Дзякуй за наведванне сайта Nature.com. Вы карыстаецеся версіяй браўзера з абмежаванай падтрымкай CSS. Для найлепшага карыстання рэкамендуем выкарыстоўваць абноўлены браўзер (або адключыць рэжым сумяшчальнасці ў Internet Explorer). Акрамя таго, каб забяспечыць пастаянную падтрымку, мы паказваем сайт без стыляў і JavaScript.
Адлюстроўвае карусель з трох слайдаў адначасова. Выкарыстоўвайце кнопкі «Папярэдні» і «Наступны», каб перамяшчацца паміж трыма слайдамі адначасова, або выкарыстоўвайце кнопкі-паўзункі ў канцы, каб перамяшчацца паміж трыма слайдамі адначасова.
Самаарганізуючыяся нейронныя арганэлы ўяўляюць сабой перспектыўную платформу in vitro для мадэлявання развіцця і захворванняў чалавека. Аднак арганоідам не хапае сувязі, якая існуе in vivo, што абмяжоўвае паспяванне і перашкаджае інтэграцыі з іншымі ланцугамі, якія кантралююць паводзіны. Тут мы паказваем, што коркавыя арганоіды, атрыманыя з чалавечых ствалавых клетак, перасаджаныя ў саматасенсорную кару нованароджаных голых пацукоў, развіваюць спелыя тыпы клетак, якія інтэгруюцца ў сэнсарныя і матывацыйныя ланцугі. МРТ выявіла рост арганоідаў пасля трансплантацыі ў некалькіх лініях ствалавых клетак і ў жывёл, у той час як аднакадравы аналіз выявіў прагрэсаванне кортыкагенезу і з'яўленне транскрыпцыйнай праграмы, якая залежыць ад актыўнасці. Сапраўды, перасаджаныя коркавыя нейроны дэманструюць больш складаныя марфалагічныя, сінаптычныя і ўнутраныя мембранныя ўласцівасці, чым іх аналагі in vitro, што дазваляе выяўляць нейрональныя дэфекты ў пацыентаў з сіндромам Цімаці. Анатамічнае і функцыянальнае адсочванне паказала, што перасаджаныя арганоіды атрымліваюць таламокартыкальныя і кортыкакартыкальныя ўваходныя сігналы, і запісы нейронавай актыўнасці in vivo сведчаць аб тым, што гэтыя ўваходныя сігналы могуць генераваць сэнсарныя рэакцыі ў клетках чалавека. Нарэшце, коркавыя арганоіды пашыраюць аксоны па ўсім мозгу пацука, і іх оптагенетычная актывацыя прыводзіць да паводзін, накіраваных на пошук узнагароды. Такім чынам, трансплантаваныя нейроны кары галаўнога мозгу чалавека спеюць і ўдзельнічаюць у ланцугах гаспадара, якія кантралююць паводзіны. Мы чакаем, што гэты падыход палегчыць выяўленне фенатыпаў на ўзроўні нітак у клетках, атрыманых ад пацыента, якія немагчыма выявіць іншымі спосабамі.
Развіццё чалавечага мозгу — гэта выдатны працэс самаарганізацыі, у якім клеткі размнажаюцца, дыферэнцыююцца, мігруюць і злучаюцца, утвараючы функцыянальныя нейрональныя ланцугі, якія далей удасканальваюцца праз сэнсарны вопыт. Ключавой праблемай у разуменні развіцця чалавечага мозгу, асабліва ў кантэксце хвароб, з'яўляецца адсутнасць доступу да тканіны мозгу. Самаарганізуючыяся арганэлы, у тым ліку арганоіды кары галаўнога мозгу чалавека (hCO; таксама вядомыя як сфера кары галаўнога мозгу чалавека), могуць генераваць 2,3,4,5,6. Аднак некалькі абмежаванняў абмяжоўваюць іх больш шырокае прымяненне для разумення развіцця і функцыянавання нейронавых ланцугоў. У прыватнасці, незразумела, ці абмяжоўваецца паспяванне hCO адсутнасцю пэўных мікраасяродных і сэнсарных уваходных дадзеных, прысутных in vivo. Акрамя таго, паколькі hCO не інтэграваны ў ланцугі, якія могуць генераваць паводніцкія вынікі, іх карыснасць у мадэляванні генетычна складаных і паводніцкіх нейрапсіхіятрычных расстройстваў у цяперашні час абмежаваная.
Трансплантацыя hCO у непашкоджаны жывы мозг можа пераадолець гэтыя абмежаванні. Папярэднія даследаванні паказалі, што нейроны чалавека, трансплантаваныя ў кару галаўнога мозгу грызуноў, здольныя выжываць, праецыраваць і мець зносіны з клеткамі грызуноў7,8,9,10,11,12. Аднак гэтыя эксперыменты звычайна праводзяцца на дарослых жывёлах, што можа абмяжоўваць сінаптычную і аксональную інтэграцыю. Тут мы апісваем парадыгму трансплантацыі, у якой мы трансплантавалі 3D hCO, атрыманы з клетак hiPS, у першасную саматасенсарную кару (S1) імунадэфіцытных пацукоў на ранняй стадыі пластычнага развіцця. Трансплантаваныя нейроны hCO (t-hCO) падвяргаюцца істотнаму паспяванню, атрымліваюць таламокартыкальныя і коркава-картыкальныя ўваходныя сігналы, якія выклікаюць сэнсарныя рэакцыі, і распаўсюджваюць аксональныя праекцыі ў мозг пацукоў, каб стымуляваць паводзіны, накіраваныя на пошук узнагароды. Працяглае паспяванне t-hCO выявіла нейрональныя дэфекты ў пацыентаў з сіндромам Цімаці (TS), цяжкім генетычным захворваннем, выкліканым мутацыямі ў напружаннеадчувальным кальцыевым канале L-тыпу CaV1.2 (кадзіруецца CACNA1C).
Для вывучэння нейронаў кары галаўнога мозгу чалавека ў ланцугах in vivo мы стэрэатаксічна перасадзілі інтактны 3D hCO у S1 ранніх постнатальных атимічных пацукоў (дні 3-7 пасля нараджэння) (мал. 1a і пашыраныя дадзеныя мал. 1a-c). На дадзены момант таламокартыкальныя і кортыкакартыкальныя аксональныя праекцыі яшчэ не завяршылі сваю S1-інервацыю (спасылка 13). Такім чынам, гэты падыход прызначаны для максімізацыі інтэграцыі t-hCO пры мінімізацыі ўздзеяння на эндагенныя ланцугі. Каб візуалізаваць месцазнаходжанне t-hCO у жывых жывёл, мы правялі Т2-зважаную МРТ-рэканструкцыю галаўнога мозгу пацукоў праз 2-3 месяцы пасля трансплантацыі (мал. 1b і пашыраныя дадзеныя, мал. 1d). t-hCO лёгка назіраліся, а аб'ёмныя вымярэнні t-hCO былі падобныя да вымярэнняў, разлічаных па фіксаваных зрэзах (пашыраныя дадзеныя, мал. 1d,e; P > 0,05). t-hCO лёгка назіраліся, а аб'ёмныя вымярэнні t-hCO былі падобныя да вымярэнняў, разлічаных па фіксаваных зрэзах (пашыраныя дадзеныя, мал. 1d,e; P > 0,05). t-hCO лёгка назіраліся, а аб'ёмныя вымярэнні t-hCO былі аналагічнымі расцэненымі для фіксаваных зрэзаў (расшыраныя дадзеныя, рыс. 1d, e; P> 0,05). t-hCO лёгка назіраліся, а аб'ёмныя вымярэнні t-hCO былі падобныя да вымярэнняў, разлічаных для фіксаваных зрэзаў (пашыраныя дадзеныя, мал. 1d, e; P > 0,05).很容易观察到t-hCO，并且t-hCO的体积测量值与从固定切片计算的测量值相似（扩展数据图1d、e；P > 0,05）。很容易观察到t-hCO，并且t-hCO t-hCO лёгка назіраўся, а аб'ёмныя вымярэнні t-hCO былі аналагічнымі расцэненымі для фіксаваных зрэзаў (расшыраныя дадзеныя, рыс. 1d, e; P> 0,05). t-hCO лёгка назіраўся, і аб'ёмныя вымярэнні t-hCO былі падобныя да вымярэнняў, разлічаных для фіксаваных зрэзаў (пашыраныя дадзеныя, мал. 1d, e; P > 0,05).Мы вызначылі t-hCO₂ у 81% трансплантаваных жывёл прыблізна праз 2 месяцы пасля трансплантацыі (n = 72 жывёлы; hCO₂ з 10 клеткавых ліній hiPS; клеткавыя лініі hiPS у Дадатковай табліцы 1). З іх 87% знаходзіліся ў кары галаўнога мозгу (мал. 1c). Выконваючы паслядоўныя МРТ-сканаванні ў некалькі момантаў часу ў аднаго і таго ж трансплантаванага пацука, мы выявілі дзевяціразовае павелічэнне аб'ёму t-hCO₂ на працягу 3 месяцаў (мал. 1d і пашыраныя дадзеныя, мал. 1f). Трансплантаваныя жывёлы мелі высокі ўзровень выжывальнасці (74%) праз 12 месяцаў пасля трансплантацыі (пашыраныя дадзеныя, мал. 1g і Дадатковая табліца 2), і не было выяўлена ніякіх відавочных рухальных або памяццевых парушэнняў, гліялёзу або электраэнцэфалаграмы (ЭЭГ). Дадзеныя мал. 1g і дадатковая табліца 2). 1h–m і 3e).
а, Схема эксперыментальнага дызайну. hCO2, атрыманы з клетак hiPS, быў трансплантаваны ў S1 нованароджаных голых пацукоў на 30-60-ы дзень дыферэнцыяцыі. b, Т2-зважаныя каранарныя і гарызантальныя МРТ-выявы, якія паказваюць t-hCO2 ў S1 праз 2 месяцы пасля трансплантацыі. Маштабная лінейка, 2 мм. c, Колькасная ацэнка паказчыкаў паспяховасці прыжыўляльнасці, паказана для кожнай лініі клетак hiPS (n = 108, лічбы ў слупках паказваюць колькасць t-hCO2 на лінію клетак hIPS) і коркавага або падкоркавага месцазнаходжання (n = 88). d, МРТ-выява каранарнай артэрыі (злева; маштабная лінейка, 3 мм) і адпаведная 3D-аб'ёмная рэканструкцыя (маштабная лінейка, 3 мм), якая паказвае павелічэнне t-hCO2 на працягу 3 месяцаў. e, Агляд карціны t-hCO2 у кары галаўнога мозгу пацукоў. Маштабная лінейка, 1 мм. f, Тыповыя імунацытахімічныя выявы t-hCO, паказаныя зверху злева направа (падчас дыферэнцыяцыі): PPP1R17 (4 месяцы), NeuN (8 месяцаў), SOX9 і GFAP (8 месяцаў), PDGFRα; (8 месяцаў), MAP2 (8 месяцаў) і IBA1 (8 месяцаў). Маштабная лінейка, 20 мкм. Сумесная экспрэсія HNA паказвае на клеткі чалавечага паходжання. g, snRNA-seq: візуалізацыя з памяншэннем памернасці з дапамогай уніфікаванай мнагастайнасці і праекцыі (UMAP) усіх высакаякасных ядраў t-hCO пасля інтэграцыі па Сёра (n=3 узоры t-hCO, n=2 клетачныя лініі hiPS). Астрацыты, клеткі лініі астрацытаў; cyc prog, цыркулюючыя папярэднікі; GluN DL, глыбокія глутаматэргічныя нейроны; GluN DL/SP, глыбокія і субламелярныя глутаматэргічныя нейроны; GluN UL, глутаматэргічныя нейроны верхняга пласта; алігадэндрацыты, алігадэндрацыты; OPC, клеткі-папярэднікі алігадэндрацытаў; RELN, рылінавыя нейроны. h, аналіз узбагачэння тэрмінамі геннай анталогіі (GO) генаў, значна павышаных (скарэкціраваны P < 0,05, кратнае змяненне > 2, экспрэсія прынамсі ў 10% ядраў) у глутаматэргічных нейронах t-hCO у параўнанні з глутаматэргічнымі нейронамі hCO. h, аналіз узбагачэння тэрмінамі геннай анталогіі (GO) генаў, значна павышаных (скарэкціраваны P < 0,05, кратнае змяненне > 2, экспрэсія прынамсі ў 10% ядраў) у глутаматэргічных нейронах t-hCO у параўнанні з глутаматэргічнымі нейронамі hCO. h, абагачэнне тэрмінаў Gene Ontology (GO) для генаў са значнай актывацыяй (скарэктаваны P <0,05, кратнасць змены> 2, экспрэсія па крайняй меры ў 10% ядра) у глутаматергічных нейронах t-hCO у параўнанні з глутаматергічнымі нейронамі hCO. h, аналіз узбагачэння тэрмінаў геннай анталогіі (GO) для генаў са значнай актывацыяй (скарэкціраваны P <0,05, кратнае змяненне >2, экспрэсія як мінімум у 10% ядраў) у глутаматэргічных нейронах t-hCO у параўнанні з глутаматэргічнымі нейронамі hCO. h，与hCO 谷氨酸能神经元相比，t-hCO 谷氨酸能神经元中基因显着上调（调整后P < 0,05，倍数变化> 2，在至少10% 的细胞核中表达）的基因本体论(GO) 术语富集分析。 h ， 与 hco 谷氨酸 能 元 相比 ， t-hco 谷氨酸 能 神经 元 基因 显着 上调 （后 后 p <0,05 ，变化 变化> 2 ， 至少 10% 的 核中 表达） 基因 基因 基因 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的的 的 的 的本体论(GO) 术语富集分析。 h, гены значна актывізаваліся (скарэктаваны P <0,05, кратнасць змены> 2, экспрэсуецца ў крайнім вымярэнні ў 10% ядра) у глутаматергічных нейронах t-hCO у параўнанні з глутаматергічнымі нейронамі hCO Анталагічны (GO) аналіз тэрміна абагачэння. h, гены былі значна рэгуляваны ўверх (скарэкціраваны P < 0,05, кратнае змяненне > 2, экспрэсія прынамсі ў 10% ядраў) у глутаматэргічных нейронах t-hCO у параўнанні з глутаматэргічнымі нейронамі hCO Анталагічны (GO) аналіз тэрміна ўзбагачэння.Пункцірная лінія паказвае значэнне aq 0,05. i, UMAP-візуалізацыя тыпаў клетак GluN у t-hCO з выкарыстаннем пераносу меткі з эталоннага набору дадзеных маторнай кары дарослых 22 snRNA-seq. КТ — кортыкаталамічныя клеткі, ET — экстрацэрэбральныя клеткі, IT — унутраныя тэленцэфалічныя клеткі, NP — блізкая праекцыя.
