Faafetai mo le asiasi ile Nature.com. O lo'o e fa'aogaina se su'esu'ega e fa'atapula'aina le lagolago a le CSS. Mo le poto sili ona lelei, matou te fautuaina oe e te faʻaogaina se suʻesuʻega fou (pe faʻamalo le Faiga Faʻatasi i Internet Explorer). E le gata i lea, ina ia mautinoa le lagolago faifaipea, matou te faʻaalia le saite e aunoa ma sitaili ma JavaScript.
Fa'aali atu se carousel e tolu fa'asolo i le taimi e tasi. Fa'aoga fa'amau muamua ma le soso'o e fa'agasolo ai fa'ase'e se tolu i le taimi, pe fa'aoga fa'aa'a fa'asolo i le pito e fa'asolo ai fa'ase'e se tolu i le taimi.
O le fa'apipi'iina e le tagata lava ia neural organelles o lo'o fa'atusalia ai se fa'amoemoega lelei i vitro mo le fa'ata'ita'iina o le atina'eina o tagata ma fa'ama'i. Ae ui i lea, o organoids e leai se fesoʻotaʻiga o loʻo i ai i vivo, lea e faʻatapulaʻaina ai le matua ma taofia le tuʻufaʻatasia ma isi taʻaloga e pulea amioga. O iinei tatou te faʻaalia ai o le tino o le tagata e maua mai i le cortical organoids ua totoina i totonu o le somatosensory cortex o neonatal nude rats e atiaʻe ai ituaiga sela matutua e tuʻufaʻatasia i vaʻaiga faʻalogo ma faʻaosofia. O le MRI na faʻaalia ai le tuputupu aʻe o le organoid pe a maeʻa ona faʻaaogaina i le tele o laina sela ma manu, ae o suʻesuʻega tasi-autu na faʻaalia ai le alualu i luma o le corticogenesis ma le tulaʻi mai o se polokalame faʻaliliuga faʻalagolago i gaioiga. O le mea moni, e fa'aalia ai le tele o mea fa'alavelave, synaptic, ma totonu o le membrane i totonu o neu fa'apipi'i, e fa'atagaina ai le su'esu'eina o fa'aletonu i tagata mama'i e maua i le ma'i o Timothy. O su'esu'ega fa'apitoa ma fa'atinoga ua fa'aalia ai e maua e totoga fa'atosina le thalamocortical ma corticocortical, ma i vivo fa'amaumauga o neural activity e fa'ailoa mai ai o nei mea e mafai ona fa'atupuina ai tali fa'alogo i sela o le tagata. Ma le mea mulimuli, o cortical organoids e faʻalauteleina ai axons i le faiʻai o le isumu, ma o latou faʻagaioiga optogenetic e taʻitaʻia ai amioga suʻesuʻe taui. O le mea lea, ua matua'i matutua neu o le tino ma auai i ta'amilosaga a le tagata talimalo e pulea amioga. Matou te faʻamoemoe o lenei auala e faʻafaigofie ai le suʻesuʻeina o phenotypes strand-level phenotypes i sela e maua mai maʻi e le mafai ona iloa i isi auala.
O le fa'atupuina o le fai'ai o le tagata o se faiga fa'apitoa e fa'atulaga ai e sela e fa'atuputeleina, fa'avasega, femalaga'i, ma fa'afeso'ota'i e fa'atupu ai ni ta'amilosaga fa'atino e fa'amama atili e ala i le poto fa'alogo. O se fa'afitauli autu i le malamalama i le atina'eina o fai'ai o le tagata, aemaise lava i le tulaga o fa'ama'i, o le leai lea o se avanoa i le fai'ai. O le faʻatulagaina o le tagata lava ia, e aofia ai organoids cortex tagata (hCO; e taʻua foi o le tagata cortex sphere), e mafai ona gaosia 2,3,4,5,6. Ae ui i lea, o le tele o tapulaʻa faʻatapulaʻaina la latou faʻaoga lautele e malamalama ai i le atinaʻeina ma le faʻaogaina o neural circuits. Aemaise lava, e le o manino pe faʻatapulaʻaina le matua o le hCO ona o le leai o ni mea faʻaoga microenvironmental ma lagona o loʻo iai i vivo. E le gata i lea, talu ai e le o tuʻufaʻatasia le hCO i totonu o taʻaloga e mafai ona faʻatupuina ai amioga, o lo latou aoga i le faʻataʻitaʻiina o faʻalavelave faʻalavelave faʻapitoa ma faʻafitauli o le neuropsychiatric amio e faʻatapulaʻaina i le taimi nei.
O le fa'aliliuina o le hCO i totonu o se fai'ai ola ola e mafai ona manumalo i nei tapula'a. O suʻesuʻega talu ai ua faʻaalia ai o neu a tagata na faʻapipiʻiina i totonu o le rodent cortex e mafai ona ola, faʻatinoina, ma fesoʻotaʻi ma rodent cells7,8,9,10,11,12. Ae ui i lea, o nei faʻataʻitaʻiga e masani ona faia i luga o manu matutua, lea e mafai ona faʻatapulaʻaina synaptic ma axonal integration. O iinei, matou te faʻamatalaina se faʻataʻitaʻiga faʻasologa lea na matou faʻapipiʻiina ai le 3D hCO e maua mai i sela hiPS i totonu o le somatosensory cortex (S1) muamua o isumu faʻamaʻi i le amataga o le atinaʻeina o palasitisi. O neu o le hCO (t-hCO) ua fa'aliliuina e tele le matua, maua le thalamocortical ma cortical-cortical inputs e fa'aoso ai tali fa'alogo, ma fa'alautele le fa'ai'uga axonal i le fai'ai o le isumu e fa'aoso ai amioga saili taui. O le fa'atuputeleina o le t-hCO ua fa'aalia ai le fa'aletonu o le neuronal i tagata mama'i e maua i le ma'i o Timothy's syndrome (TS), o se ma'i tuga e mafua mai i suiga i le alavai o le L-type CaV1.2 calcium (fa'ailoga e CACNA1C).
Ina ia suʻesuʻe neu cortical tagata i matagaluega i vivo, matou stereotactically transplanted atoatoa 3D hCO i S1 o vave postnatal iole athymic (aso 3-7 postnatally) (Fig. 1a ma faʻalauteleina faʻamatalaga o le Ata 1a-c). I le taimi nei, o le thalamocortical ma corticocortical axonal projections e leʻi maeʻa a latou S1 innervation (ref. 13). O le mea lea, o lenei faiga ua mamanuina e faʻateleina ai le tuʻufaʻatasia o t-hCO aʻo faʻaitiitia le aʻafiaga i luga o taʻavale afi. Ina ia vaʻavaʻai i le nofoaga o le t-hCO i manu ola, na matou faia le T2-weighted MRI faiʻai toe faʻaleleia o isumu 2-3 masina pe a maeʻa le faʻapipiʻiina (Fig 1b ma faʻamatalaga faʻalautele, Ata 1d). T-hCO sa faigofie ona matauina ma fua le voluma o t-hCO sa tutusa ma na fuafuaina mai fasi fasi pepa (Faʻamatalaga Faʻalautele Fig. 1d, e; P> 0.05). T-hCO sa faigofie ona matauina ma fua le voluma o t-hCO sa tutusa ma na fuafuaina mai fasi fasi pepa (Faʻamatalaga Faʻalautele Fig. 1d, e; P> 0.05). t-hCO легко наблюдались, а объемные измерения t-hCO были аналогичны рассчитанным для фиксированных срезов (расид срезов) 1d, e; P> 0,05). t-hCO sa faigofie ona matauina, ma volumetric t-hCO fua tutusa ma na fuafuaina mo vaega tumau (faʻalauteleina faʻamatalaga, Ata 1d, e; P> 0.05).很容易观察到t-hCO，并且t-hCO的体积测量值与从固定切片计算的测量值相似（扩展数据图1d、e；P > 0.05）.很容易观察到t-hCO，并且t-hCO t-hCO легко наблюдался, а объемные измерения t-hCO были аналогичны рассчитанным для фиксированных срезов (расид срезов) 1d, e; P> 0,05). t-hCO sa faigofie ona matauina, ma volumetric t-hCO fua tutusa ma na fuafuaina mo vaega tumau (faʻalauteleina faʻamatalaga, Ata 1d, e; P> 0.05).Na matou fuafuaina le t-hCO i le 81% o manu faʻapipiʻi pe a ma le 2 masina talu ona faʻapipiʻiina (n = 72 manu; hCO mai 10 hiPS laina laina; laina telefoni hiPS i le Laulau Faaopoopo 1). O nei mea, 87% o loʻo i totonu o le cerebral cortex (Fig. 1c). E ala i le faʻatinoina o suʻesuʻega o le MRI i le tele o taimi i totonu o le iole faʻapipiʻi tutusa, na matou maua ai se faʻaopoopoga iva i le t-hCO volume i totonu ole 3 masina (Fig 1d ma faʻalauteleina faʻamatalaga, Ata 1f). O manu na fa'aliliuina sa i ai le maualuga o le ola (74%) i le 12 masina talu ona fa'aliliuina (fa'alautele fa'amaumauga, Ata 1g ma le Laulau Fa'aopoopo 2), ma e leai ni fa'aletonu o le afi po'o le manatua, gliosis, po'o le electroencephalogram (EEG) na maua. Fa'amatalaga Ata 1g ma le laulau fa'aopoopo 2). 1h–m ma le 3e).
a, Fuafuaga o mamanu fa'ata'ita'i. O le hCO na maua mai i sela o le hiPS na fa'apipi'iina i totonu o le S1 o isumu fa'ato'a fananau mai i aso 30-60 o le eseesega. b, T2-mamafa ma ata MRI faʻataʻitaʻiga o loʻo faʻaalia ai le t-hCO i le S1 2 masina pe a maeʻa le gaosiga. Fua fua, 2 mm. c, Fuafuaga o fua faatatau manuia engraftment faʻaalia mo laina telefoni hiPS taʻitasi (n = 108, numera i totonu o pa e faʻaalia ai le aofaʻi o le t-hCO i le laina telefoni feaveaʻi) ma le cortical poʻo le subcortical nofoaga (n = 88). d, MRI ata o se alatoto (agavale; fua pa, 3 mm) ma tutusa 3D volumetric toe fausia (scale pa, 3 mm) faaalia ai le faateleina o le t-hCO i luga o 3 masina. u, Iloiloga o mamanu t-hCO i rat cerebral cortex. Fua fua, 1 mm. f, Faʻaaliga immunocytochemical ata o le t-hCO faʻaalia mai le pito i luga agavale i le taumatau (i le taimi o le eseesega): PPP1R17 (4 masina le matua), NeuN (8 masina le matua), SOX9 ma le GFAP (8 masina le matua), PDGFRα; (8 masina), MAP2 (8 masina) ma le IBA1 (8 masina). Fua fua, 20 µm. O le fa'aaliga fa'atasi o le HNA e fa'ailoa mai ai sela na afua mai i le tagata. g, snRNA-seq: Fa'ata'ita'iga fa'aitiitiga fa'aitiitiga ma fa'ata'ita'iga (UMAP) o nuclei t-hCO maualuga uma ina ua mae'a fa'atasi Seurat (n=3 t-hCO fa'ata'ita'iga, n=2 hiPS laina sela). Astrocytes, sela o le laina astrocyte; cyc prog, tupuaga ta'amilo; GluN DL, neu glutamatergic loloto; GluN DL/SP, loloto ma sublamellar glutamatergic neurons; GluN UL, vaega pito i luga glutamatergic neurons; oligodendrocytes, oligodendrocytes; OPC, oligodendrocyte progenitor cell; RELN, reelin neurons. h, Gene Ontology (GO) suʻesuʻega faʻatamaoaigaina o kenera matua faʻatulafonoina (fetuunaʻi P <0.05, suiga gauga> 2, faʻaalia i le itiiti ifo i le 10% o nuclei) i le t-hCO glutamatergic neurons faʻatusatusa i le hCO glutamatergic neurons. h, Gene Ontology (GO) suʻesuʻega faʻatamaoaigaina o kenera matua faʻatulafonoina (fetuunaʻi P <0.05, suiga gauga> 2, faʻaalia i le itiiti ifo i le 10% o nuclei) i le t-hCO glutamatergic neurons faʻatusatusa i le hCO glutamatergic neurons. h, Анализ обогащения терминов Gene Ontology (GO) для генов со значительной активацией (скорректированный P <0,05, кратмоснеть ия экспрессия по крайней мере в 10% ядер) i глутаматергических нейронах t-hCO по сравнению с глутаматергических нейронах t-hCO по сравнению с глутаматергическимими. h, Gene Ontology (GO) su'esu'ega fa'atamaoaigaina mo kenera ma le fa'agaoioia taua (fetuuna'i P<0.05, suiga gauga> 2, fa'amatalaga i le itiiti ifo i le 10% nuclei) i t-hCO glutamatergic neurons fa'atusatusa i le hCO glutamatergic neurons. h，与hCO 谷氨酸能神经元相比，t-hCO 谷氨酸能神经元中基因显着上调（调整后P ， 0.5 P 2，在至少10% 的细胞核中表达）的基因本体论(GO) 术语富集分析。 h ， 与 hco 谷氨酸 能 元 相比 ， t-hco 谷氨酸 能 神经 元 基因 显着 上调 （后 后 后 后 后 元 基因 显着 上调 （后后后变化> 2 ， 至少 10% 的 核中 表达） 基因 基因 基因 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 间术语富集分析。 h, гены значительно активизировались (скорректированный P <0,05, кратность изменения> 2, экспрессируется по крайне в 1%янд) глутаматергических нейронах t-hCO по сравнению с глутаматергическими нейронами hCO Онтологический (GO) анаглиз тебормий h, genes na matua faʻatulafonoina (fetuunaʻi P <0.05, suiga gauga> 2, faʻaalia i le itiiti ifo i le 10% o nuclei) i le t-hCO glutamatergic neurons faʻatusatusa i le hCO glutamatergic neurons Ontological (GO) suʻesuʻega o le taimi faʻatamaoaigaina.O le laina togitogi e faʻaalia ai le taua o le 0.05. i, UMAP ata o GluN ituaiga sela i t-hCO faʻaaogaina igoa faʻafeiloaʻi mai se faʻamatalaga 22 snRNA-seq tagata matutua moto cortex dataset. CT - sela corticothalamic, ET - sela extracerebral, IT - sela telencephalic totonu, NP - latalata projection.
