Nature.com වෙත පිවිසීම ගැන ඔබට ස්තූතියි. ඔබ සීමිත CSS සහායක් සහිත බ්‍රව්සර් අනුවාදයක් භාවිතා කරයි. හොඳම අත්දැකීම සඳහා, යාවත්කාලීන කළ බ්‍රව්සරයක් භාවිතා කරන ලෙස අපි නිර්දේශ කරමු (නැතහොත් Internet Explorer හි අනුකූලතා මාදිලිය අක්‍රීය කරන්න). ඊට අමතරව, අඛණ්ඩ සහාය සහතික කිරීම සඳහා, අපි විලාස සහ JavaScript නොමැතිව අඩවිය පෙන්වමු.
එකවර ස්ලයිඩ තුනක කැරොසලයක් පෙන්වයි. එකවර ස්ලයිඩ තුනක් හරහා ගමන් කිරීමට පෙර සහ ඊළඟ බොත්තම් භාවිතා කරන්න, නැතහොත් අවසානයේ ඇති ස්ලයිඩර් බොත්තම් භාවිතා කර එකවර ස්ලයිඩ තුනක් හරහා ගමන් කරන්න.
ස්වයං-එකලස් කිරීමේ ස්නායු ඉන්ද්‍රියයන් මානව සංවර්ධනය සහ රෝග ආකෘති නිර්මාණය සඳහා පොරොන්දු වූ අභ්‍යන්තර වේදිකාවක් නියෝජනය කරයි. කෙසේ වෙතත්, කාබනික ද්‍රව්‍යවලට ජීව විද්‍යාවේ පවතින සම්බන්ධතාවයක් නොමැති අතර, එය පරිණතභාවය සීමා කරන අතර හැසිරීම පාලනය කරන අනෙකුත් පරිපථ සමඟ ඒකාබද්ධ වීම වළක්වයි. මෙහිදී අපි පෙන්වන්නේ නව ජන්ම නිරුවත් මීයන්ගේ සෝමාටෝසෙන්සරි බාහිකයට බද්ධ කරන ලද මිනිස් කඳ සෛල-ව්‍යුත්පන්න බාහික කාබනික ද්‍රව්‍ය සංවේදක සහ අභිප්‍රේරණයට අදාළ පරිපථවලට ඒකාබද්ධ වන පරිණත සෛල වර්ග වර්ධනය කරන බවයි. MRI මගින් කඳ සෛල රේඛා කිහිපයක සහ සතුන් තුළ පශ්චාත් බද්ධ කිරීමේ කාබනික ද්‍රව්‍ය වර්ධනයක් අනාවරණය වූ අතර, තනි-හර විශ්ලේෂණය මගින් කෝටිකොජෙනසිස් ප්‍රගතිය සහ ක්‍රියාකාරකම් මත යැපෙන පිටපත් කිරීමේ වැඩසටහනක මතුවීම අනාවරණය විය. ඇත්ත වශයෙන්ම, බද්ධ කරන ලද කෝටිකොජෙනසිස් නියුරෝන ඒවායේ අභ්‍යන්තර සගයන්ට වඩා සංකීර්ණ රූප විද්‍යාත්මක, උපාගමික සහ අභ්‍යන්තර පටල ගුණාංග ප්‍රදර්ශනය කරන අතර, තිමෝතිගේ සින්ඩ්‍රෝමය ඇති රෝගීන්ගේ ස්නායු දෝෂ හඳුනා ගැනීමට ඉඩ සලසයි. ව්‍යුහ විද්‍යාත්මක හා ක්‍රියාකාරී ලුහුබැඳීම් මගින් බද්ධ කරන ලද අවයවයන්ට තලමොකෝටික සහ කෝටිකොකෝටික යෙදවුම් ලැබෙන බව පෙන්වා දී ඇති අතර, ස්නායු ක්‍රියාකාරකම්වල ජීව පටිගත කිරීම්වලින් පෙනී යන්නේ මෙම යෙදවුම් මිනිස් සෛල තුළ සංවේදී ප්‍රතිචාර ජනනය කළ හැකි බවයි. අවසාන වශයෙන්, කෝටිකොජෙනටික් කාබනික ද්‍රව්‍ය මීයන්ගේ මොළය පුරා අක්ෂයන් දිගු කරන අතර, ඒවායේ දෘෂ්ටි ජාන සක්‍රිය කිරීම විපාක සොයන හැසිරීමට හේතු වේ. මේ අනුව, බද්ධ කරන ලද මිනිස් බාහික ස්නායු පරිණත වී හැසිරීම පාලනය කරන ධාරකයාගේ පරිපථවලට සහභාගී වේ. මෙම ප්‍රවේශය වෙනත් ක්‍රම මගින් අනාවරණය කළ නොහැකි රෝගියාගෙන් ලබාගත් සෛලවල නූල් මට්ටමේ ෆීනෝටයිප් හඳුනා ගැනීමට පහසුකම් සපයනු ඇතැයි අපි අපේක්ෂා කරමු.
වර්ධනය වන මිනිස් මොළය යනු සෛල ප්‍රගුණනය, වෙනස් කිරීම, සංක්‍රමණය කිරීම සහ සම්බන්ධ වී ක්‍රියාකාරී ස්නායු පරිපථ සෑදීම සඳහා සංවේදක අත්දැකීම් හරහා තවදුරටත් පිරිපහදු කරන ලද කැපී පෙනෙන ස්වයං-සංවිධානාත්මක ක්‍රියාවලියකි. විශේෂයෙන් රෝග සන්දර්භය තුළ මිනිස් මොළයේ වර්ධනය තේරුම් ගැනීමේ ප්‍රධාන ගැටළුවක් වන්නේ මොළයේ පටක වලට ප්‍රවේශය නොමැතිකමයි. මානව බාහික ඕර්ගනොයිඩ් (hCO; මානව බාහික ගෝලය ලෙසද හැඳින්වේ) ඇතුළු ස්වයං-සංවිධානාත්මක ඉන්ද්‍රියයන් 2,3,4,5,6 ජනනය කළ හැකිය. කෙසේ වෙතත්, සීමාවන් කිහිපයක් ස්නායු පරිපථවල වර්ධනය සහ ක්‍රියාකාරිත්වය තේරුම් ගැනීමට ඒවායේ පුළුල් යෙදුම සීමා කරයි. විශේෂයෙන්, විවෝ තුළ පවතින ඇතැම් ක්ෂුද්‍ර පාරිසරික සහ සංවේදක යෙදවුම් නොමැති වීමෙන් hCO පරිණත වීම සීමා වේද යන්න පැහැදිලි නැත. ඊට අමතරව, hCOs හැසිරීම් ප්‍රතිඵල ජනනය කළ හැකි පරිපථවලට ඒකාබද්ධ කර නොමැති නිසා, ජානමය වශයෙන් සංකීර්ණ සහ හැසිරීම් ස්නායු මනෝචිකිත්සක ආබාධ ආකෘතිකරණය කිරීමේදී ඒවායේ උපයෝගීතාව දැනට සීමිතය.
hCO නොවෙනස්ව ජීවමාන මොළයකට බද්ධ කිරීමෙන් මෙම සීමාවන් ජය ගත හැකිය. මීයන් බාහිකයට බද්ධ කරන ලද මිනිස් නියුරෝන වලට මීයන් සෛල සමඟ නොනැසී පැවතීමට, ප්‍රක්ෂේපණය කිරීමට සහ සන්නිවේදනය කිරීමට හැකි බව පෙර අධ්‍යයනයන් පෙන්වා දී ඇත7,8,9,10,11,12. කෙසේ වෙතත්, මෙම අත්හදා බැලීම් සාමාන්‍යයෙන් වැඩිහිටි සතුන් මත සිදු කරනු ලබන අතර, එමඟින් උපාගමික සහ අක්ෂීය ඒකාබද්ධ කිරීම සීමා කළ හැකිය. මෙහිදී, අපි hiPS සෛල වලින් ලබාගත් 3D hCO ප්ලාස්ටික් සංවර්ධනයේ මුල් අවධියේදී ප්‍රතිශක්ති ඌනතා මීයන්ගේ ප්‍රාථමික සෝමාටෝසෙන්සරි බාහිකයට (S1) බද්ධ කළ බද්ධ කිරීමේ ආදර්ශයක් විස්තර කරමු. බද්ධ කරන ලද hCO (t-hCO) නියුරෝන සැලකිය යුතු පරිණතභාවයකට භාජනය වේ, සංවේදක ප්‍රතිචාර ලබා දෙන තලමොකෝටික සහ බාහික-බාහික යෙදවුම් ලබා ගනී, සහ විපාක සොයන හැසිරීම් මෙහෙයවීම සඳහා මී මොළයට අක්ෂීය ප්‍රක්ෂේපණ දිගු කරයි. t-hCO හි දිගු පරිණතභාවය වෝල්ටීයතා සංවේදී L-වර්ගයේ CaV1.2 කැල්සියම් නාලිකාවේ (CACNA1C මගින් කේතනය කර ඇත) විකෘති කිරීම් නිසා ඇතිවන දරුණු ජානමය ආබාධයක් වන තිමෝතිගේ සින්ඩ්‍රෝමය (TS) රෝගීන් තුළ ස්නායු දෝෂ අනාවරණය කර ඇත.
in vivo පරිපථවල මිනිස් බාහික නියුරෝන අධ්‍යයනය කිරීම සඳහා, අපි ඒකාකෘතිකව නොවෙනස්ව 3D hCO මුල් පශ්චාත් ප්‍රසව ඇටමික් මීයන්ගේ S1 වෙත බද්ධ කළෙමු (පසු ප්‍රසව දින 3-7) (රූපය 1a සහ රූපය 1a-c හි පුළුල් දත්ත). මෙම අවස්ථාවේදී, තලමොකෝටික සහ කෝටිකොකෝටික අක්ෂීය ප්‍රක්ෂේපණ තවමත් ඔවුන්ගේ S1 නවෝත්පාදනය සම්පූර්ණ කර නොමැත (ref. 13). මේ අනුව, මෙම ප්‍රවේශය නිර්මාණය කර ඇත්තේ අන්තරාසර්ග පරිපථවලට ඇති බලපෑම අවම කරන අතරම t-hCO ඒකාබද්ධ කිරීම උපරිම කිරීමටයි. සජීවී සතුන් තුළ t-hCO පිහිටීම දෘශ්‍යමාන කිරීම සඳහා, බද්ධ කිරීමෙන් මාස 2-3 කට පසු අපි මීයන්ගේ T2-බර MRI මොළයේ ප්‍රතිනිර්මාණයන් සිදු කළෙමු (රූපය 1b සහ දීර්ඝ දත්ත, රූපය 1d). t-hCO පහසුවෙන් නිරීක්ෂණය කරන ලද අතර t-hCO හි පරිමාව මැනීම් ස්ථාවර පෙති වලින් ගණනය කරන ලද ඒවාට සමාන විය (විස්තීරණ දත්ත රූපය 1d,e; P > 0.05). t-hCO පහසුවෙන් නිරීක්ෂණය කරන ලද අතර t-hCO හි පරිමාව මැනීම් ස්ථාවර පෙති වලින් ගණනය කරන ලද ඒවාට සමාන විය (විස්තීරණ දත්ත රූපය 1d,e; P > 0.05). t-hCO ලෙග්කෝ නැබ්ලිඩලිස්, а объемные измерения t-hCO били анлогичны рассчитанныm для фиксированыm данные, рис 1d, e> 0,05). t-hCO පහසුවෙන් නිරීක්ෂණය කළ හැකි වූ අතර, පරිමාමිතික t-hCO මිනුම් ස්ථාවර කොටස් සඳහා ගණනය කරන ලද ඒවාට සමාන විය (ප්‍රසාරණය කළ දත්ත, රූපය 1d, e; P > 0.05).很容易观察到t-hCO，并且t-hCO的体积测量值与从固定切片计算的测量值相似（扩展数据图1d、e；P > 0.05很容易观察到t-hCO，并且t-hCO t-hCO ledalsya, а объемные измерения t-hCO бли анлогичны рассчитанным для фиксироваными данные, рис 1d, e> 0,05). t-hCO පහසුවෙන් නිරීක්ෂණය කළ හැකි වූ අතර, පරිමාමිතික t-hCO මිනුම් ස්ථාවර කොටස් සඳහා ගණනය කරන ලද ඒවාට සමාන විය (ප්‍රසාරණය කළ දත්ත, රූපය 1d, e; P > 0.05).බද්ධ කිරීමෙන් මාස 2 කට පමණ පසු බද්ධ කරන ලද සතුන්ගෙන් 81% ක් තුළ අපි t-hCO තීරණය කළෙමු (n = සතුන් 72; hiPS සෛල රේඛා 10 කින් hCO; අතිරේක වගුව 1 හි hiPS සෛල රේඛා). මෙයින් 87% ක් මස්තිෂ්ක බාහිකයේ පිහිටා ඇත (රූපය 1c). එකම බද්ධ කරන ලද මීයා තුළ බහු කාල ලක්ෂ්‍යවල අනුක්‍රමික MRI ස්කෑන් සිදු කිරීමෙන්, මාස 3 ක් ඇතුළත t-hCO පරිමාවේ නව ගුණයකින් වැඩි වීමක් අපට හමු විය (රූපය 1d සහ පුළුල් කරන ලද දත්ත, රූපය 1f). බද්ධ කරන ලද සතුන්ට බද්ධ කිරීමෙන් පසු මාස ​​12 දී ඉහළ පැවැත්මේ අනුපාතයක් (74%) තිබුණි (ප්‍රසාරණය කරන ලද දත්ත, රූපය 1g සහ අතිරේක වගුව 2), සහ කිසිදු ප්‍රකාශිත මෝටර් හෝ මතක දුර්වලතා, ග්ලියෝසිස් හෝ විද්‍යුත් එන්සෙෆලෝග්‍රෑම් (EEG) හමු නොවීය. දත්ත රූපය 1g සහ අතිරේක වගුව 2). 1h–m සහ 3e).
a, පර්යේෂණාත්මක නිර්මාණයේ ක්‍රමලේඛනය. hiPS සෛල වලින් ලබාගත් hCO අවකලනය කිරීමෙන් 30-60 දිනවල අලුත උපන් නිරුවත් මීයන්ගේ S1 වෙත බද්ධ කරන ලදී. b, බද්ධ කිරීමෙන් මාස 2 කට පසු S1 හි t-hCO පෙන්වන T2-බර කිරීටක සහ තිරස් MRI රූප. පරිමාණ තීරුව, 2 mm. c, එක් එක් hiPS සෛල රේඛාව සඳහා පෙන්වන කැටයම් සාර්ථකත්ව අනුපාත ප්‍රමාණනය කිරීම (n = 108, තීරු තුළ ඇති සංඛ්‍යා hIPS සෛල රේඛාවකට t-hCO ප්‍රමාණය දක්වයි) සහ බාහික හෝ උපකෝටිකල් පිහිටීම (n = 88). d, කිරීටක ධමනියක MRI රූපය (වමේ; පරිමාණ තීරුව, 3 mm) සහ අනුරූප 3D පරිමාමිතික ප්‍රතිනිර්මාණය (පරිමාණ තීරුව, 3 mm) මාස 3 ක් තුළ t-hCO හි වැඩිවීමක් පෙන්නුම් කරයි. e, මීයන්ගේ මස්තිෂ්ක බාහිකයේ t-hCO රටා සමාලෝචනය. පරිමාණ තීරුව, 1 mm. f, ඉහළ වමේ සිට දකුණට (අවකලනය අතරතුර) දැක්වෙන t-hCO හි නියෝජිත ප්‍රතිශක්ති සෛල රසායනික රූප: PPP1R17 (මාස 4 ක් පැරණි), NeuN (මාස 8 ක් පැරණි), SOX9 සහ GFAP (මාස 8 ක් පැරණි), PDGFRα; (මාස 8), MAP2 (මාස 8) සහ IBA1 (මාස 8). පරිමාණ තීරුව, 20 µm. HNA හි සම-ප්‍රකාශනය මිනිස් සම්භවයක් ඇති සෛල පෙන්නුම් කරයි. g, snRNA-seq: Seurat ඒකාබද්ධ කිරීමෙන් පසු සියලුම උසස් තත්ත්වයේ t-hCO න්‍යෂ්ටිවල ඒකාබද්ධ බහුවිධ සහ ප්‍රක්ෂේපණ (UMAP) මානයන් අඩු කිරීමේ රූපකරණය (n=3 t-hCO සාම්පල, n=2 hiPS සෛල රේඛා). තාරකා සෛල, තාරකා සෛල රේඛාවේ සෛල; cyc prog, සංසරණ පූර්වජ; GluN DL, ගැඹුරු ග්ලූටමැටර්ජික් නියුරෝන; GluN DL/SP, ගැඹුරු සහ උපලැමෙලර් ග්ලූටමැටර්ජික් නියුරෝන; GluN UL, ඉහළ ස්ථරයේ ග්ලූටමැටර්ජික් නියුරෝන; ඔලිගොඩෙන්ඩ්‍රොසයිට්, ඔලිගොඩෙන්ඩ්‍රොසයිට්; OPC, ඔලිගොඩෙන්ඩ්‍රොසයිට් ප්‍රොජෙනිටර් සෛල; RELN, රීලින් නියුරෝන. h, hCO ග්ලූටමැටර්ජික් නියුරෝන සමඟ සසඳන විට t-hCO ග්ලූටමැටර්ජික් නියුරෝන වල සැලකිය යුතු ලෙස ඉහළ නංවන ලද (ගැලපුම් කරන ලද P < 0.05, ගුණයක වෙනස > 2, අවම වශයෙන් 10% ක න්‍යෂ්ටිවල ප්‍රකාශිත) ජානවල ජාන ඔන්ටොලොජි (GO) පද පොහොසත් කිරීමේ විශ්ලේෂණය. h, hCO ග්ලූටමැටර්ජික් නියුරෝන සමඟ සසඳන විට t-hCO ග්ලූටමැටර්ජික් නියුරෝන වල සැලකිය යුතු ලෙස ඉහළ නංවන ලද (ගැලපුම් කරන ලද P < 0.05, ගුණයක වෙනස > 2, අවම වශයෙන් 10% ක න්‍යෂ්ටිවල ප්‍රකාශිත) ජානවල ජාන ඔන්ටොලොජි (GO) පද පොහොසත් කිරීමේ විශ්ලේෂණය. h, ඇනලිස් ඔබෝගෂෙනියම් තර්මිනෝව් ජාන ඔන්ටොලොජි (GO) для genов со значительной активацией (скоректированный, по 0, измения > 2, එක්ස්ප්‍රෙස්සියා පො ක්‍රයිනෙයි මෙරේ වර් 10% යාඩර්) සහ ග්ලූටමැටෙර්ගිචෙක්ස් නෙයිරොනාහ් ටී-එච්සීඕ පෝ ප්‍රචාරණ глутаматергическими нейронами hCO. h, hCO ග්ලූටමැටර්ජික් නියුරෝන හා සසඳන විට t-hCO ග්ලූටමැටර්ජික් නියුරෝන වල සැලකිය යුතු සක්‍රියකරණයක් සහිත ජාන සඳහා ජාන ඔන්ටොලොජි (GO) පද පොහොසත් කිරීමේ විශ්ලේෂණය (සකස් කරන ලද P<0.05, නැමීමේ වෙනස >2, අවම වශයෙන් 10% න්‍යෂ්ටිවල ප්‍රකාශනය). h, 与hCO 谷氨酸能神经元相比，t-hCO 谷氨酸能神经元中基因显着上调（调整喕, 2，在至少10% 的细胞核中表达）的基因本体论(GO) 术语富集分析。 h , 与 hco 谷氨酸 能 元 相比 , t-hco 谷氨酸 能 神经 元 基因 显着 上调 （后变化> 2 , 至少 10% ක් පමණ的 的本体论(GO) 术语富集分析。 h, genы значительно активизировались (скоректированный P <0,05, кратность изменения> 2, экспрессирует 10% yader) в глутаматергических нейронах t-hCO по сравнению с глутаматергическими нейронами hCO ONTO) ටර්මිනා ඔබේ අවධානය. h, ජාන සැලකිය යුතු ලෙස ඉහළ නංවා ඇත (සකස් කරන ලද P < 0.05, ගුණයකින් වෙනස් වීම > 2, අවම වශයෙන් න්යෂ්ටිවලින් 10% ක් තුළ ප්රකාශිත) hCO ග්ලූටමැටර්ජික් නියුරෝන හා සසඳන විට t-hCO ග්ලූටමැටර්ජික් නියුරෝන වල පොහොසත් කිරීමේ පදයේ ඔන්ටොලොජිකල් (GO) විශ්ලේෂණය.තිත් රේඛාව 0.05 ක aq අගයක් දක්වයි. i, යොමු 22 snRNA-seq වැඩිහිටි මෝටර් බාහික දත්ත කට්ටලයකින් ලේබල් මාරු කිරීම භාවිතා කරමින් t-hCO හි GluN සෛල වර්ගවල UMAP ප්‍රතිබිම්භකරණය. CT - කෝටිකොතලමික් සෛල, ET - බාහිර මස්තිෂ්ක සෛල, IT - අභ්‍යන්තර ටෙලෙන්ස්ෆලික් සෛල, NP - ප්‍රක්ෂේපණය අසල.
