Nature.com 'ਤੇ ਜਾਣ ਲਈ ਤੁਹਾਡਾ ਧੰਨਵਾਦ। ਤੁਸੀਂ ਸੀਮਤ CSS ਸਹਾਇਤਾ ਵਾਲਾ ਬ੍ਰਾਊਜ਼ਰ ਸੰਸਕਰਣ ਵਰਤ ਰਹੇ ਹੋ। ਸਭ ਤੋਂ ਵਧੀਆ ਅਨੁਭਵ ਲਈ, ਅਸੀਂ ਸਿਫ਼ਾਰਿਸ਼ ਕਰਦੇ ਹਾਂ ਕਿ ਤੁਸੀਂ ਇੱਕ ਅੱਪਡੇਟ ਕੀਤਾ ਬ੍ਰਾਊਜ਼ਰ ਵਰਤੋ (ਜਾਂ ਇੰਟਰਨੈੱਟ ਐਕਸਪਲੋਰਰ ਵਿੱਚ ਅਨੁਕੂਲਤਾ ਮੋਡ ਨੂੰ ਅਯੋਗ ਕਰੋ)। ਇਸ ਤੋਂ ਇਲਾਵਾ, ਨਿਰੰਤਰ ਸਹਾਇਤਾ ਨੂੰ ਯਕੀਨੀ ਬਣਾਉਣ ਲਈ, ਅਸੀਂ ਸਾਈਟ ਨੂੰ ਸਟਾਈਲ ਅਤੇ JavaScript ਤੋਂ ਬਿਨਾਂ ਦਿਖਾਉਂਦੇ ਹਾਂ।
ਇੱਕੋ ਸਮੇਂ ਤਿੰਨ ਸਲਾਈਡਾਂ ਦਾ ਕੈਰੋਜ਼ਲ ਪ੍ਰਦਰਸ਼ਿਤ ਕਰਦਾ ਹੈ। ਇੱਕ ਸਮੇਂ ਤਿੰਨ ਸਲਾਈਡਾਂ ਵਿੱਚੋਂ ਲੰਘਣ ਲਈ ਪਿਛਲੇ ਅਤੇ ਅਗਲੇ ਬਟਨਾਂ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰੋ, ਜਾਂ ਇੱਕ ਸਮੇਂ ਤਿੰਨ ਸਲਾਈਡਾਂ ਵਿੱਚੋਂ ਲੰਘਣ ਲਈ ਅੰਤ ਵਿੱਚ ਸਲਾਈਡਰ ਬਟਨਾਂ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰੋ।
ਸਵੈ-ਅਸੈਂਬਲਿੰਗ ਨਿਊਰਲ ਆਰਗੇਨੈਲ ਮਨੁੱਖੀ ਵਿਕਾਸ ਅਤੇ ਬਿਮਾਰੀ ਦੇ ਮਾਡਲਿੰਗ ਲਈ ਇੱਕ ਵਾਅਦਾ ਕਰਨ ਵਾਲਾ ਇਨ ਵਿਟਰੋ ਪਲੇਟਫਾਰਮ ਦਰਸਾਉਂਦੇ ਹਨ। ਹਾਲਾਂਕਿ, ਔਰਗੈਨੋਇਡਜ਼ ਵਿੱਚ ਮੌਜੂਦ ਕਨੈਕਟੀਵਿਟੀ ਦੀ ਘਾਟ ਹੈ, ਜੋ ਪਰਿਪੱਕਤਾ ਨੂੰ ਸੀਮਤ ਕਰਦੀ ਹੈ ਅਤੇ ਵਿਵਹਾਰ ਨੂੰ ਨਿਯੰਤਰਿਤ ਕਰਨ ਵਾਲੇ ਹੋਰ ਸਰਕਟਾਂ ਨਾਲ ਏਕੀਕਰਨ ਨੂੰ ਰੋਕਦੀ ਹੈ। ਇੱਥੇ ਅਸੀਂ ਦਿਖਾਉਂਦੇ ਹਾਂ ਕਿ ਨਵਜੰਮੇ ਨੰਗੇ ਚੂਹਿਆਂ ਦੇ ਸੋਮੈਟੋਸੈਂਸਰੀ ਕਾਰਟੈਕਸ ਵਿੱਚ ਟ੍ਰਾਂਸਪਲਾਂਟ ਕੀਤੇ ਗਏ ਮਨੁੱਖੀ ਸਟੈਮ ਸੈੱਲ-ਪ੍ਰਾਪਤ ਕੋਰਟੀਕਲ ਆਰਗੇਨਾਇਡਜ਼ ਪਰਿਪੱਕ ਸੈੱਲ ਕਿਸਮਾਂ ਦਾ ਵਿਕਾਸ ਕਰਦੇ ਹਨ ਜੋ ਸੰਵੇਦੀ ਅਤੇ ਪ੍ਰੇਰਣਾ-ਸਬੰਧਤ ਸਰਕਟਾਂ ਵਿੱਚ ਏਕੀਕ੍ਰਿਤ ਹੁੰਦੇ ਹਨ। ਐਮਆਰਆਈ ਨੇ ਕਈ ਸਟੈਮ ਸੈੱਲ ਲਾਈਨਾਂ ਅਤੇ ਜਾਨਵਰਾਂ ਵਿੱਚ ਟ੍ਰਾਂਸਪਲਾਂਟ ਤੋਂ ਬਾਅਦ ਦੇ ਆਰਗੇਨੋਇਡ ਵਿਕਾਸ ਦਾ ਖੁਲਾਸਾ ਕੀਤਾ, ਜਦੋਂ ਕਿ ਸਿੰਗਲ-ਕੋਰ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਨੇ ਕੋਰਟੀਕੋਜੇਨੇਸਿਸ ਦੀ ਪ੍ਰਗਤੀ ਅਤੇ ਇੱਕ ਗਤੀਵਿਧੀ-ਨਿਰਭਰ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਸ਼ਨ ਪ੍ਰੋਗਰਾਮ ਦੇ ਉਭਾਰ ਦਾ ਖੁਲਾਸਾ ਕੀਤਾ। ਦਰਅਸਲ, ਟ੍ਰਾਂਸਪਲਾਂਟ ਕੀਤੇ ਕੋਰਟੀਕਲ ਨਿਊਰੋਨ ਆਪਣੇ ਇਨ ਵਿਟਰੋ ਹਮਰੁਤਬਾ ਨਾਲੋਂ ਵਧੇਰੇ ਗੁੰਝਲਦਾਰ ਰੂਪ ਵਿਗਿਆਨਿਕ, ਸਿਨੈਪਟਿਕ ਅਤੇ ਅੰਦਰੂਨੀ ਝਿੱਲੀ ਵਿਸ਼ੇਸ਼ਤਾਵਾਂ ਪ੍ਰਦਰਸ਼ਿਤ ਕਰਦੇ ਹਨ, ਜਿਸ ਨਾਲ ਟਿਮੋਥੀ ਸਿੰਡਰੋਮ ਵਾਲੇ ਮਰੀਜ਼ਾਂ ਵਿੱਚ ਨਿਊਰੋਨਲ ਨੁਕਸ ਦਾ ਪਤਾ ਲਗਾਇਆ ਜਾ ਸਕਦਾ ਹੈ। ਸਰੀਰਿਕ ਅਤੇ ਕਾਰਜਸ਼ੀਲ ਟਰੇਸਿੰਗ ਨੇ ਦਿਖਾਇਆ ਹੈ ਕਿ ਟ੍ਰਾਂਸਪਲਾਂਟ ਕੀਤੇ ਆਰਗੇਨੈਲਜ਼ ਥੈਲਾਮੋਕਾਰਟੀਕਲ ਅਤੇ ਕੋਰਟੀਕੋਕਾਰਟੀਕਲ ਇਨਪੁਟਸ ਪ੍ਰਾਪਤ ਕਰਦੇ ਹਨ, ਅਤੇ ਨਿਊਰਲ ਗਤੀਵਿਧੀ ਦੀਆਂ ਇਨ ਵਿਵੋ ਰਿਕਾਰਡਿੰਗਾਂ ਸੁਝਾਅ ਦਿੰਦੀਆਂ ਹਨ ਕਿ ਇਹ ਇਨਪੁਟਸ ਮਨੁੱਖੀ ਸੈੱਲਾਂ ਵਿੱਚ ਸੰਵੇਦੀ ਪ੍ਰਤੀਕਿਰਿਆਵਾਂ ਪੈਦਾ ਕਰ ਸਕਦੇ ਹਨ। ਅੰਤ ਵਿੱਚ, ਕੋਰਟੀਕਲ ਆਰਗੇਨਾਇਡਸ ਚੂਹੇ ਦੇ ਦਿਮਾਗ ਵਿੱਚ ਐਕਸੋਨ ਫੈਲਾਉਂਦੇ ਹਨ, ਅਤੇ ਉਹਨਾਂ ਦੀ ਆਪਟੋਜੈਨੇਟਿਕ ਐਕਟੀਵੇਸ਼ਨ ਇਨਾਮ-ਖੋਜ ਵਿਵਹਾਰ ਵੱਲ ਲੈ ਜਾਂਦੀ ਹੈ। ਇਸ ਤਰ੍ਹਾਂ, ਟ੍ਰਾਂਸਪਲਾਂਟ ਕੀਤੇ ਮਨੁੱਖੀ ਕਾਰਟੈਕਸ ਨਿਊਰੋਨਸ ਪਰਿਪੱਕ ਹੁੰਦੇ ਹਨ ਅਤੇ ਹੋਸਟ ਦੇ ਸਰਕਟਾਂ ਵਿੱਚ ਹਿੱਸਾ ਲੈਂਦੇ ਹਨ ਜੋ ਵਿਵਹਾਰ ਨੂੰ ਨਿਯੰਤਰਿਤ ਕਰਦੇ ਹਨ। ਅਸੀਂ ਉਮੀਦ ਕਰਦੇ ਹਾਂ ਕਿ ਇਹ ਪਹੁੰਚ ਮਰੀਜ਼ ਤੋਂ ਪ੍ਰਾਪਤ ਸੈੱਲਾਂ ਵਿੱਚ ਸਟ੍ਰੈਂਡ-ਪੱਧਰ ਦੇ ਫੀਨੋਟਾਈਪਾਂ ਦੀ ਖੋਜ ਨੂੰ ਸੁਵਿਧਾਜਨਕ ਬਣਾਏਗੀ ਜਿਨ੍ਹਾਂ ਦਾ ਹੋਰ ਤਰੀਕਿਆਂ ਨਾਲ ਪਤਾ ਨਹੀਂ ਲਗਾਇਆ ਜਾ ਸਕਦਾ।
ਵਿਕਾਸਸ਼ੀਲ ਮਨੁੱਖੀ ਦਿਮਾਗ ਇੱਕ ਸ਼ਾਨਦਾਰ ਸਵੈ-ਸੰਗਠਿਤ ਪ੍ਰਕਿਰਿਆ ਹੈ ਜਿਸ ਵਿੱਚ ਸੈੱਲ ਫੈਲਦੇ ਹਨ, ਵੱਖਰਾ ਕਰਦੇ ਹਨ, ਮਾਈਗ੍ਰੇਟ ਕਰਦੇ ਹਨ ਅਤੇ ਫੰਕਸ਼ਨਲ ਨਿਊਰੋਨਲ ਸਰਕਟ ਬਣਾਉਣ ਲਈ ਜੁੜਦੇ ਹਨ ਜੋ ਸੰਵੇਦੀ ਅਨੁਭਵ ਦੁਆਰਾ ਹੋਰ ਸੁਧਾਰੇ ਜਾਂਦੇ ਹਨ। ਮਨੁੱਖੀ ਦਿਮਾਗ ਦੇ ਵਿਕਾਸ ਨੂੰ ਸਮਝਣ ਵਿੱਚ ਇੱਕ ਮੁੱਖ ਸਮੱਸਿਆ, ਖਾਸ ਕਰਕੇ ਬਿਮਾਰੀ ਦੇ ਸੰਦਰਭ ਵਿੱਚ, ਦਿਮਾਗ ਦੇ ਟਿਸ਼ੂ ਤੱਕ ਪਹੁੰਚ ਦੀ ਘਾਟ ਹੈ। ਸਵੈ-ਸੰਗਠਿਤ ਅੰਗ, ਜਿਸ ਵਿੱਚ ਮਨੁੱਖੀ ਕਾਰਟੈਕਸ ਆਰਗੇਨੋਇਡਜ਼ (hCO; ਜਿਸਨੂੰ ਮਨੁੱਖੀ ਕਾਰਟੈਕਸ ਗੋਲਾ ਵੀ ਕਿਹਾ ਜਾਂਦਾ ਹੈ) ਸ਼ਾਮਲ ਹਨ, 2,3,4,5,6 ਪੈਦਾ ਕਰ ਸਕਦੇ ਹਨ। ਹਾਲਾਂਕਿ, ਕਈ ਸੀਮਾਵਾਂ ਨਿਊਰਲ ਸਰਕਟਾਂ ਦੇ ਵਿਕਾਸ ਅਤੇ ਕਾਰਜਸ਼ੀਲਤਾ ਨੂੰ ਸਮਝਣ ਲਈ ਉਹਨਾਂ ਦੇ ਵਿਆਪਕ ਉਪਯੋਗ ਨੂੰ ਸੀਮਤ ਕਰਦੀਆਂ ਹਨ। ਖਾਸ ਤੌਰ 'ਤੇ, ਇਹ ਸਪੱਸ਼ਟ ਨਹੀਂ ਹੈ ਕਿ ਕੀ hCO ਪਰਿਪੱਕਤਾ ਵਿਵੋ ਵਿੱਚ ਮੌਜੂਦ ਕੁਝ ਸੂਖਮ ਵਾਤਾਵਰਣ ਅਤੇ ਸੰਵੇਦੀ ਇਨਪੁਟਸ ਦੀ ਅਣਹੋਂਦ ਦੁਆਰਾ ਸੀਮਤ ਹੈ। ਇਸ ਤੋਂ ਇਲਾਵਾ, ਕਿਉਂਕਿ hCOs ਉਹਨਾਂ ਸਰਕਟਾਂ ਵਿੱਚ ਏਕੀਕ੍ਰਿਤ ਨਹੀਂ ਹਨ ਜੋ ਵਿਵਹਾਰਕ ਨਤੀਜੇ ਪੈਦਾ ਕਰ ਸਕਦੇ ਹਨ, ਜੈਨੇਟਿਕ ਤੌਰ 'ਤੇ ਗੁੰਝਲਦਾਰ ਅਤੇ ਵਿਵਹਾਰਕ ਨਿਊਰੋਸਾਈਕਿਆਟ੍ਰਿਕ ਵਿਕਾਰਾਂ ਦੇ ਮਾਡਲਿੰਗ ਵਿੱਚ ਉਹਨਾਂ ਦੀ ਉਪਯੋਗਤਾ ਵਰਤਮਾਨ ਵਿੱਚ ਸੀਮਤ ਹੈ।
hCO ਦਾ ਇੱਕ ਅਖੰਡ ਜੀਵਤ ਦਿਮਾਗ ਵਿੱਚ ਟ੍ਰਾਂਸਪਲਾਂਟੇਸ਼ਨ ਇਹਨਾਂ ਸੀਮਾਵਾਂ ਨੂੰ ਦੂਰ ਕਰ ਸਕਦਾ ਹੈ। ਪਿਛਲੇ ਅਧਿਐਨਾਂ ਨੇ ਦਿਖਾਇਆ ਹੈ ਕਿ ਚੂਹੇ ਦੇ ਕਾਰਟੈਕਸ ਵਿੱਚ ਟ੍ਰਾਂਸਪਲਾਂਟ ਕੀਤੇ ਗਏ ਮਨੁੱਖੀ ਨਿਊਰੋਨ ਚੂਹੇ ਦੇ ਸੈੱਲਾਂ 7,8,9,10,11,12 ਨਾਲ ਬਚਣ, ਪ੍ਰੋਜੈਕਟ ਕਰਨ ਅਤੇ ਸੰਚਾਰ ਕਰਨ ਦੇ ਯੋਗ ਹੁੰਦੇ ਹਨ। ਹਾਲਾਂਕਿ, ਇਹ ਪ੍ਰਯੋਗ ਆਮ ਤੌਰ 'ਤੇ ਬਾਲਗ ਜਾਨਵਰਾਂ 'ਤੇ ਕੀਤੇ ਜਾਂਦੇ ਹਨ, ਜੋ ਸਿਨੈਪਟਿਕ ਅਤੇ ਐਕਸੋਨਲ ਏਕੀਕਰਨ ਨੂੰ ਸੀਮਤ ਕਰ ਸਕਦੇ ਹਨ। ਇੱਥੇ, ਅਸੀਂ ਇੱਕ ਟ੍ਰਾਂਸਪਲਾਂਟੇਸ਼ਨ ਪੈਰਾਡਾਈਮ ਦਾ ਵਰਣਨ ਕਰਦੇ ਹਾਂ ਜਿਸ ਵਿੱਚ ਅਸੀਂ ਪਲਾਸਟਿਕ ਵਿਕਾਸ ਦੇ ਸ਼ੁਰੂਆਤੀ ਪੜਾਅ 'ਤੇ ਇਮਯੂਨੋਡਫੀਸ਼ੀਅਨ ਚੂਹਿਆਂ ਦੇ ਪ੍ਰਾਇਮਰੀ ਸੋਮੈਟੋਸੈਂਸਰੀ ਕਾਰਟੈਕਸ (S1) ਵਿੱਚ hiPS ਸੈੱਲਾਂ ਤੋਂ ਪ੍ਰਾਪਤ 3D hCO ਨੂੰ ਟ੍ਰਾਂਸਪਲਾਂਟ ਕੀਤਾ। ਟ੍ਰਾਂਸਪਲਾਂਟ ਕੀਤੇ hCO (t-hCO) ਨਿਊਰੋਨ ਕਾਫ਼ੀ ਪਰਿਪੱਕਤਾ ਵਿੱਚੋਂ ਗੁਜ਼ਰਦੇ ਹਨ, ਥੈਲੇਮੋਕਾਰਟੀਕਲ ਅਤੇ ਕੋਰਟੀਕਲ-ਕਾਰਟੀਕਲ ਇਨਪੁਟ ਪ੍ਰਾਪਤ ਕਰਦੇ ਹਨ ਜੋ ਸੰਵੇਦੀ ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆਵਾਂ ਨੂੰ ਪ੍ਰਾਪਤ ਕਰਦੇ ਹਨ, ਅਤੇ ਇਨਾਮ-ਖੋਜ ਵਿਵਹਾਰ ਨੂੰ ਚਲਾਉਣ ਲਈ ਚੂਹੇ ਦੇ ਦਿਮਾਗ ਵਿੱਚ ਐਕਸੋਨਲ ਅਨੁਮਾਨਾਂ ਨੂੰ ਵਧਾਉਂਦੇ ਹਨ। t-hCO ਦੀ ਵਧੀ ਹੋਈ ਪਰਿਪੱਕਤਾ ਨੇ ਟਿਮੋਥੀ ਸਿੰਡਰੋਮ (TS) ਵਾਲੇ ਮਰੀਜ਼ਾਂ ਵਿੱਚ ਨਿਊਰੋਨਲ ਨੁਕਸ ਦਾ ਖੁਲਾਸਾ ਕੀਤਾ ਹੈ, ਜੋ ਕਿ ਵੋਲਟੇਜ-ਸੰਵੇਦਨਸ਼ੀਲ L-ਕਿਸਮ CaV1.2 ਕੈਲਸ਼ੀਅਮ ਚੈਨਲ (CACNA1C ਦੁਆਰਾ ਏਨਕੋਡ ਕੀਤਾ ਗਿਆ) ਵਿੱਚ ਪਰਿਵਰਤਨ ਕਾਰਨ ਇੱਕ ਗੰਭੀਰ ਜੈਨੇਟਿਕ ਵਿਕਾਰ ਹੈ।
ਵਿਵੋ ਵਿੱਚ ਸਰਕਟਾਂ ਵਿੱਚ ਮਨੁੱਖੀ ਕੋਰਟੀਕਲ ਨਿਊਰੋਨਸ ਦਾ ਅਧਿਐਨ ਕਰਨ ਲਈ, ਅਸੀਂ ਸਟੀਰੀਓਟੈਕਟਿਕ ਤੌਰ 'ਤੇ ਸ਼ੁਰੂਆਤੀ ਪੋਸਟਨੇਟਲ ਐਥੀਮਿਕ ਚੂਹਿਆਂ (ਜਨਮ ਤੋਂ ਬਾਅਦ 3-7 ਦਿਨ) ਦੇ S1 ਵਿੱਚ ਸੰਪੂਰਨ 3D hCO ਟ੍ਰਾਂਸਪਲਾਂਟ ਕੀਤਾ (ਚਿੱਤਰ 1a ਅਤੇ ਚਿੱਤਰ 1a-c ਦਾ ਵਿਸਤ੍ਰਿਤ ਡੇਟਾ)। ਇਸ ਬਿੰਦੂ 'ਤੇ, ਥੈਲਾਮੋਕਾਰਟੀਕਲ ਅਤੇ ਕੋਰਟੀਕੋਕਾਰਟੀਕਲ ਐਕਸੋਨਲ ਪ੍ਰੋਜੈਕਸ਼ਨਾਂ ਨੇ ਅਜੇ ਤੱਕ ਆਪਣੇ S1 ਇਨਰਵੇਸ਼ਨ ਨੂੰ ਪੂਰਾ ਨਹੀਂ ਕੀਤਾ ਹੈ (ਰੈਫ. 13)। ਇਸ ਤਰ੍ਹਾਂ, ਇਹ ਪਹੁੰਚ ਐਂਡੋਜੇਨਸ ਸਰਕਟਾਂ 'ਤੇ ਪ੍ਰਭਾਵ ਨੂੰ ਘੱਟ ਕਰਦੇ ਹੋਏ t-hCO ਏਕੀਕਰਨ ਨੂੰ ਵੱਧ ਤੋਂ ਵੱਧ ਕਰਨ ਲਈ ਤਿਆਰ ਕੀਤੀ ਗਈ ਹੈ। ਜੀਵਤ ਜਾਨਵਰਾਂ ਵਿੱਚ t-hCO ਦੀ ਸਥਿਤੀ ਦੀ ਕਲਪਨਾ ਕਰਨ ਲਈ, ਅਸੀਂ ਟ੍ਰਾਂਸਪਲਾਂਟੇਸ਼ਨ ਤੋਂ 2-3 ਮਹੀਨਿਆਂ ਬਾਅਦ ਚੂਹਿਆਂ ਦੇ T2-ਭਾਰ ਵਾਲੇ MRI ਦਿਮਾਗ ਦੇ ਪੁਨਰ ਨਿਰਮਾਣ ਕੀਤੇ (ਚਿੱਤਰ 1b ਅਤੇ ਵਿਸਤ੍ਰਿਤ ਡੇਟਾ, ਚਿੱਤਰ 1d)। t-hCO ਨੂੰ ਆਸਾਨੀ ਨਾਲ ਦੇਖਿਆ ਗਿਆ ਅਤੇ t-hCO ਦੇ ਆਇਤਨ ਮਾਪ ਸਥਿਰ ਟੁਕੜਿਆਂ ਤੋਂ ਗਣਨਾ ਕੀਤੇ ਗਏ ਮਾਪਾਂ ਦੇ ਸਮਾਨ ਸਨ (ਵਿਸਤ੍ਰਿਤ ਡੇਟਾ ਚਿੱਤਰ 1d,e; P > 0.05)। t-hCO ਨੂੰ ਆਸਾਨੀ ਨਾਲ ਦੇਖਿਆ ਗਿਆ ਅਤੇ t-hCO ਦੇ ਆਇਤਨ ਮਾਪ ਸਥਿਰ ਟੁਕੜਿਆਂ ਤੋਂ ਗਣਨਾ ਕੀਤੇ ਗਏ ਮਾਪਾਂ ਦੇ ਸਮਾਨ ਸਨ (ਵਿਸਤ੍ਰਿਤ ਡੇਟਾ ਚਿੱਤਰ 1d,e; P > 0.05)। t-hCO легко наблюдались, а объемные измерения t-hCO были аналогичны рассчитанным для фиксированных срезов (расшированных срезов, e.d., e. ਪੀ > 0,05)। t-hCO ਨੂੰ ਆਸਾਨੀ ਨਾਲ ਦੇਖਿਆ ਗਿਆ, ਅਤੇ ਵੌਲਯੂਮੈਟ੍ਰਿਕ t-hCO ਮਾਪ ਸਥਿਰ ਭਾਗਾਂ ਲਈ ਗਣਨਾ ਕੀਤੇ ਗਏ ਮਾਪਾਂ ਦੇ ਸਮਾਨ ਸਨ (ਵਿਸਤ੍ਰਿਤ ਡੇਟਾ, ਚਿੱਤਰ 1d, e; P > 0.05)।很容易观察到t-hCO，并且t-hCO的体积测量值与从固定切片计算的测量值相似（扩展数据图1d、e；P > 0.05）।很容易观察到t-hCO，并且t-hCO t-hCO легко наблюдался, а объемные измерения t-hCO были аналогичны рассчитанным для фиксированных срезов (расшированных срезов, e.d., e. ਪੀ > 0,05)। t-hCO ਨੂੰ ਆਸਾਨੀ ਨਾਲ ਦੇਖਿਆ ਗਿਆ, ਅਤੇ ਵੌਲਯੂਮੈਟ੍ਰਿਕ t-hCO ਮਾਪ ਸਥਿਰ ਭਾਗਾਂ ਲਈ ਗਣਨਾ ਕੀਤੇ ਗਏ ਮਾਪਾਂ ਦੇ ਸਮਾਨ ਸਨ (ਵਿਸਤ੍ਰਿਤ ਡੇਟਾ, ਚਿੱਤਰ 1d, e; P > 0.05)।ਅਸੀਂ ਟ੍ਰਾਂਸਪਲਾਂਟੇਸ਼ਨ ਤੋਂ ਲਗਭਗ 2 ਮਹੀਨੇ ਬਾਅਦ 81% ਟ੍ਰਾਂਸਪਲਾਂਟ ਕੀਤੇ ਜਾਨਵਰਾਂ ਵਿੱਚ t-hCO ਨਿਰਧਾਰਤ ਕੀਤਾ (n = 72 ਜਾਨਵਰ; 10 hiPS ਸੈੱਲ ਲਾਈਨਾਂ ਤੋਂ hCO; ਪੂਰਕ ਸਾਰਣੀ 1 ਵਿੱਚ hiPS ਸੈੱਲ ਲਾਈਨਾਂ)। ਇਹਨਾਂ ਵਿੱਚੋਂ, 87% ਸੇਰੇਬ੍ਰਲ ਕਾਰਟੈਕਸ ਵਿੱਚ ਸਥਿਤ ਸਨ (ਚਿੱਤਰ 1c)। ਇੱਕੋ ਟ੍ਰਾਂਸਪਲਾਂਟ ਕੀਤੇ ਚੂਹੇ ਵਿੱਚ ਕਈ ਸਮੇਂ ਦੇ ਬਿੰਦੂਆਂ 'ਤੇ ਸੀਰੀਅਲ MRI ਸਕੈਨ ਕਰਕੇ, ਸਾਨੂੰ 3 ਮਹੀਨਿਆਂ ਦੇ ਅੰਦਰ t-hCO ਵਾਲੀਅਮ ਵਿੱਚ ਨੌਂ ਗੁਣਾ ਵਾਧਾ ਮਿਲਿਆ (ਚਿੱਤਰ 1d ਅਤੇ ਵਿਸਤ੍ਰਿਤ ਡੇਟਾ, ਚਿੱਤਰ 1f)। ਟ੍ਰਾਂਸਪਲਾਂਟੇਸ਼ਨ ਤੋਂ ਬਾਅਦ 12 ਮਹੀਨਿਆਂ ਵਿੱਚ ਟ੍ਰਾਂਸਪਲਾਂਟ ਕੀਤੇ ਜਾਨਵਰਾਂ ਵਿੱਚ ਉੱਚ ਬਚਾਅ ਦਰ (74%) ਸੀ (ਵਿਸਤ੍ਰਿਤ ਡੇਟਾ, ਚਿੱਤਰ 1g ਅਤੇ ਪੂਰਕ ਸਾਰਣੀ 2), ਅਤੇ ਕੋਈ ਵੀ ਸਪੱਸ਼ਟ ਮੋਟਰ ਜਾਂ ਯਾਦਦਾਸ਼ਤ ਕਮਜ਼ੋਰੀ, ਗਲਿਓਸਿਸ, ਜਾਂ ਇਲੈਕਟ੍ਰੋਐਂਸਫੈਲੋਗ੍ਰਾਮ (EEG) ਨਹੀਂ ਮਿਲਿਆ। ਡੇਟਾ ਚਿੱਤਰ 1g ਅਤੇ ਪੂਰਕ ਸਾਰਣੀ 2)। 1h–m ਅਤੇ 3e)।
a, ਪ੍ਰਯੋਗਾਤਮਕ ਡਿਜ਼ਾਈਨ ਦੀ ਯੋਜਨਾਬੱਧ। hiPS ਸੈੱਲਾਂ ਤੋਂ ਪ੍ਰਾਪਤ hCO ਨੂੰ ਵਿਭਿੰਨਤਾ ਦੇ 30-60 ਦਿਨਾਂ ਵਿੱਚ ਨਵਜੰਮੇ ਨੰਗੇ ਚੂਹਿਆਂ ਦੇ S1 ਵਿੱਚ ਟ੍ਰਾਂਸਪਲਾਂਟ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ। b, ਟ੍ਰਾਂਸਪਲਾਂਟੇਸ਼ਨ ਤੋਂ 2 ਮਹੀਨਿਆਂ ਬਾਅਦ S1 ਵਿੱਚ t-hCO ਦਿਖਾਉਂਦੇ ਹੋਏ T2-ਵਜ਼ਨ ਵਾਲੇ ਕੋਰੋਨਲ ਅਤੇ ਖਿਤਿਜੀ MRI ਚਿੱਤਰ। ਸਕੇਲ ਬਾਰ, 2 ਮਿਲੀਮੀਟਰ। c, ਹਰੇਕ hiPS ਸੈੱਲ ਲਾਈਨ ਲਈ ਦਿਖਾਈ ਗਈ ਐਂਗ੍ਰਾਫਟਮੈਂਟ ਸਫਲਤਾ ਦਰਾਂ ਦੀ ਮਾਤਰਾ (n = 108, ਬਾਰਾਂ ਦੇ ਅੰਦਰ ਸੰਖਿਆਵਾਂ ਪ੍ਰਤੀ hIPS ਸੈੱਲ ਲਾਈਨ t-hCO ਦੀ ਮਾਤਰਾ ਦਰਸਾਉਂਦੀਆਂ ਹਨ) ਅਤੇ ਕੋਰਟੀਕਲ ਜਾਂ ਸਬਕੋਰਟੀਕਲ ਸਥਾਨ (n = 88)। d, ਇੱਕ ਕੋਰੋਨਰੀ ਆਰਟਰੀ (ਖੱਬੇ; ਸਕੇਲ ਬਾਰ, 3 ਮਿਲੀਮੀਟਰ) ਅਤੇ ਅਨੁਸਾਰੀ 3D ਵੌਲਯੂਮੈਟ੍ਰਿਕ ਪੁਨਰ ਨਿਰਮਾਣ (ਸਕੇਲ ਬਾਰ, 3 ਮਿਲੀਮੀਟਰ) ਦਾ MRI ਚਿੱਤਰ 3 ਮਹੀਨਿਆਂ ਵਿੱਚ t-hCO ਵਿੱਚ ਵਾਧਾ ਦਰਸਾਉਂਦਾ ਹੈ। e, ਚੂਹੇ ਦੇ ਦਿਮਾਗੀ ਕਾਰਟੈਕਸ ਵਿੱਚ t-hCO ਪੈਟਰਨਾਂ ਦੀ ਸਮੀਖਿਆ। ਸਕੇਲ ਬਾਰ, 1 ਮਿਲੀਮੀਟਰ। f, ਉੱਪਰ ਖੱਬੇ ਤੋਂ ਸੱਜੇ (ਵਿਭਿੰਨਤਾ ਦੌਰਾਨ) ਦਿਖਾਏ ਗਏ t-hCO ਦੇ ਪ੍ਰਤੀਨਿਧੀ ਇਮਯੂਨੋਸਾਈਟੋਕੈਮੀਕਲ ਚਿੱਤਰ: PPP1R17 (4 ਮਹੀਨੇ ਪੁਰਾਣਾ), NeuN (8 ਮਹੀਨੇ ਪੁਰਾਣਾ), SOX9 ਅਤੇ GFAP (8 ਮਹੀਨੇ ਪੁਰਾਣਾ), PDGFRα; (8 ਮਹੀਨੇ), MAP2 (8 ਮਹੀਨੇ) ਅਤੇ IBA1 (8 ਮਹੀਨੇ)। ਸਕੇਲ ਬਾਰ, 20 µm। HNA ਦਾ ਸਹਿ-ਪ੍ਰਗਟਾਵਾ ਮਨੁੱਖੀ ਮੂਲ ਦੇ ਸੈੱਲਾਂ ਨੂੰ ਦਰਸਾਉਂਦਾ ਹੈ। g, snRNA-seq: Seurat ਏਕੀਕਰਨ ਤੋਂ ਬਾਅਦ ਸਾਰੇ ਉੱਚ-ਗੁਣਵੱਤਾ ਵਾਲੇ t-hCO ਨਿਊਕਲੀਅਸ ਦੀ ਯੂਨੀਫਾਈਡ ਮੈਨੀਫੋਲਡ ਅਤੇ ਪ੍ਰੋਜੈਕਸ਼ਨ (UMAP) ਡਾਇਮੈਂਸ਼ਲਿਟੀ ਰਿਡਕਸ਼ਨ ਇਮੇਜਿੰਗ (n=3 t-hCO ਨਮੂਨੇ, n=2 hiPS ਸੈੱਲ ਲਾਈਨਾਂ)। ਐਸਟ੍ਰੋਸਾਈਟਸ, ਐਸਟ੍ਰੋਸਾਈਟ ਲਾਈਨ ਦੇ ਸੈੱਲ; ਸਾਈਕਲ ਪ੍ਰੋਗ, ਘੁੰਮਦੇ ਪੂਰਵਜ; GluN DL, ਡੂੰਘੇ ਗਲੂਟਾਮੈਟਰਜਿਕ ਨਿਊਰੋਨਸ; GluN DL/SP, ਡੂੰਘੇ ਅਤੇ ਸਬਲੇਮੈਲਰ ਗਲੂਟਾਮੈਟਰਜਿਕ ਨਿਊਰੋਨਸ; GluN UL, ਉਪਰਲੀ ਪਰਤ ਗਲੂਟਾਮੈਟਰਜਿਕ ਨਿਊਰੋਨਸ; ਓਲੀਗੋਡੈਂਡਰੋਸਾਈਟਸ, ਓਲੀਗੋਡੈਂਡਰੋਸਾਈਟਸ; OPC, ਓਲੀਗੋਡੈਂਡਰੋਸਾਈਟ ਪ੍ਰੋਜੇਨਿਟਰ ਸੈੱਲ; RELN, ਰੀਲਿਨ ਨਿਊਰੋਨਸ। h, hCO ਗਲੂਟਾਮੈਟਰਜਿਕ ਨਿਊਰੋਨਸ ਦੇ ਮੁਕਾਬਲੇ t-hCO ਗਲੂਟਾਮੈਟਰਜਿਕ ਨਿਊਰੋਨਸ ਵਿੱਚ ਜੀਨ ਓਨਟੋਲੋਜੀ (GO) ਟਰਮ ਐਨਰਿਚਮੈਂਟ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ, ਜੋ ਕਿ ਮਹੱਤਵਪੂਰਨ ਤੌਰ 'ਤੇ ਅੱਪਰੇਗੂਲੇਟ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਹੈ (ਐਡਜਸਟ ਕੀਤਾ ਗਿਆ P < 0.05, ਫੋਲਡ ਬਦਲਾਅ > 2, ਨਿਊਕਲੀਅਸ ਦੇ ਘੱਟੋ-ਘੱਟ 10% ਵਿੱਚ ਦਰਸਾਇਆ ਗਿਆ ਹੈ)। h, hCO ਗਲੂਟਾਮੈਟਰਜਿਕ ਨਿਊਰੋਨਸ ਦੇ ਮੁਕਾਬਲੇ t-hCO ਗਲੂਟਾਮੈਟਰਜਿਕ ਨਿਊਰੋਨਸ ਵਿੱਚ ਜੀਨ ਓਨਟੋਲੋਜੀ (GO) ਟਰਮ ਐਨਰਿਚਮੈਂਟ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ, ਜੋ ਕਿ ਮਹੱਤਵਪੂਰਨ ਤੌਰ 'ਤੇ ਅੱਪਰੇਗੂਲੇਟ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਹੈ (ਐਡਜਸਟ ਕੀਤਾ ਗਿਆ P < 0.05, ਫੋਲਡ ਬਦਲਾਅ > 2, ਨਿਊਕਲੀਅਸ ਦੇ ਘੱਟੋ-ਘੱਟ 10% ਵਿੱਚ ਦਰਸਾਇਆ ਗਿਆ ਹੈ)। h, Анализ обогащения терминов ਜੀਨ ਓਨਟੋਲੋਜੀ (GO) для генов со значительной активацией (скорректированный P <0,05, кратность, эсяк2 изямре > по крайней мере в 10% ядер) в глутаматергических нейронах t-hCO по сравнению с глутаматергическими нейронами hCO. h, hCO ਗਲੂਟਾਮੈਟਰਜਿਕ ਨਿਊਰੋਨਸ ਦੇ ਮੁਕਾਬਲੇ t-hCO ਗਲੂਟਾਮੈਟਰਜਿਕ ਨਿਊਰੋਨਸ ਵਿੱਚ ਮਹੱਤਵਪੂਰਨ ਐਕਟੀਵੇਸ਼ਨ (ਐਡਜਸਟਡ P<0.05, ਫੋਲਡ ਬਦਲਾਅ >2, ਘੱਟੋ-ਘੱਟ 10% ਨਿਊਕਲੀਅਸ ਵਿੱਚ ਪ੍ਰਗਟਾਵਾ) ਵਾਲੇ ਜੀਨਾਂ ਲਈ ਜੀਨ ਓਨਟੋਲੋਜੀ (GO) ਸ਼ਬਦ ਸੰਸ਼ੋਧਨ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ। h,与hCO 谷氨酸能神经元相比，t-hCO 谷氨酸能神经元中基因显着上调（调整后P <0. 2,在至少10% 的细胞核中表达）的基因本体论(GO) 术语富集分析. h ， 与 hco 谷氨酸 能 元 相比 ， t-hco 谷氨酸 能 神经 元 基因 显着 上调 （后 变 变 变 5 <变化> 2，至少 10% 的核中表达） 基因 基因 基因 的 的至少 10% 的本体论(GO) 术语富集分析. h, гены значительно активизировались (скорректированный P <0,05, кратность изменения> 2, экспрессируется по крайнев %1мев) глутаматергических нейронах t-hCO по сравнению с глутаматергическими нейронами hCO Онтологический (GO) анализ тербоящению. h, t-hCO ਵਿੱਚ ਜੀਨਾਂ ਨੂੰ ਮਹੱਤਵਪੂਰਨ ਤੌਰ 'ਤੇ ਉੱਚਾ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ (ਐਡਜਸਟ ਕੀਤਾ ਗਿਆ P < 0.05, ਫੋਲਡ ਬਦਲਾਅ > 2, ਘੱਟੋ-ਘੱਟ 10% ਨਿਊਕਲੀਅਸ ਵਿੱਚ ਦਰਸਾਇਆ ਗਿਆ) hCO ਦੇ ਮੁਕਾਬਲੇ ਗਲੂਟਾਮੈਟਰਜਿਕ ਨਿਊਰੋਨਸ ਸੰਸ਼ੋਧਨ ਸ਼ਬਦ ਦਾ ਓਨਟੋਲੋਜੀਕਲ (GO) ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ।ਬਿੰਦੀਦਾਰ ਲਾਈਨ 0.05 ਦੇ aq ਮੁੱਲ ਨੂੰ ਦਰਸਾਉਂਦੀ ਹੈ। i, ਇੱਕ ਸੰਦਰਭ 22 snRNA-seq ਬਾਲਗ ਮੋਟਰ ਕਾਰਟੈਕਸ ਡੇਟਾਸੈਟ ਤੋਂ ਲੇਬਲ ਟ੍ਰਾਂਸਫਰ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੇ ਹੋਏ t-hCO ਵਿੱਚ GluN ਸੈੱਲ ਕਿਸਮਾਂ ਦੀ UMAP ਇਮੇਜਿੰਗ। CT — ਕੋਰਟੀਕੋਥੈਲਮਿਕ ਸੈੱਲ, ET — ਐਕਸਟਰਾਸੇਰੇਬ੍ਰਲ ਸੈੱਲ, IT — ਅੰਦਰੂਨੀ ਟੈਲੈਂਸੇਫੈਲਿਕ ਸੈੱਲ, NP — ਪ੍ਰੋਜੈਕਸ਼ਨ ਦੇ ਨੇੜੇ।
ਫਿਰ ਅਸੀਂ ਸਾਈਟੋਆਰਕੀਟੈਕਚਰ ਅਤੇ t-hCO ਦੀ ਸਮੁੱਚੀ ਸੈਲੂਲਰ ਰਚਨਾ ਦਾ ਮੁਲਾਂਕਣ ਕੀਤਾ। ਚੂਹੇ ਦੇ ਐਂਡੋਥੈਲੀਅਲ ਸੈੱਲਾਂ ਦੇ ਐਂਟੀਬਾਡੀ ਸਟੈਨਿੰਗ ਨੇ t-hCO ਨਾਲ ਵੈਸਕੁਲਰਾਈਜ਼ੇਸ਼ਨ ਦਾ ਖੁਲਾਸਾ ਕੀਤਾ, ਜਦੋਂ ਕਿ IBA1 ਸਟੈਨਿੰਗ ਨੇ ਪੂਰੇ ਗ੍ਰਾਫਟ ਵਿੱਚ ਚੂਹੇ ਦੇ ਮਾਈਕ੍ਰੋਗਲੀਆ ਦੀ ਮੌਜੂਦਗੀ ਦਾ ਖੁਲਾਸਾ ਕੀਤਾ (ਚਿੱਤਰ 1f ਅਤੇ ਵਿਸਤ੍ਰਿਤ ਡੇਟਾ, ਚਿੱਤਰ 3c,d)। ਇਮਯੂਨੋਸਟੇਨਿੰਗ ਨੇ ਮਨੁੱਖੀ ਨਿਊਕਲੀਅਰ ਐਂਟੀਜੇਨ (HNA) ਸਕਾਰਾਤਮਕ ਸੈੱਲਾਂ ਦਾ ਖੁਲਾਸਾ ਕੀਤਾ ਜੋ PPP1R17 (ਕਾਰਟੀਕਲ ਪ੍ਰੋਜੇਨਿਟਰ), NeuN (ਨਿਊਰੋਨ), SOX9 ਅਤੇ GFAP (ਗਲਾਈਅਲ-ਪ੍ਰਾਪਤ ਸੈੱਲ) ਜਾਂ PDGFRα (ਓਲੀਗੋਡੈਂਡਰੋਸਾਈਟ ਪ੍ਰੋਜੇਨਿਟਰ) (ਚਿੱਤਰ 1f) ਨੂੰ ਸਹਿ-ਪ੍ਰਗਟਾ ਰਹੇ ਹਨ। ਸਿੰਗਲ ਸੈੱਲ ਰੈਜ਼ੋਲਿਊਸ਼ਨ 'ਤੇ t-hCO ਦੀ ਸੈਲੂਲਰ ਰਚਨਾ ਦਾ ਅਧਿਐਨ ਕਰਨ ਲਈ, ਅਸੀਂ ਲਗਭਗ 8 ਮਹੀਨਿਆਂ ਦੇ ਵਿਭਿੰਨਤਾ ਤੋਂ ਬਾਅਦ ਸਿੰਗਲ-ਕੋਰ RNA ਸੀਕੁਐਂਸਿੰਗ (snRNA-seq) ਕੀਤੀ। ਚੂਹੇ ਦੇ ਨਿਊਕਲੀ ਦੇ ਥੋਕ ਫਿਲਟਰੇਸ਼ਨ ਅਤੇ ਹਟਾਉਣ ਨਾਲ 21,500 ਉੱਚ-ਗੁਣਵੱਤਾ ਵਾਲੇ ਮਨੁੱਖੀ ਮੋਨੋਨਿਊਕਲੀਅਰ ਨਕਸ਼ੇ ਪ੍ਰਾਪਤ ਹੋਏ (ਚਿੱਤਰ 1g ਅਤੇ ਵਿਸਤ੍ਰਿਤ ਡੇਟਾ, ਚਿੱਤਰ 4a,b)। ਆਮ ਸੈੱਲ-ਕਿਸਮ ਦੇ ਮਾਰਕਰਾਂ ਦੇ ਪ੍ਰਗਟਾਵੇ ਦੇ ਪੈਟਰਨਾਂ ਨੇ ਮੁੱਖ ਕੋਰਟੀਕਲ ਸੈੱਲ ਕਲਾਸਾਂ ਦੇ ਕਲੱਸਟਰਾਂ ਦੀ ਪਛਾਣ ਕੀਤੀ, ਜਿਸ ਵਿੱਚ ਡੂੰਘੇ ਅਤੇ ਸਤਹੀ ਗਲੂਟਾਮੈਟਰਜਿਕ ਨਿਊਰੋਨਸ, ਘੁੰਮਦੇ ਪੂਰਵਜ, ਓਲੀਗੋਡੈਂਡਰੋਸਾਈਟਸ, ਅਤੇ ਐਸਟ੍ਰੋਸਾਈਟ ਵੰਸ਼ ਸ਼ਾਮਲ ਹਨ (ਚਿੱਤਰ 1g, ਵਿਸਤ੍ਰਿਤ ਡੇਟਾ, ਚਿੱਤਰ 4c, ਅਤੇ ਪੂਰਕ ਸਾਰਣੀ 3)। SATB2 ਅਤੇ CTIP2 ਲਈ ਇਮਯੂਨੋਸਟੇਨਿੰਗ ਨੇ ਦਿਖਾਇਆ ਕਿ ਕੋਰਟੀਕਲ ਉਪ-ਕਿਸਮਾਂ ਦੀ ਮੌਜੂਦਗੀ ਦੇ ਬਾਵਜੂਦ, t-hCO ਨੇ ਸਪਸ਼ਟ ਸਰੀਰਿਕ ਪੱਧਰੀਕਰਨ ਨਹੀਂ ਦਿਖਾਇਆ (ਵਿਸਤ੍ਰਿਤ ਡੇਟਾ, ਚਿੱਤਰ 3a)। ਪੜਾਅ-ਮੇਲ ਖਾਂਦੇ snRNA-seq hCO ਨੇ ਕੁਝ ਅਪਵਾਦਾਂ ਦੇ ਨਾਲ, ਵਿਆਪਕ ਤੌਰ 'ਤੇ ਸਮਾਨ ਸੈੱਲ ਕਲਾਸਾਂ ਪੈਦਾ ਕੀਤੀਆਂ, ਜਿਸ ਵਿੱਚ ਓਲੀਗੋਡੈਂਡਰੋਸਾਈਟਸ ਦੀ ਅਣਹੋਂਦ ਅਤੇ GABAergic ਨਿਊਰੋਨਸ ਦੀ ਮੌਜੂਦਗੀ ਸ਼ਾਮਲ ਹੈ, ਜੋ ਕਿ ਲੇਟਰਲ ਪ੍ਰੋਜੇਨਿਟਰ ਸੈੱਲਾਂ ਲਈ ਪਹਿਲਾਂ ਰਿਪੋਰਟ ਕੀਤੇ ਅਨੁਕੂਲ ਇਨ ਵਿਟਰੋ ਸਥਿਤੀਆਂ ਨੂੰ ਦਰਸਾ ਸਕਦੇ ਹਨ15 (ਵਿਸਤ੍ਰਿਤ ਡੇਟਾ, ਚਿੱਤਰ 4f - i ਅਤੇ ਪੂਰਕ ਸਾਰਣੀ 4)। ਵਿਭਿੰਨ ਜੀਨ ਪ੍ਰਗਟਾਵੇ ਦੇ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਨੇ t-hCO ਅਤੇ hCO (ਪੂਰਕ ਸਾਰਣੀ 5) ਵਿਚਕਾਰ ਗਲੂਟਾਮੈਟਰਜਿਕ ਨਿਊਰੋਨਸ ਵਿੱਚ ਮਹੱਤਵਪੂਰਨ ਅੰਤਰ ਪ੍ਰਗਟ ਕੀਤੇ, ਜਿਸ ਵਿੱਚ ਨਿਊਰੋਨਲ ਪਰਿਪੱਕਤਾ ਨਾਲ ਜੁੜੇ ਜੀਨਾਂ ਦੇ ਸੈੱਟਾਂ ਦੀ ਕਿਰਿਆਸ਼ੀਲਤਾ ਸ਼ਾਮਲ ਹੈ ਜਿਵੇਂ ਕਿ ਸਿਨੈਪਟਿਕ ਸਿਗਨਲਿੰਗ, ਡੈਂਡਰਟਿਕ ਸਥਾਨੀਕਰਨ, ਅਤੇ ਵੋਲਟੇਜ-ਗੇਟਿਡ ਚੈਨਲ ਗਤੀਵਿਧੀ (ਚਿੱਤਰ 1h ਅਤੇ ਪੂਰਕ ਸਾਰਣੀ 5)। ਸਾਰਣੀ 6)। ਇਸ ਅਨੁਸਾਰ, ਕੋਰਟੀਕਲ ਗਲੂਟਾਮੈਟਰਜਿਕ t-hCO ਨਿਊਰੋਨਸ ਨੇ ਤੇਜ਼ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਸ਼ਨਲ ਪਰਿਪੱਕਤਾ ਦਾ ਪ੍ਰਦਰਸ਼ਨ ਕੀਤਾ।
