א דאנק פארן באזוכן Nature.com. איר ניצט א בראַוזער ווערסיע מיט באגרענעצטע CSS שטיצע. פאר דער בעסטער דערפאַרונג, רעקאָמענדירן מיר אז איר זאָלט ניצן אן אפדעיטירטן בראַוזער (אָדער אויסלעשן קאָמפּאַטיביליטי מאָדע אין אינטערנעט עקספּלאָרער). דערצו, צו זיכער מאַכן אָנגייענדיקע שטיצע, ווייַזן מיר דעם וועבזייטל אָן סטילן און דזשאַוואַסקריפּט.
ווײַזט אַ קאַרוסעל פֿון דרײַ סליידס אויף איין מאָל. ניצט די "פֿריִערדיקע" און "ווײַטער" קנעפּלעך צו גיין דורך דרײַ סליידס אויף איין מאָל, אָדער ניצט די "סליידער" קנעפּלעך אין סוף צו גיין דורך דרײַ סליידס אויף איין מאָל.
זעלבסט-אַסעמבלינג נעוראַל אָרגאַנעלעס רעפּרעזענטירן אַ פּראַמישינג אין וויטראָ פּלאַטפאָרמע פֿאַר מאָדעלינג מענטשלעכע אַנטוויקלונג און קראַנקייט. אָבער, אָרגאַנאָידס פעלן די קאַנעקטיוויטי וואָס עקזיסטירט אין וויוואָ, וואָס לימיטירט מאַטוראַציע און פאַרהיט ינטאַגריישאַן מיט אנדערע סערקאַץ וואָס קאָנטראָלירן נאַטור. דאָ ווייַזן מיר אַז מענטשלעך שטאַם צעל-דערייווד קאָרטיקאַל אָרגאַנאָידס טראַנספּלאַנטיד אין די סאָמאַטאָסענסאָרי קאָרטעקס פון נעאָנאַטאַל נאַקעט ראַץ אַנטוויקלען דערוואַקסן צעל טייפּס וואָס ינטאַגרירן אין סענסאָרי און מאָטיוואַטיאָן-פֿאַרבונדענע סערקאַץ. MRI האט גילוי פּאָסט-טראַנספּלאַנט אָרגאַנאָיד וווּקס אין עטלעכע שטאַם צעל שורות און אַנימאַלס, בשעת איין-קאָר אַנאַליסיס גילוי פּראָגרעס פון קאָרטיקאָגענעסיס און די ימערדזשאַנס פון אַ טעטיקייט-אָפענגיק טראַנסקריפּציע פּראָגראַם. טאַקע, טראַנספּלאַנטיד קאָרטיקאַל נעוראָנס ווייַזן מער קאָמפּלעקס מאָרפאַלאַדזשיקאַל, סינאַפּטיק און ינערלעך מעמבראַן פּראָפּערטיעס ווי זייער אין וויטראָ קאַונערפּאַרץ, אַלאַוינג די דיטעקשאַן פון נעוראָנאַל חסרונות אין פּאַטיענץ מיט טימאטעאָס סינדראָום. אַנאַטאָמישע און פאַנגקשאַנאַל טרייסינג האט געוויזן אַז טראַנספּלאַנטיד אָרגאַנעלעס באַקומען טאַלאַמאָקאָרטיקאַל און קאָרטיקאָקאָרטיקאַל ינפּוץ, און אין וויוואָ רעקאָרדינגס פון נעוראַל טעטיקייט פֿאָרשלאָגן אַז די ינפּוץ קענען דזשענערייט סענסאָרי ריספּאָנסעס אין מענטשלעכע סעלז. צום סוף, קאָרטיקאַל אָרגאַנאָידס פאַרברייטערן אַקסאָנס איבער די ראַט מאַרך, און זייער אָפּטאָגענעטיק אַקטאַוויישאַן פירט צו באַלוינונג-זוכן נאַטור. אזוי, טראַנספּלאַנטירטע מענטשלעכע קאָרטעקס נעוראָנען ווערן רייף און נעמען אָנטייל אין די באַלעבאָס'ס קרייזן וואָס קאָנטראָלירן נאַטור. מיר ערוואַרטן אַז דער צוגאַנג וועט ערלייכטערן די דעטעקציע פון ​​סטראַנד-לעוועל פענאָטיפּעס אין פּאַציענט-דעריוואַטעד סעלז וואָס קענען נישט דעטעקטירט ווערן דורך אנדערע מיטלען.
דער אנטוויקלענדיקער מענטשלעכער מוח איז א באמערקנסווערטער זעלבסט-ארגאניזירנדיקער פראצעס אין וועלכן צעלן פארמערן זיך, דיפערענצירן זיך, מיגרירן, און פארבינדן זיך צו שאפן פונקציאנעלע נעוראנאלע קרייזן וואס ווערן ווייטער פארבעסערט דורך סענסארישע דערפארונג. א שליסל פראבלעם אין פארשטיין מענטשלעכן מוח אנטוויקלונג, ספעציעל אין קאנטעקסט פון קראנקהייט, איז דער מאנגל אין צוטריט צו מוח געוועב. זעלבסט-ארגאניזירנדיקע אָרגאַנעלן, אריינגערעכנט מענטשלעכע קארטעקס אָרגאַנאָידן (hCO; אויך באקאנט אלס די מענטשלעכע קארטעקס ספערע), קענען דזשענערירן 2,3,4,5,6. אבער, עטלעכע באגרענעצונגען באגרענעצן זייער ברייטערע אנווענדונג צו פארשטיין די אנטוויקלונג און פונקציאנירן פון נעוראלע קרייזן. אין באזונדער, איז עס נישט קלאר צי hCO מאַטוראַציע איז באגרענעצט דורך דער אַוועק פון געוויסע מיקראָענווייראָנמענטאַלע און סענסארישע אינפוטס פאָרשטעלן אין וויוואָ. אין אַדישאַן, ווייַל hCOs זענען נישט ינטאַגרייטאַד אין קרייזן וואָס קענען דזשענערירן נאַטוראַל רעזולטאַטן, זייער נוציקייט אין מאָדעלינג דזשאַנעטיש קאָמפּלעקס און נאַטוראַל נעוראָפּסיכיאַטרישע דיסאָרדערס איז דערווייַל באגרענעצט.
די טראַנספּלאַנטאַציע פון ​​hCO אין אַ גאַנץ לעבעדיק מוח קען איבערקומען די לימיטאַציעס. פריערדיקע שטודיעס האָבן געוויזן אַז מענטשלעכע נעוראָנען טראַנספּלאַנטירט אין די ראָודאַנט קאָרטעקס זענען ביכולת צו איבערלעבן, פּראַדזשעקטירן און קאָמוניקירן מיט ראָודאַנט סעלז 7,8,9,10,11,12. אָבער, די עקספּערימענטן ווערן געוויינטלעך דורכגעפירט אויף דערוואַקסענע חיות, וואָס קען לימיטירן סינאַפּטיק און אַקסאָנאַל אינטעגראַציע. דאָ, מיר באַשרייבן אַ טראַנספּלאַנטאַציע פּאַראַדיגם אין וועלכן מיר האָבן טראַנספּלאַנטירט 3D hCO דערייווד פון hiPS סעלז אין די ערשטיק סאָמאַטאָסענסאָרי קאָרטעקס (S1) פון ימיונאָדעפישאַנט ראַץ אין אַ פרי בינע פון ​​פּלאַסטיק אַנטוויקלונג. טראַנספּלאַנטיד hCO (t-hCO) נעוראָנען דורכגיין באַטייטיק מאַטוראַטיאָן, באַקומען טאַלאַמאָקאָרטיקאַל און קאָרטיקאַל-קאָרטיקאַל ינפּוץ וואָס אַרויסרופן סענסאָרי ריספּאָנסעס, און פאַרברייטערן אַקסאָנאַל פּראַדזשעקשאַנז אין די ראַץ מוח צו פירן באַלוינונג-זוכן נאַטור. עקסטענדעד מאַטוראַטיאָן פון t-hCO האט גילוי נעוראָנאַל חסרונות אין פּאַטיענץ מיט טימאטעאָס ס סינדראָם (TS), אַ שטרענג גענעטישע דיסאָרדער געפֿירט דורך מוטאַטיאָנס אין די וואָולטידזש-סענסיטיוו L-טיפּ CaV1.2 קאַלסיום קאַנאַל (ענקאָודעד דורך CACNA1C).
כדי צו שטודירן מענטשלעכע קאָרטיקאַלע נעוראָנען אין קרייזן אין וויוואָ, האָבן מיר סטערעאָטאַקטיש טראַנספּלאַנטירט גאַנצע 3D hCO אין S1 פון פריע פּאָסטנאַטאַלע אַטימיק ראַץ (טעג 3-7 פּאָסטנאַטאַלי) (פיגור 1אַ און אויסגעברייטערטע דאַטן פון פיגור 1אַ-ק). אין דעם פונקט, האָבן די טאַלאַמאָקאָרטיקאַלע און קאָרטיקאָקאָרטיקאַלע אַקסאָנאַלע פּראָיעקציעס נאָך נישט פאַרענדיקט זייער S1 יננערוואַציע (רעף. 13). אַזוי, איז דער צוגאַנג דיזיינד צו מאַקסאַמיזירן t-hCO אינטעגראַציע בשעת מינימיזירן דעם אימפּאַקט אויף ענדאָגענע קרייזן. כדי צו וויזואַליזירן די אָרט פון t-hCO אין לעבעדיקע חיות, האָבן מיר דורכגעפירט T2-געוויכטיקטע MRI מוח רעקאָנסטרוקציעס פון ראַץ 2-3 חדשים נאָך טראַנספּלאַנטאַציע (פיגור 1ב און אויסגעברייטערטע דאַטן, פיגור 1ד). t-hCO3 זענען גרינג באמערקט געוואָרן און די וואָלומען מעסטונגען פון t-hCO3 זענען געווען ענלעך צו די וואָס זענען אויסגערעכנט געוואָרן פֿון פֿיקסירטע סלייסיז (פֿאַרברייטערטע דאַטן פֿיג. 1ד,ע; P > 0.05). t-hCO3 זענען גרינג באמערקט געוואָרן און די וואָלומען מעסטונגען פון t-hCO3 זענען געווען ענלעך צו די וואָס זענען אויסגערעכנט געוואָרן פֿון פֿיקסירטע סלייסיז (פֿאַרברייטערטע דאַטן פֿיג. 1ד,ע; P > 0.05). t-hCO גיט אַנאַלדזשיז, און t-hCO איז אַנאַלדזשיסיק פֿאַר פיקסיראָוואַנыע סרענעס, рис 1ד, e; t-hCO3 זענען לייכט באמערקט געוואָרן, און וואָלומעטרישע t-hCO3 מעסטונגען זענען געווען ענלעך צו די וואָס זענען אויסגערעכנט געוואָרן פֿאַר פֿיקסירטע סעקשאַנז (אויסגעברייטערטע דאַטן, פֿיג. 1ד, ה; P > 0.05).很容易观察到t-hCO，并且t-hCO的体积测量值与从固定切片计算的测量值相似（扩展数据图1ד、e；P>　05）很容易观察到t-hCO，并且t-hCO t-hCO גיט אַנאַלדזשיסיק, און t-hCO פֿאַרבונדן מיט אַנאַלדזשיטאַנם פֿאַר פיקסיראָוואַנыע סרעזאַון ( рис 1ד, e; t-hCO איז לייכט באמערקט געווארן, און וואָלומעטרישע t-hCO מעסטונגען זענען געווען ענלעך צו די וואָס זענען אויסגערעכנט געוואָרן פֿאַר פֿיקסירטע סעקשאַנז (אויסגעברייטערטע דאַטן, בילד 1ד, ה; P > 0.05).מיר האָבן באַשטימט t-hCO אין 81% פון טראַנספּלאַנטירטע חיות בערך 2 חדשים נאָך טראַנספּלאַנטאַציע (n = 72 חיות; hCO פון 10 hiPS צעל ליניעס; hiPS צעל ליניעס אין סאַפּלעמענטאַרי טאַבעלע 1). פון די, 87% זענען געווען ליגן אין די סערעבראַל קאָרטעקס (פיגור 1c). דורך דורכפירן סעריע MRI סקאַנס אין קייפל צייט פונקטן אין דער זעלביקער טראַנספּלאַנטירטער ראַץ, מיר געפֿונען אַ נייַן-פאַך פאַרגרעסערונג אין t-hCO באַנד אין 3 חדשים (פיגור 1d און יקספּאַנדיד דאַטן, פיגור 1f). טראַנספּלאַנטירטע חיות האָבן געהאַט אַ הויך ניצל קורס (74%) ביי 12 חדשים נאָך טראַנספּלאַנטאַציע (עקספּאַנדיד דאַטן, פיגור 1g און סאַפּלעמענטאַרי טאַבעלע 2), און קיין אָוווערט מאָטאָר אָדער זכּרון ימפּערמאַנץ, גליאָסיס, אָדער עלעקטראָענסעפאַלאָגראַם (EEG) זענען געפֿונען געוואָרן. דאַטן פיגור 1g און סאַפּלעמענטאַרי טאַבעלע 2). 1h–m און 3e).
א, סכעמאטיש פון עקספערימענטאלן פלאן. hCO דערייווד פון hiPS צעלן איז געווען טראַנספּלאַנטירט אין S1 פון נייַגעבוירענע נאַקעט ראַץ אויף טעג 30-60 פון דיפערענציאַציע. ב, T2-געוויכטיק קאָראָנאַל און האָריזאָנטאַל MRI בילדער וואָס ווייַזן t-hCO אין S1 2 חדשים נאָך טראַנספּלאַנטאַציע. סקאַלע באַר, 2 מם. ג, קוואַנטיפיקאַציע פון ​​ענגראַפטמענט הצלחה ראַטעס געוויזן פֿאַר יעדער hiPS צעל ליניע (n = 108, נומערן אין באַרס אָנווייַזן סומע פון ​​t-hCO פּער hIPS צעל ליניע) און קאָרטיקאַל אָדער סובקאָרטיקאַל אָרט (n = 88). ד, MRI בילד פון אַ קאָראָנאַרי אַרטעריע (לינקס; סקאַלע באַר, 3 מם) און קאָראַספּאַנדינג 3D וואָלומעטריק רעקאָנסטרוקציע (סקאַלע באַר, 3 מם) ווייַזונג אַ פאַרגרעסערונג אין t-hCO איבער 3 חדשים. ה, איבערבליק פון t-hCO פּאַטערנז אין ראַץ סערעבראַל קאָרטעקס. סקאַלע באַר, 1 מם. f, רעפרעזענטאטיווע אימונאציטאכעמישע בילדער פון t-hCO געוויזן פון אויבן לינקס צו רעכטס (בעת דיפערענציאציע): PPP1R17 (4 חדשים אלט), NeuN (8 חדשים אלט), SOX9 און GFAP (8 חדשים אלט), PDGFRα; (8 חדשים), MAP2 (8 חדשים) און IBA1 (8 חדשים). סקאַלע באַר, 20 µm. קא-עקספּרעסיע פון ​​HNA ווייזט אויף צעלן פון מענטשלעכן אָפּשטאַם. g, snRNA-seq: יוניפייד מאַניפאָולד און פּראָיעקציע (UMAP) דימענסיאָנאַליטי רעדוקציע בילדגעבונג פון אַלע הויך-קוואַליטעט t-hCO קערנס נאָך Seurat אינטעגראַציע (n=3 t-hCO סאַמפּאַלז, n=2 hiPS צעל ליניעס). אַסטראָציטן, צעלן פון דער אַסטראָציט ליניע; cyc prog, סערקולירנדיקע פּראָגעניטאָרס; GluN DL, טיף גלוטאַמאַטערגישע נעוראָנס; GluN DL/SP, טיף און סובלאַמעללאַר גלוטאַמאַטערגישע נעוראָנס; GluN UL, אויבערשטער שיכט גלוטאַמאַטערגישע נעוראָנס; אָליגאָדענדראָסיטן, אָליגאָדענדראָסיטן; OPC, אָליגאָדענדראָסיט פּראָגעניטאָר צעלן; RELN, ריעלין נעוראָנען. h, גענע אָנטאָלאָגיע (GO) טערמין ענריטשמענט אַנאַליז פון גענעס באַדייטנד אַפּרעגולירט (אַדזשאַסטיד P < 0.05, פאַרלייגן ענדערונג > 2, אויסגעדריקט אין לפּחות 10% פון קערנס) אין t-hCO גלוטאַמאַטערגיק נעוראָנס קאַמפּערד מיט hCO גלוטאַמאַטערגיק נעוראָנס. h, גענע אָנטאָלאָגיע (GO) טערמין ענריטשמענט אַנאַליז פון גענעס באַדייטנד אַפּרעגולירט (אַדזשאַסטיד P < 0.05, פאַרלייגן ענדערונג > 2, אויסגעדריקט אין לפּחות 10% פון קערנס) אין t-hCO גלוטאַמאַטערגיק נעוראָנס קאַמפּערד מיט hCO גלוטאַמאַטערגיק נעוראָנס. h, Анализ обогащения терминов גענע אָנטאָלאָגי (גאָ) פֿאַר גענאָוו מיט זשאַנראַ אַקטואַל אַקטואַל (סקאָררעקטאָראָוואַנניע פּ <0,05, קורס און >2, אויב איר זענט 10% מער) אין די גלאָטאַמאַטערגיטשעסקי נייַ ה-הקאָ מיט די האַסקאָמע פון ​​​​הקאָ. h, גענע אָנטאָלאָגיע (GO) טערמין ענריטשמענט אַנאַליז פֿאַר גענעס מיט באַטייטיק אַקטיוואַציע (אַדזשאַסטיד P<0.05, פאַרלייגן ענדערונג >2, אויסדרוק אין לפּחות 10% קערנס) אין t-hCO גלוטאַמאַטערגיק נעוראָנס קאַמפּערד צו hCO גלוטאַמאַטערגיק נעוראָנס. h，与hCO 谷氨酸能神经元相比，t-hCO 谷氨酸能神经元中基因显着上调（谎整0.05, 倍数变化> 2，在至少10% 的细胞核中表达）的基因本体论(GO) h , 与 hco 谷氨酸 能 元 相比 , t-hco 谷氨酸 能 神经 元 基因 显着 上谼 p <0 （后.变化 变化> 2 ， 至少 10% 的 核中 表达） 基因 基因 基因 的 的 的 的 的 的 的的 的的 的 的 的本体论(GO) 术语富集分析. h, гены значительно активизировались (סקאָררעקטיראָוואַנניי פּ <0,05, קאַפּיטאַליזיישאַן> 2, וויסנשאפטלעכע פּערספּעקטיוו אויף 1%) גלאָטאַמאַטערגיטשעס נעטהערלאַנדס הקאָ פֿאַר סקראַוונינג מיט גלאָטאַמאַטערגיטשעסקיני הקאָ אינטערנאציאנאלע (גיין) אַנאַליסיס. h, גענעס זענען געווען באַדייטנד אַרויפֿרעגולירט (אַדזשאַסטיד P < 0.05, פאַרלעג ענדערונג > 2, אויסגעדריקט אין לפּחות 10% פון קערנס) אין t-hCO גלוטאַמאַטערגיק נעוראָנס קאַמפּערד צו hCO גלוטאַמאַטערגיק נעוראָנס אָנטאָלאָגישע (GO) אַנאַליז פון די ענריטשמענט טערמין.די פּונקטירטע ליניע ווײַזט אָן אַן aq ווערט פון 0.05. i, UMAP בילדגעבונג פון GluN צעל טיפּן אין t-hCO ניצנדיק לייבל טראַנספער פון אַ רעפערענץ 22 snRNA-seq דערוואַקסענע מאָטאָר קאָרטעקס דאַטאַסעט. CT — קאָרטיקאָטאַלאַמיק צעלן, ET — עקסטראַסערעבראַל צעלן, IT — אינטערנע טעלענסעפאַליק צעלן, NP — נאָענטע פּראָיעקציע.