ඉන්පසු අපි t-hCO හි සයිටොආර්කිටෙක්චර් සහ සමස්ත සෛලීය සංයුතිය තක්සේරු කළෙමු. මීයන්ගේ එන්ඩොතලියල් සෛලවල ප්‍රතිදේහ පැල්ලම් කිරීම t-hCO සමඟ සනාලීකරණය අනාවරණය කළ අතර, IBA1 පැල්ලම් කිරීම බද්ධ කිරීම පුරා මීයන්ගේ ක්ෂුද්‍ර ග්ලියා පවතින බව අනාවරණය කළේය (රූපය 1f සහ පුළුල් කළ දත්ත, රූපය 3c,d). ප්‍රතිශක්තිකරණ පැල්ලම් කිරීම මගින් PPP1R17 (බාහික ප්‍රජනක), NeuN (නියුරෝන), SOX9 සහ GFAP (ග්ලියල්-ව්‍යුත්පන්න සෛල) හෝ PDGFRα (ඔලිගොඩෙන්ඩ්‍රොසයිට් ප්‍රජනක) සම-ප්‍රකාශ කරන මානව න්‍යෂ්ටික ප්‍රතිදේහජනක (HNA) ධනාත්මක සෛල අනාවරණය කළේය (රූපය 1f). තනි සෛල විභේදනයේදී t-hCO හි සෛලීය සංයුතිය අධ්‍යයනය කිරීම සඳහා, අපි ආසන්න වශයෙන් මාස 8 ක අවකලනයකින් පසු තනි-හර RNA අනුක්‍රමණය (snRNA-seq) සිදු කළෙමු. මීයන්ගේ න්‍යෂ්ටීන් තොග වශයෙන් පෙරීම සහ ඉවත් කිරීම උසස් තත්ත්වයේ මානව ඒක න්‍යෂ්ටික සිතියම් 21,500 ක් ලබා දුන්නේය (රූපය 1g සහ පුළුල් කළ දත්ත, රූපය 4a,b). සාමාන්‍ය සෛල වර්ගයේ සලකුණු වල ප්‍රකාශන රටා මගින් ගැඹුරු සහ මතුපිට ග්ලූටමැටර්ජික් නියුරෝන, සංසරණය වන පූර්වගාමීන්, ඔලිගොඩෙන්ඩ්‍රොසයිට් සහ තාරකා සෛල පරම්පරාව (රූපය 1g, පුළුල් කළ දත්ත, රූපය 4c, සහ අතිරේක වගුව 3) ඇතුළුව ප්‍රධාන බාහික සෛල පන්තිවල පොකුරු හඳුනා ගන්නා ලදී. SATB2 සහ CTIP2 සඳහා ප්‍රතිශක්තිකරණ පැල්ලම් කිරීම පෙන්නුම් කළේ බාහික උප වර්ග පැවතුනද, t-hCO පැහැදිලි ව්‍යුහ විද්‍යාත්මක ස්ථරීකරණයක් නොපෙන්වූ බවයි (ප්‍රසාරණය කළ දත්ත, රූපය 3a). අදියර-ගැලපෙන snRNA-seq hCO ඔලිගොඩෙන්ඩ්‍රොසයිට් නොමැතිකම සහ GABAergic නියුරෝන පැවතීම ඇතුළුව ව්‍යතිරේක කිහිපයක් සමඟ පුළුල් ලෙස සමාන සෛල පන්ති නිපදවූ අතර, එය පාර්ශ්වීය පූර්වගාමී සෛල සඳහා කලින් වාර්තා වූ හිතකර in vitro තත්වයන් පිළිබිඹු කළ හැකිය15 (ප්‍රසාරණය කළ දත්ත, රූපය 4f - i සහ අතිරේක වගුව 4). අවකල ජාන ප්‍රකාශන විශ්ලේෂණය මගින් t-hCO සහ hCO අතර ග්ලූටමැටර්ජික් නියුරෝන වල සැලකිය යුතු වෙනස්කම් අනාවරණය විය (පරිපූරක වගුව 5), සිනැප්ටික් සංඥාකරණය, ඩෙන්ඩ්‍රිටික් ප්‍රාදේශීයකරණය සහ වෝල්ටීයතා-ගේටඩ් නාලිකා ක්‍රියාකාරිත්වය වැනි ස්නායු පරිණතභාවයට සම්බන්ධ ජාන කට්ටල සක්‍රීය කිරීම ඇතුළුව (රූපය 1h සහ පරිපූරක වගුව 5). වගුව 6). ඒ අනුව, බාහික ග්ලූටමැටර්ජික් t-hCO නියුරෝන වේගවත් පිටපත් කිරීමේ පරිණතභාවයක් පෙන්නුම් කළේය.
t-hCO හි මෙම පිටපත් කිරීමේ වෙනස්කම් hCO in vitro සහ t-hCO in vivo අතර රූප විද්‍යාත්මක වෙනස්කම් සමඟ සම්බන්ධ වී ඇත්දැයි පැහැදිලි කිරීම සඳහා, අපි මාස 7-8 ක අවකලනයකින් පසු උග්‍ර කොටස්වල අදියර-ගැලපෙන බයෝසයිටින්-පිරවූ hCO සහ hCO ප්‍රතිනිර්මාණය කළෙමු. hCO නියුරෝන (රූපය 2a). t-hCO නියුරෝන සැලකිය යුතු ලෙස විශාල වූ අතර, සෝමා විෂ්කම්භය මෙන් 1.5 ගුණයක්, ඩෙන්ඩ්‍රයිට් මෙන් දෙගුණයක් සහ in vitro hCO හා සසඳන විට මුළු ඩෙන්ඩ්‍රිටික් දිගෙහි සමස්ත හය ගුණයක වැඩිවීමක් තිබුණි (රූපය 2b). ඊට අමතරව, hCO නියුරෝන වලට වඩා t-hCO නියුරෝන වල ඩෙන්ඩ්‍රිටික් කොඳු ඇට පෙළේ සැලකිය යුතු ලෙස ඉහළ ඝනත්වයක් අපි නිරීක්ෂණය කළෙමු (රූපය 2c). මෙයින් ඇඟවෙන්නේ t-hCO නියුරෝන පුළුල් ඩෙන්ඩ්‍රිටික් දිගු කිරීමකට සහ අතු බෙදීමකට භාජනය වන බවයි, එය අඛණ්ඩ සෛල ප්‍රගුණනය සමඟ ඒකාබද්ධව, බද්ධ කිරීමෙන් පසු t-hCO හි දැඩි වර්ධනයට දායක විය හැකිය (රූපය 1d සහ විස්තීර්ණ දත්ත රූපය 1f). මෙය විද්‍යුත් භෞතික විද්‍යාත්මක ගුණාංග විමර්ශනය කිරීමට අපව පොළඹවන ලදී. පටල ධාරිතාව අට ගුණයකින් වැඩි විය (ප්‍රසාරණය වූ දත්ත, රූපය 8d), විවේක-තත්ව පටල විභවය වඩාත් අධි ධ්‍රැවීකරණය විය (ආසන්න වශයෙන් 20 mV), සහ ධාරාව එන්නත් කිරීම hCO නියුරෝන වලට වඩා t-hCO නියුරෝන වල ඉහළ උපරිම උද්දීපන අනුපාතයක් ඇති කළේය. in vitro (රූපය 2d), e), එය t-hCO හි විශාල හා වඩාත් සංකීර්ණ රූප විද්‍යාත්මක ලක්ෂණ සමඟ අනුකූල වේ. ඊට අමතරව, ස්වයංසිද්ධ උද්දීපන පශ්චාත්-සිනාප්ටික් ධාරා සිදුවීම් (EPSC) සංඛ්‍යාතය t-hCO නියුරෝන වල සැලකිය යුතු ලෙස වැඩි විය (රූපය 2f), t-hCO නියුරෝන වල නිරීක්ෂණය කරන ලද ඩෙන්ඩ්‍රිටික් කොඳු ඇට පෙළේ වැඩි ඝනත්වය ක්‍රියාකාරී උද්දීපන හැකියාව සමඟ සම්බන්ධ වී ඇති බව යෝජනා කරයි. ලිංගික උපාගම. ලේබල් කරන ලද ග්ලූටමැටර්ජික් නියුරෝන (ප්‍රසාරණය වූ දත්ත, රූපය 6a-c) පටිගත කිරීමෙන් අපි hCO නියුරෝන වල නොමේරූ ස්වභාවය තහවුරු කළෙමු.
a, මාස 8ක අවකලනයකින් පසු බයෝසයිටින්-පිරවූ hCO සහ t-hCO නියුරෝනවල ත්‍රිමාණ ප්‍රතිනිර්මාණය. b, රූප විද්‍යාත්මක ලක්ෂණ ප්‍රමාණනය කිරීම (n = 8 hCO නියුරෝන, n = 6 t-hCO නියුරෝන; **P = 0.0084, *P = 0.0179 සහ ***P < 0.0001). b, රූප විද්‍යාත්මක ලක්ෂණ ප්‍රමාණනය කිරීම (n = 8 hCO නියුරෝන, n = 6 t-hCO නියුරෝන; **P = 0.0084, *P = 0.0179 සහ ***P < 0.0001). б, количественная оценка морфологических признаков (n = 8 нейронов hCO, n = 6 нейронов t-hCO; ** P = 0, 0,0 = 80, * 0,0 <0,0001). b, රූප විද්‍යාත්මක ලක්ෂණ ප්‍රමාණනය කිරීම (n=8 hCO නියුරෝන, n=6 t-hCO නියුරෝන; **P=0.0084, *P=0.0179, සහ ***P<0.0001). b,形态学特征的量化（n = 8 个hCO 神经元,n = 6 个t-hCO 神经元；**P = 0.0084,*P = 0.00179 b,形态学特征的量化（n = 8 个hCO 神经元,n = 6 个t-hCO 神经元；**P = 0.0084,*P = 0.00179 б, количественная оценка морфологических признаков (n = 8 нейронов hCO, n = 6 нейронов t-hCO; ** P = 0, 0,0 = 80, * 0,0 <0,0001). b, රූප විද්‍යාත්මක ලක්ෂණ ප්‍රමාණනය කිරීම (n=8 hCO නියුරෝන, n=6 t-hCO නියුරෝන; **P=0.0084, *P=0.0179, සහ ***P<0.0001).c, මාස 8 ක අවකලනයකින් පසු hCO සහ t-hCO ඩෙන්ඩ්‍රිටික් ශාඛා ත්‍රිමාණ ප්‍රතිනිර්මාණය කිරීම. රතු තරු ලකුණු මගින් අනුමාන ඩෙන්ඩ්‍රිටික් කශේරුකා දක්වයි. ඩෙන්ඩ්‍රිටික් කශේරුකා ඝනත්ව ප්‍රමාණනය (n = 8 hCO නියුරෝන, n = 6 t-hCO නියුරෝන; **P = 0.0092). d, විවේක පටල විභවය ප්‍රමාණනය කිරීම (n = 25 hCO නියුරෝන, n = 16 t-hCO නියුරෝන; ***P < 0.0001). d, විවේක පටල විභවය ප්‍රමාණනය කිරීම (n = 25 hCO නියුරෝන, n = 16 t-hCO නියුරෝන; ***P < 0.0001). d, количественная оценка мембранного потенциала покоя (n = 25 нейронов hCO, n = 16 нейронов t-hCO,0 *** P10). d, විවේක පටල විභව ප්‍රමාණනය (n = 25 hCO නියුරෝන, n = 16 t-hCO නියුරෝන; ***P < 0.0001). d,静息膜电位的量化（n = 25 hCO 神经元，n = 16 t-hCO 神经元；***P <0.0001）。 d,静息膜电位的量化（n = 25 hCO 神经元，n = 16 t-hCO 神经元；***P <0.0001）。 d, количественная оценка мембранного потенциала покоя (n = 25 нейронов hCO, n = 16 нейронов t-hCO,0 *** P10). d, විවේක පටල විභව ප්‍රමාණනය (n = 25 hCO නියුරෝන, n = 16 t-hCO නියුරෝන; ***P < 0.0001). e, hCO සහ t-hCO වල පුනරාවර්තන ක්‍රියාකාරී විභව වෙඩි තැබීම වැඩි කිරීමෙන් ප්‍රේරණය වන අතර උපරිම වෙඩි තැබීමේ අනුපාතය ප්‍රමාණනය කිරීම (n = 25 hCO නියුරෝන, n = 16 t-hCO නියුරෝන; ***P < 0.0001). e, hCO සහ t-hCO වල පුනරාවර්තන ක්‍රියාකාරී විභව වෙඩි තැබීම වැඩි කිරීමෙන් ප්‍රේරණය වන අතර උපරිම වෙඩි තැබීමේ අනුපාතය ප්‍රමාණනය කිරීම (n = 25 hCO නියුරෝන, n = 16 t-hCO නියුරෝන; ***P < 0.0001). e, повторное возбуждение потенциала действия в hCO и t-hCO , вызванное увеличением тока, и колически максимальной скорости возбуждения (n = 25 нейронов hCO, n = 16 нейронов t-hCO; *** P <0,0001). e, උපරිම වෙඩි තැබීමේ අනුපාතයේ ධාරාව වැඩිවීම සහ ප්‍රමාණනය මගින් ප්‍රේරණය කරන ලද hCO සහ t-hCO හි ක්‍රියාකාරී විභවය නැවත වෙඩි තැබීම (n = 25 hCO නියුරෝන, n = 16 t-hCO නියුරෝන; *** P < 0.0001). e,通过增加电流注入诱导的hCO 和t-hCO 重复动作电位放电，以及最大放电率的最大放电率的神经元，n = 16 个t-hCO 神经元；***P <0.0001）。 E , 通过 增加 电流 注入 的 的 hco 和 t-hco 重复 电位 放电 , 以及 最 大 皖 =2 hco 量神经 , n = 16 个 t-hco 神经 ； *** p <0.0001） . e, повторяющеся возбуждение потенциала действия hCO සහ t-hCO, вызваное увеличением подалечение оценка максимальной скорости возбуждения (n = 25 нейронов hCO, n = 16 нейронов t-hCO; *** P <0,0001). e, වැඩි ධාරා සැපයුමක් මගින් ප්‍රේරණය වන hCO සහ t-hCO ක්‍රියාකාරී විභවයන් නැවත නැවත දැල්වීම සහ උපරිම වෙඩි තැබීමේ අනුපාතය ප්‍රමාණනය කිරීම (n = 25 hCO නියුරෝන, n = 16 t-hCO නියුරෝන; *** P < 0.0001). f, hCO සහ t-hCO නියුරෝන වල ස්වයංසිද්ධ EPSCs (sEPSCs) අවකලනය මාස 8 කදී, සහ උපාගමික සිදුවීම් සංඛ්‍යාතය ප්‍රමාණනය කිරීම (n = 25 hCO නියුරෝන, n = 17 t-hCO නියුරෝන; ***P < 0.0001). f, hCO සහ t-hCO නියුරෝන වල මාස 8 ක අවකලනයකදී ස්වයංසිද්ධ EPSCs (sEPSCs), සහ උපාගමික සිදුවීම්වල සංඛ්‍යාතය ප්‍රමාණනය කිරීම (n = 25 hCO නියුරෝන, n = 17 t-hCO නියුරෝන; ***P < 0.0001). f, spontannыe EPSC (sEPSC) NEIRONHAHCO සහ t-hCO චෙරෙස් 8 මෙසියස්වේව් ඩීෆෆරන්සයිරොව්කි සහ කොලිචෙස්ට්වෙන්ට් ඔෆ් синаптических событий (n = 25 нейронов hCO, n = 17 нейронов t-hCO; *** P <0,0001) . f, hCO සහ t-hCO නියුරෝන වල ස්වයංසිද්ධ EPSCs (sEPSCs) උපාගමික සිදුවීම් අනුපාත අවකලනය සහ ප්‍රමාණනය කිරීමේ මාස 8 කදී (n=25 hCO නියුරෝන, n=17 t-hCO නියුරෝන; ***P<0.0001). f，分化8 个月时hCO 和t-hCO 神经元中的自发性EPSCs (sEPSCs), 以及突触事件频率的事件频率的量神经元，n = 17 t-hCO 神经元；***P <0.0001） . f，分化8 个月时hCO 和t-hCO 神经元中的自发性EPSCs (sEPSCs), 以及突触事件频率的事件频率的量神率的量匼（n = 25 hCO 神率的量匼（n = 25hCO P <0.0001） . f, spontannыe EPSC (sEPSC) NEIRONHAHCO සහ t-hCO චෙරෙස් 8 මෙසියස්වේව් ඩීෆෆරන්සයිරොව්කි සහ කොලිචෙස්ට්වෙන්ට් ඔෆ් синаптических событий (n = 25 нейронов hCO, n = 17 нейронов t-hCO; *** P <0,0001). f, hCO සහ t-hCO නියුරෝන වල ස්වයංසිද්ධ EPSCs (sEPSCs) උපාගමික සිදුවීම් අනුපාත අවකලනය සහ ප්‍රමාණනය කිරීමේ මාස 8 කදී (n = 25 hCO නියුරෝන, n = 17 t-hCO නියුරෝන; *** P<0.0001).bf සඳහා, 1208-2 පේළියේ hCO සහ t-hCO සමාන්තරව පවත්වා ගෙන යන එකම අවකලනය කාණ්ඩයෙන් ලබා ගන්නා ලදී. g, hCO සමඟ සසඳන විට t-hCO හි සැලකිය යුතු ලෙස ඉහළ නංවන ලද (ගැලපුම් කරන ලද P < 0.05, නැමීමේ වෙනස > 2, න්‍යෂ්ටිවලින් අවම වශයෙන් 10% කින් ප්‍රකාශිත) ජාන කට්ටල පොහොසත් කිරීමේ විශ්ලේෂණය (ඒකපාර්ශ්වික ෆිෂර්ගේ නිශ්චිත පරීක්ෂණය) ග්ලූටමැටර්ජික් නියුරෝන වල gCO සමඟ සසඳන විට in vivo මූසික අධ්‍යයනයකින් හඳුනාගත් මුල් ප්‍රතිචාර (ERG) සහ ප්‍රමාද ප්‍රතිචාර (LRG) ක්‍රියාකාරකම් මත යැපෙන ජාන දෙකෙහිම ජාන කට්ටල සහිත ග්ලූටමැටර්ජික් නියුරෝන16 සහ in vitro නියුරෝන17 වලින් මානව-විශේෂිත LRGs. g, hCO සමඟ සසඳන විට t-hCO හි සැලකිය යුතු ලෙස ඉහළ නංවන ලද (ගැලපුම් කරන ලද P < 0.05, නැමීමේ වෙනස > 2, න්‍යෂ්ටිවලින් අවම වශයෙන් 10% කින් ප්‍රකාශිත) ජාන කට්ටල පොහොසත් කිරීමේ විශ්ලේෂණය (ඒකපාර්ශ්වික ෆිෂර්ගේ නිශ්චිත පරීක්ෂණය) ග්ලූටමැටර්ජික් නියුරෝන වල gCO සමඟ සසඳන විට in vivo මූසික අධ්‍යයනයකින් හඳුනාගත් මුල් ප්‍රතිචාර (ERG) සහ ප්‍රමාද ප්‍රතිචාර (LRG) ක්‍රියාකාරකම් මත යැපෙන ජාන දෙකෙහිම ජාන කට්ටල සහිත ග්ලූටමැටර්ජික් නියුරෝන16 සහ in vitro නියුරෝන17 වලින් මානව-විශේෂිත LRGs. g, analyz обогащения набора генов (односторонний точный критерий फिशेरा) පි t-hCO по сравнению с ග්ලූටමැටෙර්ගිචෙස්කිමි නියිරොනාමි එච්සීඕ නැබෝරි ජෙනෝව් කැක් රන්නෙගෝ (ඊආර්ජී) vivo16 හි මිෂාහ් සහ විද්‍යාඥයින් විසින් චෙලෝවෙකා LRG из нейрон7в и селовека. g, t-hCO හි සැලකිය යුතු සක්‍රියකරණයක් සහිත ජානවල ජාන කට්ටල පොහොසත් කිරීම (එක්-වලිග ෆිෂර්ගේ නිශ්චිත පරීක්ෂණය) විශ්ලේෂණය (සකස් කරන ලද P<0.05, නැමීමේ වෙනස >2, න්‍යෂ්ටිවලින් අවම වශයෙන් 10% ක ප්‍රකාශනය) hCO හා සසඳන විට මුල් (ERG) සහ ප්‍රමාද (LRG) ක්‍රියාකාරකම් මත යැපෙන ජාන දෙකෙහිම ග්ලූටමැටර්ජික් නියුරෝන කට්ටල in vivo mice16 සහ vitro හි නියුරෝන වලින් මානව-විශේෂිත LRGs17. g,t-hCO谷氨酸能神经元与hCO谷氨酸能神经元相比，t -hCO谷氨酸能神经元显着上调（调整后P<0.05，倍数变化>2，在至少10%的细胞核中表达）的基因集富集分析（单侧F isher精确检验）从体内小鼠研究中鉴定的早期反应(ERG) 和晚期反应(LRG) 活性依赖性基因的基因组16 和体外神经元17 中的人RGL g , t-hco 谷氨酸 神经 元 与 hco 谷氨酸 神经 元 相比 , t-hco 谷氨酸 神经 元 上 谷氨酸 神经2小鼠 研究 中 的 早期 反应 反应 反应 和 晚期 反应 反应 (lrg) 活性 基因 皠 基神经元 神经元 17 中 中 17 中 17的人类特异性LRG。 g, glutamatergicheskie neyronы t-hCO были значительно активизированы по сравнению с глутаматергические нейроны t-hCO (скорректированный P<0,05, кратность изменения> 2, менее 10% ඇනලිස් обогащения набора геновитовытойто ටෙස්ට් ෆිෂෙරා) rannego ඔට්වෙටා (ඊආර්ජී) සහ පොස්ඩ්නෙගෝ ගෙන්, ඇක්ටිව්නොස්ටි ඔට්වෙටා (එල්ආර්ජී) වෙතින් යථා තත්ත්වයට පත් කිරීම, විවිධ ආකාරවලින් и нейронах in vitro17. එල්ආර්ජී, ස්පීසිෆිචින් ඩිලා චෙලෝවෙකා. g, t-hCO ග්ලූටමැටර්ජික් නියුරෝන hCO ග්ලූටමැටර්ජික් නියුරෝන හා සසඳන විට සැලකිය යුතු ලෙස ඉහළ නංවා ඇත (සකස් කරන ලද P<0.05, නැමීමේ වෙනස >2, අවම වශයෙන් 10% මුල් ප්‍රතිචාරය (ERG) සහ ප්‍රමාද ප්‍රතිචාර ජාන පොහොසත් කිරීමේ විශ්ලේෂණය (එක්-වලිග සහිත ෆිෂර්ගේ නිශ්චිත පරීක්ෂණය) ප්‍රතිචාර ක්‍රියාකාරකම් මත යැපෙන ජාන (LRGs) in vivo mice16 සහ in vitro neurons හි හඳුනාගෙන ඇත.17 මානව විශේෂිත LRGs.තිත් රේඛාවෙන් පෙන්නුම් කරන්නේ බොන්ෆෙරෝනි නිවැරදි කරන ලද P අගය 0.05. h බවයි, t-hCO ග්ලූටමැටර්ජික් නියුරෝන වල LRG ජානවල snRNA-seq අනුරූ වල GluN ජාන ප්‍රකාශනය (එක් එක් ජානයේ ව්‍යාජ පැකේජය සහ පරිමාණය) සැලකිය යුතු ලෙස ඉහළ නංවා ඇත. i, t-hCO (ඉහළ) සහ hCO (පහළ) නියුරෝන වල SCG2 ප්‍රකාශනය පෙන්වන ප්‍රතිශක්තිකරණ වර්ණ ගැන්වීම. සුදු ඊතල SCG2+ සෛල වෙත යොමු කරයි. පරිමාණ තීරුව, 25 µm. දත්ත මධ්‍යන්‍ය ± සම්මත අපගමනය ලෙස ප්‍රකාශ වේ.
ex vivo පෙති වල නිරීක්ෂණය කරන ලද t-hCO හි වැඩි ක්‍රියාකාරිත්වය මත පදනම්ව, snRNA-seq මගින් hCO in vitro හා සසඳන විට t-hCO හි ජාන පිටපත් වල ක්‍රියාකාරකම් මත යැපෙන ඉහළ නියාමනයක් අනාවරණය විය. ග්ලූටමැටර්ජික් t-hCO නියුරෝන ප්‍රමාද ප්‍රතිචාර ක්‍රියාකාරකම් නියාමනය කරන ජානවල ඉහළ මට්ටම් ප්‍රකාශ කළේය (රූපය 2g,h), ඒවා මීයන් සහ මානව නියුරෝන වල පෙර අධ්‍යයනයන්හිදී සොයා ගන්නා ලදී16,17. උදාහරණයක් ලෙස, ප්‍රයිමේට්-විශේෂිත ක්‍රියාකාරකම්-නියාමනය කරන ජානයක් වන BDNF18, SCG2 සහ OSTN, hCO නියුරෝන වලට සාපේක්ෂව t-hCO නියුරෝන වල වැඩි ප්‍රකාශනයක් පෙන්නුම් කළේය (රූපය 2g-i). මේ අනුව, t-hCO නියුරෝන පිටපත් කිරීමේ, රූප විද්‍යාත්මක සහ ක්‍රියාකාරී විශ්ලේෂණයන් මගින් hCO නියුරෝන වලට සාපේක්ෂව වැඩි දියුණු කළ පරිණත ලක්ෂණ ප්‍රදර්ශනය කළේය.
