Täname teid Nature.com-i külastamise eest. Teie brauseriversioon toetab piiratud CSS-i. Parima kogemuse saamiseks soovitame teil kasutada ajakohast brauserit (või keelata Internet Exploreris ühilduvusrežiimi). Lisaks kuvame saiti pideva toe tagamiseks ilma stiilide ja JavaScriptita.
Kuvab korraga kolmest slaidist koosneva karusselli. Kolme slaidi korraga läbimiseks kasutage nuppe Eelmine ja Järgmine või kolme slaidi korraga läbimiseks lõpus olevaid liuguri nuppe.
Iseorganeeruvad närviorganellid on paljulubav in vitro platvorm inimese arengu ja haiguste modelleerimiseks. Organoididel puudub aga in vivo eksisteeriv ühenduvus, mis piirab küpsemist ja takistab integreerumist teiste käitumist kontrollivate ahelatega. Siin näitame, et inimese tüvirakkudest pärinevad ajukoore organoidid, mis siirdati vastsündinud karvutute rottide somatosensoorsesse ajukoorde, arendavad küpseid rakutüüpe, mis integreeruvad sensoorsetesse ja motivatsiooniga seotud ahelatesse. MRI näitas siirdamisjärgset organoidide kasvu mitmetes tüvirakkude liinides ja loomades, samas kui ühetuumaline analüüs näitas kortikogeneesi progresseerumist ja aktiivsusest sõltuva transkriptsiooniprogrammi teket. Siirdatud ajukoore neuronitel on tõepoolest keerukamad morfoloogilised, sünaptilised ja sisemembraani omadused kui nende in vitro analoogidel, mis võimaldab tuvastada neuronaalseid defekte Timothy sündroomiga patsientidel. Anatoomiline ja funktsionaalne jälgimine on näidanud, et siirdatud organellid saavad talamokortikaalseid ja kortikokortikaalseid sisendeid ning närviaktiivsuse in vivo salvestused viitavad sellele, et need sisendid võivad tekitada sensoorseid reaktsioone inimese rakkudes. Lõpuks pikendavad ajukoore organoidid aksoneid kogu roti ajju ja nende optogeneetiline aktiveerimine viib tasu otsiva käitumiseni. Seega küpsevad siirdatud inimese ajukoore neuronid ja osalevad peremeesorganismi käitumist kontrollivates ahelates. Me eeldame, et see lähenemisviis hõlbustab patsientidelt pärinevate rakkude ahelataseme fenotüüpide tuvastamist, mida ei saa muul viisil tuvastada.
Arenev inimese aju on tähelepanuväärne iseorganiseeruv protsess, mille käigus rakud prolifereeruvad, diferentseeruvad, migreeruvad ja ühenduvad, moodustades funktsionaalseid neuronaalseid ahelaid, mida sensoorse kogemuse kaudu veelgi täiustatakse. Inimese aju arengu mõistmisel, eriti haiguste kontekstis, on peamine probleem ajukoele juurdepääsu puudumine. Iseorganiseeruvad organellid, sealhulgas inimese ajukoore organoidid (hCO; tuntud ka kui inimese ajukoore sfäär), võivad genereerida 2,3,4,5,6. Siiski piiravad mitmed piirangud nende laiemat rakendamist närviahelate arengu ja toimimise mõistmisel. Eelkõige on ebaselge, kas hCO küpsemist piirab teatud mikrokeskkonna ja sensoorsete sisendite puudumine in vivo. Lisaks, kuna hCO-d ei ole integreeritud ahelatesse, mis võivad genereerida käitumuslikke tulemusi, on nende kasulikkus geneetiliselt keerukate ja käitumuslike neuropsühhiaatriliste häirete modelleerimisel praegu piiratud.
HCO siirdamine tervesse elavasse ajju aitab neist piirangutest üle saada. Varasemad uuringud on näidanud, et näriliste ajukoorde siirdatud inimese neuronid on võimelised ellu jääma, projitseerima ja näriliste rakkudega suhtlema7,8,9,10,11,12. Neid katseid tehakse aga tavaliselt täiskasvanud loomadel, mis võib piirata sünaptilist ja aksonaalset integratsiooni. Siin kirjeldame siirdamisparadigmat, milles siirdasime hiPS-rakkudest saadud 3D hCO immuundefitsiitsete rottide primaarsesse somatosensorsesse ajukoore (S1) plastilise arengu varases staadiumis. Siiratud hCO (t-hCO) neuronid läbivad olulise küpsemise, saavad talamokortikaalseid ja kortikaal-kortikaalseid sisendeid, mis kutsuvad esile sensoorseid reaktsioone, ja laiendavad aksonite projektsioone roti ajju, et juhtida tasu otsivat käitumist. t-hCO pikaajaline küpsemine on näidanud neuronite defekte Timothy sündroomiga (TS) patsientidel, mis on raske geneetiline häire, mille põhjustavad mutatsioonid pingetundlikus L-tüüpi CaV1.2 kaltsiumikanalis (kodeerib CACNA1C).
Inimese ajukoore neuronite uurimiseks ajuringutes in vivo siirdasime stereotaktiliselt intaktset 3D hCO2-d varajaste postnataalsete atüümsete rottide S1-sse (3.-7. päev pärast sünnitust) (joonis 1a ja laiendatud andmed joonisel 1a-c). Selleks hetkeks ei ole talamokortikaalsed ja kortikokortikaalsed aksonite projektsioonid veel oma S1 innervatsiooni lõpetanud (viide 13). Seega on see lähenemisviis loodud t-hCO2 integratsiooni maksimeerimiseks, minimeerides samal ajal mõju endogeensetele ajuringidele. t-hCO2 asukoha visualiseerimiseks elusloomades teostasime rottide T2-kaalutud MRI aju rekonstruktsioone 2-3 kuud pärast siirdamist (joonis 1b ja laiendatud andmed, joonis 1d). t-hCO2 oli kergesti jälgitav ja t-hCO2 mahu mõõtmised olid sarnased fikseeritud viilude põhjal arvutatutega (laiendatud andmed, joonis 1d, e; P > 0,05). t-hCO2 oli kergesti jälgitav ja t-hCO2 mahu mõõtmised olid sarnased fikseeritud viilude põhjal arvutatutega (laiendatud andmed, joonis 1d, e; P > 0,05). t-hCO легко наблюдались, а объемные измерения t-hCO были аналогичны рассчитанным для фиксировансрезох данные, рис 1d, P> 0,05). t-hCO2 oli kergesti jälgitav ja volumetrilised t-hCO2 mõõtmised olid sarnased fikseeritud sektsioonide puhul arvutatutega (laiendatud andmed, joonis 1d, e; P > 0, 05).很容易观察到t-hCO，并且t-hCO的体积测量值与从固定切片计算的测量值相似（扩展数据图、e；P > 0,05＀很容易观察到t-hCO，并且t-hCO t-hCO легко наблюдался, а объемные измерения t-hCO были аналогичны рассчитанным для фиксированзеревых данные, рис 1d, P> 0,05). t-hCO2 oli kergesti jälgitav ja volumetrilised t-hCO2 mõõtmised olid sarnased fikseeritud sektsioonide puhul arvutatutega (laiendatud andmed, joonis 1d, e; P > 0, 05).Me määrasime t-hCO2 81%-l siirdatud loomadest umbes 2 kuud pärast siirdamist (n = 72 looma; hCO2 10 hiPS-rakuliinist; hiPS-rakuliinid lisatabelis 1). Neist 87% asus ajukoores (joonis 1c). Tehes samal siirdatud rotil mitmel ajahetkel järjestikuseid MRI-skaneeringuid, leidsime 3 kuu jooksul t-hCO2 mahu üheksakordse suurenemise (joonis 1d ja laiendatud andmed, joonis 1f). Siirdatud loomadel oli 12 kuud pärast siirdamist kõrge ellujäämismäär (74%) (laiendatud andmed, joonis 1g ja lisatabel 2) ning ilmseid motoorseid ega mäluhäireid, glioosi ega elektroentsefalogrammi (EEG) ei leitud. Andmed joonisel 1g ja lisatabel 2). 1h–m ja 3e).
a, Eksperimentaalse disaini skeem. hiPS-rakkudest pärinev hCO2 siirdati vastsündinud karvutute rottide S1-sse diferentseerumise 30.–60. päeval. b, T2-kaalutud koronaalsed ja horisontaalsed MRI-pildid, mis näitavad t-hCO2 S1-s 2 kuud pärast siirdamist. Skaalariba, 2 mm. c, Iga hiPS-rakuliini (n = 108, numbrid tulpade sees näitavad t-hCO2 hulka hIPS-rakuliini kohta) ja kortikaalse või subkortikaalse asukoha (n = 88) siirdumise edukuse määrade kvantifitseerimine. d, Koronaararteri MRI-pilt (vasakul; skaalariba, 3 mm) ja vastav 3D-mahuline rekonstruktsioon (skaalariba, 3 mm), mis näitab t-hCO2 suurenemist 3 kuu jooksul. e, Rottide ajukoore t-hCO2 mustrite ülevaade. Skaalariba, 1 mm. f, t-hCO representatiivsed immunotsütokeemilised kujutised ülevalt vasakult paremale (diferentseerumise ajal): PPP1R17 (4 kuud vanad), NeuN (8 kuud vanad), SOX9 ja GFAP (8 kuud vanad), PDGFRα; (8 kuud), MAP2 (8 kuud) ja IBA1 (8 kuud). Skaalariba, 20 µm. HNA koekspressioon näitab inimpäritolu rakke. g, snRNA-seq: kõigi kõrgekvaliteediliste t-hCO tuumade ühendatud mitmekihiline ja projektsiooniline (UMAP) dimensiooni vähendamise kujutis pärast Seurati integreerimist (n = 3 t-hCO proovi, n = 2 hiPS rakuliini). Astrotsüüdid, astrotsüütide liini rakud; cyc prog, ringlevad eellasrakud; GluN DL, sügavad glutamaatergilised neuronid; GluN DL/SP, sügavad ja sublamellaarsed glutamaatergilised neuronid; GluN UL, ülemise kihi glutamaatergilised neuronid; oligodendrotsüüdid, oligodendrotsüüdid; OPC, oligodendrotsüütide eellasrakud; RELN, reeliini neuronid. h, geenide ontoloogia (GO) terminite rikastamise analüüs geenide kohta, mis on oluliselt ülesreguleeritud (korrigeeritud P 2, väljendatuna vähemalt 10% tuumades) t-hCO3 glutamaatergilistes neuronites võrreldes hCO3 glutamaatergiliste neuronitega. h, geenide ontoloogia (GO) terminite rikastamise analüüs geenide kohta, mis on oluliselt ülesreguleeritud (korrigeeritud P 2, väljendatuna vähemalt 10% tuumades) t-hCO3 glutamaatergilistes neuronites võrreldes hCO3 glutamaatergiliste neuronitega. h, Анализ обогащения терминов Geeniontoloogia (GO) для генов со значительной активацией (скорректированный P <0,05, ниязмен2, ниеиязмен2, экспрессия по крайней мере в 10% ядер) в глутаматергических нейронах t-hCO по сравнению с глутамачерских närvilised hCO-d. h, geeni ontoloogia (GO) termini rikastamise analüüs geenide puhul, millel on märkimisväärne aktivatsioon (korrigeeritud P 2, ekspressioon vähemalt 10% tuumades) t-hCO3 glutamaatergilistes neuronites võrreldes hCO3 glutamaatergiliste neuronitega. h，与hCO 谷氨酸能神经元相比，t-hCO 谷氨酸能神经元中基因显着上调（谎P
0,05，倍数变化> 2，在至少10% 的细胞核中表达）的基因本体论(GO) 术语富雠 h ， 与 hco 谷氨酸 能 元 相比 ， t-hco 谷氨酸 能 神经 元 基因 显着 基因 显着 基因 显着 上谎 ０ 0.变化 变化> 2 ， 至少 10% 的 核中 表达） 基因 基因 基因 的 的 的 焳 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的的 的 的 的本体论(GO) 术语富集分析. h, гены значительно активизировались (скорректированный P <0,05, кратность изменения> 2, экспрессируется по крайне) глутаматергических нейронах t-hCO по сравнению с глутаматергическими нейронами hCO Онтологический () термина обогащения. h, geenid olid t-hCO3 glutamaatergilistes neuronites oluliselt ülesreguleeritud (korrigeeritud P 2, ekspresseeritud vähemalt 10% tuumades) võrreldes hCO3 glutamaatergiliste neuronitega. Rikastamise termini ontoloogiline (GO) analüüs.Katkendjoon näitab aq väärtust 0,05. i, GluN-rakutüüpide UMAP-kuvamine t-hCO3-s, kasutades märgistuse ülekannet täiskasvanu motoorse ajukoore 22 snRNA-seq referentsandmestikust. CT — kortikotalamuse rakud, ET — ajuvälised rakud, IT — sisemised telentsefaalirakud, NP — lähiprojektsioon.
Seejärel hindasime t-hCO tsütoarhitektuuri ja üldist rakulist koostist. Rottide endoteelirakkude antikehadega värvimine näitas t-hCO vaskularisatsiooni, samas kui IBA1 värvimine näitas roti mikrogliia olemasolu kogu transplantaadis (joonis 1f ja laiendatud andmed, joonis 3c, d). Immunovärvimine näitas inimese tuumaantigeeni (HNA) suhtes positiivseid rakke, mis ekspresseerisid koos PPP1R17 (kortikaalsed eellasrakud), NeuN (neuronid), SOX9 ja GFAP (gliaalse päritoluga rakud) või PDGFRα (oligodendrotsüütide eellasrakud) (joonis 1f). t-hCO rakulise koostise uurimiseks üksikrakulisel resolutsioonil teostasime pärast umbes 8-kuulist diferentseerumist ühetuumalise RNA sekveneerimise (snRNA-seq). Roti tuumade massfiltreerimine ja eemaldamine andis 21 500 kvaliteetset inimese mononukleaarset kaarti (joonis 1g ja laiendatud andmed, joonis 4a, b). Tüüpiliste rakutüübi markerite ekspressioonimustrid identifitseerisid peamiste kortikaalsete rakuklasside klastreid, sealhulgas sügavaid ja pindmisi glutamaatergilisi neuroneid, ringlevaid eellasrakke, oligodendrotsüüte ja astrotsüütide liini (joonis 1g, laiendatud andmed, joonis 4c ja lisatabel 3). SATB2 ja CTIP2 immunovärvimine näitas, et hoolimata kortikaalsete alatüüpide olemasolust ei näidanud t-hCO selget anatoomilist kihistumist (laiendatud andmed, joonis 3a). staadiumiga sobitatud snRNA-seq hCO andis laias laastus sarnaseid rakuklasse, mõne erandiga, sealhulgas oligodendrotsüütide puudumine ja GABAergiliste neuronite olemasolu, mis võib peegeldada varem teatatud soodsaid in vitro tingimusi lateraalsete eellasrakkude jaoks15 (laiendatud andmed, joonis 4f–i ja lisatabel 4). Diferentsiaalse geeniekspressiooni analüüs näitas olulisi erinevusi glutamaatergiliste neuronite vahel t-hCO3 ja hCO3 vahel (lisa tabel 5), sealhulgas neuronite küpsemisega seotud geenikomplektide aktivatsiooni, nagu sünaptiline signaalimine, dendriitne lokaliseerimine ja pingega juhitava kanali aktiivsus (joonis 1h ja lisa tabel 5). Tabel 6). Seega näitasid kortikaalsed glutamaatergilised t-hCO3 neuronid kiirenenud transkriptsioonilist küpsemist.
