Þakka þér fyrir að heimsækja Nature.com. Þú ert að nota vafraútgáfu með takmörkuðum CSS-stuðningi. Til að fá sem bestu upplifun mælum við með að þú notir uppfærðan vafra (eða slökkvir á samhæfingarstillingu í Internet Explorer). Til að tryggja áframhaldandi stuðning sýnum við síðuna án stíla og JavaScript.
Sýnir hringekju með þremur glærum í einu. Notaðu hnappana Fyrri og Næsta til að fletta í gegnum þrjár glærur í einu, eða notaðu rennihnappana í lokin til að fletta í gegnum þrjár glærur í einu.
Sjálfsamsettandi taugafrumulíffæri eru efnilegur in vitro vettvangur til að líkja eftir þroska og sjúkdómum manna. Hins vegar skortir frumulíffæri þá tengingu sem er til staðar in vivo, sem takmarkar þroska og kemur í veg fyrir samþættingu við önnur rásir sem stjórna hegðun. Hér sýnum við fram á að heilaberkilíffæri sem eru unnin úr stofnfrumum manna og grædd í líkamsskynjunarbörk nýfæddra nakinna rotta þróa þroskaðar frumugerðir sem samlagast skynjunar- og hvatningartengdum rásum. Segulómun leiddi í ljós vöxt frumulíffæra eftir ígræðslu í nokkrum stofnfrumulínum og dýrum, en einkjarnagreining leiddi í ljós framgang heilaberkimyndunar og tilkomu virkniháðs umritunarforrits. Reyndar sýna ígræddar heilaberkisfrumur flóknari formfræðilega, taugamóta- og innri himnueiginleika en hliðstæður þeirra in vitro, sem gerir kleift að greina taugagalla hjá sjúklingum með Timothy heilkenni. Líffærafræðileg og virknismælingar hafa sýnt að ígrædd frumulíffæri fá inntak frá stúkubarki og heilaberki, og in vivo skráningar á taugavirkni benda til þess að þessi inntak geti myndað skynjunarviðbrögð í frumum manna. Að lokum teygja heilaberkilíffæri taugasíma um allan rottnaheilann og ljósfræðileg virkjun þeirra leiðir til umbunarleitandi hegðunar. Þannig þroskast ígræddar taugafrumur í heilaberki manna og taka þátt í boðrásum hýsilsins sem stjórna hegðun. Við búumst við að þessi aðferð auðveldi greiningu á þráðstigsfrumgerðum í frumum sjúklinga sem ekki er hægt að greina með öðrum hætti.
Þroskun mannsheilans er merkilegt sjálfskipulagningarferli þar sem frumur fjölga sér, aðgreinast, flytja sig og tengjast til að mynda virk taugafrumurásir sem eru frekar fínpússaðar með skynjunarreynslu. Lykilvandamál í skilningi á þroska mannsheilans, sérstaklega í samhengi við sjúkdóma, er skortur á aðgangi að heilavef. Sjálfskipuleggjandi frumulíffæri, þar á meðal frumulíffæri í heilaberki mannsins (hCO; einnig þekkt sem heilakúla mannsins), geta myndað 2,3,4,5,6. Hins vegar takmarka nokkrar takmarkanir víðtækari notkun þeirra við skilning á þróun og virkni taugarása. Einkum er óljóst hvort þroski hCO er takmarkaður af fjarveru ákveðinna örumhverfis- og skyninntaka sem eru til staðar in vivo. Þar að auki, vegna þess að hCO eru ekki samþætt rásum sem geta myndað hegðunarniðurstöður, er notagildi þeirra við að líkja eftir erfðafræðilega flóknum og atferlisbundnum taugasálfræðilegum röskunum takmarkað eins og er.
Ígræðsla hCO í óskemmdan lifandi heila getur yfirstigið þessar takmarkanir. Fyrri rannsóknir hafa sýnt að taugafrumur manna sem græddar eru í berki nagdýra geta lifað af, varpað sjónarhornum og átt samskipti við nagdýrafrumur7,8,9,10,11,12. Hins vegar eru þessar tilraunir venjulega gerðar á fullorðnum dýrum, sem getur takmarkað taugamóta- og taugasímasamþættingu. Hér lýsum við ígræðsluaðferð þar sem við græddum þrívíddar hCO úr hiPS frumum í aðal skynjunarberki (S1) ónæmisbrestsrotta á snemmbúnu stigi plastþroska. Ígræddar hCO (t-hCO) taugafrumur gangast undir verulegan þroska, fá innslátt frá stúkubörk og berki-berki sem vekja skynjunarviðbrögð og teygja taugasímaútskot inn í rottuheila til að knýja áfram umbunarhegðun. Langvarandi þroski t-hCO hefur leitt í ljós taugagalla hjá sjúklingum með Timothy heilkenni (TS), alvarlegan erfðasjúkdóm sem orsakast af stökkbreytingum í spennunæmum L-gerð CaV1.2 kalsíumgöngum (kóðaðar af CACNA1C).
Til að rannsaka heilaberki manna í taugahringrásum in vivo, græddum við óskemmdan þrívíddar hCO2 í S1 hjá rottum með hóstarkirtilsleysi snemma á fæðingu (dagar 3-7 eftir fæðingu) (Mynd 1a og ítarlegri gögn á mynd 1a-c). Á þessum tímapunkti hafa taugasímaútskotin í stúku- og heilaberki ekki enn lokið S1 taugun sinni (tilvísun 13). Þessi aðferð er því hönnuð til að hámarka samþættingu t-hCO2 og lágmarka áhrif á innrænar taugahringrásir. Til að sjá staðsetningu t-hCO2 í lifandi dýrum, framkvæmdum við T2-vegnar segulómunarmyndir af heila rottum 2-3 mánuðum eftir ígræðslu (Mynd 1b og ítarlegri gögn, mynd 1d). t-hCO3 mælingar sáust auðveldlega og rúmmálsmælingar á t-hCO3 voru svipaðar og reiknaðar voru út frá föstum sneiðum (Ítarleg gögn mynd 1d,e; P > 0,05). t-hCO3 mælingar sáust auðveldlega og rúmmálsmælingar á t-hCO3 voru svipaðar og reiknaðar voru út frá föstum sneiðum (Ítarleg gögn mynd 1d,e; P > 0,05). t-hCO легко наблюдались, а объемные измерения t-hCO были аналогичны рассчитанным для фиксированных расрезис, ( рис 1d, e; P> 0,05). t-hCO3 var auðvelt að greina og rúmmálsmælingar á t-hCO3 voru svipaðar og reiknaðar voru fyrir fasta hluta (útvíkkuð gögn, mynd 1d, e; P > 0,05).很容易观察到t-hCO，并且t-hCO的体积测量值与从固定切片计算的测量值相似（扩展数据图1d、e；P > 。5）。很容易观察到t-hCO，并且t-hCO t-hCO легко наблюдался, а объемные измерения t-hCO были аналогичны рассчитанным для фиксированных срезия ( рис 1d, e; P> 0,05). t-hCO3 mæling var auðveldlega mæld og rúmmálsmælingar á t-hCO3 voru svipaðar og reiknaðar voru fyrir fasta hluta (útvíkkuð gögn, mynd 1d, e; P > 0,05).Við ákváðum t-hCO í 81% ígræddra dýra um það bil 2 mánuðum eftir ígræðslu (n = 72 dýr; hCO úr 10 hiPS frumulínum; hiPS frumulínur í viðbótartöflu 1). Af þessum voru 87% staðsett í heilaberki (Mynd 1c). Með því að framkvæma raðbundnar segulómunarmyndir á mörgum tímapunktum í sömu ígræddu rottu fundum við nífalda aukningu á t-hCO rúmmáli innan 3 mánaða (Mynd 1d og útvíkkuð gögn, Mynd 1f). Ígrædd dýr höfðu hátt lifunarhlutfall (74%) 12 mánuðum eftir ígræðslu (útvíkkuð gögn, Mynd 1g og viðbótartafla 2) og engar augljósar hreyfitruflanir eða minnistruflanir, heilaþekjubólga eða heilarit (EEG) fundust. Gögn Mynd 1g og viðbótartafla 2). 1 klst.–m og 3e).
a, Skýringarmynd af tilraunahönnun. hCO3 unnið úr hiPS frumum var grætt í S1 nýfæddra nakinna rotta á dögum 30-60 frá aðgreiningu. b, T2-vegnar kransæða- og láréttar segulómunarmyndir sem sýna t-hCO3 í S1 2 mánuðum eftir ígræðslu. Kvarðastika, 2 mm. c, Magnbundin ákvörðun á árangri ígræðslu sýnd fyrir hverja hiPS frumulínu (n = 108, tölur innan súlna gefa til kynna magn t-hCO3 í hverri hIPS frumulínu) og staðsetningu heilaberkis eða undirberkis (n = 88). d, Segulómunarmynd af kransæð (vinstri; kvarðastika, 3 mm) og samsvarandi þrívíddar rúmmálsuppbygging (kvarðastika, 3 mm) sem sýnir aukningu á t-hCO3 á 3 mánuðum. e, Yfirlit yfir t-hCO3 mynstur í heilaberki rotta. Kvarðastika, 1 mm. f, Dæmigerðar ónæmisfrumuefnafræðilegar myndir af t-hCO sýndar frá efri vinstri til hægri (meðan á aðgreiningu stendur): PPP1R17 (4 mánaða gamalt), NeuN (8 mánaða gamalt), SOX9 og GFAP (8 mánaða gömul), PDGFRα; (8 mánaða), MAP2 (8 mánaða) og IBA1 (8 mánaða). Kvarðastika, 20 µm. Samhliða tjáning HNA gefur til kynna frumur af mönnum. g, snRNA-raðgreining: Sameinuð margfalda og vörpun (UMAP) víddarminnkunarmyndgreining á öllum hágæða t-hCO kjarna eftir Seurat samþættingu (n=3 t-hCO sýni, n=2 hiPS frumulínur). Stjörnufrumur, frumur í stjörnufrumulínunni; cyc prog, blóðrásarforverar; GluN DL, djúpar glútamatergískar taugafrumur; GluN DL/SP, djúpar og undirlags glútamatergískar taugafrumur; GluN UL, efra lags glútamatergískar taugafrumur; fáliðuð frumur, fáliðuð frumur; OPC, fáliðuð frumur; RELN, reelin taugafrumur. h, Gen Ontology (GO) greining á genum sem voru marktækt uppstýrð (leiðrétt P < 0,05, margföld breyting > 2, tjáð í að minnsta kosti 10% af kjarna) í t-hCO glútamatergískum taugafrumum samanborið við hCO glútamatergískar taugafrumur. h, Gen Ontology (GO) greining á genum sem voru marktækt uppstýrð (leiðrétt P < 0,05, margföld breyting > 2, tjáð í að minnsta kosti 10% af kjarna) í t-hCO glútamatergískum taugafrumum samanborið við hCO glútamatergískar taugafrumur. h, Анализ обогащения терминов Gene Ontology (GO) fyrir генов со значительной активацией (скорректированный P <0,05, кратность изначительной активацией по крайней мере в 10% ядер) в глутаматергических нейронах t-hCO á сравнению с глутаматергическими нейронах. h, Gen Ontology (GO) greining á auðgun gena með marktæka virkjun (leiðrétt P <0,05, margföldun >2, tjáning í að minnsta kosti 10% kjarna) í t-hCO glútamatergískum taugafrumum samanborið við hCO glútamatergískar taugafrumur. h，与hCO 谷氨酸能神经元相比，t-hCO 谷氨酸能神经元中基因显着上调（谎整后0.05，倍数变化> 2，在至少10% 的细胞核中表达）的基因本体论(GO) 术识〈密 h ， 与 hco 谷氨酸 能 元 相比 ， t-hco 谷氨酸 能 神经 元 基因 显着 上谼 p <0 ０同 p.变化 变化> 2 ， 至少 10% 的 核中 表达） 基因 基因 基因 的 的 的 的 焚 的 的 焇 的的 的 的 的本体论(GO) 术语富集分析。 h, гены значительно активизировались (скорректированный P <0,05, кратность изменения> 2, экспрессируется по 10% кранев кратность изменения глутаматергических нейронах t-hCO á сравнению með глутаматергическими нейронами hCO Онтологический (GO) анализ. h, gen voru marktækt uppstýrð (leiðrétt P < 0,05, margföld breyting > 2, tjáð í að minnsta kosti 10% af kjarna) í t-hCO glútamatergískum taugafrumum samanborið við hCO glútamatergískar taugafrumur. Ontological (GO) greining á auðgunartímabilinu.Punktalínan gefur til kynna aq gildi upp á 0,05. i, UMAP myndgreining á GluN frumugerðum í t-hCO með því að nota merkimiðaflutning úr viðmiðunargagnasafni 22 snRNA-seq fullorðinna hreyfibarkar. CT — heilaberkisfrumur, ET — utanheilafrumur, IT — innri heilafrumur, NP — nærvörpun.