Затым мы ацанілі цытаархітэктуру і агульны клеткавы склад t-hCO. Афарбоўванне эндатэліяльных клетак пацукоў антыцеламі выявіла васкулярызацыю з дапамогай t-hCO, у той час як афарбоўванне IBA1 выявіла наяўнасць мікрагліі пацукоў па ўсім трансплантаце (мал. 1f і пашыраныя дадзеныя, мал. 3c,d). Імунаафарбоўванне выявіла клеткі, станоўчыя па ядзерным антыгене чалавека (HNA), якія сумесна экспрэсуюць PPP1R17 (кортикальныя клеткі-папярэднікі), NeuN (нейроны), SOX9 і GFAP (гліяльныя клеткі) або PDGFRα (алігадэндрацытныя клеткі-папярэднікі) (мал. 1f). Каб вывучыць клеткавы склад t-hCO з дазволам адной клеткі, мы правялі секвенаванне аднаядзернай РНК (snRNA-seq) прыблізна праз 8 месяцаў дыферэнцыяцыі. Аб'ёмная фільтрацыя і выдаленне ядраў пацукоў далі 21 500 высакаякасных монануклеарных карт чалавека (мал. 1g і пашыраныя дадзеныя, мал. 4a,b). Патэрны экспрэсіі тыповых маркераў клеткавага тыпу вызначылі кластары асноўных класаў коркавых клетак, у тым ліку глыбокія і павярхоўныя глутаматэргічныя нейроны, цыркулюючыя клеткі-папярэднікі, алігадэндрацыты і лінію астрацытаў (мал. 1g, пашыраныя дадзеныя, мал. 4c і дадатковая табліца 3). Імунаафарбоўванне на SATB2 і CTIP2 паказала, што, нягледзячы на ​​наяўнасць коркавых падтыпаў, t-hCO не прадэманстравала выразнай анатамічнай стратыфікацыі (пашыраныя дадзеныя, мал. 3a). Стадыя супастаўлення snRNA-seq hCO прывяла да ў цэлым падобных класаў клетак, за некалькімі выключэннямі, у тым ліку адсутнасці алігадэндрацытаў і наяўнасці ГАМКергічных нейронаў, што можа адлюстроўваць раней апісаныя спрыяльныя ўмовы in vitro для латэральных клетак-папярэднікаў15 (пашыраныя дадзеныя, мал. 4f-i і дадатковая табліца 4). Дыферэнцыяльны аналіз экспрэсіі генаў выявіў значныя адрозненні ў глутаматергічных нейронах паміж t-hCO і hCO (Дадатковая табліца 5), у тым ліку актывацыю набораў генаў, звязаных з паспяваннем нейронаў, такіх як сінаптычная сігналізацыя, лакалізацыя дендрытаў і актыўнасць напружаннезалежных каналаў (Малюнак 1h і Дадатковая табліца 5, табліца 6). Адпаведна, кортикальныя глутаматергічныя нейроны t-hCO прадэманстравалі паскоранае транскрыпцыйнае паспяванне.
Каб высветліць, ці былі гэтыя транскрыпцыйныя змены ў t-hCO звязаны з марфалагічнымі адрозненнямі паміж hCO in vitro і t-hCO in vivo, мы рэканструявалі стадыйна супастаўленыя hCO і hCO, запоўненыя біяцыцінам, у вострых зрэзах праз 7-8 месяцаў дыферэнцыяцыі. Нейроны hCO (мал. 2a). Нейроны t-hCO былі значна большымі, мелі ў 1,5 раза большы дыяметр сомы, удвая больш дендрытаў і агульную шасцікратную даўжыню дендрытаў у параўнанні з hCO in vitro (мал. 2b). Акрамя таго, мы назіралі значна большую шчыльнасць дендрытных шыпоў у нейронах t-hCO, чым у нейронах hCO (мал. 2c). Гэта сведчыць аб тым, што нейроны t-hCO падвяргаюцца значнаму падаўжэнню і галінаванню дендрытаў, што ў спалучэнні з працяглай праліферацыяй клетак можа спрыяць інтэнсіўнаму росту t-hCO пасля трансплантацыі (мал. 1d і пашыраныя дадзеныя, мал. 1f). Гэта падштурхнула нас даследаваць электрафізіялагічныя ўласцівасці. Ёмістасць мембраны была ў восем разоў вышэйшай (пашыраныя дадзеныя, мал. 8d), мембранны патэнцыял у стане спакою быў больш гіперпалярызаваны (прыблізна 20 мВ), а ўвядзенне току выклікала больш высокую максімальную хуткасць узбуджэння ў нейронах t-hCO, чым у нейронах hCO. in vitro (мал. 2d), e), што адпавядае больш буйным і складаным марфалагічным асаблівасцям t-hCO. Акрамя таго, частата спантанных узбуджальных постсінаптычных токавых падзей (EPSC) была значна вышэйшай у нейронах t-hCO (мал. 2f), што сведчыць аб тым, што павышаная шчыльнасць дендрытных шыпоў, якая назіраецца ў нейронах t-hCO, была звязана з функцыянальнай узбудлівасцю. палавы сінапс. Мы пацвердзілі няспелы характар ​​нейронаў hCO in vitro, рэгістраваючы мечаныя глутаматергічныя нейроны (пашыраныя дадзеныя, мал. 6a-c).
а, 3D-рэканструкцыя нейронаў hCO і t-hCO, запоўненых біяцыцінам, пасля 8 месяцаў дыферэнцыяцыі. b, Колькасная ацэнка марфалагічных асаблівасцей (n = 8 нейронаў hCO, n = 6 нейронаў t-hCO; **P = 0,0084, *P = 0,0179 і ***P < 0,0001). b, Колькасная ацэнка марфалагічных асаблівасцей (n = 8 нейронаў hCO, n = 6 нейронаў t-hCO; **P = 0,0084, *P = 0,0179 і ***P < 0,0001). б, количественная ацэнка марфалагічных прызнакаў (n = 8 нейронаў hCO, n = 6 нейронаў t-hCO; ** P = 0,0084, * P = 0,0179 і *** P <0,0001). b, колькасная ацэнка марфалагічных асаблівасцей (n=8 нейронаў hCO, n=6 нейронаў t-hCO; **P=0,0084, *P=0,0179 і ***P<0,0001). b，形态学特征的量化（n = 8 个hCO 神经元, n = 6 个t-hCO 神经元；**P = 0,0084，*P = 0,0179 和***P < 0,0001). b，形态学特征的量化（n = 8 个hCO 神经元, n = 6 个t-hCO 神经元；**P = 0,0084，*P = 0,0179 和***P < 0,0001). б, количественная ацэнка марфалагічных прызнакаў (n = 8 нейронаў hCO, n = 6 нейронаў t-hCO; ** P = 0,0084, * P = 0,0179 і *** P <0,0001). b, колькасная ацэнка марфалагічных асаблівасцей (n=8 нейронаў hCO, n=6 нейронаў t-hCO; **P=0,0084, *P=0,0179 і ***P<0,0001).c, 3D-рэканструкцыя дендрытных галін hCO і t-hCO пасля 8 месяцаў дыферэнцыяцыі. Чырвонымі зорачкамі пазначаны меркаваныя дендрытныя шыпікі. Колькасная ацэнка шчыльнасці дендрытных шыпікоў (n = 8 нейронаў hCO, n = 6 нейронаў t-hCO; **P = 0,0092). d, Колькасная ацэнка мембраннага патэнцыялу спакою (n = 25 нейронаў hCO, n = 16 нейронаў t-hCO; ***P < 0,0001). d, Колькасная ацэнка мембраннага патэнцыялу спакою (n = 25 нейронаў hCO, n = 16 нейронаў t-hCO; ***P < 0,0001). d, количественная ацэнка мембраннага патэнцыялу пакоя (n = 25 нейронаў hCO, n = 16 нейронаў t-hCO; *** P <0,0001). d, колькаснае вызначэнне мембраннага патэнцыялу спакою (n = 25 нейронаў hCO, n = 16 нейронаў t-hCO; ***P < 0,0001). d，静息膜电位的量化（n = 25 hCO 神经元, n = 16 т-hCO 神经元；***P <0,0001）. d，静息膜电位的量化（n = 25 hCO 神经元, n = 16 т-hCO 神经元；***P <0,0001）. d, количественная ацэнка мембраннага патэнцыялу пакоя (n = 25 нейронаў hCO, n = 16 нейронаў t-hCO; *** P <0,0001). d, колькаснае вызначэнне мембраннага патэнцыялу спакою (n = 25 нейронаў hCO, n = 16 нейронаў t-hCO; ***P < 0,0001). e, Паўторнае ўздзеянне патэнцыялу дзеяння ў hCO і t-hCO, выкліканае павелічэннем ін'екцый току, і колькасная ацэнка максімальнай хуткасці ўздзеяння (n = 25 нейронаў hCO, n = 16 нейронаў t-hCO; ***P < 0,0001). e, Паўторнае ўздзеянне патэнцыялу дзеяння ў hCO і t-hCO, выкліканае павелічэннем ін'екцый току, і колькасная ацэнка максімальнай хуткасці ўздзеяння (n = 25 нейронаў hCO, n = 16 нейронаў t-hCO; ***P < 0,0001). e, паўторнае павелічэнне патэнцыялу дзеяння ў hCO і t-hCO, выкліканае павелічэнне току, і колькасная адзнака максімальнай хуткасці ўзбуджэння (n = 25 нейронаў hCO, n = 16 нейронаў t-hCO; *** P <0,0001). e, паўторнае ўзбуджэнне патэнцыялу дзеяння ў hCO і t-hCO, выкліканае павелічэннем току і колькасным вызначэннем максімальнай хуткасці ўзбуджэння (n = 25 нейронаў hCO, n = 16 нейронаў t-hCO; *** P < 0,0001). e，通过增加电流注入诱导的hCO 和t-hCO 重复动作电位放电，以及最大放电率的量化（n = 25个hCO 神经元，n = 16 个t-hCO 神经元；***P <0,0001）. E ， 通过 增加 电流 注入 的 的 hco 和 t-hco 重复 电位 放电 ， 以及 最 大 的 量化 （（n = 25个 hco 神经 ， n = 16 个 t-hco 神经 ； *** p <0,0001） 。 e, паўторнае ўзбуджанне патэнцыялу дзеяння hCO і t-hCO, выкліканае павелічэнне падачы току, і колькасная адзнака максімальнай хуткасці ўзбуджэння (n = 25 нейронаў hCO, n = 16 нейронаў t-hCO; *** P <0,0001). д, паўторнае ўздзеянне патэнцыялаў дзеяння hCO і t-hCO, выкліканых павелічэннем падачы току і колькасным вызначэннем максімальнай хуткасці ўздзеяння (n = 25 нейронаў hCO, n = 16 нейронаў t-hCO; *** P < 0,0001). f, Спантанныя EPSC (sEPSC) у нейронах hCO і t-hCO праз 8 месяцаў дыферэнцыяцыі і колькасная ацэнка частаты сінаптычных падзей (n = 25 нейронаў hCO, n = 17 нейронаў t-hCO; ***P < 0,0001). f, Спантанныя EPSC (sEPSC) у нейронах hCO і t-hCO праз 8 месяцаў дыферэнцыяцыі і колькасная ацэнка частаты сінаптычных падзей (n = 25 нейронаў hCO, n = 17 нейронаў t-hCO; ***P < 0,0001). f, спантанныя EPSC (sEPSC) у нейронах hCO і t-hCO праз 8 месяцаў дыферэнцыяцыі і колькасная ацэнка частаты сінаптычных падзей (n = 25 нейронаў hCO, n = 17 нейронаў t-hCO; *** P <0,0001) . f, Спантанныя EPSC (sEPSC) у нейронах hCO і t-hCO праз 8 месяцаў дыферэнцыяцыі і колькасная ацэнка частаты сінаптычных падзей (n = 25 нейронаў hCO, n = 17 нейронаў t-hCO; ***P < 0,0001). f，分化8 个月时hCO 和t-hCO 神经元中的自发性EPSCs (sEPSCs)，以及突触事件频率的量化（n = 25 hCO神经元，n = 17 t-hCO 神经元；***P <0,0001） . f，分化8 个月时hCO 和t-hCO 神经元中的自发性EPSCs (sEPSCs)，以及突触事件频率的量匼（n = 25 hCO神率的量匼（n = 25 hCO 神率的量匼（n = 25hCO P <0,0001） . f, спантанныя EPSC (sEPSC) у нейронах hCO і t-hCO праз 8 месяцаў дыферэнцыяцыі і колькасная ацэнка частаты сінаптычных падзей (n = 25 нейронаў hCO, n = 17 нейронаў t-hCO; *** P <0,0001). f, Спантанныя EPSC (sEPSC) у нейронах hCO і t-hCO праз 8 месяцаў дыферэнцыяцыі і колькасная ацэнка частаты сінаптычных падзей (n = 25 нейронаў hCO, n = 17 нейронаў t-hCO; *** P <0,0001).Для bf, hCO і t-hCO у лініі 1208-2 былі ўзятыя з адной і той жа партыі дыферэнцыяцыі, якая падтрымлівалася паралельна. g, Аналіз узбагачэння набору генаў (аднабаковы дакладны тэст Фішэра) генаў, значна павышаных (скарэкціраваны P < 0,05, кратнае змяненне > 2, экспрэсія прынамсі ў 10% ядраў) у глутаматергічных нейронах t-hCO у параўнанні з глутаматергічнымі нейронамі hCO з наборамі генаў як ранняга (ERG), так і позняга (LRG) адказу, залежных ад актыўнасці, ідэнтыфікаванымі ў даследаванні на мышах in vivo16, і спецыфічнымі для чалавека LRG з нейронаў in vitro17. g, Аналіз узбагачэння набору генаў (аднабаковы дакладны тэст Фішэра) генаў, значна павышаных (скарэкціраваны P < 0,05, кратнае змяненне > 2, экспрэсія прынамсі ў 10% ядраў) у глутаматергічных нейронах t-hCO у параўнанні з глутаматергічнымі нейронамі hCO з наборамі генаў як ранняга (ERG), так і позняга (LRG) адказу, залежных ад актыўнасці, ідэнтыфікаванымі ў даследаванні на мышах in vivo16, і спецыфічнымі для чалавека LRG з нейронаў in vitro17. g, аналіз узбагачэння набору генаў (аднабаковы тачны крытэрый Фішэра) генаў са значнай актывацыяй (скарэкціраваны P <0,05, кратнасць змены > 2, экспрэсія па меншай меры ў 10% ядра) у глутаматергічных нейронах t-hCO у параўнанні з глутаматергічнымі нейронамі hCO наборы генаў як ранняга (ERG), так і позняга (LRG) генаў, залежных ад актыўнасці, ідэнтыфікаваных у даследаванні на мышах in vivo16, і спецыфічных для чалавека LRG з нейронаў in vitro17. g, аналіз узбагачэння набору генаў (аднабаковы дакладны тэст Фішэра) генаў са значнай актывацыяй (скарэкціраваны P <0,05, кратнае змяненне >2, экспрэсія прынамсі ў 10% ядраў) у глутаматергічных нейронах t-hCO у параўнанні з наборамі глутаматергічных нейронаў hCO як ранніх (ERG), так і позніх (LRG) генаў, залежных ад актыўнасці, ідэнтыфікаваных у мышэй in vivo16 і спецыфічных для чалавека LRG з нейронаў in vitro17. g，t-hCO谷氨酸能神经元与hCO谷氨酸能神经元相比，t -hCO谷氨酸能神经元显着上调（调整后P<0,05，倍数变化>2，在至少10% 的细胞核中表达＾)的基因集富集分析（单侧F isher精确检验）从体内小鼠研究中鉴定的早期反应(ERG)和晚期反应(LRG) 活性依赖性基因的基因组16 和体外神经元17 中的人类特异性LRG。 g ， t-hco 谷氨酸 神经 元 与 hco 谷氨酸 神经 元 相比 ， t-hco 谷氨酸 神经 元 上调 （调整 后 p <0,05 ， 倍数> 2 ， 至少 至少 10%的 细胞 核中 表达） 的 集富集 分析 （单侧 Fisher 精确）)体内 小鼠 研究 中 的 早期 反应 反应 反应 和 晚期 反应 反应 (lrg) 活性 基因 的 基因组 16 和神经元 神经元 17 中 中 17 中 17的人类特异性LRG。 g, глутаматергічныя нейроны t-hCO былі значна актываваныя ў параўнанні з глутаматергічных нейронамі hCO (скарэкціраваны P<0,05, частата змены> 2, не менш за 10% Аналіз узбагачэння набору генаў (аднабаковы тачны тэст Фішэра) ранняга адказу (ERG) і позняга гена, які залежыць ад актыўнасці адказу (LRG), ідэнтыфікаваных у даследаваннях мышах in vivo16 і нейронах in vitro17, спецыфічныя для чалавека. g, глутаматергічныя нейроны t-hCO былі значна рэгуляваны ў параўнанні з глутаматергічнымі нейронамі hCO (скарэкціраваны P <0,05, кратнае змяненне >2, не менш за 10% Аналіз узбагачэння генаў ранняга адказу (ERG) і позняга адказу (аднабаковы дакладны тэст Фішэра) Гены, залежныя ад актыўнасці адказу (LRG), ідэнтыфікаваныя ў мышэй in vivo16 і нейронаў in vitro.17 Спецыфічныя для чалавека LRG.Пункцірная лінія паказвае значэнне P, скарэкціраванае па методыцы Банфероні, роўнае 0,05. г/г. Экспрэсія гена GluN (псеўдапакет і маштабаванне кожнага гена) была значна павышана ў рэпліках snRNA-seq генаў LRG у глутаматэргічных нейронах t-hCO. i, імунафарбаванне, якое паказвае экспрэсію SCG2 у нейронах t-hCO (верхні) і hCO (ніжні). Белыя стрэлкі паказваюць на клеткі SCG2+. Маштабная лінейка, 25 мкм. Дадзеныя прадстаўлены як сярэдняе значэнне ± стандартнае адхіленне.