Et selgitada, kas need transkriptsioonilised muutused t-hCO-s olid seotud hCO in vitro ja t-hCO in vivo morfoloogiliste erinevustega, rekonstrueerisime pärast 7–8-kuulist diferentseerumist ägedates lõikudes staadiumis sobitatud biotsütiiniga täidetud hCO ja hCO3. hCO neuronid (joonis 2a). t-hCO neuronid olid oluliselt suuremad, neil oli 1,5 korda suurem soma läbimõõt, kaks korda rohkem dendriite ja kokku kuus korda suurem dendriitide kogupikkus võrreldes in vitro hCO3-ga (joonis 2b). Lisaks täheldasime t-hCO neuronites oluliselt suuremat dendriitkärnide tihedust kui hCO neuronites (joonis 2c). See viitab sellele, et t-hCO neuronid läbivad ulatusliku dendriitkoe pikenemise ja hargnemise, mis koos jätkuva rakkude proliferatsiooniga võib kaasa aidata t-hCO intensiivsele kasvule pärast siirdamist (joonis 1d ja laiendatud andmed joonisel 1f). See ajendas meid uurima elektrofüsioloogilisi omadusi. Membraani mahtuvus oli kaheksa korda suurem (laiendatud andmed, joonis 8d), puhkeoleku membraanipotentsiaal oli hüperpolariseeritum (umbes 20 mV) ja voolusüstimine indutseeris t-hCO neuronites kõrgema maksimaalse ergastuskiiruse kui hCO neuronites in vitro (joonis 2d, e), mis on kooskõlas t-hCO suuremate ja keerukamate morfoloogiliste tunnustega. Lisaks oli spontaansete ergastavate postsünaptiliste voolusündmuste (EPSC) sagedus t-hCO neuronites oluliselt suurem (joonis 2f), mis viitab sellele, et t-hCO neuronites täheldatud dendriitiliste okaste suurenenud tihedus oli seotud funktsionaalse erutuvusega. Me kinnitasime hCO neuronite ebaküpsust in vitro, registreerides märgistatud glutamaatergilisi neuroneid (laiendatud andmed, joonis 6a-c).
a, biotsütiiniga täidetud hCO3 ja t-hCO3 neuronite 3D rekonstrueerimine pärast 8-kuulist diferentseerumist. b, Morfoloogiliste tunnuste kvantifitseerimine (n = 8 hCO neuronit, n = 6 t-hCO neuronit; **P = 0, 0084, *P = 0, 0179 ja ***P <0, 0001). b, Morfoloogiliste tunnuste kvantifitseerimine (n = 8 hCO neuronit, n = 6 t-hCO neuronit; **P = 0, 0084, *P = 0, 0179 ja ***P <0, 0001). б, количественная оценка морфологических признаков (n = 8 нейронов hCO, n = 6 нейронов t-hCO; ** P = 0,0084, 0,0 P = 0,0084, 0 P = 0,0084,0 * P = 9,0 b, morfoloogiliste tunnuste kvantifitseerimine ( n = 8 hCO neuronit, n = 6 t-hCO neuronit; ** P = 0, 0084, * P = 0, 0179 ja *** P <0, 0001). b，形态学特征的量化（n = 8 个hCO 神经元，n = 6 个t-hCO 神经元；**P = 0,0084，*P = 90 和*P = 90 0,0001). b，形态学特征的量化（n = 8 个hCO 神经元，n = 6 个t-hCO 神经元；**P = 0,0084，*P = 90 和*P = 90 0,0001). б, количественная оценка морфологических признаков (n = 8 нейронов hCO, n = 6 нейронов t-hCO; ** P = 0,0084, 0,0 P = 0,0084, 0 P = 0,0084,0 * P = 9,0 b, morfoloogiliste tunnuste kvantifitseerimine ( n = 8 hCO neuronit, n = 6 t-hCO neuronit; ** P = 0, 0084, * P = 0, 0179 ja *** P <0, 0001).c, hCO3 ja t-hCO3 dendriitharude 3D rekonstruktsioon pärast 8-kuulist diferentseerumist. Punased tärnid näitavad oletatavaid dendriitlülisid. Dendriitlülide tiheduse kvantifitseerimine (n = 8 hCO3 neuronit, n = 6 t-hCO3 neuronit; **P = 0,0092). d, puhkemembraani potentsiaali kvantifitseerimine (n = 25 hCO neuronit, n = 16 t-hCO neuronit; ***P <0, 0001). d, puhkemembraani potentsiaali kvantifitseerimine (n = 25 hCO neuronit, n = 16 t-hCO neuronit; ***P <0, 0001). d, количественная оценка мембранного потенциала покоя (n = 25 нейронов hCO, n = 16 нейронов t-hCO; *** P <0,0001). d, puhkemembraani potentsiaali kvantifitseerimine (n = 25 hCO neuronit, n = 16 t-hCO neuronit; ***P <0, 0001). d，静息膜电位的量化（n = 25 hCO 神经元，n = 16 t-hCO 神经元；***P < 0,0001）. d，静息膜电位的量化（n = 25 hCO 神经元，n = 16 t-hCO 神经元；***P < 0,0001）. d, количественная оценка мембранного потенциала покоя (n = 25 нейронов hCO, n = 16 нейронов t-hCO; *** P <0,0001). d, puhkemembraani potentsiaali kvantifitseerimine (n = 25 hCO neuronit, n = 16 t-hCO neuronit; ***P <0, 0001). e, korduva aktsioonipotentsiaali tulistamine hCO3-s ja t-hCO3-s, mis on indutseeritud suurenevate voolusüstimiste abil, ja maksimaalse tulistamiskiiruse kvantifitseerimine (n = 25 hCO3 neuronit, n = 16 t-hCO3 neuronit; ***P < 0, 0001). e, korduva aktsioonipotentsiaali tulistamine hCO3-s ja t-hCO3-s, mis on indutseeritud suurenevate voolusüstimiste abil, ja maksimaalse tulistamiskiiruse kvantifitseerimine (n = 25 hCO3 neuronit, n = 16 t-hCO3 neuronit; ***P < 0, 0001). e, повторное возбуждение потенциала действия в hCO ja t-hCO, вызванное увеличением тока, и количественная оманочественная скорости возбуждения (n = 25 нейронов hCO, n = 16 нейронов t-hCO; *** P <0,0001). e, voolu suurenemise ja maksimaalse tulistamiskiiruse kvantifitseerimise poolt indutseeritud hCO3 ja t-hCO3 aktsioonipotentsiaali taasaktiveerumine (n = 25 hCO3 neuronit, n = 16 t-hCO3 neuronit; *** P < 0, 0001). e，通过增加电流注入诱导的hCO 和t-hCO 重复动作电位放电，以及最大放电 最大放电个hCO 神经元，n = 16 个t-hCO 神经元；***P < 0,0001）. E ， 通过 增加 电流 注入 的 的 hco 和 t-hco 重复 电位 放电 ， 以及 最 大 的 最 大 的 2个 hco 神经 ， n = 16 个 t-hco 神经 ； *** p <0,0001） 。 e, повторяющееся возбуждение потенциала действия hCO и t-hCO, вызванное увеличением подачи тока, и колциенчи тока максимальной скорости возбуждения (n = 25 нейронов hCO, n = 16 нейронов t-hCO; *** P <0,0001). e, suurenenud vooluvarustuse poolt indutseeritud hCO3 ja t-hCO3 aktsioonipotentsiaalide korduv tulistamine ja maksimaalse tulistamiskiiruse kvantifitseerimine (n = 25 hCO3 neuronit, n = 16 t-hCO3 neuronit; *** P < 0, 0001). f, spontaansed EPSC-d (sEPSC-d) hCO ja t-hCO neuronites 8 kuu möödudes diferentseerumisest ja sünaptiliste sündmuste sageduse kvantifitseerimine (n = 25 hCO neuronit, n = 17 t-hCO neuronit; ***P <0, 0001). f, spontaansed EPSC-d (sEPSC-d) hCO ja t-hCO neuronites 8 kuu möödudes diferentseerumisest ja sünaptiliste sündmuste sageduse kvantifitseerimine (n = 25 hCO neuronit, n = 17 t-hCO neuronit; ***P < 0, 0001). f, спонтанные EPSC (sEPSC) в нейронах hCO ja t-hCO через 8 месяцев дифференцировки и количественная оценты синаптических событий (n = 25 нейронов hCO, n = 17 нейронов t-hCO; *** P <0,0001) . f, spontaansed EPSC-d (sEPSC-d) hCO ja t-hCO neuronites 8 kuu möödudes diferentseerumisest ja sünaptiliste sündmuste määramise kvantifitseerimisest ( n = 25 hCO neuronit, n = 17 t-hCO neuronit; *** P <0, 0001). f，分化8 个月时hCO 和t-hCO 神经元中的自发性EPSC-d (sEPSC)，以及突触事件频率的2Ｆ事件频率的神经元，n = 17 t-hCO 神经元；***P < 0,0001） . f，分化8 个月时hCO 和t-hCO 神经元中的自发性EPSC-d (sEPSC)，以及突触事件频率的2Ｆ事件频率的神率的量匼（n = 25 hCO 神率的量匼（n = 25hCO P < 0,0001） . f, спонтанные EPSC (sEPSC) в нейронах hCO ja t-hCO через 8 месяцев дифференцировки и количественная оценты синаптических событий (n = 25 нейронов hCO, n = 17 нейронов t-hCO; *** P <0,0001). f, spontaansed EPSC-d (sEPSC-d) hCO ja t-hCO neuronites 8 kuu möödudes diferentseerumisest ja sünaptiliste sündmuste määrade kvantifitseerimisest (n = 25 hCO neuronit, n = 17 t-hCO neuronit; *** P <0, 0001).Bf puhul võeti liinil 1208-2 olevad hCO3 ja t-hCO3 samast paralleelselt hoitud diferentseerumispartiist. g, Geenikomplekti rikastamise analüüs (ühekülgne Fisheri täpne test) geenide kohta, mis olid oluliselt ülesreguleeritud (korrigeeritud P < 0,05, kordsmuutus > 2, ekspresseeritud vähemalt 10% tuumades) t-hCO glutamaatergilistes neuronites võrreldes hCO glutamaatergiliste neuronitega, millel on nii varajase vastuse (ERG) kui ka hilise vastuse (LRG) aktiivsusest sõltuvate geenide geenikomplektid, mis on identifitseeritud in vivo hiire uuringust16 ja inimese spetsiifilistest LRG-dest in vitro neuronitest17. g, Geenikomplekti rikastamise analüüs (ühekülgne Fisheri täpne test) geenide kohta, mis olid oluliselt ülesreguleeritud (korrigeeritud P < 0,05, kordsmuutus > 2, ekspresseeritud vähemalt 10% tuumades) t-hCO glutamaatergilistes neuronites võrreldes hCO glutamaatergiliste neuronitega, millel on nii varajase vastuse (ERG) kui ka hilise vastuse (LRG) aktiivsusest sõltuvate geenide geenikomplektid, mis on identifitseeritud in vivo hiire uuringust16 ja inimese spetsiifilistest LRG-dest in vitro neuronitest17. g, анализ обогащения набора генов (односторонний точный критерий Фишера) генов со значительной активацией (скорва,05 активацией) кратность изменения > 2, экспрессия по меньшей мере в 10% ядер) в глутаматергических нейронах t-hCO по сравнению с глутаматергическими нейронами hCO наборы генов как раннего (ERG), так и позднего (LRG) генов, нотергическими, зав идентифицированных в исследовании на мышах in vivo16, и специфических для человека LRG из нейронов in vitro17. g, t-hCO glutamaatergiliste neuronite olulise aktivatsiooniga geenide (korrigeeritud P<0,05, kordsmuutus>2, ekspressioon vähemalt 10% tuumades) geenikomplekti rikastamise analüüs (ühesuunaline Fisheri täpne test) võrreldes in vivo hiirtel16 ja neuronitest in vitro17 identifitseeritud inimesespetsiifiliste LRG-dega hCO glutamaatergiliste neuronite komplektidega, mis sisaldavad nii varajast (ERG) kui ka hilist (LRG) aktiivsusest sõltuvaid geene. g，t-hCO谷氨酸能神经元与hCO谷氨酸能神经元相比，t -hCO谷氨酸能神经元显着上调（调整后P<0,05，倍数变化>2，在至少10%的细胞核中表达）的基因集富集分析（单侧F isher精确检验）从体内小鼠研究中鉴定的早期反应(ERG)和晚期反应(LRG) 活性依赖性基因的基因组16 和体外神经元17 中的人类特LRG异 g ， t-hco 谷氨酸 神经 元 与 hco 谷氨酸 神经 元 相比 ， t-hco 谷氨酸 神 䎈 调 氨酸 尃 调 神经 元<0.05 ， 倍数> 2 ， 至少 至少 10% 的 细胞 核中 表达） 的 集富集 分析 侈单体内 小鼠 研究 中 的 早期 反应 反应 反应 和 晚期 反应 反应 (lrg) 活性 基因 的 基 基因 的 基 因 的 基 因神经元 17 中 中 17 中 17的人类特异性LRG. g, глутаматергические нейроны t-hCO были значительно активизированы по сравнению с глутаматергическимие (скорректированный P<0,05, кратность изменения> 2, не менее 10% раннего ответа (ERG) ja позднего гены, зависящие от активности ответа (LRG), идентифицированные in иссясле vivo16 ja нейронах in vitro17. LRG, специфичные для человека. g, t-hCO3 glutamaatergilised neuronid olid oluliselt ülesreguleeritud võrreldes hCO3 glutamaatergiliste neuronitega (korrigeeritud P<0,05, kordsus >2, vähemalt 10%). Varajase vastuse (ERG) ja hilise vastuse geenide rikastamise analüüs (ühesuunaline Fisheri täpne test) tuvastas in vivo hiirtel16 ja in vitro neuronitel17 inimesele spetsiifilised LRG-d.Katkendjoon näitab Bonferroni korrigeeritud P-väärtust 0,05. h, GluN geeni ekspressioon (pseudopakett ja iga geeni skaleerimine) oli oluliselt ülesreguleeritud LRG geenide snRNA-seq koopiates t-hCO3 glutamaatergilistes neuronites. i, immunovärvimine, mis näitab SCG2 ekspressiooni t-hCO3 (ülemine) ja hCO3 (alumine) neuronites. Valged nooled osutavad SCG2+ rakkudele. Skaalariba, 25 µm. Andmed on väljendatud keskmise ± standardhälbena.