මිනිස් මොළයේ වර්ධනය සමඟ t-hCO පරිණතභාවයේ සම්බන්ධය තවදුරටත් ඇගයීම සඳහා, අපි භ්‍රෑණ සහ වැඩිහිටි බාහික සෛල වර්ග 19,20 සහ වැඩිහිටි 21,22 මෙන්ම සංවර්ධනය අතරතුර බාහික ජාන ප්‍රකාශනය 23 පිළිබඳ පුළුල් දත්ත (ප්‍රසාරණය කළ දත්ත, රූපය 5) පිටපත් කිරීමේ සංසන්දනයන් සිදු කළෙමු. පෙර කාර්යය 24 සමඟ, මාස 7-8 ක අවකලනයකදී ගෝලීය hCO සහ t-hCO පිටපත් කිරීමේ පරිණත තත්ත්වය පුළුල් ලෙස in vivo සංවර්ධන කාලයට අනුකූල වන අතර එය ප්‍රමාද වූ කලලරූපී ජීවිතයට බොහෝ දුරට සමාන වේ (ප්‍රසාරණය කළ දත්ත රූපය 5a). විශේෂයෙන්, වයසට ගැළපෙන hCO හා සසඳන විට t-hCO හි වැඩි පිටපත් කිරීමේ පරිණතභාවය මෙන්ම සිනැප්ටොජෙනිස්, තාරකා උත්පාදනය සහ මයිලිනේෂන් සමඟ සම්බන්ධ පිටපත් කිරීමේ සක්‍රිය කිරීම අපි නිරීක්ෂණය කළෙමු (ප්‍රසාරණය කළ දත්ත, රූපය 5b-d). සෛලීය මට්ටමින්, වැඩිහිටි L2/3, L5 සහ L6 නියුරෝන උප වර්ග සමඟ අතිච්ඡාදනය වන ග්ලූටමැටර්ජික් නියුරෝන පොකුරු සහිත t-hCO හි තුනී බාහික උප වර්ගයක සාක්ෂි අපට හමු විය (රූපය 1i). ඊට වෙනස්ව, මැද-ගර්භණී සමයේදී ග්ලූටමැටර්ජික් t-hCO නියුරෝන සහ භ්‍රෑණ බාහික නියුරෝන අතර පොකුරු අතිච්ඡාදනය වඩාත් සීමිත විය (ප්‍රසාරණය වූ දත්ත, රූපය 5e-j). t-hCO නියුරෝන මිනිස් පශ්චාත් ප්‍රසව නවකෝටික නියුරෝන වලට ක්‍රියාකාරීව සමානද යන්න තීරණය කිරීම සඳහා, අපි මිනිස් පශ්චාත් ප්‍රසව බාහිකයේ තියුණු කොටස්වල මානව L2/3 පිරමිඩල් නියුරෝන වල විද්‍යුත් භෞතික විද්‍යාත්මක පටිගත කිරීම් සහ ව්‍යුහ විද්‍යාත්මක ප්‍රතිසංස්කරණ සිදු කළෙමු (ප්‍රසාරණය වූ දත්ත, රූපය 7a). L2/3 පිරමිඩල් නියුරෝන වල විද්‍යුත් භෞතික විද්‍යාත්මක ගුණාංග t-hCO පිරමිඩල් නියුරෝන වලට සමාන විය (ප්‍රසාරණය වූ දත්ත, රූපය 7e). රූප විද්‍යාත්මකව, පශ්චාත් ප්‍රසව මිනිස් සාම්පල වලින් L2/3 නියුරෝන hCO ට වඩා t-hCO ට සමාන විය, නමුත් L2/3 සෛල දිගු වූ අතර සමස්තයක් වශයෙන් වැඩි අතු අඩංගු වූ අතර ඉහළ කොඳු ඇට පෙළේ ඝනත්වයක් තිබුණි (රූපය 3g සහ පුළුල් කළ දත්ත, රූපය 7b-). G).
a, පාලනය සහ TS hiPS සෛල රේඛා මගින් නිපදවන ලද hCO අලුත උපන් මීයන් තුළට බද්ධ කිරීම. b, මාස 8 ක අවකලනයකින් පසු බයෝසයිටින් පිරවූ t-hCO නියුරෝන ත්‍රිමාණ ප්‍රතිනිර්මාණය කිරීම. c, සාමාන්‍ය ඩෙන්ඩ්‍රිටික් දිග ප්‍රමාණනය කිරීම (n = 19 පාලන නියුරෝන, n = 21 TS නියුරෝන; **P = 0.0041). d, මාස 8 ක අවකලනයකදී පාලනය සහ TS t-hCO වෙතින් 3D-ප්‍රතිනිර්මාණය කරන ලද ඩෙන්ඩ්‍රිටික් ශාඛා සහ ඩෙන්ඩ්‍රිටික් කොඳු ඇට පෙළේ ඝනත්වය ප්‍රමාණනය කිරීම (n = 16 පාලන නියුරෝන, n = 21 TS නියුරෝන, ***P < 0.0001). d, මාස 8 ක අවකලනයකදී පාලනය සහ TS t-hCO වෙතින් 3D-ප්‍රතිනිර්මාණය කරන ලද ඩෙන්ඩ්‍රිටික් ශාඛා සහ ඩෙන්ඩ්‍රිටික් කොඳු ඇට පෙළේ ඝනත්වය ප්‍රමාණනය කිරීම (n = 16 පාලන නියුරෝන, n = 21 TS නියුරෝන, ***P < 0.0001). d, 3D-රෙකෝන්ස්ට්‍රැක්සියා ඩෙන්ඩ්‍රිට්නික් වෙට්වෙයි ඉන් කොන්ට්‍රෝලියා සහ ටීඑස් ටී-එච්සීඕ චෙරෙස් 8 මෙස්යාෂෙව් ඩයිප්‍රෙන්සර්වික්‍වික් оценка плотности дендритных шипов (n = 16 контрольных нейронов, n = 21 TS нейронов, *** P <0,0001). d, මාස 8 ක අවකලනය සහ ඩෙන්ඩ්රිටික් කොඳු ඇට පෙළේ ඝනත්ව ප්‍රමාණනය (n=16 පාලන නියුරෝන, n=21 TS නියුරෝන, ***P<0.0001) තුළ පාලනයෙන් සහ t-hCO TS වලින් ඩෙන්ඩ්රිටික් ශාඛා 3D ප්‍රතිනිර්මාණය කිරීම. d,分化8 个月时对照和TS t-hCO 的3D 重建树突分支，以及树突棘密度的量化（n =个对照神经元，n = 21 个TS 神经元,***P <0.0001）。 d , 分化 8 个 时 对照 和 ts t-hco 的 3d 重建 分支 分支 以及 树突棘 密化 = 16 量神经 元 , n = 21 个 ts 神经 , *** p <0.0001 ）. d, 3D-රෙකෝන්ස්ට්‍රැක්සියා ඩෙන්ඩ්‍රිට්නික් වෙට්වි කොන්ට්‍රොලිය සහ ටීඑස් ටී-එච්සීඕ චෙරෙස් 8 මෙසියස්වෙව් ඩිස්කට් සහ плотности дендритных шипов (n = 16 контрольных нейронов, n = 21 TS нейронов, *** P <0,0001). d, මාස 8 ක අවකලනය සහ ඩෙන්ඩ්‍රිටික් කොඳු ඇට පෙළේ ඝනත්ව ප්‍රමාණනය (n=16 පාලන නියුරෝන, n=21 TS නියුරෝන, ***P<0.0001) තුළ පාලන ඩෙන්ඩ්‍රිටික් ශාඛා සහ TS t-hCO 3D ප්‍රතිනිර්මාණය.රතු තරු ලකුණු මඟින් අනුමාන ඩෙන්ඩ්‍රිටික් කශේරුකා දක්වයි. e, පාලනයේ ස්වයංසිද්ධ EPSC සහ මාස 8 ක අවකලනයකින් පසු TS t-hCO නියුරෝන. f, සමුච්චිත සංඛ්‍යාත කුමන්ත්‍රණය සහ උපාගමික සිදුවීම්වල සංඛ්‍යාතය සහ විස්තාරය ප්‍රමාණනය කිරීම (n=32 පාලන නියුරෝන, n=26 TS නියුරෝන; **P=0.0076 සහ P=0.8102). g, hCO සහ t-hCO හි TS සහ පාලන නියුරෝන වල Scholl විශ්ලේෂණය. ඉරි සහිත රේඛා සංසන්දනය සඳහා මානව L2/3 පශ්චාත් ප්‍රසව පිරමිඩීය නියුරෝන පෙන්වයි (n = 24 පාලන t-hCO නියුරෝන, n = 21 TS t-hCO නියුරෝන, n = 8 පාලන hCO නියුරෝන, සහ n = 7 TS hCO නියුරෝන). දත්ත සාමාන්‍ය ± සම්මත අපගමනය ලෙස ප්‍රකාශ වේ.
මිනිස් බාහිකයේ ස්නායු සෛලවල රූප විද්‍යාත්මක සහ ක්‍රියාකාරී ලක්ෂණ ඉහළ මට්ටමකින් ප්‍රතිනිර්මාණය කිරීමට t-hCO ට ඇති හැකියාව, රෝග ෆීනෝටයිප් හඳුනා ගැනීමට t-hCO භාවිතා කළ හැකිද යන්න ගවේෂණය කිරීමට අපව පොළඹවන ලදී. CaV1.2 කේතනය කරන ජානයේ ක්‍රියාකාරීත්වයේ ලාභ විකෘති නිසා ඇතිවන දරුණු ස්නායු සංවර්ධන ආබාධයක් වන TS කෙරෙහි අපි අවධානය යොමු කළෙමු, එය ස්නායු සෛලවල ක්‍රියාකාරකම් මත යැපෙන ජාන පිටපත් කිරීම ආරම්භ කරයි. වඩාත් පොදු ආදේශනය (p.G406R) සහ පාලන තුනක් (රූපය 3a) රැගෙන යන TS රෝගීන් තිදෙනෙකුගෙන් අපි hCO ලබා ගත්තෙමු. බද්ධ කිරීමෙන් පසු, පාලන සෛල හා සසඳන විට TS ස්නායු සෛලවල ඩෙන්ඩ්‍රිටික් රූප විද්‍යාව වෙනස් වී ඇති බව අපට පෙනී ගියේය (රූපය 3b සහ පුළුල් කළ දත්ත, රූපය 8a,b), ප්‍රාථමික ඩෙන්ඩ්‍රයිට් සංඛ්‍යාවේ දෙගුණයක වැඩිවීමක් සහ ඩෙන්ඩ්‍රිටික් දිගෙහි සාමාන්‍ය සහ සමස්ත අඩුවීමේ සමස්ත වැඩිවීමක් (රූපය 3c සහ විස්තීර්ණ දත්ත, රූපය 8c). මෙය පාලක නියුරෝන හා සසඳන විට TS හි කොඳු ඇට පෙළේ ඝනත්වය වැඩි වීම සහ ස්වයංසිද්ධ EPSC සංඛ්‍යාතය වැඩි වීම සමඟ සම්බන්ධ විය (රූපය 3d-f සහ පුළුල් කළ දත්ත, රූපය 8g). වැඩිදුර විශ්ලේෂණයෙන් t-hCO TS හි අසාමාන්‍ය ඩෙන්ඩ්‍රිටික් අතු රටා පාලන හා සසඳන විට අනාවරණය විය, නමුත් in vitro TS hCO හි සමාන අවකලනයක අවධියක නොවේ (රූපය 3g). මෙය TS හි ක්‍රියාකාරකම් මත යැපෙන ඩෙන්ඩ්‍රිටික් හැකිලීම පිළිබඳ අපගේ පෙර වාර්තා සමඟ අනුකූල වන අතර මෙම බද්ධ කිරීමේ වේදිකාවේ vivo තුළ රෝග ෆීනෝටයිප් හඳුනා ගැනීමේ හැකියාව ඉස්මතු කරයි.
ඉන්පසු අපි t-hCO සෛල මීයන් S1 තුළට ක්‍රියාකාරීව ඒකාබද්ධ වී ඇත්තේ කොතෙක් දුරට දැයි විමසුවෙමු. මීයන් තුළ S1 හට ipsilateral ventral basal සහ posterior thalamic න්යෂ්ටි වලින් මෙන්ම ipsilateral motor සහ secondary somatosensory cortices සහ contralateral S1 වලින් ශක්තිමත් synaptic යෙදවුම් ලැබේ (රූපය 4a). නවෝත්පාදන රටාව යථා තත්ත්වයට පත් කිරීම සඳහා, අපි hCO ජලභීතිකා වෛරසය-dG-GFP/AAV-G ආසාදනය කර දින 3 කට පසු S1 මීයාට hCO බද්ධ කළෙමු. බද්ධ කිරීමෙන් දින 7-14 කට පසු ipsilateral S1 සහ ventral basal ganglia හි නියුරෝන වල ඝන GFP ප්‍රකාශනය අපි නිරීක්ෂණය කළෙමු (රූපය 4b, c). ඊට අමතරව, තලමික් මාකර් නෙට්රින් G1 හි ප්‍රතිදේහ පැල්ලම් කිරීමෙන් t-hCO හි තලමික් අවසානයන් පවතින බව අනාවරණය විය (රූපය 4d, e). මෙම අනුබද්ධ ප්‍රක්ෂේපණ මගින් t-hCO සෛලවල synaptic ප්‍රතිචාර ලබා ගත හැකිද යන්න තක්සේරු කිරීම සඳහා, අපි තලමොකෝටිකල් ස්ථරයේ තියුණු කොටස්වල මිනිස් සෛල වලින් සම්පූර්ණ සෛල පටිගත කිරීම් සිදු කළෙමු. මීයන් S1 හි විද්‍යුත් උත්තේජනය, අභ්‍යන්තර කැප්සියුලය, සුදු පදාර්ථය, t-hCO අසල තන්තු හෝ AMPA ප්‍රතිග්‍රාහක ප්‍රතිවිරෝධක NBQX වලට නිරාවරණය වන t-hCO නියුරෝන වල t-hCO ප්‍රේරිත කෙටි-ප්‍රමාද EPSC වල ඔප්සින්-ප්‍රකාශිත තලමික් අවසානයන්හි දෘෂ්ටිජනක සක්‍රීය කිරීම. (රූපය 4f, g සහ විස්තීර්ණ දත්ත, රූපය 9a-g). මෙම දත්ත මගින් t-hCO මීයන්ගේ මොළයට ව්‍යුහ විද්‍යාත්මකව ඒකාබද්ධ වී ඇති බවත් මීයන් ධාරක පටක මගින් සක්‍රිය කළ හැකි බවත් පෙන්නුම් කරයි.
a, ජලභීතිකා ලුහුබැඳීමේ අත්හදා බැලීමක ක්‍රමානුරූප රූප සටහන. b, t-hCO සහ මී මස්තිෂ්ක බාහිකය (ඉහළ පුවරුව) අතර GFP සහ මානව-විශේෂිත STEM121 ප්‍රකාශනය. මීයාගේ ipsilateral ventral basal nucleus (VB) (පහළ වමේ) සහ ipsilateral S1 (පහළ දකුණේ) හි GFP ප්‍රකාශනය ද පෙන්වා ඇත. පරිමාණ තීරුව, 50 µm. රතු කොටු මඟින් රූප ලබා ගත් මොළයේ ප්‍රදේශ නියෝජනය කරයි. c, GFP ප්‍රකාශ කරන සෛල ප්‍රමාණනය කිරීම (n = මීයන් 4). d, e - t-hCO හි Netrin G1+ තලමික් පර්යන්ත. d t-hCO සහ VB න්යෂ්ටි අඩංගු කිරීටක කොටසක් පෙන්වයි. පරිමාණ තීරුව, 2 mm. e t-hCO (වමේ) සහ VB (දකුණු) නියුරෝන වල Netrin G1 සහ STEM121 ප්‍රකාශනය පෙන්වයි. පරිමාණ තීරුව, 50 µm. තැඹිලි පැහැති තිත් රේඛාව t-hCO මායිම දක්වයි. f, g, S1 මීයා (f) හෝ අභ්‍යන්තර කැප්සියුලය (g) තුළ විද්‍යුත් උත්තේජනයෙන් පසු t-hCO නියුරෝන වල වත්මන් අංශු, (දම් පාට) හෝ (කළු) NBQX (වමේ) සමඟ. NBQX සමඟ සහ රහිතව EPSC විස්තාර (n = 6 S1 නියුරෝන, *P = 0.0119; සහ n = අභ්‍යන්තර කැප්සියුල නියුරෝන 6, **P = 0.0022) (මැද). මීයා S1 (f) හෝ අභ්‍යන්තර කැප්සියුලය (g) හි විද්‍යුත් උත්තේජනයට ප්‍රතිචාර වශයෙන් EPSC පෙන්වන t-hCO නියුරෝන වල ප්‍රතිශතය (දකුණේ). aCSF, කෘතිම මස්තිෂ්ක තරලය. h, 2P රූපකරණ අත්හදා බැලීමේ ක්‍රමානුරූප රූප සටහන (වමේ). t-hCO (මැද) හි GCaMP6s ප්‍රකාශනය. පරිමාණ තීරුව, 100 µm. GCaMP6s හි ප්‍රතිදීප්ත කාල සීමාව (දකුණේ). i, ස්වයංසිද්ධ ක්‍රියාකාරකම් ප්‍රතිදීප්තතාවයේ Z-ලකුණ. j, උඩු රැවුල උත්තේජනයේ ක්‍රමානුරූප නිදර්ශනය. k, එක් අත්හදා බැලීමක z-ලකුණු කළ 2P ප්‍රතිදීප්ත ගමන් පථ, උදාහරණ සෛලවල වේලාව ශුන්‍යයේදී (ඉරි රේඛාව) උඩු රැවුල අපගමනය සමඟ පෙළගස්වා ඇත. l, සියලුම සෛලවල ජනගහන-සාමාන්‍ය z-ලකුණු ප්‍රතිචාර, වේලාව ශුන්‍යයේදී (ඉරි රේඛාව) (රතු) හෝ අහඹු ලෙස ජනනය කරන ලද කාල මුද්‍රා සමඟ පෙළගස්වා ඇත. m. දෘශ්‍ය සලකුණු කිරීම පිළිබඳ අත්හදා බැලීමේ ක්‍රමානුරූප රූප සටහන. n, නිල් ලේසර් උත්තේජනය හෝ උඩු රැවුල අපගමනය අතරතුර උදාහරණ t-hCO සෛලයකින් අමු වෝල්ටීයතා වක්‍ර. රතු ඊතල මඟින් ආලෝකය (ඉහළ) හෝ උඩු රැවුල අපගමනය (පහළ) නිසා ඇති වූ පළමු කරල් දක්වයි. අළු සෙවනැල්ල උඩු රැවුල අපගමනය වීමේ කාල පරිච්ඡේද දක්වයි. o, උච්ච ආලෝක තරංග ආකෘති සහ උඩු රැවුල අපගමන ප්‍රතිචාර. p, උදාහරණයේ සෛලවල උඩු රැවුලේ අපගමනය සමඟ පෙළගස්වා ඇති තනි උත්සාහයක කරල්. 0 යනු උඩු රැවුල අපගමනය (ඉරි රේඛාව) (රතු) හෝ අහඹු ලෙස ජනනය කරන ලද කාල මුද්‍රා (අළු) හි උඩු රැවුල අපගමනය සමඟ පෙළගස්වා ඇත. q, සියලුම ප්‍රභාසංවේදී සෛල සඳහා ජනගහන-සාමාන්‍ය z-ලකුණු වෙඩි තැබීමේ අනුපාතය, වේලාව ශුන්‍යයේදී (ඉරි රේඛාව) (රතු) හෝ අහඹු ලෙස ජනනය කරන ලද කාල මුද්‍රා සමඟ පෙළගස්වා ඇත. r, උඩු රැවුල අපගමනය මගින් සැලකිය යුතු ලෙස මොඩියුලේට් කරන ලද ප්‍රභාසංවේදී ඒකකවල අනුපාතය (n = මීයන් 3) (වමේ). උපරිම z-ලකුණු ප්‍රමාදය (n = මීයන් 3; n = 5 (ලා කොළ), n = 4 (තද කොළ), සහ n = 4 (සයන්) උඩු රැවුල අපගමනය මොඩියුලේෂන් ඒකක එක් මීයෙකුට) (දකුණේ). දත්ත මධ්‍යන්‍ය ± සම්මත අපගමනය ලෙස ප්‍රකාශ වේ.
