Nature.com ની મુલાકાત લેવા બદલ આભાર. તમે મર્યાદિત CSS સપોર્ટ સાથે બ્રાઉઝર વર્ઝનનો ઉપયોગ કરી રહ્યા છો. શ્રેષ્ઠ અનુભવ માટે, અમે ભલામણ કરીએ છીએ કે તમે અપડેટેડ બ્રાઉઝરનો ઉપયોગ કરો (અથવા ઇન્ટરનેટ એક્સપ્લોરરમાં સુસંગતતા મોડને અક્ષમ કરો). વધુમાં, ચાલુ સપોર્ટ સુનિશ્ચિત કરવા માટે, અમે શૈલીઓ અને JavaScript વિના સાઇટ બતાવીએ છીએ.
એકસાથે ત્રણ સ્લાઇડ્સનું કેરોયુઝલ દર્શાવે છે. એક સમયે ત્રણ સ્લાઇડ્સમાંથી આગળ વધવા માટે પહેલાના અને આગળના બટનોનો ઉપયોગ કરો, અથવા એક સમયે ત્રણ સ્લાઇડ્સમાંથી આગળ વધવા માટે અંતે સ્લાઇડર બટનોનો ઉપયોગ કરો.
સ્વ-એસેમ્બલિંગ ન્યુરલ ઓર્ગેનેલ્સ માનવ વિકાસ અને રોગના મોડેલિંગ માટે એક આશાસ્પદ ઇન વિટ્રો પ્લેટફોર્મ રજૂ કરે છે. જો કે, ઓર્ગેનોઇડ્સમાં વિવોમાં અસ્તિત્વમાં રહેલી કનેક્ટિવિટીનો અભાવ છે, જે પરિપક્વતાને મર્યાદિત કરે છે અને વર્તનને નિયંત્રિત કરતા અન્ય સર્કિટ્સ સાથે એકીકરણને અટકાવે છે. અહીં આપણે બતાવીએ છીએ કે નવજાત નગ્ન ઉંદરોના સોમેટોસેન્સરી કોર્ટેક્સમાં ટ્રાન્સપ્લાન્ટ કરાયેલા માનવ સ્ટેમ સેલ-ડેરિવ્ડ કોર્ટિકલ ઓર્ગેનોઇડ્સ પરિપક્વ કોષ પ્રકારો વિકસાવે છે જે સંવેદનાત્મક અને પ્રેરણા-સંબંધિત સર્કિટ્સમાં એકીકૃત થાય છે. MRI એ ઘણી સ્ટેમ સેલ લાઇનો અને પ્રાણીઓમાં ટ્રાન્સપ્લાન્ટ પછીના ઓર્ગેનોઇડ વૃદ્ધિ જાહેર કરી, જ્યારે સિંગલ-કોર વિશ્લેષણમાં કોર્ટિકોજેનેસિસની પ્રગતિ અને પ્રવૃત્તિ-આધારિત ટ્રાન્સક્રિપ્શન પ્રોગ્રામનો ઉદભવ જાહેર થયો. ખરેખર, ટ્રાન્સપ્લાન્ટેડ કોર્ટિકલ ચેતાકોષો તેમના ઇન વિટ્રો સમકક્ષો કરતાં વધુ જટિલ મોર્ફોલોજિકલ, સિનેપ્ટિક અને આંતરિક પટલ ગુણધર્મો દર્શાવે છે, જે ટિમોથી સિન્ડ્રોમ ધરાવતા દર્દીઓમાં ન્યુરોનલ ખામીઓને શોધવાની મંજૂરી આપે છે. એનાટોમિકલ અને ફંક્શનલ ટ્રેસિંગ દર્શાવે છે કે ટ્રાન્સપ્લાન્ટેડ ઓર્ગેનેલ્સ થેલેમોકોર્ટિકલ અને કોર્ટિકોકોર્ટિકલ ઇનપુટ્સ મેળવે છે, અને ન્યુરલ પ્રવૃત્તિના ઇન વિવો રેકોર્ડિંગ્સ સૂચવે છે કે આ ઇનપુટ્સ માનવ કોષોમાં સંવેદનાત્મક પ્રતિભાવો ઉત્પન્ન કરી શકે છે. છેલ્લે, કોર્ટિકલ ઓર્ગેનોઇડ્સ ઉંદરના મગજમાં ચેતાક્ષો ફેલાવે છે, અને તેમના ઓપ્ટોજેનેટિક સક્રિયકરણ પુરસ્કાર-શોધવાની વર્તણૂક તરફ દોરી જાય છે. આમ, ટ્રાન્સપ્લાન્ટેડ માનવ કોર્ટેક્સ ચેતાકોષો પરિપક્વ થાય છે અને વર્તનને નિયંત્રિત કરતા યજમાનના સર્કિટમાં ભાગ લે છે. અમે અપેક્ષા રાખીએ છીએ કે આ અભિગમ દર્દી-ઉત્પન્ન કોષોમાં સ્ટ્રેન્ડ-લેવલ ફેનોટાઇપ્સ શોધવામાં મદદ કરશે જે અન્ય માધ્યમો દ્વારા શોધી શકાતા નથી.
માનવ મગજનો વિકાસ એ એક નોંધપાત્ર સ્વ-સંગઠન પ્રક્રિયા છે જેમાં કોષો ગુણાકાર કરે છે, ભિન્ન થાય છે, સ્થળાંતર કરે છે અને કાર્યાત્મક ન્યુરોનલ સર્કિટ બનાવવા માટે જોડાય છે જે સંવેદનાત્મક અનુભવ દ્વારા વધુ શુદ્ધ થાય છે. માનવ મગજના વિકાસને સમજવામાં એક મુખ્ય સમસ્યા, ખાસ કરીને રોગના સંદર્ભમાં, મગજની પેશીઓ સુધી પહોંચનો અભાવ છે. માનવ કોર્ટેક્સ ઓર્ગેનોઇડ્સ (hCO; જેને માનવ કોર્ટેક્સ ગોળા તરીકે પણ ઓળખવામાં આવે છે) સહિત સ્વ-સંગઠિત ઓર્ગેનેલ્સ 2,3,4,5,6 ઉત્પન્ન કરી શકે છે. જો કે, ઘણી મર્યાદાઓ ન્યુરલ સર્કિટના વિકાસ અને કાર્યને સમજવા માટે તેમના વ્યાપક ઉપયોગને મર્યાદિત કરે છે. ખાસ કરીને, તે સ્પષ્ટ નથી કે વિવોમાં હાજર ચોક્કસ સૂક્ષ્મ પર્યાવરણીય અને સંવેદનાત્મક ઇનપુટ્સની ગેરહાજરી દ્વારા hCO પરિપક્વતા મર્યાદિત છે કે કેમ. વધુમાં, કારણ કે hCOs એવા સર્કિટમાં સંકલિત નથી જે વર્તણૂકીય પરિણામો ઉત્પન્ન કરી શકે છે, આનુવંશિક રીતે જટિલ અને વર્તણૂકીય ન્યુરોસાયકિયાટ્રિક ડિસઓર્ડર્સનું મોડેલિંગ કરવામાં તેમની ઉપયોગીતા હાલમાં મર્યાદિત છે.
hCO નું અખંડ જીવંત મગજમાં ટ્રાન્સપ્લાન્ટેશન આ મર્યાદાઓને દૂર કરી શકે છે. અગાઉના અભ્યાસોએ દર્શાવ્યું છે કે ઉંદરના કોર્ટેક્સમાં ટ્રાન્સપ્લાન્ટ કરાયેલા માનવ ચેતાકોષો ટકી શકે છે, પ્રક્ષેપિત થઈ શકે છે અને ઉંદર કોષો સાથે વાતચીત કરી શકે છે7,8,9,10,11,12. જો કે, આ પ્રયોગો સામાન્ય રીતે પુખ્ત પ્રાણીઓ પર કરવામાં આવે છે, જે સિનેપ્ટિક અને એક્સોનલ એકીકરણને મર્યાદિત કરી શકે છે. અહીં, અમે ટ્રાન્સપ્લાન્ટેશન પેરાડાઈમનું વર્ણન કરીએ છીએ જેમાં અમે પ્લાસ્ટિક વિકાસના પ્રારંભિક તબક્કે રોગપ્રતિકારક ઉંદરોના પ્રાથમિક સોમેટોસેન્સરી કોર્ટેક્સ (S1) માં hiPS કોષોમાંથી મેળવેલા 3D hCO નું ટ્રાન્સપ્લાન્ટેશન કર્યું હતું. ટ્રાન્સપ્લાન્ટેડ hCO (t-hCO) ચેતાકોષો નોંધપાત્ર પરિપક્વતામાંથી પસાર થાય છે, થેલેમોકોર્ટિકલ અને કોર્ટિકલ-કોર્ટિકલ ઇનપુટ્સ પ્રાપ્ત કરે છે જે સંવેદનાત્મક પ્રતિભાવો ઉત્પન્ન કરે છે, અને પુરસ્કાર-શોધવાની વર્તણૂકને ચલાવવા માટે ઉંદરના મગજમાં એક્સોનલ પ્રોજેક્શન્સનો વિસ્તાર કરે છે. t-hCO નું વિસ્તૃત પરિપક્વતા ટિમોથી સિન્ડ્રોમ (TS) ધરાવતા દર્દીઓમાં ન્યુરોનલ ખામીઓ જાહેર કરે છે, જે વોલ્ટેજ-સંવેદનશીલ L-પ્રકાર CaV1.2 કેલ્શિયમ ચેનલ (CACNA1C દ્વારા એન્કોડેડ) માં પરિવર્તનને કારણે થતી ગંભીર આનુવંશિક વિકૃતિ છે.
વિવોમાં સર્કિટમાં માનવ કોર્ટિકલ ચેતાકોષોનો અભ્યાસ કરવા માટે, અમે સ્ટીરિયોટેક્ટિક રીતે અખંડ 3D hCO ને પ્રારંભિક પોસ્ટનેટલ એથિમિક ઉંદરોના S1 માં ટ્રાન્સપ્લાન્ટ કર્યું (જન્મ પછીના 3-7 દિવસો) (આકૃતિ 1a અને આકૃતિ 1a-c નો વિસ્તૃત ડેટા). આ બિંદુએ, થેલેમોકોર્ટિકલ અને કોર્ટિકોર્ટિકલ એક્સોનલ પ્રોજેક્શન્સે હજુ સુધી તેમના S1 ઇનર્વેશન પૂર્ણ કર્યા નથી (સંદર્ભ 13). આમ, આ અભિગમ અંતર્જાત સર્કિટ પર અસર ઘટાડીને t-hCO એકીકરણને મહત્તમ કરવા માટે રચાયેલ છે. જીવંત પ્રાણીઓમાં t-hCO ના સ્થાનની કલ્પના કરવા માટે, અમે ટ્રાન્સપ્લાન્ટેશનના 2-3 મહિના પછી ઉંદરોના T2-ભારિત MRI મગજ પુનર્નિર્માણ કર્યા (આકૃતિ 1b અને વિસ્તૃત ડેટા, આકૃતિ 1d). t-hCO સરળતાથી અવલોકન કરવામાં આવ્યું હતું અને t-hCO ના વોલ્યુમ માપન નિશ્ચિત સ્લાઇસેસમાંથી ગણતરી કરાયેલા માપન જેવા જ હતા (વિસ્તૃત ડેટા આકૃતિ 1d,e; P > 0.05). t-hCO સરળતાથી અવલોકન કરવામાં આવ્યું હતું અને t-hCO ના વોલ્યુમ માપન નિશ્ચિત સ્લાઇસેસમાંથી ગણતરી કરાયેલા માપન જેવા જ હતા (વિસ્તૃત ડેટા આકૃતિ 1d,e; P > 0.05). t-hCO легко наблюдались, а объемные измерения t-hCO были аналогичны рассчитанным для фиксированных срезов (расшированных срезов, e.d. P> 0,05). t-hCO સરળતાથી અવલોકન કરવામાં આવ્યું હતું, અને વોલ્યુમેટ્રિક t-hCO માપ નિશ્ચિત વિભાગો માટે ગણતરી કરાયેલા માપ જેવા જ હતા (વિસ્તૃત ડેટા, આકૃતિ 1d, e; P > 0.05).很容易观察到t-hCO，并且t-hCO体积测量值与从固定切片计算的测量值相似（扩展数据图1d、e；P > 0.05）.很容易观察到t-hCO，并且t-hCO t-hCO легко наблюдался, а объемные измерения t-hCO были аналогичны рассчитанным для фиксированных срезов (расшированных срезов, e.d. P> 0,05). t-hCO સરળતાથી અવલોકન કરી શકાયું હતું, અને વોલ્યુમેટ્રિક t-hCO માપ નિશ્ચિત વિભાગો માટે ગણતરી કરાયેલા માપ જેવા જ હતા (વિસ્તૃત ડેટા, આકૃતિ 1d, e; P > 0.05).ટ્રાન્સપ્લાન્ટેશનના લગભગ 2 મહિના પછી અમે 81% ટ્રાન્સપ્લાન્ટેડ પ્રાણીઓમાં t-hCO નક્કી કર્યું (n = 72 પ્રાણીઓ; 10 hiPS કોષ રેખાઓમાંથી hCO; પૂરક કોષ્ટક 1 માં hiPS કોષ રેખાઓ). આમાંથી, 87% મગજના કોર્ટેક્સમાં સ્થિત હતા (આકૃતિ 1c). એક જ ટ્રાન્સપ્લાન્ટેડ ઉંદરમાં બહુવિધ સમય બિંદુઓ પર સીરીયલ MRI સ્કેન કરીને, અમને 3 મહિનાની અંદર t-hCO વોલ્યુમમાં નવ ગણો વધારો જોવા મળ્યો (આકૃતિ 1d અને વિસ્તૃત ડેટા, આકૃતિ 1f). ટ્રાન્સપ્લાન્ટેશન પછી 12 મહિના પછી ટ્રાન્સપ્લાન્ટેડ પ્રાણીઓનો ઉચ્ચ અસ્તિત્વ દર (74%) હતો (વિસ્તૃત ડેટા, આકૃતિ 1g અને પૂરક કોષ્ટક 2), અને કોઈ સ્પષ્ટ મોટર અથવા મેમરી ક્ષતિઓ, ગ્લિઓસિસ અથવા ઇલેક્ટ્રોએન્સફાલોગ્રામ (EEG) મળી આવ્યા ન હતા. ડેટા આકૃતિ 1g અને પૂરક કોષ્ટક 2). 1h–m અને 3e).
a, પ્રાયોગિક ડિઝાઇનનું સ્કીમેટિક. hiPS કોષોમાંથી મેળવેલા hCO ને ભિન્નતાના 30-60 દિવસે નવજાત નગ્ન ઉંદરોના S1 માં ટ્રાન્સપ્લાન્ટ કરવામાં આવ્યું હતું. b, ટ્રાન્સપ્લાન્ટેશનના 2 મહિના પછી S1 માં t-hCO દર્શાવતી T2-ભારિત કોરોનલ અને આડી MRI છબીઓ. સ્કેલ બાર, 2 મીમી. c, દરેક hiPS સેલ લાઇન માટે દર્શાવેલ એન્ગ્રાફ્ટમેન્ટ સફળતા દરનું પ્રમાણ (n = 108, બારની અંદરની સંખ્યાઓ hIPS સેલ લાઇન દીઠ t-hCO ની માત્રા દર્શાવે છે) અને કોર્ટિકલ અથવા સબકોર્ટિકલ સ્થાન (n = 88). d, કોરોનરી ધમની (ડાબે; સ્કેલ બાર, 3 મીમી) અને અનુરૂપ 3D વોલ્યુમેટ્રિક પુનર્નિર્માણ (સ્કેલ બાર, 3 મીમી) ની MRI છબી 3 મહિનામાં t-hCO માં વધારો દર્શાવે છે. e, ઉંદર મગજનો કોર્ટેક્સમાં t-hCO પેટર્નની સમીક્ષા. સ્કેલ બાર, 1 મીમી. f, t-hCO ની પ્રતિનિધિ ઇમ્યુનોસાયટોકેમિકલ છબીઓ ઉપર ડાબેથી જમણે બતાવેલ છે (વિભેદ દરમિયાન): PPP1R17 (4 મહિના જૂના), NeuN (8 મહિના જૂના), SOX9 અને GFAP (8 મહિના જૂના), PDGFRα; (8 મહિના), MAP2 (8 મહિના) અને IBA1 (8 મહિના). સ્કેલ બાર, 20 µm. HNA ની સહ-અભિવ્યક્તિ માનવ મૂળના કોષો સૂચવે છે. g, snRNA-seq: Seurat એકીકરણ પછી તમામ ઉચ્ચ-ગુણવત્તાવાળા t-hCO ન્યુક્લીની યુનિફાઇડ મેનીફોલ્ડ અને પ્રોજેક્શન (UMAP) ડાયમેન્શલિટી રિડક્શન ઇમેજિંગ (n=3 t-hCO નમૂનાઓ, n=2 hiPS કોષ રેખાઓ). એસ્ટ્રોસાઇટ્સ, એસ્ટ્રોસાઇટ લાઇનના કોષો; સાયક પ્રોગ, ફરતા પૂર્વજો; GluN DL, ઊંડા ગ્લુટામેટર્જિક ન્યુરોન્સ; GluN DL/SP, ઊંડા અને સબલેમેલર ગ્લુટામેટર્જિક ન્યુરોન્સ; GluN UL, ઉપલા સ્તરના ગ્લુટામેટર્જિક ન્યુરોન્સ; ઓલિગોડેન્ડ્રોસાઇટ્સ, ઓલિગોડેન્ડ્રોસાઇટ્સ; OPC, ઓલિગોડેન્ડ્રોસાઇટ પૂર્વજો કોષો; RELN, રીલિન ચેતાકોષો. h, hCO ગ્લુટામેટર્જિક ન્યુરોન્સની તુલનામાં t-hCO ગ્લુટામેટર્જિક ન્યુરોન્સમાં નોંધપાત્ર રીતે અપરેગ્યુલેટેડ જનીનોનું જનીન ઓન્ટોલોજી (GO) ટર્મ એન્રિચમેન્ટ વિશ્લેષણ (એડજસ્ટેડ P < 0.05, ફોલ્ડ ચેન્જ > 2, ન્યુક્લીના ઓછામાં ઓછા 10% માં વ્યક્ત). h, hCO ગ્લુટામેટર્જિક ન્યુરોન્સની તુલનામાં t-hCO ગ્લુટામેટર્જિક ન્યુરોન્સમાં નોંધપાત્ર રીતે અપરેગ્યુલેટેડ જનીનોનું જનીન ઓન્ટોલોજી (GO) ટર્મ એન્રિચમેન્ટ વિશ્લેષણ (એડજસ્ટેડ P < 0.05, ફોલ્ડ ચેન્જ > 2, ન્યુક્લીના ઓછામાં ઓછા 10% માં વ્યક્ત). h, Анализ обогащения терминов જનીન ઓન્ટોલોજી (GO) для генов со значительной активацией (скорректированный P <0,05, кратность, эсякный изямре > по крайней мере в 10% ядер) в глутаматергических нейронах t-hCO h, hCO ગ્લુટામેટર્જિક ન્યુરોન્સની તુલનામાં t-hCO ગ્લુટામેટર્જિક ન્યુરોન્સમાં નોંધપાત્ર સક્રિયકરણ (સમાયોજિત P<0.05, ફોલ્ડ ચેન્જ >2, ઓછામાં ઓછા 10% ન્યુક્લીમાં અભિવ્યક્તિ) ધરાવતા જનીનો માટે જનીન ઓન્ટોલોજી (GO) શબ્દ સંવર્ધન વિશ્લેષણ. h,与hCO 谷氨酸能神经元相比，t-hCO 谷氨酸能神经元中基因显着上调（调整后P <0. 2,在至少10% 的细胞核中表达）的基因本体论(GO) 术语富集分析. h ， 与 hco 谷氨酸 能 元 相比 ， t-hco 谷氨酸 能 神经 元 基因 显着 上调 （后 变 变 5 <变化> 2, 至少 10% 的 核中 表达） 基因 基因 基因 的 的 的 的本体论(GO) 术语富集分析. h, гены значительно активизировались (скорректированный P <0,05, кратность изменения> 2, экспрессируется по крайнев %01мед) глутаматергических нейронах t-hCO по сравнению с глутаматергическими нейронами hCO Онтологический (GO) નામ h, t-hCO ગ્લુટામેટર્જિક ન્યુરોન્સમાં જનીનો નોંધપાત્ર રીતે અપરેગ્યુલેટેડ હતા (એડજસ્ટેડ P < 0.05, ફોલ્ડ ચેન્જ > 2, ઓછામાં ઓછા 10% ન્યુક્લીમાં વ્યક્ત) hCO ગ્લુટામેટર્જિક ન્યુરોન્સની તુલનામાં સંવર્ધન શબ્દના ઓન્ટોલોજીકલ (GO) વિશ્લેષણ.ડોટેડ લાઇન 0.05 નું aq મૂલ્ય દર્શાવે છે. i, સંદર્ભ 22 snRNA-seq પુખ્ત મોટર કોર્ટેક્સ ડેટાસેટમાંથી લેબલ ટ્રાન્સફરનો ઉપયોગ કરીને t-hCO માં GluN કોષ પ્રકારોનું UMAP ઇમેજિંગ. CT — કોર્ટિકોથેલેમિક કોષો, ET — એક્સ્ટ્રાસેરેબ્રલ કોષો, IT — આંતરિક ટેલેન્સેફાલિક કોષો, NP — પ્રક્ષેપણની નજીક.