Ona matou iloiloina lea o le cytoarchitecture ma le aotelega o le telefoni feaveaʻi o t-hCO. Antibody staining o rat endothelial cell na faʻaalia ai le vasa ma le t-hCO, ae o le IBA1 staining na faʻaalia ai le i ai o le rat microglia i le taimi atoa o le sulu (Fig. 1f ma faʻalauteleina faʻamatalaga, Ata 3c, d). O le Immunostaining na faʻaalia ai sela lelei faʻamaʻi a le tagata (HNA) o loʻo faʻaalia PPP1R17 (cortical progenitors), NeuN (neurons), SOX9 ma GFAP (glial-derived cell) poʻo PDGFRα (oligodendrocyte progenitors) (Ata 1f). Ina ia suʻesuʻeina le tuʻufaʻatasiga o le t-hCO i se faʻaiʻuga e tasi, na matou faia le faʻasologa o le RNA tasi-matua (snRNA-seq) pe a ma le 8 masina o le eseesega. O le tele o le fa'amama ma le aveeseina o le rat nuclei na maua ai le 21,500 fa'afanua fa'atosina a le tagata (Fig. 1g ma fa'alautele fa'amaumauga, Ata 4a,b). Fa'aaliga fa'atusa o fa'ailoga masani cell-type fa'ailoaina fuifui o vasega cortical cell tele, e aofia ai neu glutamatergic loloto ma papa'u, ta'amilosaga tupuaga, oligodendrocytes, ma astrocyte gafa (Fig. 1g, fa'alauteleina fa'amatalaga, Ata 4c, ma le Laulau Fa'aopoopo 3). Immunostaining mo SATB2 ma CTIP2 na faʻaalia ai e ui lava i le i ai o faʻasologa o le cortical, e leʻi faʻaalia e le t-hCO le faʻavasegaina o anatomical (faʻalauteleina faʻamatalaga, Ata 3a). tulaga-matched snRNA-seq hCO gaosia lautele vasega sela tutusa, faatasi ai ma ni nai tuusaunoaga, e aofia ai le leai o oligodendrocytes ma le i ai o GABAergic neurons, lea e mafai ona atagia ai le lelei lipotia i vitro tulaga mo lateral progenitor cells15 (faʻalauteleina faʻamatalaga, Ata 4f - i ma le Laulau Faaopoopo 4). O suʻesuʻega o faʻamatalaga faʻapitoa na faʻaalia ai le tele o eseesega i le glutamatergic neurons i le va o t-hCO ma le hCO (Supplementary Table 5), e aofia ai le faʻagaoioia o seti o kenera e fesoʻotaʻi ma le matua o le neuronal e pei o le synaptic signaling, dendritic localization, ma le voltage-gated channel activity (Ata 1h ma le Laulau Faaopoopo 5). laulau 6). E tusa ai ma lea, o cortical glutamatergic t-hCO neurons na faʻaalia le faʻavaveina o le faʻasologa o tusitusiga.
Ina ia faʻamalamalamaina pe o nei suiga i le t-hCO e fesoʻotaʻi ma le eseesega o le morphological i le va o le hCO in vitro ma le t-hCO i vivo, matou te toe faʻaleleia le laʻasaga-matched biocytin-tumu hCO ma le hCO i vaega mataʻutia pe a uma le 7-8 masina o le eseesega. hCO neurons (Ata 2a). t-hCO neurons e matua tele, e 1.5 taimi i le soma diameter, faaluaina le tele o dendrites, ma le aofaʻi atoa e ono faʻateleina le umi o le dendritic pe a faʻatusatusa i le in vitro hCO (Fig. 2b). E le gata i lea, na matou matauina se maualuga maualuga o le dendritic spines i t-hCO neurons nai lo le hCO neurons (Fig. 2c). O lenei mea e taʻu mai ai o le t-hCO neurons e maua le tele o le dendritic elongation ma le lala, lea, i le tuʻufaʻatasia ma le faʻaauauina o le cell proliferation, e mafai ona saofagā i le tuputupu aʻe malosi o le t-hCO pe a uma le faʻapipiʻiina (Fig 1d ma Extended Data Fig. 1f). O lenei mea na fa'aosofia ai i matou e su'esu'e i mea tau eletise. O le malosi o le membrane e valu taimi maualuga (faʻalauteleina faʻamatalaga, Fig. 8d), o le malologa-setete membrane gafatia na sili atu hyperpolarized (tusa ma le 20 mV), ma o le tui o loʻo i ai nei na faʻaosoina ai se maualuga maualuga maualuga o le fiafia i t-hCO neurons nai lo le hCO neurons. in vitro (Fig. 2d), e), lea e ogatasi ma le tele ma sili atu ona lavelave vaega morphological o t-hCO. E le gata i lea, o le tele o taimi o faʻalavelave faʻafuaseʻi postsynaptic (EPSC) na matua maualuga atu i le t-hCO neurons (Fig 2f), ma faʻaalia ai o le faʻateleina o le maualuga o le dendritic spines o loʻo matauina i t-hCO neurons na fesoʻotaʻi ma le faʻaogaina o galuega. synapse fa'afeusuaiga. Na matou faʻamaonia le uiga leʻo o le hCO neurons in vitro e ala i le faʻamauina o le glutamatergic neurons (faʻalauteleina faʻamatalaga, Ata 6a-c).
a, 3D toe fausia o biocytin-tumu hCO ma t-hCO neurons ina ua mavae 8 masina o eseesega. b, Faʻatusatusaga o foliga faʻapitoa (n = 8 hCO neurons, n = 6 t-hCO neurons; ** P = 0.0084, * P = 0.0179 ma *** P <0.0001). b, Faʻatusatusaga o foliga faʻapitoa (n = 8 hCO neurons, n = 6 t-hCO neurons; ** P = 0.0084, * P = 0.0179 ma *** P <0.0001). б, количественная оценка морфологических признаков (n = 8 нейронов hCO, n = 6 нейронов t-hCO; ** P = 0,0084, * P = 0,001). b, faʻatusatusaga o foliga faʻapitoa (n = 8 hCO neurons, n = 6 t-hCO neurons; ** P = 0.0084, * P = 0.0179, ma *** P <0.0001). b，形态学特征的量化（n = 8 个hCO 神经元，n = 6 个t-hCO 神经元；**P = 0.0084，*P = 0.0179 。 b，形态学特征的量化（n = 8 个hCO 神经元，n = 6 个t-hCO 神经元；**P = 0.0084，*P = 0.0179 。 б, количественная оценка морфологических признаков (n = 8 нейронов hCO, n = 6 нейронов t-hCO; ** P = 0,0084, * P = 0,001). b, faʻatusatusaga o foliga faʻapitoa (n = 8 hCO neurons, n = 6 t-hCO neurons; ** P = 0.0084, * P = 0.0179, ma *** P <0.0001).c, 3D toe fausia o le hCO ma t-hCO dendritic lala pe a uma le 8 masina o le eseesega. Fetu mūmū e fa'ailoa mai ai fa'amala'au dendritic. Dendritic spine density quantification (n = 8 hCO neurons, n = 6 t-hCO neurons; ** P = 0.0092). d, Fuafuaga o le malosi o le membrane malolo (n = 25 hCO neurons, n = 16 t-hCO neurons; *** P <0.0001). d, Fuafuaga o le malosi o le membrane malolo (n = 25 hCO neurons, n = 16 t-hCO neurons; *** P <0.0001). d, количественная оценка мембранного потенциала покоя (n = 25 нейронов hCO, n = 16 нейронов t-hCO; *** P <0,0001). d, fa'ato'a fa'aputuga gafatia (n = 25 hCO neurons, n = 16 t-hCO neurons; *** P <0.0001). d，静息膜电位的量化（n = 25 hCO 神经元，n = 16 t-hCO 神经元；***P <0.0001）. d，静息膜电位的量化（n = 25 hCO 神经元，n = 16 t-hCO 神经元；***P <0.0001）. d, количественная оценка мембранного потенциала покоя (n = 25 нейронов hCO, n = 16 нейронов t-hCO; *** P <0,0001). d, fa'ato'a fa'aputuga gafatia (n = 25 hCO neurons, n = 16 t-hCO neurons; *** P <0.0001). u, Toe fa'atupu fa'atupu fa'alavelave fa'aoso i le hCO ma t-hCO fa'aosoina e ala i le fa'ateleina o tui o lo'o i ai nei, ma le fa'atusatusaina o le maualuga o le fa'aosoina (n = 25 hCO neurons, n = 16 t-hCO neurons; *** P <0.0001). u, Toe fa'atupu fa'atupu fa'alavelave fa'aoso i le hCO ma t-hCO fa'aosoina e ala i le fa'ateleina o tui o lo'o i ai nei, ma le fa'atusatusaina o le maualuga o le fa'aosoina (n = 25 hCO neurons, n = 16 t-hCO neurons; *** P <0.0001). u, fa'atupu fa'atonuga fa'apitoa i le hCO ma t-hCO, fa'atupu fa'ama'i, ma le pule fa'apitoa. возбуждения (n = 25 нейронов hCO, n = 16 нейронов t-hCO; *** P <0,0001). u, gaioiga e mafai ona toe faʻaosoina i le hCO ma le t-hCO faʻaosoina e ala i le faʻatupulaia o loʻo iai nei ma le faʻatusatusaina o le maualuga o le sasaina o le afi (n = 25 hCO neurons, n = 16 t-hCO neurons; *** P <0.0001). e，通过增加电流注入诱导的hCO 和t-hCO 重复动作电位放电，以及最大放电率的量区 = CO2神经元，n = 16 个t-hCO 神经元；***P <0.0001）. E ， 通过 增加 电流 注入 的 的 hco 和 t-hco 重复 电位 放电 ， 以及 最 大 的 量化 （n2（n ， n = 16 个 t-hco 神经 ； *** p <0.0001） . u, fa'atonuga fa'apitoa mo le fa'atonuga o le hCO ma le t-hCO, fa'apea fo'i le fa'atonuga o le pule, ma le pule fa'aletulafono. скорости возбуждения (n = 25 нейронов hCO, n = 16 нейронов t-hCO; *** P <0,0001). u, faʻatupu faʻasolosolo o le hCO ma le t-hCO gaioiga gaioiga faʻaosoina e ala i le faʻateleina o le sapalai o loʻo i ai nei ma le faʻatusatusaina o le maualuga o le sasaina (n = 25 hCO neurons, n = 16 t-hCO neurons; *** P <0.0001). f, EPSCs Spontaneous (sEPSCs) i hCO ma t-hCO neurons i le 8 masina o le eseesega, ma le faʻatusatusaina o le tele o taimi o synaptic (n = 25 hCO neurons, n = 17 t-hCO neurons; *** P <0.0001). f, EPSCs Spontaneous (sEPSCs) i hCO ma t-hCO neurons i le 8 masina o le eseesega, ma le faʻatusatusaina o le tele o taimi o synaptic mea tutupu (n = 25 hCO neurons, n = 17 t-hCO neurons; *** P <0.0001) . f, спонтанные EPSC (sEPSC) i нейронах hCO ma t-hCO через 8 месяцев дифференцировки ma количественная оценка частоты частоты синаптич 5 нейронов hCO, n = 17 нейронов t-hCO; f, EPSCs Spontaneous (sEPSCs) i hCO ma t-hCO neurons i le 8 masina o le eseesega ma le faʻatusatusaina o fua faatatau o synaptic (n = 25 hCO neurons, n = 17 t-hCO neurons; *** P <0.0001). f，分化8 个月时hCO 和t-hCO 神经元中的自发性EPSCs (sEPSCs)，以及突触事件频率的量化5（n CO =2（n 17 t-hCO 神经元；***P < 0.0001） . f，分化8 个月时hCO 和t-hCO 神经元中的自发性EPSCs (sEPSCs)，以及突触事件频率的量匼5（n CO =2（n神率的量匼（n = 25 hCO 神率的量匼（n = 25hCO P < 0.0001） . f, спонтанные EPSC (sEPSC) i нейронах hCO ma t-hCO через 8 месяцев дифференцировки ma количественная оценка частоты частоты синаптич 5 нейронов hCO, n = 17 нейронов t-hCO; f, EPSCs Spontaneous (sEPSCs) i hCO ma t-hCO neurons i le 8 masina o le eseesega ma le faʻatusatusaina o fua faatatau o synaptic (n = 25 hCO neurons, n = 17 t-hCO neurons; *** P<0.0001).Mo bf, hCO ma t-hCO i le laina 1208-2 na ave mai le vaega tutusa o le eseesega na tausia i le tutusa. g, Gene seti su'esu'ega fa'atamaoaigaina (su'ega sa'o a Fisher e tasi itu) o kenera e matua fa'atulafonoina (fetuuna'i P <0.05, suiga gauga> 2, fa'aalia i le itiiti ifo i le 10% o nuclei) i t-hCO glutamatergic neurons fa'atusatusa i le hCO glutamatergic neurons ma gene seti o le vave-tali-fa'agaoioi (ERG) fa'aalia (ERG fa'alagolago i le ga'o) su'esu'ega isumu16 ma LRG fa'apitoa a tagata mai i in vitro neurons17. g, Gene seti su'esu'ega fa'atamaoaigaina (su'ega sa'o a Fisher e tasi itu) o kenera e matua fa'atulafonoina (fetuuna'i P <0.05, suiga gauga> 2, fa'aalia i le itiiti ifo i le 10% o nuclei) i t-hCO glutamatergic neurons fa'atusatusa i le hCO glutamatergic neurons ma gene seti o le vave-tali-fa'agaoioi (ERG) fa'aalia (ERG fa'alagolago i le ga'o) su'esu'ega isumu16 ma LRG fa'apitoa a tagata mai i in vitro neurons17. g, анализ обогащения набора генов (односторонний точный критерий Фишера) генов со значительной активацией (скор0ректирой (скор0ректироть) изменения > 2, экспрессия по меньшей мере в 10% ядер) i глутаматергических нейронах t-hCO по сравнению по сравнению с глумита с глутаматергических hCO наборы генов как раннего (ERG), так и позднего (LRG) генов, зависящих от активности, идентифицированных в иваниших в имсиш6 и специфических для человека LRG из нейронов in vitro17. g, au'ili'iliga o le fa'atamaoaigaina o kenera (su'ega tonu a Fisher e tasi-tailed) o kenera ma le fa'agaoioia taua (fetuuna'i P<0.05, suiga gauga>2, fa'amatalaga i le itiiti ifo i le 10% o le nuclei) i t-hCO glutamatergic neurons fa'atusatusa i le hCO glutamatergic neurons seti o le amataga (ERG) ma le tuai (LRG) fa'aalia gaioiga fa'aletagata-fa'alagolago i le genesce16. LRGs mai neu i vitro17. g，t-hCO谷氨酸能神经元与hCO谷氨酸能神经元相比，t -hCO谷氨酸能神经元显着上调（调整后P<0.05，仍数变化>2，在至少10%的细胞核中表达）的基因集富集分析（单侧F isher精确检验）从体内小鼠研究中鉴定的早期反应(ERG)和晚期反应(LRG) 活性依赖性基因的基因组16 和体外神经元17 中的人类特异性LRG。 g ， t-hco 谷氨酸 神经 元 与 hco 谷氨酸 神经 元 相比 ， t-hco 谷氨酸 神经 元 上调0. ， 数> 2 ， 至少 至少 10%的 细胞 核中 表达） 的 集富集 分析 （单侧 精确）研究 中 的 早期 反应 反应 反应 和 晚期 反应 反应 (lrg) 活性 基因 的 基因 的 基因 璌 6神经元 17 中 中 17 中 17的人类特异性LRG. g, глутаматергические нейроны t-hCO были значительно активизированы по сравнению с глутаматергическими нейсронами hCO P<0,05, кратность изменения> 2, не менее 10% Анализ обогащения набора генов (односторонний точный тест Фишетра) позднего гены, зависящие от активности ответа (LRG), идентифицированные в исследованиях на мышах in vivo16 и in vivo16 и in vivo16 и нейри7нах для человека. g, t-hCO glutamatergic neu sa matua upregulated pe a faatusatusa i hCO glutamatergic neurons (fetuunai P<0.05, gaugau suiga>2, a itiiti mai 10% Tali vave (ERG) ma le tuai tali faʻamaoaigaina suʻesuʻega (tasi-tailed Fisher saʻo suega) tali gaoioiga faʻalagolago genes (LRGs) faailoaina i totonu ma vivo mice tagata LRGs patino i totonu ma vivo mice tagata LRG16 neurons.O le laina togitogi o loʻo faʻaalia ai le faʻamaonia o le Bonferroni P tau o le 0.05. h, GluN gene expression (pseudo-package ma scaling of genes taʻitasi) na matua faʻatonutonuina i snRNA-seq faʻatusa o kenera LRG i t-hCO glutamatergic neurons. i, immunostaining faʻaalia SCG2 faʻaaliga i t-hCO (luga) ma hCO (lalo) neu. O aū paepae e faasino i sela SCG2+. Fua fua, 25 µm. O faʻamaumauga o loʻo faʻaalia o le uiga ± masani masani.