מיר האָבן דעמאָלט אַססעססעד די ציטאָאַרכיטעקטור און קוילעלדיק צעלולאַרע קאָמפּאָזיציע פון ​​t-hCO. אַנטיבאָדי פֿאַרבונג פון ראַץ ענדאָטעליאַל סעלז האט אַנטפּלעקט וואַסקולאַריזאַציע מיט t-hCO, בשעת IBA1 פֿאַרבונג האט אַנטפּלעקט די בייַזייַן פון ראַץ מיקראָגליאַ איבער די גראַפט (פיגור 1f און יקספּאַנדיד דאַטן, פיגור 3c,d). יממונאָסטיינינג האט אַנטפּלעקט מענטשלעך נוקלעאַר אַנטיגען (HNA) positive סעלז קאָ-עקספּרעסינג PPP1R17 (קאָרטיקאַל פּראָדזשעטאָרס), NeuN (נעוראָנס), SOX9 און GFAP (גליאַל-דערייווד סעלז) אָדער PDGFRα (אָליגאָדענדראָסייט פּראָדזשעטאָרס) (פיגור 1f). צו שטודירן די צעלולאַרע קאָמפּאָזיציע פון ​​t-hCO אין איין צעל רעזאָלוציע, מיר דורכגעפירט איין-קאָר RNA סיקוואַנסינג (snRNA-seq) נאָך בעערעך 8 חדשים פון דיפערענציאַציע. מאַסע פֿילטראַציע און באַזייַטיקונג פון ראַץ קערן האט געגעבן 21,500 הויך-קוואַליטעט מענטשלעך מאָנאָנוקלעאַר מאַפּס (פיגור 1g און יקספּאַנדיד דאַטן, פיגור 4a,b). אויסדרוק מוסטערן פון טיפישע צעל-טיפ מארקערס האבן אידענטיפיצירט קלאסטערס פון הויפט קארטיקאלע צעל קלאסן, אריינגערעכנט טיפע און אויבערפלעכליכע גלוטאמאטערגישע נעוראנען, צירקולירנדע פראגעניטארן, אליגאדענדראסיטן, און אסטראציט ליניעדזש (פיגור 1ג, פארברייטערטע דאטן, פיגור 4ק, און סופּלעמענטארע טאבעלע 3). אימונאסטיינינג פאר SATB2 און CTIP2 האט געוויזן אז טראץ דעם אנוועזנהייט פון קארטיקאלע סובטיפן, האט t-hCO נישט געוויזן קלארע אנטאמאטישע סטראטיפיקאציע (אויסגעברייטערטע דאטן, פיגור 3א). שטאפעל-געמאכטע snRNA-seq hCO האט פראדוצירט ברייט ענליכע צעל קלאסן, מיט א פאר אויסנעמען, אריינגערעכנט די אפוועזנהייט פון אליגאדענדראסיטן און די אנוועזנהייט פון GABAergic נעוראנען, וואס קען אפשפיגלען די פריער באריכטעטע גינסטיגע אין וויטרא באדינגונגען פאר לאטעראלע פראגעניטאר צעלן15 (אויסגעברייטערטע דאטן, פיגור 4פ – i און סופּלעמענטארע טאבעלע 4). דיפערענציעלע גען אויסדרוק אנאליז האט געוויזן באדייטנדע אונטערשיידן אין גלוטאמאטערגישע נעוראנען צווישן t-hCO און hCO (צוגאב טאבעלע 5), אריינגערעכנט אקטיוואציע פון ​​סעטס פון גענעס פארבונדן מיט נעוראנאלער מאטוראציע ווי סינאפטישער סיגנאלינג, דענדריטישער לאקאליזאציע, און וואלטאזש-געיטעד קאנאל אקטיוויטעט (פיגור 1h און צוגאב טאבעלע 5). טאבעלע 6). דעריבער, קארטיקאלע גלוטאמאטערגישע t-hCO נעוראנען האבן אויסגעוויזן פארשנעלערטן טראנסקריפציאנעלע מאטוראציע.
כדי צו אויפקלערן צי די טראַנסקריפּציאָנעלע ענדערונגען אין t-hCO זענען געווען פֿאַרבונדן מיט מאָרפאָלאָגישע אונטערשיידן צווישן hCO אין וויטראָ און t-hCO אין וויוואָ, האָבן מיר רעקאָנסטרויִרט בינע-געפּאַסטע ביאָסיטין-געפֿילטע hCO און hCO אין אַקוטע סעקשאַנז נאָך 7-8 חדשים פון דיפערענציאַציע. hCO נעוראָנען (פיגור 2אַ). t-hCO נעוראָנען זענען געווען באַדייטנד גרעסער, האָבן געהאַט 1.5 מאָל דעם סאָמאַ דיאַמעטער, צוויי מאָל אַזוי פיל דענדריטן, און אַן אַלגעמיינע זעקס-פאַכיקע פאַרגרעסערונג אין גאַנץ דענדריטיש לענג קאַמפּערד צו אין וויטראָ hCO (פיגור 2ב). אין דערצו, האָבן מיר באמערקט אַ באַדייטנד העכערע געדיכטקייט פון דענדריטיש ספּיינז אין t-hCO נעוראָנען ווי אין hCO נעוראָנען (פיגור 2ק). דאָס סאַגדזשעסץ אַז t-hCO נעוראָנען דורכגיין ברייט דענדריטיש פֿאַרלענגערונג און צווייַג, וואָס, אין קאָמבינאַציע מיט קאַנטיניוד צעל פּראָליפעריישאַן, קען ביישטייערן צו די אינטענסיווע וווּקס פון t-hCO נאָך טראַנספּלאַנטיישאַן (פיגור 1ד און עקסטענדעד דאַטאַ פיג. 1ף). דאָס האָט אונדז פּראַמפּטיד צו ויספאָרשן די עלעקטראָפֿיזיאָלאָגישע פּראָפּערטיעס. מעמבראַן קאַפּאַסיטאַנס איז געווען אַכט מאָל העכער (עקספּאַנדעד דאַטן, פיג. 8ד), די רו-צושטאַנד מעמבראַן פּאָטענציעל איז געווען מער כייפּערפּאָלאַרייזד (בעערעך 20 mV), און קראַנט ינדזשעקשאַן האט ינדוסט אַ העכער מאַקסימום עקסייטיישאַן קורס אין t-hCO נעוראָנען ווי אין hCO נעוראָנען. אין וויטראָ (פיג. 2ד), ה), וואָס איז קאָנסיסטענט מיט די גרעסערע און מער קאָמפּלעקס מאָרפאַלאַדזשיקאַל פֿעיִקייטן פון t-hCO. אין אַדישאַן, די אָפטקייַט פון ספּאַנטייני עקסייטאַטאָרי פּאָסטסינאַפּטיק קראַנט געשעענישן (EPSC) איז געווען באַדייטנד העכער אין t-hCO נעוראָנען (פיג. 2f), וואָס סאַגדזשעסטיד אַז די געוואקסן געדיכטקייַט פון דענדריטיק ספּיינז באמערקט אין t-hCO נעוראָנען איז געווען פֿאַרבונדן מיט פאַנגקשאַנאַל עקסייטאַביליטי. סעקסואַל סינאַפּסע. מיר האָבן באשטעטיקט דעם אומרייפן כאַראַקטער פון hCO נעוראָנען אין וויטראָ דורך רעקאָרדינג לייבאַלד גלוטאַמאַטערגיק נעוראָנען (עקספּאַנדעד דאַטן, פיג. 6אַ-ק).
a, 3D רעקאָנסטרוקציע פון ​​ביאָסיטין-געפילטע hCO און t-hCO נעוראָנען נאָך 8 חדשים פון דיפערענציאַציע. ב, קוואַנטיפֿיקאַציע פֿון מאָרפֿאָלאָגישע פֿעיִקייטן (n = 8 hCO נעוראָנען, n = 6 t-hCO נעוראָנען; **P = 0.0084, *P = 0.0179 און ***P < 0.0001). ב, קוואַנטיפֿיקאַציע פֿון מאָרפֿאָלאָגישע פֿעיִקייטן (n = 8 hCO נעוראָנען, n = 6 t-hCO נעוראָנען; **P = 0.0084, *P = 0.0179 און ***P < 0.0001). б, количественная оценка морфологических признаков (n = 8 нейронов hCO, n = 6 нейронов t-hCO; ** P = 0,0084, * P = 0,01). ב, קוואַנטיפֿיקאַציע פֿון מאָרפֿאָלאָגישע פֿעיִקייטן (n=8 hCO נעוראָנען, n=6 t-hCO נעוראָנען; **P=0.0084, *P=0.0179, און ***P<0.0001). b，形态学特征的量化（n = 8 个hCO 神经元，n = 6 个t-hCO 神经元；**P = 0.0084， 1***P = 0.0084，0*P = 0.0*P = 0.0084 0.0001). b，形态学特征的量化（n = 8 个hCO 神经元，n = 6 个t-hCO 神经元；**P = 0.0084， 1***P = 0.0084，0*P = 0.0*P = 0.0084 0.0001). б, количественная оценка морфологических признаков (n = 8 нейронов hCO, n = 6 нейронов t-hCO; ** P = 0,0084, * P = 0,01). ב, קוואַנטיפֿיקאַציע פֿון מאָרפֿאָלאָגישע פֿעיִקייטן (n=8 hCO נעוראָנען, n=6 t-hCO נעוראָנען; **P=0.0084, *P=0.0179, און ***P<0.0001).c, 3D רעקאנסטרוקציע פון ​​hCO און t-hCO דענדריטישע צווייגן נאך 8 חדשים פון דיפערענציאציע. רויטע שטערנס ווייזן אויף מעגלעכע דענדריטישע רוקן-ביין. דענדריטישע רוקן-ביין געדיכטקייט קוואנטיפיקאציע (n = 8 hCO נעוראנען, n = 6 t-hCO נעוראנען; **P = 0.0092). ד, קוואַנטיפֿיקאַציע פֿון דעם רו־מעמבראַן פּאָטענציאַל (n = 25 hCO נעוראָנען, n = 16 t-hCO נעוראָנען; ***P < 0.0001). ד, קוואַנטיפֿיקאַציע פֿון דעם רו־מעמבראַן פּאָטענציאַל (n = 25 hCO נעוראָנען, n = 16 t-hCO נעוראָנען; ***P < 0.0001). ד, כוידעשלעך קאַנסאַנטריישאַן פון די האַסקאָמע (n = 25 נייַן הקאָ, n = 16 נייַן הקאָ; *** פּ <0,0001). ד, רו-מעמבראַן פּאָטענציאַל קוואַנטיפיקאַציע (n = 25 hCO נעוראָנען, n = 16 t-hCO נעוראָנען; ***P < 0.0001). d, 静息膜电位的量化（n = 25 hCO 神经元，n = 16 t-hCO 神经元；***P < 0.0001）. d, 静息膜电位的量化（n = 25 hCO 神经元，n = 16 t-hCO 神经元；***P < 0.0001）. ד, כוידעשלעך קאַנסאַנטריישאַן פון די האַסקאָמע (n = 25 נייַן הקאָ, n = 16 נייַן הקאָ; *** פּ <0,0001). ד, רו-מעמבראַן פּאָטענציאַל קוואַנטיפיקאַציע (n = 25 hCO נעוראָנען, n = 16 t-hCO נעוראָנען; ***P < 0.0001). e, איבערחזרנדיקע אַקציע פּאָטענציעל פייַערן אין hCO און t-hCO אינדוצירט דורך ינקריסינג קראַנט ינדזשעקשאַנז, און קוואַנטיפיקאַציע פון ​​​​די מאַקסימאַל פייַער קורס (n = 25 hCO נעוראָנס, n = 16 t-hCO נעוראָנס; ***P < 0.0001). e, איבערחזרנדיקע אַקציע פּאָטענציעל פייַערן אין hCO און t-hCO אינדוצירט דורך ינקריסינג קראַנט ינדזשעקשאַנז, און קוואַנטיפיקאַציע פון ​​​​די מאַקסימאַל פייַער קורס (n = 25 hCO נעוראָנס, n = 16 t-hCO נעוראָנס; ***P < 0.0001). e, повторное возбуждение потенциала действия в hCO און t-hCO, вызванное увеличением тока, און количествия סקאָראָסטיס וויידלי (n = 25 נייַן הקאָ, n = 16 נייַראָנאָוו הקאָ; *** פּ <0,0001). e, אַקציע פּאָטענציעל ווידער-פייַערן אין hCO און t-hCO אינדוצירט דורך קראַנט פאַרגרעסערונג און קוואַנטיפיקאַציע פון ​​מאַקסימום פייַער קורס (n = 25 hCO נעוראָנען, n = 16 t-hCO נעוראָנען; *** P < 0.0001). e，通过增加电流注入诱导的hCO 和t-hCO 重复动作电位放电，以及最餧攌甄＇n=2个hCO 神经元，n = 16 个t-hCO 神经元；***P <0.0001）. E , 通过 增加 电流 注入 的 的 hco 和 t-hco 重复 电位 放电 ， 以及 最 夼 的  n 2个 hco 神经 ， n = 16 个 t-hco 经 ； *** p <0.0001） 。 e, повторяющееся возбуждение потенциала действия hCO און t-hCO, вызванное величением подачи подачика, и коко. מאַקסימאַל סקאַראָסטי (n = 25 נייַן הקאָ, n = 16 נייַן הקאָ; *** פּ <0,0001). e, איבערחזרנדיקע שיסן פון hCO און t-hCO אקציע פאטענציאלן אינדוצירט דורך פארגרעסערטע שטראָם צושטעל און קוואַנטיפֿיקאַציע פון ​​מאַקסימום שיסן ראטע (n = 25 hCO נעוראָנען, n = 16 t-hCO נעוראָנען; *** P < 0.0001). f, ספּאָנטאַנע EPSCs (sEPSCs) אין hCO און t-hCO נעוראָנען ביי 8 חדשים פון דיפערענציאַציע, און קוואַנטיפֿיקאַציע פון ​​​​די אָפטקייט פון סינאַפּטיק געשעענישן (n = 25 hCO נעוראָנען, n = 17 t-hCO נעוראָנען; ***P < 0.0001). f, ספּאָנטאַנע EPSCs (sEPSCs) אין hCO און t-hCO נעוראָנען ביי 8 חדשים פון דיפערענציאַציע, און קוואַנטיפֿיקאַציע פון ​​דער אָפטקייט פון סינאַפּטישע געשעענישן (n = 25 hCO נעוראָנען, n = 17 t-hCO נעוראָנען; ***P < 0.0001). f, спонтанные EPSC (sEPSC) в нейронах hCO и t-hCO через 8 месяцев дифференцировки и количественная оценка часисти событий (n = 25 נייַראָנאָוו הקאָ, n = 17 נייַראָנאָוו הקאָ; *** פּ <0,0001) . f, ספּאָנטאַנע EPSCs (sEPSCs) אין hCO און t-hCO נעוראָנען ביי 8 חדשים פון דיפערענציאַציע און קוואַנטיפֿיקאַציע פון ​​סינאַפּטיש געשעעניש ראַטעס (n=25 hCO נעוראָנען, n=17 t-hCO נעוראָנען; ***P<0.0001). f，分化8 个月时hCO 和t-hCO 神经元中的自发性EPSCs (sEPSCs)，以及突触事件颼的的频的的神经元，n = 17 t-hCO 神经元；***P <0.0001）. f，分化8 个月时hCO 和t-hCO 神经元中的自发性EPSCs (sEPSCs)，以及突触事件颼的的ען = 25 הקאָ ין = 25הקאָ פּ <0.0001). f, спонтанные EPSC (sEPSC) в нейронах hCO и t-hCO через 8 месяцев дифференцировки и количественная оценка часисти נאָך (n = 25 נייַראָנאָוו הקאָ, n = 17 נייַראָנאָוו הקאָ; *** פּ <0,0001). f, ספּאָנטאַנע EPSCs (sEPSCs) אין hCO און t-hCO נעוראָנען ביי 8 חדשים פון דיפערענציאַציע און קוואַנטיפֿיקאַציע פון ​​סינאַפּטיש געשעעניש ראַטעס (n = 25 hCO נעוראָנען, n = 17 t-hCO נעוראָנען; *** P<0.0001).פֿאַר bf, hCO3 און t-hCO3 אין ליניע 1208-2 זענען גענומען געוואָרן פֿון דער זעלבער דיפֿערענציאַציע־פּאַרטיע וואָס איז געהאַלטן געוואָרן אין פּאַראַלעל. g, גענע סעט ענריטשמענט אנאליז (איין-זייטיגע פישער'ס עקזאַקטער טעסט) פון גענעס באדייטנד פארגרעסערט (אַדזשאַסטיד P < 0.05, פאַרלייגן ענדערונג > 2, אויסגעדריקט אין לפּחות 10% פון קערנס) אין t-hCO גלוטאַמאַטערגישע נעוראָנען קאַמפּערד מיט hCO גלוטאַמאַטערגישע נעוראָנען מיט גענע סעטס פון ביידע פרי-רעספּאָנס (ERG) און שפּעט-רעספּאָנס (LRG) טעטיקייט-אָפּהענגיקע גענעס אידענטיפיצירט פון אַן אין וויוואָ מויז שטודיע16 און מענטש-ספּעציפֿישע LRGs פון אין וויטראָ נעוראָנען17. g, גענע סעט ענריטשמענט אנאליז (איין-זייטיגע פישער'ס עקזאַקטער טעסט) פון גענעס באדייטנד פארגרעסערט (אַדזשאַסטיד P < 0.05, פאַרלייגן ענדערונג > 2, אויסגעדריקט אין לפּחות 10% פון קערנס) אין t-hCO גלוטאַמאַטערגישע נעוראָנען קאַמפּערד מיט hCO גלוטאַמאַטערגישע נעוראָנען מיט גענע סעטס פון ביידע פרי-רעספּאָנס (ERG) און שפּעט-רעספּאָנס (LRG) טעטיקייט-אָפּהענגיקע גענעס אידענטיפיצירט פון אַן אין וויוואָ מויז שטודיע16 און מענטש-ספּעציפֿישע LRGs פון אין וויטראָ נעוראָנען17. ג, אַנאַליסיס פון אַבאָרשאַן גאַנווו (односторонний точный критерий Фишера) генов со значительной активацие (5,0,0) קאַנסאַמשאַן > 2, אַ נומער פון מענטשן מיט 10% פון די אַדווייזער) אין די גלאָטאַמאַטערגיטשעס נעטהערלאַנדס פון די הקאָ. глутаматергическими нейронами hCO наборы генов как раннего (ERG), так и позднего (LRG) генов, зависящих от אַקטיאָנס, אַדוואַנטידזשיז און דיסאַדוואַנטידזשיז אין וויוואָ16, און ספּעציעלע פֿאַר LRG אין וויטראָ17. g, אנאליז פון גענע סעט ענריטשמענט (איין-טיילד פישער'ס עקזאַקטער טעסט) פון גענעס מיט באַדייטנדיקער אַקטיוואַציע (אַדזשאַסטיד P<0.05, פאַרלייגן ענדערונג >2, אויסדרוק אין לפּחות 10% פון קערנס) אין t-hCO גלוטאַמאַטערגישע נעוראָנס קאַמפּערד צו hCO גלוטאַמאַטערגישע נעוראָנס סעץ פון ביידע פרי (ERG) און שפּעט (LRG) טעטיקייט-אָפּהענגיקע גענעס אידענטיפיצירט אין אין וויוואָ מײַז16 און מענטש-ספּעציפֿישע LRGs פון נעוראָנס אין וויטראָ17. g，t-hCO谷氨酸能神经元与hCO谷氨酸能神经元相比，t -hCO谷氨酸能神经元显着上调（调整后P<0.05，倍数变化>2, 10% פון די לעצטע 10% פון די צייטן isher精确检验）从体内小鼠研究中鉴定的早期反应(ERG)和晚期反应(LRG) 活性依赖性基因的基因组16 和体外神经元17 中的人类特异 g, t-hco 谷氨酸 神经 元 与 hco 谷氨酸 神经 元 相比 , t-hco 谷氨酸 襞经 兰 神经 兰<0.05 ， 倍数> 2 ， 至少 至少 10%的 细胞 核中 表达） 的 集富集 分析 羧单）体内 小鼠 研究 中 的 早期 反应 反应 反应 和 晚期 反应 反应 (לרג) 活性 基因 嚄 基因璻 16神经元 17 中 中 17 中 17的人类特异性LRG。 g, глутаматергические нейроны t-hCO были значительно активизированы по сравнению с глутаматергический нейским פּ<0,05, קראָססיאָגראַפי> 2, ניט מער 10% אַנאַליז פון אַבאָרשאַן גאַנוף (געוויינטלעך טעסטאַסטעראָון פערזענליכען) דיאַגנאָסיס פון אַקטאַוויישאַן (LRG) мышах אין וויוואָ16 און нейронах אין וויטראָ17. LRG, специфичные для человека. g, t-hCO גלוטאַמאַטערגע נעוראָנען זענען געווען באַדייטנד אַרויפֿרעגולירט קאַמפּערד צו hCO גלוטאַמאַטערגע נעוראָנען (אַדזשאַסטיד P<0.05, פאַרלייגן ענדערונג >2, לפּחות 10%. פרי רעספּאָנס (ERG) און שפּעט רעספּאָנס דזשין ענריטשמענט אַנאַליסיס (איין-טיילד פישער ס עקזאַקטער טעסט) רעספּאָנס טעטיקייט אָפענגיק גענעס (LRGs) אידענטיפֿיצירט אין אין וויוואָ מײַז16 און אין וויטראָ נעוראָנען.17 מענטשלעכע ספּעציפֿישע LRGs.די פּונקטירטע ליניע ווײַזט אויף אַ באָנפֿעראָני-קאָרעקטירטן פּ ווערט פון 0.05. h, GluN גען אויסדרוק (פּסעוודאָ-פּאַקעט און סקיילינג פון יעדן גען) איז געווען באַדײַטנד אַרויפֿרעגולירט אין snRNA-seq רעפּליקעס פון LRG גענעס אין t-hCO גלוטאַמאַטערגישע נעוראָנען. i, אימונאָסטיינינג ווײַזט SCG2 אויסדרוק אין t-hCO (אויבערשטער) און hCO (נידעריקער) נעוראָנען. ווײַסע פײַלן ווײַזן אויף SCG2+ צעלן. סקאַלע באַר, 25 µm. דאַטן ווערן אויסגעדריקט ווי דורכשניטלעך ± סטאַנדאַרט דעוויאַציע.