ඉන්පසු අපි විමසුවේ t-hCO ඉන්වීවෝ තුළ සංවේදක උත්තේජක මගින් සක්‍රිය කළ හැකිද යන්නයි. ජානමය වශයෙන් කේතනය කරන ලද කැල්සියම් දර්ශක GCaMP6 ප්‍රකාශ කරන hCO අපි S1 මීයන් තුළට බද්ධ කළෙමු. දින 150 කට පසු, අපි තන්තු ෆොටෝමෙට්‍රි හෝ ද්වි-ෆෝටෝන කැල්සියම් ප්‍රතිබිම්බනය සිදු කළෙමු (රූපය 4h සහ පුළුල් කළ දත්ත, රූපය 10a). t-hCO සෛල සමමුහුර්ත රිද්මයානුකූල ක්‍රියාකාරකම් ප්‍රදර්ශනය කරන බව අපට පෙනී ගියේය (රූපය 4i, පුළුල් කළ දත්ත, රූපය 10b සහ අතිරේක වීඩියෝව 1). උච්ච t-hCO ක්‍රියාකාරකම් සංලක්ෂිත කිරීම සඳහා, අපි නිර්වින්දනය කරන ලද බද්ධ කිරීමේ මීයන් තුළ බාහිර සෛලීය විද්‍යුත් භෞතික විද්‍යාත්මක පටිගත කිරීම් සිදු කළෙමු (ප්‍රසාරණය කළ දත්ත, රූපය 10c-f). අපි MRI රූප වලින් ස්ටීරියෝටැක්සික් ඛණ්ඩාංක ජනනය කර ඇත්තෙමු; මේ අනුව, මෙම වාර්තාගත ඒකක අනුමාන මානව ස්නායු නියෝජනය කරයි, නමුත් විද්‍යුත් භෞතවේදය පමණක් සම්භවයක් ඇති විශේෂයක් තීරණය කිරීමට ඉඩ නොදේ. අපි සමමුහුර්ත ක්‍රියාකාරකම් පිපිරීම් නිරීක්ෂණය කළෙමු (ප්‍රසාරණය කළ දත්ත, රූපය 10d). පිපිරීම් 460 ms පමණ පැවති අතර තත්පර 2 ක පමණ නිහඬ කාල පරිච්ඡේද මගින් වෙන් කරන ලදී (ප්‍රසාරණය කළ දත්ත, රූපය 10d, e). තනි ඒකක පිපිරීමකට සාමාන්‍යයෙන් වට තුනක් පමණ වෙඩි තැබූ අතර, එය පිපිරීමකට ලියාපදිංචි ඒකක වලින් ආසන්න වශයෙන් 73% කි. තනි ඒකකවල ක්‍රියාකාරකම් ඉතා සහසම්බන්ධ වූ අතර, මෙම සහසම්බන්ධතා එකම තත්වයන් යටතේ වාර්තා කරන ලද එන්නත් නොකළ සතුන් තුළ හඳුනාගත් ඒකකවලට වඩා වැඩි විය (ප්‍රසාරණය කළ දත්ත, රූපය 10f). හඳුනාගත් මානව-ව්‍යුත්පන්න නියුරෝන වල ස්පයික් ප්‍රතිචාර තවදුරටත් සංලක්ෂිත කිරීම සඳහා, අපි hCO සමඟ බද්ධ කරන ලද නිර්වින්දනය කරන ලද මීයන් මත ආලෝක-ටැග් කිරීමේ අත්හදා බැලීම් සිදු කළ අතර, එමඟින් ආලෝක සංවේදී කැටායන නාලිකාව රොඩොප්සින් 2 (hChR2) ප්‍රකාශ කරයි, එමඟින් t-hCO නියුරෝන කෙටි-ප්‍රමාද හඳුනාගැනීම (ms 10 ට අඩු) නිල් ආලෝක උත්තේජක වලට ප්‍රතිචාර වශයෙන් (රූපය 4m–o). t-hCO නියුරෝන කැල්සියම් රූපකරණයේදී නිරීක්ෂණය කරන ලද සංඛ්‍යාතවලට සමාන සංඛ්‍යාතවලදී ස්වයංසිද්ධ ක්‍රියාකාරකම් පිපිරීම් මෙන්ම ආලෝක සලකුණු නොමැති විට t-hCO හි සිදු කරන ලද විද්‍යුත් භෞතික විද්‍යාත්මක පටිගත කිරීම් ද ප්‍රදර්ශනය කළේය (ප්‍රසාරණය වූ දත්ත, රූපය 10c-g). hCO හි අනුරූප අවධීන්හිදී in vitro හි ස්වයංසිද්ධ ක්‍රියාකාරකම් නිරීක්ෂණය නොවීය. සංවේදක උත්තේජක මගින් t-hCO සක්‍රිය කළ හැකිද යන්න තක්සේරු කිරීම සඳහා, අපි මීයන්ගේ උඩු රැවුල t-hCO වෙතින් කෙටියෙන් අපගමනය කළෙමු (රූපය 4j,m සහ විස්තීර්ණ දත්ත, රූපය 10h,k). පෙර අධ්‍යයනයන්ට අනුව8,10, t-hCO සෛලවල උප කුලකයක් උඩු රැවුල අපගමනයට ප්‍රතිචාර වශයෙන් වැඩි ක්‍රියාකාරිත්වයක් පෙන්නුම් කළ අතර, දත්ත අහඹු කාල මුද්දර සමඟ සංසන්දනය කළ විට එය නිරීක්ෂණය නොවීය (රූපය 4k-q සහ පුළුල් කළ දත්ත, රූපය 10h-q). ඇත්ත වශයෙන්ම, ඔප්ටෝ-ලේබල් කරන ලද තනි ඒකකවලින් 54% ක් පමණ උඩු රැවුල උත්තේජනයෙන් පසු සැලකිය යුතු ලෙස වැඩි වූ උද්දීපන අනුපාතයක් පෙන්නුම් කළ අතර එය ms 650 ක් පමණ විය (රූපය 4r). එකට ගත් කල, මෙම දත්ත යෝජනා කරන්නේ t-hCO සුදුසු ක්‍රියාකාරී යෙදවුම් ලබා ගන්නා බවත් පාරිසරික උත්තේජක මගින් සක්‍රිය කළ හැකි බවත්ය.
ඉන්පසු අපි t-hCO මගින් හැසිරීම පාලනය කිරීම සඳහා මීයන් තුළ පරිපථ සක්‍රිය කළ හැකිද යන්න විමර්ශනය කළෙමු. අපි මුලින්ම t-hCO නියුරෝන වල අක්ෂ මීයාගේ අවට පටක වලට ප්‍රක්ෂේපණය කරන්නේද යන්න විමර්ශනය කළෙමු. අපි HCO ආසාදනය කළේ EYFP (hChR2-EYFP) වෙත විලයනය වූ hChR2 කේතනය කරන ලෙන්ටිවයිරසයකින් ය. දින 110 කට පසු, ශ්‍රවණ, මෝටර් සහ සෝමාටෝසෙන්සරි කෝටිසස් ඇතුළු ඉප්සිලේටරල් බාහික කලාපවල මෙන්ම ස්ට්‍රයිටම්, හිපොකැම්පස් සහ තලමස් ඇතුළු උපබාහික කලාපවල ද අපි EYFP ප්‍රකාශනය නිරීක්ෂණය කළෙමු (රූපය 5a). මෙම පිටාර ප්‍රක්ෂේපණ මගින් මී සෛල තුළ උපාගමික ප්‍රතිචාර ලබා ගත හැකිද යන්න තක්සේරු කිරීම සඳහා, තියුණු මොළයේ කොටස්වල මී මස්තිෂ්ක බාහික සෛල පටිගත කිරීමෙන් අපි hChR2-EYFP ප්‍රකාශ කරන t-hCO සෛල දෘශ්‍යමය වශයෙන් සක්‍රිය කළෙමු. NBQX මගින් අවහිර කරන ලද මීයන් පිරමිඩල් බාහික නියුරෝන වල නිල් ආලෝකය ප්‍රේරිත කෙටි-ප්‍රමාද EPSC සමඟ t-hCO අක්ෂ සක්‍රිය කිරීම (රූප 5b-g). ඊට අමතරව, මෙම ප්‍රතිචාර ටෙට්‍රොඩොටොක්සින් (TTX) මගින් අවහිර කර 4-ඇමිනොපිරිඩින් (4-AP) මගින් ප්‍රතිස්ථාපනය කළ හැකි අතර, ඒවා මොනොසිනැප්ටික් සම්බන්ධතා නිසා ඇති වූ බව යෝජනා කරයි (රූපය 5e).
a, ඇක්සෝන් ලුහුබැඳීමේ ක්‍රමානුරූප රූප සටහන (වමේ). t-hCO EYFP ප්‍රකාශනය (දකුණේ). පරිමාණ තීරුව, 100 µm. A1, ශ්‍රවණ බාහිකය, ACC, ඉදිරිපස සින්ගුලේට් බාහිකය, d. ස්ට්‍රයැටම්, ඩෝසල් ස්ට්‍රයැටම්, HPC, හිපොකැම්පස්; ඩයප්‍රැම්, පාර්ශ්වික සෙප්ටම්, mPFC, මධ්‍ය ප්‍රෙෆ්‍රන්ටල් බාහිකය, පිරි, පිරිෆෝම් බාහිකය, v. ස්ට්‍රයැටම්, කශේරුකා ස්ට්‍රයැටම්, VPM, තලමස් හි ventropostomedial න්‍යෂ්ටිය, VTA, කශේරුකා ටෙග්මන්ටල් කලාපය. රතු කොටු මගින් රූප ලබා ගත් මොළයේ ප්‍රදේශ නියෝජනය වේ. b, උත්තේජක අත්හදා බැලීමේ ක්‍රමානුරූප රූප සටහන. c, d, මිනිස් (c) EYFP+ t-hCO හෝ මීයා (d) EYFP- සෛලවල නිල් ආලෝකයෙන් ප්‍රේරිත ප්‍රකාශ ධාරාව (ඉහළ) සහ වෝල්ටීයතාවයේ (පහළ) ප්‍රතිචාරයේ උදාහරණ. e, f, TTX සහ 4-AR (කොළ), TTX (අළු) හෝ aCSF (කළු) (e), (වයලට්) හෝ රහිතව (කළු) ) ) NBQX (e) සහිත t-hCO අක්ෂවල නිල් ආලෝක උත්තේජනයෙන් පසු මීයන්ගේ නියුරෝන වල වත්මන් අංශු මාත්‍ර. g, මීයන්ගේ සෛලවල නිල් ආලෝකය මගින් ප්‍රේරණය වන ප්‍රතිචාරවල ප්‍රමාදය (n = සෛල 16); තිරස් තීරු සාමාන්‍ය ප්‍රමාදය (7.13 ms) දක්වයි (වමේ). NBQX (n = සෛල 7; ***P < 0.0001) (මැද) සමඟ හෝ නැතිව වාර්තා කරන ලද ආලෝකයෙන් ප්‍රේරණය වන EPSC වල විස්තාරය. NBQX (n = සෛල 7; ***P < 0.0001) (මැද) සමඟ හෝ නැතිව වාර්තා කරන ලද ආලෝකයෙන් ප්‍රේරණය වන EPSC වල විස්තාරය. Амплитуда вызванных светом EPSC, зарегистрированных с или без NBQX (n = 7 клеток; ***P <0,0001) (в центок). NBQX (n = සෛල 7; ***P < 0.0001) (මැද) සමඟ හෝ නැතිව වාර්තා කරන ලද ආලෝක ප්‍රේරිත EPSC වල විස්තාරය.ප්‍රවේශයප්‍රවේශය Амплитуда вызванных светом EPSC, зарегистрированных с или без NBQX (n = 7 клеток; ***P <0,0001) (в центок). NBQX (n = සෛල 7; ***P < 0.0001) (මැද) සමඟ හෝ නැතිව වාර්තා කරන ලද ආලෝක ප්‍රේරිත EPSC වල විස්තාරය.නිල් ආලෝකයට ප්‍රතිචාර දක්වන EPSC පෙන්වන මී සෛලවල ප්‍රතිශතය (දකුණේ). h, හැසිරීම් කාර්යයක ක්‍රමානුරූප රූප සටහන. d0, දිනය 0. i. පුහුණුවේ 1 වන දින (වමේ) හෝ 15 වන දින (දකුණේ) ආදර්ශමත් සතුන්ගේ කාර්ය සාධනය. 1 වන දින (වමේ) හෝ 15 වන දින (දකුණු මැද) සිදු කරන ලද සාමාන්‍ය ලෙවකෑම් ගණන (n = නිල් ආලෝක අත්හදා බැලීම් 150, n = රතු ආලෝක අත්හදා බැලීම් 150; ***P < 0.0001). 1 වන දින (වමේ) හෝ 15 වන දින (දකුණු මැද) සිදු කරන ලද සාමාන්‍ය ලෙවකෑම් ගණන (n = නිල් ආලෝක අත්හදා බැලීම් 150, n = රතු ආලෝක අත්හදා බැලීම් 150; ***P < 0.0001). Среднее количество облизываний, выполненых в ден 1 (ස්ලේවා) හෝ දින 15 (සෙන්ට්‍රේ ප්‍රවාහයෙන්) (එන් = 150 දක්වා) светом, n = 150 испытаний с красным светом; ***P <0,0001). 1 වන දින (වමේ) හෝ 15 වන දින (මැද දකුණේ) සිදු කරන ලද සාමාන්‍ය ලෙවකෑම් ගණන (n = නිල් ආලෝක අත්හදා බැලීම් 150, n = රතු ආලෝක අත්හදා බැලීම් 150; ***P < 0.0001).第1 天（左）或第15 天（右中）执行的平均舔次数（n = 150 次蓝光试验，n = 150次红光试验；***P <0.0001）。第1 天（左）或第15 天（右中）执行的平均舔次数（n = 150 次蓝光试验，n = 150次红光试验；***P <0.001 Среднее количество облизываний, выполненых в ден 1 (ස්ලේවා) හෝ දින 15 (සෙන්ට්‍රේ ප්‍රවාහයෙන්) (එන් = 150 දක්වා) светом, n = 150 испытаний с красным светом; ***P <0,0001). 1 වන දින (වමේ) හෝ 15 වන දින (මැද දකුණේ) සිදු කරන ලද සාමාන්‍ය ලෙවකෑම් ගණන (n = නිල් ආලෝක අත්හදා බැලීම් 150, n = රතු ආලෝක අත්හදා බැලීම් 150; ***P < 0.0001).1 වන දින (මැද වමේ) හෝ 15 වන දින (දකුණේ) රතු සහ නිල් ආලෝක අත්හදා බැලීම් සඳහා සමුච්චිත ලෙවකෑම්. NS, සැලකිය යුතු නොවේ. j,k, 1 වන දින හෝ 15 වන දින hChR2-EYFP (j) ප්‍රකාශ කරන හෝ ෆ්ලෝරෝෆෝර් (k) පාලනය කරන t-hCO සමඟ බද්ධ කරන ලද සියලුම සතුන්ගේ හැසිරීම් ලක්ෂණ (hChR2-EYFP: n = 9 මීයන්, ** P = 0.0049; පාලනය: n = 9, P = 0.1497). l, මනාප ලකුණු පරිණාමය (n = 9 hChR2, n = 9 පාලනය; **P < 0.001, ***P < 0.0001). l, මනාප ලකුණු පරිණාමය (n = 9 hChR2, n = 9 පාලනය; **P < 0.001, ***P < 0.0001). l, Эволюция показателя предпочтения (n = 9 hChR2, n = 9 контрольных; **P <0,001, ***P <0,0001). l, මනාප ලකුණු පරිණාමය (n = 9 hChR2, n = 9 පාලන; **P < 0.001, ***P < 0.0001). l，偏好评分的演变（n = 9 hChR2,n = 9 对照；**P <0.001,***P <0.0001）。 l，偏好评分的演变（n = 9 hChR2,n = 9 对照；**P <0.001,***P <0.0001）。 l, Эволюция показателей предпочтения (n = 9 hChR2, n = 9 контролей; **P <0,001, ***P <0,0001). l, මනාප ලකුණු වල පරිණාමය (n = 9 hChR2, n = 9 පාලන; **P < 0.001, ***P < 0.0001).m, S1 හි t-hCO හි දෘෂ්ටිජනක සක්‍රියකරණයට ප්‍රතිචාර වශයෙන් FOS ප්‍රකාශනය. FOS ප්‍රකාශනයේ රූප (වමේ), සහ ප්‍රමාණනය (කණ්ඩායමකට n = 3; *P < 0.05, **P < 0.01 සහ ***P < 0.001) (දකුණේ) පෙන්වා ඇත. FOS ප්‍රකාශනයේ රූප (වමේ), සහ ප්‍රමාණනය (කණ්ඩායමකට n = 3; *P < 0.05, **P < 0.01 සහ ***P < 0.001) (දකුණේ) පෙන්වා ඇත. Показаны изображения экспрессии FOS (слева) සහ количественного определения (n = 3 на группу; * P <0,005, **1 P <0,005, **1 (ප්‍රවාව). FOS ප්‍රකාශනයේ (වමේ) සහ ප්‍රමාණකරණයේ (n = කණ්ඩායමකට 3; *P<0.05, **P<0.01, සහ ***P<0.001) රූප (දකුණේ) පෙන්වා ඇත.显示了FOS 表达（左）和量化（每组n = 3；*P <0.05、**P <0.01 和***P <0.001）（右显示了FOS 表达（左）和量化（每组n = 3；*P <0.05、**P <0.01 和***P <0.001）（右 Показаны изображения экспрессии FOS (слева) සහ количественного определения (n = 3 на группу; * P <0,005, **1 P <0,005, **1 (ප්‍රවාව). FOS ප්‍රකාශනයේ (වමේ) සහ ප්‍රමාණකරණයේ (n = කණ්ඩායමකට 3; *P<0.05, **P<0.01, සහ ***P<0.001) රූප (දකුණේ) පෙන්වා ඇත.පරිමාණ තීරුව, 100 µm. දත්ත BLA, බාසෝලේටරල් ටොන්සිල්, MDT, ඩෝසෝමෙඩියල් තලමික් න්‍යෂ්ටිය, PAG, පෙරියක්ඩක්ටල් අළු පැහැයේ මධ්‍යන්‍ය ± සම්මත දෝෂයක් ලෙස ප්‍රකාශ වේ.
අවසාන වශයෙන්, t-hCO මීයන්ගේ හැසිරීම මොඩියුලේට් කළ හැකිදැයි අපි විමසුවෙමු. මෙය පරීක්ෂා කිරීම සඳහා, අපි hChR2-EYFP-ප්‍රකාශිත hCO S1 වෙත බද්ධ කළ අතර, දින 90 කට පසු, ආලෝකය ලබා දීම සඳහා අපි t-hCO වෙත දෘශ්‍ය තන්තු බද්ධ කළෙමු. ඉන්පසු අපි මීයන් නවීකරණය කරන ලද ක්‍රියාකාරී සමීකරණ ආදර්ශයකින් පුහුණු කළෙමු (රූපය 5h). අපි සතුන් හැසිරීම් පරීක්ෂණ කුටියක තබා අහඹු ලෙස තත්පර 5 ක නිල් (473 nm) සහ රතු (635 nm) ලේසර් උත්තේජක යෙදුවෙමු. නිල් ආලෝක උත්තේජනය අතරතුර ලෙවකෑවත් රතු ආලෝක උත්තේජනය අතරතුර ලෙවකෑවේ නැත්නම් සතුන්ට ජල ත්‍යාගයක් ලැබුණි. පුහුණුවේ පළමු දිනයේදී, සතුන් නිල් හෝ රතු ආලෝකයෙන් උත්තේජනය වූ විට ලෙවකෑමේ වෙනසක් නොපෙන්වයි. කෙසේ වෙතත්, 15 වන දින, hCO ප්‍රකාශිත hChR2-EYFP සමඟ බද්ධ කළ සතුන් රතු ආලෝක උත්තේජනයට සාපේක්ෂව නිල් ආලෝකයෙන් උත්තේජනය වූ විට වඩාත් ක්‍රියාකාරී ලෙවකෑමක් පෙන්නුම් කළේය. පාලන ෆ්ලෝරෝෆෝරය ප්‍රකාශ කරන hCO සමඟ බද්ධ කරන ලද පාලන සතුන් තුළ ලෙවකෑමේ හැසිරීම් වල මෙම වෙනස්කම් නිරීක්ෂණය නොවීය (ඉගෙනීමේ සාර්ථකත්ව අනුපාතය: hChR2 89%, EYFP 0%, රූපය 5i-1 සහ අතිරේක වීඩියෝව 2). මෙම දත්ත යෝජනා කරන්නේ t-hCO සෛලවලට විපාක සොයන හැසිරීම උත්තේජනය කිරීම සඳහා මීයන්ගේ ස්නායු සෛල සක්‍රිය කළ හැකි බවයි. මෙම හැසිරීම් වෙනස්කම් වලට කුමන මීයන්ගේ t-hCO ස්නායු පරිපථ සම්බන්ධ විය හැකිද යන්න සොයා ගැනීමට, අපි පුහුණු කරන ලද සතුන් සහ අස්වැන්න නෙළන ලද පටක වල t-hCO ඔප්ටොජෙනටික් ලෙස සක්‍රිය කළෙමු. ප්‍රතිශක්තිකරණ රසායන විද්‍යාව මගින් මධ්‍ය ප්‍රෙෆ්‍රන්ටල් බාහිකය, මධ්‍ය තලමස් සහ පෙරියක්ඩක්ටල් අළු පදාර්ථය ඇතුළු අභිප්‍රේරිත හැසිරීම් වලට සම්බන්ධ මොළයේ කලාප කිහිපයක ක්‍රියාකාරකම් මත යැපෙන FOS ප්‍රෝටීනයේ ප්‍රකාශනය හෙළි කරන ලද අතර එය උත්තේජනය නොකළ පාලන සතුන් තුළ හෝ සතුන් තුළ ප්‍රකාශ විය. සහල්. 5m). එකට ගත් කල, මෙම දත්ත යෝජනා කරන්නේ t-hCO හට හැසිරීම මෙහෙයවීම සඳහා මීයන්ගේ ස්නායු ක්‍රියාකාරිත්වය මොඩියුලේට් කළ හැකි බවයි.
ස්නායු කාබනික ද්‍රව්‍ය මිනිස් සංවර්ධනය සහ ඉන් විට්‍රෝ රෝග අධ්‍යයනය කිරීම සඳහා පොරොන්දු වූ පද්ධතියක් නියෝජනය කරයි, නමුත් ඉන් විට්‍රෝ තුළ පවතින පරිපථ අතර සම්බන්ධතා නොමැතිකම නිසා ඒවා සීමා වේ. ප්‍රතිශක්තිකරණය අඩු මුල් පශ්චාත් ප්‍රසව මීයන්ගේ S1 තුළට hCO බද්ධ කළ නව වේදිකාවක් අපි සංවර්ධනය කර ඇත්තෙමු. ඉන් විට්‍රෝ තුළ නිරීක්ෂණය නොකළ පරිණත සෛල වර්ග t-hCO වර්ධනය කරන බවත් t-hCO මීයන් මොළයට ව්‍යුහ විද්‍යාත්මකව සහ ක්‍රියාකාරීව ඒකාබද්ධ කර ඇති බවත් අපි පෙන්වා දී ඇත්තෙමු. මීයන් ස්නායු පරිපථවලට t-hCO ඒකාබද්ධ කිරීම මිනිස් සෛලීය ක්‍රියාකාරකම් සහ අධ්‍යයනය කරන ලද සත්ව හැසිරීම් අතර සම්බන්ධතාවයක් ඇති කර ගැනීමට අපට ඉඩ සැලසූ අතර, t-hCO නියුරෝන වලට හැසිරීම් ප්‍රතිචාර මෙහෙයවීම සඳහා මීයන්ගේ ස්නායු ක්‍රියාකාරිත්වය මොඩියුලේට් කළ හැකි බව පෙන්නුම් කරයි.
