားသော Benjamini-Hochberg-corrected P-တန်ဖိုးများကို အစီရင်ခံပါသည်။
ပင်မဆဲလ်တစ်ခုတည်း RNA-seq သို့မဟုတ် အရွယ်ရောက်ပြီးသူ snRNA-seq19,20,21,22 ၏ ရည်ညွှန်းလေ့လာမှုများမှ အမှတ်အသားပြုထားသော ဆဲလ်အစုအဝေးများနှင့် ကျွန်ုပ်တို့၏ snRNA-seq အစုအဝေးများနှင့် ကိုက်ညီစေရန်၊ ကျွန်ုပ်တို့သည် တွဲထားသည့်ဒေတာအတွဲပေါင်းစည်းမှုချဉ်းကပ်မှုကို အသုံးပြုထားပါသည်။ Seurat ရှိ SCTransform (v2) ပုံမှန်လုပ်ဆောင်ခြင်းလုပ်ငန်းအသွားအလာကို ဒေတာအတွဲများကြားရှိ အစုအဝေးများကြားတွင် ပေါင်းစပ်ခြင်းနှင့် နှိုင်းယှဉ်ခြင်း (အထက်ပါအတိုင်း တူညီသောဘောင်များကို အသုံးပြုခြင်း)။ တစ်ဦးချင်းဒေတာအတွဲများကို တွက်ချက်မှုထိရောက်စေရန်အတွက် မူရင်းအစုတစ်ခုလျှင် ဆဲလ် 500 သို့မဟုတ် cores အထိ ကျပန်းခွဲထားသည်။ ယခင်က ဖော်ပြထားသည့်အတိုင်း အလားတူချဉ်းကပ်နည်းကို အသုံးပြု၍ ရည်ညွှန်းအစုအဝေး၏ တံဆိပ်နှင့် ထပ်နေသော အစုအစည်းတစ်ခုစီရှိ ဆဲလ်များ သို့မဟုတ် နျူကလိယ အချိုးအစားအဖြစ် သတ်မှတ်သည်။ GluN များကို ထပ်မံခွဲခြားရန်၊ ကျွန်ုပ်တို့သည် ကျွန်ုပ်တို့၏ GluN ဆဲလ်များသို့ ရည်ညွှန်းဒေတာအတွဲအညွှန်းများကို သတ်မှတ်ရန် Seurat ၏ TransferData အလုပ်အသွားအလာကို အသုံးပြုခဲ့သည်။
t-hCO နှင့် hCO နမူနာများ၏ ကမ္ဘာလုံးဆိုင်ရာ စာသားမှတ်တမ်း၏ ရင့်ကျက်မှုအခြေအနေကို အကဲဖြတ်ရန်၊ ကျွန်ုပ်တို့သည် လူ့ဦးနှောက်ဖွံ့ဖြိုးမှုကို ကျယ်ဝန်းသော RNA အစီအစဥ်ပါရှိသော ကျွန်ုပ်တို့၏ pseudo-bulk နမူနာများကို BrainSpan/psychENCODE23 နှင့် နှိုင်းယှဉ်ပါသည်။ သန္ဓေတည်ပြီးနောက် 10 ပတ်အကြာတွင် ကော်တီနမူနာများမှ ပေါင်းစပ်ပုံစံ-ပုံမှန်လုပ်ထားသော ဗီဇဖော်ပြမှုမက်ထရစ်ကို PCA တွင် လုပ်ဆောင်ခဲ့ပြီး 5567 မျိုးဗီဇ (ကျွန်ုပ်တို့၏ဒေတာနှင့်အတူ) တွင် BrainSpan ကော်တီလာနမူနာများတွင် တက်ကြွစွာပါဝင်သည်ဟု ယခင်ကသတ်မှတ်ထားသည် (အသက် 38 ကုဗပုံစံဖြင့်ရှင်းပြထားသော ဖွံ့ဖြိုးမှုဆိုင်ရာကွဲလွဲမှုတွင် 50% ထက်များသည်ဟုသတ်မှတ်ထားသည်)။ ထို့အပြင်၊ ယခင်က ဖော်ပြထားသည့်အတိုင်း အနုတ်လက္ခဏာမဟုတ်သော matrix factorization ကို အသုံးပြု၍ အာရုံကြောဖွံ့ဖြိုးတိုးတက်မှု၏ အဓိက စာသားမှတ်တမ်းများနှင့် ဆက်စပ်သော ဗီဇများ ဆင်းသက်လာသည်။ အနုတ်လက္ခဏာမဟုတ်သော matrix factorization လုပ်ထုံးလုပ်နည်းကိုအသုံးပြု၍ တွက်ချက်ထားသောနမူနာအလေးချိန်များကို ပုံများတွင် ပုံဖော်ထားသည်။ Zhu et al.38 မှ ဖော်ပြထားသော လက်မှတ်ငါးခုစီအတွက် တိုးချဲ့ဒေတာနှင့်အတူ 5b။ တဖန်၊ လှုပ်ရှားမှုအပေါ် မူတည်သော စာသားမှတ်တမ်း အမှတ်အသားများသည် ယခင်ထုတ်ဝေခဲ့သည့် လေ့လာမှုများမှ ဆင်းသက်လာသည်။ အထူးသဖြင့်၊ ERG နှင့် LRG ကို နောက်ဆက်တွဲ Table 3 Hrvatin et al.16 မှ အမြင်အာရုံလှုံ့ဆော်မှုပြီးနောက် mouse