Lähtudes t-hCO suurenenud aktiivsusest ex vivo viiludes, näitas snRNA-seq aktiivsusest sõltuvat geenitranskriptide ülesreguleerimist t-hCO-s võrreldes hCO3-ga in vitro. Glutamatergilised t-hCO neuronid ekspresseerisid kõrgemal tasemel geene, mis reguleerivad hilist vastuse aktiivsust (joonis 2g, h), mida leiti varasemates uuringutes hiire ja inimese neuronitega16,17. Näiteks BDNF18, SCG2 ja OSTN, primaadispetsiifiline aktiivsust reguleeriv geen, näitasid suurenenud ekspressiooni t-hCO neuronites võrreldes hCO neuronitega (joonis 2g-i). Seega näitasid t-hCO neuronid transkriptsioonilise, morfoloogilise ja funktsionaalse analüüsi põhjal paremaid küpsemisomadusi võrreldes hCO neuronitega.
Et täpsemalt hinnata t-hCO küpsemise seost inimese aju arenguga, viisime läbi loote ja täiskasvanu ajukoore rakutüüpide19,20 ja täiskasvanu21,22 transkriptoomilised võrdlused ning uurisime ulatuslikke andmeid ajukoore geenide ekspressiooni23 kohta arengu ajal (laiendatud andmed, joonis 5). Varasema tööga24 võrreldes on hCO ja t-hCO transkriptoomide üldine küpsemise staatus 7–8 diferentseerumiskuul laias laastus kooskõlas in vivo arenguajaga ja kõige enam samaväärne loote elu lõpuga (laiendatud andmed, joonis 5a). Märkimisväärselt täheldasime t-hCO-s suurenenud transkriptoomi küpsust võrreldes vanuselt sobiva hCO-ga, samuti transkriptoomi aktivatsiooni, mis oli seotud sünaptogeneesi, astrogeneesi ja müeliniseerumisega (laiendatud andmed, joonis 5b-d). Rakutasandil leidsime t-hCO-s tõendeid õhema ajukoore alatüübi kohta, kus glutamaatergiliste neuronite klastrid kattuvad täiskasvanud L2/3, L5 ja L6 neuronite alatüüpidega (joonis 1i). Seevastu oli glutamaatergiliste t-hCO neuronite ja loote kortikaalsete neuronite klastrite kattumine raseduse keskel piiratum (laiendatud andmed, joonis 5e-j). Et teha kindlaks, kas t-hCO neuronid on funktsionaalselt sarnased inimese postnataalsete neokortikaalsete neuronitega, viisime läbi inimese L2/3 püramiidneuronite elektrofüsioloogilised salvestused ja anatoomilised rekonstruktsioonid inimese postnataalse koore teravates lõikudes (laiendatud andmed, joonis 7a). L2/3 püramiidneuronite elektrofüsioloogilised omadused olid sarnased t-hCO püramiidneuronite omadega (laiendatud andmed, joonis 7e). Morfoloogiliselt olid postnataalsetest inimese proovidest pärit L2/3 neuronid sarnasemad t-hCO-ga kui hCO-ga, kuigi L2/3 rakud olid pikemad, sisaldasid üldiselt rohkem harusid ja neil oli suurem selgroo tihedus (joonis 3g ja laiendatud andmed, joonis 7b-). G).
a, kontroll- ja TS hiPS-rakuliinide poolt toodetud hCO3 siirdamine vastsündinud rottidele. b, biotsütiiniga täidetud t-hCO3 neuronite 3D rekonstruktsioon pärast 8-kuulist diferentseerumist. c, dendriitide keskmise pikkuse kvantifitseerimine (n = 19 kontrollneuroni, n = 21 TS neuronit; **P = 0,0041). d, 3D-rekonstrueeritud dendriitsed oksad kontroll- ja TS t-hCO3-st 8-kuulisel diferentseerumisel ja dendriitse selgroo tiheduse kvantifitseerimine (n = 16 kontrollneuroni, n = 21 TS neuroni, ***P <0, 0001). d, 3D-rekonstrueeritud dendriitsed oksad kontroll- ja TS t-hCO3-st 8-kuulisel diferentseerumisel ja dendriitse selgroo tiheduse kvantifitseerimine (n = 16 kontrollneuroni, n = 21 TS neuroni, ***P <0, 0001). d, 3D-реконструкция дендритных ветвей из контроля и TS t-hCO через 8 месяцев дифференцировки и колинчеост плотности дендритных шипов (n = 16 контрольных нейронов, n = 21 TS нейронов, *** P <0,0001). d, dendriitharude 3D rekonstrueerimine kontroll- ja t-hCO TS-rakkudest 8-kuulise diferentseerumise ja dendriitrakkude tiheduse kvantifitseerimise järel ( n = 16 kontrollneuroni, n = 21 TS neuronit, *** P <0, 0001). d，分化8 个月时对照和TS t-hCO 的3D 重建树突分支，以及树突棘密度的量n化16个对照神经元，n = 21 个TS 神经元，***P < 0,0001）. d ， 分化 8 个 时 对照 和 ts t-hco 的 3d 重建 分支 分 支 以及 树突棘 密度 骁棘 密度神经 元 ， n = 21 个 ts 神经 ， *** p <0,0001 ）. d, 3D-реконструкция дендритных ветвей контроля и TS t-hCO через 8 месяцев дифференцировки и колинцирополотна дендритных шипов (n = 16 контрольных нейронов, n = 21 TS нейронов, *** P <0,0001). d, kontrolldendriitharude ja TS t-hCO3 3D rekonstrueerimine 8 kuu möödudes diferentseerumisest ja dendriitlülide tiheduse kvantifitseerimisest ( n = 16 kontrollneuroni, n = 21 TS neuronit, *** P <0, 0001).Punased tärnid näitavad oletatavaid dendriitseid selgroogusid. e, spontaansed EPSC-d kontroll- ja TS t-hCO neuronites pärast 8-kuulist diferentseerumist. f, kumulatiivne sagedusgraafik ja sünaptiliste sündmuste sageduse ja amplituudi kvantifitseerimine (n = 32 kontrollneuroni, n = 26 TS neuronit; **P = 0,0076 ja P = 0,8102). g, TS ja kontrollneuronite Scholli analüüs hCO-s ja t-hCO-s. Katkendjooned näitavad võrdluseks inimese L2/3 postnataalseid püramiidneuroneid (n = 24 kontroll-t-hCO neuronit, n = 21 TS t-hCO neuronit, n = 8 kontroll-hCO neuronit ja n = 7 TS hCO neuronit). Andmed on väljendatud keskmise ± standardhälbena.
t-hCO võime kopeerida inimese ajukoore neuronite morfoloogilisi ja funktsionaalseid tunnuseid kõrgel tasemel ajendas meid uurima, kas t-hCO abil saaks tuvastada haiguste fenotüüpe. Keskendusime TS-ile, mis on raske neuroloogilise arengu häire, mille põhjustavad CaV1.2 kodeeriva geeni funktsiooni suurendamise mutatsioonid, mis käivitavad neuronites aktiivsusest sõltuva geenitranskriptsiooni. Saime hCO-d kolmelt TS-patsiendilt, kellel oli kõige levinum asendus (p.G406R), ja kolmelt kontrollrühmalt (joonis 3a). Pärast siirdamist leidsime, et TS-neuronites oli dendriitne morfoloogia muutunud võrreldes kontrollrühmaga (joonis 3b ja laiendatud andmed, joonis 8a,b), primaarsete dendriitide arv oli kahekordne ning dendriitide keskmine ja üldine pikkus oli suurenenud (joonis 3c ja laiendatud andmed, joonis 8c). See oli seotud suurenenud okaste tiheduse ja spontaansete EPSC-de suurenenud sagedusega TS-is võrreldes kontrollneuronitega (joonis 3d–f ja laiendatud andmed, joonis 8g). Edasine analüüs näitas t-hCO TS-is kontrollrühmaga võrreldes ebanormaalse dendriitilise hargnemise mustreid, kuid mitte in vitro TS hCO-s sarnases diferentseerumisjärgus (joonis 3g). See on kooskõlas meie varasemate aruannetega aktiivsusest sõltuva dendriitilise kahanemise kohta TS-is ja rõhutab selle siirdamisplatvormi võimet tuvastada haiguse fenotüüpe in vivo.
Seejärel küsisime, mil määral on t-hCO rakud funktsionaalselt integreeritud roti S1-sse. Närilistel saab S1 tugevaid sünaptilisi sisendeid ipsilateraalsest ventraalsest basaal- ja tagumisest talamuse tuumast, samuti ipsilateraalsest motoorsest ja sekundaarsest somatosensoorsest ajukoorest ning kontralateraalsest S1-st (joonis 4a). Innervatsioonimustri taastamiseks nakatasime hCO-d marutaudiviiruse-dG-GFP/AAV-G-ga ja siirdasime hCO S1 rotile 3 päeva hiljem. Täheldasime tihedat GFP ekspressiooni ipsilateraalse S1 ja ventraalsete basaalganglionide neuronites 7–14 päeva pärast siirdamist (joonis 4b, c). Lisaks näitas talamuse markeri netrin G1 antikehadega värvimine talamuse otste olemasolu t-hCO-s (joonis 4d, e). Et hinnata, kas need aferentsed projektsioonid võivad esile kutsuda sünaptilisi reaktsioone t-hCO rakkudes, viisime läbi täisrakulisi salvestusi inimese rakkudest talamokortikaalse kihi teravates lõikudes. Roti S1, sisemise kapsli, valgeaine ja t-hCO lähedal asuvate kiudude elektriline stimulatsioon või t-hCO-s opsiini ekspresseerivate talamuse otste optogeneetiline aktiveerimine indutseeris lühikese latentsusega EPSC-sid t-hCO neuronites, mis olid eksponeeritud AMPA retseptori antagonistile NBQX. (Joonis 4f, g ja laiendatud andmed, joonis 9a–g). Need andmed näitavad, et t-hCO on anatoomiliselt integreeritud roti ajju ja seda saab aktiveerida roti peremeeskude.
a, Marutaudi jälgimise eksperimendi skemaatiline diagramm. b, GFP ja inimese spetsiifilise STEM121 ekspressioon t-hCO ja roti ajukoore vahel (ülemine paneel). Samuti on näidatud GFP ekspressioon roti ipsilateraalses ventraalses basaalses tuumas (VB) (all vasakul) ja ipsilateraalses S1-s (all paremal). Skaalariba, 50 µm. Punased ruudud tähistavad ajupiirkondi, kus pildid tehti. c, GFP-d ekspresseerivate rakkude kvantifitseerimine (n = 4 rotti). d, e — Netrin G1+ talamuse terminaalid t-hCO-s. d näitab koronaalset lõiget, mis sisaldab t-hCO ja VB tuumasid. Skaalariba, 2 mm. e näitab Netrin G1 ja STEM121 ekspressiooni t-hCO (vasakul) ja VB (paremal) neuronites. Skaalariba, 50 µm. Oranž punktiirjoon tähistab t-hCO piiri. f, g, t-hCO neuronite voolukõverad pärast elektrilist stimulatsiooni S1 rotil (f) või sisemisel kapslil (g), NBQX-iga (lilla) või ilma (must) (vasakul). EPSC amplituudid NBQX-iga ja ilma (n = 6 S1 neuroni, *P = 0,0119; ja n = 6 sisemise kapsli neuronit, **P = 0,0022) (keskel). EPSC-d näitavate t-hCO neuronite protsent vastusena roti S1 (f) või sisemise kapsli (g) elektrilisele stimulatsioonile (paremal). aCSF, kunstlik tserebrospinaalvedelik. h, 2P pildistamise eksperimendi skemaatiline diagramm (vasakul). GCaMP6-de ekspressioon t-hCO-s (keskel). Skaalariba, 100 µm. GCaMP6-de fluorestsentsi aeglustatud analüüs (paremal). i, spontaanse aktiivsuse fluorestsentsi Z-skoor. j, vuntside stimulatsiooni skemaatiline illustratsioon. k, z-skooriga 2P fluorestsentsi trajektoorid ühes katses, joondatud vurrude hälbega ajahetkel null (katkendjoon) näidisrakkudes. l, kõigi rakkude populatsiooni keskmised z-skoori vastused, mis on joondatud vurrude hälbega ajahetkel null (katkendjoon) (punane) või juhuslikult genereeritud ajatemplitega (hall). m. Optilise märgistamise katse skemaatiline diagramm. n, Näidis-t-hCO3 raku toorpinge kõverad sinise laserstimulatsiooni või vurrude kõrvalekalde ajal. Punased nooled näitavad esimesi valguse (üleval) või vurrude kõrvalekalde (all) põhjustatud piike. Hall varjutus näitab vurrude kõrvalekalde perioode. o, Valguslainekujude tippväärtused ja vurrude kõrvalekalde vastused. p, ühe katse piigid, joondatud vurrude hälbega näite rakkudes. 0 näitab vurrude kõrvalekallet (katkendjoon). q, kõigi valgustundlike rakkude populatsiooni keskmine z-skoori tulistamiskiirus, joondatud vurrude hälbega ajahetkel null (katkendjoon) (punane) või juhuslikult genereeritud ajatemplitega (hall). r, Vurrude hälbe poolt oluliselt moduleeritud valgustundlike ühikute osakaal (n = 3 rotti) (vasakul). Tipp z-skoori latentsusaeg (n = 3 rotti; n = 5 (heleroheline), n = 4 (tumeroheline) ja n = 4 (tsüaan) vurrude hälbe modulatsiooniühikut roti kohta) (paremal). Andmed on väljendatud keskmise ± standardhälbena.