ત્યારબાદ અમે સાયટોઆર્કિટેક્ચર અને t-hCO ની એકંદર સેલ્યુલર રચનાનું મૂલ્યાંકન કર્યું. ઉંદરના એન્ડોથેલિયલ કોષોના એન્ટિબોડી સ્ટેનિંગથી t-hCO સાથે વેસ્ક્યુલરાઇઝેશન જાહેર થયું, જ્યારે IBA1 સ્ટેનિંગથી સમગ્ર ગ્રાફ્ટમાં ઉંદર માઇક્રોગ્લિયાની હાજરી જાહેર થઈ (આકૃતિ 1f અને વિસ્તૃત ડેટા, આકૃતિ 3c,d). ઇમ્યુનોસ્ટેનિંગથી માનવ ન્યુક્લિયર એન્ટિજેન (HNA) પોઝિટિવ કોષો સહ-અભિવ્યક્ત થયા જે PPP1R17 (કોર્ટિકલ પ્રોજેનિટર્સ), NeuN (ન્યુરોન્સ), SOX9 અને GFAP (ગ્લિયલ-ડેરિવ્ડ કોષો) અથવા PDGFRα (ઓલિગોડેન્ડ્રોસાઇટ પ્રોજેનિટર્સ) (આકૃતિ 1f). સિંગલ સેલ રિઝોલ્યુશન પર t-hCO ની સેલ્યુલર રચનાનો અભ્યાસ કરવા માટે, અમે લગભગ 8 મહિનાના ભિન્નતા પછી સિંગલ-કોર RNA સિક્વન્સિંગ (snRNA-seq) કર્યું. ઉંદરના ન્યુક્લીને બલ્ક ફિલ્ટર કરવા અને દૂર કરવાથી 21,500 ઉચ્ચ-ગુણવત્તાવાળા માનવ મોનોન્યુક્લિયર નકશા મળ્યા (આકૃતિ 1g અને વિસ્તૃત ડેટા, આકૃતિ 4a,b). લાક્ષણિક કોષ-પ્રકારના માર્કર્સના અભિવ્યક્તિ પેટર્નમાં મુખ્ય કોર્ટિકલ કોષ વર્ગોના ક્લસ્ટરો ઓળખાયા, જેમાં ઊંડા અને સુપરફિસિયલ ગ્લુટામેટર્જિક ન્યુરોન્સ, ફરતા પ્રોજેનિટર્સ, ઓલિગોડેન્ડ્રોસાઇટ્સ અને એસ્ટ્રોસાઇટ વંશનો સમાવેશ થાય છે (આકૃતિ 1g, વિસ્તૃત ડેટા, આકૃતિ 4c, અને પૂરક કોષ્ટક 3). SATB2 અને CTIP2 માટે ઇમ્યુનોસ્ટેનિંગ દર્શાવે છે કે કોર્ટિકલ પેટાપ્રકારોની હાજરી હોવા છતાં, t-hCO સ્પષ્ટ શરીરરચના સ્તરીકરણ દર્શાવતું નથી (વિસ્તૃત ડેટા, આકૃતિ 3a). સ્ટેજ-મેળ ખાતા snRNA-seq hCO એ ઓલિગોડેન્ડ્રોસાઇટ્સની ગેરહાજરી અને GABAergic ન્યુરોન્સની હાજરી સહિત કેટલાક અપવાદો સાથે, વ્યાપકપણે સમાન કોષ વર્ગો ઉત્પન્ન કર્યા, જે લેટરલ પ્રોજેનિટર કોષો માટે અગાઉ નોંધાયેલ અનુકૂળ ઇન વિટ્રો પરિસ્થિતિઓને પ્રતિબિંબિત કરી શકે છે15 (વિસ્તૃત ડેટા, આકૃતિ 4f - i અને પૂરક કોષ્ટક 4). વિભેદક જનીન અભિવ્યક્તિ વિશ્લેષણથી t-hCO અને hCO વચ્ચે ગ્લુટામેટર્જિક ચેતાકોષોમાં નોંધપાત્ર તફાવતો જોવા મળ્યા (પૂરક કોષ્ટક 5), જેમાં સિનેપ્ટિક સિગ્નલિંગ, ડેંડ્રિટિક સ્થાનિકીકરણ અને વોલ્ટેજ-ગેટેડ ચેનલ પ્રવૃત્તિ જેવા ચેતાકોષીય પરિપક્વતા સાથે સંકળાયેલ જનીનોના સમૂહના સક્રિયકરણનો સમાવેશ થાય છે (આકૃતિ 1h અને પૂરક કોષ્ટક 5). કોષ્ટક 6). તદનુસાર, કોર્ટિકલ ગ્લુટામેટર્જિક t-hCO ચેતાકોષોએ ઝડપી ટ્રાન્સક્રિપ્શનલ પરિપક્વતા દર્શાવી.
t-hCO માં આ ટ્રાન્સક્રિપ્શનલ ફેરફારો hCO ઇન વિટ્રો અને t-hCO ઇન વિવો વચ્ચેના મોર્ફોલોજિકલ તફાવતો સાથે સંબંધિત હતા કે કેમ તે સ્પષ્ટ કરવા માટે, અમે 7-8 મહિનાના ભિન્નતા પછી તીવ્ર વિભાગોમાં સ્ટેજ-મેચ્ડ બાયોસાયટીન-ભરેલા hCO અને hCO નું પુનર્નિર્માણ કર્યું. hCO ન્યુરોન્સ (આકૃતિ 2a). t-hCO ન્યુરોન્સ નોંધપાત્ર રીતે મોટા હતા, સોમા વ્યાસ કરતા 1.5 ગણા, ડેંડ્રાઇટ્સ કરતા બમણા અને કુલ ડેંડ્રાઇટિક લંબાઈમાં એકંદરે છ ગણો વધારો હતો. ઇન વિટ્રો hCO (આકૃતિ 2b) ની તુલનામાં. વધુમાં, અમે hCO ન્યુરોન્સ (આકૃતિ 2c) ની તુલનામાં t-hCO ન્યુરોન્સમાં ડેંડ્રાઇટિક સ્પાઇન્સની ઘનતા નોંધપાત્ર રીતે વધારે જોઈ. આ સૂચવે છે કે t-hCO ન્યુરોન્સ વ્યાપક ડેંડ્રાઇટિક વિસ્તરણ અને શાખાઓમાંથી પસાર થાય છે, જે સતત કોષ પ્રસાર સાથે સંયોજનમાં, ટ્રાન્સપ્લાન્ટેશન પછી t-hCO ના સઘન વિકાસમાં ફાળો આપી શકે છે (આકૃતિ 1d અને વિસ્તૃત ડેટા ફિગ. 1f). આનાથી અમને ઇલેક્ટ્રોફિઝીયોલોજીકલ ગુણધર્મોની તપાસ કરવા માટે પ્રેરિત કરવામાં આવ્યા. મેમ્બ્રેન કેપેસિટેન્સ આઠ ગણું વધારે હતું (વિસ્તૃત ડેટા, આકૃતિ 8d), રેસ્ટિંગ-સ્ટેટ મેમ્બ્રેન પોટેન્શિયલ વધુ હાઇપરપોલરાઇઝ્ડ હતું (આશરે 20 mV), અને કરંટ ઇન્જેક્શનથી hCO ચેતાકોષો કરતાં t-hCO ચેતાકોષોમાં મહત્તમ ઉત્તેજના દર વધુ હતો. ઇન વિટ્રો (આકૃતિ 2d), e), જે t-hCO ની મોટી અને વધુ જટિલ મોર્ફોલોજિકલ લાક્ષણિકતાઓ સાથે સુસંગત છે. વધુમાં, t-hCO ચેતાકોષોમાં સ્વયંભૂ ઉત્તેજક પોસ્ટસિનેપ્ટિક વર્તમાન ઘટનાઓ (EPSC) ની આવર્તન નોંધપાત્ર રીતે વધારે હતી (આકૃતિ 2f), જે સૂચવે છે કે t-hCO ચેતાકોષોમાં જોવા મળતી ડેન્ડ્રિટિક સ્પાઇન્સની વધેલી ઘનતા કાર્યાત્મક ઉત્તેજના સાથે સંકળાયેલી હતી. જાતીય ચેતાકોષો. અમે લેબલવાળા ગ્લુટામેટર્જિક ચેતાકોષો (વિસ્તૃત ડેટા, આકૃતિ 6a-c) રેકોર્ડ કરીને ઇન વિટ્રોમાં hCO ચેતાકોષોના અપરિપક્વ પાત્રની પુષ્ટિ કરી.
a, 8 મહિનાના ભિન્નતા પછી બાયોસાયટિનથી ભરેલા hCO અને t-hCO ચેતાકોષોનું 3D પુનર્નિર્માણ. b, મોર્ફોલોજિકલ લાક્ષણિકતાઓનું પ્રમાણીકરણ (n = 8 hCO ચેતાકોષો, n = 6 t-hCO ચેતાકોષો; **P = 0.0084, *P = 0.0179 અને ***P < 0.0001). b, મોર્ફોલોજિકલ લાક્ષણિકતાઓનું પ્રમાણીકરણ (n = 8 hCO ચેતાકોષો, n = 6 t-hCO ચેતાકોષો; **P = 0.0084, *P = 0.0179 અને ***P < 0.0001). б, количественная оценка морфологических признаков (n = 8 нейронов hCO, n = 6 нейронов t-hCO; ** P = 0,0084, * P = 0,0179, * P = 0,0179, *** 0179). b, મોર્ફોલોજિકલ લાક્ષણિકતાઓનું પ્રમાણીકરણ (n=8 hCO ચેતાકોષો, n=6 t-hCO ચેતાકોષો; **P=0.0084, *P=0.0179, અને ***P<0.0001). b，形态学特征的量化（n = 8 个hCO 神经元，n = 6 个t-hCO 神经元；**P = 0.0084，*P = 0.0179 ，*P = 0.0179 b，形态学特征的量化（n = 8 个hCO 神经元，n = 6 个t-hCO 神经元；**P = 0.0084，*P = 0.0179 ，*P = 0.0179 б, количественная оценка морфологических признаков (n = 8 нейронов hCO, n = 6 нейронов t-hCO; ** P = 0,0084, * P = 0,0179, * P = 0,0179, *** 0179). b, મોર્ફોલોજિકલ લાક્ષણિકતાઓનું પ્રમાણીકરણ (n=8 hCO ચેતાકોષો, n=6 t-hCO ચેતાકોષો; **P=0.0084, *P=0.0179, અને ***P<0.0001).c, 8 મહિનાના ભિન્નતા પછી hCO અને t-hCO ડેંડ્રિટિક શાખાઓનું 3D પુનર્નિર્માણ. લાલ ફૂદડી ચિહ્નો કથિત ડેંડ્રિટિક સ્પાઇન સૂચવે છે. ડેંડ્રિટિક સ્પાઇન ડેન્સિટી ક્વોન્ટિફિકેશન (n = 8 hCO ચેતાકોષો, n = 6 t-hCO ચેતાકોષો; **P = 0.0092). d, વિશ્રામી કલા વીજસ્થિતિમાનનું પરિમાણ (n = 25 hCO ચેતાકોષો, n = 16 t-hCO ચેતાકોષો; ***P < 0.0001). d, વિશ્રામી કલા વીજસ્થિતિમાનનું પરિમાણ (n = 25 hCO ચેતાકોષો, n = 16 t-hCO ચેતાકોષો; ***P < 0.0001). d, количественная оценка мембранного потенциала покоя (n = 25 нейронов hCO, n = 16 нейронов t-hCO; *** P <0,0001). d, વિશ્રામી પટલ સંભવિત પરિમાણ (n = 25 hCO ચેતાકોષો, n = 16 t-hCO ચેતાકોષો; ***P < 0.0001). d，静息膜电位的量化（n = 25 hCO 神经元，n = 16 t-hCO 神经元；***P < 0.0001）. d，静息膜电位的量化（n = 25 hCO 神经元，n = 16 t-hCO 神经元；***P < 0.0001）. d, количественная оценка мембранного потенциала покоя (n = 25 нейронов hCO, n = 16 нейронов t-hCO; *** P <0,0001). d, વિશ્રામી પટલ સંભવિત પરિમાણ (n = 25 hCO ચેતાકોષો, n = 16 t-hCO ચેતાકોષો; ***P < 0.0001). e, વર્તમાન ઇન્જેક્શનમાં વધારો કરીને પ્રેરિત hCO અને t-hCO માં પુનરાવર્તિત સક્રિય કલા વીજસ્થિતિમાન ફાયરિંગ, અને મહત્તમ ફાયરિંગ દરનું પ્રમાણીકરણ (n = 25 hCO ચેતાકોષો, n = 16 t-hCO ચેતાકોષો; ***P < 0.0001). e, વર્તમાન ઇન્જેક્શનમાં વધારો કરીને પ્રેરિત hCO અને t-hCO માં પુનરાવર્તિત સક્રિય કલા વીજસ્થિતિમાન ફાયરિંગ, અને મહત્તમ ફાયરિંગ દરનું પ્રમાણીકરણ (n = 25 hCO ચેતાકોષો, n = 16 t-hCO ચેતાકોષો; ***P < 0.0001). ઇ. возбуждения (n = 25 нейронов hCO, n = 16 нейронов t-hCO; *** P <0,0001). e, hCO અને t-hCO માં સક્રિય કલા વીજસ્થિતિમાન પુનઃફાયરિંગ, મહત્તમ ફાયરિંગ દરના વર્તમાન વધારા અને જથ્થાત્મકીકરણ દ્વારા પ્રેરિત (n = 25 hCO ચેતાકોષો, n = 16 t-hCO ચેતાકોષો; *** P < 0.0001). e，通过增加电流注入诱导的hCO 和t-hCO 重复动作电位放电，以及最大放电率的釀大放电率的鏪n 5神经元，n = 16 个t-hCO 神经元；*P <0.0001）. ઇ, 通过 增加 电流 注入 的 的 hco 和 t-hco 重复 电位 放电 ， 以及 最 大 的 量化 严2 弈电 5 ， n = 16 个 t-hco 神经 ； *** p <0.0001） . ઇ. скорости возбуждения (n = 25 нейронов hCO, n = 16 нейронов t-hCO; *** P <0,0001). e, hCO અને t-hCO સક્રિય કલા વીજસ્થિતિમાનોનું પુનરાવર્તિત ફાયરિંગ, જે વર્તમાન પુરવઠામાં વધારો અને મહત્તમ ફાયરિંગ દરના જથ્થાત્મકકરણ દ્વારા પ્રેરિત થાય છે (n = 25 hCO ચેતાકોષો, n = 16 t-hCO ચેતાકોષો; *** P < 0.0001). f, 8 મહિનાના ભિન્નતા પર hCO અને t-hCO ચેતાકોષોમાં સ્વયંભૂ EPSCs (sEPSCs), અને સિનેપ્ટિક ઘટનાઓની આવર્તનનું પ્રમાણીકરણ (n = 25 hCO ચેતાકોષો, n = 17 t-hCO ચેતાકોષો; ***P < 0.0001). f, 8 મહિનાના ભિન્નતા પર hCO અને t-hCO ચેતાકોષોમાં સ્વયંભૂ EPSCs (sEPSCs), અને સિનેપ્ટિક ઘટનાઓની આવર્તનનું પ્રમાણીકરણ (n = 25 hCO ચેતાકોષો, n = 17 t-hCO ચેતાકોષો; ***P < 0.0001). એફ, спонтанные EPSC (sEPSC) нейронов hCO, n = 17 нейронов t-hCO *** P <0,0001) . f, સિનેપ્ટિક ઘટના દરના 8 મહિનાના ભિન્નતા અને જથ્થાત્મકતા પર hCO અને t-hCO ચેતાકોષોમાં સ્વયંસ્ફુરિત EPSCs (sEPSCs) (n=25 hCO ચેતાકોષો, n=17 t-hCO ચેતાકોષો; ***P<0.0001). f，分化8 个月时hCO 和t-hCO 神经元中的自发性EPSCs (sEPSCs)，以及突触事件频率的量化（烞烞烞烻和率17 t-hCO 神经元；**P <0.0001） . f，分化8 个月时hCO 和t-hCO 神经元中的自发性EPSCs (sEPSCs)，以及突触事件频率的量匼（n5神率的量匼（n = 25 hCO 神率的量匼（n = 25hCO P < 0.0001） . એફ, спонтанные EPSC (sEPSC) нейронов hCO, n = 17 нейронов t-hCO *** પી <0,0001). f, સિનેપ્ટિક ઘટના દરના ભિન્નતા અને જથ્થાના 8 મહિના પર hCO અને t-hCO ચેતાકોષોમાં સ્વયંસ્ફુરિત EPSCs (sEPSCs) (n = 25 hCO ચેતાકોષો, n = 17 t-hCO ચેતાકોષો; *** P<0.0001).bf માટે, લાઇન 1208-2 માં hCO અને t-hCO સમાંતર રીતે જાળવવામાં આવેલા સમાન ડિફરન્શિયેશન બેચમાંથી લેવામાં આવ્યા હતા. g, t-hCO ગ્લુટામેટર્જિક ન્યુરોન્સમાં જનીનોનું જનીન સેટ સંવર્ધન વિશ્લેષણ (એકતરફી ફિશરનું ચોક્કસ પરીક્ષણ) નોંધપાત્ર રીતે અપરેગ્યુલેટેડ (એડજસ્ટેડ P < 0.05, ફોલ્ડ ચેન્જ > 2, ન્યુક્લીના ઓછામાં ઓછા 10% માં વ્યક્ત) hCO ગ્લુટામેટર્જિક ન્યુરોન્સની તુલનામાં, ઇન વિવો માઉસ અભ્યાસ16 અને ઇન વિટ્રો ન્યુરોન્સ17 માંથી માનવ-વિશિષ્ટ LRGs બંનેના જનીન સેટ સાથે. g, t-hCO ગ્લુટામેટર્જિક ન્યુરોન્સમાં જનીનોનું જનીન સેટ સંવર્ધન વિશ્લેષણ (એકતરફી ફિશરનું ચોક્કસ પરીક્ષણ) નોંધપાત્ર રીતે અપરેગ્યુલેટેડ (એડજસ્ટેડ P < 0.05, ફોલ્ડ ચેન્જ > 2, ન્યુક્લીના ઓછામાં ઓછા 10% માં વ્યક્ત) hCO ગ્લુટામેટર્જિક ન્યુરોન્સની તુલનામાં, ઇન વિવો માઉસ અભ્યાસ16 અને ઇન વિટ્રો ન્યુરોન્સ17 માંથી માનવ-વિશિષ્ટ LRGs બંનેના જનીન સેટ સાથે. g, анализ обогащения набора генов (односторонний точный критерий Фишера) генов со значительной активацией (скорректировань,
એક્સ વિવો સ્લાઇસેસમાં જોવા મળેલી t-hCO ની વધેલી પ્રવૃત્તિના આધારે, snRNA-seq એ hCO ની સરખામણીમાં t-hCO માં જનીન ટ્રાન્સક્રિપ્ટનું પ્રવૃત્તિ-આધારિત અપરેગ્યુલેશન જાહેર કર્યું ઇન વિટ્રો. ગ્લુટામેટર્જિક t-hCO ચેતાકોષોએ અંતમાં પ્રતિભાવ પ્રવૃત્તિને નિયંત્રિત કરતા જનીનોના ઉચ્ચ સ્તર (આકૃતિ 2g,h) વ્યક્ત કર્યા, જે ઉંદર અને માનવ ચેતાકોષોમાં અગાઉના અભ્યાસોમાં જોવા મળ્યા હતા16,17. ઉદાહરણ તરીકે, BDNF18, SCG2, અને OSTN, એક પ્રાઈમેટ-વિશિષ્ટ પ્રવૃત્તિ-નિયમનકારી જનીન, hCO ચેતાકોષોની સરખામણીમાં t-hCO ચેતાકોષોમાં વધેલી અભિવ્યક્તિ દર્શાવે છે (આકૃતિ 2g-i). આમ, ટ્રાન્સક્રિપ્શનલ, મોર્ફોલોજિકલ અને કાર્યાત્મક વિશ્લેષણ દ્વારા t-hCO ચેતાકોષોએ hCO ચેતાકોષોની સરખામણીમાં ઉન્નત પરિપક્વતા લાક્ષણિકતાઓ દર્શાવી.
માનવ મગજના વિકાસ સાથે t-hCO પરિપક્વતાના જોડાણનું વધુ મૂલ્યાંકન કરવા માટે, અમે ગર્ભ અને પુખ્ત કોર્ટિકલ કોષ પ્રકારો 19,20 અને પુખ્ત 21,22 ની ટ્રાન્સક્રિપ્ટોમિક સરખામણીઓ તેમજ વિકાસ દરમિયાન કોર્ટિકલ જનીન અભિવ્યક્તિ 23 પર વ્યાપક ડેટા (વિસ્તૃત ડેટા, આકૃતિ 5) કર્યો. અગાઉના કાર્ય 24 સાથે, 7-8 મહિનાના ભિન્નતા પર વૈશ્વિક hCO અને t-hCO ટ્રાન્સક્રિપ્ટોમ પરિપક્વતા સ્થિતિ વ્યાપકપણે ઇન વિવો વિકાસ સમય સાથે સુસંગત છે અને ગર્ભના અંતમાં જીવન (વિસ્તૃત ડેટા આકૃતિ 5a) ની સમકક્ષ છે. નોંધપાત્ર રીતે, અમે વય-મેળ ખાતા hCO ની તુલનામાં t-hCO માં વધેલી ટ્રાન્સક્રિપ્ટોમ પરિપક્વતા, તેમજ સિનેપ્ટોજેનેસિસ, એસ્ટ્રોજેનેસિસ અને માયલિનેશન (વિસ્તૃત ડેટા, આકૃતિ 5b-d) સાથે સંકળાયેલ ટ્રાન્સક્રિપ્ટોમ સક્રિયકરણ અવલોકન કર્યું. સેલ્યુલર સ્તરે, અમને t-hCO માં પાતળા કોર્ટેક્સ પેટાપ્રકારના પુરાવા મળ્યા, જેમાં ગ્લુટામેટર્જિક ન્યુરોનના ક્લસ્ટરો પુખ્ત L2/3, L5 અને L6 ન્યુરોન પેટાપ્રકારો સાથે ઓવરલેપ થાય છે (આકૃતિ 1i). તેનાથી વિપરીત, ગર્ભાવસ્થાના મધ્ય ભાગમાં ગ્લુટામેટર્જિક t-hCO ચેતાકોષો અને ગર્ભ કોર્ટિકલ ચેતાકોષો વચ્ચે ક્લસ્ટર ઓવરલેપ વધુ મર્યાદિત હતું (વિસ્તૃત ડેટા, આકૃતિ 5e-j). t-hCO ચેતાકોષો માનવ પોસ્ટનેટલ નિયોકોર્ટિકલ ચેતાકોષો જેવા કાર્યાત્મક રીતે સમાન છે કે કેમ તે નક્કી કરવા માટે, અમે માનવ પોસ્ટનેટલ કોર્ટેક્સના તીક્ષ્ણ ભાગોમાં માનવ L2/3 પિરામિડલ ચેતાકોષોના ઇલેક્ટ્રોફિઝીયોલોજીકલ રેકોર્ડિંગ્સ અને એનાટોમિકલ પુનર્નિર્માણ કર્યા (વિસ્તૃત ડેટા, આકૃતિ 7a). L2/3 પિરામિડલ ચેતાકોષોના ઇલેક્ટ્રોફિઝીયોલોજીકલ ગુણધર્મો t-hCO પિરામિડલ ચેતાકોષો જેવા જ હતા (વિસ્તૃત ડેટા, આકૃતિ 7e). આકારશાસ્ત્રની દ્રષ્ટિએ, પોસ્ટનેટલ માનવ નમૂનાઓમાંથી L2/3 ચેતાકોષો hCO કરતાં t-hCO જેવા વધુ સમાન હતા, જોકે L2/3 કોષો લાંબા હતા, એકંદરે વધુ શાખાઓ ધરાવતા હતા, અને કરોડરજ્જુની ઘનતા વધારે હતી (આકૃતિ 3g અને વિસ્તૃત ડેટા, આકૃતિ 7b-). G).