Зыходзячы з павышанай актыўнасці t-hCO, якая назіралася ў зрэзах ex vivo, snRNA-seq выявіла залежную ад актыўнасці рэгуляцыю генных транскрыптаў у t-hCO у параўнанні з hCO in vitro. Глутаматергічныя нейроны t-hCO экспрэсавалі больш высокія ўзроўні генаў, якія рэгулююць актыўнасць позняга адказу (мал. 2g,h), якія былі выяўлены ў папярэдніх даследаваннях на нейронах мышэй і чалавека16,17. Напрыклад, BDNF18, SCG2 і OSTN, спецыфічны для прыматаў ген, які рэгулюе актыўнасць, прадэманстравалі павышаную экспрэсію ў нейронах t-hCO у параўнанні з нейронамі hCO (мал. 2g-i). Такім чынам, нейроны t-hCO прадэманстравалі палепшаныя характарыстыкі паспявання ў параўнанні з нейронамі hCO, пацверджаныя транскрыпцыйным, марфалагічнай і функцыянальнай аналізамі.
Каб далей ацаніць сувязь паспявання t-hCO з развіццём мозгу чалавека, мы правялі транскрыптомныя параўнанні тыпаў клетак кары галаўнога мозгу плода і дарослага чалавека19,20 і дарослага чалавека21,22, а таксама шырокія дадзеныя аб экспрэсіі генаў кары галаўнога мозгу23 падчас развіцця (пашыраныя дадзеныя, мал. 5). Згодна з папярэдняй працай24, глабальны статус паспявання hCO і транскрыптома t-hCO на 7-8 месяцах дыферэнцыяцыі ў цэлым адпавядае часу развіцця in vivo і найбольш эквівалентны позняму перыяду жыцця плода (пашыраныя дадзеныя, мал. 5a). Прыкметна, што мы назіралі павышаную сталасць транскрыптома ў t-hCO у параўнанні з hCO таго ж узросту, а таксама актывацыю транскрыптома, звязаную з сінаптагенезам, астрагенезам і міэлінізацыяй (пашыраныя дадзеныя, мал. 5b-d). На клеткавым узроўні мы выявілі доказы больш тонкага падтыпу кары ў t-hCO, прычым кластары глутаматэргічных нейронаў перакрываюцца з падтыпамі нейронаў L2/3, L5 і L6 дарослага чалавека (малюнак 1i). Наадварот, перакрыццё кластараў паміж глутаматэргічнымі t-hCO нейронамі і фетальнымі каркавымі нейронамі было больш абмежаваным у сярэдзіне цяжарнасці (пашыраныя дадзеныя, малюнак 5e-j). Каб вызначыць, ці функцыянальна падобныя t-hCO нейроны да постнатальных неакартыкальных нейронаў чалавека, мы правялі электрафізіялагічныя запісы і анатамічныя рэканструкцыі пірамідальных нейронаў чалавека L2/3 у вострых зрэзах постнатальнай кары чалавека (пашыраныя дадзеныя, малюнак 7a). Электрафізіялагічныя ўласцівасці пірамідальных нейронаў L2/3 былі падобныя да ўласцівасцей пірамідальных нейронаў t-hCO (пашыраныя дадзеныя, малюнак 7e). Марфалагічна нейроны L2/3 з постнатальных узораў чалавека былі больш падобныя да t-hCO, чым да hCO, хоць клеткі L2/3 былі даўжэйшымі, утрымлівалі больш галін у цэлым і мелі больш высокую шчыльнасць шыпоў (мал. 3g і пашыраныя дадзеныя, мал. 7b-). G).
а, трансплантацыя hCO, выпрацаванай кантрольнымі і TS hiPS клеткавымі лініямі, нованароджаным пацукам. б, 3D-рэканструкцыя біяцыцінавых нейронаў t-hCO пасля 8 месяцаў дыферэнцыяцыі. в, колькасная ацэнка сярэдняй даўжыні дендрытаў (n = 19 кантрольных нейронаў, n = 21 TS нейрон; **P = 0,0041). d, 3D-рэканструяваныя дендрытныя галіны з кантрольнай групы і групы TS t-hCO праз 8 месяцаў дыферэнцыяцыі і колькасная ацэнка шчыльнасці дендрытных шыпікоў (n = 16 кантрольных нейронаў, n = 21 нейрон групы TS, ***P < 0,0001). d, 3D-рэканструяваныя дендрытныя галіны з кантрольнай групы і групы TS t-hCO праз 8 месяцаў дыферэнцыяцыі і колькасная ацэнка шчыльнасці дендрытных шыпікоў (n = 16 кантрольных нейронаў, n = 21 нейрон групы TS, ***P < 0,0001). d, 3D-рэканструкцыя дендритных ветвей з кантролю і TS t-hCO праз 8 месяцаў дыферэнцыяцыі і колькасная ацэнка плотнасці дендритных шыпаў (n = 16 кантрольных нейронаў, n = 21 TS нейронаў, *** P <0,0001). d, 3D-рэканструкцыя дендрытных галін з кантрольнай групы і групы t-hCO TS праз 8 месяцаў дыферэнцыяцыі і колькаснае вызначэнне шчыльнасці дендрытных шыпікоў (n=16 кантрольных нейронаў, n=21 нейрон TS, ***P<0,0001). d，分化8 个月时对照和TS t-hCO 的3D 重建树突分支，以及树突棘密度的量化（n = 16个对照神经元, n = 21 个TS 神经元, ***P < 0,0001). d ， 分化 8 个 时 对照 和 ts t-hco 的 3d 重建 分支 分支 以及 树突棘 密度 量化 （n = 16 个神经 元 ， n = 21 个 ts 神经 ， *** p <0,0001 ）. d, 3D-рэканструкцыя дендритных ветвей кантролю і TS t-hCO праз 8 месяцаў дыферэнцыяцыі і колькасная ацэнка плотнасці дендритных шыпаў (n = 16 кантрольных нейронаў, n = 21 TS нейронаў, *** P <0,0001). d, 3D-рэканструкцыя кантрольных дендрытных галін і TS t-hCO праз 8 месяцаў дыферэнцыяцыі і колькаснае вызначэнне шчыльнасці дендрытных шыпікоў (n = 16 кантрольных нейронаў, n = 21 TS нейрон, ***P < 0,0001).Чырвонымі зорачкамі пазначаны меркаваныя дендрытныя шыпікі. e — спантанныя EPSC у кантрольных нейронах і нейронах TS t-hCO пасля 8 месяцаў дыферэнцыяцыі. f — графік сукупнай частаты і колькасная ацэнка частаты і амплітуды сінаптычных падзей (n=32 кантрольныя нейроны, n=26 нейронаў TS; **P=0,0076 і P=0,8102). g — аналіз Шоля TS і кантрольных нейронаў у hCO і t-hCO. Пункцірнымі лініямі паказаны постнатальныя пірамідныя нейроны чалавека L2/3 для параўнання (n = 24 кантрольныя нейроны t-hCO, n = 21 нейрон TS t-hCO, n = 8 кантрольных нейронаў hCO і n = 7 нейронаў TS hCO). Дадзеныя прадстаўлены ў выглядзе сярэдняга значэння ± стандартнае адхіленне.
Здольнасць t-hCO рэплікаваць марфалагічныя і функцыянальныя асаблівасці нейронаў кары галаўнога мозгу чалавека на высокім узроўні падштурхнула нас даследаваць, ці можна выкарыстоўваць t-hCO для выяўлення фенатыпаў захворванняў. Мы засяродзіліся на стэроідным синдроме (СТС), цяжкім нейраразвіццёвым захворванні, выкліканым мутацыямі з набыццём функцыі ў гене, які кадуе CaV1.2, што ініцыюе залежную ад актыўнасці транскрыпцыю генаў у нейронах. Мы атрымалі hCO ад трох пацыентаў з СТС, якія маюць найбольш распаўсюджаную замену (p.G406R), і трох кантрольных груп (мал. 3a). Пасля трансплантацыі мы выявілі, што марфалогія дендрытаў была змененая ў нейронах СТС у параўнанні з кантрольнымі (мал. 3b і пашыраныя дадзеныя, мал. 8a,b), з двухразовым павелічэннем колькасці першасных дендрытаў і агульным павелічэннем сярэдняга і агульнага зніжэння даўжыні дендрытаў (мал. 3c і пашыраныя дадзеныя, мал. 8c). Гэта было звязана з павелічэннем шчыльнасці шыпоў і павелічэннем частаты спантанных EPSC у СТС у параўнанні з кантрольнымі нейронамі (мал. 3d–f і пашыраныя дадзеныя, мал. 8g). Далейшы аналіз выявіў заканамернасці анамальнага галінавання дендрытаў у t-hCO TS у параўнанні з кантрольнай групай, але не ў in vitro TS hCO на падобнай стадыі дыферэнцыяцыі (мал. 3g). Гэта адпавядае нашым папярэднім паведамленням аб залежным ад актыўнасці скарачэнні дендрытаў у TS і падкрэслівае здольнасць гэтай трансплантацыйнай платформы выяўляць фенатыпы захворванняў in vivo.
Затым мы спыталі, у якой ступені t-hCO клеткі функцыянальна інтэграваныя ў S1 пацука. S1 у грызуноў атрымлівае моцныя сінаптычныя ўваходныя сігналы ад іпсілатэральных вентральных базальных і задніх ядраў таламуса, а таксама ад іпсілатэральнай рухальнай і другаснай саматасенсарнай кары галаўнога мозгу і кантралатэральнай S1 (мал. 4a). Каб аднавіць інервацыйны патэрн, мы заразілі hCO вірусам шаленства-dG-GFP/AAV-G і праз 3 дні перасадзілі hCO пацуку S1. Мы назіралі шчыльную экспрэсію GFP у нейронах іпсілатэральных S1 і вентральных базальных гангліяў праз 7–14 дзён пасля трансплантацыі (мал. 4b, c). Акрамя таго, афарбоўванне антыцеламі таламуса маркера нетрын G1 выявіла наяўнасць таламусных канчаткаў у t-hCO (мал. 4d, e). Каб ацаніць, ці могуць гэтыя аферэнтныя праекцыі выклікаць сінаптычныя рэакцыі ў клетках t-hCO, мы правялі запісы цэлых клетак чалавека ў вострых зрэзах таламокортикальнага пласта. Электрычная стымуляцыя S1 пацука, унутранай капсулы, белага рэчыва, валокнаў паблізу t-hCO або оптагенетычная актывацыя опсін-экспрэсуючых таламусных канчаткаў у t-hCO выклікала кароткалатэнтныя EPSC у нейронах t-hCO, якія падвяргаліся ўздзеянню антаганіста AMPA-рэцэптара NBQX (мал. 4f, g і пашыраныя дадзеныя, мал. 9a–g). Гэтыя дадзеныя дэманструюць, што t-hCO анатамічна інтэграваны ў мозг пацука і можа актывавацца тканінамі гаспадара пацука.
а, Схематычная дыяграма эксперыменту па адсочванні шаленства. б, экспрэсія GFP і спецыфічнага для чалавека STEM121 паміж t-hCO і карой галаўнога мозгу пацука (верхняя панэль). Таксама паказана экспрэсія GFP у іпсілатэральным вентральным базальным ядры (VB) пацука (унізе злева) і іпсілатэральным S1 (унізе справа). Маштабная лінейка, 50 мкм. Чырвоныя квадраты прадстаўляюць вобласці мозгу, дзе былі зроблены выявы. в, колькасная ацэнка клетак, якія экспрэсуюць GFP (n = 4 пацукі). г, д — таламічныя тэрміналы Netrin G1+ у t-hCO. г паказвае каранарны зрэз, які змяшчае ядры t-hCO і VB. Маштабная лінейка, 2 мм. д паказвае экспрэсію Netrin G1 і STEM121 у нейронах t-hCO (злева) і VB (справа). Маштабная лінейка, 50 мкм. Аранжавая пункцірная лінія паказвае мяжу t-hCO. f, g, Бягучыя сляды нейронаў t-hCO пасля электрычнай стымуляцыі ў пацука S1 (f) або ўнутранай капсулы (g), з (фіялетавы) або без (чорны) NBQX (злева). Амплітуды EPSC з NBQX і без яго (n = 6 нейронаў S1, *P = 0,0119; і n = 6 нейронаў унутранай капсулы, **P = 0,0022) (у цэнтры). Працэнт нейронаў t-hCO, якія дэманструюць EPSC у адказ на электрычную стымуляцыю пацука S1 (f) або ўнутранай капсулы (g) (справа). aCSF, штучная спіннамазгавая вадкасць. h, схематычная дыяграма эксперыменту па 2P-візуалізацыі (злева). Экспрэсія GCaMP6s у t-hCO (пасярэдзіне). Маштабная лінейка, 100 мкм. Інтэрвал флуарэсцэнцыі GCaMP6s (справа). i, Z-бал спантаннай актыўнасці флуарэсцэнцыі. j, схематычная ілюстрацыя стымуляцыі вусоў. k, траекторыі флуарэсцэнцыі 2P з z-балам у адным выпрабаванні, выраўнаваныя з адхіленнем вусоў у нулявы момант часу (пунцірная лінія) у прыкладных клетках. l, усярэдненыя па папуляцыі z-балавыя адказы ўсіх клетак, выраўнаваныя з адхіленнем вусоў у нулявы момант часу (пунцірная лінія) (чырвоны колер) або выпадкова згенераваныя часавыя меткі (шэры колер). m. Схематычная дыяграма эксперыменту па аптычнай маркіроўцы. n, крывыя неапрацаванага напружання з прыкладнай ячэйкі t-hCO падчас стымуляцыі сінім лазерам або адхілення вусоў. Чырвоныя стрэлкі паказваюць першыя пікі, выкліканыя святлом (уверсе) або выкліканыя адхіленнем вусоў (унізе). Шэрае зацяненне паказвае перыяды адхілення вусоў. o, формы хваль піка святла і водгукі адхілення вусоў. p, пікі адной спробы, выраўнаваныя з адхіленнем вусоў у клетках прыкладу. 0 паказвае адхіленне вусоў (пунцірная лінія). q, усярэдненая па папуляцыі z-балальная частата спрацоўвання для ўсіх фотаадчувальных клетак, выраўнаваная з адхіленнем вусоў у нулявы момант часу (пунцірная лінія) (чырвоны колер) або выпадкова згенераваныя часавыя меткі (шэры колер). r, доля фотаадчувальных адзінак, значна мадуляваных адхіленнем вусоў (n = 3 пацукі) (злева). Пікавая латэнтнасць z-паказчыка (n = 3 пацукі; n = 5 (светла-зялёны), n = 4 (цёмна-зялёны) і n = 4 (блакітны) адзінак мадуляцыі адхілення вусоў на пацука) (справа). Дадзеныя прадстаўлены як сярэдняе значэнне ± стандартнае адхіленне.