Seejärel küsisime, kas t-hCO2-d saab sensoorsete stiimulite abil in vivo aktiveerida. Siirdasime S1 rottidele geneetiliselt kodeeritud kaltsiumiindikaatoreid GCaMP6 ekspresseeriva hCO2. 150 päeva pärast viisime läbi kiudfotomeetria või kahe footoni kaltsiumkuvamise (joonis 4h ja laiendatud andmed, joonis 10a). Leidsime, et t-hCO2 rakud näitasid sünkroniseeritud rütmilist aktiivsust (joonis 4i, laiendatud andmed, joonis 10b ja lisavideo 1). t-hCO2 maksimaalse aktiivsuse iseloomustamiseks viisime läbi anesteesia all kannatavatel siirdatud rottidel rakuvälised elektrofüsioloogilised salvestused (laiendatud andmed, joonis 10c-f). MRI-piltidest genereerisime stereotaksilised koordinaadid; seega esindavad need salvestatud üksused oletatavaid inimese neuroneid, kuigi ainuüksi elektrofüsioloogia ei võimalda päritoluliiki määrata. Täheldasime sünkroniseeritud aktiivsuse puhanguid (laiendatud andmed, joonis 10d). Pursked kestsid umbes 460 ms ja olid eraldatud umbes 2-sekundiliste vaikuseperioodidega (laiendatud andmed, joonis 10d, e). Üksikud üksused tulistasid keskmiselt umbes kolm lasku purske kohta, mis moodustab ligikaudu 73% registreeritud üksustest purske kohta. Üksikute üksuste aktiivsused olid omavahel tugevalt korreleeritud ja need korrelatsioonid olid kõrgemad kui vaktsineerimata loomadel samades tingimustes tuvastatud üksustel (laiendatud andmed, joonis 10f). Tuvastatud inimeselt saadud neuronite piik-reaktsioonide täpsemaks iseloomustamiseks viisime läbi valgusmärgistamise katseid anesteesia rottidel, kellele siirdati valgustundlikku katioonikanalit rodopsiin 2 (hChR2) ekspresseeriv hCO3, mille kaudu t-hCO neuronid lühikese latentsusega (alla 10 ms) ära tunnevad sinise valguse stiimulitele reageerides (joonis 4m–o). t-hCO neuronid näitasid spontaanse aktiivsuse purskeid sagedustel, mis olid sarnased kaltsiumikuvamisel täheldatuga, samuti t-hCO3-s valgusmärgistuseta tehtud elektrofüsioloogiliste salvestustega (laiendatud andmed, joonis 10c-g). In vitro registreeritud hCO3 vastavates etappides spontaanset aktiivsust ei täheldatud. Et hinnata, kas t-hCO2-d saab sensoorsete stiimulite abil aktiveerida, suunasime roti vurrud lühidalt t-hCO2-st eemale (joonis 4j, m ja laiendatud andmed, joonis 10h, k). Varasemate uuringute8,10 kohaselt näitas osa t-hCO2 rakkudest vurrude suunamisel suurenenud aktiivsust, mida ei täheldatud andmete võrdlemisel juhuslike ajatemplitega (joonis 4k–q ja laiendatud andmed, joonis 10h–q). Tõepoolest, umbes 54% optomärgistusega üksikutest ühikutest näitas pärast vurrude stimuleerimist oluliselt suurenenud erutuskiirust, saavutades haripunkti umbes 650 ms juures (joonis 4r). Kokkuvõttes viitavad need andmed sellele, et t-hCO2 saab sobivaid funktsionaalseid sisendeid ja seda saab aktiveerida keskkonnastiimulite abil.
Seejärel uurisime, kas t-hCO suudab rottidel aktiveerida närviahelaid, et kontrollida käitumist. Esmalt uurisime, kas t-hCO neuronite aksonid ulatuvad roti ümbritsevatesse kudedesse. Nakatasime hCO lentiviirusega, mis kodeerib hChR2 ja on sulandatud EYFP-ga (hChR2-EYFP). 110 päeva pärast täheldasime EYFP ekspressiooni ipsilateraalsetes ajukoore piirkondades, sealhulgas kuulmis-, motoorses ja somatosensoorses ajukoores, samuti subkortikaalsetes piirkondades, sealhulgas striatumis, hipokampuses ja talamuses (joonis 5a). Et hinnata, kas need efferentsed projektsioonid võivad roti rakkudes esile kutsuda sünaptilisi reaktsioone, aktiveerisime optiliselt hChR2-EYFP-d ekspresseerivaid t-hCO rakke, registreerides roti ajukoore rakke teravates ajuosades. t-hCO aksonite aktiveerimine sinise valgusega indutseeris lühikese latentsusega EPSC-sid roti püramiidkoore neuronites, mis blokeeriti NBQX-iga (joonis 5b–g). Lisaks võisid need reaktsioonid blokeerida tetrodotoksiin (TTX) ja taastada 4-aminopüridiin (4-AP), mis viitab sellele, et need olid põhjustatud monosünaptilistest ühendustest (joonis 5e).
a, Aksonite jälgimise skemaatiline diagramm (vasakul). t-hCO3 EYFP ekspressioon (paremal). Skaalariba, 100 µm. A1, kuulmiskorteks, ACC, eesmine tsingulaarne korteks, d. striatum, dorsaalne striatum, HPC, hipokampus; Diafragma, lateraalne vaheseina, mPFC, mediaalne prefrontaalne korteks, piriformne korteks, v. striatum, ventraalne striatum, VPM, talamuse ventropostomidiaalne tuum, VTA, ventraalne tegmentaalne piirkond. Punased ruudud tähistavad ajupiirkondi, kus pildid tehti. b, Stimulatsioonieksperimendi skemaatiline diagramm. c, d, Näited sinise valguse indutseeritud fotovoolu (üleval) ja pinge (all) reaktsioonist inimese (c) EYFP+ t-hCO3 või roti (d) EYFP- rakkudes. e, f, Rottide neuronite voolukõverad pärast t-hCO aksonite stimuleerimist sinise valgusega TTX ja 4-AR (roheline), TTX (hall) või aCSF (must) (e), NBQX-iga (violetne) või ilma (must) (e). g, sinise valguse poolt indutseeritud vastuste latentsus roti rakkudes (n = 16 rakku); horisontaalsed tulbad näitavad keskmist latentsusaega (7,13 ms) (vasakul). NBQX-iga või ilma salvestatud valguse poolt esile kutsutud EPSC-de amplituud (n = 7 rakku; ***P <0, 0001) (keskel). NBQX-iga või ilma salvestatud valguse poolt esile kutsutud EPSC-de amplituud (n = 7 rakku; ***P <0, 0001) (keskel). Амплитуда вызванных светом EPSC, зарегистрированных с или без NBQX (n = 7 клеток; ***P <0,0001) (в центре). Valgusest indutseeritud EPSC-de amplituud, mis registreeriti NBQX-iga või ilma (n = 7 rakku; ***P <0, 0001) (keskel).使用或不使用NBQX 记录的光诱发EPSC 的振幅（n = 7 个细胞；***P < 0,0001）（中）使用或不使用NBQX 记录的光诱发EPSC 的振幅（n = 7 个细胞；***P < 0,0001）（中） Амплитуда вызванных светом EPSC, зарегистрированных с или без NBQX (n = 7 клеток; ***P <0,0001) (в центре). Valgusest indutseeritud EPSC-de amplituud, mis registreeriti NBQX-iga või ilma (n = 7 rakku; ***P <0, 0001) (keskel).Sinise valguse suhtes reageerivate EPSC-dega rotirakkude protsent (paremal). h, käitumisülesande skemaatiline diagramm. d0, 0. päev. i. Näidisloomade sooritus treeningpäeval 1 (vasakul) või 15. päeval (paremal). Keskmine lakkumiste arv 1. päeval (vasakul) või 15. päeval (paremal keskel) (n = 150 sinise valguse katset, n = 150 punase valguse katset; ***P < 0,0001). Keskmine lakkumiste arv 1. päeval (vasakul) või 15. päeval (paremal keskel) (n = 150 sinise valguse katset, n = 150 punase valguse katset; ***P < 0,0001). Среднее количество облизываний, выполненных в день 1 (слева) или день 15 (в центре справа, в центре справа) = n = 150 испыта 150 испытаний с красным светом ***P <0,0001). Keskmine lakkumiste arv, mis tehti 1. päeval (vasakul) või 15. päeval (paremal keskel) (n = 150 sinise valguse katset, n = 150 punase valguse katset; ***P < 0,0001).第1 天（左）或第15 天（右中）执行的平均舔次数（n = 150 次蓝光试验150，n次红光试验；***P < 0,0001）.第1 天（左）或第15 天（右中）执行的平均舔次数（n = 150 次蓝光试验150，n次红光试验；***P < 0,001 Среднее количество облизываний, выполненных в день 1 (слева) или день 15 (в центре справа, в центре справа) = n = 150 испыта 150 испытаний с красным светом ***P <0,0001). Keskmine lakkumiste arv, mis tehti 1. päeval (vasakul) või 15. päeval (paremal keskel) (n = 150 sinise valguse katset, n = 150 punase valguse katset; ***P < 0,0001).Punase ja sinise valguse katsete kumulatiivsed lakkumisproovid 1. päeval (keskel vasakul) või 15. päeval (paremal). NS, mitteoluline. j, k, kõigi loomade käitumuslikud omadused, kellele siirdati hChR2-EYFP-d (j) või kontrollfluorofoori (k) ekspresseerivat t-hCO3-d 1. või 15. päeval (hChR2-EYFP: n = 9 rotti, ** P = 0,0049; kontroll: n = 9, P = 0,1497). l, Eelistusskoori areng (n = 9 hChR2, n = 9 kontroll; **P < 0,001, ***P < 0,0001). l, Eelistusskoori areng (n = 9 hChR2, n = 9 kontroll; **P < 0,001, ***P < 0,0001). l, Эволюция показателя предпочтения (n = 9 hChR2, n = 9 контрольных; **P <0,001, ***P <0,0001). l, eelistusskoori areng (n = 9 hChR2, n = 9 kontrolli; **P < 0,001, ***P < 0,0001). l，偏好评分的演变（n = 9 hChR2，n = 9 对照；**P < 0,001，***P < 0,0001）. l，偏好评分的演变（n = 9 hChR2，n = 9 对照；**P < 0,001，***P < 0,0001）. l, Эволюция показателей предпочтения (n = 9 hChR2, n = 9 контролей; **P <0,001, ***P <0,0001). l, eelistusskooride areng (n = 9 hChR2, n = 9 kontrolli; **P < 0,001, ***P < 0,0001).m, FOS-i ekspressioon vastusena t-hCO3 optogeneetilisele aktiveerimisele S1-s. Kuvatakse FOS-i ekspressiooni kujutised (vasakul) ja kvantifitseerimine (n = 3 rühma kohta; *P <0, 05, **P <0, 01 ja ***P <0, 001) (paremal). Kuvatakse FOS-i ekspressiooni kujutised (vasakul) ja kvantifitseerimine (n = 3 rühma kohta; *P <0, 05, **P <0, 01 ja ***P <0, 001) (paremal). Показаны изображения экспрессии FOS (слева) ja количественного определения (n = 3 на группу; * P <0,05, ** P <0,05, ** P <0,001*** P) (0,01). Kuvatakse FOS-i ekspressiooni kujutised (vasakul) ja kvantifitseerimine (n = 3 rühma kohta; *P<0,05, **P<0,01 ja ***P<0,001) (paremal).显示了FOS 表达（左）和量化（每组n = 3；*P < 0,05、**P < 0,01 和***P。 0,001）徚叀）显示了FOS 表达（左）和量化（每组n = 3；*P < 0,05、**P < 0,01 和***P。 0,001）徚叀） Показаны изображения экспрессии FOS (слева) ja количественного определения (n = 3 на группу; * P <0,05, ** P <0,05, ** P <0,001*** P) (0,01). Kuvatakse FOS-i ekspressiooni kujutised (vasakul) ja kvantifitseerimine (n = 3 rühma kohta; *P<0,05, **P<0,01 ja ***P<0,001) (paremal).Skaalariba, 100 µm. Andmed on väljendatud BLA, basolateraalse mandli, MDT, dorsomediaalse talamuse tuuma, PAG ja periakeduktaalse halli keskmise ± standardveana.
Lõpuks küsisime, kas t-hCO suudab moduleerida rottide käitumist. Selle testimiseks siirdasime S1-sse hChR2-EYFP-d ekspresseeriva hCO ja 90 päeva hiljem implanteerisime t-hCO-sse valguse edastamiseks optilised kiud. Seejärel treenisime rotte modifitseeritud operantse tingimise paradigmaga (joonis 5h). Asetasime loomad käitumistesti kambrisse ja rakendasime juhuslikult 5-sekundilist sinist (473 nm) ja punast (635 nm) laserstimulatsiooni. Loomad said veepreemia, kui nad sinise valguse stimulatsiooni ajal lakkusid, kuid punase valguse stimulatsiooni ajal mitte. Treeningpäeval ei näidanud loomad sinise või punase valgusega stimuleerimisel lakkumises erinevust. 15. päeval näitasid aga loomad, kellele siirdati hChR2-EYFP-d ekspresseeriv hCO, sinise valgusega stimuleerimisel aktiivsemat lakkumist võrreldes punase valguse stimulatsiooniga. Neid lakkumiskäitumise muutusi ei täheldatud kontroll-loomadel, kellele siirdati kontrollfluorofoori ekspresseeriv hCO (õppimise edukuse määr: hChR2 89%, EYFP 0%, joonis 5i-1 ja lisavideo 2). Need andmed viitavad sellele, et t-hCO rakud suudavad aktiveerida roti neuroneid, et stimuleerida tasu otsivat käitumist. Et teada saada, millised roti t-hCO närviringed võivad nende käitumuslike muutustega seotud olla, aktiveerisime treenitud loomadel optogeneetiliselt t-hCO ja kogusime 90 minutit hiljem kudesid. Immunohistokeemia näitas aktiivsusest sõltuva FOS-valgu ekspressiooni mitmes motiveeritud käitumisega seotud ajupiirkonnas, sealhulgas mediaalses prefrontaalses korteksis, mediaalses talamuses ja periakveduktaalses hallis aines, mida ekspresseeriti kas stimuleerimata kontroll-loomadel või loomadel. riis. 5m). Kokkuvõttes viitavad need andmed sellele, et t-hCO suudab moduleerida roti neuronaalset aktiivsust, et juhtida käitumist.