a, નિયંત્રણ અને TS hiPS કોષ રેખાઓ દ્વારા ઉત્પાદિત hCO નું નવજાત ઉંદરોમાં ટ્રાન્સપ્લાન્ટેશન. b, 8 મહિનાના ભિન્નતા પછી બાયોસાયટિનથી ભરેલા t-hCO ચેતાકોષોનું 3D પુનર્નિર્માણ. c, સરેરાશ ડેંડ્રિટિક લંબાઈનું પ્રમાણીકરણ (n = 19 નિયંત્રણ ચેતાકોષો, n = 21 TS ચેતાકોષો; **P = 0.0041). d, 8 મહિનાના ભિન્નતા પર નિયંત્રણ અને TS t-hCO માંથી 3D-પુનઃનિર્મિત ડેંડ્રિટિક શાખાઓ, અને ડેંડ્રિટિક સ્પાઇન ડેન્સિટીનું પ્રમાણીકરણ (n = 16 કંટ્રોલ ચેતાકોષો, n = 21 TS ચેતાકોષો, ***P < 0.0001). d, 8 મહિનાના ભિન્નતા પર નિયંત્રણ અને TS t-hCO માંથી 3D-પુનઃનિર્મિત ડેંડ્રિટિક શાખાઓ, અને ડેંડ્રિટિક સ્પાઇન ડેન્સિટીનું પ્રમાણીકરણ (n = 16 કંટ્રોલ ચેતાકોષો, n = 21 TS ચેતાકોષો, ***P < 0.0001). d, 3D-реконструкция дендритных ветвей из контроля и TS t-hCO через 8 месяцев дифференцировки и количественная оцедритных оцедритных шипов (n = 16 контрольных нейронов, n = 21 TS нейронов, *** P <0,0001). d, 8 મહિનાના ભિન્નતા અને ડેંડ્રિટિક સ્પાઇન ડેન્સિટી ક્વોન્ટિફિકેશન પર નિયંત્રણ અને t-hCO TS માંથી ડેંડ્રિટિક શાખાઓનું 3D પુનર્નિર્માણ (n=16 નિયંત્રણ ચેતાકોષો, n=21 TS ચેતાકોષો, ***P<0.0001). d，分化8 个月时对照和TS t-hCO 的3D 重建树突分支，以及树突棘密度的量化（n = 16 个煥煥的量化（n 21 个TS 神经元, ***P < 0.0001）. d ， 分化 8 个 时 对照 和 ts t-hco 的 3d 重建 分支 分支 以及 树突支 以及 树突棘 密度 量化 珪 61 密度元 ， n = 21 个 ts 神经 ， *** p <0.0001 ）. d, 3D-реконструкция дендритных ветвей контроля и TS t-hCO через 8 месяцев дифференцировки и количественная оцентвей контроля шипов (n = 16 контрольных нейронов, n = 21 TS нейронов, *** P <0,0001). d, 8 મહિનાના ભિન્નતા અને ડેંડ્રિટિક સ્પાઇન ડેન્સિટી ક્વોન્ટિફિકેશન પર નિયંત્રણ ડેંડ્રિટિક શાખાઓ અને TS t-hCO3 નું 3D પુનર્નિર્માણ (n=16 નિયંત્રણ ચેતાકોષો, n=21 TS ચેતાકોષો, ***P<0.0001).લાલ ફૂદડી ચિહ્નો કલ્પિત ડેન્ડ્રિટિક સ્પાઇન્સ દર્શાવે છે. e, નિયંત્રણમાં સ્વયંભૂ EPSCs અને 8 મહિનાના ભિન્નતા પછી TS t-hCO ચેતાકોષો. f, સંચિત આવર્તન પ્લોટ અને સિનેપ્ટિક ઘટનાઓની આવર્તન અને કંપનવિસ્તારનું પ્રમાણીકરણ (n=32 નિયંત્રણ ચેતાકોષો, n=26 TS ચેતાકોષો; **P=0.0076 અને P=0.8102). g, hCO અને t-hCO માં TS અને નિયંત્રણ ચેતાકોષોનું સ્કોલ વિશ્લેષણ. ડેશેડ રેખાઓ સરખામણી માટે માનવ L2/3 પોસ્ટનેટલ પિરામિડલ ચેતાકોષો દર્શાવે છે (n = 24 નિયંત્રણ t-hCO ચેતાકોષો, n = 21 TS t-hCO ચેતાકોષો, n = 8 નિયંત્રણ hCO ચેતાકોષો, અને n = 7 TS hCO ચેતાકોષો). ડેટા સરેરાશ ± માનક વિચલન તરીકે વ્યક્ત કરવામાં આવે છે.
t-hCO ની માનવ કોર્ટેક્સ ચેતાકોષોના મોર્ફોલોજિકલ અને કાર્યાત્મક લક્ષણોને ઉચ્ચ સ્તરે નકલ કરવાની ક્ષમતાએ અમને શોધવા માટે પ્રેરિત કર્યા કે શું t-hCO નો ઉપયોગ રોગના ફેનોટાઇપ્સ શોધવા માટે થઈ શકે છે. અમે TS પર ધ્યાન કેન્દ્રિત કર્યું, જે CaV1.2 એન્કોડિંગ જનીનમાં ગેઇન-ઓફ-ફંક્શન મ્યુટેશનને કારણે થતી ગંભીર ન્યુરોડેવલપમેન્ટલ ડિસઓર્ડર છે, જે ચેતાકોષોમાં પ્રવૃત્તિ-આધારિત જનીન ટ્રાન્સક્રિપ્શન શરૂ કરે છે. અમે ત્રણ TS દર્દીઓ પાસેથી hCO મેળવ્યું જે સૌથી સામાન્ય અવેજી (p.G406R) અને ત્રણ નિયંત્રણો (આકૃતિ 3a) ધરાવતા હતા. ટ્રાન્સપ્લાન્ટેશન પછી, અમને જાણવા મળ્યું કે નિયંત્રણોની તુલનામાં TS ચેતાકોષોમાં ડેન્ડ્રિટિક મોર્ફોલોજીમાં ફેરફાર કરવામાં આવ્યો હતો (આકૃતિ 3b અને વિસ્તૃત ડેટા, આકૃતિ 8a,b), પ્રાથમિક ડેન્ડ્રિટ્સની સંખ્યામાં બે ગણો વધારો અને સરેરાશમાં એકંદર વધારો અને ડેન્ડ્રિટિક લંબાઈમાં એકંદર ઘટાડો (આકૃતિ 3c અને વિસ્તૃત ડેટા, આકૃતિ 8c). આ નિયંત્રણ ચેતાકોષોની તુલનામાં TS માં સ્પાઇન્સની વધેલી ઘનતા અને સ્વયંભૂ EPSCs ની વધેલી આવૃત્તિ સાથે સંકળાયેલું હતું (આકૃતિ 3d–f અને વિસ્તૃત ડેટા, આકૃતિ 8g). વધુ વિશ્લેષણમાં નિયંત્રણોની તુલનામાં t-hCO TS માં અસામાન્ય ડેંડ્રિટિક શાખાઓના પેટર્ન જાહેર થયા, પરંતુ ઇન વિટ્રો TS hCO માં ભિન્નતાના સમાન તબક્કે નહીં (આકૃતિ 3g). આ TS માં પ્રવૃત્તિ-આધારિત ડેંડ્રિટિક સંકોચનના અમારા અગાઉના અહેવાલો સાથે સુસંગત છે અને આ ટ્રાન્સપ્લાન્ટ પ્લેટફોર્મની વિવોમાં રોગ ફેનોટાઇપ્સ શોધવાની ક્ષમતાને પ્રકાશિત કરે છે.
પછી અમે પૂછ્યું કે ઉંદર S1 માં t-hCO કોષો કેટલી હદ સુધી કાર્યાત્મક રીતે સંકલિત છે. ઉંદરોમાં S1 ને ipsilateral ventral basal અને posterior thalamic nuclei, તેમજ ipsilateral motor અને secondary somatosensory cortices, અને contralateral S1 (આકૃતિ 4a) માંથી મજબૂત સિનેપ્ટિક ઇનપુટ્સ મળે છે. ઇનર્વેશન પેટર્નને પુનઃસ્થાપિત કરવા માટે, અમે hCO ને રેબીઝ વાયરસ-dG-GFP/AAV-G થી ચેપ લગાવ્યો અને 3 દિવસ પછી hCO ને S1 ઉંદરમાં ટ્રાન્સપ્લાન્ટ કર્યું. ટ્રાન્સપ્લાન્ટેશનના 7-14 દિવસ પછી અમે ipsilateral S1 અને વેન્ટ્રલ બેસલ ગેંગ્લિયાના ચેતાકોષોમાં ગાઢ GFP અભિવ્યક્તિનું અવલોકન કર્યું (આકૃતિ 4b, c). વધુમાં, થેલેમિક માર્કર નેટ્રિન G1 ના એન્ટિબોડી સ્ટેનિંગથી t-hCO માં થેલેમિક અંતની હાજરી જાહેર થઈ (આકૃતિ 4d, e). આ એફરન્ટ પ્રોજેક્શન્સ t-hCO કોષોમાં સિનેપ્ટિક પ્રતિભાવો ઉત્પન્ન કરી શકે છે કે કેમ તેનું મૂલ્યાંકન કરવા માટે, અમે થેલેમોકોર્ટિકલ સ્તરના તીક્ષ્ણ ભાગોમાં માનવ કોષોમાંથી સંપૂર્ણ કોષ રેકોર્ડિંગ કર્યું. ઉંદર S1, આંતરિક કેપ્સ્યુલ, શ્વેત દ્રવ્ય, t-hCO નજીકના તંતુઓનું વિદ્યુત ઉત્તેજના અથવા t-hCO માં ઓપ્સિન-વ્યક્ત કરતા થેલેમિક અંતના ઓપ્ટોજેનેટિક સક્રિયકરણ AMPA રીસેપ્ટર વિરોધી NBQX ના સંપર્કમાં આવેલા t-hCO ચેતાકોષોમાં ટૂંકા-લેટન્સી EPSCs પ્રેરિત કરે છે. (આકૃતિ 4f, g અને વિસ્તૃત ડેટા, આકૃતિ 9a-g). આ ડેટા દર્શાવે છે કે t-hCO ઉંદરના મગજમાં શરીરરચનાત્મક રીતે સંકલિત છે અને ઉંદર યજમાન પેશીઓ દ્વારા સક્રિય થવા માટે સક્ષમ છે.
a, હડકવા ટ્રેકિંગ પ્રયોગનો યોજનાકીય આકૃતિ. b, GFP અને માનવ-વિશિષ્ટ STEM121 અભિવ્યક્તિ t-hCO અને ઉંદર મગજનો આચ્છાદન (ઉપલા પેનલ) વચ્ચે. ઉંદરના ipsilateral વેન્ટ્રલ બેઝલ ન્યુક્લિયસ (VB) (નીચલા ડાબે) અને ipsilateral S1 (નીચલા જમણે) માં GFP અભિવ્યક્તિ પણ બતાવવામાં આવી છે. સ્કેલ બાર, 50 µm. લાલ ચોરસ મગજના તે વિસ્તારોનું પ્રતિનિધિત્વ કરે છે જ્યાં છબીઓ લેવામાં આવી હતી. c, GFP વ્યક્ત કરતા કોષોનું પ્રમાણીકરણ (n = 4 ઉંદરો). d, e — t-hCO માં નેટ્રિન G1+ થેલેમિક ટર્મિનલ્સ. d t-hCO અને VB ન્યુક્લી ધરાવતો કોરોનલ વિભાગ દર્શાવે છે. સ્કેલ બાર, 2 mm. e t-hCO (ડાબે) અને VB (જમણે) ચેતાકોષોમાં નેટ્રિન G1 અને STEM121 અભિવ્યક્તિ દર્શાવે છે. સ્કેલ બાર, 50 µm. નારંગી ડોટેડ રેખા t-hCO સરહદ દર્શાવે છે. f, g, S1 ઉંદર (f) અથવા આંતરિક કેપ્સ્યુલ (g), (જાંબલી) અથવા વગર (કાળા) NBQX (ડાબે) માં વિદ્યુત ઉત્તેજના પછી t-hCO ચેતાકોષોના વર્તમાન નિશાન. NBQX (n = 6 S1 ચેતાકોષો, *P = 0.0119; અને n = 6 આંતરિક કેપ્સ્યુલ ચેતાકોષો, **P = 0.0022) (મધ્યમાં) સાથે અને વગર EPSC કંપનવિસ્તાર. ઉંદર S1 (f) અથવા આંતરિક કેપ્સ્યુલ (g) (જમણે) ના વિદ્યુત ઉત્તેજનાના પ્રતિભાવમાં EPSC દર્શાવતા t-hCO ચેતાકોષોની ટકાવારી. aCSF, કૃત્રિમ સેરેબ્રોસ્પાઇનલ પ્રવાહી. h, 2P ઇમેજિંગ પ્રયોગ (ડાબે) નું યોજનાકીય આકૃતિ. t-hCO (મધ્યમ) માં GCaMP6s ની અભિવ્યક્તિ. સ્કેલ બાર, 100 µm. GCaMP6s (જમણે) નો ફ્લોરોસેન્સ સમય વિરામ. i, સ્વયંસ્ફુરિત પ્રવૃત્તિ ફ્લોરોસેન્સનો Z-સ્કોર. j, મૂછ ઉત્તેજનાનું યોજનાકીય ચિત્ર. k, એક ટ્રાયલમાં z-સ્કોર્ડ 2P ફ્લોરોસેન્સ ટ્રેજેક્ટરીઝ, ઉદાહરણ કોષોમાં સમય શૂન્ય (ડેશ્ડ લાઇન) પર વ્હિસ્કર વિચલન સાથે સંરેખિત. l, સમય શૂન્ય (ડેશ્ડ લાઇન) (લાલ) અથવા રેન્ડમલી જનરેટ કરેલા ટાઇમસ્ટેમ્પ્સ (ગ્રે) પર વ્હિસ્કર વિચલન સાથે સંરેખિત બધા કોષોના વસ્તી-સરેરાશ z-સ્કોર પ્રતિભાવો. m. ઓપ્ટિકલ માર્કિંગ પર પ્રયોગનો યોજનાકીય આકૃતિ. n, વાદળી લેસર ઉત્તેજના અથવા વ્હિસ્કર વિચલન દરમિયાન ઉદાહરણ t-hCO સેલમાંથી કાચા વોલ્ટેજ વણાંકો. લાલ તીર પ્રકાશ (ટોચ) દ્વારા અથવા વ્હિસ્કર વિચલન (નીચે) દ્વારા થતા પ્રથમ સ્પાઇક્સ સૂચવે છે. ગ્રે શેડિંગ વ્હિસ્કર વિચલનના સમયગાળા સૂચવે છે. o, પીક લાઇટ વેવફોર્મ્સ અને વ્હિસ્કર વિચલન પ્રતિભાવો. p, એક જ પ્રયાસના સ્પાઇક્સ, ઉદાહરણના કોષોમાં વ્હિસ્કરના વિચલન સાથે સંરેખિત. 0 વ્હિસ્કર વિચલન (ડેશ્ડ લાઇન) સૂચવે છે. q, બધા ફોટોસેન્સિટિવ કોષો માટે વસ્તી-સરેરાશ z-સ્કોર ફાયરિંગ રેટ, સમય શૂન્ય (ડેશ્ડ લાઇન) (લાલ) પર વ્હિસ્કર વિચલન સાથે સંરેખિત અથવા રેન્ડમલી જનરેટ કરેલા ટાઇમસ્ટેમ્પ્સ (ગ્રે). r, વ્હિસ્કર વિચલન દ્વારા નોંધપાત્ર રીતે મોડ્યુલેટેડ પ્રકાશસંવેદનશીલ એકમોનું પ્રમાણ (n = 3 ઉંદરો) (ડાબે). પીક z-સ્કોર લેટન્સી (n = 3 ઉંદરો; n = 5 (આછો લીલો), n = 4 (ઘેરો લીલો), અને n = 4 (સ્યાન) વ્હિસ્કર ડિફ્લેક્શન મોડ્યુલેશન એકમો પ્રતિ ઉંદર) (જમણે). ડેટા સરેરાશ ± માનક વિચલન તરીકે વ્યક્ત કરવામાં આવે છે.
પછી અમે પૂછ્યું કે શું t-hCO ને સંવેદનાત્મક ઉત્તેજના દ્વારા સક્રિય કરી શકાય છે. અમે S1 ઉંદરોમાં આનુવંશિક રીતે એન્કોડેડ કેલ્શિયમ સૂચકાંકો GCaMP6 વ્યક્ત કરતા hCO નું ટ્રાન્સપ્લાન્ટેશન કર્યું. 150 દિવસ પછી, અમે ફાઇબર ફોટોમેટ્રી અથવા બે-ફોટોન કેલ્શિયમ ઇમેજિંગ કર્યું (આકૃતિ 4h અને વિસ્તૃત ડેટા, આકૃતિ 10a). અમને જાણવા મળ્યું કે t-hCO કોષોએ સિંક્રનાઇઝ્ડ લયબદ્ધ પ્રવૃત્તિ પ્રદર્શિત કરી (આકૃતિ 4i, વિસ્તૃત ડેટા, આકૃતિ 10b અને પૂરક વિડિઓ 1). ટોચ t-hCO પ્રવૃત્તિને લાક્ષણિકતા આપવા માટે, અમે એનેસ્થેટાઇઝ્ડ ટ્રાન્સપ્લાન્ટ ઉંદરોમાં બાહ્યકોષીય ઇલેક્ટ્રોફિઝીયોલોજીકલ રેકોર્ડિંગ્સ કર્યા (વિસ્તૃત ડેટા, આકૃતિ 10c-f). અમે MRI છબીઓમાંથી સ્ટીરિયોટેક્સિક કોઓર્ડિનેટ્સ જનરેટ કર્યા છે; આમ, આ રેકોર્ડ કરેલા એકમો માનવ ચેતાકોષોનું પ્રતિનિધિત્વ કરે છે, જોકે ઇલેક્ટ્રોફિઝીયોલોજી ફક્ત મૂળની પ્રજાતિ નક્કી કરવાની મંજૂરી આપતી નથી. અમે પ્રવૃત્તિના સમન્વયિત વિસ્ફોટોનું અવલોકન કર્યું (વિસ્તૃત ડેટા, આકૃતિ 10d). આ વિસ્ફોટો લગભગ 460 ms સુધી ચાલ્યા અને લગભગ 2 s ના મૌન સમયગાળા દ્વારા અલગ કરવામાં આવ્યા (વિસ્તૃત ડેટા, આકૃતિ 10d, e). વ્યક્તિગત એકમોએ પ્રતિ વિસ્ફોટ સરેરાશ લગભગ ત્રણ રાઉન્ડ ફાયર કર્યા, જે પ્રતિ વિસ્ફોટ નોંધાયેલા એકમોના આશરે 73% છે. વ્યક્તિગત એકમોની પ્રવૃત્તિઓ ખૂબ જ સહસંબંધિત હતી, અને આ સહસંબંધો સમાન પરિસ્થિતિઓ હેઠળ નોંધાયેલા રસી ન આપેલા પ્રાણીઓમાં ઓળખાયેલા એકમો કરતા વધારે હતા (વિસ્તૃત ડેટા, આકૃતિ 10f). ઓળખાયેલા માનવ-ઉત્પન્ન ચેતાકોષોના સ્પાઇક પ્રતિભાવોને વધુ લાક્ષણિકતા આપવા માટે, અમે hCO સાથે ટ્રાન્સપ્લાન્ટ કરાયેલા એનેસ્થેટાઇઝ્ડ ઉંદરો પર પ્રકાશ-ટેગિંગ પ્રયોગો કર્યા જે પ્રકાશ-સંવેદનશીલ કેશન ચેનલ રોડોપ્સિન 2 (hChR2) વ્યક્ત કરે છે, જેના દ્વારા t-hCO ન્યુરોન્સ વાદળી પ્રકાશ ઉત્તેજનાના પ્રતિભાવમાં ટૂંકા-લેટન્સી ઓળખ (10 ms કરતા ઓછા) (આકૃતિ 4m–o). t-hCO ચેતાકોષોએ કેલ્શિયમ ઇમેજિંગમાં જોવા મળતી ફ્રીક્વન્સીઝ પર સ્વયંભૂ પ્રવૃત્તિના વિસ્ફોટો દર્શાવ્યા હતા, તેમજ પ્રકાશ માર્કિંગની ગેરહાજરીમાં t-hCO માં કરવામાં આવેલા ઇલેક્ટ્રોફિઝીયોલોજીકલ રેકોર્ડિંગ્સ (વિસ્તૃત ડેટા, આકૃતિ 10c-g). ઇન વિટ્રોમાં રેકોર્ડ કરાયેલ hCO ના અનુરૂપ તબક્કામાં કોઈ સ્વયંભૂ પ્રવૃત્તિ જોવા મળી ન હતી. સંવેદનાત્મક ઉત્તેજના દ્વારા t-hCO સક્રિય થઈ શકે છે કે કેમ તેનું મૂલ્યાંકન કરવા માટે, અમે ઉંદરના મૂછોને t-hCO થી દૂર ખસેડ્યા (આકૃતિ 4j,m અને વિસ્તૃત ડેટા, આકૃતિ 10h,k). અગાઉના અભ્યાસો 8,10 અનુસાર, t-hCO કોષોના સબસેટે મૂછોના વિચલનના પ્રતિભાવમાં વધેલી પ્રવૃત્તિ દર્શાવી હતી, જે ડેટાની રેન્ડમ ટાઇમ સ્ટેમ્પ્સ (આકૃતિ 4k–q અને વિસ્તૃત ડેટા, આકૃતિ 10h–q) સાથે સરખામણી કરવામાં આવી ત્યારે જોવા મળી ન હતી. ખરેખર, ઓપ્ટો-લેબલવાળા લગભગ 54% સિંગલ યુનિટ્સે મૂછોના ઉત્તેજના પછી નોંધપાત્ર રીતે વધેલા ઉત્તેજના દર દર્શાવ્યા હતા, જે લગભગ 650 ms (આકૃતિ 4r) પર ટોચ પર હતા. એકસાથે લેવામાં આવે તો, આ ડેટા સૂચવે છે કે t-hCO યોગ્ય કાર્યાત્મક ઇનપુટ્સ મેળવે છે અને પર્યાવરણીય ઉત્તેજના દ્વારા સક્રિય થઈ શકે છે.