באַזירט אויף דער געוואקסענער אַקטיוויטעט פון t-hCO באמערקט אין ex vivo סלייסיז, האָט snRNA-seq אַנטפּלעקט אַן אַקטיוויטעט-אָפּהענגיקע ארויפרעגונג פון גענע טראַנסקריפּטן אין t-hCO קאַמפּערד צו hCO אין וויטראָ. גלוטאַמאַטערגישע t-hCO נעוראָנען האָבן אויסגעדריקט העכערע לעוועלס פון גענעס וואָס רעגולירן שפּעטע רעספּאָנס אַקטיוויטעט (פיגור 2g,h), וואָס זענען געפֿונען געוואָרן אין פריערדיקע שטודיעס אין מויז און מענטשלעכע נעוראָנען16,17. למשל, BDNF18, SCG2, און OSTN, אַ פּרימאַט-ספּעציפֿיש אַקטיוויטעט-רעגולירנדיק גענע, האָבן געוויזן געוואקסענע אויסדרוק אין t-hCO נעוראָנען קאַמפּערד צו hCO נעוראָנען (פיגור 2g-i). אַזוי, t-hCO נעוראָנען האָבן אויסגעוויזן פֿאַרבעסערטע מאַטוראַציע קעראַקטעריסטיקס קאַמפּערד צו hCO נעוראָנען דורך טראַנסקריפּשאַנאַל, מאָרפאָלאָגישע, און פאַנגקשאַנאַל אַנאַליזעס.
כדי ווייטער צו אפשאצן די פארבינדונג פון t-hCO מאַטוראַציע מיט מענטשלעכער מוח אַנטוויקלונג, האָבן מיר דורכגעפירט טראַנסקריפּטאָמישע פאַרגלייַכן פון פיטאַל און דערוואַקסענע קאָרטיקאַל צעל טיפּן19,20 און דערוואַקסענע21,22 ווי אויך ברייטע דאַטן וועגן קאָרטיקאַל דזשין אויסדרוק23 בעשאַס אַנטוויקלונג (עקספּאַנדיד דאַטן, פיג. 5). מיט פריערדיקער אַרבעט24, די גלאבאלע hCO און t-hCO טראַנסקריפּטאָם מאַטוראַציע סטאַטוס ביי 7-8 חדשים פון דיפערענציאַציע איז ברייט קאָנסיסטענט מיט אין וויוואָ אַנטוויקלונג צייט און איז מערסט עקוויוואַלענט צו שפּעט פיטאַל לעבן (עקסטענדעד דאַטן פיג. 5אַ). באַמערקענסווערט, מיר האָבן באמערקט געוואקסן טראַנסקריפּטאָם מאַטוראַציע אין t-hCO קאַמפּערד צו עלטער-מאַטשט hCO, ווי אויך טראַנסקריפּטאָם אַקטיוואַציע פארבונדן מיט סינאַפּטאָגענעסיס, אַסטראָגענעסיס, און מייעלינאַטיאָן (עקספּאַנדיד דאַטן, פיג. 5ב-ד). אויף די צעלולאַרע מדרגה, האָבן מיר געפֿונען באַווייַזן פון אַ דין קאָרטעקס סובטיפּ אין t-hCO, מיט קלאַסטערס פון גלוטאַמאַטערגיק נעוראָנס אָוווערלאַפּינג מיט דערוואַקסענע L2/3, L5, און L6 נעוראָן סובטיפּס (פיגור 1י). אין קאנטראסט, קלאסטער איבערלאַפּונג צווישן גלוטאַמאַטערגישע t-hCO נעוראָנען און פיטאַלע קאָרטיקאַלע נעוראָנען איז געווען מער באגרענעצט אין מיטן שוואַנגערשאַפט (אויסגעברייטערטע דאַטן, פיגור 5e-j). צו באַשטימען צי t-hCO נעוראָנען זענען פאַנגקשאַנאַלי ענלעך צו מענטשלעכע פּאָסטנאַטאַל נעאָקאָרטיקאַלע נעוראָנען, האָבן מיר דורכגעפירט עלעקטראָפֿיזיאָלאָגישע רעקאָרדירונגען און אַנאַטאָמישע רעקאָנסטרוקציעס פון מענטשלעכע L2/3 פּיראַמידאַלע נעוראָנען אין שאַרפע סעקשאַנז פון די מענטשלעכע פּאָסטנאַטאַלע קאָרטעקס (אויסגעברייטערטע דאַטן, פיג. 7a). די עלעקטראָפֿיזיאָלאָגישע אייגנשאַפֿטן פון L2/3 פּיראַמידאַלע נעוראָנען זענען געווען ענלעך צו יענע פון ​​t-hCO פּיראַמידאַלע נעוראָנען (אויסגעברייטערטע דאַטן, פיג. 7e). מאָרפאָלאָגיש, L2/3 נעוראָנען פון פּאָסטנאַטאַלע מענטשלעכע סאַמפּאַלז זענען געווען מער ענלעך צו t-hCO ווי צו hCO, כאָטש L2/3 צעלן זענען געווען לענגער, האָבן ענטהאַלטן מער צווייגן אין אַלגעמיין, און האָבן געהאַט אַ העכערע רוקנביין געדיכטקייט (פיג. 3g און אויסגעברייטערטע דאַטן, פיג. 7b-). G).
א, טראַנספּלאַנטאַציע פון ​​hCO פּראָדוצירט דורך קאָנטראָל און TS hiPS צעל ליניעס אין נייַגעבוירענע ראַץ. ב, 3D רעקאָנסטרוקציע פון ​​ביאָסיטין-געפילטע t-hCO נעוראָנען נאָך 8 חדשים פון דיפערענציאַציע. ג, קוואַנטיפיקאַציע פון ​​דורכשניטלעך דענדריטיק לענג (n = 19 קאָנטראָל נעוראָנען, n = 21 TS נעוראָנען; **P = 0.0041). ד, 3D-רעקאנסטרואירטע דענדריטישע צווייגן פון קאנטראל און TS t-hCO ביי 8 חדשים פון דיפערענציאציע, און קוואנטיפיקאציע פון ​​דענדריטישער רוקנביין געדיכטקייט (n = 16 קאנטראל נעוראנען, n = 21 TS נעוראנען, ***P < 0.0001). ד, 3D-רעקאנסטרואירטע דענדריטישע צווייגן פון קאנטראל און TS t-hCO ביי 8 חדשים פון דיפערענציאציע, און קוואנטיפיקאציע פון ​​דענדריטישער רוקנביין געדיכטקייט (n = 16 קאנטראל נעוראנען, n = 21 TS נעוראנען, ***P < 0.0001). ד, 3 ד-רעקאָנסטראָאַל דיווייסאַז פון קאַנטראָול און TS t-hCO איז געווען 8 מעטער. אַדוואַנטידזשיז (n = 16 כוידעשלעך נייַן, n = 21 ץ נייַראָנאָוו, *** פּ <0,0001). ד, 3D רעקאָנסטרוקציע פון ​​דענדריטיק צווייגן פון קאָנטראָל און t-hCO TS ביי 8 חדשים פון דיפערענציאַציע און דענדריטיק רוקנביין געדיכטקייט קוואַנטיפיקאַציע (n=16 קאָנטראָל נעוראָנס, n=21 TS נעוראָנס, ***P<0.0001). d，分化8 个月时对照和TS t-hCO 的3D 重建树突分支，以及树突棘密度的量化1,6个对照神经元，n = 21 个TS 神经元，***P <0.0001）. d , 分化 8 个 时 对照 和 ts t-hco 的 3d 重建 分支 分支 以及 树突棘 导度 1 帖 度 1，神经 元 ， n = 21 个 צ 神经 ， *** p <0.0001 ）. ד, 3 ד-רעקאָנסטרעאַל קאַנטראַביושאַנז און TS t-hCO האָבן 8 מינוט דיפפערענטשאַל קאַנטראָול און TS t-hCO. אַדוואַנטידזשיז (n = 16 כוידעשלעך נייַן, n = 21 ץ נייַראָנאָוו, *** פּ <0,0001). ד, 3D רעקאנסטרוקציע פון ​​קאנטראל דענדריטישע צווייגן און TS t-hCO ביי 8 חדשים פון דיפערענציאציע און דענדריטישע רוקנביין געדיכטקייט קוואנטיפיקאציע (n=16 קאנטראל נעוראנען, n=21 TS נעוראנען, ***P<0.0001).רויטע שטערנס ווײַזן אויף מעגלעכע דענדריטישע ספּיינס. e, ספּאָנטאַנע EPSCs אין קאָנטראָל און TS t-hCO נעוראָנען נאָך 8 חדשים פון דיפערענציאַציע. f, קומולאַטיווע אָפטקייט פּלאַנעווען און קוואַנטיפֿיקאַציע פון ​​אָפטקייט און אַמפּליטוד פון סינאַפּטישע געשעענישן (n=32 קאָנטראָל נעוראָנען, n=26 TS נעוראָנען; **P=0.0076 און P=0.8102). g, שאָל אַנאַליז פון TS און קאָנטראָל נעוראָנען אין hCO און t-hCO. געשטריכלטע ליניעס ווײַזן מענטשלעכע L2/3 פּאָסטנאַטאַלע פּיראַמידאַלע נעוראָנען פֿאַר פֿאַרגלײַך (n = 24 קאָנטראָל t-hCO נעוראָנען, n = 21 TS t-hCO נעוראָנען, n = 8 קאָנטראָל hCO נעוראָנען, און n = 7 TS hCO נעוראָנען). דאַטן ווערן אויסגעדריקט ווי דער דורכשניט ± סטאַנדאַרט דעוויאַציע.
די מעגלעכקייט פון t-hCO צו רעפּליקירן די מאָרפאָלאָגישע און פונקציאָנעלע פֿעיִקייטן פון מענטשלעכע קאָרטעקס נעוראָנען אויף אַ הויך מדרגה האָט אונדז געפֿירט צו ויספאָרשן צי t-hCO קען ווערן גענוצט צו דעטעקטירן קראַנקייט פענאָטיפּעס. מיר האָבן זיך קאָנצענטרירט אויף TS, אַ שווערע נעוראָ-אַנטוויקלונג דיסאָרדער געפֿירט דורך געווינס-פון-פונקציע מוטאַציעס אין דעם גען וואָס קאָדירט CaV1.2, וואָס איניציאירט אַקטיוויטעט-אָפּהענגיקע גען טראַנסקריפּציע אין נעוראָנען. מיר האָבן באַקומען hCO פון דריי TS פּאַציענטן וואָס טראָגן די מערסט פּראָסט סאַבסטיטוציע (p.G406R) און דריי קאָנטראָלן (פיגור 3a). נאָך טראַנספּלאַנטאַציע, האָבן מיר געפֿונען אַז דענדריטיק מאָרפאָלאָגיע איז געווען געביטן אין TS נעוראָנען קאַמפּערד צו קאָנטראָלן (פיגור 3b און יקספּאַנדיד דאַטן, פיגור 8a,b), מיט אַ צוויי-פאַכיקע פאַרגרעסערונג אין דער נומער פון ערשטיק דענדריטן און אַן אַלגעמיין פאַרגרעסערונג אין דורכשניטלעך און אַלגעמיין פאַרקלענערן אין דענדריטיק לענג (פיגור 3c און יקספּאַנדיד דאַטן, פיגור 8c). דאָס איז געווען פֿאַרבונדן מיט אַ געוואקסן געדיכטקייט פון ספּיינז און אַ געוואקסן אָפטקייַט פון ספּאַנטייניאַס EPSCs אין TS קאַמפּערד צו קאָנטראָל נעוראָנען (פיגור 3d-f און יקספּאַנדיד דאַטן, פיגור 8g). ווייטערדיגע אנאליז האט אנטפלעקט מוסטערן פון אומנארמאלער דענדריטישער צווייגונג אין t-hCO TS קאמפערד צו קאנטראלן, אבער נישט אין אין וויטרא TS hCO אין א ענליכער שטאפל פון דיפערענציאציע (פיגור 3ג). דאס איז קאנסיסטענט מיט אונזערע פריערדיגע באריכטן פון אקטיוויטעט-אפהענגיקע דענדריטישער שרינקינג אין TS און אונטערשטרייכט די מעגלעכקייט פון דעם טראנספלאנט פלאטפארמע צו דעטעקטירן קראנקהייט פענאטיפן אין וויווא.
מיר האָבן דעמאָלט געפרעגט אין וואָסער מאָס t-hCO צעלן זענען פאַנגקשאַנאַלי אינטעגרירט אין ראַץ S1. S1 אין ראָודאַנץ באַקומט שטאַרקע סינאַפּטישע אינפוטס פון די יפּסילאַטעראַל ווענטראַל באַסאַל און פּאָסטעריאָר טהאַלאַמיק קערן, ווי אויך די יפּסילאַטעראַל מאָטאָר און סעקאַנדערי סאָמאַטאָסענסיאָרי קאָרטעקסעס, און קאָנטראַלאַטעראַל S1 (פיגור 4אַ). צו ומקערן די יננערוויישאַן מוסטער, מיר האָבן ינפעקטאַד hCO מיט ראַביעס ווירוס-dG-GFP/AAV-G און טראַנספּלאַנטיד hCO אין S1 ראַץ 3 טעג שפּעטער. מיר האָבן באמערקט געדיכטע GFP אויסדרוק אין נעוראָנס פון די יפּסילאַטעראַל S1 און ווענטראַל באַסאַל גאַנגליאַ 7-14 טעג נאָך טראַנספּלאַנטיישאַן (פיגור 4ב, ג). אין דערצו, אַנטיבאָדי סטיינינג פון די טהאַלאַמיק מאַרקער נעטרין G1 האט גילוי די בייַזייַן פון טהאַלאַמיק ענדינגז אין t-hCO (פיגור 4ד, ה). צו אָפּשאַצן צי די אַפערענט פּראַדזשעקשאַנז קענען אַרויסרופן סינאַפּטישע ריספּאָנסעס אין t-hCO צעלן, מיר האָבן דורכגעפירט גאַנצע צעל רעקאָרדינגס פון מענטשלעכע צעלן אין שאַרף סעקשאַנז פון די טהאַלאַמאָקאָרטיקאַל שיכט. עלעקטרישע סטימולאציע פון ​​ראַץ S1, אינעווייניקסטע קאַפּסל, ווייסע מאַטעריע, פייבערז לעבן t-hCO אדער אָפּטאָגענעטישע אַקטיוואַציע פון ​​אָפּסין-אויסדריקנדיקע טהאַלאַמישע ענדינגז אין t-hCO אינדוצירטע קורץ-לעיטענסי EPSCs אין t-hCO נעוראָנען אויסגעשטעלט צו דעם AMPA רעצעפּטאָר אַנטאַגאָניסט NBQX. (פיגור 4f, g און עקסטענדעד דאַטן, פיגור 9a–g). די דאַטן ווייַזן אַז t-hCO איז אַנאַטאָמיש ינטאַגרירט אין די ראַץ מוח און איז ביכולת צו זיין אַקטיווייטיד דורך ראַץ באַלעבאָס געוועב.
א, סכעמאטישע דיאגראם פון א ראביעס טרעקינג עקספערימענט. ב, GFP און מענטש-ספעציפישע STEM121 אויסדרוק צווישן t-hCO און ראַץ סערעבראַל קאָרטעקס (אויבערשטער פּאַנעל). אויך געוויזן איז GFP אויסדרוק אין די ראַץ יפּסילאַטעראַל ווענטראַל באַזאַל קערן (VB) (אונטן לינקס) און יפּסילאַטעראַל S1 (אונטן רעכטס). סקאַלע באַר, 50 µm. די רויטע קוואַדראַטן רעפּרעזענטירן די געביטן פון די מוח וווּ די בילדער זענען גענומען. ג, קוואַנטיפיקאַציע פון ​​סעלז וואָס אויסדריקן GFP (n = 4 ראַץ). ד, ה — נעטרין G1+ טהאַלאַמיק טערמינאַלס אין t-hCO. ד ווייזט אַ קאָראָנאַל סעקציע מיט t-hCO און VB קערנס. סקאַלע באַר, 2 מם. ה ווייזט נעטרין G1 און STEM121 אויסדרוק אין t-hCO (לינקס) און VB (רעכטס) נעוראָנס. סקאַלע באַר, 50 µm. די אָראַנדזשע פּונקטירטע ליניע ינדיקייץ די t-hCO גרענעץ. f, g, איצטיקע שפּורן פון t-hCO נעוראָנען נאָך עלעקטרישע סטימולאַציע אין S1 ראַץ (f) אָדער אינעווייניקסטע קאַפּסל (g), מיט (לילאַ) אָדער אָן (שוואַרץ) NBQX (לינקס). EPSC אַמפּליטודן מיט און אָן NBQX (n = 6 S1 נעוראָנען, *P = 0.0119; און n = 6 אינעווייניקסטע קאַפּסל נעוראָנען, **P = 0.0022) (צענטער). פּראָצענט פון t-hCO נעוראָנען וואָס ווייַזן EPSC אין ענטפער צו עלעקטרישע סטימולאַציע פון ​​ראַץ S1 (f) אָדער אינעווייניקסטע קאַפּסל (g) (רעכטס). aCSF, קינסטלעכע סערעבראָספּינאַל פליסיק. h, סכעמאַטישע דיאַגראַמע פון ​​​​די 2P בילדגעבונג עקספּערימענט (לינקס). אויסדרוק פון GCaMP6s אין t-hCO (מיטן). סקאַלע באַר, 100 µm. פלאָרעסענס צייט-פאַרשפּעטיקונג פון GCaMP6s (רעכטס). i, Z-סקאָר פון ספּאָנטאַנע טעטיקייט פלאָרעסענס. j, סכעמאַטישע אילוסטראַציע פון ​​​​מאָוסטאַטש סטימולאַציע. k, z-געשאַצטע 2P פלואָרעסצענץ טראַיעקטאָריעס אין איין פּראָבע, אויסגעשטעלט מיט וויסקער דעוויאַציע ביי צייט נול (געשטריכלטע ליניע) אין בייַשפּיל צעלן. l, באַפעלקערונג-דורכשניטלעכע z-סקאָר רעספּאָנסעס פון אַלע צעלן אויסגעשטעלט מיט וויסקער דעוויאַציע ביי צייט נול (געשטריכלטע ליניע) (רויט) אָדער ראַנדאָם דזשענערייטאַד צייטשטאַמפּס (גרוי). m. סכעמאַטישע דיאַגראַמע פון ​​דעם עקספּערימענט אויף אָפּטיש מאַרקינג. n, רויע וואָולטידזש קורוועס פון אַ בייַשפּיל t-hCO צעל בעשאַס בלוי לאַזער סטימולאַציע אָדער וויסקער דעפלעקשאַן. רויטע פייַלן ווייַזן די ערשטע ספּייקס געפֿירט דורך ליכט (אויבן) אָדער געפֿירט דורך וויסקער דעפלעקשאַן (אונטן). גרויע שאַדינג ווייזט פּיריאַדז פון וויסקער דעפלעקשאַן. o, שפּיץ ליכט כוואַליעפאָרמז און וויסקער דעפלעקשאַן רעספּאָנסעס. p, ספּייקס פון אַ איין פּרוּוו, אויסגעשטעלט מיט די דעוויאַציע פון ​​די וויסקערס אין די צעלן פון דעם בייַשפּיל. 0 ווייזט וויסקער דעוויאַציע (געשטריכלטע ליניע). q, באַפעלקערונג-דורכשניטלעכע z-סקאָר פייַער קורס פֿאַר אַלע פאָטאָסענסיטיוו צעלן, אויסגעשטעלט מיט וויסקער דעוויאַציע ביי צייט נול (געשטריכלטע ליניע) (רויט) אָדער ראַנדאָם דזשענערייטאַד צייטשטאַמפּס (גרוי). r, פּראָפּאָרציע פון ​​פאָטאָסענסיטיוו איינהייטן באַדייטנד מאָדולירט דורך וויסקער דעפלעקשאַן (n = 3 ראַץ) (לינקס). שפּיץ z-סקאָר לעיטענסי (n = 3 ראַץ; n = 5 (ליכט גרין), n = 4 (טונקל גרין), און n = 4 (ציאַן) וויסקער דעפלעקשאַן מאָדולאַציע איינהייטן פּער ראַץ) (רעכטס). דאַטן ווערן אויסגעדריקט ווי דורכשניטלעך ± סטאַנדאַרט דעפלעקשאַן.