Затым мы спыталі, ці можа t-hCO актывавацца сэнсарнымі раздражняльнікамі in vivo. Мы перасадзілі hCO, які экспрэсуе генетычна закадаваныя кальцыевыя індыкатары GCaMP6, пацукам S1. Праз 150 дзён мы правялі валаконную фотаметрыю або двухфатонную кальцыевую візуалізацыю (мал. 4h і пашыраныя дадзеныя, мал. 10a). Мы выявілі, што клеткі t-hCO праяўлялі сінхранізаваную рытмічную актыўнасць (мал. 4i, пашыраныя дадзеныя, мал. 10b і дадатковае відэа 1). Каб ахарактарызаваць пікавую актыўнасць t-hCO, мы правялі пазаклеткавыя электрафізіялагічныя запісы ў анестэзаваных трансплантаваных пацуках (пашыраныя дадзеныя, мал. 10c-f). Мы стварылі стэрэатаксічныя каардынаты з МРТ-выяў; такім чынам, гэтыя запісаныя адзінкі ўяўляюць сабой меркаваныя чалавечыя нейроны, хоць сама электрафізіялогія не дазваляе вызначыць відавое паходжанне. Мы назіралі сінхранізаваныя ўсплёскі актыўнасці (пашыраныя дадзеныя, мал. 10d). Усплёскі доўжыліся каля 460 мс і былі падзеленыя перыядамі цішыні каля 2 с (пашыраныя дадзеныя, мал. 10d, e). Асобныя адзінкі выстралялі ў сярэднім каля трох стрэлаў за чаргу, што складае прыблізна 73% ад зарэгістраваных адзінак за чаргу. Актыўнасць асобных адзінак была высока карэляваная, і гэтыя карэляцыі былі вышэйшымі, чым у адзінак, выяўленых у невакцынаваных жывёл, зарэгістраваных у тых жа ўмовах (пашыраныя дадзеныя, мал. 10f). Каб далей ахарактарызаваць рэакцыі спайкаў ідэнтыфікаваных нейронаў, атрыманых ад чалавека, мы правялі эксперыменты па светлавой маркіроўцы на анестэзаваных пацуках, якім перасадзілі hCO, які экспрэсуе святлоадчувальны катыённы канал радапсін 2 (hChR2), праз які t-hCO-нейроны распазнаюць з кароткай затрымкай (менш за 10 мс) у адказ на стымулы сіняга святла (мал. 4m–o). t-hCO-нейроны праяўлялі ўсплёскі спантаннай актыўнасці на частотах, падобных да тых, што назіраюцца пры кальцыевай візуалізацыі, а таксама электрафізіялагічныя запісы, выкананыя ў t-hCO пры адсутнасці светлавой маркіроўкі (пашыраныя дадзеныя, мал. 10c-g). Спантаннай актыўнасці на адпаведных стадыях hCO, зарэгістраваных in vitro, не назіралася. Каб ацаніць, ці можа t-hCO актывавацца сэнсарнымі раздражняльнікамі, мы ненадоўга адхілілі вусы пацука ад t-hCO (мал. 4j,m і пашыраныя дадзеныя, мал. 10h,k). Згодна з папярэднімі даследаваннямі8,10, падмноства клетак t-hCO прадэманстравала павышаную актыўнасць у адказ на адхіленне вусоў, чаго не назіралася пры параўнанні дадзеных з выпадковымі часовымі меткамі (мал. 4k–q і пашыраныя дадзеныя, мал. 10h–q). Сапраўды, каля 54% адзінкавых адзінак з оптамечанай меткай прадэманстравалі значна павышаную хуткасць узбуджэння пасля стымуляцыі вусоў, дасягаючы піку прыкладна праз 650 мс (мал. 4r). У сукупнасці гэтыя дадзеныя сведчаць аб тым, што t-hCO атрымлівае адпаведныя функцыянальныя ўваходныя сігналы і можа актывавацца раздражняльнікамі навакольнага асяроддзя.
Затым мы даследавалі, ці можа t-hCO актываваць ланцугі ў пацукоў для кантролю паводзін. Спачатку мы даследавалі, ці праецыруюцца аксоны нейронаў t-hCO ў навакольныя тканіны пацука. Мы заразілі hCO лентывірусам, які кадуе hChR2, зліты з EYFP (hChR2-EYFP). Праз 110 дзён мы назіралі экспрэсію EYFP у іпсілатэральных каравых абласцях, уключаючы слыхавую, рухальную і саматасенсарную кару, а таксама ў падкоркавых абласцях, уключаючы стрыатум, гіпакамп і таламус (мал. 5a). Каб ацаніць, ці могуць гэтыя эферэнтныя праекцыі выклікаць сінаптычныя рэакцыі ў клетках пацукоў, мы аптычна актывавалі клеткі t-hCO, якія экспрэсуюць hChR2-EYFP, шляхам рэгістрацыі клетак кары галаўнога мозгу пацукоў у вострых зрэзах мозгу. Актывацыя аксонаў t-hCO сінім святлом выклікала кароткалатэнтныя EPSC у нейронах пірамідальнай кары пацукоў, якія былі заблакаваныя NBQX (мал. 5b–g). Акрамя таго, гэтыя рэакцыі маглі быць заблакаваныя тэтрадатаксінам (TTX) і адноўлены 4-амінапірыдынам (4-AP), што сведчыць аб іх выкліканасці монасінаптычнымі сувязямі (мал. 5e).
a, Схематычная дыяграма адсочвання аксонаў (злева). Экспрэсія t-hCO EYFP (справа). Маштабная лінейка, 100 мкм. A1, слыхавая кара, ACC, пярэдняя паясыльная кара, d. striatum, дорсальны стрыатум, HPC, гіпакамп; дыяфрагма, латэральная перагародка, mPFC, медыяльная прэфрантальная кара, піры, грушападобная кара, v. striatum, вентральны стрыатум, VPM, вентрапастомедыяльнае ядро ​​таламуса, VTA, вентральная тегментальная вобласць. Чырвоныя квадраты прадстаўляюць вобласці мозгу, дзе былі атрыманы выявы. b, Схематычная дыяграма эксперыменту па стымуляцыі. c, d, Прыклады рэакцыі фотатоку (уверсе) і напружання (унізе), індукаванага сінім святлом, у клетках EYFP+ чалавека (c) або EYFP- пацука (d). e, f, Бягучыя сляды нейронаў пацукоў пасля стымуляцыі сінім святлом аксонаў t-hCO з дапамогай TTX і 4-AR (зялёны), TTX (шэры) або aCSF (чорны) (e), з (фіялетавы) або без (чорны) ) ) NBQX (e). g, латэнтнасць рэакцый, выкліканых сінім святлом у клетках пацукоў (n = 16 клетак); гарызантальныя палоскі паказваюць сярэднюю латэнтнасць (7,13 мс) (злева). Амплітуда выкліканых святлом EPSC, зарэгістраваных з NBQX або без яго (n = 7 клетак; ***P < 0,0001) (пасярэдзіне). Амплітуда выкліканых святлом EPSC, зарэгістраваных з NBQX або без яго (n = 7 клетак; ***P < 0,0001) (пасярэдзіне). Амплітуда вызванных светам EPSC, зарэгістраваных з або без NBQX (n = 7 клетак; ***P <0,0001) (у цэнтры). Амплітуда індукаваных святлом EPSC, зарэгістраваных з NBQX або без яго (n = 7 клетак; ***P < 0,0001) (у цэнтры).使用或不使用NBQX 记录的光诱发 EPSC 的振幅（n = 7 个细胞；***P < 0,0001）（中）。使用或不使用NBQX 记录的光诱发 EPSC 的振幅（n = 7 个细胞；***P < 0,0001）（中）。 Амплітуда вызванных светам EPSC, зарэгістраваных з або без NBQX (n = 7 клетак; ***P <0,0001) (у цэнтры). Амплітуда індукаваных святлом EPSC, зарэгістраваных з NBQX або без яго (n = 7 клетак; ***P < 0,0001) (у цэнтры).Працэнт клетак пацукоў, якія дэманструюць EPSC, што рэагуюць на сіняе святло (справа). h, Схематычная дыяграма паводніцкай задачы. d0, дзень 0. i. Паказчыкі жывёл-прыкладаў у 1-ы (злева) або 15-ы (справа) дзень навучання. Сярэдняя колькасць лізання, выкананых у 1-ы (злева) або 15-ы дзень (справа па цэнтры) (n = 150 спроб сіняга святла, n = 150 спроб чырвонага святла; ***P < 0,0001). Сярэдняя колькасць лізання, выкананых у 1-ы (злева) або 15-ы дзень (справа па цэнтры) (n = 150 спроб сіняга святла, n = 150 спроб чырвонага святла; ***P < 0,0001). Сярэдняя колькасць абліцоўванняў, выкананых у дзень 1 (злева) або дзень 15 (у цэнтры справы) (n = 150 выпрабаванняў з сінім светам, n = 150 выпрабаванняў з чырвоным светам; ***P <0,0001). Сярэдняя колькасць лізання, выкананых у 1-ы (злева) або 15-ы дзень (справа ў цэнтры) (n = 150 спроб сіняга святла, n = 150 спроб чырвонага святла; ***P < 0,0001).第1 天（左）或第15 天（右中）执行的平均舔次数（n = 150 次蓝光试验, n = 150次红光试验；***P <0,0001）。第1 天（左）或第15 天（右中）执行的平均舔次数（n = 150 次蓝光试验, n = 150次红光试验；***P <0,001 Сярэдняя колькасць абліцоўванняў, выкананых у дзень 1 (злева) або дзень 15 (у цэнтры справы) (n = 150 выпрабаванняў з сінім светам, n = 150 выпрабаванняў з чырвоным светам; ***P <0,0001). Сярэдняя колькасць лізання, выкананых у 1-ы (злева) або 15-ы дзень (справа ў цэнтры) (n = 150 спроб сіняга святла, n = 150 спроб чырвонага святла; ***P < 0,0001).Сукупныя паказчыкі лізання для выпрабаванняў чырвоным і сінім святлом у 1-ы дзень (у цэнтры злева) або 15-ы дзень (справа). NS, неістотна. j,k, Паводніцкія характарыстыкі ўсіх жывёл, якім трансплантавалі t-hCO, які экспрэсуе hChR2-EYFP (j), або кантрольны флуарафор (k) у 1-ы або 15-ы дзень (hChR2-EYFP: n = 9 пацукоў, ** P = 0,0049; кантроль: n = 9, P = 0,1497). l, Эвалюцыя перавагі (n = 9 hChR2, n = 9 кантроль; **P < 0,001, ***P < 0,0001). l, Эвалюцыя перавагі (n = 9 hChR2, n = 9 кантроль; **P < 0,001, ***P < 0,0001). l, Эвалюцыя паказчыка перавагі (n = 9 hChR2, n = 9 кантрольных; **P <0,001, ***P <0,0001). l, Эвалюцыя перавагі (n = 9 hChR2, n = 9 кантрольнай групы; **P < 0,001, ***P < 0,0001). l，偏好评分的演变（n = 9 hChR2，n = 9 对照；**P <0,001，***P<0,0001）。 l，偏好评分的演变（n = 9 hChR2，n = 9 对照；**P <0,001，***P<0,0001）。 l, Эвалюцыя паказчыкаў пераваг (n = 9 hChR2, n = 9 кантрольных паказчыкаў; **P <0,001, ***P <0,0001). l, Эвалюцыя балаў пераваг (n = 9 hChR2, n = 9 кантрольнай групы; **P < 0,001, ***P < 0,0001).м, экспрэсія FOS у адказ на оптагенетычную актывацыю t-hCO ў S1. Паказаны выявы экспрэсіі FOS (злева) і колькаснай ацэнкі (n = 3 на групу; *P < 0,05, **P < 0,01 і ***P < 0,001) (справа). Паказаны выявы экспрэсіі FOS (злева) і колькаснай ацэнкі (n = 3 на групу; *P < 0,05, **P < 0,01 і ***P < 0,001) (справа). Паказаны выявы экспрэсіі FOS (злева) і колькаснага вызначэння (n = 3 у групе; * P <0,05, ** P <0,01 и *** P <0,001) (справа). Паказаны выявы экспрэсіі FOS (злева) і колькаснай ацэнкі (n = 3 на групу; *P<0,05, **P<0,01 і ***P<0,001) (справа).显示了FOS 表达（左）和量化（每组n = 3；*P <0,05、**P<0,01 和***P<0,001）（右）的图像。显示了FOS 表达（左）和量化（每组n = 3；*P <0,05、**P<0,01 和***P<0,001）（右）的图像。 Паказаны выявы экспрэсіі FOS (злева) і колькаснага вызначэння (n = 3 у групе; * P <0,05, ** P <0,01 и *** P <0,001) (справа). Паказаны выявы экспрэсіі FOS (злева) і колькаснай ацэнкі (n = 3 на групу; *P<0,05, **P<0,01 і ***P<0,001) (справа).Маштабная лінейка, 100 мкм. Дадзеныя прадстаўлены як сярэдняе значэнне ± стандартная памылка BLA, базалатэральных міндалін, MDT, дорсамедыяльнага ядра таламуса, PAG, перыядуктальнага шэрага.
Нарэшце, мы спыталі, ці можа t-hCO мадуляваць паводзіны пацукоў. Каб праверыць гэта, мы перасадзілі hCO, які экспрэсуе hChR2-EYFP, у S1, а праз 90 дзён імплантавалі аптычныя валокны ў t-hCO для падачы святла. Затым мы навучылі пацукоў з дапамогай мадыфікаванай парадыгмы оперантнага кандыцыянавання (мал. 5h). Мы змясцілі жывёл у камеру для паводніцкіх тэстаў і выпадковым чынам прымянілі 5-секундныя сінія (473 нм) і чырвоныя (635 нм) лазерныя стымулы. Жывёлы атрымлівалі ўзнагароду ў выглядзе вады, калі яны лізалі падчас стымуляцыі сінім святлом, але не лізалі падчас стымуляцыі чырвоным святлом. У першы дзень навучання жывёлы не выяўлялі розніцы ў лізанні пры стымуляцыі сінім або чырвоным святлом. Аднак на 15-ы дзень жывёлы, якім перасадзілі hCO, які экспрэсуе hChR2-EYFP, праявілі больш актыўнае лізанне пры стымуляцыі сінім святлом у параўнанні са стымуляцыяй чырвоным святлом. Гэтыя змены ў паводзінах пры лізанні не назіраліся ў кантрольных жывёл, якім перасадзілі hCO, які экспрэсуе кантрольны флуарафор (узровень паспяховасці навучання: hChR2 89%, EYFP 0%, малюнак 5i-1 і дадатковае відэа 2). Гэтыя дадзеныя сведчаць аб тым, што клеткі t-hCO могуць актываваць нейроны пацукоў, каб стымуляваць паводзіны, накіраваныя на пошук узнагароды. Каб высветліць, якія нейронавыя ланцугі t-hCO пацукоў могуць быць уцягнуты ў гэтыя змены ў паводзінах, мы оптагенетычна актывавалі t-hCO ў навучаных жывёл і праз 90 хвілін сабралі тканіны. Імунагістахімія выявіла экспрэсію бялку FOS, які залежыць ад актыўнасці, у некалькіх абласцях мозгу, якія ўдзельнічаюць у матываваных паводзінах, у тым ліку ў медыяльнай прэфрантальнай кары, медыяльным таламусе і перыядуктальным шэрым рэчыве, якое экспрэсавалася альбо ў нестимуляваных кантрольных жывёл, альбо ў жывёл (рыс. 5m). У сукупнасці гэтыя дадзеныя сведчаць аб тым, што t-hCO можа мадуляваць нейрональную актыўнасць пацукоў, каб кіраваць паводзінамі.