પછી અમે તપાસ કરી કે શું t-hCO ઉંદરોમાં વર્તનને નિયંત્રિત કરવા માટે સર્કિટ સક્રિય કરી શકે છે. અમે પહેલા તપાસ કરી કે શું t-hCO ચેતાકોષોના ચેતાક્ષ ઉંદરની આસપાસના પેશીઓમાં પ્રવેશ કરે છે. અમે hCO ને EYFP (hChR2-EYFP) માં ફ્યુઝ્ડ hChR2 એન્કોડિંગ લેન્ટિવાયરસથી ચેપ લગાવ્યો. 110 દિવસ પછી, અમે શ્રાવ્ય, મોટર અને સોમેટોસેન્સરી કોર્ટિસીસ સહિત આઇપ્સિલેટરલ કોર્ટિકલ પ્રદેશોમાં તેમજ સ્ટ્રાઇટમ, હિપ્પોકેમ્પસ અને થેલેમસ સહિત સબકોર્ટિકલ પ્રદેશોમાં EYFP અભિવ્યક્તિનું અવલોકન કર્યું (આકૃતિ 5a). આ એફરન્ટ પ્રોજેક્શન્સ ઉંદર કોષોમાં સિનેપ્ટિક પ્રતિભાવો ઉત્પન્ન કરી શકે છે કે કેમ તેનું મૂલ્યાંકન કરવા માટે, અમે તીક્ષ્ણ મગજ વિભાગોમાં ઉંદર સેરેબ્રલ કોર્ટેક્સ કોષો રેકોર્ડ કરીને hChR2-EYFP વ્યક્ત કરતા t-hCO કોષોને ઓપ્ટિકલી સક્રિય કર્યા. ઉંદર પિરામિડલ કોર્ટેક્સ ચેતાકોષોમાં વાદળી પ્રકાશ પ્રેરિત ટૂંકા-લેટન્સી EPSCs સાથે t-hCO ચેતાક્ષનું સક્રિયકરણ, જે NBQX દ્વારા અવરોધિત હતા (આકૃતિ 5b-g). વધુમાં, આ પ્રતિભાવોને ટેટ્રોડોટોક્સિન (TTX) દ્વારા અવરોધિત કરી શકાય છે અને 4-એમિનોપાયરિડિન (4-AP) દ્વારા પુનઃસ્થાપિત કરી શકાય છે, જે સૂચવે છે કે તે મોનોસિનેપ્ટિક જોડાણોને કારણે થયા હતા (આકૃતિ 5e).
a, ચેતાક્ષ ટ્રેકિંગનું સ્કીમેટિક ડાયાગ્રામ (ડાબે). t-hCO EYFP અભિવ્યક્તિ (જમણે). સ્કેલ બાર, 100 µm. A1, શ્રાવ્ય કોર્ટેક્સ, ACC, અગ્રવર્તી સિંગ્યુલેટ કોર્ટેક્સ, d. સ્ટ્રાઇટમ, ડોર્સલ સ્ટ્રાઇટમ, HPC, હિપ્પોકેમ્પસ; ડાયાફ્રેમ, લેટરલ સેપ્ટમ, mPFC, મેડિયલ પ્રીફ્રન્ટલ કોર્ટેક્સ, પિરી, પિરીફોર્મ કોર્ટેક્સ, v. સ્ટ્રાઇટમ, વેન્ટ્રલ સ્ટ્રાઇટમ, VPM, થેલેમસનું વેન્ટ્રોપોસ્ટોમેડિયલ ન્યુક્લિયસ, VTA, વેન્ટ્રલ ટેગમેન્ટલ પ્રદેશ. લાલ ચોરસ મગજના તે વિસ્તારોનું પ્રતિનિધિત્વ કરે છે જ્યાં છબીઓ લેવામાં આવી હતી. b, ઉત્તેજના પ્રયોગનું સ્કીમેટિક ડાયાગ્રામ. c, d, માનવ (c) EYFP+ t-hCO અથવા ઉંદર (d) EYFP- કોષોમાં વાદળી પ્રકાશ-પ્રેરિત ફોટોકરન્ટ (ટોચ) અને વોલ્ટેજ (નીચે) ના પ્રતિભાવના ઉદાહરણો. e, f, TTX અને 4-AR (લીલો), TTX (ગ્રે) અથવા aCSF (કાળો) (e), (વાયોલેટ) અથવા (કાળા) વગર (કાળા) ) સાથે t-hCO ચેતાક્ષના વાદળી પ્રકાશ ઉત્તેજના પછી ઉંદર ચેતાકોષોના વર્તમાન નિશાનો NBQX (e). g, ઉંદર કોષોમાં વાદળી પ્રકાશ દ્વારા પ્રેરિત પ્રતિભાવોની વિલંબતા (n = 16 કોષો); આડી પટ્ટીઓ સરેરાશ વિલંબતા (7.13 ms) (ડાબે) દર્શાવે છે. NBQX (n = 7 કોષો; ***P < 0.0001) (મધ્યમ) સાથે અથવા વગર રેકોર્ડ કરાયેલ પ્રકાશ-ઉત્પન્ન EPSCs નું કંપનવિસ્તાર. NBQX (n = 7 કોષો; ***P < 0.0001) (મધ્યમ) સાથે અથવા વગર રેકોર્ડ કરાયેલ પ્રકાશ-ઉત્પન્ન EPSCs નું કંપનવિસ્તાર. Амплитуда вызванных светом EPSC, зарегистрированных с или без NBQX (n = 7 клеток; ***P <0,0001) (в центре). NBQX (n = 7 કોષો; ***P < 0.0001) (મધ્યમાં) સાથે અથવા વગર રેકોર્ડ કરાયેલ પ્રકાશ-પ્રેરિત EPSCs નું કંપનવિસ્તાર.使用或不使用NBQX 记录的光诱发EPSC 的振幅（n = 7 个细胞；***P < 0.0001）（中）.使用或不使用NBQX 记录的光诱发EPSC 的振幅（n = 7 个细胞；***P < 0.0001）（中）. Амплитуда вызванных светом EPSC, зарегистрированных с или без NBQX (n = 7 клеток; ***P <0,0001) (в центре). NBQX (n = 7 કોષો; ***P < 0.0001) (મધ્યમાં) સાથે અથવા વગર રેકોર્ડ કરાયેલ પ્રકાશ-પ્રેરિત EPSCs નું કંપનવિસ્તાર.વાદળી પ્રકાશ (જમણે) ને પ્રતિભાવ આપતા EPSCs દર્શાવતા ઉંદર કોષોની ટકાવારી. h, વર્તણૂકીય કાર્યનો યોજનાકીય આકૃતિ. d0, દિવસ 0. i. તાલીમના દિવસ 1 (ડાબે) અથવા દિવસ 15 (જમણે) પર અનુકરણીય પ્રાણીઓનું પ્રદર્શન. દિવસ 1 (ડાબે) અથવા દિવસ 15 (જમણી મધ્યમાં) પર કરવામાં આવેલા ચાટવાની સરેરાશ સંખ્યા (n = 150 વાદળી પ્રકાશના અજમાયશ, n = 150 લાલ પ્રકાશના અજમાયશ; ***P < 0.0001). દિવસ 1 (ડાબે) અથવા દિવસ 15 (જમણી મધ્યમાં) પર કરવામાં આવેલા ચાટવાની સરેરાશ સંખ્યા (n = 150 વાદળી પ્રકાશના અજમાયશ, n = 150 લાલ પ્રકાશના અજમાયશ; ***P < 0.0001). Среднее количество облизываний, выполненных в день 1 (слева) или день 15 (в центре справа) (n = 150 испытаний с , с = симений с =150 испытаний с красным светом ***P <0,0001). દિવસ 1 (ડાબે) અથવા દિવસ 15 (મધ્યમાં જમણે) પર કરવામાં આવેલા લિકની સરેરાશ સંખ્યા (n = 150 વાદળી પ્રકાશના અજમાયશ, n = 150 લાલ પ્રકાશના અજમાયશ; ***P < 0.0001).第1 天（左）或第15 天（右中）执行的平均舔次数（n = 150 次蓝光试验，n = 150次红光试验；**P <0.0001）.第1 天（左）或第15 天（右中）执行的平均舔次数（n = 150 次蓝光试验，n = 150次红光试验；**P <0.001 Среднее количество облизываний, выполненных в день 1 (слева) или день 15 (в центре справа) (n = 150 испытаний с , с = симений с =150 испытаний с красным светом ***P <0,0001). દિવસ 1 (ડાબે) અથવા દિવસ 15 (મધ્યમાં જમણે) પર કરવામાં આવેલા લિકની સરેરાશ સંખ્યા (n = 150 વાદળી પ્રકાશના અજમાયશ, n = 150 લાલ પ્રકાશના અજમાયશ; ***P < 0.0001).દિવસ 1 (મધ્યમાં ડાબે) અથવા દિવસ 15 (જમણે) પર લાલ અને વાદળી પ્રકાશના પરીક્ષણો માટે સંચિત ચાટ. NS, નોંધપાત્ર નથી. j,k, દિવસ 1 અથવા 15 પર hChR2-EYFP (j) વ્યક્ત કરતા t-hCO અથવા નિયંત્રણ ફ્લોરોફોર (k) સાથે ટ્રાન્સપ્લાન્ટ કરાયેલા બધા પ્રાણીઓની વર્તણૂકીય લાક્ષણિકતાઓ (hChR2-EYFP: n = 9 ઉંદરો, ** P = 0.0049; નિયંત્રણ: n = 9, P = 0.1497). l, પસંદગી સ્કોરનું ઉત્ક્રાંતિ (n = 9 hChR2, n = 9 નિયંત્રણ; **P < 0.001, ***P < 0.0001). l, પસંદગી સ્કોરનું ઉત્ક્રાંતિ (n = 9 hChR2, n = 9 નિયંત્રણ; **P < 0.001, ***P < 0.0001). l, Эволюция показателя предпочтения (n = 9 hChR2, n = 9 контрольных; **P <0,001, ***P <0,0001). l, પસંદગી સ્કોરનું ઉત્ક્રાંતિ (n = 9 hChR2, n = 9 નિયંત્રણો; **P < 0.001, ***P < 0.0001). l，偏好评分的演变（n = 9 hChR2，n = 9 对照；**P < 0.001，***P < 0.0001）. l，偏好评分的演变（n = 9 hChR2，n = 9 对照；**P < 0.001，***P < 0.0001）. l, Эволюция показателей предпочтения (n = 9 hChR2, n = 9 контролей; **P <0,001, ***P <0,0001). l, પસંદગીના સ્કોર્સનું ઉત્ક્રાંતિ (n = 9 hChR2, n = 9 નિયંત્રણો; **P < 0.001, ***P < 0.0001).m, S1 માં t-hCO ના ઓપ્ટોજેનેટિક સક્રિયકરણના પ્રતિભાવમાં FOS અભિવ્યક્તિ. FOS અભિવ્યક્તિ (ડાબે), અને જથ્થાત્મકતા (n = 3 પ્રતિ જૂથ; *P < 0.05, **P < 0.01 અને ***P < 0.001) (જમણે) ની છબીઓ બતાવવામાં આવી છે. FOS અભિવ્યક્તિ (ડાબે), અને જથ્થાત્મકતા (n = 3 પ્રતિ જૂથ; *P < 0.05, **P < 0.01 અને ***P < 0.001) (જમણે) ની છબીઓ બતાવવામાં આવી છે. Показаны изображения экспрессии FOS (слева) и количественного определения (n = 3 на группу; * P <0,05, ** P <0,01 и *** P <0,001). FOS અભિવ્યક્તિ (ડાબે) અને પરિમાણીકરણ (n = 3 પ્રતિ જૂથ; *P<0.05, **P<0.01, અને ***P<0.001) ની છબીઓ (જમણે) બતાવવામાં આવી છે.显示了FOS 表达（左）和量化（每组n = 3；*P < 0.05、**P < 0.01 和***P < 0.001）（叾叾ﾼ显示了FOS 表达（左）和量化（每组n = 3；*P < 0.05、**P < 0.01 和***P < 0.001）（叾叾ﾼ Показаны изображения экспрессии FOS (слева) и количественного определения (n = 3 на группу; * P <0,05, ** P <0,01 и *** P <0,001). FOS અભિવ્યક્તિ (ડાબે) અને પરિમાણીકરણ (n = 3 પ્રતિ જૂથ; *P<0.05, **P<0.01, અને ***P<0.001) ની છબીઓ (જમણે) બતાવવામાં આવી છે.સ્કેલ બાર, 100 µm. ડેટા સરેરાશ ± BLA, બેસોલેટરલ ટોન્સિલ, MDT, ડોર્સોમેડિયલ થેલેમિક ન્યુક્લિયસ, PAG, પેરિયાક્વેડક્ટલ ગ્રે ની માનક ભૂલ તરીકે દર્શાવવામાં આવે છે.
છેલ્લે, અમે પૂછ્યું કે શું t-hCO ઉંદરોના વર્તનને સુધારી શકે છે. આ ચકાસવા માટે, અમે hChR2-EYFP-પ્રદર્શિત hCO ને S1 માં ટ્રાન્સપ્લાન્ટ કર્યું, અને 90 દિવસ પછી, અમે પ્રકાશ વિતરણ માટે t-hCO માં ઓપ્ટિકલ ફાઇબરનું પ્રત્યારોપણ કર્યું. ત્યારબાદ અમે ઉંદરોને સુધારેલા ઓપરેટ કન્ડીશનીંગ પેરાડાઈમ (આકૃતિ 5h) સાથે તાલીમ આપી. અમે પ્રાણીઓને વર્તણૂકીય પરીક્ષણ ચેમ્બરમાં મૂક્યા અને રેન્ડમલી 5 સેકન્ડ વાદળી (473 nm) અને લાલ (635 nm) લેસર ઉત્તેજના લાગુ કરી. જો પ્રાણીઓ વાદળી પ્રકાશ ઉત્તેજના દરમિયાન ચાટતા હતા પરંતુ લાલ પ્રકાશ ઉત્તેજના દરમિયાન ચાટતા ન હતા તો તેમને પાણીનો પુરસ્કાર મળ્યો. તાલીમના પહેલા દિવસે, પ્રાણીઓ વાદળી અથવા લાલ પ્રકાશથી ઉત્તેજિત થાય ત્યારે ચાટવામાં કોઈ તફાવત દર્શાવતા નહોતા. જો કે, 15મા દિવસે, hChR2-EYFP વ્યક્ત કરતા hCO સાથે ટ્રાન્સપ્લાન્ટ કરાયેલા પ્રાણીઓએ લાલ પ્રકાશ ઉત્તેજનાની તુલનામાં વાદળી પ્રકાશથી ઉત્તેજિત થાય ત્યારે વધુ સક્રિય ચાટતા દર્શાવ્યા. ચાટવાની વર્તણૂકમાં આ ફેરફારો નિયંત્રણ ફ્લોરોફોર વ્યક્ત કરતા hCO સાથે ટ્રાન્સપ્લાન્ટ કરાયેલા નિયંત્રણ પ્રાણીઓમાં જોવા મળ્યા ન હતા (શીખવાની સફળતા દર: hChR2 89%, EYFP 0%, આકૃતિ 5i-1 અને પૂરક વિડિઓ 2). આ ડેટા સૂચવે છે કે t-hCO કોષો પુરસ્કાર-શોધવાની વર્તણૂકને ઉત્તેજીત કરવા માટે ઉંદર ચેતાકોષોને સક્રિય કરી શકે છે. આ વર્તણૂકીય ફેરફારોમાં કયા ઉંદર t-hCO ન્યુરલ સર્કિટ સામેલ હોઈ શકે છે તે શોધવા માટે, અમે 90 મિનિટ પછી પ્રશિક્ષિત પ્રાણીઓ અને કાપેલા પેશીઓમાં t-hCO ને ઓપ્ટોજેનેટિકલી સક્રિય કર્યું. ઇમ્યુનોહિસ્ટોકેમિસ્ટ્રીએ પ્રેરિત વર્તણૂકમાં સામેલ ઘણા મગજ પ્રદેશોમાં પ્રવૃત્તિ-આધારિત FOS પ્રોટીનની અભિવ્યક્તિ જાહેર કરી, જેમાં મધ્યવર્તી પ્રીફ્રન્ટલ કોર્ટેક્સ, મધ્યવર્તી થેલેમસ અને પેરિયાક્વેડક્ટલ ગ્રે મેટરનો સમાવેશ થાય છે, જે કાં તો ઉત્તેજિત નિયંત્રણ પ્રાણીઓમાં અથવા પ્રાણીઓમાં વ્યક્ત કરવામાં આવ્યું હતું. ચોખા. 5m). એકસાથે લેવામાં આવે તો, આ ડેટા સૂચવે છે કે t-hCO વર્તન ચલાવવા માટે ઉંદર ચેતાકોષીય પ્રવૃત્તિને મોડ્યુલેટ કરી શકે છે.
માનવ વિકાસ અને રોગનો અભ્યાસ કરવા માટે ન્યુરલ ઓર્ગેનોઇડ્સ ઇન વિટ્રોમાં એક આશાસ્પદ સિસ્ટમ રજૂ કરે છે, પરંતુ તે ઇન વિવો અસ્તિત્વમાં રહેલા સર્કિટ વચ્ચે જોડાણોના અભાવને કારણે મર્યાદિત છે. અમે એક નવલકથા પ્લેટફોર્મ વિકસાવ્યું છે જેમાં અમે માનવ કોષ વિકાસ અને ઇન વિવો કાર્યનો અભ્યાસ કરવા માટે રોગપ્રતિકારક શક્તિ ધરાવતા પ્રારંભિક પોસ્ટનેટલ ઉંદરોના S1 માં hCO ટ્રાન્સપ્લાન્ટ કર્યું છે. અમે બતાવ્યું છે કે t-hCO પરિપક્વ કોષ પ્રકારો વિકસાવે છે જે ઇન વિટ્રો28 માં જોવા મળતા નથી અને તે t-hCO શરીરરચનાત્મક અને કાર્યાત્મક રીતે ઉંદરના મગજમાં સંકલિત થાય છે. ઉંદરના ન્યુરલ સર્કિટમાં t-hCO નું એકીકરણ અમને માનવ કોષીય પ્રવૃત્તિ અને અભ્યાસ કરેલા પ્રાણીઓના વર્તન વચ્ચે એક જોડાણ સ્થાપિત કરવાની મંજૂરી આપે છે, જે દર્શાવે છે કે t-hCO ચેતાકોષો વર્તણૂકીય પ્રતિભાવો ચલાવવા માટે ઉંદર ચેતાકોષીય પ્રવૃત્તિને મોડ્યુલેટ કરી શકે છે.
અમે જે પ્લેટફોર્મનું વર્ણન કરીએ છીએ તે ઉંદરોના મગજમાં માનવ કોષોના ટ્રાન્સપ્લાન્ટેશન પરના અગાઉના સંશોધન કરતાં ઘણા ફાયદા ધરાવે છે. પ્રથમ, અમે hCO ને પ્રારંભિક પોસ્ટનેટલ ઉંદરોના વિકાસશીલ કોર્ટેક્સમાં ટ્રાન્સપ્લાન્ટ કર્યું, જે શરીરરચના અને કાર્યાત્મક એકીકરણને સરળ બનાવી શકે છે. બીજું, t-hCO MRI મોનિટરિંગથી અમને જીવંત પ્રાણીઓમાં ગ્રાફ્ટ સ્થિતિ અને વૃદ્ધિનો અભ્યાસ કરવાની મંજૂરી મળી, જેનાથી અમને લાંબા ગાળાના બહુ-પ્રાણી અભ્યાસ હાથ ધરવા અને અનેક hiPS કોષ રેખાઓની વિશ્વસનીયતા સ્થાપિત કરવાની મંજૂરી મળી. અંતે, અમે અલગ સિંગલ સેલ સસ્પેન્શનને બદલે અખંડ ઓર્ગેનોઇડ્સનું ટ્રાન્સપ્લાન્ટ કર્યું, જે માનવ કોષો માટે ઓછા વિનાશક છે અને ઉંદરોના મગજમાં માનવ કોર્ટેક્સ ચેતાકોષોના એકીકરણ અને ઉત્પાદનને પ્રોત્સાહન આપી શકે છે.
અમે સ્વીકારીએ છીએ કે આ પ્લેટફોર્મમાં પ્રગતિ હોવા છતાં, વિકાસના પ્રારંભિક તબક્કે ટ્રાન્સપ્લાન્ટેશન પછી પણ, ટેમ્પોરલ, સ્પેશિયલ અને ક્રોસ-પ્રજાતિના અવરોધો ઉચ્ચ વફાદારી સાથે માનવ ન્યુરલ સર્કિટના નિર્માણને અટકાવે છે. ઉદાહરણ તરીકે, તે સ્પષ્ટ નથી કે t-hCO માં જોવા મળતી સ્વયંસ્ફુરિત પ્રવૃત્તિ કોર્ટિકલ વિકાસ દરમિયાન જોવા મળતી લયબદ્ધ પ્રવૃત્તિ જેવી જ વિકાસલક્ષી ફેનોટાઇપનું પ્રતિનિધિત્વ કરે છે કે તે t-hCO માં હાજર દમનકારી કોષ પ્રકારોની ગેરહાજરીને કારણે છે. તેવી જ રીતે, તે સ્પષ્ટ નથી કે t-hCO માં લેમિનેશનની ગેરહાજરી ચેઇન કનેક્ટિવિટી30 ને કેટલી હદ સુધી અસર કરે છે. ભવિષ્યનું કાર્ય એસેમ્બલી 6 ઇન વિટ્રોનો ઉપયોગ કરીને દર્શાવવામાં આવેલા અન્ય કોષ પ્રકારો જેમ કે માનવ માઇક્રોગ્લિયા, માનવ એન્ડોથેલિયલ કોષો અને GABAergic ઇન્ટરન્યુરોન્સના વિવિધ પ્રમાણને એકીકૃત કરવા પર ધ્યાન કેન્દ્રિત કરશે, તેમજ દર્દીઓ પાસેથી મેળવેલા કોષોમાં બદલાયેલા t-hCO માં ન્યુરલ એકીકરણ અને પ્રક્રિયા કેવી રીતે થઈ શકે છે તે સમજવા પર ધ્યાન કેન્દ્રિત કરશે. ટ્રાન્સક્રિપ્શનલ, સિનેપ્ટિક અને વર્તણૂકીય સ્તરો.
એકંદરે, આ ઇન વિવો પ્લેટફોર્મ એક શક્તિશાળી સંસાધનનું પ્રતિનિધિત્વ કરે છે જે ઇન વિટ્રો માનવ મગજ વિકાસ અને રોગ સંશોધનને પૂરક બનાવી શકે છે. અમે અપેક્ષા રાખીએ છીએ કે આ પ્લેટફોર્મ અમને દર્દી-ઉત્પન્ન કોષોમાં નવા સ્ટ્રેન્ડ-લેવલ ફેનોટાઇપ્સ શોધવા અને નવી ઉપચારાત્મક વ્યૂહરચનાઓનું પરીક્ષણ કરવાની મંજૂરી આપશે.