අපි විස්තර කරන වේදිකාවට මිනිස් සෛල මීයන්ගේ මොළයට බද්ධ කිරීම පිළිබඳ පෙර පර්යේෂණවලට වඩා වාසි කිහිපයක් තිබේ. පළමුව, අපි hCO මුල් පශ්චාත් ප්‍රසව මීයන්ගේ වර්ධනය වන බාහිකයට බද්ධ කළ අතර, එය ව්‍යුහ විද්‍යාත්මක හා ක්‍රියාකාරී ඒකාබද්ධ කිරීමට පහසුකම් සපයයි. දෙවනුව, t-hCO MRI නිරීක්ෂණය මඟින් සජීවී සතුන්ගේ බද්ධ කිරීමේ පිහිටීම සහ වර්ධනය අධ්‍යයනය කිරීමට අපට ඉඩ සැලසුණු අතර, එමඟින් දිගුකාලීන බහු-සත්ව අධ්‍යයනයන් සිදු කිරීමට සහ hiPS සෛල රේඛා කිහිපයක විශ්වසනීයත්වය ස්ථාපිත කිරීමට අපට ඉඩ සැලසුණි. අවසාන වශයෙන්, අපි හුදකලා තනි සෛල අත්හිටුවීම් වෙනුවට නොවෙනස්ව කාබනික ද්‍රව්‍ය බද්ධ කළෙමු, ඒවා මිනිස් සෛල වලට අඩු විනාශකාරී වන අතර මීයන්ගේ මොළයේ මිනිස් බාහික නියුරෝන ඒකාබද්ධ කිරීම සහ උත්පාදනය ප්‍රවර්ධනය කළ හැකිය.
මෙම වේදිකාවේ දියුණුව තිබියදීත්, තාවකාලික, අවකාශීය සහ හරස්-විශේෂ සීමාවන් මගින් සංවර්ධනයේ මුල් අවධියේදී බද්ධ කිරීමෙන් පසුව පවා ඉහළ විශ්වාසවන්තභාවයකින් යුත් මානව ස්නායු පරිපථ සෑදීම වළක්වන බව අපි පිළිගනිමු. නිදසුනක් ලෙස, t-hCO හි නිරීක්ෂණය කරන ලද ස්වයංසිද්ධ ක්‍රියාකාරකම්, බාහික සංවර්ධනයේදී නිරීක්ෂණය කරන ලද රිද්මයානුකූල ක්‍රියාකාරිත්වයට සමාන සංවර්ධන ප්‍රවේණිකයක් නියෝජනය කරනවාද, නැතහොත් t-hCO හි පවතින මර්දනකාරී සෛල වර්ග නොමැති වීම නිසාද යන්න පැහැදිලි නැත. ඒ හා සමානව, t-hCO හි ලැමිනේෂන් නොමැතිකම දාම සම්බන්ධතාවයට කොතරම් දුරට බලපාන්නේද යන්න පැහැදිලි නැත. අනාගත කාර්යයේදී මානව ක්ෂුද්‍ර ග්ලියා, මානව එන්ඩොතලියල් සෛල වැනි අනෙකුත් සෛල වර්ග සහ GABAergic අන්තර් නියුරෝනවල විවිධ අනුපාත ඒකාබද්ධ කිරීම කෙරෙහි අවධානය යොමු කරනු ඇත, මෙන්ම වෙනස් කළ t-hCO හි ස්නායු ඒකාබද්ධ කිරීම සහ සැකසීම සිදුවිය හැකි ආකාරය තේරුම් ගැනීම. රෝගීන්ගෙන් ලබාගත් සෛලවල පිටපත් කිරීමේ, උපාගමික සහ හැසිරීම් මට්ටම්.
සමස්තයක් වශයෙන්, මෙම in vivo වේදිකාව in vitro මිනිස් මොළයේ වර්ධනයට සහ රෝග පර්යේෂණයට අනුපූරක විය හැකි බලවත් සම්පතක් නියෝජනය කරයි. මෙම වේදිකාව අපට වෙනත් ආකාරයකින් නොපෙනෙන රෝගී-ව්‍යුත්පන්න සෛලවල නව නූල් මට්ටමේ ෆීනෝටයිප් සොයා ගැනීමට සහ නව චිකිත්සක උපාය මාර්ග පරීක්ෂා කිරීමට ඉඩ සලසන බව අපි අපේක්ෂා කරමු.
කලින් විස්තර කර ඇති පරිදි අපි HiPS සෛල වලින් hCO2.5 ජනනය කළෙමු. පෝෂක ස්ථර මත වගා කරන ලද hiPS සෛල වලින් hCO නිෂ්පාදනය ආරම්භ කිරීම සඳහා, dispase (0.35 mg/mL) භාවිතයෙන් වගා භාජන වලින් hiPS සෛලවල නොවෙනස්ව ඇති ජනපද ඉවත් කර hiPS සෛල වගා මාධ්‍යය සහිත කෑම අඩංගු අතිශය අඩු ඇමිණුම් ප්ලාස්ටික් සංස්කෘතීන් වෙත මාරු කරන ලදී. (කෝනිං) SMAD නිෂේධක දෙකක් වන dorsomorphine (5 μM; P5499, Sigma-Aldrich) සහ SB-431542 (10 μM; 1614, Tocris) සහ ROCK නිෂේධක Y-27632 (10 μM; S1049, Selleckchem) සමඟ අතිරේකව සපයන ලදී. පළමු දින 5 තුළ, hiPS සෛල මාධ්‍යය දිනපතා වෙනස් කරන ලද අතර dorsomorphine සහ SB-431542 එකතු කරන ලදී. අත්හිටුවීමේ හයවන දිනයේදී, ස්නායු ගෝලාකාර ස්නායු බාසල්-ඒ (10888, ලයිෆ් ටෙක්නොලොජීස්), විටමින් ඒ නොමැතිව බී-27 අතිරේකය (12587, ලයිෆ් ටෙක්නොලොජීස්), ග්ලූටාමැක්ස් (1:100, ලයිෆ් ටෙක්නොලොජීස්), පෙනිසිලින් සහ ස්ට්‍රෙප්ටොමයිසින් (1:100, ලයිෆ් ටෙක්නොලොජීස්) අඩංගු ස්නායු මාධ්‍යයට මාරු කරන ලද අතර 24 වන දින දක්වා එපීඩර්මල් වර්ධන සාධකය (EGF; 20 ng ml−1; R&D පද්ධති) සහ ෆයිබ්‍රොබ්ලාස්ට් වර්ධන සාධකය 2 (FGF2; 20 ng ml−1; R&D පද්ධති) සමඟ අතිරේක කරන ලදී. 25 වන දින සිට 42 වන දින දක්වා, මාධ්‍යය මොළයෙන් ලබාගත් ස්නායු ට්‍රොෆික් සාධකය (BDNF; 20 ng ml−1, පෙප්‍රොටෙක්) සහ නියුරෝට්‍රොෆින් 3 (NT3; 20 ng ml−1; පෙප්‍රොටෙක්) සමඟ අතිරේක කරන ලදී. අත්හිටුවීමේ හයවන දිනයේදී, ස්නායු ගෝලාකාර ස්නායු බාසල්-ඒ (10888, ලයිෆ් ටෙක්නොලොජීස්), විටමින් ඒ නොමැතිව බී-27 අතිරේකය (12587, ලයිෆ් ටෙක්නොලොජීස්), ග්ලූටාමැක්ස් (1:100, ලයිෆ් ටෙක්නොලොජීස්), පෙනිසිලින් සහ ස්ට්‍රෙප්ටොමයිසින් (1:100, ලයිෆ් ටෙක්නොලොජීස්) අඩංගු ස්නායු මාධ්‍යයට මාරු කරන ලද අතර 24 වන දින දක්වා එපීඩර්මල් වර්ධන සාධකය (EGF; 20 ng ml−1; R&D පද්ධති) සහ ෆයිබ්‍රොබ්ලාස්ට් වර්ධන සාධකය 2 (FGF2; 20 ng ml−1; R&D පද්ධති) සමඟ අතිරේක කරන ලදී. 25 වන දින සිට 42 වන දින දක්වා, මාධ්‍යය මොළයෙන් ලබාගත් ස්නායු ට්‍රොෆික් සාධකය (BDNF; 20 ng ml−1, පෙප්‍රොටෙක්) සහ නියුරෝට්‍රොෆින් 3 (NT3; 20 ng ml−1; පෙප්‍රොටෙක්) සමඟ අතිරේක කරන ලදී.අත්හිටුවීමේ හයවන දිනයේදී, ස්නායු ගෝලාකාර ස්නායු මාධ්‍යයකට මාරු කරන ලදී, විටමින් A නොමැතිව Neurobasal-A (10888, Life Technologies), B-27 අතිරේකය (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies), පෙනිසිලින් අඩංගු වේ.සහ ස්ට්‍රෙප්ටොමිෂන් (1:100, ජීවිත තාක්‍ෂණ) සහ ඩොපොල්නෙන් එපීඩර්මල් ෆැක්ටෝරම් රොස්ටා (ඊජීඑෆ්; 20 ng/ml; R&D පද්ධති) සහ පෙබරවාරි 2 (FGF2; 20 ng/ml; R&D Systems) 24-gо дня. සහ ස්ට්‍රෙප්ටොමයිසින් (1:100, ලයිෆ් ටෙක්නොලොජීස්) සහ 24 වන දිනය දක්වා එපීඩර්මල් වර්ධන සාධකය (EGF; 20 ng/ml; පර්යේෂණ සහ සංවර්ධන පද්ධති) සහ ෆයිබ්‍රොබ්ලාස්ට් වර්ධන සාධකය 2 (FGF2; 20 ng/ml; පර්යේෂණ සහ සංවර්ධන පද්ධති) සමඟ අතිරේකව ලබා දෙනු ලැබේ.දින 25 සිට 42 දක්වා, මොළයෙන් ලබාගත් ස්නායු පෝෂක සාධකය (BDNF; 20 ng ml-1, Peprotech) සහ නියුරෝට්‍රොෆින් 3 (NT3; 20 ng ml-1, Peprotech) මාධ්‍යයට එකතු කරන ලද අතර, දිනක් පාසා මාධ්‍යය වෙනස් කරන ලදී.在悬浮的第6 天，将神经球体转移到含有neurobasal-A（10888, Life Technologies）、不含维生紉补充剂（12587, Life Technologies）、GlutaMax（1:100, Life Technologies තාක්ෂණයන් ml-1R&D පද්ධති）和成纤维细胞生长因子2（FGF2；20 ng ml-1；R&D පද්ධති）直至第24在 悬浮 的 第 第 6 天 将 神经 球体 转移 含有 含有 neurobasal-a （10888 ， Life Technologies）的 b-27 补充剂 （12587 , ජීවිත තාක්ෂණ 100 , Life Technologies 表皮 生长 因子 （（20 ng ml-1 ； r & d පද්ධති පද්ධති 直至第24天. දින 6 සිට දින 6 දක්වා නීරොස්ෆර්ස් බ්ලිලි පෙරෙවෙඩන් හෝ ඩෝබාව්කු, සෝඩර්ෂාෂ්යු නීරෝබසාල්-අයි (10888, ලයිෆ් ටෙක්නොලොජිස්), В-27 без витамина А (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies), пеницилин- нейтрализованный стреполог, Life Technologies ඩොබව්ලේනියම් එපිඩර්මල්නොගෝ ෆැක්ටෝරා රොස්ටා (EGF; 20 ng мл-1; R&D පද්ධති) සහ ෆැක්ටෝරා රොස්ටැ ෆෙබ්‍රොබ්ලාස්ට් 2 (FGF2; 20 ng мл-1) 1; 6 වන දින, ස්නායු ගෝල අත්හිටුවීම්, එපීඩර්මල් වර්ධන සාධකය (EGF; 20 ng ml-1; R&D පද්ධති) සහ ෆයිබ්‍රොබ්ලාස්ට් වර්ධන සාධකය 2 (FGF2; 20 ng ml-1) 1 සමඟ අතිරේක කරන ලද neurobasal-A (10888, Life Technologies), විටමින් A නොමැතිව B-27 අතිරේකය (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies), පෙනිසිලින්-උදාසීන කළ ස්ට්‍රෙප්ටොමයිසින් (1:100, Life Technologies) අඩංගු අතිරේකයකට මාරු කරන ලදී. පර්යේෂණ සහ සංවර්ධන පද්ධති) දින 24 සිට. (R&D පද්ධති) 24 වන දින දක්වා.දින 25 සිට 42 දක්වා, මොළයෙන් ලබාගත් ස්නායු පෝෂක සාධකය (BDNF; 20 ng ml-1, Peprotech) සහ ස්නායු පෝෂක සාධකය 3 (NT3; 20 ng ml-1, Peprotech) දිනක් පාසා සංස්කෘතික මාධ්‍යයට එකතු කරන ලදී. මධ්‍යස්ථ වෙනසක් එක් වරක් සිදු කරන ලදී.43 වන දින සිට, hCO සෑම දින 4-6 කට වරක් මධ්‍යම වෙනසක් සහිතව අතිරේක නොකළ ස්නායු-A මාධ්‍යයක (NM; 1088022, Thermo Fisher) පවත්වා ගන්නා ලදී. පෝෂක රහිත තත්වයන් යටතේ වගා කරන ලද hiPS සෛල වලින් hCO ලබා ගැනීම සඳහා, hiPS සෛල 37°C දී මිනිත්තු 7 ක් සඳහා Accutase (AT-104, Innovate Cell Technologies) සමඟ පුර්ව ලියාපදිංචි කරන ලද අතර, තනි සෛල බවට විඝටනය කර, ROCK නිෂේධක Y-27632 (10 μM; S1049, Selleckchem) සමඟ අතිරේක කරන ලද Essential 8 මාධ්‍යයේ ළිඳකට තනි සෛල 3 × 106 ක ඝනත්වයකින් AggreWell 800 තහඩු (34815, STEMCELL Technologies) මත ආලේප කරන ලදී. පැය 24 කට පසු, ළිංවල ඇති මාධ්‍ය, ඩෝර්සොමෝෆීන් (2.5 μM; P5499, සිග්මා-ඇල්ඩ්රිච්) සහ SB-431542 (10 μM; 1614) සමඟ අතිරේකව Essential 6 මාධ්‍ය (A1516401, Life Technologies) අඩංගු මාධ්‍යවලට ඉහළට සහ පහළට පයිප්ප කරන ලදී. , ටොක්රිඩා). දින 2 සිට 6 දක්වා, අත්‍යවශ්‍ය 6 මාධ්‍යය දිනපතා ඩෝර්සොමෝෆීන් සහ අතිරේක SB-431542 සමඟ ප්‍රතිස්ථාපනය කරන ලදී. හයවන දින සිට, ස්නායු ගෝල අත්හිටුවීම් ස්නායු පාදක මාධ්‍යයට මාරු කර ඉහත විස්තර කර ඇති පරිදි නඩත්තු කරන ලදී.
ස්ටැන්ෆර්ඩ් විශ්ව විද්‍යාලයේ රසායනාගාර සත්ව ආරක්ෂණ පරිපාලන කමිටුව (APLAC) විසින් අනුමත කරන ලද සත්ව ආරක්ෂණ මාර්ගෝපදේශයන්ට අනුකූලව සියලුම සත්ව ක්‍රියා පටිපාටි සිදු කරන ලදී. ගර්භනී යුතිමික් RNU (rnu/+) මීයන් මිලදී ගන්නා ලදී හෝ නවාතැන් ගෙන ඇත (චාල්ස් ගංගා රසායනාගාර) හෝ නවාතැන් ගෙන ඇත. ආහාර සහ ජලය ඇඩ් ලිබිටම් සමඟ සතුන් පැය 12 ක ආලෝක-අඳුරු චක්‍රයක තබා ඇත. දින තුනේ සිට හත දක්වා වයසැති නිරුවත් (FOXN1–/–) මී පැටවුන් කපා දැමීමට පෙර නොමේරූ උඩු රැවුලේ වර්ධනය මගින් හඳුනා ගන්නා ලදී. බලු පැටවුන් (පිරිමි සහ ගැහැණු) 2-3% අයිසොෆ්ලුරේන් සමඟ නිර්වින්දනය කර ස්ටීරියෝටැක්සික් රාමුවක් මත තබන ලදී. ඩුරා මේටරයේ අඛණ්ඩතාව පවත්වා ගනිමින් S1 ට වඩා ආසන්න වශයෙන් 2-3 mm විෂ්කම්භයක් සහිත හිස් කබලේ ට්‍රෙපනේෂන් එකක් සිදු කරන ලදී. ඉන්පසු ඩුරා සිදුරු කිරීම සඳහා හිස් කබලෙන් පිටත 30-G ඉඳිකටුවක් (ආසන්න වශයෙන් 0.3 මි.මී.) භාවිතා කරන්න. ඉන්පසු HCO තුනී 3×3 සෙ.මී. පැරෆිල්මයකට යොදන්න සහ අතිරික්ත මාධ්‍යය ඉවත් කරන්න. 23 G, 45° ඉඳිකටුවකට සවි කර ඇති හැමිල්ටන් සිරින්ජයක් භාවිතා කරමින්, ඉඳිකටුවේ වඩාත්ම දුරස්ථ කෙළවරට hCO මෘදු ලෙස ඇද ගන්න. ඉන්පසු ස්ටීරියෝටැක්සික් උපාංගයට සම්බන්ධ කර ඇති සිරින්ජ පොම්පය මත සිරින්ජය සවි කරන්න. ඉන්පසු ඉඳිකටුවේ කෙළවර ඩුරා (z = 0 මි.මී.) හි කලින් සාදන ලද 0.3 මි.මී. පළල සිදුරු සිදුරක් මත තබා ඉඳිකටුව ඩුරා මේටර් A අතර වන තෙක් සිරින්ජය 1–2 මි.මී. (z = ආසන්න වශයෙන් –1.5 මි.මී.) පටු කරන්න. ඝන මුද්‍රාවක් සාදනු ලැබේ. ඉන්පසු සිරින්ජය z = -0.5 මි.මී. හි බාහික මතුපිට මැදට ඔසවා විනාඩියකට 1-2 µl අනුපාතයකින් hCO එන්නත් කරන්න. hCO එන්නත් කිරීම අවසන් වූ පසු, ඉඳිකටුව විනාඩියකට 0.2-0.5 මි.මී. අනුපාතයකින් ආපසු ලබා ගනු ලැබේ, සම මැහුම් කරනු ලැබේ, සහ සම්පූර්ණ සුවය ලැබෙන තෙක් බලු පැටියා වහාම උණුසුම් තාපන පෑඩ් මත තබා ඇත. සමහර සතුන් ද්විපාර්ශ්විකව බද්ධ කරන ලදී.
සියලුම සත්ව ක්‍රියා පටිපාටි ස්ටැන්ෆර්ඩ් විශ්ව විද්‍යාලයේ APLAC අනුමත සත්ව ආරක්ෂණ මාර්ගෝපදේශයන්ට අනුකූලව සිදු කරන ලදී. මීයන් (බද්ධ කිරීමෙන් දින 60 කට වඩා වැඩි) 5% අයිසොෆ්ලුරේන් නිර්වින්දනයකින් ප්‍රේරණය කරන ලද අතර රූපකරණය අතරතුර 1-3% අයිසොෆ්ලුරේන් සමඟ නිර්වින්දනය කරන ලදී. දෘශ්‍යකරණය සඳහා, ජාත්‍යන්තර විදුලි සමාගම (IECO) අනුක්‍රමික ධාවකයක් සහිත 7 ටෙස්ලා සක්‍රීයව ආවරණය කරන ලද තිරස් සිදුරු ස්කෑනරයක් බෲකර් (බෲකර් කෝපරේෂන්), අභ්‍යන්තර විෂ්කම්භය 120 mm (600 mT/m, 1000 T/m/s) සහිත ආවරණ සහිත අනුක්‍රමික ඇතුළු කිරීමක් AVANCE භාවිතා කරන ලදී. III, අට-නාලිකා බහු-දඟර RF සහ බහු-හර හැකියාවන් සහ ඒ සමඟ ඇති පැරවිෂන් 6.0.1 වේදිකාව. 86 mm අභ්‍යන්තර විෂ්කම්භයක් සහිත ක්‍රියාකාරීව විසන්ධි කරන ලද පරිමාමිතික RF දඟරයක් සහ ලැබීම සඳහා පමණක් සිව්-නාලිකා ක්‍රියෝ-සිසිල් RF දඟරයක් භාවිතයෙන් පටිගත කිරීම සිදු කරන ලදී. අක්ෂීය 2D Turbo-RARE (පුනරාවර්තන කාලය = 2500 ms, දෝංකාර කාලය = 33 ms, සාමාන්‍ය 2) පෙති ග්‍රහණ 16ක් සමඟ, පෙති ඝණකම 0.6–0.8 mm, සාම්පල 256 × 256 අඩංගු වේ. සෙන්ටිමීටර 2 ක අභ්‍යන්තර විෂ්කම්භයක් සහිත චතුරස්‍ර සම්ප්‍රේෂක පරිමාමිතික RF දඟරයක් භාවිතයෙන් සංඥා ලැබුණි (Rapid MR International, LLC). අවසාන වශයෙන්, 3D විදැහුම්කරණය සහ පරිමාව විශ්ලේෂණය සඳහා බිල්ට්-ඉන් ඉමාරිස් (BitPlane) මතුපිට ඇස්තමේන්තු කාර්යයන් භාවිතා කරන්න. සාර්ථක බද්ධ කිරීමක් අර්ථ දක්වා ඇත්තේ බද්ධ කළ අර්ධගෝලයේ අඛණ්ඩ T2-බරිත MRI සංඥා ප්‍රදේශ සෑදූ එකක් ලෙස ය. බද්ධ කිරීම ප්‍රතික්ෂේප කිරීම අර්ථ දක්වා ඇත්තේ බද්ධ කළ අර්ධගෝලයේ අඛණ්ඩ T2-බරිත MRI සංඥා ප්‍රදේශ නිපදවා නොමැති බද්ධ කිරීමක් ලෙස ය. උපකෝටිකල් t-hCO පසුකාලීන විශ්ලේෂණයෙන් බැහැර කරන ලදී.