Við metum síðan frumubyggingu og heildarfrumusamsetningu t-hCO. Mótefnalitun á æðaþelsfrumum í rottum leiddi í ljós æðamyndun með t-hCO, en IBA1 litun leiddi í ljós nærveru örgliu í rottum um allt ígræðsluna (Mynd 1f og útvíkkuð gögn, Mynd 3c, d). Ónæmislitun leiddi í ljós frumur sem eru jákvæðar fyrir kjarnaóþægindum manna (HNA) sem tjáðu saman PPP1R17 (forverar heilaberki), NeuN (taugafrumur), SOX9 og GFAP (frumur úr glialfrumum) eða PDGFRα (forverar fáfrumukjarna) (Mynd 1f). Til að rannsaka frumusamsetningu t-hCO við einstakar frumur, framkvæmdum við einkjarna RNA raðgreiningu (snRNA-seq) eftir um það bil 8 mánaða aðgreiningu. Magnsíun og fjarlæging rottukjarna skilaði 21.500 hágæða einkjarnakortum af mönnum (Mynd 1g og útvíkkuð gögn, Mynd 4a, b). Tjáningarmynstur dæmigerðra frumugerðarmerkja bentu til klasa helstu flokka heilaberkisfrumna, þar á meðal djúpra og yfirborðslegra glútamatergískra taugafrumna, blóðrásarforvera, fáliðuðra frumna og stjörnufrumnaættkvíslar (Mynd 1g, útvíkkuð gögn, Mynd 4c og Viðbótartafla 3). Ónæmislitun fyrir SATB2 og CTIP2 sýndi að þrátt fyrir nærveru undirgerða heilaberkis sýndi t-hCO ekki skýra líffærafræðilega lagskiptingu (útvíkkuð gögn, Mynd 3a). Stiga-samsvarað snRNA-raðgreining hCO framleiddi svipaða frumuflokka, með fáeinum undantekningum, þar á meðal fjarveru fáliðuðra frumna og nærveru GABAergískra taugafrumna, sem gæti endurspeglað áður tilkynntar hagstæðar in vitro aðstæður fyrir hliðarforvera15 (útvíkkuð gögn, Mynd 4f - i og Viðbótartafla 4). Greining á mismunandi genatjáningu leiddi í ljós marktækan mun á glútamatergískum taugafrumum milli t-hCO og hCO (viðbótartafla 5), ​​þar á meðal virkjun gena sem tengjast þroska taugafruma eins og taugaboðleiðum, staðsetningu taugagripa og spennustýrðri rásavirkni (Mynd 1h og viðbótartafla 5). Tafla 6). Þar af leiðandi sýndu glútamatergískar t-hCO taugafrumur í heilaberki hraðaða umritunarþroska.
Til að skýra hvort þessar umritunarbreytingar í t-hCO tengdust formfræðilegum mun á hCO in vitro og t-hCO in vivo, endurgerðum við stigssamsvarandi bíósýtínfyllta hCO og hCO í bráðasneiðum eftir 7–8 mánaða sérhæfingu. hCO taugafrumur (Mynd 2a). t-hCO taugafrumur voru marktækt stærri, höfðu 1,5 sinnum þvermál sómanna, tvöfalt fleiri griputauga og sexfalda aukningu á heildarlengd griputauga samanborið við in vitro hCO (Mynd 2b). Að auki sáum við marktækt meiri þéttleika griputauga í t-hCO taugafrumum en í hCO taugafrumum (Mynd 2c). Þetta bendir til þess að t-hCO taugafrumur gangi undir mikla lengingu og greiningu griputauga, sem, ásamt áframhaldandi frumufjölgun, gæti stuðlað að miklum vexti t-hCO eftir ígræðslu (Mynd 1d og Ítarleg gögn Mynd 1f). Þetta hvatti okkur til að rannsaka rafgreiningarfræðilega eiginleika. Himnurýmið var átta sinnum hærra (útvíkkuð gögn, mynd 8d), himnuspennan í hvíldarástandi var meira ofskautuð (u.þ.b. 20 mV) og strauminnspýting olli hærri hámarksörvunarhraða í t-hCO taugafrumum en í hCO taugafrumum. in vitro (mynd 2d), e), sem er í samræmi við stærri og flóknari formfræðilega eiginleika t-hCO. Að auki var tíðni sjálfsprottinna örvandi eftirsynaptískra straumatburða (EPSC) marktækt hærri í t-hCO taugafrumum (mynd 2f), sem bendir til þess að aukinn þéttleiki dendritískra hryggja sem sést í t-hCO taugafrumum tengdist virkni örvun kynferðislegrar taugamóta. Við staðfestum óþroskaða eiginleika hCO taugafrumna in vitro með því að skrá merktar glútamatergískar taugafrumur (útvíkkuð gögn, mynd 6a-c).
a, þrívíddar endurgerð á bíósýtínfylltum hCO og t-hCO taugafrumum eftir 8 mánaða aðgreiningu. b, Magnbundin ákvörðun á formfræðilegum eiginleikum (n = 8 hCO taugafrumur, n = 6 t-hCO taugafrumur; **P = 0,0084, *P = 0,0179 og ***P < 0,0001). b, Magnbundin ákvörðun á formfræðilegum eiginleikum (n = 8 hCO taugafrumur, n = 6 t-hCO taugafrumur; **P = 0,0084, *P = 0,0179 og ***P < 0,0001). б, количественная оценка морфологических признаков (n = 8 нейронов hCO, n = 6 нейронов t-hCO; ** P = 0,0084, * P = 0,01***). b, magnbundin ákvörðun á formfræðilegum eiginleikum (n=8 hCO taugafrumur, n=6 t-hCO taugafrumur; **P=0,0084, *P=0,0179 og ***P<0,0001). b，形态学特征的量化（n = 8 个hCO 神经元，n = 6 个t-hCO 神经元；**P = 0,0084，0.1***P9 0. 0,0001）. b，形态学特征的量化（n = 8 个hCO 神经元，n = 6 个t-hCO 神经元；**P = 0,0084，0.1***P9 0. 0,0001）. б, количественная оценка морфологических признаков (n = 8 нейронов hCO, n = 6 нейронов t-hCO; ** P = 0,0084, * P = 0,01***). b, magnbundin ákvörðun á formfræðilegum eiginleikum (n=8 hCO taugafrumur, n=6 t-hCO taugafrumur; **P=0,0084, *P=0,0179 og ***P<0,0001).c, Þrívíddaruppbygging á hCO og t-hCO greinum taugafrumum eftir 8 mánaða sérhæfingu. Rauðar stjörnur gefa til kynna hugsanlega taugafrumur. Magnbundin þéttleikamæling taugafrumu (n = 8 hCO taugafrumur, n = 6 t-hCO taugafrumur; **P = 0,0092). d, Magnbundin ákvörðun hvíldarhimnuspennu (n = 25 hCO taugafrumur, n = 16 t-hCO taugafrumur; ***P < 0,0001). d, Magnbundin ákvörðun hvíldarhimnuspennu (n = 25 hCO taugafrumur, n = 16 t-hCO taugafrumur; ***P < 0,0001). d, количественная оценка мембранного потенциала покоя (n = 25 нейронов hCO, n = 16 нейронов t-hCO; *** P <0,0001). d, magngreining hvíldarhimnuspennu (n = 25 hCO taugafrumur, n = 16 t-hCO taugafrumur; ***P < 0,0001). d，静息膜电位的量化（n = 25 hCO 神经元，n = 16 t-hCO 神经元；***P < 0,0001）。 d，静息膜电位的量化（n = 25 hCO 神经元，n = 16 t-hCO 神经元；***P < 0,0001）。 d, количественная оценка мембранного потенциала покоя (n = 25 нейронов hCO, n = 16 нейронов t-hCO; *** P <0,0001). d, magngreining hvíldarhimnuspennu (n = 25 hCO taugafrumur, n = 16 t-hCO taugafrumur; ***P < 0,0001). e, Endurtekin boðspennuáhrif í hCO3 og t-hCO3 framkölluð með aukinni strauminnspýtingu og magnbundin ákvörðun á hámarksskotshraða (n = 25 hCO3 taugafrumur, n = 16 t-hCO3 taugafrumur; ***P < 0,0001). e, Endurtekin boðspennuáhrif í hCO3 og t-hCO3 framkölluð með aukinni strauminnspýtingu og magnbundin ákvörðun á hámarksskotshraða (n = 25 hCO3 taugafrumur, n = 16 t-hCO3 taugafrumur; ***P < 0,0001). e, повторное возбуждение потенциала действия в hCO og t-hCO, вызванное увеличением тока, og количествия скорости возбуждения (n = 25 нейронов hCO, n = 16 нейронов t-hCO; *** P <0,0001). e, endurkveikja boðspennu í hCO3 og t-hCO3 framkölluð með straumaukningu og magnbundinni ákvörðun hámarkskveisluhraða (n = 25 hCO3 taugafrumur, n = 16 t-hCO3 taugafrumur; *** P < 0,0001). e，通过增加电流注入诱导的hCO 和t-hCO 重复动作电位放电，以及最大放善缇n =2个hCO 神经元，n = 16 个t-hCO 神经元；***P < 0,0001）。 E ， 通过 增加 电流 注入 的 的 hco 和 t-hco 重复 电位 放电 ， 以及 最 大刼 最 大 嚄 2个 hco 神经 ， n = 16 个 t-hco 神经 ； *** p <0.0001） 。 e, повторяющееся возбуждение потенциала действия hCO og t-hCO, вызванное увеличением подачи токенкаич, и коцич максимальной скорости возбуждения (n = 25 нейронов hCO, n = 16 нейронов t-hCO; *** P <0,0001). e, endurtekin skothríð hCO3 og t-hCO3 boðspenna framkölluð með aukinni straumframboði og magnbundinni ákvörðun hámarks skothríðar (n = 25 hCO3 taugafrumur, n = 16 t-hCO3 taugafrumur; *** P < 0,0001). f, Sjálfsprottnar EPSC-frumur (sEPSC-frumur) í hCO og t-hCO taugafrumum eftir 8 mánaða aðgreiningu og magnbundin ákvörðun á tíðni taugamóta (n = 25 hCO taugafrumur, n = 17 t-hCO taugafrumur; ***P < 0,0001). f, Sjálfsprottnar EPSC-frumur (sEPSC-frumur) í hCO og t-hCO taugafrumum eftir 8 mánaða sérhæfingu og magnbundin ákvörðun á tíðni taugamóta (n = 25 hCO taugafrumur, n = 17 t-hCO taugafrumur; ***P < 0,0001). f, спонтанные EPSC (sEPSC) в нейронах hCO og t-hCO через 8 месяцев дифференцировки и количественная оценка часистоты событий (n = 25 нейронов hCO, n = 17 нейронов t-hCO; *** P <0,0001) . f, Sjálfsprottnar EPSC-frumur (sEPSC-frumur) í hCO og t-hCO taugafrumum eftir 8 mánaða aðgreiningu og magngreiningu á tíðni taugamóta (n=25 hCO taugafrumur, n=17 t-hCO taugafrumur; ***P<0,0001). f，分化8 个月时hCO 和t-hCO 神经元中的自发性EPSCs (sEPSCs)，以及突触事件频率的5CO神经元，n = 17 t-hCO 神经元；***P < 0,0001） . f，分化8 个月时hCO 和t-hCO 神经元中的自发性EPSCs (sEPSCs)，以及突触事件频率的5CO神率的量匼（n = 25 hCO 神率的量匼（n = 25hCO P < 0,0001）. f, спонтанные EPSC (sEPSC) в нейронах hCO og t-hCO через 8 месяцев дифференцировки и количественная оценка часистоты событий (n = 25 нейронов hCO, n = 17 нейронов t-hCO; *** P <0,0001). f, Sjálfsprottnar EPSC-frumur (sEPSC-frumur) í hCO og t-hCO taugafrumum eftir 8 mánaða aðgreiningu og magngreiningu á tíðni taugamóta (n = 25 hCO taugafrumur, n = 17 t-hCO taugafrumur; *** P < 0,0001).Fyrir bf voru hCO3 og t-hCO3 í línu 1208-2 tekin úr sömu aðgreiningarlotu sem haldið var samsíða. g, Greining á genasetti sem auðgaðist (einhliða Fisher-próf) á genum sem voru marktækt uppstýrð (leiðrétt P < 0,05, margföld breyting > 2, tjáð í að minnsta kosti 10% af kjarna) í t-hCO glútamatergískum taugafrumum samanborið við hCO glútamatergískar taugafrumur með genasettum bæði snemmbærrar svörunar (ERG) og seint svörunar (LRG) virkniháðra gena sem greind voru í in vivo músarannsókn16 og manna-sértækum LRG úr in vitro taugafrumum17. g, Greining á genasetti sem auðgaðist (einhliða Fisher-próf) á genum sem voru marktækt uppstýrð (leiðrétt P < 0,05, margföld breyting > 2, tjáð í að minnsta kosti 10% af kjarna) í t-hCO glútamatergískum taugafrumum samanborið við hCO glútamatergískar taugafrumur með genasettum bæði snemmbærrar svörunar (ERG) og seint svörunar (LRG) virkniháðra gena sem greind voru í in vivo músarannsókn16 og manna-sértækum LRG úr in vitro taugafrumum17. g, анализ обогащения набора генов (односторонний точный критерий Фишера) генов со значительной активацорекий (skr0,0 кратность изменения > 2, экспрессия по меньшей мере в 10% ядер) в глутаматергических нейровнах t-hCO á сратность глутаматергическими нейронами hCO наборы генов как раннего (ERG), так и позднего (LRG) генов, зависящих от aðgerðir, upplýsingar og útfærslur á vélum in vivo16, og sérfræðiþjónustur fyrir LRG í vitro17. g, greining á genaauðgun (einhliða Fisher-próf) gena með marktæka virkjun (leiðrétt P < 0,05, margföldun > 2, tjáning í að minnsta kosti 10% af kjarna) í t-hCO glútamatergískum taugafrumum samanborið við hCO glútamatergískar taugafrumusett bæði af snemmbærum (ERG) og seintbærum (LRG) virkniháðum genum sem greind voru í in vivo músum16 og manna-sértækum LRG úr taugafrumum in vitro17. g，t-hCO谷氨酸能神经元与hCO谷氨酸能神经元相比，t -hCO谷氨酸能神经元显着上调（调整后P<0.05，倍数变化>2，在至少10%的细胞核中表达）的基因集富集分析（单侧F isher精确检验）从体内小鼠研究中鉴定的早期反应(ERG)和晚期反应(LRG) 活性依赖性基因的基因组16 和体外神经元17 中的人类特异 g ， t-hco 谷氨酸 神经 元 与 hco 谷氨酸 神经 元 相比 ， t-hco 谷氨酸 谷氨酸 神经 兰 襞绸 兰<0.05 ， 倍数> 2 ， 至少 至少 10%的 细胞 核中 表达） 的 集富集 分析ＲＧ单）体内 小鼠 研究 中 的 早期 反应 反应 反应 和 晚期 反应 反应 (lrg) 活性 基因 的 基因瞻绌 16神经元 17 中 中 17 中 17的人类特异性LRG。 g, глутаматергические нейроны t-hCO были значительно активизированы по сравнению с глутаматергическическими нейронкованы P<0,05, кратность изменения> 2, не менее 10% Анализ обогащения набора генов (односторонний точный тест Фирашерат) позднего гены, зависящие от активности ответа (LRG), идентифицированные в исследованиях на мышах in vivo16 og нейронах in vitro17. LRG, специфичные для человека. g, t-hCO glútamatergískar taugafrumur voru marktækt uppstýrðar samanborið við hCO glútamatergískar taugafrumur (leiðrétt P <0,05, margföld breyting >2, að minnsta kosti 10%. Greining á genaaukningu snemma viðbragða (ERG) og seint viðbragða (einhliða Fisher's nákvæmnispróf) sem háð eru svörunarvirkni gena (LRG) sem greind voru í in vivo músum16 og in vitro taugafrumum.17 LRG sem eru sértæk fyrir menn.Punktalínan gefur til kynna Bonferroni-leiðrétt P gildi upp á 0,05. h, GluN genatjáning (sýndarpakkning og kvarðastærð hvers gens) var marktækt uppstýrð í snRNA-seq eftirmyndum af LRG genum í t-hCO glútamatergískum taugafrumum. i, ónæmislitun sem sýnir SCG2 tjáningu í t-hCO (efri) og hCO (neðri) taugafrumum. Hvítar örvar benda á SCG2+ frumur. Kvarðastika, 25 µm. Gögn eru gefin upp sem meðaltal ± staðalfrávik.