અમે અગાઉ વર્ણવ્યા મુજબ HiPS કોષોમાંથી hCO2.5 ઉત્પન્ન કર્યું. ફીડર સ્તરો પર કલ્ચર કરાયેલા hiPS કોષોમાંથી hCO ઉત્પાદન શરૂ કરવા માટે, ડિસ્પેઝ (0.35 mg/mL) નો ઉપયોગ કરીને કલ્ચર ડીશમાંથી hiPS કોષોની અખંડ વસાહતો દૂર કરવામાં આવી અને hiPS સેલ કલ્ચર માધ્યમ ધરાવતી વાનગીઓ ધરાવતા અલ્ટ્રા-લો એટેચમેન્ટ પ્લાસ્ટિક કલ્ચરમાં સ્થાનાંતરિત કરવામાં આવી. (કોર્નિંગ) બે SMAD અવરોધકો ડોર્સોમોર્ફિન (5 μM; P5499, સિગ્મા-એલ્ડ્રિચ) અને SB-431542 (10 μM; 1614, ટોક્રિસ) અને ROCK અવરોધક Y-27632 (10 μM; S1049, સેલેકકેમ) સાથે પૂરક હતું. પ્રથમ 5 દિવસ દરમિયાન, hiPS સેલ માધ્યમ દરરોજ બદલવામાં આવતું હતું અને ડોર્સોમોર્ફિન અને SB-431542 ઉમેરવામાં આવતા હતા. સસ્પેન્શનના છઠ્ઠા દિવસે, ન્યુરલ સ્ફેરોઇડ્સને ન્યુરોબેસલ-એ (૧૦૮૮૮, લાઇફ ટેક્નોલોજીસ), વિટામિન એ વગરના બી-૨૭ સપ્લિમેન્ટ (૧૨૫૮૭, લાઇફ ટેક્નોલોજીસ), ગ્લુટામેક્સ (૧:૧૦૦, લાઇફ ટેક્નોલોજીસ), પેનિસિલિન અને સ્ટ્રેપ્ટોમાસીન (૧:૧૦૦, લાઇફ ટેક્નોલોજીસ) ધરાવતા ન્યુરલ માધ્યમમાં ટ્રાન્સફર કરવામાં આવ્યા હતા અને ૨૪મા દિવસ સુધી એપિડર્મલ ગ્રોથ ફેક્ટર (EGF; ૨૦ ng ml−૧; R&D સિસ્ટમ્સ) અને ફાઇબ્રોબ્લાસ્ટ ગ્રોથ ફેક્ટર ૨ (FGF2; ૨૦ ng ml−૧; R&D સિસ્ટમ્સ) સાથે પૂરક બનાવવામાં આવ્યા હતા. ૨૫મા દિવસથી ૪૨મા દિવસ સુધી, માધ્યમને મગજમાંથી મેળવેલા ન્યુરોટ્રોફિક ફેક્ટર (BDNF; ૨૦ ng ml−૧, પેપ્રોટેક) અને ન્યુરોટ્રોફિન ૩ (NT3; ૨૦ ng ml−૧; પેપ્રોટેક) સાથે પૂરક બનાવવામાં આવ્યું હતું જેમાં દર બીજા દિવસે મધ્યમ ફેરફાર કરવામાં આવ્યા હતા. સસ્પેન્શનના છઠ્ઠા દિવસે, ન્યુરલ સ્ફેરોઇડ્સને ન્યુરોબેસલ-એ (૧૦૮૮૮, લાઇફ ટેક્નોલોજીસ), વિટામિન એ વગરના બી-૨૭ સપ્લિમેન્ટ (૧૨૫૮૭, લાઇફ ટેક્નોલોજીસ), ગ્લુટામેક્સ (૧:૧૦૦, લાઇફ ટેક્નોલોજીસ), પેનિસિલિન અને સ્ટ્રેપ્ટોમાસીન (૧:૧૦૦, લાઇફ ટેક્નોલોજીસ) ધરાવતા ન્યુરલ માધ્યમમાં ટ્રાન્સફર કરવામાં આવ્યા હતા અને ૨૪મા દિવસ સુધી એપિડર્મલ ગ્રોથ ફેક્ટર (EGF; ૨૦ ng ml−૧; R&D સિસ્ટમ્સ) અને ફાઇબ્રોબ્લાસ્ટ ગ્રોથ ફેક્ટર ૨ (FGF2; ૨૦ ng ml−૧; R&D સિસ્ટમ્સ) સાથે પૂરક બનાવવામાં આવ્યા હતા. ૨૫મા દિવસથી ૪૨મા દિવસ સુધી, માધ્યમને મગજમાંથી મેળવેલા ન્યુરોટ્રોફિક ફેક્ટર (BDNF; ૨૦ ng ml−૧, પેપ્રોટેક) અને ન્યુરોટ્રોફિન ૩ (NT3; ૨૦ ng ml−૧; પેપ્રોટેક) સાથે પૂરક બનાવવામાં આવ્યું હતું જેમાં દર બીજા દિવસે મધ્યમ ફેરફાર કરવામાં આવ્યા હતા.સસ્પેન્શનના છઠ્ઠા દિવસે, ન્યુરલ સ્ફેરોઇડ્સને ન્યુરોબેસલ-એ (૧૦૮૮૮, લાઇફ ટેક્નોલોજીસ), વિટામિન એ વગર બી-૨૭ સપ્લિમેન્ટ (૧૨૫૮૭, લાઇફ ટેક્નોલોજીસ), ગ્લુટામેક્સ (૧:૧૦૦, લાઇફ ટેક્નોલોજીસ), પેનિસિલિન ધરાવતા ન્યુરલ માધ્યમમાં ટ્રાન્સફર કરવામાં આવ્યા હતા.и стрептомицин (1:100, લાઇફ ટેક્નોલોજીસ) и дополнены эпидермальным фактором роста (EGF; 20 ng/мл; R&D સિસ્ટમ્સ) и фактором роста; ng/мл; R&D સિસ્ટમ્સ) 24-го дня. અને સ્ટ્રેપ્ટોમાસીન (1:100, લાઇફ ટેક્નોલોજીસ) અને 24મા દિવસ સુધી એપિડર્મલ ગ્રોથ ફેક્ટર (EGF; 20 ng/ml; R&D સિસ્ટમ્સ) અને ફાઇબ્રોબ્લાસ્ટ ગ્રોથ ફેક્ટર 2 (FGF2; 20 ng/ml; R&D સિસ્ટમ્સ) સાથે પૂરક.૨૫ થી ૪૨ દિવસ સુધી, મગજમાંથી મેળવેલ ન્યુરોટ્રોફિક પરિબળ (BDNF; ૨૦ ng ml-૧, પેપ્રોટેક) અને ન્યુરોટ્રોફિન ૩ (NT૩; ૨૦ ng ml-૧, પેપ્રોટેક) ને માધ્યમમાં ઉમેરવામાં આવ્યા, દર બીજા દિવસે માધ્યમ બદલતા રહ્યા.在悬浮的第6 天，将神经球体转移到含有neurobasal-A（10888，Life Technologies）、不含维生素AB2-7补充剂（12587，Life Technologies）、GlutaMax（1:100，Life Technologies）、青霉素的神经培养剂（12587，Life Technologies）、GlutaMax（1:100，Life Technologies）、青霉素的神经培养基中和龉龙01 ટેક્નોલોજીસ）并辅以表皮生长因子（EGF；20 ng ml-1；R&D સિસ્ટમ્સ）和成纤维细胞生长因子2（FGF2；20 ng ml-1；R&D સિસ્ટમ્સ）直至第24 天.在 悬浮 的 第 6 天 将 神经 球体 转移 含有 含有 ન્યુરોબાસલ-એ （10888 ， લાઇફ ટેક્નોલોજીસ补充剂 （12587, Life Technologies） Glutamax （1: 100, Life TechNOGIS 青霉素 的 神经 培养 基 中 链霉素 ， 1: 100 લાઇફ ટેક્નોલોજીસ） 表皮 生长 因子 20 એનજી એમએલ-1 6-й день суспензии нейросферы были переведены на добавку, содержащую нейробазал-А (10888, લાઇફ ટેક્નોલોજી), добавку добавку витамина А (12587, લાઇફ ટેક્નોલોજીસ), ગ્લુટામેક્સ (1:100, લાઇફ ટેક્નોલોજીસ), пенициллин- нейтрализованный стрептомицин (1:100, લાઇફ ટેક્નોલોજીસ) ફેક્ટોરા રોસ્ટા (EGF; 20 ng ml-1; R&D સિસ્ટમ્સ) и фактора роста фибробластов 2 (FGF2; 20 нг мл-1) 1; છઠ્ઠા દિવસે, ન્યુરોસ્ફિયર સસ્પેન્શનને ન્યુરોબેસલ-એ (૧૦૮૮૮, લાઇફ ટેક્નોલોજીસ), વિટામિન એ વગરના બી-૨૭ સપ્લિમેન્ટ (૧૨૫૮૭, લાઇફ ટેક્નોલોજીસ), ગ્લુટામેક્સ (૧:૧૦૦, લાઇફ ટેક્નોલોજીસ), પેનિસિલિન-તટસ્થ સ્ટ્રેપ્ટોમાસીન (૧:૧૦૦, લાઇફ ટેક્નોલોજીસ) ધરાવતા પૂરકમાં ફેરવવામાં આવ્યા હતા જેમાં એપિડર્મલ ગ્રોથ ફેક્ટર (EGF; ૨૦ ng ml-૧; R&D સિસ્ટમ્સ) અને ફાઇબ્રોબ્લાસ્ટ ગ્રોથ ફેક્ટર ૨ (FGF2; ૨૦ ng ml-૧) ૧ નો સમાવેશ થતો હતો; R&D સિસ્ટમ્સ) 24-го дня. (આર એન્ડ ડી સિસ્ટમ્સ) 24 દિવસ સુધી.૨૫ થી ૪૨ દિવસ સુધી, મગજમાંથી મેળવેલા ન્યુરોટ્રોફિક પરિબળ (BDNF; ૨૦ ng ml-૧, પેપ્રોટેક) અને ન્યુરોટ્રોફિક પરિબળ ૩ (NT3; ૨૦ ng ml-૧, પેપ્રોટેક) ને દર બીજા દિવસે કલ્ચર માધ્યમમાં ઉમેરવામાં આવ્યા. એક વાર મધ્યમ ફેરફાર કરવામાં આવ્યો.૪૩મા દિવસથી શરૂ કરીને, hCO ને પૂરક ન હોય તેવા ન્યુરોબેસલ-A માધ્યમ (NM; 1088022, થર્મો ફિશર) માં દર ૪-૬ દિવસે મધ્યમ ફેરફાર સાથે જાળવવામાં આવ્યું. ફીડરલેસ પરિસ્થિતિઓમાં સંવર્ધિત hiPS કોષોમાંથી hCO મેળવવા માટે, hiPS કોષોને Accutase (AT-104, ઇનોવેટ સેલ ટેક્નોલોજીસ) સાથે ૩૭°C પર ૭ મિનિટ માટે ઇન્ક્યુબેટ કરવામાં આવ્યા હતા, સિંગલ સેલમાં વિભાજીત કરવામાં આવ્યા હતા, અને એગ્રેવેલ 800 પ્લેટ્સ (34815, STEMCELL ટેક્નોલોજીસ) પર ROCK ઇન્હિબિટર Y-27632 (10 μM; S1049, Selleckchem) સાથે પૂરક એસેન્શિયલ 8 માધ્યમમાં પ્રતિ કૂવામાં ૩ × ૧૦૬ સિંગલ સેલ્સની ઘનતા પર પ્લેટેડ કરવામાં આવ્યા હતા. 24 કલાક પછી, કુવાઓમાં રહેલા માધ્યમોને ડોર્સોમોર્ફિન (2.5 μM; P5499, સિગ્મા-એલ્ડ્રિચ) અને SB-431542 (10 μM; 1614) સાથે પૂરક એસેન્શિયલ 6 મીડિયા (A1516401, લાઇફ ટેક્નોલોજીસ) ધરાવતા માધ્યમમાં ઉપર અને નીચે પાઇપેટ કરવામાં આવ્યા. , ટોક્રિડા). દિવસ 2 થી 6 સુધી, એસેન્શિયલ 6 માધ્યમને દરરોજ ડોર્સોમોર્ફિન અને પૂરક SB-431542 સાથે બદલવામાં આવતું હતું. છઠ્ઠા દિવસથી, ન્યુરોસ્ફિયર સસ્પેન્શનને ન્યુરોબેસલ માધ્યમમાં સ્થાનાંતરિત કરવામાં આવ્યા હતા અને ઉપર વર્ણવ્યા મુજબ જાળવવામાં આવ્યા હતા.
સ્ટેનફોર્ડ યુનિવર્સિટી લેબોરેટરી એનિમલ કેર એડમિનિસ્ટ્રેટિવ કમિટી (APLAC) દ્વારા મંજૂર કરાયેલ પ્રાણી સંભાળ માર્ગદર્શિકા અનુસાર તમામ પ્રાણીઓની પ્રક્રિયાઓ કરવામાં આવી હતી. ગર્ભવતી યુથિમિક RNU (rnu/+) ઉંદરોને (ચાર્લ્સ રિવર લેબોરેટરીઝ) ખરીદવામાં આવ્યા હતા અથવા રાખવામાં આવ્યા હતા. પ્રાણીઓને ખોરાક અને પાણી સાથે 12-કલાકના પ્રકાશ-અંધારા ચક્ર પર રાખવામાં આવ્યા હતા. ત્રણ થી સાત દિવસની ઉંમરના નગ્ન (FOXN1–/–) ઉંદરના બચ્ચાને મારતા પહેલા અપરિપક્વ મૂછોની વૃદ્ધિ દ્વારા ઓળખવામાં આવ્યા હતા. ગલુડિયાઓ (નર અને માદા) ને 2-3% આઇસોફ્લુરેનથી એનેસ્થેટાઇઝ કરવામાં આવ્યા હતા અને સ્ટીરિયોટેક્સિક ફ્રેમ પર મૂકવામાં આવ્યા હતા. ડ્યુરા મેટરની અખંડિતતા જાળવી રાખીને S1 ઉપર આશરે 2-3 મીમી વ્યાસ ધરાવતી ખોપરીની ટ્રેપેનેશન કરવામાં આવી હતી. પછી ડ્યુરાને વીંધવા માટે ક્રેનિયોટોમીની બહાર 30-G સોય (આશરે 0.3 મીમી) નો ઉપયોગ કરો. પછી પાતળા 3×3 સેમી પેરાફિલ્મ પર HCO લાગુ કરો અને વધારાનું માધ્યમ દૂર કરો. 23 G, 45° સોય સાથે જોડાયેલ હેમિલ્ટન સિરીંજનો ઉપયોગ કરીને, સોયના સૌથી દૂરના છેડામાં hCO ને ધીમેથી ખેંચો. પછી સિરીંજને સ્ટીરિયોટેક્સિક ઉપકરણ સાથે જોડાયેલા સિરીંજ પંપ પર સ્થાપિત કરો. પછી સોયની ટોચને ડ્યુરા (z = 0 mm) માં અગાઉ બનાવેલા 0.3 mm પહોળા પંચર છિદ્ર પર મૂકો અને સિરીંજને 1-2 mm (z = આશરે -1.5 mm) સાંકડી કરો જ્યાં સુધી સોય ડ્યુરા મેટર A ની વચ્ચે ન આવે. એક ગાઢ સીલ બને છે. પછી સિરીંજને z = -0.5 mm પર કોર્ટિકલ સપાટીના કેન્દ્રમાં ઉંચી કરો અને 1-2 μl પ્રતિ મિનિટના દરે hCO ઇન્જેક્ટ કરો. hCO ઇન્જેક્શન પૂર્ણ થયા પછી, સોયને 0.2-0.5 mm પ્રતિ મિનિટના દરે પાછી ખેંચવામાં આવે છે, ત્વચાને સીવવામાં આવે છે, અને કુરકુરિયું તરત જ સંપૂર્ણ સ્વસ્થ થાય ત્યાં સુધી ગરમ હીટિંગ પેડ પર મૂકવામાં આવે છે. કેટલાક પ્રાણીઓનું દ્વિપક્ષીય ટ્રાન્સપ્લાન્ટેશન કરવામાં આવ્યું હતું.
સ્ટેનફોર્ડ યુનિવર્સિટી APLAC દ્વારા મંજૂર કરાયેલ પ્રાણી સંભાળ માર્ગદર્શિકા અનુસાર તમામ પ્રાણીઓની પ્રક્રિયાઓ કરવામાં આવી હતી. ઉંદરોને (પ્રત્યારોપણ પછી 60 દિવસથી વધુ) 5% આઇસોફ્લુરેન એનેસ્થેસિયાથી પ્રેરિત કરવામાં આવ્યા હતા અને ઇમેજિંગ દરમિયાન 1-3% આઇસોફ્લુરેનથી એનેસ્થેટાઇઝ કરવામાં આવ્યા હતા. વિઝ્યુલાઇઝેશન માટે, ઇન્ટરનેશનલ ઇલેક્ટ્રિક કંપની (IECO) ગ્રેડિયન્ટ ડ્રાઇવ સાથે 7 ટેસ્લા સક્રિય રીતે શિલ્ડેડ હોરિઝોન્ટલ બોરહોલ સ્કેનર બ્રુકર (બ્રુકર કોર્પ.), 120 મીમી (600 mT/m, 1000 T/m/s) ના આંતરિક વ્યાસ સાથે શિલ્ડેડ ગ્રેડિયન્ટ ઇન્સર્ટનો ઉપયોગ AVANCE નો ઉપયોગ કરીને કરવામાં આવ્યો હતો. III, આઠ-ચેનલ મલ્ટી-કોઇલ RF અને મલ્ટી-કોર ક્ષમતાઓ, અને તેની સાથે પેરાવિઝન 6.0.1 પ્લેટફોર્મ. 86 મીમીના આંતરિક વ્યાસ સાથે સક્રિય રીતે ડીકપ્લ્ડ વોલ્યુમેટ્રિક RF કોઇલ અને ફક્ત પ્રાપ્ત કરવા માટે ચાર-ચેનલ ક્રાયો-કૂલ્ડ RF કોઇલનો ઉપયોગ કરીને રેકોર્ડિંગ કરવામાં આવ્યું હતું. અક્ષીય 2D ટર્બો-રેર (પુનરાવર્તન સમય = 2500 ms, ઇકો સમય = 33 ms, 2 સરેરાશ) 16 સ્લાઇસ કેપ્ચર સાથે, સ્લાઇસ જાડાઈ 0.6–0.8 mm, જેમાં 256 × 256 નમૂનાઓ છે. 2 સેમીના આંતરિક વ્યાસ સાથે ક્વાડ્રેચર ટ્રાન્સસીવર વોલ્યુમેટ્રિક RF કોઇલનો ઉપયોગ કરીને સિગ્નલો પ્રાપ્ત થયા હતા (રેપિડ MR ઇન્ટરનેશનલ, LLC). અંતે, 3D રેન્ડરિંગ અને વોલ્યુમ વિશ્લેષણ માટે બિલ્ટ-ઇન ઇમારિસ (બિટપ્લેન) સપાટી અંદાજ કાર્યોનો ઉપયોગ કરો. સફળ ટ્રાન્સપ્લાન્ટને એક તરીકે વ્યાખ્યાયિત કરવામાં આવ્યું હતું જેમાં ટ્રાન્સપ્લાન્ટેડ ગોળાર્ધમાં સતત T2-ભારિત MRI સિગ્નલના ક્ષેત્રો રચાયા હતા. ગ્રાફ્ટ રિજેક્શનને એક ગ્રાફ્ટ તરીકે વ્યાખ્યાયિત કરવામાં આવ્યું હતું જે ટ્રાન્સપ્લાન્ટેડ ગોળાર્ધમાં સતત T2-ભારિત MRI સિગ્નલના ક્ષેત્રો ઉત્પન્ન કરતું ન હતું. સબકોર્ટિકલ t-hCO ને અનુગામી વિશ્લેષણમાંથી બાકાત રાખવામાં આવ્યું હતું.
બે-ફોટોન કેલ્શિયમ ઇમેજિંગ માટે hCO માં GCaMP6 ને સ્થિર રીતે વ્યક્ત કરવા માટે, hiPS કોષોને pLV[Exp]-EF1a::GcaMP6s-WPRE-Puro થી ચેપ લાગ્યો હતો અને ત્યારબાદ એન્ટિબાયોટિક્સ પસંદ કરવામાં આવ્યા હતા. ટૂંકમાં, કોષોને EDTA થી અલગ કરવામાં આવ્યા હતા અને પોલીબ્રેન (5 μg/ml) અને 15 μl વાયરસની હાજરીમાં આશરે 300,000 કોષોની ઘનતા પર 1 મિલી આવશ્યક 8 માધ્યમમાં સસ્પેન્ડ કરવામાં આવ્યા હતા. ત્યારબાદ કોષોને 60 મિનિટ માટે સસ્પેન્શનમાં ઉકાળવામાં આવ્યા હતા અને દરેક કૂવામાં 50,000 કોષોની ઘનતા પર બીજ આપવામાં આવ્યા હતા. સંગમ પછી, કોષોને 5-10 દિવસ માટે અથવા સ્થિર કોલોની દેખાય ત્યાં સુધી 5-10 μg ml-1 પ્યુરોમિસિનથી સારવાર આપવામાં આવી હતી. તીવ્ર hCO ચેપ અગાઉ વર્ણવ્યા મુજબ કરવામાં આવ્યો હતો5 કેટલાક ફેરફારો સાથે. ટૂંકમાં, દિવસ 30-45 hCO ને 100 μl ચેતા માધ્યમ ધરાવતી 1.5 મિલી એપેન્ડોર્ફ માઇક્રોસેન્ટ્રીફ્યુજ ટ્યુબમાં સ્થાનાંતરિત કરો. પછી આશરે 90 µl માધ્યમ દૂર કરવામાં આવે છે, 3-6 µl ઉચ્ચ ટાઇટર લેન્ટીવાયરસ (0.5 x 108 થી 1.2 x 109 સુધી) ટ્યુબમાં ઉમેરવામાં આવે છે, અને hCO ને 30 મિનિટ માટે ઇન્ક્યુબેટરમાં ટ્રાન્સફર કરવામાં આવે છે. પછી દરેક ટ્યુબમાં 90-100 µl માધ્યમ ઉમેરો અને ટ્યુબને રાતોરાત ઇન્ક્યુબેટરમાં પાછી આપો. બીજા દિવસે, ઓછી જોડાણ પ્લેટોમાં તાજા ચેતા માધ્યમમાં hCO ટ્રાન્સફર કરો. 7 દિવસ પછી, ચેપ ગુણવત્તાના વિઝ્યુલાઇઝેશન અને મૂલ્યાંકન માટે hCO ને 24-કુવા કાચની નીચેની પ્લેટમાં ટ્રાન્સફર કરવામાં આવ્યું. pLV[Exp]-SYN1::EYFP-WPRE અને pLV[Exp]-SYN1::hChR2-EYFP-WPRE વેક્ટરબિલ્ડર દ્વારા જનરેટ કરવામાં આવ્યા હતા. મોટાભાગના પ્રયોગોમાં લેન્ટીવાયરસનો ઉપયોગ થાય છે કારણ કે તે હોસ્ટ જીનોમમાં સંકલિત છે, જે ચેપગ્રસ્ત કોષ રેખાઓમાં રિપોર્ટર જનીન અભિવ્યક્તિને મંજૂરી આપે છે. હડકવા ફોલો-અપ માટે, 30-45 દિવસ hCO ને હડકવા-ΔG-eGFP અને AAV-DJ-EF1a-CVS-G-WPRE-pGHpA (પ્લાઝમિડ #67528, એડજીન) સાથે સહ-સંક્રમિત કરવામાં આવ્યું હતું, 3 દિવસ સુધી સારી રીતે ધોવામાં આવ્યું હતું, અને S1 માં ઉંદરોમાં ટ્રાન્સપ્લાન્ટ કરવામાં આવ્યું હતું અને 7-14 દિવસ માટે ઇન વિવો રાખવામાં આવ્યું હતું.