Faʻavae i luga o le faʻateleina o le gaioioiga o t-hCO o loʻo matauina i totonu o fasi pepa, snRNA-seq na faʻaalia ai se faʻatonuga faʻalagolago i le gaioiga o faʻasologa o kenera i t-hCO faʻatusatusa i le hCO in vitro. Glutamatergic t-hCO neurons na faʻaalia le maualuga maualuga o kenera e faʻatonutonu ai le tuai o le tali atu (Fig. 2g, h), lea na maua i suʻesuʻega muamua i le kiore ma tagata neu16,17. Mo se faʻataʻitaʻiga, o le BDNF18, SCG2, ma le OSTN, o se gaʻo e faʻatonuina gaioiga faʻapitoa, na faʻaalia ai le faʻateleina o faʻamatalaga i le t-hCO neurons faʻatusatusa i le hCO neurons (Fig. 2g-i). O le mea lea, o t-hCO neurons na faʻaalia le faʻaleleia atili o uiga matua faʻatusatusa i le hCO neurons e ala i le faʻaliliuga, morphological, ma suʻesuʻega faʻatinoga.
Ina ia toe iloilo atili le fesoʻotaʻiga o le matua o le t-hCO ma le atinaʻeina o faiʻai o le tagata, matou te faia faʻatusatusaga transcriptomic o fetal ma matua cortical cell types19,20 ma adult21,22 faʻapea foʻi ma faʻamatalaga lautele i luga o le cortical gene expression23 i le taimi o le atinaʻe (faʻalauteleina faʻamatalaga, Ata 5). ). faʻatasi ai ma le galuega talu ai 24, o le lalolagi atoa o le hCO ma le t-hCO transcriptome maturation status i 7-8 masina o le eseesega e lautele faʻatasi ma le taimi o le atinaʻeina o le vivo ma e sili ona tutusa ma le tuai o le ola o le fetal (Extended Data Fig. 5a). E le gata i lea, na matou matauina le faʻatupulaia o le matua o le transcriptome i le t-hCO faʻatusatusa i le hCO tutusa tausaga, faʻapea foʻi ma le faʻagaioiina o tusitusiga e fesoʻotaʻi ma le synaptogenesis, astrogenesis, ma le myelination (faʻalauteleina faʻamatalaga, Ata 5b-d). I luga o le telefoni feaveaʻi, na matou maua ai faʻamaoniga o se faʻataʻitaʻiga o le cortex sili atu i le t-hCO, faʻatasi ai ma fuifui o glutamatergic neurons o loʻo faʻapipiʻiina ma tagata matutua L2 / 3, L5, ma L6 neuron subtypes (Ata 1i). I le faʻatusatusaga, o le fuifui faʻapipiʻi i le va o le glutamatergic t-hCO neurons ma fetal cortical neurons na sili atu ona faʻatapulaʻaina i le ogatotonu o le maitaga (faʻalauteleina faʻamatalaga, Ata 5e-j). Ina ia iloa pe o le t-hCO neurons e foliga tutusa ma tagata postnatal neocortical neurons, matou faia electrophysiological faamaumauga ma anatomical reconstructions o tagata L2 / 3 pyramidal neurons i vaega maai o le postnatal cortex tagata (faʻalauteleina faʻamatalaga, Ata 7a). O mea eletise eletise o L2 / 3 pyramidal neurons e tutusa ma le t-hCO pyramidal neurons (faʻalauteleina faʻamatalaga, Ata 7e). Morphologically, L2 / 3 neurons mai faʻataʻitaʻiga tagata postnatal e sili atu ona tutusa i le t-hCO nai lo le hCO, e ui lava o le L2 / 3 sela e umi atu, o loʻo i ai le tele o lala i le aotelega, ma e maualuga atu le maualuga o le tui (Fig. 3g ma faʻalauteleina faʻamatalaga, Ata 7b-). G).
a, fa'aliliuina o le hCO gaosia e ala ile pulea ma TS hiPS laina sela i iole pepe. b, 3D toe fausia o biocytin-tumu t-hCO neurons ina ua uma le 8 masina o eseesega. c, faʻatusatusaga o le umi o le dendritic umi (n = 19 pulea neurons, n = 21 TS neurons; ** P = 0.0041). d, 3D-reconstructed dendritic lala mai le pule ma TS t-hCO i 8 masina o le eseesega, ma le faʻatusatusaina o le dendritic spine density (n = 16 control neurons, n = 21 TS neurons, *** P <0.0001). d, 3D-reconstructed dendritic lala mai le pule ma TS t-hCO i 8 masina o le eseesega, ma le faʻatusatusaina o le dendritic spine density (n = 16 control neurons, n = 21 TS neurons, *** P <0.0001). d, 3D-pulepulega pulepulega ветвей из контроля и TS t-hCO через 8 mесяцев дифференцировки и контроля количествентя дендритных шипов (n = 16 контрольных нейронов, n = 21 TS нейронов, *** P <0,0001). d, 3D toe fausia o lala dendritic mai le pulea ma t-hCO TS i 8 masina o le eseesega ma le dendritic spine density quantification (n = 16 pulea neurons, n = 21 TS neurons, *** P<0.0001). d，分化8 个月时对照和TS t-hCO 的3D 重建树突分支，以及树突棘密度的量化（n = 16 个切21 个TS 神经元，***P < 0.0001）. d ， 分化 8 个 时 对照 和 ts t-hco 的 3d 重化 分支 分支 以及 树突棘 密度 量化 （n = 16元， n = 21 个 ts 神经 ， *** p <0.0001 ）. d, 3D-pulepulepulega faʻapitoa i totonu o le fale ma le TS t-hCO e 8 masina faʻamalo ma le pule o le pule шипов (n = 16 контрольных нейронов, n = 21 TS нейронов, *** P <0,0001). d, 3D toe fausia o lala dendritic pulea ma TS t-hCO i 8 masina o eseesega ma le dendritic iviila density quantification (n = 16 pulea neurons, n = 21 TS neurons, *** P<0.0001).Fetu mūmū e fa'ailoa mai ai fa'amala'au dendritic. u, EPSCs tuusao i le pulea ma TS t-hCO neurons ina ua mavae 8 masina o eseesega. f, faʻasologa faʻasolosolo faʻasologa ma le faʻatusatusaina o taimi ma le tele o mea tutupu synaptic (n = 32 pulea neu, n = 26 TS neurons; ** P = 0.0076 ma P = 0.8102). g, Iloiloga a le Scholl o TS ma pulea neu i hCO ma t-hCO. O laina faʻasalalau e faʻaalia ai le tagata L2 / 3 postnatal pyramidal neurons mo faʻatusatusaga (n = 24 pulea t-hCO neu, n = 21 TS t-hCO neu, n = 8 pulea hCO neu, ma n = 7 TS hCO neu). O faʻamaumauga o loʻo faʻaalia o le uiga ± faʻasologa masani
O le malosi o le t-hCO e toe faʻataʻitaʻia ai le morphological ma le faʻaogaina o foliga o le cortex neurons i se tulaga maualuga na mafua ai ona matou suʻesuʻeina pe mafai ona faʻaogaina le t-hCO e iloa ai faʻamaʻi faʻamaʻi. Na matou taulaʻi atu i le TS, o se maʻi ogaoga neurodevelopmental e mafua mai i suiga o le gaʻo-o-galuega i le gene encoding CaV1.2, lea e amataina ai le faʻaogaina o gene faʻalagolago i gaioiga i neu. Na matou mauaina le hCO mai le tolu maʻi TS o loʻo tauaveina le suiga sili ona taatele (p.G406R) ma le tolu faʻatonuga (Fig. 3a). Ina ua maeʻa le faʻapipiʻiina, na matou iloa ai o le dendritic morphology na suia i le TS neurons pe a faʻatusatusa i faʻatonuga (Fig 3b ma faʻalauteleina faʻamatalaga, Ata 8a, b), faʻatasi ai ma le faʻaluaina o le numera o le dendrites muamua ma le faʻaopoopoga atoa o le uiga ma le faʻaitiitia atoa o le umi o le dendritic (Fig 3c ma faʻamatalaga faʻalautele, Ata 8c). O lenei mea na fesoʻotaʻi ma le faʻateleina o le tele o tui ma le faʻateleina o taimi ole EPSC i le TS faʻatusatusa i le pulea o neu (Fig. 3d-f ma faʻalauteleina faʻamatalaga, Ata 8g). O isi suʻesuʻega na faʻaalia ai faʻataʻitaʻiga o lala dendritic e le masani ai i le t-hCO TS faʻatusatusa i faʻatonuga, ae le o in vitro TS hCO i se tulaga tutusa o le eseesega (Fig. 3g). O loʻo ogatasi lea ma a matou lipoti talu ai o le faʻaogaina o le dendritic faʻalagolago i le TS ma faʻamaonia ai le gafatia o lenei faʻasologa faʻavae e iloa ai faʻamaʻi faʻamaʻi i vivo.
Ona matou fesili lea pe o le a le tele o le t-hCO o loʻo tuʻufaʻatasia i totonu o le iole S1. S1 i rodents maua malosi synaptic inputs mai le ipsilateral ventral basal ma posterior thalamic nuclei, faʻapea foʻi ma le ipsilateral motor ma somatosensory cortices lona lua, ma contralateral S1 (Fig. 4a). Ina ia toe faʻafoʻi le mamanu innervation, matou faʻamaʻiina le hCO i le rabies virus-dG-GFP/AAV-G ma faʻapipiʻi le hCO i le S1 rat i le 3 aso mulimuli ane. Na matou matauina le tele o le GFP faʻamatalaga i neu o le ipsilateral S1 ma le ventral basal ganglia 7-14 aso talu ona faʻapipiʻiina (Fig. 4b, c). E le gata i lea, o le faʻailogaina o le antibody o le thalamic marker netrin G1 na faʻaalia ai le i ai o faʻauʻuga thalamic i le t-hCO (Fig. 4d, e). Ina ia iloilo pe mafai e nei faʻataʻitaʻiga faʻafefe ona faʻaalia tali synaptic i sela t-hCO, matou te faia faʻamaumauga atoa mai sela o tagata i vaega maʻai o le thalamocortical layer. Fa'aoso eletise ole iole S1, pusa i totonu, mea pa'epa'e, filo e latalata ile t-hCO po'o le fa'agaoioia o le optogenetic o opsin-fa'aalia fa'ai'uga thalamic i le t-hCO fa'aosoina pupuu ePSCs i t-hCO neu fa'aalia ile AMPA fa'afeagai le NBQX. (Ata 4f, g ma faʻamatalaga faʻalautele, Ata 9a-g). O fa'amaumauga nei o lo'o fa'aalia ai o le t-hCO o lo'o tu'ufa'atasia i totonu o le fai'ai o isumu ma e mafai ona fa'agaoioi e ala i mea'ai o le iole.
a, Fa'ata'ita'iga fa'ata'ita'iga o se su'ega su'esu'e rabies. b, GFP ma faʻamatalaga STEM121 faʻapitoa a le tagata i le va o le t-hCO ma le rat cerebral cortex (pito i luga). O lo'o fa'aalia fo'i le fa'aaliga o le GFP i le isumu ipsilateral ventral basal nucleus (VB) (lalo agavale) ma le ipsilateral S1 (lalo taumatau). Fua fua, 50 µm. O sikuea mumu e fai ma sui o vaega o le faiʻai na ave ai ata. c, fa'atusatusaga o sela fa'aalia GFP (n = 4 rats). d, e - Netrin G1 + thalamic terminals i t-hCO. d o loʻo faʻaalia ai se vaega o le korona o loʻo iai le t-hCO ma le VB nuclei. Fua fua, 2 mm. e faʻaalia Netrin G1 ma STEM121 faʻaaliga i t-hCO (agavale) ma VB (taumatau) neu. Fua fua, 50 µm. O le laina togitogi moli e fa'ailoa ai le tuaoi t-hCO. f, g, Fa'ailoga o lo'o i ai nei o t-hCO neu pe a uma le fa'aosoina o le eletise i le S1 rat (f) po'o le pusa totonu (g), fa'atasi ai ma le (lanu viole) po'o le leai (uliuli) NBQX (agavale). EPSC amplitudes ma e aunoa ma le NBQX (n = 6 S1 neurons, * P = 0.0119; ma le n = 6 internal capsule neurons, ** P = 0.0022) (ogatotonu). Pasene o t-hCO neurons o loʻo faʻaalia le EPSC i le tali atu i le faʻamalosia o le eletise S1 (f) poʻo le pusa totonu (g) ​​(taumatau). aCSF, sua ole cerebrospinal. h, ata fa'ata'ita'i o le fa'ata'ita'iga ata 2P (agavale). Fa'aaliga o GCaMP6s ile t-hCO (ogatotonu). Fua fua, 100 µm. Taimi fa'alelei ole GCaMP6s (taumatau). i, Z-sikoa o le fa'aoso fa'atotonugalemu. j, fa'ata'ita'iga fa'ata'ita'iga o le fa'aosoina o misa. k, z-scored 2P fluorescence trajectories i se tasi tofotofoga, ogatasi ma le 'ava 'ese'ese i le taimi zero (laina tipi) i sela faataitaiga. l, o le faitau aofa'i-average z-score tali o sela uma o lo'o fa'aogatasi ma le 'ava 'ese'ese i le taimi e leai (laina laina) (lanumumu) po'o fa'ailoga taimi fa'atupu fa'afuase'i (efuefu). m. Ata fa'ata'ita'i ole fa'ata'ita'iga ile fa'ailoga mata. n, Pi'o eletise mata'utia mai se fa'ata'ita'iga t-hCO sela i le taimi o le fa'aoso leisa lanumoana po'o le fa'a'ese'ese o le 'ava. O aū mumu e fa'aalia ai tui muamua e mafua mai i le malamalama (pito i luga) po'o le fa'afefe o le 'ava (lalo). O le paolo efuefu e fa'ailoa mai ai taimi e fa'afefe ai le 'ava. o, Fa'aalu fa'aalu malamalama pito i luga ma tali fa'afe'ese'esea'i. p, tui o se taumafaiga e tasi, o loʻo ogatusa ma le faʻasesega o le 'ava i totonu o sela o le faʻataʻitaʻiga. 0 o lo'o fa'ailoa mai ai le 'ese'ese o le 'ava (laina tipi). q, fua fa'aupuina z-sikoa fa'atatau o le faitau aofa'i mo sela ma'ale'ale uma, fa'afetaui ma le 'ese'ese o le 'ava i le taimi e leai (laina tipi) (mumu) po'o fa'ailoga taimi fa'atupu fa'afuase'i (efuefu). r, Fa'avasegaina o iunite fa'ata'ita'i e matua fa'atulagaina e ala i le 'ava (n = 3 iole) (agavale). O le maualuga o le z-score latency (n = 3 iole; n = 5 (meamata lanumeamata), n = 4 (lanumeamata pogisa), ma le n = 4 (cyan) iunite fa'afe'ese'ese 'ava'ai i iole) (taumatau). O faʻamaumauga o loʻo faʻaalia o le uiga ± masani masani
Ona matou fesili lea pe mafai ona faʻagaoioia le t-hCO e ala i lagona faʻaosofia i vivo. Na matou su'iina le hCO e fa'aalia ai fa'ailoga o le calcium fa'ailoga GCaMP6 i totonu o isumu S1. A maeʻa aso 150, matou te faia le fiber photometry poʻo le lua-photon calcium imaging (Fig 4h ma faʻalauteleina faʻamatalaga, Ata 10a). Na matou iloa o sela t-hCO o loʻo faʻaalia le gaioiga faʻatasi (Ata 4i, Faʻamatalaga Faʻalautele, Ata 10b ma Vitio Faʻaopoopo 1). Ina ia faʻaalia le maualuga o le t-hCO gaioiga, matou te faia extracellular electrophysiological puʻeina i faʻamaʻi faʻamaʻi toto (faʻalauteleina faʻamatalaga, Ata 10c-f). Ua matou fatuina faʻasalalauga faʻapitoa mai ata MRI; o lea, o nei iunite faamauina e fai ma sui putative neurons tagata, e ui lava electrophysiology e le faatagaina se ituaiga o tupuaga e fuafuaina. Na matou matauina le fa'amaopoopoina o fa'agaioiga (fa'alautele fa'amaumauga, Ata 10d). O faʻalavelave faʻafuaseʻi e tusa ma le 460 ms ma na vavaeeseina i taimi lemu e tusa ma le 2 s (faʻalauteleina faʻamatalaga, Ata 10d, e). E tusa ma le tolu ta'amilosaga na pa'u e iunite ta'ito'atasi, e tusa ma le 73% o iunite fa'amauina i le pa. O gaioiga a iunite taʻitasi na matua faʻapipiʻiina, ma o nei fesoʻotaʻiga e maualuga atu nai lo vaega na faʻaalia i manu e leʻi tuiina na faʻamauina i lalo o tulaga tutusa (faʻalauteleina faʻamatalaga, Ata 10f). Ina ia faʻaalia atili le faʻaogaina o tali a le tagata ua iloa, na matou faia ni suʻesuʻega faʻamalama i luga o isumu faʻamaʻi faʻapipiʻiina ma le hCO faʻaalia le rhodopsin 2 (hChR2), lea e iloa ai e le t-hCO neurons puupuu (itiiti ifo i le 10 ms) i le tali atu i le moli lanumoana stimuli (Fioga). t-hCO neurons na faʻaalia le paʻu o gaioiga faʻafuaseʻi i laina tutusa ma mea na matauina i le faʻataʻitaʻiga o le calcium, faʻapea foʻi ma faʻamaumauga electrophysiological na faia i le t-hCO i le leai o se faʻailoga malamalama (faʻalauteleina faʻamatalaga, Ata 10c-g). E leai se gaioiga faʻafuaseʻi na matauina i laʻasaga tutusa o le hCO faʻamaumau i vitro. Ina ia su'esu'e pe mafai ona fa'agaoioia le t-hCO e ala i mea fa'aoso fa'alogona, na matou fa'ate'a fa'apu'upu'u le 'ava o isumu mai le t-hCO (Fig. 4j,m ma fa'amatalaga fa'alautele, Ata 10h,k). E tusa ai ma suʻesuʻega muamua 8,10, o se vaega o le t-hCO sela na faʻaalia ai le faʻateleina o le gaioiga i le tali atu i le faʻafefe o le whisker, lea e leʻi matauina pe a faʻatusatusa faʻamaumauga ma faʻamaufaʻailoga taimi (Fig 4k-q ma faʻalauteleina faʻamatalaga, Ata 10h-q). O le mea moni, e uiga i le 54% o le opto-labeled unite na faʻaalia ai le faʻateleina o le faʻatupuina o le faʻaosoina ina ua maeʻa le faʻaosofia o le whisker, o loʻo maualuga ile 650 ms (Fig. 4r). Ile tu'ufa'atasia, o nei fa'amaumauga o lo'o fautua mai ai e maua e le t-hCO mea fa'aoga talafeagai ma e mafai ona fa'agaoioia e ala i le si'osi'omaga.