ਇਹ ਸਪੱਸ਼ਟ ਕਰਨ ਲਈ ਕਿ ਕੀ t-hCO ਵਿੱਚ ਇਹ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਸ਼ਨਲ ਬਦਲਾਅ hCO ਇਨ ਵਿਟਰੋ ਅਤੇ t-hCO ਇਨ ਵਿਵੋ ਵਿਚਕਾਰ ਰੂਪ ਵਿਗਿਆਨਿਕ ਅੰਤਰਾਂ ਨਾਲ ਸਬੰਧਤ ਸਨ, ਅਸੀਂ 7-8 ਮਹੀਨਿਆਂ ਦੇ ਵਿਭਿੰਨਤਾ ਤੋਂ ਬਾਅਦ ਤੀਬਰ ਭਾਗਾਂ ਵਿੱਚ ਪੜਾਅ-ਮੇਲ ਖਾਂਦੇ ਬਾਇਓਸਾਈਟਿਨ-ਭਰੇ hCO ਅਤੇ hCO ਦਾ ਪੁਨਰਗਠਨ ਕੀਤਾ। hCO ਨਿਊਰੋਨਸ (ਚਿੱਤਰ 2a)। t-hCO ਨਿਊਰੋਨਸ ਕਾਫ਼ੀ ਵੱਡੇ ਸਨ, ਸੋਮਾ ਵਿਆਸ ਦਾ 1.5 ਗੁਣਾ, ਡੈਂਡਰਾਈਟਸ ਨਾਲੋਂ ਦੁੱਗਣਾ, ਅਤੇ ਇਨ ਵਿਟਰੋ hCO (ਚਿੱਤਰ 2b) ਦੇ ਮੁਕਾਬਲੇ ਕੁੱਲ ਡੈਂਡਰਾਈਟਿਕ ਲੰਬਾਈ ਵਿੱਚ ਕੁੱਲ ਛੇ ਗੁਣਾ ਵਾਧਾ ਸੀ। ਇਸ ਤੋਂ ਇਲਾਵਾ, ਅਸੀਂ hCO ਨਿਊਰੋਨਸ (ਚਿੱਤਰ 2c) ਦੇ ਮੁਕਾਬਲੇ t-hCO ਨਿਊਰੋਨਸ ਵਿੱਚ ਡੈਂਡਰਾਈਟਿਕ ਰੀੜ੍ਹ ਦੀ ਹੱਡੀ ਦੀ ਇੱਕ ਮਹੱਤਵਪੂਰਨ ਤੌਰ 'ਤੇ ਉੱਚ ਘਣਤਾ ਦੇਖੀ। ਇਹ ਸੁਝਾਅ ਦਿੰਦਾ ਹੈ ਕਿ t-hCO ਨਿਊਰੋਨਸ ਵਿਆਪਕ ਡੈਂਡਰਾਈਟਿਕ ਲੰਬਾਈ ਅਤੇ ਸ਼ਾਖਾਵਾਂ ਵਿੱਚੋਂ ਗੁਜ਼ਰਦੇ ਹਨ, ਜੋ ਕਿ ਨਿਰੰਤਰ ਸੈੱਲ ਪ੍ਰਸਾਰ ਦੇ ਨਾਲ, ਟ੍ਰਾਂਸਪਲਾਂਟੇਸ਼ਨ ਤੋਂ ਬਾਅਦ t-hCO ਦੇ ਤੀਬਰ ਵਿਕਾਸ ਵਿੱਚ ਯੋਗਦਾਨ ਪਾ ਸਕਦੇ ਹਨ (ਚਿੱਤਰ 1d ਅਤੇ ਵਿਸਤ੍ਰਿਤ ਡੇਟਾ ਚਿੱਤਰ 1f)। ਇਸਨੇ ਸਾਨੂੰ ਇਲੈਕਟ੍ਰੋਫਿਜ਼ੀਓਲੋਜੀਕਲ ਵਿਸ਼ੇਸ਼ਤਾਵਾਂ ਦੀ ਜਾਂਚ ਕਰਨ ਲਈ ਪ੍ਰੇਰਿਤ ਕੀਤਾ। ਝਿੱਲੀ ਸਮਰੱਥਾ ਅੱਠ ਗੁਣਾ ਵੱਧ ਸੀ (ਵਿਸਤ੍ਰਿਤ ਡੇਟਾ, ਚਿੱਤਰ 8d), ਆਰਾਮ-ਅਵਸਥਾ ਝਿੱਲੀ ਸੰਭਾਵੀ ਵਧੇਰੇ ਹਾਈਪਰਪੋਲਰਾਈਜ਼ਡ ਸੀ (ਲਗਭਗ 20 mV), ਅਤੇ ਮੌਜੂਦਾ ਟੀਕੇ ਨੇ hCO ਨਿਊਰੋਨਸ ਨਾਲੋਂ t-hCO ਨਿਊਰੋਨਸ ਵਿੱਚ ਵੱਧ ਤੋਂ ਵੱਧ ਉਤੇਜਨਾ ਦਰ ਨੂੰ ਪ੍ਰੇਰਿਤ ਕੀਤਾ। ਇਨ ਵਿਟਰੋ (ਚਿੱਤਰ 2d), e), ਜੋ ਕਿ t-hCO ਦੀਆਂ ਵੱਡੀਆਂ ਅਤੇ ਵਧੇਰੇ ਗੁੰਝਲਦਾਰ ਰੂਪ ਵਿਗਿਆਨਿਕ ਵਿਸ਼ੇਸ਼ਤਾਵਾਂ ਦੇ ਅਨੁਕੂਲ ਹੈ। ਇਸ ਤੋਂ ਇਲਾਵਾ, t-hCO ਨਿਊਰੋਨਸ (ਚਿੱਤਰ 2f) ਵਿੱਚ ਸਵੈ-ਚਾਲਤ ਉਤਸਾਹਿਤ ਪੋਸਟਸਿਨੈਪਟਿਕ ਮੌਜੂਦਾ ਘਟਨਾਵਾਂ (EPSC) ਦੀ ਬਾਰੰਬਾਰਤਾ ਕਾਫ਼ੀ ਜ਼ਿਆਦਾ ਸੀ, ਜੋ ਸੁਝਾਅ ਦਿੰਦੀ ਹੈ ਕਿ t-hCO ਨਿਊਰੋਨਸ ਵਿੱਚ ਦੇਖੇ ਗਏ ਡੈਂਡਰਟਿਕ ਰੀੜ੍ਹ ਦੀ ਵਧੀ ਹੋਈ ਘਣਤਾ ਕਾਰਜਸ਼ੀਲ ਉਤਸੁਕਤਾ ਨਾਲ ਜੁੜੀ ਹੋਈ ਸੀ। ਜਿਨਸੀ ਸਿੰਨੈਪਸ। ਅਸੀਂ ਲੇਬਲ ਕੀਤੇ ਗਲੂਟਾਮੈਟਰਜਿਕ ਨਿਊਰੋਨਸ (ਵਿਸਤ੍ਰਿਤ ਡੇਟਾ, ਚਿੱਤਰ 6a-c) ਨੂੰ ਰਿਕਾਰਡ ਕਰਕੇ ਵਿਟਰੋ ਵਿੱਚ hCO ਨਿਊਰੋਨਸ ਦੇ ਅਪਰਿਪਕ ਚਰਿੱਤਰ ਦੀ ਪੁਸ਼ਟੀ ਕੀਤੀ।
a, 8 ਮਹੀਨਿਆਂ ਦੇ ਵਿਭਿੰਨਤਾ ਤੋਂ ਬਾਅਦ ਬਾਇਓਸਾਈਟਿਨ ਨਾਲ ਭਰੇ hCO ਅਤੇ t-hCO ਨਿਊਰੋਨਸ ਦਾ 3D ਪੁਨਰ ਨਿਰਮਾਣ। b, ਰੂਪ ਵਿਗਿਆਨਿਕ ਵਿਸ਼ੇਸ਼ਤਾਵਾਂ ਦੀ ਮਾਤਰਾ (n = 8 hCO ਨਿਊਰੋਨਸ, n = 6 t-hCO ਨਿਊਰੋਨਸ; **P = 0.0084, *P = 0.0179 ਅਤੇ ***P < 0.0001)। b, ਰੂਪ ਵਿਗਿਆਨਿਕ ਵਿਸ਼ੇਸ਼ਤਾਵਾਂ ਦੀ ਮਾਤਰਾ (n = 8 hCO ਨਿਊਰੋਨਸ, n = 6 t-hCO ਨਿਊਰੋਨਸ; **P = 0.0084, *P = 0.0179 ਅਤੇ ***P < 0.0001)। б, количественная оценка морфологических признаков (n = 8 нейронов hCO, n = 6 нейронов t-hCO; ** P = 0,0084, * P = 0,0179, * P = 0,0179, *** 00179). b, ਰੂਪ ਵਿਗਿਆਨਿਕ ਵਿਸ਼ੇਸ਼ਤਾਵਾਂ ਦੀ ਮਾਤਰਾ (n=8 hCO ਨਿਊਰੋਨਸ, n=6 t-hCO ਨਿਊਰੋਨਸ; **P=0.0084, *P=0.0179, ਅਤੇ ***P<0.0001)। b，形态学特征的量化（n = 8 个hCO 神经元，n = 6 个t-hCO 神经元；**P = 0.0084，*P = 0.0179,*P = 0.0179 和*00179 b，形态学特征的量化（n = 8 个hCO 神经元，n = 6 个t-hCO 神经元；**P = 0.0084，*P = 0.0179,*P = 0.0179 和*00179 б, количественная оценка морфологических признаков (n = 8 нейронов hCO, n = 6 нейронов t-hCO; ** P = 0,0084, * P = 0,0179, * P = 0,0179, *** 00179). b, ਰੂਪ ਵਿਗਿਆਨਿਕ ਵਿਸ਼ੇਸ਼ਤਾਵਾਂ ਦੀ ਮਾਤਰਾ (n=8 hCO ਨਿਊਰੋਨਸ, n=6 t-hCO ਨਿਊਰੋਨਸ; **P=0.0084, *P=0.0179, ਅਤੇ ***P<0.0001)।c, 8 ਮਹੀਨਿਆਂ ਦੇ ਵਿਭਿੰਨਤਾ ਤੋਂ ਬਾਅਦ hCO ਅਤੇ t-hCO ਡੈਂਡਰਟਿਕ ਸ਼ਾਖਾਵਾਂ ਦਾ 3D ਪੁਨਰ ਨਿਰਮਾਣ। ਲਾਲ ਤਾਰੇ ਪੁਟੇਟਿਵ ਡੈਂਡਰਟਿਕ ਰੀੜ੍ਹ ਦੀ ਹੱਡੀ ਨੂੰ ਦਰਸਾਉਂਦੇ ਹਨ। ਡੈਂਡਰਟਿਕ ਰੀੜ੍ਹ ਦੀ ਘਣਤਾ ਮਾਤਰਾ (n = 8 hCO ਨਿਊਰੋਨਸ, n = 6 t-hCO ਨਿਊਰੋਨਸ; **P = 0.0092)। d, ਆਰਾਮ ਕਰਨ ਵਾਲੀ ਝਿੱਲੀ ਸੰਭਾਵੀ ਦੀ ਮਾਤਰਾ (n = 25 hCO ਨਿਊਰੋਨਸ, n = 16 t-hCO ਨਿਊਰੋਨਸ; ***P < 0.0001)। d, ਆਰਾਮ ਕਰਨ ਵਾਲੀ ਝਿੱਲੀ ਸੰਭਾਵੀ ਦੀ ਮਾਤਰਾ (n = 25 hCO ਨਿਊਰੋਨਸ, n = 16 t-hCO ਨਿਊਰੋਨਸ; ***P < 0.0001)। d, количественная оценка мембранного потенциала покоя (n = 25 нейронов hCO, n = 16 нейронов t-hCO; *** P <0,0001). d, ਆਰਾਮ ਕਰਨ ਵਾਲੀ ਝਿੱਲੀ ਸੰਭਾਵੀ ਮਾਤਰਾ (n = 25 hCO ਨਿਊਰੋਨਸ, n = 16 t-hCO ਨਿਊਰੋਨਸ; ***P < 0.0001)। d，静息膜电位的量化（n = 25 hCO 神经元，n = 16 t-hCO 神经元；**P <0.0001）. d，静息膜电位的量化（n = 25 hCO 神经元，n = 16 t-hCO 神经元；**P <0.0001）. d, количественная оценка мембранного потенциала покоя (n = 25 нейронов hCO, n = 16 нейронов t-hCO; *** P <0,0001). d, ਆਰਾਮ ਕਰਨ ਵਾਲੀ ਝਿੱਲੀ ਸੰਭਾਵੀ ਮਾਤਰਾ (n = 25 hCO ਨਿਊਰੋਨਸ, n = 16 t-hCO ਨਿਊਰੋਨਸ; ***P < 0.0001)। e, hCO ਅਤੇ t-hCO ਵਿੱਚ ਦੁਹਰਾਉਣ ਵਾਲੀ ਐਕਸ਼ਨ ਪੋਟੈਂਸ਼ੀਅਲ ਫਾਇਰਿੰਗ, ਜੋ ਕਿ ਮੌਜੂਦਾ ਟੀਕਿਆਂ ਨੂੰ ਵਧਾ ਕੇ ਪ੍ਰੇਰਿਤ ਕੀਤੀ ਗਈ ਹੈ, ਅਤੇ ਵੱਧ ਤੋਂ ਵੱਧ ਫਾਇਰਿੰਗ ਦਰ ਦੀ ਮਾਤਰਾ (n = 25 hCO ਨਿਊਰੋਨਸ, n = 16 t-hCO ਨਿਊਰੋਨਸ; ***P < 0.0001)। e, hCO ਅਤੇ t-hCO ਵਿੱਚ ਦੁਹਰਾਉਣ ਵਾਲੀ ਐਕਸ਼ਨ ਪੋਟੈਂਸ਼ੀਅਲ ਫਾਇਰਿੰਗ, ਜੋ ਕਿ ਮੌਜੂਦਾ ਟੀਕਿਆਂ ਨੂੰ ਵਧਾ ਕੇ ਪ੍ਰੇਰਿਤ ਕੀਤੀ ਗਈ ਹੈ, ਅਤੇ ਵੱਧ ਤੋਂ ਵੱਧ ਫਾਇਰਿੰਗ ਦਰ ਦੀ ਮਾਤਰਾ (n = 25 hCO ਨਿਊਰੋਨਸ, n = 16 t-hCO ਨਿਊਰੋਨਸ; ***P < 0.0001)। e, повторное возбуждение потенциала действия в hCO и t-hCO, вызванное увеличением тока, и количественная оценка максиала действия максиала. возбуждения (n = 25 нейронов hCO, n = 16 нейронов t-hCO; *** ਪੀ <0,0001)। e, hCO ਅਤੇ t-hCO ਵਿੱਚ ਕਿਰਿਆ ਸੰਭਾਵੀ ਮੁੜ-ਫਾਇਰਿੰਗ, ਮੌਜੂਦਾ ਵਾਧੇ ਅਤੇ ਵੱਧ ਤੋਂ ਵੱਧ ਫਾਇਰਿੰਗ ਦਰ ਦੀ ਮਾਤਰਾ ਦੁਆਰਾ ਪ੍ਰੇਰਿਤ (n = 25 hCO ਨਿਊਰੋਨਸ, n = 16 t-hCO ਨਿਊਰੋਨਸ; *** P < 0.0001)। e，通过增加电流注入诱导的hCO 和t-hCO 重复动作电位放电，以及最大放甾率的釀大放电率的釀大放电率的鏪2h5神经元，n = 16 个t-hCO 神经元；*P <0.0001）। ਈ, 通过 增加 电流 注入 的 的 hco 和 t-hco 重复 电位 放电 ， 以及 最 大 的 量 （2 hco 5 ， n = 16 个 t-hco 神经 ； *** p <0.0001） . e, повторяющееся возбуждение потенциала действия hCO и t-hCO, вызванное увеличением подачи тока, и количественкаициальная количественкаиная. скорости возбуждения (n = 25 нейронов hCO, n = 16 нейронов t-hCO; *** ਪੀ <0,0001)। e, ਵਧੀ ਹੋਈ ਮੌਜੂਦਾ ਸਪਲਾਈ ਅਤੇ ਵੱਧ ਤੋਂ ਵੱਧ ਫਾਇਰਿੰਗ ਦਰ ਦੀ ਮਾਤਰਾ (n = 25 hCO ਨਿਊਰੋਨਸ, n = 16 t-hCO ਨਿਊਰੋਨਸ; *** P < 0.0001) ਦੁਆਰਾ ਪ੍ਰੇਰਿਤ hCO ਅਤੇ t-hCO ਐਕਸ਼ਨ ਪੋਟੈਂਸ਼ਲ ਦੀ ਦੁਹਰਾਉਣ ਵਾਲੀ ਫਾਇਰਿੰਗ। f, 8 ਮਹੀਨਿਆਂ ਦੇ ਵਿਭਿੰਨਤਾ 'ਤੇ hCO ਅਤੇ t-hCO ਨਿਊਰੋਨਸ ਵਿੱਚ ਸਵੈਚਾਲਿਤ EPSCs (sEPSCs), ਅਤੇ ਸਿਨੈਪਟਿਕ ਘਟਨਾਵਾਂ ਦੀ ਬਾਰੰਬਾਰਤਾ ਦੀ ਮਾਤਰਾ (n = 25 hCO ਨਿਊਰੋਨਸ, n = 17 t-hCO ਨਿਊਰੋਨਸ; ***P < 0.0001)। f, 8 ਮਹੀਨਿਆਂ ਦੇ ਵਿਭਿੰਨਤਾ 'ਤੇ hCO ਅਤੇ t-hCO ਨਿਊਰੋਨਸ ਵਿੱਚ ਸਵੈਚਾਲਿਤ EPSCs (sEPSCs), ਅਤੇ ਸਿਨੈਪਟਿਕ ਘਟਨਾਵਾਂ ਦੀ ਬਾਰੰਬਾਰਤਾ ਦੀ ਮਾਤਰਾ (n = 25 hCO ਨਿਊਰੋਨਸ, n = 17 t-hCO ਨਿਊਰੋਨਸ; ***P < 0.0001)। f, спонтанные EPSC (sEPSC) в нейронах hCO и t-hCO через 8 месяцев дифференцировки и количественная оценка = частоты сипыткинка = сипыхи. нейронов hCO, n = 17 нейронов t-hCO *** P <0,0001)। f, 8 ਮਹੀਨਿਆਂ ਦੇ ਵਿਭਿੰਨਤਾ ਅਤੇ ਸਿਨੈਪਟਿਕ ਘਟਨਾ ਦਰਾਂ ਦੀ ਮਾਤਰਾ ਨਿਰਧਾਰਤ ਕਰਨ 'ਤੇ hCO ਅਤੇ t-hCO ਨਿਊਰੋਨਸ ਵਿੱਚ ਸਵੈਚਾਲਿਤ EPSCs (sEPSCs) (n=25 hCO ਨਿਊਰੋਨਸ, n=17 t-hCO ਨਿਊਰੋਨਸ; ***P<0.0001)। f，分化8 个月时hCO 和t-hCO 神经元中的自发性EPSCs (sEPSCs)，以及突触事件频率的量化（烞烞n2hCO = 17 t-hCO 神经元；**P <0.0001） . f，分化8 个月时hCO 和t-hCO 神经元中的自发性EPSCs (sEPSCs),以及突触事件频率的量匼（n=CO神率的量匼（n = 25 hCO 神率的量匼（n = 25hCO P <0.0001）। f, спонтанные EPSC (sEPSC) в нейронах hCO и t-hCO через 8 месяцев дифференцировки и количественная оценка = частоты сипыткинка = сипыхи. нейронов hCO, n = 17 нейронов t-hCO *** ਪੀ <0,0001). f, ਸਿਨੈਪਟਿਕ ਘਟਨਾ ਦਰਾਂ ਦੇ ਵਿਭਿੰਨਤਾ ਅਤੇ ਮਾਤਰਾ ਦੇ 8 ਮਹੀਨਿਆਂ 'ਤੇ hCO ਅਤੇ t-hCO ਨਿਊਰੋਨਸ ਵਿੱਚ ਸਵੈਚਾਲਿਤ EPSCs (sEPSCs) (n = 25 hCO ਨਿਊਰੋਨਸ, n = 17 t-hCO ਨਿਊਰੋਨਸ; *** P<0.0001)।bf ਲਈ, ਲਾਈਨ 1208-2 ਵਿੱਚ hCO ਅਤੇ t-hCO ਸਮਾਨਾਂਤਰ ਵਿੱਚ ਰੱਖੇ ਗਏ ਇੱਕੋ ਵਿਭਿੰਨਤਾ ਬੈਚ ਤੋਂ ਲਏ ਗਏ ਸਨ। g, ਜੀਨ ਸੈੱਟ ਸੰਸ਼ੋਧਨ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ (ਇੱਕ-ਪਾਸੜ ਫਿਸ਼ਰ ਦਾ ਸਹੀ ਟੈਸਟ) t-hCO ਵਿੱਚ ਜੀਨਾਂ ਦਾ ਮਹੱਤਵਪੂਰਨ ਤੌਰ 'ਤੇ ਅਪਰੇਗੂਲੇਟ ਕੀਤਾ ਗਿਆ (ਐਡਜਸਟ ਕੀਤਾ ਗਿਆ P < 0.05, ਫੋਲਡ ਬਦਲਾਅ > 2, ਨਿਊਕਲੀਅਸ ਦੇ ਘੱਟੋ-ਘੱਟ 10% ਵਿੱਚ ਦਰਸਾਇਆ ਗਿਆ) hCO ਦੇ ਮੁਕਾਬਲੇ ਗਲੂਟਾਮੈਟਰਜਿਕ ਨਿਊਰੋਨਸ ਇੱਕ ਇਨ ਵਿਵੋ ਮਾਊਸ ਅਧਿਐਨ 16 ਅਤੇ ਇਨ ਵਿਟਰੋ ਨਿਊਰੋਨਸ 17 ਤੋਂ ਮਨੁੱਖੀ-ਵਿਸ਼ੇਸ਼ LRGs ਦੀ ਪਛਾਣ ਕੀਤੇ ਗਏ ਸ਼ੁਰੂਆਤੀ-ਪ੍ਰਤੀਕਿਰਿਆ (ERG) ਅਤੇ ਦੇਰ-ਪ੍ਰਤੀਕਿਰਿਆ (LRG) ਗਤੀਵਿਧੀ-ਨਿਰਭਰ ਜੀਨਾਂ ਦੇ ਜੀਨ ਸੈੱਟਾਂ ਦੇ ਨਾਲ। g, ਜੀਨ ਸੈੱਟ ਸੰਸ਼ੋਧਨ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ (ਇੱਕ-ਪਾਸੜ ਫਿਸ਼ਰ ਦਾ ਸਹੀ ਟੈਸਟ) t-hCO ਵਿੱਚ ਜੀਨਾਂ ਦਾ ਮਹੱਤਵਪੂਰਨ ਤੌਰ 'ਤੇ ਅਪਰੇਗੂਲੇਟ ਕੀਤਾ ਗਿਆ (ਐਡਜਸਟ ਕੀਤਾ ਗਿਆ P < 0.05, ਫੋਲਡ ਬਦਲਾਅ > 2, ਨਿਊਕਲੀਅਸ ਦੇ ਘੱਟੋ-ਘੱਟ 10% ਵਿੱਚ ਦਰਸਾਇਆ ਗਿਆ) hCO ਦੇ ਮੁਕਾਬਲੇ ਗਲੂਟਾਮੈਟਰਜਿਕ ਨਿਊਰੋਨਸ ਇੱਕ ਇਨ ਵਿਵੋ ਮਾਊਸ ਅਧਿਐਨ 16 ਅਤੇ ਇਨ ਵਿਟਰੋ ਨਿਊਰੋਨਸ 17 ਤੋਂ ਮਨੁੱਖੀ-ਵਿਸ਼ੇਸ਼ LRGs ਦੀ ਪਛਾਣ ਕੀਤੇ ਗਏ ਸ਼ੁਰੂਆਤੀ-ਪ੍ਰਤੀਕਿਰਿਆ (ERG) ਅਤੇ ਦੇਰ-ਪ੍ਰਤੀਕਿਰਿਆ (LRG) ਗਤੀਵਿਧੀ-ਨਿਰਭਰ ਜੀਨਾਂ ਦੇ ਜੀਨ ਸੈੱਟਾਂ ਦੇ ਨਾਲ। g, анализ обогащения набора генов (односторонний точный критерий Фишера) генов со значительной активацией (скорректирован, скорректирован, 5 изменения > 2, экспрессия по меньшей мере в 10% ядер) в глутаматергических нейронах t-hCO по сравнению с глутаматергических по сравнению с глутамению hCO наборы генов как раннего (ERG), так и позднего (LRG) генов, зависящих от активности, идентифицированных в исследованных в исследовании на мышипчицихах, in для человека LRG из нейронов in vitro17. g, t-hCO ਵਿੱਚ ਮਹੱਤਵਪੂਰਨ ਸਰਗਰਮੀ (ਐਡਜਸਟਡ P<0.05, ਫੋਲਡ ਬਦਲਾਅ >2, ਨਿਊਕਲੀਅਸ ਦੇ ਘੱਟੋ-ਘੱਟ 10% ਵਿੱਚ ਪ੍ਰਗਟਾਵੇ) ਵਾਲੇ ਜੀਨਾਂ ਦੇ ਜੀਨ ਸੈੱਟ ਸੰਸ਼ੋਧਨ (ਇੱਕ-ਪੂਛ ਵਾਲਾ ਫਿਸ਼ਰ ਦਾ ਸਹੀ ਟੈਸਟ) ਦਾ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ hCO ਦੇ ਮੁਕਾਬਲੇ ਗਲੂਟਾਮੈਟਰਜਿਕ ਨਿਊਰੋਨਸ ਸ਼ੁਰੂਆਤੀ (ERG) ਅਤੇ ਦੇਰ (LRG) ਗਤੀਵਿਧੀ-ਨਿਰਭਰ ਜੀਨਾਂ ਦੇ ਸੈੱਟ ਇਨ ਵਿਟ੍ਰੋ ਚੂਹੇ16 ਅਤੇ ਇਨ ਵਿਟਰੋ17 ਵਿੱਚ ਨਿਊਰੋਨਸ ਤੋਂ ਮਨੁੱਖੀ-ਵਿਸ਼ੇਸ਼ LRGs। g,t-hCO谷氨酸能神经元与hCO谷氨酸能神经元相比,t -hCO谷氨酸能神经元显着上调（调整后P<0.05,倍数变化>2，在至少10%的细胞核中表达）的基因集富集分析（单侧F isher精确检验）从体内小鼠研究中鉴定的早期反应(ERG)和晚期反应(LRG) 活性依赖性基因的基因组16 和体外神经元17 中的人类特异性性 g ， t-hco 谷氨酸 神经 元 与 hco 谷氨酸 神经 元 相比 ， t-hco 谷氨酸 神经 元谨酸 神经 元谨酸 神经 元谈弈有 5 2 ， 至少 至少 10%的 细胞 核中 表达） 的 集富集 分析 （单侧 ਫਿਸ਼ਰ 精确）叉台集研究 中 的 早期 反应 反应 反应 和 晚期 反应 反应 (lrg) 活性 基因 基因组 基因组 16 和烞煞17 中 中 17 中 17 人类特异性LRG. g, глутаматергические нейроны t-hCO были значительно активизированы по сравнению с глутаматергическими нейронами hCO P<0,05, кратность изменения> 2, не менее 10% ਅਨਾਲੀਜ਼ обогащения набора генов (односторонний точный тест Фишера) ранотигера позднего гены, зависящие от активности ответа (LRG), идентифицированные в исследованиях на мышах in vivo16 ਅਤੇ нейронах in vitro17. LRG, специфичные для человека. g, t-hCO ਗਲੂਟਾਮੈਟਰਜਿਕ ਨਿਊਰੋਨਸ hCO ਦੇ ਮੁਕਾਬਲੇ ਕਾਫ਼ੀ ਜ਼ਿਆਦਾ ਅੱਪਰੇਗੂਲੇਟ ਕੀਤੇ ਗਏ ਸਨ ਗਲੂਟਾਮੈਟਰਜਿਕ ਨਿਊਰੋਨਸ (ਐਡਜਸਟਡ P<0.05, ਫੋਲਡ ਬਦਲਾਅ >2, ਘੱਟੋ-ਘੱਟ 10% ਸ਼ੁਰੂਆਤੀ ਪ੍ਰਤੀਕਿਰਿਆ (ERG) ਅਤੇ ਦੇਰ ਨਾਲ ਪ੍ਰਤੀਕਿਰਿਆ ਜੀਨ ਸੰਸ਼ੋਧਨ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ (ਇੱਕ-ਪੂਛ ਵਾਲਾ ਫਿਸ਼ਰ ਦਾ ਸਹੀ ਟੈਸਟ) ਪ੍ਰਤੀਕਿਰਿਆ ਗਤੀਵਿਧੀ ਨਿਰਭਰ ਜੀਨ (LRGs) ਇਨ ਵਿਵੋ ਮਾਊਸ16 ਅਤੇ ਇਨ ਵਿਟਰੋ ਨਿਊਰੋਨਸ ਵਿੱਚ ਪਛਾਣੇ ਗਏ।17 ਮਨੁੱਖੀ ਵਿਸ਼ੇਸ਼ LRGs।ਬਿੰਦੀਦਾਰ ਲਾਈਨ 0.05.h ਦੇ ਬੋਨਫੈਰੋਨੀ-ਸੁਧਾਰੇ ਗਏ P ਮੁੱਲ ਨੂੰ ਦਰਸਾਉਂਦੀ ਹੈ, T-hCO ਗਲੂਟਾਮੈਟਰਜਿਕ ਨਿਊਰੋਨਸ ਵਿੱਚ LRG ਜੀਨਾਂ ਦੇ snRNA-seq ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਤੀਆਂ ਵਿੱਚ GluN ਜੀਨ ਪ੍ਰਗਟਾਵੇ (ਹਰੇਕ ਜੀਨ ਦਾ ਸੂਡੋ-ਪੈਕੇਜ ਅਤੇ ਸਕੇਲਿੰਗ) ਨੂੰ ਮਹੱਤਵਪੂਰਨ ਤੌਰ 'ਤੇ ਅਪਰੇਗੂਲੇਟ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ। i, ਇਮਯੂਨੋਸਟੇਨਿੰਗ t-hCO (ਉੱਪਰਲੇ) ਅਤੇ hCO (ਹੇਠਲੇ) ਨਿਊਰੋਨਸ ਵਿੱਚ SCG2 ਪ੍ਰਗਟਾਵੇ ਨੂੰ ਦਰਸਾਉਂਦੀ ਹੈ। ਚਿੱਟੇ ਤੀਰ SCG2+ ਸੈੱਲਾਂ ਵੱਲ ਇਸ਼ਾਰਾ ਕਰਦੇ ਹਨ। ਸਕੇਲ ਬਾਰ, 25 µm। ਡੇਟਾ ਨੂੰ ਔਸਤ ± ਮਿਆਰੀ ਭਟਕਣ ਵਜੋਂ ਦਰਸਾਇਆ ਗਿਆ ਹੈ।
ਐਕਸ ਵੀਵੋ ਟੁਕੜਿਆਂ ਵਿੱਚ ਦੇਖੇ ਗਏ t-hCO ਦੀ ਵਧੀ ਹੋਈ ਗਤੀਵਿਧੀ ਦੇ ਆਧਾਰ 'ਤੇ, snRNA-seq ਨੇ hCO ਇਨ ਵਿਟਰੋ ਦੇ ਮੁਕਾਬਲੇ t-hCO ਵਿੱਚ ਜੀਨ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਟਾਂ ਦੀ ਇੱਕ ਗਤੀਵਿਧੀ-ਨਿਰਭਰ ਅਪਰੇਗੂਲੇਸ਼ਨ ਦਾ ਖੁਲਾਸਾ ਕੀਤਾ। ਗਲੂਟਾਮੈਟਰਜਿਕ t-hCO ਨਿਊਰੋਨਸ ਨੇ ਦੇਰ ਨਾਲ ਪ੍ਰਤੀਕਿਰਿਆ ਗਤੀਵਿਧੀ ਨੂੰ ਨਿਯੰਤ੍ਰਿਤ ਕਰਨ ਵਾਲੇ ਜੀਨਾਂ ਦੇ ਉੱਚ ਪੱਧਰ (ਚਿੱਤਰ 2g,h) ਨੂੰ ਪ੍ਰਗਟ ਕੀਤਾ, ਜੋ ਕਿ ਮਾਊਸ ਅਤੇ ਮਨੁੱਖੀ ਨਿਊਰੋਨਸ16,17 ਵਿੱਚ ਪਿਛਲੇ ਅਧਿਐਨਾਂ ਵਿੱਚ ਪਾਏ ਗਏ ਸਨ। ਉਦਾਹਰਨ ਲਈ, BDNF18, SCG2, ਅਤੇ OSTN, ਇੱਕ ਪ੍ਰਾਈਮੇਟ-ਵਿਸ਼ੇਸ਼ ਗਤੀਵਿਧੀ-ਨਿਯੰਤ੍ਰਿਤ ਜੀਨ, ਨੇ hCO ਨਿਊਰੋਨਸ (ਚਿੱਤਰ 2g-i) ਦੇ ਮੁਕਾਬਲੇ t-hCO ਨਿਊਰੋਨਸ ਵਿੱਚ ਵਧੀ ਹੋਈ ਪ੍ਰਗਟਾਵੇ ਦਿਖਾਈ। ਇਸ ਤਰ੍ਹਾਂ, t-hCO ਨਿਊਰੋਨਸ ਨੇ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਸ਼ਨਲ, ਰੂਪ ਵਿਗਿਆਨਿਕ, ਅਤੇ ਕਾਰਜਸ਼ੀਲ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣਾਂ ਦੁਆਰਾ hCO ਨਿਊਰੋਨਸ ਦੇ ਮੁਕਾਬਲੇ ਵਧੀਆਂ ਪਰਿਪੱਕਤਾ ਵਿਸ਼ੇਸ਼ਤਾਵਾਂ ਦਾ ਪ੍ਰਦਰਸ਼ਨ ਕੀਤਾ।