Нейронавыя арганоіды ўяўляюць сабой перспектыўную сістэму для вывучэння развіцця і захворванняў чалавека in vitro, але яны абмежаваныя адсутнасцю сувязяў паміж ланцугамі, якія існуюць in vivo. Мы распрацавалі новую платформу, на якой перасадзілі hCO у S1 імунакампрамітаваных ранніх постнатальных пацукоў для вывучэння развіцця і функцыі клетак чалавека in vivo. Мы паказалі, што t-hCO развівае спелыя тыпы клетак, якія не назіраліся in vitro28, і што t-hCO анатамічна і функцыянальна інтэграваны ў мозг грызуноў. Інтэграцыя t-hCO у нейронавыя ланцугі грызуноў дазволіла нам усталяваць сувязь паміж клеткавай актыўнасцю чалавека і паводзінамі вывучаных жывёл, паказваючы, што нейроны t-hCO могуць мадуляваць нейрональную актыўнасць пацукоў для стымулявання паводніцкіх рэакцый.
Апісаная намі платформа мае некалькі пераваг у параўнанні з папярэднімі даследаваннямі па трансплантацыі клетак чалавека ў мозг грызуноў. Па-першае, мы трансплантавалі hCO у кару галаўнога мозгу, якая развіваецца, у раннім постнатальным перыядзе пацукоў, што можа спрыяць анатамічнай і функцыянальнай інтэграцыі. Па-другое, маніторынг t-hCO МРТ дазволіў нам вывучыць становішча і рост трансплантата ў жывых жывёл, што дазволіла нам праводзіць доўгатэрміновыя шматжыльныя даследаванні і ўстанаўліваць надзейнасць некалькіх ліній клетак hiPS. Нарэшце, мы трансплантавалі непашкоджаныя арганоіды, а не ізаляваныя суспензіі асобных клетак, якія менш разбуральныя для клетак чалавека і могуць спрыяць інтэграцыі і генерацыі нейронаў кары галаўнога мозгу чалавека ў мозгу пацукоў.
Мы прызнаем, што, нягледзячы на ​​прагрэс у гэтай платформе, часавыя, прасторавыя і міжвідавыя абмежаванні перашкаджаюць фарміраванню нейронавых ланцугоў чалавека з высокай дакладнасцю, нават пасля трансплантацыі на ранняй стадыі развіцця. Напрыклад, незразумела, ці ўяўляе сабой спантанная актыўнасць, якая назіраецца ў t-hCO, фенатып развіцця, падобны да рытмічнай актыўнасці, якая назіраецца падчас развіцця кары галаўнога мозгу, ці гэта звязана з адсутнасцю супрэсіўных тыпаў клетак, якія прысутнічаюць у t-hCO. Аналагічна, незразумела, у якой ступені адсутнасць ламінацыі ў t-hCO уплывае на злучэнне ланцугоў30. Будучая праца будзе сканцэнтравана на інтэграцыі іншых тыпаў клетак, такіх як мікраглія чалавека, эндатэліяльныя клеткі чалавека і розныя прапорцыі ГАМКергічных інтэрнейронаў, як паказана з выкарыстаннем зборкі 6 in vitro, а таксама на разуменні таго, як нейронавая інтэграцыя і апрацоўка могуць адбывацца ў змененым t-hCO на транскрыпцыйным, сінаптычным і паводніцкім узроўнях у клетках, атрыманых ад пацыентаў.
У цэлым, гэтая платформа in vivo прадстаўляе сабой магутны рэсурс, які можа дапоўніць даследаванні in vitro развіцця і захворванняў чалавечага мозгу. Мы чакаем, што гэтая платформа дазволіць нам выявіць новыя фенатыпы на ўзроўні нітак у інакш няўлоўных клетках, атрыманых ад пацыентаў, і праверыць новыя тэрапеўтычныя стратэгіі.
Мы атрымалі hCO2.5 з клетак HiPS, як апісана раней. Каб ініцыяваць выпрацоўку hCO з клетак hiPS, якія культываваліся на пластах-падсілкоўвальніках, непашкоджаныя калоніі клетак hiPS былі выдалены з культуральных чашкаў з выкарыстаннем дыспазы (0,35 мг/мл) і перанесены ў пластыкавыя культуры з ультранізкім прымацаваннем, якія змяшчалі чашкі з культуральным асяроддзем для клетак hiPS (Corning), дапоўненым двума інгібітарамі SMAD: дорсамарфінам (5 мкМ; P5499, Sigma-Aldrich) і SB-431542 (10 мкМ; 1614, Tocris), а таксама інгібітарам ROCK Y-27632 (10 мкМ; S1049, Selleckchem). На працягу першых 5 дзён асяроддзе для клетак hiPS мянялі штодня, і дадавалі дорсамарфін і SB-431542. На шосты дзень у суспензіі нейрональныя сфероіды былі перанесены ў нейрональнае асяроддзе, якое змяшчала нейрабазальны-А (10888, Life Technologies), дабаўку B-27 без вітаміна А (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies), пеніцылін і стрэптаміцын (1:100, Life Technologies), і да 24-га дня дадавалі эпідэрмальны фактар ​​росту (EGF; 20 нг мл−1; R&D Systems) і фактар ​​росту фібрабластаў 2 (FGF2; 20 нг мл−1; R&D Systems). З 25-га па 42-і дзень асяроддзе дапаўнялі нейратрофным фактарам мозгу (BDNF; 20 нг мл−1, Peprotech) і нейратрафінам 3 (NT3; 20 нг мл−1; Peprotech) са зменай асяроддзя праз дзень. На шосты дзень у суспензіі нейрональныя сфероіды былі перанесены ў нейрональнае асяроддзе, якое змяшчала нейрабазальны-А (10888, Life Technologies), дабаўку B-27 без вітаміна А (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies), пеніцылін і стрэптаміцын (1:100, Life Technologies), і да 24-га дня дадавалі эпідэрмальны фактар ​​росту (EGF; 20 нг мл−1; R&D Systems) і фактар ​​росту фібрабластаў 2 (FGF2; 20 нг мл−1; R&D Systems). З 25-га па 42-і дзень асяроддзе дапаўнялі нейратрофным фактарам мозгу (BDNF; 20 нг мл−1, Peprotech) і нейратрафінам 3 (NT3; 20 нг мл−1; Peprotech) са зменай асяроддзя праз дзень.На шосты дзень у суспензіі нейронавыя сфероіды былі перанесены ў нейронавае асяроддзе, якое змяшчала Neurobasal-A (10888, Life Technologies), дабаўку B-27 без вітаміна А (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies) і пеніцылін.і стрэптаміцін (1:100, Life Technologies) і дапоўнены эпідэрмальныя фактарам росту (EGF; 20 нг/мл; R&D Systems) і фактарам росту фібрабластаў 2 (FGF2; 20 нг/мл; R&D Systems) да 24-га дня. і стрэптаміцын (1:100, Life Technologies) і дапаўнялі эпідэрмальным фактарам росту (EGF; 20 нг/мл; R&D Systems) і фактарам росту фібрабластаў 2 (FGF2; 20 нг/мл; R&D Systems) да 24-га дня.З 25 па 42 дзень у асяроддзе дадавалі нейратрофны фактар ​​мозгу (BDNF; 20 нг мл-1, Peprotech) і нейратрафін 3 (NT3; 20 нг мл-1, Peprotech), мяняючы асяроддзе праз дзень.在悬浮的第6 天，将神经球体转移到含有neurobasal-A（10888，Life Technologies）、不含维生素A 的B-27补充剂（12587，Life Technologies）、GlutaMax（1:100，Life Technologies）、青霉素的神经培养基中和链霉素（1:100，Life Тэхналогіі）并辅以表皮生长因子（EGF；20 нг мл-1；R&D Systems）和成纤维细胞生长因子2（FGF2；20 нг мл-1；НДДКР Сістэмы）直至第24 天。.在 悬浮 的 第 第 6 天 将 神经 球体 转移 含有 含有 нейрабазальны-a （10888 ， Life Technologies） 不 含 维生素 a的 b-27 补充剂 （12587 ， Life Technologies） Glutamax （1: 100 ， Life TechNOGIS青霉素 的 神经 培养 基 中 链霉素（（1: 100 ， Life Technologies） 表皮 生长 因子 （（（20 нг мл-1 ； R & D Systems） 成 纤维 细胞 生长 2 （fgf2 ； 20 нг мл-1；НДДКР Сістэмы）直至第24天. На 6-й дзень суспензіі нейросферы былі пераведзены на дабаўку, якая змяшчае нейробазал-А (10888, Life Technologies), дабаўку В-27 без вітаміна А (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies), пеніцылін-нейтралізаваны стрэптаміцын (1:100, Life Technologies). Technologies) з даданнем эпідэрмальнага фактару росту (EGF; 20 нг мл-1; R&D Systems) і фактару росту фібрабластаў 2 (FGF2; 20 нг мл-1) 1; На 6-ы дзень суспензіі нейрасфер былі пераведзены на дабаўку, якая змяшчала нейрабазал-А (10888, Life Technologies), дабаўку B-27 без вітаміна А (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies), стрэптаміцын, нейтралізаваны пеніцылінам (1:100, Life Technologies), дапоўнены эпідэрмальным фактарам росту (EGF; 20 нг мл-1; R&D Systems) і фактарам росту фібрабластаў 2 (FGF2; 20 нг мл-1)1; R&D Systems) да 24-га дня. (сістэмы даследаванняў і распрацовак) да 24-га дня.З 25 па 42 дзень у культуральнае асяроддзе праз дзень дадавалі нейратрофны фактар ​​мозгу (BDNF; 20 нг мл-1, Peprotech) і нейратрофны фактар ​​3 (NT3; 20 нг мл-1, Peprotech). Асяроддзе мянялі адзін раз.Пачынаючы з 43-га дня, hCO₂ падтрымлівалі ў недапоўненым нейрабазальным асяроддзі A (NM; 1088022, Thermo Fisher) са зменай асяроддзя кожныя 4-6 дзён. Для атрымання hCO₂ з клетак hiPS, якія культываваліся ў безкармільных умовах, клеткі hiPS інкубавалі з Accutase (AT-104, Innovate Cell Technologies) пры тэмпературы 37°C на працягу 7 хвілін, дысацыявалі на асобныя клеткі і высейвалі на пласціны AggreWell 800 (34815, STEMCELL Technologies) пры шчыльнасці 3 × 10⁶ асобных клетак на лунку ў асяроддзі Essential 8 з даданнем інгібітара ROCK Y-27632 (10 мкМ; S1049, Selleckchem). Праз 24 гадзіны асяроддзе з лунак піпеткай пералівалі ў асяроддзе, якое змяшчала асяроддзе Essential 6 (A1516401, Life Technologies) з даданнем дорсамарфіну (2,5 мкМ; P5499, Sigma-Aldrich) і SB-431542 (10 мкМ; 1614). (Tocrida). З 2-га па 6-ы дзень асяроддзе Essential 6 штодня замянялі дорсамарфінам і дадаткам SB-431542. З шостага дня суспензіі нейрасфер пераносілі ў нейрабазальнае асяроддзе і падтрымлівалі, як апісана вышэй.
Усе працэдуры з жывёламі праводзіліся ў адпаведнасці з рэкамендацыямі па доглядзе за жывёламі, зацверджанымі Адміністрацыйным камітэтам па доглядзе за лабараторнымі жывёламі Стэнфардскага ўніверсітэта (APLAC). Цяжарныя эўтымныя пацукі RNU (rnu/+) былі набыты (Charles River Laboratories) або змешчаны. Жывёл утрымлівалі на 12-гадзінным цыкле святло-цемра, атрымліваючы ежу і ваду ў вольным доступе. Дзівятых голых пацукоў (FOXN1–/–) ва ўзросце ад трох да сямі дзён ідэнтыфікавалі па росце няспелых вусоў перад выбракоўваннем. Шчанюкоў (самцоў і самак) анестэзавалі 2-3% ізафлуранам і змяшчалі на стэрэатаксічную раму. Была праведзена трэпанацыя чэрапа дыяметрам прыблізна 2-3 мм вышэй за S1, захоўваючы цэласнасць цвёрдай мазгавой абалонкі. Затым выкарыстоўвалі іголку 30-G (прыблізна 0,3 мм) непасрэдна звонку ад краніятоміі, каб прабіць цвёрдую мазгавую абалонку. Затым нанесці HCO3 на тонкую парафільму 3×3 см і выдаліць лішкі асяроддзя. З дапамогай шпрыца Гамільтана, падлучанага да іголкі 23 G пад вуглом 45°, акуратна набярыце hCO₃ у самы дыстальны канец іголкі. Затым усталюйце шпрыц на шпрыцавы помпа, падлучаны да стэрэатаксічнай прылады. Далей размясціце кончык іголкі над папярэдне зробленай адтулінай для праколу шырынёй 0,3 мм у цвёрдай мазгавой абалонцы (z = 0 мм) і звузьце шпрыц на 1–2 мм (z = прыблізна –1,5 мм), пакуль іголка не апынецца паміж А цвёрдай мазгавой абалонкай. Не ўтворыцца шчыльнае ўшчыльненне. Затым падніміце шпрыц да цэнтра кортыкальнай паверхні пры z = -0,5 мм і ўводзьце hCO₃ з хуткасцю 1-2 мкл у хвіліну. Пасля завяршэння ўвядзення hCO₃ іголку выцягваюць з хуткасцю 0,2-0,5 мм у хвіліну, скуру зашываюць, і шчанюка неадкладна кладуць на цёплую грэлку да поўнага выздараўлення. Некаторым жывёлам рабілі трансплантацыю двухбакова.
Усе працэдуры на жывёлах праводзіліся ў адпаведнасці з рэкамендацыямі па доглядзе за жывёламі, зацверджанымі APLAC Стэнфардскага ўніверсітэта. Пацукам (старэйшым за 60 дзён пасля трансплантацыі) індукавалі 5% ізафлуранавы наркоз і анестэзавалі 1-3% ізафлуранам падчас візуалізацыі. Для візуалізацыі выкарыстоўваўся актыўна экранаваны гарызантальны свідравінный сканер магутнасцю 7 Тэсла Bruker (Bruker Corp.) з градыентным прывадам International Electric Company (IECO), экранаванай градыентнай устаўкай з унутраным дыяметрам 120 мм (600 мТл/м, 1000 Тл/м/с) з выкарыстаннем AVANCE.III, васьміканальнай шматшпулькавай ВЧ-шпулькі і шмат'ядравых магчымасцей, а таксама суправаджальнай платформы Paravision 6.0.1. Запіс праводзіўся з выкарыстаннем актыўна развязанай аб'ёмнай ВЧ-шпулькі з унутраным дыяметрам 86 мм і чатырохканальнай крыяахаладжальнай ВЧ-шпулькі толькі для прыёму. Аксіяльны 2D Turbo-RARE (час паўтарэння = 2500 мс, час рэха = 33 мс, 2 сярэднія значэнні) з 16 захопамі зрэзаў, таўшчыня зрэзу 0,6–0,8 мм, які змяшчае 256 × 256 узораў. Сігналы атрымліваліся з дапамогай квадратурнай прыёмаперадатчычнай аб'ёмнай радыёчастотнай шпулькі з унутраным дыяметрам 2 см (Rapid MR International, LLC). Нарэшце, выкарыстоўваліся ўбудаваныя функцыі ацэнкі паверхні Imaris (BitPlane) для 3D-рэндэрынгу і аналізу аб'ёму. Паспяховая трансплантацыя вызначалася як трансплантацыя, пры якой у перасаджаным паўшар'і ўтварыліся вобласці бесперапыннага Т2-зважанага сігналу МРТ. Адрыньванне трансплантата вызначалася як трансплантат, які не стварыў вобласці бесперапыннага Т2-зважанага сігналу МРТ у перасаджаным паўшар'і. Падкоркавы t-hCO3 быў выключаны з наступнага аналізу.