Byggt á aukinni virkni t-hCO sem sást í sneiðum utan líkama, sýndi snRNA-seq virkniháða uppstýringu á genaritunum í t-hCO samanborið við hCO in vitro. Glútamatergískar t-hCO taugafrumur tjáðu hærra magn gena sem stjórna seintvirkni (Mynd 2g,h), sem fundust í fyrri rannsóknum á músa- og manna taugafrumum16,17. Til dæmis sýndu BDNF18, SCG2 og OSTN, virknistýrandi gen sem er sértækt fyrir prímata, aukna tjáningu í t-hCO taugafrumum samanborið við hCO taugafrumur (Mynd 2g-i). Þannig sýndu t-hCO taugafrumur betri þroskaeiginleika samanborið við hCO taugafrumur samkvæmt umritunar-, formgerðar- og virknigreiningum.
Til að meta frekar tengsl þroska t-hCO við þroska heilans hjá mönnum, framkvæmdum við umritunarsamanburð á frumutýpum fósturs og fullorðinna frumugerða19,20 og fullorðinna21,22 sem og ítarlegar gögn um tjáningu gena í heilaberki23 meðan á þroska stóð (ítarlegri gögn, mynd 5). Með fyrri rannsóknum24 er heildarþroskastaða hCO og t-hCO umritunarfruma við 7-8 mánaða aðgreiningu í meginatriðum í samræmi við þroskatíma in vivo og jafngildir líklegast síðar á fósturskeiði (ítarlegri gögn, mynd 5a). Athyglisvert er að við sáum aukinn þroska umritunarfruma í t-hCO samanborið við hCO á sama aldri, sem og virkjun umritunarfruma tengda taugamótamyndun, stjörnumyndun og mýlingu taugafruma (ítarlegri gögn, mynd 5b-d). Á frumustigi fundum við vísbendingar um þynnri undirgerð heilaberkis í t-hCO, með klasa af glútamatergískum taugafrumum sem skarast við undirgerðir fullorðinna L2/3, L5 og L6 taugafrumna (mynd 1i). Aftur á móti var skörun klasa milli glútamatergískra t-hCO taugafrumna og fósturberkis taugafrumna takmörkuð um miðja meðgöngu (víkkuð gögn, mynd 5e-j). Til að ákvarða hvort t-hCO taugafrumur eru virknilega svipaðar nýberkis taugafrumum manna eftir fæðingu, framkvæmdum við rafgreiningar og líffærafræðilegar endurgerðir af L2/3 pýramída taugafrumum manna í skörpum sneiðum af fæðingarberki manna (víkkuð gögn, mynd 7a). Rafgreiningareiginleikar L2/3 pýramída taugafrumna voru svipaðir og hjá t-hCO pýramída taugafrumum (víkkuð gögn, mynd 7e). Formfræðilega voru L2/3 taugafrumur úr sýnum úr mönnum eftir fæðingu líkari t-hCO en hCO, þó að L2/3 frumur væru lengri, innihéldu fleiri greinar í heildina og hefðu meiri hryggþéttleika (mynd 3g og víkkuð gögn, mynd 7b-). G).
a, ígræðsla á hCO3 framleiddu af samanburðar- og TS hiPS frumulínum í nýfæddar rottur. b, þrívíddar endurgerð á bíósýtínfylltum t-hCO taugafrumum eftir 8 mánaða aðgreiningu. c, magnbundin ákvörðun á meðallengd taugafrumugreininga (n = 19 samanburðartaugafrumur, n = 21 TS taugafruma; **P = 0,0041). d, þrívíddarendurgerðar greinar úr samanburðarfrumum og TS t-hCO eftir 8 mánuði frá aðgreiningu og magnbundin ákvörðun á þéttleika hryggjarins (n ​​= 16 samanburðarfrumur, n = 21 TS taugafruma, ***P < 0,0001). d, þrívíddarendurgerðar greinar úr samanburðarfrumum og TS t-hCO eftir 8 mánuði frá aðgreiningu og magnbundin ákvörðun á þéttleika hryggjarins (n ​​= 16 samanburðarfrumur, n = 21 TS taugafruma, ***P < 0,0001). d, 3D-viðskiptareglur og TS t-hCO eru í 8 mánuði дендритных шипов (n = 16 контрольных нейронов, n = 21 TS нейронов, *** P <0,0001). d, þrívíddar endurgerð á greinum taugafrumum úr samanburðarhópi og t-hCO TS eftir 8 mánuði frá aðgreiningu og magnbundinni þéttleikamælingu á taugafrumum í taugafrumum (n = 16 samanburðarfrumur, n = 21 TS taugafruma, ***P < 0,0001). d，分化8 个月时对照和TS t-hCO 的3D 重建树突分支，以及树突棘密度的量n=1,6个对照神经元，n = 21 个TS 神经元，***P < 0,0001）。 d ， 分化 8 个 时 对照 和 ts t-hco 的 3d 重建 分支 分支 以及 树突棘 导度 1n 度 1n神经 元 ， n = 21 个 ts 神经 ， *** p <0,0001 ）。 d, 3D-viðskiptakerfi og TS t-hCO eru í 8 mánuði дендритных шипов (n = 16 контрольных нейронов, n = 21 TS нейронов, *** P <0,0001). d, þrívíddar endurgerð á greinum samanburðartaugafrumum og TS t-hCO eftir 8 mánuði frá aðgreiningu og magngreiningu á þéttleika taugafrumu í taugafrumum (n = 16 samanburðartaugafrumur, n = 21 TS taugafruma, ***P < 0,0001).Rauðar stjörnur gefa til kynna hugsanlega dendrítahryggi. e, sjálfsprottnar EPSC taugafrumur í samanburðar- og TS t-hCO taugafrumum eftir 8 mánaða aðgreiningu. f, uppsafnað tíðnigraf og magnbundin ákvörðun tíðni og sveifluvíddar taugamóta (n = 32 samanburðar taugafrumur, n = 26 TS taugafrumur; **P = 0,0076 og P = 0,8102). g, Scholl greining á TS og samanburðar taugafrumum í hCO og t-hCO. Strikaðar línur sýna píramídalaga taugafrumur úr L2/3 mönnum eftir fæðingu til samanburðar (n = 24 samanburðar t-hCO taugafrumur, n = 21 TS t-hCO taugafrumur, n = 8 samanburðar hCO taugafrumur og n = 7 TS hCO taugafrumur). Gögn eru gefin upp sem meðaltal ± staðalfrávik.
Hæfni t-hCO til að endurtaka formfræðilega og virknieiginleika taugafrumna í heilaberki manna á háu stigi hvatti okkur til að kanna hvort hægt væri að nota t-hCO til að greina sjúkdómsgerðir. Við einbeittum okkur að TS, alvarlegum taugaþroskaröskun sem orsakast af stökkbreytingum í geninu sem kóðar fyrir CaV1.2, sem hefst virkniháðrar genatjáningar í taugafrumum. Við fengum hCO frá þremur TS sjúklingum sem báru algengustu skiptinguna (p.G406R) og þremur samanburðarhópum (Mynd 3a). Eftir ígræðslu komumst við að því að formfræði griputauga var breytt í TS taugafrumum samanborið við samanburðarhóp (Mynd 3b og útvíkkuð gögn, Mynd 8a,b), með tvöfaldri aukningu á fjölda frumgriputauga og heildaraukningu á meðaltali og heildarlækkun á lengd griputauga (Mynd 3c og útvíkkuð gögn, Mynd 8c). Þetta tengdist aukinni þéttleika hryggjar og aukinni tíðni sjálfsprottinna EPSCs í TS samanborið við samanburðarhópa (Mynd 3d–f og útvíkkuð gögn, Mynd 8g). Frekari greining leiddi í ljós mynstur óeðlilegrar greiningar á gripulfrumum í t-hCO TS samanborið við samanburðarhóp, en ekki í in vitro TS hCO á svipuðu stigi aðgreiningar (Mynd 3g). Þetta er í samræmi við fyrri skýrslur okkar um virkniháða rýrnun gripulfrumu í TS og undirstrikar getu þessa ígræðsluvettvangs til að greina sjúkdómsgerðir in vivo.
Við spurðum síðan að hve miklu leyti t-hCO frumur væru virkir hluti af S1 rottna. S1 í nagdýrum fær sterk taugaboð frá kjarna þalamus í sama hlið, bæði kvið og aftari, sem og frá hreyfi- og annars stigs líkamsskynjunarberki í sama hlið, og frá hinum gagnstæða S1 (Mynd 4a). Til að endurheimta taugaboðmynstrið smituðum við hCO með hundaæðisveirunni dG-GFP/AAV-G og græddum hCO í S1 rottuna 3 dögum síðar. Við sáum þétta GFP tjáningu í taugafrumum í S1 í sama hlið og kvið og kvið, 7–14 dögum eftir ígræðslu (Mynd 4b, c). Að auki leiddi mótefnalitun á þalamusmerkinu netrín G1 í ljós nærveru þalamusenda í t-hCO (Mynd 4d, e). Til að meta hvort þessar frálægu vörpun gætu kallað fram taugaboð í t-hCO frumum, framkvæmdum við heilfrumuupptökur úr mannafrumum í hvössum hlutum af þalamusberkislaginu. Rafmagnsörvun á S1 í rottum, innri hylki, hvítu efni, trefjum nálægt t-hCO eða ljósfræðileg virkjun á opsín-tjáandi þalamusendum í t-hCO örvuðum stuttum leyndar EPSCs í t-hCO taugafrumum sem verða fyrir AMPA viðtakablokkanum NBQX. (Mynd 4f, g og ítarlegri gögn, mynd 9a–g). Þessi gögn sýna að t-hCO er líffærafræðilega samþætt í rottuheila og getur verið virkjað af vefjum rottna.
a, Skýringarmynd af tilraun með hundaæðismælingar. b, GFP og mannsértæk STEM121 tjáning milli t-hCO og heilaberki rotta (efri hluti). Einnig er sýnd GFP tjáning í samhliða ventral basal nucleus (VB) rotta (neðst til vinstri) og samhliða S1 (neðst til hægri). Kvarðastika, 50 µm. Rauðu ferningarnir tákna svæðin í heilanum þar sem myndirnar voru teknar. c, magngreining frumna sem tjá GFP (n = 4 rottur). d, e — Netrin G1+ þalamusenda í t-hCO. d sýnir kransæðasnið sem inniheldur t-hCO og VB kjarna. Kvarðastika, 2 mm. e sýnir Netrin G1 og STEM121 tjáningu í t-hCO (vinstri) og VB (hægri) taugafrumum. Kvarðastika, 50 µm. Appelsínugula punktalínan gefur til kynna t-hCO mörkin. f, g, Núverandi ummerki um t-hCO taugafrumna eftir raförvun í S1 rottu (f) eða innri hylki (g), með (fjólubláum) eða án (svörtum) NBQX (vinstri). EPSC sveifluvídd með og án NBQX (n = 6 S1 taugafrumur, *P = 0,0119; og n = 6 innri hylki taugafrumur, **P = 0,0022) (miðja). Hlutfall t-hCO taugafrumna sem sýna EPSC sem svar við raförvun í S1 rottu (f) eða innri hylki (g) (hægri). aCSF, gervi heila- og mænuvökvi. h, skýringarmynd af 2P myndgreiningartilrauninni (vinstri). Tjáning GCaMP6 í t-hCO (miðja). Kvarðastika, 100 µm. Flúrljómunartímabil GCaMP6 (hægri). i, Z-stig fyrir sjálfsprottna flúrljómun. j, skýringarmynd af yfirvaraskeggsörvun. k, z-stigaðar 2P flúrljómunarferlar í einni tilraun, í samræmi við frávik sjónhimnunnar við tíma núll (brotin lína) í dæmifrumum. l, meðaltal z-stigs svörunar allra frumna í samræmi við frávik sjónhimnunnar við tíma núll (brotin lína) (rauð) eða handahófskennd tímastimplar (grár). m. Skýringarmynd af tilrauninni með ljósfræðilega merkingu. n, Óunnar spennukúrfur frá dæmi um t-hCO frumu við bláa leysigeislaörvun eða frávik sjónhimnunnar. Rauðar örvar gefa til kynna fyrstu toppana af völdum ljóss (efst) eða af völdum fráviks sjónhimnunnar (neðst). Grár skuggi gefur til kynna tímabil fráviks sjónhimnunnar. o, Hámarksljósbylgjuform og svör við fráviki sjónhimnunnar. p, toppar í einni tilraun, í samræmi við frávik sjónhimnunnar í frumum dæmisins. 0 gefur til kynna frávik sjónhimnunnar (brotin lína). q, meðaltal z-stigs skothríðar fyrir allar ljósnæmar frumur í þýði, í samræmi við frávik sjónhimnunnar við tíma núll (brotin lína) (rauð) eða handahófskennd tímastimplar (grár). r, Hlutfall ljósnæmra eininga sem eru marktækt mótuð af fráviki skörðs (n = 3 rottur) (vinstri). Hámarks z-stigseinkun (n = 3 rottur; n = 5 (ljósgrænt), n = 4 (dökkgrænt) og n = 4 (blágrænt) skörðssveiflumótunareiningar á rottu) (hægri). Gögn eru gefin upp sem meðaltal ± staðalfrávik.