ਮਨੁੱਖੀ ਦਿਮਾਗ ਦੇ ਵਿਕਾਸ ਨਾਲ t-hCO ਪਰਿਪੱਕਤਾ ਦੇ ਸਬੰਧ ਦਾ ਹੋਰ ਮੁਲਾਂਕਣ ਕਰਨ ਲਈ, ਅਸੀਂ ਗਰੱਭਸਥ ਸ਼ੀਸ਼ੂ ਅਤੇ ਬਾਲਗ ਕੋਰਟੀਕਲ ਸੈੱਲ ਕਿਸਮਾਂ 19,20 ਅਤੇ ਬਾਲਗ21,22 ਦੀ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਟੋਮਿਕ ਤੁਲਨਾ ਕੀਤੀ ਅਤੇ ਨਾਲ ਹੀ ਵਿਕਾਸ ਦੌਰਾਨ ਕੋਰਟੀਕਲ ਜੀਨ ਪ੍ਰਗਟਾਵੇ23 'ਤੇ ਵਿਆਪਕ ਡੇਟਾ (ਵਿਸਤ੍ਰਿਤ ਡੇਟਾ, ਚਿੱਤਰ 5)। ਪਿਛਲੇ ਕੰਮ 24 ਦੇ ਨਾਲ, 7-8 ਮਹੀਨਿਆਂ ਦੇ ਵਿਭਿੰਨਤਾ 'ਤੇ ਗਲੋਬਲ hCO ਅਤੇ t-hCO ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਟੋਮ ਪਰਿਪੱਕਤਾ ਸਥਿਤੀ ਵਿਆਪਕ ਤੌਰ 'ਤੇ ਇਨ ਵਿਵੋ ਵਿਕਾਸ ਸਮੇਂ ਦੇ ਨਾਲ ਇਕਸਾਰ ਹੈ ਅਤੇ ਦੇਰ ਨਾਲ ਭਰੂਣ ਜੀਵਨ ਦੇ ਬਰਾਬਰ ਹੈ (ਵਿਸਤ੍ਰਿਤ ਡੇਟਾ ਚਿੱਤਰ 5a)। ਖਾਸ ਤੌਰ 'ਤੇ, ਅਸੀਂ ਉਮਰ-ਮੇਲ ਖਾਂਦੇ hCO ਦੇ ਮੁਕਾਬਲੇ t-hCO ਵਿੱਚ ਵਧੀ ਹੋਈ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਟੋਮ ਪਰਿਪੱਕਤਾ ਦੇਖੀ, ਨਾਲ ਹੀ ਸਿਨੈਪਟੋਜੇਨੇਸਿਸ, ਐਸਟ੍ਰੋਜੇਨੇਸਿਸ, ਅਤੇ ਮਾਈਲੀਨੇਸ਼ਨ ਨਾਲ ਸੰਬੰਧਿਤ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਟੋਮ ਐਕਟੀਵੇਸ਼ਨ (ਵਿਸਤ੍ਰਿਤ ਡੇਟਾ, ਚਿੱਤਰ 5b-d)। ਸੈਲੂਲਰ ਪੱਧਰ 'ਤੇ, ਸਾਨੂੰ t-hCO ਵਿੱਚ ਇੱਕ ਪਤਲੇ ਕਾਰਟੈਕਸ ਉਪ-ਕਿਸਮ ਦੇ ਸਬੂਤ ਮਿਲੇ, ਜਿਸ ਵਿੱਚ ਗਲੂਟਾਮੈਟਰਜਿਕ ਨਿਊਰੋਨ ਦੇ ਸਮੂਹ ਬਾਲਗ L2/3, L5, ਅਤੇ L6 ਨਿਊਰੋਨ ਉਪ-ਕਿਸਮਾਂ (ਚਿੱਤਰ 1i) ਨਾਲ ਓਵਰਲੈਪ ਹੋ ਰਹੇ ਹਨ। ਇਸ ਦੇ ਉਲਟ, ਗਰਭ ਅਵਸਥਾ ਦੇ ਮੱਧ ਵਿੱਚ ਗਲੂਟਾਮੈਟਰਜਿਕ t-hCO ਨਿਊਰੋਨਸ ਅਤੇ ਭਰੂਣ ਦੇ ਕੋਰਟੀਕਲ ਨਿਊਰੋਨਸ ਵਿਚਕਾਰ ਕਲੱਸਟਰ ਓਵਰਲੈਪ ਵਧੇਰੇ ਸੀਮਤ ਸੀ (ਵਿਸਤ੍ਰਿਤ ਡੇਟਾ, ਚਿੱਤਰ 5e-j)। ਇਹ ਨਿਰਧਾਰਤ ਕਰਨ ਲਈ ਕਿ ਕੀ t-hCO ਨਿਊਰੋਨਸ ਮਨੁੱਖੀ ਜਨਮ ਤੋਂ ਬਾਅਦ ਦੇ ਨਿਓਕਾਰਟੀਕਲ ਨਿਊਰੋਨਸ ਦੇ ਸਮਾਨ ਹਨ, ਅਸੀਂ ਮਨੁੱਖੀ ਜਨਮ ਤੋਂ ਬਾਅਦ ਦੇ ਕਾਰਟੈਕਸ ਦੇ ਤਿੱਖੇ ਭਾਗਾਂ ਵਿੱਚ ਮਨੁੱਖੀ L2/3 ਪਿਰਾਮਿਡਲ ਨਿਊਰੋਨਸ ਦੇ ਇਲੈਕਟ੍ਰੋਫਿਜ਼ੀਓਲੋਜੀਕਲ ਰਿਕਾਰਡਿੰਗ ਅਤੇ ਸਰੀਰਿਕ ਪੁਨਰ ਨਿਰਮਾਣ ਕੀਤੇ (ਵਿਸਤ੍ਰਿਤ ਡੇਟਾ, ਚਿੱਤਰ 7a)। L2/3 ਪਿਰਾਮਿਡਲ ਨਿਊਰੋਨਸ ਦੇ ਇਲੈਕਟ੍ਰੋਫਿਜ਼ੀਓਲੋਜੀਕਲ ਗੁਣ t-hCO ਪਿਰਾਮਿਡਲ ਨਿਊਰੋਨਸ ਦੇ ਸਮਾਨ ਸਨ (ਵਿਸਤ੍ਰਿਤ ਡੇਟਾ, ਚਿੱਤਰ 7e)। ਰੂਪ ਵਿਗਿਆਨਿਕ ਤੌਰ 'ਤੇ, ਜਨਮ ਤੋਂ ਬਾਅਦ ਦੇ ਮਨੁੱਖੀ ਨਮੂਨਿਆਂ ਤੋਂ L2/3 ਨਿਊਰੋਨਸ hCO ਨਾਲੋਂ t-hCO ਦੇ ਸਮਾਨ ਸਨ, ਹਾਲਾਂਕਿ L2/3 ਸੈੱਲ ਲੰਬੇ ਸਨ, ਕੁੱਲ ਮਿਲਾ ਕੇ ਵਧੇਰੇ ਸ਼ਾਖਾਵਾਂ ਸਨ, ਅਤੇ ਰੀੜ੍ਹ ਦੀ ਘਣਤਾ ਵਧੇਰੇ ਸੀ (ਚਿੱਤਰ 3g ਅਤੇ ਵਿਸਤ੍ਰਿਤ ਡੇਟਾ, ਚਿੱਤਰ 7b-)। G)।
a, ਕੰਟਰੋਲ ਅਤੇ TS hiPS ਸੈੱਲ ਲਾਈਨਾਂ ਦੁਆਰਾ ਪੈਦਾ ਕੀਤੇ hCO ਦਾ ਨਵਜੰਮੇ ਚੂਹਿਆਂ ਵਿੱਚ ਟ੍ਰਾਂਸਪਲਾਂਟੇਸ਼ਨ। b, 8 ਮਹੀਨਿਆਂ ਦੇ ਵਿਭਿੰਨਤਾ ਤੋਂ ਬਾਅਦ ਬਾਇਓਸਾਈਟਿਨ ਨਾਲ ਭਰੇ t-hCO ਨਿਊਰੋਨਸ ਦਾ 3D ਪੁਨਰ ਨਿਰਮਾਣ। c, ਔਸਤ ਡੈਂਡਰਟਿਕ ਲੰਬਾਈ ਦੀ ਮਾਤਰਾ (n = 19 ਕੰਟਰੋਲ ਨਿਊਰੋਨਸ, n = 21 TS ਨਿਊਰੋਨਸ; **P = 0.0041)। d, 8 ਮਹੀਨਿਆਂ ਦੇ ਵਿਭਿੰਨਤਾ 'ਤੇ ਨਿਯੰਤਰਣ ਅਤੇ TS t-hCO ਤੋਂ 3D-ਮੁੜ-ਨਿਰਮਿਤ ਡੈਂਡਰਟਿਕ ਸ਼ਾਖਾਵਾਂ, ਅਤੇ ਡੈਂਡਰਟਿਕ ਰੀੜ੍ਹ ਦੀ ਘਣਤਾ ਦੀ ਮਾਤਰਾ (n = 16 ਨਿਯੰਤਰਣ ਨਿਊਰੋਨਸ, n = 21 TS ਨਿਊਰੋਨਸ, ***P < 0.0001)। d, 8 ਮਹੀਨਿਆਂ ਦੇ ਵਿਭਿੰਨਤਾ 'ਤੇ ਨਿਯੰਤਰਣ ਅਤੇ TS t-hCO ਤੋਂ 3D-ਮੁੜ-ਨਿਰਮਿਤ ਡੈਂਡਰਟਿਕ ਸ਼ਾਖਾਵਾਂ, ਅਤੇ ਡੈਂਡਰਟਿਕ ਰੀੜ੍ਹ ਦੀ ਘਣਤਾ ਦੀ ਮਾਤਰਾ (n = 16 ਨਿਯੰਤਰਣ ਨਿਊਰੋਨਸ, n = 21 TS ਨਿਊਰੋਨਸ, ***P < 0.0001)। d, 3D-реконструкция дендритных ветвей из контроля и TS t-hCO через 8 месяцев дифференцировки и количественкая оцидритнхенка оцидритнхественка. шипов (n = 16 контрольных нейронов, n = 21 TS нейронов, *** P <0,0001). d, 8 ਮਹੀਨਿਆਂ ਦੇ ਵਿਭਿੰਨਤਾ ਅਤੇ ਡੈਂਡਰਟਿਕ ਰੀੜ੍ਹ ਦੀ ਘਣਤਾ ਮਾਤਰਾ (n=16 ਨਿਯੰਤਰਣ ਨਿਊਰੋਨਸ, n=21 TS ਨਿਊਰੋਨਸ, ***P<0.0001) 'ਤੇ ਨਿਯੰਤਰਣ ਅਤੇ t-hCO TS ਤੋਂ ਡੈਂਡਰਟਿਕ ਸ਼ਾਖਾਵਾਂ ਦਾ 3D ਪੁਨਰ ਨਿਰਮਾਣ। d，分化8 个月时对照和TS t-hCO 的3D 重建树突分支，以及树突棘密度的量化（n = 16个煥烦的量化（n = 16 个煥21 个TS 神经元, ***P <0.0001）। d ， 分化 8 个 时 对照 和 ts t-hco 的 3d 重建 分支 分支 以及 树突棘 密度 量化 6 个突棘 密度 量化11元 ， n = 21 个 ts 神经 ， *** p < 0.0001 ）. d, 3D-реконструкция дендритных ветвей контроля и TS t-hCO через 8 месяцев дифференцировки и количественная оцентвей контроля шипов (n = 16 контрольных нейронов, n = 21 TS нейронов, *** P <0,0001). d, 8 ਮਹੀਨਿਆਂ ਦੇ ਵਿਭਿੰਨਤਾ ਅਤੇ ਡੈਂਡਰਟਿਕ ਰੀੜ੍ਹ ਦੀ ਘਣਤਾ ਮਾਤਰਾ (n=16 ਨਿਯੰਤਰਣ ਨਿਊਰੋਨਸ, n=21 TS ਨਿਊਰੋਨਸ, ***P<0.0001) 'ਤੇ ਕੰਟਰੋਲ ਡੈਂਡਰਟਿਕ ਸ਼ਾਖਾਵਾਂ ਅਤੇ TS t-hCO3 ਦਾ 3D ਪੁਨਰ ਨਿਰਮਾਣ।ਲਾਲ ਤਾਰੇ ਪੁਟੇਟਿਵ ਡੈਂਡਰੈਟਿਕ ਰੀੜ੍ਹ ਦੀ ਹੱਡੀ ਨੂੰ ਦਰਸਾਉਂਦੇ ਹਨ। e, 8 ਮਹੀਨਿਆਂ ਦੇ ਵਿਭਿੰਨਤਾ ਤੋਂ ਬਾਅਦ ਨਿਯੰਤਰਣ ਵਿੱਚ ਸਵੈ-ਚਾਲਿਤ EPSCs ਅਤੇ TS t-hCO ਨਿਊਰੋਨਸ। f, ਸੰਚਤ ਬਾਰੰਬਾਰਤਾ ਪਲਾਟ ਅਤੇ ਸਿਨੈਪਟਿਕ ਘਟਨਾਵਾਂ ਦੀ ਬਾਰੰਬਾਰਤਾ ਅਤੇ ਐਪਲੀਟਿਊਡ ਦੀ ਮਾਤਰਾ (n=32 ਕੰਟਰੋਲ ਨਿਊਰੋਨਸ, n=26 TS ਨਿਊਰੋਨਸ; **P=0.0076 ਅਤੇ P=0.8102)। g, hCO ਅਤੇ t-hCO ਵਿੱਚ TS ਅਤੇ ਕੰਟਰੋਲ ਨਿਊਰੋਨਸ ਦਾ ਸਕੋਲ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ। ਡੈਸ਼ਡ ਲਾਈਨਾਂ ਤੁਲਨਾ ਲਈ ਮਨੁੱਖੀ L2/3 ਪੋਸਟਨੇਟਲ ਪਿਰਾਮਿਡਲ ਨਿਊਰੋਨਸ ਦਿਖਾਉਂਦੀਆਂ ਹਨ (n = 24 ਕੰਟਰੋਲ t-hCO ਨਿਊਰੋਨਸ, n = 21 TS t-hCO ਨਿਊਰੋਨਸ, n = 8 ਕੰਟਰੋਲ hCO ਨਿਊਰੋਨਸ, ਅਤੇ n = 7 TS hCO ਨਿਊਰੋਨਸ)। ਡੇਟਾ ਨੂੰ ਔਸਤ ± ਮਿਆਰੀ ਭਟਕਣ ਵਜੋਂ ਦਰਸਾਇਆ ਗਿਆ ਹੈ।
t-hCO ਦੀ ਉੱਚ ਪੱਧਰ 'ਤੇ ਮਨੁੱਖੀ ਕਾਰਟੈਕਸ ਨਿਊਰੋਨਸ ਦੀਆਂ ਰੂਪ ਵਿਗਿਆਨਿਕ ਅਤੇ ਕਾਰਜਸ਼ੀਲ ਵਿਸ਼ੇਸ਼ਤਾਵਾਂ ਦੀ ਨਕਲ ਕਰਨ ਦੀ ਯੋਗਤਾ ਨੇ ਸਾਨੂੰ ਇਹ ਖੋਜ ਕਰਨ ਲਈ ਪ੍ਰੇਰਿਤ ਕੀਤਾ ਕਿ ਕੀ t-hCO ਨੂੰ ਬਿਮਾਰੀ ਦੇ ਫੀਨੋਟਾਈਪਾਂ ਦਾ ਪਤਾ ਲਗਾਉਣ ਲਈ ਵਰਤਿਆ ਜਾ ਸਕਦਾ ਹੈ। ਅਸੀਂ TS 'ਤੇ ਧਿਆਨ ਕੇਂਦਰਿਤ ਕੀਤਾ, ਜੋ ਕਿ CaV1.2 ਨੂੰ ਏਨਕੋਡਿੰਗ ਕਰਨ ਵਾਲੇ ਜੀਨ ਵਿੱਚ ਲਾਭ-ਆਫ-ਫੰਕਸ਼ਨ ਪਰਿਵਰਤਨ ਕਾਰਨ ਹੋਣ ਵਾਲਾ ਇੱਕ ਗੰਭੀਰ ਨਿਊਰੋਡਿਵੈਲਪਮੈਂਟਲ ਵਿਕਾਰ ਹੈ, ਜੋ ਨਿਊਰੋਨਸ ਵਿੱਚ ਗਤੀਵਿਧੀ-ਨਿਰਭਰ ਜੀਨ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਸ਼ਨ ਸ਼ੁਰੂ ਕਰਦਾ ਹੈ। ਅਸੀਂ ਤਿੰਨ TS ਮਰੀਜ਼ਾਂ ਤੋਂ hCO ਪ੍ਰਾਪਤ ਕੀਤਾ ਜੋ ਸਭ ਤੋਂ ਆਮ ਬਦਲ (p.G406R) ਅਤੇ ਤਿੰਨ ਨਿਯੰਤਰਣ (ਚਿੱਤਰ 3a) ਲੈ ਕੇ ਜਾਂਦੇ ਹਨ। ਟ੍ਰਾਂਸਪਲਾਂਟੇਸ਼ਨ ਤੋਂ ਬਾਅਦ, ਅਸੀਂ ਪਾਇਆ ਕਿ ਨਿਯੰਤਰਣਾਂ (ਚਿੱਤਰ 3b ਅਤੇ ਵਿਸਤ੍ਰਿਤ ਡੇਟਾ, ਚਿੱਤਰ 8a,b) ਦੇ ਮੁਕਾਬਲੇ TS ਨਿਊਰੋਨਸ ਵਿੱਚ ਡੈਂਡਰਟਿਕ ਰੂਪ ਵਿਗਿਆਨ ਨੂੰ ਬਦਲਿਆ ਗਿਆ ਸੀ, ਪ੍ਰਾਇਮਰੀ ਡੈਂਡਰਾਈਟਸ ਦੀ ਗਿਣਤੀ ਵਿੱਚ ਦੋ ਗੁਣਾ ਵਾਧਾ ਅਤੇ ਔਸਤ ਵਿੱਚ ਸਮੁੱਚਾ ਵਾਧਾ ਅਤੇ ਡੈਂਡਰਟਿਕ ਲੰਬਾਈ ਵਿੱਚ ਸਮੁੱਚੀ ਕਮੀ (ਚਿੱਤਰ 3c ਅਤੇ ਵਿਸਤ੍ਰਿਤ ਡੇਟਾ, ਚਿੱਤਰ 8c) ਦੇ ਨਾਲ। ਇਹ ਕੰਟਰੋਲ ਨਿਊਰੋਨਸ ਦੇ ਮੁਕਾਬਲੇ TS ਵਿੱਚ ਰੀੜ੍ਹ ਦੀ ਹੱਡੀ ਦੀ ਵਧੀ ਹੋਈ ਘਣਤਾ ਅਤੇ ਸਵੈ-ਚਾਲਿਤ EPSCs ਦੀ ਵਧੀ ਹੋਈ ਬਾਰੰਬਾਰਤਾ ਨਾਲ ਜੁੜਿਆ ਹੋਇਆ ਸੀ (ਚਿੱਤਰ 3d–f ਅਤੇ ਵਿਸਤ੍ਰਿਤ ਡੇਟਾ, ਚਿੱਤਰ 8g)। ਹੋਰ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਨੇ ਨਿਯੰਤਰਣਾਂ ਦੇ ਮੁਕਾਬਲੇ t-hCO TS ਵਿੱਚ ਅਸਧਾਰਨ ਡੈਂਡਰਟਿਕ ਬ੍ਰਾਂਚਿੰਗ ਦੇ ਪੈਟਰਨ ਪ੍ਰਗਟ ਕੀਤੇ, ਪਰ ਵਿਭਿੰਨਤਾ ਦੇ ਸਮਾਨ ਪੜਾਅ 'ਤੇ ਇਨ ਵਿਟਰੋ TS hCO ਵਿੱਚ ਨਹੀਂ (ਚਿੱਤਰ 3g)। ਇਹ TS ਵਿੱਚ ਗਤੀਵਿਧੀ-ਨਿਰਭਰ ਡੈਂਡਰਟਿਕ ਸੁੰਗੜਨ ਦੀਆਂ ਸਾਡੀਆਂ ਪਿਛਲੀਆਂ ਰਿਪੋਰਟਾਂ ਦੇ ਅਨੁਕੂਲ ਹੈ ਅਤੇ ਇਸ ਟ੍ਰਾਂਸਪਲਾਂਟ ਪਲੇਟਫਾਰਮ ਦੀ ਵਿਵੋ ਵਿੱਚ ਬਿਮਾਰੀ ਫੀਨੋਟਾਈਪਾਂ ਦਾ ਪਤਾ ਲਗਾਉਣ ਦੀ ਯੋਗਤਾ ਨੂੰ ਉਜਾਗਰ ਕਰਦਾ ਹੈ।
ਫਿਰ ਅਸੀਂ ਪੁੱਛਿਆ ਕਿ ਚੂਹਿਆਂ ਵਿੱਚ T-hCO ਸੈੱਲ ਕਿਸ ਹੱਦ ਤੱਕ ਕਾਰਜਸ਼ੀਲ ਤੌਰ 'ਤੇ ਚੂਹੇ S1 ਵਿੱਚ ਏਕੀਕ੍ਰਿਤ ਹਨ। ਚੂਹਿਆਂ ਵਿੱਚ S1 ਨੂੰ ipsilateral ventral ਬੇਸਲ ਅਤੇ ਪੋਸਟਰਿਅਰ ਥੈਲੇਮਿਕ ਨਿਊਕਲੀਅਸ, ਨਾਲ ਹੀ ipsilateral ਮੋਟਰ ਅਤੇ ਸੈਕੰਡਰੀ ਸੋਮੈਟੋਸੈਂਸਰੀ ਕੋਰਟੀਸ, ਅਤੇ contralateral S1 (ਚਿੱਤਰ 4a) ਤੋਂ ਮਜ਼ਬੂਤ ​​ਸਿਨੈਪਟਿਕ ਇਨਪੁਟਸ ਪ੍ਰਾਪਤ ਹੁੰਦੇ ਹਨ। ਇਨਰਵੇਸ਼ਨ ਪੈਟਰਨ ਨੂੰ ਬਹਾਲ ਕਰਨ ਲਈ, ਅਸੀਂ hCO ਨੂੰ ਰੇਬੀਜ਼ ਵਾਇਰਸ-dG-GFP/AAV-G ਨਾਲ ਸੰਕਰਮਿਤ ਕੀਤਾ ਅਤੇ 3 ਦਿਨਾਂ ਬਾਅਦ HCO ਨੂੰ S1 ਚੂਹੇ ਵਿੱਚ ਟ੍ਰਾਂਸਪਲਾਂਟ ਕੀਤਾ। ਅਸੀਂ ਟ੍ਰਾਂਸਪਲਾਂਟੇਸ਼ਨ ਤੋਂ 7-14 ਦਿਨਾਂ ਬਾਅਦ ipsilateral S1 ਅਤੇ ਵੈਂਟ੍ਰਲ ਬੇਸਲ ਗੈਂਗਲੀਆ ਦੇ ਨਿਊਰੋਨਸ ਵਿੱਚ ਸੰਘਣੀ GFP ਸਮੀਕਰਨ ਦੇਖਿਆ (ਚਿੱਤਰ 4b, c)। ਇਸ ਤੋਂ ਇਲਾਵਾ, ਥੈਲੇਮਿਕ ਮਾਰਕਰ ਨੇਟਰਿਨ G1 ਦੇ ਐਂਟੀਬਾਡੀ ਸਟੈਨਿੰਗ ਨੇ t-hCO ਵਿੱਚ ਥੈਲੇਮਿਕ ਅੰਤ ਦੀ ਮੌਜੂਦਗੀ ਦਾ ਖੁਲਾਸਾ ਕੀਤਾ (ਚਿੱਤਰ 4d, e)। ਇਹ ਮੁਲਾਂਕਣ ਕਰਨ ਲਈ ਕਿ ਕੀ ਇਹ ਐਫਰੈਂਟ ਪ੍ਰੋਜੈਕਸ਼ਨ t-hCO ਸੈੱਲਾਂ ਵਿੱਚ ਸਿਨੈਪਟਿਕ ਪ੍ਰਤੀਕਿਰਿਆਵਾਂ ਨੂੰ ਪ੍ਰਾਪਤ ਕਰ ਸਕਦੇ ਹਨ, ਅਸੀਂ ਥੈਲੇਮੋਕਾਰਟੀਕਲ ਪਰਤ ਦੇ ਤਿੱਖੇ ਹਿੱਸਿਆਂ ਵਿੱਚ ਮਨੁੱਖੀ ਸੈੱਲਾਂ ਤੋਂ ਪੂਰੇ ਸੈੱਲ ਰਿਕਾਰਡਿੰਗ ਕੀਤੇ। ਚੂਹੇ S1, ਅੰਦਰੂਨੀ ਕੈਪਸੂਲ, ਚਿੱਟੇ ਪਦਾਰਥ, t-hCO ਦੇ ਨੇੜੇ ਰੇਸ਼ੇ ਜਾਂ t-hCO ਵਿੱਚ ਓਪਸਿਨ-ਪ੍ਰਗਟਾਵੇ ਵਾਲੇ ਥੈਲੇਮਿਕ ਅੰਤਾਂ ਦੇ ਆਪਟੋਜੈਨੇਟਿਕ ਐਕਟੀਵੇਸ਼ਨ ਦਾ ਇਲੈਕਟ੍ਰੀਕਲ ਉਤੇਜਨਾ, AMPA ਰੀਸੈਪਟਰ ਵਿਰੋਧੀ NBQX ਦੇ ਸੰਪਰਕ ਵਿੱਚ ਆਉਣ ਵਾਲੇ t-hCO ਨਿਊਰੋਨਸ ਵਿੱਚ ਛੋਟੀ-ਲੇਟੈਂਸੀ EPSCs ਨੂੰ ਪ੍ਰੇਰਿਤ ਕਰਦਾ ਹੈ। (ਚਿੱਤਰ 4f, g ਅਤੇ ਵਿਸਤ੍ਰਿਤ ਡੇਟਾ, ਚਿੱਤਰ 9a–g)। ਇਹ ਡੇਟਾ ਦਰਸਾਉਂਦੇ ਹਨ ਕਿ t-hCO ਸਰੀਰਿਕ ਤੌਰ 'ਤੇ ਚੂਹੇ ਦੇ ਦਿਮਾਗ ਵਿੱਚ ਏਕੀਕ੍ਰਿਤ ਹੈ ਅਤੇ ਚੂਹੇ ਦੇ ਮੇਜ਼ਬਾਨ ਟਿਸ਼ੂ ਦੁਆਰਾ ਕਿਰਿਆਸ਼ੀਲ ਹੋਣ ਦੇ ਯੋਗ ਹੈ।
a, ਇੱਕ ਰੇਬੀਜ਼ ਟਰੈਕਿੰਗ ਪ੍ਰਯੋਗ ਦਾ ਯੋਜਨਾਬੱਧ ਚਿੱਤਰ। b, GFP ਅਤੇ ਮਨੁੱਖੀ-ਵਿਸ਼ੇਸ਼ STEM121 ਸਮੀਕਰਨ t-hCO ਅਤੇ ਚੂਹੇ ਦੇ ਦਿਮਾਗ਼ੀ ਕਾਰਟੈਕਸ (ਉੱਪਰਲੇ ਪੈਨਲ) ਵਿਚਕਾਰ। ਚੂਹੇ ਦੇ ipsilateral ਵੈਂਟ੍ਰਲ ਬੇਸਲ ਨਿਊਕਲੀਅਸ (VB) (ਹੇਠਲਾ ਖੱਬੇ) ਅਤੇ ipsilateral S1 (ਹੇਠਲਾ ਸੱਜੇ) ਵਿੱਚ GFP ਸਮੀਕਰਨ ਵੀ ਦਿਖਾਇਆ ਗਿਆ ਹੈ। ਸਕੇਲ ਬਾਰ, 50 µm। ਲਾਲ ਵਰਗ ਦਿਮਾਗ ਦੇ ਉਹਨਾਂ ਖੇਤਰਾਂ ਨੂੰ ਦਰਸਾਉਂਦੇ ਹਨ ਜਿੱਥੇ ਤਸਵੀਰਾਂ ਲਈਆਂ ਗਈਆਂ ਸਨ। c, GFP (n = 4 ਚੂਹੇ) ਨੂੰ ਦਰਸਾਉਣ ਵਾਲੇ ਸੈੱਲਾਂ ਦੀ ਮਾਤਰਾ। d, e — t-hCO ਵਿੱਚ Netrin G1+ ਥੈਲੇਮਿਕ ਟਰਮੀਨਲ। d ਇੱਕ ਕੋਰੋਨਲ ਭਾਗ ਦਰਸਾਉਂਦਾ ਹੈ ਜਿਸ ਵਿੱਚ t-hCO ਅਤੇ VB ਨਿਊਕਲੀਅਸ ਹੁੰਦਾ ਹੈ। ਸਕੇਲ ਬਾਰ, 2 mm। e t-hCO (ਖੱਬੇ) ਅਤੇ VB (ਸੱਜੇ) ਨਿਊਰੋਨਸ ਵਿੱਚ Netrin G1 ਅਤੇ STEM121 ਸਮੀਕਰਨ ਦਰਸਾਉਂਦਾ ਹੈ। ਸਕੇਲ ਬਾਰ, 50 µm। ਸੰਤਰੀ ਬਿੰਦੀ ਵਾਲੀ ਲਾਈਨ t-hCO ਬਾਰਡਰ ਨੂੰ ਦਰਸਾਉਂਦੀ ਹੈ। f, g, S1 ਚੂਹਾ (f) ਜਾਂ ਅੰਦਰੂਨੀ ਕੈਪਸੂਲ (g), (ਜਾਮਨੀ) ਜਾਂ ਬਿਨਾਂ (ਕਾਲਾ) NBQX (ਖੱਬੇ) ਵਿੱਚ ਬਿਜਲੀ ਉਤੇਜਨਾ ਤੋਂ ਬਾਅਦ t-hCO ਨਿਊਰੋਨਸ ਦੇ ਮੌਜੂਦਾ ਨਿਸ਼ਾਨ। NBQX (n = 6 S1 ਨਿਊਰੋਨਸ, *P = 0.0119; ਅਤੇ n = 6 ਅੰਦਰੂਨੀ ਕੈਪਸੂਲ ਨਿਊਰੋਨਸ, **P = 0.0022) (ਕੇਂਦਰ) ਦੇ ਨਾਲ ਅਤੇ ਬਿਨਾਂ EPSC ਐਪਲੀਟਿਊਡ। ਚੂਹਾ S1 (f) ਜਾਂ ਅੰਦਰੂਨੀ ਕੈਪਸੂਲ (g) (ਸੱਜੇ) ਦੇ ਬਿਜਲੀ ਉਤੇਜਨਾ ਦੇ ਜਵਾਬ ਵਿੱਚ EPSC ਦਿਖਾ ਰਹੇ t-hCO ਨਿਊਰੋਨਸ ਦਾ ਪ੍ਰਤੀਸ਼ਤ। aCSF, ਨਕਲੀ ਸੇਰੇਬ੍ਰੋਸਪਾਈਨਲ ਤਰਲ। h, 2P ਇਮੇਜਿੰਗ ਪ੍ਰਯੋਗ (ਖੱਬੇ) ਦਾ ਯੋਜਨਾਬੱਧ ਚਿੱਤਰ। t-hCO (ਮੱਧ) ਵਿੱਚ GCaMP6s ਦਾ ਪ੍ਰਗਟਾਵਾ। ਸਕੇਲ ਬਾਰ, 100 µm। GCaMP6s (ਸੱਜੇ) ਦਾ ਫਲੋਰੋਸੈਂਸ ਟਾਈਮ ਲੈਪਸ। i, ਸਵੈ-ਚਾਲਿਤ ਗਤੀਵਿਧੀ ਫਲੋਰੋਸੈਂਸ ਦਾ Z-ਸਕੋਰ। j, ਮੁੱਛਾਂ ਉਤੇਜਨਾ ਦਾ ਯੋਜਨਾਬੱਧ ਚਿੱਤਰ। k, ਇੱਕ ਟ੍ਰਾਇਲ ਵਿੱਚ z-ਸਕੋਰ ਕੀਤੇ 2P ਫਲੋਰੋਸੈਂਸ ਟ੍ਰੈਜੈਕਟਰੀਜ਼, ਉਦਾਹਰਨ ਸੈੱਲਾਂ ਵਿੱਚ ਸਮਾਂ ਜ਼ੀਰੋ (ਡੈਸ਼ਡ ਲਾਈਨ) 'ਤੇ ਵਿਸਕਰ ਭਟਕਣ ਨਾਲ ਇਕਸਾਰ। l, ਸਮਾਂ ਜ਼ੀਰੋ (ਡੈਸ਼ਡ ਲਾਈਨ) (ਲਾਲ) ਜਾਂ ਬੇਤਰਤੀਬੇ ਤੌਰ 'ਤੇ ਤਿਆਰ ਕੀਤੇ ਟਾਈਮਸਟੈਂਪ (ਸਲੇਟੀ) 'ਤੇ ਵਿਸਕਰ ਭਟਕਣ ਨਾਲ ਇਕਸਾਰ ਸਾਰੇ ਸੈੱਲਾਂ ਦੇ ਆਬਾਦੀ-ਔਸਤ z-ਸਕੋਰ ਪ੍ਰਤੀਕਿਰਿਆਵਾਂ। m. ਆਪਟੀਕਲ ਮਾਰਕਿੰਗ 'ਤੇ ਪ੍ਰਯੋਗ ਦਾ ਯੋਜਨਾਬੱਧ ਚਿੱਤਰ। n, ਨੀਲੇ ਲੇਜ਼ਰ ਉਤੇਜਨਾ ਜਾਂ ਵਿਸਕਰ ਭਟਕਣ ਦੌਰਾਨ ਇੱਕ ਉਦਾਹਰਣ t-hCO ਸੈੱਲ ਤੋਂ ਕੱਚਾ ਵੋਲਟੇਜ ਕਰਵ। ਲਾਲ ਤੀਰ ਰੋਸ਼ਨੀ (ਉੱਪਰ) ਜਾਂ ਵਿਸਕਰ ਭਟਕਣ (ਹੇਠਾਂ) ਕਾਰਨ ਹੋਣ ਵਾਲੇ ਪਹਿਲੇ ਸਪਾਈਕਸ ਨੂੰ ਦਰਸਾਉਂਦੇ ਹਨ। ਸਲੇਟੀ ਛਾਂ ਵਿਸਕਰ ਭਟਕਣ ਦੇ ਸਮੇਂ ਨੂੰ ਦਰਸਾਉਂਦੀ ਹੈ। o, ਪੀਕ ਲਾਈਟ ਵੇਵਫਾਰਮ ਅਤੇ ਵਿਸਕਰ ਭਟਕਣ ਪ੍ਰਤੀਕਿਰਿਆਵਾਂ। p, ਇੱਕ ਸਿੰਗਲ ਕੋਸ਼ਿਸ਼ ਦੇ ਸਪਾਈਕਸ, ਉਦਾਹਰਨ ਦੇ ਸੈੱਲਾਂ ਵਿੱਚ ਵਿਸਕਰ ਦੇ ਭਟਕਣ ਨਾਲ ਇਕਸਾਰ। 0 ਵਿਸਕਰ ਭਟਕਣ (ਡੈਸ਼ਡ ਲਾਈਨ) ਨੂੰ ਦਰਸਾਉਂਦਾ ਹੈ। q, ਸਾਰੇ ਫੋਟੋਸੈਂਸਟਿਵ ਸੈੱਲਾਂ ਲਈ ਆਬਾਦੀ-ਔਸਤ z-ਸਕੋਰ ਫਾਇਰਿੰਗ ਦਰ, ਸਮਾਂ ਜ਼ੀਰੋ (ਡੈਸ਼ਡ ਲਾਈਨ) (ਲਾਲ) 'ਤੇ ਵਿਸਕਰ ਭਟਕਣ ਨਾਲ ਇਕਸਾਰ ਜਾਂ ਬੇਤਰਤੀਬੇ ਤੌਰ 'ਤੇ ਤਿਆਰ ਕੀਤੇ ਟਾਈਮਸਟੈਂਪ (ਸਲੇਟੀ)। r, ਵਿਸਕਰ ਡਿਵੀਏਸ਼ਨ (n = 3 ਚੂਹੇ) (ਖੱਬੇ) ਦੁਆਰਾ ਮਹੱਤਵਪੂਰਨ ਤੌਰ 'ਤੇ ਮਾਡਿਊਲੇਟ ਕੀਤੇ ਗਏ ਫੋਟੋਸੈਂਸਟਿਵ ਯੂਨਿਟਾਂ ਦਾ ਅਨੁਪਾਤ। ਪੀਕ z-ਸਕੋਰ ਲੇਟੈਂਸੀ (n = 3 ਚੂਹੇ; n = 5 (ਹਲਕਾ ਹਰਾ), n = 4 (ਗੂੜ੍ਹਾ ਹਰਾ), ਅਤੇ n = 4 (ਸਿਆਨ) ਵਿਸਕਰ ਡਿਫਲੈਕਸ਼ਨ ਮੋਡਿਊਲੇਸ਼ਨ ਯੂਨਿਟ ਪ੍ਰਤੀ ਚੂਹਾ) (ਸੱਜੇ)। ਡੇਟਾ ਨੂੰ ਔਸਤ ± ਮਿਆਰੀ ਭਟਕਣ ਵਜੋਂ ਦਰਸਾਇਆ ਗਿਆ ਹੈ।
ਫਿਰ ਅਸੀਂ ਪੁੱਛਿਆ ਕਿ ਕੀ t-hCO ਨੂੰ ਸੰਵੇਦੀ ਉਤੇਜਨਾ ਦੁਆਰਾ ਕਿਰਿਆਸ਼ੀਲ ਕੀਤਾ ਜਾ ਸਕਦਾ ਹੈ। ਅਸੀਂ s1 ਚੂਹਿਆਂ ਵਿੱਚ ਜੈਨੇਟਿਕ ਤੌਰ 'ਤੇ ਏਨਕੋਡ ਕੀਤੇ ਕੈਲਸ਼ੀਅਮ ਸੂਚਕਾਂ GCaMP6 ਨੂੰ ਪ੍ਰਗਟ ਕਰਨ ਵਾਲੇ hCO ਨੂੰ ਟ੍ਰਾਂਸਪਲਾਂਟ ਕੀਤਾ। 150 ਦਿਨਾਂ ਬਾਅਦ, ਅਸੀਂ ਫਾਈਬਰ ਫੋਟੋਮੈਟਰੀ ਜਾਂ ਦੋ-ਫੋਟੋਨ ਕੈਲਸ਼ੀਅਮ ਇਮੇਜਿੰਗ ਕੀਤੀ (ਚਿੱਤਰ 4h ਅਤੇ ਵਿਸਤ੍ਰਿਤ ਡੇਟਾ, ਚਿੱਤਰ 10a)। ਅਸੀਂ ਪਾਇਆ ਕਿ t-hCO ਸੈੱਲਾਂ ਨੇ ਸਮਕਾਲੀ ਤਾਲਬੱਧ ਗਤੀਵਿਧੀ ਦਾ ਪ੍ਰਦਰਸ਼ਨ ਕੀਤਾ (ਚਿੱਤਰ 4i, ਵਿਸਤ੍ਰਿਤ ਡੇਟਾ, ਚਿੱਤਰ 10b ਅਤੇ ਪੂਰਕ ਵੀਡੀਓ 1)। ਪੀਕ t-hCO ਗਤੀਵਿਧੀ ਨੂੰ ਦਰਸਾਉਣ ਲਈ, ਅਸੀਂ ਅਨੱਸਥੀਸੀਆ ਵਾਲੇ ਟ੍ਰਾਂਸਪਲਾਂਟ ਚੂਹਿਆਂ ਵਿੱਚ ਐਕਸਟਰਸੈਲੂਲਰ ਇਲੈਕਟ੍ਰੋਫਿਜ਼ੀਓਲੋਜੀਕਲ ਰਿਕਾਰਡਿੰਗਾਂ ਕੀਤੀਆਂ (ਵਿਸਤ੍ਰਿਤ ਡੇਟਾ, ਚਿੱਤਰ 10c-f)। ਅਸੀਂ MRI ਚਿੱਤਰਾਂ ਤੋਂ ਸਟੀਰੀਓਟੈਕਸਿਕ ਕੋਆਰਡੀਨੇਟਸ ਤਿਆਰ ਕੀਤੇ ਹਨ; ਇਸ ਤਰ੍ਹਾਂ, ਇਹ ਰਿਕਾਰਡ ਕੀਤੀਆਂ ਇਕਾਈਆਂ ਪੁਟੇਟਿਵ ਮਨੁੱਖੀ ਨਿਊਰੋਨਸ ਨੂੰ ਦਰਸਾਉਂਦੀਆਂ ਹਨ, ਹਾਲਾਂਕਿ ਇਲੈਕਟ੍ਰੋਫਿਜ਼ੀਓਲੋਜੀ ਇਕੱਲੇ ਮੂਲ ਦੀ ਇੱਕ ਪ੍ਰਜਾਤੀ ਨੂੰ ਨਿਰਧਾਰਤ ਕਰਨ ਦੀ ਆਗਿਆ ਨਹੀਂ ਦਿੰਦੀ। ਅਸੀਂ ਗਤੀਵਿਧੀ ਦੇ ਸਮਕਾਲੀ ਬਰਸਟਾਂ ਨੂੰ ਦੇਖਿਆ (ਵਿਸਤ੍ਰਿਤ ਡੇਟਾ, ਚਿੱਤਰ 10d)। ਇਹ ਧਮਾਕੇ ਲਗਭਗ 460 ms ਤੱਕ ਚੱਲੇ ਅਤੇ ਲਗਭਗ 2 s ਦੇ ਚੁੱਪ ਸਮੇਂ ਦੁਆਰਾ ਵੱਖ ਕੀਤੇ ਗਏ (ਵਿਸਤ੍ਰਿਤ ਡੇਟਾ, ਚਿੱਤਰ 10d, e)। ਵਿਅਕਤੀਗਤ ਇਕਾਈਆਂ ਨੇ ਪ੍ਰਤੀ ਬਰਸਟ ਔਸਤਨ ਲਗਭਗ ਤਿੰਨ ਰਾਉਂਡ ਫਾਇਰ ਕੀਤੇ, ਜੋ ਕਿ ਪ੍ਰਤੀ ਬਰਸਟ ਰਜਿਸਟਰਡ ਯੂਨਿਟਾਂ ਦਾ ਲਗਭਗ 73% ਹੈ। ਵਿਅਕਤੀਗਤ ਇਕਾਈਆਂ ਦੀਆਂ ਗਤੀਵਿਧੀਆਂ ਬਹੁਤ ਜ਼ਿਆਦਾ ਸੰਬੰਧਿਤ ਸਨ, ਅਤੇ ਇਹ ਸਬੰਧ ਉਹਨਾਂ ਹੀ ਸਥਿਤੀਆਂ (ਵਿਸਤ੍ਰਿਤ ਡੇਟਾ, ਚਿੱਤਰ 10f) ਅਧੀਨ ਦਰਜ ਕੀਤੇ ਗਏ ਟੀਕਾਕਰਨ ਨਾ ਕੀਤੇ ਜਾਨਵਰਾਂ ਵਿੱਚ ਪਛਾਣੀਆਂ ਗਈਆਂ ਇਕਾਈਆਂ ਨਾਲੋਂ ਵੱਧ ਸਨ। ਪਛਾਣੇ ਗਏ ਮਨੁੱਖੀ-ਪ੍ਰਾਪਤ ਨਿਊਰੋਨਾਂ ਦੇ ਸਪਾਈਕ ਪ੍ਰਤੀਕਿਰਿਆਵਾਂ ਨੂੰ ਹੋਰ ਵਿਸ਼ੇਸ਼ਤਾ ਦੇਣ ਲਈ, ਅਸੀਂ hCO ਨਾਲ ਟ੍ਰਾਂਸਪਲਾਂਟ ਕੀਤੇ ਗਏ ਅਨੱਸਥੀਸੀਆ ਵਾਲੇ ਚੂਹਿਆਂ 'ਤੇ ਲਾਈਟ-ਟੈਗਿੰਗ ਪ੍ਰਯੋਗ ਕੀਤੇ ਜੋ ਪ੍ਰਕਾਸ਼-ਸੰਵੇਦਨਸ਼ੀਲ ਕੈਸ਼ਨ ਚੈਨਲ ਰੋਡੋਪਸਿਨ 2 (hChR2) ਨੂੰ ਪ੍ਰਗਟ ਕਰਦੇ ਹਨ, ਜਿਸ ਰਾਹੀਂ t-hCO ਨਿਊਰੋਨਾਂ ਛੋਟੀ-ਲੇਟੈਂਸੀ ਪਛਾਣ (10 ms ਤੋਂ ਘੱਟ) ਨੀਲੀ ਰੋਸ਼ਨੀ ਉਤੇਜਨਾ ਦੇ ਜਵਾਬ ਵਿੱਚ (ਚਿੱਤਰ 4m–o)। t-hCO ਨਿਊਰੋਨਸ ਨੇ ਕੈਲਸ਼ੀਅਮ ਇਮੇਜਿੰਗ ਵਿੱਚ ਦੇਖੇ ਗਏ ਸਮਾਨ ਫ੍ਰੀਕੁਐਂਸੀ 'ਤੇ ਸਵੈ-ਚਾਲਿਤ ਗਤੀਵਿਧੀ ਦੇ ਫਟਣ ਦਾ ਪ੍ਰਦਰਸ਼ਨ ਕੀਤਾ, ਨਾਲ ਹੀ ਲਾਈਟ ਮਾਰਕਿੰਗ ਦੀ ਅਣਹੋਂਦ ਵਿੱਚ t-hCO ਵਿੱਚ ਕੀਤੇ ਗਏ ਇਲੈਕਟ੍ਰੋਫਿਜ਼ੀਓਲੋਜੀਕਲ ਰਿਕਾਰਡਿੰਗਾਂ (ਵਿਸਤ੍ਰਿਤ ਡੇਟਾ, ਚਿੱਤਰ 10c-g)। ਵਿਟਰੋ ਵਿੱਚ ਦਰਜ hCO ਦੇ ਅਨੁਸਾਰੀ ਪੜਾਵਾਂ ਵਿੱਚ ਕੋਈ ਵੀ ਸਵੈ-ਚਾਲਿਤ ਗਤੀਵਿਧੀ ਨਹੀਂ ਦੇਖੀ ਗਈ। ਇਹ ਮੁਲਾਂਕਣ ਕਰਨ ਲਈ ਕਿ ਕੀ t-hCO ਨੂੰ ਸੰਵੇਦੀ ਉਤੇਜਨਾ ਦੁਆਰਾ ਕਿਰਿਆਸ਼ੀਲ ਕੀਤਾ ਜਾ ਸਕਦਾ ਹੈ, ਅਸੀਂ ਸੰਖੇਪ ਵਿੱਚ ਚੂਹਿਆਂ ਦੀਆਂ ਮੁੱਛਾਂ ਨੂੰ t-hCO ਤੋਂ ਦੂਰ ਮੋੜਿਆ (ਚਿੱਤਰ 4j,m ਅਤੇ ਵਿਸਤ੍ਰਿਤ ਡੇਟਾ, ਚਿੱਤਰ 10h,k)। ਪਿਛਲੇ ਅਧਿਐਨਾਂ ਦੇ ਅਨੁਸਾਰ 8,10, t-hCO ਸੈੱਲਾਂ ਦੇ ਇੱਕ ਉਪ ਸਮੂਹ ਨੇ ਮੁੱਛਾਂ ਦੇ ਡਿਫਲੈਕਸ਼ਨ ਦੇ ਜਵਾਬ ਵਿੱਚ ਵਧੀ ਹੋਈ ਗਤੀਵਿਧੀ ਦਿਖਾਈ, ਜੋ ਕਿ ਡੇਟਾ ਦੀ ਤੁਲਨਾ ਬੇਤਰਤੀਬ ਸਮਾਂ ਸਟੈਂਪਾਂ (ਚਿੱਤਰ 4k–q ਅਤੇ ਵਿਸਤ੍ਰਿਤ ਡੇਟਾ, ਚਿੱਤਰ 10h–q) ਨਾਲ ਕਰਨ 'ਤੇ ਨਹੀਂ ਦੇਖੀ ਗਈ। ਦਰਅਸਲ, ਓਪਟੋ-ਲੇਬਲ ਵਾਲੀਆਂ ਸਿੰਗਲ ਯੂਨਿਟਾਂ ਵਿੱਚੋਂ ਲਗਭਗ 54% ਨੇ ਮੁੱਛਾਂ ਦੇ ਉਤੇਜਨਾ ਤੋਂ ਬਾਅਦ ਇੱਕ ਮਹੱਤਵਪੂਰਨ ਤੌਰ 'ਤੇ ਵਧੀ ਹੋਈ ਉਤੇਜਨਾ ਦਰ ਦਿਖਾਈ, ਜੋ ਲਗਭਗ 650 ms (ਚਿੱਤਰ 4r) 'ਤੇ ਸਿਖਰ 'ਤੇ ਪਹੁੰਚ ਗਈ। ਇਕੱਠੇ ਲਏ ਜਾਣ 'ਤੇ, ਇਹ ਡੇਟਾ ਸੁਝਾਅ ਦਿੰਦਾ ਹੈ ਕਿ t-hCO ਢੁਕਵੇਂ ਕਾਰਜਸ਼ੀਲ ਇਨਪੁਟ ਪ੍ਰਾਪਤ ਕਰਦਾ ਹੈ ਅਤੇ ਵਾਤਾਵਰਣਕ ਉਤੇਜਨਾ ਦੁਆਰਾ ਕਿਰਿਆਸ਼ੀਲ ਕੀਤਾ ਜਾ ਸਕਦਾ ਹੈ।