Для стабільнай экспрэсіі GCaMP6s у hCO для двухфатоннай кальцыевай візуалізацыі, клеткі hiPS былі інфікаваныя pLV[Exp]-EF1a::GcaMP6s-WPRE-Puro з наступным адборам антыбіётыкаў. Карацей кажучы, клеткі дысацыявалі з EDTA і суспендавалі ў 1 мл асяроддзя Essential 8 пры шчыльнасці прыблізна 300 000 клетак у прысутнасці полібрэну (5 мкг/мл) і 15 мкл віруса. Затым клеткі інкубавалі ў суспензіі на працягу 60 хвілін і высейвалі пры шчыльнасці 50 000 клетак на лунку. Пасля зліцця клеткі апрацоўвалі 5-10 мкг мл-1 пуроміцыну на працягу 5-10 дзён або да з'яўлення стабільных калоній. Вострае заражэнне hCO праводзілася, як апісана раней5, з некаторымі мадыфікацыямі. Карацей кажучы, hCO на 30-45 дзень пераносілі ў 1,5 мл мікрацэнтрыфужныя прабіркі Eppendorf, якія змяшчалі 100 мкл нервовага асяроддзя. Затым прыблізна 90 мкл асяроддзя выдаляюць, у прабірку дадаюць 3-6 мкл лентывіруса з высокім тытрам (ад 0,5 x 108 да 1,2 x 109), і hCO3 пераносяць у інкубатар на 30 хвілін. Затым у кожную прабірку дадаюць 90-100 мкл асяроддзя і вяртаюць прабіркі ў інкубатар на ноч. На наступны дзень пераносяць hCO3 у свежае нервовае асяроддзе ў пласцінах з нізкім узроўнем прымацавання. Праз 7 дзён hCO3 пераносяць у 24-лункавыя пласціны са шкляным дном для візуалізацыі і ацэнкі якасці інфекцыі. pLV[Exp]-SYN1::EYFP-WPRE і pLV[Exp]-SYN1::hChR2-EYFP-WPRE былі створаны з дапамогай VectorBuilder. Лентывірус выкарыстоўваецца ў большасці эксперыментаў, таму што ён інтэграваны ў геном гаспадара, што дазваляе экспрэсію рэпарцёрнага гена ў інфікаваных клеткавых лініях. Для назірання за выпадкамі шаленства, на 30-45 дзень hCO сумесна інфікавалі вірусам шаленства-ΔG-eGFP і AAV-DJ-EF1a-CVS-G-WPRE-pGHpA (плазміда № 67528, Addgene), старанна прамывалі на працягу 3 дзён, перасаджвалі пацукам у S1 і падтрымлівалі in vivo на працягу 7-14 дзён.
Для імунацытахіміі жывёл анестэзавалі і транскардыяльна перфузавалі PBS, а затым 4% парафармальдэгідам (PFA ў PBS; Electron Microscopy Sciences). Мозг фіксавалі ў 4% PFA на працягу 2 гадзін або на ноч пры тэмпературы 4°C, крыякансервавалі ў 30% цукрозе ў PBS на працягу 48-72 гадзін і залівалі ў раствор 1:1, 30% цукроза: OCT (Tissue-Tek OCT Compound 4583, Sakura Finetek), і рабілі каранарныя зрэзы з таўшчынёй 30 мкм з выкарыстаннем крыястата (Leica). Для імунагістахіміі тоўстых зрэзаў жывёл перфузавалі PBS, мозг рассякалі і рабілі каранарныя зрэзы з таўшчынёй 300-400 мкм з выкарыстаннем вібратома (Leica), і зрэзы фіксавалі 4% PFA на працягу 30 хвілін. Затым крыязрэзы або тоўстыя зрэзы прамывалі PBS, блакавалі на працягу 1 гадзіны пры пакаёвай тэмпературы (10% нармальнай аслінай сыроваткі (NDS) і 0,3% Triton X-100, разведзенага ў PBS) і блакавалі блакуючым растворам пры 4°C. – Інкубацыя Крыязрэзы інкубавалі на працягу ночы, а тоўстыя зрэзы інкубавалі на працягу 5 дзён. Асноўнымі выкарыстоўванымі антыцеламі былі: анты-NeuN (мышы, 1:500; ab104224, abcam), анты-CTIP2 (пацукі, 1:300; ab18465, abcam), анты-GFAP (трусы, 1:1000; Z0334, Dako), анты-GFP (курыцы, 1:1000; GTX13970, GeneTex), анты-HNA (мышы, 1:200; ab191181, abcam), анты-NeuN (трусы, 1:500; ABN78, Millipore), анты-PDGFRA (трусы, 1:200; sc-338, Santa Cruz), анты-PPP1R17 (трусы, 1:200; HPA047819, Atlas Antibodies), анты-RECA-1 (мышы, 1:50; ab9774, abcam), анты-SCG2 (трус, 1:100; 20357-1-AP, Proteintech), анты-SOX9 (каза, 1:500; AF3075, R&D Systems), Netrin G1a (каза, 1:100; AF1166, R&D Systems), анты-STEM121 (мыш, 1:200; Y40410, Takara Bio), анты-SATB2 (мыш, 1:50; ab51502, abcam), анты-GAD65/67 (трус, 1:400; ABN904, Millipore) і анты-IBA1 (каза, 1:100; ab5076, abcam). Асноўнымі выкарыстоўванымі антыцеламі былі: анты-NeuN (мышы, 1:500; ab104224, abcam), анты-CTIP2 (пацукі, 1:300; ab18465, abcam), анты-GFAP (трусы, 1:1000; Z0334, Dako), анты-GFP (курыцы, 1:1000; GTX13970, GeneTex), анты-HNA (мышы, 1:200; ab191181, abcam), анты-NeuN (трусы, 1:500; ABN78, Millipore), анты-PDGFRA (трусы, 1:200; sc-338, Santa Cruz), анты-PPP1R17 (трусы, 1:200; HPA047819, Atlas Antibodies), анты-RECA-1 (мышы, 1:50; ab9774, abcam), анты-SCG2 (трус, 1:100; 20357-1-AP, Proteintech), анты-SOX9 (каза, 1:500; AF3075, R&D Systems), Netrin G1a (каза, 1:100; AF1166, R&D Systems), анты-STEM121 (мышы, 1:200; Y40410, Takara Bio), анты-SATB2 (мышы, 1:50; ab51502, abcam), анты-GAD65/67 (трус, 1:400; ABN904, Millipore) і анты-IBA1 (каза, 1:100; ab5076, abcam). Выкарыстоўваліся наступныя першасныя антытэлы: анты-NeuN (мышыны, 1: 500; ab104224, abcam), анты-CTIP2 (крышыны, 1: 300; ab18465, abcam), анты-GFAP (кролікі, 1: 1000; Z0334, Dako), анты- -GFP (курыца, 1: 1000; GTX13970, GeneTex), анты-HNA (мышь, 1:200; ab191181, abcam), анты-NeuN (кролік, 1:500; ABN78, Millipore), анты-PDGFRA (кролік, 1:200; sc-338, Санта-Круз), анты-PPP1R17 (кролік, 1:200; HPA047819, Atlas Antibodies), анты-RECA-1 (мышь, 1:50; ab9774, abcam), анты-SCG2 (кролік, 1:100; 20357-1-AP, Proteintech), анты-SOX9 (козій, 1:500; AF3075, R&D Systems), нетрын G1a (козый, 1:100; AF1166, R&D Systems), анты-STEM121 (мышыны , 1:200; Y40410, Takara Bio), анты-SATB2 (мышь, 1:50; ab51502, abcam), анты-GAD65/67 (кролік, 1:400; ABN904, Millipore) і анты-IBA1 (коза, 1:100; аб5076, абкам). Асноўнымі выкарыстоўванымі антыцеламі былі: анты-NeuN (мышы, 1:500; ab104224, abcam), анты-CTIP2 (пацукі, 1:300; ab18465, abcam), анты-GFAP (трусікі, 1:1000; Z0334, Dako), анты-GFP (курыцы, 1:1000; GTX13970, GeneTex), анты-HNA (мышы, 1:200; ab191181, abcam), анты-NeuN (трусікі, 1:500; ABN78, Millipore), анты-PDGFRA (трусікі, 1:200; sc-338, Santa Cruz), анты-PPP1R17 (трусікі, 1:200; HPA047819, Atlas Antibodies), анты-RECA-1 (мышыкі, 1:50; ab9774). abcam), анты-SCG2 (трус, 1:100; 20357-1-AP, Proteintech), анты-SOX9 (каза, 1:500; AF3075, R&D Systems), нетрын G1a (каза, 1:100; AF1166, R&D Systems), анты-STEM121 (мыш, 1:200; Y40410, Takara Bio), анты-SATB2 (мыш, 1:50; ab51502, abcam), анты-GAD65/67 (трус, 1:400; ABN904, Millipore) і анты-IBA1 (каза, 1:100; ab5076, abkam).使用的一抗是: 抗NeuN（小鼠，1:500；ab104224，abcam）抗CTIP2（大鼠，1:3 00；ab18465，abcam），抗GFAP（兔，1:1000；Z0334，Dako），抗-GF P（鸡，1:1000；GTX13970，GeneTex），抗HNA（小鼠，1:200；ab1911 81，abcam），抗NeuN（兔，1:500；ABN78，Millipore），抗PDGFRA（兔， 1:200；sc-338，Санта-Крус），抗PPP1R17（兔，1:200；HPA047819，Атлас抗体），抗RECA-1（小鼠，1:50；ab9774，abcam），抗SCG2(兔）), 1:100；20357-1-AP，Proteintech），抗SOX9（山羊＊,1:500；AF3075，R&D Systems，Netrin G1a（山羊＊,1:100；AF1166，R&D Systems，抗STEM121＠(小鼠, 1:200;使用的一抗是：抗NeuN（小鼠＠,1:500；ab104224，abcam）抗CTIP2（大鼠，1 :300；ab18465，abcam），抗GFAP（兔，1:1000；Z0334，Dako），抗-GFP（鸡，1:1000；GTX13970，GeneTex），抗HNA（小鼠，1:200；аб 191181，abcam）,抗NeuN４(兔，1:500；ABN78，Millipore％弔４,抗1: 200；sc-338，Санта-Крус），抗PPP1R17（兔，1:200；HPA047819，Атлас抗体），抗RECA-1（小鼠，1:50；ab9774，abcam），抗SCG2 100；20357-1-AP，Proteintech），抗SOX9（山羊＊1:500；AF3075，R&D Systems，Netrin G1a（山羊＊1:100；AF1166，R&D Сістэмы）頏1:20, ;Y40410, Takara Bio), анты-SATB2 (мышы, 1:50; ab51502, abcam), анты-GAD65/67 (трус, 1:400; ABN904, Millipore) і анты-IBA1 (каза, 1:100; ab5076, abcam).У якасці асноўных антыцелаў выкарыстоўваліся наступныя: анты-NeuN (мышы, 1:500; ab104224, abcam), анты-CTIP2 (пацукі, 1:300; ab18465, abcam), анты-GFAP (трусікі, 1:1000; Z0334, Dako). , анты-GFP (курыца, 1:1000; GTX13970, GeneTex), анты-HNA (мышы, 1:200; ab191181, abcam), анты-NeuN (трус, 1:500; ABN78, Millipore), анты-PDGFRA (трус, 1:200; sc-338, Santa Cruz), анты-PPP1R17 (трус, 1:200; HPA047819, антыцела Atlas), анты-RECA-1 (мышы, 1:50; ab9774, abcam), анты-SCG2 (трус), 1:100;20357-1-AP, Proteintech), анты-SOX9 (коза, 1:500; AF3075, R&D Systems), Нетрин G1a (коза, 1:100; AF1166, R&D Systems), анты -STEM121 (мышь, 1:200; Y40410, Takara Bio), анты-SATB2 (мышь, 1:50; ab51502, abcam), анты-GAD65/67 (кролік, 1:400; ABN904, Millipore) і анты-IBA1 (коза, 1:100; аб5076, абкам). 20357-1-AP, Proteintech), анты-SOX9 (каза, 1:500; AF3075, R&D Systems), Netrin G1a (каза, 1:100; AF1166, R&D Systems), анты-STEM121 (мыш, 1:200; Y40410, Takara Bio), анты-SATB2 (мыш, 1:50; ab51502, abcam), анты-GAD65/67 (трус, 1:400; ABN904, Millipore) і анты-IBA1 (каза, 1:100; ab5076, abkam).Затым зрэзы прамывалі PBS і інкубавалі з другаснымі антыцеламі на працягу 1 гадзіны пры пакаёвай тэмпературы (замарожаныя зрэзы) або на працягу ночы пры 4°C (тоўстыя зрэзы). Выкарыстоўваліся другасныя антыцелы Alexa Fluor (Life Technologies), разведзеныя 1:1000 у блакуючым растворы. Пасля прамывання PBS ядры візуалізавалі з дапамогай Hoechst 33258 (Life Technologies). Нарэшце, слайды змяшчалі на мікраскоп з покрыўнымі шкламі (Fisher Scientific) з выкарыстаннем Aquamount (Polysciences) і аналізавалі на флуарэсцэнтным мікраскопе Keyence (аналізатар BZ-X) або канфакальным мікраскопе Leica TCS SP8 (Las-X) на выяве. Выявы апрацоўвалі з дапамогай праграмы ImageJ (Fiji). Для колькаснай ацэнкі долі нейронаў чалавека ў t-hCO₂ і кары галаўнога мозгу пацука рабілі прастакутныя выявы шырынёй 387,5 мкм у цэнтры t-hCO₂, на краі кары галаўнога мозгу пацука або паблізу яго. Межы трансплантата вызначалі шляхам ацэнкі змяненняў празрыстасці тканін, ядраў HNA+ і/або наяўнасці аўтафлуарэсцэнцыі тканін. На кожным малюнку агульная колькасць клетак NeuN+ і HNA+ была падзелена на агульную колькасць клетак NeuN+ у той жа вобласці. Каб гарантаваць, што ўлічваюцца толькі клеткі з ядрамі ў плоскасці выявы, у разлік уключаюцца толькі клеткі, якія таксама з'яўляюцца Hoechst+. Для памяншэння статыстычнай памылкі былі ўсреднены два малюнкі, падзеленыя не менш чым 1 мм.