Við spurðum síðan hvort hægt væri að virkja t-hCO með skynjunarörvun in vivo. Við græddum hCO sem tjáði erfðabreyttu kalsíumvísana GCaMP6 í S1 rottur. Eftir 150 daga framkvæmdum við trefjaljósmælingar eða tveggja ljóseinda kalsíummyndgreiningu (Mynd 4h og útvíkkuð gögn, Mynd 10a). Við komumst að því að t-hCO frumur sýndu samstillta taktfasta virkni (Mynd 4i, Útvíkkuð gögn, Mynd 10b og Viðbótarmyndband 1). Til að lýsa hámarks t-hCO virkni framkvæmdum við utanfrumu rafgreiningar í svæfðum ígræðslurottum (útvíkkuð gögn, Mynd 10c-f). Við höfum búið til staðbundin hnit úr segulómunarmyndum; þannig tákna þessar skráðu einingar hugsanlegar taugafrumur úr mönnum, þó að rafgreining ein og sér leyfi ekki að ákvarða uppruna tegundar. Við sáum samstilltar virknisbylgjur (útvíkkuð gögn, Mynd 10d). Skothríðin stóðu yfir í um 460 ms og aðskildar voru með þögnartímum sem stóðu yfir í um 2 sekúndur (útvíkkuð gögn, mynd 10d, e). Einstakar einingar skutu að meðaltali um þrjár skothríð í hverri skothríð, sem er um það bil 73% af skráðum einingum í hverri skothríð. Virkni einstakra eininga var mjög fylgnileg og þessi fylgni var hærri en hjá einingum sem greindar voru í óbólusettum dýrum sem skráð voru við sömu aðstæður (útvíkkuð gögn, mynd 10f). Til að lýsa frekar viðbrögðum við toppum greindra taugafrumna úr mönnum, framkvæmdum við ljósmerkingartilraunir á svæfðum rottum sem höfðu fengið hCO3 sem tjáir ljósnæma katjónaganginn rhodopsin 2 (hChR2), þar sem t-hCO3 taugafrumur greina stutta seinkun (minna en 10 ms) við bláu ljósörvun (mynd 4m–o). Taugafrumur í t-hCO sýndu hraðar sjálfsprottnar virknir við svipaða tíðni og sést í kalsíummyndgreiningu, sem og í rafgreiningarlegum skráningum sem framkvæmdar voru í t-hCO án ljósmerkingar (útvíkkuð gögn, mynd 10c-g). Engin sjálfsprottin virkni sást í samsvarandi stigum hCO sem skráð voru in vitro. Til að meta hvort t-hCO gæti virkjast með skynjunarörvun, beygðum við rottukúlurnar stuttlega frá t-hCO (mynd 4j,m og útvíkkuð gögn, mynd 10h,k). Samkvæmt fyrri rannsóknum8,10 sýndi undirhópur af t-hCO frumum aukna virkni sem svar við víggirðingu, sem sást ekki þegar gögnin voru borin saman við handahófskenndar tímastimpla (mynd 4k–q og útvíkkuð gögn, mynd 10h–q). Reyndar sýndu um 54% af ljósfræðilega merktum einingum marktækt aukna örvunartíðni eftir víggirðingarörvun, sem náði hámarki við um 650 ms (mynd 4r). Samanlagt benda þessi gögn til þess að t-hCO fái viðeigandi virkni og geti verið virkjað af umhverfisörvun.
Við könnuðum síðan hvort t-hCO gæti virkjað frumurásir í rottum til að stjórna hegðun. Við könnuðum fyrst hvort taugasímar t-hCO taugafrumna teygja sig út í nærliggjandi vefi rottunnar. Við smituðum hCO með lentiveiru sem kóðar fyrir hChR2 samruna við EYFP (hChR2-EYFP). Eftir 110 daga sáum við EYFP tjáningu í samhliða heilaberki, þar á meðal heyrnar-, hreyfi- og líkamsheilaberki, sem og í undirheilaberki, þar á meðal ráki, dreka og stúku (Mynd 5a). Til að meta hvort þessar frásogsfrumur gætu kallað fram taugamót í rottufrumum, virkjuðum við sjónrænt t-hCO frumur sem tjá hChR2-EYFP með því að skrá heilaberkifrumur úr rottum í skarpa hluta heilans. Virkjun t-hCO taugasíma með bláu ljósi framkallaði stutta leynd EPSCs í pýramídalaga heilaberki taugafrumum úr rottum, sem voru blokkaðar af NBQX (Myndir 5b–g). Að auki gætu þessi svör verið blokkuð af tetrodotoxin (TTX) og endurheimt af 4-aminopyridine (4-AP), sem bendir til þess að þau séu af völdum einsynapískra tenginga (Mynd 5e).
a, Skýringarmynd af taugasímamælingum (vinstri). t-hCO EYFP tjáning (hægri). Kvarðastika, 100 µm. A1, heyrnarbörkur, ACC, fremri hringlaga börkur, d. striatum, dorsal striatum, HPC, hippocampus; þind, hliðlægur skilrúm, mPFC, miðlægur framheilabörkur, piri, piriform börkur, v. striatum, ventral striatum, VPM, ventropostomedial kjarni stúku, VTA, ventral tegmental svæðið. Rauðu ferningarnir tákna svæðin í heilanum þar sem myndirnar voru teknar. b, Skýringarmynd af örvunartilrauninni. c, d, Dæmi um svörun blás ljósstraums (efst) og spennu (neðst) í EYFP+ t-hCO frumum hjá mönnum eða (c) EYFP+ frumum úr rottum (d). e, f, Núverandi ummerki um rottutaugafrumur eftir örvun með bláu ljósi á t-hCO taugasímum með TTX og 4-AR (grænt), TTX (grátt) eða aCSF (svart) (e), með (fjólubláu) eða án (svarts)) NBQX (e). g, seinkun svörunar sem bláu ljósi veldur í rottufrumum (n = 16 frumur); láréttir súlur gefa til kynna meðalseinkun (7,13 ms) (vinstra megin). Sviðsmynd ljósframkallaðra EPSC frumna skráðra með eða án NBQX (n = 7 frumur; ***P < 0,0001) (miðja). Sviðsmynd ljósframkallaðra EPSC frumna skráðra með eða án NBQX (n = 7 frumur; ***P < 0,0001) (miðja). Амплитуда вызванных светом EPSC, зарегистрированных с или без NBQX (n = 7 клеток; ***P <0,0001) (í senn). Sviðsstærð ljósframkallaðra EPSC-frumna skráðra með eða án NBQX (n = 7 frumur; ***P < 0,0001) (miðja).使用或不使用NBQX 记录的光诱发EPSC 的振幅（n = 7 个细胞；***P < 0,0001）（中）。使用或不使用NBQX 记录的光诱发EPSC 的振幅（n = 7 个细胞；***P < 0,0001）（中）。 Амплитуда вызванных светом EPSC, зарегистрированных с или без NBQX (n = 7 клеток; ***P <0,0001) (í senn). Sviðsstærð ljósframkallaðra EPSC-frumna skráðra með eða án NBQX (n = 7 frumur; ***P < 0,0001) (miðja).Hlutfall rottufrumum sem sýna EPSCs sem bregðast við bláu ljósi (hægra megin). h, Skýringarmynd af hegðunarverkefni. d0, dagur 0. i. Frammistaða fyrirmyndardýra á degi 1 (vinstra megin) eða degi 15 (hægra megin) þjálfunar. Meðalfjöldi sleikja sem framkvæmdir voru á degi 1 (vinstri) eða degi 15 (hægri í miðjunni) (n = 150 tilraunir með bláu ljósi, n = 150 tilraunir með rauðu ljósi; ***P < 0,0001). Meðalfjöldi sleikja sem framkvæmdir voru á degi 1 (vinstri) eða degi 15 (hægri í miðjunni) (n = 150 tilraunir með bláu ljósi, n = 150 tilraunir með rauðu ljósi; ***P < 0,0001). Среднее количество облизываний, выполненных в день 1 (слева) eða день 15 (with центре справа) (n = 150 árstíðir, слева) n = 150 испытаний с красным светом ***P <0,0001). Meðalfjöldi sleikja sem framkvæmdir voru á degi 1 (vinstri) eða degi 15 (miðja hægra megin) (n = 150 tilraunir með bláu ljósi, n = 150 tilraunir með rauðu ljósi; ***P < 0,0001).第1 天（左）或第15 天（右中）执行的平均舔次数（n = 150 次蓝光试验,150n = 150.次红光试验；***P < 0,0001）.第1 天（左）或第15 天（右中）执行的平均舔次数（n = 150 次蓝光试验,150n = 150.次红光试验；***P < 0,001 Среднее количество облизываний, выполненных в день 1 (слева) eða день 15 (with центре справа) (n = 150 árstíðir, слева) n = 150 испытаний с красным светом ***P <0,0001). Meðalfjöldi sleikja sem framkvæmdir voru á degi 1 (vinstri) eða degi 15 (miðja hægra megin) (n = 150 tilraunir með bláu ljósi, n = 150 tilraunir með rauðu ljósi; ***P < 0,0001).Uppsafnaðar sleikjur fyrir rauða og bláa ljóstilraunir á degi 1 (miðja vinstra megin) eða degi 15 (hægra megin). NS, ekki marktækt. j,k, Hegðunareinkenni allra dýra sem voru grædd með t-hCO sem tjáði hChR2-EYFP (j) eða samanburðarflúorófór (k) á degi 1 eða 15 (hChR2-EYFP: n = 9 rottur, ** P = 0,0049; samanburður: n = 9, P = 0,1497). l, Þróun ákjósanleikastigs (n = 9 hChR2, n = 9 í samanburðarhópi; **P < 0,001, ***P < 0,0001). l, Þróun ákjósanleikastigs (n = 9 hChR2, n = 9 í samanburðarhópi; **P < 0,001, ***P < 0,0001). l, Эволюция показателя предпочтения (n = 9 hChR2, n = 9 контрольных; **P <0,001, ***P <0,0001). l, Þróun ákjósanleikastigs (n = 9 hChR2, n = 9 samanburðarhópar; **P < 0,001, ***P < 0,0001). l，偏好评分的演变（n = 9 hChR2，n = 9 对照；**P < 0,001，***P < 0,0001）。 l，偏好评分的演变（n = 9 hChR2，n = 9 对照；**P < 0,001，***P < 0,0001）。 l, Эволюция показателей предпочтения (n = 9 hChR2, n = 9 контролей; **P <0,001, ***P <0,0001). l, Þróun ákjósanlegra skora (n = 9 hChR2, n = 9 samanburðarhópar; **P < 0,001, ***P < 0,0001).m, FOS tjáning sem svar við ljósfræðilegri virkjun t-hCO í S1. Myndir af FOS tjáningu (vinstri) og magngreiningu (n = 3 í hverjum hópi; *P < 0,05, **P < 0,01 og ***P < 0,001) (hægri) eru sýndar. Myndir af FOS tjáningu (vinstri) og magngreiningu (n = 3 í hverjum hópi; *P < 0,05, **P < 0,01 og ***P < 0,001) (hægri) eru sýndar. Показаны изображения экспрессии FOS (слева) и количественного определения (n = 3 á leik; * P <0,05, <01 ** P <0,***) (sjálfsögð). Myndir af FOS tjáningu (vinstri) og magngreiningu (n = 3 í hverjum hópi; *P < 0,05, **P < 0,01 og ***P < 0,001) eru sýndar (hægri).显示了FOS 表达（左）和量化（每组n = 3；*P < 0.05、**P < 0.01 和***P < 0.001）（像〳）（像〳）显示了FOS 表达（左）和量化（每组n = 3；*P < 0.05、**P < 0.01 和***P < 0.001）（像〳）（像〳） Показаны изображения экспрессии FOS (слева) и количественного определения (n = 3 á leik; * P <0,05, <01 ** P <0,***) (sjálfsögð). Myndir af FOS tjáningu (vinstri) og magngreiningu (n = 3 í hverjum hópi; *P < 0,05, **P < 0,01 og ***P < 0,001) eru sýndar (hægri).Kvarðastika, 100 µm. Gögn eru gefin upp sem meðaltal ± staðalvilla fyrir BLA, basolateral tonsils, MDT, dorsomedial thalamic nucleus, PAG, periaqueductal grey.
Að lokum spurðum við hvort t-hCO gæti haft áhrif á hegðun rotta. Til að prófa þetta græddum við hChR2-EYFP-tjáandi hCO í S1 og 90 dögum síðar græddum við ljósleiðara í t-hCO til að gefa ljós. Við þjálfuðum síðan rotturnar með breyttri virkri skilyrðingaraðferð (Mynd 5h). Við settum dýrin í atferlisprófunarklefa og beitum af handahófi 5 sekúndna bláum (473 nm) og rauðum (635 nm) leysiörvum. Dýrin fengu vatnsverðlaun ef þau sleiktu við örvun með bláu ljósi en ekki við örvun með rauðu ljósi. Á fyrsta degi þjálfunarinnar sýndu dýrin engan mun á sleikingu þegar þau voru örvuð með bláu eða rauðu ljósi. Hins vegar, á degi 15, sýndu dýr sem voru grædd með hCO-tjáandi hChR2-EYFP virkari sleikingu þegar þau voru örvuð með bláu ljósi samanborið við örvun með rauðu ljósi. Þessar breytingar á sleikhegðun sáust ekki hjá samanburðardýrum sem fengu hCO sem tjáði samanburðarflúorófórann (námsárangurshlutfall: hChR2 89%, EYFP 0%, mynd 5i-1 og viðbótarmyndband 2). Þessi gögn benda til þess að t-hCO frumur geti virkjað rottutaugafrumur til að örva umbunarhegðun. Til að komast að því hvaða t-hCO taugarásir í rottum gætu átt þátt í þessum hegðunarbreytingum virkjuðum við t-hCO ljósfræðilega í þjálfuðum dýrum og tekin vefi 90 mínútum síðar. Ónæmisvefjaefnafræði leiddi í ljós tjáningu virkniháðs FOS próteins í nokkrum heilasvæðum sem taka þátt í hvatningu í hegðun, þar á meðal miðlægum framheilabörk, miðlægum stúku og gráa efninu í kringum höfði, sem var tjáð annað hvort í óörvuðum samanburðardýrum eða í dýrum. hrísgrjón. 5m). Samanlagt benda þessi gögn til þess að t-hCO geti haft áhrif á virkni rottutaugafrumunnar til að knýja áfram hegðun.