ද්වි-ෆෝටෝන කැල්සියම් ප්‍රතිබිම්බනය සඳහා hCO හි GCaMP6s ස්ථායීව ප්‍රකාශ කිරීම සඳහා, hiPS සෛල pLV[Exp]-EF1a::GcaMP6s-WPRE-Puro ආසාදනය කර ප්‍රතිජීවක තෝරා ගන්නා ලදී. කෙටියෙන් කිවහොත්, සෛල EDTA සමඟ විඝටනය කර පොලිබ්‍රීන් (5 μg/ml) සහ වෛරස් 15 μl ඉදිරියේ ආසන්න වශයෙන් සෛල 300,000 ක ඝනත්වයකින් Essential 8 මාධ්‍යයේ මිලි ලීටර් 1 ක අත්හිටුවන ලදී. ඉන්පසු සෛල විනාඩි 60 ක් අත්හිටුවීමේදී පුර්ව ලියාපදිංචි කරන ලද අතර ළිඳකට සෛල 50,000 ක ඝනත්වයකින් බීජ කරන ලදී. සංසර්ගයෙන් පසු, සෛල දින 5-10 ක් හෝ ස්ථාවර ජනපද දිස්වන තුරු 5-10 μg ml-1 puromycin සමඟ ප්‍රතිකාර කරන ලදී. උග්‍ර hCO ආසාදනය කලින් විස්තර කර ඇති පරිදි 5 සමහර වෙනස් කිරීම් සමඟ සිදු කරන ලදී. කෙටියෙන් කිවහොත්, ස්නායු මාධ්‍යයේ 100 µl අඩංගු 1.5 ml Eppendorf ක්ෂුද්‍ර කේන්ද්‍රාපසාරී නල වලට දින 30-45 hCO මාරු කරන්න. ඉන්පසු මාධ්‍යයෙන් ආසන්න වශයෙන් 90 µl ඉවත් කරනු ලැබේ, ඉහළ ටයිටර් ලෙන්ටිවයිරසයෙන් 3-6 µl (0.5 x 108 සිට 1.2 x 109 දක්වා) නලයට එකතු කරනු ලැබේ, සහ hCO විනාඩි 30 ක් සඳහා ඉන්කියුබේටරයට මාරු කරනු ලැබේ. ඉන්පසු සෑම නලයකටම මාධ්‍යයෙන් 90–100 µl එකතු කර නල එක රැයකින් ඉන්කියුබේටරයට ආපසු එවන්න. ඊළඟ දවසේ, අඩු ඇමුණුම් තහඩු වල නැවුම් ස්නායු මාධ්‍යයට hCO මාරු කරන්න. දින 7 කට පසු, දෘශ්‍යකරණය සහ ආසාදන ගුණාත්මකභාවය ඇගයීම සඳහා hCO 24-ළිං වීදුරු පහළ තහඩු වෙත මාරු කරන ලදී. pLV[Exp]-SYN1::EYFP-WPRE සහ pLV[Exp]-SYN1::hChR2-EYFP-WPRE ජනනය කරන ලද්දේ VectorBuilder විසිනි. Lentivirus බොහෝ අත්හදා බැලීම් වලදී භාවිතා කරනු ලබන්නේ එය ධාරක ජෙනෝමය තුළට ඒකාබද්ධ වී ඇති නිසා, ආසාදිත සෛල රේඛා වල වාර්තාකරු ජාන ප්‍රකාශනයට ඉඩ සලසන බැවිනි. ජලභීතිකා රෝගය පිළිබඳ පසු විපරම සඳහා, දින 30-45 hCO ජලභීතිකා රෝගය-ΔG-eGFP සහ AAV-DJ-EF1a-CVS-G-WPRE-pGHpA (plasmid #67528, Addgene) සමඟ සම-ආසාදනය කර, දින 3 ක් හොඳින් සෝදා, S1 හි මීයන් තුළට බද්ධ කර දින 7-14 ක් සජීවීව පවත්වා ගෙන යන ලදී.
ප්‍රතිශක්ති සෛල රසායන විද්‍යාව සඳහා, සතුන් නිර්වින්දනය කර PBS සමඟ 4% පැරෆෝමල්ඩිහයිඩ් (PBS හි PFA; ඉලෙක්ට්‍රෝන අන්වීක්ෂ විද්‍යා) සමඟ හෘද පරිවරණය කරන ලදී. මොළය පැය 2 ක් හෝ රාත්‍රියක් 4°C දී 4% PFA හි සවි කර, පැය 48-72 ක් PBS හි 30% සුක්‍රෝස් හි ක්‍රයෝප්‍රෙසර් කර, 1:1, 30% සුක්‍රෝස්: OCT (පටක-ටෙක් OCT සංයෝගය 4583, සකුරා ෆිනෙටෙක්) තුළ තැන්පත් කර, ක්‍රයෝස්ටැට් (ලයිකා) භාවිතයෙන් 30 µm හි කිරීටක කොටස් සාදන ලදී. ඝන කොටස්වල ප්‍රතිශක්තිකරණ රසායන විද්‍යාව සඳහා, සතුන් PBS සමඟ සිදුරු කරන ලද අතර, මොළය විච්ඡේදනය කර වයිබ්‍රටෝමයක් (ලයිකා) භාවිතයෙන් 300-400 µm හි කිරීටක වශයෙන් කොටස් කරන ලද අතර කොටස් විනාඩි 30 ක් සඳහා 4% PFA සමඟ සවි කරන ලදී. ඉන්පසු ක්‍රයෝසෙක්ෂන් හෝ ඝන කොටස් PBS වලින් සෝදා, කාමර උෂ්ණත්වයේ දී පැය 1 ක් අවහිර කරන ලදී (10% සාමාන්‍ය ඩොන්කි සීරම් (NDS) සහ 0.3% ට්‍රයිටන් X-100 PBS වල තනුක කර ඇත) සහ 4°C දී අවහිර කිරීමේ ද්‍රාවණයකින් අවහිර කරන ලදී. – ඉන්කියුබේෂන් ක්‍රයෝසෙක්ෂන් එක රැයකින් ඉන්කියුබේට් කරන ලද අතර ඝන කොටස් දින 5 ක් ඉන්කියුබේට් කරන ලදී. භාවිතා කරන ලද ප්‍රාථමික ප්‍රතිදේහ වූයේ: ප්‍රති-NeuN (මූසිකයා, 1:500; ab104224, abcam) ප්‍රති-CTIP2 (මීයා, 1:300; ab18465, abcam), ප්‍රති-GFAP (හාවා, 1:1,000; Z0334, Dako), ප්‍රති-GFP (කුකුල් මස්, 1:1,000; GTX13970, GeneTex), ප්‍රති-HNA (මූසිකයා, 1:200; ab191181, abcam), ප්‍රති-NeuN (හාවා, 1:500; ABN78, මිලිපෝර්), ප්‍රති-PDGFRA (හාවා, 1:200; sc-338, සැන්ටා කෲස්), ප්‍රති-PPP1R17 (හාවා, 1:200; HPA047819, ඇට්ලස් ප්‍රතිදේහ), ප්‍රති-RECA-1 (මූසිකයා, 1:50; ab9774, abcam), SCG2 විරෝධී (හාවා, 1:100; 20357-1-AP, Proteintech), SOX9 විරෝධී (එළුවා, 1:500; AF3075, පර්යේෂණ සහ සංවර්ධන පද්ධති), Netrin G1a (එළුවා, 1:100; AF1166, පර්යේෂණ සහ සංවර්ධන පද්ධති), STEM121 විරෝධී (මූසිකයා, 1:200; Y40410, ටකාරා බයෝ), SATB2 විරෝධී (මූසිකයා, 1:50; ab51502, abcam), GAD65/67 විරෝධී (හාවා, 1:400; ABN904, මිලිපෝර්) සහ IBA1 විරෝධී (එළුවා, 1:100; ab5076, abcam). භාවිතා කරන ලද ප්‍රාථමික ප්‍රතිදේහ වූයේ: ප්‍රති-NeuN (මූසිකයා, 1:500; ab104224, abcam) ප්‍රති-CTIP2 (මීයා, 1:300; ab18465, abcam), ප්‍රති-GFAP (හාවා, 1:1,000; Z0334, Dako), ප්‍රති-GFP (කුකුල් මස්, 1:1,000; GTX13970, GeneTex), ප්‍රති-HNA (මූසිකයා, 1:200; ab191181, abcam), ප්‍රති-NeuN (හාවා, 1:500; ABN78, මිලිපෝර්), ප්‍රති-PDGFRA (හාවා, 1:200; sc-338, සැන්ටා කෲස්), ප්‍රති-PPP1R17 (හාවා, 1:200; HPA047819, ඇට්ලස් ප්‍රතිදේහ), ප්‍රති-RECA-1 (මූසිකයා, 1:50; ab9774, abcam), SCG2 විරෝධී (හාවා, 1:100; 20357-1-AP, ප්‍රෝටීන්ටෙක්), SOX9 විරෝධී (එළුවා, 1:500; AF3075, පර්යේෂණ සහ සංවර්ධන පද්ධති), Netrin G1a (එළුවා, 1:100; AF1166, පර්යේෂණ සහ සංවර්ධන පද්ධති), STEM121 විරෝධී (මූසිකය, 1:200; Y40410, ටකාරා බයෝ), SATB2 විරෝධී (මූසිකය, 1:50; ab51502, abcam), GAD65/67 විරෝධී (හාවා, 1:400; ABN904, මිලිපෝර්) සහ IBA1 විරෝධී (එළුවා, 1:100; ab5076, abcam). Использовались следуюющие первичные антитела: anti-NeuN (මිෂින්, 1:500; ab104224, abcam: ANTI,0CT1, ANTI,0CT1 ab18465, abcam), ඇන්ටි-GFAP (ක්‍රොලිච්, 1: 1000; Z0334, Dako), ඇන්ටි- -GFP (කුරිසා, 1:1000; GTX13970, GeneTex), анти:20, ab191181, abcam), анти-NeuN (кролик, 1:500; ABN78, Millipore), ඇන්ටි-PDGFRA (кролик, 1:200; sc-338, santa-Kruz), анти-PPP1R17, кроли-PPP1R17; HPA047819, ඇට්ලස් ප්‍රතිදේහ), ඇන්ටි-RECA-1 (මූෂ්‍ය, 1:50; ab9774, abcam), ඇන්ටි-SCG2 (ක්‍රොලික්, 1:100; 20357-1-AP, ප්‍රෝටීන්-සොක්ස්, AF3075, R&D පද්ධති), NETRIN G1a (කොසියි, 1:100; AF1166, R&D Systems), anti-STEM121 (මැෂින් , 1:200; Y40410, Takara Bio), ANTI-SATB2 (මෑ, 1:50; ab51502, abcam), AD65ти-G 1:400; ABN904, Millipore) සහ ඇන්ටි-IBA1 (කෝසා, 1:100; ඇබ්5076, ඇබ්කාම්). භාවිතා කරන ලද ප්‍රාථමික ප්‍රතිදේහ වූයේ: ප්‍රති-NeuN (මූසිකයා, 1:500; ab104224, abcam), ප්‍රති-CTIP2 (මීයා, 1:300; ab18465, abcam), ප්‍රති-GFAP (හාවා, 1:1000; Z0334, Dako), ප්‍රති-GFP (කුකුල් මස්, 1:1000; GTX13970, GeneTex), ප්‍රති-HNA (මූසිකයා, 1:200; ab191181, abcam), ප්‍රති-NeuN (හාවා, 1:500; ABN78, Millipore), ප්‍රති-PDGFRA (හාවා, 1:200; sc-338, සැන්ටා කෲස්), ප්‍රති-PPP1R17 (හාවා, 1:200; HPA047819, ඇට්ලස් ප්‍රතිදේහ), ප්‍රති-RECA-1 (මූසිකයා, 1:50; ab9774, abcam), SCG2 විරෝධී (හාවා, 1:100; 20357-1-AP, ප්‍රෝටීන්ටෙක්), SOX9 විරෝධී (එළුවා, 1:500; AF3075, පර්යේෂණ සහ සංවර්ධන පද්ධති), netrin G1a (එළුවා, 1:100; AF1166, පර්යේෂණ සහ සංවර්ධන පද්ධති), STEM121 විරෝධී (මූසිකයා, 1:200; Y40410, ටකාරා බයෝ), SATB2 විරෝධී (මූසිකයා, 1:50; ab51502, abcam), GAD65/67 විරෝධී (හාවා, 1:400; ABN904, මිලිපෝර්) සහ IBA1 විරෝධී (එළු, 1:100; ab5076, abkam).使用的一抗是：抗NeuN（小鼠, 1:500；ab104224,abcam）抗CTIP2 00ab18465,abcam）,抗GFAP（兔,1:1,000；Z0334,Dako）,抗-GF P（鸡, 1:1,000;GTX13970, GeneTex）, 抗HNA（小鼠, 1:200;ab1911 81, abcam），抗NeuN（兔, 1:500；ABN78, Millipore）,抗PDGFRA 1:200；sc-338, සැන්ටා කෲස්, 抗PPP1R17（兔, 1:200;HPA047819, ඇට්ලස්抗体）,抗RECA-1（小鼠,1:50；ab9774,abcam）,抗SCG2 (兔） 1:100;20357-1-AP,Proteintech）,抗SOX9（山羊,1:500；AF3075,R&D Systems,Netrin G1a（山羊,1:100；AF116 පද්ධති), 抗STEM121 (小鼠, 1:200;使用的一抗是：抗NeuN（小鼠, 1:500；ab104224,abcam）抗CTIP2 :300;ab18465,abcam），抗GFAP（兔, 1:1,000；Z0334, Dako）,抗-GFP (鸡,1:1,000;GTX13970,GeneTex）,抗HNA（小鼠,1:200；ab 191181,abcam）,抗NeuN（兔,1:500；ABN78,Millipore％弔,抗1: 200；sc-338, Santa Cruz）,抗PPP1R17（兔, 1:200；HPA047819, Atlas 抗体）,抗RECA-1 100;20357-1-AP,Proteintech）,抗SOX9Y40410, Takara Bio), SATB2 විරෝධී (මූසිකය, 1:50; ab51502, abcam), GAD65/67 විරෝධී (හාවා, 1:400; ABN904, මිලිපෝර්) සහ IBA1 විරෝධී (එළුවා, 1:100; ab5076, abcam).භාවිතා කරන ලද ප්‍රාථමික ප්‍රතිදේහ වූයේ: ප්‍රති-NeuN (මූසිකය, 1:500; ab104224, abcam), ප්‍රති-CTIP2 (මීයා, 1:300; ab18465, abcam), ප්‍රති-GFAP (හාවා, 1:1000; Z0334, Dako) . , GFP විරෝධී (කුකුල් මස්, 1:1000; GTX13970, GeneTex), HNA විරෝධී (මූසිකයා, 1:200; ab191181, abcam), NeuN විරෝධී (හාවා, 1:500; ABN78, මිලිපෝර්), PDGFRA විරෝධී (හාවා, 1:200; sc-338, සැන්ටා කෲස්), PPP1R17 විරෝධී (හාවා, 1:200; HPA047819, ඇට්ලස් ප්‍රතිදේහය), RECA-1 විරෝධී (මූසිකයා, 1:50; ab9774, abcam), SCG2 විරෝධී (හාවා), 1:100;20357-1-AP, Proteintech), ඇන්ටි-SOX9 (කෝසා, 1:500; AF3075, R&D පද්ධති), NETRIN G1a (කෝසා, 1:100; AF1166, R&D පද්ධති), анти, 120;STEM121; Y40410, Takara Bio), ඇන්ටි-SATB2 (මැ, 1:50; ab51502, abcam), ඇන්ටි-GAD65/67 (кролик, 1:400; ABN904, Millipore) и, анти-IBA10; ab5076, ABKAM). 20357-1-AP, Proteintech), SOX9 විරෝධී (එළුවා, 1:500; AF3075, පර්යේෂණ සහ සංවර්ධන පද්ධති), Netrin G1a (එළුවා, 1:100; AF1166, පර්යේෂණ සහ සංවර්ධන පද්ධති), STEM121 විරෝධී (මූසිකයා, 1:200; Y40410, ටකාරා බයෝ), SATB2 විරෝධී (මූසිකයා, 1:50; ab51502, abcam), GAD65/67 විරෝධී (හාවා, 1:400; ABN904, මිලිපෝර්), සහ IBA1 විරෝධී (එළුවා, 1:100; ab5076, abkam).ඉන්පසු කොටස් PBS වලින් සෝදා කාමර උෂ්ණත්වයේ දී (ශීත කළ කොටස්) හෝ එක රැයකින් 4°C (ඝන කොටස්) දී ද්විතියික ප්‍රතිදේහ සමඟ පැය 1 ක් පුර්ව ලියාපදිංචි කරන ලදී. ඇලෙක්සා ෆ්ලෝර් ද්විතියික ප්‍රතිදේහය (ලයිෆ් ටෙක්නොලොජීස්) අවහිර කිරීමේ ද්‍රාවණයක 1:1000 තනුක කරන ලදී. PBS සමඟ සේදීමෙන් පසු, න්‍යෂ්ටීන් Hoechst 33258 (ලයිෆ් ටෙක්නොලොජීස්) සමඟ දෘශ්‍යමාන කරන ලදී. අවසාන වශයෙන්, ස්ලයිඩ Aquamount (Polysciences) භාවිතා කරමින් ආවරණ ස්ලිප් (ෆිෂර් සයන්ටිෆික්) සහිත අන්වීක්ෂයක් මත තබා රූපයේ Keyence fluorescent microscope (BZ-X විශ්ලේෂකය) හෝ Leica TCS SP8 confocal microscope (Las-X) මත විශ්ලේෂණය කරන ලදී. රූප ImageJ වැඩසටහන (Fiji) භාවිතයෙන් සකසන ලදී. t-hCO සහ මීයන් බාහිකයේ මිනිස් ස්නායු සෛල අනුපාතය ප්‍රමාණනය කිරීම සඳහා, t-hCO මධ්‍යයේ, මීයන් බාහිකයේ කෙළවරේ හෝ ඒ ආසන්නයේ 387.5 μm පළල සෘජුකෝණාස්‍රාකාර රූප ගන්නා ලදී. පටක විනිවිදභාවය, HNA+ න්‍යෂ්ටි සහ/හෝ පටක ස්වයංක්‍රීය ප්‍රතිදීප්තතාවයේ වෙනස්කම් තක්සේරු කිරීමෙන් බද්ධ කිරීමේ මායිම් තීරණය කරන ලදී. සෑම රූපයකම, NeuN+ සහ HNA+ සෛලවල මුළු සංඛ්‍යාව එකම ප්‍රදේශයේ ඇති මුළු NeuN+ සෛල ගණනින් බෙදන ලදී. රූප තලයේ න්‍යෂ්ටි සහිත සෛල පමණක් ගණන් කර ඇති බව සහතික කිරීම සඳහා, Hoechst+ ද වන සෛල පමණක් ගණනය කිරීමේදී ඇතුළත් කර ඇත. සංඛ්‍යානමය දෝෂය අඩු කිරීම සඳහා අවම වශයෙන් 1 mm කින් වෙන් කරන ලද රූප දෙකක් සාමාන්‍යකරණය කරන ලදී.
සාම්පල එකතු කිරීමට සතියකට පෙර, hCO බද්ධ කිරීමේ සතුන් (ආසන්න වශයෙන් මාස 8 ක අවකලනය) අඳුරු කාමරයක සංවේදක උත්තේජනය අවම කිරීම සඳහා උඩු රැවුල කපා දමා තබන්න. කලින් විස්තර කර ඇති පරිදි, න්‍යෂ්ටීන් හුදකලා කිරීම සිදු කරන ලදී, සමහර වෙනස් කිරීම් සමඟ. කෙටියෙන් කිවහොත්, ඩිටර්ජන්ට්-යාන්ත්‍රික සෛල ලයිසිස් සහ 2 ml වීදුරු පටක ඇඹරුම් යන්තයක් (D8938, සිග්මා-ඇල්ඩ්රිච්/KIMBLE) භාවිතයෙන් t-hCO සහ hCO විනාශ කරන ලදී. ඉන්පසු අමු න්‍යෂ්ටීන් 40 µm පෙරහනක් භාවිතයෙන් පෙරා ඉවත් කර සුක්‍රෝස් ඝනත්ව අනුක්‍රමණයක් සිදු කිරීමට පෙර 4 °C දී මිනිත්තු 10 ක් සඳහා 320 g දී කේන්ද්‍රාපසාරී කරන ලදී. කේන්ද්‍රාපසාරී පියවරෙන් පසු (4°C දී මිනිත්තු 20 ක් සඳහා 320 g), සාම්පල 0.04% BSA/PBS හි µl-1 RNase නිෂේධක (40 u µl-1, AM2682, Ambion) ඒකක 0.2 ක් එකතු කර 40 µm ප්‍රවාහ පෙරහනක් හරහා ගමන් කරන ලදී. ඉන්පසු විඝටනය වූ න්‍යෂ්ටි 0.02% BSA අඩංගු PBS තුළ නැවත ස්ථාපනය කර Chromium Single Cell 3′ චිපයකට පටවන ලදී (එක් මංතීරුවකට සෛල 8,000 ක ඇස්තමේන්තුගත ප්‍රතිසාධනය). snRNA-seq පුස්තකාල Chromium Single cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics) සමඟින් සකස් කරන ලදී. snRNA-seq පුස්තකාල Chromium Single cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics) සමඟින් සකස් කරන ලදී. Библиотеки snRNA-seq были приготовлены с помощью Chromium Single cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics). snRNA-seq පුස්තකාල සකස් කරන ලද්දේ Chromium Single cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics) භාවිතයෙන්ය. snRNA-seq 文库是使用Chromium තනි සෛල 3′ GEM, පුස්තකාලය සහ Gel Bead Kit v3 (10x Genomics) 制备的。 snRNA-seq 文库是使用Chromium තනි සෛල 3′ GEM, පුස්තකාලය සහ Gel Bead Kit v3 (10x Genomics) 制备的。 Библиотеку snRNA-seq готовили с использованием Chromium Single Cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics). snRNA-seq පුස්තකාලය සකස් කරන ලද්දේ Chromium Single Cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics) භාවිතයෙන්ය.විවිධ සාම්පල වලින් ලබාගත් පුස්තකාල, NovaSeq S4 (Illumina) හි Admera Health විසින් එකතු කර අනුපිළිවෙලට සකස් කරන ලදී.
එක් එක් අනුමාන න්‍යෂ්ටික තීරු කේතය සඳහා ජාන ප්‍රකාශන මට්ටම් 10x Genomics CellRanger විශ්ලේෂණ මෘදුකාංග පැකේජය (අනුවාදය 6.1.2) භාවිතයෙන් ප්‍රමාණනය කරන ලදී. විශේෂයෙන්, කියවීම් mkref විධානය සමඟ නිර්මාණය කරන ලද මානව (GRCh38, Ensemble, අනුවාදය 98) සහ මීයන් (Rnor_6.0, Ensemble, අනුවාදය 100) යොමු ජෙනෝමවල සංයෝජනයකට ගැලපෙන අතර –include-introns=TRUE විධානය සමඟ ගණනය කිරීම භාවිතා කරමින් ප්‍රමාණනයට ඉන්ට්‍රෝන් කලාපවලට සිතියම්ගත කළ කියවීම් ඇතුළත් වේ. t-hCO සාම්පල සඳහා, සිතියම්ගත කළ කියවීම් වලින් අවම වශයෙන් 95% ක් මිනිස් ජෙනෝමයට ගැලපෙන ගතානුගතික අවශ්‍යතාවය මත පදනම්ව මානව න්‍යෂ්ටීන් හඳුනා ගන්නා ලදී. සියලුම පසුකාලීන විශ්ලේෂණ R පැකේජය (අනුවාදය 4.1.2) Seurat (අනුවාදය 4.1.1)32 භාවිතා කරමින් CellRanger වෙතින් පෙරන ලද තීරු කේත අරා ප්‍රතිදානයක් මත සිදු කරන ලදී.