visual cortex snRNA-seq စုဆောင်းမှုမှဖော်ထုတ်ထားသော glutamatergic neurons တွင် သိသိသာသာ ထိန်းညှိပေးထားပါသည်။ လူ့ကြွယ်ဝသော LRGs များကို KCl-အသက်သွင်းထားသော လူ့သန္ဓေသားဦးနှောက် ယဉ်ကျေးမှုများမှ ရရှိပြီး လှုံ့ဆော်ပြီးနောက် 6 နာရီကြာ ရိတ်သိမ်းကာ စစ်ထုတ်ထားသော မျိုးဗီဇများကို လူသားများတွင် သိသာထင်ရှားစွာ ထိန်းညှိပေးခဲ့သော်လည်း ကြွက်များတွင် မပါဝင်ပါ (နောက်ဆက်တွဲဇယား 4)။ ဤမျိုးဗီဇအစုံများကိုအသုံးပြု၍ မျိုးရိုးဗီဇအစုံဖြည့်တင်းမှုကို ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာခြင်းသည် one-way Fisher ၏တိကျသောစမ်းသပ်မှုကို အသုံးပြု၍ လုပ်ဆောင်ခဲ့သည်။
ကြွက်များကို isoflurane ဖြင့် မေ့ဆေးပေးကာ ဦးနှောက်ကို ဖယ်ထုတ်ပြီး အအေး (ခန့်မှန်းခြေအားဖြင့် 4°C) အောက်ဆီဂျင်ပါရှိသော (95% O2 နှင့် 5% CO2) sucrose ဖြေရှင်းချက်- 234 mM sucrose၊ 11 mM ဂလူးကို့စ်၊ 26 mM NaHCO3၊ 2.5 mM KCl၊ 1.1. NaH2PO4၊ 10 mM MgSO4 နှင့် 0.5 mM CaCl2 (310 mOsm ခန့်)။ t-hCO ပါရှိသော ကြွက်ဦးနှောက်၏ ကော်ရိုးနယ်အပိုင်းများ (300–400 µm) ကို ယခင်က ဖော်ပြထားသည့်အတိုင်း Leica VT1200 တုန်ခါမှုကို အသုံးပြု၍ ပြုလုပ်ထားသည်။ ထို့နောက် အပိုင်းများကို စဉ်ဆက်မပြတ် အခန်းအပူချိန်အောက်ဆီဂျင်ထုတ်ပေးသည့် အခန်းများသို့ ပြောင်းရွှေ့ခဲ့သည်- 10 mM ဂလူးကို့စ်၊ 26 mM NaHCO3၊ 2.5 mM KCl၊ 1.25 mM NaHPO4၊ 1 mM MgSO4၊ 2 mM CaCl2 နှင့် 126 mM NaCl (298 mM NaCl) တို့ပါရှိသော အခန်းတွင်းအပူချိန်အောက်ဆီဂျင်ကို စဉ်ဆက်မပြတ် လွှဲပြောင်းပေးခဲ့သည်။ မှတ်တမ်းတင်ခြင်းမပြုမီ အနည်းဆုံး 45 မိနစ်။ အပိုင်းများကို aCSF (95% O2 နှင့် 5% CO2 ဖန်ပုလင်း) ဖြင့် စဉ်ဆက်မပြတ် ရောနှောထားသော နှစ်မြှုပ်ခန်းတွင် မှတ်တမ်းတင်ထားသည်။ အချက်အလက်အားလုံးကို အခန်းအပူချိန်တွင် မှတ်တမ်းတင်ထားသည်။ t-hCO အာရုံကြောများကို 127 mM ပိုတက်စီယမ်ဂလူးကိုနိတ်၊ 8 mM NaCl၊ 4 mM မဂ္ဂနီဆီယမ် ATP၊ 0.3 mM ဆိုဒီယမ် GTP၊ 10 mM HEPES နှင့် 0.6 mM EGTA၊ pH 7.2၊ အတွင်းပိုင်းဖြေရှင်းချက်ဖြင့် ချိန်ညှိထားသော t-hCO ရှိသော borosilicate ဖန်ပိုက်ပိုက်ဖြင့် ရပ်စဲခဲ့သည်။ ပြန်လည်ရယူရန်အတွက်၊ မှတ်တမ်းတင်ဖြေရှင်းချက်တွင် biocytin (0.2%) ကို ထည့်သွင်းခဲ့သည်။
MultiClamp 700B အသံချဲ့စက် (Molecular Devices) နှင့် Digidata 1550B digitizer (Molecular Devices)၊ low-pass 2 kHz တွင် စစ်ထုတ်ပြီး၊ 20 kHz တွင် ဒစ်ဂျစ်တယ်စနစ်ဖြင့် ဒေတာကို ရယူထားပြီး Clampfit (Molecular Devices)၊ မူရင်း (OriginPro) ကို အသုံးပြု၍ ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာပါသည်။ 2021b၊ OriginLab)။ နှင့် စိတ်ကြိုက် MATLAB လုပ်ဆောင်ချက်များ (Mathworks)။ လမ်းဆုံအလားအလာကို JPCalc သုံးပြီး တွက်ချက်ပြီး ထည့်သွင်းမှုများကို တွက်ချက်ထားသောတန်ဖိုး -14 mV သို့ ချိန်ညှိထားသည်။ Operation IV တွင် -250 မှ 750 pA မှ 10-25 pA အဆင့်များတွင် လက်ရှိအဆင့်များ ပါဝင်ပါသည်။