Taugafrumur eru efnilegt kerfi til að rannsaka þroska og sjúkdóma manna in vitro, en þær eru takmarkaðar af skorti á tengingum milli taugahringrása sem eru til staðar in vivo. Við höfum þróað nýjan vettvang þar sem við græddum hCO í S1 úr rottum með skerta ónæmiskerfi fyrir fæðingu til að rannsaka þroska og virkni mannsfrumna in vivo. Við höfum sýnt fram á að t-hCO þróar þroskaðar frumugerðir sem ekki sjást in vitro28 og að t-hCO er líffærafræðilega og virknilega samþætt heila nagdýra. Samþætting t-hCO í taugahringrás nagdýra gerði okkur kleift að koma á tengslum milli frumuvirkni manna og rannsakaðrar hegðunar dýra, sem sýnir að t-hCO taugafrumur geta stjórnað taugavirkni rotta til að knýja áfram hegðunarviðbrögð.
Vettvangurinn sem við lýsum hefur nokkra kosti umfram fyrri rannsóknir á ígræðslu mannafruma í heila nagdýra. Í fyrsta lagi ígræddum við hCO3 í þroskaða heilaberki rotta á snemmbúnum aldri, sem gæti auðveldað líffærafræðilega og virknilega samþættingu. Í öðru lagi gerði t-hCO3 segulómun okkur kleift að rannsaka staðsetningu og vöxt ígræðslu í lifandi dýrum, sem gerir okkur kleift að framkvæma langtímarannsóknir á mörgum dýrum og staðfesta áreiðanleika nokkurra hiPS frumulína. Að lokum ígræddum við heil líffæri frekar en einangraðar stakar frumusviflausnir, sem eru minna skaðlegar fyrir mannsfrumur og geta stuðlað að samþættingu og myndun taugafrumna í heila rotta.
Við viðurkennum að þrátt fyrir framfarir á þessu sviði koma takmarkanir á tíma, rúmi og tegundum í veg fyrir myndun taugahringrása hjá mönnum með mikilli nákvæmni, jafnvel eftir ígræðslu á frumstigi þroska. Til dæmis er ekki ljóst hvort sjálfsprottna virknin sem sést í t-hCO táknar þroskasvipgerð svipaða og taktfasta virkni sem sést við heilaberkiþroska, eða hvort hún stafar af fjarveru bælandi frumugerða í t-hCO. Á sama hátt er ekki ljóst í hvaða mæli fjarvera lagskipta í t-hCO hefur áhrif á keðjutengingu30. Framtíðarvinna mun einbeita sér að því að samþætta aðrar frumugerðir eins og örgliufrumur hjá mönnum, æðaþelsfrumur hjá mönnum og mismunandi hlutföll GABAergic millitaugafrumna eins og sýnt er með samsetningu 6 in vitro, sem og að skilja hvernig taugasamþætting og vinnsla getur átt sér stað í breyttum t-hCO umritunar-, taugamóta- og hegðunarstigum í frumum sem fengnar eru frá sjúklingum.
Í heildina er þessi in vivo vettvangur öflug auðlind sem getur bætt við in vitro rannsóknir á þroska og sjúkdómum í heila manna. Við gerum ráð fyrir að þessi vettvangur muni gera okkur kleift að uppgötva nýjar svipgerðir á þráðstigi í annars torsóttum frumum frá sjúklingum og prófa nýjar meðferðaraðferðir.
Við mynduðum hCO2.5 úr HiPS frumum eins og áður hefur verið lýst. Til að hefja hCO framleiðslu úr hiPS frumum sem ræktaðar voru á fóðrunarlögum voru óskemmdar nýlendur af hiPS frumum fjarlægðar úr ræktunarskálum með dispasa (0,35 mg/ml) og fluttar í plastræktanir með mjög lágum viðloðunarhraða sem innihéldu skálar með hiPS frumuræktunarmiðli (Corning) bætt við tveimur SMAD hemlum, dorsomorphini (5 μM; P5499, Sigma-Aldrich) og SB-431542 (10 μM; 1614, Tocris) og ROCK hemli Y-27632 (10 μM; S1049, Selleckchem). Fyrstu 5 dagana var hiPS frumumiðlinum skipt út daglega og dorsomorphini og SB-431542 bætt við. Á sjötta degi í blöndunni voru taugakúlurnar fluttar í taugamiðil sem innihélt neurobasal-A (10888, Life Technologies), B-27 fæðubótarefni án A-vítamíns (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies), penisillín og streptómýsín (1:100, Life Technologies) og bætt við með epidermal growth factor (EGF; 20 ng ml−1; R&D Systems) og fibroblast growth factor 2 (FGF2; 20 ng ml−1; R&D Systems) þar til 24. dags. Frá 25. degi til 42. dags var miðlinum bætt við með heilaafleiddum taugakvillaþætti (BDNF; 20 ng ml−1, Peprotech) og taugakrófíni 3 (NT3; 20 ng ml−1; Peprotech) með miðilsskiptum annan hvern dag. Á sjötta degi í blöndunni voru taugakúlurnar fluttar í taugamiðil sem innihélt neurobasal-A (10888, Life Technologies), B-27 fæðubótarefni án A-vítamíns (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies), penisillín og streptómýsín (1:100, Life Technologies) og bætt við með epidermal growth factor (EGF; 20 ng ml−1; R&D Systems) og fibroblast growth factor 2 (FGF2; 20 ng ml−1; R&D Systems) þar til 24. dags. Frá 25. degi til 42. dags var miðlinum bætt við með heilaafleiddum taugakvillaþætti (BDNF; 20 ng ml−1, Peprotech) og taugakrófíni 3 (NT3; 20 ng ml−1; Peprotech) með miðilsskiptum annan hvern dag.Á sjötta degi í sviflausninni voru taugakúlurnar fluttar í taugamiðil sem innihélt Neurobasal-A (10888, Life Technologies), B-27 fæðubótarefni án A-vítamíns (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies) og penisillín.и стрептомицин (1:100, Life Technologies) og дополнены эпидермальным фактором роста (EGF; 20 нг/мл; R&D Systems) og факторофи робста20F; нг/мл; R&D Systems) til 24-го дня. og streptómýcíni (1:100, Life Technologies) og bætt við vaxtarþætti húðþekju (EGF; 20 ng/ml; R&D Systems) og vaxtarþætti vefjasöfnunar 2 (FGF2; 20 ng/ml; R&D Systems) þar til 24. dags.Frá dögum 25 til 42 var taugakvillaþáttur, sem unninn er úr heila (BDNF; 20 ng ml-1, Peprotech) og taugakvilla 3 (NT3; 20 ng ml-1, Peprotech) bætt við ræktunarvökvann, og var skipt um ræktunarvökva annan hvern dag.在悬浮的第6 天，将神经球体转移到含有neurobasal-A（10888，Life Technologies）、不含维生焠B-27生焠补充剂（12587，Life Technologies）、GlutaMax（1:100，Life Technologies）、青霉素的神经培养基丠和瓼，1瓾霉:链霉Tækni）并辅以表皮生长因子（EGF；20 ng ml-1；R&D Systems）和成纤维细胞生长因子2（FGF2；20 ng ml-1；R&D Systems）直至第24 天。在 悬浮 的 第 第 6 天 将 神经 球体 转移 含有 含有 neurobasal-a （10888 ， Life Technologies０ 焟 縻b-27 补充剂 （12587 ， Life Technologies） Glutamax （1: 100 ， Life TechNOGIS青霉素 的 祴经 培养 基 中（链霉（，霉）（链霉:0 Tækni） 表皮 生长 因子 （（（20 ng ml-1 ； r & d Systems） 成 纤维 细胞 生长 2 （fgf2 ； 20 ng ml- 1；R&D Systems）詞笛24Ｓ Á 6-й день суспензии нейросферы были переведены на добавку, содержащую нейробазал-А (10888, Life Technologies), добна-27, добававку А (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies), пенициллин- нейтрализованный стрептомицин (1:100, Life Technologies) с добавлениемо фальпицин (EGF; 20 нг мл-1; R&D Systems) og фактора роста фибробластов 2 (FGF2; 20 нг ml-1) 1; Á 6. degi var taugakúlusviflausnunum skipt yfir í fæðubótarefni sem innihélt taugabasal-A (10888, Life Technologies), B-27 fæðubótarefni án A-vítamíns (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies), penisillín-hlutleyst streptómýsín (1:100, Life Technologies) bætt við húðþekjuvaxtarþætti (EGF; 20 ng ml-1; R&D Systems) og bandvefsfrumuvaxtarþætti 2 (FGF2; 20 ng ml-1)1; R&D Systems) til 24-gó дня. R&D kerfi) til 24. dags.Frá dögum 25 til 42 var taugafrumuvöxtur, unninn úr heila (BDNF; 20 ng ml-1, Peprotech) og taugafrumuvöxtur 3 (NT3; 20 ng ml-1, Peprotech) bætt við ræktunarvökvann annan hvern dag. Skipt var um ræktunarvökva einu sinni.Frá og með degi 43 var hCO3 viðhaldið í óbættu taugabasal-A miðli (NM; 1088022, Thermo Fisher) með miðilsskiptum á 4–6 daga fresti. Til að fá hCO3 úr hiPS frumum sem ræktaðar voru án fóðrunar voru hiPS frumurnar ræktaðar með Accutase (AT-104, Innovate Cell Technologies) við 37°C í 7 mínútur, sundraðar í stakar frumur og settar á AggreWell 800 plötur (34815, STEMCELL Technologies) við þéttleika 3 × 106 stakar frumur í hverjum brunni í Essential 8 miðli bætt við ROCK hemilinn Y-27632 (10 μM; S1049, Selleckchem). Eftir 24 klukkustundir voru miðlarnir í brunnunum pípettaðir upp og niður í miðla sem innihéldu Essential 6 miðla (A1516401, Life Technologies) bætt við dorsomorfíni (2,5 μM; P5499, Sigma-Aldrich) og SB-431542 (10 μM; 1614). , Tocrida). Frá 2. til 6. degi var Essential 6 miðlanum skipt út daglega fyrir dorsomorfín og viðbótina SB-431542. Frá sjötta degi voru taugakúlusviflausnirnar fluttar yfir í taugagrunnsmiðilinn og viðhaldið eins og lýst er hér að ofan.
Allar dýraaðgerðir voru framkvæmdar í samræmi við dýraumhirðuleiðbeiningar sem samþykktar voru af stjórnsýslunefnd Stanford-háskóla um dýraathvarf (APLAC). Þungaðar, ófrískar RNU (rnu/+) rottur voru keyptar (Charles River Laboratories) eða hýstar. Dýrunum var haldið í 12 klukkustunda ljós-myrkur hringrás með fóður og vatni að vild. Naktir (FOXN1–/–) rottuungar á aldrinum þriggja til sjö daga voru greindir með vexti óþroskaðra skeggja áður en þeir voru aflífaðir. Hvolparnir (karlkyns og kvenkyns) voru svæfðir með 2-3% ísóflúrani og settir á stereotaxískan ramma. Höfuðkúpuskurður með þvermál um það bil 2-3 mm fyrir ofan S1 var framkvæmdur, á meðan heilleiki hörðu húðarinnar var viðhaldið. Síðan var notuð 30-G nál (um það bil 0,3 mm) rétt fyrir utan höfuðkúpuskurðinn til að stinga í gegnum hörðu húðina. Síðan var HCO3 sett á þunna 3×3 cm parafilmu og umfram miðil fjarlægður. Notið Hamilton sprautu sem er fest við 23 G, 45° nál, dragið varlega hCO3 í ysta enda nálarinnar. Setjið síðan sprautuna á sprautudæluna sem er tengd við stereotaxic tækið. Setjið síðan nálaroddinn yfir áður gert 0,3 mm breitt gat í hörðu ...
Allar dýraaðgerðir voru framkvæmdar í samræmi við dýraumhirðuleiðbeiningar sem Stanford-háskóli hefur samþykkt og APLAC hefur samþykkt. Rottur (eldri en 60 dögum eftir ígræðslu) voru svæfðar með 5% ísóflúrani og svæfðar með 1-3% ísóflúrani meðan á myndgreiningu stóð. Til sjónrænnar skoðunar var notaður 7 Tesla virkt varinn láréttur borholuskanni frá Bruker (Bruker Corp.) með halladrif frá International Electric Company (IECO), varinn halladíski með innra þvermál 120 mm (600 mT/m, 1000 T/m/s) með AVANCE. III, átta rása fjölspólu RF og fjölkjarna getu og meðfylgjandi Paravision 6.0.1 kerfi. Upptökur voru framkvæmdar með virkt aftengdri rúmmáls RF spólu með innra þvermál 86 mm og fjögurra rása frostkældri RF spólu eingöngu til móttöku. Axial 2D Turbo-RARE (endurtekningartími = 2500 ms, bergmálstími = 33 ms, 2 meðaltöl) með 16 sneiðatökum, sneiðþykkt 0,6–0,8 mm, sem innihélt 256 × 256 sýni. Merkin voru móttekin með rúmmáls RF spólu með ferhyrningslaga senditæki og innra þvermál 2 cm (Rapid MR International, LLC). Að lokum var innbyggða Imaris (BitPlane) yfirborðsmatsaðgerðirnar notaðar fyrir þrívíddarmyndun og rúmmálsgreiningu. Vel heppnuð ígræðsla var skilgreind sem sú þar sem svæði með samfelldu T2-vegnu segulómunarmerki mynduðust í ígrædda heilahvelinu. Höfnun ígræðslu var skilgreind sem ígræðsla sem framleiddi ekki svæði með samfelldu T2-vegnu segulómunarmerki í ígrædda heilahvelinu. Undirberki t-hCO var útilokað frá síðari greiningu.