מיר האָבן דעמאָלט געפרעגט צי t-hCO קען אַקטיוויזירט ווערן דורך סענסאָרישע סטימולי אין וויוואָ. מיר האָבן טראַנספּלאַנטירט hCO וואָס אויסדריקט די גענעטיש ענקאָודיד קאַלסיום אינדיקאַטאָרן GCaMP6 אין S1 ראַץ. נאָך 150 טעג, האָבן מיר דורכגעפירט פיברע פאָטאָמעטריע אָדער צוויי-פאָטאָן קאַלסיום ימאַגינג (פיגור 4ה און יקספּאַנדיד דאַטן, פיגור 10אַ). מיר האָבן געפֿונען אַז t-hCO צעלן האָבן אויסגעשטעלט סינגקראַנייזירטע ריטמישע אַקטיוויטעט (פיגור 4י, יקספּאַנדיד דאַטן, פיגור 10ב און סאַפּלעמענטאַרי ווידעא 1). צו כאַראַקטעריזירן שפּיץ t-hCO אַקטיוויטעט, האָבן מיר דורכגעפירט עקסטראַסעלולאַר עלעקטראָפֿיזיאָלאָגישע רעקאָרדינגס אין אַנעסטעזירטע טראַנספּלאַנט ראַץ (עקספּאַנדיד דאַטן, פיגור 10ק-ו). מיר האָבן דזשענערייטאַד סטערעאָטאַקסיק קאָאָרדינאַטן פון MRI בילדער; אַזוי, די רעקאָרדעד וניץ רעפּרעזענטירן פּוטאַטיוו מענטשלעך נעוראָנס, כאָטש עלעקטראָפֿיזיאָלאָגיע אַליין אַלאַוז נישט אַ מינים פון אָפּשטאַם צו זיין באשלאסן. מיר האָבן באמערקט סינגקראַנייזיד בורסטס פון אַקטיוויטעט (עקספּאַנדיד דאַטן, פיגור 10ד). די אויסברוכן האבן געדויערט בערך 460 מיליסעקונדעס און זענען געווען אפגעטיילט מיט שטילקייט פעריאדן פון בערך 2 סעקונדעס (אויסגעברייטערטע דאטן, פיג. 10ד, ה). יחיד איינהייטן האבן געשאסן א דורכשניט פון בערך דריי קוילן פער אויסברוך, וואס איז בערך 73% פון רעגיסטרירטע איינהייטן פער אויסברוך. די אקטיוויטעטן פון יחיד איינהייטן זענען געווען שטארק קארעלירט, און די קארעלאציעס זענען געווען העכער ווי די פון איינהייטן אידענטיפיצירט אין נישט-וואקסינירטע חיות רעקארדירט ​​אונטער די זעלבע באדינגונגען (אויסגעברייטערטע דאטן, פיג. 10ו). צו ווייטער כאראקטעריזירן די שפיץ רעאקציעס פון אידענטיפיצירטע מענטש-דעריוואטירטע נעוראנען, האבן מיר דורכגעפירט ליכט-טאגינג עקספערימענטן אויף אנעסטעזירטע ראצן וואס זענען איבערגעפלאנצט געווארן מיט hCO3 וואס אויסדריקן דעם ליכט-סענסיטיווע קאטיון קאנאל ראדאפסין 2 (hChR2), דורך וועלכן t-hCO3 נעוראנען האבן קורץ-לעיטענסי דערקענונג (ווייניקער ווי 10 מיליסעקונדעס) אין רעאקציע צו בלויע ליכט סטימולן (פיג. 4מ-אָ). t-hCO נעוראָנען האָבן אויסגעוויזן אויסברוכן פון ספּאָנטאַנע אַקטיוויטעט ביי פרעקווענצן ענלעך צו די וואָס זענען באמערקט געוואָרן אין קאַלסיום בילדגעבונג, ווי אויך עלעקטראָפֿיזיאָלאָגישע רעקאָרדירונגען דורכגעפֿירט אין t-hCO אָן ליכט מאַרקינג (אויסגעברייטערטע דאַטן, בילד 10c-g). קיין ספּאָנטאַנע אַקטיוויטעט איז נישט באמערקט געוואָרן אין די קאָרעספּאָנדירנדיקע סטאַגעס פון hCO רעקאָרדירט ​​אין וויטראָ. צו אָפּשאַצן צי t-hCO קען אַקטיוויזירט ווערן דורך סענסאָרישע סטימולי, האָבן מיר קורץ אָפּגעליגט די ראַץ וויסקערס אַוועק פֿון t-hCO (בילד 4j,m און אויסגעברייטערטע דאַטן, בילד 10h,k). לויט פֿריִערדיקע שטודיעס8,10, האָט אַ סאַבסעט פון t-hCO צעלן געוויזן געוואקסענע אַקטיוויטעט אין ענטפער צו וויסקער אָפּלייגונג, וואָס איז נישט באמערקט געוואָרן ווען די דאַטן זענען קאַמפּערד מיט ראַנדאָם צייט שטעמפּלס (בילד 4k–q און אויסגעברייטערטע דאַטן, בילד 10h–q). טאַקע, וועגן 54% פון די אָפּטאָ-לייבאַלד איין וניץ האָבן געוויזן אַ באַדייטנד געוואקסענע אויפרעגונג קורס נאָך וויסקער סטימולאַציע, שפּיץ ביי וועגן 650 ms (בילד 4r). צוזאַמען גענומען, פֿאָרשלאָגן די דאַטן אַז t-hCO באַקומט צונעמען פונקציאָנעלע אינפוטס און קען ווערן אַקטיוויזירט דורך סביבה'דיקע סטימולי.
מיר האָבן דעמאָלט אויסגעפאָרשט צי t-hCO קען אַקטיווירן קרייזן אין ראַץ צו קאָנטראָלירן נאַטור. מיר האָבן ערשט אויסגעפאָרשט צי די אַקסאָנס פון t-hCO נעוראָנען פּראַיעקטירן אין די אַרומיקע געוועבן פון די ראַץ. מיר האָבן ינפעקטירט hCO מיט אַ לענטיווירוס וואָס קאָדירט hChR2 פיוזד צו EYFP (hChR2-EYFP). נאָך 110 טעג, האָבן מיר באמערקט EYFP אויסדרוק אין יפּסילאַטעראַל קאָרטיקאַל מקומות, אַרייַנגערעכנט די אָדיטאָרי, מאָטאָר און סאָמאַטאָ-סענסאָרי קאָרטעקסעס, ווי אויך אין סובקאָרטיקאַל מקומות, אַרייַנגערעכנט די סטריאַטום, היפּאָקאַמפּוס און טאַלאַמוס (פיגור 5אַ). צו אַססעסס צי די עפערענט פּראַדזשעקשאַנז קענען אַרויסרופן סינאַפּטיק ריספּאָנסעס אין ראַץ סעלז, האָבן מיר אָפּטיש אַקטיוויזירט t-hCO סעלז וואָס אויסדריקן hChR2-EYFP דורך רעקאָרדינג ראַץ סערעבראַל קאָרטעקס סעלז אין שאַרף מאַרך סעקשאַנז. אַקטיוואַציע פון ​​t-hCO אַקסאָנס מיט בלוי ליכט ינדוסט קורץ-לעטענסי EPSCs אין ראַץ פּיראַמידאַל קאָרטעקס נעוראָנען, וואָס זענען געווען בלאַקט דורך NBQX (פיגס. 5ב-ג). דערצו, קענען די רעאקציעס ווערן בלאקירט דורך טעטראדאטאקסין (TTX) און צוריקגעשטעלט דורך 4-אמינאפירידין (4-AP), וואס ווייזט אז זיי זענען געווען געפֿירט דורך מאנאסינאפטישע פארבינדונגען (פיגור 5e).
א, סכעמאטישע דיאַגראַמע פון ​​אַקסאָן טראַקינג (לינקס). t-hCO EYFP אויסדרוק (רעכטס). סקאַלע באַר, 100 µm. A1, אָדיטאָרישער קאָרטעקס, ACC, אַנטעריאָר סינגולאַט קאָרטעקס, ד. סטריאַטום, דאָרסאַל סטריאַטום, HPC, היפּאָקאַמפוס; דיאַפראַגמע, לאַטעראַל סעפּטום, mPFC, מעדיאַל פּרעפראָנטאַל קאָרטעקס, פּירי, פּיריפאָרם קאָרטעקס, v. סטריאַטום, ווענטראַל סטריאַטום, VPM, ווענטראָפּאָסטאָמעדיאַל קערן פון די טאַלאַמוס, VTA, ווענטראַל טעגמענטאַל געגנט. די רויטע קוואַדראַטן רעפּרעזענטירן די געביטן פון די מוח וווּ די בילדער זענען גענומען געוואָרן. ב, סכעמאטישע דיאַגראַמע פון ​​די סטימולאַציע עקספּערימענט. ג, ד, ביישפילן פון די רעאַקציע פון ​​בלוי ליכט-ינדוסט פאָטאָקראַנט (אויבן) און וואָולטידזש (אונטן) אין מענטשלעכע (ג) EYFP+ t-hCO אָדער ראַץ (ד) EYFP- צעלן. e, f, איצטיקע שפּורן פון ראַץ נעוראָנען נאָך בלוי ליכט סטימולאַציע פון ​​t-hCO אַקסאָנס מיט TTX און 4-AR (גרין), TTX (גרוי) אָדער aCSF (שוואַרץ) (e), מיט (וויאָלעט) אָדער אָן (שוואַרץ)) ) NBQX (e). g, לעטאַנסי פון רעאַקציעס ינדוסט דורך בלוי ליכט אין ראַץ צעלן (n = 16 צעלן); האָריזאָנטאַלע באַרס ווייַזן דורכשניטלעך לעטאַנסי (7.13 מס) (לינקס). אַמפּליטוד פון ליכט-אַרויסגערופענע EPSCs רעקאָרדירט ​​מיט אָדער אָן NBQX (n = 7 צעלן; ***P < 0.0001) (מיטן). אַמפּליטוד פון ליכט-אַרויסגערופענע EPSCs רעקאָרדירט ​​מיט אָדער אָן NBQX (n = 7 צעלן; ***P < 0.0001) (מיטן). עמפּלוייז פון עפּסק סיסטעם, איז באזירט אויף NBQX (n = 7 קילאָמעטערס; ***P <0,0001) (אין סענטרע). אַמפּליטוד פון ליכט-אינדוצירטע EPSCs רעקאָרדירט ​​מיט אָדער אָן NBQX (n = 7 צעלן; ***P < 0.0001) (צענטער).使用或不使用NBQX 记录的光诱发EPSC 的振幅（n = 7 个细胞；***P <0.0001）（中）。使用或不使用NBQX 记录的光诱发EPSC 的振幅（n = 7 个细胞；***P <0.0001）（中）。 עמפּלוייז פון עפּסק סיסטעם, איז באזירט אויף NBQX (n = 7 קילאָמעטערס; ***P <0,0001) (אין סענטרע). אַמפּליטוד פון ליכט-אינדוצירטע EPSCs רעקאָרדירט ​​מיט אָדער אָן NBQX (n = 7 צעלן; ***P < 0.0001) (צענטער).פּראָצענט פון ראַץ צעלן וואָס ווייַזן EPSCs וואָס רעאַגירן צו בלוי ליכט (רעכטס). h, סכעמאַטישע דיאַגראַמע פון ​​אַ נאַטוראַל אַרבעט. d0, טאָג 0. i. פאָרשטעלונג פון בייַשפּיל חיות אויף טאָג 1 (לינקס) אָדער טאָג 15 (רעכטס) פון טריינינג. די דורכשניטלעכע צאָל ליקס דורכגעפירט אויף טאָג 1 (לינקס) אָדער טאָג 15 (רעכטס צענטער) (n = 150 בלוי ליכט פּראָבעס, n = 150 רויט ליכט פּראָבעס; ***P < 0.0001). די דורכשניטלעכע צאָל ליקס דורכגעפירט אויף טאָג 1 (לינקס) אָדער טאָג 15 (רעכטס צענטער) (n = 150 בלוי ליכט פּראָבעס, n = 150 רויט ליכט פּראָבעס; ***P < 0.0001). די סטאַנדאַרט פון 15 (אין די סוף פון די צייט) (n = 150 סעסיע, נס) n = 150 אָספּיטאַל מיט קוואַנטום ***P <0,0001). דורכשניטלעכע צאָל ליקס דורכגעפירט אויף טאָג 1 (לינקס) אָדער טאָג 15 (צענטער רעכטס) (n = 150 בלוי ליכט פּראָבעס, n = 150 רויט ליכט פּראָבעס; ***P < 0.0001).第1 天（左）或第15 天（右中）执行的平均舔次数（n = 150 次蓝光试验）n = 150ן次红光试验；***P <0.0001）.第1 天（左）或第15 天（右中）执行的平均舔次数（n = 150 次蓝光试验）n = 150ן次红光试验；***P <0.001 די סטאַנדאַרט פון 15 (אין די סוף פון די צייט) (n = 150 סעסיע, נס) n = 150 אָספּיטאַל מיט קוואַנטום ***P <0,0001). דורכשניטלעכע צאָל ליקס דורכגעפירט אויף טאָג 1 (לינקס) אָדער טאָג 15 (צענטער רעכטס) (n = 150 בלוי ליכט פּראָבעס, n = 150 רויט ליכט פּראָבעס; ***P < 0.0001).קומולאַטיווע ליקס פֿאַר רויט און בלוי ליכט טריאַלס אויף טאָג 1 (צענטער לינקס) אָדער טאָג 15 (רעכטס). NS, נישט באַטייַטיק. j,k, נאַטור קעראַקטעריסטיקס פון אַלע אַנימאַלס טראַנספּלאַנטיד מיט t-hCO וואָס אויסדריקן hChR2-EYFP (j) אָדער קאָנטראָל פלאָראָפאָר (k) אויף טאָג 1 אָדער 15 (hChR2-EYFP: n = 9 ראַץ, ** P = 0.0049; קאָנטראָל: n = 9, P = 0.1497). ל, עוואָלוציע פון ​​פּרעפֿערענץ כעזשבן (n = 9 hChR2, n = 9 קאָנטראָל; **P < 0.001, ***P < 0.0001). ל, עוואָלוציע פון ​​פּרעפֿערענץ כעזשבן (n = 9 hChR2, n = 9 קאָנטראָל; **P < 0.001, ***P < 0.0001). l, Эволюция показателя предпочтения (n = 9 hChR2, n = 9 קאָנטראָולניх; **P <0,001, ***P <0,0001). ל, עוואָלוציע פון ​​פּרעפֿערענץ כעזשבן (n = 9 hChR2, n = 9 קאָנטראָלן; **P < 0.001, ***P < 0.0001). l，偏好评分的演变（n = 9 הChR2，n = 9 对照；**P <0.001，***P <0.0001）. l，偏好评分的演变（n = 9 הChR2，n = 9 对照；**P <0.001，***P <0.0001）. l, Эволюция показателей предпочтения (n = 9 hChR2, n = 9 קאָנטראָלעי; **P <0,001, ***P <0,0001). ל, עוואָלוציע פון ​​פּרעפֿערענץ סקאָרז (n = 9 hChR2, n = 9 קאָנטראָלס; **P < 0.001, ***P < 0.0001).m, FOS אויסדרוק אין ענטפער צו אָפּטאָגענעטיש אַקטיוואַציע פון ​​t-hCO אין S1. בילדער פון FOS אויסדרוק (לינקס), און קוואַנטיפֿיקאַציע (n = 3 פּער גרופּע; *P < 0.05, **P < 0.01 און ***P < 0.001) (רעכטס) ווערן געוויזן. בילדער פון FOS אויסדרוק (לינקס), און קוואַנטיפֿיקאַציע (n = 3 פּער גרופּע; *P < 0.05, **P < 0.01 און ***P < 0.001) (רעכטס) ווערן געוויזן. וויסנשאפטלעכע פאָס (סלויף) און קאַלקיאַלייטיד פּראַסעסאַז (n = 3 פֿאַר די שפּיל; * פּ <0,05, <0, 0, פּ <0, 0***) (справа). בילדער פון FOS אויסדרוק (לינקס) און קוואַנטיפֿיקאַציע (n = 3 פּער גרופּע; *P<0.05, **P<0.01, און ***P<0.001) ווערן געוויזן (רעכטס).显示了FOS 表达（左）和量化（每组n = 3；*P < 0.05、**P < 0.01 和***P <0.001））；像〳）显示了FOS 表达（左）和量化（每组n = 3；*P < 0.05、**P < 0.01 和***P <0.001））；像〳） וויסנשאפטלעכע פאָס (סלויף) און קאַלקיאַלייטיד פּראַסעסאַז (n = 3 פֿאַר די שפּיל; * פּ <0,05, <0, 0, פּ <0, 0***) (справа). בילדער פון FOS אויסדרוק (לינקס) און קוואַנטיפֿיקאַציע (n = 3 פּער גרופּע; *P<0.05, **P<0.01, און ***P<0.001) ווערן געוויזן (רעכטס).סקאַלע באַר, 100 מיקראָמעטער. דאַטן ווערן אויסגעדריקט ווי דורכשניט ± סטאַנדאַרט טעות פון BLA, באַזאָלאַטעראַל טאָנסיל, MDT, דאָרסאָמעדיאַל טהאַלאַמיק קערן, PAG, פּעריאַקוועדוקטאַל גרוי.
צום סוף, האבן מיר געפרעגט צי t-hCO קען מאדולירן ראַץ נאַטור. צו פּרובירן דאָס, האבן מיר טראַנספּלאַנטירט hChR2-EYFP-אויסדריקנדיק hCO אין S1, און 90 טעג שפּעטער, האבן מיר אימפּלאַנטירט אָפּטישע פֿאַזערס אין t-hCO פֿאַר ליכט דעליווערי. מיר האבן דעמאָלט טרענירט די ראַץ מיט אַ מאָדיפֿיצירטער אָפּעראַנט קאַנדישאַנינג פּאַראַדיגם (פיגור 5ה). מיר האבן געשטעלט די חיות אין אַ נאַטוראַל טעסט קאַמער און ראַנדאָם געווענדט 5 סעקונדע בלויע (473 נאַנאָמעטער) און רויטע (635 נאַנאָמעטער) לאַזער סטימולן. חיות האבן באַקומען אַ וואַסער באַלוינונג אויב זיי האבן געלעקט בעת בלוי ליכט סטימולאַציע אָבער נישט געלעקט בעת רויט ליכט סטימולאַציע. אויף דעם ערשטן טאָג פון טריינינג, האבן די חיות געוויזן קיין חילוק אין לעקן ווען סטימולירט מיט בלוי אָדער רויט ליכט. אָבער, אויף טאָג 15, חיות טראַנספּלאַנטירט מיט hCO אויסדריקנדיק hChR2-EYFP האבן געוויזן מער אַקטיווע לעקן ווען סטימולירט מיט בלוי ליכט קאַמפּערד צו רויט ליכט סטימולאַציע. די ענדערונגען אין לעקן נאַטור זענען נישט באמערקט געוואָרן אין קאָנטראָל חיות טראַנספּלאַנטירט מיט hCO וואָס אויסדריקן די קאָנטראָל פלאָראָפאָר (לערנען הצלחה קורס: hChR2 89%, EYFP 0%, פיגור 5i-1 און סאַפּלעמענטאַרי ווידעא 2). די דאַטן פֿאָרשלאָגן אַז t-hCO צעלן קענען אַקטיווירן ראַט נעוראָנען צו סטימולירן באַלוינונג-זוכן נאַטור. צו געפֿינען אויס וועלכע ראַט t-hCO נעוראַל קרייזן קען זיין ינוואַלווד אין די נאַטור ענדערונגען, מיר אָפּטאָגענעטיקלי אַקטיוויירט t-hCO אין טריינד חיות און כאַרוואַסטיד געוועבן 90 מינוט שפּעטער. יממונאָכיסטאָכעמיע האט גילוי אויסדרוק פון די טעטיקייט-אָפענגיק FOS פּראָטעין אין עטלעכע מאַרך מקומות ינוואַלווד אין מאָוטיווייטיד נאַטור, אַרייַנגערעכנט די מעדיאַל פּרעפראָנטאַל קאָרטעקס, מעדיאַל טהאַלאַמוס, און פּעריאַקוועדוקטאַל גרוי מאַטעריע, וואָס איז געווען אויסגעדריקט אָדער אין אַנסטימיאַלייטיד קאָנטראָל חיות אָדער אין חיות. רייַז. 5m). צוזאַמען גענומען, די דאַטן פֿאָרשלאָגן אַז t-hCO קען מאָדולירן ראַט נעוראָנאַל טעטיקייט צו דרייוו נאַטור.
נעוראַלע אָרגאַנאָידן רעפּרעזענטירן אַ פּראַמישינג סיסטעם פֿאַר שטודירן מענטשלעכע אַנטוויקלונג און קראַנקייט אין וויטראָ, אָבער זיי זענען באַגרענעצט דורך דעם מאַנגל פון פֿאַרבינדונגען צווישן קרייזן וואָס עקזיסטירן אין וויוואָ. מיר האָבן דעוועלאָפּעד אַ נייַע פּלאַטפאָרמע אין וועלכער מיר האָבן טראַנספּלאַנטירט hCO אין S1 פון ימיונאָקאָמפּראָמיסעד פרי פּאָסטנאַטאַל ראַץ צו שטודירן מענטשלעכע צעל אַנטוויקלונג און פונקציע אין וויוואָ. מיר האָבן געוויזן אַז t-hCO אַנטוויקלט דערוואַקסן צעל טייפּס נישט באמערקט אין וויטראָ28 און אַז t-hCO איז אַנאַטאָמיש און פאַנגקשאַנאַלי ינטאַגרייטיד אין די נאַגער מוח. די ינטאַגריישאַן פון t-hCO אין נאַגער נעוראַל קרייזן האט דערלויבט אונדז צו שאַפֿן אַ פֿאַרבינדונג צווישן מענטשלעכע צעלולאַרע טעטיקייט און שטודירט כייַע נאַטור, ווייַזנדיק אַז t-hCO נעוראָנס קענען מאָדולירן ראַץ נעוראָנאַל טעטיקייט צו דרייוו נאַטוראַל ריספּאָנסעס.