ઇમ્યુનોસાયટોકેમિસ્ટ્રી માટે, પ્રાણીઓને એનેસ્થેટાઇઝ કરવામાં આવ્યા હતા અને ટ્રાન્સકાર્ડિયલી પરફ્યુઝ કરવામાં આવ્યા હતા અને ત્યારબાદ 4% પેરાફોર્માલ્ડિહાઇડ (PBS માં PFA; ઇલેક્ટ્રોન માઇક્રોસ્કોપી સાયન્સ) આપવામાં આવ્યું હતું. મગજને 4% PFA માં 2 કલાક માટે અથવા રાતોરાત 4°C પર ફિક્સ કરવામાં આવ્યા હતા, PBS માં 30% સુક્રોઝમાં 48-72 કલાક માટે ક્રાયોપ્રિઝર્વ કરવામાં આવ્યા હતા, અને 1:1, 30% સુક્રોઝમાં એમ્બેડ કરવામાં આવ્યા હતા: OCT (ટીશ્યુ-ટેક OCT કમ્પાઉન્ડ 4583, સાકુરા ફિનેટેક) અને ક્રાયોસ્ટેટ (લેઇકા) નો ઉપયોગ કરીને 30 µm પર કોરોનલ સેક્શન બનાવવામાં આવ્યા હતા. જાડા સેક્શનની ઇમ્યુનોહિસ્ટોકેમિસ્ટ્રી માટે, પ્રાણીઓને PBS થી પરફ્યુઝ કરવામાં આવ્યા હતા, અને મગજને વાઇબ્રેટોમ (લેઇકા) નો ઉપયોગ કરીને 300-400 µm પર કોરોનલ સેક્શન કરવામાં આવ્યું હતું અને સેક્શન 30 મિનિટ માટે 4% PFA સાથે ફિક્સ કરવામાં આવ્યા હતા. પછી ક્રાયોસેક્શન અથવા જાડા ભાગોને PBS વડે ધોવામાં આવ્યા, ઓરડાના તાપમાને 1 કલાક માટે બ્લોક કરવામાં આવ્યા (10% સામાન્ય ગધેડા સીરમ (NDS) અને 0.3% ટ્રાઇટોન X-100 PBS માં ભેળવવામાં આવ્યા) અને 4°C પર બ્લોકિંગ સોલ્યુશનથી બ્લોક કરવામાં આવ્યા. - ઇન્ક્યુબેશન ક્રાયોસેક્શનને રાતોરાત ઇન્ક્યુબેટ કરવામાં આવ્યા અને જાડા ભાગોને 5 દિવસ માટે ઇન્ક્યુબેટ કરવામાં આવ્યા. ઉપયોગમાં લેવાતા પ્રાથમિક એન્ટિબોડીઝ હતા: એન્ટિ-ન્યુએન (ઉંદર, 1:500; ab104224, abcam) એન્ટિ-CTIP2 (ઉંદર, 1:300; ab18465, abcam), એન્ટિ-GFAP (સસલું, 1:1,000; Z0334, ડાકો), એન્ટિ-GFP (ચિકન, 1:1,000; GTX13970, GeneTex), એન્ટિ-HNA (ઉંદર, 1:200; ab191181, abcam), એન્ટિ-ન્યુએન (સસલું, 1:500; ABN78, મિલિપોર), એન્ટિ-PDGFRA (સસલું, 1:200; sc-338, સાન્ટા ક્રુઝ), એન્ટિ-PPP1R17 (સસલું, 1:200; HPA047819, એટલાસ એન્ટિબોડીઝ), એન્ટિ-RECA-1 (ઉંદર, ૧:૫૦; ab9774, abcam), એન્ટી-SCG2 (સસલું, ૧:૧૦૦; ૨૦૩૫૭-૧-એપી, પ્રોટીનટેક), એન્ટી-SOX9 (બકરી, ૧:૫૦૦; AF3075, R&D સિસ્ટમ્સ), નેટ્રિન G1a (બકરી, ૧:૧૦૦; AF1166, R&D સિસ્ટમ્સ), એન્ટી-STEM121 (ઉંદર, ૧:૨૦૦; Y40410, ટાકારા બાયો), એન્ટી-SATB2 (ઉંદર, ૧:૫૦; ab51502, abcam), એન્ટી-GAD65/67 (સસલું, ૧:૪૦૦; ABN904, મિલિપોર) અને એન્ટી-IBA1 (બકરી, ૧:૧૦૦; ab5076, abcam). ઉપયોગમાં લેવાતા પ્રાથમિક એન્ટિબોડીઝ હતા: એન્ટિ-ન્યુએન (ઉંદર, 1:500; ab104224, abcam) એન્ટિ-CTIP2 (ઉંદર, 1:300; ab18465, abcam), એન્ટિ-GFAP (સસલું, 1:1,000; Z0334, ડાકો), એન્ટિ-GFP (ચિકન, 1:1,000; GTX13970, GeneTex), એન્ટિ-HNA (ઉંદર, 1:200; ab191181, abcam), એન્ટિ-ન્યુએન (સસલું, 1:500; ABN78, મિલિપોર), એન્ટિ-PDGFRA (સસલું, 1:200; sc-338, સાન્ટા ક્રુઝ), એન્ટિ-PPP1R17 (સસલું, 1:200; HPA047819, એટલાસ એન્ટિબોડીઝ), એન્ટિ-RECA-1 (ઉંદર, ૧:૫૦; ab9774, abcam), એન્ટી-SCG2 (સસલું, ૧:૧૦૦; ૨૦૩૫૭-૧-એપી, પ્રોટીનટેક), એન્ટી-SOX9 (બકરી, ૧:૫૦૦; AF૩૦૭૫, R&D સિસ્ટમ્સ), નેટ્રિન G1a (બકરી, ૧:૧૦૦; AF૧૧૬૬, R&D સિસ્ટમ્સ), એન્ટી-STEM૧૨૧ (માઉસ, ૧:૨૦૦; Y૪૦૪૧૦, ટાકારા બાયો), એન્ટી-SATB૨ (માઉસ, ૧:૫૦; ab૫૧૫૦૨, abcam), એન્ટી-GAD૬૫/૬૭ (સસલું, ૧:૪૦૦; ABN૯૦૪, મિલિપોર) અને એન્ટી-IBA1 (બકરી, ૧:૧૦૦; ab૫૦૭૬, abcam). Использовались следующие первичные антитела: анти-NeuN (мышиные, 1:500; ab104224, abcam), анти-CTIP2 (крысиные, abcam), 136, abcam ANTI-GFAP (кроличьи, 1:1000; Z0334, Dako), ANTI- -GFP (kuрица, 1:1000; GTX13970, GeneTex), анти-HNA (мышь, 1:200; ab19-cameu), ab19198 (ક્રોલિક, 1:500; ABN78, મિલીપોર), ANTI-PDGFRA (krolik, 1:200; sc-338, SANTA-KRUZ), ANTI-PPP1R17 (кролик, 1:200; HPA047819, એટલાસ એન્ટિબોડીઝ), ANTI-RECA-1 (мышь, 74, ab19), ANTI-SCG2 (кролик , 1:100; 20357-1-AP, Proteintech), ANTI-SOX9 (козий, 1:500; AF3075, R&D સિસ્ટમ્સ), нетрин G1a (козий, 1&100, R166; સિસ્ટમ), ANTI-STEM121 (мышиный , 1:200; Y40410, Takara Bio), ANTI-SATB2 (мышь, 1:50; ab51502, abcam), анти-GAD65/67 (кролик, 1:400; ABN904, મિલિપોર) અને анти-IBA1 (коза, 1 :100; абкама7). ઉપયોગમાં લેવાતા પ્રાથમિક એન્ટિબોડીઝ હતા: એન્ટિ-ન્યુએન (ઉંદર, 1:500; ab104224, abcam), એન્ટિ-CTIP2 (ઉંદર, 1:300; ab18465, abcam), એન્ટિ-GFAP (સસલું, 1:1000; Z0334, ડાકો), એન્ટિ-GFP (ચિકન, 1:1000; GTX13970, GeneTex), એન્ટિ-HNA (ઉંદર, 1:200; ab191181, abcam), એન્ટિ-ન્યુએન (સસલું, 1:500; ABN78, મિલિપોર), એન્ટિ-PDGFRA (સસલું, 1:200; sc-338, સાન્ટા ક્રુઝ), એન્ટિ-PPP1R17 (સસલું, 1:200; HPA047819, એટલાસ એન્ટિબોડીઝ), એન્ટિ-RECA-1 (ઉંદર, ૧:૫૦; ab9774, abcam), એન્ટી-SCG2 (સસલું, ૧:૧૦૦; ૨૦૩૫૭-૧-એપી, પ્રોટીનટેક), એન્ટી-SOX9 (બકરી, ૧:૫૦૦; AF3075, R&D સિસ્ટમ્સ), નેટ્રિન G1a (બકરી, ૧:૧૦૦; AF1166, R&D સિસ્ટમ્સ), એન્ટી-STEM121 (ઉંદર, ૧:૨૦૦; Y40410, ટાકારા બાયો), એન્ટી-SATB2 (ઉંદર, ૧:૫૦; ab51502, abcam), એન્ટી-GAD65/67 (સસલું, ૧:૪૦૦; ABN904, મિલિપોર) અને એન્ટી-IBA1 (બકરી, ૧:૧૦૦; ab5076, abkam).使用的一抗是：抗NeuN（小鼠，1:500；ab104224，abcam）抗CTIP2（大鼠,1:3 00；ab18465，abcam），抗GFAP（兔，1:1,000；Z0334,ડાકો）,抗-GF P（鸡，1:1,000；GTX13970，GeneTex）,抗HNA（小鼠,1:200；ab1911 81，abcam），抗NeuN（兔，1:500；ABN78,મિલીપોર）,抗PDGFRA（兔, 1:200；sc-338，સાન્ટા ક્રુઝ），抗PPP1R17（兔,1:200；HPA047819, એટલાસ抗体），抗RECA-1（小鼠，1:50；ab9774，abcam），抗SCG2（兔） , 1:100；20357-1-AP，Proteintech），抗SOX9（山羊，1:500；AF3075,R&D Systems）,Netrin G1a（山羊，1:100；AF1166，R&D સિસ્ટમ્સ)，抗STEM121（小鼠, 1:200;使用的一抗是：抗NeuN（小鼠，1:500；ab104224，abcam）抗CTIP2（大鼠，1 :300；ab18465，abcam），抗GFAP（兔,1:1,000；Z0334,ડાકો）,抗-GFP（鸡，1:1,000；GTX13970，GeneTex）,抗HNA（小鼠，1:200；ab 191181，abcam），抗NeuN（兔，1:500；ABN78,મિલીપોર％弔,抗1: 200；sc-338，Santa Cruz），抗PPP1R17（兔,1:200；HPA047819,એટલાસ 抗体）,抗RECA-1（小鼠，1:50；ab97）抗SC27 100；20357-1-AP，પ્રોટીનટેક），抗SOX9（山羊，1:500；AF3075,R&D સિસ્ટમ્સ），Netrin G1a（山羊，1:100；AF1166,R&0s:1166;R&0;Y40410, ટાકારા બાયો), એન્ટિ-SATB2 (ઉંદર, 1:50; ab51502, abcam), એન્ટિ-GAD65/67 (સસલું, 1:400; ABN904, મિલિપોર) અને એન્ટિ-IBA1 (બકરી, 1:100; ab5076, abcam).ઉપયોગમાં લેવાતા પ્રાથમિક એન્ટિબોડીઝ હતા: એન્ટિ-ન્યુએન (ઉંદર, 1:500; ab104224, abcam), એન્ટિ-CTIP2 (ઉંદર, 1:300; ab18465, abcam), એન્ટિ-GFAP (સસલું, 1:1000; Z0334, ડાકો). , એન્ટિ-GFP (ચિકન, 1:1000; GTX13970, GeneTex), એન્ટિ-HNA (ઉંદર, 1:200; ab191181, abcam), એન્ટિ-NeuN (સસલું, 1:500; ABN78, મિલિપોર), એન્ટિ-PDGFRA (સસલું, 1:200; sc-338, સાન્ટા ક્રુઝ), એન્ટિ-PPP1R17 (સસલું, 1:200; HPA047819, એટલાસ એન્ટિબોડી), એન્ટિ-RECA-1 (ઉંદર, 1:50; ab9774, abcam), એન્ટિ-SCG2 (સસલું), 1:100;20357-1-AP, Proteintech), ANTI-SOX9 (કોઝા, 1:500; AF3075, R&D સિસ્ટમ્સ), NETRIN G1a (коза, 1:100; AF1166, R&D સિસ્ટમ્સ), анти -STEM121, Y0121; Takara Bio), анти-SATB2 (мышь, 1:50; ab51502, abcam), анти-GAD65/67 (кролик, 1:400; ABN904, મિલિપોર) и анти-IBA1 (коза, 1:100, бама6); 20357-1-AP, પ્રોટીનટેક), એન્ટિ-SOX9 (બકરી, 1:500; AF3075, R&D સિસ્ટમ્સ), નેટ્રિન G1a (બકરી, 1:100; AF1166, R&D સિસ્ટમ્સ), એન્ટિ-STEM121 (ઉંદર, 1:200; Y40410, ટાકારા બાયો), એન્ટિ-SATB2 (ઉંદર, 1:50; ab51502, abcam), એન્ટિ-GAD65/67 (સસલું, 1:400; ABN904, મિલિપોર), અને એન્ટિ-IBA1 (બકરી, 1:100; ab5076, abkam).ત્યારબાદ વિભાગોને PBS થી ધોવામાં આવ્યા હતા અને ઓરડાના તાપમાને (સ્થિર વિભાગો) અથવા 4°C (જાડા વિભાગો) પર 1 કલાક માટે ગૌણ એન્ટિબોડી સાથે ઉકાળવામાં આવ્યા હતા. એલેક્સા ફ્લોર સેકન્ડરી એન્ટિબોડી (લાઇફ ટેક્નોલોજીસ) 1:1000 માં પાતળું બ્લોકિંગ સોલ્યુશનનો ઉપયોગ કરવામાં આવ્યો હતો. PBS થી ધોવા પછી, ન્યુક્લીને હોચસ્ટ 33258 (લાઇફ ટેક્નોલોજીસ) સાથે વિઝ્યુઅલાઈઝ કરવામાં આવ્યા હતા. અંતે, સ્લાઇડ્સને એક્વામાઉન્ટ (પોલિસાયન્સ) નો ઉપયોગ કરીને કવરસ્લિપ્સ (ફિશર સાયન્ટિફિક) સાથે માઇક્રોસ્કોપ પર મૂકવામાં આવી હતી અને છબી પર કીન્સ ફ્લોરોસન્ટ માઇક્રોસ્કોપ (BZ-X વિશ્લેષક) અથવા લેઇકા TCS SP8 કોન્ફોકલ માઇક્રોસ્કોપ (લાસ-X) પર વિશ્લેષણ કરવામાં આવ્યું હતું. છબીઓને ImageJ પ્રોગ્રામ (Fiji) નો ઉપયોગ કરીને પ્રક્રિયા કરવામાં આવી હતી. t-hCO અને ઉંદર કોર્ટેક્સમાં માનવ ચેતાકોષોના પ્રમાણને માપવા માટે, t-hCO ના કેન્દ્રમાં, ઉંદર કોર્ટેક્સની ધાર પર અથવા તેની નજીક 387.5 μm પહોળી લંબચોરસ છબીઓ લેવામાં આવી હતી. પેશી પારદર્શિતામાં ફેરફાર, HNA+ ન્યુક્લી અને/અથવા પેશી ઓટોફ્લોરોસેન્સની હાજરીનું મૂલ્યાંકન કરીને ગ્રાફ્ટ માર્જિન નક્કી કરવામાં આવ્યા હતા. દરેક છબીમાં, NeuN+ અને HNA+ કોષોની કુલ સંખ્યાને તે જ વિસ્તારમાં NeuN+ કોષોની કુલ સંખ્યા દ્વારા વિભાજીત કરવામાં આવી હતી. છબી સમતલમાં ન્યુક્લી ધરાવતા કોષોની ગણતરી કરવામાં આવે તેની ખાતરી કરવા માટે, ગણતરીમાં ફક્ત Hoechst+ કોષોનો જ સમાવેશ કરવામાં આવ્યો છે. આંકડાકીય ભૂલ ઘટાડવા માટે ઓછામાં ઓછા 1 મીમીથી અલગ પડેલી બે છબીઓનું સરેરાશ કરવામાં આવ્યું હતું.
નમૂના સંગ્રહના એક અઠવાડિયા પહેલા, hCO ટ્રાન્સપ્લાન્ટ પ્રાણીઓ (લગભગ 8 મહિનાના ભિન્નતા) ને સંવેદનાત્મક ઉત્તેજનાને ઘટાડવા માટે મૂછો કાપીને અંધારાવાળા ઓરડામાં મૂકો. અગાઉ વર્ણવ્યા મુજબ, કેટલાક ફેરફારો સાથે, ન્યુક્લીનું અલગકરણ કરવામાં આવ્યું હતું. ટૂંકમાં, t-hCO અને hCO ને ડિટર્જન્ટ-મિકેનિકલ સેલ લિસિસ અને 2 મિલી ગ્લાસ ટીશ્યુ ગ્રાઇન્ડર (D8938, સિગ્મા-એલ્ડ્રિચ/કિમ્બલ) નો ઉપયોગ કરીને નાશ કરવામાં આવ્યો હતો. ત્યારબાદ ક્રૂડ ન્યુક્લીને 40 µm ફિલ્ટરનો ઉપયોગ કરીને ફિલ્ટર કરવામાં આવ્યા હતા અને સુક્રોઝ ડેન્સિટી ગ્રેડિયન્ટ કરતા પહેલા 4 °C પર 10 મિનિટ માટે 320 ગ્રામ પર સેન્ટ્રીફ્યુજ કરવામાં આવ્યા હતા. સેન્ટ્રીફ્યુગેશન સ્ટેપ (4°C પર 20 મિનિટ માટે 320 ગ્રામ), નમૂનાઓને 0.2 યુનિટ µl-1 RNase ઇન્હિબિટર (40 u µl-1, AM2682, એમ્બિયન) ના ઉમેરા સાથે 0.04% BSA/PBS માં ફરીથી સસ્પેન્ડ કરવામાં આવ્યા હતા અને 40 µm ફ્લો ફિલ્ટરમાંથી પસાર કરવામાં આવ્યા હતા. ત્યારબાદ વિખરાયેલા ન્યુક્લીને 0.02% BSA ધરાવતા PBS માં ફરીથી સસ્પેન્ડ કરવામાં આવ્યા અને ક્રોમિયમ સિંગલ સેલ 3′ ચિપ પર લોડ કરવામાં આવ્યા (પ્રતિ લેન 8,000 કોષોની અંદાજિત પુનઃપ્રાપ્તિ). snRNA-seq લાઇબ્રેરીઓ ક્રોમિયમ સિંગલ સેલ 3′ GEM, લાઇબ્રેરી અને જેલ બીડ કિટ v3 (10x જીનોમિક્સ) સાથે તૈયાર કરવામાં આવી હતી. snRNA-seq લાઇબ્રેરીઓ ક્રોમિયમ સિંગલ સેલ 3′ GEM, લાઇબ્રેરી અને જેલ બીડ કિટ v3 (10x જીનોમિક્સ) સાથે તૈયાર કરવામાં આવી હતી. Библиотеки snRNA-seq были приготовлены с помощью ક્રોમિયમ સિંગલ સેલ 3′ GEM, લાઇબ્રેરી અને જેલ બીડ કિટ v3 (10x જીનોમિક્સ). snRNA-seq લાઇબ્રેરીઓ ક્રોમિયમ સિંગલ સેલ 3′ GEM, લાઇબ્રેરી અને જેલ બીડ કિટ v3 (10x જીનોમિક્સ) નો ઉપયોગ કરીને તૈયાર કરવામાં આવી હતી. snRNA-seq 文库是使用Chromium સિંગલ સેલ 3′ GEM、Library & Gel Bead Kit v3 (10x જિનોમિક્સ) 制备的. snRNA-seq 文库是使用Chromium સિંગલ સેલ 3′ GEM、Library & Gel Bead Kit v3 (10x જિનોમિક્સ) 制备的. Библиотеку snRNA-seq готовили с использованием ક્રોમિયમ સિંગલ સેલ 3′ GEM, લાઇબ્રેરી અને જેલ બીડ કિટ v3 (10x જીનોમિક્સ). snRNA-seq લાઇબ્રેરી ક્રોમિયમ સિંગલ સેલ 3′ GEM, લાઇબ્રેરી અને જેલ બીડ કિટ v3 (10x જીનોમિક્સ) નો ઉપયોગ કરીને તૈયાર કરવામાં આવી હતી.વિવિધ નમૂનાઓમાંથી લાઇબ્રેરીઓને એડમેરા હેલ્થ દ્વારા નોવાસેક S4 (ઇલ્યુમિના) પર એકત્રિત અને ક્રમબદ્ધ કરવામાં આવી હતી.
દરેક પુટેટિવ ન્યુક્લિયર બારકોડ માટે જનીન અભિવ્યક્તિ સ્તરો 10x જીનોમિક્સ સેલરેન્જર વિશ્લેષણ સોફ્ટવેર પેકેજ (સંસ્કરણ 6.1.2) નો ઉપયોગ કરીને માપવામાં આવ્યા હતા. ખાસ કરીને, રીડ્સને માનવ (GRCh38, એન્સેમ્બલ, સંસ્કરણ 98) અને ઉંદર (Rnor_6.0, એન્સેમ્બલ, સંસ્કરણ 100) સંદર્ભ જીનોમના સંયોજન સામે મેચ કરવામાં આવ્યા હતા જે mkref આદેશ સાથે બનાવવામાં આવ્યા હતા અને –include-introns=TRUE આદેશ સાથે ગણતરીનો ઉપયોગ કરીને ઇન્ટ્રોન પ્રદેશોમાં મેપ કરેલા રીડિંગ્સનો સમાવેશ થાય છે. t-hCO નમૂનાઓ માટે, રૂઢિચુસ્ત જરૂરિયાતના આધારે માનવ ન્યુક્લી ઓળખવામાં આવ્યા હતા કે તમામ મેપ કરેલા રીડમાંથી ઓછામાં ઓછા 95% માનવ જીનોમ સાથે મેળ ખાય છે. બધા અનુગામી વિશ્લેષણો R પેકેજ (સંસ્કરણ 4.1.2) Seurat (સંસ્કરણ 4.1.1)32 નો ઉપયોગ કરીને સેલરેન્જરમાંથી ફિલ્ટર કરેલા બારકોડ એરે આઉટપુટ પર કરવામાં આવ્યા હતા.
અનુગામી વિશ્લેષણમાં ફક્ત ઉચ્ચ ગુણવત્તાવાળા ન્યુક્લીનો જ સમાવેશ થાય છે તેની ખાતરી કરવા માટે, દરેક નમૂના માટે પુનરાવર્તિત ફિલ્ટરિંગ પ્રક્રિયા લાગુ કરવામાં આવી હતી. પ્રથમ, 1000 થી ઓછા અનન્ય જનીનો અને કુલ મિટોકોન્ડ્રિયાના 20% થી વધુ સાથે ઓછી ગુણવત્તાવાળા ન્યુક્લી ઓળખવામાં આવે છે અને દૂર કરવામાં આવે છે. ત્યારબાદ, sctransform(vst.flavor=”v2″) ફંક્શનનો ઉપયોગ કરીને નિયમિત નકારાત્મક દ્વિપદી રીગ્રેશન દ્વારા કાચા જનીન નંબર મેટ્રિક્સને સામાન્ય બનાવવામાં આવ્યું હતું, જેણે ડિફોલ્ટ પરિમાણોનો ઉપયોગ કરીને 3000 સૌથી વધુ ચલ જનીનોને પણ ઓળખ્યા હતા. 30 ના ડેટા સેટ પરિમાણનો ઉપયોગ કરીને ડિફોલ્ટ પરિમાણો સાથે પ્રિન્સિપલ કમ્પોનન્ટ એનાલિસિસ (PCA) નો ઉપયોગ કરીને ઉપલા ચલ જનીનો પર પરિમાણ ઘટાડો કરવામાં આવ્યો હતો (ઘૂંટણની સાઇટ્સના દ્રશ્ય નિરીક્ષણના આધારે ડિમ્સ = 30 પસંદ કરવામાં આવ્યું હતું અને બધા નમૂનાઓ અને એન્સેમ્બલ વિશ્લેષણ માટે ઉપયોગમાં લેવાયું હતું). ત્યારબાદ અમે અસામાન્ય રીતે ઓછી જનીન ગણતરી (10મા પર્સેન્ટાઇલથી નીચે મધ્યક), અસામાન્ય રીતે ઉચ્ચ મિટોકોન્ડ્રીયલ જનીન ગણતરી (95મા પર્સેન્ટાઇલથી ઉપર મધ્યક) ના આધારે જનીનોને વર્ગીકૃત કરવા માટે પુનરાવર્તિત ક્લસ્ટરિંગ (રીઝોલ્યુશન = 1) ના ઘણા રાઉન્ડ કર્યા જેથી ઓછી ગુણવત્તાવાળા પુટેટીવ કોષોને ઓળખી શકાય અને દૂર કરી શકાય. DoubletFinder33 પેકેજ (95મા પર્સેન્ટાઇલથી ઉપર સરેરાશ DoubletFinder સ્કોર) નો ઉપયોગ કરીને ઓળખાયેલા શંકાસ્પદ જોડિયા બાળકોના ક્લસ્ટર અને/અથવા ઉચ્ચ પ્રમાણ. t-hCO નમૂનાઓ (n=3) અને hCO નમૂનાઓ (n=3) અલગથી સંકલિત કરવામાં આવ્યા હતા. ઉપરોક્ત પરિમાણો સાથે ઇન્ટિગ્રેટડેટા ફંક્શન. પછી ઉપર વર્ણવ્યા મુજબ ઇન્ટિગ્રેટેડ ડેટા સેટના ગુણાત્મક ફિલ્ટરિંગનો બીજો રાઉન્ડ કરવામાં આવ્યો.