Til að tjá GCaMP6s stöðugt í hCO3 fyrir tveggja-fótóna kalsíummyndgreiningu voru hiPS frumur smitaðar með pLV[Exp]-EF1a::GcaMP6s-WPRE-Puro og síðan valið sýklalyf. Í stuttu máli voru frumurnar aðskildar með EDTA og settar í sviflausn í 1 ml af Essential 8 miðli við um það bil 300.000 frumur í viðurvist pólýbrens (5 µg/ml) og 15 µl af veiru. Frumurnar voru síðan ræktaðar í sviflausn í 60 mínútur og sáðar við 50.000 frumur í hverjum brunni. Eftir samrennsli voru frumurnar meðhöndlaðar með 5-10 µg ml-1 af púrómýsíni í 5-10 daga eða þar til stöðugar nýlendur komu fram. Bráð hCO3 sýking var framkvæmd eins og áður hefur verið lýst5 með nokkrum breytingum. Í stuttu máli var hCO3 flutt á 30-45 dögum í 1,5 ml Eppendorf örskiljunarrör sem innihéldu 100 µl af taugamiðli. Síðan eru um það bil 90 µl af miðlinum fjarlægð, 3-6 µl af lentiveiru með háum títra (frá 0,5 x 108 til 1,2 x 109) bætt í rörið og hCO3 flutt í ræktunarofninn í 30 mínútur. Bætið síðan 90–100 µl af miðli í hvert rör og setjið rörin aftur í ræktunarofninn yfir nótt. Daginn eftir er hCO3 flutt yfir í ferskt taugamiðil í plötum með lágum festingarhraða. Eftir 7 daga var hCO3 flutt yfir á 24 hols glerbotnplötur til að sjá og meta gæði sýkingarinnar. pLV[Exp]-SYN1::EYFP-WPRE og pLV[Exp]-SYN1::hChR2-EYFP-WPRE voru búin til með VectorBuilder. Lentiveiran er notuð í flestum tilraunum vegna þess að hún er samþætt erfðamengi hýsilsins, sem gerir kleift að tjá fréttagen í sýktum frumulínum. Til eftirfylgni með hundaæði var hCO smitað samhliða með hundaæði-ΔG-eGFP og AAV-DJ-EF1a-CVS-G-WPRE-pGHpA (plasmíði #67528, Addgene) á 30-45 dögum, þvegið vandlega í 3 daga og grætt í rottur í S1 og haldið in vivo í 7-14 daga.
Fyrir ónæmisfrumuefnafræði voru dýrin svæfð og gegndreypt með PBS í gegnum hjartað og síðan gefið 4% paraformaldehýð (PFA í PBS; Electron Microscopy Sciences). Heilinn var festur í 4% PFA í 2 klukkustundir eða yfir nótt við 4°C, frystur í 30% súkrósa í PBS í 48-72 klukkustundir og síðan innfelldur í 1:1, 30% súkrósa: OCT (Tissue-Tek OCT Compound 4583, Sakura Finetek) og kransæðasneiðar voru gerðar við 30 µm með frystibúnaði (Leica). Fyrir ónæmisvefjaefnafræði á þykkum sneiðum voru dýrin gegndreypt með PBS og heilinn var krufinn og skorinn í kransæðar við 300–400 µm með titringsmæli (Leica) og sneiðarnar voru festar með 4% PFA í 30 mínútur. Síðan voru frostskurðir eða þykkir sneiðar þvegnir með PBS, blokkaðir í 1 klukkustund við stofuhita (10% venjulegt asnasermi (NDS) og 0,3% Triton X-100 þynnt í PBS) og blokkaðir með blokkunarlausn við 4°C. – Ræktun Frostskurðirnir voru ræktaðir yfir nótt og þykkir sneiðar voru ræktaðir í 5 daga. Helstu mótefni sem notuð voru voru: anti-NeuN (mús, 1:500; ab104224, abcam) anti-CTIP2 (rotta, 1:300; ab18465, abcam), anti-GFAP (kanína, 1:1.000; Z0334, Dako), anti-GFP (kjúklingur, 1:1.000; GTX13970, GeneTex), anti-HNA (mús, 1:200; ab191181, abcam), anti-NeuN (kanína, 1:500; ABN78, Millipore), anti-PDGFRA (kanína, 1:200; sc-338, Santa Cruz), anti-PPP1R17 (kanína, 1:200; HPA047819, Atlas Antibodies), anti-RECA-1 (mús, 1:50; ab9774, abcam), and-SCG2 (kanína, 1:100; 20357-1-AP, Proteintech), and-SOX9 (geit, 1:500; AF3075, R&D Systems), Netrin G1a (geit, 1:100; AF1166, R&D Systems), and-STEM121 (mús, 1:200; Y40410, Takara Bio), and-SATB2 (mús, 1:50; ab51502, abcam), and-GAD65/67 (kanína, 1:400; ABN904, Millipore) og and-IBA1 (geit, 1:100; ab5076, abcam). Helstu mótefni sem notuð voru voru: anti-NeuN (mús, 1:500; ab104224, abcam) anti-CTIP2 (rotta, 1:300; ab18465, abcam), anti-GFAP (kanína, 1:1.000; Z0334, Dako), anti-GFP (kjúklingur, 1:1.000; GTX13970, GeneTex), anti-HNA (mús, 1:200; ab191181, abcam), anti-NeuN (kanína, 1:500; ABN78, Millipore), anti-PDGFRA (kanína, 1:200; sc-338, Santa Cruz), anti-PPP1R17 (kanína, 1:200; HPA047819, Atlas Antibodies), anti-RECA-1 (mús, 1:50; ab9774, abcam), and-SCG2 (kanína, 1:100; 20357-1-AP, Proteintech), and-SOX9 (geit, 1:500; AF3075, R&D Systems), Netrin G1a (geit, 1:100; AF1166, R&D Systems), and-STEM121 (mús, 1:200; Y40410, Takara Bio), and-SATB2 (mús, 1:50; ab51502, abcam), and-GAD65/67 (kanína, 1:400; ABN904, Millipore) og and-IBA1 (geit, 1:100; ab5076, abcam). Использовались следующие первичные антитела: анти-NeuN (мышиные, 1:500; ab104224, abcam), анти-CTIP2 (крысины6,abcam),abcam,abcam,abcam,abcam,abcam. анти-GFAP (кроличьи, 1:1000; Z0334, Dako), анти- -GFP (курица, 1:1000; GTX13970, GeneTex), анти-HNA (мышь, 1:200; ab19118) 1:500; ABN78, Millipore), анти-PDGFRA (kórólik, 1:200; sc-338, Санта-Круз), анти-PPP1R17 (кролик, 1:200; HPA047819, Atlas Antibodies), анти-RECA-1 (мышь, 1:50; ab9774, abcam), анти-SCG2 (10, 10, 10; 20357-1-AP, Proteintech), анти-SOX9 (козий, 1:500; AF3075, R&D Systems), нетрин G1a (козий, 1:100; AF1166, R&D Systems), анти-STEM121 (мынй: 20ши; Y40410, Takara Bio), анти-SATB2 (мышь, 1:50; ab51502, abcam), анти-GAD65/67 (кролик, 1:400; ABN904, Millipore) og анти-IBA1 (коза, 1:100; аб5076, абкам). Helstu mótefnin sem notuð voru voru: anti-NeuN (mús, 1:500; ab104224, abcam), anti-CTIP2 (rotta, 1:300; ab18465, abcam), anti-GFAP (kanína, 1:1000; Z0334, Dako), anti-GFP (kjúklingur, 1:1000; GTX13970, GeneTex), anti-HNA (mús, 1:200; ab191181, abcam), anti-NeuN (kanína, 1:500; ABN78, Millipore), anti-PDGFRA (kanína, 1:200; sc-338, Santa Cruz), anti-PPP1R17 (kanína, 1:200; HPA047819, Atlas Antibodies), anti-RECA-1 (mús, 1:50; ab9774, abcam), and-SCG2 (kanína, 1:100; 20357-1-AP, Proteintech), and-SOX9 (geit, 1:500; AF3075, R&D Systems), netrín G1a (geit, 1:100; AF1166, R&D Systems), and-STEM121 (mús, 1:200; Y40410, Takara Bio), and-SATB2 (mús, 1:50; ab51502, abcam), and-GAD65/67 (kanína, 1:400; ABN904, Millipore) og and-IBA1 (geit, 1:100; ab5076, abkam).使用的一抗是：抗NeuN（小鼠，1:500；ab104224，abcam）抗CTIP2（大鼠，1:3 00；ab18465，abcam），抗GFAP（兔，1:1.000；Z0334，Dako），抗-GF P（鸡，1:1.000；GTX13970，GeneTex），抗HNA（小鼠，1:200；ab1911 81，abcam），抗NeuN（兔，1:500；ABN78，Millipore），抗PDGFRA（兔， 1:200；sc-338，Santa Cruz），抗PPP1R17（兔，1:200；HPA047819，Atlas抗体），抗RECA-1（小鼠，1:50；ab9774，abcam），抗SCG2（兔） , 1:100；20357-1-AP，Proteintech），抗SOX9（山羊，1:500；AF3075，R&D Systems），Netrin G1a（山羊，（山羊，，，1:10 Systems），抗STEM121（小鼠, 1:200;使用的一抗是：抗NeuN（小鼠，1:500；ab104224，abcam）抗CTIP2（大鼠，1 :300；ab18465，abcam），抗GFAP（兔，1:1,000；Z0334，Dako），抗-GFP（鸡，1:1.000；GTX13970，GeneTex），抗HNA（小鼠，1:200；ab 191181，abcam），抗NeuN（兔，1:500；ABN78，Millipore％弔，抗1: 200；sc-338，Santa Cruz），抗PPP1R17（兔，1:200；HPA047819，Atlas抗体），抗RECA-1（小鼠，1:50；ab9774，abcam），抗SCG2 100；20357-1-AP，Proteintech），抗SOX9（山羊，1:500；AF3075，R&D Systems），Netrin G1a（山羊，1:106，AF&R Kerfi）頏1:20, ;Y40410, Takara Bio), and-SATB2 (mús, 1:50; ab51502, abcam), and-GAD65/67 (kanína, 1:400; ABN904, Millipore) og and-IBA1 (geit, 1:100; ab5076, abcam).Helstu mótefnin sem notuð voru voru: anti-NeuN (mús, 1:500; ab104224, abcam), anti-CTIP2 (rotta, 1:300; ab18465, abcam), anti-GFAP (kanína, 1:1000; Z0334, Dako). , and-GFP (kjúklingur, 1:1000; GTX13970, GeneTex), and-HNA (mús, 1:200; ab191181, abcam), and-NeuN (kanína, 1:500; ABN78, Millipore), and-PDGFRA (kanína, 1:200; sc-338, Santa Cruz), and-PPP1R17 (kanína, 1:200; HPA047819, Atlas mótefni), and-RECA-1 (mús, 1:50; ab9774, abcam), and-SCG2 (kanína), 1:100;20357-1-AP, Proteintech), анти-SOX9 (коза, 1:500; AF3075, R&D Systems), Нетрин G1a (коза, 1:100; AF1166, R&D Systems), анти -STEM121, мы401201 (mы0ш100; Bio), анти-SATB2 (мышь, 1:50; ab51502, abcam), анти-GAD65/67 (кролик, 1:400; ABN904, Millipore) og анти-IBA1 (коза, 1:100; абаба76; аба5076; аба50ка). 20357-1-AP, Proteintech), and-SOX9 (geit, 1:500; AF3075, R&D Systems), Netrin G1a (geit, 1:100; AF1166, R&D Systems), and-STEM121 (mús, 1:200; Y40410, Takara Bio), and-SATB2 (mús, 1:50; ab51502, abcam), and-GAD65/67 (kanína, 1:400; ABN904, Millipore) og and-IBA1 (geit, 1:100; ab5076, abkam).Sneiðarnar voru síðan þvegnar með PBS og ræktaðar með aukamótefni í 1 klukkustund við stofuhita (frosnar sneiðar) eða yfir nótt við 4°C (þykkar sneiðar). Alexa Fluor aukamótefni (Life Technologies) þynnt 1:1000 í blokkunarlausn var notað. Eftir þvott með PBS voru kjarnar skoðaðir með Hoechst 33258 (Life Technologies). Að lokum voru glærurnar settar í smásjá með hlífðarglerjum (Fisher Scientific) með því að nota Aquamount (Polysciences) og greindar með Keyence flúrljómunarsmásjá (BZ-X greiningartæki) eða Leica TCS SP8 confocal smásjá (Las-X) á myndinni. Myndirnar voru unnar með ImageJ forritinu (Fiji). Til að magngreina hlutfall taugafrumna úr mönnum í t-hCO og rottuberki voru teknar 387,5 μm breiðar rétthyrndar myndir í miðju t-hCO, við eða nálægt brún rottuberkisins. Jaðar ígræðslunnar voru ákvarðaðir með því að meta breytingar á gegnsæi vefjar, HNA+ kjarna og/eða nærveru sjálfflúrljómunar vefjar. Í hverri mynd var heildarfjöldi NeuN+ og HNA+ frumna deilt með heildarfjölda NeuN+ frumna á sama svæði. Til að tryggja að aðeins frumur með kjarna í myndfletinum séu taldar eru aðeins frumur sem eru einnig Hoechst+ teknar með í útreikninginn. Meðaltal tveggja mynda með að minnsta kosti 1 mm millibili var reiknað til að draga úr tölfræðilegri skekkju.