ਫਿਰ ਅਸੀਂ ਜਾਂਚ ਕੀਤੀ ਕਿ ਕੀ t-hCO ਚੂਹਿਆਂ ਵਿੱਚ ਵਿਵਹਾਰ ਨੂੰ ਕੰਟਰੋਲ ਕਰਨ ਲਈ ਸਰਕਟਾਂ ਨੂੰ ਸਰਗਰਮ ਕਰ ਸਕਦਾ ਹੈ। ਅਸੀਂ ਪਹਿਲਾਂ ਜਾਂਚ ਕੀਤੀ ਕਿ ਕੀ t-hCO ਨਿਊਰੋਨਸ ਦੇ ਐਕਸੋਨ ਚੂਹੇ ਦੇ ਆਲੇ ਦੁਆਲੇ ਦੇ ਟਿਸ਼ੂਆਂ ਵਿੱਚ ਪ੍ਰੋਜੈਕਟ ਕਰਦੇ ਹਨ। ਅਸੀਂ hCO ਨੂੰ EYFP (hChR2-EYFP) ਨਾਲ ਜੁੜੇ hChR2 ਨੂੰ ਏਨਕੋਡਿੰਗ ਕਰਨ ਵਾਲੇ ਲੈਂਟੀਵਾਇਰਸ ਨਾਲ ਸੰਕਰਮਿਤ ਕੀਤਾ। 110 ਦਿਨਾਂ ਬਾਅਦ, ਅਸੀਂ ਆਈਪਸੀਲੇਟਰਲ ਕੋਰਟੀਕਲ ਖੇਤਰਾਂ ਵਿੱਚ EYFP ਪ੍ਰਗਟਾਵੇ ਨੂੰ ਦੇਖਿਆ, ਜਿਸ ਵਿੱਚ ਆਡੀਟੋਰੀ, ਮੋਟਰ, ਅਤੇ ਸੋਮੈਟੋਸੈਂਸਰੀ ਕੋਰਟੀਸਿਸ ਸ਼ਾਮਲ ਹਨ, ਅਤੇ ਨਾਲ ਹੀ ਸਬਕੋਰਟੀਕਲ ਖੇਤਰਾਂ ਵਿੱਚ, ਜਿਸ ਵਿੱਚ ਸਟ੍ਰਾਈਟਮ, ਹਿਪੋਕੈਂਪਸ ਅਤੇ ਥੈਲੇਮਸ ਸ਼ਾਮਲ ਹਨ (ਚਿੱਤਰ 5a)। ਇਹ ਮੁਲਾਂਕਣ ਕਰਨ ਲਈ ਕਿ ਕੀ ਇਹ ਐਫਰੈਂਟ ਪ੍ਰੋਜੈਕਸ਼ਨ ਚੂਹੇ ਦੇ ਸੈੱਲਾਂ ਵਿੱਚ ਸਿਨੈਪਟਿਕ ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆਵਾਂ ਨੂੰ ਪ੍ਰਾਪਤ ਕਰ ਸਕਦੇ ਹਨ, ਅਸੀਂ ਤਿੱਖੇ ਦਿਮਾਗ ਦੇ ਭਾਗਾਂ ਵਿੱਚ ਚੂਹੇ ਦੇ ਸੇਰੇਬ੍ਰਲ ਕਾਰਟੈਕਸ ਸੈੱਲਾਂ ਨੂੰ ਰਿਕਾਰਡ ਕਰਕੇ hChR2-EYFP ਨੂੰ ਪ੍ਰਗਟ ਕਰਨ ਵਾਲੇ t-hCO ਸੈੱਲਾਂ ਨੂੰ ਆਪਟੀਕਲੀ ਕਿਰਿਆਸ਼ੀਲ ਕੀਤਾ। ਚੂਹੇ ਦੇ ਪਿਰਾਮਿਡਲ ਕਾਰਟੈਕਸ ਨਿਊਰੋਨਸ ਵਿੱਚ ਨੀਲੀ ਰੋਸ਼ਨੀ ਦੁਆਰਾ ਪ੍ਰੇਰਿਤ ਛੋਟੀ-ਲੇਟੈਂਸੀ EPSCs ਨਾਲ t-hCO ਐਕਸੋਨ ਦੀ ਕਿਰਿਆਸ਼ੀਲਤਾ, ਜੋ ਕਿ NBQX ਦੁਆਰਾ ਬਲੌਕ ਕੀਤੇ ਗਏ ਸਨ (ਚਿੱਤਰ 5b-g)। ਇਸ ਤੋਂ ਇਲਾਵਾ, ਇਹਨਾਂ ਪ੍ਰਤੀਕਿਰਿਆਵਾਂ ਨੂੰ ਟੈਟਰੋਡੋਟੌਕਸਿਨ (TTX) ਦੁਆਰਾ ਬਲੌਕ ਕੀਤਾ ਜਾ ਸਕਦਾ ਹੈ ਅਤੇ 4-ਐਮੀਨੋਪਾਈਰੀਡੀਨ (4-AP) ਦੁਆਰਾ ਬਹਾਲ ਕੀਤਾ ਜਾ ਸਕਦਾ ਹੈ, ਜੋ ਸੁਝਾਅ ਦਿੰਦਾ ਹੈ ਕਿ ਇਹ ਮੋਨੋਸਿਨੈਪਟਿਕ ਕਨੈਕਸ਼ਨਾਂ (ਚਿੱਤਰ 5e) ਕਾਰਨ ਹੋਏ ਸਨ।
a, ਐਕਸੋਨ ਟਰੈਕਿੰਗ ਦਾ ਯੋਜਨਾਬੱਧ ਚਿੱਤਰ (ਖੱਬੇ)। t-hCO EYFP ਪ੍ਰਗਟਾਵਾ (ਸੱਜੇ)। ਸਕੇਲ ਬਾਰ, 100 µm। A1, ਆਡੀਟੋਰੀ ਕਾਰਟੈਕਸ, ACC, ਐਂਟੀਰੀਅਰ ਸਿੰਗੁਲੇਟ ਕਾਰਟੈਕਸ, d. ਸਟ੍ਰਾਈਟਮ, ਡੋਰਸਲ ਸਟ੍ਰਾਈਟਮ, HPC, ਹਿਪੋਕੈਂਪਸ; ਡਾਇਆਫ੍ਰਾਮ, ਲੈਟਰਲ ਸੈਪਟਮ, mPFC, ਮੈਡੀਅਲ ਪ੍ਰੀਫ੍ਰੰਟਲ ਕਾਰਟੈਕਸ, ਪੀਰੀ, ਪਾਈਰੀਫਾਰਮ ਕਾਰਟੈਕਸ, v. ਸਟ੍ਰਾਈਟਮ, ਵੈਂਟ੍ਰਲ ਸਟ੍ਰਾਈਟਮ, VPM, ਥੈਲੇਮਸ ਦਾ ਵੈਂਟ੍ਰੋਪੋਸਟੋਮੀਡੀਅਲ ਨਿਊਕਲੀਅਸ, VTA, ਵੈਂਟ੍ਰਲ ਟੈਗਮੈਂਟਲ ਖੇਤਰ। ਲਾਲ ਵਰਗ ਦਿਮਾਗ ਦੇ ਉਹਨਾਂ ਖੇਤਰਾਂ ਨੂੰ ਦਰਸਾਉਂਦੇ ਹਨ ਜਿੱਥੇ ਤਸਵੀਰਾਂ ਲਈਆਂ ਗਈਆਂ ਸਨ। b, ਉਤੇਜਨਾ ਪ੍ਰਯੋਗ ਦਾ ਯੋਜਨਾਬੱਧ ਚਿੱਤਰ। c, d, ਮਨੁੱਖ (c) EYFP+ t-hCO ਜਾਂ ਚੂਹਾ (d) EYFP- ਸੈੱਲਾਂ ਵਿੱਚ ਨੀਲੀ ਰੋਸ਼ਨੀ-ਪ੍ਰੇਰਿਤ ਫੋਟੋਕਰੰਟ (ਉੱਪਰ) ਅਤੇ ਵੋਲਟੇਜ (ਹੇਠਾਂ) ਦੇ ਜਵਾਬ ਦੀਆਂ ਉਦਾਹਰਣਾਂ। e, f, TTX ਅਤੇ 4-AR (ਹਰਾ), TTX (ਸਲੇਟੀ) ਜਾਂ aCSF (ਕਾਲਾ) (e), (ਵਾਇਲੇਟ) ਜਾਂ ਬਿਨਾਂ (ਕਾਲਾ) ) NBQX (e) ਦੇ ਨਾਲ t-hCO ਐਕਸਨਾਂ ਦੇ ਨੀਲੇ ਪ੍ਰਕਾਸ਼ ਉਤੇਜਨਾ ਤੋਂ ਬਾਅਦ ਚੂਹੇ ਦੇ ਨਿਊਰੋਨਸ ਦੇ ਮੌਜੂਦਾ ਨਿਸ਼ਾਨ। g, ਚੂਹੇ ਦੇ ਸੈੱਲਾਂ ਵਿੱਚ ਨੀਲੇ ਪ੍ਰਕਾਸ਼ ਦੁਆਰਾ ਪ੍ਰੇਰਿਤ ਪ੍ਰਤੀਕਿਰਿਆਵਾਂ ਦੀ ਲੇਟੈਂਸੀ (n = 16 ਸੈੱਲ); ਖਿਤਿਜੀ ਪੱਟੀਆਂ ਔਸਤ ਲੇਟੈਂਸੀ (7.13 ms) (ਖੱਬੇ) ਨੂੰ ਦਰਸਾਉਂਦੀਆਂ ਹਨ। NBQX (n = 7 ਸੈੱਲ; ***P < 0.0001) (ਮੱਧਮ) ਦੇ ਨਾਲ ਜਾਂ ਬਿਨਾਂ ਰਿਕਾਰਡ ਕੀਤੇ ਪ੍ਰਕਾਸ਼-ਉਤਪੰਨ EPSCs ਦਾ ਐਪਲੀਟਿਊਡ। NBQX (n = 7 ਸੈੱਲ; ***P < 0.0001) (ਮੱਧਮ) ਦੇ ਨਾਲ ਜਾਂ ਬਿਨਾਂ ਰਿਕਾਰਡ ਕੀਤੇ ਪ੍ਰਕਾਸ਼-ਉਤਪੰਨ EPSCs ਦਾ ਐਪਲੀਟਿਊਡ। Амплитуда вызванных светом EPSC, зарегистрированных с или без NBQX (n = 7 клеток; ***P <0,0001) (в центре). NBQX (n = 7 ਸੈੱਲ; ***P < 0.0001) (ਕੇਂਦਰ) ਦੇ ਨਾਲ ਜਾਂ ਬਿਨਾਂ ਰਿਕਾਰਡ ਕੀਤੇ ਪ੍ਰਕਾਸ਼-ਪ੍ਰੇਰਿਤ EPSCs ਦਾ ਐਪਲੀਟਿਊਡ।使用或不使用NBQX 记录的光诱发EPSC 的振幅（n = 7 个细胞；**P <0.0001）（中）।使用或不使用NBQX 记录的光诱发EPSC 的振幅（n = 7 个细胞；**P <0.0001）（中）। Амплитуда вызванных светом EPSC, зарегистрированных с или без NBQX (n = 7 клеток; ***P <0,0001) (в центре). NBQX (n = 7 ਸੈੱਲ; ***P < 0.0001) (ਕੇਂਦਰ) ਦੇ ਨਾਲ ਜਾਂ ਬਿਨਾਂ ਰਿਕਾਰਡ ਕੀਤੇ ਪ੍ਰਕਾਸ਼-ਪ੍ਰੇਰਿਤ EPSCs ਦਾ ਐਪਲੀਟਿਊਡ।ਨੀਲੀ ਰੋਸ਼ਨੀ (ਸੱਜੇ) ਦਾ ਜਵਾਬ ਦੇਣ ਵਾਲੇ EPSC ਦਿਖਾਉਂਦੇ ਚੂਹਿਆਂ ਦੇ ਸੈੱਲਾਂ ਦਾ ਪ੍ਰਤੀਸ਼ਤ। h, ਇੱਕ ਵਿਵਹਾਰਕ ਕਾਰਜ ਦਾ ਯੋਜਨਾਬੱਧ ਚਿੱਤਰ। d0, ਦਿਨ 0। i. ਸਿਖਲਾਈ ਦੇ ਦਿਨ 1 (ਖੱਬੇ) ਜਾਂ ਦਿਨ 15 (ਸੱਜੇ) 'ਤੇ ਮਿਸਾਲੀ ਜਾਨਵਰਾਂ ਦਾ ਪ੍ਰਦਰਸ਼ਨ। ਦਿਨ 1 (ਖੱਬੇ) ਜਾਂ ਦਿਨ 15 (ਸੱਜੇ ਵਿਚਕਾਰ) 'ਤੇ ਕੀਤੇ ਗਏ ਲਿਕਸ ਦੀ ਔਸਤ ਸੰਖਿਆ (n = 150 ਨੀਲੀ ਰੋਸ਼ਨੀ ਦੇ ਟਰਾਇਲ, n = 150 ਲਾਲ ਰੋਸ਼ਨੀ ਦੇ ਟਰਾਇਲ; ***P < 0.0001)। ਦਿਨ 1 (ਖੱਬੇ) ਜਾਂ ਦਿਨ 15 (ਸੱਜੇ ਵਿਚਕਾਰ) 'ਤੇ ਕੀਤੇ ਗਏ ਲਿਕਸ ਦੀ ਔਸਤ ਸੰਖਿਆ (n = 150 ਨੀਲੀ ਰੋਸ਼ਨੀ ਦੇ ਟਰਾਇਲ, n = 150 ਲਾਲ ਰੋਸ਼ਨੀ ਦੇ ਟਰਾਇਲ; ***P < 0.0001)। Среднее количество облизываний, выполненных в день 1 (слева) или день 15 (в центре справа) (n = 150 испытаний с, с = ситом 150) испытаний с красным светом; ***P <0,0001). ਦਿਨ 1 (ਖੱਬੇ) ਜਾਂ ਦਿਨ 15 (ਵਿਚਕਾਰ ਸੱਜੇ) 'ਤੇ ਕੀਤੇ ਗਏ ਲਿਕਸ ਦੀ ਔਸਤ ਸੰਖਿਆ (n = 150 ਨੀਲੀ ਰੋਸ਼ਨੀ ਦੇ ਟਰਾਇਲ, n = 150 ਲਾਲ ਰੋਸ਼ਨੀ ਦੇ ਟਰਾਇਲ; ***P < 0.0001)।第1 天（左）或第15 天（右中）执行的平均舔次数（n = 150 次蓝光试验，n = 150次红光试验；**P <0.0001）।第1 天（左）或第15 天（右中）执行的平均舔次数（n = 150 次蓝光试验，n = 150次红光试验；**P <0.001 Среднее количество облизываний, выполненных в день 1 (слева) или день 15 (в центре справа) (n = 150 испытаний с, с = ситом 150) испытаний с красным светом; ***P <0,0001). ਦਿਨ 1 (ਖੱਬੇ) ਜਾਂ ਦਿਨ 15 (ਵਿਚਕਾਰ ਸੱਜੇ) 'ਤੇ ਕੀਤੇ ਗਏ ਲਿਕਸ ਦੀ ਔਸਤ ਸੰਖਿਆ (n = 150 ਨੀਲੀ ਰੋਸ਼ਨੀ ਦੇ ਟਰਾਇਲ, n = 150 ਲਾਲ ਰੋਸ਼ਨੀ ਦੇ ਟਰਾਇਲ; ***P < 0.0001)।ਦਿਨ 1 (ਵਿਚਕਾਰ ਖੱਬੇ) ਜਾਂ ਦਿਨ 15 (ਸੱਜੇ) 'ਤੇ ਲਾਲ ਅਤੇ ਨੀਲੀ ਰੋਸ਼ਨੀ ਦੇ ਟਰਾਇਲਾਂ ਲਈ ਸੰਚਤ ਲਿਕਸ। NS, ਮਹੱਤਵਪੂਰਨ ਨਹੀਂ। j,k, ਦਿਨ 1 ਜਾਂ 15 'ਤੇ hChR2-EYFP (j) ਜਾਂ ਕੰਟਰੋਲ ਫਲੋਰੋਫੋਰ (k) ਨੂੰ ਦਰਸਾਉਂਦੇ t-hCO ਨਾਲ ਟ੍ਰਾਂਸਪਲਾਂਟ ਕੀਤੇ ਗਏ ਸਾਰੇ ਜਾਨਵਰਾਂ ਦੇ ਵਿਵਹਾਰਕ ਗੁਣ (hChR2-EYFP: n = 9 ਚੂਹੇ, ** P = 0.0049; ਨਿਯੰਤਰਣ: n = 9, P = 0.1497)। l, ਤਰਜੀਹ ਸਕੋਰ ਦਾ ਵਿਕਾਸ (n = 9 hChR2, n = 9 ਨਿਯੰਤਰਣ; **P < 0.001, ***P < 0.0001)। l, ਤਰਜੀਹ ਸਕੋਰ ਦਾ ਵਿਕਾਸ (n = 9 hChR2, n = 9 ਨਿਯੰਤਰਣ; **P < 0.001, ***P < 0.0001)। l, Эволюция показателя предпочтения (n = 9 hChR2, n = 9 контрольных; **P <0,001, ***P <0,0001)। l, ਤਰਜੀਹ ਸਕੋਰ ਦਾ ਵਿਕਾਸ (n = 9 hChR2, n = 9 ਨਿਯੰਤਰਣ; **P < 0.001, ***P < 0.0001)। l，偏好评分的演变（n = 9 hChR2，n = 9 对照；**P <0.001，***P <0.0001）। l，偏好评分的演变（n = 9 hChR2，n = 9 对照；**P <0.001，***P <0.0001）। l, Эволюция показателей предпочтения (n = 9 hChR2, n = 9 контролей; **P <0,001, ***P <0,0001)। l, ਤਰਜੀਹ ਸਕੋਰਾਂ ਦਾ ਵਿਕਾਸ (n = 9 hChR2, n = 9 ਨਿਯੰਤਰਣ; **P < 0.001, ***P < 0.0001)।m, S1 ਵਿੱਚ t-hCO ਦੇ ਆਪਟੋਜੈਨੇਟਿਕ ਐਕਟੀਵੇਸ਼ਨ ਦੇ ਜਵਾਬ ਵਿੱਚ FOS ਪ੍ਰਗਟਾਵਾ। FOS ਪ੍ਰਗਟਾਵੇ (ਖੱਬੇ), ਅਤੇ ਮਾਤਰਾ (n = 3 ਪ੍ਰਤੀ ਸਮੂਹ; *P < 0.05, **P < 0.01 ਅਤੇ ***P < 0.001) (ਸੱਜੇ) ਦੀਆਂ ਤਸਵੀਰਾਂ ਦਿਖਾਈਆਂ ਗਈਆਂ ਹਨ। FOS ਪ੍ਰਗਟਾਵੇ (ਖੱਬੇ), ਅਤੇ ਮਾਤਰਾ (n = 3 ਪ੍ਰਤੀ ਸਮੂਹ; *P < 0.05, **P < 0.01 ਅਤੇ ***P < 0.001) (ਸੱਜੇ) ਦੀਆਂ ਤਸਵੀਰਾਂ ਦਿਖਾਈਆਂ ਗਈਆਂ ਹਨ। Показаны изображения экспрессии FOS (слева) и количественного определения (n = 3 на группу; * P <0,05, ** P <0,01 и *** P <0,001)। FOS ਪ੍ਰਗਟਾਵੇ (ਖੱਬੇ) ਅਤੇ ਮਾਤਰਾਕਰਨ (n = 3 ਪ੍ਰਤੀ ਸਮੂਹ; *P<0.05, **P<0.01, ਅਤੇ ***P<0.001) ਦੀਆਂ ਤਸਵੀਰਾਂ (ਸੱਜੇ) ਦਿਖਾਈਆਂ ਗਈਆਂ ਹਨ।显示了FOS 表达（左）和量化（每组n = 3；*P <0.05、**P <0.01 和***P <0.001）（叾叾ﾼ）显示了FOS 表达（左）和量化（每组n = 3；*P <0.05、**P <0.01 和***P <0.001）（叾叾ﾼ） Показаны изображения экспрессии FOS (слева) и количественного определения (n = 3 на группу; * P <0,05, ** P <0,01 и *** P <0,001)। FOS ਪ੍ਰਗਟਾਵੇ (ਖੱਬੇ) ਅਤੇ ਮਾਤਰਾਕਰਨ (n = 3 ਪ੍ਰਤੀ ਸਮੂਹ; *P<0.05, **P<0.01, ਅਤੇ ***P<0.001) ਦੀਆਂ ਤਸਵੀਰਾਂ (ਸੱਜੇ) ਦਿਖਾਈਆਂ ਗਈਆਂ ਹਨ।ਸਕੇਲ ਬਾਰ, 100 µm। ਡੇਟਾ ਨੂੰ BLA, ਬੇਸੋਲੇਟਰਲ ਟੌਨਸਿਲ, MDT, ਡੋਰਸੋਮੀਡੀਅਲ ਥੈਲੇਮਿਕ ਨਿਊਕਲੀਅਸ, PAG, ਪੈਰੀਐਕਿਊਡਕਟਲ ਗ੍ਰੇ ਦੀ ਔਸਤ ± ਮਿਆਰੀ ਗਲਤੀ ਵਜੋਂ ਦਰਸਾਇਆ ਗਿਆ ਹੈ।
ਅੰਤ ਵਿੱਚ, ਅਸੀਂ ਪੁੱਛਿਆ ਕਿ ਕੀ t-hCO ਚੂਹਿਆਂ ਦੇ ਵਿਵਹਾਰ ਨੂੰ ਸੋਧ ਸਕਦਾ ਹੈ। ਇਸਦੀ ਜਾਂਚ ਕਰਨ ਲਈ, ਅਸੀਂ hChR2-EYFP-ਪ੍ਰਗਟਾਵੇ ਵਾਲੇ hCO ਨੂੰ S1 ਵਿੱਚ ਟ੍ਰਾਂਸਪਲਾਂਟ ਕੀਤਾ, ਅਤੇ 90 ਦਿਨਾਂ ਬਾਅਦ, ਅਸੀਂ ਪ੍ਰਕਾਸ਼ ਡਿਲੀਵਰੀ ਲਈ t-hCO ਵਿੱਚ ਆਪਟੀਕਲ ਫਾਈਬਰ ਲਗਾਏ। ਫਿਰ ਅਸੀਂ ਚੂਹਿਆਂ ਨੂੰ ਇੱਕ ਸੋਧੇ ਹੋਏ ਓਪਰੇਟ ਕੰਡੀਸ਼ਨਿੰਗ ਪੈਰਾਡਾਈਮ (ਚਿੱਤਰ 5h) ਨਾਲ ਸਿਖਲਾਈ ਦਿੱਤੀ। ਅਸੀਂ ਜਾਨਵਰਾਂ ਨੂੰ ਇੱਕ ਵਿਵਹਾਰਕ ਟੈਸਟ ਚੈਂਬਰ ਵਿੱਚ ਰੱਖਿਆ ਅਤੇ ਬੇਤਰਤੀਬੇ ਤੌਰ 'ਤੇ 5 ਸਕਿੰਟ ਨੀਲਾ (473 nm) ਅਤੇ ਲਾਲ (635 nm) ਲੇਜ਼ਰ ਉਤੇਜਨਾ ਲਾਗੂ ਕੀਤੀ। ਜੇਕਰ ਜਾਨਵਰ ਨੀਲੀ ਰੋਸ਼ਨੀ ਉਤੇਜਨਾ ਦੌਰਾਨ ਚੱਟਦੇ ਸਨ ਪਰ ਲਾਲ ਰੋਸ਼ਨੀ ਉਤੇਜਨਾ ਦੌਰਾਨ ਨਹੀਂ ਚੱਟਦੇ ਸਨ ਤਾਂ ਉਨ੍ਹਾਂ ਨੂੰ ਪਾਣੀ ਦਾ ਇਨਾਮ ਮਿਲਿਆ। ਸਿਖਲਾਈ ਦੇ ਪਹਿਲੇ ਦਿਨ, ਜਾਨਵਰਾਂ ਨੇ ਨੀਲੀ ਜਾਂ ਲਾਲ ਰੋਸ਼ਨੀ ਨਾਲ ਉਤੇਜਿਤ ਹੋਣ 'ਤੇ ਚੱਟਣ ਵਿੱਚ ਕੋਈ ਅੰਤਰ ਨਹੀਂ ਦਿਖਾਇਆ। ਹਾਲਾਂਕਿ, 15ਵੇਂ ਦਿਨ, hChR2-EYFP ਨੂੰ ਪ੍ਰਗਟ ਕਰਨ ਵਾਲੇ hCO ਨਾਲ ਟ੍ਰਾਂਸਪਲਾਂਟ ਕੀਤੇ ਜਾਨਵਰਾਂ ਨੇ ਲਾਲ ਰੋਸ਼ਨੀ ਉਤੇਜਨਾ ਦੇ ਮੁਕਾਬਲੇ ਨੀਲੀ ਰੋਸ਼ਨੀ ਨਾਲ ਉਤੇਜਿਤ ਹੋਣ 'ਤੇ ਵਧੇਰੇ ਸਰਗਰਮ ਚੱਟਣਾ ਦਿਖਾਇਆ। ਚੱਟਣ ਦੇ ਵਿਵਹਾਰ ਵਿੱਚ ਇਹ ਬਦਲਾਅ ਕੰਟਰੋਲ ਫਲੋਰੋਫੋਰ (ਸਿੱਖਣ ਦੀ ਸਫਲਤਾ ਦਰ: hChR2 89%, EYFP 0%, ਚਿੱਤਰ 5i-1 ਅਤੇ ਪੂਰਕ ਵੀਡੀਓ 2) ਨੂੰ ਦਰਸਾਉਂਦੇ ਹੋਏ hCO ਨਾਲ ਟ੍ਰਾਂਸਪਲਾਂਟ ਕੀਤੇ ਗਏ ਕੰਟਰੋਲ ਜਾਨਵਰਾਂ ਵਿੱਚ ਨਹੀਂ ਦੇਖੇ ਗਏ। ਇਹ ਡੇਟਾ ਸੁਝਾਅ ਦਿੰਦਾ ਹੈ ਕਿ t-hCO ਸੈੱਲ ਇਨਾਮ-ਖੋਜ ਵਿਵਹਾਰ ਨੂੰ ਉਤੇਜਿਤ ਕਰਨ ਲਈ ਚੂਹੇ ਦੇ ਨਿਊਰੋਨਸ ਨੂੰ ਸਰਗਰਮ ਕਰ ਸਕਦੇ ਹਨ। ਇਹ ਪਤਾ ਲਗਾਉਣ ਲਈ ਕਿ ਕਿਹੜਾ ਚੂਹਾ t-hCO ਨਿਊਰਲ ਸਰਕਟ ਇਹਨਾਂ ਵਿਵਹਾਰਕ ਤਬਦੀਲੀਆਂ ਵਿੱਚ ਸ਼ਾਮਲ ਹੋ ਸਕਦਾ ਹੈ, ਅਸੀਂ 90 ਮਿੰਟ ਬਾਅਦ ਸਿਖਲਾਈ ਪ੍ਰਾਪਤ ਜਾਨਵਰਾਂ ਅਤੇ ਕੱਟੇ ਹੋਏ ਟਿਸ਼ੂਆਂ ਵਿੱਚ ਆਪਟੋਜੈਨੇਟਿਕ ਤੌਰ 'ਤੇ t-hCO ਨੂੰ ਸਰਗਰਮ ਕੀਤਾ। ਇਮਯੂਨੋਹਿਸਟੋਕੈਮਿਸਟਰੀ ਨੇ ਪ੍ਰੇਰਿਤ ਵਿਵਹਾਰ ਵਿੱਚ ਸ਼ਾਮਲ ਕਈ ਦਿਮਾਗੀ ਖੇਤਰਾਂ ਵਿੱਚ ਗਤੀਵਿਧੀ-ਨਿਰਭਰ FOS ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਦੀ ਪ੍ਰਗਟਾਵੇ ਦਾ ਖੁਲਾਸਾ ਕੀਤਾ, ਜਿਸ ਵਿੱਚ ਮੱਧਮ ਪ੍ਰੀਫ੍ਰੰਟਲ ਕਾਰਟੈਕਸ, ਮੱਧਮ ਥੈਲੇਮਸ, ਅਤੇ ਪੈਰੀਆਕਿਊਡਕਟਲ ਸਲੇਟੀ ਪਦਾਰਥ ਸ਼ਾਮਲ ਹੈ, ਜੋ ਕਿ ਜਾਂ ਤਾਂ ਅਣ-ਉਤੇਜਿਤ ਨਿਯੰਤਰਣ ਜਾਨਵਰਾਂ ਵਿੱਚ ਜਾਂ ਜਾਨਵਰਾਂ ਵਿੱਚ ਪ੍ਰਗਟ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ। ਚੌਲ। 5m)। ਇਕੱਠੇ ਲਏ ਜਾਣ 'ਤੇ, ਇਹ ਡੇਟਾ ਸੁਝਾਅ ਦਿੰਦੇ ਹਨ ਕਿ t-hCO ਵਿਵਹਾਰ ਨੂੰ ਚਲਾਉਣ ਲਈ ਚੂਹੇ ਦੇ ਨਿਊਰੋਨਲ ਗਤੀਵਿਧੀ ਨੂੰ ਸੰਸ਼ੋਧਿਤ ਕਰ ਸਕਦਾ ਹੈ।
ਨਿਊਰਲ ਆਰਗੇਨਾਇਡਜ਼ ਇਨ ਵਿਟਰੋ ਵਿੱਚ ਮਨੁੱਖੀ ਵਿਕਾਸ ਅਤੇ ਬਿਮਾਰੀ ਦਾ ਅਧਿਐਨ ਕਰਨ ਲਈ ਇੱਕ ਵਾਅਦਾ ਕਰਨ ਵਾਲੀ ਪ੍ਰਣਾਲੀ ਨੂੰ ਦਰਸਾਉਂਦੇ ਹਨ, ਪਰ ਉਹ ਇਨ ਵਿਟਰੋ ਵਿੱਚ ਮੌਜੂਦ ਸਰਕਟਾਂ ਵਿਚਕਾਰ ਸਬੰਧਾਂ ਦੀ ਘਾਟ ਕਾਰਨ ਸੀਮਤ ਹਨ। ਅਸੀਂ ਇੱਕ ਨਵਾਂ ਪਲੇਟਫਾਰਮ ਵਿਕਸਤ ਕੀਤਾ ਹੈ ਜਿਸ ਵਿੱਚ ਅਸੀਂ ਮਨੁੱਖੀ ਸੈੱਲ ਵਿਕਾਸ ਅਤੇ ਇਨ ਵਿਟਰੋ ਵਿੱਚ ਕਾਰਜ ਦਾ ਅਧਿਐਨ ਕਰਨ ਲਈ ਇਮਯੂਨੋਕੰਪਰੋਮਾਈਜ਼ਡ ਸ਼ੁਰੂਆਤੀ ਜਨਮ ਤੋਂ ਬਾਅਦ ਦੇ ਚੂਹਿਆਂ ਦੇ S1 ਵਿੱਚ hCO ਟ੍ਰਾਂਸਪਲਾਂਟ ਕੀਤਾ ਹੈ। ਅਸੀਂ ਦਿਖਾਇਆ ਹੈ ਕਿ t-hCO ਵਿਟਰੋ ਵਿੱਚ ਨਾ ਦੇਖੇ ਗਏ ਪਰਿਪੱਕ ਸੈੱਲ ਕਿਸਮਾਂ ਨੂੰ ਵਿਕਸਤ ਕਰਦਾ ਹੈ28 ਅਤੇ ਇਹ ਕਿ t-hCO ਸਰੀਰਿਕ ਅਤੇ ਕਾਰਜਸ਼ੀਲ ਤੌਰ 'ਤੇ ਚੂਹੇ ਦੇ ਦਿਮਾਗ ਵਿੱਚ ਏਕੀਕ੍ਰਿਤ ਹੈ। ਚੂਹੇ ਦੇ ਨਿਊਰਲ ਸਰਕਟਾਂ ਵਿੱਚ t-hCO ਦੇ ਏਕੀਕਰਨ ਨੇ ਸਾਨੂੰ ਮਨੁੱਖੀ ਸੈਲੂਲਰ ਗਤੀਵਿਧੀ ਅਤੇ ਅਧਿਐਨ ਕੀਤੇ ਜਾਨਵਰਾਂ ਦੇ ਵਿਵਹਾਰ ਵਿਚਕਾਰ ਇੱਕ ਸਬੰਧ ਸਥਾਪਤ ਕਰਨ ਦੀ ਆਗਿਆ ਦਿੱਤੀ, ਇਹ ਦਰਸਾਉਂਦਾ ਹੈ ਕਿ t-hCO ਨਿਊਰੋਨ ਵਿਵਹਾਰਕ ਪ੍ਰਤੀਕਿਰਿਆਵਾਂ ਨੂੰ ਚਲਾਉਣ ਲਈ ਚੂਹੇ ਦੇ ਨਿਊਰੋਨਲ ਗਤੀਵਿਧੀ ਨੂੰ ਸੰਸ਼ੋਧਿਤ ਕਰ ਸਕਦੇ ਹਨ।
ਜਿਸ ਪਲੇਟਫਾਰਮ ਦਾ ਅਸੀਂ ਵਰਣਨ ਕਰਦੇ ਹਾਂ, ਉਸ ਦੇ ਚੂਹਿਆਂ ਦੇ ਦਿਮਾਗ ਵਿੱਚ ਮਨੁੱਖੀ ਸੈੱਲਾਂ ਦੇ ਟ੍ਰਾਂਸਪਲਾਂਟ ਬਾਰੇ ਪਿਛਲੀ ਖੋਜ ਨਾਲੋਂ ਕਈ ਫਾਇਦੇ ਹਨ। ਪਹਿਲਾਂ, ਅਸੀਂ hCO ਨੂੰ ਸ਼ੁਰੂਆਤੀ ਜਨਮ ਤੋਂ ਬਾਅਦ ਦੇ ਚੂਹਿਆਂ ਦੇ ਵਿਕਾਸਸ਼ੀਲ ਕਾਰਟੈਕਸ ਵਿੱਚ ਟ੍ਰਾਂਸਪਲਾਂਟ ਕੀਤਾ, ਜੋ ਸਰੀਰਿਕ ਅਤੇ ਕਾਰਜਸ਼ੀਲ ਏਕੀਕਰਨ ਦੀ ਸਹੂਲਤ ਦੇ ਸਕਦਾ ਹੈ। ਦੂਜਾ, t-hCO MRI ਨਿਗਰਾਨੀ ਨੇ ਸਾਨੂੰ ਜੀਵਤ ਜਾਨਵਰਾਂ ਵਿੱਚ ਗ੍ਰਾਫਟ ਸਥਿਤੀ ਅਤੇ ਵਿਕਾਸ ਦਾ ਅਧਿਐਨ ਕਰਨ ਦੀ ਆਗਿਆ ਦਿੱਤੀ, ਜਿਸ ਨਾਲ ਸਾਨੂੰ ਲੰਬੇ ਸਮੇਂ ਦੇ ਬਹੁ-ਜਾਨਵਰ ਅਧਿਐਨ ਕਰਨ ਅਤੇ ਕਈ hiPS ਸੈੱਲ ਲਾਈਨਾਂ ਦੀ ਭਰੋਸੇਯੋਗਤਾ ਸਥਾਪਤ ਕਰਨ ਦੀ ਆਗਿਆ ਮਿਲੀ। ਅੰਤ ਵਿੱਚ, ਅਸੀਂ ਅਲੱਗ-ਥਲੱਗ ਸਿੰਗਲ ਸੈੱਲ ਸਸਪੈਂਸ਼ਨਾਂ ਦੀ ਬਜਾਏ, ਬਰਕਰਾਰ ਆਰਗੇਨੋਇਡਜ਼ ਟ੍ਰਾਂਸਪਲਾਂਟ ਕੀਤੇ, ਜੋ ਮਨੁੱਖੀ ਸੈੱਲਾਂ ਲਈ ਘੱਟ ਵਿਨਾਸ਼ਕਾਰੀ ਹਨ ਅਤੇ ਚੂਹਿਆਂ ਦੇ ਦਿਮਾਗ ਵਿੱਚ ਮਨੁੱਖੀ ਕਾਰਟੈਕਸ ਨਿਊਰੋਨਸ ਦੇ ਏਕੀਕਰਨ ਅਤੇ ਪੀੜ੍ਹੀ ਨੂੰ ਉਤਸ਼ਾਹਿਤ ਕਰ ਸਕਦੇ ਹਨ।
ਅਸੀਂ ਮੰਨਦੇ ਹਾਂ ਕਿ ਇਸ ਪਲੇਟਫਾਰਮ ਵਿੱਚ ਤਰੱਕੀ ਦੇ ਬਾਵਜੂਦ, ਅਸਥਾਈ, ਸਥਾਨਿਕ ਅਤੇ ਅੰਤਰ-ਪ੍ਰਜਾਤੀਆਂ ਦੀਆਂ ਰੁਕਾਵਟਾਂ ਵਿਕਾਸ ਦੇ ਸ਼ੁਰੂਆਤੀ ਪੜਾਅ 'ਤੇ ਟ੍ਰਾਂਸਪਲਾਂਟੇਸ਼ਨ ਤੋਂ ਬਾਅਦ ਵੀ, ਉੱਚ ਵਫ਼ਾਦਾਰੀ ਨਾਲ ਮਨੁੱਖੀ ਤੰਤੂ ਸਰਕਟਾਂ ਦੇ ਗਠਨ ਨੂੰ ਰੋਕਦੀਆਂ ਹਨ। ਉਦਾਹਰਣ ਵਜੋਂ, ਇਹ ਸਪੱਸ਼ਟ ਨਹੀਂ ਹੈ ਕਿ ਕੀ t-hCO ਵਿੱਚ ਦੇਖੀ ਗਈ ਸਵੈ-ਚਾਲਿਤ ਗਤੀਵਿਧੀ ਕੋਰਟੀਕਲ ਵਿਕਾਸ ਦੌਰਾਨ ਦੇਖੀ ਗਈ ਤਾਲਬੱਧ ਗਤੀਵਿਧੀ ਦੇ ਸਮਾਨ ਵਿਕਾਸ ਸੰਬੰਧੀ ਫੀਨੋਟਾਈਪ ਨੂੰ ਦਰਸਾਉਂਦੀ ਹੈ, ਜਾਂ ਕੀ ਇਹ t-hCO ਵਿੱਚ ਮੌਜੂਦ ਦਮਨਕਾਰੀ ਸੈੱਲ ਕਿਸਮਾਂ ਦੀ ਅਣਹੋਂਦ ਕਾਰਨ ਹੈ। ਇਸੇ ਤਰ੍ਹਾਂ, ਇਹ ਸਪੱਸ਼ਟ ਨਹੀਂ ਹੈ ਕਿ t-hCO ਵਿੱਚ ਲੈਮੀਨੇਸ਼ਨ ਦੀ ਅਣਹੋਂਦ ਕਿਸ ਹੱਦ ਤੱਕ ਚੇਨ ਕਨੈਕਟੀਵਿਟੀ30 ਨੂੰ ਪ੍ਰਭਾਵਤ ਕਰਦੀ ਹੈ। ਭਵਿੱਖ ਦਾ ਕੰਮ ਹੋਰ ਸੈੱਲ ਕਿਸਮਾਂ ਜਿਵੇਂ ਕਿ ਮਨੁੱਖੀ ਮਾਈਕ੍ਰੋਗਲੀਆ, ਮਨੁੱਖੀ ਐਂਡੋਥੈਲੀਅਲ ਸੈੱਲ, ਅਤੇ GABAergic ਇੰਟਰਨਿਊਰੋਨ ਦੇ ਵੱਖੋ-ਵੱਖਰੇ ਅਨੁਪਾਤ ਨੂੰ ਏਕੀਕ੍ਰਿਤ ਕਰਨ 'ਤੇ ਕੇਂਦ੍ਰਤ ਕਰੇਗਾ ਜਿਵੇਂ ਕਿ ਅਸੈਂਬਲੀ 6 ਇਨ ਵਿਟਰੋ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੇ ਹੋਏ ਦਿਖਾਇਆ ਗਿਆ ਹੈ, ਨਾਲ ਹੀ ਇਹ ਸਮਝਣ 'ਤੇ ਕਿ ਬਦਲੇ ਹੋਏ t-hCO ਵਿੱਚ ਤੰਤੂ ਏਕੀਕਰਣ ਅਤੇ ਪ੍ਰੋਸੈਸਿੰਗ ਕਿਵੇਂ ਹੋ ਸਕਦੀ ਹੈ। ਮਰੀਜ਼ਾਂ ਤੋਂ ਪ੍ਰਾਪਤ ਸੈੱਲਾਂ ਵਿੱਚ ਟ੍ਰਾਂਸਪਲਾਂਟੇਸ਼ਨਲ, ਸਿਨੈਪਟਿਕ ਅਤੇ ਵਿਵਹਾਰਕ ਪੱਧਰ।
ਕੁੱਲ ਮਿਲਾ ਕੇ, ਇਹ ਇਨ ਵੀਵੋ ਪਲੇਟਫਾਰਮ ਇੱਕ ਸ਼ਕਤੀਸ਼ਾਲੀ ਸਰੋਤ ਨੂੰ ਦਰਸਾਉਂਦਾ ਹੈ ਜੋ ਇਨ ਵਿਟਰੋ ਮਨੁੱਖੀ ਦਿਮਾਗ ਦੇ ਵਿਕਾਸ ਅਤੇ ਬਿਮਾਰੀ ਖੋਜ ਨੂੰ ਪੂਰਾ ਕਰ ਸਕਦਾ ਹੈ। ਅਸੀਂ ਉਮੀਦ ਕਰਦੇ ਹਾਂ ਕਿ ਇਹ ਪਲੇਟਫਾਰਮ ਸਾਨੂੰ ਮਰੀਜ਼ ਤੋਂ ਪ੍ਰਾਪਤ ਸੈੱਲਾਂ ਵਿੱਚ ਨਵੇਂ ਸਟ੍ਰੈਂਡ-ਪੱਧਰ ਦੇ ਫੀਨੋਟਾਈਪਾਂ ਦੀ ਖੋਜ ਕਰਨ ਅਤੇ ਨਵੀਆਂ ਇਲਾਜ ਰਣਨੀਤੀਆਂ ਦੀ ਜਾਂਚ ਕਰਨ ਦੀ ਆਗਿਆ ਦੇਵੇਗਾ।