ယခင်က ဖော်ပြထားသည့်အတိုင်း hCO နျူရွန်များကို patch-clamp မှတ်တမ်းတင်နေစဉ် thalamus၊ အဖြူရောင်နှင့် S1 afferent များကို လျှပ်စစ်ဖြင့် လှုံ့ဆော်ပေးခဲ့သည်။ တိုတိုပြောရရင် ဦးနှောက်ကို 10° ထောင့်ချိုး 3D ပုံနှိပ်စက်ပေါ်မှာ တင်ထားပြီး ဦးနှောက်ရဲ့ အရှေ့ကို 35° ထောင့်မှာ ဖြတ်ထားပါတယ်။ ထို့နောက် ဦးနှောက်ကို ဖြတ်ထားသော မျက်နှာပြင်တွင် ကပ်ထားပြီး အပိုင်းပိုင်းဖြတ်ကာ thalamocortical အပြူးသားကို ထိန်းသိမ်းထားသည်။ Bipolar tungsten လျှပ်ကူးပစ္စည်း (0.5 MΩ) ကို ဒုတိယ မိုက်ခရိုခြယ်လှယ်မှုတွင် တပ်ဆင်ထားပြီး ဆဲလ်တစ်ခုလျှင် ဒေသလေးခု (အတွင်းပိုင်းဆေးတောင့်၊ အဖြူရောင်ပစ္စည်း၊ S1 နှင့် hCO) တို့ကို လှုံ့ဆော်ရန် ဗျူဟာမြောက်နေရာချထားသည်။ 0.03–0.1 Hz တွင် 300 µA phasic လှုံ့ဆော်မှုပြီးနောက် synaptic တုံ့ပြန်မှုများကို မှတ်တမ်းတင်ပါ။
hChR2-expressing hCO အာရုံကြောများကို 480 nm တွင် activated လုပ်ပြီး ဆဲလ်များအနီးရှိ hChR2 ဖော်ပြမှုကို မှတ်တမ်းတင်ရန်အတွက် LED (Prizmatix) မှထုတ်ပေးသော အလင်းတန်းများကို ×40 ရည်မှန်းချက် (0.9 NA; Olympus) မှတဆင့် အသုံးချခဲ့သည်။ တောက်ပသောလယ်ကွင်းအချင်းသည် ခန့်မှန်းခြေ 0.5 မီလီမီတာဖြစ်ပြီး စုစုပေါင်းပါဝါသည် 10-20 mW ဖြစ်သည်။ သွေးခုန်နှုန်း အကျယ်ကို 10 ms သို့ သတ်မှတ်ထားပြီး အပြုအမူဆိုင်ရာ သင်ယူမှု စမ်းသပ်မှုအတွင်း ပေးထားသည့် သွေးခုန်နှုန်းနှင့် ကိုက်ညီပါသည်။ အမျိုးမျိုးသောလှုံ့ဆော်မှုကြိမ်နှုန်းများကို 1 မှ 20 Hz မှအသုံးပြုခဲ့သည်၊ သို့သော် စီးရီး၏ပထမဆုံးသွေးခုန်နှုန်းကိုသာ ပမာဏသတ်မှတ်ရန်အတွက်အသုံးပြုခဲ့သည်။ synaptic inhibitory သို့မဟုတ် လမ်းကြောင်းများကို လွယ်ကူချောမွေ့စေခြင်းအပေါ် အကျိုးသက်ရောက်မှုကို လျှော့ချရန် ရထားများကြားကာလသည် 30 ထက် ပိုကြာတတ်သည်။ hChR2 တုံ့ပြန်မှုသည် monosynaptic ဟုတ်၊ မဟုတ် စမ်းသပ်ရန်၊ ကျွန်ုပ်တို့သည် EPSC တုံ့ပြန်မှု ပျောက်ကွယ်သွားသည်အထိ ရေချိုးခန်းတွင် TTX (1 μM) ကို အသုံးချကာ 4-aminopyridine (4-AP; 100 μM) ကို လိမ်းပေးသည်။ ပုံမှန်အားဖြင့်၊ LED ပစ်ခတ်မှု နှင့် EPSC မျိုးဆက်ကြား အနည်းငယ် ပိုကြာကြာ နှောင့်နှေးမှုဖြင့် မိနစ်အနည်းငယ်အတွင်း တုံ့ပြန်မှုတစ်ခု ပြန်လာပါသည်။ NBQX (10 μM) သည် AMPA receptors များမှ တုံ့ပြန်မှုကို မောင်းနှင်ခြင်းရှိမရှိ စမ်းသပ်ရန် အသုံးပြုခဲ့သည်။