Viku fyrir sýnistöku eru hCO3 ígræðsludýr (um það bil 8 mánaða aðgreining) sett í dimmt herbergi með klipptum skeggjum til að lágmarka skynörvun. Einangrun kjarnanna var framkvæmd eins og áður hefur verið lýst, með nokkrum breytingum. Í stuttu máli voru t-hCO3 og hCO3 eytt með því að nota vélræna frumurof með þvottaefnis- og 2 ml glervefskvörn (D8938, Sigma-Aldrich/KIMBLE). Óhreinsuðu kjarnarnir voru síðan síaðir frá með 40 µm síu og skilvindaðir við 320 g í 10 mínútur við 4°C áður en súkrósaþéttleikahalli var framkvæmdur. Eftir skilvinduskrefið (320 g í 20 mínútur við 4°C) voru sýnin enduruppleyst í 0,04% BSA/PBS með viðbættu 0,2 einingum af µl-1 RNasa hemli (40 u µl-1, AM2682, Ambion) og látin fara í gegnum 40 µm flæðisíu. Aðskildu kjarnar voru síðan enduruppleystir í PBS sem innihélt 0,02% BSA og settir á Chromium Single Cell 3′ flís (áætluð endurheimt upp á 8.000 frumur á braut). snRNA-seq bókasöfn voru útbúin með Chromium Single cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics). snRNA-seq bókasöfn voru útbúin með Chromium Single cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics). Библиотеки snRNA-seq были приготовлены с помощью Chromium Single cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics). snRNA-seq bókasöfnin voru útbúin með Chromium Single cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics). snRNA-seq 文库是使用Chromium Single Cell 3′ GEM、Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics) 制备的。 snRNA-seq 文库是使用Chromium Single Cell 3′ GEM、Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics) 制备的。 Библиотеку snRNA-seq готовили с использованием Chromium Single Cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics). snRNA-seq bókasafnið var útbúið með Chromium Single Cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics).Bókasöfn úr mismunandi sýnum voru sett saman og raðgreind af Admera Health á NovaSeq S4 (Illumina).
Genatjáningarstig fyrir hvert hugsanlegt kjarnastrikmerki voru magngreind með 10x Genomics CellRanger greiningarhugbúnaðarpakkanum (útgáfa 6.1.2). Nánar tiltekið voru lesturnar paraðar saman við blöndu af viðmiðunarerfðamengjum manna (GRCh38, Ensemble, útgáfa 98) og rotta (Rnor_6.0, Ensemble, útgáfa 100) sem voru búin til með mkref skipuninni og með því að nota count með –include-introns=TRUE skipuninni til að magngreina lestirnar sem eru varpaðar á intron svæði. Fyrir t-hCO sýni voru kjarnar manna greindir út frá þeirri íhaldssömu kröfu að að minnsta kosti 95% allra kortlagðra lestra pössuðu við erfðamengi manna. Allar síðari greiningar voru framkvæmdar á síuðu strikamerkjafylki sem kom út úr CellRanger með því að nota R pakkann (útgáfa 4.1.2) Seurat (útgáfa 4.1.1)32.
Til að tryggja að aðeins hágæða kjarnar væru teknir með í síðari greiningunni var endurtekin síun framkvæmd fyrir hvert sýni. Fyrst eru lággæða kjarnar með færri en 1000 einstökum genum fundust og meira en 20% af heildarfjölda hvatbera greindir og fjarlægðir. Í kjölfarið var hráa genatölumatrixinn staðlaður með reglulegri neikvæðri tvíliðu aðhvarfsgreiningu með því að nota sctransform(vst.flavor=”v2″) fallið, sem einnig greindi 3000 breytilegustu genin með sjálfgefnum breytum. Víddarminnkun var framkvæmd á efri breytugenunum með því að nota aðalþáttagreiningu (PCA) með sjálfgefnum breytum með því að nota gagnasafnsvídd 30 (dims = 30 var valið út frá sjónrænni skoðun á hnésvæðum og notað fyrir öll sýni og safngreiningar). Við framkvæmdum síðan nokkrar umferðir af endurtekinni þyrpingu (upplausn = 1) til að flokka gen út frá óeðlilega lágum genatölu (miðgildi undir 10. hundraðshluta), óeðlilega háum hvatberagentölu (miðgildi yfir 95. hundraðshluta) til að bera kennsl á og fjarlægja hugsanlegar frumur af lágum gæðum. Þyrpingar og/eða hátt hlutfall grunaðra tvíbura sem greindir voru með DoubletFinder33 pakkanum (meðal DoubletFinder stig yfir 95. hundraðshluta). t-hCO sýni (n=3) og hCO sýni (n=3) voru samþætt sérstaklega með því að nota IntegrateData fallið með ofangreindum breytum. Síðan Önnur umferð eigindlegrar síunar á samþætta gagnasafninu var framkvæmd eins og lýst er hér að ofan.
Eftir að kjarnar af lágum gæðum voru fjarlægðir var samþætta gagnasafninu flokkað (upplausn = 0,5) og fellt inn til að sýna UMAP34. Merkjagen fyrir hvert klasa voru ákvörðuð með FindMarkers fallinu með sjálfgefnum breytum sem reiknuðum út frá staðluðum genatjáningargögnum. Við auðkennum og flokkum helstu frumuflokka með því að sameina viðmiðunargagnasöfn fyrir fóstur- og fullorðinsberki með merkjagenatjáningu 19,20,21,35 og skýringum. Sérstaklega voru forverar í blóðrás auðkenndir með tjáningu MKI67 og TOP2A. Forveraklasar voru skilgreindir með fjarveru mítósu umrita, mikilli skörun við fjölhæfa glial forveraklasa sem lýst er í síðfrumuberki fósturs og EGFR og OLIG1 tjáningu. Við notum hugtakið stjörnufrumur til að ná yfir nokkur stig stjörnufrumnaaðgreiningar, allt frá síðfrumuþroska til þroska stjörnufrumna. Stjörnufrumuklasar tjá mikið magn af SLC1A3 og AQP4 og hefur reynst tengjast undirtegundum fóstur- og/eða fullorðinna stjörnufrumna. OPC-frumur tjá PDGFRA og SOX10 en oligodendrocytar tjá mýlismyndunarmerki (MOG og MYRF). Glútamatergískar taugafrumur voru greindar með nærveru taugafrumurita (SYT1 og SNAP25), fjarveru GABAergískra merkja (GAD2) og tjáningu NEUROD6, SLC17A7, BCL11B eða SATB2. GluN-taugafrumur voru frekar skipt í efri (SATB2 tjáning og tap á BCL11B) og djúpa (BCL11B tjáningu) undirflokka. Hugsanlegar undirplötutaugafrumur (SP) tjá þekkt SP18-merki eins og ST18 og SORCS1 auk djúpra GluN-merkja. Æðhimnuplexus-líkar frumur voru greindar með TTR-tjáningu og heilahimnu-líkar frumur tjáðu fibroblast-tengd gen og kortlagðar æða-/æðafrumur úr viðmiðunargagnagrunninum.
Mismunagreining á genatjáningu milli t-hCO og hCO undirflokka var framkvæmd með nýþróaðri gerviliðsaðferð sem endurgerð var í sýnum sem voru útfærð með Libra R pakkanum (útgáfa 1.0.0). Nánar tiltekið voru edgeR log-líkindapróf (útgáfa 3.36.0, pakki R) framkvæmd fyrir hópa með því að leggja saman fjölda gena í frumum fyrir tiltekinn frumuflokk fyrir hverja afritun sýnis. Til að birta hitakort eru staðlað gildi á milljón (CPM) reiknuð með edgeR (cpm() falli) og kvarðað (til að ná meðaltali = 0, staðalfráviki = 1). Framkvæmd var erfðafræðileg auðgunargreining (GO) á marktækt uppstýrðum t-hCO GluN genum (Benjamini-Hochberg leiðrétt P gildi minna en 0,05 tjáð í að minnsta kosti 10% af t-hCO GluN frumum og að minnsta kosti tvöföld aukning í breytingu) framkvæmd með ToppGene Suite (https://toppgene.cchmc.org/)37. Við notum ToppFun appið með sjálfgefnum breytum og birtum Benjamini-Hochberg-leiðrétt p-gildi reiknuð út frá GO-skýrðum ofurrúmfræðilegum prófum.
Til að para snRNA-seq klasa okkar við skýrða frumuklasa úr viðmiðunarrannsóknum á einfrumu RNA-seq eða fullorðins snRNA-seq19,20,21,22, notuðum við paraða gagnasafnssamþættingaraðferð. Við notuðum SCTransform (v2) staðlunarvinnuflæðið í Seurat til að samþætta og bera saman klasaskörun milli gagnasafna (með sömu breytum og að ofan). Einstök gagnasöfn voru af handahófi sett í undirhópa allt að 500 frumur eða kjarna í hverjum upprunalegum klasa til að auka skilvirkni í útreikningum. Með svipaðri aðferð og áður hefur verið lýst var klasaskörun skilgreind sem hlutfall frumna eða kjarna í hverjum safni klasa sem sköruðust við merki viðmiðunarklasans. Til að flokka GluN frekar notuðum við TransferData vinnuflæðið frá Seurat fyrir GluN undirhópsgögn til að úthluta viðmiðunargagnasöfnum til GluN frumna okkar.
Til að meta þroskastöðu alþjóðlegs umrits t-hCO og hCO sýna, bárum við saman gervi-massasýnin okkar við BrainSpan/psychENCODE23, sem samanstendur af stórri RNA röð sem spannar þroska mannsheilans. Við framkvæmdum PCA á sameinuðu mynstur-normaliseruðu genatjáningarfylki úr heilaberkisýnum 10 vikum eftir getnað og síðar, í 5567 genum (ásamt gögnum okkar) sem áður höfðu verið greind sem virk í BrainSpan heilaberkisýnum (skilgreint sem meira en 50% í þroskabreytileika útskýrðum með aldri með rúmmetralíkani)38. Að auki fengum við gen sem tengjast helstu umritunareinkennum taugaþroska með því að nota óneikvæða fylkisþáttun eins og áður hefur verið lýst. Þyngd sýnanna sem reiknuð var með óneikvæðri fylkisþáttun er teiknuð á mynd 5b með útvíkkuðum gögnum fyrir hvert af þeim fimm einkennum sem lýst er af Zhu o.fl.38. Aftur voru virkniháð umritunarmerki fengin úr áður birtum rannsóknum. Einkum voru ERG og LRG marktækt uppstýrð í glútamatergískum taugafrumum sem greindar voru með snRNA-seq safni í sjónberki músa eftir sjónræna örvun úr viðbótartöflu 3 Hrvatin o.fl.16. Mannauðguð LRG voru fengin úr KCl-virkjuðum heilaræktunum úr fóstrum manna og uppskorin 6 klukkustundum eftir örvun, og síuðu genin voru marktækt uppstýrð í mönnum en ekki í nagdýrum (viðbótartafla 4). Greining á auðgun genasetta með þessum genasettum var framkvæmd með einstefnu Fishers nákvæmnisprófi.
Deyfið rottur með ísóflúrani, fjarlægið heila og setjið í kalda (um það bil 4°C) súrefnisríka (95% O2 og 5% CO2) súkrósalausn fyrir sneiðar sem innihalda: 234 mM súkrósa, 11 mM glúkósa, 26 mM NaHCO3, 2,5 mM KCl, 1,25 mM NaH2PO4, 10 mM MgSO4 og 0,5 mM CaCl2 (um það bil 310 mOsm). Kransneiðar af rottuheila (300–400 µm) sem innihéldu t-hCO3 voru gerðar með Leica VT1200 titringsmæli eins og áður hefur verið lýst39. Sneiðarnar voru síðan fluttar í skurðarhólf með samfelldri súrefnismettun við stofuhita sem innihélt aCSF, búið til úr: 10 mM glúkósa, 26 mM NaHCO3, 2,5 mM KCl, 1,25 mM NaHPO4, 1 mM MgSO4, 2 mM CaCl2 og 126 mM NaCl (298 mOsm), að minnsta kosti 45 mínútum fyrir skráningu. Sneiðarnar voru skráðar í djúpu hólfi þar sem þær voru stöðugt gegndreyptar með aCSF (95% O2 og 5% CO2 hettuglasi). Öll gögn voru skráð við stofuhita. t-hCO taugafrumur voru endaðar með bórsílíkatglerpípettu fylltri lausn sem innihélt 127 mM kalíumglúkonat, 8 mM NaCl, 4 mM magnesíum ATP, 0,3 mM natríum GTP, 10 mM HEPES og 0,6 mM EGTA, pH 7,2, innri lausn stillt með KOH (290 mOsm). Til að endurheimta var bíósýtín (0,2%) bætt við upptökulausnina.
Gögnum var aflað með MultiClamp 700B magnara (Molecular Devices) og Digidata 1550B stafrænum mæli (Molecular Devices), lágtíðnisíað við 2 kHz, stafrænt við 20 kHz og greind með Clampfit (Molecular Devices), Origin (OriginPro, 2021b, OriginLab) og sérsniðnum MATLAB föllum (Mathworks). Gatnamótaspennan var reiknuð með JPCalc og færslurnar leiðréttar að útreiknuðu gildi -14 mV. Aðgerð IV samanstendur af röð straumskrefa í 10-25 pA skrefum, frá -250 til 750 pA.
Þalamus, hvítt efni og S1 taugafrumur voru örvuð með rafmagni í sneiðum af stúkuberki við klemmuupptöku á hCO taugafrumum, eins og áður hefur verið lýst. Í stuttu máli var heilinn settur á þrívíddar prentborð sem hallaði sér í 10° horni og framhluti heilans skorinn í 35° horni. Heilinn var síðan límdur á skurðflötinn og skorinn í sneiðar, þannig að útstandandi taugasímar stúkuberkisins voru varðveittir. Tvípólar wolfram rafskautar (0,5 MΩ) voru festir á annan örstýribúnað og staðsettir stefnumiðað til að örva fjögur svæði í hverri frumu (innra hylki, hvítt efni, S1 og hCO). Skráning taugamótaviðbragða eftir 300 µA fasaörvun við 0,03–0,1 Hz.