ਅਸੀਂ ਪਹਿਲਾਂ ਦੱਸੇ ਅਨੁਸਾਰ HiPS ਸੈੱਲਾਂ ਤੋਂ hCO2.5 ਪੈਦਾ ਕੀਤਾ। ਫੀਡਰ ਲੇਅਰਾਂ 'ਤੇ ਕਲਚਰ ਕੀਤੇ ਗਏ hiPS ਸੈੱਲਾਂ ਤੋਂ hCO ਉਤਪਾਦਨ ਸ਼ੁਰੂ ਕਰਨ ਲਈ, hiPS ਸੈੱਲਾਂ ਦੀਆਂ ਬਰਕਰਾਰ ਕਲੋਨੀਆਂ ਨੂੰ ਡਿਸਪੇਸ (0.35 mg/mL) ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ ਕਲਚਰ ਡਿਸ਼ਾਂ ਤੋਂ ਹਟਾ ਦਿੱਤਾ ਗਿਆ ਅਤੇ hiPS ਸੈੱਲ ਕਲਚਰ ਮਾਧਿਅਮ ਵਾਲੇ ਪਕਵਾਨਾਂ ਵਾਲੇ ਅਤਿ-ਘੱਟ ਅਟੈਚਮੈਂਟ ਪਲਾਸਟਿਕ ਕਲਚਰ ਵਿੱਚ ਤਬਦੀਲ ਕੀਤਾ ਗਿਆ। (ਕੋਰਨਿੰਗ) ਦੋ SMAD ਇਨਿਹਿਬਟਰ ਡੋਰਸੋਮੋਰਫਾਈਨ (5 μM; P5499, ਸਿਗਮਾ-ਐਲਡਰਿਕ) ਅਤੇ SB-431542 (10 μM; 1614, ਟੋਕਰਿਸ) ਅਤੇ ROCK ਇਨਿਹਿਬਟਰ Y-27632 (10 μM; S1049, ਸੇਲੇਕਚੇਮ) ਨਾਲ ਪੂਰਕ ਕੀਤਾ ਗਿਆ। ਪਹਿਲੇ 5 ਦਿਨਾਂ ਦੌਰਾਨ, hiPS ਸੈੱਲ ਮਾਧਿਅਮ ਨੂੰ ਰੋਜ਼ਾਨਾ ਬਦਲਿਆ ਜਾਂਦਾ ਸੀ ਅਤੇ ਡੋਰਸੋਮੋਰਫਾਈਨ ਅਤੇ SB-431542 ਸ਼ਾਮਲ ਕੀਤੇ ਗਏ ਸਨ। ਸਸਪੈਂਸ਼ਨ ਦੇ ਛੇਵੇਂ ਦਿਨ, ਨਿਊਰਲ ਸਫੇਰੋਇਡਜ਼ ਨੂੰ ਨਿਊਰੋਬਾਸਲ-ਏ (10888, ਲਾਈਫ ਟੈਕਨਾਲੋਜੀਜ਼), ਵਿਟਾਮਿਨ ਏ ਤੋਂ ਬਿਨਾਂ ਬੀ-27 ਸਪਲੀਮੈਂਟ (12587, ਲਾਈਫ ਟੈਕਨਾਲੋਜੀਜ਼), ਗਲੂਟਾਮੈਕਸ (1:100, ਲਾਈਫ ਟੈਕਨਾਲੋਜੀਜ਼), ਪੈਨਿਸਿਲਿਨ ਅਤੇ ਸਟ੍ਰੈਪਟੋਮਾਈਸਿਨ (1:100, ਲਾਈਫ ਟੈਕਨਾਲੋਜੀਜ਼) ਵਾਲੇ ਨਿਊਰਲ ਮਾਧਿਅਮ ਵਿੱਚ ਤਬਦੀਲ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਅਤੇ 24ਵੇਂ ਦਿਨ ਤੱਕ ਐਪੀਡਰਮਲ ਗ੍ਰੋਥ ਫੈਕਟਰ (EGF; 20 ng ml−1; R&D ਸਿਸਟਮ) ਅਤੇ ਫਾਈਬਰੋਬਲਾਸਟ ਗ੍ਰੋਥ ਫੈਕਟਰ 2 (FGF2; 20 ng ml−1; R&D ਸਿਸਟਮ) ਨਾਲ ਪੂਰਕ ਕੀਤਾ ਗਿਆ। ਦਿਨ 25 ਤੋਂ ਦਿਨ 42 ਤੱਕ, ਮਾਧਿਅਮ ਨੂੰ ਦਿਮਾਗ ਤੋਂ ਪ੍ਰਾਪਤ ਨਿਊਰੋਟ੍ਰੋਫਿਕ ਫੈਕਟਰ (BDNF; 20 ng ml−1, Peprotech) ਅਤੇ ਨਿਊਰੋਟ੍ਰੋਫਿਨ 3 (NT3; 20 ng ml−1; Peprotech) ਨਾਲ ਪੂਰਕ ਕੀਤਾ ਗਿਆ, ਹਰ ਦੂਜੇ ਦਿਨ ਦਰਮਿਆਨੇ ਬਦਲਾਅ ਦੇ ਨਾਲ। ਸਸਪੈਂਸ਼ਨ ਦੇ ਛੇਵੇਂ ਦਿਨ, ਨਿਊਰਲ ਸਫੇਰੋਇਡਜ਼ ਨੂੰ ਨਿਊਰੋਬਾਸਲ-ਏ (10888, ਲਾਈਫ ਟੈਕਨਾਲੋਜੀਜ਼), ਵਿਟਾਮਿਨ ਏ ਤੋਂ ਬਿਨਾਂ ਬੀ-27 ਸਪਲੀਮੈਂਟ (12587, ਲਾਈਫ ਟੈਕਨਾਲੋਜੀਜ਼), ਗਲੂਟਾਮੈਕਸ (1:100, ਲਾਈਫ ਟੈਕਨਾਲੋਜੀਜ਼), ਪੈਨਿਸਿਲਿਨ ਅਤੇ ਸਟ੍ਰੈਪਟੋਮਾਈਸਿਨ (1:100, ਲਾਈਫ ਟੈਕਨਾਲੋਜੀਜ਼) ਵਾਲੇ ਨਿਊਰਲ ਮਾਧਿਅਮ ਵਿੱਚ ਤਬਦੀਲ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਅਤੇ 24ਵੇਂ ਦਿਨ ਤੱਕ ਐਪੀਡਰਮਲ ਗ੍ਰੋਥ ਫੈਕਟਰ (EGF; 20 ng ml−1; R&D ਸਿਸਟਮ) ਅਤੇ ਫਾਈਬਰੋਬਲਾਸਟ ਗ੍ਰੋਥ ਫੈਕਟਰ 2 (FGF2; 20 ng ml−1; R&D ਸਿਸਟਮ) ਨਾਲ ਪੂਰਕ ਕੀਤਾ ਗਿਆ। ਦਿਨ 25 ਤੋਂ ਦਿਨ 42 ਤੱਕ, ਮਾਧਿਅਮ ਨੂੰ ਦਿਮਾਗ ਤੋਂ ਪ੍ਰਾਪਤ ਨਿਊਰੋਟ੍ਰੋਫਿਕ ਫੈਕਟਰ (BDNF; 20 ng ml−1, Peprotech) ਅਤੇ ਨਿਊਰੋਟ੍ਰੋਫਿਨ 3 (NT3; 20 ng ml−1; Peprotech) ਨਾਲ ਪੂਰਕ ਕੀਤਾ ਗਿਆ, ਹਰ ਦੂਜੇ ਦਿਨ ਦਰਮਿਆਨੇ ਬਦਲਾਅ ਦੇ ਨਾਲ।ਸਸਪੈਂਸ਼ਨ ਦੇ ਛੇਵੇਂ ਦਿਨ, ਨਿਊਰਲ ਸਫੇਰੋਇਡਜ਼ ਨੂੰ ਨਿਊਰੋਬਾਸਲ-ਏ (10888, ਲਾਈਫ ਟੈਕਨਾਲੋਜੀਜ਼), ਵਿਟਾਮਿਨ ਏ ਤੋਂ ਬਿਨਾਂ ਬੀ-27 ਸਪਲੀਮੈਂਟ (12587, ਲਾਈਫ ਟੈਕਨਾਲੋਜੀਜ਼), ਗਲੂਟਾਮੈਕਸ (1:100, ਲਾਈਫ ਟੈਕਨਾਲੋਜੀਜ਼), ਪੈਨਿਸਿਲਿਨ ਵਾਲੇ ਨਿਊਰਲ ਮਾਧਿਅਮ ਵਿੱਚ ਤਬਦੀਲ ਕੀਤਾ ਗਿਆ।и стрептомицин (1:100, ਲਾਈਫ ਟੈਕਨੋਲੋਜੀ) и дополнены эпидермальным фактором роста (EGF; 20 ng/мл; R&D Systems) и фактором роста; блаб2фобла2фовста; ng/ml; R&D ਸਿਸਟਮ) 24-го дня. ਅਤੇ ਸਟ੍ਰੈਪਟੋਮਾਈਸਿਨ (1:100, ਲਾਈਫ ਟੈਕਨਾਲੋਜੀਜ਼) ਅਤੇ 24ਵੇਂ ਦਿਨ ਤੱਕ ਐਪੀਡਰਮਲ ਗ੍ਰੋਥ ਫੈਕਟਰ (EGF; 20 ng/ml; R&D ਸਿਸਟਮ) ਅਤੇ ਫਾਈਬਰੋਬਲਾਸਟ ਗ੍ਰੋਥ ਫੈਕਟਰ 2 (FGF2; 20 ng/ml; R&D ਸਿਸਟਮ) ਨਾਲ ਪੂਰਕ।25ਵੇਂ ਤੋਂ 42ਵੇਂ ਦਿਨ ਤੱਕ, ਦਿਮਾਗ ਤੋਂ ਪ੍ਰਾਪਤ ਨਿਊਰੋਟ੍ਰੋਫਿਕ ਫੈਕਟਰ (BDNF; 20 ng ml-1, Peprotech) ਅਤੇ ਨਿਊਰੋਟ੍ਰੋਫਿਨ 3 (NT3; 20 ng ml-1, Peprotech) ਨੂੰ ਮਾਧਿਅਮ ਵਿੱਚ ਜੋੜਿਆ ਗਿਆ, ਹਰ ਦੂਜੇ ਦਿਨ ਮਾਧਿਅਮ ਬਦਲਿਆ ਗਿਆ।在悬浮的第6 天，将神经球体转移到含有neurobasal-A（10888，Life Technologies）、不含维生素A7B-7补充剂（12587，Life Technologies）、GlutaMax（1:100，Life Technologies）、青霉素的神经培养基的神经培养基中和链01:Life10 ਤਕਨਾਲੋਜੀਆਂ）并辅以表皮生长因子（EGF；20 ng ml-1；R&D ਸਿਸਟਮਸ）和成纤维细胞生长因子2（FGF2；20ng ml-1；R&D Systems）直至第24 天.在 悬浮的第第 6 天 将 神经 球体 转移 含有 含有 neurobasal-a （10888 ， Life Technologies） b-27 納納 天补充剂 （12587, Life Technologies） Glutamax （1: 100, Life TechNOGIS 青霉素 的 神经 培养 基 中 链霉素 ， 1: 100 Life ਤਕਨਾਲੋਜੀਆਂ） 表皮 生长 因子 （（（20 ng ml-1 ； r & d Systems） 成 纤维 细胞 生长 2 （fgf2 ； 20 ng ml- 1；R&D ਸਿਸਟਮ）笩嬩囤24. На 6-й день суспензии нейросферы были переведены на добавку, содержащую нейробазал-А (10888, ਲਾਈਫ ਟੈਕਨੋਲੋਜੀ), дубавку 2. витамина А (12587, ਲਾਈਫ ਟੈਕਨੋਲੋਜੀ), ਗਲੂਟਾਮੈਕਸ (1:100, ਲਾਈਫ ਟੈਕਨੋਲੋਜੀ), пенициллин- нейтрализованный стрептомицин (1:100, ਲਾਈਫ ਟੈਕਨੋਲੋਜੀ) фактора роста (EGF; 20 нг мл-1; R&D ਸਿਸਟਮ) и фактора роста фибробластов 2 (FGF2; 20 нг мл-1) 1; ਛੇਵੇਂ ਦਿਨ, ਨਿਊਰੋਸਫੀਅਰ ਸਸਪੈਂਸ਼ਨਾਂ ਨੂੰ ਨਿਊਰੋਬਾਸਲ-ਏ (10888, ਲਾਈਫ ਟੈਕਨਾਲੋਜੀਜ਼), ਵਿਟਾਮਿਨ ਏ ਤੋਂ ਬਿਨਾਂ ਬੀ-27 ਸਪਲੀਮੈਂਟ (12587, ਲਾਈਫ ਟੈਕਨਾਲੋਜੀਜ਼), ਗਲੂਟਾਮੈਕਸ (1:100, ਲਾਈਫ ਟੈਕਨਾਲੋਜੀਜ਼), ਪੈਨਿਸਿਲਿਨ-ਨਿਊਟਰਲਾਈਜ਼ਡ ਸਟ੍ਰੈਪਟੋਮਾਈਸਿਨ (1:100, ਲਾਈਫ ਟੈਕਨਾਲੋਜੀਜ਼) ਵਾਲੇ ਪੂਰਕ ਵਿੱਚ ਬਦਲ ਦਿੱਤਾ ਗਿਆ ਜੋ ਐਪੀਡਰਮਲ ਗ੍ਰੋਥ ਫੈਕਟਰ (EGF; 20 ng ml-1; R&D ਸਿਸਟਮ) ਅਤੇ ਫਾਈਬਰੋਬਲਾਸਟ ਗ੍ਰੋਥ ਫੈਕਟਰ 2 (FGF2; 20 ng ml-1) 1 ਨਾਲ ਪੂਰਕ ਸਨ; R&D ਸਿਸਟਮ) 24-го дня. (ਆਰ ਐਂਡ ਡੀ ਸਿਸਟਮ) 24ਵੇਂ ਦਿਨ ਤੱਕ।25ਵੇਂ ਤੋਂ 42ਵੇਂ ਦਿਨ ਤੱਕ, ਦਿਮਾਗ ਤੋਂ ਪ੍ਰਾਪਤ ਨਿਊਰੋਟ੍ਰੋਫਿਕ ਫੈਕਟਰ (BDNF; 20 ng ml-1, Peprotech) ਅਤੇ ਨਿਊਰੋਟ੍ਰੋਫਿਕ ਫੈਕਟਰ 3 (NT3; 20 ng ml-1, Peprotech) ਨੂੰ ਹਰ ਦੂਜੇ ਦਿਨ ਕਲਚਰ ਮਾਧਿਅਮ ਵਿੱਚ ਜੋੜਿਆ ਗਿਆ। ਇੱਕ ਵਾਰ ਦਰਮਿਆਨਾ ਬਦਲੋ।ਦਿਨ 43 ਤੋਂ ਸ਼ੁਰੂ ਕਰਦੇ ਹੋਏ, hCO ਨੂੰ ਹਰ 4-6 ਦਿਨਾਂ ਵਿੱਚ ਦਰਮਿਆਨੇ ਬਦਲਾਅ ਦੇ ਨਾਲ ਗੈਰ-ਪੂਰਕ ਨਿਊਰੋਬੇਸਲ-ਏ ਮਾਧਿਅਮ (NM; 1088022, ਥਰਮੋ ਫਿਸ਼ਰ) ਵਿੱਚ ਬਣਾਈ ਰੱਖਿਆ ਗਿਆ ਸੀ। ਫੀਡਰ ਰਹਿਤ ਹਾਲਤਾਂ ਵਿੱਚ ਸੰਸਕ੍ਰਿਤ hiPS ਸੈੱਲਾਂ ਤੋਂ hCO ਪ੍ਰਾਪਤ ਕਰਨ ਲਈ, hiPS ਸੈੱਲਾਂ ਨੂੰ Accutase (AT-104, ਇਨੋਵੇਟ ਸੈੱਲ ਟੈਕਨਾਲੋਜੀਜ਼) ਨਾਲ 37°C 'ਤੇ 7 ਮਿੰਟ ਲਈ ਇਨਕੁਬੇਟ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ, ਸਿੰਗਲ ਸੈੱਲਾਂ ਵਿੱਚ ਵੱਖ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ, ਅਤੇ ਐਗਰਵੈੱਲ 800 ਪਲੇਟਾਂ (34815, STEMCELL ਟੈਕਨਾਲੋਜੀਜ਼) 'ਤੇ ROCK ਇਨਿਹਿਬਟਰ Y-27632 (10 μM; S1049, Selleckchem) ਨਾਲ ਪੂਰਕ ਜ਼ਰੂਰੀ 8 ਮਾਧਿਅਮ ਵਿੱਚ ਪ੍ਰਤੀ ਖੂਹ 3 × 106 ਸਿੰਗਲ ਸੈੱਲਾਂ ਦੀ ਘਣਤਾ 'ਤੇ ਪਲੇਟ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ। 24 ਘੰਟਿਆਂ ਬਾਅਦ, ਖੂਹਾਂ ਵਿੱਚ ਮੀਡੀਆ ਨੂੰ ਉੱਪਰ ਅਤੇ ਹੇਠਾਂ ਪਾਈਪੇਟ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਜਿਸ ਵਿੱਚ ਐਸੈਂਸ਼ੀਅਲ 6 ਮੀਡੀਆ (A1516401, ਲਾਈਫ ਟੈਕਨਾਲੋਜੀਜ਼) ਡੋਰਸੋਮੋਰਫਾਈਨ (2.5 μM; P5499, ਸਿਗਮਾ-ਐਲਡਰਿਕ) ਅਤੇ SB-431542 (10 μM; 1614) ਨਾਲ ਪੂਰਕ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ। , ਟੋਕਰੀਡਾ)। ਦਿਨ 2 ਤੋਂ 6 ਤੱਕ, ਐਸੈਂਸ਼ੀਅਲ 6 ਮਾਧਿਅਮ ਨੂੰ ਰੋਜ਼ਾਨਾ ਡੋਰਸੋਮੋਰਫਾਈਨ ਅਤੇ ਪੂਰਕ SB-431542 ਨਾਲ ਬਦਲਿਆ ਗਿਆ ਸੀ। ਛੇਵੇਂ ਦਿਨ ਤੋਂ, ਨਿਊਰੋਸਫੀਅਰ ਸਸਪੈਂਸ਼ਨਾਂ ਨੂੰ ਨਿਊਰੋਬੇਸਲ ਮਾਧਿਅਮ ਵਿੱਚ ਤਬਦੀਲ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ ਅਤੇ ਉੱਪਰ ਦੱਸੇ ਅਨੁਸਾਰ ਬਣਾਈ ਰੱਖਿਆ ਗਿਆ ਸੀ।
ਸਾਰੀਆਂ ਜਾਨਵਰਾਂ ਦੀਆਂ ਪ੍ਰਕਿਰਿਆਵਾਂ ਸਟੈਨਫੋਰਡ ਯੂਨੀਵਰਸਿਟੀ ਲੈਬਾਰਟਰੀ ਐਨੀਮਲ ਕੇਅਰ ਐਡਮਿਨਿਸਟ੍ਰੇਟਿਵ ਕਮੇਟੀ (APLAC) ਦੁਆਰਾ ਪ੍ਰਵਾਨਿਤ ਜਾਨਵਰਾਂ ਦੀ ਦੇਖਭਾਲ ਦਿਸ਼ਾ-ਨਿਰਦੇਸ਼ਾਂ ਦੇ ਅਨੁਸਾਰ ਕੀਤੀਆਂ ਗਈਆਂ ਸਨ। ਗਰਭਵਤੀ ਯੂਥਾਈਮਿਕ RNU (rnu/+) ਚੂਹਿਆਂ ਨੂੰ (ਚਾਰਲਸ ਰਿਵਰ ਲੈਬਾਰਟਰੀਜ਼) ਖਰੀਦਿਆ ਗਿਆ ਸੀ ਜਾਂ ਰੱਖਿਆ ਗਿਆ ਸੀ। ਜਾਨਵਰਾਂ ਨੂੰ ਭੋਜਨ ਅਤੇ ਪਾਣੀ ਦੇ ਨਾਲ 12-ਘੰਟੇ ਦੇ ਹਲਕੇ-ਹਨੇਰੇ ਚੱਕਰ 'ਤੇ ਰੱਖਿਆ ਗਿਆ ਸੀ। ਤਿੰਨ ਤੋਂ ਸੱਤ ਦਿਨਾਂ ਦੀ ਉਮਰ ਦੇ ਨੰਗੇ (FOXN1–/–) ਚੂਹਿਆਂ ਦੇ ਕਤੂਰਿਆਂ ਨੂੰ ਕੱਟਣ ਤੋਂ ਪਹਿਲਾਂ ਅਪੂਰਣ ਮੁੱਛਾਂ ਦੇ ਵਾਧੇ ਦੁਆਰਾ ਪਛਾਣਿਆ ਗਿਆ ਸੀ। ਕਤੂਰੇ (ਨਰ ਅਤੇ ਮਾਦਾ) ਨੂੰ 2-3% ਆਈਸੋਫਲੂਰੇਨ ਨਾਲ ਬੇਹੋਸ਼ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ ਅਤੇ ਇੱਕ ਸਟੀਰੀਓਟੈਕਸਿਕ ਫਰੇਮ 'ਤੇ ਰੱਖਿਆ ਗਿਆ ਸੀ। ਡੂਰਾ ਮੈਟਰ ਦੀ ਇਕਸਾਰਤਾ ਨੂੰ ਬਣਾਈ ਰੱਖਦੇ ਹੋਏ S1 ਤੋਂ ਲਗਭਗ 2-3 ਮਿਲੀਮੀਟਰ ਦੇ ਵਿਆਸ ਵਾਲੀ ਖੋਪੜੀ ਦਾ ਟ੍ਰੇਪਨੇਸ਼ਨ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ। ਫਿਰ ਡੂਰਾ ਨੂੰ ਵਿੰਨ੍ਹਣ ਲਈ ਕ੍ਰੈਨੀਓਟੋਮੀ ਦੇ ਬਿਲਕੁਲ ਬਾਹਰ 30-G ਸੂਈ (ਲਗਭਗ 0.3 ਮਿਲੀਮੀਟਰ) ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰੋ। ਫਿਰ HCO ਨੂੰ ਇੱਕ ਪਤਲੇ 3×3 ਸੈਂਟੀਮੀਟਰ ਪੈਰਾਫਿਲਮ 'ਤੇ ਲਗਾਓ ਅਤੇ ਵਾਧੂ ਮਾਧਿਅਮ ਨੂੰ ਹਟਾਓ। 23 G, 45° ਸੂਈ ਨਾਲ ਜੁੜੀ ਹੈਮਿਲਟਨ ਸਰਿੰਜ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੇ ਹੋਏ, ਸੂਈ ਦੇ ਸਭ ਤੋਂ ਦੂਰ ਦੇ ਸਿਰੇ ਵਿੱਚ ਹੌਲੀ-ਹੌਲੀ hCO ਨੂੰ ਖਿੱਚੋ। ਫਿਰ ਸਰਿੰਜ ਨੂੰ ਸਟੀਰੀਓਟੈਕਸਿਕ ਡਿਵਾਈਸ ਨਾਲ ਜੁੜੇ ਸਰਿੰਜ ਪੰਪ 'ਤੇ ਲਗਾਓ। ਫਿਰ ਸੂਈ ਦੀ ਨੋਕ ਨੂੰ ਡੂਰਾ (z = 0 mm) ਵਿੱਚ ਪਹਿਲਾਂ ਬਣਾਏ ਗਏ 0.3 mm ਚੌੜੇ ਪੰਕਚਰ ਹੋਲ ਉੱਤੇ ਰੱਖੋ ਅਤੇ ਸਰਿੰਜ ਨੂੰ 1-2 mm (z = ਲਗਭਗ –1.5 mm) ਤੱਕ ਤੰਗ ਕਰੋ ਜਦੋਂ ਤੱਕ ਸੂਈ ਡੂਰਾ ਮੈਟਰ A ਦੇ ਵਿਚਕਾਰ ਨਾ ਆ ਜਾਵੇ। ਇੱਕ ਸੰਘਣੀ ਸੀਲ ਬਣ ਜਾਂਦੀ ਹੈ। ਫਿਰ ਸਰਿੰਜ ਨੂੰ z = -0.5 mm 'ਤੇ ਕੋਰਟੀਕਲ ਸਤਹ ਦੇ ਕੇਂਦਰ ਤੱਕ ਚੁੱਕੋ ਅਤੇ 1-2 µl ਪ੍ਰਤੀ ਮਿੰਟ ਦੀ ਦਰ ਨਾਲ hCO ਟੀਕਾ ਲਗਾਓ। hCO ਟੀਕਾ ਪੂਰਾ ਹੋਣ ਤੋਂ ਬਾਅਦ, ਸੂਈ ਨੂੰ 0.2-0.5 mm ਪ੍ਰਤੀ ਮਿੰਟ ਦੀ ਦਰ ਨਾਲ ਵਾਪਸ ਲਿਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ, ਚਮੜੀ ਨੂੰ ਸੀਨੇ ਨਾਲ ਲਗਾਇਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ, ਅਤੇ ਕਤੂਰੇ ਨੂੰ ਤੁਰੰਤ ਪੂਰੀ ਤਰ੍ਹਾਂ ਠੀਕ ਹੋਣ ਤੱਕ ਇੱਕ ਗਰਮ ਹੀਟਿੰਗ ਪੈਡ 'ਤੇ ਰੱਖਿਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ। ਕੁਝ ਜਾਨਵਰਾਂ ਨੂੰ ਦੁਵੱਲੇ ਤੌਰ 'ਤੇ ਟ੍ਰਾਂਸਪਲਾਂਟ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।
ਸਾਰੀਆਂ ਜਾਨਵਰਾਂ ਦੀਆਂ ਪ੍ਰਕਿਰਿਆਵਾਂ ਸਟੈਨਫੋਰਡ ਯੂਨੀਵਰਸਿਟੀ APLAC-ਪ੍ਰਵਾਨਿਤ ਜਾਨਵਰਾਂ ਦੀ ਦੇਖਭਾਲ ਦਿਸ਼ਾ-ਨਿਰਦੇਸ਼ਾਂ ਦੇ ਅਨੁਸਾਰ ਕੀਤੀਆਂ ਗਈਆਂ ਸਨ। ਚੂਹਿਆਂ (ਟ੍ਰਾਂਸਪਲਾਂਟੇਸ਼ਨ ਤੋਂ 60 ਦਿਨਾਂ ਤੋਂ ਵੱਧ) ਨੂੰ 5% ਆਈਸੋਫਲੂਰੇਨ ਅਨੱਸਥੀਸੀਆ ਨਾਲ ਪ੍ਰੇਰਿਤ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ ਅਤੇ ਇਮੇਜਿੰਗ ਦੌਰਾਨ 1-3% ਆਈਸੋਫਲੂਰੇਨ ਨਾਲ ਬੇਹੋਸ਼ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ। ਵਿਜ਼ੂਅਲਾਈਜ਼ੇਸ਼ਨ ਲਈ, ਇੱਕ 7 ਟੇਸਲਾ ਸਰਗਰਮੀ ਨਾਲ ਸ਼ੀਲਡ ਹਰੀਜੱਟਲ ਬੋਰਹੋਲ ਸਕੈਨਰ ਬਰੂਕਰ (ਬਰੂਕਰ ਕਾਰਪੋਰੇਸ਼ਨ) ਇੱਕ ਇੰਟਰਨੈਸ਼ਨਲ ਇਲੈਕਟ੍ਰਿਕ ਕੰਪਨੀ (IECO) ਗਰੇਡੀਐਂਟ ਡਰਾਈਵ ਦੇ ਨਾਲ, 120 ਮਿਲੀਮੀਟਰ (600 mT/m, 1000 T/m/s) ਦੇ ਅੰਦਰੂਨੀ ਵਿਆਸ ਵਾਲਾ ਇੱਕ ਸ਼ੀਲਡ ਗਰੇਡੀਐਂਟ ਇਨਸਰਟ AVANCE ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ ਵਰਤਿਆ ਗਿਆ ਸੀ। III, ਅੱਠ-ਚੈਨਲ ਮਲਟੀ-ਕੋਇਲ RF ਅਤੇ ਮਲਟੀ-ਕੋਰ ਸਮਰੱਥਾਵਾਂ, ਅਤੇ ਨਾਲ ਵਾਲਾ ਪੈਰਾਵਿਜ਼ਨ 6.0.1 ਪਲੇਟਫਾਰਮ। ਰਿਕਾਰਡਿੰਗ 86 ਮਿਲੀਮੀਟਰ ਦੇ ਅੰਦਰੂਨੀ ਵਿਆਸ ਵਾਲੇ ਇੱਕ ਸਰਗਰਮੀ ਨਾਲ ਡੀਕਪਲਡ ਵੋਲਯੂਮੈਟ੍ਰਿਕ RF ਕੋਇਲ ਅਤੇ ਸਿਰਫ਼ ਪ੍ਰਾਪਤ ਕਰਨ ਲਈ ਇੱਕ ਚਾਰ-ਚੈਨਲ ਕ੍ਰਾਇਓ-ਕੂਲਡ RF ਕੋਇਲ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ ਕੀਤੀ ਗਈ ਸੀ। ਐਕਸੀਅਲ 2D ਟਰਬੋ-RARE (ਦੁਹਰਾਓ ਸਮਾਂ = 2500 ms, ਈਕੋ ਸਮਾਂ = 33 ms, 2 ਔਸਤ) 16 ਸਲਾਈਸ ਕੈਪਚਰ ਦੇ ਨਾਲ, ਸਲਾਈਸ ਮੋਟਾਈ 0.6–0.8 mm, ਜਿਸ ਵਿੱਚ 256 × 256 ਨਮੂਨੇ ਹਨ। ਸਿਗਨਲ 2 ਸੈਂਟੀਮੀਟਰ (ਰੈਪਿਡ MR ਇੰਟਰਨੈਸ਼ਨਲ, LLC) ਦੇ ਅੰਦਰੂਨੀ ਵਿਆਸ ਵਾਲੇ ਇੱਕ ਕਵਾਡ੍ਰੈਚਰ ਟ੍ਰਾਂਸਸੀਵਰ ਵੌਲਯੂਮੈਟ੍ਰਿਕ RF ਕੋਇਲ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ ਪ੍ਰਾਪਤ ਕੀਤੇ ਗਏ ਸਨ। ਅੰਤ ਵਿੱਚ, 3D ਰੈਂਡਰਿੰਗ ਅਤੇ ਵਾਲੀਅਮ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਲਈ ਬਿਲਟ-ਇਨ ਇਮਾਰਿਸ (ਬਿਟਪਲੇਨ) ਸਤਹ ਅਨੁਮਾਨ ਫੰਕਸ਼ਨਾਂ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰੋ। ਇੱਕ ਸਫਲ ਟ੍ਰਾਂਸਪਲਾਂਟ ਨੂੰ ਇੱਕ ਵਜੋਂ ਪਰਿਭਾਸ਼ਿਤ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ ਜਿਸ ਵਿੱਚ ਟ੍ਰਾਂਸਪਲਾਂਟ ਕੀਤੇ ਗੋਲਾਕਾਰ ਵਿੱਚ ਨਿਰੰਤਰ T2-ਭਾਰ ਵਾਲੇ MRI ਸਿਗਨਲ ਦੇ ਖੇਤਰ ਬਣਾਏ ਗਏ ਸਨ। ਗ੍ਰਾਫਟ ਅਸਵੀਕਾਰ ਨੂੰ ਇੱਕ ਗ੍ਰਾਫਟ ਵਜੋਂ ਪਰਿਭਾਸ਼ਿਤ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ ਜੋ ਟ੍ਰਾਂਸਪਲਾਂਟ ਕੀਤੇ ਗੋਲਾਕਾਰ ਵਿੱਚ ਨਿਰੰਤਰ T2-ਭਾਰ ਵਾਲੇ MRI ਸਿਗਨਲ ਦੇ ਖੇਤਰ ਪੈਦਾ ਨਹੀਂ ਕਰਦਾ ਸੀ। ਸਬਕੋਰਟੀਕਲ t-hCO ਨੂੰ ਬਾਅਦ ਦੇ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਤੋਂ ਬਾਹਰ ਰੱਖਿਆ ਗਿਆ ਸੀ।
ਦੋ-ਫੋਟੋਨ ਕੈਲਸ਼ੀਅਮ ਇਮੇਜਿੰਗ ਲਈ hCO ਵਿੱਚ GCaMP6s ਨੂੰ ਸਥਿਰ ਰੂਪ ਵਿੱਚ ਪ੍ਰਗਟ ਕਰਨ ਲਈ, hiPS ਸੈੱਲਾਂ ਨੂੰ pLV[Exp]-EF1a::GcaMP6s-WPRE-Puro ਨਾਲ ਸੰਕਰਮਿਤ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ ਅਤੇ ਉਸ ਤੋਂ ਬਾਅਦ ਐਂਟੀਬਾਇਓਟਿਕਸ ਦੀ ਚੋਣ ਕੀਤੀ ਗਈ। ਸੰਖੇਪ ਵਿੱਚ, ਸੈੱਲਾਂ ਨੂੰ EDTA ਨਾਲ ਵੱਖ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ ਅਤੇ ਪੌਲੀਬ੍ਰੀਨ (5 μg/ml) ਅਤੇ 15 μl ਵਾਇਰਸ ਦੀ ਮੌਜੂਦਗੀ ਵਿੱਚ ਲਗਭਗ 300,000 ਸੈੱਲਾਂ ਦੀ ਘਣਤਾ 'ਤੇ 1 ਮਿਲੀਲੀਟਰ ਜ਼ਰੂਰੀ 8 ਮਾਧਿਅਮ ਵਿੱਚ ਮੁਅੱਤਲ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ। ਫਿਰ ਸੈੱਲਾਂ ਨੂੰ 60 ਮਿੰਟਾਂ ਲਈ ਸਸਪੈਂਸ਼ਨ ਵਿੱਚ ਇਨਕਿਊਬੇਟ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ ਅਤੇ ਪ੍ਰਤੀ ਖੂਹ 50,000 ਸੈੱਲਾਂ ਦੀ ਘਣਤਾ 'ਤੇ ਬੀਜਿਆ ਗਿਆ ਸੀ। ਸੰਗਮ ਤੋਂ ਬਾਅਦ, ਸੈੱਲਾਂ ਦਾ ਇਲਾਜ 5-10 ਦਿਨਾਂ ਲਈ ਜਾਂ ਸਥਿਰ ਕਲੋਨੀਆਂ ਦਿਖਾਈ ਦੇਣ ਤੱਕ 5-10 μg ml-1 puromycin ਨਾਲ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ। ਤੀਬਰ hCO ਇਨਫੈਕਸ਼ਨ ਪਹਿਲਾਂ ਦੱਸੇ ਅਨੁਸਾਰ 5 ਕੁਝ ਸੋਧਾਂ ਨਾਲ ਕੀਤੀ ਗਈ ਸੀ। ਸੰਖੇਪ ਵਿੱਚ, ਦਿਨ 30-45 hCO ਨੂੰ 1.5 ਮਿਲੀਲੀਟਰ ਐਪੇਨਡੋਰਫ ਮਾਈਕ੍ਰੋਸੈਂਟਰੀਫਿਊਜ ਟਿਊਬਾਂ ਵਿੱਚ ਟ੍ਰਾਂਸਫਰ ਕਰੋ ਜਿਸ ਵਿੱਚ 100 μl ਨਰਵ ਮਾਧਿਅਮ ਹੁੰਦਾ ਹੈ। ਫਿਰ ਲਗਭਗ 90 µl ਮਾਧਿਅਮ ਨੂੰ ਹਟਾ ਦਿੱਤਾ ਜਾਂਦਾ ਹੈ, 3-6 µl ਹਾਈ ਟਾਇਟਰ ਲੈਂਟੀਵਾਇਰਸ (0.5 x 108 ਤੋਂ 1.2 x 109 ਤੱਕ) ਟਿਊਬ ਵਿੱਚ ਜੋੜਿਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ, ਅਤੇ hCO ਨੂੰ 30 ਮਿੰਟਾਂ ਲਈ ਇਨਕਿਊਬੇਟਰ ਵਿੱਚ ਟ੍ਰਾਂਸਫਰ ਕੀਤਾ ਜਾਂਦਾ ਹੈ। ਫਿਰ ਹਰੇਕ ਟਿਊਬ ਵਿੱਚ 90-100 µl ਮਾਧਿਅਮ ਪਾਓ ਅਤੇ ਟਿਊਬਾਂ ਨੂੰ ਰਾਤ ਭਰ ਇਨਕਿਊਬੇਟਰ ਵਿੱਚ ਵਾਪਸ ਕਰ ਦਿਓ। ਅਗਲੇ ਦਿਨ, hCO ਨੂੰ ਘੱਟ ਅਟੈਚਮੈਂਟ ਪਲੇਟਾਂ ਵਿੱਚ ਤਾਜ਼ੇ ਨਰਵ ਮਾਧਿਅਮ ਵਿੱਚ ਟ੍ਰਾਂਸਫਰ ਕਰੋ। 7 ਦਿਨਾਂ ਬਾਅਦ, hCO ਨੂੰ ਇਨਫੈਕਸ਼ਨ ਗੁਣਵੱਤਾ ਦੇ ਵਿਜ਼ੂਅਲਾਈਜ਼ੇਸ਼ਨ ਅਤੇ ਮੁਲਾਂਕਣ ਲਈ 24-ਖੂਹ ਵਾਲੇ ਸ਼ੀਸ਼ੇ ਦੇ ਹੇਠਲੇ ਪਲੇਟਾਂ ਵਿੱਚ ਟ੍ਰਾਂਸਫਰ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ। pLV[Exp]-SYN1::EYFP-WPRE ਅਤੇ pLV[Exp]-SYN1::hChR2-EYFP-WPRE ਵੈਕਟਰਬਿਲਡਰ ਦੁਆਰਾ ਤਿਆਰ ਕੀਤੇ ਗਏ ਸਨ। ਲੈਂਟੀਵਾਇਰਸ ਜ਼ਿਆਦਾਤਰ ਪ੍ਰਯੋਗਾਂ ਵਿੱਚ ਵਰਤਿਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ ਕਿਉਂਕਿ ਇਹ ਹੋਸਟ ਜੀਨੋਮ ਵਿੱਚ ਏਕੀਕ੍ਰਿਤ ਹੁੰਦਾ ਹੈ, ਜਿਸ ਨਾਲ ਸੰਕਰਮਿਤ ਸੈੱਲ ਲਾਈਨਾਂ ਵਿੱਚ ਰਿਪੋਰਟਰ ਜੀਨ ਪ੍ਰਗਟਾਵੇ ਦੀ ਆਗਿਆ ਮਿਲਦੀ ਹੈ। ਰੇਬੀਜ਼ ਫਾਲੋ-ਅਪ ਲਈ, ਦਿਨ 30-45 hCO ਨੂੰ ਰੇਬੀਜ਼-ΔG-eGFP ਅਤੇ AAV-DJ-EF1a-CVS-G-WPRE-pGHpA (ਪਲਾਜ਼ਮੀਡ #67528, ਐਡਜੀਨ) ਨਾਲ ਸਹਿ-ਸੰਕਰਮਿਤ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ, 3 ਦਿਨਾਂ ਲਈ ਚੰਗੀ ਤਰ੍ਹਾਂ ਧੋਤਾ ਗਿਆ ਸੀ, ਅਤੇ S1 ਵਿੱਚ ਚੂਹਿਆਂ ਵਿੱਚ ਟ੍ਰਾਂਸਪਲਾਂਟ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ ਅਤੇ 7-14 ਦਿਨਾਂ ਲਈ ਵਿਵੋ ਵਿੱਚ ਰੱਖਿਆ ਗਿਆ ਸੀ।