Sharp hCO ကဏ္ဍများကို ယခင်က ဖော်ပြထားသည့်အတိုင်း ဖန်တီးထားသည်။ အတိုချုပ်အားဖြင့်၊ hCO အပိုင်းများကို 4% agarose တွင် မြှုပ်နှံထားပြီး 126 mM NaCl၊ 2.5 mM KCl၊ 1.25 mM NaH2PO4၊ 1 mM MgSO4၊ 2 mM CaCl2၊ 26 mM NaHCO3 နှင့် 10 mM d-(20µg အပိုင်း) - 30µg ကို အပိုင်း 3 တွင် ဖြတ်တောက်ထားသည်။ Leica VT1200 vibrator ကိုအသုံးပြုပြီး အခန်းအပူချိန်တွင် ASF တွင် သိမ်းဆည်းထားသည်။ ထို့နောက်၊ တိုက်ရိုက် SliceScope အဏုစကုပ် (Scientifica) အောက်တွင် ဆဲလ်တစ်ခုလုံး၏ patch-camp မှတ်တမ်းတင်ခြင်းကို hCO ကဏ္ဍများတွင် လုပ်ဆောင်ခဲ့သည်။ အပိုင်းများကို aCSF (95% O2 နှင့် 5% CO2) ဖြင့် ရောနှောပြီး အခန်းအပူချိန်တွင် ဆဲလ်အချက်ပြမှုများကို မှတ်တမ်းတင်ခဲ့သည်။ hCO အာရုံကြောများကို 127 mM ပိုတက်စီယမ်ဂလူးကွန်နိတ်၊ 8 mM NaCl၊ 4 mM မဂ္ဂနီဆီယမ် ATP၊ 0.3 mM ဆိုဒီယမ် GTP၊ 10 mM HEPES နှင့် 0.6 mM EGTA၊ အတွင်းပိုင်း pH 7၊ 2 ပါဝင်သော ဖြေရှင်းချက်ဖြင့် ဖြည့်ထားသော borosilicate ဖန်ပိုက်ကို အသုံးပြု၍ အသုံးချခဲ့သည်။ ပြန်လည်ထူထောင်ရေးရည်ရွယ်ချက်အတွက်၊ အတွင်းပိုင်းဖြေရှင်းချက်တွင် 0.2% Biocytin ထည့်ပါ။
MultiClamp 700B အသံချဲ့စက် (Molecular Devices) နှင့် Digidata 1550B digitizer (Molecular Devices)၊ MultiClamp 700B အသံချဲ့စက် (Molecular Devices) တို့ကို အသုံးပြု၍ Clampex (Clampex 11.1၊ Molecular Devices) မှ ရယူထားပါသည် စိတ်ကြိုက် MATLAB လုပ်ဆောင်ချက်များ (MATLAB 2019b၊ Mathworks)။ လမ်းဆုံအလားအလာကို JPCalc သုံးပြီး တွက်ချက်ပြီး ထည့်သွင်းမှုများကို တွက်ချက်ထားသော လမ်းဆုံအလားအလာ -14 mV သို့ ချိန်ညှိထားသည်။ Operation IV တွင် -50 မှ 250 pA တွင် 5-10 pA အဆင့်များတွင် လက်ရှိအဆင့်များ ဆက်တိုက်ပါဝင်သည်။
pinched neurons များ၏ပုံသဏ္ဍာန်ပြန်လည်တည်ဆောက်မှုအတွက်၊ 0.2% biocytin (Sigma-Aldrich) ကိုအတွင်းပိုင်းဖြေရှင်းချက်ထဲသို့ထည့်ခဲ့သည်။ ဆဲလ်များကို ဟက်ကာပြီးနောက် အနည်းဆုံး 15 မိနစ်ကြာ အဖုံးအုပ်ထားသည်။ ထို့နောက် မှတ်ပုံတင်ထားသော အမြှေးပါးကို လုံး၀အလုံပိတ်သည်အထိ ပိုက်ပိုက်ကို 1-2 မိနစ်ကြာအောင် ဖြည်းညှင်းစွာဆွဲပါ။ အပိုင်းဇီဝကမ္မဗေဒလုပ်ထုံးလုပ်နည်းပြီးနောက်၊ အပိုင်းများကို 4°C တွင် 4% PFA တွင် ညတွင်းချင်းပြင်ပြီး PBS X3 ဖြင့်ဆေးကာ 1:1000 ကို streptavidin-conjugated DyLight 549 သို့မဟုတ် DyLight 405 (Vector Labs) ဖြင့် ရောနှောထားသည်။ biocytin (2%; Sigma-Aldrich) ဖြင့် ပြည့်နေသော ဆဲလ်များကို အခန်းအပူချိန်တွင် 2 နာရီကြာ patch ကုပ်ဖမ်းစဉ် အညွှန်းတပ်ထားသည်။ ထို့နောက် အပိုင်းများကို Aquamount (Thermo Scientific) ကို အသုံးပြု၍ အဏုကြည့်မှန်ပြောင်းပေါ်တွင် တပ်ဆင်ပြီး နောက်တစ်နေ့တွင် Leica TCS