Taugafrumur sem tjá hChR2 voru virkjaðar við 480 nm og ljóspúlsar, sem LED (Prizmatix) myndaði, voru sendir í gegnum ×40 hlutgler (0,9 NA; Olympus) til að skrá hChR2 tjáningu nálægt frumunum. Þvermál upplýsta sviðsins er um það bil 0,5 mm og heildaraflið er 10-20 mW. Púlsbreiddin var stillt á 10 ms, sem samsvarar púlsinum sem gefinn var í atferlisnámstilrauninni. Ýmsar örvunartíðnir voru notaðar, frá 1 til 20 Hz, en aðeins fyrsti púlsinn í seríunni var notaður til magngreiningar. Bilið milli taugaleiða er venjulega lengra en 30 sekúndur til að lágmarka áhrif á taugamótahömlunar- eða örvunarleiðir. Til að prófa hvort hChR2 svörunin væri einsynapísk, settum við TTX (1 μM) á baðið þar til EPSC viðbrögðin hurfu og síðan settum við 4-amínópýridín (4-AP; 100 μM). Venjulega kemur svörun til baka innan nokkurra mínútna, með aðeins lengri töf milli þess að LED kveikir og EPSC myndast. NBQX (10 μM) var notað til að prófa hvort svörunin sé knúin áfram af AMPA viðtökum.
Skarpar hCO sneiðar voru búnar til eins og áður hefur verið lýst. Í stuttu máli voru hCO sneiðar settar í 4% agarósa og fluttar í frumur sem innihéldu 126 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM NaH2PO4, 1 mM MgSO4, 2 mM CaCl2, 26 mM NaHCO3 og 10 mM d-(+)-glúkósa. Sneiðarnar voru skornar í 200–300 µm fjarlægð við stofuhita með Leica VT1200 titrara og geymdar í ASF við stofuhita. Síðan var gerð „patch-camp“ skráning á heilum frumum á hCO sneiðum undir beinni SliceScope smásjá (Scientifica). Sneiðarnar voru gegndreyptar með aCSF (95% O2 og 5% CO2) og frumumerki voru skráð við stofuhita. hCO taugafrumur voru settar á með pípettu úr bórsílikatgleri fylltri með lausn sem innihélt 127 mM kalíumglúkonat, 8 mM NaCl, 4 mM magnesíum ATP, 0,3 mM natríum GTP, 10 mM HEPES og 0,6 mM EGTA, innra pH 7, 2, stillt með KOH (osmólstyrkur 290). Til að endurheimta var 0,2% Biocytin bætt við innri lausnina.
Gögnum var aflað með Clampex (Clampex 11.1, Molecular Devices) með MultiClamp 700B magnara (Molecular Devices) og Digidata 1550B stafrænum mæli (Molecular Devices), lágtíðnisíað við 2 kHz, stafrænt við 20 kHz og greind með Clampfit (útgáfa 10.6) fyrir greiningu, sameindatæki) og sérsniðnum MATLAB föllum (MATLAB 2019b, Mathworks). Samskeytaspennan var reiknuð með JPCalc og færslurnar voru leiðréttar að útreiknuðu samskeytaspennunni -14 mV. Aðgerð IV samanstendur af röð straumskrefa í 5-10 pA skrefum frá -50 til 250 pA.
Til að endurskapa formgerð klemmdra taugafruma var 0,2% bíósýtín (Sigma-Aldrich) bætt við innri lausnina. Frumurnar eru undirbúnar í að minnsta kosti 15 mínútur eftir að þær eru brotnar niður. Pípettan er síðan dregin hægt inn í 1-2 mínútur þar til himnan er alveg innsigluð. Í kjölfar sneiðmyndunarferlisins voru sneiðarnar festar yfir nótt við 4°C í 4% PFA, þvegnar með PBS X3 og þynntar 1:1000 með streptavíðín-tengdu DyLight 549 eða DyLight 405 (Vector Labs). Frumur fylltar með bíósýtín (2%; Sigma-Aldrich) voru merktar með klemmuupptöku við stofuhita í 2 klukkustundir. Sneiðarnar voru síðan festar á smásjárgler með Aquamount (Thermo Scientific) og skoðaðar daginn eftir á Leica TCS SP8 confocal smásjá með olíudýfingarlinsu með tölulegu ljósopi ×40 1.3, stækkun ×0.9–1.0, xy. Sýnatökutíðnin er um það bil 7 pixlar á míkron. Z-staflar voru teknir í röð með 1 µm millibili og z-stafla mósaík og Leica-byggð sjálfvirk saumun voru framkvæmd til að þekja allt taugafrumutréð í hverri taugafrumu. Taugafrumur voru síðan raktar hálfhandvirkt með neuTube 40 viðmótinu og SWC skrár voru búnar til. Skrárnar voru síðan hlaðið inn í SimpleNeuriteTracer41 Fiji viðbótina (ImageJ, útgáfa 2.1.0; NIH).
Mannsberkivefur var fenginn með upplýstu samþykki samkvæmt verklagsreglum sem samþykktar voru af Siðanefnd Stanford-háskóla. Tvö sýni af mannsberki eftir fæðingu (3 og 18 ára) voru tekin með fjarlægingu á framheilaberki (miðframheilaberki) sem hluta af aðgerð við þrálátri flogaveiki. Eftir fjarlægingu var vefurinn tekinn í ísköldu NMDG-aCSF sem innihélt: 92 mM NMDG, 2,5 mM KCl, 1,25 mM NaH2PO4, 30 mM NaHCO3, 20 mM HEPES, 25 mM glúkósa, 2 mM þíóúrea, 5 mM natríumaskorbat, 3 mM natríumpýrúvat, 0,5 mM CaCl2 4H2O og 10 mM MgSO4 7H2O. Títrað þar til pH 7,3-7,4 er náð með óblandaðri saltsýru. Vefir voru afhentir rannsóknarstofunni innan 30 mínútna og kransæðasneiðar teknar samkvæmt aðferðinni sem lýst er hér að ofan.
Allar dýraaðgerðir voru framkvæmdar í samræmi við dýraumhirðuleiðbeiningar sem Stanford-háskóli hefur samþykkt og APLAC hefur veitt henni. Rottur (meira en 140 dögum eftir ígræðslu) voru svæfðar með 5% ísóflúrani og svæfðar með 1-3% ísóflúrani fyrir aðgerð. Dýrin voru sett í staðbundið grind (Kopf) og búprenorfín með seinkuðu losun (SR) var sprautað undir húð. Höfuðkúpan er afhjúpuð, hreinsuð og 3-5 beinskrúfur settar í. Til að miða á t-hCO3 bjuggum við til staðbundin hnit úr segulómunarmyndum. Borað var gat á staðnum sem var til skoðunar og trefjar (400 µm í þvermál, NA 0,48, Doric) voru lækkaðar 100 µm undir yfirborð hCO3 og festar við höfuðkúpuna með útfjólubláa-herðanlegu tannlímingu (Relyx).
Ljósmælingar á ljósleiðurum voru framkvæmdar eins og áður hefur verið lýst42. Til að skrá sjálfsprottna virkni voru rottur settar í hreint búr og 400 µm þvermál ljósleiðaratengingarsnúra (Doric) tengd við ljósleiðara gagnasöfnunarkerfi var tengd við ígrædda ljósleiðarann. Á meðan 10 mínútna skráning á hreyfivirkni stóð voru dýrin frjáls til að skoða búrið. Til að skrá framkallaða virkni voru rottur (meira en 140 dögum eftir ígræðslu) svæfðar með 5% ísóflúrani til örvunar og 1-3% ísóflúrani til viðhalds. Setjið dýrið í stereotaktískan ramma (Kopf) og skeggið á gagnstæðri hlið t-hCO3 er snyrt í um 2 cm og látið renna í gegnum möskva sem er tengdur við piezoelectric actuator (PI). 400 µm ljósleiðaratengingarsnúra (Doric) var tengd við ígrædda ljósleiðarann ​​og tengdur við gagnasöfnunarkerfið. Skírnarvöðvunum á gagnstæðri hlið t-hCO var síðan beygt 50 sinnum (2 mm við 20 Hz, 2 sekúndur á kynningu) af handahófi með piezoelectric drifi yfir 20 mínútna upptökutímabil. Notið Arduino MATLAB stuðningspakkann til að stjórna beygjutíma með sérsniðnum MATLAB kóða. Atburðir eru samstilltir við gagnaöflunarhugbúnaðinn með því að nota transistor-transistor rökfræði (TTL) púlsa.
Rottur (meira en 140 dögum eftir ígræðslu) voru svæfðar með 5% ísóflúrani og svæfðar með 1-3% ísóflúrani fyrir aðgerð. Dýrin voru sett í staðbundið ramma (Kopf) og búprenorfín SR og dexametasóni voru sprautuð undir húð. Höfuðkúpan er afhjúpuð, hreinsuð og 3-5 beinskrúfur settar í. Til að miða á t-hCO2 bjuggum við til staðbundin hnit úr segulómunarmyndum. Hringlaga höfuðkúpuskurður (u.þ.b. 1 cm í þvermál) var framkvæmdur með hraðbor beint yfir ígrædda hCO2. Þegar beinið er eins þunnt og mögulegt er, en áður en borað er í gegnum allt beinið, skal nota töng til að fjarlægja eftirstandandi grindarbotnsdisk til að sýna undirliggjandi t-hCO2. Höfuðkúpuskurðurinn var fylltur með sæfðu saltvatni og hlífðargler og sérstakur höfuðpinni voru festir við höfuðkúpuna með útfjólubláum tannsementi (Relyx).
Tveggja ljóseinda myndgreining var framkvæmd með Bruker fjölljóseindasmásjá með Nikon LWD (×16, 0,8 NA) hlutgleri. GCaMP6 myndgreining var framkvæmd við 920 nm með 1,4x stækkun á einni z-plani og 8x meðaltali 7,5 fps. Rottur voru örvaðar með 5% ísóflúran svæfingu og viðhaldið með 1-3% ísóflúrani. Rotturnar voru settar í sérsmíðaðan höfuðfestingu og staðsettar undir linsunni. Þriggja mínútna bakgrunnsupptaka af hreyfivirkni var tekin. Á 20 mínútna upptöku voru 50 pústar (hver kynning 100 ms löng) gefnir af handahófi á whisker-púðann gegnt t-hCO með því að nota picospricer. Notið Arduino MATLAB stuðningspakkann til að stjórna burst-tíma með sérsniðnum MATLAB kóða. Samstillið atburði við gagnaöflunarhugbúnað (PrairieView 5.5) með TTL púlsum. Til greiningar voru myndirnar leiðréttar fyrir xy-hreyfingu með því að nota affine leiðréttingu í MoCo forritinu sem hleypt var af stokkunum á Fídjieyjum. Útdráttur á flúrljómunarleifum úr einstökum frumum með CNMF-E43. Flúrljómun var dregin út fyrir hvert svæði sem völ var á, breytt í dF/F ferla og síðan í z-stig.
Rottur (meira en 140 dögum eftir ígræðslu) voru örvaðar með 5% ísóflúran svæfingu og svæfðar með 1-3% ísóflúrani meðan á aðgerð stóð. Dýrin voru sett í stereotaxískan ramma (Kopf) og búprenorfín SR og dexametasón voru sprautuð undir húð. Skífurhárin á gagnstæðri hlið t-hCO voru klippt í um 2 cm og þrædd í gegnum möskva sem tengdist við rafsegulstýringu. Höfuðkúpan er afhjúpuð og hreinsuð. Jarðskrúfa úr ryðfríu stáli er fest við höfuðkúpuna. Til að miða á t-hCO bjuggum við til stereotaxískar hnit úr segulómunarmyndum. Framkvæmdu hringlaga höfuðkúpuskurð (u.þ.b. 1 cm í þvermál) með hraðbor rétt fyrir ofan t-hCO. Þegar beinið er eins þunnt og mögulegt er, en áður en borað er í gegnum allt beinið, notaðu töng til að fjarlægja eftirstandandi heila grindarbotnsþilfar til að sýna undirliggjandi t-hCO. Einstakar frumur voru skráðar með 32 rása eða 64 rása háþéttni kísilmæli (Cambridge Neurotech) sem voru jarðtengdir við jarðskrúfur og formagnaðir með RHD magnurum (Intan). Notið var stjórntækið til að lækka rafskautin niður á marksvæðið í gegnum höfuðkúpuskurðinn, sem er fylltur með dauðhreinsuðu saltvatni. Gagnasöfnun var framkvæmd við tíðnina 30 kHz með því að nota Open Ephys gagnasöfnunarkerfið. Skráningin hélt aðeins áfram þegar við greindum mjög fylgni taktfasta sjálfsprottna virkni í meira en 10 rásum, sem bendir til þess að rafskautin væru staðsett í ígræðslunni (byggt á tveggja ljóseinda kalsíummyndagögnum). 10 mínútna bakgrunnsupptaka af hreyfivirkni var fengin. Skíði á gagnstæðri hlið t-hCO3 var síðan sveigð 50 sinnum (2 mm við 20 Hz, 2 sekúndur á kynningu) af handahófi með piezoelectric drifi yfir 20 mínútna upptökutímabil. Með því að nota MATLAB stuðningspakkann fyrir Arduino (MATLAB 2019b) er hægt að stjórna sveigjutíma með sérsniðnum MATLAB kóða. Notið TTL-púlsa til að samstilla atburði við gagnaöflunarhugbúnað.
Fyrir tilraunir með ljósmerkingar var 200 µm ljósleiðara (Doric), tengdur við 473 nm leysi (Omicron), tengdur við 200 µm ljósleiðara sem staðsettur var yfir höfuðkúpuskurðinum. Rétt áður en þetta gerðist var stökkbreyttur afls tengingarinnar stilltur á 20 mW. Notið stjórntækið til að lækka rafskautin að marksvæðinu í gegnum höfuðkúpuskurðinn, sem er fylltur með sæfðu saltvatni. Í upphafi upptökunnar voru send út tíu ljóspúlsar 473 nm (tíðni 2 Hz, púlslengd 10 ms). Ljósnæmar frumur voru skilgreindar sem frumur sem sýndu toppviðbrögð innan 10 ms af ljósi í 70% eða fleiri tilrauna.