ਇਮਯੂਨੋਸਾਈਟੋਕੈਮਿਸਟਰੀ ਲਈ, ਜਾਨਵਰਾਂ ਨੂੰ ਬੇਹੋਸ਼ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਅਤੇ PBS ਨਾਲ ਟ੍ਰਾਂਸਕਾਰਡਲੀ ਪਰਫਿਊਜ਼ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਜਿਸ ਤੋਂ ਬਾਅਦ 4% ਪੈਰਾਫਾਰਮਲਡੀਹਾਈਡ (PBS ਵਿੱਚ PFA; ਇਲੈਕਟ੍ਰੌਨ ਮਾਈਕ੍ਰੋਸਕੋਪੀ ਸਾਇੰਸਜ਼) ਦਿੱਤਾ ਗਿਆ। ਦਿਮਾਗ ਨੂੰ 4% PFA ਵਿੱਚ 2 ਘੰਟੇ ਜਾਂ ਰਾਤ ਭਰ 4°C 'ਤੇ ਫਿਕਸ ਕੀਤਾ ਗਿਆ, PBS ਵਿੱਚ 30% ਸੁਕਰੋਜ਼ ਵਿੱਚ 48-72 ਘੰਟਿਆਂ ਲਈ ਕ੍ਰਾਇਓਪ੍ਰੀਜ਼ਰਵ ਕੀਤਾ ਗਿਆ, ਅਤੇ 1:1, 30% ਸੁਕਰੋਜ਼ ਵਿੱਚ ਏਮਬੇਡ ਕੀਤਾ ਗਿਆ: OCT (ਟਿਸ਼ੂ-ਟੈਕ OCT ਕੰਪਾਊਂਡ 4583, ਸਾਕੁਰਾ ਫਿਨੇਟੈਕ) ਅਤੇ ਕੋਰੋਨਲ ਸੈਕਸ਼ਨ 30 µm 'ਤੇ ਕ੍ਰਾਇਓਸਟੈਟ (ਲੀਕਾ) ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ ਬਣਾਏ ਗਏ। ਮੋਟੇ ਸੈਕਸ਼ਨਾਂ ਦੀ ਇਮਯੂਨੋਹਿਸਟੋਕੈਮਿਸਟਰੀ ਲਈ, ਜਾਨਵਰਾਂ ਨੂੰ PBS ਨਾਲ ਪਰਫਿਊਜ਼ ਕੀਤਾ ਗਿਆ, ਅਤੇ ਦਿਮਾਗ ਨੂੰ ਵਾਈਬ੍ਰੇਟੋਮ (ਲੀਕਾ) ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ 300-400 µm 'ਤੇ ਕੱਟਿਆ ਗਿਆ ਅਤੇ ਕੋਰੋਨਲੀ ਸੈਕਸ਼ਨ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਅਤੇ ਭਾਗਾਂ ਨੂੰ 30 ਮਿੰਟਾਂ ਲਈ 4% PFA ਨਾਲ ਫਿਕਸ ਕੀਤਾ ਗਿਆ। ਫਿਰ ਕ੍ਰਾਇਓਸੈਕਸ਼ਨ ਜਾਂ ਮੋਟੇ ਹਿੱਸਿਆਂ ਨੂੰ ਪੀਬੀਐਸ ਨਾਲ ਧੋਤਾ ਗਿਆ, ਕਮਰੇ ਦੇ ਤਾਪਮਾਨ 'ਤੇ 1 ਘੰਟੇ ਲਈ ਬਲਾਕ ਕੀਤਾ ਗਿਆ (10% ਆਮ ਡੌਕਨ ਸੀਰਮ (ਐਨਡੀਐਸ) ਅਤੇ 0.3% ਟ੍ਰਾਈਟਨ ਐਕਸ-100 ਪੀਬੀਐਸ ਵਿੱਚ ਪਤਲਾ ਕੀਤਾ ਗਿਆ) ਅਤੇ 4°C 'ਤੇ ਬਲਾਕਿੰਗ ਘੋਲ ਨਾਲ ਬਲਾਕ ਕੀਤਾ ਗਿਆ। - ਇਨਕਿਊਬੇਸ਼ਨ ਕ੍ਰਾਇਓਸੈਕਸ਼ਨਾਂ ਨੂੰ ਰਾਤੋ-ਰਾਤ ਇਨਕਿਊਬੇਟ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਅਤੇ ਮੋਟੇ ਹਿੱਸਿਆਂ ਨੂੰ 5 ਦਿਨਾਂ ਲਈ ਇਨਕਿਊਬੇਟ ਕੀਤਾ ਗਿਆ। ਵਰਤੇ ਗਏ ਪ੍ਰਾਇਮਰੀ ਐਂਟੀਬਾਡੀਜ਼ ਸਨ: ਐਂਟੀ-ਨਿਊਐਨ (ਮੂਹਾ, 1:500; ab104224, ਐਬਕੈਮ) ਐਂਟੀ-ਸੀਟੀਆਈਪੀ2 (ਚੂਹਾ, 1:300; ab18465, ਐਬਕੈਮ), ਐਂਟੀ-ਜੀਐਫਏਪੀ (ਖਰਗੋਸ਼, 1:1,000; Z0334, ਡਾਕੋ), ਐਂਟੀ-ਜੀਐਫਪੀ (ਚਿਕਨ, 1:1,000; GTX13970, ਜੀਨਟੈਕਸ), ਐਂਟੀ-ਐਚਐਨਏ (ਮੂਹਾ, 1:200; ab191181, ਐਬਕੈਮ), ਐਂਟੀ-ਨਿਊਐਨ (ਖਰਗੋਸ਼, 1:500; ABN78, ਮਿਲੀਪੋਰ), ਐਂਟੀ-ਪੀਡੀਜੀਐਫਆਰਏ (ਖਰਗੋਸ਼, 1:200; ਐਸਸੀ-338, ਸੈਂਟਾ ਕਰੂਜ਼), ਐਂਟੀ-ਪੀਪੀਪੀ1ਆਰ17 (ਖਰਗੋਸ਼, 1:200; HPA047819, ਐਟਲਸ ਐਂਟੀਬਾਡੀਜ਼), ਐਂਟੀ-RECA-1 (ਮੂਹਾ, 1:50; ab9774, abcam), ਐਂਟੀ-SCG2 (ਖਰਗੋਸ਼, 1:100; 20357-1-AP, ਪ੍ਰੋਟੀਨਟੈਕ), ਐਂਟੀ-SOX9 (ਬੱਕਰੀ, 1:500; AF3075, R&D ਸਿਸਟਮ), Netrin G1a (ਬੱਕਰੀ, 1:100; AF1166, R&D ਸਿਸਟਮ), ਐਂਟੀ-STEM121 (ਮੂਹਾ, 1:200; Y40410, ਟਾਕਾਰਾ ਬਾਇਓ), ਐਂਟੀ-SATB2 (ਮੂਹਾ, 1:50; ab51502, abcam), ਐਂਟੀ-GAD65/67 (ਖਰਗੋਸ਼, 1:400; ABN904, ਮਿਲੀਪੋਰ) ਅਤੇ ਐਂਟੀ-IBA1 (ਬੱਕਰੀ, 1:100; ab5076, abcam)। ਵਰਤੇ ਗਏ ਪ੍ਰਾਇਮਰੀ ਐਂਟੀਬਾਡੀਜ਼ ਸਨ: ਐਂਟੀ-ਨਿਊਐਨ (ਮੂਹਾ, 1:500; ab104224, ਐਬਕੈਮ) ਐਂਟੀ-ਸੀਟੀਆਈਪੀ2 (ਚੂਹਾ, 1:300; ab18465, ਐਬਕੈਮ), ਐਂਟੀ-ਜੀਐਫਏਪੀ (ਖਰਗੋਸ਼, 1:1,000; Z0334, ਡਾਕੋ), ਐਂਟੀ-ਜੀਐਫਪੀ (ਚਿਕਨ, 1:1,000; GTX13970, ਜੀਨਟੈਕਸ), ਐਂਟੀ-ਐਚਐਨਏ (ਮੂਹਾ, 1:200; ab191181, ਐਬਕੈਮ), ਐਂਟੀ-ਨਿਊਐਨ (ਖਰਗੋਸ਼, 1:500; ABN78, ਮਿਲੀਪੋਰ), ਐਂਟੀ-ਪੀਡੀਜੀਐਫਆਰਏ (ਖਰਗੋਸ਼, 1:200; ਐਸਸੀ-338, ਸੈਂਟਾ ਕਰੂਜ਼), ਐਂਟੀ-ਪੀਪੀਪੀ1ਆਰ17 (ਖਰਗੋਸ਼, 1:200; HPA047819, ਐਟਲਸ ਐਂਟੀਬਾਡੀਜ਼), ਐਂਟੀ-RECA-1 (ਮੂਹਾ, 1:50; ab9774, abcam), ਐਂਟੀ-SCG2 (ਖਰਗੋਸ਼, 1:100; 20357-1-AP, ਪ੍ਰੋਟੀਨਟੈਕ), ਐਂਟੀ-SOX9 (ਬੱਕਰੀ, 1:500; AF3075, R&D ਸਿਸਟਮ), Netrin G1a (ਬੱਕਰੀ, 1:100; AF1166, R&D ਸਿਸਟਮ), ਐਂਟੀ-STEM121 (ਮੂਹਾ, 1:200; Y40410, ਟਾਕਾਰਾ ਬਾਇਓ), ਐਂਟੀ-SATB2 (ਮੂਹਾ, 1:50; ab51502, abcam), ਐਂਟੀ-GAD65/67 (ਖਰਗੋਸ਼, 1:400; ABN904, ਮਿਲੀਪੋਰ) ਅਤੇ ਐਂਟੀ-IBA1 (ਬੱਕਰੀ, 1:100; ab5076, abcam)। Использовались следующие первичные антитела: анти-NeuN (мышиные, 1:500; ab104224, abcam), анти-CTIP2 (крысиные, ab13), abcam; ANTI-GFAP (кроличьи, 1:1000; Z0334, Dako), анти- -GFP (курица, 1:1000; GTX13970, GeneTex), анти-HNA (мышь, 1:200; ab19-1900); (кролик, 1:500; ABN78, ਮਿਲੀਪੋਰ), ANTI-PDGFRA (кролик, 1:200; sc-338, SANTA-KRUZ), ANTI-PPP1R17 (кролик, 1:200; HPA047819, ਐਟਲਸ ਐਂਟੀਬਾਡੀਜ਼), ANTI-RECA-1 (мышь,74), abcam9; ANTI-SCG2 (кролик , 1:100; 20357-1-AP, Proteintech), ANTI-SOX9 (ਕੋਜ਼ੀ, 1:500; AF3075, R&D ਸਿਸਟਮ), нетрин G1a (ਕੋਜ਼ੀ, 1:100, R166; ਸਿਸਟਮ), ANTI-STEM121 (мышиный , 1:200; Y40410, Takara Bio), анти-SATB2 (мышь, 1:50; ab51502, abcam), анти-GAD65/67 (кролик, 1:400; ABN904, Millipore) ਅਤੇ анти-IBA1 (коза, 1 :100; абкама 6м 67)। ਵਰਤੇ ਗਏ ਪ੍ਰਾਇਮਰੀ ਐਂਟੀਬਾਡੀਜ਼ ਸਨ: ਐਂਟੀ-ਨਿਊਐਨ (ਮੂਹਾ, 1:500; ab104224, ਐਬਕੈਮ), ਐਂਟੀ-ਸੀਟੀਆਈਪੀ2 (ਚੂਹਾ, 1:300; ab18465, ਐਬਕੈਮ), ਐਂਟੀ-ਜੀਐਫਏਪੀ (ਖਰਗੋਸ਼, 1:1000; Z0334, ਡਾਕੋ), ਐਂਟੀ-ਜੀਐਫਪੀ (ਚਿਕਨ, 1:1000; GTX13970, ਜੀਨਟੈਕਸ), ਐਂਟੀ-ਐਚਐਨਏ (ਮੂਹਾ, 1:200; ab191181, ਐਬਕੈਮ), ਐਂਟੀ-ਨਿਊਐਨ (ਖਰਗੋਸ਼, 1:500; ABN78, ਮਿਲੀਪੋਰ), ਐਂਟੀ-ਪੀਡੀਜੀਐਫਆਰਏ (ਖਰਗੋਸ਼, 1:200; sc-338, ਸੈਂਟਾ ਕਰੂਜ਼), ਐਂਟੀ-ਪੀਪੀਪੀ1ਆਰ17 (ਖਰਗੋਸ਼, 1:200; HPA047819, ਐਟਲਸ ਐਂਟੀਬਾਡੀਜ਼), ਐਂਟੀ-RECA-1 (ਮੂਹਾ, 1:50; ab9774, abcam), ਐਂਟੀ- SCG2 (ਖਰਗੋਸ਼, 1:100; 20357-1-AP, ਪ੍ਰੋਟੀਨਟੈਕ), ਐਂਟੀ-SOX9 (ਬੱਕਰੀ, 1:500; AF3075, R&D ਸਿਸਟਮ), ਨੇਟਰਿਨ G1a (ਬੱਕਰੀ, 1:100; AF1166, R&D ਸਿਸਟਮ), ਐਂਟੀ- STEM121 (ਮੂਹਾ, 1:200; Y40410, ਟਾਕਾਰਾ ਬਾਇਓ), ਐਂਟੀ-SATB2 (ਮੂਹਾ, 1:50; ab51502, abcam), ਐਂਟੀ-GAD65/67 (ਖਰਗੋਸ਼, 1:400; ABN904, ਮਿਲੀਪੋਰ) ਅਤੇ ਐਂਟੀ-IBA1 (ਬੱਕਰੀ, 1:100; ab5076, abkam)।使用的一抗是：抗NeuN（小鼠，1:500；ab104224，abcam）抗CTIP2（大鼠,1:3 00；ab18465，abcam），抗GFAP（兔,1:1,000；Z0334,ਡਾਕੋ）,抗-GF P（鸡，1:1,000；GTX13970，GeneTex）,抗HNA（小鼠,1:200；ab1911 81,abcam）,抗NeuN（兔,1:500；ABN78,ਮਿਲੀਪੁਰ）,抗PDGFRA（兔, 1:200；sc-338，Santa Cruz），抗PPP1R17（兔,1:200；HPA047819, ਐਟਲਸ抗体）,抗RECA-1（小鼠,1:50；ab9774,abcam）,抗SCG2（兔）, 1:100；20357-1-AP，ਪ੍ਰੋਟੀਨਟੈਕ），抗SOX9（山羊，1:500；AF3075，R&D Systems），Netrin G1a（山羊，1:100；AF1166，R&D. ਸਿਸਟਮ），抗STEM121（小鼠, 1:200;使用的一抗是：抗NeuN（小鼠，1:500；ab104224，abcam）抗CTIP2（大鼠，1 :300；ab18465，abcam），抗GFAP（兔,1:1,000；Z0334,ਡਾਕੋ）,抗-GFP（鸡，1:1,000；GTX13970，GeneTex）,抗HNA（小鼠,1:200；ab 191181, abcam）,抗NeuN（兔,1:500;ABN78,ਮਿਲੀਪੁਰ％弔,抗1: 200;sc-338, ਸੈਂਟਾ ਕਰੂਜ਼), 抗PPP1R17（兔，1:200；HPA047819, ਐਟਲਸ 抗体）,抗RECA-1（小鼠,1:50；ab9774,abcam）,抗SCG2 100；20357-1-AP，ਪ੍ਰੋਟੀਨਟੈਕ），抗SOX9（山羊,1:500；AF3075,R&D ਸਿਸਟਮ），Netrin G1a（山羊，1:100；AF1166）,R&0s:1166;R&0;Y40410, ਟਾਕਾਰਾ ਬਾਇਓ), ਐਂਟੀ-SATB2 (ਮੂਹਾ, 1:50; ab51502, abcam), ਐਂਟੀ-GAD65/67 (ਖਰਗੋਸ਼, 1:400; ABN904, ਮਿਲੀਪੋਰ) ਅਤੇ ਐਂਟੀ-IBA1 (ਬੱਕਰੀ, 1:100; ab5076, abcam)।ਵਰਤੇ ਗਏ ਪ੍ਰਾਇਮਰੀ ਐਂਟੀਬਾਡੀਜ਼ ਸਨ: ਐਂਟੀ-ਨਿਊਐਨ (ਮੂਹਾ, 1:500; ab104224, abcam), ਐਂਟੀ-CTIP2 (ਚੂਹਾ, 1:300; ab18465, abcam), ਐਂਟੀ-GFAP (ਖਰਗੋਸ਼, 1:1000; Z0334, ਡਾਕੋ)। , ਐਂਟੀ-GFP (ਚਿਕਨ, 1:1000; GTX13970, GeneTex), ਐਂਟੀ-HNA (ਮੂਹਾ, 1:200; ab191181, abcam), ਐਂਟੀ-NeuN (ਖਰਗੋਸ਼, 1:500; ABN78, ਮਿਲੀਪੋਰ), ਐਂਟੀ-PDGFRA (ਖਰਗੋਸ਼, 1:200; sc-338, ਸੈਂਟਾ ਕਰੂਜ਼), ਐਂਟੀ-PPP1R17 (ਖਰਗੋਸ਼, 1:200; HPA047819, ਐਟਲਸ ਐਂਟੀਬਾਡੀ), ਐਂਟੀ-RECA-1 (ਮੂਹਾ, 1:50; ab9774, abcam), ਐਂਟੀ-SCG2 (ਖਰਗੋਸ਼), 1:100;20357-1-AP, ਪ੍ਰੋਟੀਨਟੈਕ), ANTI-SOX9 (ਕੋਜ਼ਾ, 1:500; AF3075, R&D ਸਿਸਟਮ), NETRIN G1a (koza, 1:100; AF1166, R&D ਸਿਸਟਮ), ANTI-STEM121, 4021; ਟਾਕਾਰਾ ਬਾਇਓ), анти-SATB2 (мышь, 1:50; ab51502, abcam), анти-GAD65/67 (кролик, 1:400; ABN904, Millipore) и анти-IBA1 (коза, 1:100, бама6); 20357-1-AP, ਪ੍ਰੋਟੀਨਟੈਕ), ਐਂਟੀ-SOX9 (ਬੱਕਰੀ, 1:500; AF3075, R&D ਸਿਸਟਮ), Netrin G1a (ਬੱਕਰੀ, 1:100; AF1166, R&D ਸਿਸਟਮ), ਐਂਟੀ-STEM121 (ਮੂਹਾ, 1:200; Y40410, ਟਾਕਾਰਾ ਬਾਇਓ), ਐਂਟੀ-SATB2 (ਮੂਹਾ, 1:50; ab51502, abcam), ਐਂਟੀ-GAD65/67 (ਖਰਗੋਸ਼, 1:400; ABN904, ਮਿਲੀਪੋਰ), ਅਤੇ ਐਂਟੀ-IBA1 (ਬੱਕਰੀ, 1:100; ab5076, abkam)।ਫਿਰ ਭਾਗਾਂ ਨੂੰ PBS ਨਾਲ ਧੋਤਾ ਗਿਆ ਅਤੇ ਸੈਕੰਡਰੀ ਐਂਟੀਬਾਡੀ ਨਾਲ ਕਮਰੇ ਦੇ ਤਾਪਮਾਨ (ਜੰਮੇ ਹੋਏ ਭਾਗ) 'ਤੇ 1 ਘੰਟੇ ਲਈ ਜਾਂ 4°C (ਮੋਟੇ ਭਾਗ) 'ਤੇ ਰਾਤ ਭਰ ਲਈ ਪ੍ਰਫੁੱਲਤ ਕੀਤਾ ਗਿਆ। ਅਲੈਕਸਾ ਫਲੋਰ ਸੈਕੰਡਰੀ ਐਂਟੀਬਾਡੀ (ਲਾਈਫ ਟੈਕਨਾਲੋਜੀਜ਼) ਨੂੰ ਬਲਾਕਿੰਗ ਘੋਲ ਵਿੱਚ 1:1000 ਪਤਲਾ ਕੀਤਾ ਗਿਆ। PBS ਨਾਲ ਧੋਣ ਤੋਂ ਬਾਅਦ, ਨਿਊਕਲੀਅਸ ਨੂੰ ਹੋਚਸਟ 33258 (ਲਾਈਫ ਟੈਕਨਾਲੋਜੀਜ਼) ਨਾਲ ਵਿਜ਼ੂਅਲਾਈਜ਼ ਕੀਤਾ ਗਿਆ। ਅੰਤ ਵਿੱਚ, ਸਲਾਈਡਾਂ ਨੂੰ ਇੱਕ ਐਕੁਆਮਾਊਂਟ (ਪੋਲੀਸਾਇੰਸ) ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੇ ਹੋਏ ਕਵਰਲਿਪਸ (ਫਿਸ਼ਰ ਸਾਇੰਟਿਫਿਕ) ਦੇ ਨਾਲ ਇੱਕ ਮਾਈਕ੍ਰੋਸਕੋਪ 'ਤੇ ਰੱਖਿਆ ਗਿਆ ਅਤੇ ਚਿੱਤਰ 'ਤੇ ਇੱਕ ਕੀਏਂਸ ਫਲੋਰੋਸੈਂਟ ਮਾਈਕ੍ਰੋਸਕੋਪ (BZ-X ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਕ) ਜਾਂ ਇੱਕ ਲੀਕਾ TCS SP8 ਕਨਫੋਕਲ ਮਾਈਕ੍ਰੋਸਕੋਪ (ਲਾਸ-X) 'ਤੇ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਕੀਤਾ ਗਿਆ। ਚਿੱਤਰਾਂ ਨੂੰ ImageJ ਪ੍ਰੋਗਰਾਮ (Fiji) ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ ਪ੍ਰੋਸੈਸ ਕੀਤਾ ਗਿਆ। t-hCO ਅਤੇ ਚੂਹੇ ਦੇ ਕਾਰਟੈਕਸ ਵਿੱਚ ਮਨੁੱਖੀ ਨਿਊਰੋਨਸ ਦੇ ਅਨੁਪਾਤ ਨੂੰ ਮਾਪਣ ਲਈ, 387.5 μm ਚੌੜੀਆਂ ਆਇਤਾਕਾਰ ਤਸਵੀਰਾਂ t-hCO ਦੇ ਕੇਂਦਰ ਵਿੱਚ, ਚੂਹੇ ਦੇ ਕਾਰਟੈਕਸ ਦੇ ਕਿਨਾਰੇ 'ਤੇ ਜਾਂ ਨੇੜੇ ਲਈਆਂ ਗਈਆਂ। ਗ੍ਰਾਫ਼ਟ ਹਾਸ਼ੀਏ ਟਿਸ਼ੂ ਪਾਰਦਰਸ਼ਤਾ, HNA+ ਨਿਊਕਲੀਅਸ, ਅਤੇ/ਜਾਂ ਟਿਸ਼ੂ ਆਟੋਫਲੋਰੇਸੈਂਸ ਦੀ ਮੌਜੂਦਗੀ ਵਿੱਚ ਤਬਦੀਲੀਆਂ ਦਾ ਮੁਲਾਂਕਣ ਕਰਕੇ ਨਿਰਧਾਰਤ ਕੀਤੇ ਗਏ ਸਨ। ਹਰੇਕ ਚਿੱਤਰ ਵਿੱਚ, NeuN+ ਅਤੇ HNA+ ਸੈੱਲਾਂ ਦੀ ਕੁੱਲ ਸੰਖਿਆ ਨੂੰ ਉਸੇ ਖੇਤਰ ਵਿੱਚ NeuN+ ਸੈੱਲਾਂ ਦੀ ਕੁੱਲ ਸੰਖਿਆ ਨਾਲ ਵੰਡਿਆ ਗਿਆ ਸੀ। ਇਹ ਯਕੀਨੀ ਬਣਾਉਣ ਲਈ ਕਿ ਚਿੱਤਰ ਸਮਤਲ ਵਿੱਚ ਸਿਰਫ਼ ਨਿਊਕਲੀਅਸ ਵਾਲੇ ਸੈੱਲਾਂ ਦੀ ਗਿਣਤੀ ਕੀਤੀ ਜਾਵੇ, ਸਿਰਫ਼ ਉਹ ਸੈੱਲ ਜੋ Hoechst+ ਵੀ ਹਨ, ਗਣਨਾ ਵਿੱਚ ਸ਼ਾਮਲ ਕੀਤੇ ਗਏ ਹਨ। ਅੰਕੜਾਤਮਕ ਗਲਤੀ ਨੂੰ ਘਟਾਉਣ ਲਈ ਘੱਟੋ-ਘੱਟ 1 ਮਿਲੀਮੀਟਰ ਨਾਲ ਵੱਖ ਕੀਤੇ ਦੋ ਚਿੱਤਰਾਂ ਦਾ ਔਸਤ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।
ਨਮੂਨਾ ਇਕੱਠਾ ਕਰਨ ਤੋਂ ਇੱਕ ਹਫ਼ਤਾ ਪਹਿਲਾਂ, hCO ਟ੍ਰਾਂਸਪਲਾਂਟ ਜਾਨਵਰਾਂ (ਲਗਭਗ 8 ਮਹੀਨਿਆਂ ਦੇ ਵਿਭਿੰਨਤਾ) ਨੂੰ ਇੱਕ ਹਨੇਰੇ ਕਮਰੇ ਵਿੱਚ ਰੱਖੋ ਜਿਸ ਵਿੱਚ ਸੰਵੇਦੀ ਉਤੇਜਨਾ ਨੂੰ ਘੱਟ ਤੋਂ ਘੱਟ ਕਰਨ ਲਈ ਮੁੱਛਾਂ ਨੂੰ ਕੱਟਿਆ ਗਿਆ ਹੋਵੇ। ਨਿਊਕਲੀਅਸ ਦਾ ਆਈਸੋਲੇਸ਼ਨ ਪਹਿਲਾਂ ਦੱਸੇ ਅਨੁਸਾਰ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ, ਕੁਝ ਸੋਧਾਂ ਦੇ ਨਾਲ। ਸੰਖੇਪ ਵਿੱਚ, t-hCO ਅਤੇ hCO ਨੂੰ ਡਿਟਰਜੈਂਟ-ਮਕੈਨੀਕਲ ਸੈੱਲ ਲਾਈਸਿਸ ਅਤੇ 2 ਮਿਲੀਲੀਟਰ ਗਲਾਸ ਟਿਸ਼ੂ ਗ੍ਰਾਈਂਡਰ (D8938, ਸਿਗਮਾ-ਐਲਡਰਿਕ/ਕਿਮਬਲ) ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ ਨਸ਼ਟ ਕਰ ਦਿੱਤਾ ਗਿਆ। ਫਿਰ ਕੱਚੇ ਨਿਊਕਲੀਅਸ ਨੂੰ 40 µm ਫਿਲਟਰ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ ਫਿਲਟਰ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਅਤੇ ਸੁਕਰੋਜ਼ ਘਣਤਾ ਗਰੇਡੀਐਂਟ ਕਰਨ ਤੋਂ ਪਹਿਲਾਂ 4 °C 'ਤੇ 10 ਮਿੰਟ ਲਈ 320 ਗ੍ਰਾਮ 'ਤੇ ਸੈਂਟਰਿਫਿਊਜ ਕੀਤਾ ਗਿਆ। ਸੈਂਟਰਿਫਿਊਗੇਸ਼ਨ ਪੜਾਅ (4°C 'ਤੇ 20 ਮਿੰਟ ਲਈ 320 ਗ੍ਰਾਮ) ਤੋਂ ਬਾਅਦ, ਨਮੂਨਿਆਂ ਨੂੰ 0.04% BSA/PBS ਵਿੱਚ µl-1 RNase ਇਨਿਹਿਬਟਰ (40 u µl-1, AM2682, ਐਂਬੀਅਨ) ਦੇ 0.2 ਯੂਨਿਟਾਂ ਦੇ ਜੋੜ ਨਾਲ ਦੁਬਾਰਾ ਸਸਪੈਂਡ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਅਤੇ 40 µm ਫਲੋ ਫਿਲਟਰ ਵਿੱਚੋਂ ਲੰਘਾਇਆ ਗਿਆ। ਫਿਰ ਵੱਖ ਕੀਤੇ ਨਿਊਕਲੀਅਸ ਨੂੰ 0.02% BSA ਵਾਲੇ PBS ਵਿੱਚ ਦੁਬਾਰਾ ਸਸਪੈਂਡ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਅਤੇ ਇੱਕ ਕ੍ਰੋਮੀਅਮ ਸਿੰਗਲ ਸੈੱਲ 3′ ਚਿੱਪ (ਪ੍ਰਤੀ ਲੇਨ 8,000 ਸੈੱਲਾਂ ਦੀ ਅਨੁਮਾਨਿਤ ਰਿਕਵਰੀ) ਉੱਤੇ ਲੋਡ ਕੀਤਾ ਗਿਆ। snRNA-seq ਲਾਇਬ੍ਰੇਰੀਆਂ ਨੂੰ Chromium ਸਿੰਗਲ ਸੈੱਲ 3′ GEM, ਲਾਇਬ੍ਰੇਰੀ ਅਤੇ ਜੈੱਲ ਬੀਡ ਕਿੱਟ v3 (10x ਜੀਨੋਮਿਕਸ) ਨਾਲ ਤਿਆਰ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ। snRNA-seq ਲਾਇਬ੍ਰੇਰੀਆਂ ਨੂੰ Chromium ਸਿੰਗਲ ਸੈੱਲ 3′ GEM, ਲਾਇਬ੍ਰੇਰੀ ਅਤੇ ਜੈੱਲ ਬੀਡ ਕਿੱਟ v3 (10x ਜੀਨੋਮਿਕਸ) ਨਾਲ ਤਿਆਰ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ। Библиотеки snRNA-seq были приготовлены с помощью Chromium ਸਿੰਗਲ ਸੈੱਲ 3′ GEM, ਲਾਇਬ੍ਰੇਰੀ ਅਤੇ ਜੈੱਲ ਬੀਡ ਕਿੱਟ v3 (10x ਜੀਨੋਮਿਕਸ)। snRNA-seq ਲਾਇਬ੍ਰੇਰੀਆਂ ਨੂੰ Chromium ਸਿੰਗਲ ਸੈੱਲ 3′ GEM, ਲਾਇਬ੍ਰੇਰੀ ਅਤੇ ਜੈੱਲ ਬੀਡ ਕਿੱਟ v3 (10x ਜੀਨੋਮਿਕਸ) ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ ਤਿਆਰ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ। snRNA-seq 文库是使用Chromium ਸਿੰਗਲ ਸੈੱਲ 3′ GEM、Library & Gel Bead Kit v3 (10x ਜੀਨੋਮਿਕਸ) 制备的. snRNA-seq 文库是使用Chromium ਸਿੰਗਲ ਸੈੱਲ 3′ GEM、Library & Gel Bead Kit v3 (10x ਜੀਨੋਮਿਕਸ) 制备的. Библиотеку snRNA-seq готовили с использованием Chromium ਸਿੰਗਲ ਸੈੱਲ 3′ GEM, ਲਾਇਬ੍ਰੇਰੀ ਅਤੇ ਜੈੱਲ ਬੀਡ ਕਿੱਟ v3 (10x ਜੀਨੋਮਿਕਸ)। snRNA-seq ਲਾਇਬ੍ਰੇਰੀ ਨੂੰ Chromium Single Cell 3′ GEM, ਲਾਇਬ੍ਰੇਰੀ ਅਤੇ ਜੈੱਲ ਬੀਡ ਕਿੱਟ v3 (10x ਜੀਨੋਮਿਕਸ) ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ ਤਿਆਰ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।ਵੱਖ-ਵੱਖ ਨਮੂਨਿਆਂ ਦੀਆਂ ਲਾਇਬ੍ਰੇਰੀਆਂ ਨੂੰ ਐਡਮੇਰਾ ਹੈਲਥ ਦੁਆਰਾ ਨੋਵਾਸੇਕ ਐਸ4 (ਇਲੂਮੀਨਾ) 'ਤੇ ਇਕੱਠਾ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਅਤੇ ਕ੍ਰਮਬੱਧ ਕੀਤਾ ਗਿਆ।
ਹਰੇਕ ਪੁਟੇਟਿਵ ਨਿਊਕਲੀਅਰ ਬਾਰਕੋਡ ਲਈ ਜੀਨ ਪ੍ਰਗਟਾਵੇ ਦੇ ਪੱਧਰਾਂ ਨੂੰ 10x ਜੀਨੋਮਿਕਸ ਸੈਲਰੇਂਜਰ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਸਾਫਟਵੇਅਰ ਪੈਕੇਜ (ਵਰਜਨ 6.1.2) ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ ਮਾਪਿਆ ਗਿਆ ਸੀ। ਖਾਸ ਤੌਰ 'ਤੇ, ਰੀਡਾਂ ਨੂੰ ਮਨੁੱਖੀ (GRCh38, ਐਨਸੈਂਬਲ, ਵਰਜਨ 98) ਅਤੇ ਚੂਹੇ (Rnor_6.0, ਐਨਸੈਂਬਲ, ਵਰਜਨ 100) ਸੰਦਰਭ ਜੀਨੋਮ ਦੇ ਸੁਮੇਲ ਨਾਲ ਮੇਲਿਆ ਗਿਆ ਸੀ ਜੋ mkref ਕਮਾਂਡ ਨਾਲ ਬਣਾਏ ਗਏ ਸਨ ਅਤੇ -include-introns=TRUE ਕਮਾਂਡ ਨਾਲ ਗਿਣਤੀ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ ਮਾਤਰਾ ਵਿੱਚ ਇੰਟਰੋਨ ਖੇਤਰਾਂ ਵਿੱਚ ਮੈਪ ਕੀਤੀਆਂ ਰੀਡਿੰਗਾਂ ਸ਼ਾਮਲ ਸਨ। t-hCO ਨਮੂਨਿਆਂ ਲਈ, ਮਨੁੱਖੀ ਨਿਊਕਲੀਅਸ ਦੀ ਪਛਾਣ ਇਸ ਰੂੜੀਵਾਦੀ ਲੋੜ ਦੇ ਅਧਾਰ ਤੇ ਕੀਤੀ ਗਈ ਸੀ ਕਿ ਸਾਰੇ ਮੈਪ ਕੀਤੇ ਰੀਡਾਂ ਵਿੱਚੋਂ ਘੱਟੋ ਘੱਟ 95% ਮਨੁੱਖੀ ਜੀਨੋਮ ਨਾਲ ਮੇਲ ਖਾਂਦੇ ਹਨ। ਬਾਅਦ ਦੇ ਸਾਰੇ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ R ਪੈਕੇਜ (ਵਰਜਨ 4.1.2) ਸੇਉਰਾਟ (ਵਰਜਨ 4.1.1)32 ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੇ ਹੋਏ ਸੈਲਰੇਂਜਰ ਤੋਂ ਫਿਲਟਰ ਕੀਤੇ ਬਾਰਕੋਡ ਐਰੇ ਆਉਟਪੁੱਟ 'ਤੇ ਕੀਤੇ ਗਏ ਸਨ।
ਇਹ ਯਕੀਨੀ ਬਣਾਉਣ ਲਈ ਕਿ ਬਾਅਦ ਦੇ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਵਿੱਚ ਸਿਰਫ਼ ਉੱਚ-ਗੁਣਵੱਤਾ ਵਾਲੇ ਨਿਊਕਲੀਅਸ ਹੀ ਸ਼ਾਮਲ ਕੀਤੇ ਜਾਣ, ਹਰੇਕ ਨਮੂਨੇ ਲਈ ਇੱਕ ਦੁਹਰਾਉਣ ਵਾਲੀ ਫਿਲਟਰਿੰਗ ਪ੍ਰਕਿਰਿਆ ਲਾਗੂ ਕੀਤੀ ਗਈ ਸੀ। ਪਹਿਲਾਂ, 1000 ਤੋਂ ਘੱਟ ਵਿਲੱਖਣ ਜੀਨਾਂ ਵਾਲੇ ਘੱਟ-ਗੁਣਵੱਤਾ ਵਾਲੇ ਨਿਊਕਲੀਅਸ ਅਤੇ ਕੁੱਲ ਮਾਈਟੋਕੌਂਡਰੀਆ ਦੇ 20% ਤੋਂ ਵੱਧ ਦੀ ਪਛਾਣ ਕੀਤੀ ਜਾਂਦੀ ਹੈ ਅਤੇ ਹਟਾ ਦਿੱਤੀ ਜਾਂਦੀ ਹੈ। ਇਸ ਤੋਂ ਬਾਅਦ, ਕੱਚੇ ਜੀਨ ਨੰਬਰ ਮੈਟ੍ਰਿਕਸ ਨੂੰ sctransform(vst.flavor=”v2″) ਫੰਕਸ਼ਨ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ ਨਿਯਮਤ ਨੈਗੇਟਿਵ ਬਾਇਨੋਮੀਅਲ ਰਿਗਰੈਸ਼ਨ ਦੁਆਰਾ ਆਮ ਬਣਾਇਆ ਗਿਆ ਸੀ, ਜਿਸਨੇ ਡਿਫਾਲਟ ਪੈਰਾਮੀਟਰਾਂ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੇ ਹੋਏ 3000 ਸਭ ਤੋਂ ਵੱਧ ਵੇਰੀਏਬਲ ਜੀਨਾਂ ਦੀ ਪਛਾਣ ਵੀ ਕੀਤੀ। ਪ੍ਰਿੰਸੀਪਲ ਕੰਪੋਨੈਂਟ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ (PCA) ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੇ ਹੋਏ ਉੱਪਰਲੇ ਵੇਰੀਏਬਲ ਜੀਨਾਂ 'ਤੇ ਡਾਇਮੈਂਸ਼ਨ ਰਿਡਕਸ਼ਨ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ ਜਿਸ ਵਿੱਚ ਡਿਫਾਲਟ ਪੈਰਾਮੀਟਰਾਂ ਦੀ ਵਰਤੋਂ 30 ਦੇ ਡੇਟਾ ਸੈੱਟ ਡਾਇਮੈਂਸ਼ਨ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕੀਤੀ ਗਈ ਸੀ (ਡਿਮਸ = 30 ਗੋਡਿਆਂ ਦੀਆਂ ਸਾਈਟਾਂ ਦੇ ਵਿਜ਼ੂਅਲ ਨਿਰੀਖਣ ਦੇ ਅਧਾਰ ਤੇ ਚੁਣਿਆ ਗਿਆ ਸੀ ਅਤੇ ਸਾਰੇ ਨਮੂਨਿਆਂ ਅਤੇ ਐਨਸੈਂਬਲ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣਾਂ ਲਈ ਵਰਤਿਆ ਗਿਆ ਸੀ)। ਫਿਰ ਅਸੀਂ ਘੱਟ ਗੁਣਵੱਤਾ ਵਾਲੇ ਪੁਟੇਟਿਵ ਸੈੱਲਾਂ ਦੀ ਪਛਾਣ ਕਰਨ ਅਤੇ ਹਟਾਉਣ ਲਈ ਅਸਧਾਰਨ ਤੌਰ 'ਤੇ ਘੱਟ ਜੀਨ ਗਿਣਤੀ (10ਵੇਂ ਪ੍ਰਤੀਸ਼ਤ ਤੋਂ ਹੇਠਾਂ ਮੱਧਮਾਨ), ਅਸਧਾਰਨ ਤੌਰ 'ਤੇ ਉੱਚ ਮਾਈਟੋਕੌਂਡਰੀਅਲ ਜੀਨ ਗਿਣਤੀ (95ਵੇਂ ਪ੍ਰਤੀਸ਼ਤ ਤੋਂ ਉੱਪਰ ਮੱਧਮਾਨ) ਦੇ ਅਧਾਰ ਤੇ ਜੀਨਾਂ ਨੂੰ ਸ਼੍ਰੇਣੀਬੱਧ ਕਰਨ ਲਈ ਦੁਹਰਾਉਣ ਵਾਲੇ ਕਲੱਸਟਰਿੰਗ (ਰੈਜ਼ੋਲਿਊਸ਼ਨ = 1) ਦੇ ਕਈ ਦੌਰ ਕੀਤੇ। ਕਲੱਸਟਰ ਅਤੇ/ਜਾਂ ਸ਼ੱਕੀ ਜੁੜਵਾਂ ਬੱਚਿਆਂ ਦਾ ਇੱਕ ਉੱਚ ਅਨੁਪਾਤ ਜੋ DoubletFinder33 ਪੈਕੇਜ (95ਵੇਂ ਪ੍ਰਤੀਸ਼ਤ ਤੋਂ ਉੱਪਰ DoubletFinder ਸਕੋਰ) ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ ਪਛਾਣਿਆ ਗਿਆ ਹੈ। t-hCO ਨਮੂਨੇ (n=3) ਅਤੇ hCO ਨਮੂਨੇ (n=3) ਨੂੰ ਵੱਖਰੇ ਤੌਰ 'ਤੇ ਏਕੀਕ੍ਰਿਤ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ। ਉਪਰੋਕਤ ਪੈਰਾਮੀਟਰਾਂ ਨਾਲ ਏਕੀਕ੍ਰਿਤ ਡੇਟਾ ਫੰਕਸ਼ਨ। ਫਿਰ ਉੱਪਰ ਦੱਸੇ ਅਨੁਸਾਰ ਏਕੀਕ੍ਰਿਤ ਡੇਟਾ ਸੈੱਟ ਦੀ ਗੁਣਾਤਮਕ ਫਿਲਟਰਿੰਗ ਦਾ ਇੱਕ ਹੋਰ ਦੌਰ ਕੀਤਾ ਗਿਆ।