Ona matou suʻesuʻeina lea pe mafai e le t-hCO ona faʻagaoioia taʻavale i isumu e pulea ai amioga. Na matou suʻesuʻeina muamua pe faʻapipiʻi atu axons o t-hCO neurons i totonu o le siʻosiʻomaga o le iole. Na matou a'afia le hCO i le lentivirus e fa'aogaina le hChR2 fa'afefiloi i le EYFP (hChR2-EYFP). Ina ua maeʻa aso 110, na matou matauina le faʻaaliga o le EYFP i totonu o le ipsilateral cortical regions, e aofia ai le suʻega suʻega, afi, ma somatosensory cortices, faʻapea foʻi ma vaega o le subcortical, e aofia ai le striatum, hippocampus, ma thalamus (Fig 5a). Ina ia iloilo pe mafai e nei suʻesuʻega faʻapitoa ona faʻaalia tali synaptic i sela iole, matou te faʻaogaina le t-hCO sela o loʻo faʻaalia le hChR2-EYFP e ala i le puʻeina o sela o le cerebral cortex rat i vaega o le faiʻai maʻai. Fa'agaoioia o t-hCO axons ma moli lanumoana fa'aosoina pupuu pupuu EPSCs i rat pyramidal cortex neurons, lea na poloka e NBQX (Fig. 5b-g). E le gata i lea, o nei tali e mafai ona poloka e le tetrodotoxin (TTX) ma toe faʻaleleia e le 4-aminopyridine (4-AP), e faʻapea na mafua mai i fesoʻotaʻiga monosynaptic (Fig 5e).
a, Ata fa'ata'ita'i ole su'ega axon (agavale). t-hCO EYFP fa'aaliga (taumatau). Fua fua, 100 µm. A1, su'ega su'ega, ACC, pito i luma cingulate, o. striatum, dorsal striatum, HPC, hippocampus; Diaphragm, lateral septum, mPFC, medial prefrontal cortex, piri, piriform cortex, v. striatum, ventral striatum, VPM, ventropostomedial nucleus o le thalamus, VTA, ventral tegmental region. O sikuea mumu e fai ma sui o vaega o le faiʻai na ave ai ata. b, Ata fa'ata'ita'i o le su'ega fa'aosofia. c, d, Faʻataʻitaʻiga o le tali o le ata lanumoana faʻaosoina ata (pito i luga) ma le voltage (lalo) i totonu o le tagata (c) EYFP + t-hCO poʻo le iole (d) EYFP- sela. e, f, Fa'ailoga o lo'o i ai nei o iole neu pe a uma le lanu moana fa'aosofia o t-hCO axons ma TTX ma 4-AR (lanu meamata), TTX (grey) po'o le aCSF (uliuli) (e), fa'atasi ma (violet) pe leai (uliuli) ) ) NBQX (e). g, le tumau o tali fa'aosoina e le moli lanumoana i sela iole (n = 16 sela); o fa'alava fa'alava o lo'o fa'ailoa mai ai le averesi o le leo (7.13 ms) (agavale). Amplitude o EPSCs fa'amalama fa'amalama fa'amaumau fa'atasi ma le leai o se NBQX (n = 7 sela; ***P <0.0001) (ogatotonu). Amplitude o EPSCs fa'amalama fa'amalama fa'amaumau fa'atasi ma le leai o se NBQX (n = 7 sela; ***P <0.0001) (ogatotonu). Амплитуда вызванных светом EPSC, зарегистрированных с и без NBQX (n = 7 клеток; ***P <0,0001) (i центре). Amplitude o EPSCs fa'aoso malamalama fa'amaumau fa'atasi ma le leai o se NBQX (n = 7 sela; ***P <0.0001) (ogatotonu).使用或不使用NBQX 记录的光诱发EPSC 的振幅（n = 7 个细胞；***P < 0.0001）（中）.使用或不使用NBQX 记录的光诱发EPSC 的振幅（n = 7 个细胞；***P < 0.0001）（中）. Амплитуда вызванных светом EPSC, зарегистрированных с и без NBQX (n = 7 клеток; ***P <0,0001) (i центре). Amplitude o EPSCs fa'aoso malamalama fa'amaumau fa'atasi ma le leai o se NBQX (n = 7 sela; ***P <0.0001) (ogatotonu).Pasene o sela iole o lo'o fa'aalia EPSC e tali atu ile moli lanumoana (taumatau). h, Ata fa'ata'atia o se galuega tau amio. d0, aso 0. i. Fa'atinoga o manu fa'ata'ita'i ile aso 1 (agavale) po'o le aso 15 (taumatau) o toleniga. Ole numera ole numera o licks na faia ile aso 1 (agavale) poʻo le aso 15 (taumatau ogatotonu) (n = 150 faʻataʻitaʻiga moli lanumoana, n = 150 faʻataʻitaʻiga mumu mumu; *** P <0.0001). Ole numera ole numera o licks na faia ile aso 1 (agavale) poʻo le aso 15 (taumatau ogatotonu) (n = 150 faʻataʻitaʻiga moli lanumoana, n = 150 faʻataʻitaʻiga mumu mumu; *** P <0.0001). Среднее количество облизываний, выполненных i le aso 1 (слева) po o le aso 15 (i le центре справа) (n = 150 испытаний с =ситоний с = ситоним испытаний с красным светом; ***P <0,0001). Ole aofa'i ole laiga na faia ile aso 1 (agavale) po'o le aso 15 (ogatotonu taumatau) (n = 150 fa'ata'ita'iga moli lanumoana, n = 150 su'ega moli mumu; ***P <0.0001).第1 天（左）或第15 天（右中）执行的平均舔次数（n = 150 次蓝光试验，n = 150次红光试验；***P < 0.0001）.第1 天（左）或第15 天（右中）执行的平均舔次数（n = 150 次蓝光试验，n = 150次红光试验；***P < 0.001 Среднее количество облизываний, выполненных i le aso 1 (слева) po o le aso 15 (i le центре справа) (n = 150 испытаний с =ситоний с = ситоним испытаний с красным светом; ***P <0,0001). Ole aofa'i ole laiga na faia ile aso 1 (agavale) po'o le aso 15 (ogatotonu taumatau) (n = 150 fa'ata'ita'iga moli lanumoana, n = 150 su'ega moli mumu; ***P <0.0001).Liki fa'aopoopo mo su'ega moli mumu ma le lanumoana ile aso 1 (ogatotonu agavale) po'o le aso 15 (taumatau). NS, e le taua. j, k, Uiga amio a manu uma ua totoina i le t-hCO faʻaalia le hChR2-EYFP (j) poʻo le pulea o le fluorophore (k) i le aso 1 poʻo le 15 (hChR2-EYFP: n = 9 rats, ** P = 0.0049; pulea: n = 9, P = 0.1497). l, Evolution of preference score (n = 9 hChR2, n = 9 pule; ** P <0.001, *** P <0.0001). l, Evolution of preference score (n = 9 hChR2, n = 9 pule; ** P <0.001, *** P <0.0001). l, Эволюция показателя предпочтения (n = 9 hChR2, n = 9 контрольных; **P <0,001, ***P <0,0001). l, Evolution of preserv score (n = 9 hChR2, n = 9 pule; ** P <0.001, *** P <0.0001). l，偏好评分的演变（n = 9 hChR2，n = 9 对照；**P <0.001，***P <0.0001）. l，偏好评分的演变（n = 9 hChR2，n = 9 对照；**P <0.001，***P <0.0001）. l, Эволюция показателей предпочтения (n = 9 hChR2, n = 9 контролей; **P <0,001, ***P <0,0001). l, Faʻaleleia o togi e fiafia i ai (n = 9 hChR2, n = 9 pule; ** P <0.001, *** P <0.0001).m, faʻamatalaga FOS i le tali atu i le faʻamalosia o le optogenetic o t-hCO i le S1. O ata o faʻamatalaga FOS (agavale), ma faʻatusatusaga (n = 3 i le vaega; * P <0.05, ** P <0.01 ma *** P <0.001) (taumatau) o loʻo faʻaalia. O ata o faʻamatalaga FOS (agavale), ma faʻatusatusaga (n = 3 i le vaega; * P <0.05, ** P <0.01 ma *** P <0.001) (taumatau) o loʻo faʻaalia. Показаны изображения экспрессии FOS (слева) ma количественного определения (n = 3 на группу; * P <0,05, ** P <0,01 и *** P <0,01 и *** P <0,01 и *** ). O ata o le faʻaaliga FOS (agavale) ma le faʻatusatusaga (n = 3 i le vaega; * P<0.05, ** P<0.01, ma *** P<0.001) o loʻo faʻaalia (taumatau).显示了FOS 表达（左）和量化（每组n = 3；*P < 0.05、**P < 0.01 和***P < 0.001））的叾）显示了FOS 表达（左）和量化（每组n = 3；*P < 0.05、**P < 0.01 和***P < 0.001））的叾） Показаны изображения экспрессии FOS (слева) ma количественного определения (n = 3 на группу; * P <0,05, ** P <0,01 и *** P <0,01 и *** P <0,01 и *** ). O ata o le faʻaaliga FOS (agavale) ma le faʻatusatusaga (n = 3 i le vaega; * P<0.05, ** P<0.01, ma *** P<0.001) o loʻo faʻaalia (taumatau).Fua fua, 100 µm. O faʻamatalaga o loʻo faʻaalia o le uiga ± masani sese o le BLA, basolateral tonsil, MDT, dorsomedial thalamic nucleus, PAG, periaqueductal grey.
Mulimuli ane, na matou fesili pe mafai e le t-hCO ona faʻaogaina amioga a isumu. Ina ia faʻataʻitaʻiina lenei mea, na matou faʻapipiʻiina le hChR2-EYFP-faʻaalia le hCO i le S1, ma le 90 aso mulimuli ane, matou faʻapipiʻi filo opitika i le t-hCO mo le tuʻuina atu o le malamalama. Ona matou aʻoaʻoina lea o isumu i se faʻataʻitaʻiga o le operant conditioning paradigm (Fig. 5h). Na matou tuʻuina manu i totonu o se potu suʻega amio ma faʻaoga faʻafuaseʻi le 5 lua lanumoana (473 nm) ma le mumu (635 nm) faʻamalosi leisa. Na maua e manu se taui vai pe a latou etoeto i le taimi e faaosofia ai le moli lanumoana ae leʻi etoeto i le taimi e faʻaosofia ai le moli mumu. I le aso muamua o aʻoaʻoga, e leai se eseesega o manu i le mitiina pe a faʻaosofia i le lanumoana poʻo le mumu mumu. Ae ui i lea, i le aso 15, o manu na faʻapipiʻiina i le hCO faʻaalia le hChR2-EYFP na faʻaalia ai le sili atu le malosi o le licking pe a faʻaosofia i le moli lanumoana faʻatusatusa i le moli mumu. O nei suiga i le mitiina o amioga e leʻi matauina i le pulea o manu na totoina ma le hCO o loʻo faʻaalia ai le faʻaogaina o le fluorophore (fuafuaga manuia aʻoaʻoga: hChR2 89%, EYFP 0%, Ata 5i-1 ma Vitio Faaopoopo 2). O nei faʻamatalaga e faʻaalia ai e mafai e sela t-hCO ona faʻagaoioia ni rat neurons e faʻaosofia ai amioga saili taui. Ina ia su'esu'e po'o fea o rat t-hCO neural circuits e ono a'afia i nei suiga o amioga, matou te fa'agaoioia le t-hCO i manu fa'aa'oa'oina ma fa'ato'a seleseleina 90 minute mulimuli ane. O le Immunohistochemistry na faʻaalia ai le faʻaalia o le porotini FOS faʻalagolago i le tele o faiʻai e aʻafia i amioga faʻaosofia, e aofia ai le medial prefrontal cortex, medial thalamus, ma le periaqueductal gray matter, lea na faʻaalia i totonu o manu e le faʻamalosia poʻo manu. araisa. 5m). Ile tu'ufa'atasia, o nei fa'amaumauga o lo'o fautua mai ai e mafai e le t-hCO ona fa'aogaina le gaioiga o le iole e fa'aoso ai amioga.