SP8 confocal microscope တွင် ဂဏန်းအပါချာ ×40 1.3၊ ချဲ့ထွင်မှု ×0.9–1.0၊ xy ဖြင့် ဆီနှစ်မြှုပ်ခြင်းဆိုင်ရာ ရည်ရွယ်ချက်ကို အသုံးပြုထားသည်။ နမူနာနှုန်းသည် မိုက်ခရိုတွင် 7 pixels ခန့်ရှိသည်။ 1 µm ကြားကာလတွင် Z-stacks များကို စဉ်ဆက်မပြတ်ရယူခဲ့ပြီး z-stack mosaics နှင့် Leica-based auto-stitching တို့သည် neuron တစ်ခုစီ၏ dendritic tree တစ်ခုလုံးကို ဖုံးအုပ်ရန် လုပ်ဆောင်ခဲ့သည်။ ထို့နောက် neuTube 40 အင်တာဖေ့စ်ကို အသုံးပြု၍ နျူရွန်များကို တစ်ပိုင်းခြေရာခံပြီး SWC ဖိုင်များကို ထုတ်ပေးခဲ့သည်။ ထို့နောက် ဖိုင်များကို SimpleNeuriteTracer41 Fiji ပလပ်အင် (ImageJ၊ ဗားရှင်း 2.1.0; NIH) သို့ အပ်လုဒ်လုပ်ခဲ့သည်။
စတန်းဖို့ဒ်တက္ကသိုလ်၏ Institutional Review Board မှ အတည်ပြုထားသော ပရိုတိုကောအရ လူ၏ကော်တီတစ်ရှူးများကို အကြောင်းကြားစာဖြင့် ရရှိခဲ့သည်။ မီးဖွားပြီးနောက် တစ်သျှူးနမူနာနှစ်ခု (အသက် ၃ နှစ်နှင့် ၁၈ နှစ်ကြား) ကို ဝက်ရူးပြန်ရောဂါအတွက် ခွဲစိတ်မှုတစ်စိတ်တစ်ပိုင်းအဖြစ် Frontal Cortex (middle Frontal gyrus) ကို ခွဲစိပ်ခြင်းဖြင့် ရရှိခဲ့သည်။ ခွဲစိတ်ကုသပြီးနောက်၊ ရေခဲ-အေးသော NMDG-aCSF တွင်- 92 mM NMDG၊ 2.5 mM KCl၊ 1.25 mM NaH2PO4၊ 30 mM NaHCO3၊ 20 mM HEPES၊ 25 mM ဂလူးကို့စ်၊ 2 mM thiourea၊ 5 mM ဆိုဒီယမ် 0 mM ပါသော ဆိုဒီယမ် 5 mM ။ CaCl2 4H2O နှင့် 10 mM MgSO4 7H2O ။ စုစည်းထားသော ဟိုက်ဒရိုကလိုရစ်အက်ဆစ်ဖြင့် pH 7.3-7.4 သို့ တိုက်တရိတ်။ မိနစ် 30 အတွင်း ဓာတ်ခွဲခန်းသို့ တစ်ရှူးများ ပို့ဆောင်ခဲ့ပြီး အထက်ဖော်ပြပါ လုပ်ထုံးလုပ်နည်းအရ ဆီးလမ်းကြောင်းဆိုင်ရာ အပိုင်းများကို ဆောင်ရွက်ပေးခဲ့သည်။
တိရိစ္ဆာန်လုပ်ထုံးလုပ်နည်းအားလုံးကို စတန်းဖို့ဒ်တက္ကသိုလ် APLAC ခွင့်ပြုထားသော တိရစ္ဆာန်စောင့်ရှောက်မှုလမ်းညွှန်ချက်များနှင့်အညီ လုပ်ဆောင်ခဲ့သည်။ ကြွက်များကို အစားထိုးကုသပြီးနောက် ရက်ပေါင်း 140 ထက်ပိုသော ကြွက်များကို မေ့ဆေး 5% isoflurane ဖြင့် လှုံ့ဆော်ပေးပြီး ခွဲစိတ်မှု 1-3% isoflurane ဖြင့် မေ့ဆေးပေးသည်။ တိရစ္ဆာန်များကို stereotaxic frame (Kopf) တွင် ထားရှိခဲ့ပြီး ဆက်တိုက်ထုတ်လွှတ်သော buprenorphine (SR) ကို အရေပြားအောက်၌ ထိုးသွင်းခဲ့သည်။ ဦးခေါင်းခွံကို ထိတွေ့၊ သန့်စင်ပြီး အရိုးဝက်အူ 3-5 ခု ထည့်သွင်းထားသည်။ t-hCO ကို ပစ်မှတ်ထားရန်၊ ကျွန်ုပ်တို့သည် MRI ပုံများမှ စတီရီယိုအဆိပ်သင့် သြဒိနိတ်များကို ထုတ်ပေးပါသည်။ စိတ်ပါဝင်စားသောနေရာ၌ မြှေးအပေါက်တစ်ခုကို တူးဖော်ပြီး အမျှင်များ (400 µm အချင်း၊ NA 0.48၊ Doric) သည် hCO မျက်နှာပြင်အောက် 100 µm နိမ့်သွားပြီး ဦးခေါင်းခွံကို UV-ကုစားနိုင်သော သွားဘက်ဆိုင်ရာဘိလပ်မြေ (Relyx) ဖြင့် လုံခြုံစေပါသည်။