ઓછી ગુણવત્તાવાળા કર્નલોને દૂર કર્યા પછી, સંકલિત ડેટાસેટને જૂથબદ્ધ કરવામાં આવ્યું (રિઝોલ્યુશન = 0.5) અને UMAP34 વિઝ્યુલાઇઝેશન હેતુઓ માટે એમ્બેડ કરવામાં આવ્યું. દરેક ક્લસ્ટર માટે માર્કર જનીનો સામાન્યકૃત જનીન અભિવ્યક્તિ ડેટામાંથી ગણતરી કરાયેલ ડિફોલ્ટ પરિમાણો સાથે FindMarkers ફંક્શનનો ઉપયોગ કરીને નક્કી કરવામાં આવ્યા હતા. અમે માર્કર જનીન અભિવ્યક્તિ 19,20,21,35 અને એનોટેશન સાથે ગર્ભ અને પુખ્ત કોર્ટિકલ સંદર્ભ ડેટાસેટ્સને જોડીને મુખ્ય કોષ વર્ગોને ઓળખીએ છીએ અને વર્ગીકૃત કરીએ છીએ. ખાસ કરીને, MKI67 અને TOP2A ની અભિવ્યક્તિ દ્વારા પરિભ્રમણ કરનારા પૂર્વગામીઓને ઓળખવામાં આવ્યા હતા. પ્રોજેનિટર ક્લસ્ટરોને મિટોટિક ટ્રાન્સક્રિપ્ટ્સની ગેરહાજરી, લેટ મેટાફેસ ફેટલ કોર્ટેક્સમાં વર્ણવેલ મલ્ટિપોટેન્ટ ગ્લિયલ પ્રોજેનિટર ક્લસ્ટરો સાથે ઉચ્ચ ઓવરલેપ અને EGFR અને OLIG1 અભિવ્યક્તિ દ્વારા વ્યાખ્યાયિત કરવામાં આવ્યા હતા. અમે એસ્ટ્રોસાઇટ શબ્દનો ઉપયોગ એસ્ટ્રોસાઇટ ભિન્નતાની ઘણી સ્થિતિઓને સમાવિષ્ટ કરવા માટે કરીએ છીએ, લેટ રેડિયલ ગ્લિયાથી એસ્ટ્રોસાઇટ્સની પરિપક્વતા સુધી. એસ્ટ્રોસાઇટ ક્લસ્ટરો SLC1A3 અને AQP4 ના ઉચ્ચ સ્તરને વ્યક્ત કરે છે અને ગર્ભ રેડિયલ ગ્લિયા અને/અથવા પુખ્ત એસ્ટ્રોસાઇટ્સના પેટા પ્રકારો સાથે નકશા બનાવતા દર્શાવવામાં આવ્યા છે. OPCs PDGFRA અને SOX10 વ્યક્ત કરે છે જ્યારે ઓલિગોડેન્ડ્રોસાઇટ્સ માયલિનેશન માર્કર્સ (MOG અને MYRF) વ્યક્ત કરે છે. ગ્લુટામેટર્જિક ચેતાકોષો ન્યુરોનલ ટ્રાન્સક્રિપ્ટ્સ (SYT1 અને SNAP25), GABAergic માર્કર્સ (GAD2) ની ગેરહાજરી અને NEUROD6, SLC17A7, BCL11B, અથવા SATB2 ની અભિવ્યક્તિ દ્વારા ઓળખવામાં આવ્યા હતા. GluN ચેતાકોષોને વધુ ઉપલા (SATB2 અભિવ્યક્તિ અને BCL11B નું નુકસાન) અને ઊંડા (BCL11B અભિવ્યક્તિ) પેટા વર્ગોમાં વિભાજિત કરવામાં આવ્યા હતા. પુટેટિવ સબપ્લેટ (SP) ચેતાકોષો ઊંડા GluN માર્કર્સ ઉપરાંત ST18 અને SORCS1 જેવા જાણીતા SP18 માર્કર્સ વ્યક્ત કરે છે. કોરોઇડ પ્લેક્સસ જેવા કોષો TTR અભિવ્યક્તિ દ્વારા ઓળખવામાં આવ્યા હતા, અને મેનિન્જિયલ જેવા કોષો ફાઇબ્રોબ્લાસ્ટ-સંકળાયેલ જનીનો અને સંદર્ભ ડેટા સેટના મેપ કરેલા પાયલ/વેસ્ક્યુલર કોષો વ્યક્ત કરે છે.
લિબ્રા આર પેકેજ (સંસ્કરણ 1.0.0) નો ઉપયોગ કરીને અમલમાં મુકાયેલા નમૂનાઓમાં પુનઃઉત્પાદિત નવી વિકસિત સ્યુડો-બેચ પદ્ધતિનો ઉપયોગ કરીને t-hCO અને hCO પેટા વર્ગો વચ્ચે જનીન અભિવ્યક્તિનું વિભેદક વિશ્લેષણ કરવામાં આવ્યું હતું. ખાસ કરીને, edgeR લોગ-સંભવના પરીક્ષણો (સંસ્કરણ 3.36.0, પેકેજ R) દરેક નમૂના પ્રતિકૃતિ માટે આપેલ કોષ વર્ગ માટે કોષોમાં જનીનોની સંખ્યાનો સારાંશ આપીને જૂથો માટે કરવામાં આવ્યા હતા. હીટમેપ વિઝ્યુલાઇઝેશન માટે, edgeR (cpm() ફંક્શન) નો ઉપયોગ કરીને નોર્મલાઇઝ્ડ પ્રતિ મિલિયન (CPM) મૂલ્યોની ગણતરી કરવામાં આવે છે અને સ્કેલ કરવામાં આવે છે (સરેરાશ = 0, પ્રમાણભૂત વિચલન = 1 પ્રાપ્ત કરવા માટે). નોંધપાત્ર રીતે અપરેગ્યુલેટેડ t-hCO GluN જનીનોનું જનીન ઓન્ટોલોજી (GO) સંવર્ધન વિશ્લેષણ કરવામાં આવ્યું હતું (બેન્જામિન-હોચબર્ગે t-hCO GluN કોષોના ઓછામાં ઓછા 10% માં વ્યક્ત કરાયેલ 0.05 કરતા ઓછાનું સુધારેલું P મૂલ્ય અને ઓછામાં ઓછા 2 ગણો ફેરફાર વધારો). ToppGene Suite (https://toppgene.cchmc.org/)37 નો ઉપયોગ કરીને કરવામાં આવ્યું હતું. અમે ડિફોલ્ટ પરિમાણો સાથે ToppFun એપ્લિકેશનનો ઉપયોગ કરીએ છીએ અને GO-એનોટેટેડ હાઇપરજીઓમેટ્રિક પરીક્ષણોમાંથી ગણતરી કરાયેલ બેન્જામિની-હોચબર્ગ-સુધારેલા P-મૂલ્યોનો અહેવાલ આપીએ છીએ.
પ્રાથમિક સિંગલ-સેલ RNA-seq અથવા પુખ્ત snRNA-seq19,20,21,22 ના સંદર્ભ અભ્યાસોમાંથી અમારા snRNA-seq ક્લસ્ટરોને એનોટેટેડ સેલ ક્લસ્ટરો સાથે મેચ કરવા માટે, અમે જોડી કરેલ ડેટાસેટ એકીકરણ અભિગમ લાગુ કર્યો. અમે ડેટાસેટ્સ વચ્ચે ક્લસ્ટર ઓવરલેપ્સને એકીકૃત કરવા અને તેની તુલના કરવા માટે Seurat માં SCTransform (v2) નોર્મલાઇઝેશન વર્કફ્લોનો ઉપયોગ કર્યો (ઉપરના સમાન પરિમાણોનો ઉપયોગ કરીને). ગણતરીત્મક કાર્યક્ષમતા માટે વ્યક્તિગત ડેટાસેટ્સને મૂળ ક્લસ્ટર દીઠ 500 કોષો અથવા કોરો સુધી રેન્ડમલી સબસેટ કરવામાં આવ્યા હતા. અગાઉ વર્ણવ્યા મુજબ સમાન અભિગમનો ઉપયોગ કરીને, ક્લસ્ટર ઓવરલેપને દરેક પૂલ્ડ ક્લસ્ટરમાં કોષો અથવા ન્યુક્લીના પ્રમાણ તરીકે વ્યાખ્યાયિત કરવામાં આવ્યું હતું જે સંદર્ભ ક્લસ્ટરના લેબલ સાથે ઓવરલેપ થાય છે. GluN ને વધુ વર્ગીકૃત કરવા માટે, અમે અમારા GluN કોષોને સંદર્ભ ડેટાસેટ લેબલ્સ સોંપવા માટે GluN સબસેટ ડેટા માટે Seurat ના TransferData વર્કફ્લોનો ઉપયોગ કર્યો.
t-hCO અને hCO નમૂનાઓના વૈશ્વિક ટ્રાન્સક્રિપ્ટોમની પરિપક્વતા સ્થિતિનું મૂલ્યાંકન કરવા માટે, અમે અમારા સ્યુડો-બલ્ક નમૂનાઓની તુલના BrainSpan/psychENCODE23 સાથે કરી, જેમાં માનવ મગજના વિકાસને આવરી લેતા મોટા RNA ક્રમનો સમાવેશ થાય છે. અમે ગર્ભધારણના 10 અઠવાડિયા પછી અને પછી, 5567 જનીનો (અમારા ડેટા સાથે) માં કોર્ટિકલ નમૂનાઓમાંથી સંયુક્ત પેટર્ન-નોર્મલાઇઝ્ડ જનીન અભિવ્યક્તિ મેટ્રિક્સ પર PCA કર્યું જે અગાઉ BrainSpan કોર્ટિકલ નમૂનાઓમાં સક્રિય તરીકે ઓળખાયા હતા (ક્યુબિક મોડેલનો ઉપયોગ કરીને ઉંમર દ્વારા સમજાવાયેલ વિકાસલક્ષી ભિન્નતામાં 50% કરતા વધુ તરીકે વ્યાખ્યાયિત)38. વધુમાં, અમે અગાઉ વર્ણવ્યા મુજબ બિન-નકારાત્મક મેટ્રિક્સ ફેક્ટરાઇઝેશનનો ઉપયોગ કરીને ન્યુરોડેવલપમેન્ટના મુખ્ય ટ્રાન્સક્રિપ્ટોમ સહીઓ સાથે સંકળાયેલા જનીનો મેળવ્યા. બિન-નકારાત્મક મેટ્રિક્સ ફેક્ટરાઇઝેશન પ્રક્રિયાનો ઉપયોગ કરીને ગણતરી કરાયેલ નમૂના વજન ઝુ એટ અલ.38 દ્વારા વર્ણવેલ પાંચ સહીઓમાંથી દરેક માટે વિસ્તૃત ડેટા સાથે આકૃતિ 5b માં પ્લોટ કરવામાં આવ્યા છે. ફરીથી, પ્રવૃત્તિ આધારિત ટ્રાન્સક્રિપ્શનલ માર્કર્સ અગાઉ પ્રકાશિત અભ્યાસોમાંથી મેળવવામાં આવ્યા હતા. ખાસ કરીને, પૂરક કોષ્ટક 3 Hrvatin et al.16 માંથી દ્રશ્ય ઉત્તેજના પછી માઉસ વિઝ્યુઅલ કોર્ટેક્સ snRNA-seq સંગ્રહ દ્વારા ઓળખાયેલા ગ્લુટામેટર્જિક ન્યુરોન્સમાં ERG અને LRG નોંધપાત્ર રીતે અપરેગ્યુલેટ થયા હતા. માનવ-સમૃદ્ધ LRGs KCl-સક્રિય માનવ ગર્ભ મગજ સંસ્કૃતિઓમાંથી મેળવવામાં આવ્યા હતા અને ઉત્તેજના પછી 6 કલાક કાપવામાં આવ્યા હતા, અને ફિલ્ટર કરેલા જનીનો માનવોમાં નોંધપાત્ર રીતે અપરેગ્યુલેટ થયા હતા પરંતુ ઉંદરોમાં નહીં (પૂરક કોષ્ટક 4). આ જનીન સેટનો ઉપયોગ કરીને જનીન સેટ સંવર્ધનનું વિશ્લેષણ એક-માર્ગી ફિશરના ચોક્કસ પરીક્ષણનો ઉપયોગ કરીને કરવામાં આવ્યું હતું.
ઉંદરોને આઇસોફ્લુરેનથી એનેસ્થેટાઇઝ કરો, મગજ દૂર કરો અને ઠંડા (આશરે 4°C) ઓક્સિજનયુક્ત (95% O2 અને 5% CO2) સુક્રોઝ દ્રાવણમાં મૂકો જેમાં 234 mM સુક્રોઝ, 11 mM ગ્લુકોઝ, 26 mM NaHCO3, 2.5 mM KCl, 1.25 mM. NaH2PO4, 10 mM MgSO4 અને 0.5 mM CaCl2 (લગભગ 310 mOsm) હોય તેવા વિભાગો હોય. ઉંદરોના મગજના કોરોનલ વિભાગો (300-400 µm) જેમાં t-hCO2 હોય છે તે અગાઉ વર્ણવ્યા મુજબ Leica VT1200 વાઇબ્રેટોમનો ઉપયોગ કરીને બનાવવામાં આવ્યા હતા39. ત્યારબાદ વિભાગોને સતત ઓરડાના તાપમાને ઓક્સિજનેશન ધરાવતા સેક્શનિંગ ચેમ્બરમાં સ્થાનાંતરિત કરવામાં આવ્યા હતા જેમાં aCSF તૈયાર કરવામાં આવ્યું હતું: 10 mM ગ્લુકોઝ, 26 mM NaHCO3, 2.5 mM KCl, 1.25 mM NaHPO4, 1 mM MgSO4, 2 mM CaCl2 અને 126 mM NaCl (298 mOsm). રેકોર્ડિંગના ઓછામાં ઓછા 45 મિનિટ પહેલા. વિભાગોને ડૂબેલા ચેમ્બરમાં રેકોર્ડ કરવામાં આવ્યા હતા જ્યાં તેમને aCSF (95% O2 અને 5% CO2 શીશી) સાથે સતત પરફ્યુઝ કરવામાં આવ્યા હતા. બધા ડેટા ઓરડાના તાપમાને રેકોર્ડ કરવામાં આવ્યા હતા. t-hCO ન્યુરોન્સને 127 mM પોટેશિયમ ગ્લુકોનેટ, 8 mM NaCl, 4 mM મેગ્નેશિયમ ATP, 0.3 mM સોડિયમ GTP, 10 mM HEPES અને 0.6 mM EGTA, pH 7.2, KOH (290 mOsm) સાથે સમાયોજિત આંતરિક દ્રાવણ ધરાવતા દ્રાવણથી ભરેલા બોરોસિલિકેટ ગ્લાસ પીપેટથી સમાપ્ત કરવામાં આવ્યા હતા. પુનઃપ્રાપ્તિ માટે, રેકોર્ડિંગ સોલ્યુશનમાં બાયોસાયટીન (0.2%) ઉમેરવામાં આવ્યું.
ડેટા મલ્ટિક્લેમ્પ 700B એમ્પ્લીફાયર (મોલેક્યુલર ડિવાઇસીસ) અને ડિજિડેટા 1550B ડિજિટાઇઝર (મોલેક્યુલર ડિવાઇસીસ) નો ઉપયોગ કરીને મેળવવામાં આવ્યો હતો, 2 kHz પર લો-પાસ ફિલ્ટર કરવામાં આવ્યો હતો, 20 kHz પર ડિજિટાઇઝ કરવામાં આવ્યો હતો અને Clampfit (મોલેક્યુલર ડિવાઇસીસ), ઓરિજિન (ઓરિજિનપ્રો). 2021b, ઓરિજિનલેબ). અને કસ્ટમ MATLAB ફંક્શન્સ (મેથવર્ક્સ) નો ઉપયોગ કરીને વિશ્લેષણ કરવામાં આવ્યું હતું. JPCalc નો ઉપયોગ કરીને જંકશન પોટેન્શિયલની ગણતરી કરવામાં આવી હતી અને એન્ટ્રીઓને -14 mV ના ગણતરી કરેલ મૂલ્યમાં ગોઠવવામાં આવી હતી. ઓપરેશન IV માં -250 થી 750 pA સુધીના 10-25 pA સ્ટેપ્સમાં વર્તમાન સ્ટેપ્સની શ્રેણીનો સમાવેશ થાય છે.
અગાઉ વર્ણવ્યા મુજબ, hCO ચેતાકોષોના પેચ-ક્લેમ્પ રેકોર્ડિંગ દરમિયાન થેલેમસ, શ્વેત દ્રવ્ય અને S1 એફેરન્ટ્સને થેલેમોકોર્ટિકલ સ્લાઇસેસમાં વિદ્યુત રીતે ઉત્તેજિત કરવામાં આવ્યા હતા. ટૂંકમાં, મગજને 10° ના ખૂણા પર નમેલા 3D પ્રિન્ટિંગ ટેબલ પર મૂકવામાં આવ્યું હતું, અને મગજનો આગળનો ભાગ 35° ના ખૂણા પર કાપવામાં આવ્યો હતો. ત્યારબાદ મગજને કાપેલી સપાટી પર ગુંદર કરવામાં આવ્યું હતું અને તેને વિભાજિત કરવામાં આવ્યું હતું, જેનાથી થેલેમોકોર્ટિકલ બહાર નીકળેલા ચેતાક્ષો સાચવવામાં આવ્યા હતા. બાયપોલર ટંગસ્ટન ઇલેક્ટ્રોડ્સ (0.5 MΩ) બીજા માઇક્રોમેનિપ્યુલેટર પર માઉન્ટ કરવામાં આવ્યા હતા અને કોષ દીઠ ચાર પ્રદેશો (આંતરિક કેપ્સ્યુલ, શ્વેત દ્રવ્ય, S1 અને hCO) ને ઉત્તેજીત કરવા માટે વ્યૂહાત્મક રીતે સ્થિત કરવામાં આવ્યા હતા. 0.03–0.1 Hz પર 300 µA ફેસિક ઉત્તેજના પછી સિનેપ્ટિક પ્રતિભાવો રેકોર્ડ કરો.
hChR2-અભિવ્યક્ત hCO ચેતાકોષોને 480 nm પર સક્રિય કરવામાં આવ્યા હતા અને કોષોની નજીક hChR2 અભિવ્યક્તિ રેકોર્ડ કરવા માટે LED (પ્રિઝમેટિક્સ) દ્વારા ઉત્પન્ન થતા પ્રકાશ પલ્સને ×40 ઉદ્દેશ્ય (0.9 NA; ઓલિમ્પસ) દ્વારા લાગુ કરવામાં આવ્યા હતા. પ્રકાશિત ક્ષેત્ર વ્યાસ આશરે 0.5 mm છે અને કુલ શક્તિ 10-20 mW છે. પલ્સ પહોળાઈ 10 ms પર સેટ કરવામાં આવી હતી, જે વર્તણૂકીય શિક્ષણ પ્રયોગ દરમિયાન આપવામાં આવેલા પલ્સને અનુરૂપ છે. 1 થી 20 Hz સુધીની વિવિધ ઉત્તેજના ફ્રીક્વન્સીઝનો ઉપયોગ કરવામાં આવ્યો હતો, પરંતુ શ્રેણીના ફક્ત પ્રથમ પલ્સનો ઉપયોગ જથ્થાત્મકતા માટે કરવામાં આવ્યો હતો. સિનેપ્ટિક અવરોધક અથવા સુવિધાજનક માર્ગો પર અસર ઘટાડવા માટે ટ્રેનો વચ્ચેના અંતરાલ સામાન્ય રીતે 30 s કરતા વધુ લાંબા હોય છે. hChR2 પ્રતિભાવ મોનોસિનેપ્ટિક હતો કે કેમ તે ચકાસવા માટે, અમે EPSC પ્રતિક્રિયા અદૃશ્ય થઈ જાય ત્યાં સુધી બાથમાં TTX (1 μM) લાગુ કર્યું, અને પછી 4-એમિનોપાયરિડિન (4-AP; 100 μM) લાગુ કર્યું. સામાન્ય રીતે, LED ફાયરિંગ અને EPSC જનરેશન વચ્ચે થોડો લાંબો વિલંબ થાય છે, જેમાં થોડી મિનિટોમાં પ્રતિભાવ પાછો આવે છે. પ્રતિભાવ AMPA રીસેપ્ટર્સ દ્વારા સંચાલિત છે કે કેમ તે ચકાસવા માટે NBQX (10 μM) નો ઉપયોગ કરવામાં આવ્યો હતો.
અગાઉ વર્ણવ્યા મુજબ શાર્પ hCO વિભાગો બનાવવામાં આવ્યા હતા. ટૂંકમાં, hCO વિભાગો 4% એગારોઝમાં એમ્બેડ કરવામાં આવ્યા હતા અને 126 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM NaH2PO4, 1 mM MgSO4, 2 mM CaCl2, 26 mM NaHCO3 અને 10 mM d-(+) -ગ્લુકોઝ ધરાવતા કોષોમાં સ્થાનાંતરિત કરવામાં આવ્યા હતા. વિભાગોને Leica VT1200 વાઇબ્રેટરનો ઉપયોગ કરીને ઓરડાના તાપમાને 200-300 µm પર કાપવામાં આવ્યા હતા અને ઓરડાના તાપમાને ASF માં સંગ્રહિત કરવામાં આવ્યા હતા. પછી, સીધા સ્લાઇસસ્કોપ માઇક્રોસ્કોપ (સાયન્ટિફિકા) હેઠળ hCO વિભાગો પર આખા કોષોનું પેચ-કેમ્પ રેકોર્ડિંગ કરવામાં આવ્યું હતું. વિભાગોને aCSF (95% O2 અને 5% CO2) સાથે પરફ્યુઝ કરવામાં આવ્યા હતા અને ઓરડાના તાપમાને કોષ સંકેતો રેકોર્ડ કરવામાં આવ્યા હતા. ૧૨૭ mM પોટેશિયમ ગ્લુકોનેટ, ૮ mM NaCl, ૪ mM મેગ્નેશિયમ ATP, ૦.૩ mM સોડિયમ GTP, ૧૦ mM HEPES, અને ૦.૬ mM EGTA, આંતરિક pH ૭, ૨, KOH (ઓસ્મોલેરિટી ૨૯૦) સાથે સમાયોજિત દ્રાવણથી ભરેલા બોરોસિલિકેટ ગ્લાસ પીપેટનો ઉપયોગ કરીને hCO ન્યુરોન્સ લાગુ કરવામાં આવ્યા હતા. પુનઃપ્રાપ્તિ હેતુઓ માટે, આંતરિક દ્રાવણમાં ૦.૨% બાયોસાયટિન ઉમેરો.