Neuraalsed organoidid on paljulubav süsteem inimese arengu ja haiguste uurimiseks in vitro, kuid neid piirab in vivo eksisteerivate närviahelate vaheliste ühenduste puudumine. Oleme välja töötanud uudse platvormi, mille abil siirdasime hCO immuunpuudulikkusega varajaste postnataalsete rottide S1-sse, et uurida inimese rakkude arengut ja funktsiooni in vivo. Oleme näidanud, et t-hCO arendab küpseid rakutüüpe, mida in vitro ei täheldata28, ja et t-hCO on anatoomiliselt ja funktsionaalselt integreeritud näriliste ajju. t-hCO integreerimine näriliste närviahelatesse võimaldas meil luua seose inimese rakkude aktiivsuse ja uuritud loomade käitumise vahel, näidates, et t-hCO neuronid võivad moduleerida roti neuronaalset aktiivsust, et juhtida käitumuslikke reaktsioone.
Kirjeldatud platvormil on mitmeid eeliseid võrreldes varasemate uuringutega, mis käsitlevad inimrakkude siirdamist näriliste ajusse. Esiteks siirdasime hCO₂ varajaste postnataalsete rottide arenevasse ajukoore, mis võib hõlbustada anatoomilist ja funktsionaalset integratsiooni. Teiseks võimaldas t-hCO₂ MRI-monitooring meil uurida siiriku asendit ja kasvu elusloomadel, mis võimaldas meil läbi viia pikaajalisi mitme loomaga uuringuid ja kindlaks teha mitme hiPS-rakuliini usaldusväärsust. Lõpuks siirdasime terveid organoide, mitte isoleeritud üksikrakkude suspensioone, mis on inimrakkudele vähem hävitavad ja võivad soodustada inimkoore neuronite integratsiooni ja teket rottide ajus.
Me mööname, et vaatamata selle platvormi edusammudele takistavad ajalised, ruumilised ja liikidevahelised piirangud inimese närviahelate moodustumist kõrge täpsusega isegi pärast siirdamist varases arengujärgus. Näiteks pole selge, kas t-hCO-s täheldatud spontaanne aktiivsus esindab arengufenotüüpi, mis sarnaneb kortikaalse arengu ajal täheldatud rütmilise aktiivsusega, või on see tingitud t-hCO-s esinevate supresseerivate rakutüüpide puudumisest. Samuti pole selge, mil määral mõjutab lamineerimise puudumine t-hCO-s ahela ühenduvust30. Edasine töö keskendub teiste rakutüüpide, näiteks inimese mikrogliia, inimese endoteelirakkude ja GABAergiliste interneuronite erinevate proportsioonide integreerimisele, nagu on näidatud assembly 6 abil in vitro, samuti arusaamisele, kuidas neuraalne integratsioon ja töötlemine saab toimuda muutunud t-hCO-s, transkriptsioonilistel, sünaptilistel ja käitumuslikel tasemetel patsientidelt saadud rakkudes.
Üldiselt kujutab see in vivo platvorm endast võimsat ressurssi, mis saab täiendada in vitro inimese aju arengu ja haiguste uuringuid. Eeldame, et see platvorm võimaldab meil avastada uusi ahelataseme fenotüüpe muidu patsientidelt saadud rakkudes, mis on raskesti leitavad, ja testida uusi ravistrateegiaid.
Me genereerisime HiPS-rakkudest hCO2.5 nagu eelnevalt kirjeldatud. HCO2 tootmise alustamiseks söötjakihtidel kultiveeritud hiPS-rakkudest eemaldati terved hiPS-rakkude kolooniad kultuurinõudelt dispaasi (0,35 mg/ml) abil ja viidi ülimadala kinnitumisega plastkultuuridega nõudesse, mis sisaldasid hiPS-rakkude kultuurikeskkonda (Corning), millele oli lisatud kahte SMAD inhibiitorit: dorsomorfiini (5 μM; P5499, Sigma-Aldrich) ja SB-431542 (10 μM; 1614, Tocris) ning ROCK inhibiitorit Y-27632 (10 μM; S1049, Selleckchem). Esimese 5 päeva jooksul vahetati hiPS-rakkude keskkonda iga päev ning lisati dorsomorfiini ja SB-431542. Kuuendal suspensioonipäeval viidi närvisferoidid närvikeskkonda, mis sisaldas neurobasaal-A-d (10888, Life Technologies), A-vitamiinita B-27 toidulisandit (12587, Life Technologies), GlutaMaxi (1:100, Life Technologies), penitsilliini ja streptomütsiini (1:100, Life Technologies) ning millele lisati epidermise kasvufaktorit (EGF; 20 ng ml−1; R&D Systems) ja fibroblastide kasvufaktorit 2 (FGF2; 20 ng ml−1; R&D Systems) kuni 24. päevani. 25. päevast kuni 42. päevani lisati keskkonda aju päritolu neurotroofset faktorit (BDNF; 20 ng ml−1, Peprotech) ja neurotrofiin 3-d (NT3; 20 ng ml−1; Peprotech), vahetades keskkonda ülepäeviti. Kuuendal suspensioonipäeval viidi närvisferoidid närvikeskkonda, mis sisaldas neurobasaal-A-d (10888, Life Technologies), A-vitamiinita B-27 toidulisandit (12587, Life Technologies), GlutaMaxi (1:100, Life Technologies), penitsilliini ja streptomütsiini (1:100, Life Technologies) ning millele lisati epidermise kasvufaktorit (EGF; 20 ng ml−1; R&D Systems) ja fibroblastide kasvufaktorit 2 (FGF2; 20 ng ml−1; R&D Systems) kuni 24. päevani. 25. päevast kuni 42. päevani lisati keskkonda aju päritolu neurotroofset faktorit (BDNF; 20 ng ml−1, Peprotech) ja neurotrofiin 3-d (NT3; 20 ng ml−1; Peprotech), vahetades keskkonda ülepäeviti.Kuuendal suspensioonipäeval viidi närvisferoidid närvikeskkonda, mis sisaldas Neurobasal-A (10888, Life Technologies), A-vitamiinita B-27 toidulisandit (12587, Life Technologies), GlutaMaxi (1:100, Life Technologies) ja penitsilliini.и стрептомицин (1:100, Life Technologies) ja дополнены эпидермальным фактором роста (EGF; 20 нг/мл; R&D Systems) ja фактомифром ро2ста 20 нг/мл; R&D Systems) kuni 24-го дня. ja streptomütsiini (1:100, Life Technologies) ning täiendati epidermaalse kasvufaktoriga (EGF; 20 ng/ml; R&D Systems) ja fibroblastide kasvufaktoriga 2 (FGF2; 20 ng/ml; R&D Systems) kuni 24. päevani.25. kuni 42. päevani lisati söötmele ajust pärinevat neurotroofset faktorit (BDNF; 20 ng ml-1, Peprotech) ja neurotrofiini 3 (NT3; 20 ng ml-1, Peprotech), vahetades söötme ülepäeviti.在悬浮的第6 天，将神经球体转移到含有neurobasal-A（10888，Life Technologies）、不含焁-A2生皴B不含焴补充剂 (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100), Life Technologies) Tehnoloogiad）并辅以表皮生长因子（EGF；20 ng ml-1；R&D Systems）和成纤维细胞生长因子2（2（FGF2ng ml；D Süsteemid）直至第24 天.在 悬浮 的 第 第 6 将 神 经 球体 转移 含有 含有 neurobasal-a （10888 绁 焠 ， Life Technologies０ 丟 丟b-27 补充剂 （12587 ， Life Technologies） Glutamax （1: 100 ， Life TechNOGIS青霉素 的 神经 培养 基 中 韹养 基 中 韹养 基 中 韹养 基 中 韹养 基 中 韹养 基 中 韹养 基 中 須 1（ ， Life Technologies） 表皮 生长 因子 （（（20 ng ml-1 ； teadus- ja arendussüsteemid） 成 纤维 细胞 生长 2 （fgf2 ； 20 ng ml- 1；R&D Süsteemid）直至第24天. На 6-й день суспензии нейросферы были переведены на добавку, содержащую нейробазал-А (10888, Life Technобаваку72) без витамина А (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies), пенициллин- нейтрализованный стрептомицин (1:100, Life Technologies) эпидермального фактора роста (EGF; 20 нг мл-1; R&D Systems) и фактора роста фибробластов 2 (FGF2; 20 нг мл-1) 1; 6. päeval vahetati neurosfääri suspensioonid toidulisandi vastu, mis sisaldas neurobasal-A-d (10888, Life Technologies), A-vitamiinita B-27 toidulisandit (12587, Life Technologies), GlutaMaxi (1:100, Life Technologies), penitsilliiniga neutraliseeritud streptomütsiini (1:100, Life Technologies), millele oli lisatud epidermise kasvufaktorit (EGF; 20 ng ml-1; R&D Systems) ja fibroblastide kasvufaktorit 2 (FGF2; 20 ng ml-1) 1; R&D Systems) kuni 24-го дня. teadus- ja arendussüsteemid) kuni 24. päevani.25. kuni 42. päevani lisati kultuurisöötmele ülepäeviti ajust pärinevat neurotroofset faktorit (BDNF; 20 ng ml-1, Peprotech) ja neurotroofset faktorit 3 (NT3; 20 ng ml-1, Peprotech). Söödet vahetati üks kord.Alates 43. päevast hoiti hCO2 lisanditeta neurobasal-A söötmes (NM; 1088022, Thermo Fisher), vahetades söötmet iga 4–6 päeva järel. HCO2 saamiseks söötmeta tingimustes kultiveeritud hiPS-rakkudest inkubeeriti hiPS-rakke Accutase'iga (AT-104, Innovate Cell Technologies) temperatuuril 37 °C 7 minutit, dissotsieeriti üksikuteks rakkudeks ja külvati AggreWell 800 plaatidele (34815, STEMCELL Technologies) tihedusega 3 × 106 üksikut rakku süvendi kohta Essential 8 söötmes, millele oli lisatud ROCK inhibiitorit Y-27632 (10 μM; S1049, Selleckchem). 24 tunni pärast pipeteeriti süvendites olev sööde üles-alla söötmesse, mis sisaldas Essential 6 söödet (A1516401, Life Technologies), millele oli lisatud dorsomorfiini (2,5 μM; P5499, Sigma-Aldrich) ja SB-431542 (10 μM; 1614). , Tocrida). 2. kuni 6. päevani asendati Essential 6 sööde iga päev dorsomorfiini ja lisandiga SB-431542. Alates kuuendast päevast viidi neurosfääride suspensioonid neurobasaalsesse söötmesse ja hoiti nagu eespool kirjeldatud.
Kõik loomadega tehtavad protseduurid viidi läbi vastavalt Stanfordi ülikooli laboriloomade hoolduse halduskomitee (APLAC) poolt heakskiidetud loomade hooldusjuhistele. Tiined eutüümsed RNU (rnu/+) rotid osteti (Charles River Laboratories) või majutati eraldi. Loomi hoiti 12-tunnisel valguse-pimeduse tsüklil, toitu ja vett anti piiramatult. Kolme kuni seitsme päeva vanused karvutud (FOXN1–/–) rotipojad identifitseeriti enne praakimist ebaküpsete vurrude kasvu järgi. Kutsikad (isased ja emased) tuimestati 2–3% isofluraaniga ja asetati stereotaksilisele raamile. Koljule tehti trepanatsioon läbimõõduga umbes 2–3 mm üle S1, säilitades samal ajal dura mater terviklikkuse. Seejärel kasutati dura mater'i läbistamiseks 30-G nõela (umbes 0,3 mm) kraniotoomia välisküljel. Seejärel kandke õhukesele 3 × 3 cm parafilmile HCO3 ja eemaldage liigne sööde. Kasutades Hamiltoni süstalt, mis on kinnitatud 23 G, 45° nõela külge, tõmmake ettevaatlikult hCO3 nõela kõige distaalsemasse otsa. Seejärel paigaldage süstal stereotaksilise seadmega ühendatud süstlapumba külge. Seejärel asetage nõela ots eelnevalt tehtud 0,3 mm laiuse torkeaugu kohale dura mater'is (z = 0 mm) ja kitsendage süstalt 1–2 mm (z = umbes –1,5 mm), kuni nõel on dura mater'i A vahel. Moodustub tihe tihend. Seejärel tõstke süstal kortikaalse pinna keskele z = -0,5 mm juures ja süstige hCO3 kiirusega 1–2 µl minutis. Pärast hCO3 süstimise lõpetamist tõmmatakse nõel tagasi kiirusega 0,2–0,5 mm minutis, nahk õmmeldakse kinni ja kutsikas asetatakse kohe soojale soojenduspadjale kuni täieliku taastumiseni. Mõnele loomale siirdati bilateraalselt.
Kõik loomadega tehtavad protseduurid viidi läbi vastavalt Stanfordi ülikooli APLAC-i poolt heakskiidetud loomade hooldamise suunistele. Rottidele (üle 60 päeva pärast siirdamist) manustati 5% isofluraananesteesiat ja nad anesteseeriti pildistamise ajal 1-3% isofluraaniga. Visualiseerimiseks kasutati 7 Tesla aktiivselt varjestatud horisontaalset puuraugu skannerit Bruker (Bruker Corp.) koos International Electric Company (IECO) gradientajamiga, varjestatud gradientskanneriga siseläbimõõduga 120 mm (600 mT/m, 1000 T/m/s), kasutades AVANCE. III kaheksakanalilist mitme mähisega raadiosageduslikku ja mitmetuumalist võimekust ning sellega kaasnevat Paravision 6.0.1 platvormi. Salvestamine viidi läbi aktiivselt lahtisidestatud volumeetrilise raadiosagedusliku mähise abil siseläbimõõduga 86 mm ja neljakanalilise krüojahutusega raadiosagedusliku mähise abil ainult vastuvõtmiseks. Axial 2D Turbo-RARE (kordusaeg = 2500 ms, kajaaeg = 33 ms, 2 keskmist) 16 viilu jäädvustamisega, viilu paksusega 0,6–0,8 mm, mis sisaldas 256 × 256 proovi. Signaalid võeti vastu kvadratuur-transiiver-volumetrilise RF-mähise abil, mille siseläbimõõt oli 2 cm (Rapid MR International, LLC). Lõpuks kasutati 3D-renderdamiseks ja mahu analüüsiks sisseehitatud Imaris (BitPlane) pinna hindamise funktsioone. Edukaks siirdamiseks loeti seda, mille korral siirdatud poolkeras moodustusid pideva T2-kaalutud MRI-signaali alad. Transplantaadi äratõukereaktsiooniks loeti transplantaati, mis ei tekitanud siirdatud poolkeras pideva T2-kaalutud MRI-signaali alasid. Subkortikaalne t-hCO2 jäeti järgnevast analüüsist välja.