පසුකාලීන විශ්ලේෂණයට උසස් තත්ත්වයේ න්‍යෂ්ටීන් පමණක් ඇතුළත් කර ඇති බව සහතික කිරීම සඳහා, සෑම නියැදියකටම පුනරාවර්තන පෙරහන් ක්‍රියාවලියක් ක්‍රියාත්මක කරන ලදී. පළමුව, අද්විතීය ජාන 1000 කට වඩා අඩු ප්‍රමාණයක් සහ මුළු මයිටොකොන්ඩ්‍රියා වලින් 20% කට වඩා වැඩි ප්‍රමාණයක් සහිත අඩු ගුණාත්මක න්‍යෂ්ටීන් හඳුනාගෙන ඉවත් කරනු ලැබේ. පසුව, අමු ජාන අංක අනුකෘතිය sctransform(vst.flavor=”v2″) ශ්‍රිතය භාවිතයෙන් විධිමත් කරන ලද සෘණ ද්විපද ප්‍රතිගමනය මගින් සාමාන්‍යකරණය කරන ලද අතර, එමඟින් පෙරනිමි පරාමිතීන් භාවිතා කරමින් වඩාත්ම විචල්‍ය ජාන 3000 ද හඳුනා ගන්නා ලදී. 30 ක දත්ත කට්ටල මානයක් භාවිතා කරමින් පෙරනිමි පරාමිතීන් සමඟ ප්‍රධාන සංරචක විශ්ලේෂණය (PCA) භාවිතයෙන් ඉහළ විචල්‍ය ජාන මත මාන අඩු කිරීම සිදු කරන ලදී (අඳුරු = 30 දණහිසේ ස්ථානවල දෘශ්‍ය පරීක්ෂාව මත පදනම්ව තෝරා ගන්නා ලද අතර සියලුම සාම්පල සහ සමූහ විශ්ලේෂණයන් සඳහා භාවිතා කරන ලදී). ඉන්පසු අපි අසාමාන්‍ය ලෙස අඩු ජාන ගණන (10 වන ප්‍රතිශතයට වඩා අඩු මධ්‍යන්‍ය), අසාමාන්‍ය ලෙස ඉහළ මයිටොකොන්ඩ්‍රියල් ජාන ගණන (95 වන ප්‍රතිශතයට වඩා මධ්‍යන්‍ය) මත පදනම්ව ජාන වර්ගීකරණය කිරීම සඳහා පුනරාවර්තන පොකුරු වට කිහිපයක් (විභේදනය = 1) සිදු කළෙමු. අඩු ගුණාත්මක භාවයෙන් යුත් අනුමාන සෛල හඳුනාගෙන ඉවත් කිරීම සඳහා. DoubletFinder33 පැකේජය භාවිතයෙන් හඳුනාගත් සැක සහිත නිවුන් දරුවන්ගේ පොකුරු සහ/හෝ ඉහළ ප්‍රතිශතයක් (95 වන ප්‍රතිශතයට වඩා වැඩි DoubletFinder ලකුණු). t-hCO සාම්පල (n=3) සහ hCO සාම්පල (n=3) වෙන වෙනම ඒකාබද්ධ කරන ලදී. ඉහත පරාමිතීන් සමඟ IntegrateData ශ්‍රිතය. ඉන්පසු ඉහත විස්තර කර ඇති පරිදි ඒකාබද්ධ දත්ත කට්ටලයේ ගුණාත්මක පෙරීමේ තවත් වටයක් සිදු කරන ලදී.
අඩු ගුණාත්මක කර්නල් ඉවත් කිරීමෙන් පසු, ඒකාබද්ධ දත්ත කට්ටලය කාණ්ඩගත කරන ලදී (විභේදනය = 0.5) සහ UMAP34 දෘශ්‍යකරණ අරමුණු සඳහා කාවැද්දුවා. සාමාන්‍යකරණය කරන ලද ජාන ප්‍රකාශන දත්ත වලින් ගණනය කරන ලද පෙරනිමි පරාමිතීන් සමඟ FindMarkers ශ්‍රිතය භාවිතයෙන් එක් එක් පොකුර සඳහා සලකුණු ජාන තීරණය කරන ලදී. භ්‍රෑණ සහ වැඩිහිටි බාහික යොමු දත්ත කට්ටල මාකර් ජාන ප්‍රකාශනය 19,20,21,35 සහ විවරණ සමඟ ඒකාබද්ධ කිරීමෙන් අපි ප්‍රධාන සෛල පන්ති හඳුනාගෙන වර්ගීකරණය කරමු. විශේෂයෙන්, සංසරණ පූර්වගාමීන් MKI67 සහ TOP2A ප්‍රකාශනය මගින් හඳුනා ගන්නා ලදී. මයිටොටික් පිටපත් නොමැතිකම, ප්‍රමාද මෙටාෆේස් භ්‍රෑණ බාහිකයේ විස්තර කර ඇති බහුබල ග්ලියල් ප්‍රොජෙනිටර් පොකුරු සමඟ ඉහළ අතිච්ඡාදනය සහ EGFR සහ OLIG1 ප්‍රකාශනය මගින් ප්‍රජනක පොකුරු අර්ථ දක්වා ඇත. ප්‍රමාද රේඩියල් ග්ලියා සිට තාරකා සෛල පරිණත වීම දක්වා තාරකා සෛල අවකලනය කිරීමේ අවස්ථා කිහිපයක් ඇතුළත් කිරීමට අපි තාරකා සෛල යන පදය භාවිතා කරමු. තාරකා සෛල පොකුරු SLC1A3 සහ AQP4 ඉහළ මට්ටම් ප්‍රකාශ කරන අතර භ්‍රෑණ රේඩියල් ග්ලියා සහ/හෝ වැඩිහිටි තාරකා සෛලවල උප වර්ග සමඟ සිතියම්ගත කරන බව පෙන්වා දී ඇත. OPCs PDGFRA සහ SOX10 ප්‍රකාශ කරන අතර ඔලිගොඩෙන්ඩ්‍රොසයිට් මයිලිනේෂන් සලකුණු (MOG සහ MYRF) ප්‍රකාශ කරයි. ග්ලූටමැටර්ජික් නියුරෝන හඳුනාගනු ලැබුවේ ස්නායු පිටපත් (SYT1 සහ SNAP25), GABAergic සලකුණු (GAD2) නොමැතිකම සහ NEUROD6, SLC17A7, BCL11B, හෝ SATB2 ප්‍රකාශනය මගිනි. GluN නියුරෝන තවදුරටත් ඉහළ (SATB2 ප්‍රකාශනය සහ BCL11B නැතිවීම) සහ ගැඹුරු (BCL11B ප්‍රකාශනය) උප කාණ්ඩවලට බෙදා ඇත. Putative subplate (SP) නියුරෝන ගැඹුරු GluN සලකුණු වලට අමතරව ST18 සහ SORCS1 වැනි දන්නා SP18 සලකුණු ප්‍රකාශ කරයි. Choroid plexus-සමාන සෛල TTR ප්‍රකාශනය මගින් හඳුනාගෙන ඇති අතර, meningeal-සමාන සෛල ෆයිබ්‍රොබ්ලාස්ට්-ආශ්‍රිත ජාන ප්‍රකාශ කර ඇති අතර යොමු දත්ත කට්ටලයේ pial/සනාල සෛල සිතියම්ගත කර ඇත.
ලිබ්‍රා R පැකේජය (අනුවාදය 1.0.0) භාවිතයෙන් ක්‍රියාත්මක කරන ලද සාම්පලවල ප්‍රතිනිෂ්පාදනය කරන ලද අලුතින් සංවර්ධනය කරන ලද ව්‍යාජ-කණ්ඩායම් ක්‍රමයක් භාවිතයෙන් t-hCO සහ hCO උප පංති අතර ජාන ප්‍රකාශනයේ අවකල විශ්ලේෂණය සිදු කරන ලදී. විශේෂයෙන්, එක් එක් සාම්පල ප්‍රතිනිර්මාණය සඳහා දී ඇති සෛල පන්තියක් සඳහා සෛලවල ජාන ගණන සාරාංශ කිරීමෙන් කණ්ඩායම් සඳහා edgeR ලොග්-සම්භාවිතා පරීක්ෂණ (අනුවාදය 3.36.0, පැකේජය R) සිදු කරන ලදී. තාප සිතියම් දෘශ්‍යකරණය සඳහා, මිලියනයකට සාමාන්‍යකරණය කරන ලද (CPM) අගයන් edgeR (cpm() ශ්‍රිතය) භාවිතයෙන් ගණනය කර පරිමාණය කරනු ලැබේ (මධ්‍යන්‍යය = 0 ලබා ගැනීමට, සම්මත අපගමනය = 1). සැලකිය යුතු ලෙස ඉහළ නංවන ලද t-hCO GluN ජානවල ජාන ඔන්ටොලොජි (GO) පොහොසත් කිරීමේ විශ්ලේෂණය සිදු කරන ලදී (බෙන්ජමිනි-හොච්බර්ග් t-hCO GluN සෛල වලින් අවම වශයෙන් 10% කින් ප්‍රකාශිත 0.05 ට අඩු P අගයක් සහ අවම වශයෙන් 2 ගුණයකින් වෙනස් වීමේ වැඩි වීමක්). ToppGene Suite (https://toppgene.cchmc.org/) භාවිතයෙන් සිදු කරන ලදී. අපි පෙරනිමි පරාමිතීන් සහිත ToppFun යෙදුම භාවිතා කරන අතර GO-විවරණ සහිත අධිජ්‍යාමිතික පරීක්ෂණ වලින් ගණනය කරන ලද Benjamini-Hochberg-නිවැරදි කරන ලද P-අගය වාර්තා කරමු.
අපගේ snRNA-seq පොකුරු, ප්‍රාථමික තනි සෛල RNA-seq හෝ වැඩිහිටි snRNA-seq19,20,21,22 හි යොමු අධ්‍යයනයන්ගෙන් විවරණය කළ සෛල පොකුරු සමඟ ගැලපීම සඳහා, අපි යුගල කළ දත්ත කට්ටල ඒකාබද්ධ කිරීමේ ප්‍රවේශයක් යෙදුවෙමු. දත්ත කට්ටල අතර පොකුරු අතිච්ඡාදනය ඒකාබද්ධ කිරීමට සහ සංසන්දනය කිරීමට අපි Seurat හි SCTransform (v2) සාමාන්‍යකරණ වැඩ ප්‍රවාහය භාවිතා කළෙමු (ඉහත පරාමිතීන් භාවිතා කරමින්). පරිගණක කාර්යක්ෂමතාව සඳහා තනි දත්ත කට්ටල අහඹු ලෙස මුල් පොකුරකට සෛල හෝ මධ්‍ය 500 ක් දක්වා උප කාණ්ඩගත කරන ලදී. කලින් විස්තර කර ඇති පරිදි සමාන ප්‍රවේශයක් භාවිතා කරමින්, පොකුරු අතිච්ඡාදනය යනු යොමු පොකුරේ ලේබලය සමඟ අතිච්ඡාදනය වූ එක් එක් සංචිත පොකුරේ සෛල හෝ න්‍යෂ්ටිවල අනුපාතය ලෙස අර්ථ දක්වා ඇත. GluNs තවදුරටත් වර්ගීකරණය කිරීම සඳහා, අපගේ GluN සෛල වෙත යොමු දත්ත කට්ටල ලේබල් පැවරීම සඳහා අපි GluN උප කුලක දත්ත සඳහා Seurat හි TransferData වැඩ ප්‍රවාහය භාවිතා කළෙමු.
t-hCO සහ hCO සාම්පලවල ගෝලීය පිටපත් කිරීමේ පරිණත තත්ත්වය තක්සේරු කිරීම සඳහා, අපි අපගේ ව්‍යාජ-තොග සාම්පල BrainSpan/psychENCODE23 සමඟ සංසන්දනය කළෙමු, එය මිනිස් මොළයේ වර්ධනය පුරා විහිදෙන විශාල RNA අනුපිළිවෙලකින් සමන්විත වේ. පිළිසිඳ ගැනීමෙන් සති 10 කට පසුව සහ පසුව, BrainSpan බාහික සාම්පල වලින් ඒකාබද්ධ රටා-සාමාන්‍යකරණය කරන ලද ජාන ප්‍රකාශන අනුකෘතියක් මත අපි PCA සිදු කළෙමු, ජාන 5567 කින් (අපගේ දත්ත සමඟ එක්ව) BrainSpan බාහික සාම්පලවල ක්‍රියාකාරී ලෙස කලින් හඳුනාගෙන ඇත (ඝන ආකෘතියක් භාවිතයෙන් වයස අනුව පැහැදිලි කරන ලද සංවර්ධන විචලනයෙන් 50% ට වඩා වැඩි ලෙස අර්ථ දක්වා ඇත)38. ඊට අමතරව, අපි කලින් විස්තර කර ඇති පරිදි සෘණ නොවන අනුකෘති සාධකකරණය භාවිතයෙන් ස්නායු සංවර්ධනයේ ප්‍රධාන පිටපත් කිරීමේ අත්සන් සමඟ සම්බන්ධ ජාන ලබා ගත්තෙමු. සෘණ නොවන අනුකෘති සාධකකරණ ක්‍රියා පටිපාටිය භාවිතයෙන් ගණනය කරන ලද නියැදි බර, Zhu et al.38 විසින් විස්තර කරන ලද අත්සන් පහෙන් එක් එක් සඳහා පුළුල් කළ දත්ත සමඟ රූප සටහන් 5b හි සැලසුම් කර ඇත. නැවතත්, ක්‍රියාකාරකම් මත යැපෙන පිටපත් කිරීමේ සලකුණු කලින් ප්‍රකාශිත අධ්‍යයනයන්ගෙන් ලබා ගන්නා ලදී. විශේෂයෙන්, අතිරේක වගුව 3 Hrvatin et al.16 වෙතින් දෘශ්‍ය උත්තේජනයෙන් පසුව, මූසික දෘශ්‍ය බාහිකයේ snRNA-seq එකතුවෙන් හඳුනාගත් ග්ලූටමැටර්ජික් නියුරෝන වල ERG සහ LRG සැලකිය යුතු ලෙස ඉහළ නංවන ලදී. මානව-පොහොසත් LRG KCl-සක්‍රීය මිනිස් භ්‍රෑණ මොළයේ සංස්කෘතීන්ගෙන් ලබා ගන්නා ලද අතර උත්තේජනයෙන් පැය 6 කට පසු අස්වනු නෙළන ලද අතර, පෙරන ලද ජාන මිනිසුන් තුළ සැලකිය යුතු ලෙස ඉහළ නංවන ලද නමුත් මීයන් තුළ නොවේ (අතිරේක වගුව 4). මෙම ජාන කට්ටල භාවිතා කරමින් ජාන කට්ටල පොහොසත් කිරීම විශ්ලේෂණය කරන ලද්දේ ඒක-මාර්ග ෆිෂර්ගේ නිශ්චිත පරීක්ෂණයක් භාවිතා කරමිනි.
අයිසොෆ්ලුරේන් සමඟ මීයන් නිර්වින්දනය කර, මොළය ඉවත් කර සීතල (ආසන්න වශයෙන් 4°C) ඔක්සිජන් සහිත (95% O2 සහ 5% CO2) සුක්‍රෝස් ද්‍රාවණයක තබන්න: 234 mM සුක්‍රෝස්, 11 mM ග්ලූකෝස්, 26 mM NaHCO3, 2.5 mM KCl, 1.25 mM. NaH2PO4, 10 mM MgSO4 සහ 0.5 mM CaCl2 (310 mOsm පමණ). කලින් විස්තර කර ඇති පරිදි t-hCO අඩංගු මී මොළයේ කිරීටක කොටස් (300–400 µm) ලයිකා VT1200 වයිබ්‍රටෝමයක් භාවිතයෙන් සාදන ලදී39. ඉන්පසු කොටස් 10 mM ග්ලූකෝස්, 26 mM NaHCO3, 2.5 mM KCl, 1.25 mM NaHPO4, 1 mM MgSO4, 2 mM CaCl2 සහ 126 mM NaCl (298 mOsm) වලින් සකස් කරන ලද aCSF අඩංගු අඛණ්ඩ කාමර උෂ්ණත්ව ඔක්සිජන්කරණයක් සහිත කොටස් කිරීමේ කුටියකට මාරු කරන ලදී. පටිගත කිරීමට අවම වශයෙන් මිනිත්තු 45 කට පෙර. කොටස් ගිල්වන ලද කුටියක වාර්තා කරන ලද අතර එහිදී ඒවා ACSF (95% O2 සහ 5% CO2 කුප්පිය) සමඟ අඛණ්ඩව සුවඳ ගන්වන ලදී. සියලුම දත්ත කාමර උෂ්ණත්වයේ දී සටහන් කරන ලදී. t-hCO නියුරෝන 127 mM පොටෑසියම් ග්ලූකෝනේට්, 8 mM NaCl, 4 mM මැග්නීසියම් ATP, 0.3 mM සෝඩියම් GTP, 10 mM HEPES සහ 0.6 mM EGTA, pH අගය 7.2 අඩංගු ද්‍රාවණයකින් පුරවන ලද බෝරෝසිලිකේට් වීදුරු පයිප්පයකින් අවසන් කරන ලදී, අභ්‍යන්තර ද්‍රාවණය KOH (290 mOsm) සමඟ සකස් කරන ලදී. යථා තත්ත්වයට පත් කිරීම සඳහා, බයෝසයිටින් (0.2%) පටිගත කිරීමේ ද්‍රාවණයට එකතු කරන ලදී.
MultiClamp 700B ඇම්ප්ලිෆයර් (අණුක උපාංග) සහ Digidata 1550B ඩිජිටල්කාරකයක් (අණුක උපාංග) භාවිතයෙන් දත්ත ලබා ගන්නා ලදී, 2 kHz ට අඩු-පාස් පෙරහන් කර, 20 kHz ට ඩිජිටල් කර, Clampfit (අණුක උපාංග), Origin (OriginPro) සහ අභිරුචි MATLAB ශ්‍රිත (Mathworks) භාවිතයෙන් විශ්ලේෂණය කරන ලදී. JPCalc භාවිතයෙන් සන්ධි විභවය ගණනය කරන ලද අතර ඇතුළත් කිරීම් -14 mV හි ගණනය කළ අගයට සකස් කරන ලදී. මෙහෙයුම IV -250 සිට 750 pA දක්වා 10-25 pA පියවරවල වත්මන් පියවර මාලාවකින් සමන්විත වේ.
කලින් විස්තර කර ඇති පරිදි, hCO නියුරෝන වල පැච්-ක්ලැම්ප් පටිගත කිරීමේදී තලමස්, සුදු පදාර්ථ සහ S1 අනුබද්ධයන් තලමස්කෝටික පෙති වල විද්‍යුත් වශයෙන් උත්තේජනය කරන ලදී. කෙටියෙන් කිවහොත්, මොළය 10° කෝණයකින් ඇලවූ 3D මුද්‍රණ මේසයක් මත තබා ඇති අතර, මොළයේ ඉදිරිපස කොටස 35° කෝණයකින් කපා ඇත. ඉන්පසු මොළය කැපූ මතුපිටට ඇලවූ අතර කොටස් කර, තලමකෝටික නෙරා ඇති අක්ෂ සංරක්ෂණය කරන ලදී. ද්විධ්‍රැව ටංස්ටන් ඉලෙක්ට්‍රෝඩ (0.5 MΩ) දෙවන ක්ෂුද්‍ර හැසිරවීමක් මත සවි කර ඇති අතර සෛලයකට කලාප හතරක් උත්තේජනය කිරීම සඳහා උපායමාර්ගිකව ස්ථානගත කර ඇත (අභ්‍යන්තර කැප්සියුලය, සුදු පදාර්ථය, S1 සහ hCO). 0.03–0.1 Hz හි 300 µA අවධි උත්තේජනයෙන් පසු උපාගමික ප්‍රතිචාර වාර්තා කරන්න.
hChR2-ප්‍රකාශිත hCO නියුරෝන 480 nm හිදී සක්‍රිය කරන ලද අතර LED (Prizmatix) මගින් ජනනය කරන ලද ආලෝක ස්පන්දන ×40 අරමුණක් (0.9 NA; Olympus) හරහා යොදන ලද අතර සෛල අසල hChR2 ප්‍රකාශනය වාර්තා කරන ලදී. ආලෝකමත් ක්ෂේත්‍ර විෂ්කම්භය ආසන්න වශයෙන් 0.5 mm වන අතර මුළු බලය 10-20 mW වේ. ස්පන්දන පළල 10 ms ලෙස සකසා ඇති අතර එය හැසිරීම් ඉගෙනුම් අත්හදා බැලීමේදී ලබා දුන් ස්පන්දනයට අනුරූප වේ. 1 සිට 20 Hz දක්වා විවිධ උත්තේජක සංඛ්‍යාත භාවිතා කරන ලදී, නමුත් ප්‍රමාණනය සඳහා ශ්‍රේණියේ පළමු ස්පන්දනය පමණක් භාවිතා කරන ලදී. සිනැප්ටික් නිෂේධනීය හෝ පහසුකම් සපයන මාර්ගවල බලපෑම අවම කිරීම සඳහා දුම්රිය අතර පරතරයන් සාමාන්‍යයෙන් තත්පර 30 ට වඩා දිගු වේ. hChR2 ප්‍රතිචාරය මොනොසයිනැප්ටික් දැයි පරීක්ෂා කිරීම සඳහා, අපි EPSC ප්‍රතික්‍රියාව අතුරුදහන් වන තෙක් ස්නානයට TTX (1 μM) යෙදූ අතර, පසුව 4-ඇමිනොපිරිඩීන් (4-AP; 100 μM) යෙදුවෙමු. සාමාන්‍යයෙන්, ප්‍රතිචාරයක් මිනිත්තු කිහිපයක් ඇතුළත ආපසු ලබා දෙන අතර, LED දැල්වීම සහ EPSC උත්පාදනය අතර තරමක් දිගු ප්‍රමාදයක් ඇත. ප්‍රතිචාරය AMPA ප්‍රතිග්‍රාහක මගින් මෙහෙයවනු ලබන්නේද යන්න පරීක්ෂා කිරීමට NBQX (10 μM) භාවිතා කරන ලදී.