ક્લેમ્પેક્સ (ક્લેમ્પેક્સ 11.1, મોલેક્યુલર ડિવાઇસીસ) દ્વારા મલ્ટિક્લેમ્પ 700B એમ્પ્લીફાયર (મોલેક્યુલર ડિવાઇસીસ) અને ડિજિડેટા 1550B ડિજિટાઇઝર (મોલેક્યુલર ડિવાઇસીસ) નો ઉપયોગ કરીને ડેટા મેળવવામાં આવ્યો હતો, 2 kHz પર લો-પાસ ફિલ્ટર કરવામાં આવ્યો હતો, 20 kHz પર ડિજિટાઇઝ્ડ કરવામાં આવ્યો હતો, અને વિશ્લેષણ માટે ક્લેમ્પફિટ (વર્ઝન 10.6) નો ઉપયોગ કરીને વિશ્લેષણ કરવામાં આવ્યું હતું, મોલેક્યુલર ડિવાઇસીસ) અને કસ્ટમ MATLAB ફંક્શન્સ (MATLAB 2019b, Mathworks). JPCalc નો ઉપયોગ કરીને જંકશન પોટેન્શિયલની ગણતરી કરવામાં આવી હતી અને એન્ટ્રીઓને -14 mV ની ગણતરી કરેલ જંકશન પોટેન્શિયલ સાથે ગોઠવવામાં આવી હતી. ઓપરેશન IV માં -50 થી 250 pA સુધીના 5-10 pA સ્ટેપ્સમાં વર્તમાન સ્ટેપ્સની શ્રેણીનો સમાવેશ થાય છે.
પિંચ્ડ ચેતાકોષોના મોર્ફોલોજિકલ પુનર્નિર્માણ માટે, આંતરિક દ્રાવણમાં 0.2% બાયોસાયટીન (સિગ્મા-એલ્ડ્રિચ) ઉમેરવામાં આવ્યું હતું. હેકિંગ પછી કોષોને ઓછામાં ઓછા 15 મિનિટ માટે પ્રાઇમ કરવામાં આવે છે. ત્યારબાદ રજિસ્ટર્ડ મેમ્બ્રેન સંપૂર્ણપણે સીલ ન થાય ત્યાં સુધી પિપેટને 1-2 મિનિટ માટે ધીમે ધીમે ખેંચવામાં આવે છે. સેક્શન ફિઝિયોલોજી પ્રક્રિયાને અનુસરીને, સેક્શનને 4% PFA માં 4° C પર રાતોરાત ઠીક કરવામાં આવ્યા હતા, PBS X3 થી ધોવામાં આવ્યા હતા, અને સ્ટ્રેપ્ટાવિડિન-કન્જુગેટેડ ડાયલાઇટ 549 અથવા ડાયલાઇટ 405 (વેક્ટર લેબ્સ) સાથે 1:1000 પાતળું કરવામાં આવ્યું હતું. બાયોસાયટીન (2%; સિગ્મા-એલ્ડ્રિચ) થી ભરેલા કોષોને પેચ ક્લેમ્પ રેકોર્ડિંગ દરમિયાન 2 કલાક માટે ઓરડાના તાપમાને લેબલ કરવામાં આવ્યા હતા. ત્યારબાદ સેક્શનને એક્વામાઉન્ટ (થર્મો સાયન્ટિફિક) નો ઉપયોગ કરીને માઇક્રોસ્કોપી સ્લાઇડ્સ પર માઉન્ટ કરવામાં આવ્યા હતા અને બીજા દિવસે લેઇકા TCS SP8 કોન્ફોકલ માઇક્રોસ્કોપ પર ન્યુમેરિકલ એપરચર ×40 1.3, મેગ્નિફિકેશન ×0.9–1.0, xy સાથે ઓઇલ ઇમરઝન ઓબ્જેક્ટિવનો ઉપયોગ કરીને વિઝ્યુઅલાઈઝ કરવામાં આવ્યા હતા. નમૂના લેવાનો દર આશરે 7 પિક્સેલ પ્રતિ માઇક્રોન છે. 1 µm અંતરાલ પર Z-સ્ટેક્સ ક્રમિક રીતે મેળવવામાં આવ્યા હતા, અને દરેક ન્યુરોનના સમગ્ર ડેંડ્રિટિક વૃક્ષને આવરી લેવા માટે z-સ્ટેક મોઝેઇક અને Leica-આધારિત ઓટો-સ્ટીચિંગ કરવામાં આવ્યું હતું. ત્યારબાદ neuTube 40 ઇન્ટરફેસનો ઉપયોગ કરીને ન્યુરોન્સને અર્ધ-મેન્યુઅલી ટ્રેક કરવામાં આવ્યા હતા અને SWC ફાઇલો જનરેટ કરવામાં આવી હતી. ત્યારબાદ ફાઇલોને SimpleNeuriteTracer41 Fiji પ્લગઇન (ImageJ, સંસ્કરણ 2.1.0; NIH) પર અપલોડ કરવામાં આવી હતી.
સ્ટેનફોર્ડ યુનિવર્સિટીના ઇન્સ્ટિટ્યૂશનલ રિવ્યૂ બોર્ડ દ્વારા મંજૂર કરાયેલા પ્રોટોકોલ અનુસાર માનવ કોર્ટિકલ પેશીઓ જાણકાર સંમતિથી મેળવવામાં આવ્યા હતા. રિફ્રેક્ટરી એપિલેપ્સી માટે સર્જરીના ભાગ રૂપે ફ્રન્ટલ કોર્ટેક્સ (મધ્યમ આગળનો ગાયરસ) ના રિસેક્શન દ્વારા માનવ પોસ્ટપાર્ટમ પેશીઓ (3 અને 18 વર્ષ જૂના) ના બે નમૂના મેળવવામાં આવ્યા હતા. રિસેક્શન પછી, બરફ-ઠંડા NMDG-aCSF માં પેશીઓ કાપો જેમાં શામેલ છે: 92 mM NMDG, 2.5 mM KCl, 1.25 mM NaH2PO4, 30 mM NaHCO3, 20 mM HEPES, 25 mM ગ્લુકોઝ, 2 mM થિયોરિયા, 5 mM સોડિયમ એસ્કોર્બેટ, 3 mM સોડિયમ પાયરુવેટ, 0.5 mM CaCl2 4H2O અને 10 mM MgSO4 7H2O. સાંદ્ર હાઇડ્રોક્લોરિક એસિડ સાથે pH 7.3-7.4 સુધી ટાઇટ્રેટ કરો. 30 મિનિટની અંદર પેશીઓ પ્રયોગશાળામાં પહોંચાડવામાં આવ્યા હતા અને ઉપર વર્ણવેલ પ્રક્રિયા અનુસાર કોરોનલ સેક્શન લેવામાં આવ્યા હતા.
સ્ટેનફોર્ડ યુનિવર્સિટી APLAC દ્વારા મંજૂર કરાયેલ પ્રાણી સંભાળ માર્ગદર્શિકા અનુસાર તમામ પ્રાણીઓની પ્રક્રિયાઓ કરવામાં આવી હતી. ઉંદરોને (ટ્રાન્સપ્લાન્ટેશન પછી 140 દિવસથી વધુ) 5% આઇસોફ્લુરેન એનેસ્થેસિયા આપવામાં આવ્યા હતા અને શસ્ત્રક્રિયા દરમિયાન 1-3% આઇસોફ્લુરેન સાથે એનેસ્થેટાઇઝ કરવામાં આવ્યા હતા. પ્રાણીઓને સ્ટીરિયોટેક્સિક ફ્રેમ (કોપ્ફ) માં મૂકવામાં આવ્યા હતા અને સતત રિલીઝ બ્યુપ્રેનોર્ફિન (SR) ને ચામડીની નીચે ઇન્જેક્ટ કરવામાં આવ્યું હતું. ખોપરીને ખુલ્લી કરવામાં આવી હતી, સાફ કરવામાં આવી હતી અને 3-5 હાડકાના સ્ક્રૂ દાખલ કરવામાં આવ્યા હતા. t-hCO ને લક્ષ્ય બનાવવા માટે, અમે MRI છબીઓમાંથી સ્ટીરિયોટેક્સિક કોઓર્ડિનેટ્સ જનરેટ કર્યા હતા. રસના સ્થળે એક બર હોલ ડ્રિલ કરવામાં આવ્યો હતો અને ફાઇબર (400 µm વ્યાસ, NA 0.48, ડોરિક) hCO સપાટીથી 100 µm નીચે કરવામાં આવ્યા હતા અને UV-ક્યોરેબલ ડેન્ટલ સિમેન્ટ (Relyx) સાથે ખોપરીમાં સુરક્ષિત કરવામાં આવ્યા હતા.
અગાઉ વર્ણવ્યા મુજબ ફાઇબર ફોટોમેટ્રિક રેકોર્ડિંગ કરવામાં આવ્યા હતા42. સ્વયંભૂ પ્રવૃત્તિ રેકોર્ડ કરવા માટે, ઉંદરોને સ્વચ્છ પાંજરામાં મૂકવામાં આવ્યા હતા અને ફાઇબર ઓપ્ટિક ફોટોમેટ્રિક ડેટા એક્વિઝિશન સિસ્ટમ સાથે જોડાયેલ 400 µm વ્યાસનો ફાઇબર ઓપ્ટિક પેચ કેબલ (ડોરિક) ઇમ્પ્લાન્ટેડ ફાઇબર ઓપ્ટિક કેબલ સાથે જોડાયેલ હતો. મોટર પ્રવૃત્તિના 10-મિનિટના રેકોર્ડિંગ દરમિયાન, પ્રાણીઓ પાંજરામાં અન્વેષણ કરવા માટે મુક્ત હતા. ઉત્તેજિત પ્રવૃત્તિ રેકોર્ડ કરવા માટે, ઉંદરોને (ટ્રાન્સપ્લાન્ટેશન પછી 140 દિવસથી વધુ) ઇન્ડક્શન માટે 5% આઇસોફ્લુરેન અને જાળવણી માટે 1-3% આઇસોફ્લુરેન સાથે એનેસ્થેટાઇઝ કરવામાં આવ્યા હતા. પ્રાણીને સ્ટીરિયોટેક્ટિક ફ્રેમ (કોપ્ફ) માં મૂકો અને t-hCO ની વિરુદ્ધ બાજુના મૂછોને લગભગ 2 સેમી સુધી કાપવામાં આવે છે અને પીઝોઇલેક્ટ્રિક એક્ટ્યુએટર (PI) સાથે જોડાયેલ મેશમાંથી પસાર કરવામાં આવે છે. 400 µm ફાઇબર ઓપ્ટિક પેચ કેબલ (ડોરિક) ઇમ્પ્લાન્ટેડ ફાઇબર સાથે જોડાયેલ હતો અને ડેટા એક્વિઝિશન સિસ્ટમ સાથે જોડાયેલ હતો. t-hCO ની વિરુદ્ધ બાજુના મૂછોને પછી 20 મિનિટના રેકોર્ડિંગ સમયગાળા દરમિયાન પીઝોઇલેક્ટ્રિક ડ્રાઇવ દ્વારા રેન્ડમ સમયે 50 વખત (20 Hz પર 2 mm, પ્રેઝન્ટેશન દીઠ 2 સેકન્ડ) વિચલિત કરવામાં આવ્યા. કસ્ટમ MATLAB કોડ સાથે વિચલન સમયને નિયંત્રિત કરવા માટે Arduino MATLAB સપોર્ટ પેકેજનો ઉપયોગ કરો. ટ્રાન્ઝિસ્ટર-ટ્રાન્ઝિસ્ટર લોજિક (TTL) પલ્સનો ઉપયોગ કરીને ઇવેન્ટ્સ ડેટા એક્વિઝિશન સોફ્ટવેર સાથે સિંક્રનાઇઝ કરવામાં આવે છે.
ઉંદરોને (ટ્રાન્સપ્લાન્ટેશન પછી 140 દિવસથી વધુ) 5% આઇસોફ્લુરેન એનેસ્થેસિયાથી પ્રેરિત કરવામાં આવ્યા હતા અને ઓપરેશન દરમિયાન 1-3% આઇસોફ્લુરેન સાથે એનેસ્થેટાઇઝ કરવામાં આવ્યા હતા. પ્રાણીઓને સ્ટીરિયોટેક્સિક ફ્રેમ (કોપ્ફ) માં મૂકવામાં આવ્યા હતા અને બ્યુપ્રેનોર્ફિન SR અને ડેક્સામેથાસોન સબક્યુટેનીયસ ઇન્જેક્ટ કરવામાં આવ્યા હતા. ખોપરીને ખુલ્લી કરવામાં આવે છે, સાફ કરવામાં આવે છે અને 3-5 હાડકાના સ્ક્રૂ દાખલ કરવામાં આવે છે. t-hCO ને લક્ષ્ય બનાવવા માટે, અમે MRI છબીઓમાંથી સ્ટીરિયોટેક્સિક કોઓર્ડિનેટ્સ જનરેટ કર્યા હતા. ટ્રાન્સપ્લાન્ટેડ hCO પર સીધા હાઇ સ્પીડ ડ્રિલ સાથે ગોળાકાર ક્રેનિયોટોમી (આશરે 1 સેમી વ્યાસ) કરવામાં આવી હતી. એકવાર હાડકું શક્ય તેટલું પાતળું થઈ જાય, પરંતુ આખા હાડકામાંથી ડ્રિલિંગ કરતા પહેલા, બાકીની અકબંધ પેલ્વિક ડિસ્કને દૂર કરવા માટે ફોર્સેપ્સનો ઉપયોગ કરો જેથી અંતર્ગત t-hCO દેખાય. ક્રેનિયોટોમી જંતુરહિત ખારાથી ભરવામાં આવી હતી, અને UV-ક્યોર્ડ ડેન્ટલ સિમેન્ટ (Relyx) સાથે ખોપરી સાથે કવરસ્લિપ અને ખાસ હેડ પિન જોડવામાં આવ્યા હતા.
Nikon LWD (×16, 0.8 NA) ઉદ્દેશ્ય સાથે બ્રુકર મલ્ટિફોટોન માઇક્રોસ્કોપનો ઉપયોગ કરીને બે-ફોટોન ઇમેજિંગ કરવામાં આવ્યું હતું. GCaMP6 ઇમેજિંગ 920 nm પર 1.4x સિંગલ z-પ્લેન મેગ્નિફિકેશન અને 8x સરેરાશ 7.5 fps સાથે કરવામાં આવ્યું હતું. ઉંદરોને 5% આઇસોફ્લુરેન એનેસ્થેસિયા સાથે પ્રેરિત કરવામાં આવ્યા હતા અને 1-3% આઇસોફ્લુરેન સાથે જાળવવામાં આવ્યા હતા. ઉંદરોને કસ્ટમ મેઇડ હેડ ફિક્સ્ચરમાં મૂકવામાં આવ્યા હતા અને લેન્સ હેઠળ મૂકવામાં આવ્યા હતા. મોટર પ્રવૃત્તિનું 3-મિનિટનું પૃષ્ઠભૂમિ રેકોર્ડિંગ મેળવવામાં આવ્યું હતું. રેકોર્ડિંગના 20 મિનિટ દરમિયાન, 50 પફ (દરેક પ્રેઝન્ટેશન 100 ms લાંબા) ને પિકોસ્પ્રિસરનો ઉપયોગ કરીને t-hCO ની સામે વ્હિસ્કર પેડ પર રેન્ડમલી પહોંચાડવામાં આવ્યા હતા. કસ્ટમ MATLAB કોડ સાથે બર્સ્ટ ટાઇમને નિયંત્રિત કરવા માટે Arduino MATLAB સપોર્ટ પેકેજનો ઉપયોગ કરો. TTL પલ્સનો ઉપયોગ કરીને ડેટા એક્વિઝિશન સોફ્ટવેર (PrairieView 5.5) સાથે ઇવેન્ટ્સને સિંક્રનાઇઝ કરો. વિશ્લેષણ માટે, ફિજીમાં શરૂ કરાયેલા MoCo પ્રોગ્રામમાં એફાઇન કરેક્શનનો ઉપયોગ કરીને xy ગતિ માટે છબીઓને સુધારવામાં આવી હતી. CNMF-E43 નો ઉપયોગ કરીને વ્યક્તિગત કોષોમાંથી ફ્લોરોસન્ટ ટ્રેસનું નિષ્કર્ષણ. રસના દરેક ક્ષેત્ર માટે ફ્લોરોસેન્સ કાઢવામાં આવ્યું હતું, dF/F વણાંકોમાં રૂપાંતરિત કરવામાં આવ્યું હતું, અને પછી z-સ્કોરમાં રૂપાંતરિત કરવામાં આવ્યું હતું.
ઉંદરો (ટ્રાન્સપ્લાન્ટેશન પછી 140 દિવસથી વધુ) ને 5% આઇસોફ્લુરેન એનેસ્થેસિયા આપવામાં આવ્યું હતું અને ઓપરેશન દરમિયાન 1-3% આઇસોફ્લુરેન સાથે એનેસ્થેટાઇઝ કરવામાં આવ્યું હતું. પ્રાણીઓને સ્ટીરિયોટેક્સિક ફ્રેમ (કોપ્ફ) માં મૂકવામાં આવ્યા હતા અને બ્યુપ્રેનોર્ફિન SR અને ડેક્સામેથાસોન સબક્યુટેનીયસ ઇન્જેક્ટ કરવામાં આવ્યા હતા. t-hCO ની વિરુદ્ધ બાજુ પરના મૂછો લગભગ 2 સેમી સુધી કાપવામાં આવ્યા હતા અને પીઝોઇલેક્ટ્રિક એક્ટ્યુએટર સાથે જોડાયેલા જાળી દ્વારા દોરવામાં આવ્યા હતા. ખોપરી ખુલ્લી અને સાફ કરવામાં આવી હતી. ખોપરી સાથે સ્ટેનલેસ સ્ટીલ ગ્રાઉન્ડ સ્ક્રૂ જોડાયેલ છે. t-hCO ને લક્ષ્ય બનાવવા માટે, અમે MRI છબીઓમાંથી સ્ટીરિયોટેક્સિક કોઓર્ડિનેટ્સ જનરેટ કર્યા હતા. t-hCO ની ઉપર હાઇ સ્પીડ ડ્રિલ સાથે ગોળાકાર ક્રેનિયોટોમી (આશરે 1 સેમી વ્યાસ) કરો. એકવાર હાડકું શક્ય તેટલું પાતળું થઈ જાય, પરંતુ આખા હાડકામાંથી ડ્રિલિંગ કરતા પહેલા, બાકીની અકબંધ પેલ્વિક ડિસ્કને દૂર કરવા માટે ફોર્સેપ્સનો ઉપયોગ કરો જેથી અંતર્ગત t-hCO દેખાય. 32-ચેનલ અથવા 64-ચેનલ હાઇ-ડેન્સિટી સિલિકોન પ્રોબ્સ (કેમ્બ્રિજ ન્યુરોટેક) નો ઉપયોગ કરીને વ્યક્તિગત કોષો રેકોર્ડ કરવામાં આવ્યા હતા, જે ગ્રાઉન્ડ સ્ક્રૂ પર ગ્રાઉન્ડ કરવામાં આવ્યા હતા અને RHD એમ્પ્લીફાયર (ઇન્ટાન) સાથે પ્રી-એમ્પ્લીફાઇડ હતા. ક્રેનિયોટોમી દ્વારા ઇલેક્ટ્રોડ્સને લક્ષ્ય સ્થળ પર નીચે લાવવા માટે મેનિપ્યુલેટરનો ઉપયોગ કરો, જે જંતુરહિત ખારાથી ભરેલું છે. ઓપન એફિસ ડેટા એક્વિઝિશન સિસ્ટમનો ઉપયોગ કરીને 30 kHz ની આવર્તન પર ડેટા સંગ્રહ કરવામાં આવ્યો હતો. રેકોર્ડિંગ ત્યારે જ ચાલુ રહ્યું જ્યારે અમે 10 થી વધુ ચેનલોમાં ખૂબ જ સહસંબંધિત લયબદ્ધ સ્વયંસ્ફુરિત પ્રવૃત્તિ શોધી કાઢી, જે સૂચવે છે કે ઇલેક્ટ્રોડ્સ ગ્રાફ્ટમાં સ્થિત હતા (બે-ફોટોન કેલ્શિયમ ઇમેજિંગ ડેટા પર આધારિત). મોટર પ્રવૃત્તિનું 10-મિનિટનું પૃષ્ઠભૂમિ રેકોર્ડિંગ મેળવવામાં આવ્યું હતું. t-hCO ની વિરુદ્ધ બાજુના મૂછોને પછી 20 મિનિટના રેકોર્ડિંગ સમયગાળા દરમિયાન પીઝોઇલેક્ટ્રિક ડ્રાઇવ દ્વારા રેન્ડમ સમયે 50 વખત (20 Hz પર 2 mm, પ્રેઝન્ટેશન દીઠ 2 s) વિચલિત કરવામાં આવ્યા હતા. Arduino (MATLAB 2019b) માટે MATLAB સપોર્ટ પેકેજનો ઉપયોગ કરીને, કસ્ટમ MATLAB કોડ સાથે ડિફ્લેક્શન સમય નિયંત્રિત કરો. ડેટા એક્વિઝિશન સોફ્ટવેર સાથે ઇવેન્ટ્સને સિંક્રનાઇઝ કરવા માટે TTL પલ્સનો ઉપયોગ કરો.
ઓપ્ટિકલ માર્કિંગ પ્રયોગો માટે, 473 nm લેસર (ઓમિક્રોન) સાથે જોડાયેલ 200 µm ઓપ્ટિકલ પેચ કોર્ડ (ડોરિક) ક્રેનિયોટોમી ઉપર મૂકવામાં આવેલા 200 µm ઓપ્ટિકલ ફાઇબર સાથે જોડાયેલ હતું. આ પહેલા તરત જ, જમ્પર પાવરને 20 mW સુધી ગોઠવો. ક્રેનિયોટોમી દ્વારા ઇલેક્ટ્રોડ્સને લક્ષ્ય સ્થળ પર ઘટાડવા માટે મેનિપ્યુલેટરનો ઉપયોગ કરો, જે જંતુરહિત ખારાથી ભરેલું છે. રેકોર્ડિંગની શરૂઆતમાં, 473 nm (આવર્તન 2 Hz, પલ્સ અવધિ 10 ms) પ્રકાશના દસ પલ્સ ઉત્સર્જિત થયા હતા. પ્રકાશસંવેદનશીલ કોષોને એવા કોષો તરીકે વ્યાખ્યાયિત કરવામાં આવ્યા હતા જે 70% કે તેથી વધુ ટ્રાયલ્સમાં 10 ms પ્રકાશની અંદર સ્પાઇક પ્રતિભાવ દર્શાવે છે.
પોસ્ટ સમય: નવેમ્બર-૧૯-૨૦૨૨