Neural organoids o loʻo faʻatusalia se faiga faʻamoemoeina mo le suʻesuʻeina o le atinaʻeina o tagata ma faʻamaʻi in vitro, ae faʻatapulaʻaina i le leai o se fesoʻotaʻiga i le va o taʻaloga o loʻo i ai i vivo. Ua matou atia'e se fa'ailoga fou lea na matou fa'atūina ai le hCO i le S1 o iole fa'ato'a fa'ato'a fa'agata fa'amasani e su'esu'e ai le atina'eina o sela o le tagata ma galuega i vivo. Ua matou faʻaalia o le t-hCO e faʻatupuina ituaiga sela matutua e le o matauina i vitro28 ma o le t-hCO o loʻo faʻapipiʻiina ma faʻaogaina i totonu o le faiʻai rodent. O le tuʻufaʻatasia o le t-hCO i totonu o rodent neural circuits na mafai ai ona matou faʻatuina se fesoʻotaʻiga i le va o gaioiga feaveaʻi a le tagata ma suʻesuʻeina amioga a manu, e faʻaalia ai e mafai e le t-hCO neurons ona faʻaogaina le gaioiga o le rat neuronal e faʻaulu ai tali amio.
O le tulaga o loʻo matou faʻamatalaina e tele mea lelei nai lo suʻesuʻega muamua i le suʻiina o sela o le tagata i faiʻai rodent. Muamua, matou te faʻapipiʻiina le hCO i totonu o le atinaʻe o le faʻatupuina o isumu pe a maeʻa, lea e mafai ona faʻafaigofieina le faʻaogaina o le anatomical ma le gaioiga. Lona lua, o le t-hCO MRI mataʻituina na mafai ai ona matou suʻesuʻeina le tulaga faʻapipiʻi ma le tuputupu aʻe o manu ola, faʻatagaina i matou e faʻatautaia suʻesuʻega umi-manu ma faʻamautu le faʻamaoni o le tele o laina telefoni hiPS. Mulimuli ane, na matou faʻapipiʻiina organoids, nai lo le tuʻufaʻatasia o le tuʻufuaina o sela e tasi, e faʻaitiitia ai le faʻaleagaina o sela o le tagata ma mafai ona faʻalauteleina le tuʻufaʻatasia ma le faʻatupuina o neu cortex tagata i faiʻai iole.
Matou te faʻailoa e ui lava i le alualu i luma i lenei tulaga, faʻalavelave faʻaletino, faʻafanua, ma faʻalavelave faʻasolosolo e taofia ai le faʻavaeina o le neural circuits a le tagata ma le faʻamaoni maualuga, e tusa lava pe a maeʻa le totoina i le amataga o le atinaʻe. Mo se faʻataʻitaʻiga, e leʻo manino pe o le gaioiga faʻafuaseʻi o loʻo matauina i le t-hCO o loʻo faʻatusalia ai se faʻataʻitaʻiga faʻapitoa e tutusa ma le gaioioiga o loʻo matauina i le taimi o le atinaʻeina o le cortical, pe mafua ona o le leai o ni ituaiga cell suppressive o loʻo iai i le t-hCO. E faapena foi, e le o manino pe o le a le tele o le leai o se lamination i le t-hCO e aafia ai le fesoʻotaʻiga filifili30. O galuega i le lumanaʻi o le a taulaʻi atu i le tuʻufaʻatasia o isi ituaiga sela e pei o microglia tagata, sela endothelial tagata, ma fesuiaiga eseese o GABAergic interneurons e pei ona faʻaalia i le faʻaogaina o le 6 in vitro, faʻapea foʻi ma le malamalama pe faʻafefea ona tupu le tuʻufaʻatasia ma le gaioiga i suiga t-hCO. transcriptional, synaptic ma amio i sela maua mai gasegase.
I le aotelega, o lenei in vivo platform o loʻo faʻatusalia ai se punaoa malosi e mafai ona faʻapipiʻi i vitro le atinaʻeina o faiʻai o le tagata ma suʻesuʻega faʻamaʻi. Matou te faʻamoemoe o lenei faʻavae o le a faʻatagaina ai i matou e suʻesuʻe ni faʻasologa fou o le strand-level phenotypes i se isi itu e le mafai ona maua mai i le gasegase ma suʻesuʻe ni togafiti fou.
Na matou gaosia le hCO2.5 mai sela HiPS e pei ona faʻamatalaina muamua. Ina ia amataina le gaosiga o le hCO mai sela o le hiPS o loʻo faʻatupuina i luga o fata fafaga, na aveesea ai vaega o sela o le hiPS mai ipu faʻaleaganuʻu e faʻaaoga ai le dispase (0.35 mg / mL) ma faʻafeiloaʻi i tu ma aga palasitika faʻapipiʻi ultra-maualalo o loʻo i ai ipu ma le faʻaogaina o le aganuʻu o le hiPS. (Corning) faaopoopo i le lua SMAD inhibitors dorsomorphine (5 μM; P5499, Sigma-Aldrich) ma SB-431542 (10 μM; 1614, Tocris) ma ROCK inhibitor Y-27632 (10 μM; S1049, Selleckchem). I le 5 aso muamua, o le hiPS cell medium na suia i aso uma ma dorsomorphine ma SB-431542 na faʻaopoopoina. I le aso lona ono o le faʻamalologa, na faʻafeiloaʻi ai neural spheroids i le neural medium o loʻo i ai le neurobasal-A (10888, Life Technologies), B-27 faʻaopoopoga e aunoa ma le vaitamini A (12587, Life Technologies), GlutaMax (1: 100, Life Technologies), penicillin ma streptomycin (1: 100, Life Technologies) ma faʻaopoopoina i le e (Eml − faʻatekonolosi); R & D Systems) ma le fibroblast growth factor 2 (FGF2; 20 ng ml-1; R & D Systems) seia oʻo i le aso 24. Mai le aso 25 i le aso 42, na faʻaopoopoina le ala ile faiʻai e maua mai ai le neurotrophic factor (BDNF; 20 ng ml-1, Peprotech) ma le neurotrophin 3 (NT3; 20 ng ml) suiga i aso uma. I le aso lona ono o le faʻamalologa, na faʻafeiloaʻi ai neural spheroids i le neural medium o loʻo i ai le neurobasal-A (10888, Life Technologies), B-27 faʻaopoopoga e aunoa ma le vaitamini A (12587, Life Technologies), GlutaMax (1: 100, Life Technologies), penicillin ma streptomycin (1: 100, Life Technologies) ma faʻaopoopoina i le e (Eml − faʻatekonolosi); R & D Systems) ma le fibroblast growth factor 2 (FGF2; 20 ng ml-1; R & D Systems) seia oʻo i le aso 24. Mai le aso 25 i le aso 42, na faʻaopoopoina le ala ile faiʻai e maua mai ai le neurotrophic factor (BDNF; 20 ng ml-1, Peprotech) ma le neurotrophin 3 (NT3; 20 ng ml) suiga i aso uma.I le aso lona ono o le faʻamalologa, na faʻafeiloaʻi ai neural spheroids i se neural medium e iai le Neurobasal-A (10888, Life Technologies), B-27 faʻaopoopoga e aunoa ma le vaitamini A (12587, Life Technologies), GlutaMax (1: 100, Life Technologies), penicillin.и стрептомицин (1:100, Life Technologies) ma le дополнены эпидермальным фактором роста (EGF; 20 нг/мл; R&D Systems) ma фактором роста фиброб; R&D Systems) i le 24-gо дня. ma le streptomycin (1:100, Life Technologies) ma faʻaopoopoina i le epidermal growth factor (EGF; 20 ng/ml; R&D Systems) ma le fibroblast growth factor 2 (FGF2; 20 ng/ml; R&D Systems) seia oo i le aso 24.Mai aso 25 i le 42, o le faiʻai e maua mai le neurotrophic factor (BDNF; 20 ng ml-1, Peprotech) ma le neurotrophin 3 (NT3; 20 ng ml-1, Peprotech) na faʻaopoopoina i le ala, suia le ala i isi aso uma.在悬浮的第6 天，将神经球体转移到含有neurobosal-A（10888，Life Technologies）、不含维生素A 的B-27补充剂（12587，Life Technologies）、GlutaMax（1:100，Life Technologies）、青霉素的神经培养基中和链霉素（1:Life Tekinolosi Systems）直至第24 天。在 悬浮 的 第 第 6 天 将 神经 球体 转移 含有 含有 neurobasal-a （10888 ， Life Technologies） 不 a生索2补充剂 （12587 ， Life Technologies） Glutamax （1: 100 ， Life TechNOGIS青霉素 的 神经 培养 基 中 链霉素 （1（素 （1（素 （1（素 （1（素生长 因子 （（（20 ng ml-1 ； r & d Systems） 成 纤维 细胞 生长 2 （fgf2 ； 20 ng ml- 1 ；R&D System；笛华Ｓ。 6-й день суспензии нейросферы были переведены на добавку, содержащую нейробазал-А (10888, Life Technologies), добизавку А (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies), пенициллин- нейтрализованный стрептомицин (1:100, Life Technologies) с добавлением эпидермальакото (GF2; нг мл-1; R&D Systems) и фактора роста фибробластов 2 (FGF2; 20 нг мл-1) 1; I le aso 6, na suia ai le taofiga o le neurosphere i se faʻaopoopoga o loʻo i ai le neurobasal-A (10888, Life Technologies), B-27 faʻaopoopoga e aunoa ma le vaitamini A (12587, Life Technologies), GlutaMax (1: 100, Life Technologies), penicillin-neutralized streptomycin (1: 100, Life Technologies) faʻaopoopoina i le epidermal 1; R02; fibroblast tuputupu aʻe vaega 2 (FGF2; 20 ng ml-1) 1; R&D Systems) i le 24-gо дня. R&D Systems) seia oo i le aso 24.Mai aso 25 i le 42, o le faiʻai e maua mai le neurotrophic factor (BDNF; 20 ng ml-1, Peprotech) ma le neurotrophic factor 3 (NT3; 20 ng ml-1, Peprotech) na faʻaopoopoina i le aganuu i aso uma. Suiga feololo tasi.Amata mai le aso 43, na tausia le hCO i le neurobasal-A e leʻi faʻaopoopoina (NM; 1088022, Thermo Fisher) faʻatasi ai ma suiga masani ile 4-6 aso. Ina ia maua le hCO mai sela o le hiPS o loʻo faʻatupuina i lalo o tulaga e leai ni meaʻai, na faʻapipiʻiina siama o le hiPS i Accutase (AT-104, Innovate Cell Technologies) i le 37 ° C mo le 7 minute, faʻamavaeina i sela e tasi, ma faʻapipiʻi i luga ole AggreWell 800 plates (34815, STEMCELL Technologies) i le mamafa o le 3 × 106 faʻapipiʻi faʻapipiʻi i le 3 × 106 sela faʻaopoopo i le ROCK. Y-27632 (10 μM; S1049, Selleckchem). Ina ua maeʻa le 24 itula, o le aufaasālalau i totonu o vaieli na faʻapipiʻiina i luga ma lalo i luga o le aufaasālalau o loʻo i ai le Essential 6 media (A1516401, Life Technologies) faʻaopoopo i le dorsomorphine (2.5 μM; P5499, Sigma-Aldrich) ma le SB-431542 (10 μM; 1614). , Tocrida). Mai aso 2 i le 6, Essential 6 medium na suia i aso uma i le dorsomorphine ma faaopoopo SB-431542. Mai le aso lona ono, o le faʻamalologa o le neurosphere na tuʻuina atu i le neurobasal medium ma tausia e pei ona faʻamatalaina i luga.
O fa'ata'ita'iga uma o manu sa faia e tusa ai ma ta'iala mo le tausiga o manu ua fa'amaonia e le Stanford University Laboratory Animal Care Administrative Committee (APLAC). Na fa'atauina iole euthymic RNU (rnu/+) ma'itaga (Charles River Laboratories) pe fa'afale. Sa tausia manu i le 12-itula malamalama-pogisa taamilosaga ma meaai ma vai ad libitum. O tama'i isumu e ta'i tolu i le fitu aso le matutua (FOXN1–/–) na iloa i le tuputupu a'e o fusuaga e le'i matutua a'o le'i tafiesea. O maile (tane ma le fafine) sa fa'ama'i ile 2-3% isoflurane ma tu'u i luga o se fa'avaa fa'ata'ita'i. O le faʻauluina o le ulupulu ma le lautele e tusa ma le 2-3 mm i luga aʻe o le S1 na faia aʻo faʻamautinoa le faʻamaoni o le dura mater. Ona fa'aaoga lea o le nila 30-G (pe tusa ma le 0.3 mm) i fafo o le craniotomy e tu'ia ai le dura. Ona fa'apipi'i lea o le HCO i se parafilm manifinifi 3×3 cm ma aveese le tele o mea. Fa'aaogā le tui Hamilton e fa'apipi'i i le nila 23 G, 45°, toso malie le hCO i le pito pito sili ona mamao o le nila. Ona faʻapipiʻi lea o le tui i luga o le pamu tui e fesoʻotaʻi ma le masini stereotaxic. Ona tuʻu lea o le pito o le nila i luga o le 0.3 mm lautele puncture pu na faia muamua i le dura (z = 0 mm) ma vaapiapi le tui 1-2 mm (z = tusa -1.5 mm) seia oʻo i le nila i le va o le dura mater A. faia se faʻamaufaʻailoga mafiafia. Ona sii lea o le tui i le ogatotonu o le cortical surface i le z = -0.5 mm ma tui le hCO i le fua o le 1-2 µl i le minute. A maeʻa le tui o le hCO, e toe toso le nila i le fua o le 0.2-0.5 mm i le minute, faʻapipiʻi le paʻu, ma tuʻu loa le maile i luga o se pusa mafanafana mafanafana seia maeʻa ona toe faʻaleleia. O nisi o manu na fa'atūina fa'alua.
O faʻataʻitaʻiga uma o manu na faia e tusa ai ma taʻiala o le tausiga o manu a le Iunivesite o Stanford APLAC. Iole (sili atu i le 60 aso talu ona toe fa'atupuina) na fa'aosoina ile 5% isoflurane fa'ama'i ma fa'ama'i ile 1-3% isoflurane ile taimi ole ata. Mo le va'aiga, o le 7 Tesla fa'amalosi puipui fa'alava fa'ata'amilosaga va'ava'ai Bruker (Bruker Corp.) fa'atasi ai ma le Kamupani Fa'ava-o-Malo (IECO) fa'asolosolo fa'asolo, fa'apipi'i gradient fa'apipi'i ma le lautele totonu ole 120 mm (600 mT/m, 1000 T/m/s) sa fa'aaogaina e fa'aaoga ai le AVANCE. III, valu-channel multi-coil RF ma le tele-core capabilities, ma le Paravision 6.0.1 faʻatasi faʻatasi. Na fa'atinoina le fa'amauina i le fa'aaogaina o le vili fa'avili RF fa'ato'a fa'amuta fa'atasi ma le lautele o totonu o le 86 mm ma le fa'auila RF fa'amalo e fa mo le mauaina. Axial 2D Turbo-RARE (taimi toe fai = 2500 ms, taimi faʻalogo = 33 ms, 2 averesi) faʻatasi ma 16 fasi puʻe, fasi mafiafia 0.6-0.8 mm, e aofia ai 256 × 256 faʻataʻitaʻiga. O faʻailoga na maua mai i le faʻaaogaina o le quadrature transceiver volumetric RF coil ma le lautele totonu ole 2 cm (Rapid MR International, LLC). Fa'ai'u, fa'aaoga galuega fa'atatau i luga ole Imaris (BitPlane) mo le fa'aliliuga 3D ma le su'esu'eina o voluma. O se faʻasologa manuia na faʻamatalaina o se tasi lea na fausia ai vaega o le T2-weighted MRI faʻailoga i totonu o le hemisphere toto. O le teenaina o le faʻaogaina o loʻo faʻamatalaina o se sulu e leʻi maua ai vaega o faʻaauau T2-mamafa MRI faailoilo i totonu o le lalolagi toto. Subcortical t-hCO na le aofia mai suʻesuʻega mulimuli ane.