За тыдзень да збору ўзораў жывёл змяшчалі з трансплантатам hCO (прыблізна 8 месяцаў дыферэнцыяцыі) у цёмны пакой з падстрыжанымі вусамі, каб мінімізаваць сэнсарную стымуляцыю. Вылучэнне ядраў праводзілі, як апісана раней, з некаторымі мадыфікацыямі. Карацей кажучы, t-hCO і hCO былі знішчаны з дапамогай дэтэргентна-механічнага лізісу клетак і 2-мілілітровага шклянога тканевага дробільніка (D8938, Sigma-Aldrich/KIMBLE). Неачышчаныя ядры затым адфільтроўвалі з дапамогай фільтра 40 мкм і цэнтрыфугавалі пры 320 g на працягу 10 хвілін пры 4°C перад выкананнем градыенту шчыльнасці цукрозы. Пасля этапу цэнтрыфугавання (320 g на працягу 20 хвілін пры 4°C) узоры рэсуспендавалі ў 0,04% BSA/PBS з даданнем 0,2 адзінак інгібітара РНКазы ў мкл-1 (40 адзінак мкл-1, AM2682, Ambion) і прапускалі праз праточны фільтр 40 мкм. Дысацыяваныя ядры затым рэсуспендавалі ў PBS, які змяшчае 0,02% BSA, і загружалі на чып Chromium Single Cell 3′ (арыенціровачнае аднаўленне 8000 клетак на паласу). Бібліятэкі snRNA-seq былі падрыхтаваны з дапамогай набору Chromium Single cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics). Бібліятэкі snRNA-seq былі падрыхтаваны з дапамогай набору Chromium Single cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics). Бібліятэкі snRNA-seq былі прыгатаваны з дапамогай Chromium Single cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics). Бібліятэкі snRNA-seq былі падрыхтаваны з выкарыстаннем набору Chromium Single cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics). snRNA-seq 文库是使用Chromium Single cell 3′ GEM、Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics) 制备的。 snRNA-seq 文库是使用Chromium Single cell 3′ GEM、Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics) 制备的。 Бібліятэку snRNA-seq падрыхтавалі з выкарыстаннем Chromium Single Cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics). Бібліятэка snRNA-seq была падрыхтавана з выкарыстаннем набору Chromium Single Cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics).Бібліятэкі з розных узораў былі аб'яднаны і секвенаваны з дапамогай Admera Health на NovaSeq S4 (Illumina).
Узроўні экспрэсіі генаў для кожнага меркаванага ядзернага штрых-кода былі колькасна вызначаны з выкарыстаннем праграмнага пакета аналізу 10x Genomics CellRanger (версія 6.1.2). У прыватнасці, паказанні супастаўляліся з камбінацыяй эталонных геномаў чалавека (GRCh38, Ensemble, версія 98) і пацука (Rnor_6.0, Ensemble, версія 100), створаных з дапамогай каманды mkref, з выкарыстаннем функцый count з камандай –include-introns=TRUE для колькаснага ўключэння паказанняў, адлюстраваных у інтронных абласцях. Для ўзораў t-hCO ядры чалавека былі ідэнтыфікаваны на аснове кансерватыўнага патрабавання, каб не менш за 95% усіх адлюстраваных паказанняў адпавядалі геному чалавека. Усе наступныя аналізы праводзіліся на адфільтраваным масіве штрых-кодаў, атрыманым з CellRanger, з выкарыстаннем пакета R (версія 4.1.2) Seurat (версія 4.1.1)32.
Каб гарантаваць, што ў наступны аналіз будуць уключаны толькі ядры высокай якасці, для кожнага ўзору быў ужыты ітэрацыйны працэс фільтрацыі. Спачатку ідэнтыфікуюцца і выдаляюцца ядры нізкай якасці з менш чым 1000 унікальнымі генамі і больш чым 20% ад агульнай колькасці мітахондрый. Пасля гэтага неапрацаваная матрыца колькасці генаў была нармалізавана з дапамогай рэгулярызаванай адмоўнай бінамінальнай рэгрэсіі з выкарыстаннем функцыі sctransform(vst.flavor=”v2″), якая таксама вызначыла 3000 найбольш зменлівых генаў з выкарыстаннем параметраў па змаўчанні. Зніжэнне памернасці было праведзена для верхніх зменлівых генаў з выкарыстаннем аналізу галоўных кампанент (PCA) з параметрамі па змаўчанні з выкарыстаннем памернасці набору дадзеных 30 (dims = 30 быў выбраны на аснове візуальнага агляду месцаў кален і выкарыстаны для ўсіх узораў і ансамблевага аналізу). Затым мы правялі некалькі раўндаў ітэрацыйнай кластэрызацыі (разрозненне = 1) для класіфікацыі генаў на аснове анамальна нізкай колькасці генаў (медыяна ніжэй за 10-ы перцэнтыль), анамальна высокай колькасці мітахондрыяльных генаў (медыяна вышэй за 95-ы перцэнтыль) для ідэнтыфікацыі і выдалення меркаваных клетак нізкай якасці, кластараў і/або высокай долі падазраваных двайнят, ідэнтыфікаваных з выкарыстаннем пакета DoubletFinder33 (сярэдні бал DoubletFinder вышэй за 95-ы перцэнтыль). Узоры t-hCO (n=3) і ўзоры hCO (n=3) былі інтэграваны асобна з выкарыстаннем функцыі IntegrateData з вышэйзгаданымі параметрамі. Затым Яшчэ адзін раўнд якаснай фільтрацыі інтэграванага набору дадзеных быў выкананы, як апісана вышэй.
Пасля выдалення нізкаякасных ядраў інтэграваны набор даных быў згрупаваны (разрозненне = 0,5) і ўбудаваны для візуалізацыі UMAP34. Маркерныя гены для кожнага кластара былі вызначаны з дапамогай функцыі FindMarkers з параметрамі па змаўчанні, разлічанымі з нармалізаваных даных экспрэсіі генаў. Мы ідэнтыфікуем і класіфікуем асноўныя класы клетак, аб'ядноўваючы эталонныя наборы даных кары галаўнога мозгу плода і дарослага чалавека з экспрэсіяй маркерных генаў 19, 20, 21, 35 і анатацыяй. У прыватнасці, цыркулюючыя папярэднікі былі ідэнтыфікаваны па экспрэсіі MKI67 і TOP2A. Кластары-папярэднікі былі вызначаны адсутнасцю мітатычных транскрыптаў, высокім перакрыццём з мультыпатэнтнымі гліяльнымі кластарамі-папярэднікамі, апісанымі ў кары галаўнога мозгу плода ў позняй метафазе, і экспрэсіяй EGFR і OLIG1. Мы выкарыстоўваем тэрмін "астрацыт", каб ахапіць некалькі станаў дыферэнцыяцыі астрацытаў, ад позняй радыяльнай гліі да паспявання астрацытаў. Кластары астрацытаў экспрэсуюць высокі ўзровень SLC1A3 і AQP4 і, як было паказана, супадаюць з падтыпамі радыяльнай гліі плода і/або дарослых астрацытаў. OPC экспрэсуюць PDGFRA і SOX10, а алігадэндрацыты экспрэсуюць маркеры міэлінізацыі (MOG і MYRF). Глутаматергічныя нейроны былі ідэнтыфікаваны па наяўнасці нейрональных транскрыптаў (SYT1 і SNAP25), адсутнасці ГАМКергічных маркераў (GAD2) і экспрэсіі NEUROD6, SLC17A7, BCL11B або SATB2. Нейроны GluN былі далей падзелены на верхнія (экспрэсія SATB2 і страта BCL11B) і глыбокія (экспрэсія BCL11B) падкласы. Меркаваныя нейроны падпласцін (SP) экспрэсуюць вядомыя маркеры SP18, такія як ST18 і SORCS1, у дадатак да глыбокіх маркераў GluN. Клеткі, падобныя на харыяідальнае спляценне, былі ідэнтыфікаваны па экспрэсіі TTR, а менінгеападобныя клеткі экспрэсавалі гены, звязаныя з фібрабластамі, і картавалі піальныя/сасудзістыя клеткі з эталоннага набору дадзеных.
Дыферэнцыяльны аналіз экспрэсіі генаў паміж t-hCO і падкласамі hCO быў праведзены з выкарыстаннем нядаўна распрацаванага псеўдапакетнага метаду, які быў прайграны ў выбарках, рэалізаваных з выкарыстаннем пакета Libra R (версія 1.0.0). У прыватнасці, для груп былі праведзены лагарыфмічныя тэсты праўдападобнасці edgeR (версія 3.36.0, пакет R) шляхам сумавання колькасці генаў у клетках для дадзенага класа клетак для кожнай рэплікацыі выбаркі. Для візуалізацыі цеплавой карты нармалізаваныя значэнні на мільён (CPM) вылічваюцца з выкарыстаннем edgeR (функцыя cpm()) і маштабуюцца (для дасягнення сярэдняга значэння = 0, стандартнага адхілення = 1). Быў праведзены аналіз узбагачэння Gene Ontology (GO) значна павышаных генаў t-hCO GluN (скарэкціраванае па Бенджаміні-Хохбергу значэнне P менш за 0,05 экспрэсавалася як мінімум у 10% клетак t-hCO GluN і кратнае павелічэнне змены як мінімум у 2 разы), праведзены з выкарыстаннем ToppGene Suite (https://toppgene.cchmc.org/)37. Мы выкарыстоўваем праграму ToppFun з параметрамі па змаўчанні і паведамляем пра P-значэнні з карэкцыяй па Бенджаміні-Хохбергу, разлічаныя з дапамогай гіпергеаметрычных тэстаў з анатацыямі GO.
Каб супаставіць нашы кластары snRNA-seq з анатаванымі кластарамі клетак з эталонных даследаванняў першаснай RNA-seq аднаклетачных або snRNA-seq дарослых19,20,21,22, мы ўжылі падыход інтэграцыі парных набораў даных. Мы выкарысталі працоўны працэс нармалізацыі SCTransform (v2) у Seurat для інтэграцыі і параўнання перакрыццяў кластараў паміж наборамі даных (выкарыстоўваючы тыя ж параметры, што і вышэй). Асобныя наборы даных былі выпадковым чынам падзеленыя на падмноства да 500 клетак або ядраў на зыходны кластар для павышэння вылічальнай эфектыўнасці. Выкарыстоўваючы падобны падыход, як апісаны раней, перакрыццё кластараў было вызначана як доля клетак або ядраў у кожным аб'яднаным кластары, якія перакрываліся з пазнакай эталоннага кластара. Для далейшай класіфікацыі GluN мы выкарысталі працоўны працэс TransferData Seurat для дадзеных падмноства GluN, каб прызначыць пазнакі эталонных набораў даных нашым клеткам GluN.
Каб ацаніць статус паспявання глабальнага транскрыптома ўзораў t-hCO і hCO, мы параўналі нашы псеўдааб'ёмныя ўзоры з BrainSpan/psychENCODE23, які складаецца з вялікай паслядоўнасці РНК, якая ахоплівае развіццё мозгу чалавека. Мы правялі PCA на камбінаванай нармалізаванай па шаблоне матрыцы экспрэсіі генаў з узораў кары праз 10 тыдняў пасля зачацця і пазней у 5567 генах (разам з нашымі дадзенымі), якія раней былі ідэнтыфікаваны як актыўныя ў узорах кары BrainSpan (вызначаныя як больш за 50% у дысперсіі развіцця, тлумачанай узростам з выкарыстаннем кубічнай мадэлі)38. Акрамя таго, мы атрымалі гены, звязаныя з асноўнымі транскрыптомнымі сігнатурамі нейраразвіцця, выкарыстоўваючы неадмоўную матрычную фактарызацыю, як апісана раней. Вагі выбаркі, разлічаныя з выкарыстаннем працэдуры неадмоўнай матрычнай фактарызацыі, прадстаўлены на малюнку 5b з пашыранымі дадзенымі для кожнай з пяці сігнатур, апісаных Чжу і інш.38. Зноў жа, транскрыпцыйныя маркеры, якія залежаць ад актыўнасці, былі атрыманы з раней апублікаваных даследаванняў. У прыватнасці, ERG і LRG былі значна павышаны ў глутаматэргічных нейронах, ідэнтыфікаваных з дапамогай калекцыі аднаРНК-секвенавання зрокавай кары галаўнога мозгу мышэй пасля візуальнай стымуляцыі з дадатковай табліцы 3 (Хрвацін і інш.). LRG, узбагачаныя чалавекам, былі атрыманы з актываваных KCl культур чалавечага эмбрыянальнага мозгу і сабраны праз 6 гадзін пасля стымуляцыі, і адфільтраваныя гены былі значна павышаны ў людзей, але не ў грызуноў (Дадатковая табліца 4). Аналіз узбагачэння набору генаў з выкарыстаннем гэтых набораў генаў быў праведзены з дапамогай аднабаковага дакладнага тэсту Фішэра.
Анестэзавалі пацукоў ізафлуранам, вынялі мозг і змясцілі ў халодны (прыблізна 4°C) насычаны кіслародам (95% O2 і 5% CO2) раствор цукрозы для зрэзаў, якія змяшчалі: 234 мМ цукрозы, 11 мМ глюкозы, 26 мМ NaHCO3, 2,5 мМ KCl, 1,25 мМ NaH2PO4, 10 мМ MgSO4 і 0,5 мМ CaCl2 (каля 310 мОсм). Каранальныя зрэзы мозгу пацукоў (300–400 мкм), якія змяшчалі t-hCO2, былі зроблены з выкарыстаннем вібратома Leica VT1200, як апісана раней39. Затым зрэзы перанеслі ў камеру для секцыявання з бесперапыннай аксігенацыяй пры пакаёвай тэмпературы, якая змяшчала аксігенаваную вадкасць з вадкасцю, падрыхтаваную з: 10 мМ глюкозы, 26 мМ NaHCO3, 2,5 мМ KCl, 1,25 мМ NaHPO4, 1 мМ MgSO4, 2 мМ CaCl2 і 126 мМ NaCl (298 мОсм). не менш чым за 45 хвілін да запісу. Зрэзы запісвалі ў пагружанай камеры, дзе яны бесперапынна перфузаваліся aCSF (95% O2 і 5% CO2 у флаконе). Усе дадзеныя запісвалі пры пакаёвай тэмпературы. t-hCO нейроны спынялі з дапамогай боросілікатнай шкляной піпеткі, напоўненай растворам, які змяшчаў 127 мМ глюканату калію, 8 мМ NaCl, 4 мМ АТФ магнію, 0,3 мМ ГТФ натрыю, 10 мМ HEPES і 0,6 мМ EGTA, pH 7,2, унутраны раствор даводзілі да KOH (290 мОсм). Для аднаўлення ў раствор для запісу дадавалі біяцыцін (0,2%).
Дадзеныя былі атрыманы з выкарыстаннем узмацняльніка MultiClamp 700B (Molecular Devices) і лічбавізатара Digidata 1550B (Molecular Devices), нізкачастотнай фільтрацыі на частаце 2 кГц, алічбаваны на частаце 20 кГц і прааналізаваны з выкарыстаннем Clampfit (Molecular Devices), Origin (OriginPro). 2021b, OriginLab) і карыстальніцкіх функцый MATLAB (Mathworks). Патэнцыял пераходу быў разлічаны з дапамогай JPCalc, і запісы былі скарэкціраваны да разліковага значэння -14 мВ. Аперацыя IV складаецца з серыі крокаў току з крокам 10-25 пА, ад -250 да 750 пА.
Таламус, белае рэчыва і аферэнтныя вугалі S1 стымуляваліся электрычна ў таламокартыкальных зрэзах падчас рэгістрацыі нейронаў hCO з дапамогай патч-клэмпа, як апісана раней. Коратка кажучы, мозг быў размешчаны на стале для 3D-друку, нахіленым пад вуглом 10°, а пярэдняя частка мозгу была разрэзана пад вуглом 35°. Затым мозг быў прыклеены да паверхні разрэзу і нарэзаны, захоўваючы выступаючыя аксоны таламокартыка. Біпалярныя вальфрамавыя электроды (0,5 МОм) былі ўсталяваны на другі мікраманіпулятар і стратэгічна размешчаны для стымуляцыі чатырох абласцей на клетку (унутраная капсула, белае рэчыва, S1 і hCO). Запісвайце сінаптычныя рэакцыі пасля фазавай стымуляцыі 300 мкА пры частаце 0,03–0,1 Гц.