ယခင်က ဖော်ပြထားသည့်အတိုင်း ဖိုက်ဘာ ဓာတ်ပုံမက်ထရစ် မှတ်တမ်းတင်ခြင်းများ လုပ်ဆောင်ခဲ့သည်။ အလိုအလျောက်လှုပ်ရှားမှုကို မှတ်တမ်းတင်ရန်အတွက် ကြွက်များကို သန့်ရှင်းသောလှောင်အိမ်ထဲတွင် ထားရှိကာ 400 µm အချင်း ဖိုက်ဘာအော့ပတစ်ဖာထေးသည့်ကေဘယ်လ် (Doric) ကို ဖိုက်ဘာအော့ပတစ် ဓာတ်ပုံမက်ထရစ်ဒေတာရယူမှုစနစ်နှင့် ချိတ်ဆက်ထားသည့် ဖိုက်ဘာအော့ပတစ် ဓာတ်ပုံမက်ထရစ်ဒေတာရယူမှုစနစ်နှင့် ချိတ်ဆက်ထားသည်။ 10 မိနစ်ကြာ မော်တာလှုပ်ရှားမှုကို မှတ်တမ်းတင်နေစဉ်အတွင်း တိရစ္ဆာန်များသည် လှောင်အိမ်အတွင်း လွတ်လပ်စွာ စူးစမ်းလေ့လာနိုင်ခဲ့ကြသည်။ စိတ်အားထက်သန်သော လှုပ်ရှားမှုကို မှတ်တမ်းတင်ရန်အတွက် ကြွက်များကို (အစားထိုးကုသပြီးနောက် ရက်ပေါင်း 140 ကျော်) တွင် လှုံ့ဆော်မှုအတွက် 5% isoflurane နှင့် ပြုပြင်ထိန်းသိမ်းရန်အတွက် 1-3% isoflurane တို့ဖြင့် မေ့ဆေးပေးခဲ့ပါသည်။ တိရစ္ဆာန်ကို stereotactic frame (Kopf) တွင် ထားပြီး t-hCO ၏ ဆန့်ကျင်ဘက်ခြမ်းရှိ ပါးသိုင်းမွှေးများကို 2 စင်တီမီတာခန့် ဖြတ်တောက်ကာ piezoelectric actuator (PI) နှင့် ချိတ်ဆက်ထားသော ကွက်တစ်ခုမှတဆင့် ဖြတ်သန်းပါ။ 400 µm fiber optic patch cable (Doric) ကို စိုက်ထားသော fiber နှင့် ချိတ်ဆက်ထားပြီး data acquisition system နှင့် ချိတ်ဆက်ထားသည်။ ထို့နောက် t-hCO ၏ ဆန့်ကျင်ဘက်ခြမ်းရှိ ပါးသိုင်းမွှေးများသည် မိနစ် 20 ကြာမြင့်သော အသံဖမ်းကာလတစ်ခုကျော်တွင် ပီဇိုအီလက်ထရွန်းနစ်မောင်းနှင်မှုဖြင့် ကျပန်းအကြိမ်များတွင် အကြိမ် 50 (2 မီလီမီတာ 20 Hz၊ တင်ဆက်မှုတစ်ခုလျှင် 2 စက္ကန့်) ဘက်သို့ပြောင်းသွားသည်။ စိတ်ကြိုက် MATLAB ကုဒ်ဖြင့် ကူးပြောင်းချိန်ကို ထိန်းချုပ်ရန် Arduino MATLAB ပံ့ပိုးမှု ပက်ကေ့ချ်ကို အသုံးပြုပါ။ ဖြစ်ရပ်များကို transistor-transistor logic (TTL) pulses သုံးပြီး data acquisition software နှင့် synchronized လုပ်ပါသည်။
ကြွက်များကို အစားထိုးကုသပြီးနောက် ရက်ပေါင်း 140 ထက်ပိုသော ကြွက်များကို မေ့ဆေး 5% isoflurane ဖြင့် လှုံ့ဆော်ပေးပြီး ခွဲစိတ်မှု 1-3% isoflurane ဖြင့် မေ့ဆေးပေးသည်။ တိရစ္ဆာန်များကို stereotaxic frame (Kopf) တွင် ထားရှိခဲ့ပြီး buprenorphine SR နှင့် dexamethasone ကို အရေပြားအောက်၌ ထိုးသွင်းခဲ့သည်။ ဦးခေါင်းခွံကို ထိတွေ့၊ သန့်စင်ပြီး အရိုးဝက်အူ 3-5 ခု ထည့်သွင်းထားသည်။ t-hCO ကို ပစ်မှတ်ထားရန်၊ ကျွန်ုပ်တို့သည် MRI ပုံများမှ စတီရီယိုအဆိပ်သင့် သြဒိနိတ်များကို ထုတ်ပေးပါသည်။ အစားထိုးစိုက်ထားသော hCO အပေါ် တိုက်ရိုက် မြန်နှုန်းမြင့် လေ့ကျင့်မှုဖြင့် စက်ဝိုင်းပုံ သွေးကြောခွဲစိတ်ခြင်း (အချင်း 1 စင်တီမီတာခန့်) ကို ပြုလုပ်ခဲ့သည်။ အရိုးသည် တတ်နိုင်သမျှ ပါးသွားသော်လည်း