GCaMP6 stabiilseks ekspresseerimiseks hCO-s kahefootonilise kaltsiumikuvamise jaoks nakatati hiPS-rakud pLV[Exp]-EF1a::GcaMP6s-WPRE-Puro'ga, millele järgnes antibiootikumide valik. Lühidalt, rakud dissotsieeriti EDTA-ga ja suspendeeriti 1 ml Essential 8 söötmes tihedusega ligikaudu 300 000 rakku polübreeni (5 μg/ml) ja 15 μl viiruse juuresolekul. Seejärel inkubeeriti rakke suspensioonis 60 minutit ja külvati tihedusega 50 000 rakku süvendi kohta. Pärast ühinemist töödeldi rakke 5–10 μg ml-1 puromütsiiniga 5–10 päeva või kuni stabiilsete kolooniate ilmumiseni. Äge hCO infektsioon viidi läbi nagu eelnevalt kirjeldatud5, mõningate muudatustega. Lühidalt, 30.–45. päeval viidi hCO 1,5 ml Eppendorfi mikrotsentrifuugituubidesse, mis sisaldasid 100 µl närvikeskkonda. Seejärel eemaldatakse ligikaudu 90 µl keskkonda, tuubi lisatakse 3–6 µl kõrge tiitriga lentiviirust (0,5 x 108 kuni 1,2 x 109) ja hCO3 viiakse 30 minutiks inkubaatorisse. Seejärel lisatakse igasse tuubi 90–100 µl keskkonda ja pannakse tuubid üleöö inkubaatorisse tagasi. Järgmisel päeval kantakse hCO3 värskesse närvikeskkonda madala kinnitusega plaatidele. 7 päeva pärast kanti hCO3 24-süvendilistesse klaaspõhjaga plaatidele visualiseerimiseks ja nakkuse kvaliteedi hindamiseks. pLV[Exp]-SYN1::EYFP-WPRE ja pLV[Exp]-SYN1::hChR2-EYFP-WPRE genereeriti VectorBuilderi abil. Lentiviirust kasutatakse enamikus katsetes, kuna see on integreeritud peremeesorganismi genoomi, võimaldades reportergeeni ekspressiooni nakatunud rakuliinides. Marutaudide järelkontrolliks nakatati 30.–45. päeval hCO-d marutaud-ΔG-eGFP ja AAV-DJ-EF1a-CVS-G-WPRE-pGHpA-ga (plasmiid #67528, Addgene), pesti hoolikalt 3 päeva ja siirdati S1 rottidele ning hoiti in vivo 7–14 päeva.
Immunotsütokeemia jaoks anesteseeriti loomad ja perfundeeriti transkardiaalselt PBS-iga, millele järgnes 4% paraformaldehüüd (PFA PBS-is; Electron Microscopy Sciences). Ajusid fikseeriti 4% PFA-s 2 tundi või üleöö temperatuuril 4 °C, krüokonserveeriti 30% sahharoosi PBS-is 48–72 tundi ja manustati 1:1 30% sahharoosi:OCT lahusesse (Tissue-Tek OCT Compound 4583, Sakura Finetek) ning tehti krüostaadi (Leica) abil koronaalsed lõigud paksusega 30 µm. Paksude lõikude immunohistokeemia jaoks perfundeeriti loomi PBS-iga ning aju dissekteeriti ja lõigati vibratoomi (Leica) abil koronaalsed lõigud paksusega 300–400 µm ning lõike fikseeriti 4% PFA-ga 30 minutit. Seejärel pesti krüosektsioonid või paksud lõigud PBS-iga, blokeeriti 1 tund toatemperatuuril (10% normaalne eesliseerum (NDS) ja 0,3% Triton X-100, lahjendatud PBS-is) ning blokeeriti blokeerimislahusega temperatuuril 4 °C. – Inkubatsioon Krüosektsioonid inkubeeriti üleöö ja paksud lõigud inkubeeriti 5 päeva. Kasutatud primaarsed antikehad olid: anti-NeuN (hiir, 1:500; ab104224, abcam), anti-CTIP2 (rott, 1:300; ab18465, abcam), anti-GFAP (küülik, 1:1000; Z0334, Dako), anti-GFP (kana, 1:1000; GTX13970, GeneTex), anti-HNA (hiir, 1:200; ab191181, abcam), anti-NeuN (küülik, 1:500; ABN78, Millipore), anti-PDGFRA (küülik, 1:200; sc-338, Santa Cruz), anti-PPP1R17 (küülik, 1:200; HPA047819, Atlas Antibodies), anti-RECA-1 (hiir, 1:50; ab9774, abcam), anti-SCG2 (küülik, 1:100; 20357-1-AP, Proteintech), anti-SOX9 (kits, 1:500; AF3075, R&D Systems), Netrin G1a (kits, 1:100; AF1166, R&D Systems), anti-STEM121 (hiir, 1:200; Y40410, Takara Bio), anti-SATB2 (hiir, 1:50; ab51502, abcam), anti-GAD65/67 (küülik, 1:400; ABN904, Millipore) ja anti-IBA1 (kits, 1:100; ab5076, abcam). Kasutatud primaarsed antikehad olid: anti-NeuN (hiir, 1:500; ab104224, abcam), anti-CTIP2 (rott, 1:300; ab18465, abcam), anti-GFAP (küülik, 1:1000; Z0334, Dako), anti-D-GFP (kana, 1:1000; GTX13970, GeneTex), anti-HNA (hiir, 1:200; ab191181, abcam), anti-NeuN (küülik, 1:500; ABN78, Millipore), anti-PDGFRA (küülik, 1:200; sc-338, Santa Cruz), anti-PPP1R17 (küülik, 1:200; HPA047819, Atlas antikehad), anti-RECA-1 (hiir, 1:50; ab9774, abcam), anti-SCG2 (küülik, 1:100; 20357-1-AP, Proteintech), anti-SOX9 (kits, 1:500; AF3075, R&D Systems), Netrin G1a (kits, 1:100; AF1166, R&D Systems), anti-STEM121 (hiir, 1:200; Y40410, Takara Bio), anti-SATB2 (hiir, 1:50; ab51502, abcam), anti-GAD65/67 (küülik, 1:400; ABN904, Millipore) ja anti-IBA1 (kits, 1:100; ab5076, abcam). Использовались следующие первичные антитела: анти-NeuN (мышиные, 1:500; ab104224, abcam), анти-CTIP2 (ке, CTIP2: ны0; ab18465, abcam), анти-GFAP (кроличьи, 1:1000; Z0334, Dako), анти-GFP (курица, 1:1000; GTX13970, GeneTex), анти-HNA (мы1,2910,8; abcam), анти-NeuN (кролик, 1:500; ABN78, Millipore), анти-PDGFRA (кролик, 1:200; sc-338, Санта-Круз), анти-PPP1R17 (кролик, 1:200; HPA047819, Atlase antikehad), ab9774, abcam), анти-SCG2 (кролик , 1:100; 20357-1-AP, Proteintech), анти-SOX9 (козий, 1:500; AF3075, R&D Systems), нети-SCG2 (кролик , 1:100;,1:1 AF101a,;,1:1,1&1) Süsteemid), анти-STEM121 (мышиный , 1:200; Y40410, Takara Bio), анти-SATB2 (мышь, 1:50; ab51502, abcam), анти-GAD65/67 (кролик, 1:400; ABAIpore)-IBAiант904, (коза, 1 :100; аб5076, абкам). Kasutatud primaarsed antikehad olid: anti-NeuN (hiir, 1:500; ab104224, abcam), anti-CTIP2 (rott, 1:300; ab18465, abcam), anti-GFAP (küülik, 1:1000; Z0334, Dako), anti-GFP (kana, 1:1000; GTX13970, GeneTex), anti-HNA (hiir, 1:200; ab191181, abcam), anti-NeuN (küülik, 1:500; ABN78, Millipore), anti-PDGFRA (küülik, 1:200; sc-338, Santa Cruz), anti-PPP1R17 (küülik, 1:200; HPA047819, Atlas Antibodies), anti-RECA-1 (hiir, 1:50; ab9774, abcam), anti-SCG2 (küülik, 1:100; 20357-1-AP, Proteintech), anti-SOX9 (kits, 1:500; AF3075, R&D Systems), netrin G1a (kits, 1:100; AF1166, R&D Systems), anti-STEM121 (hiir, 1:200; Y40410, Takara Bio), anti-SATB2 (hiir, 1:50; ab51502, abcam), anti-GAD65/67 (küülik, 1:400; ABN904, Millipore) ja anti-IBA1 (kits, 1:100; ab5076, abkam).使用的一抗是：抗NeuN（小鼠，1:500；ab104224，abcam）抗CTIP2（大鼠，1:3 00；ab18465，abcam），抗GFAP（兔，1:1000；Z0334，Dako），抗-GF P（鸡，1:1000；GTX13970，GeneTex），抗HNA（小鼠，1:200；ab1911 81，abcam），抗NeuN（兔，1:500；ABN78，Millipore），抗PDGFRA（兔， 1:200；sc-338，Santa Cruz），抗PPP1R17（兔，1:200；HPA047819，Atlas抗体），抗RECA-1（小鼠，1:50；ab9774，abcam），抗SCG2（兔）, 1:100；20357-1-AP，Proteintech），抗SOX9（山羊，1:500；AF3075，R&D Systems），Netrin G1a（山羊，1:100；AF1166，R&D Systems），抗STEM121（小鼠, 1:200;使用的一抗是：抗NeuN（小鼠，1:500；ab104224，abcam）抗CTIP2（大鼠，1 :300；ab18465，abcam），抗GFAP（兔，1:1000；Z0334，Dako），抗-GFP（鸡，1:1000；GTX13970，GeneTex），抗HNA（小鼠，1:200；ab 191181，abcam），抗NeuN（兔，1:500；ABN78，Millipore％弔，抗1: 200；sc-338，Santa Cruz），抗PPP1R17（兔，1:200；HPA047819，Atlas抗体），抗RECA-1（小鼠，1:50；ab9774，abcam），抗SCG2 100；20357-1-AP，Proteintech），抗SOX9（山羊，1:500；AF3075，R&D Systems），Netrin G1a（山羊，1:100（山羊，1:100， Süsteemid）頏1:20, ;Y40410, Takara Bio), anti-SATB2 (hiir, 1:50; ab51502, abcam), anti-GAD65/67 (küülik, 1:400; ABN904, Millipore) ja anti-IBA1 (kits, 1:100; ab5076, abcam).Kasutatud primaarsed antikehad olid: anti-NeuN (hiir, 1:500; ab104224, abcam), anti-CTIP2 (rott, 1:300; ab18465, abcam), anti-GFAP (küülik, 1:1000; Z0334, Dako). , anti-GFP (kana, 1:1000; GTX13970, GeneTex), anti-HNA (hiir, 1:200; ab191181, abcam), anti-NeuN (jänes, 1:500; ABN78, Millipore), anti-PDGFRA (jänes, 1:200; sc-338, Santa Cruz), anti-PPP1R17 (jänes, 1:200; HPA047819, Atlas antikeha), anti-RECA-1 (hiir, 1:50; ab9774, abcam), anti-SCG2 (jänes), 1:100;20357-1-AP, Proteintech), анти-SOX9 (коза, 1:500; AF3075, R&D Systems), Нетрин G1a (коза, 1:100; AF1166, R&D Systems), анти -STEM120,, 1:1201,, 1:401; Takara Bio), анти-SATB2 (мышь, 1:50; ab51502, abcam), анти-GAD65/67 (кролик, 1:400; ABN904, Millipore) ja анти-IBA1 (коза; 6мба70ка, 1,1500; 1,1500; 20357-1-AP, Proteintech), anti-SOX9 (kits, 1:500; AF3075, R&D Systems), Netrin G1a (kits, 1:100; AF1166, R&D Systems), anti-STEM121 (hiir, 1:200; Y40410, Takara Bio), anti-SATB2 (hiir, 1:50; ab51502, abcam), anti-GAD65/67 (küülik, 1:400; ABN904, Millipore) ja anti-IBA1 (kits, 1:100; ab5076, abkam).Seejärel pesti lõike PBS-iga ja inkubeeriti sekundaarse antikehaga 1 tund toatemperatuuril (külmutatud lõigud) või üleöö temperatuuril 4 °C (paksud lõigud). Kasutati Alexa Fluori sekundaarset antikeha (Life Technologies), mis oli lahjendatud blokeerimislahuses vahekorras 1:1000. Pärast PBS-iga pesemist visualiseeriti tuumad Hoechst 33258 (Life Technologies) abil. Lõpuks asetati slaidid katteklaasidega mikroskoobile (Fisher Scientific), kasutades Aquamount (Polysciences) seadet, ja analüüsiti pildil Keyence'i fluorestsentsmikroskoobi (BZ-X analüsaator) või Leica TCS SP8 konfokaalse mikroskoobi (Las-X) abil. Pilte töödeldi ImageJ programmi (Fidži) abil. Inimese neuronite osakaalu kvantifitseerimiseks t-hCO-s ja roti ajukoores tehti 387,5 μm laiused ristkülikukujulised pildid t-hCO keskelt, roti ajukoore servast või selle lähedalt. Transplantaadi servad määrati, hinnates muutusi koe läbipaistvuses, HNA+ tuumades ja/või koe autofluorestsentsi olemasolus. Igal pildil jagati NeuN+ ja HNA+ rakkude koguarv samas piirkonnas asuvate NeuN+ rakkude koguarvuga. Selleks, et arvestada ainult pilditasandil olevate tuumadega rakke, kaasatakse arvutusse ainult need rakud, mis on ka Hoechst+. Statistilise vea vähendamiseks keskmistati kaks vähemalt 1 mm kaugusel olevat pilti.