කලින් විස්තර කර ඇති පරිදි තියුණු hCO කොටස් නිර්මාණය කරන ලදී. කෙටියෙන් කිවහොත්, hCO කොටස් 4% ඇගරෝස් වල තැන්පත් කර 126 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM NaH2PO4, 1 mM MgSO4, 2 mM CaCl2, 26 mM NaHCO3 සහ 10 mM d-(+) - ග්ලූකෝස් අඩංගු සෛල වෙත මාරු කරන ලදී. Leica VT1200 කම්පනයක් භාවිතා කර කාමර උෂ්ණත්වයේ දී 200–300 µm දී කොටස් කපා කාමර උෂ්ණත්වයේ දී ASF හි ගබඩා කරන ලදී. ඉන්පසු, සෘජු SliceScope අන්වීක්ෂයක් (Scientifica) යටතේ hCO කොටස් මත සම්පූර්ණ සෛලවල පැච්-කෑම්ප් පටිගත කිරීම සිදු කරන ලදී. කොටස් aCSF (95% O2 සහ 5% CO2) සමඟ සුවඳ ගන්වන ලද අතර කාමර උෂ්ණත්වයේ දී සෛල සංඥා වාර්තා කරන ලදී. 127 mM පොටෑසියම් ග්ලූකෝනේට්, 8 mM NaCl, 4 mM මැග්නීසියම් ATP, 0.3 mM සෝඩියම් GTP, 10 mM HEPES සහ 0.6 mM EGTA, අභ්‍යන්තර pH අගය 7, 2, KOH (ඔස්මෝලාරිටි 290) සමඟ සකස් කරන ලද ද්‍රාවණයකින් පුරවන ලද බෝරෝසිලිකේට් වීදුරු පයිප්පයක් භාවිතයෙන් hCO නියුරෝන යොදන ලදී. ප්‍රතිසාධන අරමුණු සඳහා, අභ්‍යන්තර ද්‍රාවණයට 0.2% බයෝසයිටින් එකතු කරන්න.
ක්ලැම්පෙක්ස් (ක්ලැම්පෙක්ස් 11.1, අණුක උපාංග) විසින් බහුක්ලැම්ප් 700B ඇම්ප්ලිෆයර් (අණුක උපාංග) සහ ඩිජිඩේටා 1550B ඩිජිටල්කාරකයක් (අණුක උපාංග) භාවිතයෙන් දත්ත ලබා ගන්නා ලදී, 2 kHz ට අඩු-පාස් පෙරහන් කර, 20 kHz ට ඩිජිටල් කර, විශ්ලේෂණය, අණුක උපාංග) සහ අභිරුචි MATLAB ශ්‍රිත සඳහා ක්ලැම්ප්ෆිට් (අනුවාදය 10.6) භාවිතයෙන් විශ්ලේෂණය කරන ලදී (MATLAB 2019b, Mathworks). හන්දිය විභවය JPCalc භාවිතයෙන් ගණනය කරන ලද අතර ඇතුළත් කිරීම් -14 mV හි ගණනය කරන ලද හන්දිය විභවයට සකස් කරන ලදී. මෙහෙයුම IV -50 සිට 250 pA දක්වා 5-10 pA පියවරවල වත්මන් පියවර මාලාවකින් සමන්විත වේ.
ඇණ ගැසූ ස්නායු වල රූප විද්‍යාත්මක ප්‍රතිනිර්මාණය සඳහා, අභ්‍යන්තර ද්‍රාවණයට 0.2% බයෝසයිටින් (සිග්මා-ඇල්ඩ්‍රිච්) එකතු කරන ලදී. හැක් කිරීමෙන් පසු සෛල අවම වශයෙන් විනාඩි 15 ක් ප්‍රාථමික කරනු ලැබේ. ලියාපදිංචි පටලය සම්පූර්ණයෙන්ම මුද්‍රා තබන තෙක් පයිප්පය මිනිත්තු 1-2 ක් සෙමින් ඇද ගනු ලැබේ. අංශ කායික විද්‍යා ක්‍රියා පටිපාටිය අනුගමනය කරමින්, කොටස් 4° C දී එක රැයකින් සවි කරන ලදී. 4% PFA හි, PBS X3 සමඟ සෝදා, ස්ට්‍රෙප්ටාවයිඩින්-සංයුක්ත DyLight 549 හෝ DyLight 405 (Vector Labs) සමඟ 1:1000 තනුක කරන ලදී. බයෝසයිටින් (2%; සිග්මා-ඇල්ඩ්‍රිච්) පුරවා ඇති සෛල පැය 2 ක් කාමර උෂ්ණත්වයේ දී පැච් කලම්ප පටිගත කිරීමේදී ලේබල් කරන ලදී. ඉන්පසු කොටස් ඇක්වාමවුන්ට් (තර්මෝ සයන්ටිෆික්) භාවිතයෙන් අන්වීක්ෂීය ස්ලයිඩ මත සවි කරන ලද අතර ඊළඟ දිනයේ ලයිකා TCS SP8 කොන්ෆෝකල් අන්වීක්ෂයක සංඛ්‍යාත්මක විවරයක් ×40 1.3, විශාලනය ×0.9–1.0, xy සහිත තෙල් ගිල්වීමේ අරමුණක් භාවිතා කරමින් දෘශ්‍යමාන කරන ලදී. සාම්පල අනුපාතය මයික්‍රෝනයකට ආසන්න වශයෙන් පික්සල 7 කි. 1 µm පරතරයකින් Z-ස්ටැක් අනුක්‍රමිකව ලබා ගන්නා ලද අතර, එක් එක් නියුරෝනයේ සම්පූර්ණ ඩෙන්ඩ්‍රිටික් ගස ආවරණය කිරීම සඳහා z-ස්ටැක් මොසෙයික් සහ ලයිකා මත පදනම් වූ ස්වයංක්‍රීය මැහුම් සිදු කරන ලදී. ඉන්පසු නියුටියුබ් 40 අතුරුමුහුණත භාවිතයෙන් නියුරෝන අර්ධ අතින් නිරීක්ෂණය කරන ලද අතර SWC ගොනු ජනනය කරන ලදී. ඉන්පසු ගොනු SimpleNeuriteTracer41 Fiji ප්ලගිනයට උඩුගත කරන ලදී (ImageJ, අනුවාදය 2.1.0; NIH).
ස්ටැන්ෆර්ඩ් විශ්ව විද්‍යාලයේ ආයතනික සමාලෝචන මණ්ඩලය විසින් අනුමත කරන ලද ප්‍රොටෝකෝලයකට අනුව දැනුවත් කැමැත්තක් ඇතිව මිනිස් බාහික පටක ලබා ගන්නා ලදී. පරාවර්තක අපස්මාරය සඳහා ශල්‍යකර්මයේ කොටසක් ලෙස ඉදිරිපස බාහිකය (මැද ඉදිරිපස ගයිරස්) වෙන් කිරීම මගින් මිනිස් පශ්චාත් ප්‍රසව පටක සාම්පල දෙකක් (අවුරුදු 3 සහ 18) ලබා ගන්නා ලදී. වෙන් කිරීමෙන් පසු, අයිස්-සීතල NMDG-aCSF හි පටක අස්වැන්න නෙළා ගන්න: 92 mM NMDG, 2.5 mM KCl, 1.25 mM NaH2PO4, 30 mM NaHCO3, 20 mM HEPES, 25 mM ග්ලූකෝස්, 2 mM තයෝරියා, 5 mM සෝඩියම් ඇස්කෝර්බේට්, 3 mM සෝඩියම් පයිරුවේට්, 0.5 mM CaCl2 4H2O සහ 10 mM MgSO4 7H2O. සාන්ද්‍රිත හයිඩ්‍රොක්ලෝරික් අම්ලය සමඟ pH අගය 7.3-7.4 දක්වා ටයිටරේට් කරන්න. පටක මිනිත්තු 30ක් ඇතුළත රසායනාගාරයට ලබා දෙන ලද අතර ඉහත විස්තර කර ඇති ක්‍රියා පටිපාටියට අනුව කිරීටක කොටස් ලබා ගන්නා ලදී.
සියලුම සත්ව ක්‍රියා පටිපාටි ස්ටැන්ෆර්ඩ් විශ්ව විද්‍යාලයේ APLAC අනුමත සත්ව ආරක්ෂණ මාර්ගෝපදේශයන්ට අනුකූලව සිදු කරන ලදී. (බද්ධ කිරීමෙන් දින 140 කට වඩා වැඩි) මීයන් 5% අයිසොෆ්ලුරේන් නිර්වින්දනයකින් ප්‍රේරණය කරන ලද අතර අභ්‍යන්තර ශල්‍යකර්මයක් ලෙස 1-3% අයිසොෆ්ලුරේන් සමඟ නිර්වින්දනය කරන ලදී. සතුන් ස්ටීරියෝටැක්සික් රාමුවක (Kopf) තබා තිරසාර මුදා හැරීමේ බුප්‍රෙනෝෆින් (SR) චර්මාභ්‍යන්තරව එන්නත් කරන ලදී. හිස් කබල නිරාවරණය කර, පිරිසිදු කර අස්ථි ඉස්කුරුප්පු 3-5 ක් ඇතුල් කරනු ලැබේ. t-hCO ඉලක්ක කර ගැනීම සඳහා, අපි MRI රූප වලින් ස්ටීරියෝටැක්සික් ඛණ්ඩාංක ජනනය කළෙමු. උනන්දුවක් දක්වන ස්ථානයේ බර් සිදුරක් විදින ලද අතර තන්තු (400 µm විෂ්කම්භය, NA 0.48, ඩොරික්) hCO මතුපිටට පහළින් 100 µm පහත් කර UV-සුව කළ හැකි දන්ත සිමෙන්ති (Relyx) සමඟ හිස් කබලට සුරක්ෂිත කරන ලදී.
කලින් විස්තර කර ඇති පරිදි තන්තු ෆොටෝමිතික පටිගත කිරීම් සිදු කරන ලදී42. ස්වයංසිද්ධ ක්‍රියාකාරකම් වාර්තා කිරීම සඳහා, මීයන් පිරිසිදු කූඩුවක තබා ඇති අතර ෆයිබර් ඔප්ටික් ෆොටෝමිතික දත්ත අත්පත් කර ගැනීමේ පද්ධතියකට සම්බන්ධ කර ඇති 400 µm විෂ්කම්භයකින් යුත් ෆයිබර් ඔප්ටික් පැච් කේබලයක් (ඩොරික්) බද්ධ කරන ලද ෆයිබර් ඔප්ටික් කේබලයට සම්බන්ධ කර ඇත. මෝටර් ක්‍රියාකාරකම් විනාඩි 10 ක පටිගත කිරීමේදී, සතුන්ට කූඩුව ගවේෂණය කිරීමට නිදහස තිබුණි. උද්දීපනය වූ ක්‍රියාකාරකම් වාර්තා කිරීම සඳහා, මීයන් (බද්ධ කිරීමෙන් දින 140 කට වඩා වැඩි කාලයක්) ප්‍රේරණය සඳහා 5% අයිසොෆ්ලුරේන් සහ නඩත්තුව සඳහා 1-3% අයිසොෆ්ලුරේන් සමඟ නිර්වින්දනය කරන ලදී. සත්වයා ස්ටීරියෝටැක්ටික් රාමුවක (Kopf) තබන්න, t-hCO හි ප්‍රතිවිරුද්ධ පැත්තේ ඇති උඩු රැවුල සෙන්ටිමීටර 2 ක් පමණ කපා පීසෝ ඉලෙක්ට්‍රික් ක්‍රියාකාරකයකට (PI) සම්බන්ධ කර ඇති දැලක් හරහා ගමන් කරයි. 400 µm ෆයිබර් ඔප්ටික් පැච් කේබලයක් (ඩොරික්) බද්ධ කරන ලද තන්තුවට සම්බන්ධ කර දත්ත අත්පත් කර ගැනීමේ පද්ධතියට සම්බන්ධ කරන ලදී. ඉන්පසු t-hCO හි ප්‍රතිවිරුද්ධ පැත්තේ ඇති රැවුල් ගස් අහඹු වේලාවන්හිදී 50 වතාවක් (20 Hz හිදී 2 mm, ඉදිරිපත් කිරීමකට තත්පර 2) මිනිත්තු 20 ක පටිගත කිරීමේ කාලයක් තුළ පීසෝ ඉලෙක්ට්‍රික් ධාවකයක් මගින් අපගමනය කරන ලදී. අභිරුචි MATLAB කේතය සමඟ අපගමනය කාලය පාලනය කිරීමට Arduino MATLAB සහාය පැකේජය භාවිතා කරන්න. ට්‍රාන්සිස්ටර-ට්‍රාන්සිස්ටර තර්කනය (TTL) ස්පන්දන භාවිතයෙන් සිදුවීම් දත්ත අත්පත් කර ගැනීමේ මෘදුකාංගයට සමමුහුර්ත කර ඇත.
(බද්ධ කිරීමෙන් දින 140 කට වඩා වැඩි) මීයන් 5% අයිසොෆ්ලුරේන් නිර්වින්දනය සමඟ ප්‍රේරණය කරන ලද අතර අභ්‍යන්තර ශල්‍යකර්මයේදී 1-3% අයිසොෆ්ලුරේන් සමඟ නිර්වින්දනය කරන ලදී. සතුන් ස්ටීරියෝටැක්සික් රාමුවක (Kopf) තබා බුප්‍රෙනෝෆින් SR සහ ඩෙක්සමෙතසෝන් චර්මාභ්‍යන්තරව එන්නත් කරන ලදී. හිස් කබල නිරාවරණය කර, පිරිසිදු කර අස්ථි ඉස්කුරුප්පු 3-5 ක් ඇතුල් කරනු ලැබේ. t-hCO ඉලක්ක කර ගැනීම සඳහා, අපි MRI රූප වලින් ස්ටීරියෝටැක්සික් ඛණ්ඩාංක ජනනය කළෙමු. බද්ධ කළ hCO මත සෘජුවම අධිවේගී සරඹයකින් චක්‍රලේඛ ක්‍රේනියෝටමියක් (ආසන්න වශයෙන් සෙන්ටිමීටර 1 ක විෂ්කම්භයක්) සිදු කරන ලදී. අස්ථිය හැකිතාක් තුනී වූ පසු, නමුත් සම්පූර්ණ අස්ථිය හරහා සිදුරු කිරීමට පෙර, යටින් පවතින t-hCO හෙළි කිරීම සඳහා ඉතිරි නොවෙනස්ව ඇති ශ්‍රෝණි තැටිය ඉවත් කිරීමට ෆෝර්සෙප් භාවිතා කරන්න. හිස් කබල විෂබීජහරණය කළ සේලයින් වලින් පුරවා ඇති අතර, ආවරණ ස්ලිප් එකක් සහ විශේෂ හිස් පින් එකක් UV-සුව කළ දන්ත සිමෙන්ති (Relyx) සමඟ හිස් කබලට සවි කර ඇත.
Nikon LWD (×16, 0.8 NA) අරමුණක් සහිත Bruker බහු ෆොටෝන අන්වීක්ෂයක් භාවිතයෙන් ද්වි-ෆෝටෝන ප්‍රතිබිම්බනය සිදු කරන ලදී. GCaMP6 ප්‍රතිබිම්බනය 920 nm හි 1.4x තනි z-තල විශාලනය සහ 8x සාමාන්‍යය 7.5 fps සමඟ සිදු කරන ලදී. මීයන් 5% අයිසොෆ්ලුරේන් නිර්වින්දනයකින් ප්‍රේරණය කරන ලද අතර 1-3% අයිසොෆ්ලුරේන් සමඟ නඩත්තු කරන ලදී. මීයන් අභිරුචි-සාදන ලද හිස සවිකිරීමක තබා කාචය යටතේ ස්ථානගත කරන ලදී. මෝටර් ක්‍රියාකාරකම් පිළිබඳ මිනිත්තු 3 ක පසුබිම් පටිගත කිරීමක් ලබා ගන්නා ලදී. පටිගත කිරීමේ මිනිත්තු 20 තුළ, පිකොස්ප්‍රයිසර් භාවිතයෙන් t-hCO ඉදිරිපිට ඇති විස්කර් පෑඩ් වෙත පෆ් 50 ක් (එක් එක් ඉදිරිපත් කිරීම 100 ms දිග) අහඹු ලෙස ලබා දෙන ලදී. අභිරුචි MATLAB කේතය සමඟ පිපිරුම් කාලය පාලනය කිරීමට Arduino MATLAB සහාය පැකේජය භාවිතා කරන්න. TTL ස්පන්දන භාවිතයෙන් දත්ත අත්පත් කර ගැනීමේ මෘදුකාංග (PrairieView 5.5) සමඟ සිදුවීම් සමමුහුර්ත කරන්න. විශ්ලේෂණය සඳහා, ෆීජි හි දියත් කරන ලද MoCo වැඩසටහනේ affine නිවැරදි කිරීම භාවිතයෙන් xy චලිතය සඳහා රූප නිවැරදි කරන ලදී. CNMF-E43 භාවිතයෙන් තනි සෛල වලින් ප්‍රතිදීප්ත අංශු නිස්සාරණය කිරීම. උනන්දුවක් දක්වන සෑම කලාපයක් සඳහාම ප්‍රතිදීප්තතාව නිස්සාරණය කර, dF/F වක්‍ර බවට පරිවර්තනය කර, පසුව z-ලකුණු බවට පරිවර්තනය කරන ලදී.
(බද්ධ කිරීමෙන් පසු දින 140 කට වඩා වැඩි) මීයන් 5% අයිසොෆ්ලුරේන් නිර්වින්දනය සමඟ ප්‍රේරණය කරන ලද අතර අභ්‍යන්තර ශල්‍යකර්මයේදී 1-3% අයිසොෆ්ලුරේන් සමඟ නිර්වින්දනය කරන ලදී. සතුන් ස්ටීරියෝටැක්සික් රාමුවක (Kopf) තබා බුප්‍රෙනෝෆින් SR සහ ඩෙක්සමෙතසෝන් චර්මාභ්‍යන්තරව එන්නත් කරන ලදී. t-hCO හි ප්‍රතිවිරුද්ධ පැත්තේ ඇති උඩු රැවුල සෙන්ටිමීටර 2 ක් පමණ කපා පීසෝ ඉලෙක්ට්‍රික් ක්‍රියාකාරකයකට සම්බන්ධ කර ඇති දැලක් හරහා නූල් කරන ලදී. හිස් කබල නිරාවරණය කර පිරිසිදු කර ඇත. මල නොබැඳෙන වානේ බිම් ඉස්කුරුප්පුවක් හිස් කබලට සවි කර ඇත. t-hCO ඉලක්ක කර ගැනීම සඳහා, අපි MRI රූප වලින් ස්ටීරියෝටැක්සික් ඛණ්ඩාංක ජනනය කළෙමු. t-hCO ට ඉහළින් අධිවේගී සරඹයක් සමඟ චක්‍රලේඛ හිස් කබලක් (ආසන්න වශයෙන් සෙන්ටිමීටර 1 ක විෂ්කම්භයක්) සිදු කරන්න. අස්ථිය හැකි තරම් තුනී වූ පසු, නමුත් සම්පූර්ණ අස්ථිය හරහා සිදුරු කිරීමට පෙර, යටින් පවතින t-hCO හෙළි කිරීමට ඉතිරි නොවෙනස්ව ඇති ශ්‍රෝණි තැටිය ඉවත් කිරීමට ෆෝසෙප්ස් භාවිතා කරන්න. තනි සෛල පටිගත කරන ලද්දේ 32-නාලිකා හෝ 64-නාලිකා අධි-ඝනත්ව සිලිකන් පරීක්ෂණ (කේම්බ්‍රිජ් නියුරොටෙක්) භාවිතයෙන් බිමට ඉස්කුරුප්පු කර RHD ඇම්ප්ලිෆයර් (ඉන්ටාන්) සමඟ පූර්ව-විස්තාරණය කරමිනි. වඳ සේලයින් වලින් පුරවා ඇති ක්‍රැනියෝටමි හරහා ඉලෙක්ට්‍රෝඩ ඉලක්ක ස්ථානයට පහත් කිරීමට හැසිරවීම භාවිතා කරන්න. විවෘත එෆිස් දත්ත අත්පත් කර ගැනීමේ පද්ධතිය භාවිතයෙන් 30 kHz සංඛ්‍යාතයකින් දත්ත රැස් කිරීම සිදු කරන ලදී. නාලිකා 10 කට වඩා වැඩි ගණනක ඉහළ සහසම්බන්ධිත රිද්මයානුකූල ස්වයංසිද්ධ ක්‍රියාකාරකම් අපගමනය වූ විට පමණක් පටිගත කිරීම දිගටම පැවතුනි, එයින් ඇඟවෙන්නේ ඉලෙක්ට්‍රෝඩ බද්ධයේ පිහිටා ඇති බවයි (ෆෝටෝන දෙකක කැල්සියම් රූප දත්ත මත පදනම්ව). මෝටර් ක්‍රියාකාරකම් පිළිබඳ මිනිත්තු 10 ක පසුබිම් පටිගත කිරීමක් ලබා ගන්නා ලදී. ඉන්පසු t-hCO හි ප්‍රතිවිරුද්ධ පැත්තේ උඩු රැවුල විනාඩි 20 ක පටිගත කිරීමේ කාලයක් තුළ පීසෝ ඉලෙක්ට්‍රික් ධාවකයක් මගින් අහඹු වේලාවන්හිදී 50 වතාවක් (20 Hz ට 2 මි.මී., ඉදිරිපත් කිරීමකට තත්පර 2) අපගමනය කරන ලදී. Arduino සඳහා MATLAB සහාය පැකේජය (MATLAB 2019b) භාවිතා කරමින්, අභිරුචි MATLAB කේතය සමඟ අපගමනය කාලය පාලනය කරන්න. දත්ත අත්පත් කර ගැනීමේ මෘදුකාංග සමඟ සිදුවීම් සමමුහුර්ත කිරීමට TTL ස්පන්දන භාවිතා කරන්න.
දෘශ්‍ය සලකුණු කිරීමේ අත්හදා බැලීම් සඳහා, 473 nm ලේසර් (Omicron) එකකට සම්බන්ධ කර ඇති 200 µm දෘශ්‍ය පැච් ලණුවක් (Doric) හිස් කබල මත තබා ඇති 200 µm දෘශ්‍ය තන්තුවකට සම්බන්ධ කරන ලදී. මෙයට පෙර, ජම්පරයේ බලය 20 mW දක්වා සකසන්න. වඳ සේලයින් වලින් පුරවා ඇති හිස් කබල හරහා ඉලෙක්ට්‍රෝඩ ඉලක්ක ස්ථානයට පහත් කිරීමට හසුරුවන්නා භාවිතා කරන්න. පටිගත කිරීම ආරම්භයේදී, 473 nm (සංඛ්‍යාත 2 Hz, ස්පන්දන කාලය 10 ms) ආලෝක ස්පන්දන දහයක් විමෝචනය කරන ලදී. ඡායාරූප සංවේදී සෛල අර්ථ දක්වා ඇත්තේ අත්හදා බැලීම් වලින් 70% ක් හෝ ඊට වැඩි ප්‍රමාණයකදී ආලෝකයේ 10 ms ඇතුළත ස්පයික් ප්‍රතිචාරයක් පෙන්නුම් කරන සෛල ලෙසය.