Нейроны hChR2, якія экспрэсуюць hChR2, актываваліся пры 480 нм, і светлавыя імпульсы, згенераваныя святлодыёдам (Prizmatix), падаваліся праз аб'ектыў ×40 (0.9 NA; Olympus) для рэгістрацыі экспрэсіі hChR2 паблізу клетак. Дыяметр асветленага поля складае прыблізна 0,5 мм, а агульная магутнасць - 10-20 мВт. Шырыня імпульсу была ўстаноўлена на 10 мс, што адпавядае імпульсу, які падаецца падчас эксперыменту па паводніцкім навучанні. Выкарыстоўваліся розныя частоты стымуляцыі, ад 1 да 20 Гц, але для колькаснай ацэнкі выкарыстоўваўся толькі першы імпульс серыі. Інтэрвалы паміж серыямі звычайна перавышаюць 30 с, каб мінімізаваць уплыў на сінаптычныя інгібіруючыя або палягчаючыя шляхі. Каб праверыць, ці з'яўляецца рэакцыя hChR2 монасінаптычнай, мы наносілі TTX (1 мкМ) на ванну, пакуль рэакцыя EPSC не знікла, а затым наносілі 4-амінапірыдын (4-AP; 100 мкМ). Як правіла, рэакцыя вяртаецца на працягу некалькіх хвілін, з крыху большай затрымкай паміж уключэннем святлодыёда і генерацыяй EPSC. Для праверкі таго, ці выкліканы адказ AMPA-рэцэптарамі, выкарыстоўвалі NBQX (10 мкМ).
Вострыя зрэзы hCO былі створаны, як апісана раней. Карацей кажучы, зрэзы hCO былі заліты ў 4% агарозу і перанесены ў клеткі, якія змяшчалі 126 мМ NaCl, 2,5 мМ KCl, 1,25 мМ NaH2PO4, 1 мМ MgSO4, 2 мМ CaCl2, 26 мМ NaHCO3 і 10 мМ d-(+)-глюкозы. Зрэзы былі выразаны з таўшчынёй 200–300 мкм пры пакаёвай тэмпературы з выкарыстаннем вібратара Leica VT1200 і захоўваны ў ASF пры пакаёвай тэмпературы. Затым на зрэзах hCO пад прамым мікраскопам SliceScope (Scientifica) быў праведзены patch-camp запіс цэлых клетак. Зрэзы перфузавалі aCSF (95% O2 і 5% CO2), і сігналы клетак рэгістраваліся пры пакаёвай тэмпературы. Нейроны hCO наносілі з дапамогай піпеткі з боросілікатнага шкла, напоўненай растворам, які змяшчаў 127 мМ глюканату калію, 8 мМ NaCl, 4 мМ АТФ магнію, 0,3 мМ ГТФ натрыю, 10 мМ HEPES і 0,6 мМ EGTA, унутраны pH 7,2, даведзены да KOH (асмалярнасць 290). Для аднаўлення да ўнутранага раствора дадалі 0,2% біяцытыну.
Дадзеныя былі атрыманы з дапамогай праграмы Clampex (Clampex 11.1, Molecular Devices) з выкарыстаннем узмацняльніка MultiClamp 700B (Molecular Devices) і лічбавізатара Digidata 1550B (Molecular Devices), адфільтраваны нізкачастотна пры частаце 2 кГц, алічбаваны пры частаце 20 кГц і прааналізаваны з дапамогай праграмы Clampfit (версія 10.6) для аналізу (molecular devices) і карыстальніцкіх функцый MATLAB (MATLAB 2019b, Mathworks). Патэнцыял пераходу быў разлічаны з дапамогай JPCalc, і запісы былі скарэкціраваны з разліковым патэнцыялам пераходу -14 мВ. Аперацыя IV складаецца з серыі крокаў току з крокам 5-10 пА ад -50 да 250 пА.
Для марфалагічнай рэканструкцыі зашчымленых нейронаў да ўнутранага раствора дадавалі 0,2% біяцытыну (Sigma-Aldrich). Пасля ўзлому клеткі прайміравалі не менш за 15 хвілін. Затым піпетку павольна ўцягвалі на працягу 1-2 хвілін, пакуль зарэгістраваная мембрана цалкам не загерметызуецца. Пасля працэдуры фізіялогіі зрэзаў зрэзы фіксавалі на працягу ночы пры 4°C у 4% PFA, прамывалі PBS X3 і разводзілі 1:1000 стрэптавідынам-кан'югаваным DyLight 549 або DyLight 405 (Vector Labs). Клеткі, напоўненыя біяцытынам (2%; Sigma-Aldrich), маркіравалі падчас запісу з дапамогай патч-клэмп пры пакаёвай тэмпературы на працягу 2 гадзін. Затым зрэзы мацавалі на прадметныя шкла з дапамогай Aquamount (Thermo Scientific) і візуалізавалі на наступны дзень на канфакальным мікраскопе Leica TCS SP8 з выкарыстаннем алейнага иммерсионного аб'ектыва з лікавай апертурай ×40 1,3, павелічэннем ×0,9–1,0, xy. Частата дыскрэтызацыі складае прыблізна 7 пікселяў на мікрон. Z-стэкі з інтэрвалам 1 мкм атрымліваліся паслядоўна, і для ахопу ўсяго дендрытнага дрэва кожнага нейрона выкарыстоўваліся мазаікі z-стэкаў і аўтаматычнае сшыванне на аснове Leica. Затым нейроны адсочваліся паўручным спосабам з дапамогай інтэрфейсу neuTube 40 і ствараліся файлы SWC. Затым файлы былі загружаны ў плагін SimpleNeuriteTracer41 Fiji (ImageJ, версія 2.1.0; NIH).
Тканіна кары галаўнога мозгу чалавека была атрымана з інфармаванай згоды ў адпаведнасці з пратаколам, зацверджаным Інстытуцыйным саветам па аглядзе Стэнфардскага ўніверсітэта. Два ўзоры тканіны чалавека пасля родаў (3 і 18 гадоў) былі атрыманы шляхам рэзекцыі лобнай кары (сярэдняй лобнай звіліны) у рамках хірургічнага ўмяшання пры рэфрактэрнай эпілепсіі. Пасля рэзекцыі тканіну збіралі ў ледзяным NMDG-aCSF, які змяшчаў: 92 мМ NMDG, 2,5 мМ KCl, 1,25 мМ NaH2PO4, 30 мМ NaHCO3, 20 мМ HEPES, 25 мМ глюкозы, 2 мМ тыямачавіны, 5 мМ аскарбату натрыю, 3 мМ пірувату натрыю, 0,5 мМ CaCl2 4H2O і 10 мМ MgSO4 7H2O. Тытравалі да pH 7,3-7,4 канцэнтраванай салянай кіслатой. Тканіны былі дастаўлены ў лабараторыю на працягу 30 хвілін, і каранарныя зрэзы былі зроблены ў адпаведнасці з апісанай вышэй працэдурай.
Усе працэдуры на жывёлах праводзіліся ў адпаведнасці з рэкамендацыямі па доглядзе за жывёламі, зацверджанымі APLAC Стэнфардскага ўніверсітэта. Пацукам (старэйшым за 140 дзён пасля трансплантацыі) індукавалі 5% ізафлуранавы наркоз і інтрааперацыйна анестэзавалі 1-3% ізафлуранам. Жывёл змяшчалі ў стэрэатаксічную рамку (Kopf) і падскурна ўводзілі бупрэнарфін пралангаванага вызвалення (SR). Чэрап агалялі, ачышчалі і ўстаўлялі 3-5 шруб у косці. Для ўздзеяння t-hCO3 мы генеравалі стэрэатаксічныя каардынаты з МРТ-здымкаў. У месцы, якое цікавіць, прасвідравалі адтуліну для свердзела, і валокны (дыяметрам 400 мкм, NA 0,48, Doric) апускалі на 100 мкм ніжэй паверхні hCO3 і мацавалі да чэрапа з дапамогай УФ-зацвярдзельнага стаматалагічнага цэменту (Relyx).
Валаконна-фатаметрычныя запісы праводзіліся, як апісана раней42. Для рэгістрацыі спантаннай актыўнасці пацукоў змяшчалі ў чыстую клетку, і да імплантаванага валаконна-аптычнага кабеля падключалі валаконна-аптычны патч-кабель дыяметрам 400 мкм (Doric), падлучаны да валаконна-аптычнай сістэмы збору фотаметрычных дадзеных. Падчас 10-хвіліннай рэгістрацыі рухальнай актыўнасці жывёлы маглі свабодна даследаваць клетку. Для рэгістрацыі выкліканай актыўнасці пацукоў (больш чым праз 140 дзён пасля трансплантацыі) анестэзавалі 5% ізафлуранам для індукцыі і 1-3% ізафлуранам для падтрымання. Жывёлу змяшчалі ў стэрэатаксічную рамку (Kopf), і вусы на процілеглым баку t-hCO2 падстрыгалі прыкладна да 2 см і прапускалі праз сетку, падлучаную да п'езаэлектрычнага прывада (PI). Валаконна-аптычны патч-кабель дыяметрам 400 мкм (Doric) падключалі да імплантаванага валакна і да сістэмы збору дадзеных. Вусы на процілеглым баку t-hCO затым адхіляліся 50 разоў (2 мм пры 20 Гц, 2 с на прадстаўленне) у выпадковы час з дапамогай п'езаэлектрычнага прывада на працягу 20 хвілін запісу. Выкарыстоўвайце пакет падтрымкі Arduino MATLAB для кіравання часам адхілення з дапамогай карыстальніцкага кода MATLAB. Падзеі сінхранізуюцца з праграмным забеспячэннем для збору дадзеных з дапамогай імпульсаў транзістар-транзістарнай логікі (TTL).
Пацукам (больш за 140 дзён пасля трансплантацыі) праводзілі анестэзію 5% ізафлуранам і інтрааперацыйна анестэзавалі 1-3% ізафлуранам. Жывёл змяшчалі ў стэрэатаксічную рамку (Kopf) і падскурна ўводзілі бупрэнарфін SR і дэксаметазон. Чэрап агалялі, ачышчалі і ўстаўлялі 3-5 шруб у косці. Для ўздзеяння t-hCO3 мы генеравалі стэрэатаксічныя каардынаты з МРТ-здымкаў. Кальцавая краніятомія (дыяметрам прыблізна 1 см) была выканана з дапамогай высакахуткаснага свердзела непасрэдна над трансплантаванай hCO3. Пасля таго, як костка стала максімальна тонкай, але перад тым, як свідраваць наскрозь усю костку, выкарыстоўвалі шчыпцы для выдалення пакінутага непашкоджанага тазавага дыска, каб выявіць ніжэйлеглы t-hCO3. Краніятомія была запоўнена стэрыльным фізіялагічным растворам, а покрыўнае шкло і спецыяльны штыфт для галоўкі былі прымацаваны да чэрапа з дапамогай стаматалагічнага цэменту, зацвярдзелага пад уздзеяннем УФ-выпраменьвання (Relyx).
Двухфатонная візуалізацыя праводзілася з выкарыстаннем шматфатоннага мікраскопа Bruker з аб'ектывам Nikon LWD (×16, 0,8 NA). Візуалізацыя GCaMP6 праводзілася пры 920 нм з павелічэннем у адной z-плоскасці 1,4x і сярэдняй частатой 7,5 кадраў у секунду ў 8 разоў. Пацукоў выклікалі 5% ізафлуранавай анестэзіяй і падтрымлівалі яе з дапамогай 1-3% ізафлурану. Пацукоў змяшчалі ў спецыяльна вырабленую галаву і размяшчалі пад аб'ектывам. Быў атрыманы 3-хвілінны фонавы запіс рухальнай актыўнасці. На працягу 20 хвілін запісу 50 зацяжак (кожная прэзентацыя працягласцю 100 мс) выпадковым чынам дастаўляліся на падушачку вусоў насупраць t-hCO3 з дапамогай пікапрыцэра. Выкарыстоўвайце пакет падтрымкі Arduino MATLAB для кіравання часам пакета з дапамогай карыстальніцкага кода MATLAB. Сінхранізуйце падзеі з праграмным забеспячэннем для збору дадзеных (PrairieView 5.5) з выкарыстаннем імпульсаў TTL. Для аналізу выявы былі скарэкціраваны на рух xy з выкарыстаннем афіннай карэкцыі ў праграме MoCo, запушчанай на Фіджы. Экстракцыя флуарэсцэнтных слядоў з асобных клетак з выкарыстаннем CNMF-E43. Флуарэсцэнцыя была выдзелена для кожнай вобласці цікавасці, пераўтворана ў крывыя dF/F, а затым пераўтворана ў z-паказчыкі.
Пацукам (больш за 140 дзён пасля трансплантацыі) індукавалі анестэзію 5% ізафлуранам і інтрааперацыйна анестэзавалі 1-3% ізафлуранам. Жывёл змяшчалі ў стэрэатаксічную рамку (Kopf) і падскурна ўводзілі бупрэнарфін SR і дэксаметазон. Вусы на процілеглым баку ад t-hCO2 былі абрэзаны прыкладна да 2 см і прапушчаны праз сетку, падлучаную да п'езаэлектрычнага прывада. Чэрап агалялі і ачышчалі. Да чэрапа прымацоўвалі шрубу для зазямлення з нержавеючай сталі. Для ўздзеяння на t-hCO2 мы стварылі стэрэатаксічныя каардынаты з МРТ-здымкаў. Выканайце кругавую краніятомію (дыяметрам прыблізна 1 см) з дапамогай высакахуткаснага свердзела крыху вышэй за t-hCO2. Пасля таго, як костка стане максімальна тонкай, але перад тым, як свідраваць наскрозь усю костку, выкарыстоўвайце шчыпцы, каб выдаліць пакінуты непашкоджаны тазавы дыск, каб выявіць размешчаны t-hCO2 пад ёй. Асобныя клеткі рэгістраваліся з выкарыстаннем 32-канальных або 64-канальных крэмніевых зондаў высокай шчыльнасці (Cambridge Neurotech), зазямленых на шрубы зазямлення і папярэдне ўзмацняемых узмацняльнікамі RHD (Intan). Выкарыстоўвайце маніпулятар, каб апусціць электроды да мэтавага месца праз краніатамію, якая запоўнена стэрыльным фізіялагічным растворам. Збор дадзеных праводзіўся на частаце 30 кГц з выкарыстаннем сістэмы збору дадзеных Open Ephys. Запіс працягваўся толькі тады, калі мы выявілі высокакарэляваную рытмічную спантанную актыўнасць у больш чым 10 каналах, што сведчыць аб тым, што электроды знаходзіліся ў трансплантаце (на аснове дадзеных двухфатоннай кальцыевай візуалізацыі). Быў атрыманы 10-хвілінны фонавы запіс рухальнай актыўнасці. Затым вусы на процілеглым баку t-hCO2 адхіляліся 50 разоў (2 мм пры 20 Гц, 2 с на прадстаўленне) у выпадковы час з дапамогай п'езаэлектрычнага прывада на працягу 20-хвіліннага перыяду запісу. Выкарыстоўваючы пакет падтрымкі MATLAB для Arduino (MATLAB 2019b), кіруйце часам адхілення з дапамогай карыстальніцкага кода MATLAB. Выкарыстоўвайце імпульсы TTL для сінхранізацыі падзей з праграмным забеспячэннем для збору дадзеных.
Для эксперыментаў па аптычнай маркіроўцы аптычны патч-корд дыяметрам 200 мкм (Doric), падлучаны да лазера з даўжынёй хвалі 473 нм (Omicron), быў падлучаны да аптычнага валакна дыяметрам 200 мкм, размешчанага над краніятаміяй. Непасрэдна перад гэтым магутнасць перамычкі была адрэгулявана да 20 мВт. З дапамогай маніпулятара апусціце электроды да мэтавага месца праз краніятамію, якая запоўнена стэрыльным фізіялагічным растворам. У пачатку запісу было выпраменьвана дзесяць імпульсаў святла 473 нм (частата 2 Гц, працягласць імпульсу 10 мс). Фотаадчувальныя клеткі вызначаліся як клеткі, якія праяўлялі пікавую рэакцыю на працягу 10 мс святла ў 70% або больш выпрабаванняў.