Nädal enne proovide võtmist asetage hCO3 siirdamisloomad (umbes 8 kuud diferentseerumist) pimedasse ruumi, lõigates vurrud ära, et minimeerida sensoorset stimulatsiooni. Tuumade eraldamine viidi läbi eelnevalt kirjeldatud viisil, mõningate muudatustega. Lühidalt, t-hCO3 ja hCO3 hävitati detergent-mehaanilise rakulüüsi ja 2 ml klaaskoeveski abil (D8938, Sigma-Aldrich/KIMBLE). Seejärel filtriti toortuumad 40 µm filtri abil välja ja tsentrifuugiti 320 g juures 10 minutit temperatuuril 4 °C enne sahharoosi tihedusgradiendi rakendamist. Pärast tsentrifuugimisetappi (320 g 20 minutit temperatuuril 4 °C) suspendeeriti proovid uuesti 0,04% BSA/PBS-is, lisades 0,2 ühikut µl-1 RNaasi inhibiitorit (40 u µl-1, AM2682, Ambion) ja juhiti läbi 40 µm voolufiltri. Seejärel suspendeeriti dissotsieerunud tuumad uuesti PBS-is, mis sisaldas 0, 02% BSA-d, ja laaditi Chromium Single Cell 3' kiibile (hinnanguline taastumine 8000 rakku raja kohta). snRNA-seq teegid valmistati Chromium Single cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics) abil. snRNA-seq teegid valmistati Chromium Single cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics) abil. Библиотеки snRNA-seq были приготовлены с помощью Chromium Single cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics). snRNA-seq teegid valmistati, kasutades Chromium Single cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics). snRNA-seq 文库是使用Chromium Single cell 3′ GEM、Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics) 制备的。 snRNA-seq 文库是使用Chromium Single cell 3′ GEM、Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics) 制备的。 Библиотеку snRNA-seq готовили с использованием Chromium Single Cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics). SnRNA-seq raamatukogu valmistati, kasutades Chromium Single Cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics).Erinevate proovide teegid ühendati ja sekveneeriti Admera Healthi poolt NovaSeq S4 (Illumina) abil.
Iga oletatava tuuma vöötkoodi geeniekspressiooni tasemed kvantifitseeriti, kasutades 10x Genomics CellRanger analüüsitarkvara paketti (versioon 6.1.2). Täpsemalt, näidud võrreldi inimese (GRCh38, Ensemble, versioon 98) ja roti (Rnor_6.0, Ensemble, versioon 100) referentsgenoomide kombinatsiooniga, mis loodi käsuga mkref ning kasutades count funktsiooni koos käsuga –include-introns=TRUE, et kvantifitseerida intronipiirkondadele kaardistatud kaasatud näidud. t-hCO proovide puhul identifitseeriti inimese tuumad konservatiivse nõude alusel, et vähemalt 95% kõigist kaardistatud näitudest vastaks inimese genoomile. Kõik järgnevad analüüsid viidi läbi CellRangeri filtreeritud vöötkoodimassiivi väljundil, kasutades R paketti (versioon 4.1.2) Seurat (versioon 4.1.1)32.
Selleks, et tagada ainult kõrge kvaliteediga tuumade kaasamine järgnevasse analüüsi, rakendati iga proovi jaoks iteratiivset filtreerimisprotsessi. Esmalt tuvastatakse ja eemaldatakse madala kvaliteediga tuumad, milles on vähem kui 1000 unikaalset geeni ja üle 20% mitokondrite koguarvust. Seejärel normaliseeriti toores geenide arvu maatriks regulariseeritud negatiivse binoomregressiooniga, kasutades funktsiooni sctransform(vst.flavor=”v2”), mis tuvastas ka 3000 kõige muutlikumat geeni vaikesätete abil. Ülemise muutlikkusega geenide dimensiooni vähendamine viidi läbi peakomponentide analüüsi (PCA) abil vaikesätetega, kasutades andmestiku dimensiooni 30 (dims = 30 valiti põlveliigese visuaalse kontrolli põhjal ja seda kasutati kõigi proovide ja ansamblianalüüside jaoks). Seejärel viisime läbi mitu iteratiivse klasterdamise vooru (resolutsioon = 1), et klassifitseerida geene ebanormaalselt madala geenide arvu (mediaan alla 10. protsentiili) ja ebanormaalselt kõrge mitokondriaalsete geenide arvu (mediaan üle 95. protsentiili) alusel, et tuvastada ja eemaldada oletatavad madala kvaliteediga rakud. Klastrid ja/või kahtlustatavate kaksikute suur osakaal, mis tuvastati DoubletFinder33 paketi abil (keskmine DoubletFinderi skoor üle 95. protsentiili). t-hCO proovid (n=3) ja hCO proovid (n=3) integreeriti eraldi, kasutades funktsiooni IntegrateData ülaltoodud parameetritega. Seejärel Integreeritud andmestiku kvalitatiivse filtreerimise teine ​​voor viidi läbi nagu eespool kirjeldatud.
Pärast madala kvaliteediga tuumade eemaldamist grupeeriti integreeritud andmestik (resolutsioon = 0,5) ja manustati UMAP34 visualiseerimise eesmärgil. Iga klastri markergeenid määrati funktsiooni FindMarkers abil, kasutades normaliseeritud geeniekspressiooni andmete põhjal arvutatud vaikeparameetreid. Me identifitseerime ja klassifitseerime peamised rakuklassid, kombineerides loote ja täiskasvanu ajukoore võrdlusandmestikke markergeenide ekspressiooni 19, 20, 21, 35 ja annotatsiooniga. Täpsemalt identifitseeriti ringlevad prekursorid MKI67 ja TOP2A ekspressiooni järgi. Eellasrakud defineeriti mitootiliste transkriptide puudumise, suure kattuvuse järgi multipotentsete gliaalsete eellasrakkude klastritega, mida on kirjeldatud loote ajukoore hilisemas metafaasis, ning EGFR ja OLIG1 ekspressiooni järgi. Me kasutame terminit "astrotsüüt", et hõlmata mitmeid astrotsüütide diferentseerumise seisundeid, alates hilisest radiaalsest gliast kuni astrotsüütide küpsemiseni. Astrotsüütide klastrid ekspresseerivad kõrgel tasemel SLC1A3 ja AQP4 ning on näidatud, et need kaardistuvad loote radiaalse glia ja/või täiskasvanud astrotsüütide alatüüpidega. OPC-d ekspresseerivad PDGFRA-d ja SOX10-t, samas kui oligodendrotsüüdid ekspresseerivad müelinisatsioonimarkereid (MOG ja MYRF). Glutamatergilised neuronid identifitseeriti neuronaalsete transkriptide (SYT1 ja SNAP25) olemasolu, GABAergiliste markerite (GAD2) puudumise ning NEUROD6, SLC17A7, BCL11B või SATB2 ekspressiooni järgi. GluN-i neuronid jagati edasi ülemisteks (SATB2 ekspressioon ja BCL11B kadumine) ja sügavateks (BCL11B ekspressioon) alamklassideks. Oletatavad alamplaadi (SP) neuronid ekspresseerivad lisaks sügavatele GluN-i markeritele ka tuntud SP18 markereid, nagu ST18 ja SORCS1. Kooroidpõimiku-sarnased rakud identifitseeriti TTR-i ekspressiooni järgi ning meninge-sarnased rakud ekspresseerisid fibroblastidega seotud geene ja kaardistasid võrdlusandmestiku piaal-/vaskulaarseid rakke.
Geeniekspressiooni diferentsiaalanalüüs t-hCO3 ja hCO3 alamklasside vahel viidi läbi äsja väljatöötatud pseudopartiimeetodi abil, mida reprodutseeriti Libra R paketi (versioon 1.0.0) abil rakendatud proovides. Täpsemalt viidi rühmadele läbi edgeR log-tõenäosustestid (versioon 3.36.0, pakett R), summeerides iga proovi replikatsiooni puhul antud rakuklassi rakkudes olevate geenide arvu. Soojuskaardi visualiseerimiseks arvutati normaliseeritud miljoni kohta (CPM) väärtused edgeR (cpm() funktsiooni abil) ja skaleeriti (keskmise = 0, standardhälbe = 1 saavutamiseks). Oluliselt ülesreguleeritud t-hCO3 GluN geenide geeniontoloogia (GO) rikastamisanalüüs viidi läbi ToppGene Suite'i (https://toppgene.cchmc.org/)37 abil (Benjamini-Hochbergi korrigeeritud P-väärtus alla 0,05, mida ekspresseeriti vähemalt 10% t-hCO3 GluN rakkudes ja muutuse kordne suurenemine vähemalt 2 korda). Kasutame ToppFun rakendust vaikeparameetritega ja esitame Benjamini-Hochbergi korrigeeritud P-väärtused, mis on arvutatud GO-annoteeritud hüpergeomeetriliste testide põhjal.
Meie snRNA-seq klastrite sobitamiseks primaarsete üherakuliste RNA-seq või täiskasvanute snRNA-seq võrdlusuuringute annoteeritud rakuklastritega19,20,21,22 rakendasime paarisandmestike integreerimise lähenemisviisi. Andmekogumite klastrite kattumiste integreerimiseks ja võrdlemiseks kasutasime Seurati SCTransform (v2) normaliseerimistöövoogu (kasutades samu parameetreid nagu eespool). Arvutusliku efektiivsuse huvides jaotati individuaalsed andmekogumid juhuslikult alamhulkadesse kuni 500 rakku või südamikku algse klastri kohta. Kasutades sarnast lähenemisviisi nagu eelnevalt kirjeldatud, defineeriti klastri kattumine kui rakkude või tuumade osakaal igas koondatud klastris, mis kattusid võrdlusklastri sildiga. GluN-ide edasiseks klassifitseerimiseks kasutasime Seurati TransferData töövoogu GluN alamhulga andmete jaoks, et määrata meie GluN-rakkudele võrdlusandmestiku sildid.
t-hCO ja hCO proovide globaalse transkriptoomi küpsusstaatuse hindamiseks võrdlesime oma pseudo-bulk proove BrainSpan/psychENCODE23-ga, mis koosneb suurest RNA järjestusest, mis hõlmab inimese aju arengut. Tegime PCA kombineeritud mustri-normaliseeritud geeniekspressiooni maatriksiga kortikaalsetest proovidest 10 nädalat pärast viljastumist ja hiljem 5567 geenis (koos meie andmetega), mis olid varem tuvastatud aktiivsetena BrainSpani kortikaalsetes proovides (defineeritud kui üle 50% arenguvariatsioonist, mida seletatakse vanusega kuupmudeli abil)38. Lisaks tuletasime geenid, mis on seotud neuroloogilise arengu peamiste transkriptoomi signatuuridega, kasutades mittenegatiivset maatriksi faktoriseerimist, nagu eelnevalt kirjeldatud. Mittenegatiivse maatriksi faktoriseerimise protseduuri abil arvutatud valimi kaalud on joonistatud joonisel 5b koos laiendatud andmetega iga viie signatuuri kohta, mida on kirjeldanud Zhu jt38. Jällegi tuletati aktiivsusest sõltuvad transkriptsioonimarkerid varem avaldatud uuringutest. Täpsemalt öeldes olid ERG ja LRG glutamaatergilistes neuronites, mis tuvastati hiire visuaalse korteksi snRNA-seq kollektsiooniga pärast visuaalset stimulatsiooni lisatabelist 3 (Hrvatin jt.16), oluliselt ülesreguleeritud. Inimese rikastatud LRG-d saadi KCl-aktiveeritud inimese loote ajukultuuridest ja koguti 6 tundi pärast stimulatsiooni ning filtreeritud geenid olid inimestel oluliselt ülesreguleeritud, kuid mitte närilistel (lisatabel 4). Geenikomplektide rikastamise analüüs nende geenikomplektide abil viidi läbi ühesuunalise Fisheri täpse testi abil.
Tuimestage rotid isofluraaniga, eemaldage ajud ja asetage need külma (umbes 4 °C) hapnikuga rikastatud (95% O2 ja 5% CO2) sahharoosilahusesse lõikude jaoks, mis sisaldavad: 234 mM sahharoosi, 11 mM glükoosi, 26 mM NaHCO3, 2,5 mM KCl, 1,25 mM NaH2PO4, 10 mM MgSO4 ja 0,5 mM CaCl2 (umbes 310 mOsm). t-hCO3-ga roti aju koronaalsed lõigud (300–400 µm) valmistati Leica VT1200 vibratoomi abil, nagu eelnevalt kirjeldatud39. Seejärel viidi lõigud pideva toatemperatuuril hapnikuga rikastatud sektsioonikambrisse, mis sisaldas aCSF-i, mis oli valmistatud: 10 mM glükoosist, 26 mM NaHCO3-st, 2,5 mM KCl-st, 1,25 mM NaHPO4-st, 1 mM MgSO4-st, 2 mM CaCl2-st ja 126 mM NaCl-st (298 mOsm). vähemalt 45 minutit enne registreerimist. Lõigud registreeriti sukeldatud kambris, kus neid pidevalt perfundeeriti aCSF-iga (95% O2 ja 5% CO2 viaal). Kõik andmed registreeriti toatemperatuuril. t-hCO neuronid lõpetati boorsilikaatklaasist pipetiga, mis oli täidetud lahusega, mis sisaldas 127 mM kaaliumglükonaati, 8 mM NaCl, 4 mM magneesium-ATP-d, 0,3 mM naatrium-GTP-d, 10 mM HEPES-i ja 0,6 mM EGTA-d, pH 7,2, sisemine lahus oli reguleeritud KOH-ga (290 mOsm). Taaskasutamiseks lisati registreerimislahusele biotsütiini (0,2%).
Andmed saadi MultiClamp 700B võimendi (Molecular Devices) ja Digidata 1550B digiteerija (Molecular Devices) abil, need filtreeriti madalpääsfiltriga sagedusel 2 kHz, digitaliseeriti sagedusel 20 kHz ja analüüsiti Clampfit'i (Molecular Devices), Origini (OriginPro) (2021b, OriginLab) ja kohandatud MATLAB-funktsioonide (Mathworks) abil. Ühenduspotentsiaal arvutati JPCalc'i abil ja kirjed kohandati arvutatud väärtusele -14 mV. Operatsioon IV koosneb voolutugevuse sammudest 10-25 pA sammuga, vahemikus -250 kuni 750 pA.