Ina ia faʻaalia lelei GCaMP6s i le hCO mo faʻataʻitaʻiga calcium lua-photon, o sela hiPS na aʻafia i le pLV [Exp] -EF1a :: GcaMP6s-WPRE-Puro sosoo ai ma le filifilia o vailaʻau faʻamaʻi. I se faapuupuuga, o sela na vavae ese ma EDTA ma taofia i le 1 ml o le Essential 8 medium i le maualuga o le tusa ma le 300,000 sela i le i ai o le polybrene (5 μg / ml) ma le 15 μl o le siama. Ona tuu lea o sela i le taofiga mo le 60 minute ma fatu i le mamafa e 50,000 sela i le vaieli. A maeʻa le faʻafeiloaʻiga, na togafitia sela i le 5-10 μg ml-1 puromycin mo 5-10 aso poʻo seʻia oʻo ina faʻaalia ni kolone mautu. O fa'ama'i pipisi o le hCO na fa'atinoina e pei ona fa'amatalaina muamua5 ma nisi o suiga. Fa'apuupuu, fa'afeiloa'i le aso 30-45 hCO i totonu o le 1.5 ml Eppendorf microcentrifuge paipa o lo'o i ai le 100 μl o le nerve medium. Pe tusa ma le 90 µl o le ala e aveese ai, 3-6 µl o le titer lentivirus maualuga (mai le 0.5 x 108 i le 1.2 x 109) fa'aopoopo i le paipa, ma le hCO e tu'u i le incubator mo le 30 minute. Ona faaopoopo lea o le 90-100 µl o le medium i faagaau taitasi ma toe faafoi atu paipa i totonu o le incubator i le po. O le aso e soso'o ai, fa'afeiloa'i le hCO i le neura fou i ni mea fa'apipi'i maualalo. A maeʻa le 7 aso, ona tuʻuina atu lea o le hCO i ipu tioata pito i lalo e 24-well mo le vaʻaia ma le iloiloga o le lelei o faʻamaʻi. pLV[Exp]-SYN1::EYFP-WPRE ma pLV[Exp]-SYN1::hChR2-EYFP-WPRE na gaosia e VectorBuilder. Lentivirus e faʻaaogaina i le tele o faʻataʻitaʻiga ona o loʻo tuʻufaʻatasia i totonu o le genome talimalo, e mafai ai ona faʻaalia le kenera a le tusitala i laina telefoni feaveaʻi. Mo le tulitatao rabies, aso 30-45 hCO sa pipii faatasi ma rabies-ΔG-eGFP ma AAV-DJ-EF1a-CVS-G-WPRE-pGHpA (plasmid #67528, Addgene), fufulu mama mo 3 aso, ma totoina i isumu i le S1 ma tausia i vivo aso.
Mo le immunocytochemistry, sa fa'ama'i fa'ama'i manu ma fa'aulu fa'atasi i le PBS soso'o ma le 4% paraformaldehyde (PFA i le PBS; Electron Microscopy Sciences). O faiʻai na faʻamauina i le 4% PFA mo le 2 itula poʻo le po i le 4 ° C, cryopreserved i le 30% sucrose i le PBS mo 48-72 itula, ma faʻapipiʻi i le 1: 1, 30% sucrose: OCT (Tissue-Tek OCT Compound 4583 , Sakura Finetek) ma faʻaogaina le coronal section 30sstat. Mo le immunohistochemistry o vaega mafiafia, o manu na faʻafefeteina i le PBS, ma o le faiʻai na vavaeina ma faʻavasegaina i le 300-400 μm e faʻaaoga ai le vibratome (Leica) ma faʻamauina vaega i le 4% PFA mo le 30 minute. Ona fufuluina lea o cryosections poʻo vaega mafiafia i le PBS, poloka mo le 1 itula i le vevela o le potu (10% masani asini serum (NDS) ma le 0.3% Triton X-100 faʻafefe i le PBS) ma poloka ile vaifofo poloka ile 4°C. – Incubation Cryosections sa fa'a'ofuina i le po ma vaega mafiafia sa fa'a'a'ofuina mo le 5 aso. O faʻamaʻi muamua na faʻaaogaina o: anti-NeuN ( isumu, 1: 500; ab104224, abcam) anti-CTIP2 (iole, 1:300; ab18465, abcam), anti-GFAP (lapiti, 1: 1,000; Z0334, Dako), anti-GFP (1300 Genes), GTX 1000; anti-HNA (isu, 1:200; ab191181, abcam), anti-NeuN (lapiti, 1:500; ABN78, Millipore), anti-PDGFRA (lapiti, 1:200; sc-338, Santa Cruz), anti-PPP1R17 (lapiti, HPA0, Atlasbo1; HPA0, Atlasbo1; 2478; HPA0, Atlasbo1; anti-RECA-1 ( isumu, 1:50; ab9774, abcam), anti-SCG2 (lapiti, 1:100; 20357-1-AP, Proteintech), anti-SOX9 (oti, 1:500; AF3075, R & D Systems), Netrin G1AFa (oti, 106; 106), R&D Systems, Netrin G106; anti-STEM121 ( isumu, 1:200; Y40410, Takara Bio), anti-SATB2 ( isumu, 1:50; ab51502, abcam), anti-GAD65/67 (lapiti, 1:400; ABN904, Millipore) ma le anti-IBA1 (oti, a1:b5). O faʻamaʻi muamua na faʻaaogaina o: anti-NeuN ( isumu, 1: 500; ab104224, abcam) anti-CTIP2 (rat, 1: 300; ab18465, abcam), anti-GFAP (lapiti, 1: 1,000; Z0334, Dako), anti -GFP: 1:100 Gene, GTX 1000; anti-HNA (isu, 1:200; ab191181, abcam), anti-NeuN (lapiti, 1:500; ABN78, Millipore), anti-PDGFRA (lapiti, 1:200; sc-338, Santa Cruz), anti-PPP1R17 (lapiti, HPA0, Atlasbo1; HPA0, Atlasbo1; 2478; HPA0, Atlasbo1; anti-RECA-1 (isu, 1:50; ab9774, abcam), anti-SCG2 (lapiti , 1:100; 20357-1-AP, Proteintech), anti-SOX9 (oti, 1:500; AF3075, R & D Systems), Netrin G1a (oti, 6), & 1A: R&D Systems, R&D, R&D 10, 6; anti-STEM121 ( isumu, 1:200; Y40410, Takara Bio), anti-SATB2 ( isumu, 1:50; ab51502, abcam), anti-GAD65/67 (lapiti, 1:400; ABN904, Millipore) ma le anti-IBA1 :107; a107; a107. Использовались следующие первичные антитела: анти-NeuN (мышиные, 1:500; ab104224, abcam), анти-CTIP2 (крысиные, 5:1bcam), 5:304; анти-GFAP (кроличьи, 1:1000; Z0334, Dako), анти- -GFP (курица, 1:1000; GTX13970, GeneTex), анти-HNA (мышь, 1:200; ab191181, ab19181, ab19181, нкроклик), анти-HNA 1:500; ABN78, Millipore), анти-PDGFRA (кролик, 1:200; sc-338, Санта-Круз), анти-PPP1R17 (кролик, 1:200; HPA047819, Atlas1 Antibodies) ab9774, abcam), анти-SCG2 (кролик , 1:100; 20357-1-AP, Proteintech), анти-SOX9 (козий, 1:500; AF3075, R&D Systems), нетрин G1a (козий, AF10), нетрин G1a (козий, 1:500; AF3075, R&D Systems), нетрин G1a (коз10, 1:AF10), R&D анти-STEM121 (мышиный , 1:200; Y40410, Takara Bio), анти-SATB2 (мышь, 1:50; ab51502, abcam), анти-GAD65/67 (кролик, 1:4040, анти-SATB2 (мышь, 1:50; ab51502, abcam), анти-GAD65/67 (кролик, 1:4040, и антин9тик) (koza, 1:100; аб5076, абкам). O faʻamaʻi muamua na faʻaaogaina o: anti-NeuN ( isumu, 1: 500; ab104224, abcam), anti-CTIP2 (rat, 1: 300; ab18465, abcam), anti-GFAP (lapiti, 1: 1000; Z0334, Dako), anti-GFP1000, GTX1000; anti-HNA (isuo, 1:200; ab191181, abcam), anti-NeuN (lapiti, 1:500; ABN78, Millipore), anti-PDGFRA ( lapiti, 1:200; sc-338, Santa Cruz), anti-PPP1R17 (lapiti, HPA, Atlas908; HPA, Atlas908; HPA, 24078; HPA, 24078; HPA, 24078; HPA, Atlas. anti-RECA-1 ( isumu, 1:50; ab9774, abcam), anti- SCG2 (lapiti, 1:100; 20357-1-AP, Proteintech), anti-SOX9 (oti, 1:500; AF3075, R & D Systems), netrin G1AFa: 106; R&D 10, R&D 100 (oti, 106) STEM121 (isu, 1:200; Y40410, Takara Bio), anti-SATB2 (iole, 1:50; ab51502, abcam), anti-GAD65/67 (lapiti, 1:400; ABN904, Millipore) ma le anti-IBA1 (oti, ab:107).使用的一抗是：抗NeuN（小鼠，1:500；ab104224，abcam）抗CTIP2（大鼠，1:3 00；ab18465，abcam），抗GFAP（兔，1:1,000；Z0334，Dako），抗-GF P（鸡，1:1,000；GTX13970，GeneTex），抗HNA（小鼠，1:200；ab1911 81，abcam），抗NeuN（兔，1:500；ABN78，Millipore），抗PDGFRA（兔， 1:200；sc-338，Santa Cruz），抗PPP1R17（兔，1:200；HPA047819，Atlas抗体），抗RECA-1（小鼠，1:50；ab9774，abcam），抗SCG2（兔） , 1:100；20357-1-AP，Proteintech），SOX9（山羊，1:500；AF3075，R&D Systems），Netrin G1a（山羊，1:100；AF1166，R&D Systems），抗STEM121（小鼠, 1:200;使用的一抗是：抗NeuN（小鼠，1:500；ab104224，abcam）抗CTIP2（大鼠，1 :300；ab18465，abcam），抗GFAP（兔，1:1,000；Z0334，Dako），抗-GFP（鸡，1:1,000；GTX13970，GeneTex），抗HNA（小鼠，1:200；ab191181，abcam），抗NeuN（兔，1:508；ABN re:7. 200；sc-338，Santa Cruz），抗PPP1R17（兔，1:200；HPA047819，Atlas 抗体），抗RECA-1（小鼠，1:50；ab9774，ab9774，ab9774， 100；20357-1-AP，Proteintech），抗SOX9（山羊，1:500；AF3075，R&D Systems），Netrin G1a（山羊，1:100；AF1166，R&D1: AF1166，R&D1:Y40410, Takara Bio), anti-SATB2 ( isumu, 1:50; ab51502, abcam), anti-GAD65/67 (lapiti, 1:400; ABN904, Millipore) ma le anti-IBA1 (oti, 1:100; ab5076, abcam).O faʻamaʻi muamua na faʻaaogaina o: anti-NeuN (mouse, 1:500; ab104224, abcam), anti-CTIP2 (rat, 1:300; ab18465, abcam), anti-GFAP (rabbit, 1:1000; Z0334, Dako) . , anti-GFP (moa, 1:1000; GTX13970, GeneTex), anti-HNA ( isumu, 1:200; ab191181, abcam), anti-NeuN (lapiti, 1:500; ABN78, Millipore), anti-PDGFRA (lapiti, 1:200), anti-PDGFRA (lapiti, 1:200R), 1:2308; (lapiti, 1:200; HPA047819, Atlas antibody), anti-RECA-1 ( isumu, 1:50; ab9774, abcam), anti- SCG2 (lapiti), 1:100;20357-1-AP, Proteintech), анти-SOX9 (коза, 1:500; AF3075, R&D Systems), Нетрин G1a (коза, 1:100; AF1166, R&D Systems), анти -STEM121 (мы2ь0, мы2ш121) анти-SATB2 (мышь, 1:50; ab51502, abcam), анти-GAD65/67 (кролик, 1:400; ABN904, Millipore) ma анти-IBA1 (коза, 1:100; аб5076, аб5076). 20357-1-AP, Proteintech), anti-SOX9 (oti, 1: 500; AF3075, R & D Systems), Netrin G1a (oti, 1: 100; AF1166, R & D Systems), anti-STEM121 (isu, 1: 200; Takara Bio, 500; Y404, 10, SAT; Y404; ab51502, abcam), anti-GAD65/67 (lapiti, 1:400; ABN904, Millipore), ma anti-IBA1 (oti, 1:100; ab5076, abkam).Ona fufuluina lea o vaega i le PBS ma faʻapipiʻi i le antibody lona lua mo le 1 itula i le vevela o le potu (vaega malulu) poʻo le po i le 4 ° C (vaega mafiafia). Alexa Fluor lona lua antibody (Life Technologies) fa'afefeteina 1:1000 i le poloka vaifofo na fa'aaogaina. Ina ua uma ona fufulu i le PBS, na vaʻaia le nuclei i se Hoechst 33258 (Life Technologies). Mulimuli ane, na tu'u fa'ase'e i luga o se microscope ma coverlips (Fisher Scientific) e fa'aaoga ai le Aquamount (Polysciences) ma su'esu'e i luga ole Keyence fluorescent microscope (BZ-X analyzer) po'o le Leica TCS SP8 confocal microscope (Las-X) ile ata. O ata na fa'agasolo i le fa'aogaina o le polokalame ImageJ (Fiji). Ina ia faʻatusatusa le aofaʻi o neu tagata i le t-hCO ma le rat cortex, 387.5 μm lautele ata faʻataʻifaʻatasi na puʻeina i le ogatotonu o le t-hCO, pe latalata i le pito o le rat cortex. Fa'amaufa'ailoga fa'amau na fa'amauina e ala i le su'esu'eina o suiga i le manino o le tino, HNA + nuclei, ma/po'o le iai o le autofluorescence. I ata taʻitasi, o le aofaʻi o le NeuN + ma le HNA + sela na vaevaeina i le aofaʻi o NeuN + sela i le eria lava e tasi. Ina ia mautinoa e naʻo sela e iai nuclei i le ata vaʻaia e faitaulia, naʻo sela o loʻo iai foi Hoechst + o loʻo aofia i le faʻatusatusaga. E lua ata na vavae ese e le itiiti ifo i le 1 mm na faʻatauina e faʻaitiitia ai le faʻasologa o fuainumera.
E tasi le vaiaso a'o lumana'i le aoina mai o fa'ata'ita'iga, tu'u manu fe'avea'i o le hCO (pe tusa ma le 8 masina o fa'avasegaga) i totonu o se potu pogisa e teuteu 'ava e fa'aitiitia ai lagona fa'aosofia. O le vavaeeseina o nuclei sa faia e pei ona faamatalaina muamua, faatasi ai ma nisi o suiga. I se faapuupuuga, na faʻaumatia le t-hCO ma le hCO i le faʻaaogaina o le lysis cell detergent-mechanical ma le 2 ml tioata tioata (D8938, Sigma-Aldrich / KIMBLE). Ona fa'amama ese lea o le nuclei i le fa'aaogaina o le 40 µm faamama ma fa'a'ese'ese i le 320 g mo le 10 minute i le 4 ° C a'o le'i faia le fa'alili o le sucrose density. I le maeʻa ai o le faʻasologa o le centrifugation (320 g mo le 20 min i le 4 ° C), o faʻataʻitaʻiga na toe faʻaleleia i le 0.04% BSA / PBS faʻatasi ai ma le faʻaopoopoga o le 0.2 iunite o le µl-1 RNase inhibitor (40 u μl-1, AM2682, Ambion) ma pasia i le 40 μm flow filter. O le nuclei vavae'ese na toe faʻaleleia i le PBS o loʻo i ai le 0.02% BSA ma faʻapipiʻiina i luga o le Chromium Single Cell 3' chip (faʻatatau le toe faʻaleleia o 8,000 sela i le laina). snRNA-seq faletusi na saunia ma le Chromium Single cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics). snRNA-seq faletusi na saunia ma le Chromium Single cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics). Библиотеки snRNA-seq были приготовлены с помощью Chromium Cell tasi 3′ GEM, Faletusi & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics). O faletusi snRNA-seq na saunia e faʻaaoga ai le Chromium Single cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics). snRNA-seq 文库是使用Chromium Selula Tasi 3′ GEM, Faletusi & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics) 制备的。 snRNA-seq 文库是使用Chromium Selula Tasi 3′ GEM, Faletusi & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics) 制备的。 Библиотеку snRNA-seq готовили с использованием Chromium Cell Single 3′ GEM, Faletusi & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics). O le faletusi snRNA-seq na saunia e faʻaaoga ai le Chromium Single Cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics).O faletusi mai faʻataʻitaʻiga eseese na tuʻufaʻatasia ma faʻasolosolo e le Admera Health i NovaSeq S4 (Illumina).