די פּלאַטפאָרמע וואָס מיר באַשרײַבן האָט עטלעכע מעלות איבער פריערדיקע פאָרשונגען וועגן טראַנספּלאַנטירן מענטשלעכע צעלן אין ראָודאַנט מוחות. ערשטנס, האָבן מיר טראַנספּלאַנטירט hCO אין די אַנטוויקלנדיקע קאָרטעקס פון פריע פּאָסטנאַטאַלע ראַץ, וואָס קען פֿאַרלייכטערן אַנאַטאַמישע און פאַנגקשאַנאַלע אינטעגראַציע. צווייטנס, t-hCO MRI מאָניטאָרינג האָט אונדז דערלויבט צו שטודירן גראַפט פּאָזיציע און וווּקס אין לעבעדיקע חיות, וואָס האָט אונדז דערלויבט צו דורכפירן לאַנג-טערמין מולטי-חיה שטודיעס און פעסטשטעלן די פאַרלעסלעכקייט פון עטלעכע hiPS צעל ליניעס. צום סוף, האָבן מיר טראַנספּלאַנטירט גאַנצע אָרגאַנאָידן, אַנשטאָט אפגעזונדערטע איין צעל סאַספּענשאַנז, וואָס זענען ווייניקער דעסטרוקטיוו צו מענטשלעכע צעלן און קענען העכערן די אינטעגראַציע און דזשענעריישאַן פון מענטשלעכע קאָרטעקס נעוראָנס אין ראַץ מוחות.
מיר אנערקענען אז טראץ פארשריט אין דעם פלאטפארמע, פארמיידן צייטווייליגע, ספעציעלע, און קראָס-ספּעציעס באגרענעצונגען די פאָרמירונג פון מענטשלעכע נעוראַלע קרייזן מיט הויך געטריישאַפט, אפילו נאָך טראַנספּלאַנטאַציע אין אַ פרי בינע פון ​​אַנטוויקלונג. למשל, עס איז נישט קלאָר צי די ספּאָנטאַנע טעטיקייט באמערקט אין t-hCO רעפּרעזענטירט אַ אַנטוויקלונגס פענאָטיפּ ענלעך צו די ריטמישע טעטיקייט באמערקט בעשאַס קאָרטיקאַל אַנטוויקלונג, אָדער צי עס איז רעכט צו דער אַוועק פון סאַפּרעסיוו צעל טייפּס פאָרשטעלן אין t-hCO. סימילאַרלי, עס איז נישט קלאָר צו וואָס מאָס די אַוועק פון לאַמינאַציע אין t-hCO אַפעקטירט קייט קאַנעקטיוויטי30. צוקונפֿט אַרבעט וועט פאָקוס אויף ינטאַגרייטינג אנדערע צעל טייפּס אַזאַ ווי מענטשלעך מיקראָגליאַ, מענטשלעך ענדאָטעליאַל סעלז, און וועריינג פּראָפּאָרציעס פון GABAergic ינטערנעוראָנס ווי געוויזן ניצן אַסעמבלי 6 אין וויטראָ, ווי געזונט ווי פֿאַרשטיין ווי נעוראַלע ינטאַגריישאַן און פּראַסעסינג קענען פּאַסירן אין געביטן t-hCO. טראַנסקריפּשאַנאַל, סינאַפּטיק און ביכייוויעראַל לעוועלס אין סעלז באקומען פון פּאַטיענץ.
אינגאנצן, רעפּרעזענטירט די אין וויוואָ פּלאַטפאָרמע אַ שטאַרקע רעסורס וואָס קען קאָמפּלעמענטירן אין וויטראָ מענטשלעכע מוח אַנטוויקלונג און קראַנקהייט פאָרשונג. מיר ערוואַרטן אַז די פּלאַטפאָרמע וועט אונדז דערלויבן צו אַנטדעקן נייַע סטראַנד-לעוועל פענאָטיפּעס אין אַנדערש שווער צו דערגרייכן פּאַציענט-דעריוואַטעד סעלז און פּרובירן נייַע טעראַפּיוטיק סטראַטעגיעס.
מיר האָבן גענערירט hCO2.5 פֿון HiPS צעלן ווי פריער באַשריבן. כּדי צו אָנהייבן hCO פּראָדוקציע פֿון hiPS צעלן וואָס זענען קאָלטיווירט געוואָרן אויף פֿידער שיכטן, זענען גאַנצע קאָלאָניעס פֿון hiPS צעלן אַרויסגענומען געוואָרן פֿון קולטור שיסלען מיט דיספּאַסע (0.35 מג/מל) און איבערגעפֿירט געוואָרן צו גאָר נידעריק-אַטאַטשמענט פּלאַסטיק קולטורן וואָס האָבן ענטהאַלטן שיסלען מיט hiPS צעל קולטור מעדיום. (קאָרנינג) סופּלעמענטירט מיט צוויי SMAD אינהיביטאָרן דאָרסאָמאָרפֿין (5 μM; P5499, Sigma-Aldrich) און SB-431542 (10 μM; 1614, Tocris) און ROCK אינהיביטאָר Y-27632 (10 μM; S1049, Selleckchem). בעת די ערשטע 5 טעג, איז די hiPS צעל מעדיום געטוישט געוואָרן טעגלעך און דאָרסאָמאָרפֿין און SB-431542 זענען צוגעגעבן געוואָרן. אום זעקסטן טאג אין סוספענשאן, זענען נעוראלע ספערוידן אריבערגעפירט געווארן צו נעוראלע מעדיום וואס אנטהאלט נעוראבאסאל-א (10888, לייף טעקנאַלאַדזשיז), B-27 סופּלעמענט אָן וויטאַמין א (12587, לייף טעקנאַלאַדזשיז), גלוטאַמאַקס (1:100, לייף טעקנאַלאַדזשיז), פּעניסיללין און סטרעפּטאָמיצין (1:100, לייף טעקנאַלאַדזשיז) און סופּלעמענטירט מיטן עפּידערמאַלן וואוקס פאַקטאָר (EGF; 20 ng ml−1; R&D סיסטעמס) און פיבראָבלאַסט וואוקס פאַקטאָר 2 (FGF2; 20 ng ml−1; R&D סיסטעמס) ביזן 24סטן טאג. פון טאג 25 ביזן 42סטן טאג, איז דער מעדיום סופּלעמענטירט געווארן מיטן מוח-דערייוודן נעוראָטראָפֿישן פאַקטאָר (BDNF; 20 ng ml−1, פּעפּראָטעק) און נעוראָטראָפֿין 3 (NT3; 20 ng ml−1; פּעפּראָטעק) מיט מעדיום וועקסל יעדן צווייטן טאג. אום זעקסטן טאג אין סוספענשאן, זענען נעוראלע ספערוידן אריבערגעפירט געווארן צו נעוראלע מעדיום וואס אנטהאלט נעוראבאסאל-א (10888, לייף טעקנאַלאַדזשיז), B-27 סופּלעמענט אָן וויטאַמין א (12587, לייף טעקנאַלאַדזשיז), גלוטאַמאַקס (1:100, לייף טעקנאַלאַדזשיז), פּעניסיללין און סטרעפּטאָמיצין (1:100, לייף טעקנאַלאַדזשיז) און סופּלעמענטירט מיטן עפּידערמאַלן וואוקס פאַקטאָר (EGF; 20 ng ml−1; R&D סיסטעמס) און פיבראָבלאַסט וואוקס פאַקטאָר 2 (FGF2; 20 ng ml−1; R&D סיסטעמס) ביזן 24סטן טאג. פון טאג 25 ביזן 42סטן טאג, איז דער מעדיום סופּלעמענטירט געווארן מיטן מוח-דערייוודן נעוראָטראָפֿישן פאַקטאָר (BDNF; 20 ng ml−1, פּעפּראָטעק) און נעוראָטראָפֿין 3 (NT3; 20 ng ml−1; פּעפּראָטעק) מיט מעדיום וועקסל יעדן צווייטן טאג.אום זעקסטן טאָג אין סאַספּענשאַן, זענען די נעוראַלע ספעראָידן איבערגעפירט געוואָרן צו אַ נעוראַלן מעדיום וואָס האָט ענטהאַלטן נעוראָבאַסאַל-A (10888, לייף טעכנאָלאָגיעס), B-27 סופּלעמענט אָן וויטאַמין A (12587, לייף טעכנאָלאָגיעס), גלוטאַמאַקס (1:100, לייף טעכנאָלאָגיעס), פּעניסיללין.и стрептомицин (1:100, לעבן טעטשנאָלאָגיעס) и дополнены эпидермальным фактором роста (EGF; 20 нг/мл; R&D Systems) און фактором роста 2GF; нг/мл; ר & די סיסטעמס) צו 24-го дня. און סטרעפּטאָמיצין (1:100, לייף טעכנאָלאָגיעס) און סופּלעמענטירט מיט עפּידערמאַל גראָוט פאַקטאָר (EGF; 20 ng/ml; R&D סיסטעמס) און פיבראָבלאַסט גראָוט פאַקטאָר 2 (FGF2; 20 ng/ml; R&D סיסטעמס) ביז טאָג 24.פֿון טעג 25 ביז 42, איז צוגעגעבן געוואָרן צום מעדיום דער מוח-דערייווד נעוראָטראָפֿישער פֿאַקטאָר (BDNF; 20 ng ml-1, פּעפּראָטעק) און נעוראָטראָפֿין 3 (NT3; 20 ng ml-1, פּעפּראָטעק), און מען האָט דאָס מעדיום געטוישט יעדן צווייטן טאָג.在悬浮的第6 天，将神经球体转移到含有neurobasal-A（10888, לעבן טעטשנאָלאָגיעס）、不含维生素A-2补充剂 (12587, לעבן טעטשנאָלאָגיעס), גלוטאַמאַקס (1:100), לעבן טעטשנאָלאָגיעס), טעטשנאָלאָגיעס）并辅以表皮生长因子（EGF；20 ng מל-1；ר&די סיסטעמס）和成纤维细胞生长因子2（FGF2；20 ng מל-1；ר&די סיסטעמען）直至第24 天.在 悬浮 的 第 第 6 天 将 神经 球体 转移 含有 含有 נעוראָבאַסאַל-אַ （10888 ， לעבן טעטשנאָלאָגיעס０ 焟 縴b-27 补充剂 （12587 ， Life Technologies） Glutamax （1: 100 ， Life TechNOGIS 青霉素 的 祴经 培养 基 中 链 铈 1， טעטשנאָלאָגיעס） 表皮 生长 因子 ((((20 נג מל-1 ； ר & די סיסטעמס) 成 纤维 细胞 生长 2 （פגפ2 ； 20 נג מל- 1；ר & די סיסטעמעןＴ 〩 笛 2 ） אין די 6-יאָר פון די לעצטע יאָרן, די 10888, לעבן טעטשנאָלאָגיעס, די 27, 10888, לעבן טעטשנאָלאָגיעס. А (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies), пенициллин- нейтрализованный стрептомицин (1:100, Life Technologies) с добавлением эпица (EGF; 20 нг мл-1; ר & די סיסטעמס) און фактора роста фибробластов 2 (FGF2; 20 нг מל-1) 1; אום טאג 6, זענען די נעוראָספערע סאַספּענשאַנז געטוישט געוואָרן צו אַ סאַפּלאַמענט מיט נעוראָבאַסאַל-A (10888, לייף טעכנאָלאָגיעס), B-27 סאַפּלאַמענט אָן וויטאַמין A (12587, לייף טעכנאָלאָגיעס), גלוטאַמאַקס (1:100, לייף טעכנאָלאָגיעס), פּעניסיללין-נעוטראַליזירט סטרעפּטאָמיצין (1:100, לייף טעכנאָלאָגיעס) סאַפּלאַמענטירט מיט עפּידערמאַל גראָוט פאַקטאָר (EGF; 20 ng ml-1; R&D סיסטעמס) און פיבראָבלאַסט גראָוט פאַקטאָר 2 (FGF2; 20 ng ml-1) 1; ר & די סיסטעמס) ביז 24 טעג. ר&ד סיסטעמען) ביזן 24סטן טאג.פֿון טעג 25 ביז 42, איז צוגעגעבן געוואָרן צום קולטור-מעדיום יעדן צווייטן טאָג נעוראָטראָפֿישער פֿאַקטאָר פֿון מוח (BDNF; 20 ng ml-1, Peprotech) און נעוראָטראָפֿישער פֿאַקטאָר 3 (NT3; 20 ng ml-1, Peprotech). מעדיום וועקסלט איין מאָל.אָנהייבנדיק פֿון טאָג 43, איז hCO3 געהאַלטן געוואָרן אין אַן אומגעזונטן נעוראָבאַסאַל-A מעדיום (NM; 1088022, טערמאָ פֿישער) מיט מעדיום וועקסל יעדע 4-6 טעג. כּדי צו באַקומען hCO3 פֿון hiPS צעלן וואָס זענען קאָלטיווירט געוואָרן אונטער פֿיטערלאָזע באַדינגונגען, זענען hiPS צעלן אינקובירט געוואָרן מיט Accutase (AT-104, Innovate Cell Technologies) ביי 37°C פֿאַר 7 מינוט, דיסאָסיִירט אין איינציקע צעלן, און געלייגט אויף AggreWell 800 פּלאַטעס (34815, STEMCELL Technologies) מיט אַ געדיכטקייט פֿון 3 × 106 איינציקע צעלן פּער קוואל אין Essential 8 מעדיום וואָס איז געווען סופּלעמענטירט מיטן ROCK אינהיביטאָר Y-27632 (10 μM; S1049, Selleckchem). נאך 24 שעה, זענען די מעדיע אין די וועללס פּיפּעטירט געוואָרן אַרויף און אַראָפּ אין מעדיע וואָס האט ענטהאַלטן עסענטשעל 6 מעדיע (A1516401, לייף טעכנאָלאָגיעס) סופּלעמענטירט מיט דאָרסאָמאָרפין (2.5 μM; P5499, סיגמאַ-אַלדריטש) און SB-431542 (10 μM; 1614). , טאָקרידאַ). פון טעג 2 ביז 6, איז עסענטשעל 6 מעדיום טעגלעך ריפּלייסט געוואָרן מיט דאָרסאָמאָרפין און סופּלעמענט SB-431542. פון זעקסטן טאָג, זענען די נעוראָספערע סאַספּענשאַנז איבערגעפירט געוואָרן צום נעוראָבאַזאַל מעדיום און געהאלטן ווי אויבן באַשריבן.
אלע כייַע פּראָצעדורן זענען דורכגעפירט געוואָרן לויט די כייַע זאָרג גיידליינז באַשטעטיקט דורך די סטאַנפֿאָרד אוניווערסיטעט לאַבאָראַטאָריע כייַע זאָרג אַדמיניסטראַטיווע קאמיטעט (APLAC). שוואַנגערע עוטהימישע RNU (rnu/+) ראַץ זענען געקויפט געוואָרן (טשאַרלס ריווער לאַבאָראַטאָריעס) אָדער געהויזט. כייַע איז געהאַלטן געוואָרן אויף אַ 12-שעה ליכט-פינסטער ציקל מיט עסן און וואַסער אַד לביטום. נאַקעטע (FOXN1–/–) ראַץ הינטעלעך פון דריי ביז זיבן טעג אַלט זענען אידענטיפיצירט געוואָרן דורך דעם וואוקס פון אומרייפע באָרדז איידער די קאַלינג. הינטעלעך (זכר און ווייַבלעך) זענען אַנעסטעזירט געוואָרן מיט 2-3% יסאָפֿלוראַן און געשטעלט אויף אַ סטערעאָטאַקסיק ראַם. א טרעפּאַניישאַן פון די שאַרבן מיט אַ דיאַמעטער פון בעערעך 2-3 מם העכער S1 איז דורכגעפירט געוואָרן בשעת די אָרנטלעכקייט פון די דוראַ מאַטער איז געהאַלטן געוואָרן. דערנאָך ניצט אַ 30-G נאָדל (בעערעך 0.3 מם) גלייך אַרויס פון די קראַניאָטאָמי צו דורכשטעכן די דוראַ. דערנאָך אַפּלייזט HCO צו אַ דין 3×3 סענטימעטער פּאַראַפילם און אַראָפּנעמט איבעריק מעדיום. ניצנדיק אַ האַמילטאָן שפּריץ אַטאַטשט צו אַ 23 ג, 45° נאָדל, ציט לײַכט hCO3 אין דעם ווײַטסטן עק פֿון דער נאָדל. דערנאָך אינסטאַלירט די שפּריץ אויף דער שפּריץ פּאָמפּע וואָס איז פֿאַרבונדן צום סטערעאָטאַקסישן מיטל. דערנאָך שטעלט די שפּיץ פֿון דער נאָדל איבער אַ פֿריִער געמאַכטן 0.3 מ״מ ברייטן לאָך אין דער דוראַ (z = 0 מ״מ) און פֿאַרענגט די שפּריץ 1–2 מ״מ (z = אַפּראָקסימאַטיוו –1.5 מ״מ) ביז די נאָדל איז צווישן דער דוראַ מאַטער A. אַ דיקע פֿאַרזיגלונג ווערט געשאַפֿן. דערנאָך הייבט די שפּריץ צום צענטער פֿון דער קאָרטיקאַלער ייבערפֿלאַך בײַ z = -0.5 מ״מ און ינדזשעקטירט hCO3 מיט אַ גיכקייט פֿון 1-2 µl פּער מינוט. נאָך דעם ווי די hCO3 ינדזשעקשאַן איז פֿאַרענדיקט, ווערט די נאָדל צוריקגעצויגן מיט אַ גיכקייט פֿון 0.2-0.5 מ״מ פּער מינוט, די הויט ווערט צוגענייט, און דאָס הינטעלע ווערט גלייך געלייגט אויף אַ וואַרעמען הייצונג פּאַד ביז עס ווערט פֿולשטענדיק אָפּגעהויבן. עטלעכע חיות זענען טראַנספּלאַנטירט געוואָרן בילאַטעראַל.
אלע כייַע פּראָצעדורן זענען דורכגעפירט געוואָרן לויט די סטאַנפֿאָרד אוניווערסיטעט APLAC-באַשטעטיקטע כייַע זאָרג גיידליינז. ראַץ (גרעסער ווי 60 טעג נאָך טראַנספּלאַנטאַציע) זענען אינדוצירט געוואָרן מיט 5% יסאָפֿלוראַן אַנעסטעזיע און אַנעסטעזירט מיט 1-3% יסאָפֿלוראַן בעת ​​בילדגעבונג. פֿאַר וויזואַליזאַציע, אַ 7 טעסלאַ אַקטיוולי באַשיצט האָריזאָנטאַל באָרהאָל סקאַנער ברוקער (ברוקער קאָרפּ.) מיט אַן אינטערנאַציאָנאַלע עלעקטריק קאָמפּאַני (IECO) גראַדיענט דרייוו, אַ באַשיצט גראַדיענט ינסערט מיט אַן אינערלעכן דיאַמעטער פון 120 מם (600 mT/m, 1000 T/m/s) איז געניצט געוואָרן מיט AVANCE. III, אַכט-קאַנאַל מולטי-קוואַל RF און מולטי-קאָר קייפּאַבילאַטיז, און די באַגלייטנדיקע Paravision 6.0.1 פּלאַטפאָרמע. רעקאָרדינג איז דורכגעפירט געוואָרן מיט אַן אַקטיוולי דיקאָופּאַלד וואָלומעטריק RF שפּול מיט אַן אינערלעכן דיאַמעטער פון 86 מם און אַ פֿיר-קאַנאַל קריאָ-געקילט RF שפּול פֿאַר באַקומען בלויז. אַקסיאַל 2D טורבאָ-RARE (ריפּיטיישאַן צייט = 2500 מס, עקאָ צייט = 33 מס, 2 דורכשניטלעך) מיט 16 סלייס קאַפּטשערז, סלייס גרעב 0.6–0.8 מם, מיט 256 × 256 סאַמפּאַלז. די סיגנאַלן זענען באקומען מיט אַ קוואַדראַטור טראַנססיווער וואָלומעטריק RF שפּול מיט אַן ינערלעך דיאַמעטער פון 2 סענטימעטער (Rapid MR International, LLC). צום סוף, נוצן די איינגעבויטע Imaris (BitPlane) ייבערפלאַך עסטימאַציע פאַנגקשאַנז פֿאַר 3D רענדערינג און וואָלומען אַנאַליז. אַ געראָטן טראַנספּלאַנט איז געווען דעפינירט ווי איינער אין וואָס געביטן פון קאַנטיניואַס T2-וואָוגייטאַד MRI סיגנאַל זענען געשאפן אין די טראַנספּלאַנטיד האַלבקוגל. גראַפט רידזשעקשאַן איז געווען דעפינירט ווי אַ גראַפט וואָס האט נישט פּראָדוצירט געביטן פון קאַנטיניואַס T2-וואָוגייטאַד MRI סיגנאַל אין די טראַנספּלאַנטיד האַלבקוגל. סובקאָרטיקאַל t-hCO איז געווען אויסגעשלאָסן פון סאַבסאַקוואַנט אַנאַליז.