Nagu eelnevalt kirjeldatud, stimuleeriti talamokortikaalsetes viiludes elektriliselt talamust, valgeainet ja S1 aferentseid piirkondi hCO neuronite patch-clamp registreerimise ajal, nagu eelnevalt kirjeldatud. Lühidalt, aju asetati 10° nurga all kallutatud 3D-printimislauale ja aju esiosa lõigati 35° nurga all. Seejärel liimiti aju lõikepinnale ja lõigati sektsioonideks, säilitades talamokortikaalsed väljaulatuvad aksonid. Bipolaarsed volframelektroodid (0,5 MΩ) paigaldati teisele mikromanipulaatorile ja paigutati strateegiliselt nii, et need stimuleeriksid nelja piirkonda raku kohta (sisemine kapsel, valgeaine, S1 ja hCO). Registreerige sünaptilised vastused pärast 300 µA faasilist stimulatsiooni sagedusel 0,03–0,1 Hz.
hChR2-d ekspresseerivad hCO neuronid aktiveeriti lainepikkusel 480 nm ja LED-i (Prizmatix) tekitatud valgusimpulsse rakendati läbi ×40 objektiivi (0.9 NA; Olympus), et registreerida hChR2 ekspressiooni rakkude lähedal. Valgustatud välja läbimõõt oli ligikaudu 0,5 mm ja koguvõimsus 10-20 mW. Impulsi laiuseks seati 10 ms, mis vastab käitumusliku õppe eksperimendi ajal antud impulsile. Kasutati erinevaid stimulatsioonisagedusi vahemikus 1 kuni 20 Hz, kuid kvantifitseerimiseks kasutati ainult seeria esimest impulssi. Stimulatsiooniseeriate vahelised intervallid on tavaliselt pikemad kui 30 sekundit, et minimeerida mõju sünaptilistele inhibeerivatele või soodustavatele radadele. Selleks, et testida, kas hChR2 vastus oli monosünaptiline, rakendasime vannile TTX-i (1 μM), kuni EPSC reaktsioon kadus, ja seejärel rakendasime 4-aminopüridiini (4-AP; 100 μM). Tavaliselt taastub vastus mõne minuti jooksul, LED-i süttimise ja EPSC genereerimise vahel on veidi pikem viivitus. NBQX-i (10 μM) kasutati selleks, et testida, kas vastust juhivad AMPA retseptorid.
Teravad hCO3 lõigud loodi nagu eelnevalt kirjeldatud. Lühidalt, hCO3 lõigud sisestati 4% agaroosi ja kanti rakkudesse, mis sisaldasid 126 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM NaH2PO4, 1 mM MgSO4, 2 mM CaCl2, 26 mM NaHCO3 ja 10 mM d-(+)-glükoosi. Lõigud lõigati toatemperatuuril Leica VT1200 vibraatoriga paksusega 200–300 µm ja säilitati ASF-is toatemperatuuril. Seejärel teostati hCO3 lõikudel tervete rakkude patch-camp registreerimine SliceScope mikroskoobi (Scientifica) all. Lõike perfundeeriti aCSF-iga (95% O2 ja 5% CO2) ning rakkude signaale registreeriti toatemperatuuril. hCO neuroneid kanti peale borosilikaatklaasist pipeti abil, mis oli täidetud lahusega, mis sisaldas 127 mM kaaliumglükonaati, 8 mM NaCl, 4 mM magneesium-ATP-d, 0,3 mM naatrium-GTP-d, 10 mM HEPES-i ja 0,6 mM EGTA-d, sisemine pH oli 7, 2, reguleeritud KOH-ga (osmolaarsus 290). Taaskasutamise eesmärgil lisati sisemisse lahusesse 0,2% biotsütiini.
Andmed saadi Clampexi (Clampex 11.1, Molecular Devices) abil, kasutades MultiClamp 700B võimendit (Molecular Devices) ja Digidata 1550B digiteerijat (Molecular Devices), need filtreeriti madalpääsfiltriga sagedusel 2 kHz, digitaliseeriti sagedusel 20 kHz ja analüüsiti Clampfit'i (versioon 10.6) abil (Molecular devices) ja kohandatud MATLABi funktsioonidega (MATLAB 2019b, Mathworks). Siirdepotentsiaal arvutati JPCalci abil ja kirjed kohandati arvutatud siirdepotentsiaalile -14 mV. Operatsioon IV koosneb voolutugevuse sammudest 5-10 pA sammuga vahemikus -50 kuni 250 pA.
Pigistatavate neuronite morfoloogiliseks rekonstrueerimiseks lisati siselahusele 0,2% biotsütiini (Sigma-Aldrich). Rakke eelsoojendatakse pärast purustamist vähemalt 15 minutit. Seejärel tõmmatakse pipett aeglaselt 1–2 minuti jooksul sisse, kuni registreeritud membraan on täielikult suletud. Pärast sektsioonide füsioloogiaprotseduuri fikseeriti sektsioonid üleöö temperatuuril 4 °C 4% PFA-s, pesti PBS X3-ga ja lahjendati 1:1000 streptavidiiniga konjugeeritud DyLight 549 või DyLight 405-ga (Vector Labs). Biotsütiiniga (2%; Sigma-Aldrich) täidetud rakud märgistati plaastriklambriga registreerimise ajal toatemperatuuril 2 tundi. Seejärel kinnitati sektsioonid mikroskoobi slaididele, kasutades Aquamount'i (Thermo Scientific) ja visualiseeriti järgmisel päeval Leica TCS SP8 konfokaalsel mikroskoobil, kasutades õliimmersiooniobjektiivi numbrilise avaga ×40 1,3, suurendusega ×0,9–1,0, xy. Proovivõtu sagedus on ligikaudu 7 pikslit mikroni kohta. Z-virnad saadi järjestikku 1 µm intervallidega ning iga neuroni kogu dendriitpuu katmiseks teostati z-virna mosaiigid ja Leica-põhine automaatne õmblemine. Seejärel jälgiti neuroneid poolmanuaalselt neuTube 40 liidese abil ja genereeriti SWC-failid. Seejärel laaditi failid üles SimpleNeuriteTracer41 Fiji pluginasse (ImageJ, versioon 2.1.0; NIH).
Inimese kortikaalkude saadi teadlikul nõusolekul vastavalt Stanfordi ülikooli institutsionaalse eetikakomitee poolt heakskiidetud protokollile. Kaks inimese sünnitusjärgset koeproovi (3- ja 18-aastased) saadi otsmikukoore (keskmine otsmikukeerd) resektsiooni teel refraktaarse epilepsia operatsiooni osana. Pärast resektsiooni koguti kude jääkülmas NMDG-aCSF-is, mis sisaldas: 92 mM NMDG-d, 2,5 mM KCl-i, 1,25 mM NaH2PO4-d, 30 mM NaHCO3-d, 20 mM HEPES-i, 25 mM glükoosi, 2 mM tiouureat, 5 mM naatriumaskorbaati, 3 mM naatriumpüruvaati, 0,5 mM CaCl2·4H2O ja 10 mM MgSO4·7H2O. Tiitriti kontsentreeritud vesinikkloriidhappega pH väärtuseni 7,3–7,4. Koed toimetati laborisse 30 minuti jooksul ja koronaalsed lõigud võeti vastavalt eespool kirjeldatud protseduurile.
Kõik loomadega tehtavad protseduurid viidi läbi vastavalt Stanfordi ülikooli APLAC-i poolt heakskiidetud loomade hooldusjuhistele. Rottidele (üle 140 päeva pärast siirdamist) manustati 5% isofluraananesteesiat ja nad tuimestati intraoperatiivselt 1-3% isofluraaniga. Loomad paigutati stereotaksilisse raami (Kopf) ja subkutaanselt süstiti pikaajalise vabanemisega buprenorfiini (SR). Kolju paljastati, puhastati ja sisestati 3-5 luukruvi. t-hCO2 sihtimiseks genereeriti MRI-piltide põhjal stereotaksilised koordinaadid. Huvipakkuvasse kohta puuriti auk ja kiud (läbimõõt 400 µm, NA 0,48, Doric) langetati 100 µm hCO2 pinnast allapoole ja kinnitati kolju külge UV-kõveneva hambatsemendiga (Relyx).
Kiudfotomeetrilised salvestused viidi läbi nagu eelnevalt kirjeldatud42. Spontaanse aktiivsuse registreerimiseks paigutati rotid puhtasse puuri ja implanteeritud kiudoptilise kaabliga ühendati 400 µm läbimõõduga fiiberoptiline ühenduskaabel (Doric), mis oli ühendatud fiiberoptilise fotomeetrilise andmete kogumissüsteemiga. 10-minutilise motoorse aktiivsuse registreerimise ajal said loomad puuri vabalt uurida. Esilekutsutud aktiivsuse registreerimiseks anesteseeriti rotte (enam kui 140 päeva pärast siirdamist) 5% isofluraaniga induktsiooniks ja 1-3% isofluraaniga säilitusraviks. Loom asetati stereotaktilisse raami (Kopf) ja t-hCO2 vastasküljel olevad vurrud lõigati umbes 2 cm pikkuseks ning juhiti läbi piesoelektrilise ajamiga (PI) ühendatud võrgu. 400 µm fiiberoptiline ühenduskaabel (Doric) ühendati implanteeritud kiuga ja seejärel andmekogumissüsteemiga. Seejärel suunati t-hCO vastasküljel asuvaid vurrusid piesoelektrilise ajamiga 20-minutilise salvestusperioodi jooksul juhuslikel aegadel 50 korda kõrvale (2 mm sagedusel 20 Hz, 2 sekundit esituskorra kohta). Liigutusaja juhtimiseks kohandatud MATLAB-koodiga kasutage Arduino MATLAB tugipaketti. Sündmused sünkroniseeritakse andmete kogumise tarkvaraga transistor-transistorloogika (TTL) impulsside abil.
Rottidele (üle 140 päeva pärast siirdamist) manustati 5% isofluraananesteesiat ja nad tuimestati intraoperatiivselt 1-3% isofluraaniga. Loomad paigutati stereotaksilisse raami (Kopf) ja neile süstiti naha alla buprenorfiin SR ja deksametasoon. Kolju paljastati, puhastati ja sisestati 3-5 luukruvi. T-hCO2 sihtimiseks genereeriti MRI-piltide põhjal stereotaksilised koordinaadid. Siirdatud hCO2 kohale tehti ringikujuline kraniotoomia (umbes 1 cm läbimõõduga) suure kiirusega puuriga. Kui luu on võimalikult õhuke, kuid enne kogu luu läbi puurimist, eemaldati tangidega allesjäänud terve vaagnaplaat, et paljastada selle all olev t-hCO2. Kraniotoomia täideti steriilse soolalahusega ning kolju külge kinnitati katteklaas ja spetsiaalne peatihvt UV-kõvastunud hambatsemendiga (Relyx).
Kahefootonilist pildistamist teostati Brukeri multifootonmikroskoobi ja Nikoni LWD (×16, 0,8 NA) objektiivi abil. GCaMP6 pildistamist teostati lainepikkusel 920 nm, 1,4-kordse ühe z-tasandi suurendusega ja 8-kordse keskmisega 7,5 kaadrit sekundis. Rottidele manustati 5% isofluraananesteesiat ja neid hoiti 1-3% isofluraaniga. Rotid paigutati spetsiaalselt valmistatud peakontorisse ja asetati läätse alla. Saadi 3-minutiline motoorse aktiivsuse taustsalvestus. 20-minutilise registreerimise jooksul manustati picospriceri abil juhuslikult 50 mahvi (igaüks 100 ms pikk) t-hCO3 vastas asuvale vurrupadjale. Kasutage Arduino MATLAB tugipaketti, et juhtida purske aega kohandatud MATLAB koodiga. Sünkroniseerige sündmused andmete kogumise tarkvaraga (PrairieView 5.5) TTL-impulsside abil. Analüüsiks korrigeeriti pilte xy-liikumise suhtes afiinse korrektsiooni abil MoCo programmis, mis käivitati Fidžil. Fluorestsentsjälgede ekstraheerimine üksikutest rakkudest CNMF-E43 abil. Fluorestsents ekstraheeriti iga huvipakkuva piirkonna jaoks, teisendati dF/F-kõverateks ja seejärel teisendati z-skoorideks.
Rottidele (üle 140 päeva pärast siirdamist) manustati 5% isofluraananesteesiat ja nad tuimestati intraoperatiivselt 1-3% isofluraaniga. Loomad paigutati stereotaksilisse raami (Kopf) ja neile süstiti naha alla buprenorfiin SR ja deksametasoon. T-hCO vastasküljel olevad vurrud lõigati umbes 2 cm pikkuseks ja keerati läbi piesoelektrilise ajamiga ühendatud võrgu. Kolju paljastati ja puhastati. Kolju külge kinnitati roostevabast terasest maanduskruvi. T-hCO sihtimiseks genereeriti MRI-piltide põhjal stereotaksilised koordinaadid. Tehke ringikujuline kraniotoomia (umbes 1 cm läbimõõduga) kiire puuriga vahetult t-hCO kohal. Kui luu on võimalikult õhuke, kuid enne kogu luu läbi puurimist, eemaldage tangidega ülejäänud terve vaagnaplaat, et paljastada selle all olev t-hCO. Üksikute rakkude registreerimiseks kasutati 32- või 64-kanalilisi suure tihedusega ränisondide (Cambridge Neurotech) abil, mis olid maandatud maanduskruvide külge ja eelvõimendatud RHD võimenditega (Intan). Elektroodide langetamiseks sihtmärgile kasutage manipulaatorit läbi kraniotoomia, mis on täidetud steriilse soolalahusega. Andmete kogumine viidi läbi sagedusel 30 kHz, kasutades Open Ephys andmekogumissüsteemi. Salvestamine jätkus alles siis, kui tuvastasime enam kui 10 kanalis kõrgelt korreleeritud rütmilist spontaanset aktiivsust, mis viitab elektroodide paiknemisele transplantaadis (kahe footoni kaltsiumpildistamise andmete põhjal). Saadi 10-minutiline motoorse aktiivsuse taustsalvestus. Seejärel suunati t-hCO2 vastasküljel asuvaid vurrusid piesoelektrilise ajamiga juhuslikel aegadel 20-minutilise salvestusperioodi jooksul kõrvale 50 korda (2 mm sagedusel 20 Hz, 2 sekundit esituse kohta). Kasutades MATLABi tugipaketti Arduino jaoks (MATLAB 2019b), kontrollige kõrvalekaldeaega kohandatud MATLABi koodiga. Kasutage TTL-impulsse sündmuste sünkroonimiseks andmekogumistarkvaraga.
Optilise märgistamise katseteks ühendati 200 µm optiline ühendusjuhe (Doric), mis oli ühendatud 473 nm laseriga (Omicron), kraniotoomia kohale asetatud 200 µm optilise kiuga. Vahetult enne seda reguleeriti hüppaja võimsus 20 mW-ni. Elektroodide langetamiseks sihtmärgile läbi kraniotoomia, mis on täidetud steriilse soolalahusega, kasutati manipulaatorit. Salvestamise alguses kiirati kümme 473 nm valgusimpulssi (sagedus 2 Hz, impulsi kestus 10 ms). Valgustundlikeks rakkudeks loeti rakke, mis näitasid 10 ms jooksul valgusest teravikvastust 70% või enamas katsetes.