O le maualuga o le fa'aaliga o le kenera mo ta'iala faaniukilia ta'itasi sa fa'atatauina i le fa'aaogaina o le 10x Genomics CellRanger su'esu'ega pusa polokalame (version 6.1.2). Aemaise lava, o le faitau na fetaui ma se tuufaatasiga o tagata (GRCh38, Ensemble, version 98) ma rat (Rnor_6.0, Ensemble, version 100) reference genomes na fatuina ma le mkref command ma le faʻaogaina o le numera ma le -include-introns = TRUE poloaiga i quantitation e aofia ai faitauga faʻafanua i totonu o itulagi. Mo fa'ata'ita'iga t-hCO, na fa'ailoaina le nuclei o le tagata e fa'atatau i le mana'oga fa'asao e le itiiti ifo i le 95% o fa'afanua uma faitau e fetaui ma le genome o le tagata. O su'esu'ega uma na soso'o mai na fa'atino i luga o se fa'asologa o fa'asologa o fa'ailoga fa'a-filo mai le CellRanger e fa'aaoga ai le R package (version 4.1.2) Seurat (version 4.1.1)32.
Ina ia faʻamautinoa e naʻo le maualuga o le nuclei o loʻo aofia i le suʻesuʻega mulimuli ane, na faʻatinoina se faʻagasologa o le faʻavasegaina mo faʻataʻitaʻiga taʻitasi. Muamua, o le nuclei maualalo maualalo ma le itiiti ifo i le 1000 genes tulaga ese na maua ma sili atu i le 20% o le aofaʻi o mitochondria ua iloa ma aveese. Mulimuli ane, o le numera o le gene mataʻutia na faʻavasegaina e ala i le faʻaogaina o le faʻaogaina o le binomial regression e faʻaaoga ai le sctransform (vst.flavor = "v2″) galuega, lea na faʻaalia ai foi le 3000 sili ona fesuisuiai genes e faʻaaoga ai faʻamaufaʻailoga le faʻaogaina. asiasiga o nofoaga tulivae ma faʻaoga mo faʻataʻitaʻiga uma ma suʻesuʻega ensemble (o lona uiga o le DoubletFinder score i luga aʻe o le 95th percentile faʻataʻitaʻiga (n = 3) ma faʻataʻitaʻiga hCO (n = 3) na tuʻufaʻatasia e faʻaaoga ai le IntegrateData galuega faʻatasi ai ma faʻasologa o loʻo i luga Ona faia lea o se isi taamilosaga o le faʻavasegaina o faʻamaumauga tuʻufaʻatasia e pei ona faʻamatalaina i luga.
Ina ua uma ona aveese fatu maualalo maualalo, o le faʻamaumauga tuʻufaʻatasia sa tuʻufaʻatasia (faʻamatalaga = 0.5) ma faʻapipiʻi mo faamoemoega UMAP34 faʻaaliga. Fa'ailoga genes mo fuifui ta'itasi na fuafuaina e fa'aaoga ai le FindMarkers galuega fa'atasi ai ma fa'amaufa'ailoga le fa'atatauina mai fa'amatalaga fa'amatalaga fa'agenano masani. Matou te fa'ailoa ma fa'avasega vasega tele o sela e ala i le tu'ufa'atasia o fa'amaumauga fa'amaufa'ailoga fetal ma tagata matutua fa'atasi ai ma fa'amatalaga fa'ailoga fa'ailoga 19,20,21,35 ma fa'amatalaga. Aemaise lava, o faʻasalalauga faʻasalalau na faʻaalia i le faʻaaliga o le MKI67 ma le TOP2A. O fuifui tupuaga na faʻamatalaina i le leai o ni tusitusiga mitotic, maualuga faʻapipiʻi ma fuifui glial progenitor multipotent faʻamatalaina i le tuai o metaphase fetal cortex, ma le EGFR ma le OLIG1 faʻamatalaga. Matou te fa'aogaina le upu astrocyte e aofia ai le tele o setete o le eseesega o le astrocyte, mai le tuai radial glia i le matua o astrocytes. O fuifui a Astrocyte e fa'aalia le maualuga o le SLC1A3 ma le AQP4 ma ua fa'aalia e fa'afanua fa'atasi ai ma vaega laiti ole fetal radial glia ma/po'o astrocytes matutua. OPCs faʻaalia PDGFRA ma SOX10 aʻo oligodendrocytes faʻaalia faailoga o le myelination (MOG ma MYRF). Glutamatergic neurons na faʻaalia e ala i le i ai o faʻamaumauga o le neuronal (SYT1 ma le SNAP25), le leai o faʻailoga GABAergic (GAD2), ma le faʻaaliga o NEUROD6, SLC17A7, BCL11B, poʻo le SATB2. GluN neurons na toe vaevaeina i luga (SATB2 faʻamatalaga ma leiloa BCL11B) ma loloto (BCL11B faʻamatalaga) subclasses. Putative subplate (SP) neurons faʻaalia SP18 faʻailoga e pei o ST18 ma SORCS1 faʻaopoopo i faʻailoga loloto GluN. Choroid plexus-pei sela na iloa i le TTR faʻaaliga, ma sela e pei o le meningeal faʻaalia fibroblast-fesoʻotaʻi genes ma faʻafanua pial / vascular sela o faʻamaumauga faʻamatalaga seti.
O suʻesuʻega faʻapitoa o faʻamatalaga o kenera i le va o le t-hCO ma le hCO subclasses na faʻatinoina i le faʻaaogaina o se metotia faʻataʻitaʻi fou na toe gaosia i faʻataʻitaʻiga na faʻaaogaina e faʻaaoga ai le Libra R package (version 1.0.0). Aemaise lava, edgeR log-likelihood tests (version 3.36.0, package R) na faia mo kulupu e ala i le faʻaputuina o le numera o kenera i sela mo se vasega cell tuʻuina atu mo faʻataʻitaʻiga faʻataʻitaʻiga taʻitasi. Mo le va'aiga fa'afanua vevela, fa'atatau ile miliona (CPM) fa'atatau ile fa'aogaina o le edgeR (cpm() galuega) ma fa'afuaina (ia ausia le uiga = 0, fa'asologa masani = 1). Gene Ontology (GO) suʻesuʻega faʻatamaoaigaina o genes t-hCO GluN faʻamalosia tele na faia (Benjamini-Hochberg faʻasaʻoina le tau P o le itiiti ifo i le 0.05 faʻaalia i le itiiti ifo i le 10% o t-hCO GluN sela ma le faʻateleina o le gaugau o suiga a itiiti ifo i le 2 taimi). faia i le fa'aaogaina o le ToppGene Suite (https://toppgene.cchmc.org/)37. Matou te faʻaogaina le ToppFun app faʻatasi ai ma faʻamaufaʻailoga le lelei ma lipoti atu Benjamini-Hochberg-faʻasaʻoina P-tau faʻatatau mai GO-annotated hypergeometric suʻega.
Ina ia faʻafetauia matou fuifui snRNA-seq ma fuifui sela faʻamatalaga mai suʻesuʻega o suʻesuʻega o le RNA-seq muamua poʻo le matua snRNA-seq19,20,21,22, matou te faʻaogaina se faiga faʻapipiʻi faʻapipiʻi. Na matou faʻaogaina le SCTransform (v2) faʻasologa o galuega masani i Seurat e tuʻufaʻatasia ma faʻatusatusa le faʻapipiʻiina o fuifui i le va o faʻamaumauga (faʻaoga tutusa tutusa e pei ona i luga). O fa'amaumauga ta'ito'atasi na fa'asolo fa'atasi i luga ole 500 sela po'o 'a'ai i le ulua'i fuifui mo le fa'aogaina lelei. I le fa'aogaina o se faiga fa'apena e pei ona fa'amatalaina muamua, o lo'o fa'amatalaina le fuifui o lo'o fa'amatalaina o le vaega o sela po'o nuclei i fuifui ta'itasi ta'itasi o lo'o fa'atasi ma le fa'ailoga o le fuifui fa'asino. Ina ia faʻavasega atili GluNs, matou faʻaaogaina le Seurat's TransferData workflow mo GluN subset data e tuʻuina atu ai faʻamaumauga faʻamaumauga i matou GluN sela.
Ina ia iloilo le tulaga matua o le lalolagi transcriptome o t-hCO ma hCO faʻataʻitaʻiga, matou te faʻatusatusaina a matou faʻataʻitaʻiga faʻataʻitaʻiga ma BrainSpan / psychENCODE23, lea e aofia ai se faʻasologa RNA tele e vaʻaia le atinaʻeina o faiʻai o le tagata. Na matou faia le PCA i luga o se faʻataʻitaʻiga tuʻufaʻatasia faʻataʻitaʻiga matrix mai faʻataʻitaʻiga cortical 10 vaiaso talu ona maʻitaga ma mulimuli ane, i le 5567 genes (faʻatasi ai ma a matou faʻamatalaga) lea na faʻaalia muamua o loʻo galue i BrainSpan cortical samples (faʻamatalaina e sili atu nai lo le 50% i le eseesega o atinaʻe faʻamatalaina e le matua e faʻaaoga ai se faʻataʻitaʻiga kupita)38. E le gata i lea, na matou maua mai kenera e fesoʻotaʻi ma faʻamaufaʻailoga tetele o le neurodevelopment e faʻaaoga ai le faʻavasegaina o matrix e le lelei e pei ona faʻamatalaina muamua. O fua fa'ata'ita'i na fa'atatauina i le fa'aogaina o le fa'avasegaina o matrix e le-negative o lo'o fa'atulagaina i le Ata. 5b faʻatasi ai ma faʻamatalaga faʻalauteleina mo saini taʻitasi e lima na faʻamatalaina e Zhu et al.38. Toe fo'i, o fa'ailoga fa'aliliuga fa'alagolago i gaioiga na maua mai su'esu'ega na lomia muamua. Aemaise lava, o le ERG ma le LRG sa matua fa'atulafonoina i glutamatergic neurons ua fa'ailoa mai e le kiore visual cortex snRNA-seq fa'aputuina ina ua mae'a le fa'aosofiaga va'aia mai le Laulau Fa'aopoopo 3 Hrvatin et al.16. LRGs fa'atamaoaigaina tagata na maua mai le KCl-fa'agaoioia aganu'u fai'ai fetal ma selesele 6 itula i le mae'a ai o le fa'aosofia, ma o kenera fa'amama na matua fa'atulafonoina i totonu o tagata ae le o rodents (Laulau Fa'aopoopo 4). O le su'esu'eina o le fa'atamaoaigaina o kenera e fa'aaoga ai nei seti na faia i le fa'aogaina o le su'ega sa'o a Fisher e tasi.
Fa'ama'i isumu i le isoflurane, aveese fai'ai ma tu'u i le malulu (pe tusa o le 4°C) fa'a-okesene (95% O2 ma le 5% CO2) vaifofo sucrose mo vaega o lo'o i ai: 234 mM sucrose, 11 mM kulukose, 26 mM NaHCO3, 2.5 mM KCl, 1.25 mM. NaH2PO4, 10 mM MgSO4 ma le 0.5 mM CaCl2 (e tusa ma le 310 mOsm). O vaega o le fai'ai o le iole (300-400 µm) o lo'o iai le t-hCO sa fa'aogaina le vibratome Leica VT1200 e pei ona fa'amatala muamua39. Ona tu'uina atu lea o vaega i se potu fa'asoa fa'atasi ai ma le fa'aauau pea o le okesene o le vevela o le potu o lo'o iai le aCSF saunia mai: 10 mM kulukose, 26 mM NaHCO3, 2.5 mM KCl, 1.25 mM NaHPO4, 1 mM MgSO4, 2 mM CaCl2 ma le 126 mM NaCl (298 mM NaCl). ia le itiiti ifo i le 45 minute a'o le'i pueina. O vaega na fa'amauina i totonu o se potu fa'atofuina o lo'o fa'aauau pea ona fa'ainu i le aCSF (95% O2 ma le 5% CO2 vial). O fa'amaumauga uma na fa'amauina i le vevela o le potu. t-hCO neurons na faʻamutaina i se paipa tioata borosilicate ua tumu i se vaifofo o loʻo i ai le 127 mM potassium gluconate, 8 mM NaCl, 4 mM magnesium ATP, 0.3 mM sodium GTP, 10 mM HEPES, ma le 0.6 mM EGTA, pH 7.2, fofo faʻalotoifale faʻafetaui ma KOH (m290 faʻaoga). Ina ia toe faʻaleleia, o le biocytin (0.2%) na faʻaopoopo i le vaifofo puʻeina.
Na maua faʻamaumauga e faʻaaoga ai le MultiClamp 700B amplifier (Molecular Devices) ma le Digidata 1550B digitizer (Molecular Devices), maualalo-pass filtered i le 2 kHz, numera i le 20 kHz, ma suʻesuʻeina e faʻaaoga ai le Clampfit (Molecular Devices), Origin (OriginPro). 2021b, OriginLab). ma galuega masani a le MATLAB (Mathworks). O le avanoa faʻapipiʻi na fuafuaina e faʻaaoga ai le JPCalc ma o faʻamaumauga na faʻafetaui i le tau fuafuaina o le -14 mV. Fa'agaioiga IV e aofia ai se fa'asologa o laasaga o lo'o i ai nei i le 10-25 pA laasaga, mai le -250 i le 750 pA.
O le thalamus, mea paʻepaʻe, ma le S1 afferents na faʻaosofia eletise i fasi talatala i le taimi o le faʻamaufaʻailogaina o le hCO neurons, e pei ona faʻamatalaina muamua. I se faapuupuuga, o le faiʻai na tuʻuina i luga o se laulau lomitusi 3D faʻasaga i le 10 ° angle, ma le pito i luma o le faiʻai na tipi i le 35 ° angle. Ona fa'apipi'i lea o le fai'ai i le pito i luga ma vaelua, ma fa'asao ai le thalamocortical protruding axons. Bipolar tungsten electrodes (0.5 MΩ) na faʻapipiʻiina i luga o se micromanipulator lona lua ma faʻatulagaina faʻatulagaina e faʻaosofia ai itulagi e fa i le cell (capsule i totonu, mea paʻepaʻe, S1 ma hCO). Fa'amaumau tali synaptic pe a uma le 300 μA fa'aosofiaga fa'apitoa ile 0.03-0.1 Hz.
hChR2-faʻaalia o le hCO neurons na faʻagaoioia i le 480 nm ma faʻamalosi moli na gaosia e se LED (Prizmatix) na faʻaaogaina e ala i le × 40 faʻamoemoe (0.9 NA; Olympus) e faʻamaumau le faʻaaliga hChR2 i tafatafa o sela. O le lautele o le fanua faʻamalamalamaina e tusa ma le 0.5 mm ma le aofaʻi o le malosi e 10-20 mW. O le lautele o le pulupulu na seti i le 10 ms, lea e fetaui ma le pulupulu na tuʻuina atu i le taimi o le suʻega aʻoaʻoga amio. Na faʻaaogaina ala faʻaosofia eseese, mai le 1 i le 20 Hz, ae naʻo le pulupulu muamua o le faʻasologa na faʻaaogaina mo le faʻatusatusaina. Ole va ole va o nofoaafi e masani ona umi nai lo le 30 s e faʻaitiitia ai le aʻafiaga ile synaptic inhibitory poʻo auala faʻafaigofie. Ina ia suʻeina pe o le tali a le hChR2 o le monosynaptic, matou te faʻaogaina le TTX (1 μM) i le taele seia mou atu le tali a le EPSC, ona faʻaaogaina lea o le 4-aminopyridine (4-AP; 100 μM). E masani lava, e toe fa'afo'i mai se tali i totonu o ni nai minute, fa'atasi ai ma sina fa'atuai teisi i le va o le fa'avelaina o le LED ma le fa'atupuina o le EPSC. NBQX (10 μM) na faʻaaogaina e faʻataʻitaʻi pe o le tali o loʻo faʻauluina e le AMPA receptors.