כדי סטאביל אויסצודריקן GCaMP6s אין hCO פאר צוויי-פאָטאָן קאַלסיום בילדגעבונג, זענען hiPS צעלן אינפעקטירט געוואָרן מיט pLV[Exp]-EF1a::GcaMP6s-WPRE-Puro, נאכגעפאלגט דורך סעלעקציע פון ​​אַנטיביאָטיקס. בקיצור, צעלן זענען דיסאָוסיייטאַד געוואָרן מיט EDTA און סוספּענדירט אין 1 מל פון עסענטשאַל 8 מעדיום ביי א געדיכטקייט פון בערך 300,000 צעלן אין דער אנוועזנהייט פון פּאָליברען (5 μg/ml) און 15 μl פון ווירוס. די צעלן זענען דעמאָלט אינקובירט געוואָרן אין סאַספּענשאַן פֿאַר 60 מינוט און געזייט ביי א געדיכטקייט פון 50,000 צעלן פּער וועלל. נאָך קאָנפלוענס, זענען צעלן באַהאַנדלט געוואָרן מיט 5-10 μg ml-1 פּוראָמיצין פֿאַר 5-10 טעג אָדער ביז סטאַבילע קאָלאָניעס זענען דערשינען. אַקוטע hCO אינפעקציע איז דורכגעפירט געוואָרן ווי פריער באַשריבן5 מיט עטלעכע מאָדיפיקאַציעס. בקיצור, טראַנספערירן טאָג 30-45 hCO אין 1.5 מל עפּפּענדאָרף מיקראָצענטריפוגע טובז מיט 100 μl פון נערוו מעדיום. דערנאך ווערט בערך 90 µl פון דעם מעדיום ארויסגענומען, 3-6 µl פון הויך-טיטער לענטיווירוס (פון 0.5 x 108 ביז 1.2 x 109) ווערט צוגעגעבן צום רער, און די hCO3 ווערט אריבערגעפירט צום אינקובאַטאָר פאר 30 מינוט. דערנאך לייגט צו 90-100 µl פון מעדיום צו יעדן רער און שטעלט די רערן צוריק צום אינקובאַטאָר איבערנאכט. דעם נעקסטן טאג, טראנספערירט hCO3 צו פרישן נערוו מעדיום אין נידעריקע אַטאַטשמענט פּלאַטעס. נאך 7 טעג, איז hCO3 אריבערגעפירט געווארן צו 24-וועלל גלאז דנאָ פּלאַטעס פאר וויזואַליזאַציע און עוואַלואַציע פון ​​אינפעקציע קוואַליטעט. pLV[Exp]-SYN1::EYFP-WPRE און pLV[Exp]-SYN1::hChR2-EYFP-WPRE זענען גענערירט געווארן דורך VectorBuilder. לענטיווירוס ווערט גענוצט אין רוב עקספּערימענטן ווייל עס איז אינטעגרירט אין דעם באַלעבאָס גענאָם, וואָס ערמעגליכט רעפּאָרטער גענע אויסדרוק אין אינפעקטירטע צעל ליניעס. פאר ראַביעס נאכפאלג, איז טאָג 30-45 hCO קאָ-אינפעקטירט געוואָרן מיט ראַביעס-ΔG-eGFP און AAV-DJ-EF1a-CVS-G-WPRE-pGHpA (פּלאַזמיד #67528, Addgene), גוט געוואַשן פֿאַר 3 טעג, און טראַנספּלאַנטירט אין ראַץ אין S1 און געהאלטן אין וויוואָ פֿאַר 7-14 טעג.
פֿאַר אימונאָציטאָכעמיע, זענען די חיות אַנעסטעזירט געוואָרן און טראַנסקאַרדיאַל פּערפיוזד מיט PBS און דערנאָך 4% פּאַראַפאָרמאַלדעכייד (PFA אין PBS; עלעקטראָן מיקראָסקאָפּי סייאַנסעס). מוחות זענען פיקסירט געוואָרן אין 4% PFA פֿאַר 2 שעה אָדער איבער נאַכט ביי 4°C, קריאָפּרעזערווירט אין 30% סוכראָז אין PBS פֿאַר 48-72 שעה, און עמבעדיד אין 1:1, 30% סוכראָז: OCT (Tissue-Tek OCT Compound 4583, Sakura Finetek) און קאָראָנאַלע סעקשאַנז זענען געמאַכט ביי 30 µm מיט אַ קריאָסטאַט (Leica). פֿאַר אימונאָכיסטאָכעמיע פון ​​דיקע סעקשאַנז, זענען די חיות פּערפיוזד געוואָרן מיט PBS, און דער מוח איז דיסעקטירט און סעקציאָנירט קאָראָנאַל ביי 300-400 µm מיט אַ וויבראַטאָם (Leica) און די סעקשאַנז זענען פיקסירט געוואָרן מיט 4% PFA פֿאַר 30 מינוט. דערנאך זענען קריאָסעקציעס אדער דיקע סעקשאַנז געוואַשן געוואָרן מיט PBS, בלאָקירט פֿאַר 1 שעה ביי צימער טעמפּעראַטור (10% נאָרמאַל אייזל סערום (NDS) און 0.3% טריטאָן X-100 דיילוטאַד אין PBS) און בלאָקירט מיט בלאָקיר לייזונג ביי 4°C. – אינקובאַציע קריאָסעקציעס זענען אינקובירט געוואָרן איבער נאַכט און דיקע סעקשאַנז זענען אינקובירט געוואָרן פֿאַר 5 טעג. די ערשטיקע אַנטיקערפּערס וואָס מען האָט גענוצט זענען געווען: אַנטי-NeuN (מויז, 1:500; ab104224, abcam) אַנטי-CTIP2 (ראַט, 1:300; ab18465, abcam), אַנטי-GFAP (קיניגל, 1:1,000; Z0334, Dako), אַנטי-GFP (הינדל, 1:1,000; GTX13970, GeneTex), אַנטי-HNA (מויז, 1:200; ab191181, abcam), אַנטי-NeuN (קיניגל, 1:500; ABN78, Millipore), אַנטי-PDGFRA (קיניגל, 1:200; sc-338, Santa Cruz), אַנטי-PPP1R17 (קיניגל, 1:200; HPA047819, Atlas Antibodies), אַנטי-RECA-1 (מויז, 1:50; ab9774, abcam), אַנטי-SCG2 (קיניגל, 1:100; 20357-1-AP, פּראָטעיןטעק), אַנטי-SOX9 (ציג, 1:500; AF3075, R&D סיסטעמס), נעטרין G1a (ציג, 1:100; AF1166, R&D סיסטעמס), אַנטי-STEM121 (מויז, 1:200; Y40410, טאַקאַראַ ביאָ), אַנטי-SATB2 (מויז, 1:50; ab51502, abcam), אַנטי-GAD65/67 (קיניגל, 1:400; ABN904, מיליפּאָר) און אַנטי-IBA1 (ציג, 1:100; ab5076, abcam). די ערשטיקע אַנטיקערפּערס וואָס מען האָט גענוצט זענען געווען: אַנטי-NeuN (מויז, 1:500; ab104224, abcam) אַנטי-CTIP2 (ראַט, 1:300; ab18465, abcam), אַנטי-GFAP (קיניגל, 1:1,000; Z0334, Dako), אַנטי-GFP (הינדל, 1:1,000; GTX13970, GeneTex), אַנטי-HNA (מויז, 1:200; ab191181, abcam), אַנטי-NeuN (קיניגל, 1:500; ABN78, Millipore), אַנטי-PDGFRA (קיניגל, 1:200; sc-338, Santa Cruz), אַנטי-PPP1R17 (קיניגל, 1:200; HPA047819, Atlas Antibodies), אַנטי-RECA-1 (מויז, 1:50; ab9774, abcam), אַנטי-SCG2 (קיניגל, 1:100; 20357-1-AP, פּראָטעיןטעק), אַנטי-SOX9 (ציג, 1:500; AF3075, R&D סיסטעמס), נעטרין G1a (ציג, 1:100; AF1166, R&D סיסטעמס), אַנטי-STEM121 (מויז, 1:200; Y40410, טאַקאַראַ ביאָ), אַנטי-SATB2 (מויז, 1:50; ab51502, abcam), אַנטי-GAD65/67 (קיניגל, 1:400; ABN904, מיליפּאָר) און אַנטי-IBA1 (ציג, 1:100; ab5076, abcam). Использовались следующие первичные антитела: анти-NeuN (мышиные, 1:500; ab104224, abcam), анти-CTIP2 (крысиные, אַבקאַם, 1:840, אַבקאַם), אַנטי-קטיפּ2 (אַבקאַם 1:840, 1:840, 1:800, 1:500; анти-GFAP (кроличьи, 1:1000; Z0334, Dako), анти-GFP (курица, 1:1000; GTX13970, GeneTex), анти-HNA (мышь, 1:200; אַב19118, אַב19118) 1:500, ABN78, מיליפּאָרע), אַנטי-PDGFRA (קראָליק, 1:200; sc-338, Санта-Круз), анти-PPP1R17 (кролик, 1:200; HPA047819, Atlas Antibodies), анти-RECA-1 (мышь, 1:50; ab9774, abcam), анти-SCG2, анти-SCG2, анти-SCG2; 20357-1-AP, פּראָטעינטעטש), אַנטי-סאָקס9 (קאָזיי, 1:500; AF3075, ר & די סיסטעמס), נעץ ג1אַ (קאָזיי, 1:100; AF1166, ר & די סיסטעמס), אַנטי-סטעמ 121 (מייַן: 20, 121; י40410, טאַקאַראַ ביאָ), אַנטי-סאַטב2 (מיר, 1:50; ab51502, אַבקאַם), אַנטי-גאַד65/67 (קאָליק, 1:400; ABN904, מיליפּאָרע) און אַנטי-יבאַ1 (קאָזאַ, 1:100; אַבנ904, אַבקאַם). די הויפּט אַנטיקערפּערס וואָס מען האָט גענוצט זענען געווען: אַנטי-NeuN (מויז, 1:500; ab104224, abcam), אַנטי-CTIP2 (ראַט, 1:300; ab18465, abcam), אַנטי-GFAP (קיניגל, 1:1000; Z0334, Dako), אַנטי-GFP (הינדל, 1:1000; GTX13970, GeneTex), אַנטי-HNA (מויז, 1:200; ab191181, abcam), אַנטי-NeuN (קיניגל, 1:500; ABN78, Millipore), אַנטי-PDGFRA (קיניגל, 1:200; sc-338, Santa Cruz), אַנטי-PPP1R17 (קיניגל, 1:200; HPA047819, Atlas Antibodies), אַנטי-RECA-1 (מויז, 1:50; ab9774, abcam), אַנטי-SCG2 (קיניגל, 1:100; 20357-1-AP, Proteintech), אַנטי-SOX9 (ציג, 1:500; AF3075, R&D Systems), נעטרין G1a (ציג, 1:100; AF1166, R&D Systems), אַנטי-STEM121 (מויז, 1:200; Y40410, Takara Bio), אַנטי-SATB2 (מויז, 1:50; ab51502, abcam), אַנטי-GAD65/67 (קיניגל, 1:400; ABN904, Millipore) און אַנטי-IBA1 (ציג, 1:100; ab5076, abkam).使用的一抗是：抗NeuN（小鼠，1:500；ab104224，abcam）抗CTIP2（大鼠，1:3 00；ab18465，abcam），抗GFAP（兔，1:1,000；Z0334，Dako），抗-GF P（鸡，1:1,000；GTX13970，GeneTex），抗HNA（小鼠，1:200；ab1911 81，abcam），抗NeuN（兔，1:500；ABN78，Millipore），抗PDGFRA（兔， 1:200；sc-338，Santa Cruz），抗PPP1R17（兔，1:200；HPA047819，אַטלאַס抗体），抗RECA-1（小鼠，1:50；ab9774，abcam），抗SCG2（兔）, 1:100；20357-1-AP，פּראָטעינטעטש），抗SOX9（山羊，1:500；AF3075，R&D Systems），Netrin G1a（山羊（山羊，6，R，1:1001 סיסטעמ, סטעם 121, 1:200;使用的一抗是：抗NeuN（小鼠，1:500；ab104224，abcam）抗CTIP2（大鼠，1 :300；ab18465，abcam），抗GFAP（兔，1:1,000；Z0334，Dako），抗-GFP（鸡，1:1,000；GTX13970，GeneTex），抗HNA（小鼠，1:200；ab 191181, אַבקאַם），抗NeuN（兔，1:500；ABN78，Millipore％弔，抗1: 200；sc-338，Santa Cruz），抗PPP1R17（兔，1:200；HPA047819，אַטלאַס抗体），抗RECA-1（小鼠，1:50；ab9774，abcam），抗SCG2 100；20357-1-AP，Proteintech），抗SOX9（山羊，1:500；AF3075，R&D Systems），Netrin G1a（山羊，1:106，DQ106， סיסטעמען (1:20, ;Y40410, טאַקאַראַ ביאָ), אַנטי-SATB2 (מויז, 1:50; ab51502, abcam), אַנטי-GAD65/67 (קיניגל, 1:400; ABN904, Millipore) און אַנטי-IBA1 (ציג, 1:100; ab5076, abcam).די הויפּט אַנטיקערפּערס וואָס מען האָט גענוצט זענען געווען: אַנטי-NeuN (מויז, 1:500; ab104224, abcam), אַנטי-CTIP2 (ראַט, 1:300; ab18465, abcam), אַנטי-GFAP (קיניגל, 1:1000; Z0334, Dako). , אַנטי-GFP (הינדל, 1:1000; GTX13970, GeneTex), אַנטי-HNA (מויז, 1:200; ab191181, abcam), אַנטי-NeuN (קיניגל, 1:500; ABN78, Millipore), אַנטי-PDGFRA (קיניגל, 1:200; sc-338, סאַנטאַ קרוז), אַנטי-PPP1R17 (קיניגל, 1:200; HPA047819, אַטלאַס אַנטיבאָדי), אַנטי-RECA-1 (מויז, 1:50; ab9774, abcam), אַנטי-SCG2 (קיניגל), 1:100;20357-1-AP, פּראָטעינסטעטש), אַנטי-סאָקס9 (קאָזאַ, 1:500; AF3075, ר & די סיסטעמס), נעטרין ג1אַ (קאָזאַ, 1:100; AF1166, ר & די סיסטעמס), אַנטי -STEM121 (מי, 1,42000, י, 4,4000; ביאָ), אַנטי-סאַטב2 (מיי, 1:50; אב51502, אַבקאַם), אַנטי-גאַד65/67 (קאָליק, 1:400; ABN904, מיליפּאָרע) און אַנטי-יבאַ1 (קאָזאַ, 1:100, 50, 500, 500, 500, 1:400). 20357-1-AP, פּראָטעיןטעק), אַנטי-SOX9 (ציג, 1:500; AF3075, R&D סיסטעמס), נעטרין G1a (ציג, 1:100; AF1166, R&D סיסטעמס), אַנטי-STEM121 (מויז, 1:200; Y40410, טאַקאַראַ ביאָ), אַנטי-SATB2 (מויז, 1:50; ab51502, אַבקאַם), אַנטי-GAD65/67 (קיניגל, 1:400; ABN904, מיליפּאָר), און אַנטי-IBA1 (ציג, 1:100; ab5076, אַבקאַם).סעקציעס זענען דעמאָלט געוואַשן געוואָרן מיט PBS און אינקובירט מיט צווייטיקן אַנטיבאָדי פֿאַר 1 שעה ביי צימער טעמפּעראַטור (געפֿרוירענע סעקציעס) אָדער איבערנאַכט ביי 4°C (דיקע סעקציעס). Alexa Fluor צווייטיקן אַנטיבאָדי (Life Technologies) פֿאַרדיןנט 1:1000 אין בלאָקירנדיקער לייזונג איז געניצט געוואָרן. נאָך וואַשן מיט PBS, זענען די קערנס וויזואַליזירט געוואָרן מיט אַ Hoechst 33258 (Life Technologies). צום סוף, זענען די סליידז געשטעלט געוואָרן אויף אַ מיקראָסקאָפּ מיט דעקגליפּס (Fisher Scientific) ניצנדיק אַן Aquamount (Polysciences) און אַנאַליזירט אויף אַ Keyence פֿלורעסצענט מיקראָסקאָפּ (BZ-X אַנאַליזער) אָדער אַ Leica TCS SP8 קאָנפֿאָקאַל מיקראָסקאָפּ (Las-X) אויף דעם בילד. די בילדער זענען פּראַסעסט געוואָרן ניצנדיק די ImageJ פּראָגראַם (Fiji). צו קוואַנטיפֿיצירן דעם פּראָפּאָרציע פֿון מענטשלעכע נעוראָנען אין t-hCO און די ראַץ קאָרטעקס, זענען 387.5 μm ברייטע רעכטעקיקע בילדער גענומען געוואָרן אין צענטער פֿון די t-hCO, ביי אָדער לעבן דעם ברעג פֿון די ראַץ קאָרטעקס. גראַפֿט מאַרדזשינס זענען באַשטימט געוואָרן דורך אַססעססינג ענדערונגען אין געוועב טראַנספּאַרענץ, HNA+ קערנס, און/אָדער די בייַזייַן פֿון געוועב אַוטאָפֿלורעסצענץ. אין יעדן בילד, איז די גאַנצע צאָל פון NeuN+ און HNA+ צעלן צעטיילט געוואָרן דורך די גאַנצע צאָל פון NeuN+ צעלן אין דער זעלבער געגנט. כּדי צו זיכער מאַכן אַז נאָר צעלן מיט קערנס אין דער בילד־פלאַך ווערן געציילט, ווערן נאָר צעלן וואָס זענען אויך Hoechst+ אַרייַנגערעכנט אין דער חשבון. צוויי בילדער וואָס זענען געטיילט מיט לפּחות 1 מ"מ זענען דורכשניטלעך געוואָרן כּדי צו רעדוצירן דעם סטאַטיסטישן טעות.
איין וואָך איידער די מוסטער זאַמלונג, שטעלט די hCO טראַנספּלאַנט חיות (אומגעפער 8 חדשים פון דיפערענציאַציע) אין אַ טונקל צימער מיט געשניטענע באָרדז צו מינימיזירן סענסאָרי סטימולאַציע. אפגעזונדערטקייט פון די קערנס איז דורכגעפירט געוואָרן ווי פריער באַשריבן, מיט עטלעכע מאָדיפיקאַציעס. בקיצור, t-hCO און hCO זענען חרובֿ געוואָרן מיט דיטערדזשענט-מעכאַנישע צעל ליזיס און אַ 2 מל גלאז געוועב גרינדער (D8938, Sigma-Aldrich/KIMBLE). די רויע קערנס זענען דעמאָלט אָפּגעפֿילטערט געוואָרן מיט אַ 40 µm פֿילטער און סענטריפוגירט ביי 320 g פֿאַר 10 מינוט ביי 4 °C איידער דורכפֿירן אַ סוכראָז געדיכטקייט גראַדיענט. נאָך דעם סענטריפוגאַציע שריט (320 g פֿאַר 20 מינוט ביי 4 °C), זענען די מוסטערן ווידער סוספּענדירט געוואָרן אין 0.04% BSA/PBS מיטן צוגאב פון 0.2 יוניץ פון µl-1 RNase אינהיביטאָר (40 u µl-1, AM2682, Ambion) און דורכגעגאַנגען אַ 40 µm פֿלוס פֿילטער. די דיסאָסיאַטעד קערנס זענען דעמאָלט ווידער סוספּענדירט געוואָרן אין PBS מיט 0.02% BSA און אַריינגעלאָדן אויף אַ קראָומיאַם סינגל צעל 3′ טשיפּ (געשאַצטע אָפּזוך פון 8,000 צעלן פּער ליין). snRNA-seq ביבליאָטעקן זענען צוגעגרייט געוואָרן מיטן Chromium Single cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics). snRNA-seq ביבליאָטעקן זענען צוגעגרייט געוואָרן מיטן Chromium Single cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics). snRNA-סעק אַבאָנירן צו די קראָומיאַם סינגלע צעל 3′ יידלשטיין ביבליאָטעק און געל קרעלן קיט וו3 (10 קס גענאָמיקס). די snRNA-seq ביבליאָטעקן זענען צוגעגרייט געוואָרן ניצנדיק Chromium Single cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics). snRNA-seq 文库是使用Chromium סינגלע צעל 3′ יידלשטיין, ביבליאָטעק & געל קרעלן קיט וו3 (10 קס גענאָמיקס) 制备的. snRNA-seq 文库是使用Chromium סינגלע צעל 3′ יידלשטיין, ביבליאָטעק & געל קרעלן קיט וו3 (10 קס גענאָמיקס) 制备的. די snRNA-סעקוו האַכלאָטע מיט קראָומיאַם סינגלע צעל 3′ יידלשטיין, ביבליאָטעק און געל קרעלן קיט וו3 (10 קס גענאָמיקס). די snRNA-seq ביבליאָטעק איז צוגעגרייט געוואָרן ניצנדיק Chromium Single Cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics).ביבליאָטעקן פון פֿאַרשידענע מוסטערן זענען צוזאַמענגעשטעלט און סיקווענסט געוואָרן דורך אַדמיראַ געזונט אויף נאָוואַסעק S4 (אילומינאַ).