ਘੱਟ ਕੁਆਲਿਟੀ ਵਾਲੇ ਕਰਨਲਾਂ ਨੂੰ ਹਟਾਉਣ ਤੋਂ ਬਾਅਦ, ਏਕੀਕ੍ਰਿਤ ਡੇਟਾਸੈੱਟ ਨੂੰ ਸਮੂਹਬੱਧ ਕੀਤਾ ਗਿਆ (ਰੈਜ਼ੋਲਿਊਸ਼ਨ = 0.5) ਅਤੇ UMAP34 ਵਿਜ਼ੂਅਲਾਈਜ਼ੇਸ਼ਨ ਉਦੇਸ਼ਾਂ ਲਈ ਏਮਬੇਡ ਕੀਤਾ ਗਿਆ। ਹਰੇਕ ਕਲੱਸਟਰ ਲਈ ਮਾਰਕਰ ਜੀਨ ਆਮ ਜੀਨ ਪ੍ਰਗਟਾਵੇ ਡੇਟਾ ਤੋਂ ਗਣਨਾ ਕੀਤੇ ਗਏ ਡਿਫੌਲਟ ਪੈਰਾਮੀਟਰਾਂ ਦੇ ਨਾਲ FindMarkers ਫੰਕਸ਼ਨ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ ਨਿਰਧਾਰਤ ਕੀਤੇ ਗਏ ਸਨ। ਅਸੀਂ ਮਾਰਕਰ ਜੀਨ ਪ੍ਰਗਟਾਵੇ 19,20,21,35 ਅਤੇ ਐਨੋਟੇਸ਼ਨ ਨਾਲ ਭਰੂਣ ਅਤੇ ਬਾਲਗ ਕੋਰਟੀਕਲ ਸੰਦਰਭ ਡੇਟਾਸੈੱਟਾਂ ਨੂੰ ਜੋੜ ਕੇ ਮੁੱਖ ਸੈੱਲ ਕਲਾਸਾਂ ਦੀ ਪਛਾਣ ਅਤੇ ਵਰਗੀਕਰਨ ਕਰਦੇ ਹਾਂ। ਖਾਸ ਤੌਰ 'ਤੇ, MKI67 ਅਤੇ TOP2A ਦੇ ਪ੍ਰਗਟਾਵੇ ਦੁਆਰਾ ਘੁੰਮਦੇ ਪੂਰਵਗਾਮੀਆਂ ਦੀ ਪਛਾਣ ਕੀਤੀ ਗਈ ਸੀ। ਪ੍ਰੋਜੇਨਿਟਰ ਕਲੱਸਟਰਾਂ ਨੂੰ ਮਾਈਟੋਟਿਕ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਟਾਂ ਦੀ ਅਣਹੋਂਦ, ਦੇਰ ਨਾਲ ਮੈਟਾਫੇਜ਼ ਭਰੂਣ ਕਾਰਟੈਕਸ ਵਿੱਚ ਵਰਣਿਤ ਮਲਟੀਪੋਟੈਂਟ ਗਲਾਈਅਲ ਪ੍ਰੋਜੇਨਿਟਰ ਕਲੱਸਟਰਾਂ ਦੇ ਨਾਲ ਉੱਚ ਓਵਰਲੈਪ, ਅਤੇ EGFR ਅਤੇ OLIG1 ਪ੍ਰਗਟਾਵੇ ਦੁਆਰਾ ਪਰਿਭਾਸ਼ਿਤ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ। ਅਸੀਂ ਐਸਟ੍ਰੋਸਾਈਟ ਵਿਭਿੰਨਤਾ ਦੀਆਂ ਕਈ ਸਥਿਤੀਆਂ ਨੂੰ ਸ਼ਾਮਲ ਕਰਨ ਲਈ ਐਸਟ੍ਰੋਸਾਈਟ ਸ਼ਬਦ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੇ ਹਾਂ, ਦੇਰ ਨਾਲ ਰੇਡੀਅਲ ਗਲਿਆ ਤੋਂ ਐਸਟ੍ਰੋਸਾਈਟਸ ਦੀ ਪਰਿਪੱਕਤਾ ਤੱਕ। ਐਸਟ੍ਰੋਸਾਈਟ ਕਲੱਸਟਰ SLC1A3 ਅਤੇ AQP4 ਦੇ ਉੱਚ ਪੱਧਰਾਂ ਨੂੰ ਪ੍ਰਗਟ ਕਰਦੇ ਹਨ ਅਤੇ ਭਰੂਣ ਰੇਡੀਅਲ ਗਲਿਆ ਅਤੇ/ਜਾਂ ਬਾਲਗ ਐਸਟ੍ਰੋਸਾਈਟਸ ਦੇ ਉਪ-ਕਿਸਮਾਂ ਨਾਲ ਨਕਸ਼ੇ ਕਰਦੇ ਦਿਖਾਇਆ ਗਿਆ ਹੈ। OPCs PDGFRA ਅਤੇ SOX10 ਨੂੰ ਪ੍ਰਗਟ ਕਰਦੇ ਹਨ ਜਦੋਂ ਕਿ oligodendrocytes ਮਾਈਲੀਨੇਸ਼ਨ ਮਾਰਕਰ (MOG ਅਤੇ MYRF) ਨੂੰ ਪ੍ਰਗਟ ਕਰਦੇ ਹਨ। ਗਲੂਟਾਮੈਟਰਜਿਕ ਨਿਊਰੋਨਸ ਦੀ ਪਛਾਣ ਨਿਊਰੋਨਲ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਟਾਂ (SYT1 ਅਤੇ SNAP25), GABAergic ਮਾਰਕਰ (GAD2) ਦੀ ਅਣਹੋਂਦ, ਅਤੇ NEUROD6, SLC17A7, BCL11B, ਜਾਂ SATB2 ਦੀ ਪ੍ਰਗਟਾਵੇ ਦੁਆਰਾ ਕੀਤੀ ਗਈ ਸੀ। GluN ਨਿਊਰੋਨਸ ਨੂੰ ਅੱਗੇ ਉੱਪਰਲੇ (SATB2 ਪ੍ਰਗਟਾਵੇ ਅਤੇ BCL11B ਦਾ ਨੁਕਸਾਨ) ਅਤੇ ਡੂੰਘੇ (BCL11B ਪ੍ਰਗਟਾਵੇ) ਉਪ-ਸ਼੍ਰੇਣੀਆਂ ਵਿੱਚ ਵੰਡਿਆ ਗਿਆ ਸੀ। ਪੁਟੇਟਿਵ ਸਬਪਲੇਟ (SP) ਨਿਊਰੋਨਸ ਡੂੰਘੇ GluN ਮਾਰਕਰਾਂ ਤੋਂ ਇਲਾਵਾ ST18 ਅਤੇ SORCS1 ਵਰਗੇ ਜਾਣੇ-ਪਛਾਣੇ SP18 ਮਾਰਕਰਾਂ ਨੂੰ ਪ੍ਰਗਟ ਕਰਦੇ ਹਨ। ਕੋਰੋਇਡ ਪਲੇਕਸਸ-ਵਰਗੇ ਸੈੱਲਾਂ ਦੀ ਪਛਾਣ TTR ਪ੍ਰਗਟਾਵੇ ਦੁਆਰਾ ਕੀਤੀ ਗਈ ਸੀ, ਅਤੇ ਮੇਨਿਨਜੀਅਲ-ਵਰਗੇ ਸੈੱਲਾਂ ਨੇ ਫਾਈਬਰੋਬਲਾਸਟ-ਸਬੰਧਤ ਜੀਨਾਂ ਅਤੇ ਸੰਦਰਭ ਡੇਟਾ ਸੈੱਟ ਦੇ ਮੈਪ ਕੀਤੇ ਪਾਈਅਲ/ਵੈਸਕੁਲਰ ਸੈੱਲਾਂ ਨੂੰ ਪ੍ਰਗਟ ਕੀਤਾ ਸੀ।
t-hCO ਅਤੇ hCO ਉਪ-ਸ਼੍ਰੇਣੀਆਂ ਵਿਚਕਾਰ ਜੀਨ ਪ੍ਰਗਟਾਵੇ ਦਾ ਵਿਭਿੰਨ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਲਿਬਰਾ R ਪੈਕੇਜ (ਵਰਜਨ 1.0.0) ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ ਲਾਗੂ ਕੀਤੇ ਗਏ ਨਮੂਨਿਆਂ ਵਿੱਚ ਦੁਬਾਰਾ ਤਿਆਰ ਕੀਤੇ ਗਏ ਇੱਕ ਨਵੇਂ ਵਿਕਸਤ ਸੂਡੋ-ਬੈਚ ਵਿਧੀ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ। ਖਾਸ ਤੌਰ 'ਤੇ, edgeR ਲੌਗ-ਸੰਭਾਵਨਾ ਟੈਸਟ (ਵਰਜਨ 3.36.0, ਪੈਕੇਜ R) ਹਰੇਕ ਨਮੂਨੇ ਦੀ ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਤੀ ਲਈ ਇੱਕ ਦਿੱਤੇ ਸੈੱਲ ਕਲਾਸ ਲਈ ਸੈੱਲਾਂ ਵਿੱਚ ਜੀਨਾਂ ਦੀ ਸੰਖਿਆ ਨੂੰ ਜੋੜ ਕੇ ਸਮੂਹਾਂ ਲਈ ਕੀਤੇ ਗਏ ਸਨ। ਹੀਟਮੈਪ ਵਿਜ਼ੂਅਲਾਈਜ਼ੇਸ਼ਨ ਲਈ, edgeR (cpm() ਫੰਕਸ਼ਨ) ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ ਸਧਾਰਣ ਪ੍ਰਤੀ ਮਿਲੀਅਨ (CPM) ਮੁੱਲਾਂ ਦੀ ਗਣਨਾ ਕੀਤੀ ਜਾਂਦੀ ਹੈ ਅਤੇ ਸਕੇਲ ਕੀਤਾ ਜਾਂਦਾ ਹੈ (ਮਤਲਬ = 0, ਮਿਆਰੀ ਵਿਵਹਾਰ = 1 ਪ੍ਰਾਪਤ ਕਰਨ ਲਈ)। ਮਹੱਤਵਪੂਰਨ ਤੌਰ 'ਤੇ ਅਪਰੇਗੂਲੇਟ ਕੀਤੇ t-hCO GluN ਜੀਨਾਂ ਦਾ ਜੀਨ ਓਨਟੋਲੋਜੀ (GO) ਸੰਸ਼ੋਧਨ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ (ਬੈਂਜਾਮਿਨੀ-ਹੋਚਬਰਗ ਨੇ t-hCO GluN ਸੈੱਲਾਂ ਦੇ ਘੱਟੋ-ਘੱਟ 10% ਵਿੱਚ 0.05 ਤੋਂ ਘੱਟ ਦਾ ਸਹੀ P ਮੁੱਲ ਦਰਸਾਇਆ ਗਿਆ ਸੀ ਅਤੇ ਘੱਟੋ-ਘੱਟ 2 ਗੁਣਾ ਤਬਦੀਲੀ ਵਿੱਚ ਵਾਧਾ ਹੋਇਆ ਸੀ)। ToppGene Suite (https://toppgene.cchmc.org/)37 ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ ਕੀਤਾ ਗਿਆ। ਅਸੀਂ ਡਿਫੌਲਟ ਪੈਰਾਮੀਟਰਾਂ ਦੇ ਨਾਲ ਟੌਪਫਨ ਐਪ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੇ ਹਾਂ ਅਤੇ GO-ਐਨੋਟੇਟਿਡ ਹਾਈਪਰਜੀਓਮੈਟ੍ਰਿਕ ਟੈਸਟਾਂ ਤੋਂ ਗਣਨਾ ਕੀਤੇ ਗਏ ਬੇਂਜਾਮਿਨੀ-ਹੋਚਬਰਗ-ਸੁਧਾਰੇ ਗਏ P-ਮੁੱਲਾਂ ਦੀ ਰਿਪੋਰਟ ਕਰਦੇ ਹਾਂ।
ਪ੍ਰਾਇਮਰੀ ਸਿੰਗਲ-ਸੈੱਲ RNA-seq ਜਾਂ ਬਾਲਗ snRNA-seq19,20,21,22 ਦੇ ਸੰਦਰਭ ਅਧਿਐਨਾਂ ਤੋਂ ਐਨੋਟੇਟਿਡ ਸੈੱਲ ਕਲੱਸਟਰਾਂ ਨਾਲ ਸਾਡੇ snRNA-seq ਕਲੱਸਟਰਾਂ ਦਾ ਮੇਲ ਕਰਨ ਲਈ, ਅਸੀਂ ਇੱਕ ਪੇਅਰਡ ਡੇਟਾਸੈਟ ਏਕੀਕਰਣ ਪਹੁੰਚ ਲਾਗੂ ਕੀਤੀ। ਅਸੀਂ ਡੇਟਾਸੈਟਾਂ ਵਿਚਕਾਰ ਕਲੱਸਟਰ ਓਵਰਲੈਪਾਂ ਨੂੰ ਏਕੀਕ੍ਰਿਤ ਕਰਨ ਅਤੇ ਤੁਲਨਾ ਕਰਨ ਲਈ Seurat ਵਿੱਚ SCTransform (v2) ਸਧਾਰਣਕਰਨ ਵਰਕਫਲੋ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕੀਤੀ (ਉੱਪਰ ਦਿੱਤੇ ਗਏ ਪੈਰਾਮੀਟਰਾਂ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੇ ਹੋਏ)। ਕੰਪਿਊਟੇਸ਼ਨਲ ਕੁਸ਼ਲਤਾ ਲਈ ਵਿਅਕਤੀਗਤ ਡੇਟਾਸੈਟਾਂ ਨੂੰ ਪ੍ਰਤੀ ਮੂਲ ਕਲੱਸਟਰ 500 ਸੈੱਲਾਂ ਜਾਂ ਕੋਰਾਂ ਤੱਕ ਬੇਤਰਤੀਬ ਤੌਰ 'ਤੇ ਸਬਸੈੱਟ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ। ਪਹਿਲਾਂ ਦੱਸੇ ਗਏ ਸਮਾਨ ਪਹੁੰਚ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੇ ਹੋਏ, ਕਲੱਸਟਰ ਓਵਰਲੈਪ ਨੂੰ ਹਰੇਕ ਪੂਲਡ ਕਲੱਸਟਰ ਵਿੱਚ ਸੈੱਲਾਂ ਜਾਂ ਨਿਊਕਲੀਅਸ ਦੇ ਅਨੁਪਾਤ ਵਜੋਂ ਪਰਿਭਾਸ਼ਿਤ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ ਜੋ ਸੰਦਰਭ ਕਲੱਸਟਰ ਦੇ ਲੇਬਲ ਨਾਲ ਓਵਰਲੈਪ ਹੋਇਆ ਸੀ। GluNs ਨੂੰ ਹੋਰ ਵਰਗੀਕ੍ਰਿਤ ਕਰਨ ਲਈ, ਅਸੀਂ ਆਪਣੇ GluN ਸੈੱਲਾਂ ਨੂੰ ਸੰਦਰਭ ਡੇਟਾਸੈਟ ਲੇਬਲ ਨਿਰਧਾਰਤ ਕਰਨ ਲਈ GluN ਸਬਸੈੱਟ ਡੇਟਾ ਲਈ Seurat ਦੇ ਟ੍ਰਾਂਸਫਰਡਾਟਾ ਵਰਕਫਲੋ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕੀਤੀ।
t-hCO ਅਤੇ hCO ਨਮੂਨਿਆਂ ਦੇ ਗਲੋਬਲ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਟੋਮ ਦੀ ਪਰਿਪੱਕਤਾ ਸਥਿਤੀ ਦਾ ਮੁਲਾਂਕਣ ਕਰਨ ਲਈ, ਅਸੀਂ ਆਪਣੇ ਸੂਡੋ-ਬਲਕ ਨਮੂਨਿਆਂ ਦੀ ਤੁਲਨਾ BrainSpan/psychENCODE23 ਨਾਲ ਕੀਤੀ, ਜਿਸ ਵਿੱਚ ਮਨੁੱਖੀ ਦਿਮਾਗ ਦੇ ਵਿਕਾਸ ਨੂੰ ਫੈਲਾਉਣ ਵਾਲਾ ਇੱਕ ਵੱਡਾ RNA ਕ੍ਰਮ ਹੁੰਦਾ ਹੈ। ਅਸੀਂ ਗਰਭ ਧਾਰਨ ਤੋਂ 10 ਹਫ਼ਤਿਆਂ ਬਾਅਦ ਅਤੇ ਬਾਅਦ ਵਿੱਚ, 5567 ਜੀਨਾਂ (ਸਾਡੇ ਡੇਟਾ ਦੇ ਨਾਲ) ਵਿੱਚ ਕੋਰਟੀਕਲ ਨਮੂਨਿਆਂ ਤੋਂ ਇੱਕ ਸੰਯੁਕਤ ਪੈਟਰਨ-ਸਧਾਰਨ ਜੀਨ ਪ੍ਰਗਟਾਵੇ ਮੈਟ੍ਰਿਕਸ 'ਤੇ PCA ਕੀਤਾ ਜੋ ਪਹਿਲਾਂ BrainSpan ਕੋਰਟੀਕਲ ਨਮੂਨਿਆਂ ਵਿੱਚ ਸਰਗਰਮ ਵਜੋਂ ਪਛਾਣੇ ਗਏ ਸਨ (ਇੱਕ ਘਣ ਮਾਡਲ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ ਉਮਰ ਦੁਆਰਾ ਸਮਝਾਏ ਗਏ ਵਿਕਾਸ ਸੰਬੰਧੀ ਭਿੰਨਤਾ ਵਿੱਚ 50% ਤੋਂ ਵੱਧ ਵਜੋਂ ਪਰਿਭਾਸ਼ਿਤ)38। ਇਸ ਤੋਂ ਇਲਾਵਾ, ਅਸੀਂ ਪਹਿਲਾਂ ਦੱਸੇ ਅਨੁਸਾਰ ਗੈਰ-ਨੈਗੇਟਿਵ ਮੈਟ੍ਰਿਕਸ ਫੈਕਟਰਾਈਜ਼ੇਸ਼ਨ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੇ ਹੋਏ ਨਿਊਰੋਡਿਵੈਲਪਮੈਂਟ ਦੇ ਮੁੱਖ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਟੋਮ ਦਸਤਖਤਾਂ ਨਾਲ ਜੁੜੇ ਜੀਨ ਪ੍ਰਾਪਤ ਕੀਤੇ। ਗੈਰ-ਨੈਗੇਟਿਵ ਮੈਟ੍ਰਿਕਸ ਫੈਕਟਰਾਈਜ਼ੇਸ਼ਨ ਪ੍ਰਕਿਰਿਆ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ ਗਣਨਾ ਕੀਤੇ ਗਏ ਨਮੂਨੇ ਦੇ ਭਾਰ ਨੂੰ Zhu et al.38 ਦੁਆਰਾ ਵਰਣਿਤ ਪੰਜ ਦਸਤਖਤਾਂ ਵਿੱਚੋਂ ਹਰੇਕ ਲਈ ਵਿਸਤ੍ਰਿਤ ਡੇਟਾ ਦੇ ਨਾਲ ਚਿੱਤਰ 5b ਵਿੱਚ ਪਲਾਟ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਹੈ। ਦੁਬਾਰਾ, ਗਤੀਵਿਧੀ ਨਿਰਭਰ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਸ਼ਨਲ ਮਾਰਕਰ ਪਹਿਲਾਂ ਪ੍ਰਕਾਸ਼ਿਤ ਅਧਿਐਨਾਂ ਤੋਂ ਪ੍ਰਾਪਤ ਕੀਤੇ ਗਏ ਸਨ। ਖਾਸ ਤੌਰ 'ਤੇ, ਸਪਲੀਮੈਂਟਰੀ ਟੇਬਲ 3 Hrvatin et al.16 ਤੋਂ ਵਿਜ਼ੂਅਲ ਉਤੇਜਨਾ ਤੋਂ ਬਾਅਦ ਮਾਊਸ ਵਿਜ਼ੂਅਲ ਕਾਰਟੈਕਸ snRNA-seq ਸੰਗ੍ਰਹਿ ਦੁਆਰਾ ਪਛਾਣੇ ਗਏ ਗਲੂਟਾਮੈਟਰਜਿਕ ਨਿਊਰੋਨਸ ਵਿੱਚ ERG ਅਤੇ LRG ਨੂੰ ਮਹੱਤਵਪੂਰਨ ਤੌਰ 'ਤੇ ਅਪਰੇਗੂਲੇਟ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ। ਮਨੁੱਖੀ-ਸੰਪੰਨ LRGs KCl-ਸਰਗਰਮ ਮਨੁੱਖੀ ਭਰੂਣ ਦਿਮਾਗ ਦੇ ਸਭਿਆਚਾਰਾਂ ਤੋਂ ਪ੍ਰਾਪਤ ਕੀਤੇ ਗਏ ਸਨ ਅਤੇ ਉਤੇਜਨਾ ਤੋਂ 6 ਘੰਟੇ ਬਾਅਦ ਕਟਾਈ ਕੀਤੀ ਗਈ ਸੀ, ਅਤੇ ਫਿਲਟਰ ਕੀਤੇ ਜੀਨ ਮਨੁੱਖਾਂ ਵਿੱਚ ਮਹੱਤਵਪੂਰਨ ਤੌਰ 'ਤੇ ਅਪਰੇਗੂਲੇਟ ਕੀਤੇ ਗਏ ਸਨ ਪਰ ਚੂਹਿਆਂ ਵਿੱਚ ਨਹੀਂ (ਪੂਰਕ ਸਾਰਣੀ 4)। ਇਹਨਾਂ ਜੀਨ ਸੈੱਟਾਂ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੇ ਹੋਏ ਜੀਨ ਸੈੱਟ ਸੰਸ਼ੋਧਨ ਦਾ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਇੱਕ-ਪਾਸੜ ਫਿਸ਼ਰ ਦੇ ਸਹੀ ਟੈਸਟ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।
ਚੂਹਿਆਂ ਨੂੰ ਆਈਸੋਫਲੂਰੇਨ ਨਾਲ ਬੇਹੋਸ਼ ਕਰੋ, ਦਿਮਾਗ ਕੱਢੋ ਅਤੇ ਠੰਡੇ (ਲਗਭਗ 4°C) ਆਕਸੀਜਨ ਵਾਲੇ (95% O2 ਅਤੇ 5% CO2) ਸੁਕਰੋਜ਼ ਘੋਲ ਵਿੱਚ ਰੱਖੋ ਜਿਨ੍ਹਾਂ ਵਿੱਚ 234 mM ਸੁਕਰੋਜ਼, 11 mM ਗਲੂਕੋਜ਼, 26 mM NaHCO3, 2.5 mM KCl, 1.25 mM। NaH2PO4, 10 mM MgSO4 ਅਤੇ 0.5 mM CaCl2 (ਲਗਭਗ 310 mOsm) ਸ਼ਾਮਲ ਹਨ। ਚੂਹਿਆਂ ਦੇ ਦਿਮਾਗ ਦੇ ਕੋਰੋਨਲ ਭਾਗ (300–400 µm) ਜਿਨ੍ਹਾਂ ਵਿੱਚ t-hCO2 ਹੁੰਦਾ ਹੈ, ਨੂੰ ਪਹਿਲਾਂ ਦੱਸੇ ਅਨੁਸਾਰ Leica VT1200 ਵਾਈਬ੍ਰੇਟੋਮ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ ਬਣਾਇਆ ਗਿਆ ਸੀ39। ਫਿਰ ਭਾਗਾਂ ਨੂੰ ਇੱਕ ਸੈਕਸ਼ਨਿੰਗ ਚੈਂਬਰ ਵਿੱਚ ਤਬਦੀਲ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਜਿਸ ਵਿੱਚ ਲਗਾਤਾਰ ਕਮਰੇ ਦੇ ਤਾਪਮਾਨ 'ਤੇ ਆਕਸੀਜਨੇਸ਼ਨ ਵਾਲਾ aCSF ਤਿਆਰ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ: 10 mM ਗਲੂਕੋਜ਼, 26 mM NaHCO3, 2.5 mM KCl, 1.25 mM NaHPO4, 1 mM MgSO4, 2 mM CaCl2 ਅਤੇ 126 mM NaCl (298 mOsm)। ਰਿਕਾਰਡਿੰਗ ਤੋਂ ਘੱਟੋ-ਘੱਟ 45 ਮਿੰਟ ਪਹਿਲਾਂ। ਭਾਗਾਂ ਨੂੰ ਇੱਕ ਡੁੱਬੇ ਹੋਏ ਚੈਂਬਰ ਵਿੱਚ ਰਿਕਾਰਡ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ ਜਿੱਥੇ ਉਹਨਾਂ ਨੂੰ aCSF (95% O2 ਅਤੇ 5% CO2 ਸ਼ੀਸ਼ੀ) ਨਾਲ ਲਗਾਤਾਰ ਪਰਫਿਊਜ਼ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ। ਸਾਰਾ ਡੇਟਾ ਕਮਰੇ ਦੇ ਤਾਪਮਾਨ 'ਤੇ ਰਿਕਾਰਡ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ। t-hCO ਨਿਊਰੋਨਸ ਨੂੰ 127 mM ਪੋਟਾਸ਼ੀਅਮ ਗਲੂਕੋਨੇਟ, 8 mM NaCl, 4 mM ਮੈਗਨੀਸ਼ੀਅਮ ATP, 0.3 mM ਸੋਡੀਅਮ GTP, 10 mM HEPES, ਅਤੇ 0.6 mM EGTA, pH 7.2, KOH (290 mOsm) ਨਾਲ ਐਡਜਸਟ ਕੀਤੇ ਗਏ ਘੋਲ ਨਾਲ ਭਰੇ ਇੱਕ ਬੋਰੋਸਿਲੀਕੇਟ ਗਲਾਸ ਪਾਈਪੇਟ ਨਾਲ ਖਤਮ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ। ਠੀਕ ਹੋਣ ਲਈ, ਰਿਕਾਰਡਿੰਗ ਘੋਲ ਵਿੱਚ ਬਾਇਓਸਾਈਟਿਨ (0.2%) ਜੋੜਿਆ ਗਿਆ ਸੀ।
ਡਾਟਾ ਇੱਕ ਮਲਟੀਕਲੈਂਪ 700B ਐਂਪਲੀਫਾਇਰ (ਮੌਲੀਕਿਊਲਰ ਡਿਵਾਈਸ) ਅਤੇ ਇੱਕ ਡਿਜੀਡਾਟਾ 1550B ਡਿਜੀਟਾਈਜ਼ਰ (ਮੌਲੀਕਿਊਲਰ ਡਿਵਾਈਸ) ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ ਪ੍ਰਾਪਤ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ, 2 kHz 'ਤੇ ਘੱਟ-ਪਾਸ ਫਿਲਟਰ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ, 20 kHz 'ਤੇ ਡਿਜੀਟਾਈਜ਼ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ, ਅਤੇ ਕਲੈਂਪਫਿਟ (ਮੌਲੀਕਿਊਲਰ ਡਿਵਾਈਸ), ਓਰੀਜਨ (ਓਰੀਜਨਪ੍ਰੋ) ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ। 2021b, ਓਰੀਜਨਲੈਬ)। ਅਤੇ ਕਸਟਮ MATLAB ਫੰਕਸ਼ਨ (ਮੈਥਵਰਕਸ)। ਜੰਕਸ਼ਨ ਸੰਭਾਵੀ ਦੀ ਗਣਨਾ JPCalc ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ ਕੀਤੀ ਗਈ ਸੀ ਅਤੇ ਐਂਟਰੀਆਂ ਨੂੰ -14 mV ਦੇ ਗਣਨਾ ਕੀਤੇ ਮੁੱਲ ਵਿੱਚ ਐਡਜਸਟ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ। ਓਪਰੇਸ਼ਨ IV ਵਿੱਚ 10-25 pA ਕਦਮਾਂ ਵਿੱਚ ਮੌਜੂਦਾ ਕਦਮਾਂ ਦੀ ਇੱਕ ਲੜੀ ਸ਼ਾਮਲ ਹੈ, -250 ਤੋਂ 750 pA ਤੱਕ।
ਜਿਵੇਂ ਕਿ ਪਹਿਲਾਂ ਦੱਸਿਆ ਗਿਆ ਹੈ, hCO ਨਿਊਰੋਨਸ ਦੀ ਪੈਚ-ਕਲੈਂਪ ਰਿਕਾਰਡਿੰਗ ਦੌਰਾਨ ਥੈਲੇਮਸ, ਚਿੱਟਾ ਪਦਾਰਥ, ਅਤੇ S1 ਐਫੀਰੈਂਟਸ ਨੂੰ ਥੈਲੇਮੋਕਾਰਟੀਕਲ ਟੁਕੜਿਆਂ ਵਿੱਚ ਇਲੈਕਟ੍ਰਿਕ ਤੌਰ 'ਤੇ ਉਤੇਜਿਤ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ। ਸੰਖੇਪ ਵਿੱਚ, ਦਿਮਾਗ ਨੂੰ 10° ਕੋਣ 'ਤੇ ਝੁਕਿਆ ਹੋਇਆ 3D ਪ੍ਰਿੰਟਿੰਗ ਟੇਬਲ 'ਤੇ ਰੱਖਿਆ ਗਿਆ ਸੀ, ਅਤੇ ਦਿਮਾਗ ਦੇ ਅਗਲੇ ਹਿੱਸੇ ਨੂੰ 35° ਕੋਣ 'ਤੇ ਕੱਟਿਆ ਗਿਆ ਸੀ। ਫਿਰ ਦਿਮਾਗ ਨੂੰ ਕੱਟੀ ਹੋਈ ਸਤ੍ਹਾ ਨਾਲ ਚਿਪਕਾਇਆ ਗਿਆ ਸੀ ਅਤੇ ਭਾਗ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ, ਥੈਲੇਮੋਕਾਰਟੀਕਲ ਫੈਲਣ ਵਾਲੇ ਐਕਸੋਨ ਨੂੰ ਸੁਰੱਖਿਅਤ ਰੱਖਿਆ ਗਿਆ ਸੀ। ਬਾਈਪੋਲਰ ਟੰਗਸਟਨ ਇਲੈਕਟ੍ਰੋਡ (0.5 MΩ) ਨੂੰ ਦੂਜੇ ਮਾਈਕ੍ਰੋਮੈਨੀਪੁਲੇਟਰ 'ਤੇ ਮਾਊਂਟ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ ਅਤੇ ਪ੍ਰਤੀ ਸੈੱਲ ਚਾਰ ਖੇਤਰਾਂ (ਅੰਦਰੂਨੀ ਕੈਪਸੂਲ, ਚਿੱਟਾ ਪਦਾਰਥ, S1 ਅਤੇ hCO) ਨੂੰ ਉਤੇਜਿਤ ਕਰਨ ਲਈ ਰਣਨੀਤਕ ਤੌਰ 'ਤੇ ਸਥਿਤੀ ਦਿੱਤੀ ਗਈ ਸੀ। 0.03–0.1 Hz 'ਤੇ 300 µA ਫਾਸਿਕ ਉਤੇਜਨਾ ਤੋਂ ਬਾਅਦ ਸਿਨੈਪਟਿਕ ਪ੍ਰਤੀਕਿਰਿਆਵਾਂ ਰਿਕਾਰਡ ਕਰੋ।
hChR2-ਪ੍ਰਗਟਾਵੇ ਵਾਲੇ hCO ਨਿਊਰੋਨਸ ਨੂੰ 480 nm 'ਤੇ ਸਰਗਰਮ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ ਅਤੇ ਸੈੱਲਾਂ ਦੇ ਨੇੜੇ hChR2 ਪ੍ਰਗਟਾਵੇ ਨੂੰ ਰਿਕਾਰਡ ਕਰਨ ਲਈ ਇੱਕ LED (Prizmatix) ਦੁਆਰਾ ਪੈਦਾ ਕੀਤੇ ਗਏ ਹਲਕੇ ਪਲਸਾਂ ਨੂੰ ਇੱਕ ×40 ਉਦੇਸ਼ (0.9 NA; Olympus) ਰਾਹੀਂ ਲਾਗੂ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ। ਪ੍ਰਕਾਸ਼ਮਾਨ ਖੇਤਰ ਵਿਆਸ ਲਗਭਗ 0.5 ਮਿਲੀਮੀਟਰ ਹੈ ਅਤੇ ਕੁੱਲ ਸ਼ਕਤੀ 10-20 mW ਹੈ। ਪਲਸ ਚੌੜਾਈ 10 ms 'ਤੇ ਸੈੱਟ ਕੀਤੀ ਗਈ ਸੀ, ਜੋ ਕਿ ਵਿਵਹਾਰਕ ਸਿਖਲਾਈ ਪ੍ਰਯੋਗ ਦੌਰਾਨ ਦਿੱਤੀ ਗਈ ਪਲਸ ਨਾਲ ਮੇਲ ਖਾਂਦੀ ਹੈ। 1 ਤੋਂ 20 Hz ਤੱਕ ਵੱਖ-ਵੱਖ ਉਤੇਜਨਾ ਫ੍ਰੀਕੁਐਂਸੀ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕੀਤੀ ਗਈ ਸੀ, ਪਰ ਮਾਤਰਾ ਲਈ ਲੜੀ ਦੀ ਸਿਰਫ ਪਹਿਲੀ ਪਲਸ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕੀਤੀ ਗਈ ਸੀ। ਸਿਨੈਪਟਿਕ ਇਨਿਹਿਬਿਟਰੀ ਜਾਂ ਸੁਵਿਧਾਜਨਕ ਮਾਰਗਾਂ 'ਤੇ ਪ੍ਰਭਾਵ ਨੂੰ ਘੱਟ ਕਰਨ ਲਈ ਟ੍ਰੇਨਾਂ ਵਿਚਕਾਰ ਅੰਤਰਾਲ ਆਮ ਤੌਰ 'ਤੇ 30 ਸਕਿੰਟ ਤੋਂ ਵੱਧ ਹੁੰਦੇ ਹਨ। ਇਹ ਜਾਂਚ ਕਰਨ ਲਈ ਕਿ ਕੀ hChR2 ਪ੍ਰਤੀਕਿਰਿਆ ਮੋਨੋਸਿਨੈਪਟਿਕ ਸੀ, ਅਸੀਂ ਇਸ਼ਨਾਨ ਵਿੱਚ TTX (1 μM) ਲਾਗੂ ਕੀਤਾ ਜਦੋਂ ਤੱਕ EPSC ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆ ਗਾਇਬ ਨਹੀਂ ਹੋ ਗਈ, ਅਤੇ ਫਿਰ 4-ਐਮੀਨੋਪਾਈਰੀਡੀਨ (4-AP; 100 μM) ਲਾਗੂ ਕੀਤਾ। ਆਮ ਤੌਰ 'ਤੇ, ਕੁਝ ਮਿੰਟਾਂ ਦੇ ਅੰਦਰ ਇੱਕ ਜਵਾਬ ਵਾਪਸ ਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ, LED ਫਾਇਰਿੰਗ ਅਤੇ EPSC ਜਨਰੇਸ਼ਨ ਵਿਚਕਾਰ ਥੋੜ੍ਹੀ ਜਿਹੀ ਲੰਬੀ ਦੇਰੀ ਦੇ ਨਾਲ। NBQX (10 μM) ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਇਹ ਜਾਂਚ ਕਰਨ ਲਈ ਕੀਤੀ ਗਈ ਸੀ ਕਿ ਕੀ ਜਵਾਬ AMPA ਰੀਸੈਪਟਰਾਂ ਦੁਆਰਾ ਚਲਾਇਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ।
ਪਹਿਲਾਂ ਦੱਸੇ ਅਨੁਸਾਰ ਤਿੱਖੇ hCO ਭਾਗ ਬਣਾਏ ਗਏ ਸਨ। ਸੰਖੇਪ ਵਿੱਚ, hCO ਭਾਗਾਂ ਨੂੰ 4% ਐਗਰੋਜ਼ ਵਿੱਚ ਏਮਬੇਡ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ ਅਤੇ 126 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM NaH2PO4, 1 mM MgSO4, 2 mM CaCl2, 26 mM NaHCO3 ਅਤੇ 10 mM d-(+) -ਗਲੂਕੋਜ਼ ਵਾਲੇ ਸੈੱਲਾਂ ਵਿੱਚ ਟ੍ਰਾਂਸਫਰ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ। ਭਾਗਾਂ ਨੂੰ Leica VT1200 ਵਾਈਬ੍ਰੇਟਰ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ ਕਮਰੇ ਦੇ ਤਾਪਮਾਨ 'ਤੇ 200-300 µm 'ਤੇ ਕੱਟਿਆ ਗਿਆ ਸੀ ਅਤੇ ਕਮਰੇ ਦੇ ਤਾਪਮਾਨ 'ਤੇ ASF ਵਿੱਚ ਸਟੋਰ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ। ਫਿਰ, ਪੂਰੇ ਸੈੱਲਾਂ ਦੀ ਪੈਚ-ਕੈਂਪ ਰਿਕਾਰਡਿੰਗ hCO ਭਾਗਾਂ 'ਤੇ ਸਿੱਧੇ ਸਲਾਈਸਕੋਪ ਮਾਈਕ੍ਰੋਸਕੋਪ (ਸਾਇੰਟੀਫਿਕਾ) ਦੇ ਅਧੀਨ ਕੀਤੀ ਗਈ ਸੀ। ਭਾਗਾਂ ਨੂੰ aCSF (95% O2 ਅਤੇ 5% CO2) ਨਾਲ ਪਰਫਿਊਜ਼ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ ਅਤੇ ਸੈੱਲ ਸਿਗਨਲ ਕਮਰੇ ਦੇ ਤਾਪਮਾਨ 'ਤੇ ਰਿਕਾਰਡ ਕੀਤੇ ਗਏ ਸਨ। hCO ਨਿਊਰੋਨਸ ਨੂੰ ਇੱਕ ਬੋਰੋਸਿਲੀਕੇਟ ਗਲਾਸ ਪਾਈਪੇਟ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ ਲਾਗੂ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ ਜਿਸ ਵਿੱਚ 127 mM ਪੋਟਾਸ਼ੀਅਮ ਗਲੂਕੋਨੇਟ, 8 mM NaCl, 4 mM ਮੈਗਨੀਸ਼ੀਅਮ ATP, 0.3 mM ਸੋਡੀਅਮ GTP, 10 mM HEPES, ਅਤੇ 0.6 mM EGTA, ਅੰਦਰੂਨੀ pH 7, 2, KOH (osmolarity 290) ਨਾਲ ਐਡਜਸਟ ਕੀਤੇ ਗਏ ਘੋਲ ਨਾਲ ਭਰਿਆ ਹੋਇਆ ਸੀ। ਰਿਕਵਰੀ ਦੇ ਉਦੇਸ਼ਾਂ ਲਈ, ਅੰਦਰੂਨੀ ਘੋਲ ਵਿੱਚ 0.2% ਬਾਇਓਸਾਈਟਿਨ ਸ਼ਾਮਲ ਕਰੋ।