O vaega maʻai hCO na faia e pei ona faʻamatalaina muamua. I se faapuupuuga, o vaega o le hCO na faʻapipiʻiina i le 4% agarose ma faʻafeiloaʻi i sela o loʻo i ai le 126 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM NaH2PO4, 1 mM MgSO4, 2 mM CaCl2, 26 mM NaHCO3 ma le 10 mM d-(+0gluco3) na tipi i le Vaega 2-0-glucose. µm ile vevela ole potu e fa'aaoga ai le vibrator Leica VT1200 ma teu ile ASF ile vevela ole potu. Ona, fa'amauina fa'amauina o sela atoa i luga o vaega o le hCO i lalo o le SliceScope microscope sa'o (Scientifica). O vaega na faʻafefeteina i le aCSF (95% O2 ma le 5% CO2) ma faʻamaufaʻailoga faʻailoga i le potu vevela. Na faʻaaogaina neu hCO e faʻaaoga ai se paipa tioata borosilicate ua tumu i se vaifofo o loʻo i ai le 127 mM potassium gluconate, 8 mM NaCl, 4 mM magnesium ATP, 0.3 mM sodium GTP, 10 mM HEPES, ma le 0.6 mM EGTA, totonu pH 7, 2, fetuutuunai ma KOH290larity. Mo faʻamoemoega toe faʻaleleia, faʻaopoopo le 0.2% Biocytin i le fofo i totonu.
O faʻamaumauga na maua e Clampex (Clampex 11.1, Molecular Devices) faʻaogaina le MultiClamp 700B faʻamalo (Molecular Devices) ma le Digidata 1550B digitizer (Molecular Devices), maualalo-pass filtered i le 2 kHz, faʻapipiʻiina i le 20 kHz, ma suʻesuʻeina e faʻaaoga ai le Clampfit (version 10) masini faʻapitoa mo suʻesuʻega MAT. (MATLAB 2019b, Mathworks). O le gafatia o le so'oga na fa'atatau i le fa'aaogaina o le JPCalc ma o fa'amaumauga na fetu'una'i ile fua fa'atatau ole -14 mV. Fa'agaioiga IV e aofia ai se fa'asologa o laasaga o lo'o i ai nei i le 5-10 pA laasaga mai le -50 i le 250 pA.
Mo morphological toe fausia o neu pinched, 0.2% biocytin (Sigma-Aldrich) faaopoopo i le vaifofo totonu. O sela e fa'apolopolo mo le itiiti ifo i le 15 minute pe a uma le hacking. Ona toso malie lea o le paipa i totonu mo le 1-2 minute seia oʻo ina faʻamaufaʻailogaina le paʻu faʻamau. I le mulimuli ai i le vaega o le physiology procedure, o vaega na faʻamauina i le po i le 4 ° C. i le 4% PFA, fufulu i le PBS X3, ma faʻafefeteina le 1: 1000 ma le streptavidin-conjugated DyLight 549 poʻo le DyLight 405 (Vector Labs). O sela na tumu i le biocytin (2%; Sigma-Aldrich) na faʻailogaina i le taimi o le faʻamauina o faʻamau i le vevela o le potu mo le 2 itula. Ona faʻapipiʻi lea o vaega i luga o faʻataʻitaʻiga microscopy e faʻaaoga ai le Aquamount (Thermo Scientific) ma vaʻaia i le aso na sosoo ai i luga o le Leica TCS SP8 confocal microscope e faʻaaoga ai se suauʻu faʻatofu faʻatasi ma se numera numera × 40 1.3, faʻalauteleina × 0.9-1.0, xy. Ole fua ole fa'ata'ita'iga e tusa ma le 7 pika ile micron. Z-stacks i le 1 µm vaeluaga na maua fa'asolosolo, ma z-stack mosaics ma Leica-fa'avae auto-su'i sa faia e ufiufi uma le dendritic laau o neuron taitasi. Ona siaki lea o Neurons i le semi-manual e faʻaaoga ai le neuTube 40 interface ma SWC faila na gaosia. Ona tuʻuina atu lea o faila i le SimpleNeuriteTracer41 Fiti plugin (ImageJ, version 2.1.0; NIH).
O le tino o le tagata na maua ma le faʻatagaga faʻamaonia e tusa ai ma se faʻasalalauga faʻamaonia e le Komiti Faʻatonu a le Iunivesite o Stanford. E lua faʻataʻitaʻiga o le tino o le tagata failele (3 ma le 18 tausaga) na maua e ala i le tipiina o le pito i luma (gatotonu pito i luma gyrus) o se vaega o le taotoga mo le epilepsy refractory. A maeʻa le toe tipi, selesele aano i le NMDG-aCSF malulu aisa o loʻo i ai: 92 mM NMDG, 2.5 mM KCl, 1.25 mM NaH2PO4, 30 mM NaHCO3, 20 mM HEPES, 25 mM kulukose, 2 mM thiourea, 5 mM thiourea, 5 mM thiourea 0.5 mM CaCl2 4H2O ma le 10 mM MgSO4 7H2O. Titrate i le pH 7.3-7.4 faʻatasi ai ma le faʻaogaina o le hydrochloric acid. Tisu i le falesuesue i totonu o le 30 minute ma ave vaega o le coronal e tusa ai ma le faiga o loʻo faʻamatalaina i luga.
O faʻataʻitaʻiga uma o manu na faia e tusa ai ma taʻiala o le tausiga o manu a le Iunivesite o Stanford APLAC. O isumu (sili atu i le 140 aso talu ona uma le totoina) na faʻaosoina ile 5% isoflurane faʻamaʻi ma faʻamaʻi ile 1-3% isoflurane ile gaioiga. Na tu'u manu i totonu o se fa'avaa stereotaxic (Kopf) ma tu'i le buprenorphine (SR) fa'asa'olotoina i lalo o le tino. O lo'o fa'aalia le ulupo'o, fa'amama ma fa'apipi'i 3-5 ponaivi fa'amau. Ina ia taulaʻi i le t-hCO, matou te fatuina faʻasalalauga faʻapitoa mai ata MRI. Sa viliina se pu i le nofoaga o le tului ma alava (400 µm le lautele, NA 0.48, Doric) sa tuutuu i lalo i le 100 µm i lalo ole hCO ma faamau i le ulupoo i le sima nifo e mafai ona togafitia i le UV (Relyx).
Fiber photometric pueina e pei ona faamatalaina muamua42. Ina ia fa'amaumau gaioiga fa'afuase'i, na tu'u iole i totonu o se pa'u mama ma o le 400 µm le lautele o le fiber optic patch cable (Doric) fa'afeso'ota'i i se faiga e maua mai ai fa'amaumauga a le fibre optic photometric sa feso'ota'i i le uaea fibre optic ua totoina. I le 10-minute pu'eina o gaioioiga afi, sa sa'oloto manu e su'esu'e le pa. Ina ia faʻamaumau le gaioiga na faʻaalia, o isumu (sili atu i le 140 aso talu ona faʻapipiʻiina) na faʻamaʻi faʻatasi ma le 5% isoflurane mo le induction ma le 1-3% isoflurane mo le tausiga. Tu'u le manu i totonu o se fa'avaa fa'ata'ita'i (Kopf) ma 'avaisa i le isi itu o le t-hCO o lo'o teuteu pe a ma le 2 cm ma pasi atu i totonu o se mata e feso'ota'i i se piezoelectric actuator (PI). O le 400 µm fiber optic patch cable (Doric) na fa'afeso'ota'i i le alava fa'ato'a ma fa'afeso'ota'i i le faiga e maua ai fa'amaumauga. O le 'ava i le isi itu o le t-hCO 'ona fa'afefeteina 50 taimi (2 mm i le 20 Hz, 2 s i le fa'aaliga) i taimi fa'afuase'i e ala i le piezoelectric drive i luga o le 20 minute fa'amaumau. Fa'aaoga le Arduino MATLAB Support Package e fa'atonutonu ai le taimi fa'aletonu i le MATLAB code masani. O mea e tutupu e fa'amaopoopoina i le polokalame e maua ai fa'amaumauga e fa'aaoga ai pulusi transistor-transistor logic (TTL).
O isumu (sili atu i le 140 aso talu ona uma le totoina) na faʻaosoina ile 5% isoflurane faʻamaʻi ma faʻamaʻi ile 1-3% isoflurane ile gaioiga. O manu na tuʻuina i totonu o se faʻavaa stereotaxic (Kopf) ma le buprenorphine SR ma le dexamethasone na tui i lalo. O lo'o fa'aalia le ulupo'o, fa'amama ma fa'apipi'i 3-5 ponaivi fa'amau. Ina ia taulaʻi i le t-hCO, matou te fatuina faʻasalalauga faʻapitoa mai ata MRI. Sa faia se fa'ata'otoga fa'ata'amilomilo (e tusa ma le 1 cm le lautele) fa'atasi ai ma se vili saosaoa maualuga sa'o i luga o le hCO ua fa'atupuina. O le taimi lava e manifinifi ai le ponaivi, ae a'o le'i viliina le ponaivi atoa, fa'aoga vili e aveese ai le pelvic disc o totoe e fa'aalia ai le t-hCO. Sa faatumuina le craniotomy i le masima mama, ma se ie ufiufi ma se pine ulu faapitoa sa faapipii i le ulupoo i le UV-cured nifo sima (Relyx).
O ata e lua-photon na faia i le faʻaaogaina o le Bruker multiphoton microscope ma le Nikon LWD (× 16, 0.8 NA) faʻamoemoe. GCaMP6 faʻataʻitaʻiga na faia i le 920 nm faʻatasi ai ma le 1.4x tasi z-vaalele faʻalautele ma 8x averesi o 7.5 fps. Na fa'aosoina iole ile 5% fa'ama'i fa'ama'i ole isoflurane ma fa'atumauina ile 1-3% isoflurane. Sa tu'u isumu i totonu o se mea fa'apipi'i ulu ma fa'atū i lalo ole tioata. Na maua se 3-minute faʻamaumauga o gaioiga afi. I le aluga o le 20 minute o le pueina, 50 puffs (faʻaaliga taʻitasi 100 ms le umi) na tuʻuina faʻafuaseʻi i le paʻu whisker faʻafeagai ma t-hCO e faʻaaoga ai se picospricer. Fa'aaoga le Arduino MATLAB Support Package e fa'atonutonu ai le taimi fa'atasi ma le code MATLAB masani. Fa'amaopoopo mea tutupu ma fa'amatalaga e maua ai fa'amatalaga (PrairieView 5.5) fa'aoga TTL pulus. Mo au'ili'iliga, sa fa'asa'o ata mo le xy motion e fa'aoga ai le fa'asa'oga affine i le polokalame a le MoCo na fa'alauiloa i Fiti. Ave'esega fa'asolo mai sela ta'itasi e fa'aaoga ai le CNMF-E43. Na maua mai le Fluorescence mo itulagi taʻitasi e fiafia i ai, liliu i le dF / F curves, ona liua lea i z-scores.
O isumu (sili atu i le 140 aso talu ona uma le totoina) na faʻaosoina ile 5% isoflurane faʻamaʻi ma faʻamaʻi ile 1-3% isoflurane ile gaioiga. O manu na tuʻuina i totonu o se faʻavaa stereotaxic (Kopf) ma le buprenorphine SR ma le dexamethasone na tui i lalo. O le 'ava i le isi itu o le t-hCO sa tipiina pe a ma le 2 cm ma fa'aulu i totonu o se mata e feso'ota'i i se piezoelectric actuator. Ua fa'aalia ma fa'amama le ulupo'o. O lo'o fa'apipi'i i le ulupo'o se fa'avili u'amea uamea. Ina ia taulaʻi i le t-hCO, matou te fatuina faʻasalalauga faʻapitoa mai ata MRI. Fa'atino se fa'ata'oto fa'ata'amilo (pe tusa ma le 1 cm le lautele) fa'atasi ai ma se vili saosaoa i luga a'e lava o le t-hCO. O le taimi lava e manifinifi ai le ponaivi, ae a'o le'i viliina le ponaivi atoa, fa'aoga vili e aveese ai le pelvic disc o totoe e fa'aalia ai le t-hCO. O sela ta'ito'atasi na fa'amauina i le fa'aogaina o su'esu'ega silicon silicon 32-channel po'o le 64-channel (Cambridge Neurotech) fa'amauina i fa'a'ele'ele ma fa'apipi'i muamua i mea fa'aola RHD (Intan). Fa'aaoga le manipulator e tu'u ifo ai le eletise i le nofoaga fa'atatau e ala i le craniotomy, lea e fa'atumu i le saline sterile. O le aoina o faʻamaumauga na faʻatinoina ile taimi ole 30 kHz e faʻaaoga ai le Open Ephys data acquisition system. Na faʻaauau pea le faʻamaumauga pe a matou iloa le faʻaogaina o gaioiga faʻapitoa i le sili atu i le 10 auala, faʻapea o loʻo i ai le eletise i totonu o le sulu (faʻavae i luga o faʻamatalaga faʻataʻitaʻiga calcium lua-photon). Na maua se 10-minute faʻamaumauga o gaioiga afi. O le 'ava i le isi itu o le t-hCO 'ona fa'afefeteina 50 taimi (2 mm i le 20 Hz, 2 s i le fa'aaliga) i taimi fa'afuase'i e ala i le piezoelectric drive i luga o le 20 minute fa'amaumau. Fa'aaogaina o le MATLAB Support Package mo Arduino (MATLAB 2019b), fa'atonutonu le taimi fa'aletonu i le MATLAB code masani. Fa'aoga pulus TTL e fa'amaopoopo mea tutupu ma polokalame e maua ai fa'amaumauga.
Mo faʻataʻitaʻiga faʻailoga mata, o le 200 μm optical patch cord (Doric) faʻafesoʻotaʻi i le 473 nm laser (Omicron) na fesoʻotaʻi atu i le 200 μm fiber opitika na tuʻuina i luga o le craniotomy. I le taimi lava a'o le'i faia lenei mea, fetu'una'i le mana osooso i le 20 mW. Fa'aaoga le manipulator e tu'u ifo ai le eletise i le nofoaga fa'atatau e ala i le craniotomy, lea e fa'atumu i le saline sterile. I le amataga o le puʻeina, e sefulu pulupulu o le malamalama 473 nm (auau 2 Hz, umi pulupulu 10 ms) na tuʻuina atu. O sela photosensitive na faʻamatalaina o sela e faʻaalia ai le tali atu i totonu ole 10 ms o le malamalama ile 70% pe sili atu o faʻataʻitaʻiga.