גענע אויסדרוק לעוועלס פאר יעדן מעגלעכע נוקלעארע באַרקאָד זענען קוואַנטיפיצירט געוואָרן מיטן 10x Genomics CellRanger אנאליז ווייכווארג פּעקל (ווערסיע 6.1.2). ספּעציפֿיש, די רידס זענען געמאַטשט געוואָרן קעגן אַ קאָמבינאַציע פון ​​מענטשלעכע (GRCh38, Ensemble, ווערסיע 98) און ראַץ (Rnor_6.0, Ensemble, ווערסיע 100) רעפֿערענץ גענאָמען באשאפן מיטן mkref באַפֿעל און ניצנדיק count מיטן –include-introns=TRUE באַפֿעל צו קוואַנטיפיצירן אַרייננעמען רידס געמאַפּט צו ינטראָן געגנטן. פֿאַר t-hCO סאַמפּאַלז, מענטשלעכע קערנס זענען אידענטיפֿיצירט געוואָרן באַזירט אויף דער קאָנסערוואַטיווער פאָדערונג אַז לפּחות 95% פון אַלע געמאַפּטע רידס פּאַסן מיטן מענטשלעכן גענאָם. אַלע ווייטערדיקע אַנאַליזעס זענען דורכגעפֿירט געוואָרן אויף אַ פֿילטערירטן באַרקאָד אַרעי וואָס איז אַרויסגעקומען פֿון CellRanger מיטן R פּעקל (ווערסיע 4.1.2) Seurat (ווערסיע 4.1.1)32.
כדי צו זיכער מאַכן אַז נאָר הויך-קוואַליטעט קערנס ווערן אַרייַנגערעכנט אין דער ווייטערדיקער אַנאַליז, איז אַן איטעראַטיווער פֿילטערינג פּראָצעס דורכגעפֿירט געוואָרן פֿאַר יעדן מוסטער. ערשטנס, נידעריק-קוואַליטעט קערנס מיט ווייניקער ווי 1000 יינציקע גענעס געפֿונען און מער ווי 20% פֿון די גאַנצע מיטאָטשאָנדריע ווערן אידענטיפֿיצירט און אַוועקגענומען. דערנאך, איז די רויע גענע נומער מאטריץ נארמאליזירט געווארן דורך רעגולאריזירטע נעגאטיווע בינאמיאל רעגרעסיע ניצנדיג די sctransform(vst.flavor=”v2″) פונקציע, וואס האט אויך אידענטיפיצירט די 3000 מערסט וועריאַבלע גענעס ניצנדיג פעליקייט פאראמעטערס. דימענסיע רעדוקציע איז דורכגעפירט געווארן אויף די אויבערשטע וועריאַבלע גענעס ניצנדיג פּרינסיפּאַל קאָמפּאָנענט אַנאַליז (PCA) מיט פעליקייט פאראמעטערס ניצנדיג א דאַטן סעט דימענסיע פון ​​30 (dims = 30 איז אויסגעקליבן געווארן באזירט אויף וויזועלע דורכקוק פון קני זייטלעך און גענוצט פאר אלע סאַמפּלעס און אַנסאַמבל אַנאַליזעס). מיר האבן דערנאך דורכגעפירט עטלעכע רונדעס פון איטעראַטיווע קלאַסטערינג (רעזאָלוציע = 1) צו קלאַסיפיצירן גענעס באזירט אויף אַבנאָרמאַל נידעריק גענע צייל (מעדיאַן אונטער 10טן פּערסענטיל), אַבנאָרמאַל הויך מיטאָטשאָנדריאַל גענע צייל (מעדיאַן העכער 95טן פּערסענטיל) צו אידענטיפיצירן און באַזייַטיקן פּוטאַטיווע סעלז פון נידעריק קוואַליטעט. קלאַסטערס און/אָדער אַ הויך פּראָפּאָרציע פון ​​​​פאַרדעכטיקט צווילינג אידענטיפיצירט ניצנדיג די DoubletFinder33 פּעקל (דורכשניטלעך DoubletFinder כעזשבן העכער די 95טן פּערסענטיל). t-hCO סאַמפּלעס (n=3) און hCO סאַמפּלעס (n=3) זענען אינטעגרירט סעפּעראַטלי ניצנדיג די IntegrateData פונקציע מיט די אויבן פּאַראמעטערס. דערנאך נאך א רונדע פון ​​קוואַליטאַטיווע פֿילטערינג פון די אינטעגרירטע דאַטן סעט איז דורכגעפֿירט געוואָרן ווי אויבן באַשריבן.
נאכדעם וואס מען האט אוועקגענומען די נידעריג-קוואליטעט קערנעלס, איז דער אינטעגרירטער דאטן-זאמלונג גרופירט געווארן (רעזאלוציע = 0.5) און איינגעבעטן פאר UMAP34 וויזואליזאציע צוועקן. מארקער גענעס פאר יעדן קלאסטער זענען באשטימט געווארן ניצנדיג די FindMarkers פונקציע מיט פעליקייט פאראמעטערס אויסגערעכנט פון נארמאליזירטע גענע אויסדרוק דאטן. מיר אידענטיפיצירן און קלאסיפיצירן הויפט צעל קלאסן דורך קאמבינירן פעטאלע און דערוואקסענע קארטיקאלע רעפערענץ דאטן-זאמלונגען מיט מארקער גענע אויסדרוק 19,20,21,35 און אנאטאציע. ספעציעל, צירקולירנדע פארגייער זענען אידענטיפיצירט געווארן דורך דער אויסדרוק פון MKI67 און TOP2A. פראגעניטאר קלאסטערס זענען דעפינירט געווארן דורך דער אפוועזנהייט פון מיטאטישע טראנסקריפּטן, הויכע איבערלאפונג מיט מולטיפאטענט גליאל פראגעניטאר קלאסטערס באשריבן אין שפעטער מעטאפאזע פעטאלער קארטעקס, און EGFR און OLIG1 אויסדרוק. מיר ניצן דעם טערמין אסטראציט צו איינשליסן עטליכע שטאנדן פון אסטראציט דיפערענציאציע, פון שפעטער ראדיאלער גליא ביז מאטוראציע פון ​​אסטראציטן. אסטראציט קלאסטערס אויסדריקן הויכע לעוועלס פון SLC1A3 און AQP4 און עס איז געוויזן געווארן אז זיי מאפן זיך מיט סובטיפן פון פעטאלע ראדיאלער גליא און/אדער דערוואקסענע אסטראציטן. OPCs אויסדריקן PDGFRA און SOX10 בשעת אָליגאָדענדראָסיטן אויסדריקן מיעלינאַציע מאַרקערס (MOG און MYRF). גלוטאַמאַטערגישע נעוראָנען זענען אידענטיפיצירט געוואָרן דורך דער אנוועזנהייט פון נעוראָנאַלע טראַנסקריפּטן (SYT1 און SNAP25), דער אָפּוועזנהייט פון GABAergic מאַרקערס (GAD2), און דער אויסדרוק פון NEUROD6, SLC17A7, BCL11B, אדער SATB2. GluN נעוראָנען זענען ווייטער צעטיילט געוואָרן אין אויבערשטע (SATB2 אויסדרוק און פארלוסט פון BCL11B) און טיפע (BCL11B אויסדרוק) סובקלאַסן. פּוטאַטיווע סובפּלאַטע (SP) נעוראָנען אויסדריקן באַקאַנטע SP18 מאַרקערס ווי ST18 און SORCS1 אין אַדישאַן צו טיפע GluN מאַרקערס. כאָראָיד פלעקסוס-ווי צעלן זענען אידענטיפיצירט געוואָרן דורך TTR אויסדרוק, און מענינגעאַל-ווי צעלן האָבן אויסגעדריקט פיבראָבלאַסט-פארבונדענע גענעס און געמאַפּט פּיאַל/וואַסקולאַר צעלן פון די רעפערענץ דאַטן סעט.
דיפערענציעלע אנאליז פון גענע אויסדרוק צווישן t-hCO און hCO סובקלאסן איז דורכגעפירט געווארן מיט א ניי-אנטוויקלטע פסעוודא-באַטש מעטאד רעפּראָדוצירט אין מוסטערן אימפלעמענטירט מיטן Libra R פּעקל (ווערסיע 1.0.0). ספּעציפֿיש, edgeR לאָג-לייקליהאָאָד טעסטן (ווערסיע 3.36.0, פּעקל R) זענען דורכגעפירט געווארן פֿאַר גרופּעס דורך סאַמינג די נומער פון גענעס אין צעלן פֿאַר אַ געגעבענער צעל קלאַס פֿאַר יעדער מוסטער רעפּליקאַציע. פֿאַר היץמאַפּ וויזואַליזאַציע, נאָרמאַליזירטע פּער מיליאָן (CPM) ווערטן זענען קאַמפּיוטיד מיט edgeR (cpm() פונקציע) און סקיילד (צו דערגרייכן מיטל = 0, סטאַנדאַרט דיווייישאַן = 1). גענע אָנטאָלאָגיע (GO) ענריטשמענט אנאליז פון באַדייטנד אַפּרעגולייטיד t-hCO GluN גענעס איז דורכגעפירט געווארן (Benjamini-Hochberg קאָריגירט P ווערט פון ווייניקער ווי 0.05 אויסגעדריקט אין לפּחות 10% פון t-hCO GluN צעלן און אַ פאַרלייגן פאַרגרעסערן אין ענדערונג פון לפּחות 2 מאָל) דורכגעפירט מיט ToppGene Suite (https://toppgene.cchmc.org/)37. מיר ניצן די ToppFun אַפּ מיט דיפאָלט פּאַראַמעטערס און באריכטן Benjamini-Hochberg-קאָרעקטעד P-ווערטן קאַלקיאַלייטיד פון GO-אַנאָטייטיד היפּערגעאָמעטרישע טעסץ.
כדי צו צופּאַסן אונדזערע snRNA-seq קלאַסטערס מיט אַנאָטירטע צעל קלאַסטערס פֿון רעפֿערענץ שטודיעס פֿון ערשטיק איין-צעל RNA-seq אָדער דערוואַקסענע snRNA-seq19,20,21,22, האָבן מיר געווענדט אַ פּאָרעד דאַטאַסעט אינטעגראַציע צוגאַנג. מיר האָבן גענוצט די SCTransform (v2) נאָרמאַליזאַציע וואָרקפלאָו אין Seurat צו אינטעגרירן און פֿאַרגלייַכן קלאַסטער אָוווערלאַפּס צווישן דאַטאַסעץ (ניצנדיק די זעלבע פּאַראַמעטערס ווי אויבן). יחיד דאַטאַסעץ זענען ראַנדאָם סאַבסעטעד ביז 500 סעלז אָדער קערנס פּער אָריגינעל קלאַסטער פֿאַר קאַמפּיוטיישאַנאַל עפֿעקטיוויטי. ניצנדיק אַ ענלעכן צוגאַנג ווי פריער באַשריבן, קלאַסטער אָוווערלאַפּ איז געווען דעפֿינירט ווי די פּראָפּאָרציע פון ​​סעלז אָדער קערנס אין יעדן פּולד קלאַסטער וואָס אָוווערלאַפּט מיט די לייבל פון די רעפֿערענץ קלאַסטער. צו ווייטער קלאַסיפֿיצירן GluNs, האָבן מיר גענוצט Seurat's TransferData וואָרקפלאָו פֿאַר GluN סאַבסעט דאַטן צו צוטיילן רעפֿערענץ דאַטאַסעט לייבלס צו אונדזערע GluN סעלז.
כדי צו אפשאצן דעם מאטוראציע סטאטוס פון דעם גלאבאלן טראנסקריפטאם פון t-hCO און hCO מוסטערן, האבן מיר פארגליכן אונזערע פסעוודא-באלק מוסטערן מיט BrainSpan/psychENCODE23, וואס באשטייט פון א גרויסער RNA סיקווענץ וואס שפאנט מענטשלעכן מוח אנטוויקלונג. מיר האבן דורכגעפירט PCA אויף א קאמבינירטער מוסטער-נארמאליזירטער דזשין אויסדרוק מאטריץ פון קארטיקאלע מוסטערן 10 וואכן נאך קאנצעפציע און שפעטער, אין 5567 גענען (צוזאמען מיט אונזערע דאטן) וואס זענען פריער אידענטיפיצירט געווארן אלס אקטיוו אין BrainSpan קארטיקאלע מוסטערן (דעפינירט אלס גרעסער ווי 50% אין אנטוויקלונגס וועריאנץ דערקלערט דורך עלטער מיט א קוביק מאדעל)38. דערצו, האבן מיר דעריווט גענען פארבונדן מיט הויפט טראנסקריפטאם סיגנאטורן פון נעוראאנטוויקלונג מיט נישט-נעגאטיוו מאטריץ פאקטאריזאציע ווי פריער באשריבן. די מוסטער ווייץ אויסגערעכנט מיט די נישט-נעגאטיוו מאטריץ פאקטאריזאציע פראצעדור זענען געצייכנט אין פיגורן 5ב מיט פארברייטערטע דאטן פאר יעדן פון די פינף סיגנאטורן באשריבן דורך זשו עט אל.38. נאכאמאל, אקטיוויטעט אפהענגיקע טראנסקריפציאנעלע מארקערס זענען דעריווט געווארן פון פריער פארעפנטלעכטע שטודיעס. באַזונדער, ERG און LRG זענען באַדייטנד אַרויפֿרעגולירט געוואָרן אין גלוטאַמאַטערגע נעוראָנען אידענטיפֿיצירט דורך די מויז וויזועלע קאָרטעקס snRNA-seq זאַמלונג נאָך וויזועלע סטימולאַציע פֿון סאַפּלעמענטאַרי טאַבעלע 3 Hrvatin et al.16. מענטש-ענריטשט LRGs זענען באַקומען פֿון KCl-אַקטיווייטיד מענטשלעכע פֿעטאַל מאַרך קולטורן און כאַרוואַסטיד 6 שעה נאָך סטימולאַציע, און די פֿילטרירט גענעס זענען באַדייטנד אַרויפֿרעגולירט געוואָרן אין מענטשן אָבער נישט אין ראָודאַנץ (סאַפּלעמענטאַרי טאַבעלע 4). אַנאַליז פֿון גענע סעט ענריטשמענט ניצן די גענע סעטס איז דורכגעפֿירט געוואָרן ניצן אַ איין-וועג פֿישער ס עקזאַקטער טעסט.
אנעסטעזירן די ראַץ מיט איזאָפלוראַן, אַרויסנעמען די מוחות און שטעלן אין אַ קאַלט (בעערעך 4°C) זויערשטאָף-גענערירטע (95% O2 און 5% CO2) סוכראָז לייזונג פֿאַר סעקשאַנז וואָס אַנטהאַלטן: 234 mM סוכראָז, 11 mM גלוקאָזע, 26 mM NaHCO3, 2.5 mM KCl, 1.25 mM NaH2PO4, 10 mM MgSO4 און 0.5 mM CaCl2 (בעערעך 310 mOsm). ראַט מוח קאָראָנאַל סעקשאַנז (300–400 µm) וואָס אַנטהאַלטן t-hCO3 זענען געמאַכט מיט אַ Leica VT1200 וויבראַטאָם ווי פריער באַשריבן39. די סעקציעס זענען דעמאָלט איבערגעפירט געוואָרן צו אַ סעקשאַנינג קאַמער מיט קאָנטינויִערלעכער צימער טעמפּעראַטור זויערשטאָף-געבונג וואָס ענטהאַלט aCSF צוגעגרייט פון: 10 mM גלוקאָזע, 26 mM NaHCO3, 2.5 mM KCl, 1.25 mM NaHPO4, 1 mM MgSO4, 2 mM CaCl2 און 126 mM NaCl (298 mOsm). לפּחות 45 מינוט איידער רעקאָרדינג. די סעקציעס זענען רעקאָרדירט ​​געוואָרן אין אַ אייַנגעטובלט קאַמער, וואו זיי זענען קאָנטינויִערלעך פּערפיוזד געוואָרן מיט aCSF (95% O2 און 5% CO2 וויאַל). אַלע דאַטן זענען רעקאָרדירט ​​געוואָרן ביי צימער טעמפּעראַטור. t-hCO נעוראָנען זענען טערמינירט געוואָרן מיט אַ באָראָסיליקאַט גלאָז פּיפּעטטע אָנגעפילט מיט אַ לייזונג וואָס ענטהאַלט 127 mM פּאָטאַסיום גלוקאָנאַט, 8 mM NaCl, 4 mM מאַגנעזיום ATP, 0.3 mM נאַטריום GTP, 10 mM HEPES, און 0.6 mM EGTA, pH 7.2, אינערלעכע לייזונג אַדזשאַסטיד מיט KOH (290 mOsm). כּדי צו צוריקקריגן, איז ביאָסיטין (0.2%) צוגעגעבן געוואָרן צו דער רעקאָרדינג לייזונג.
דאטן איז באקומען געווארן מיט א MultiClamp 700B פארשטארקער (Molecular Devices) און א Digidata 1550B דידזשיטייזער (Molecular Devices), נידריג-פאס געפילטערט ביי 2 kHz, דידזשיטאליזירט ביי 20 kHz, און אנאליזירט מיט Clampfit (Molecular Devices), Origin (OriginPro). 2021b, OriginLab). און אייגענע MATLAB פונקציעס (Mathworks). דער דזשאנקשאן פאטענציאל איז אויסגערעכנט געווארן מיט JPCalc און די איינגאבעס זענען צוגעפאסט געווארן צום אויסגערעכנטן ווערט פון -14 mV. אפעראציע IV באשטייט פון א סעריע פון ​​שטראָם טריט אין 10-25 pA טריט, פון -250 ביז 750 pA.
דער טאלאמוס, ווייסע מאַטעריע, און S1 אַפערענץ זענען עלעקטריש סטימולירט געוואָרן אין טאלאמאָקאָרטיקאַלע סלייסיז בעת פּאַטש-קלאַמפּ רעקאָרדינג פון hCO נעוראָנען, ווי פריער באַשריבן. בקיצור, דער מוח איז געשטעלט געוואָרן אויף אַ 3D דרוק טיש גענייגט ביי אַ 10° ווינקל, און די פראָנט פון דעם מוח איז געשניטן ביי אַ 35° ווינקל. דער מוח איז דעמאָלט געקליבט געוואָרן צו דער געשניטענער ייבערפלאַך און צעטיילט, באַוואָרנדיק די טאלאמאָקאָרטיקאַלע אַרויסשטעקנדיקע אַקסאָנען. בייפּאָלאַרע טאַנגסטען עלעקטראָדן (0.5 MΩ) זענען מאָונטעד געוואָרן אויף אַ צווייטן מיקראָמאַניפּולאַטאָר און סטראַטעגיש פּאַזיציאָנירט צו סטימולירן פיר געגנטן פּער צעל (אינעווייניקסטע קאַפּסל, ווייסע מאַטעריע, S1 און hCO). רעקאָרדירן סינאַפּטישע רעאַקציעס נאָך 300 µA פאַזיק סטימולאַציע ביי 0.03–0.1 Hz.
hChR2-אויסדריקנדיקע hCO נעוראָנען זענען אַקטיוויזירט געוואָרן ביי 480 נאַנאָמעטער און ליכט פּולסן דזשענערירט דורך אַן LED (Prizmatix) זענען אַפּליצירט געוואָרן דורך אַ ×40 אָביעקטיוו (0.9 NA; Olympus) צו רעקאָרדירן hChR2 אויסדרוק לעבן די צעלן. דער באַלויכטענער פעלד דיאַמעטער איז אַרום 0.5 מם און די גאַנץ מאַכט איז 10-20 mW. די פּולס ברייט איז געשטעלט געוואָרן צו 10 ms, וואָס קאָרעספּאָנדירט צו דעם פּולס געגעבן בעת ​​דעם ביכייוויעראַל לערנען עקספּערימענט. פֿאַרשידענע סטימולאַציע פרעקווענצן זענען געניצט געוואָרן, פֿון 1 ביז 20 הערץ, אָבער בלויז דער ערשטער פּולס פֿון דער סעריע איז געניצט געוואָרן פֿאַר קוואַנטיפֿיקאַציע. די אינטערוואַלן צווישן באַנען זענען געוויינטלעך לענגער ווי 30 סעקונדעס צו מינאַמיזירן דעם ווירקונג אויף סינאַפּטיש ינכיבאַטאָרי אָדער פאַסילאַטייטינג פּאַטווייז. צו פּרובירן אויב די hChR2 רעאַקציע איז געווען מאָנאָסינאַפּטיק, האָבן מיר אַפּליצירט TTX (1 μM) צו דער וואַנע ביז די EPSC רעאַקציע איז פֿאַרשוואונדן, און דערנאָך אַפּליצירט 4-אַמינאָפּירידין (4-AP; 100 μM). טיפּישערווייַז, ווערט אַן רעאַקציע צוריקגעקערט אין אַ פּאָר מינוט, מיט אַ ביסל לענגערער פֿאַרהאַלטונג צווישן LED פֿײַערן און EPSC דזשענעריישאַן. NBQX (10 μM) איז גענוצט געוואָרן צו פּרובירן צי די רעאַקציע ווערט געטריבן דורך AMPA רעצעפּטאָרן.