ਕਲੈਂਪੈਕਸ (ਕਲੈਮਪੈਕਸ 11.1, ਮੌਲੀਕਿਊਲਰ ਡਿਵਾਈਸਿਸ) ਦੁਆਰਾ ਮਲਟੀਕਲੈਂਪ 700B ਐਂਪਲੀਫਾਇਰ (ਮੌਲੀਕਿਊਲਰ ਡਿਵਾਈਸਿਸ) ਅਤੇ ਡਿਜੀਡਾਟਾ 1550B ਡਿਜੀਟਾਈਜ਼ਰ (ਮੌਲੀਕਿਊਲਰ ਡਿਵਾਈਸਿਸ) ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ ਡੇਟਾ ਪ੍ਰਾਪਤ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ, 2 kHz 'ਤੇ ਘੱਟ-ਪਾਸ ਫਿਲਟਰ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ, 20 kHz 'ਤੇ ਡਿਜੀਟਾਈਜ਼ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ, ਅਤੇ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਲਈ ਕਲੈਂਪਫਿਟ (ਵਰਜਨ 10.6) ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ, ਅਣੂ ਡਿਵਾਈਸਿਸ) ਅਤੇ ਕਸਟਮ MATLAB ਫੰਕਸ਼ਨ (MATLAB 2019b, ਮੈਥਵਰਕਸ)। ਜੰਕਸ਼ਨ ਸੰਭਾਵੀ ਦੀ ਗਣਨਾ JPCalc ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ ਕੀਤੀ ਗਈ ਸੀ ਅਤੇ ਐਂਟਰੀਆਂ ਨੂੰ -14 mV ਦੀ ਗਣਨਾ ਕੀਤੀ ਗਈ ਜੰਕਸ਼ਨ ਸੰਭਾਵੀ ਵਿੱਚ ਐਡਜਸਟ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ। ਓਪਰੇਸ਼ਨ IV ਵਿੱਚ -50 ਤੋਂ 250 pA ਤੱਕ 5-10 pA ਕਦਮਾਂ ਵਿੱਚ ਮੌਜੂਦਾ ਕਦਮਾਂ ਦੀ ਇੱਕ ਲੜੀ ਸ਼ਾਮਲ ਹੈ।
ਪਿੰਚਡ ਨਿਊਰੋਨਸ ਦੇ ਰੂਪ ਵਿਗਿਆਨਿਕ ਪੁਨਰ ਨਿਰਮਾਣ ਲਈ, 0.2% ਬਾਇਓਸਾਈਟਿਨ (ਸਿਗਮਾ-ਐਲਡਰਿਕ) ਨੂੰ ਅੰਦਰੂਨੀ ਘੋਲ ਵਿੱਚ ਜੋੜਿਆ ਗਿਆ ਸੀ। ਹੈਕਿੰਗ ਤੋਂ ਬਾਅਦ ਸੈੱਲਾਂ ਨੂੰ ਘੱਟੋ-ਘੱਟ 15 ਮਿੰਟ ਲਈ ਪ੍ਰਾਈਮ ਕੀਤਾ ਜਾਂਦਾ ਹੈ। ਫਿਰ ਪਾਈਪੇਟ ਨੂੰ 1-2 ਮਿੰਟ ਲਈ ਹੌਲੀ-ਹੌਲੀ ਖਿੱਚਿਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ ਜਦੋਂ ਤੱਕ ਰਜਿਸਟਰਡ ਝਿੱਲੀ ਪੂਰੀ ਤਰ੍ਹਾਂ ਸੀਲ ਨਹੀਂ ਹੋ ਜਾਂਦੀ। ਸੈਕਸ਼ਨ ਫਿਜ਼ੀਓਲੋਜੀ ਪ੍ਰਕਿਰਿਆ ਦੇ ਬਾਅਦ, ਸੈਕਸ਼ਨਾਂ ਨੂੰ 4% PFA ਵਿੱਚ ਰਾਤੋ-ਰਾਤ 4° C 'ਤੇ ਫਿਕਸ ਕੀਤਾ ਗਿਆ, PBS X3 ਨਾਲ ਧੋਤਾ ਗਿਆ, ਅਤੇ ਸਟ੍ਰੈਪਟਾਵਿਡਿਨ-ਕਨਜੁਗੇਟਿਡ ਡਾਇਲਾਈਟ 549 ਜਾਂ ਡਾਇਲਾਈਟ 405 (ਵੈਕਟਰ ਲੈਬਜ਼) ਨਾਲ 1:1000 ਪਤਲਾ ਕੀਤਾ ਗਿਆ। ਬਾਇਓਸਾਈਟਿਨ (2%; ਸਿਗਮਾ-ਐਲਡਰਿਕ) ਨਾਲ ਭਰੇ ਸੈੱਲਾਂ ਨੂੰ ਕਮਰੇ ਦੇ ਤਾਪਮਾਨ 'ਤੇ ਪੈਚ ਕਲੈਂਪ ਰਿਕਾਰਡਿੰਗ ਦੌਰਾਨ 2 ਘੰਟਿਆਂ ਲਈ ਲੇਬਲ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ। ਫਿਰ ਸੈਕਸ਼ਨਾਂ ਨੂੰ ਐਕਵਾਮਾਉਂਟ (ਥਰਮੋ ਸਾਇੰਟਿਫਿਕ) ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ ਮਾਈਕ੍ਰੋਸਕੋਪੀ ਸਲਾਈਡਾਂ 'ਤੇ ਮਾਊਂਟ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਅਤੇ ਅਗਲੇ ਦਿਨ ਇੱਕ ਸੰਖਿਆਤਮਕ ਅਪਰਚਰ ×40 1.3, ਵਿਸਤਾਰ ×0.9–1.0, xy ਦੇ ਨਾਲ ਇੱਕ ਤੇਲ ਇਮਰਸ਼ਨ ਉਦੇਸ਼ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੇ ਹੋਏ ਇੱਕ Leica TCS SP8 ਕਨਫੋਕਲ ਮਾਈਕ੍ਰੋਸਕੋਪ 'ਤੇ ਵਿਜ਼ੂਅਲਾਈਜ਼ ਕੀਤਾ ਗਿਆ। ਸੈਂਪਲਿੰਗ ਦਰ ਲਗਭਗ 7 ਪਿਕਸਲ ਪ੍ਰਤੀ ਮਾਈਕਰੋਨ ਹੈ। 1 µm ਅੰਤਰਾਲਾਂ 'ਤੇ Z-ਸਟੈਕਸ ਲੜੀਵਾਰ ਪ੍ਰਾਪਤ ਕੀਤੇ ਗਏ ਸਨ, ਅਤੇ ਹਰੇਕ ਨਿਊਰੋਨ ਦੇ ਪੂਰੇ ਡੈਂਡਰਟਿਕ ਟ੍ਰੀ ਨੂੰ ਕਵਰ ਕਰਨ ਲਈ z-ਸਟੈਕ ਮੋਜ਼ੇਕ ਅਤੇ ਲੀਕਾ-ਅਧਾਰਿਤ ਆਟੋ-ਸਟਿਚਿੰਗ ਕੀਤੀ ਗਈ ਸੀ। ਫਿਰ ਨਿਊਰੋਨ ਨੂੰ neuTube 40 ਇੰਟਰਫੇਸ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ ਅਰਧ-ਮੈਨੂਅਲੀ ਟ੍ਰੈਕ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ ਅਤੇ SWC ਫਾਈਲਾਂ ਤਿਆਰ ਕੀਤੀਆਂ ਗਈਆਂ ਸਨ। ਫਿਰ ਫਾਈਲਾਂ ਨੂੰ SimpleNeuriteTracer41 Fiji ਪਲੱਗਇਨ (ImageJ, ਸੰਸਕਰਣ 2.1.0; NIH) 'ਤੇ ਅਪਲੋਡ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।
ਸਟੈਨਫੋਰਡ ਯੂਨੀਵਰਸਿਟੀ ਦੇ ਸੰਸਥਾਗਤ ਸਮੀਖਿਆ ਬੋਰਡ ਦੁਆਰਾ ਪ੍ਰਵਾਨਿਤ ਪ੍ਰੋਟੋਕੋਲ ਦੇ ਅਨੁਸਾਰ ਸੂਚਿਤ ਸਹਿਮਤੀ ਨਾਲ ਮਨੁੱਖੀ ਕਾਰਟੀਕਲ ਟਿਸ਼ੂ ਪ੍ਰਾਪਤ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ। ਰਿਫ੍ਰੈਕਟਰੀ ਮਿਰਗੀ ਲਈ ਸਰਜਰੀ ਦੇ ਹਿੱਸੇ ਵਜੋਂ ਫਰੰਟਲ ਕਾਰਟੈਕਸ (ਮਿਡਲ ਫਰੰਟਲ ਗਾਇਰਸ) ਦੇ ਰਿਸੈਕਸ਼ਨ ਦੁਆਰਾ ਮਨੁੱਖੀ ਪੋਸਟਪਾਰਟਮ ਟਿਸ਼ੂ (3 ਅਤੇ 18 ਸਾਲ ਪੁਰਾਣੇ) ਦੇ ਦੋ ਨਮੂਨੇ ਪ੍ਰਾਪਤ ਕੀਤੇ ਗਏ ਸਨ। ਰਿਸੈਕਸ਼ਨ ਤੋਂ ਬਾਅਦ, ਬਰਫ਼-ਠੰਡੇ NMDG-aCSF ਵਿੱਚ ਟਿਸ਼ੂ ਦੀ ਕਟਾਈ ਕਰੋ ਜਿਸ ਵਿੱਚ ਸ਼ਾਮਲ ਹਨ: 92 mM NMDG, 2.5 mM KCl, 1.25 mM NaH2PO4, 30 mM NaHCO3, 20 mM HEPES, 25 mM ਗਲੂਕੋਜ਼, 2 mM ਥਿਓਰੀਆ, 5 mM ਸੋਡੀਅਮ ਐਸਕੋਰਬੇਟ, 3 mM ਸੋਡੀਅਮ ਪਾਈਰੂਵੇਟ, 0.5 mM CaCl2 4H2O ਅਤੇ 10 mM MgSO4 7H2O। ਗਾੜ੍ਹੇ ਹਾਈਡ੍ਰੋਕਲੋਰਿਕ ਐਸਿਡ ਨਾਲ pH 7.3-7.4 ਤੱਕ ਟਾਈਟਰੇਟ ਕਰੋ। ਟਿਸ਼ੂ 30 ਮਿੰਟਾਂ ਦੇ ਅੰਦਰ ਪ੍ਰਯੋਗਸ਼ਾਲਾ ਵਿੱਚ ਪਹੁੰਚਾ ਦਿੱਤੇ ਗਏ ਅਤੇ ਉੱਪਰ ਦੱਸੀ ਗਈ ਪ੍ਰਕਿਰਿਆ ਅਨੁਸਾਰ ਕੋਰੋਨਲ ਸੈਕਸ਼ਨ ਲਏ ਗਏ।
ਸਾਰੀਆਂ ਜਾਨਵਰਾਂ ਦੀਆਂ ਪ੍ਰਕਿਰਿਆਵਾਂ ਸਟੈਨਫੋਰਡ ਯੂਨੀਵਰਸਿਟੀ APLAC-ਪ੍ਰਵਾਨਿਤ ਜਾਨਵਰਾਂ ਦੀ ਦੇਖਭਾਲ ਦਿਸ਼ਾ-ਨਿਰਦੇਸ਼ਾਂ ਦੇ ਅਨੁਸਾਰ ਕੀਤੀਆਂ ਗਈਆਂ ਸਨ। ਚੂਹਿਆਂ (ਟ੍ਰਾਂਸਪਲਾਂਟੇਸ਼ਨ ਤੋਂ ਬਾਅਦ 140 ਦਿਨਾਂ ਤੋਂ ਵੱਧ) ਨੂੰ 5% ਆਈਸੋਫਲੂਰੇਨ ਅਨੱਸਥੀਸੀਆ ਨਾਲ ਪ੍ਰੇਰਿਤ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ ਅਤੇ 1-3% ਆਈਸੋਫਲੂਰੇਨ ਨਾਲ ਇੰਟਰਾਓਪਰੇਟਿਵ ਤੌਰ 'ਤੇ ਬੇਹੋਸ਼ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ। ਜਾਨਵਰਾਂ ਨੂੰ ਇੱਕ ਸਟੀਰੀਓਟੈਕਸਿਕ ਫਰੇਮ (ਕੋਪਫ) ਵਿੱਚ ਰੱਖਿਆ ਗਿਆ ਸੀ ਅਤੇ ਨਿਰੰਤਰ ਰਿਲੀਜ਼ ਬਿਊਪ੍ਰੇਨੋਰਫਾਈਨ (SR) ਨੂੰ ਚਮੜੀ ਦੇ ਹੇਠਾਂ ਟੀਕਾ ਲਗਾਇਆ ਗਿਆ ਸੀ। ਖੋਪੜੀ ਨੂੰ ਬੇਨਕਾਬ ਕੀਤਾ ਗਿਆ, ਸਾਫ਼ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਅਤੇ 3-5 ਹੱਡੀਆਂ ਦੇ ਪੇਚ ਪਾਏ ਗਏ। t-hCO ਨੂੰ ਨਿਸ਼ਾਨਾ ਬਣਾਉਣ ਲਈ, ਅਸੀਂ MRI ਚਿੱਤਰਾਂ ਤੋਂ ਸਟੀਰੀਓਟੈਕਸਿਕ ਕੋਆਰਡੀਨੇਟਸ ਤਿਆਰ ਕੀਤੇ। ਦਿਲਚਸਪੀ ਵਾਲੀ ਥਾਂ 'ਤੇ ਇੱਕ ਬਰਰ ਹੋਲ ਡ੍ਰਿਲ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ ਅਤੇ ਫਾਈਬਰ (400 µm ਵਿਆਸ, NA 0.48, Doric) ਨੂੰ hCO ਸਤ੍ਹਾ ਤੋਂ 100 µm ਹੇਠਾਂ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ ਅਤੇ UV-ਇਲਾਜਯੋਗ ਦੰਦਾਂ ਦੇ ਸੀਮੈਂਟ (Relyx) ਨਾਲ ਖੋਪੜੀ ਤੱਕ ਸੁਰੱਖਿਅਤ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।
ਫਾਈਬਰ ਫੋਟੋਮੈਟ੍ਰਿਕ ਰਿਕਾਰਡਿੰਗਾਂ ਪਹਿਲਾਂ ਦੱਸੇ ਅਨੁਸਾਰ ਕੀਤੀਆਂ ਗਈਆਂ ਸਨ42। ਸਵੈ-ਚਾਲਿਤ ਗਤੀਵਿਧੀ ਨੂੰ ਰਿਕਾਰਡ ਕਰਨ ਲਈ, ਚੂਹਿਆਂ ਨੂੰ ਇੱਕ ਸਾਫ਼ ਪਿੰਜਰੇ ਵਿੱਚ ਰੱਖਿਆ ਗਿਆ ਸੀ ਅਤੇ ਇੱਕ 400 µm ਵਿਆਸ ਵਾਲਾ ਫਾਈਬਰ ਆਪਟਿਕ ਪੈਚ ਕੇਬਲ (ਡੋਰਿਕ) ਇੱਕ ਫਾਈਬਰ ਆਪਟਿਕ ਫੋਟੋਮੈਟ੍ਰਿਕ ਡੇਟਾ ਪ੍ਰਾਪਤੀ ਪ੍ਰਣਾਲੀ ਨਾਲ ਜੁੜਿਆ ਹੋਇਆ ਸੀ, ਜੋ ਇਮਪਲਾਂਟ ਕੀਤੇ ਫਾਈਬਰ ਆਪਟਿਕ ਕੇਬਲ ਨਾਲ ਜੁੜਿਆ ਹੋਇਆ ਸੀ। ਮੋਟਰ ਗਤੀਵਿਧੀ ਦੀ 10-ਮਿੰਟ ਦੀ ਰਿਕਾਰਡਿੰਗ ਦੌਰਾਨ, ਜਾਨਵਰ ਪਿੰਜਰੇ ਦੀ ਪੜਚੋਲ ਕਰਨ ਲਈ ਸੁਤੰਤਰ ਸਨ। ਪੈਦਾ ਹੋਈ ਗਤੀਵਿਧੀ ਨੂੰ ਰਿਕਾਰਡ ਕਰਨ ਲਈ, ਚੂਹਿਆਂ (ਟ੍ਰਾਂਸਪਲਾਂਟੇਸ਼ਨ ਤੋਂ 140 ਦਿਨਾਂ ਤੋਂ ਵੱਧ) ਨੂੰ ਇੰਡਕਸ਼ਨ ਲਈ 5% ਆਈਸੋਫਲੂਰੇਨ ਅਤੇ ਰੱਖ-ਰਖਾਅ ਲਈ 1-3% ਆਈਸੋਫਲੂਰੇਨ ਨਾਲ ਬੇਹੋਸ਼ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ। ਜਾਨਵਰ ਨੂੰ ਇੱਕ ਸਟੀਰੀਓਟੈਕਟਿਕ ਫਰੇਮ (ਕੋਪਫ) ਵਿੱਚ ਰੱਖੋ ਅਤੇ t-hCO ਦੇ ਉਲਟ ਪਾਸੇ ਦੇ ਮੁੱਛਾਂ ਨੂੰ ਲਗਭਗ 2 ਸੈਂਟੀਮੀਟਰ ਤੱਕ ਕੱਟਿਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ ਅਤੇ ਇੱਕ ਪਾਈਜ਼ੋਇਲੈਕਟ੍ਰਿਕ ਐਕਚੁਏਟਰ (PI) ਨਾਲ ਜੁੜੇ ਇੱਕ ਜਾਲ ਵਿੱਚੋਂ ਲੰਘਾਇਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ। ਇੱਕ 400 µm ਫਾਈਬਰ ਆਪਟਿਕ ਪੈਚ ਕੇਬਲ (ਡੋਰਿਕ) ਇਮਪਲਾਂਟ ਕੀਤੇ ਫਾਈਬਰ ਨਾਲ ਜੁੜਿਆ ਹੋਇਆ ਸੀ ਅਤੇ ਡੇਟਾ ਪ੍ਰਾਪਤੀ ਪ੍ਰਣਾਲੀ ਨਾਲ ਜੁੜਿਆ ਹੋਇਆ ਸੀ। t-hCO ਦੇ ਉਲਟ ਪਾਸੇ ਵਾਲੇ ਮੁੱਛਾਂ ਨੂੰ ਫਿਰ 20 ਮਿੰਟ ਦੀ ਰਿਕਾਰਡਿੰਗ ਮਿਆਦ ਦੇ ਦੌਰਾਨ ਇੱਕ ਪਾਈਜ਼ੋਇਲੈਕਟ੍ਰਿਕ ਡਰਾਈਵ ਦੁਆਰਾ ਬੇਤਰਤੀਬ ਸਮੇਂ 'ਤੇ 50 ਵਾਰ (20 Hz 'ਤੇ 2 mm, ਪ੍ਰਤੀ ਪੇਸ਼ਕਾਰੀ 2 s) ਮੋੜਿਆ ਗਿਆ। ਕਸਟਮ MATLAB ਕੋਡ ਨਾਲ ਮੋੜ ਦੇ ਸਮੇਂ ਨੂੰ ਕੰਟਰੋਲ ਕਰਨ ਲਈ Arduino MATLAB ਸਹਾਇਤਾ ਪੈਕੇਜ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰੋ। ਇਵੈਂਟਾਂ ਨੂੰ ਟਰਾਂਜ਼ਿਸਟਰ-ਟ੍ਰਾਂਜ਼ਿਸਟਰ ਲਾਜਿਕ (TTL) ਪਲਸਾਂ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ ਡੇਟਾ ਪ੍ਰਾਪਤੀ ਸੌਫਟਵੇਅਰ ਨਾਲ ਸਮਕਾਲੀ ਕੀਤਾ ਜਾਂਦਾ ਹੈ।
ਚੂਹਿਆਂ (ਟ੍ਰਾਂਸਪਲਾਂਟੇਸ਼ਨ ਤੋਂ ਬਾਅਦ 140 ਦਿਨਾਂ ਤੋਂ ਵੱਧ) ਨੂੰ 5% ਆਈਸੋਫਲੂਰੇਨ ਅਨੱਸਥੀਸੀਆ ਨਾਲ ਪ੍ਰੇਰਿਤ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਅਤੇ 1-3% ਆਈਸੋਫਲੂਰੇਨ ਨਾਲ ਇੰਟਰਾਓਪਰੇਟਿਵ ਤਰੀਕੇ ਨਾਲ ਬੇਹੋਸ਼ ਕੀਤਾ ਗਿਆ। ਜਾਨਵਰਾਂ ਨੂੰ ਇੱਕ ਸਟੀਰੀਓਟੈਕਸਿਕ ਫਰੇਮ (ਕੋਪਫ) ਵਿੱਚ ਰੱਖਿਆ ਗਿਆ ਅਤੇ ਬਿਊਪ੍ਰੇਨੋਰਫਾਈਨ ਐਸਆਰ ਅਤੇ ਡੈਕਸਾਮੇਥਾਸੋਨ ਨੂੰ ਚਮੜੀ ਦੇ ਹੇਠਾਂ ਟੀਕਾ ਲਗਾਇਆ ਗਿਆ। ਖੋਪੜੀ ਨੂੰ ਖੋਲ੍ਹਿਆ ਗਿਆ, ਸਾਫ਼ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਅਤੇ 3-5 ਹੱਡੀਆਂ ਦੇ ਪੇਚ ਪਾਏ ਗਏ। ਟੀ-ਐਚਸੀਓ ਨੂੰ ਨਿਸ਼ਾਨਾ ਬਣਾਉਣ ਲਈ, ਅਸੀਂ ਐਮਆਰਆਈ ਚਿੱਤਰਾਂ ਤੋਂ ਸਟੀਰੀਓਟੈਕਸਿਕ ਕੋਆਰਡੀਨੇਟਸ ਤਿਆਰ ਕੀਤੇ। ਟ੍ਰਾਂਸਪਲਾਂਟ ਕੀਤੇ ਐਚਸੀਓ ਉੱਤੇ ਸਿੱਧੇ ਇੱਕ ਤੇਜ਼ ਰਫ਼ਤਾਰ ਡ੍ਰਿਲ ਨਾਲ ਇੱਕ ਗੋਲਾਕਾਰ ਕ੍ਰੈਨੀਓਟੋਮੀ (ਲਗਭਗ 1 ਸੈਂਟੀਮੀਟਰ ਵਿਆਸ) ਕੀਤੀ ਗਈ। ਇੱਕ ਵਾਰ ਹੱਡੀ ਜਿੰਨੀ ਸੰਭਵ ਹੋ ਸਕੇ ਪਤਲੀ ਹੋ ਜਾਂਦੀ ਹੈ, ਪਰ ਪੂਰੀ ਹੱਡੀ ਵਿੱਚੋਂ ਡ੍ਰਿਲ ਕਰਨ ਤੋਂ ਪਹਿਲਾਂ, ਅੰਡਰਲਾਈੰਗ ਟੀ-ਐਚਸੀਓ ਨੂੰ ਪ੍ਰਗਟ ਕਰਨ ਲਈ ਬਾਕੀ ਬਚੀ ਹੋਈ ਪੇਲਵਿਕ ਡਿਸਕ ਨੂੰ ਹਟਾਉਣ ਲਈ ਫੋਰਸੇਪਸ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰੋ। ਕ੍ਰੈਨੀਓਟੋਮੀ ਨੂੰ ਨਿਰਜੀਵ ਖਾਰੇ ਨਾਲ ਭਰਿਆ ਗਿਆ ਸੀ, ਅਤੇ ਇੱਕ ਕਵਰਸਲਿਪ ਅਤੇ ਇੱਕ ਵਿਸ਼ੇਸ਼ ਹੈੱਡ ਪਿੰਨ ਨੂੰ ਯੂਵੀ-ਕਿਊਰਡ ਡੈਂਟਲ ਸੀਮਿੰਟ (ਰੀਲਿਕਸ) ਨਾਲ ਖੋਪੜੀ ਨਾਲ ਜੋੜਿਆ ਗਿਆ ਸੀ।
ਦੋ-ਫੋਟੋਨ ਇਮੇਜਿੰਗ ਇੱਕ Nikon LWD (×16, 0.8 NA) ਉਦੇਸ਼ ਨਾਲ ਇੱਕ Bruker ਮਲਟੀਫੋਟੋਨ ਮਾਈਕ੍ਰੋਸਕੋਪ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ ਕੀਤੀ ਗਈ। GCaMP6 ਇਮੇਜਿੰਗ 920 nm 'ਤੇ 1.4x ਸਿੰਗਲ z-ਪਲੇਨ ਮੈਗਨੀਫਿਕੇਸ਼ਨ ਅਤੇ 8x ਔਸਤ 7.5 fps ਦੇ ਨਾਲ ਕੀਤੀ ਗਈ। ਚੂਹਿਆਂ ਨੂੰ 5% ਆਈਸੋਫਲੂਰੇਨ ਅਨੱਸਥੀਸੀਆ ਨਾਲ ਪ੍ਰੇਰਿਤ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ ਅਤੇ 1-3% ਆਈਸੋਫਲੂਰੇਨ ਨਾਲ ਬਣਾਈ ਰੱਖਿਆ ਗਿਆ ਸੀ। ਚੂਹਿਆਂ ਨੂੰ ਇੱਕ ਕਸਟਮ ਬਣਾਏ ਹੈੱਡ ਫਿਕਸਚਰ ਵਿੱਚ ਰੱਖਿਆ ਗਿਆ ਸੀ ਅਤੇ ਲੈਂਸ ਦੇ ਹੇਠਾਂ ਰੱਖਿਆ ਗਿਆ ਸੀ। ਮੋਟਰ ਗਤੀਵਿਧੀ ਦੀ 3-ਮਿੰਟ ਦੀ ਬੈਕਗ੍ਰਾਉਂਡ ਰਿਕਾਰਡਿੰਗ ਪ੍ਰਾਪਤ ਕੀਤੀ ਗਈ ਸੀ। ਰਿਕਾਰਡਿੰਗ ਦੇ 20 ਮਿੰਟਾਂ ਦੇ ਦੌਰਾਨ, 50 ਪਫ (ਹਰੇਕ ਪੇਸ਼ਕਾਰੀ 100 ms ਲੰਬੇ) ਨੂੰ ਇੱਕ ਪਿਕੋਸਪ੍ਰਾਈਸਰ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੇ ਹੋਏ t-hCO ਦੇ ਉਲਟ ਵਿਸਕਰ ਪੈਡ 'ਤੇ ਬੇਤਰਤੀਬ ਢੰਗ ਨਾਲ ਡਿਲੀਵਰ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ। ਕਸਟਮ MATLAB ਕੋਡ ਨਾਲ ਬਰਸਟ ਟਾਈਮ ਨੂੰ ਕੰਟਰੋਲ ਕਰਨ ਲਈ Arduino MATLAB ਸਪੋਰਟ ਪੈਕੇਜ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰੋ। TTL ਪਲਸਾਂ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੇ ਹੋਏ ਡੇਟਾ ਪ੍ਰਾਪਤੀ ਸੌਫਟਵੇਅਰ (PrairieView 5.5) ਨਾਲ ਇਵੈਂਟਾਂ ਨੂੰ ਸਿੰਕ੍ਰੋਨਾਈਜ਼ ਕਰੋ। ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਲਈ, ਫਿਜੀ ਵਿੱਚ ਸ਼ੁਰੂ ਕੀਤੇ ਗਏ MoCo ਪ੍ਰੋਗਰਾਮ ਵਿੱਚ affine ਸੁਧਾਰ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ xy ਮੋਸ਼ਨ ਲਈ ਚਿੱਤਰਾਂ ਨੂੰ ਠੀਕ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ। CNMF-E43 ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੇ ਹੋਏ ਵਿਅਕਤੀਗਤ ਸੈੱਲਾਂ ਤੋਂ ਫਲੋਰੋਸੈਂਟ ਟਰੇਸ ਕੱਢਣਾ। ਦਿਲਚਸਪੀ ਦੇ ਹਰੇਕ ਖੇਤਰ ਲਈ ਫਲੋਰੋਸੈਂਸ ਕੱਢਿਆ ਗਿਆ ਸੀ, dF/F ਕਰਵ ਵਿੱਚ ਬਦਲਿਆ ਗਿਆ ਸੀ, ਅਤੇ ਫਿਰ z-ਸਕੋਰ ਵਿੱਚ ਬਦਲਿਆ ਗਿਆ ਸੀ।
ਚੂਹਿਆਂ (ਟ੍ਰਾਂਸਪਲਾਂਟੇਸ਼ਨ ਤੋਂ ਬਾਅਦ 140 ਦਿਨਾਂ ਤੋਂ ਵੱਧ) ਨੂੰ 5% ਆਈਸੋਫਲੂਰੇਨ ਅਨੱਸਥੀਸੀਆ ਨਾਲ ਪ੍ਰੇਰਿਤ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਅਤੇ 1-3% ਆਈਸੋਫਲੂਰੇਨ ਨਾਲ ਇੰਟਰਾਓਪਰੇਟਿਵ ਤਰੀਕੇ ਨਾਲ ਬੇਹੋਸ਼ ਕੀਤਾ ਗਿਆ। ਜਾਨਵਰਾਂ ਨੂੰ ਇੱਕ ਸਟੀਰੀਓਟੈਕਸਿਕ ਫਰੇਮ (ਕੋਪਫ) ਵਿੱਚ ਰੱਖਿਆ ਗਿਆ ਅਤੇ ਬਿਊਪ੍ਰੇਨੋਰਫਾਈਨ ਐਸਆਰ ਅਤੇ ਡੈਕਸਾਮੇਥਾਸੋਨ ਨੂੰ ਚਮੜੀ ਦੇ ਹੇਠਾਂ ਟੀਕਾ ਲਗਾਇਆ ਗਿਆ। ਟੀ-ਐਚਸੀਓ ਦੇ ਉਲਟ ਪਾਸੇ ਦੀਆਂ ਮੁੱਛਾਂ ਨੂੰ ਲਗਭਗ 2 ਸੈਂਟੀਮੀਟਰ ਤੱਕ ਕੱਟਿਆ ਗਿਆ ਅਤੇ ਇੱਕ ਪਾਈਜ਼ੋਇਲੈਕਟ੍ਰਿਕ ਐਕਚੁਏਟਰ ਨਾਲ ਜੁੜੇ ਇੱਕ ਜਾਲ ਰਾਹੀਂ ਥ੍ਰੈੱਡ ਕੀਤਾ ਗਿਆ। ਖੋਪੜੀ ਨੂੰ ਬੇਨਕਾਬ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਅਤੇ ਸਾਫ਼ ਕੀਤਾ ਗਿਆ। ਇੱਕ ਸਟੇਨਲੈਸ ਸਟੀਲ ਗਰਾਊਂਡ ਪੇਚ ਖੋਪੜੀ ਨਾਲ ਜੁੜਿਆ ਹੋਇਆ ਹੈ। ਟੀ-ਐਚਸੀਓ ਨੂੰ ਨਿਸ਼ਾਨਾ ਬਣਾਉਣ ਲਈ, ਅਸੀਂ ਐਮਆਰਆਈ ਚਿੱਤਰਾਂ ਤੋਂ ਸਟੀਰੀਓਟੈਕਸਿਕ ਕੋਆਰਡੀਨੇਟਸ ਤਿਆਰ ਕੀਤੇ। ਟੀ-ਐਚਸੀਓ ਦੇ ਬਿਲਕੁਲ ਉੱਪਰ ਇੱਕ ਹਾਈ ਸਪੀਡ ਡ੍ਰਿਲ ਨਾਲ ਇੱਕ ਗੋਲਾਕਾਰ ਕ੍ਰੈਨੀਓਟੋਮੀ (ਲਗਭਗ 1 ਸੈਂਟੀਮੀਟਰ ਵਿਆਸ) ਕਰੋ। ਇੱਕ ਵਾਰ ਹੱਡੀ ਜਿੰਨੀ ਪਤਲੀ ਹੋ ਜਾਵੇ, ਪਰ ਪੂਰੀ ਹੱਡੀ ਵਿੱਚੋਂ ਡ੍ਰਿਲ ਕਰਨ ਤੋਂ ਪਹਿਲਾਂ, ਅੰਡਰਲਾਈੰਗ ਟੀ-ਐਚਸੀਓ ਨੂੰ ਪ੍ਰਗਟ ਕਰਨ ਲਈ ਬਾਕੀ ਬਚੀ ਹੋਈ ਪੇਲਵਿਕ ਡਿਸਕ ਨੂੰ ਹਟਾਉਣ ਲਈ ਫੋਰਸੇਪਸ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰੋ। ਵਿਅਕਤੀਗਤ ਸੈੱਲਾਂ ਨੂੰ 32-ਚੈਨਲ ਜਾਂ 64-ਚੈਨਲ ਉੱਚ-ਘਣਤਾ ਵਾਲੇ ਸਿਲੀਕਾਨ ਪ੍ਰੋਬ (ਕੈਮਬ੍ਰਿਜ ਨਿਊਰੋਟੈਕ) ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ ਰਿਕਾਰਡ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ ਜੋ ਜ਼ਮੀਨੀ ਪੇਚਾਂ 'ਤੇ ਆਧਾਰਿਤ ਸਨ ਅਤੇ RHD ਐਂਪਲੀਫਾਇਰ (ਇੰਟਾਨ) ਨਾਲ ਪਹਿਲਾਂ ਤੋਂ ਐਂਪਲੀਫਾਈਡ ਸਨ। ਕ੍ਰੈਨੀਓਟੋਮੀ ਰਾਹੀਂ ਇਲੈਕਟ੍ਰੋਡਾਂ ਨੂੰ ਨਿਸ਼ਾਨਾ ਸਾਈਟ 'ਤੇ ਘਟਾਉਣ ਲਈ ਮੈਨੀਪੁਲੇਟਰ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰੋ, ਜੋ ਕਿ ਨਿਰਜੀਵ ਖਾਰੇ ਨਾਲ ਭਰਿਆ ਹੁੰਦਾ ਹੈ। ਓਪਨ ਐਫਿਸ ਡੇਟਾ ਪ੍ਰਾਪਤੀ ਪ੍ਰਣਾਲੀ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੇ ਹੋਏ 30 kHz ਦੀ ਬਾਰੰਬਾਰਤਾ 'ਤੇ ਡੇਟਾ ਸੰਗ੍ਰਹਿ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ। ਰਿਕਾਰਡਿੰਗ ਉਦੋਂ ਹੀ ਜਾਰੀ ਰਹੀ ਜਦੋਂ ਅਸੀਂ 10 ਤੋਂ ਵੱਧ ਚੈਨਲਾਂ ਵਿੱਚ ਬਹੁਤ ਜ਼ਿਆਦਾ ਸਹਿ-ਸਬੰਧਤ ਤਾਲਬੱਧ ਸਵੈ-ਚਾਲਤ ਗਤੀਵਿਧੀ ਦਾ ਪਤਾ ਲਗਾਇਆ, ਜੋ ਸੁਝਾਅ ਦਿੰਦਾ ਹੈ ਕਿ ਇਲੈਕਟ੍ਰੋਡ ਗ੍ਰਾਫਟ ਵਿੱਚ ਸਥਿਤ ਸਨ (ਦੋ-ਫੋਟੋਨ ਕੈਲਸ਼ੀਅਮ ਇਮੇਜਿੰਗ ਡੇਟਾ ਦੇ ਅਧਾਰ ਤੇ)। ਮੋਟਰ ਗਤੀਵਿਧੀ ਦੀ 10-ਮਿੰਟ ਦੀ ਪਿਛੋਕੜ ਰਿਕਾਰਡਿੰਗ ਪ੍ਰਾਪਤ ਕੀਤੀ ਗਈ ਸੀ। t-hCO ਦੇ ਉਲਟ ਪਾਸੇ ਦੇ ਮੁੱਛਾਂ ਨੂੰ ਫਿਰ 20 ਮਿੰਟ ਦੀ ਰਿਕਾਰਡਿੰਗ ਅਵਧੀ ਦੇ ਦੌਰਾਨ ਇੱਕ ਪਾਈਜ਼ੋਇਲੈਕਟ੍ਰਿਕ ਡਰਾਈਵ ਦੁਆਰਾ ਬੇਤਰਤੀਬ ਸਮੇਂ 'ਤੇ 50 ਵਾਰ (20 Hz 'ਤੇ 2 mm, ਪ੍ਰਤੀ ਪੇਸ਼ਕਾਰੀ 2 s) ਡਿਫਲੈਕਟ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ। Arduino (MATLAB 2019b) ਲਈ MATLAB ਸਹਾਇਤਾ ਪੈਕੇਜ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੇ ਹੋਏ, ਕਸਟਮ MATLAB ਕੋਡ ਨਾਲ ਡਿਫਲੈਕਸ਼ਨ ਸਮੇਂ ਨੂੰ ਕੰਟਰੋਲ ਕਰੋ। ਡਾਟਾ ਪ੍ਰਾਪਤੀ ਸੌਫਟਵੇਅਰ ਨਾਲ ਘਟਨਾਵਾਂ ਨੂੰ ਸਮਕਾਲੀ ਬਣਾਉਣ ਲਈ TTL ਪਲਸ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰੋ।
ਆਪਟੀਕਲ ਮਾਰਕਿੰਗ ਪ੍ਰਯੋਗਾਂ ਲਈ, 473 nm ਲੇਜ਼ਰ (Omicron) ਨਾਲ ਜੁੜਿਆ 200 µm ਆਪਟੀਕਲ ਪੈਚ ਕੋਰਡ (ਡੋਰਿਕ) ਕ੍ਰੈਨੀਓਟੋਮੀ ਦੇ ਉੱਪਰ ਰੱਖੇ 200 µm ਆਪਟੀਕਲ ਫਾਈਬਰ ਨਾਲ ਜੁੜਿਆ ਹੋਇਆ ਸੀ। ਇਸ ਤੋਂ ਤੁਰੰਤ ਪਹਿਲਾਂ, ਜੰਪਰ ਪਾਵਰ ਨੂੰ 20 ਮੈਗਾਵਾਟ ਤੱਕ ਐਡਜਸਟ ਕਰੋ। ਕ੍ਰੈਨੀਓਟੋਮੀ ਰਾਹੀਂ ਇਲੈਕਟ੍ਰੋਡਾਂ ਨੂੰ ਨਿਸ਼ਾਨਾ ਸਾਈਟ 'ਤੇ ਘਟਾਉਣ ਲਈ ਮੈਨੀਪੁਲੇਟਰ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰੋ, ਜੋ ਕਿ ਨਿਰਜੀਵ ਖਾਰੇ ਨਾਲ ਭਰਿਆ ਹੁੰਦਾ ਹੈ। ਰਿਕਾਰਡਿੰਗ ਦੀ ਸ਼ੁਰੂਆਤ ਵਿੱਚ, 473 nm (ਫ੍ਰੀਕੁਐਂਸੀ 2 Hz, ਪਲਸ ਦੀ ਮਿਆਦ 10 ms) ਪ੍ਰਕਾਸ਼ ਦੀਆਂ ਦਸ ਪਲਸਾਂ ਨਿਕਲੀਆਂ ਸਨ। ਫੋਟੋਸੈਂਸਟਿਵ ਸੈੱਲਾਂ ਨੂੰ ਉਹਨਾਂ ਸੈੱਲਾਂ ਵਜੋਂ ਪਰਿਭਾਸ਼ਿਤ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ ਜਿਨ੍ਹਾਂ ਨੇ 70% ਜਾਂ ਇਸ ਤੋਂ ਵੱਧ ਟ੍ਰਾਇਲਾਂ ਵਿੱਚ 10 ms ਪ੍ਰਕਾਸ਼ ਦੇ ਅੰਦਰ ਸਪਾਈਕ ਪ੍ਰਤੀਕਿਰਿਆ ਪ੍ਰਦਰਸ਼ਿਤ ਕੀਤੀ ਸੀ।