အရိုးတစ်ခုလုံးကို တူးဖော်ခြင်းမပြုမီ၊ အရင်းခံ t-hCO ကိုဖော်ထုတ်ရန် ကျန်ရှိနေသော တင်ပါးဆုံတွင်းအကြောကို ဖယ်ရှားရန် forceps ကိုအသုံးပြုပါ။ ခွဲစိတ်ကုသခြင်းတွင် ပိုးသတ်ထားသော ဆားရည်ဖြင့် ပြည့်နေပြီး ဦးခေါင်းခွံတွင် ကာဗာစလစ်နှင့် အထူးခေါင်းညှပ်တစ်ခုကို ခရမ်းလွန်ရောင်ခြည်ဖြင့် ကုသထားသော သွားဘိလပ်မြေ (Relyx) ဖြင့် ဦးခေါင်းခွံတွင် တွဲထားသည်။
Nikon LWD (×16, 0.8 NA) ရည်ရွယ်ချက်ဖြင့် Bruker multiphoton အဏုစကုပ်ကို အသုံးပြု၍ ဖိုတွန်နှစ်ပုံ ပုံရိပ်ဖော်ခြင်းကို လုပ်ဆောင်ခဲ့သည်။ GCaMP6 ပုံရိပ်ကို 920 nm တွင် 1.4x single z-plane magnification နှင့် 8x ပျမ်းမျှ 7.5 fps ဖြင့် လုပ်ဆောင်ခဲ့သည်။ ကြွက်များကို မေ့ဆေး 5% isoflurane ဖြင့် သွေးဆောင်ပြီး 1-3% isoflurane ဖြင့် ထိန်းသိမ်းထားသည်။ ကြွက်များကို စိတ်ကြိုက်ပြုလုပ်ထားသော ခေါင်းစွပ်တစ်ခုတွင် ထည့်ထားပြီး မှန်ဘီလူးအောက်တွင် နေရာချထားသည်။ မော်တာလှုပ်ရှားမှု၏ ၃ မိနစ်ကြာ နောက်ခံမှတ်တမ်းတင်မှုကို ရရှိခဲ့သည်။ မှတ်တမ်းတင်ခြင်း မိနစ် 20 တစ်လျှောက်တွင် picospricer ကို အသုံးပြု၍ puffs 50 (တင်ဆက်မှုတစ်ခုစီတွင် 100 ms ရှည်သည်) ကို t-hCO ဆန့်ကျင်ဘက်ရှိ ပါးစပ်ပြားသို့ ကျပန်းပေးပို့ခဲ့သည်။ စိတ်ကြိုက် MATLAB ကုဒ်ဖြင့် ဆက်တိုက်အချိန်ကို ထိန်းချုပ်ရန် Arduino MATLAB ပံ့ပိုးမှု Package ကို အသုံးပြုပါ။ TTL ပဲမျိုးစုံကို အသုံးပြု၍ ဒေတာရယူခြင်းဆော့ဖ်ဝဲ (PrairieView 5.5) ဖြင့် အဖြစ်အပျက်များကို ထပ်တူပြုပါ။ ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုအတွက်၊ ဖီဂျီတွင် စတင်ခဲ့သော MoCo ပရိုဂရမ်တွင် affine တည့်မတ်မှုကို အသုံးပြု၍ xy လှုပ်ရှားမှုအတွက် ပုံများကို ပြုပြင်ခဲ့သည်။ CNMF-E43 ကို အသုံးပြု၍ ဆဲလ်တစ်ခုချင်းစီမှ ချောင်းခြေရာများကို ထုတ်ယူခြင်း။ စိတ်ပါဝင်စားသော ဒေသတစ်ခုစီအတွက် မီးရောင်များကို ထုတ်ယူပြီး dF/F မျဉ်းကွေးများအဖြစ် ပြောင်းလဲကာ z-scores အဖြစ်သို့ ပြောင်းလဲခဲ့သည်။
ကြွက်များကို အစားထိုးကုသပြီးနောက် ရက်ပေါင်း 140 ထက်ပိုသော ကြွက်များကို မေ့ဆေး 5% isoflurane ဖြင့် လှုံ့ဆော်ပေးပြီး ခွဲစိတ်မှု 1-3% isoflurane ဖြင့် မေ့ဆေးပေးသည်။ တိရစ္ဆာန်များကို stereotaxic frame (Kopf) တွင် ထားရှိခဲ့ပြီး buprenorphine SR နှင့် dexamethasone ကို အရေပြားအောက်၌ ထိုးသွင်းခဲ့သည်။ t-hCO ၏ တစ်ဖက်ခြမ်းရှိ ပါးသိုင်းမွှေးများကို 2 စင်တီမီတာခန့် ဖြတ်ပြီး piezoelectric actuator နှင့် ချိတ်ဆက်ထားသော ကွက်တစ်ခုမှတစ်ဆင့် ချည်မျှင်များ ချည်နှောင်ထားသည်။ ဦးခေါင်းခွံကို ထိတွေ့ပြီး သန့်စင်ထားပါ။ သံမဏိမြေစိုက်ဝက်အူတစ်ခုကို ဦးခေါင်းခွံတွင် ချိတ်ထားသည်။ t-hCO ကို ပစ်မှတ်ထားရန်၊ ကျွန်ုပ်တို့သည် MRI ပုံများမှ စတီရီယိုအဆိပ်သင့် သြဒိနိတ်များကို ထုတ်ပေးပါသည်။ t-hCO ၏အထက်တွင် အရှိန်မြင့်သော တူးခြင်းဖြင့် စက်ဝိုင်းပုံ (အချင်း 1 စင်တီမီတာခန့်) ကို ပြုလုပ်ပါ။ အရိုးသည် တတ်နိုင်သမျှ ပါးသွားသော်လည်း အရိုးတစ်ခုလုံးကို တူးဖော်ခြင်းမပြုမီ၊ အရင်းခံ t-hCO ကိုဖော်ထုတ်ရန် ကျန်ရှိနေသော တင်ပါးဆုံတွင်းအကြောကို ဖယ်ရှားရန် forceps ကိုအသုံးပြုပါ။ ဆဲလ်တစ်ခုချင်းစီကို 32-channel သို့မဟုတ် 64-channel high-density silicon probes (Cambridge Neurotech) မှ မြေစိုက်ဝက်အူများနှင့် RHD amplifiers (Intan) ဖြင့် ကြိုတင်ချဲ့ထွင်ထားသော ဆဲလ်တစ်ခုချင်းစီကို မှတ်တမ်းတင်ထားပါသည်။ ပိုးမွှားဆားရည်ဖြင့် ပြည့်နေသော သားအိမ်ခွဲစိတ်မှုမှတစ်ဆင့် လျှပ်ကူးပစ္စည်းများကို ပစ်မှတ်နေရာသို့ လျှော့ချရန် ခြယ်လှယ်မှုကို အသုံးပြုပါ။ Open Ephys data acquisition system ကို အသုံးပြု၍ 30 kHz ကြိမ်နှုန်းဖြင့် ဒေတာစုဆောင်းခြင်းကို လုပ်ဆောင်ခဲ့ပါသည်။ ချန်နယ် 10 ကျော်တွင် ဆက်စပ်နေသော စည်းချက်ညီညီ လှုပ်ရှားမှုကို ကျွန်ုပ်တို့ တွေ့ရှိမှသာ လျှပ်ကူးပစ္စည်းသည် ဖောက်ထွင်းမှုတွင် ရှိနေကြောင်း (ဖိုတွန် ကယ်လ်စီယမ် ပုံရိပ်ဖော်ခြင်းဒေတာကို အခြေခံ၍) နှစ်ခုကို ဖြတ်တောက်ထားမှသာ ဆက်လက်၍ ရိုက်ကူးသည်။ မော်တာလှုပ်ရှားမှု၏ 10 မိနစ် နောက်ခံမှတ်တမ်းကို ရယူခဲ့သည်။ ထို့နောက် t-hCO ၏ ဆန့်ကျင်ဘက်ခြမ်းရှိ ပါးသိုင်းမွှေးများသည် မိနစ် 20 ကြာမြင့်သော အသံဖမ်းကာလတစ်ခုကျော်တွင် ပီဇိုအီလက်ထရွန်းနစ်မောင်းနှင်မှုဖြင့် ကျပန်းအကြိမ်များတွင် အကြိမ် 50 (2 မီလီမီတာ 20 Hz၊ တင်ဆက်မှုတစ်ခုလျှင် 2 စက္ကန့်) ဘက်သို့ပြောင်းသွားသည်။ Arduino အတွက် MATLAB ပံ့ပိုးမှု ပက်ကေ့ချ်ကို အသုံးပြု၍ (MATLAB 2019b)၊ စိတ်ကြိုက် MATLAB ကုဒ်ဖြင့် ကူးပြောင်းချိန်ကို ထိန်းချုပ်ပါ။ ဒေတာရယူခြင်းဆော့ဖ်ဝဲနှင့် ဖြစ်ရပ်များကို ထပ်တူပြုရန် TTL ပဲမျိုးစုံကို အသုံးပြုပါ။
optical marking စမ်းသပ်မှုများအတွက်၊ 200 µm optical patch cord (Doric) ကို 473 nm လေဆာ (Omicron) နှင့် ချိတ်ဆက်ထားပြီး craniotomy တွင် 200 µm optical fiber နှင့် ချိတ်ဆက်ထားသည်။ ၎င်းမတိုင်မီချက်ချင်း၊ jumper power ကို 20 mW သို့ချိန်ညှိပါ။ ပိုးမွှားဆားရည်ဖြင့် ပြည့်နေသော သားအိမ်ခွဲစိတ်မှုမှတစ်ဆင့် လျှပ်ကူးပစ္စည်းများကို ပစ်မှတ်နေရာသို့ လျှော့ချရန် ခြယ်လှယ်မှုကို အသုံးပြုပါ။ ရိုက်ကူးမှုအစတွင်၊ အလင်း 473 nm (ကြိမ်နှုန်း 2 Hz၊ သွေးခုန်နှုန်း 10 ms) 10 ms ကို ထုတ်လွှတ်ခဲ့သည်။ Photosensitive ဆဲလ်များကို စမ်းသပ်မှု၏ 70% သို့မဟုတ် ထို့ထက်ပိုသော စမ်းသပ်မှုများတွင် အလင်း၏ 10 ms အတွင်း spike တုံ့ပြန်မှုကို ပြသသည့်ဆဲလ်များအဖြစ် သတ်မှတ်သည်။