שאַרפע hCO סעקשאַנז זענען באשאפן געוואָרן ווי פריער באַשריבן. בקיצור, hCO סעקשאַנז זענען איינגעבעטן געוואָרן אין 4% אַגאַראָזע און טראַנספערירט צו צעלן מיט 126 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM NaH2PO4, 1 mM MgSO4, 2 mM CaCl2, 26 mM NaHCO3 און 10 mM d-(+) -גלוקאָז אין סעקשאַנז זענען געשניטן געוואָרן ביי 200-300 µm ביי צימער טעמפּעראַטור מיט אַ Leica VT1200 וויבראַטאָר און געהאלטן אין ASF ביי צימער טעמפּעראַטור. דערנאָך, איז פּאַטש-קעמפ רעקאָרדינג פון גאַנצע צעלן דורכגעפירט געוואָרן אויף hCO סעקשאַנז אונטער אַ דירעקטן SliceScope מיקראָסקאָפּ (Scientifica). סעקשאַנז זענען פּערפיוזד געוואָרן מיט aCSF (95% O2 און 5% CO2) און צעל סיגנאַלן זענען רעקאָרדירט ​​געוואָרן ביי צימער טעמפּעראַטור. hCO נעוראָנען זענען אַפּליצירט געוואָרן מיט אַ באָראָסיליקאַט גלאָז פּיפּעטטע אָנגעפילט מיט אַ לייזונג וואָס ענטהאַלט 127 mM פּאָטאַסיום גלוקאָנאַט, 8 mM NaCl, 4 mM מאַגנעזיום ATP, 0.3 mM נאַטריום GTP, 10 mM HEPES, און 0.6 mM EGTA, אינערלעכער pH 7, 2, אַדזשאַסטיד מיט KOH (אָסמאָלאַריטעט 290). פֿאַר אָפּזוך צוועקן, לייגט צו 0.2% ביאָסיטין צו דער אינערלעכער לייזונג.
דאטן זענען באקומען געווארן דורך Clampex (Clampex 11.1, Molecular Devices) ניצנדיק א MultiClamp 700B פארשטארקער (Molecular Devices) און א Digidata 1550B דידזשיטייזער (Molecular Devices), נידריג-פאס געפילטערט ביי 2 kHz, דידזשיטאליזירט ביי 20 kHz, און אנאליזירט ניצנדיק Clampfit (ווערסיע 10.6) פאר אנאליז, מאלעקולארע דעווייסעס) און אייגענע MATLAB פונקציעס (MATLAB 2019b, Mathworks). דער דזשאנקשאן פאטענציאל איז אויסגערעכנט געווארן ניצנדיק JPCalc און די איינגאבעס זענען צוגעפאסט געווארן צום אויסגערעכנטן דזשאנקשאן פאטענציאל פון -14 mV. אפעראציע IV באשטייט פון א סעריע פון ​​שטראָם טריט אין 5-10 pA טריט פון -50 ביז 250 pA.
פאר מארפאָלאָגישע רעקאָנסטרוקציע פון ​​צוגעקניפּטע נעוראָנען, איז 0.2% ביאָסיטין (סיגמאַ-אַלדריטש) צוגעגעבן געוואָרן צו דער אינערלעכער לייזונג. די צעלן ווערן צוגעגרייט פאר לפּחות 15 מינוט נאָך דעם כאַקינג. די פּיפּעטע ווערט דעמאָלט לאַנגזאַם אַרײַנגעצויגן פאר 1-2 מינוט ביז די רעגיסטרירטע מעמבראַנע איז גאָר פארזיגלט. נאָכפאָלגנדיק די פּראָצעדור פון די סעקציע פיזיאָלאָגיע, זענען די סעקציעס פיקסירט געוואָרן איבער נאַכט ביי 4°C אין 4% PFA, געוואַשן מיט PBS X3, און פארדיןנט 1:1000 מיט סטרעפּטאַווידין-קאָניוגירטן DyLight 549 אדער DyLight 405 (וועקטאָר לאַבס). צעלן אָנגעפילט מיט ביאָסיטין (2%; סיגמאַ-אַלדריטש) זענען באַצייכנט געוואָרן בעת ​​פּאַטש קלאַמפּ רעקאָרדינג ביי צימער טעמפּעראַטור פאר 2 שעה. די סעקציעס זענען דעמאָלט מאָנטירט געוואָרן אויף מיקראָסקאָפּיע סליידז מיט אַן אַקוואַמאָונט (טהערמאָ סייענטיפיק) און וויזואַליזירט דעם נעקסטן טאָג אויף אַ לייקאַ TCS SP8 קאָנפאָקאַל מיקראָסקאָפּ מיט אַן אויל אימערשאַן אָביעקטיוו מיט אַ נומערישער אַפּערטור ×40 1.3, מאַגניפיקאַציע ×0.9-1.0, xy. די סאַמפּלינג קורס איז אַפּפּראָקסימאַטלי 7 פּיקסעלס פּער מיקראָן. Z-סטאַקס אין 1 µm אינטערוואַלן זענען באקומען סעריעל, און z-סטאַק מאָסאַיקס און Leica-באזירט אויטאָ-סטיטשינג זענען דורכגעפירט געוואָרן צו דעקן דעם גאַנצן דענדריטישן בוים פון יעדן נעוראָן. נעוראָנען זענען דעמאָלט טראַקט האַלב-מאַנועל ניצנדיק די neuTube 40 אינטערפייס און SWC טעקעס זענען דזשענערירט געוואָרן. די טעקעס זענען דעמאָלט אַרויפגעלאָדן געוואָרן צו די SimpleNeuriteTracer41 Fiji פּלוגין (ImageJ, ווערסיע 2.1.0; NIH).
מענטשלעכע קאָרטיקאַלע געוועב איז באַקומען געוואָרן מיט אינפאָרמירטער צושטימונג לויט אַ פּראָטאָקאָל באַשטעטיקט דורך די אינסטיטוציאָנעלע איבערבליק באָרד פון סטאַנפֿאָרד אוניווערסיטעט. צוויי מוסטערן פון מענטשלעכע פּאָסטפּאַרטום געוועב (3 און 18 יאָר אַלט) זענען באַקומען געוואָרן דורך רעזעקציע פון ​​די פראָנטאַל קאָרטעקס (מיטל פראָנטאַל גירוס) ווי טייל פון כירורגיע פֿאַר רעפֿראַקטאָרי עפּילעפּסי. נאָך רעזעקציע, האַרוועסט געוועב אין אייז-קאַלט NMDG-aCSF וואָס כּולל: 92 mM NMDG, 2.5 mM KCl, 1.25 mM NaH2PO4, 30 mM NaHCO3, 20 mM HEPES, 25 mM גלוקאָזע, 2 mM טהיאָורעאַ, 5 mM נאַטריום אַסקאָרבאַט, 3 mM נאַטריום פּירווואַט, 0.5 mM CaCl2 4H2O און 10 mM MgSO4 7H2O. טיטרירן צו pH 7.3-7.4 מיט קאָנצענטרירט הידראָטשלאָריק זויער. געוועבן זענען געבראַכט געוואָרן צו דער לאַבאָראַטאָריע אין 30 מינוט און קאָראָנאַל סעקשאַנז זענען גענומען לויט דער פּראָצעדור באַשריבן אויבן.
אלע כייַע פּראָצעדורן זענען דורכגעפירט געוואָרן לויט די סטאַנפֿאָרד אוניווערסיטעט APLAC-באַשטעטיקטע כייַע זאָרג גיידליינז. ראַץ (מער ווי 140 טעג נאָך טראַנספּלאַנטאַציע) זענען אינדוצירט געוואָרן מיט 5% יסאָפֿלוראַן אַנעסטעזיע און אַנעסטעזירט מיט 1-3% יסאָפֿלוראַן ינטראַאָפּעראַטיוולי. כייַע איז געשטעלט געוואָרן אין אַ סטערעאָטאַקסיק ראַם (Kopf) און סאַסטיינד ריליס בופּרענאָרפֿין (SR) איז ינדזשעקטעד סובקוטאַנעאָוסלי. דער שאַרבן איז אַנטפּלעקט, ריין געמאַכט און 3-5 ביין שרויפן זענען ינסערטאַד. צו צילן t-hCO3, מיר האָבן דזשענערייטאַד סטערעאָטאַקסיק קאָאָרדינאַטן פון MRI בילדער. א בור לאָך איז געווען בוילד אין דער אָרט פון אינטערעס און פייבערז (400 µm דיאַמעטער, NA 0.48, Doric) זענען לאָוערד 100 µm אונטער די hCO3 ייבערפלאַך און באַזייַטיקט צו די שאַרבן מיט UV-קיוראַבאַל דענטאַל צעמענט (Relyx).
פיבער פאטאמעטרישע רעקארדירונגען זענען דורכגעפירט געווארן ווי פריער באשריבן42. כדי צו רעקארדירן ספאנטאנע אקטיוויטעט, זענען ראצן געשטעלט געווארן אין א ריינעם שטעג און א 400 µm דיאמעטער פיבער אפטישע פאטש קאבל (Doric) פארבונדן צו א פיבער אפטישע פאטאמעטרישע דאטן אקווייזישאן סיסטעם איז פארבונדן געווארן צום אימפלאנטירטן פיבער אפטישן קאבל. בעת דער 10-מינוט רעקארדירונג פון מאטאר אקטיוויטעט, זענען די בעלי חיים געווען פריי צו אויספארשן דעם שטעג. כדי צו רעקארדירן די ארויסגערופענע אקטיוויטעט, זענען ראצן (מער ווי 140 טעג נאך טראנספלאנטאציע) אנעסטעזירט געווארן מיט 5% איזאפלוראן פאר אינדוקציע און 1-3% איזאפלוראן פאר אויפהאלטונג. שטעלט דאס בעל-חיים אין א סטערעאטאקטישן ראם (Kopf) און די וואנצן אויף דער אנדערער זייט פון די t-hCO זענען אפגעשניטן צו בערך 2 cm און דורכגעפירט דורך א מעש פארבונדן צו א פּיעזאָעלעקטרישן אַקטואַטאָר (PI). א 400 µm פיבער אפטישע פאטש קאבל (Doric) איז פארבונדן געווארן צום אימפלאנטירטן פיבער און פארבונדן צום דאטן אקווייזישאן סיסטעם. די שנורקעס אויף דער אנדערער זייט פון t-hCO זענען דעמאָלט אָפּגעבויגן געוואָרן 50 מאָל (2 מם ביי 20 הערץ, 2 סעקונדעס פּער פּרעזענטאַציע) אין צופֿעליקע צייטן דורך אַ פּיעזאָעלעקטרישן דרייוו איבער אַ 20 מינוט רעקאָרדינג פּעריאָד. ניצט דעם Arduino MATLAB שטיצע פּאַקעט צו קאָנטראָלירן אָפּבייגונג צייט מיט מנהג MATLAB קאָד. געשעענישן ווערן סינגקראָניזירט צו די דאַטן אַקוויזישאַן ווייכווארג ניצן טראַנזיסטאָר-טראַנזיסטאָר לאָגיק (TTL) פּאַלסן.
ראַץ (מער ווי 140 טעג נאָך טראַנספּלאַנטאַציע) זענען אינדוצירט געוואָרן מיט 5% יסאָפלוראַן אַנעסטעזיע און אַנעסטעזירט מיט 1-3% יסאָפלוראַן אינטראַאָפּעראַטיוו. די חיות זענען געשטעלט געוואָרן אין אַ סטערעאָטאַקסיש ראַם (Kopf) און בופּרענאָרפין SR און דעקסאַמעטהאַסאָן זענען אינדזשעקטירט געוואָרן סובקוטאַנעאָוסלי. דער שאַרבן איז אַנטפּלעקט, ריין געמאַכט און 3-5 ביין שרויפן זענען אײַנגעשטעקט געוואָרן. צו צילן t-hCO, האָבן מיר דזשענערירט סטערעאָטאַקסישע קאָאָרדינאַטן פֿון MRI בילדער. אַ קײַלעכדיקע קראַניאָטאָמיע (בעערעך 1 סענטימעטער אין דיאַמעטער) איז דורכגעפֿירט געוואָרן מיט אַ הויך-גיכקייט בויער גלייך איבער דעם טראַנספּלאַנטירטן hCO. אַמאָל דער ביין איז אַזוי דין ווי מעגלעך, אָבער איידער מען בויערט דורך דעם גאַנצן ביין, ניצט פֿאַנגען צו אַראָפּנעמען דעם פֿאַרבליבענעם גאַנצען בעקן דיסק צו אַנטפּלעקן דעם אונטערלייגנדיקן t-hCO. די קראַניאָטאָמיע איז אָנגעפֿילט געוואָרן מיט סטעריל סאַלין, און אַ דעקל און אַ ספּעציעלע קאָפּ-שטיפט זענען אַטאַטשט געוואָרן צום שאַרבן מיט UV-געקײַלטן דענטאַל צעמענט (Relyx).
צוויי-פאָטאָן בילדגעבונג איז דורכגעפירט געוואָרן מיט אַ ברוקער מולטיפאָטאָן מיקראָסקאָפּ מיט אַ ניקאָן LWD (×16, 0.8 NA) אָביעקטיוו. GCaMP6 בילדגעבונג איז דורכגעפירט געוואָרן ביי 920 נם מיט 1.4x איין ז-פּלאַן מאַגניפיקאַציע און 8x דורכשניטלעך פון 7.5 fps. ראַץ זענען אינדוצירט געוואָרן מיט 5% יסאָפלוראַן אַנעסטעזיע און געהאלטן מיט 1-3% יסאָפלוראַן. די ראַץ זענען געשטעלט געוואָרן אין אַ ספּעציעל געמאַכט קאָפּ פיקסטשער און פּאַזישאַנד אונטער דער לינז. א 3-מינוט הינטערגרונט רעקאָרדינג פון מאָטאָר אַקטיוויטעט איז באקומען. איבער דעם קורס פון 20 מינוט פון רעקאָרדינג, 50 פּאַפס (יעדע פּרעזענטאַציע 100 ms לאַנג) זענען ראַנדאָם איבערגעגעבן געוואָרן צו די וויסקער פּאַד קעגן איבער t-hCO ניצנדיק אַ פּיקאָספּריסער. ניצט דעם אַרדוינאָ MATLAB שטיצע פּאַקעט צו קאָנטראָלירן בערסט צייט מיט מנהג MATLAB קאָד. סינקראָניזירן געשעענישן מיט דאַטן אַקוויזישאַן ווייכווארג (PrairieView 5.5) ניצנדיק TTL פּאַלסיז. פֿאַר אַנאַליז, די בילדער זענען קאָריגירט געוואָרן פֿאַר xy באַוועגונג ניצנדיק אַפין קאָרעקציע אין די MoCo פּראָגראַם לאָנטשט אין פידזשי. עקסטראקציע פון ​​פלורעסצענטע שפּורן פון יחידישע צעלן ניצנדיק CNMF-E43. פלורעסצענץ איז עקסטראַקטירט געוואָרן פֿאַר יעדער געגנט פון אינטערעס, קאָנווערטירט צו dF/F קורוועס, און דערנאָך קאָנווערטירט צו z-סקאָרס.
ראַץ (מער ווי 140 טעג נאָך טראַנספּלאַנטאַציע) זענען אינדוצירט געוואָרן מיט 5% יסאָפלוראַן אַנעסטעזיע און אַנעסטעזירט מיט 1-3% יסאָפלוראַן אינטראַאָפּעראַטיוו. די חיות זענען געשטעלט געוואָרן אין אַ סטערעאָטאַקסיש ראַם (Kopf) און בופּרענאָרפין SR און דעקסאַמעטהאַסאָן זענען אינדזשעקטירט געוואָרן סובקוטאַנעאָוסלי. די וויסקאָרן אויף דער אַנדערער זייט פון די t-hCO זענען געשניטן געוואָרן צו בערך 2 סענטימעטער און דורכגעפאָדעט דורך אַ מעש פארבונדן צו אַ פּיעזאָעלעקטרישן אַקטואַטאָר. דער שאַרבן איז אַנטפּלעקט און ריין געמאַכט. א ומבאַפלעקט שטאָל גראַונד שרויף איז אַטאַטשט צו דעם שאַרבן. צו צילן t-hCO, האָבן מיר דזשענערייטאַד סטערעאָטאַקסישע קאָאָרדינאַטן פון MRI בילדער. דורכפירן אַ קייַלעכדיק קראַניאָטאָמי (בעערעך 1 סענטימעטער אין דיאַמעטער) מיט אַ הויך-גיכקייַט בויער פּונקט העכער די t-hCO. אַמאָל דער ביין איז אַזוי דין ווי מעגלעך, אָבער איידער בויערן דורך דעם גאַנצן ביין, נוצן פאָרסעפּס צו אַראָפּנעמען די פארבליבענע גאַנצע בעקן דיסק צו אַנטפּלעקן אַנדערלייינג t-hCO. יחידישע צעלן זענען רעקארדירט ​​געווארן מיט 32-קאַנאַל אדער 64-קאַנאַל הויך-דענסיטי סיליקאָן פּראָבעס (קעמברידזש נעוראָטעק) געערדעט צו גראַונד סקרוז און פאַר-אַמפּליפיצירט מיט RHD אַמפּליפייערז (אינטאַן). ניצט דעם מאַניפּולאַטאָר צו נידעריקערן די עלעקטראָדעס צו דער ציל פּלאַץ דורך די קראַניאָטאָמי, וואָס איז אָנגעפילט מיט סטערילע סאַלין. דאַטן זאַמלונג איז דורכגעפירט געוואָרן ביי אַ אָפטקייט פון 30 kHz ניצן די Open Ephys דאַטן אַקוויזישאַן סיסטעם. די רעקאָרדינג איז פארגעזעצט נאָר ווען מיר האָבן דעטעקטירט הויך קאָרעלירטע ריטמישע ספּאָנטאַנע טעטיקייט אין מער ווי 10 קאַנאַלן, וואָס סאַגדזשעסט אַז די עלעקטראָדעס זענען ליגן אין די גראַפט (באַזירט אויף צוויי-פאָטאָן קאַלסיום בילדגעבונג דאַטן). א 10-מינוט הינטערגרונט רעקאָרדינג פון מאָטאָר טעטיקייט איז באקומען. די וויסקאָרס אויף דער פאַרקערטער זייט פון t-hCO זענען דעמאָלט דיפלעקטעד 50 מאָל (2 מם ביי 20 Hz, 2 ס פּער פּרעזענטירונג) אין ראַנדאָם מאל דורך אַ פּיעזאָעלעקטריק דרייוו איבער אַ 20 מינוט רעקאָרדינג פּעריאָד. ניצן די MATLAB שטיצן פּאַקאַדזש פֿאַר אַרדוינאָ (MATLAB 2019b), קאָנטראָלירן די דיפלעקשאַן צייט מיט מנהג MATLAB קאָד. ניצן TTL פּאַלסן צו סינקראָניזירן געשעענישן מיט דאַטן אַקוויזישאַן ווייכווארג.
פֿאַר אָפּטישע מאַרקינג עקספּערימענטן, איז אַ 200 מיקראָמעטער אָפּטישער פּאַטש שנור (דאָריק) פֿאַרבונדן צו אַ 473 נאַנאָמעטער לאַזער (אָמיקראָן) פֿאַרבונדן געוואָרן צו אַ 200 מיקראָמעטער אָפּטישער פֿאַזער געשטעלט איבער דער קראַניאָטאָמיע. גלייך פֿאַר דעם, זאָל מען צופּאַסן די דזשאַמפּער מאַכט צו 20 מיליוואַט. מען ניצט דעם מאַניפּולאַטאָר צו נידעריקערן די עלעקטראָדן צום ציל אָרט דורך דער קראַניאָטאָמיע, וואָס איז אָנגעפֿילט מיט סטעריל סאַלין. ביים אָנהייב פֿון דער רעקאָרדירונג זענען אַרויסגעלאָזט געוואָרן צען פּולסן פֿון ליכט 473 נאַנאָמעטער (פֿרעקווענץ 2 הערץ, פּולס געדויער 10 מיליסעקונדעס). פֿאָטאָסענסיטיוו צעלן זענען דעפֿינירט געוואָרן ווי צעלן וואָס האָבן אויסגעוויזן אַ שפּיץ רעאַקציע אין 10 מיליסעקונדעס פֿון ליכט אין 70% אָדער מער פֿון די פּראָבעס.